KR20140096029A - Hcv 치료 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 간염 C 바이러스 감염을 치료하는데 유용한 치료적 분자의 조합에 관한 것이다. 본 발명은 방법, 용도, 투여 양생법, 및 조성물에 관한 것이다.

Description

HCV 치료 방법 {METHODS FOR TREATING HCV}
발명의 우선권
본 출원은 2011년 9월 16일에 제출된 미국 가출원 제 61/535,885호; 및 2011년 11월 18일에 제출된 미국 가출원 제 61/561,753호에 대한 우선권을 주장한다. 상기 각각의 가출원의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 간염 C 바이러스 감염을 치료하는데 유용한 치료적 분자의 조합에 관한 것이다. 본 발명은 방법, 용도, 투여 양생법 및 조성물에 관한 것이다.
간염은 세계적으로 발생하는 질환이다. 간의 만성 염증의 상태를 고려하는 경우, 공지된 다른 비전염성 원인이 있을 수 있지만, 간염은 일반적으로 바이러스에서 기원한다. 바이러스성 간염은 단연코 가장 보편적인 형태의 간염이다. 미국 질병관리국 (The U.S. Centers for Disease Control) 은 만성 활성 감염과 관련된 다수의 경우에서 미국 인구의 1.8% 이상이 HCV 감염의 혈청학적 증거를 갖는다고 추정한다. HCV 는 플라비바이러스 과에 속하는 양성-가닥 RNA 바이러스이고, 돼지 콜레라 바이러스 및 소 바이러스성 설사 바이러스를 포함하는 페스티바이러스와 밀접한 관련이 있다.
HCV 게놈은 3009-3030 아미노산의 다단백질을 코딩하는 약 9,600 bp 의 단일-가닥, 양의 방향 RNA 이고, 세포 및 두 개의 바이러스성 단백질분해효소에 의해 번역과 동시 및 번역 후에 성숙한 바이러스성 단백질 (코어, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) 로 쪼개어 진다. 구조 단백질인 E1 및 E2 는 바이러스 지질 외피로 포매되어 안정적인 헤테로다이머를 형성하는 것으로 알려져 있다. 구조적 코어 단백질은 바이러스성 RNA 게놈과 상호작용하여 뉴클레오캡시드를 형성하는 것으로 알려져 있다. NS2 내지 NS5 로 지정된 비구조 단백질은 폴리메라아제, 프로테아제 및 헬리카제를 포함하는, 바이러스 복제 및 단백질 프로세싱과 관련된 효소 작용을 갖는 단백질을 포함한다. HCV 는 상보적 음성-가닥 RNA 주형의 생성을 통해 복제한다.
HCV 는 유전적으로 다양한 바이러스이다. 단독으로 감염된 환자에 있어서, '바이러스 무리'의 서술에 따라 많은 변종 바이러스 또는 바이러스 준종이 확인될 수 있다. 세계 인구에 있어서, HCV 는 또한 확인된 6 개 이상의 주요 '유전자형' (유전자형 1-6) 및 많은 아형 (즉, HCV 유전자형 1a 및 1b) 으로, 유전적으로 다양하다. HCV 유전자형은 게놈 계통발생 분석에 의해 정의되고, HCV RNA 서열-기반 진단 검정에 의해 (주어진 환자에서) 진단된다.
HCV 로의 감염의 주요 경로는 출혈이다. 건강 문제로서 HCV 감염의 심각성은 고위험군 사이의 유병률에 의해 설명된다. 예를 들어, 몇몇 조사에 따르면 서양에서 60% ~ 90% 의 혈우병 환자 및 80% 초과의 정맥내 마약 중독자가 만성 HCV 감염을 갖고 있다. 정맥내 마약 중독자의 경우, 유병률은 연구된 집단에 따라 약 28% ~ 80% 로 달라진다. 수혈 또는 혈액 제품 투입과 관련된 신규 HCV 감염의 비율은 약학적 진보 및 감도 높은 혈청학의 광범위한 사용 및 혈액 기증자를 검진하기 위해 사용되는 RNA 검출 검정으로 인해 현저하게 감소하였으나, 대규모 집단의 노화되고, 만성적으로 감염된 사람들이 이미 밝혀졌다.
HCV 감염에 대한 한가지 가능한 치료는 PEG화 인터페론-α (PEG-IFNα1a 또는 PEG-IFNα1b) 이고, 현재의 치료 지침 하에, 치료될 HCV 바이러스성 유전자형에 따라 24 ~ 48 주 동안 피하 주사에 의해 매주 투여된다. 비록 유전자형 1 HCV 감염을 보유한 환자의 50% 초과는 48 주 요법의 완료 시 HCV 바이러스혈증의 억제를 기대할 수 있지만, 상당한 비율의 이들 환자는 바이러스성 재발을 할 것이다. 그에 따라, 지속된 바이러스 반응 (SVR, 치료 중단 후 24 주에서 HCV RNA 음성도로서 정의되고 '치료'와 마찬가지로 간주됨) 은 PEG-IFN 단독으로 치료된 유전자형 1 HCV 감염의 30-40% 중에서만 달성된다. 또한, PEG-IFN + RBV 를 사용하는 치료는 감기같은 증상, 혈소판감소증, 빈혈증 및 심각한 정신의학 부작용을 포함하는 부작용 프로파일에 대해 내성이 좋지 않다. 간병의 현재 표준으로의 치료가 차선인 반면, 정신의학 장애, 중증 간질환 및 약물 남용을 포함하여 HCV-감염 집단에서의 흔한 동반 이환으로 인해 많은 환자는 출발 요법을 방해받는다.
리바비린 (Ribavirin) 은 뉴클레오시드 유사 항바이러스 약이다. 리바비린은 통상적으로 하루에 두 번 경구로 (입으로) 복용된다. 리바비린에 관한 정확한 메커니즘은 알려져 있지 않다. 그러나, 리바비린이 세포에 들어가는 경우, 이는 인산화 되고; 그 후 이노신 5'-모노포스페이트 디하이드로게나아제 (IMPDH) 의 억제제로서 작용하는 것으로 알려져 있다. IMPDH 억제제, 예를 들어 리바비린은 세포내 합성 및 구아닌의 저장, DNA 및 RNA 생성을 위해 필요한 뉴클레오티드 "빌딩 블록"을 감소시켜서, 바이러스 복제를 억제한다. IMPDH 억제제는 또한 빠르게 증식하는 세포 및 높은 비율의 단백질 전환을 갖는 세포의 생식을 방해한다. 리바비린 단일요법을 사용하는 치료는 HCV RNA 레벨에 대해서 효과가 거의 없지만, 혈청 알라닌 전이효소 (ALT) 에서의 감소와 관련되어 있다. 이러한 관찰은 리바비린이 항바이러스제로서 작용하기보다는 면역계 기능의 조정자로서 작용할 것이라는 것을 제안한다. 리바비린은 HCV 감염과 관련하여 IFN 과 조합하여 사용하는 것만 승인된다.
요법의 중단 시 바이러스성 재발 빈도의 감소로 인해서, PEG-IFN + 리바비린 조합의 치료는 PEG-IFN 단독으로 관찰된 치료에 비해 SVR 비율을 아주 많이 개선한다. PEG-IFN/리바비린 치료된, HCV 유전자형 1 감염을 갖는 환자에 대한 대규모 임상 시험용 SVR 비율은 40-55% 의 범위를 갖는다. 현재에는, PEG-IFN/리바비린 요법은 만성 HCV 감염에 대한 '관리의 표준' 치료로 간주된다. 그러나, 관리의 표준은 직접 작용하는 항바이러스제의 승인과 함께 가까운 미래에 빠르게 변화될 것으로 기대되고, 이는 처음으로 PEG-IFN/리바비린과 조합하여 사용될 것이다.
유감스럽게도, 상이한 HCV 유전자형은 PEG-IFN/리바비린 요법에 상이하게 대응한다; 예를 들어, HCV 유전자형 1 은 요법에 대해 유형 2 및 3 보다 저항성이 더 크다. 부가적으로, HCV 에 대한 많은 현재의 치료는 원치않는 부작용을 발생한다. 따라서, 최신 신규 항바이러스 요법이 필요하다. 특히, 원치 않는 부작용이 더 적게 발생하고, HCV 유전자형의 범위에 대해 보다 효과적이거나, 또는 덜 복잡한 투여 스케줄, 즉 하루동안 더 적은 횟수로 작용제의 투여를 필요로 하는 스케쥴을 갖는 신규 항바이러스성 요법이 필요하다.
본 발명은 바이러스 감염 (예를 들어, HCV) 을 치료하는데 유용한 조성물 및 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 특정 조성물 및 방법은 원치 않는 부작용을 덜 생성하고, 다양한 HCV 유전자형에 대해 보다 효과적이고, 저항성 선택으로 인한 바이러스성 리바운드 (rebound) 에 대한 잠재성을 감소시키고, 현재 이용가능한 요법보다 투여 스케줄을 덜 복잡하게 단축시켰다.
그에 따라, 일 양상에서 본 발명은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로부터 선택되는 둘 이상의 화합물 및 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물을 제공한다.
또다른 양상에서 본 발명은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로부터 선택되는 둘 이상의 화합물 및 그의 약학적으로 허용가능한 염을 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 HCV 감염을 치료하는 방법을 제공한다.
또다른 양상에서 본 발명은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로부터 선택되는 둘 이상의 화합물 및 그의 약학적으로 허용가능한 염을 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선시키는 방법을 제공한다.
또다른 양상에서 본 발명은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로부터 선택되는 둘 이상의 화합물 및 그의 약학적으로 허용가능한 염을 인간에게 투여하는 것을 포함하는, HCV 를 갖는 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법을 제공한다.
또다른 양상에서 본 발명은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로부터 선택되는 둘 이상의 화합물 및 그의 약학적으로 허용가능한 염을 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 동시투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 제공한다.
또다른 양상에서 본 발명은 의학 요법에서, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로부터 선택되는 둘 이상의 화합물 및 그의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
또다른 양상에서 본 발명은 바이러스 (예를 들어, HCV) 감염의 예방적 또는 치료적 처리를 위한, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로부터 선택되는 둘 이상의 화합물 및 그의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
또다른 양상에서 본 발명은 바이러스 (예를 들어, HCV) 감염의 예방적 또는 치료적 처리를 위한 본 발명의 조성물의 용도를 제공한다.
또다른 양상에서 본 발명은 인간에서 바이러스 (예를 들어, HCV) 감염 치료용 약제를 제조하기 위한, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로부터 선택되는 둘 이상의 화합물 및 그의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
또다른 양상에서 본 발명은 인간에서 바이러스 (예를 들어, HCV) 감염 치료용 약제를 제조하기 위한 본 발명의 조성물의 용도를 제공한다.
또다른 양상에서 본 발명은 인간에서 바이러스 (예를 들어, HCV) 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 약제를 제조하기 위한, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 및 그의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
또다른 양상에서 본 발명은 인간에서 바이러스 (HCV) 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 약제를 제조하기 위한 본 발명의 조성물의 용도를 제공한다.
또다른 양상에서 본 발명은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 약제를 제조하기 위한, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 및 그의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
또다른 양상에서 본 발명은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 약제를 제조하기 위한 본 발명의 조성물의 용도를 제공한다.
또다른 양상에서 본 발명은 인간에서 동시투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 약제를 제조하기 위한, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 및 그의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
또다른 양상에서 본 발명은 인간에서 동시투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 약제를 제조하기 위한 본 발명의 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 조성물 및 방법은 "상승작용" 및 "상승 효과" 를 제공할 수 있으며, 즉, 활성 성분 (둘 이상의 조합 화합물을 포함) 을 함께 사용할 때 달성되는 효과가 화합물을 별도로 사용하여 초래되는 효과의 합보다 더 크다.
본 발명의 조성물 및 방법은 넓은 범위의 HCV 유전자형에 대한 치료를 제공하고, 현재의 HCV 요법 (예를 들어, 인터페론의 투여를 포함하는 치료) 보다 더 적거나 덜 심각한 부작용을 야기하기 때문에 유익하다. 부가적으로, 화합물의 특정 조합 (예를 들어, 화합물 10 및 5, 화합물 10 및 6, 및 화합물 10, 5 및 6) 은 현재의 요법 (예를 들어, HCV 요법) 에 의해 달성되는 것보다 상당히 더 높은, 지속된 바이러스 반응 (Sustained Virological Response: SVR) 을 제공할 수 있다. 예를 들어, 화합물의 몇몇 조합은 약 70% 이상 또는 약 80% 이상인 SVR 을 제공할 수 있다.
정의
별도의 언급이 없는 한, 본원에 사용된 바와 같은 하기 용어 및 구절은 하기 의미를 나타내기 위함이다. 특정 용어 또는 구절이 명확하게 정의되지 않는다는 점을 불분명함 또는 명확성의 부족함으로 연관지어서는 안되고, 본원의 용어는 그의 통상적인 의미 내에서 사용된다. 상표명이 본원에 사용되는 경우, 출원인은 상표명 제품 및 상표명 제품의 활성 약학 성분(들)을 독립적으로 포함하고자 한다.
본원에서 사용되는 용어 "조합 화합물" 은 화합물 1, 화합물　2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 을 언급한다.
본원에서 사용되는, 화합물 1 은 하기와 같다:
Figure pct00001
화합물 1 은 5-((6-(2,4-비스(트리플루오로메틸)페닐)피리다진-3-일) 메틸)-2-(2-플루오로페닐)-5H-이미다조[4,5-c]피리딘 또는 5H-이미다조[4,5-c]피리딘, 5-[[6-[2,4-비스(트리플루오로메틸)페닐]피리다진-3-일]메틸]-2-(2-플루오로페닐)로서 또한 언급될 수 있다.
본원에서 사용되는, 화합물 2 는 하기와 같다:
Figure pct00002
화합물 2 는 (2R,6S,13aR,14aS,16aS)-2-(8-클로로-2-(2-(이소프로필아미노) 티아졸-4-일)-7-메톡시퀴놀린-4-일옥시)-6-(시클로펜틸옥시카르보닐아미노)-5,16-디옥소옥타데카히드로시클로프로파[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아자시클로펜타데신-14a-일(2,6-디플루로벤질)포스핀산으로서 또한 언급될 수 있다.
본원에서 사용되는, 화합물 3 은 하기와 같다:
Figure pct00003
본원에서 사용되는, 화합물 4 는 하기와 같다:
Figure pct00004
본원에서 사용되는, 화합물 5 는 하기와 같다:
본원에서 사용되는, 화합물 6 은 하기와 같다:
Figure pct00006
본원에서 사용되는, 화합물 7 은 하기와 같다:
Figure pct00007
본원에서 사용되는, 화합물 8 은 하기와 같다:
Figure pct00008
본원에서 사용되는, 화합물 9 (P 에서의 부분입체이성질체) 는 하기와 같다:
Figure pct00009
화합물 9 와 관련하여, 화합물 9 의 제조 및 정제에 관해서 US 7,964,580 및 US 2010/0298257 (이들 둘 다 본원에 참조로 포함됨) 을 참조한다.
본원에서 사용되는, 화합물 10 (화합물 9 의 S-이성질체) 은 하기와 같다:
Figure pct00010
화합물 10 과 관련하여, 화합물 10 의 제조 및 정제에 관해서 US 7,964,580 및 US 2010/0298257 (이들 둘 다 본원에 참조로 포함됨) 을 참조한다.
본원에서 사용되는, 화합물 11 은 하기와 같다:
Figure pct00011
화합물 11 과 관련하여, 화합물 11 의 제조 및 정제에 관해서 US 2010/0081628 (이는 본원에 참조로 포함됨) 을 참조한다.
본원에서 사용되는, 화합물 12 (P 에서의 부분입체이성질체) 는 하기와 같다:
Figure pct00012
화합물 12 와 관련하여, 화합물 12 의 제조 및 정제에 관해서 US 20110015146 (이는 본원에 참조로 포함됨) 을 참조한다.
본원에서 사용되는, 화합물 13 (P 에서의 화합물 12 의 S-부분입체이성질체) 은 하기와 같다:
Figure pct00013
화합물 13 과 관련하여, 화합물 13 의 제조 및 정제에 관해서 US 20110015146 (이는 본원에 참조로 포함됨) 을 참조한다.
본원에서 사용되는, 화합물 14 는 하기와 같다:
Figure pct00014
화합물 14 와 관련하여, 화합물 14 의 제조 및 정제에 관해서 US 7,964,580 (이는 본원에 참조로 포함됨) 을 참조한다.
본원에서 사용되는, 화합물 15 는 하기와 같다:
Figure pct00015
화합물 15 와 관련하여, 화합물 15 의 제조 및 정제에 관해서 US 7,964,580 (이는 본원에 참조로 포함됨) 을 참조한다.
본원에서 사용되는, 화합물 16 은 하기와 같다:
Figure pct00016
화합물 16 과 관련하여, 화합물 16 의 제조 및 정제에 관해서 US 7,429,572 (이는 본원에 참조로 포함됨) 을 참조한다.
리바비린과 관련하여, 리바비린에 관한 제조 방법 및 명명법에 관해서 본원에 참조로 포함된 EP 0 093 401 B1 을 참조한다. 본원에서 사용되는, 리바비린은 하기를 언급한다:
Figure pct00017
.
리바비린은 1-β-D-리보푸라노실-1H-1,2,4-트리아졸-3-카르복스아미드, 1-β-D-리보푸라노실-1,2,4-트리아졸-3-카르복시아미드; 1-β-D-리보푸라노실-1,2,4-트리아졸-3-카르복스아미드; 코페구스 (Roche); DRG-0028; HSDB 6513; ICN 1229; 메가리바비린 (예를 들어, 100 ㎎ 의 리바비린/mL 의 제형); NSC 163039; 라바넥스 (BioPartners); 레베톨 (Schering-Plough; Aesca; Bayer Schering Pharma; Essex; Pfizer; Trading Pharma; Zuellig Pharma); 리바미드; 리바미딜 (Biopharma, Russia); 리바스피어 (Three Rivers Pharmaceuticals); 리바바린; 리바비리나; 트리바비린; 빌로나 (Valeant Pharmaceuticals; ICN Pharmaceuticals); 비라미드 (ICN Pharmaceuticals; Alfa Wassermann); 비라졸 (Valeant Pharmaceuticals); 및 비리자돌 (Uci-farma, Sao Bernardo do Campo, Sao Paulo, Brazil) 로서 또한 언급된다. 또한, 본원에서 사용되는 리바비린은 타리바비린 (비라미딘, ICN 3142) 을 포함하여, 리바비린의 유사체를 포함한다.
용어 "인터페론" 은 1) 인터페론, 예를 들어, PEG화 rIFN-알파 2b (PEG-Intron, Merck & Co., Inc.), PEG화 rIFN-알파 2a (PEGASYS, Hoffmann-La Roche Inc.), rIFN-알파 2b (INTRON® A, Merck & Co., Inc.), rIFN-알파 2a (Roferon®-A, Hoffmann-La Roche Inc.), 인터페론 알파 (MULTIFERON® Viranative AB Corporation, OPC-18, Alfaferone, Alfanative, subalin), 인터페론 알파콘-1 (Valeant), 인터페론 알파-n1 (Wellferon™, Glaxo Wellcome), 인터페론 알파-n3 (ALFERON®-Hemispherx Biopharma, Inc.), 인터페론-베타-1a (AVONEX® Biogen Idec, DL-8234 Daiichi Pharmaceutical Co. Ltd), 인터페론-오메가 (omega DUROS®, Alza Corporation, Intarcia Therapeutics, Inc.; Biomed 510, Intarcia Therapeutics, Inc.), 알브인터페론 알파-2b (ALBUFERON®, Human Genome Sciences, INC.), IFN 알파-2b XL, BLX-883 (LOCTERON®, Biolex Therapeutics, INC.), DA-3021, 글리코실화 인터페론 알파-2b (AVI-005), PEG-INFERGEN®, A㎎en, Inc., PEG화 인터페론 람다-1(유형 III) (PEG화 IL-29), 및 BELEROFON®, Nautilus Biotech 를 포함한다.
용어 "조합 요법" 은 둘 이상의 조합 화합물을 포함하는 조성물 또는 방법 또는 용도 등을 의미한다. 조합 요법은 하기를 포함하여 둘 이상의 조합 화합물에 추가로 기타 활성 성분을 포함할 수 있지만, 이들로만 제한되지는 않는다: 리바비린, 인터페론, 알파-글루코시다제 1 저해인자, 헤파토프로텍탄트 (hepatoprotectant), 톨-유사 수용체 (TLR)-7 아고니스트, 시클로필린 저해인자, HCV 바이러스 진입 저해인자, HCV 성숙 저해인자, 및 HCV IRES 저해인자.
용어 "활성 성분" 은 임의의 조합 화합물, 리바비린, 인터페론, 알파-글루코시다제 1 저해인자, 헤파토프로텍탄트, TLR-7 아고니스트, 시클로필린 저해인자, HCV 바이러스 진입 저해인자, HCV 성숙 저해인자 및 HCV IRES 저해인자를 포함하는, 약학적 효과를 발휘하거나 발휘할 수 있는 조합 요법의 성분을 의미한다.
용어 "치료" 및 이의 문법상 동의어는 질환을 치료하는 문맥에서 사용되는 경우, 질환의 진행을 완화시키거나 정지시키거나, 또는 하나 이상의 질환의 증상을 개선시키거나, 보다 바람직하게는 하나 초과의 질환의 증상을 개선시키는 것을 의미한다. 예를 들어, HCV 환자는 HCV 감염과 관련될 수 있는 하기 증상의 한 가지 또는 모두에 대해서 개선을 경험할 수 있다: 알라닌 아미노트랜스퍼라아제 (ALT) 레벨의 증가, 열, 두통, 근육통, 황달, 피로, 식욕 감퇴, 구역질, 구토 및 설사. 간염 C 바이러스 감염의 치료는 HCV 감염된 인간에서 HCV 바이러스 부하를 감소시키는 것을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 특정 화합물은 하나 이상의 키랄 중심을 함유하거나, 또는 그렇지 않으면 다중 입체이성질체로서 존재할 수 있다. 본 발명의 범주는 입체이성질체의 혼합물 및 정제된 거울상이성질체 또는 거울상이성질체적으로/부분입체이성질체적으로 강화된 혼합물을 포함한다. 본원에 나타낸 식으로 대표되는 화합물의 개별 이성질체 및 완전하게 또는 부분적으로 평형된 이의 임의의 혼합물이 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다. 본 발명은 본원에 나타낸 식으로 대표되는 화합물의 개별 이성질체를 하나 이상의 키랄 중심이 도치된 이의 이성질체와의 혼합물로서 또한 포함한다. 본원에 사용된 입체화학적 정의 및 관례는 일반적으로 그의 전문이 본원에 참조로 포함된 하기 문헌 [S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York]; 및 [Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York] 에 따른다.
많은 유기 화합물은 광학적인 활성 형태로 존재하고, 즉, 이들은 평면 편광의 평면을 회전시키는 능력을 갖는다. 광학적 활성 화합물의 기재에 있어서, 그의 키랄 중심(들)에 관한 분자의 절대 배열을 표시하기 위해서 접두사 D 및 L 또는 R 및 S 가 사용된다. 접두사 d 및 l 또는 (+) 및 (-) 는 화합물에 의한 평면 편광의 회전의 표시를 지정하기 위해 사용되고, (-) 또는 l 은 화합물이 좌선성임을 의미한다. 접두사 (+) 또는 d 를 갖는 화합물은 우선성이다.
특이적 입체이성질체는 거울상이성질체로서 또한 언급될 수 있고, 상기 이성질체의 혼합물은 거울상이성질체 혼합물로 종종 언급된다. 거울상이성질체의 50:50 혼합물은 라세미 혼합물 또는 라세미체로서 언급되고, 화학 반응 또는 공정 중 입체선택 또는 입체특이성을 갖지 않는 곳에서 발생할 수 있다. 용어 "라세미 혼합물" 및 "라세미체"는 광학 활성이 없는 두 개의 거울상이성질체 종의 등몰의 혼합물을 언급한다.
조합
본 발명은 둘 이상의 조합 화합물의 조합을 포함한다. 본 발명의 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 의 가능한 2 원 (조합 1-21), 3 원 (조합 22-56), 4 원 (조합 57-92) 및 5 원 (조합 93-113) 조합을 나타낸 표 I 을 하기에 제공하였다. 화합물 4, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 은 HCV NS5b 폴리메라아제의 뉴클레오시드 저해인자이고, 조합 화합물의 조합은 화합물 4, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 중 한가지만을 가장 빈번하게 포함할 것이다 (표 I 의 컬럼 6 참조).
[표 1]
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
조성물
본 발명의 하나의 양상은 화합물 1 을 포함하고, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다. 본 발명의 하나의 구체적 양상에서, 제 2 화합물은 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5 또는 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 2 를 포함하고, 화합물 1, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다. 본 발명의 하나의 구체적 양상에서, 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 본 발명의 하나의 구체적 양상에서, 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있다. 본 발명의 하나의 구체적 양상에서, 제 2 화합물은 화합물 5 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 3 을 포함하고, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다. 본 발명의 하나의 구체적 양상에서, 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있다. 본 발명의 하나의 구체적 양상에서, 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 본 발명의 하나의 구체적 양상에서, 제 2 화합물은 화합물 5 일 수 있다. 본 발명의 하나의 구체적 양상에서, 제 2 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 4 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 1 화합물을 포함하고, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다. 본 발명의 하나의 구체적 양상에서, 제 2 화합물은 화합물 1 또는 화합물 2 또는 화합물 3 또는 화합물 6 일 수 있다. 본 발명의 하나의 구체적 양상에서, 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있다. 본 발명의 하나의 구체적 양상에서, 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있다. 본 발명의 하나의 구체적 양상에서, 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있다. 본 발명의 하나의 구체적 양상에서, 제 2 화합물은 화합물 5 일 수 있다. 본 발명의 하나의 구체적 양상에서, 제 2 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 5 를 포함하고, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다. 본 발명의 하나의 구체적 양상에서, 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있다. 본 발명의 하나의 구체적 양상에서, 제 2 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 6 을 포함하고, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다. 본 발명의 하나의 구체적 양상에서, 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있다. 본 발명의 하나의 구체적 양상에서, 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있다. 본 발명의 하나의 구체적 양상에서, 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있다. 본 발명의 하나의 구체적 양상에서, 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 7 을 포함하고, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 1 화합물을 포함하고, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 1 을 포함하고, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물 및 제 3 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 3, 또는 화합물 4, 또는 화합물 5 또는 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 3 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 5 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 5 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 2 를 포함하고, 화합물 1, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물 및 제 3 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 5 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 3 을 포함하고, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물 및 제 3 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 1 또는 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 5 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 4 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 1 화합물을 포함하고, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물 및 제 3 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3 또는 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 2 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 3 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 5 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 5 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 5 를 포함하고, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물 및 제 3 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 6 을 포함하고, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물 및 제 3 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3 또는 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 2 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 3 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 5 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 5 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 5 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 7 을 포함하고, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물 및 제 3 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 1 화합물을 포함하고, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물 및 제 3 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 1 을 포함하고, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물 및 제 4 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 또는 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있고, 제 4 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있고, 제 4 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 2 를 포함하고, 화합물 1, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물 및 제 4 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 3 을 포함하고, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물 및 제 4 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 1 또는 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 5 일 수 있고, 제 4 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 4 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 1 화합물을 포함하고, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물 및 제 4 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 또는 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 2 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 3 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 5 를 포함하고, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물 및 제 4 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 6 을 포함하고, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물 및 제 4 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 또는 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 2 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 3 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 7 을 포함하고, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물 및 제 4 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 추가로 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 1 화합물을 포함하고, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물 및 제 4 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 1 을 포함하고, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물, 제 4 화합물 및 제 5 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5 또는 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 2 를 포함하고, 화합물 1, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물, 제 4 화합물 및 제 5 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 3 을 포함하고, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물, 제 4 화합물 및 제 5 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 1 또는 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 4 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 1 화합물을 포함하고, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물, 제 4 화합물 및 제 5 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3 또는 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 2 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 3 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 5 를 포함하고, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물, 제 4 화합물 및 제 5 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 6 을 포함하고, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물, 제 4 화합물 및 제 5 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3 및 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 2 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 3 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 7 을 포함하고, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물, 제 4 화합물 및 제 5 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 1 화합물을 포함하고, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물, 제 4 화합물 및 제 5 화합물을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다.
염
조합 화합물 및 기타 활성 성분은 염의 형태로 존재할 수 있다. 통상적으로, 그러나 절대적으로는 아니고, 조합 화합물 및 기타 활성 성분의 염은 약학적으로 허용가능한 염이다. 용어 "약학적으로 허용가능한 염" 안에 포함되는 염은 조합 화합물 및/또는 기타 활성 성분의 무독성 염을 언급한다. 약학적으로 허용가능한 염의 적합한 예는 무기산 부가 염, 예를 들어 염화물, 브롬화물, 황산염, 인산염 및 질산염; 유기산 부가 염, 예를 들어 아세트산염, 갈락타르산염, 프로피온산염, 숙신산염, 젖산염, 글리콜산염, 말산염, 주석산염, 구연산염, 말레인산염, 푸마르산염, 메탄술폰산염, p-톨루엔술폰산염 및 아스코르브산염; 산성 아미노산을 갖는 염, 예를 들어 아스파르트산염 및 글루탐산염; 알칼리 금속 염, 예를 들어 나트륨 염 및 칼륨 염; 알칼리토류 금속 염, 예를 들어 마그네슘 염 및 칼슘 염; 암모늄 염; 유기 염기성 염, 예를 들어 트리메틸아민 염, 트리에틸아민 염, 피리딘 염, 피콜린 염, 디시클로헥실아민 염 및 N,N'-디벤질에틸렌디아민 염; 및 염기성 아미노산을 갖는 염, 예를 들어 리신 염 및 아르기닌 염을 포함한다. 상기 염은 일부 경우에서 수화물 또는 에탄올 용매화물일 수 있다.
약학 제형
조합 화합물 및/또는 기타 활성 성분은 통상적인 담체 또는 부형제와 함께 제형화 될 수 있고, 이는 통상적인 관행에 따라 선택될 수 있다. 정제는 통상적으로 부형제, 유동화제, 충전제, 결합제 등을 함유한다. 수성 제형은 살균 형태로 제조될 수 있고, 경구 이외의 투여로 전달하고자 하는 경우는 일반적으로 등장성일 것이다. 모든 제형은 부형제, 예를 들어 그의 전문이 본원에 참조로 포함되어 있는 문헌 [Handbook of Pharmaceutical Excipients (1986)] 에 제시되어 있는 부형제를 임의로 함유할 것이다. 부형제는 아스코르브산 및 기타 항산화제, 킬레이트제, 예를 들어 EDTA, 탄수화물, 예를 들어 덱스트린, 히드록시알킬셀룰로스, 히드록시알킬메틸셀룰로스, 스테아르산 등을 포함한다.
제형의 pH 는 약 3 ~ 약 11 의 범위이지만, 통상적으로는 약 7 ~ 10 이다.
하나의 활성 성분이 단독으로 투여되는 것이 가능하지만, 하나 이상의 활성 성분들을 약학적 제형으로서 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 제형 (동물용 및 인간용 둘 다) 은 하나 이상의 활성 성분을 하나 이상의 허용가능한 담체 및 임의로 기타 치료적 성분과 함께 포함한다. 담체(들)은 제형의 기타 성분과 화합성이고 이의 수령자에게 생리학적으로 무해하다는 의미로 "허용가능" 해야한다.
제형은 하기 제시된 투여 경로에 적합한 것을 포함한다. 제형은 단위 투여 형태로 편리하게 제공될 수 있고, 약학 업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 기술 및 제형은 일반적으로 그의 전문이 본원에 참조로 포함되어 있는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, Pa.)] 에서 발견할 수 있다. 상기 방법은 활성 성분과 하나 이상의 부속 성분을 구성하는 담체와의 조합을 가져오는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 하나 이상의 활성 성분과 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 다를 균일하게 및 직접적으로 조합하고, 그 후 필요한 경우에 제품을 성형하여 제조될 수 있다.
경구 투여에 적합한 본 발명의 제형은 개별 단위, 예를 들어 각각 예정된 양의 활성 성분을 함유하는 캡슐, 카시에 (cachet) 또는 정제; 분말 또는 과립; 수성 또는 비-수성 액체 중 용액 또는 현탁액; 또는 수중유 액체 에멀전 또는 유중수 액체 에멀전으로서 나타낼 수 있다. 활성 성분은 볼루스, 연약 또는 페이스트로서 또한 투여될 수 있다.
정제는 임의로 하나 이상의 부속 성분과 함께 압착 또는 성형에 의해 제조될 수 있다. 압착된 정제는 자유-유동 형태, 예를 들어 분말 또는 과립 중 활성 성분을 임의로 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 보존제, 계면 활성제 또는 분산제와 혼합하여 적합한 기계에서 압착하여 제조될 수 있다. 성형된 정제는 불활성 액체 희석제로 적신 분말 활성 성분의 혼합물을 적합한 기계에서 성형하여 제조될 수 있다. 활성 성분의 지속 방출 또는 조절 방출을 제공하기 위해서 정제는 임의로 코팅되거나 또는 스코어링 될 수 있고, 임의로 제형화될 수 있다.
눈 또는 다른 외부 조직, 예를 들어 입 및 피부에 투여하기 위해서, 제형은 예를 들어, 0.075 ~ 20% w/w (0.1% w/w 의 증가, 예를 들어 0.6% w/w, 0.7% w/w 등으로, 0.1% ~ 20% 범위 내에서 활성 성분(들)을 포함함), 바람직하게는 0.2 ~ 15% w/w 및 가장 바람직하게는 0.5 ~ 10% w/w 의 양으로 활성 성분(들)을 함유하는 국소 연고 또는 크림으로서 바람직하게는 도포될 수 있다. 연고로 제형화되는 경우, 활성 성분은 파라핀성 또는 수혼화성 연고 기제로 사용될 수 있다. 별법으로, 활성 성분은 수중 유적 크림 기제를 갖는 크림으로 제형화될 수 있다.
원하는 경우, 크림 기제의 수상은 예를 들어 30% w/w 이상의 다가 알코올, 즉, 둘 이상의 히드록실기를 갖는 알코올, 예를 들어 프로필렌 글리콜, 부탄 1,3-디올, 만니톨, 소르비톨, 글리세롤 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG 400 을 포함함) 및 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 국소 제형은 바람직하게는 피부 또는 기타 환부를 통해서 활성 성분의 흡수 또는 침투를 증강시키는 화합물을 포함할 수 있다. 상기 피부 침투 증강제의 예는 디메틸 술폭시드 및 관련 유사체를 포함한다.
조합 화합물 및/또는 기타 활성 성분의 에멀전의 유상은 공지된 방식으로 공지된 성분으로부터 구성될 수 있다. 상기 상은 단지 유화제 (에멀전화제로도 공지됨) 만을 포함할 수 있지만, 바람직하게는 지방 또는 오일, 또는 지방 및 오일 두 가지 모두와 하나 이상의 유화제의 혼합물을 포함한다. 바람직하게는, 친수성 유화제는 안정제로서 작용하는 친유성 유화제와 함께 포함된다. 오일 및 지방 두 가지 모두를 포함하는 것이 또한 바람직하다. 안정제(들)과 함께 또는 안정제(들) 없이 유화제(들)은 이른바 에멀전화 왁스를 만들고, 오일 및 지방과 함께 상기 왁스는 크림 제형의 유분산상을 형성하는 이른바 에멀전화 연고 기제를 만든다.
본 발명의 제형에 사용하기 적합한 에멀전화제 및 에멀전 안정제는 Tween® 60 (ICI Americas Inc.), Span 80, 세토스테아릴 알코올, 벤질 알코올, 미리스틸 알코올, 글리세릴 모노-스테아레이트 및 라우릴 황산 나트륨을 포함한다.
제형에 대해 적합한 오일 또는 지방의 선택은 원하는 화장품 특성의 달성에 달려있다. 크림은 바람직하게는 튜브 또는 기타 용기로부터 새는 것을 방지하기 위한 적합한 밀도를 갖는, 기름기 없고, 착색 없고 세척 가능한 제품일 것이다. 직쇄 또는 분지쇄, 일- 또는 2염기성 알킬 에스테르, 예를 들어 디-이소아디페이트, 이소세틸 스테아레이트, 코코넛 지방산의 프로필렌 글리콜 디에스테르, 이소프로필 미리스테이트, 데실 올레에이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸 스테아레이트, 2-에틸헥실 팔미테이트 또는 크로다몰 캡 (Crodamol CAP) 으로 공지된 분지쇄 에스테르의 배합물이 사용될 수 있고, 끝에서 세 가지가 바람직한 에스테르이다. 이들은 필요한 특성에 따라 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 별법으로, 고융점 지질, 예를 들어 백색 연질 파라핀 및/또는 액체 파라핀 또는 기타 광물성 오일이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 제형은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제 및 임의로 기타 치료적 작용제와 함께 하나 이상의 활성을 포함한다. 활성 성분을 함유하는 약학 제형은 의도하는 투여 방법에 적합한 임의의 형태로 존재할 수 있다. 경구용으로 사용되는 경우, 예를 들어 정제, 트로키제, 함당정제, 수성 또는 유성 현탁액, 분산성 분말 또는 과립, 유화제, 경질 또는 연질 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제가 제조될 수 있다. 경구용으로 의도된 조성물은 약학적 조성물의 제조에 대해서 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 제조될 수 있고, 상기 조성물은 맛있는 제제를 제공하기 위해서 감미제, 착향제, 착색제 및 보존제를 포함하여 하나 이상의 작용제를 함유할 수 있다. 정제의 제조에 적합한 무독성의 약학상 허용가능한 부형제와 혼화시킨, 활성 성분을 함유하는 정제가 허용된다. 상기 부형제는 예를 들어 불활성 희석제, 예를 들어 탄산칼슘 또는 탄산나트륨, 락토오즈, 락토오즈 일수화물, 크로스카멜로오즈 나트륨, 포비돈, 인산칼슘 또는 인산나트륨; 과립화제 및 붕해제, 예를 들어 옥수수 전분, 또는 알긴산; 결합제, 예를 들어 셀룰로오즈, 미정질 셀룰로오즈, 녹말, 젤라틴 또는 아카시아; 및 윤활제, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 활석일 수 있다. 정제는 위장관에서의 분해 및 흡착을 지연시키기 위한 마이크로캡슐화를 포함하여 공지된 기술에 의해 코팅되지 않거나 코팅될 수 있고, 따라서 긴 기간에 걸쳐 지속되는 작용을 제공한다. 예를 들어 시간 지연 물질, 예를 들어 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트가 단독으로 또는 왁스와 함께 사용될 수 있다.
경구용 제형은 활성 성분(들)이 고체 희석제, 예를 들어 인산칼슘 또는 고령토와 혼합되는 경질 젤라틴 캡슐, 또는 활성 성분이 물 또는 오일 매질, 예를 들어 땅콩 기름, 액체 파라핀 또는 올리브유과 혼합되는 연질 젤라틴 캡슐로서 또한 제공될 수 있다.
본 발명의 수성 현탁액은 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와 혼화하여 활성 물질을 함유한다. 상기 부형제는 현탁제, 예를 들어 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검 및 아카시아 검, 및 분산제 또는 습윤제, 예를 들어 자연 발생 인지질 (예를 들어, 레시틴), 알킬렌 옥시드와 지방산의 축합체 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트), 에틸렌 옥시드와 장쇄 지방족 알코올의 축합체 (예를 들어, 헵타데카에틸렌옥시세타놀), 에틸렌 옥시드와 지방산 및 헥시톨 무수물에서 유래된 불완전한 에스테르의 축합체 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트) 를 포함한다. 수성 현탁액은 하나 이상의 보존제, 예를 들어 에틸 또는 n-프로필 p-히드록시-벤조에이트, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 착향제 및 하나 이상의 감미제, 예를 들어 수크로스 또는 사카린을 또한 함유할 수 있다.
오일 현탁액은 식물성 오일, 예를 들어 땅콩 기름, 올리브유, 참기름 또는 야자유, 또는 광물성 오일, 예를 들어 액체 파라핀 중 활성 성분을 현탁시켜서 제형화될 수 있다. 경구 현탁액은 농조화제, 예를 들어 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알코올을 함유할 수 있다. 본원에 제시된 것과 같은 감미제 및 착향제는 맛있는 경구 제제를 제공하기 위하여 첨가될 수 있다. 상기 조성물은 항산화제, 예를 들어 아스코르브산의 첨가에 의해 보존될 수 있다.
물의 첨가에 의한 수성 현탁액의 제조에 적합한 본 발명의 분산성 분말 및 과립은 분산제 또는 습윤제, 현탁제, 하나 이상의 보존제와 혼화한 활성 성분을 제공한다. 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제는 상기 개시된 바에 의해 예시되어 있다. 부가적 부형제, 예를 들어 감미제, 착향제 및 착색제가 또한 제공될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 수중유 에멀전의 형태로 존재할 수 있다. 유상은 식물성 오일, 예를 들어 올리브유 또는 땅콩 기름, 광물성 오일, 예를 들어 액체 파라핀 또는 이의 혼합물일 수 있다. 적합한 유화제는 자연 발생 검, 예를 들어 아카시아 검 및 트라가칸트 검, 자연 발생 인지질, 예를 들어 대두 레시틴, 에스테르 또는 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래된 불완전한 에스테르, 예를 들어 소르비탄 모노올레에이트, 및 상기 불완전한 에스테르와 에틸렌 옥시드의축합체, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트를 포함한다. 에멀전은 감미제 및 착향제를 또한 함유할 수 있다. 시럽 및 엘릭시르는 감미제, 예를 들어 글리세롤, 소르비톨 또는 수크로스를 사용하여 제형화 될 수 있다. 상기 제형은 완화제, 보존제, 착향제 또는 착색제를 또한 함유할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 살균한 주사가능 제제, 예를 들어 살균한 주사가능 수성 또는 유성 현탁액의 형태로 존재할 수 있다. 상기 현탁액은 본원에 언급했던 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 살균한 주사가능 제제는 무독성의 비경구적으로 허용가능한 희석제 중 살균한 주사가능 용액 또는 현탁액, 또는 용매, 예를 들어 1,3-부탄-디올 중 용액일 수 있거나 또는 동결건조 분말로서 제조될 수 있다. 허용가능한 비히클 및 사용될 수 있는 용매는 물, 링거액 및 등장 식염 용액이다. 또한, 살균한 고정유는 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용될 수 있다. 상기 목적을 위해, 임의의 완하성 지방유 (bland fixed oil) 는 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함하여 사용될 수 있다. 또한, 지방산, 예를 들어 올레산이 주사제의 제조에 또한 사용될 수 있다.
단일 투여 형태를 생성하기 위해서 담체 물질과 함께 조합할 수 있는 활성 성분의 양은 치료된 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 다를 것이다. 예를 들어, 인간에게 경구 투여를 하기 위한 시간-방출 제형은 약 5 ~ 약 95% 의 총 조성물 (중량:중량) 으로 다양할 수 있는 적절하고 편리한 양의 담체 물질과 혼합되는 대략 1 ~ 1000 ㎎ 의 활성 물질을 함유할 수 있다. 약학적 조성물은 투여를 위해 용이하게 측정가능한 양을 제공하기 위해 제조될 수 있다. 예를 들어, 정맥 내 주입을 위한 수성 용액은 약 30 mL/hr 의 속도로 적합한 부피의 주입이 발생할 수 있도록 하기 위해서 용액의 밀리리터 (㎖) 당 약 3 ~ 500㎍ 의 활성 성분을 함유할 수 있다.
눈에 투여하기에 적합한 제형은 활성 성분이 적합한 담체, 특히 활성 성분을 위한 수성 용매 중 용해되거나 또는 현탁되어 있는 점안액을 포함한다. 활성 성분은 0.5 ~ 20%, 유리하게는 0.5 ~ 10% 특히 약 1.5% w/w 의 농도로 바람직하게는 상기 제형 중 존재한다.
입 안으로 국소투여하기에 적합한 제형은 향미 기제의 활성 성분을 포함하는 약용 캔디 (lozenges), 일반적으로 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트; 불활성 기재의 활성 성분을 포함하는 사탕형 알약 (pastilles), 예를 들어 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아; 및 적합한 액체 담체 중 활성 성분을 포함하는 구강청결제를 포함한다.
직장 투여를 위한 제형은 적합한 기제, 예를 들어 코코아 버터 또는 살리실산염을 포함하는 기제를 갖는 좌제로서 제공될 수 있다.
폐내 또는 비강 투여에 적합한 제형은 입도, 예를 들어 0.1 ~ 500㎛ 의 범위 (0.5㎛, 1㎛, 30㎛, 35㎛ 등과 같이 증가하는, 0.1 내지 500㎛ 의 범위 내의 입도를 포함함) 를 갖고, 폐포에 도달하기 위해서 비강을 통한 빠른 흡입 또는 입을 통한 흡입에 의해서 투여된다. 적합한 제형은 활성 성분의 수성 또는 유성 용액을 포함한다. 분무 또는 건조 분말 투여에 적합한 제형은 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있고, 본원에 기재된 바와 같은 감염의 치료 또는 예방에 있어서 종전에 사용된 화합물과 같은 기타 치료적 작용제와 함께 전달될 수 있다.
질 투여에 적합한 제형은 페서리, 탐폰, 크림, 젤, 페이스트, 발포 또는 분무 제형으로서, 적절한 것으로 당업계에 공지된 상기 담체에 활성성분을 첨가한 제형으로서 제공될 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제형은 항산화제, 완충제, 세균발육억제제 및 의도하는 수용체의 혈액과 함께 등장성 제형을 제공하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 살균 주사 용액; 및 현탁제 및 농조화제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 살균 현탁액을 포함한다.
제형은 단위-투여 또는 다중-투여 용기, 예를 들어 밀봉된 앰플 및 바이알로 제공될 수 있고, 사용하기 직전에 살균한 액체 담체, 예를 들어 주사용수의 첨가만을 필요로 하는 동결 건조된 (감압 하에 동결건조함) 상태로 저장될 수 있다. 임시 주사 용액 및 현탁액은 앞서 기재된 종류의 살균한 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다. 바람직한 단위 투여 형태는 본원에 상기 인용한 바와 같이 활성 성분의 일일 투여 (daily dose) 또는 단위 일일 하위-투여 (unit daily sub-dose), 또는 적절한 이의 분획을 함유하는 형태일 수 있다.
특히 상기 언급한 성분에 대한 첨가에 있어서, 조합 화합물 및/또는 기타 활성 성분의 제형은 문제의 제형의 유형과 관련하여 당업계에서 통상적인 기타 작용제를 포함할 수 있고, 예를 들어 경구 투여에 적합한 제형은 착향제를 포함할 수 있다는 것이 이해되어 질 것이다.
조합 화합물 및 기타 활성 성분은 덜 빈번하게 투여하게끔 활성 성분의 조절 방출을 제공하거나 또는 활성 성분의 약동학 또는 독성 프로파일을 개선하기 위해서 또한 제형화 될 수 있다. 따라서, 본 발명은 지속 또는 조절 방출을 위해 제형화 된 둘 이상의 조합 화합물을 포함하는 조성물을 또한 제공한다.
투여량
활성 성분의 유효량은 적어도 치료할 병상의 성질, 독성, 화합물이 예방적으로 (더 낮은 투여량) 또는 활성 질환 또는 병상에 대항해 사용되는지 여부, 전달 방법 및 약학적 제형에 따라 달라지고, 통상적인 투여량의 단계적 확대 (escalation) 연구를 사용하여 임상의에 의해서 결정될 수 있다.
예로서, 본 발명의 조성물 (예를 들어, 정제) 은 유효량을 제공하기 위해 제형화 될 수 있다. 예를 들어, 화합물 1, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염과 관련하여, 조성물은 1.0 ㎎ ~ 100 ㎎, 5 ㎎ ~ 40 ㎎, 30 ㎎ ~ 50 ㎎, 또는 20 ㎎ 또는 40 ㎎ 을 포함할 수 있고, 임의의 하나 이상의 화합물 2, 화합물 3, 화합물 6, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 과 조합하여 이를 필요로 하는 인간에게 일일 1 회 이상 투여되도록 조정될 수 있다. 화합물 2, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염과 관련하여, 조성물은 25 ㎎ ~ 800 ㎎, 50 ㎎ ~ 400 ㎎, 또는 60 ㎎ ~ 300 ㎎ 또는 70 ㎎ ~ 200 ㎎ 을 포함할 수 있거나 또는 150 ㎎ 일 수 있고, 임의의 하나 이상의 화합물 1, 화합물 3, 화합물 6, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 과 조합하여 이를 필요로 하는 인간에게 일일 1 회 이상 투여되도록 조정될 수 있다. 화합물 3, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염과 관련하여, 조성물은 10 ㎎ ~ 1000 ㎎, 또는 50 ~ 400 ㎎, 또는 100 ㎎ ~ 400 ㎎ 또는 200 ㎎ ~ 400 ㎎ 을 포함할 수 있고, 임의의 하나 이상의 화합물 1, 화합물 2, 화합물 6, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 과 조합하여 이를 필요로 하는 인간에게 일일 1 회 이상 투여되도록 조정될 수 있다. 화합물 4, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염과 관련하여, 조성물은 25 ㎎ ~ 400 ㎎ 또는 25 ㎎ ~ 200 ㎎ 을 포함할 수 있고, 임의의 하나 이상의 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 6, 화합물 5 및 화합물 7 과 조합하여 이를 필요로 하는 인간에게 일일 1 회 이상 투여되도록 조정될 수 있다. 화합물 5, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염과 관련하여, 조성물은 50 ㎎ ~ 1000 ㎎ 또는 100 ㎎ ~ 750 ㎎ 을 포함할 수 있고, 임의의 하나 이상의 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 6, 화합물 4, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 과 조합하여 이를 필요로 하는 인간에게 일일 1 회 이상 투여되도록 조정될 수 있다. 화합물 6, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염과 관련하여, 조성물은 1 ㎎ ~ 500 ㎎ 또는 3 ㎎ ~ 300 ㎎ 또는 3 ㎎ ~ 200 ㎎ 또는 3 ㎎ ~ 100 ㎎ 또는 10 ㎎ ~ 90 ㎎ 또는 30 ㎎ ~ 90 ㎎ 을 포함할 수 있고, 임의의 하나 이상의 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 과 조합하여 이를 필요로 하는 인간에게 일일 1 회 이상 투여되도록 조정될 수 있다. 화합물 7, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염과 관련하여, 조성물은 100 ㎍ ~ 3000 ㎎ 이하, 25 ㎎ ~ 2000 ㎎ 이하, 또는 50 ㎎ ~ 1000 ㎎ 이하를 포함할 수 있고, 임의의 하나 이상의 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 과 조합하여 이를 필요로 하는 인간에게 일일 1 회 이상 (예를 들어 일일 4회) 투여되도록 조정될 수 있다. 화합물 9 및 10, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염과 관련하여, 조성물은 하루 당 10 ㎎ ~ 1000 ㎎ 을 포함할 수 있다 (US 2010/0298257 에 따름). 화합물 11, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염과 관련하여, 조성물은 하루 당 1 ㎎ ~ 1000 ㎎ 을 포함할 수 있다 (US 2010/0081628 을 따름). 동시 투여되는 화합물 1-7 에 관한 투여량은 잠재적인 약물-약물 상호작용을 설명하기 위해 조정될 필요가 있을 수 있다. 예를 들어, 화합물 1 이 약물 대사 시스템에 영향을 미치는 것으로 나타나지 않았을지라도, 화합물 2 는 화합물 1 의 노출을 대략 2-3X 증가시키는 효과를 갖는 것으로 나타난다. 따라서, 화합물 1 이 화합물 2 와 병용되는 경우, 화합물 1 의 투여량 감소 (예를 들어 2x-3x) 를 예상할 수 있다. 화합물 16 과 조합하는 경우, 화합물 2 는 화합물 6 의 노출을 대략 5x 증가시키는 효과를 갖는 것으로 나타나고, 따라서 화합물 16 이 화합물 2 와 함께 투여되는 경우, 화합물 16 의 투여량 감소 (예를 들어 3x-5x) 를 예상할 수 있다. 따라서, 화합물 2 와 동시투여되는 경우, 화합물 6 의 10 ㎎ 투여량은 30 ㎎ 투여량과 비슷하다.
둘 이상의 조합 화합물은 단일 또는 다중 투여 (예를 들어 일일 2회, 약 400 ㎎, 500 ㎎ 또는 600 ㎎) 로, 하루 당 약 800 ㎎, 1000 ㎎ 또는 1200 ㎎ 의 양으로 리바비린과 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 조합의 용도
본 발명의 이들 양상의 실행에서, 조합 화합물은 상기 제시된 투여량으로 사용될 수 있다.
본 발명의 하나의 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 1 을 포함하고, 여기서 화합물 1 은 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물과 조합하여 사용된다. 제 2 화합물은 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5 또는 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 2 를 포함하고, 여기서 화합물 2 는 화합물 1, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물과 조합하여 사용된다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 3 을 포함하고, 여기서 화합물 3 은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물과 조합하여 사용된다. 제 2 화합물은 화합물 1 또는 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 4 를 포함하고, 여기서 화합물 4 는 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물과 조합하여 사용된다. 제 2 화합물은 화합물 1 또는 화합물 2 또는 화합물 3 또는 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 5 를 포함하고, 여기서 화합물 5 는 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물과 조합하여 사용된다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 6 을 포함하고, 여기서 화합물 6 은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물과 조합하여 사용된다. 제 2 화합물은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3 또는 화합물 4 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 7 을 포함하고, 여기서 화합물 7 은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물과 조합하여 사용된다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 9 를 포함하고, 여기서 화합물 9 는 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6, 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물과 조합하여 사용된다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 10 을 포함하고, 여기서 화합물 10 은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6, 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물과 조합하여 사용된다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 11 을 포함하고, 여기서 화합물 11 은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6, 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물과 조합하여 사용된다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 12 를 포함하고, 여기서 화합물 12 는 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6, 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물과 조합하여 사용된다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 13 을 포함하고, 여기서 화합물 13 은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6, 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물과 조합하여 사용된다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 14 를 포함하고, 여기서 화합물 14 는 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6, 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물과 조합하여 사용된다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 15 를 포함하고, 여기서 화합물 15 는 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6, 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물과 조합하여 사용된다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 16 을 포함하고, 여기서 화합물 16 은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6, 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물과 조합하여 사용된다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 1 을 포함하고, 여기서 화합물 1 은 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물 및 제 3 화합물과 조합하여 사용된다. 제 2 화합물은 화합물 3, 또는 화합물 4, 또는 화합물 5 또는 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 2 를 포함하고, 여기서 화합물 2 는 화합물 1, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물 및 제 3 화합물과 조합하여 사용된다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 3 을 포함하고, 여기서 화합물 3 은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물 및 제 3 화합물과 조합하여 사용된다. 제 2 화합물은 화합물 1 또는 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 4 를 포함하고, 여기서 화합물 4 는 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물 및 제 3 화합물과 조합하여 사용된다. 제 2 화합물은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3 또는 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 2 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 3 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 5 를 포함하고, 여기서 화합물 5 는 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물 및 제 3 화합물과 조합하여 사용된다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 6 을 포함하고, 여기서 화합물 6 은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물 및 제 3 화합물과 조합하여 사용된다. 제 2 화합물은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3 또는 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 2 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 3 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 7 을 포함하고, 여기서 화합물 7 은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물 및 제 3 화합물과 조합하여 사용된다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 9 를 포함하고, 여기서 화합물 9 는 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물 및 제 3 화합물과 조합하여 사용된다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 10 을 포함하고, 여기서 화합물 10 은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물 및 제 3 화합물과 조합하여 사용된다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 11 을 포함하고, 여기서 화합물 11 은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물 및 제 3 화합물과 조합하여 사용된다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 1 을 포함하고, 여기서 화합물 1 은 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물 및 제 3 화합물 및 제 4 화합물과 조합하여 사용된다. 제 2 화합물은 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 또는 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 2 를 포함하고, 여기서 화합물 2 는 화합물 1, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물 및 제 3 화합물 및 제 4 화합물과 조합하여 사용된다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 3 을 포함하고, 여기서 화합물 3 은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물 및 제 4 화합물과 조합하여 사용된다. 제 2 화합물은 화합물 1 또는 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 4 를 포함하고, 여기서 화합물 4 는 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물 및 제 4 화합물과 조합하여 사용된다. 제 2 화합물은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3 또는 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 2 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 3 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 5 를 포함하고, 여기서 화합물 5 는 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물 및 제 4 화합물과 조합하여 사용된다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 6 을 포함하고, 여기서 화합물 6 은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물 및 제 4 화합물과 조합하여 사용된다. 제 2 화합물은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3 또는 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 2 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 3 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 7 을 포함하고, 여기서 화합물 7 은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물 및 제 4 화합물과 조합하여 사용된다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 9 를 포함하고, 여기서 화합물 9 는 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물 및 제 4 화합물과 조합하여 사용된다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 10 을 포함하고, 여기서 화합물 10 은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물 및 제 4 화합물과 조합하여 사용된다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 11 을 포함하고, 여기서 화합물 11 은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물 및 제 4 화합물과 조합하여 사용된다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 1 을 포함하고, 여기서 화합물 1 은 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물, 제 4 화합물 및 제 5 화합물과 조합하여 사용된다. 제 2 화합물은 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5 또는 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 2 를 포함하고, 여기서 화합물 2 는 화합물 1, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물, 제 4 화합물 및 제 5 화합물과 조합하여 사용된다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 3 을 포함하고, 여기서 화합물 3 은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물, 제 4 화합물 및 제 5 화합물과 조합하여 사용된다. 제 2 화합물은 화합물 1 또는 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 4 를 포함하고, 여기서 화합물 4 는 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물, 제 4 화합물 및 제 5 화합물과 조합하여 사용된다. 제 2 화합물은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3 또는 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 2 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 3 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염 치료 방법에 사용하기 위한 화합물 5 를 포함하고, 여기서 화합물 5 는 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물, 제 4 화합물 및 제 5 화합물과 조합하여 사용된다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염의 치료 방법에서 사용하기 위한 화합물 6 을 포함하는데, 여기서 화합물 6 은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물, 제 4 화합물 및 제 5 화합물과의 조합으로 사용된다. 제 2 화합물은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3 또는 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 2 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 3 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염의 치료 방법에서 사용하기 위한 화합물 7 을 포함하는데, 여기서 화합물 7 은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물, 제 4 화합물 및 제 5 화합물과의 조합으로 사용된다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염의 치료 방법에서 사용하기 위한 화합물 9 를 포함하는데, 여기서 화합물 9 는 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물, 제 4 화합물 및 제 5 화합물과의 조합으로 사용된다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염의 치료 방법에서 사용하기 위한 화합물 10 을 포함하는데, 여기서 화합물 10 은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물, 제 4 화합물 및 제 5 화합물과의 조합으로 사용된다.
본 발명의 또다른 양상은 HCV 감염의 치료 방법에서 사용하기 위한 화합물 11 을 포함하는데, 여기서 화합물 11 은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물, 제 4 화합물 및 제 5 화합물과의 조합으로 사용된다.
본 발명의 하나의 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 1 을 투여하는 것을 포함하고, 추가로 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 을 포함하여 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5 또는 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 2 를 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 3 을 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 1 또는 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 4 를 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 5 를 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 6 을 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3 또는 화합물 4 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV 를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 7 을 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 9 를 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 10 을 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 11 을 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 1 을 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물 및 제 3 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 3, 또는 화합물 4, 또는 화합물 5 또는 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 2 를 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물 및 제 3 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 3 을 투여하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물 및 제 3 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 1 또는 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 4 를 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물 및 제 3 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3 또는 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 2 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 3 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 5 를 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물 및 제 3 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 6 을 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물 및 제 3 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3 또는 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 2 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 3 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 7 을 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물 및 제 3 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 9 를 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물 및 제 3 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 10 을 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물 및 제 3 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 11 을 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물 및 제 3 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 1 을 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물 및 제 4 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 또는 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 2 를 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물 및 제 4 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 3 을 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물 및 제 4 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 1 또는 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 4 를 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물 및 제 4 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 또는 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 2 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 2 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 3 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 5 를 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물 및 제 4 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 6 을 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물 및 제 4 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 또는 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고, 제 3 화합물은 화합물 2 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 3 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 7 을 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물 및 제 4 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 9 를 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물 및 제 4 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 10 을 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물 및 제 4 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 11 을 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물 및 제 4 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 1 을 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물, 제 4 화합물 및 제 5 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5 또는 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 2 를 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물, 제 4 화합물 및 제 5 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 3 을 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물, 제 4 화합물 및 제 5 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 1 또는 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 4 를 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물, 제 4 화합물 및 제 5 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3 또는 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 2 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 3 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 5 를 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물, 제 4 화합물 및 제 5 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 6 을 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물, 제 4 화합물 및 제 5 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 제 2 화합물은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 및 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 2 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 1 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 3 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 4 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 6 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 2 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다. 제 2 화합물은 화합물 3 일 수 있고 제 3 화합물은 화합물 4 일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 7 을 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 으로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물, 제 4 화합물 및 제 5 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 9 를 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물, 제 4 화합물 및 제 5 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 10 을 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물, 제 4 화합물 및 제 5 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법, HCV 를 진단받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법, 인간 대상체에서 HCV를 치료하는 방법, 및 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함하는데, 각각의 방법은 화합물 11 을 투여하는 것을 포함하고 추가로 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 5, 화합물 6 및 화합물 7 로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 제 2 화합물, 제 3 화합물, 제 4 화합물 및 제 5 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
투여 경로 및 방식
화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 중 둘 이상 및 조합 요법의 임의의 다른 성분은, 치료하고자 하는 병상에 적절한 임의의 경로로 투여되기에 적합화될 수 있다. 적합한 경로는 경구, 직장내, 비강, 국소 (협 및 설하 포함), 질 및 비경구 (피하, 근육내, 정맥내, 피내, 척추 강내 및 경막외) 등을 포함한다. 바람직한 경로는 예를 들어 수용자의 상태에 따라 변화될 수 있는 것으로 여겨질 것이다.
활성 성분이 하기와 같을 때 상조적 효과가 얻어질 수 있다: (1) 동시-제형화 (예를 들어 단일 투여 형태) 및 투여되거나, 조합 제형으로 동시에 전달됨; (2) 별도의 제형으로서 교대로 또는 병행하여 전달됨; 또는 (3) 일부 다른 양생법에 의함. 교대 요법으로 전달되는 경우, 화합물이 순서대로, 예를 들어 별도의 정제, 알약 또는 캡슐로 또는 별도 주사기로의 상이한 주입에 의해 투여 또는 전달될 때 상조적 효과가 얻어질 수 있다. 일반적으로, 교대 요법 동안 각각의 활성 성분의 유효 투여량은 순차적으로, 즉 연속으로 투여되는 한편, 조합 요법에서는 둘 이상의 활성 성분의 유효 투여량이 함께 투여된다.
조합 화합물과 하나 이상의 조합 화합물의 동시-투여는 일반적으로, 둘 이상의 조합 화합물의 치료적 유효량이 환자 체내에 존재하도록 하는, 하나 이상의 조합 화합물의 동시 또는 순차적 투여를 나타낸다. 일부 경우에서, 조합 화합물 (예를 들어, 2, 3 또는 4 개의 조합 화합물) 은 동시 투여를 허용하기 위해 동시-제형화될 것이다. 일부 경우에, 동시-제형화된 조합 화합물은 하나 이상의 부가적 조합 화합물과 동시-제형화될 수 있다.
동시-투여는 또한 하나 이상의 기타 활성 성분의 단위 투여량의 투여 이전 또는 이후의 조합 화합물의 단위 투여량의 투여, 예를 들어 하나 이상의 기타 활성 성분의 투여 수 초, 분 또는 시간 이내에의 둘 이상의 조합 화합물의 투여를 포함한다. 예를 들어, 조합 화합물의 단위 투여량이 먼저 투여되고, 수 초 또는 분 이내에 제 2 조합 화합물의 단위 투여량의 투여가 뒤따르고, 수 초 또는 분 이내에 하나 이상의 기타 활성 성분의 단위 투여량의 투여가 뒤따를 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 기타 활성 성분의 단위 투여량이 먼저 투여되고, 수 초 또는 분 이내에 조합 화합물의 단위 투여량의 투여가 뒤따르고, 수 초 또는 수 분 이내에 제 2 조합 화합물의 단위 투여량의 투여가 뒤따를 수 있다. 일부 경우에, 먼저 조합 화합물의 단위 투여량을 투여하고, 수 시간의 기간 이후 (예를 들어 1-12 시간) 제 2 조합 화합물의 단위 투여량의 투여가 뒤따르고, 수 시간의 기간 이후 (예를 들어 1-12 시간) 하나 이상의 기타 활성 성분의 단위 투여량의 투여가 뒤따르는 것이 바람직할 수 있다. 기타 경우에, 먼저 하나 이상의 기타 활성 성분의 단위 투여량이 투여되고, 수 시간의 기간 이후 (예를 들어 1-12 시간) 조합 화합물의 단위 투여량의 투여가 뒤따르고, 수 시간의 기간 이후 (예를 들어 1-12 시간) 제 2 조합 화합물의 단위 투여량의 투여가 뒤따르는 것이 바람직할 수 있다. 셋 이상의 조합 화합물이 하나 이상의 부가적 활성 성분과 함께 투여되는 경우, 조합 화합물은 서로 수 초, 분 또는 시간 (예를 들어 1-12 시간) 내에 차례로 투여될 수 있고, 하나 이상의 부가적 활성 성분은 조합 화합물의 투여 이전, 도중 또는 이후에 투여될 수 있다. 조합 화합물이 동시-제형화되는 경우, 이는 하나 이상의 부가적 활성 성분의 투여와 동시에, 또는 이전 또는 이후에 투여될 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 조합 요법은 함께 또는 별도로, 순차적으로 또는 동시에 그리고 서로 가까운 시간에 또는 먼 시간에 투여된, 각각의 활성 성분과 별도의 투여 형태로 투여될 수 있다.
치료 과정은 예를 들어 약 12 주 로부터 약 48 주로, 또는 더 길게, 예를 들어 약 12 주 로부터 약 24 주로 연장될 수 있다.
본 발명은 제한 없이 구역질, 구토, 식욕 부진, 피로, 황달, 구토, 설사, 탈수, 복통, 간경변을 포함하는 인간의 HCV 감염 증상 하나 이상을 개선하기 위한 치료적 유효 성분의 조합을 포함한다. 또한, 일부 HCV 감염된 개인에서 조합 요법의 사용은 감염된 사람의 신체에 존재하는 HCV 바이러스성 입자의 바이러스 부하를 통계적으로 유의한 양으로 감소시키는데 유효하다. 예를 들어, 바이러스 부하는 예를 들어 COBAS TaqMan HCV 검정 (Roche Molecular Systems) 을 사용해 혈장 HCV RNA 수준을 측정함으로써 측정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명에 따라 조합 화합물을 사용해 치료 받는 HCV 감염된 인간은 HCV 감염과 관련된 증상 중 하나 또는 모두의 개선을 경험한다.
리바비린은 갖지만 인터페론은 갖지 않는 조합 화합물 둘 이상의 조합
상기 논의된 바와 같이, 일부 현재 HCV 치료는 인터페론의 투여를 포함하나, 이러한 치료는 전형적으로 원치 않는 부작용을 산출한다. 따라서, 인터페론의 투여를 필요로 하지 않는 효과적 HCV 치료를 찾는 것이 바람직할 것이다.
본 발명의 하나의 양상은 하나 이상의 인터페론의 투여 없이, 둘 이상의 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 리바비릴을 투여하는 것을 포함하는 HCV 의 처를 위한 조성물, 방법, 용도 등을 제공한다. 이러한 본 발명의 양상은 이것이 하나 이상의 인터페론의 투여와 관련된 부작용 없이 HCV 의 유효한 치료를 허용하기 때문에 특히 유용할 수 있다.
본 발명의 한 양상에서, 리바비린 및 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 임의로 하나 이상의 부가적 작용제의 조합량은 HCV 감염을 치료하는데 유효하다.
본 발명의 또다른 양상은 하기를 포함하는, 인간의 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법을 포함한다: 하나 이상의 인터페론의 동시 투여 없이 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 리바비린 중 둘 이상을 투여하는 것. 이와 관련하여, 본 발명은 하나 이상의 인터페론을 투여하는 것에 관한 잠재력을 배제하지 않는다. 더욱이 본 발명은 실제로 하나 이상의 인터페론을 포함하는 또다른 요법과 결합하여 사용될 수 있다. 본 발명의 양상은 하나 이상의 인터페론을 필요로 하지 않는 리바비린에 의한 HCV 의 효과적인 치료를 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 하기를 포함하는, HCV 를 진단 받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법을 포함한다: 하나 이상의 인터페론 없이 둘 이상의 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 리바비린을 투여하는 것.
본 발명의 또다른 양상은 본질적으로 둘 이상의 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염과 결합된 리바비린의 투여로 이루어지는, 인간 대상체에서 HCV 를 치료하기 위한 방법을 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 하기를 포함하는, 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함한다: 하나 이상의 인터페론의 동시 투여 없이, 둘 이상의 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 리바비린을 투여하는 것.
유사하게, 본 발명의 또다른 양상은 하나 이상의 인터페론 없이 둘 이상의 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 리바비린을 포함하는 인간에서의 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하기 위한 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 포함한다. 본 발명의 또다른 양상은 하나 이상의 인터페론 없이, 둘 이상의 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 리바비린을 포함하는 HCV 를 진단 받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키기 위한 조성물을 포함한다. 본 발명의 또다른 양상은 본질적으로 둘 이상의 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염과 함께 리바비린으로 이루어지는, 인간 대상체에서 HCV 를 치료하기 위한 조성물을 포함한다. 본 발명의 또다른 양상은 둘 이상의 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 리바비린-기반 HCV 요법을 위한 조성물을 포함하고, 단 상기 조성물은 하나 이상의 인터페론을 포함하지 않는다. 본 발명의 또다른 양상은 하나 이상의 인터페론 없이, 둘 이상의 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 리바비린을 포함하는, 동시투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 조성물을 포함한다.
유사하게, 본 발명의 또다른 양상은 하기를 포함한다: 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 경감시키기 위한 약제의 제조에서 하나 이상의 인터페론 없이, 둘 이상의 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 리바비린의 사용; 및 HCV 를 진단 받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키기 위한 약제의 제조에서 하나 이상의 인터페론 없이, 둘 이상의 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 리바비린의 사용; 및 인간 대상체에서 HCV 를 치료하기 위한 약제의 생산에서 둘 이상의 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염과 함께 리바비린의 사용 (상기 사용은 하나 이상의 인터페론의 사용을 포함하지 않음); 및 리바비린-기반 HCV 요법을 위한 약제의 제조에서 둘 이상의 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 사용 (상기 사용은 하나 이상의 인터페론의 투여를 회피함); 및 동시투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키기 위한 약제의 제조에서 하나 이상의 인터페론 없이, 둘 이상의 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 리바비린의 사용.
본 발명의 또다른 양상은 리바비린 및 둘 이상의 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조합을 포함하고, 이 조합은 실질적으로 하나 이상의 인터페론이 없다. 한 양상에서, 조합은 함께 또는 별도로, 순차적으로 또는 동시에 그리고 서로 가까운 시간에 또는 먼 시간에 투여된, 각각의 활성 성분과 별도의 투여 형태로 발생할 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 하기를 포함하는 키트를 포함한다: 리바비린, 둘 이상의 조합 화합물 및 치료, 바이러스 부하 감소, 또는 HCV 의 개시 또는 진전의 지연을 위한 치료 양생법에 관한 지시사항 (여기서 치료 양생법은 하나 이상의 인터페론의 투여 없이 둘 이상의 조합 화합물 및 리바비린의 투여를 포함함). 한 구현예에서, 상기 키트는 또한 포장, 예컨대 블리스터 팩을 포함할 수 있다. 대안적으로 상기 키트는 포장된 약품과 별도로 각각의 성분의 투여량 및 개별적 처방전을 제공할 수 있지만, 치료, 바이러스 부하의 감소 또는 HCV 의 개시 또는 진전의 지연을 위한 치료 양생법에 관한 지시사항과 조합되는 경우에 상기는 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 의도된다.
본 발명의 또다른 양상은 하기를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다: 리바비린; 둘 이상의 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체. 한 구현예에서, 약학적 조성물은 단일 투여 형태일 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 리바비린과의 조합 요법은 투여된 각각의 활성 성분 (조합 화합물을 포함함) 과 별도의 투여 형태로 투여될 수 있고, 함께 (예를 들어 단위 투여 형태, 예컨대 정제) 또는 별도로, 순차적으로 또는 동시에 그리고 서로 가까운 시간에 또는 먼 시간에 투여될 수 있다. 별도로 투여되는 경우, 각각의 화합물은 기타(들) 의 투여와 동시에, 또는 이전 또는 이후에 기타(들) 과 함께 투여될 수 있다. 활성 성분은 매일 투여될 수 있다. 한 구현예에서, 활성 성분의 매일 투여량은 날마다 별도의 하위-투여량, 예컨대 1 회, 2 회 3 회 또는 4 회로 투여된다. 유리하게는, 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 리바비린의 매일 투여량은 날마다 1 회 투여될 수 있다.
비록 본 발명이 하나 이상의 인터페론 없이 둘 이상의 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염; 및 리바비린을 투여하는 것을 포함하는 HCV 의 치료를 위한 조성물, 방법, 용도 등을 포함할지라도, 본 발명은 인간에게 하나 이상의 인터페론을 투여하는 것에 관한 잠재력을 배제하지는 않는다. 더욱이 본 발명은 실제로 하나 이상의 인터페론을 포함하는 또다른 지침을 위한 또다른 요법과 함께 사용될 수 있다.
둘 이상의 조합 화합물과 리바비린 및 인터페론의 조합
본 발명의 또다른 양상은 HCV 의 치료를 위해 둘 이상의 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 리바비린 및 하나 이상의 인터페론을 투여하는 것을 포함하는, 조성물, 방법, 용도 등을 제공한다. 더 많은 인터페론의 투여는 조합 화합물 및 리바비린의 투여와 시간적 관계일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 둘 이상의 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 리바비린, 및 하나 이상의 인터페론을 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법을 포함한다. 본 발명의 또다른 양상은 하기를 포함하는 HCV 를 진단 받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법을 포함한다: 둘 이상의 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염과 함께 리바비린 및 하나 이상의 인터페론의 투여.
본 발명의 또다른 양상은 둘 이상의 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염과 함께 리바비린 및 하나 이상의 인터페론의 투여를 포함하는, 리바비린-기반 HCV 요법의 방법을 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 하기를 포함하는 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법을 포함한다: 둘 이상의 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염과 함께 리바비린 및 하나 이상의 인터페론의 투여.
본 발명의 또다른 양상은 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하기 위한 약제의 제조에서, 둘 이상의 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 리바비린, 및 하나 이상의 인터페론의 용도를 포함한다. 본 발명의 또다른 양상은 HCV 를 진단 받은 인간에서 바이러스 부하를 감소시키기 위한 약제의 제조에서의, 둘 이상의 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염과 함께 리바비린 및 하나 이상의 인터페론의 용도를 포함한다. 본 발명의 또다른 양상은 인간 대상체에서 HCV 를 치료하기 위한 약제의 제조에서의 둘 이상의 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염과 함께 리바비린의 용도를 포함하고, 여기서 상기 용도는 하나 이상의 인터페론의 용도를 포함한다. 본 발명의 또다른 양상은 리바비린-기반 HCV 요법을 위한 약제의 제조에서의, 둘 이상의 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 포함하는데, 여기서 상기 용도는 하나 이상의 인터페론의 투여를 포함한다. 본 발명의 또다른 양상은 동시 투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키기 위한 약제의 제조에서의, 둘 이상의 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 리바비린, 및 하나 이상의 인터페론의 용도를 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 리바비린 및 둘 이상의 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조합을 포함하는데, 이 조합은 하나 이상의 인터페론을 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 하기를 포함하는 키트를 포함한다: 리바비린, 둘 이상의 조합 화합물 및 하나 이상의 인터페론; 및 치료, 바이러스 부하의 감소 또는 HCV 의 개시 또는 진전의 지연을 위한 치료 양생법에 관한 지시사항, 여기서 상기 치료 양생법은 둘 이상의 조합 화합물 및 리바비린의 투여 및 하나 이상의 인터페론의 투여를 포함함. 한 양상에서, 상기 키트는 또한 포장, 예컨대 블리스터 팩을 포함할 수 있다. 대안적으로 상기 키트는 개별적 처방전 및 별도로 포장된 약품으로서 각각의 성분의 투여량을 제공할 수 있으나, 치료, 바이러스 부하의 감소 또는 HCV 의 개시 또는 진전의 지연을 위한 치료 양생법에 관한 지시사항과 결합되는 경우 상기는 본 발명의 범주 이내인 것으로 여겨진다.
본 발명의 또다른 양상은 하기를 포함하는 약학 조성물을 포함한다: 둘 이상의 조합 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 리바비린, 및 하나 이상의 인터페론; 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체. 한 양상에서, 약학적 조성물은 단일 투여 형태일 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 리바비린 및 하나 이상의 인터페론을 갖는 조합 요법은 환자에게 투여된 하나 이상의 인터페론과 별도의 투여 형태로 투여될 수 있고 조합 요법 (조합 화합물을 포함) 에 사용하고자 하는 잔여 활성 성분 각각은 함께 (예를 들어 단위 투여량 형태, 예컨대 정제) 또는 별도로, 순차적으로 또는 동시에 그리고 서로 가까운 시간에 또는 먼 시간에 투여된다. 별도로 투여되는 경우, 각각의 활성 성분은 기타(들) 의 투여와 동시에, 또는 상기 투여 이전 또는 이후에 기타(들) 과 투여될 수 있다. 활성 성분은 매일 투여될 수 있다. 한 구현예에서, 매일 투여량은 별도의 하위-투여량으로, 예컨대 매일 1 회, 2 회, 3 회 또는 4 회 투여된다.
부가적 치료를 포함한 조합 요법
또다른 구현예에서, 적합한 조합의 비제한적 예는 둘 이상의 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 화합물 6, 화합물 7, 화합물 9, 화합물 10, 화합물 11, 화합물 12, 화합물 13, 화합물 14, 화합물 15 및 화합물 16 과 하나 이상의 부가적 활성 성분 HCV NS3 프로테아제 저해인자, 알파-글루코시다제 1 저해인자, 헤파토프로텍탄트, HCV NS5B 폴리머라아제의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 저해인자, HCV NS5B 폴리머라아제의 비-뉴클레오시드 저해인자, HCV NS5A 저해인자, TLR-7 아고니스트, 시클로필린 저해인자, HCV IRES 저해인자, HCV 진입 저해인자, HCV 성숙 저해인자, HCV 조립 저해인자, HCV 감염 저해인자 및 약물동력학적 강화제, 및 HCV 의 치료를 위한 기타 약물의 조합을 포함한다. 더욱 구체적으로는, 본 발명의 하나 이상의 화합물은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물과 조합될 수 있다:
(i) HCV NS3 프로테아제 저해인자, 예를 들어, 보세프레비르 (SCH-503034, SCH-7), 텔라프레비르 (VX-950), TMC-435 (IUPAC N-[(2R,3aR,10Z,11aS,12aR,14aR)-2-[2-(4-이소프로필티아졸-2-일)-7-메톡시-8-메틸퀴놀린-4-일옥시]-5-메틸-4,14-디옥소-1,2,3,3a,4,5,6,7,8,9,11a,12,12a,13,14,14a-헥사데카히드로시클로펜타[c]시클로프로파[g][1,6]디아자시클로테트라데신-12a-일카르보닐]시클로프로판술폰아미드], ABT-450, ACH-1625, ACH-2684, BI-201335, BI-1230, MK-5172, MK-7009, SCH-900518, VBY-376, VX-500, GS-9256, GS-9451, BMS-605339, PHX-1766, AS-101, YH-5258, YH-5530, YH-5531, 및 ITMN-191 (R-7227);
(ii) 알파-글루코시다제 1 저해인자, 예를 들어, 셀고시비르 (MX-3253), UT-231B, 미그리톨 (Miglitol);
(iii) 헤파토프로텍탄트, 예를 들어, 에메리카산 (emericasan) (IDN-6556), ME-3738, 실리빌린 및 MitoQ;
(iv) HCV NS5B 폴리머라아제의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 저해인자, 예를 들어, R1626, R7128 (R4048), IDX184, IDX-102, PSI-661, PSI-938, PSI-7851, PSI-7977, BCX-4678, 발로피시타빈 (NM-283), MK-0608 및 TMC649128;
(v) HCV NS5B 폴리머라아제의 비-뉴클레오시드 저해인자, 예를 들어, 필리부비르 (PF-868554), ABT-333, ABT-072, BI-207127, VCH-759, VCH-916, JTK-652, MK-3281, VBY-708, VCH-222, A848837, ANA-598, GL60667, GL59728, A-63890, A-48773, A-48547, BC-2329, VCH-796 (네스부비르), GSK625433, BILN-1941, 및 XTL-2125;
(vi) HCV NS5A 저해인자, 예를 들어, ACH-2928, AZD-2836 (A-831), AZD-7295 (A-689), BMS-766, BMS-790052, BMS-824393, 및 PPI-461;
(vii) TLR-7 아고니스트, 예를 들어, 이미퀴모드, 852A, ANA-773, ANA-975, AZD-8848 (DSP-3025), PF-04878691, 및 SM-360320 및 화합물 8;
(viii) 시클로필린 저해인자, 예를 들어, DEBIO-025, SCY-635, 및 NIM811;
(ix) HCV IRES 저해인자, 예를 들어, MCI-067;
(x) 약물동력학적 강화제, 예를 들어 록시트로마이신, BAS-100, SPI-452, PF-4194477, TMC-41629;
(xi) HCV 진입 저해인자
(xii) HCV 조립 저해인자;
(xiii) HCV 성숙 저해인자;
(xiv) HCV 감염 저해인자; 및
(xv) HCV 의 치료를 위한 기타 약물, 예를 들어, 티모신 알파 1 (Zadaxin), 니타족사니드 (Alinea, NTZ), BIVN-401 (virostat), PYN-17 (altirex), KPE02003002, 액틸론 (actilon) (CPG-10101), KRN-7000, 시바시어 (civacir), GI-5005, XTL-6865, BIT225, PTX-111, ITX2865, TT-033i, ANA 971, NOV-205, 타르바신, EHC-18, VGX-410C, EMZ-702, AVI 4065, BMS-650032, BMS-791325, 바비툭시맵 (Bavituximab), MDX-1106 (ONO-4538), 오글루파니드 (Oglufanide), FK-788, 및 VX-497 (메리메포딥 (merimepodib)).
합성예
화합물 1, 2, 3, 6, 7 및 8 의 제조를 위한 합성 프로토콜은 문헌에 공지되어 있다. 부가적으로, 조합 화합물 각각의 제조를 위한 합성 프로토콜이 아래 실시예에 제공되어 있다.
화합물 1 은 US7,754,720 에 기재된 것과 같은 합성 방법 및 중간체를 사용하여 제조될 수 있다. 화합물 1 은 또한 하기 실시예에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
실시예 1: 5-({6-[2,4-비스(트리플루오로메틸)페닐]피리다진-3-일}메틸)-2-(2-플루오로페닐)-5H-이미다조[4,5-c]피리딘 1.
Figure pct00021
Figure pct00022
화합물 103 을 디메톡시에탄 (DME) 에 용해시켰다. 이러한 용액에 2,4-비스(트리플루오로메틸)페닐보론산 105 를 첨가하고, 2N Na2CO3 수용액을 첨가하였다. 생성된 2상 혼합물에 Pd(PPh3)4 를 첨가하고 반응물을 이후 72 시간 동안 80 ℃ 에서 가열하였다. 반응물을 실온으로 냉각시키고 셀라이트를 통해 여과하고 셀라이트를 EtOAc 로 세척하였다. 여과액을 진공 하에 농축시켰다. 잔여물을 MeOH/CH2Cl2 를 사용하여 6 g 의 SiO2 에서 정제하여, 화합물을 용출시켰다. 이에 따라 수득된 화합물을 PPh3(O) 로 오염시켰다. 생성물을 1% 단계로 0 → 5 % MeOH/CH2Cl2 를 사용하여 1 mm 크로마토트론 플레이트 (Chromatotron plate) 에서 재정제하였다. 순수한 분획을 합치고, 진공 하에 농축시킨 후, 12 시간 동안 고진공 하에 건조시켰다. 11.8 mg 의 화합물 1 의 유리 염기를 PPh3 오염 없이 수득하였다.
Figure pct00023
중간체 화합물 104 를 하기와 같이 제조하였다.
a. 화합물 102 의 제조
Figure pct00024
Figure pct00025
CHCl3 중 시판되는 출발 물질 101 의 용액에, 60 ℃ 에서 트리클로로이소시아누르산 (TCCA) 를 첨가하였다. 이후 용액을 1.5 시간 동안 교반하고, 냉각하고, HiFlo-셀라이트로 여과하였다. 여과액을 농축하고, 진공 하에 건조하였다. 화합물 102 를 5.037 g 수득하였다.
b. 화합물 104 의 제조
Figure pct00026
Figure pct00027
DMF (디메틸포름아미드) 중 화합물 103 의 용액에, NaOH 를 첨가하였다. 화합물 102 를 DMF (20 ml) 에 용해시키고, 상기 용액에 천천히 첨가하였다. 반응물을 3 시간 동안 교반하고, 물로 희석시키고, EtOAc 로 추출하였다. 유기 층을 Na2SO4 로 건조시켰다. 용매를 제거하고, 생성물을 디클로로메탄으로 재결정화하였다. 5.7 g 의 화합물 103 을 수득하였다.
USSN 12/202319 (US 20100051763 A1) 에 기재된 것과 같은 합성 방법 및 중간체를 사용하여 화합물 2 를 제조할 수 있다. 화합물 2 를 또한 하기 실시예에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
실시예 2: 화합물 2 의 제조
Figure pct00028
CH3CN (240 mL) 에 포스피네이트 에스테르 206 (23.7 g, 24.05 mmol) 을 용해시키고 0 ℃ 로 냉각시켰다. 요오도트리메틸실란 (17.4 mL, 122.3 mmol) 을 빠른 적가 속도로 첨가하고, 10 분 후 2,6-루티딘 (17.0 mL, 146.4 mmol) 을 적가하였다. 반응 혼합물을 천천히 실온으로 가온하고, 1 시간 동안 교반한 후 다시 0 ℃ 로 냉각시키고, 2,6-루티딘 (11.1 mL, 95.6 mmol) 이후 MeOH (24 mL) 을 첨가하였다. 용액을 진공 하에 농축시키고, 미정제 잔여물을 HPLC 로 정제하여, 12.68 g 의 화합물 2 를 55% 수율로 수득하였다.
Figure pct00029
중간체 화합물 206 을 하기와 같이 제조하였다.
a. 화합물 203 의 제조
Figure pct00030
THF (136 mL) 에 화합물 201 (17.42 g, 28.30 mmol) 을 용해시키고 0 ℃ 로 냉각시켰다. 용액에 N-메틸모르폴린 (4.7 mL, 42.7 mmol) 을 첨가하였다. 0 ℃ 에서 10 분 이후, i-부틸클로로포르메이트 (4.05 mL, 30.96 mmol) 를 적가하였다. 부가적 1 시간 이후, (1-아미노-2-비닐-시클로프로필)-(2,6-디플루오로-벤질)-포스핀산 에틸 에스테르 202 (8.94 g, 29.70 mmol) 를 THF (20 mL) 중의 용액으로서 천천히 첨가하였다. 현탁액을 실온으로 가온하고, 2 시간 이후 이를 H2O (400 mL) 및 에틸아세테이트 (200 mL) 사이에서 분할하였다. 수성 층을 에틸아세테이트 (200 mL x 2) 로 추출하고 합쳐진 유기 층을 HCl (1N, 225 mL) 및 H2O (200 mL) 로 추출하였다. 산 세척 및 수성 세척물을 합치고, 에틸아세테이트 (175 mL x 2, 100 mL x 2) 로 다시 추출하였다. 합쳐진 유기 층을 염수 (400 mL) 로 세척하고, Na2SO4 로 건조시키고, 진공 하에 농축시켜, 25.06 g 의 디엔 203 을 98.5 % 미정제 수율로 산출하였다. LCMS (M + 1): 898.06.
b. 화합물 204 의 제조.
Figure pct00031
화합물 203 (12.91 g, 14.36 mmol) 을 CH2Cl2 (1440 mL) 에 용해시키고, 용액을 30 분 동안 탈기시켰다. 용액을 40 ℃ 로 가열하고, Grubb's G1 촉매 (2.95 g, 3.59 mmol) 를 첨가하였다. 반응물을 17 시간 동안 환류시킴에 따라 트리스-히드록시메틸포스핀 (22.3 g, 18.0 mmol), TEA (50 mL, 35.9 mmol) 및 H2O (400 mL) 을 첨가하고 반응 혼합물을 부가적 16 시간 동안 환류를 위해 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 두 층을 분리하였다. 유기 층을 H2O (400 mL) 및 염수 (300 mL) 로 세척하고, MgSO4 로 건조시키고 농축하였다. 미정제 잔여물을 실리카-겔 크로마토그래피로 정제하여 8.30 g 의 마크로시클릭 올레핀 204 를 66% 수율로 수득하였다. LCMS (M + 1): 870.09.
c. 화합물 205 의 제조
Figure pct00032
마크로시클릭 올레핀 204 (7.34 g, 8.42 mmol) 를 에틸아세테이트 (105 ml) 에 용해시키고, 로듐/알루미늄 (5 중량%, 2.945 g, 0.40 중량%) 을 첨가하였다. 시스템을 비우고, H2 (1 atm, 3x) 로 플러시 (flush) 하였다. 시스템에, 3 시간 후에 더 많은 로듐/알루미늄 (5 중량%, 842 mg, 0.10 중량%) 을 첨가하고, 비우고, H2 (1 atm, 3x) 로 플러시하였다. 부가적 1 시간 이후, 현탁액을 여과하고 진공 하에 농축시켜, 6.49 g 의 환원된 마크로사이클 205 를 88% 미정제 수율로 산출하였다. LCMS (M + 1): 872.04.
d. 화합물 206 의 제조.
Figure pct00033
N-메틸피롤리디논 (25.0 mL) 에 브로실레이트 마크로사이클 205 (6.49 g, 7.67 mmol) 을 용해시키고, 8-클로로-2-(2-이소프로필아미노-티아졸-4-일)-7-메톡시-퀴놀린-4-올 207 (2.564 g, 7.33 mmol) 이후 Cs2CO3 (4.40 g, 13.50 mmol) 을 첨가하였다. 혼합물을 6 시간 동안 65 ℃ 로 가열한 후, 에틸아세테이트 (200 mL) 로 희석하고, LiCl (5%, 250 mL) 로 세척하였다. 수성 층을 에틸아세테이트 (100 mL x 2) 로 추출하고, 합쳐진 유기 층을 염수 (150 mL) 로 세척하고 Na2SO4/MgSO4 로 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 미정제 잔여물을 실리카-겔 크로마토그래피 (에틸아세테이트-메탄올) 를 통해 정제하여, 4.39 g 의 아미노티아졸 206 을 58% 수율로 수득하였다. LCMS (M + 1): 985.28.
중간체 화합물 201 을 하기와 같이 제조할 수 있다.
Figure pct00034
Figure pct00035
e. 화합물 209 의 제조
화합물 208 (7.00 g, 28.55 mmol) 및 DABCO (5.13 g,45.94 mmol) 을 톨루엔 (30 mL) 에 용해시켰다. 브로실클로라이드 (10.22 g, 40.01 mmol) 의 톨루엔 (11 mL) 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응물을 EtOAc (210 mL) 로 희석시키고 0.5N HCl (200 mL) 을 첨가하였다. 2 개의 층을 분리하고 수성 층을 EtOAc (2 x 200 mL) 로 추출하였다. 합쳐진 유기 층을 염수 (200 mL) 로 세척하고, Na2S04 로 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 미정제 생성물을 콤비-플래시 (combi-flash) 로 정제하여, 12.23 g 의 화합물 209 을 92% 의 수율로 산출하였다.
f. 화합물 210 및 212 의 제조
화합물 209 (12.2 g, 26.3 mmol) 를 4 N HCl / 1,4-디옥산 (60 mL) 으로 처리하고 1 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하고, 20 분 동안 진공 하에 건조하였다. 화합물 210 의 미정제 아민 HCl 염을 DMF (150 mL) 에 용해시키고, 산 211 (14.2 g, 52.6 mmol) 을 첨가하였다. HATU (20.0 g, 52.6 mmol) 및 NMM (13.5 g, 131.5 mmol) 을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응물을 EtOAc (300 mL) 로 희석하고, 1 N HCl (200 mL), 포화 NaHCO3, 염수로 세척하고, Na2SO4 로 건조시키고, 농축하였다. 미정제 생성물을 콤비-플래시로 정제하여, 15.1 g 의 화합물 212 를 93% 수율로 수득하였다.
g. 화합물 213 의 제조
CH2Cl2 (50 mL) 중 212 (12.8 g, 20.7 mmol) 의 용액에 1,4-디옥산 (50 mL, 200 mmol) 중 4N HCl 을 첨가하였다. 반응 혼합물을 2 시간 동안 실온에서 교반하고, 농축하고 20 분 동안 진공 하에 건조한 후, CH3CN (50 mL) 에 용해시켰다. H20 (50 mL) 중 포화 NaHCO3 을 첨가하고, 5 분 동안 교반하였다. 새로 제조된 THF (50mL) 중 시클로펜틸클로로포르메이트를 첨가하였다. 반응을 1 시간 이내에 완료하였다. 용매를 감압 하에 제거하고, 잔여물을 EtOAc 로 희석하였다. 혼합물을 1 N HCl 을 사용해 pH = 2 로 만들고 두 개의 층을 분리하였다. 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4 로 건조하고, 여과하고, 농축하여, 미정제 화합물 213 (3.18 g) 을 산출하였다.
h. 화합물 201 의 제조.
미정제 에스테르 213 (3.18 g, 5.07 mmol) 을 THF (25 mL), H2O (25 mL) 에 용해시키고, 이후 MeOH (6 mL) 및 LiOH (660 mg, 25.4 mmol) 을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하고 EtOAc 로 희석하였다. 반응 혼합물을 1 N HCl 을 사용하여 pH 2 로 산성화시키고, 두 개의 층을 분리하였다. 수성 층을 EtOAc (2 x) 로 추출하였다. 합쳐진 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4 로 건조시키고, 농축하고, 진공 하에 건조시켜, 3.09 g 의 산 201 을 산출하였다.
중간체 8-클로로-2-(2-이소프로필아미노-티아졸-4-일)-7-메톡시-퀴놀린-4-올 207 이 하기와 같이 제조될 수 있다.
Figure pct00036
i. 8-클로로-4-히드록시-7-메톡시퀴놀린-2-카르복실산 215 의 제조
MeOH: THF 의 1:1 혼합물 (총 160 mL) 중 메틸 8-클로로-4-히드록시-7-메톡시퀴놀린-2-카르복실레이트 214 (36.5g, 0.145 mol) 의 용액에, H20 (80 mL) 중 LiOH (30.5 g, 0.725 mol) 의 용액을 첨가하였다. LCMS 분석이 카르복실산으로의 완전을 전환을 나타낼 때 혼합물을 실온에서 한 시간 동안 교반하였다. 휘발 물질의 제거 및 수성 6N HCl 을 사용한 용액의 pH 의 6 으로의 조절에 의해 반응을 종결하였다. 생성된 찐득한 잔여물을 여과하고, 2 일 동안 동결 건조기에서 건조시켜, 34.4 g (99.6 %) 의 화합물 215 를 백색 고체로서 산출하였다. EI MS (mlz) 253.9 [M+H].
j. 2-(2-디아조-l-옥소)-8-클로로-7-메톡시퀴놀린-4-일 이소부틸 카르보네이트 216 의 제조.
THF (400 mL) 중 8-클로로-4-히드록시-7-메톡시퀴놀린-2-카르복실산 215 (10.2 g, 0.04 mol) 의 용액에, 아르곤 분위기 하에 0 ℃ 에서 트리에틸 아민 (12.3 mL, 0.088 mol) 및 i-부틸클로로포르메이트 (11.6 mL, 0.088 mol) 를 첨가하였다. LCMS 분석이 원하는 혼합 무수물을 제공하기 위한 반응의 완료를 입증할 때 혼합물을 1 시간 동안 0 ℃ 에서 교반하였다. EI MS (mlz) 454.0 [M+H]. 무수물의 반응 혼합물에 0 ℃ 에서 플라스틱 깔대기를 통해 디에틸 에테르 중 디아조메탄 (121 mL, 0.121 mol) 의 1M 용액을 첨가하였다. 이러한 혼합물을 교반시키면서, 부가적 2 시간 동안 실온까지 가온시켰다. LCMS 에 의한 혼합물의 분석은 반응의 완료를 입증하였다. 격막을 제거하고, 반응물을 부가적 20 분 동안 교반한 후, 용매를 제거하였다. 잔여물을 추가로 고진공 하에 건조시켜, 화합물 216 을 산출하였고, 이는 다음 단계로 보냈다. EI MS (m/z) 377.9 [M+H].
k. 8-클로로-2-(2-(이소프로필아미노)티아졸-4-일)-7-메톡시퀴놀린-4-올 207 의 제조.
THF (268 mL) 중 0 ℃ 에서 2-(2-디아조-l-옥소)-8-클로로-7-메톡시퀴놀린-4-일 이소부틸 카르보네이트 216 (15.2 g, 0.040 mol) 의 냉각 용액에 15 분에 걸쳐 48% HBr (23 mL, 0.201 mol) 를 천천히 첨가하였다. LCMS 분석이 완전한 반응을 입증하는 경우 용액을 0 ℃ 에서 부가적 40 분 동안 교반하였다. 수성층의 pH 의 9 로의 조절을 위한 0 ℃ 에서의 수성 1N NaOH (180 mL) 의 첨가에 의해 반응을 종결하였다. 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc (2 x 200 mL) 으로 세척하였다. 합쳐진 유기 추출물을 염수로 세척하고 MgSO4 로 건조하였다. 용매를 진공 하에 제거하여, 17.7 g 의 황색 고체를 산출하였다. EI MS (m/z) 431.9 [M+H].
상기 반응으로부터 수득된 브로모케톤의 용액을 i-프로판올 (270 mL) 및 이소프로필이소우레아 (9.4 g, 0.080 mol) 에 현탁시켰다. 반응 혼합물을 32 시간 동안 72 ℃ 에서 가열하였다. 반응물의 LCMS 분석은 원하는 생성물로의 완전한 전환을 입증하였다. 반응물을 실온으로 냉각시켜, 생성물이 용액으로부터 침전되게 하였다. 반응물을 12 시간 동안 0 ℃ 로 추가로 냉각시킨 후, 여과하였다. 여과액을 에테르로 세척하고, 동결 건조기에서 건조시켜, 8.03 g 화합물 207 을 오렌지색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00037
화합물 3 은 USSN 12/215,605 (US 20090257978 A1) 에 기재된 것과 같은 합성 방법 및 중간체를 사용하여 제조될 수 있다. 화합물 3 은 또한 하기 실시예에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
실시예 3: 화합물 3 의 제조
Figure pct00038
화합물 315 (12 g, 13 mmol) 을 THF (200 ml) 에 용해시키고, H2O (200 ml) 중 LiOH (11g, 260 mmol) 을 첨가한 후, MeOH (200 ml) 을 첨가하였다. 혼합물을 20 시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응의 완료시에, 0 ℃ 에서 H2O 중 4N HCl 을 첨가하여, pH 를 7 로 조절하였다. 혼합물을 EtOAc (2 x 400 ml) 로 추출하였다. 합쳐진 유기 층을 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축하여, 화합물 3 을 황색 고체로서 (11 g, 93%) 수득하였다. LC/MS =　911.52(M++1).
Figure pct00039
중간체 화합물 315 를 하기와 같이 제조하였다.
Figure pct00040
a. 화합물 301 의 제조
건조를 위해, 아르곤 퍼징된 3-넥 둥근 바닥 플라스크 (1000 mL) 에 무수 디클로로메탄 (100 mL) 및 Et2Zn (28 mL, 273 mmol) 을 0 ℃ 에서 첨가하였다. (주의: 아르곤의 공급원은 바늘로부터 올 수 없음. 적절한 유리 어댑터만을 사용할 것. 과다한 압력이 생성되는 것을 방지하기 위해 제 2 발포기가 또한 플라스크에 부착될 수 있음). 이후 시클로펜텐-3-올 (10.0 mL, 119 mmol) 을 플라스크에 적가 (다량의 에탄 기체가 생성됨) 하고, 반응 혼합물을 기체의 발생이 멈출 때까지 교반시켰다. 디요오도메탄 (22 mL, 242 mmol) 을 이후 30 분의 기간에 걸쳐 적가하였다. 반응물을 실온으로 가온시키고, 아르곤의 확실한 흐름 (positive flow) 하에 밤새 교반을 지속하였고, 이 지점에서 TLC 분석은 출발 알코올의 완전한 소멸을 나타냈다. 반응물을 이후 CH2Cl2 로 희석시키고, 2M HCl (백색 침전물이 완전히 용해되어야 함) 로 켄칭하였다. 2상 혼합물을 분별 깔대기에 붓고, 유기 층을 수집하였다. 화합물 301 을 함유하는 물질 100 mL 가 남을 때까지 용매를 감압 하에 제거하였다.
b. 화합물 302 의 제조
플라스크에 무수 디클로로메탄 (525 mL) 을 첨가한 후, 트리에틸아민 (34 mL, 245 mmol) 을 적가하였다. 질소의 확실한 흐름 하에 실온에서 반응물을 계속 교반시켰고, 이 지점에서 디숙신이미딜카르보네이트 (40.7 g, 159 mmol) 를 플라스크에 분획으로 첨가하였다. TLC 분석이 출발 물질의 완전한 소멸을 나타낼 때까지 반응물을 계속 교반시켰다 (2-3 일). 완료시에, 반응 혼합물을 1M HCl (200 mL x 2) 로 켄칭하고, H20 (200 mL x 2) 로 세척하였다. 원하는 물질을 CH2Cl2 를 사용해 추출하고, 합쳐진 유기 층을 무수 MgSO4 를 사용해 건조시키고, 실리카 플러그에 통과시켰다. 용매를 감압 하에 제거하고, 미정제 물질을 플래시 크로마토그래피 (Rf = 0.33, 1:1 Hex/EtOAc) 를 사용해 정제하여, 화합물 302 (22 g, 75%) 를 산출하였다.
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
c. 화합물 304 의 제조
기계적 교반기 및 추가 깔대기를 갖는 2 L 3-넥 둥근 바닥 플라스크에서 N-t-Boc-시스-4-히드록시-L-프롤린 메틸 에스테르 303 (100.0 g, 407.7 mmol) 및 DABCO (1.5eq, 68.6g, 611.6 mmol) 을 무수 톨루엔 (200 mL) 에 용해시켰다. N2 하에 용액을 0 ℃ 로 냉각시킨 후, 300 mL 의 톨루엔 중 4-브로모-벤젠술포닐 클로라이드 (1.3eq, 135.6g, 530.0 mmol) 의 용액을 60 분에 걸쳐 첨가 깔대기를 통해 첨가하였다. 반응 혼합물을 교반하고, 실온에서 밤새 (16 시간) 가온하였다. 혼합물을 2L 1M Na2CO3 (수성)에 천천히 붓고, 생성물을 EtOAc (2L) 로 추출하였다. 유기 상을 0.5 N HCl (2L), H2O (1L), 및 염수 (1L) 로 세척하고, 이를 건조 (MgSO4) 시키고, 농축하여, 195.45 g 의 황색 유성 브로실레이트 생성물을 산출하였다.
상기 디클로로메탄 (300 mL) 중 브로실레이트 (407.7 mmol) 의 용액에 디옥산 중 4.0 M HCl (500 mL, 5eq) 을 천천히 첨가하고, 생성된 용액을 2 시간 동안 실온에서 교반하였다. 에테르 (500 mL) 를 반응 혼합물에 첨가한 후, 혼합물을 15 분 동안 교반하고, 백색 침전물을 여과에 의해 수집하였다. 고체를 에테르 및 헥산으로 세척한 후, 밤새 진공 하에 건조하여, 화합물 304 의 HCl 아민 염 153.0 g, 381.8 mmol 을 94 % 의 수율 (2 단계의 경우) 로 수득하였다.
d. 화합물 305 의 제조
DMF (200mL) 및 메틸렌 클로라이드 (200mL) 중 Boc-tert-부틸-글리신 (97.0g, 420.0 mmol) 의 용액에 실온에서 HATU (217.76g, 572.7 mmol) 및 Hunig's 염기 (126 mL, 1145.4 mmol) 를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 20 분 동안 교반한 후, 상기 DMF (200mL) 및 디클로로메탄 (200mL) 중 HCl 염 (153.0 g, 381.8 mmol) 및 Hunig's 염기 (126 mL, 1145.4 mmol) 의 용액을 상기 산 혼합물에 한 분획으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 3 시간 동안 LCMS 로 모니터링하면서 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시켜, 감압 하에 디클로로메탄을 제거하고, 형성된 백색 고체를 여과하였다. 잔여 DMF 용액을 에틸 아세테이트 (1L) 로 희석시키고, 순서대로 3% LiCl (수성) (3x650mL), 포화 NH4Cl (2x500mL), 0.5N HCl (수성) (2x600mL), 염수 (500mL), 포화 NaHCO3 (3x500mL), 및 염수 (500mL) 로 세척하였다. 생성된 유기 분획을 건조 (MgSO4) 시키고, 농축하여, 화합물 305 (111 g) 을 수득하였다.
e. 화합물 306 의 제조
THF (300 mL), MeOH (75 mL) 중 메틸 에스테르 305 (120 g, 207.8 mmol) 의 용액에, H2O (150 mL) 중 LiOH (26.18 g, 623.4 mmol) 의 용액을 첨가하였다. 용액을 4 시간 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 얼음-배쓰에서 냉각시키면서, 3N HCl 을 사용해 pH 약 5.5 로 산성화시키고, 10 분 동안 교반하고, 생성된 백색 고체를 여과에 의해 수집하였다. 고체를 더 많은 물, 에테르 및 헥산을 사용해 세척하였다. 고체를 밤새 40 ℃ 에서 진공 하에 건조하여, 95.78g (82%) 의 산 306 을 산출하였다.
f. 화합물 307 의 제조
DMF (200mL) 및 디클로로메탄 (200mL) 중 카르복실산 306 (81.4 g, 144.27 mmol) 의 용액에 실온에서 HATU (82.3g, 216.4 mmol) 및 Hunig's 염기 (47.5 mL, 432.8 mmol) 을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 20 분 동안 교반한 후에, DMF (200mL) 및 디클로로메탄 (200mL) 중 아민 (158.7 mmol) 및 Hunig's 염기 (47.5 mL, 1145.4 mmol) 의 용액을 상기 산 혼합물에 한 분획으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하고, LCMS 로 모니터링하였다. 혼합물을 감압 하에 농축시켜 디클로로메탄을 제거한 후에, 형성된 백색 고체를 여과하였다. 잔여 DMF 용액을 에틸 아세테이트 (600 mL) 로 희석시키고, 연속적으로 3% LiCl (수성) (2x550mL), 포화 NH4Cl (500mL), 1N HCl (수성) (500mL), 포화 NaHCO3 (500mL), 및 염수 (300mL) 로 세척하였다. 생성된 유기 분획을 건조 (Na2SO4) 시키고, 농축하여, 화합물 307 (111g) 을 수득하였다.
g. 화합물 308 의 제조.
화합물 307 을 실온에서 디옥산 (300 mL) 중 4N HCl 에 용해시키고, 2 시간 동안 교반하였다. 이를 이후 진공 하에 농축시키고, 디클로로메탄 (2 x 200mL) 와 동시-증발시켜, 건조시켰다. 잔여물을 EtOAc (600mL) 및 포화 수성 NaHCO3 (1L) 에 용해시켰다. 이를 강하게 교반시켰다. 10 분 이후, 카르본산 비시클로[3.1.0]헥-3-실 에스테르 2,5-디옥소-피롤리딘-1-일 에스테르 302 (41.4 g, 173.1 mmol) 을 한 분획으로 첨가하였다. 생성된 혼합물을 또다른 30 분 동안 교반한 후에, 유기 층을 수집하고, 염수 (500 mL) 로 세척하고, 건조 (Na2SO4) 시키고, 농축하였다. 미정제 생성물을 에틸 아세테이트/헥산을 사용해 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 94.44 g (92%) 의 화합물 308 을 수득하였다.
Figure pct00044
h. 화합물 310 의 제조
72 시간 동안 110 ℃ 에서 48% 수성 HBr (500 mL) 중에 1-(2-아미노-3-클로로-4-히드록시-페닐)-에타논 309 (70.7 g, 354 mmol) 을 교반하였다. 혼합물을 교반과 함께 0 ℃ 로 냉각시킨 후, 고체를 여과하고, 물로 세척하였다. 생성된 고체를 포화 NaHCO3 용액 (~350 mL) 과 함께 연마하고, 여과하고, 물로 세척하고, 진공 하에 건조하여, ~40 g (61%) 의 미정제 310 을 암갈색 고체로서 수득하였다. LC/MS = 186 (M++1).
i. 화합물 311 의 제조
1-(2-아미노-3-클로로-4-히드록시-페닐)-에타논 310 (40 g, 215 mmol) 을 DMF (360 ml) 에 용해시켰다. 세슘 카르보네이트 (140 g, 430 mmol) 를 첨가한 후, 브로모아세트알데히드 디메틸 아세탈 (54.5 g, 323 mmol) 을 첨가하였다. 혼합물을 이후 24 시간 동안 65 ℃ 에서 강하게 교반하였다. 실온으로 냉각되면, EtOAc (1 L) 및 H2O (1 L) 을 혼합물에 첨가하였다. 유기 층을 EtOAc (1 x 400 ml) 로 추출하였다. 합쳐진 유기 층을 수성 3% LiCl 용액 (2 x 1L), 염수로 세척하고, 건조 (Na2SO4) 시키고, 진공 하에 농축하였다. 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 화합물 311 을 백색 고체 (39 g, 67%) 로서 수득하였다.
j. 화합물 312 의 제조
피리딘 (150 ml) 중 1-[2-아미노-3-클로로-4-(2,2-디메톡시-에톡시)-페닐]-에타논 311 (13 g, 47.5 mmol) 및 이소프로필아미노티아졸-4-카르복실산 히드로브로마이드 (12.64 g, 47.5 mmol) 의 혼합물에 -40 ℃ 에서 인 옥시클로라이드 (9.47 g, 61.8 mmol) 를 천천히 첨가하였다. 혼합물을 이후 4 시간 동안 0 ℃ 에서 교반하였다. 반응이 완료되면, H2O (30 ml) 를 혼합물을 적가하였다. 혼합물을 이후 또다른 15 분 동안 0 ℃ 에서 교반하였다. 혼합물을 진공 하에 농축하였다. 잔여물을 EtOAc 로 희석시키고, 포화 NaHCO3 수용액으로 세척하였다. 유기 층을 건조 (Na2SO4) 하고, 진공 하에 농축시켰다. 잔여물을 CH2Cl2 에 용해시키고, 헥산을 용액에 천천히 첨가하였고, 황색 고체가 떨어지기 시작했다. 생성물이 모액에 별로 남지 않을 때까지 더 많은 헥산을 첨가하여, 화합물 312 (18 g, 85%) 을 산출하였다.
k. 화합물 313 의 제조
2-이소프로필아미노-티아졸-4-카르복실산 [6-아세틸-2-클로로-3-(2,2-디메톡시-에톡시)-페닐]-아미드 312 (18 g, 40.7 mmol) 를 톨루엔 (400 ml) 에 현탁시켰다. NaH (2.4 g, 61 mmol) 을 강하게 교반된 혼합물에 첨가하면서 H2 방출을 모니터링하였다. 혼합물은 환류를 위한 가열하는 동안에 맑아졌다. 반응은 3 시간 동안 환류한 후에 완료되었다. 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. H2O (3 vol) 중 AcOH (69.2 mmol) 의 용액을 혼합물에 첨가하였다. 0 ℃ 에서 1 시간 동안의 강한 진탕 후에, 고체를 여과에 의해 수집하고, H2O 로 헹구었다. 습식 케이크를 일정한 중량까지 고진공 하에 건조시켜, 화합물 313 (15 g, 86%) 을 제공하였다.
l. 화합물 314 의 제조.
NMP (200 ml) 중 브로실레이트 중간체 303 (15 g, 35 mmol) 및 화합물 313 (27.5 g, 38.5 mmol) 의 혼합물에 세슘 카르보네이트 (25.1 g, 77 mmol) 를 첨가하였다. 혼합물을 5 시간 동안 65 ℃ 에서 교반하였다. 반응물을 실온으로 냉각시키고, EtOAc (600 ml) 및 3% LiCl (600 ml) 의 수용액을 혼합물에 첨가하였다. 유기층을 수성 3% LiCl (1 x 600 ml), 염수로 세척하고, 건조 (Na2SO4) 시키고, 진공 하에 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 원하는 메틸 에스테르를 황색 고체로서 수득하였다 (23.6 g, 75%). LC/MS =　900.13(M++1).
m. 화합물 315 의 제조
빙초산 (200 mL) 에 메틸 에스테르 314 (23.6 g, 26 mmol) 을 용해시키고, H2O (75 ml) 중 1.4 N HCl 을 상기 용액에 첨가하였다. 혼합물을 1 시간 동안 60 ℃ 에서 교반하였다. 반응이 완료되면, 혼합물을 농축시켜, 용매를 제거하고, 톨루엔 (x 2) 과 동시 증발시켜, 잔여 아세트산을 제거하였다. 잔여물을 이후 EtOAc (500 ml) 및 포화 NaHCO3 수용액 (혼합물을 중화시키기에 충분함) 에 용해시키면서, CO2 방출을 모니터링하였다. 유기 층을 염수로 세척하고, 건조 (Na2SO4) 시키고, 진공 하에 농축하였다. 잔여물을 고진공 하에 1 시간 동안 추가 건조시키고, 다음 단계에 그대로 사용하였다. 미정제물을 CH2Cl2 (360 ml) 에 용해시키고, 모르폴린 (3.4 g, 39 mmol) 및 나트륨 트리아세톡시보로히드라이드 (7.2 g, 34 mmol) 을 0 ℃ 에서 혼합물에 첨가하였다. 빙초산 (0.47 g, 7.8 mmol) 을 혼합물에 적가하였다. 0 ℃ 에서 10 분 내에 반응이 완료되었다. 포화 NaHCO3 수용액을 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 또다른 20 분 동안 교반한 후에, 유기 층을 염수로 세척하고, 건조 (Na2SO4) 시키고, 진공 하에 농축하였다. 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여, 원하는 아민 생성물 315 를 황색 고체 (12 g, 50%) 로서 수득하였다. LC/MS =　924.63(M++1).
화합물 4 는 하기 실시예에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
실시예 4: 화합물 4 의 제조.
Figure pct00045
부분입체 이성질체 혼합물 414 를 헵탄 및 이소프로판올에 용해 (70%:30%, 4.5 mL 의 혼합 용매 중 230 mg) 시키고, 하기 조건 하에 키랄 컬럼 분리에 적용하였다:
컬럼: Chiralcel OD-H, 2 x 25 cm
용매 시스템: 70% 헵탄 및 30% 이소프로판올
흐름 속도: 6 mL/min.
실행 당 적재 부피: 2.5 mL
화합물 4 는 20 분의 체류 시간을 가졌다.
Figure pct00046
화합물 4 는 이후 x-선 품질 결정을 위해 MTBE 로부터 재결정화되었다.
화합물 4a 는 50 분의 체류 시간을 가졌다.
Figure pct00047
중간체 부분 입체 이성질체 혼합물 414 를 하기와 같지 제조하였다.
a. 화합물 402 의 제조.
Figure pct00048
메탄올 (300 mL) 중 화합물 401 (22.0 g, 54.9 mmol, J.O.C., 2004, 6257 에 기재된 과정에 따라 제조됨) 의 용액에, 30 분의 기간에 걸쳐 적하 깔대기를 사용해 0 ℃ 에서 아세틸 클로라이드 (22 mL) 를 적가한 후, 16 시간 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 농축하고, 에틸 아세테이트 (400 mL) 에 재용해시키고, 얼음-냉각된 2N NaOH 로 세척하고, 농축하여 건조시켜서, 미정제 메틸 에테르 402 를 오일로서 수득하였다. MS = 437.2 (M + Na+).
b. 화합물 403 의 제조.
Figure pct00049
메탄올 (300 mL) 중 화합물 402 의 용액에 메탄올 (20 mL, 10 mmol) 중 0.5 M 나트륨 메톡시드 용액을 첨가하고, 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. 반응물을 디옥산 (2.5 mL, 10 mmol) 중 4.0 N HCl 용액으로 켄칭하였다. 혼합물을 이후 농축하여, 미정제 화합물 403 을 수득하였다. MS = 201.0 (M + Na+).
c. 화합물 404 의 제조.
Figure pct00050
부착된 딘-스타크 트랩 (Dean-Stark trap) 을 사용하여, 톨루엔 (500 mL) 중 화합물 403, 트리트론 X-405 (수중 70%, 6.0 g), 50% KOH (수중, 85 g) 의 혼합물을 가열하여 환류시켰다. 25 ml 의 물을 수집한 1 시간 후에, 벤질 클로라이드 (33 g, 260 mmol) 를 첨가하고, 16 시간 동안 교반하면서 환류를 지속하였다. 혼합물을 이후 냉각시키고, 에틸 아세테이트 (400 mL) 와 물 (300 mL) 사이에 분할하였다. 유기 층을 물 (300 mL) 로 세척하고, 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (20% EtOAc /헥산) 로 정제하여, 메틸 에테르 404 를 오일로서 수득하였다 (22.0 g, 3 단계에서 89%).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ7.3 (m, 15H), 4.5-4.9 (m, 7H), 4.37 (m, 1H), 3.87 (d, 1H), 3.56 (m, 2H), 3.52 (s, 3H), 1.40 (s, 3H).
d. 화합물 405 의 제조.
Figure pct00051
아세트산 (110 mL) 중 404 (22.0 g, 49.0 mmol) 의 용액에, 3 M 황산 (4.8 g 의 농축 황산과 24 mL 의 물의 혼합에 의해 제조됨) 을 첨가하고, 8 시간 동안 70 ℃ 에서 교반하였다. 혼합물을 20 mL 의 부피까지 농축시키고, 에틸 아세테이트와 얼음-냉각된 2N NaOH 사이에서 분할하였다. 에틸 아세테이트 층을 농축하고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (~35% EtOAc/헥산) 로 정제하여, 화합물 405 를 오일로서 수득하였다 (17.0 g, 80%). MS = 457.2 (M + Na+).
e. 화합물 406 의 제조.
Figure pct00052
DMSO (135 mL) 중 화합물 405 (45 g, 104 mmol) 의 용액에 아세트산 무수물 (90 mL, 815 mmol) 을 실온에서 아르곤 하에 적가하였다. 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 교반한 후, 교반하면서 얼음-물 (1 L) 에 부었다. 얼음이 완전히 녹은 후에 (30 분), 에틸 아세테이트 (500 mL) 를 첨가하였다. 유기 층을 분리하였다. 추출 과정을 3 회 반복하였다 (3x500 mL). 유기 추출물을 합치고, 농축하였다. 잔여물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (20% EtOAc /헥산) 로 정제하여, 화합물 406 을 오일로서 수득하였다 (39 g, 88%).
Figure pct00053
f. 화합물 407 의 제조
Figure pct00054
건조, 아르곤 퍼징된 둥근 바닥 플라스크 (100 mL) 에 7-브로모-피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-4-일아민 (234 mg, 1.10 mmol) (WO2007056170 에 따라 제조) 및 무수 THF (1.5 mL) 를 첨가하였다. 이어서, TMSCl (276 ㎕, 2.2 mmol) 를 첨가하고 반응 혼합물을 2 시간 동안 교반하였다. 플라스크를 드라이아이스/아세톤 욕 (-78℃) 에 두고 BuLi (2.5 mL, 4.0 mmol, 헥산 중 1.6M) 를 적가하였다. 1 시간 후, THF 중 화합물 406 (432.5 mg, 1.0 mmol) 용액을 0℃ 로 냉각하고 이어서 반응 플라스크에 적가하였다. -78℃ 에서 교반 1 시간 후, 플라스크를 0℃ 로 가온시키고 포화 NH4Cl (5 mL) 을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 유기층을 EtOAc (3 x 10 mL) 를 이용하여 추출하고 결합된 유기 층을 MgSO4 를 이용하여 건조시켰다. 용매를 감압 하에 제거하고 미정제 물질을 플래시 크로마토그래피 (헥산 / EtOAc) 를 사용하여 정제하였다. 2 개의 아노머의 혼합물로서 화합물 407 의 560 mg (90 %) 을 단리하였다.
Figure pct00055
g. 화합물 408 의 제조
Figure pct00056
0℃ 에서 CH2Cl2 (20 mL) 중 화합물 407 (1 g, 1.77 mmol) 의 용액에, TMSCN (1.4 mL, 10.5 mmol) 및 BF3-Et2O (1 mL, 8.1 mmol) 을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃ 에서 0.5 시간 동안 교반하고, 이어서 추가 0.5 시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응을 0℃ 에서 NaHCO3 을 이용하여 켄칭하고 CH3CO2Et 를 이용하여 희석하였다. 유기 상을 분리하고, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 잔류물를 실리카 겔 상에서 크로마토그래피로 정제하고, CH3CO2Et-헥산 (1:1 내지 2:1) 를 이용하여 용리하여, 이성질체 혼합물로서 화합물 408 (620 mg, 61%) 을 제공하였다. MS = 576.1 (M + H+).
h. 화합물 409 의 제조
Figure pct00057
-78℃ 에서 CH2Cl2 (4 mL) 중 화합물 408 (150 mg, 0.26 mmol) 의 용액에, BCl3 (2 mL, CH2Cl2 중 1M) 를 첨가하였다. 반응 혼합물을 -78℃ 에서 1 시간 동안 교반하였다. TEA (2 mL) 및 MeOH (5 mL) 를 적가함으로써 반응을 -78℃ 에서 켄칭시켰다. 혼합물을 실온으로 가온시키고, 증발시키고, MeOH 를 이용하여 수회 공동-증발시켰다. 잔류물을 NaHCO3 (10 mL H2O 중 1 g) 를 이용하여 처리하고, 농축시키고 HPLC 로 정제하여 원하는 생성 화합물 409 (48 mg, 60%) 를 수득하였다.
Figure pct00058
다른 알파-아노머를 또한 수득하였다 (9 mg, 11%):
Figure pct00059
i. 화합물 412 의 제조
Figure pct00060
화합물 410 (상업적으로 입수가능, 4.99 g, 23.8 mmol) 을 디클로로메탄 (100 mL) 에 용해시키고 알라닌 이소프로필 에스테르 염화수소 411 (3.98 g, 23.8 mmol) 을 첨가하였다. 생성되는 투명 용액을 -78℃ 에서 30 분 동안 냉각시켰다. 트리에틸아민 (6.63 mL, 47.5 mmol) 을 15 분에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 실온으로 가온시켰다. 16 시간 후, 용매를 아르곤 스트림에 의해 제거하였다. 잔류물을 MTBE (25 mL) 에 재용해시키고 불용성 물질을 아르곤 하에서 여과에 의해 제거하였다. 여과물을 아르곤 스트림에 의해 응축시키고 미정제 생성물 412 를 추가의 정제 단계 없이 다음 반응에 사용하였다.
Figure pct00061
j. 화합물 413 의 제조
Figure pct00062
THF (20 mL) 및 트리메틸 포스페이트 (2.0 mL) 중 화합물 409 (1.03 g, 3.37 mmol) 용액에, 0℃ 에서 N-메틸 이미다졸 (1.5 g, 18.3 mmol) 을 첨가하였다. THF (3 mL) 중 화합물 412 (2.5 g, 8.18 mmol) 용액을 적가하였다. 생성 혼합물을 1.5 시간에 걸쳐 실온으로 가온시켰다. 에틸 아세테이트와 물로 분할시켰다. 에틸 아세테이트 층을 농축시키고 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (에틸 아세테이트 - 10% 에탄올 / 에틸 아세테이트) 로 정제하여, 1.15 g (59%) 의 화합물 413 을 인에서 1:1 부분입체이성질체 혼합물로서 수득하였다.
Figure pct00063
k. 화합물 414 의 제조.
Figure pct00064
아세토니트릴 (2 mL) 중 화합물 413 (175 mg, 0.305 mmol) 의 용액에, N,N-디메틸포름아미드 디메틸 아세탈 (41 ㎕, 0.34 mmol, 1.1 eq.) 을 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응을 완료하였다 (LCMS). 이어서, 혼합물을 건조 농축시켰다. 잔류물에 DCC (250 mg, 1.21 mmol, 4 eq.), 아세토니트릴 (5 mL) 및 이소부티르산 (55 mg, 58 ㎕, 2 eq.) 을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 48 시간 동안 교반하였다. 물 (0.2 mL) 및 트리플루오로아세트산 (0.1 mL) 을 0℃ 에서 첨가하고 실온에서 64 시간 동안 교반하였다. 중탄산나트륨 (500 mg) 을 0℃ 에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 0.5 시간 동안 교반하고 여과하였다. 여과액을 농축시키고 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (5% 메탄올 / 디클로로메탄), 144 mg (73%) 의 화합물 414 을 1:1 부분입체이성질체 혼합물으로서 인에서 수득하였다.
Figure pct00065
화합물 5 를 하기 실시예에서 기술된 바와 같이 제조하였다.
실시예 5: 화합물 5 의 제조: 5-(3,3-디메틸부트-1-인-1-일)-3-[(시스-4-히드록시-4-{[(3S)-테트라히드로푸란-3-일옥시]메틸}시클로헥실){[(1R)-4-메틸시클로헥스-3-엔-1-일]카르보닐}아미노]티오펜-2-카르복시산 5.
Figure pct00066
1-메틸-피롤리딘-2-온 (3 mL) 중 5-(3,3-디메틸-부트-1-이닐)-3-[((1R)-4-메틸-시클로헥스-3-엔카르보닐)-(1-옥사-스피로[2.5]옥트-6-일)-아미노]-티오펜-2-카르복시산 메틸 에스테르 508 (132 mg, 0.28 mmol) 및 (S)-테트라히드로-푸란-3-올 509 (247 mg, 2.8 mmol) 을 칼륨 tert-부톡시드 (251 mg, 2.24 mmol) 를 이용하여 처리하고, 40℃ 에서 16 시간 동안 가열 밀봉시켰다. 냉각 후 혼합물을 pH 3 이 될 때까지 2 M HCl 로 처리하고, 에틸 아세테이트과 물로 분할하고, 분리시켰다. 유기 층을 5% 염화리튬 용액, 물, 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 여과 및 농축 후, 잔류물을 CH3CN (0.1% TFA)/H2O(0.1% TFA) 을 이용하는 HPLC 로 정제하여 107 mg (70% 수율) 의 화합물 5 를 백색 분말로서 수득하였다: MS (m/z): 544.0 [M+H]+; HPLC 보유 시간 4.22 분 (2-98% 아세토니트릴: 물과 0.05% 트리플루오로아세트산).
중간체 화합물 508 을 하기와 같이 제조하였다.
Figure pct00067
a. 화합물 502 의 제조
디클로로메탄 (25 mL) 중 (S)-3-히드록시-4,4-디메틸디히드로푸란-2(3H)-온 (2.60 g, 20 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (5.2 mL, 30 mmol) 을 -10℃ 로 냉각시키고 아크릴로일 클로라이드 (2.03 mL, 25 mmol) 를 이용하여 적가 처리하고 2 h 동안 교반하였다. 1M HCl (20 mL) 를 첨가하고 유기 층을 중탄산나트륨 및 물로 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과시키고 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피 (10-40% EtOAc, 헥산) 로 2.09 g (57% 수율) 의 원하는 (S)-4,4-디메틸-2-옥소테트라히드로푸란-3-일 아크릴레이트 501 을 투명한 오일로서 수득하였다.
디클로로메탄 (17.5 mL) 및 헥산 (2.5 mL) 중에서 (S)-4,4-디메틸-2-옥소테트라히드로푸란-3-일 아크릴레이트 501 (2.05 g, 11.1 mmol) 를 -10℃ 로 냉각시키고 티탄 테트라클로라이드 (2.2 mL, 디클로로메탄 중 1 M, 2.2 mmol) 를 이용하여 처리하였다. 황색 용액을 15 분 동안 교반하고 이소프렌 (1.67 mL, 16.7 mmol) 을 이용하여 5 분에 걸쳐 적가 처리하였다. 2 시간 동안 교반 후, 이소프렌 (1.67 mL, 16.7 mmol) 의 부가적 부분을 첨가하고 반응 혼합물을 -10 내지 0℃ 에서 3.5 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 염화암모늄 (포화, 수성) 으로 켄칭시켰다. 물 및 에틸 아세테이트:헥산 (1:1) 을 첨가하였다. 유기 층을 분리하고 수성 층을 에틸 아세테이트:헥산 (1:1) 로 다시 추출하였다. 결합된 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과시키고 농축시켰다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피 (10-50% EtOAc:Hex, 80 g 컬럼) 로 정제하여 1.30 g (46% 수율) 의 (R)-((S)-4,4-디메틸-2-옥소테트라히드로푸란-3-일) 4-메틸시클로헥스-3-엔카르복실레이트 502 을 투명한 오일로서 수득하였다.
b. 화합물 503 의 제조
THF (10 mL), 물 (1 mL) 및 메탄올 (1 mL) 중에서 (R)-((S)-4,4-디메틸-2-옥소테트라히드로푸란-3-일) 4-메틸시클로헥스-3-엔카르복실레이트 502 (1.30 g, 5.15 mmol) 를 수산화리튬 일수화물 (2.16 g, 51.5 mmol) 로 처리하고 교반 하에 50℃로 가온시켰다. 1 시간 후, 반응 혼합물을 1M HCl 로 처리하였다. 혼합물을 헥산:THF (10:1) 로 추출하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 농축시켜 0.738 g (정량적 수율) 의 (R)-4-메틸시클로헥스-3-엔카르복시산 503 을 백색 분말로서 수득하였다.
c. 화합물 504 의 제조
Figure pct00068
톨루엔으로부터 증발에 의해 공비 건조된 (R)-4-메틸시클로헥스-3-엔카르복시산 503 (371 mg, 2.65 mmol) 을 제3인산칼륨 (1.13 g, 7.94 mmol) 으로 처리하고, 디클로로메탄 (7.6 mL) 중에서 현탁하고 디메틸포름아미드 (4 액적) 으로 처리하였다. 반응 혼합물을 0℃ 로 냉각하고 옥살릴 클로라이드 (0.75 mL, 7.9 mmol) 를 이용하여 적하 방식으로 처리하였다. 반응 혼합물을 2 시간 동안 교반하면서 주위 온도로 가온시켰다. 고체를 여과시킨 후, 용액을 농축시키고, 헥산으로 처리하고 다시 농축시켜 (R)-4-메틸시클로헥스-3-엔카르보닐 클로라이드 504 를 연한 황색 오일로서 수득하였고 이를 다음 단계에 즉시 사용하였다.
d. 화합물 506 의 제조
Figure pct00069
(R)-4-메틸시클로헥스-3-엔카르보닐 클로라이드 504 (2.65 mmol), 5-(3,3-디메틸-부트-1-이닐)-3-(1,4-디옥사-스피로[4.5]데크-8-일아미노)-티오펜-2-카르복시산 메틸 에스테르 505 (250 mg, 0.66 mmol) 및 제3인산칼륨 (562 mg, 2.65 mmol) 을 디클로로에탄 (1.7 mL) 에 현탁시키고, 캡으로 밀봉하고 90℃ 로 가열시켰다. 16 시간 후, 반응 혼합물을 냉각시키고 에틸 아세테이트와 물로 분할시켰다. 유기 층을 분리시키고 수성 층을 에틸 아세테이트로 다시 추출하였다. 결합된 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과시키고 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피 (10-40% EtOAc:헥산) 하여 220 mg (67% 수율) 의 원하는 5-(3,3-디메틸-부트-1-이닐)-3-[(1,4-디옥사-스피로[4.5]데크-8-일)-((1R)-4-메틸-시클로헥스-3-엔카르보닐)-아미노]-티오펜-2-카르복시산 메틸 에스테르 506 을 베이지색 포말로서 수득하였다.
e. 화합물 507 의 제조
Figure pct00070
5-(3,3-디메틸-부트-1-이닐)-3-[(1,4-디옥사-스피로[4.5]데크-8-일)-((1R)-4-메틸-시클로헥스-3-엔카르보닐)-아미노]-티오펜-2-카르복시산 메틸 에스테르 506 (219 mg, 0.438 mmol) 를 THF (3.5 mL) 에 용해시키고 4M HCl (1.75 mL, 7.01 mmol) 로 처리하였다. 반응 혼합물을 45℃ 로 가열시키고 2 h 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트를 첨가하고 이어서 유기 층을 분리하고 이어서 물, 중탄산나트륨 (sat aq), 물, 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 농축시켜 0.190 g (95% 수율) 의 원하는 5-(3,3-디메틸-부트-1-이닐)-3-[((1R)-4-메틸-시클로헥스-3-엔카르보닐)-(4-옥소-시클로헥실)-아미노]-티오펜-2-카르복시산 메틸 에스테르 507 를 백색 포말로서 수득하였다.
f. 화합물 508 의 제조
Figure pct00071
DMSO (1.5 mL) 중에서 트리메틸술폭소늄 클로라이드 (79 mg, 0.62 mmol) 를 수소화나트륨 (21 mg, 60% 오일 분산액, 0.53 mmol) 으로 처리하고 주위 온도에서 10 분 동안 교반하였다. THF (1 mL + 0.5 mL) 중에서 5-(3,3-디메틸-부트-1-이닐)-3-[((1R)-4-메틸-시클로헥스-3-엔카르보닐)-(4-옥소-시클로헥실)-아미노]-티오펜-2-카르복시산 메틸 에스테르 507 를 적하 방식으로 첨가하고 반응 혼합물을 45 분 동안 교반하였다. 오렌지색 용액을 pH 3 이 될 때까지 5% 시트르산으로 처리하고 물과 에틸 아세테이트로 분할시켰다. 유기 층을 분리시키고 수성 층을 에틸 아세테이트로 다시 추출하였다. 결합된 유기 층을 5% LiCl, 물 및 염수로 세척하고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 여과 및 농축 후, 잔류물을 플래시 크로마토그래피 (20-75% EtOAc:헥산) 로 정제하여 0.134 g (70% 수율) 의 5-(3,3-디메틸-부트-1-이닐)-3-[((1R)-4-메틸-시클로헥스-3-엔카르보닐)-(1-옥사-스피로[2.5]옥트-6-일)-아미노]-티오펜-2-카르복시산 메틸 에스테르 508 을 백색 분말로서 수득하였다.
화합물 6 을 USSN 12/779,023 (US 20100310512 A1) 에 기술된 바와 같은 합성 방법 및 중간체를 이용하여 제조하였다. 화합물 6 을 하기 실시예에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다.
실시예 6: (1-{3-[6-(9,9-디플루오로-7-{2-[5-(2-메톡시카르보닐아미노-3-메틸-부티릴)-5-아자-스피로[2.4]헵트-6-일]-3H-이미다졸-4-일}-9H-플루오렌-2-일)-1H-벤조이미다졸-2-일]-2-아자-바이시클로[2.2.1]헵탄-2-카르보닐}-2-메틸-프로필)-카르밤산 메틸 에스테르 6 의 제조
Figure pct00072
3-[6-(9,9-디플루오로-7-{2-[5-(2-메톡시카르보닐아미노-3-메틸-부티릴)-5-아자-스피로[2.4]헵트-6-일]-3H-이미다졸-4-일}-9H-플루오렌-2-일)-1H-벤조이미다졸-2-일]-2-아자-바이시클로[2.2.1]헵탄-2-카르복시산 tert-부틸 에스테르 614 (115 mg, 0.138 mmol) 를 메틸렌 클로라이드 (2 mL) 에 용해시키고 디옥산 (4M, 2 mL) 중 HCl 을 첨가하고 실온에서 교반을 지속하였다. 20 분 후, 모든 휘발성 물질을 진공 하에 제거하였다. 미정제 물질을 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. 미정제 물질을 DMF (1.5 mL) 에 용해시키고 DIEA (53.4 mg, 0.414 mmol) 를 첨가하였다. DMF (1 mL) 중 2-(L) 메톡시카르보닐아미노-3-메틸-부티르산 611 (24.2 mg, 0.138 mmol), HATU (52.4 mg, 0.138 mmol) 및 DIEA (17.8 mg, 0.138 mmol) 용액을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 교반하였다. 20 분 후, 반응물을 EtOAc 로 희석시키고 바이카르보네이트 수용액, LiCl 수용액 (5%), 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 진공 하에 용매를 여과하고 제거하여 미정제 물질을 생성하고, 이를 RP-HPLC (용리액: 물 / MeCN w/ 0.1% TFA) 로 정제하여 화합물 6 (76 mg) 을 수득하였다. LCMS-ESI+: C49H54F2N8O6 에 대한 계산치: 888.9 (M +); 측정치: 890.0 (M+H+).
Figure pct00073
중간체 화합물 614 를 하기와 같이 제조하였다.
Figure pct00074
a. 화합물 4-메틸렌-피롤리딘-1,2-디카르복시산 1-벤질 에스테르 2-메틸 에스테르 602 의 제조
4-메틸렌-피롤리딘-1,2-디카르복시산 1-tert-부틸 에스테르 601 (10.0 g, 44 mmol) 을 실온에서 MeOH (75 mL) 에 용해시키고 HCl (디옥산 중 4M, 75 mL) 을 첨가하였다. 실온에서의 교반을 4 시간 동안 지속하였다. 모든 휘발성 물질을 진공 하에 제거하고 베이지색 고체를 수득하였다. 미정제 물질을 메틸렌 클로라이드 (100 mL) 에서 현탁시키고 N-메틸 모르폴린 (13.3 g, 132 mmol) 을 첨가하였다. 혼합물을 0℃ 로 냉각시키고 벤질 클로로포르메이트 (8.26 g, 48.4 mmol) 를 교반하면서 첨가하였다. 30 분 후, 반응물을 실온으로 가온시키고 용액을 물 및 수성 HCl (1M) 으로 세척하였다. 용액을 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매를 여과시키고 증발시켜 미정제 생성물을 생성하고, 이를 실리카 겔 크로마토그래피 (용리액: EtOAc / 헥산) 로 정제하여 화합물 602 (10.2 g) 을 수득하였다. LCMS-ESI+: C15H17NO4에 대한 계산치: 275.3 (M +); 측정치: 276.4 (M+H+).
b. 화합물 603 및 604 의 혼합물의 제조
오븐-건조된 3목 둥근 바닥 플라스크에 질소 유입구 어댑터 및 250 mL 첨가 깔때기를 장착시켰다. 제 3 목을 격막으로 밀봉하였다. 플라스크를 교반 막대기, 디클로로메탄 (120 mL) 및 디에틸 아연 (헥산 중 1.0 M, 118 mL, 118 mmol) 을 넣고 이이서 빙욕 중에서 0℃ 로 냉각시켰다. 첨가 깔때기에 디클로로메탄 (40 mL) 및 트리플루오로아세트산 (9.1 mL, 118 mmol) 을 넣었다. 디에틸 아연 용액을 0℃ 로 냉각시킨 후 (약 25 분), 트리플루오로아세트산 용액을 20 분에 걸쳐 적하 방식으로 교반된 반응 혼합물에 첨가하였다. 0℃ 에서 20 분 동안 교반한 후, 디요오도메탄 (9.5 mL, 118 mmol) 을 4 분에 걸쳐 천천히 첨가하였다. 추가 20 분 후, 4-메틸렌-피롤리딘-1,2-디카르복시산 1-벤질 에스테르 2-메틸 에스테르 602 (8.10 g, 29.4 mmol) 를 캐뉼라에 의해 30 mL 디클로로메탄에 첨가하였다. 4-메틸렌-피롤리딘-1,2-디카르복시산 1-벤질 에스테르 2-메틸 에스테르를 함유하는 플라스크를 추가의 10 mL 디클로로메탄으로 헹구고 이 용액 또한 캐뉼라를 통해 반응 혼합물에 이동시켰다. 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고 110 시간 (약 5 일) 동안 교반한 후, 포화 수성 염화암모늄 (~150 mL) 을 이용하여 시약을 켄칭처리하였다. 플라스크의 내용물을 포화 수성 중탄산나트륨 (800 mL) 을 함유하는 2 L 분리 깔때기에 천천히 부었다. 수성 상을 300 mL 에틸 아세테이트로 3 회 추출하였다. 결합된 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고 농축시켜 화합물 603 및 604 의 혼합물을 수득하였다.
c. 화합물 603 의 제조
하위-부분 b 로부터의 미정제 물질을 3:1:1 THF/물/아세톤 (165 mL) 에 용해시키고 이어서 N-메틸모르폴린-N-옥시드 (3.45 g, 29.4 mmol) 및 오스뮴 테트라옥시드 (물 중 4 wt%, 5 mL, 0.818 mmol) 로 처리하였다. 실온에서 7 시간 동안 교반한 후, 시약을 1 M 수성 나트륨 티오술페이트 (~100 mL) 를 이용하여 켄칭처리하였다. 이어서, 플라스크의 내용물을 물 (~300 mL) 을 함유하는 1 L 분리 깔때기에 부었다. 수성 상을 300 mL 디클로로메탄으로 3 회 추출하였다. 결합된 유기물질을 황산마그네슘 상에서 건조시키고 농축시켰다. 미정제 잔류물 실리카 컬럼 크로마토그래피 (5% 내지 45% EtOAc/헥산) 로 정제하여 5-아자-스피로[2.4]헵탄-5,6-디카르복시산 5-벤질 에스테르 6-메틸 에스테르 603 을 투명한 오일로서 (5.54g, 19.15 mmol, 65%) 수득하였다.
Figure pct00075
d. 5-아자-스피로[2.4]헵탄-5,6-디카르복시산 5-벤질 에스테르 606 의 제조
5-아자-스피로[2.4]헵탄-5,6-디카르복시산 5-벤질 에스테르 6-메틸 에스테르 603 (244 mg, 0.840 mmol) 을 THF (2.0 mL) / MeOH (1.5 mL) 에 용해시켰다. LiOH (35.5 mg, 0.84 mmol) 의 수용액을 첨가하고 실온에서 교반을 지속하였다. 3 시간 후, 반응물을 수성 HCl (1M) 로 중성화하고 유기 용매를 진공 하에 제거하였다. 미정제 혼합물을 물 및 EtOAc 로 희석하고 유기 층을 수집하였다. 모든 휘발성 물질을 진공 하에 제거하고 미정제 산 606 을 추가의 정제 없이 사용하였다. LCMS-ESI+: C15H17NO4 에 대한 계산치: 275.3 (M +); 측정치: 276.3 (M+H+).
Figure pct00076
e. 2,7-디브로모-9,9-디플루오로-9H-플루오렌 608 의 제조
2,7-디브로모-플루오렌-9-온 607 (4.0 g, 11.8 mmol) 을 실온에서 데옥소플루오르 (12 mL) 에 현탁하고 EtOH (4 액적) 를 첨가하였다. 교반된 현탁액을 T = 90℃ 에서 24 시간 동안 가열시켰다 (주의: 상기 기술된 바와 같이 승온에서 데옥소플루오르를 사용하는 것은 주의를 기울여 신속히 작업하며 강렬한 발열반응이 발생할 수 있음). 반응물을 실온으로 냉각시키고 중탄산나트륨을 함유하는 얼음 위에 부었다. 고체가 형성되었으며 여과를 통해 이를 수집하였다. 미정제 물질을 EtOAc 로 채취하고 수성 HCl (1M) 및 염수로 세척하였다. 용액을 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매의 여과 및 증발로 미정제 생성물을 수득하였고, 이를 실리카 겔 크로마토그래피 (용리액: EtOAc / 헥산) 로 정제하여 화합물 608 (3.2 g) 를 수득하였다. 19F-NMR: 282 MHz, (dmso-d6) δ : -111.6 ppm. 다음 단계에 물질을 사용하기 전에, 이를 EtOAc 중 용액으로서 숯에 노출시켰다.
f. 5-아자-스피로[2.4]헵탄-5,6-디카르복시산 5-벤질 에스테르 6-[2-(7-브로모-9,9-디플루오로-9H-플루오렌-2-일)-2-옥소-에틸] 에스테르 609 의 제조
2,7-디브로모-9,9-디플루오로-9H-플루오렌 608 (372 mg, 1.04 mmol), Pd(PPh3)4 (30.0 mg, 0.026 mmol), PdCl2(PPh3)2 (18.2 mg, 0.026 mmol), As(PPh3)3 (5.0 mg) 을 아르곤 대기 하에서 디옥산 (10 mL) 에 용해시켰다. 에톡시비닐-트리부틸 주석 (376.4 mg, 1.04 mmol) 을 첨가하였다. 혼합물을 140 분 동안 85℃ 에서 가열시켰다 (오일 욕). 반응물을 실온으로 냉각시켰다. N-브로모 숙신이미드 (177 mg, 1.0 mmol) 이어서 물 (2 mL) 을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 3 시간 동안 교반하고, 이후, 대부분의 디옥산을 진공 하에 제거하였다. 미정제 반응 혼합물을 EtOAc 로 희석시키고 물로 세척하였다. 모든 휘발성 물질을 진공 하에 제거하였다. 톨루엔을 첨가하고 모든 휘발성 물질을 다시 한번 진공 하에 제거하였다. 미정제 물질을 실온에서 DMF / MeCN (2 mL, 1:1) 에 용해시켰다. MeCN (2 mL) 중에서 N-Cbz-4-시클로프로필 (L) 프롤린 606 (0.84 mmol) 및 DIEA (268 mg, 2.08 mmol) 용액을 첨가하고 실온에서 교반을 지속하였다. 14 시간 후, 대부분의 MeCN 을 진공 하에 제거하고 미정제 반응 혼합물을 EtOAc 로 희석시켰다. 혼합물을 수성 HCl (1M), 수성 LiCl 용액 (5%), 염수로 세척하고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매의 여과 및 증발로 미정제 반응 생성물을 수득하였고, 이를 실리카 겔 크로마토그래피 (용리액: EtOAc / 헥산) 를 통해 정제하여 화합물 609 (176 mg) 을 수득하였다. LCMS-ESI+: C30H24BrF2NO5 에 대한 계산치: 596.4 (M +); 측정치: 595.2 / 597.2 (M+H+).
g. 6-[5-(7-브로모-9,9-디플루오로-9H-플루오렌-2-일)-1H-이미다졸-2-일]-5-아자-스피로[2.4]헵탄-5-카르복시산 벤질 에스테르 610 의 제조
5-아자-스피로[2.4]헵탄-5,6-디카르복시산 5-벤질 에스테르 6-[2-(7-브로모-9,9-디플루오로-9H-플루오렌-2-일)-2-옥소-에틸] 에스테르 609 (172 mg, 0.293 mmol) 을 m-자일렌 (6.0 mL) 에 용해시켰다. 암모늄 아세테이트 (226 mg, 2.93 mmol) 를 첨가하고 반응물을 마이크로파 조건 하에서 140℃ 에서 60 분 동안 교반하였다. 반응물을 실온으로 냉각시키고 모든 휘발성 물질을 진공 하에 제거하였다. 미정제 물질을 실리카 겔 크로마토그래피 (용리액: EtOAc / 헥산) 로 정제하여 화합물 610 (80.3 mg) 을 수득하였다. LCMS-ESI+: C30H24BrF2N3O2에 대한 계산치: 576.4 (M +); 측정치: 575.2 / 577.2 (M+H+).
h. (1-{6-[5-(7-브로모-9,9-디플루오로-9H-플루오렌-2-일)-1H-이미다졸-2-일]-5-아자-스피로[2.4]헵탄-5-카르보닐}-2-메틸-프로필)-카르밤산 메틸 에스테르 612 의 제조
6-[5-(7-브로모-9,9-디플루오로-9H-플루오렌-2-일)-1H-이미다졸-2-일]-5-아자-스피로[2.4]헵탄-5-카르복시산 벤질 에스테르 610 (800 mg, 1.38 mmol) 을 메틸렌 클로라이드 (15 mL) 에 용해시키고 AcOH (37%, 2 mL) 중 HBr 을 첨가하고 실온에서 교반을 지속하였다. 180 분 후, 현탁액을 헥산으로 희석시키고 고체를 여과시켜 수집하고 헥산으로 세척하고 진공 처리하였다. 미정제 물질을 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. 미정제 물질을 DMF (4.0 mL) 에 용해시키고 DIEA (356 mg, 2.76 mmol) 를 첨가하였다. DMF (1 mL) 중 2-(L)-메톡시카르보닐아미노-3-메틸-부티르산 611 (242 mg, 1.38 mmol), HATU (524 mg, 1.38 mmol) 및 DIEA (178 mg, 1.38 mmol) 용액을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 교반하였다. 50 분 후, 반응물을 EtOAc 로 희석시키고 바이카르보네이트 수용액, LiCl 수용액 (5%), 염수로 세척하고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 진공 하에 용매를 여과 및 제거하여 미정제 물질을 수득하였고, 이를 실리카 겔 크로마토그래피 (용리액: EtOAc / 헥산) 로 정제하여 약간의 불순물 화합물 612 (878 mg) 을 수득하였다. LCMS-ESI+: C29H29BrF2N4O3에 대한 계산치: 599.5 (M +); 측정치: 598.5 / 600.5 (M+H+).
i. 3-[6-(9,9-디플루오로-7-{2-[5-(2-메톡시카르보닐아미노-3-메틸-부티릴)-5-아자-스피로[2.4]헵트-6-일]-3H-이미다졸-4-일}-9H-플루오렌-2-일)-1H-벤조이미다졸-2-일]-2-아자-바이시클로[2.2.1]헵탄-2-카르복시산 tert-부틸 에스테르 614 의 제조
(1-{6-[5-(7-브로모-9,9-디플루오로-9H-플루오렌-2-일)-1H-이미다졸-2-일]-5-아자-스피로[2.4]헵탄-5-카르보닐}-2-메틸-프로필)-카르밤산 메틸 에스테르 612 (840 mg, 1.4 mmol), 3-[6-(4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]디옥사보롤란-2-일)-1H-벤조이미다졸-2-일]-2-아자-바이시클로[2.2.1]헵탄-2-카르복시산 tert-부틸 에스테르 613 (615 mg, 1.4 mmol), Pd(PPh3)4 (161 mg, 0.14 mmol), K2CO3 (579 mg, 4.2 mmol) 을 아르곤 분위기 하에서 DME (15 mL) / 물 (3 mL) 에 용해시켰다. 혼합물을 120 분 동안 85 - 90℃ (오일욕) 에서 가열시켰다. 120 분 후, 부가적 보로네이트 에스테르 (61 mg, 0.14 mmol) 를 첨가하고 가열을 지속하였다. 3 시간 후, 반응물을 실온으로 냉각시켰다. 대부분의 DME 를 진공 하에 제거하고 미정제 반응 혼합물을 EtOAc 로 희석시켰다. 혼합물을 염수로 세척하고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매의 여과 및 증발로 미정제 반응 생성물을 수득하였고, 이를 실리카 겔 크로마토그래피 (용리액: EtOAc / 헥산) 를 통해 정제하여 화합물 614 (878 mg) 을 수득하였다. LCMS-ESI+: C47H51F2N7O5에 대한 계산치: 831.9 (M +); 측정치: 832.7 (M+H+).
중간체 화합물 613 을 하기와 같이 제조할 수 있다.
Figure pct00077
j. 3-(2-아미노-4-브로모-페닐카르바모일)-2-아자-바이시클로[2.2.1]헵탄-2-카르복시산 tert-부틸 에스테르 617 의 제조
10 mL DMF 중 2-아자-바이시클로[2.2.1]헵탄-2,3-디카르복시산 2-tert-부틸 에스테르 616 (0.327 g, 1.36 mmol, 1 eq.), 4-브로모-벤젠-1,2-디아민 615 (0.507 g, 2.71 mmol, 2 eq.) 및 4-메틸모르폴린 (0.299 mL, 2 eq.) 용액에 HATU (0.543g, 1.05 eq.) 을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하고 이어서 농축시켰다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석시키고 희석된 NaHCO3 수용액 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 농축시키고 플래시 컬럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 20 내지 80% 에틸 아세테이트/헥산) 로 정제하여 구조적이성질체 3-(2-아미노-4-브로모-페닐카르바모일)-2-아자-바이시클로[2.2.1]헵탄-2-카르복시산 tert-부틸 에스테르 617 의 혼합물을 수득하였다.
k. 3-(6-브로모-1H-벤조이미다졸-2-일)-2-아자-바이시클로[2.2.1]헵탄-2-카르복시산 tert-부틸 에스테르 618 의 제조
구조적이성질체 3-(2-아미노-4-브로모-페닐카르바모일)-2-아자-바이시클로[2.2.1]헵탄-2-카르복시산 tert-부틸 에스테르 617 의 상기 혼합물을 에탄올에 용해시키고 밀봉 튜브에서 밤새 130℃ 로 가열시키고 170℃ 에서 3 일 동안 가열을 지속하였다. LC-MS 는 원하는 생성물 및 Boc 분해 생성물 (약 1:1 비율) 을 나타냈다. 혼합물을 농축시키고 HCL 에 용해시켰다. 디-tert-부틸 디카르보네이트 (0.6 eq.) 를 첨가하고 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고 플래시 컬럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 20 내지 80% 에틸 아세테이트/헥산) 로 정제하여 3-(6-브로모-1H-벤조이미다졸-2-일)-2-아자-바이시클로[2.2.1]헵탄-2-카르복시산 tert-부틸 에스테르 618 (0.383 g, 72%) 을 오렌지색 포말로서 수득하였다.
l. 화합물 613 의 제조
5 mL DME 중 3-(6-브로모-1H-벤조이미다졸-2-일)-2-아자-바이시클로[2.2.1]헵탄-2-카르복시산 tert-부틸 에스테르 618 (264 mg, 0.673 mmol), 벤젠-1,4-디보론산 디피노칼 에스테르 (5 eq., 3.36 g, 6.95 mmol), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (5%, 39 mg) 및 2M 칼륨 카르보네이트 수용액 (3 eq., 1.01 mL) 의 혼합물을 Ar 하에서 4 시간 동안 90℃ 로 가열시켰다. 반응 혼합물을 냉각시키고 에틸 아세테이트에 희석시키고 포화중탄산나트륨 용액으로 세척하였다. 유기 층을 건조시키고 (MgSO4) 농축시키고 플래시 컬럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 20 내지 60% 에틸 아세테이트/헥산) 로 정제하여 3-{6-[4-(4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]디옥사보롤란-2-일)-페닐]-1H-벤조이미다졸-2-일}-2-아자-바이시클로[2.2.1]헵탄-2-카르복시산 tert-부틸 에스테르 613 (295 mg, 수율 85%) 을 수득하였다. LCMS-ESI-: C30H38BN3O4 에 대한 계산치: 515.45; 측정치: 516.1 (M+H+).
화합물 7 을 US 7,429,572 에서 기술된 바와 같은 합성 방법 및 중간체를 사용하여 제조할 수 있었다. 또한, 화합물 7 을 하기 실시예에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다.
실시예 7: 화합물 7 의 제조
Figure pct00078
THF (10 L) 중 화합물 701 (970 g, 3.74 mol) 및 DMAP (50 g, 0.412 mol) 의 빙냉 현탁액에, TEA (2.3 kg, 16.5 mol) 및 물 (7 L) 을 첨가하여 투명 용액을 생성하였다. 이소부티릴 클로라이드 (3 당량) 를 교반된 혼합물에 천천히 첨가하면서 약 0℃ 의 온도를 유지하였다. 부가적인 화합물 1.2 및 이어서 0.7 당량의 이소부틸 클로라이드를 HPLC 가 본질적으로 반응이 완료되었음을 나타낼 때까지 첨가하였다 (총 약 1.95 kg). 반응 혼합물을 진한 HCl 으로 산성화하여 pH 를 약 6.4 로 만들고 유기 상을 EtOAc (2 x 10 L) 로 세척하였다. 결합된 추출물을 물 (1 x 15 L) 로 세척하였다. 유기 상을 여과시키고 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 IPA (약 20 kg) 에 용해시키고 헵탄 (14.2 kg) 을 첨가하였다. 용액을 약 74-75℃ 로 가열시켜 투명 용액을 생성하고, 이어서 약 5L 를 증류로 제거하였다. 생성 용액을 실온으로 천천히 냉각시켰다. 침전물을 약 42-43℃ 에서 형성시켰다. 냉각을 5℃ 까지 냉각을 계속하고 이어서 밤새 교반하였다. 생성 고체를 여과하고 여과액을 IPA/헵탄 (1:8) 혼합물 (13.4 kg) 로 세척하고, 진공 하에 약 60-70℃ 에서 건조시켜 1.295 kg (86.65%) 의 화합물 7 을 수득하였다 (HPLC 에 의한 순도: 99.45%).
중간체 화합물 706 을 하기와 같이 제조할 수 있다.
Figure pct00079
a. 화합물 701 의 제조
DMF (2.06 L) 중 사이티딘 (100 g, 0.411 mol) 현탁액에, 벤조 무수물 (102.4 g, 0.452 mol) 을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 20 시간 동안 교반하였다. DMF 를 진공 하에 제거하고 잔류물을 디에틸 에테르를 이용하여 분쇄하였다. 생성 고체를 흡인 여과로 수집하고 디에틸 에테르 (2 x 200 mL) 로 세척하였다. 실온에서 진공 하에 추가 건조하여 N4 벤즈아미드 (140.6 g, 98.3%) 를 수득하였다. 이러한 물질 (139.3 g, 0.401 mol) 의 일부를 무수 피리딘 (1.2 L) 에 용해시키고 실온에서 1,3-디클로로-1,1,3,3-테트라이소프로필-디실록산 (141.4 mL, 0.441 mol) 으로 처리하였다. 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 거의 건조 진공 하에 농축시키고 툴루엔 (3 x 200 mL) 으로 공동증발시켰다. 잔류물을 EtOAc (1.8 L) 로 처리하고 HCl (2 x 200 mL, 0.05 N), NaHCO3 (5 %, 2 x 400 mL) 로 세척하였다. 유기 층을 건조시키고 (Na2SO4), 여과시키고, 건조 증발시켰다. 화합물 701 (256.5 g, >100%) 을 백색 포말로서 단리시키고 추가의 정제 없이 사용하였다.
b. 화합물 702 의 제조.
화합물 701 (236.5 g, 0.40 mol) 을 건조 THF (1.22 L) 에 용해시켰다. 무수 DMSO (180.8 mL, 2.1 mol) 을 첨가하고 생성 용액을 -20℃ 내지 -15℃ 로 냉각시켰다. 트리플루오로아세틱 무수물 (90.6 mL, 0.64 mol) 을 적하 방식으로 45 분에 걸쳐 첨가하고 용액을 2 시간 동안 -20℃ 내지 -15℃ 에서 교반한 후, 무수 트리에틸아민 (223.5 mL, 1.6 mol) 을 20 분에 걸쳐 첨가하였다. 케톤 702 을 함유하는 미정제 반응물을 EtOAc (500 mL) 에 용해시키고, 생성 용액을 H2O (3 x 400 mL) 로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4) 용매를 진공 하에 제거하여 황색 고체를 수득하고, 이를 헥산 중 Et2O 의 단계 방식 구배로 (0-60%) 이어서 헥산 중 EtOAc 의 단계 방식 구배로 (50-100%) 용리하는 실리카 겔 컬럼 상에서 정제하였다. 이에 따라 수득된 미정제 케톤 (~192 g) 을 석유 에테르로부터 결정화하여 케톤 702 (138.91 g, 사이티딘으로부터 57.5%) 을 백색 고체로서 수득하고 22 g 의 미반응 출발 물질 701 을 황색 고체로서 수득하였다.
c. 화합물 703 의 제조
화합물 702 (48.57 g, 8.26 mmol) 을 무수 톨루엔 (~400 mL) 에 용해시키고 용매를 습기를 배제하고 진공 하에서 제거하였다. 이어서, 잔류물을 추가 2 시간 동안 진공 하에서 (오일 펌프) 추가로 건조시켰다. 습기를 엄격하게 배제시키고, 잔류하는 포말을 아르곤 하에서 무수 디에틸 에테르 (1.03 L) 에 용해시켰다. 생성 용액을 아르곤 하에서 -78℃ 로 냉각시키고 MeLi (1.6 M, 258.0 mL, 0.413 mol) 를 첨가 깔때기를 통해 적하 방식으로 첨가하였다. 첨가를 완료한 후, 혼합물을 2 시간 동안 -78℃ 에서 교반하였다. 수성 1M NH4Cl(500 mL) 를 천천히 첨가하였다. 실온으로 가온한 후, 혼합물을 H2O (2 x 500 mL) 로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 이어서 건조 농축시켜 갈색 포말을 수득하였다 (~60 g, >100%).
37.62 g 및 56.4 g 의 화합물 702 을 사용하여 2 회 이상 반응을 수행하였다. 결합된 미정제 생성물 (128.0 g, 0.212 mol) 을 THF (1.28 L) 에 용해시키고 농축 HOAc (23 mL, 0.402 mol) 로 처리하였다. 용액에 TBAF (384.0 mL, THF 중 1 M) 를 첨가하였다. 용액을 0.75 시간 동안 실온에서 교반하고 혼합물을 실리카 겔 (750 g) 로 처리하고 건조 농축시켰다. 분말을 CH2Cl2 중에 패킹된 실리카 겔 컬럼 상에 두었다. 1:7 EtOH-CH2Cl2 를 이용한 용리를 통해 진한 색의 왁스성 고체를 수득하였고 이를 실리카 겔 (300 g) 상에서 예비-흡착처리하고 상기와 같이 크로마토그래피하였다. 화합물 703 (46.4 g, 화합물 702 로부터 53.0 %) 을 회백색 고체로서 단리시켰다.
Figure pct00080
d. 화합물 704 의 제조
화합물 703 (46.0 g, 0.13 mol) 을 무수 피리딘에 용해시키고 진공 하에 건조 농축시켰다. 생성 시럽을 아르곤 하에서 무수 피리딘에 용해시키고 교반 하에 0℃ 로 냉각시켰다. 갈색 용액을 벤조일 클로라이드 (30mL, 0.250 mol) 를 이용하여 10 분에 걸쳐 적하 방식으로 처리하였다. 빙욕을 제거하고 1.5 시간 동안 교반을 계속하였고, 이로써 TLC 는 잔류하는 출발 물질이 없음을 나타냈다. 혼합물을 물 (5 mL) 의 첨가에 의해 켄칭시키고 건조 농축시켰다. 잔류물을 최소량의 CH2Cl2 에 용해시키고 포화 NaHCO3 (1 x 500 mL) 및 H2O (1 x 500 mL) 로 세척하였다. 유기 상을 건조시키고 (Na2SO4) 여과하고, 건조 농축시키고 EtOAc-헥산 단계적 구배 (25-60%) 로 용리하는 실리카 겔 상에서 크로마토그래피 처리하여 화합물 704 을 황색 포말로서 수득하였다 (48.5 g, 67%).
Figure pct00081
e. 화합물 705 의 제조
화합물 704 (7.50 g, 0.013 mol) 를 아르곤 하에서 무수 톨루엔 (150 mL) 에 용해시키고 -20℃ 로 냉각시켰다. DAST (2.5 mL, 18.9 mmol) 를 천천히 첨가하고 첨가를 완료한 후 냉각욕을 제거하였다. 교반을 1 시간 동안 지속하고 혼합물을 포화 NaHCO3 (100 mL) 에 붓고 기체 발생이 중지될 때가지 세척하였다. 유기 상을 건조시키고 (Na2SO4), 농축시키고 1:1 EtOAc-헥산으로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다. 1.22 g (16.3%) 의 순수 화합물 705 를 백색 고체로서 수득하였다. mp 241℃ (CH2Cl2-헥산);
Figure pct00082
C31H26FN3O7 ·0.7 H20 에 대한 분석 계산치: C, 63.74; H, 4.72; N, 7.20. 측정치: C, 63.71; H, 4.54; N, 7.20.
f. 화합물 706 의 제조
화합물 705 (6.30 g, 0.011 mol) 를 메탄올성 암모니아 (약 7 N, 150 mL) 에 현탁하고 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 진공 하에 제거하고, 메탄올 (1×20mL) 을 이용하여 공동-증발시키고 실리카 겔 상에서 예비-흡착처리하였다. 백색 분말을 실리카 겔 컬럼 (CHCl3 에서 패킹됨) 에 두고 컬럼을 CHCl3 에서 9% EtOH, 이어서 17% EtOH 및 최종적으로 CHCl3 에서 25% EtOH 로 용리하였다. 생성물을 함유하는 분획을 농축시키고, 0.4 ㎛ 디스크를 통해 여과시키고, 물로부터 동결건조하여 화합물 706, 2.18 g (76%) 을 수득하였다.
Figure pct00083
C10H14FN3O4·1.4 H2O 에 대한 분석 계산치: C, 44.22; H, 5.95; N, 14.77. 측정치: C, 42.24; H, 5.63; N, 14.54. 화합물 706 (0.10 g, 0.386 mmol) 을 물 (2 mL) 에 용해시킴으로써 염화수소 염으로 전환하고 1 M HCl 를 이용하여 pH 를 대략 3.0 으로 조정하였다. 진공 하에 물을 제거하고 잔류물을 수성 EtOH 로부터 결정화하여 화합물 706 을 염화수소 염 (71.0 mg) 으로서 수득하였다. mp 243℃ (dec);
Figure pct00084
19F NMR (DMSO-d6;):δ 1.69 (m). C10H14FN3O4·HCl 에 대한 분석 계산치: C, 40.62; H, 5.11; N, 14.21. 측정치: C, 40.80; H, 5.09; N, 14.23.
USSN 12/632,194 에서 기술된 바와 같은 합성 방법 및 중간체를 사용하여 화합물 8 을 제조하였다. 또한, 화합물 8 을 하기 실시예에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다.
실시예 8: 4-아미노-2-n-부톡시-8-[3'-(피롤리딘-1''-일메틸)-벤질]-5,6,7,8-테트라히드로프테리딘-6-온 8 의 제조 (R = n-부틸)
Figure pct00085
MeOH (10 mL) 중에서 니트로 화합물 807 (730 mg, 1.5 mmol) 의 용액에, 라니 니켈 (~200 ㎕, H2O 에서 슬러리) 을 첨가하였다. 반응 관을 H2 로 플러싱하고 이어서 H2 분위기 하에서 1.5 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 CH2Cl2 및 MeOH (1:1) 를 이용하는 셀라이트를 통해 여과시켰다. 여과액을 진공 하에 농축시키고 동결건조기 상에서 밤새 방치하였다. 화합물 8 의 유리 염기를 백색 고체로서 수득하였다. 화합물 8 의 HCl 염을 수득하기 위해, 상기의 여과액 샘플을 1.0 M HCl 로 스파이킹하여 pH = 1-2 로 만들고 동결건조하였다.
Figure pct00086
LCMS-ESI+: C22H31N6O2 에 대한 계산치: 411.5 (M+H+); 측정치: 411.3 (M+H+).
중간체 화합물 807 하기와 같이 제조하였다.
Figure pct00087
a. 화합물 802 의 제조
-20℃ 에서 THF (34 mL) 중 화합물 801 (2.46 g, 10.2 mmol) 의 용액에, Et3N (3.14 mL, 22.5 mmol) 를 첨가하고 이어서 NH3 (MeOH 중 2.0 M, 5.4 mL, 11 mmol) 의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 1.5 h 동안 0℃ 로 가온하면서 교반하였다 (LC/MS 는 출발 물질의 소비를 나타냄). 화합물 802 를 함유하는 반응 혼합물을 후처리 없이 채취하였다.
b. 화합물 803 의 제조
Figure pct00088
0℃ 에서, THF (34 mL) 중 3-((1-피롤리디닐메틸)페닐)메탄아민 806 (1.95 g, 10.2 mmol) 용액에, Et3N (3.14 mmol, 22.5 mmol) 이어서 메틸 브로모아세테이트 (1.04 mL, 22.3 mmol) 를 적하 방식으로 첨가하였다. LC/MS 가 출발 물질이 소비되었음을 나타낼 때까지 대략 2 시간 동안 반응 혼합물을 교반하였다. 화합물 803 를 함유하는 혼합물을 후처리를 위해 채취하였다.
c. 화합물 804 의 제조
화합물 803 을 함유하는 반응 혼합물을 0℃ 에서 화합물 802 을 함유하는 반응 혼합물에 첨가하였다. LC/MS 가 화합물 802 의 소비를 나타낼 때까지 반응 혼합물을 대략 45 분 동안 교반하였다. NH4Cl (50 mL) 의 포화 용액을 첨가하였다. 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc (2 x 30 mL) 로 추출하였다. 결합된 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 진공 하에 농축시켰다. 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 2.11 g 의 화합물 804 을 수득하였다.
Figure pct00089
LCMS-ESI+: C21H29N6O4S 에 대한 계산치: 461.2 (M+H+); 측정치: 461.0 (M+H+).
d. 에틸-Nα[4-아미노-2-메탄술포닐-5-니트로피리미딘-6-일],Nα[3'-(피롤리딘-1"-일메틸)-벤질]-글리시네이트 805 의 제조
Figure pct00090
0　℃ 에서 EtOH (40 mL) 중 술피드 804 (3.68 g, 8.00 mmol) 현탁액 용액에 나트륨 텅스테이트 디히드레이트 (792 mg, 2.40 mmol), 아세트산 (4.6 mL, 80 mmol), 및 과산화수소 (3.4 mL, ~40 mmol, H2O 중 35% w/w) 를 순차적으로 첨가하였다. 3 시간 후, 부가적 아세트산 (4.6 mL) 및 과산화수소 (3.4 mL) 를 첨가하였다. 반응물을 0℃ 에서 16 시간 동안 유지하였다. Na2SO3 (50 mL) 포화용액을 0℃ 에서 조심스럽게 첨가하고 이어서 CH2Cl2 (75 mL) 를 첨가하였다. 층을 분리하고, 수성 층을 CH2Cl2 (4 x 50 mL) 를 이용하여 추출하였다. 결합된 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 진공 하에 농축시켜 추가의 정제 없이 화합물 805 를 함유하는 물질을 제공하였다.
e. 화합물 807 의 제조 (R = n-부틸)
Figure pct00091
n-부탄올 (10 mL) 중 술폰 805 (1.0 g, 2.0 mmol) 용액에 TFA (470　㎕, 6.1 mmol) 를 첨가하였다. 반응물을 100℃ 에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 NaHCO3 (20 mL) 및 CH2Cl2 (30 mL) 포화용액에 부었다. 층을 분리하고, 수성 층을 CH2Cl2 (30 mL) 로 추출하였다. 결합된 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 진공 하에 농축시켰다. 실리카 겔 크로마토그래피 (1 g 기질/10 g SiO2) (2-15% MeOH/CH2Cl2) 로 정제를 수행하여 화합물 807 을 수득하였다.
실시예 9: 화합물 9 의 제조 (US2010/0298257)
Figure pct00092
(S)-2-{[(1R,4R,5R)-5-(2,4-디옥소-3,4-디히드로-2H-피리미딘-1-일)-4-(R)-플루오로-3-히드록시-4-메틸-테트라히드로-푸란-2-일-메톡시]-페녹시포스포릴아미노}-프로피온산 이소프로필 에스테르 (US2010/0298257 실시예 2) 의 제조
동의어: 5'-O-(이소프로필-L-알라네이트, 페닐 포스포라미딜)-2'-데옥시-2'-플루오로-2'-C-메틸-우리딘 부분입체이성질체 혼합물.
기계적 교반기, 염수 빙욕, 내부 온도계를 장착시키고, 질소 분위기의 5 L 3목 플라스크를 사용하였다. 플라스크에 L-알라닌 이소프로필 에스테르 염화수소 (82.0 g, 0.490 몰) 및 무수 디클로로메탄 (0.80 L) 를 충전시켰다. 이를 교반하면서, 페닐 디클로로포스페이트 (85.0 g, 0.40 몰) 를 하나로 첨가하고 교반하였다. 내부 온도를 -5 내지 5℃ 로 유지하면서, 디클로로메탄 (250 mL) 중 N-메틸이미다졸 (NMI, 250 g, 3.07 몰) 용액을 30 분에 걸쳐 첨가하였다. 용액을 이러한 온도 범위에서 1 시간 동안 교반하였다. 2'-데옥시-2'-플루오로-2'-C-메틸-우리딘 (3,80.0 g, 0.307 몰) 을 0℃ 에서 한번에 첨가하고 이어서 반응 플라스크를 염수욕에서 천천히 가온시켰다. 1 시간 후, 내부 온도를 -2℃ 로 올렸다. 1 h 에서 TLC (HCL 중 5% 메탄올) 는 50% 초과의 뉴클레오시드가 소비되었음을 나타냈다. 욕을 제거하였고 반응 플라스크는 1 h 이상에 걸쳐 주위 온도에 도달하였다. 3 h 및 5 h 후 총 TLC 는 출발 뉴클레오시드의 95% 가 소비되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 메탄올 (100 mL) 를 첨가함으로써 켄칭하고 5 분 동안 반응물을 교반하였다.
반응 혼합물을 1N HCl (2x500 mL) 이어서 포화중탄산나트륨 용액 (2x500 mL) 으로 세척하였다. 분리된 유기 층을 무수 황산나트륨 (50 g) 상에서 건조시키고 여과시켰다. 용액을 감압 하에 증발시키고 이어서 고 진공 하에서 증발시켜 미정제 생성물을 점성 오일로서 수득하였다 (170 g). 미정제 생성물 (31P 및 1H) 의 NMR 을 취하였다. 31P-NMR 은 총 인 통합의 약 1% 를 나타냈으며 이는 3' 이성질체 5 의 존재로 인한 것이었다.
미정제 생성물을 무수 피리딘 (1700 mL) 에 첨가하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 이어서 고 진공 하에 증발시켜 공동-증발을 통해 미정제 혼합물의 수분 함량을 감소시켰다. 오일의 생성을 무수 피리딘 (500 ml) 에 재-용해시키고 이어서 과량의 t-부틸디메틸실릴 클로라이드 (9.0 g, 60 mM) 를 첨가하였다. 반응물을 주위 온도에서 교반하였다. 반응이 진행되는 것을 UPLC/MS 로 모니터링하였다. 3 시간 후, 3' 불순물 5 는 더 이상 검출될 수 없었고 메탄올 (50 mL) 의 첨가로 반응을 켄칭시켰다.
반응물을 감압 하에 증발시켜 오일을 수득하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트 (1.5 L) 에 용해시키고 1N HCl (2x500 mL) 로 세척하고, 이어서 포화중탄산나트륨 용액 (2x500 mL) 로 세척하였다. 유기 층을 무수 황산나트륨 (50 g) 상에서 건조시키고, 여과시키고, 감압 하에 증발시켜 연한 황색 오일로서 미정제 생성물을 수득하였다.
미정제 오일을 디클로로메탄과 동일한 부피로 희석시키고 2.5 Kg 실리카 겔 카트리지 n (공기압 100 psi 에서 방사상 압착 계수) 상에서 적재하였다. 60 psi 의 구배 펌프를 사용하고 400 ml/분의 유속을 사용하며, 카트리지를 메틸렌 클로라이드 (4L) 로 세척하고, 메틸렌 클로라이드 (48 L) 에서 구배 1-4% 메탄올로 세척하였다. 대부분의 불순물 (디-(이소프로필알라닐) 페닐 포스페이트, 3',5'-비스 포스포라미데이트, 3'-포스포라미데이트-5'-TBDMS 부가물 (7)) 을 ~3% 구배로 용리하였다. 원하는 생성물을 3 내지 4% 메탄올로 용리하였다. 분획을 함유하는 생성물을 2 개의 부분으로 분류하였다. 첫번째 부분은 소량의 상부 불순물을 함유하고 두번째 부분은 순수 생성물이었다. 분획의 첫번째 세트는 3',5'-비스 포스포라미데이트 및 디-알라닐페닐 포스페이트와 같은 덜 극성인 불순물 (상부 불순물) 을 소량 함유하고 대부분의 Rp 부분입체이성질체를 함유했고 제 2 컬럼 정제가 필요했다. (상대적인 용어 상부 대 하부는 표준 상 실리카-겔 크로마토그래피 상의 용리액을 지칭하는데, 여기서 "상부 이성질체" 는 첫번째 용리되는 이성질체을 의미함.) 분획의 제 2 세트는 다량의 불순말을 갖지 않고 - 단지 남아 있는 것은 Rp 및 대부분 Sp 부분입체이성질체이다. 이는 후에 2회 컬럼화 분획과 재결합된다. 용매를 감압 하에 증발시키고 생성되는 백색 포말을 1 시간 동안 추가로 건조시켜 (0.20mmHg) 42 g 의 불순물 부분 (31P-NMR 에 기초하여 4:1 의 상부 대 하부 이성질체) 및 38 g 의 순수 부분 (1:3 의 상부 대 하부 이성질체) 를 수득하였다. 불순물 부분을 유사한 방식으로 재컬럼화하여 3.8 g 의 97% 순수 상부 이성질체 (제외된 분획 및 36 g 의 순수 생성물의 4:1 비) 를 수득하였다. 2 개의 주요 부분을 HCL 에 용해시키고, 결합시키고, 감압 하에 증발시키고 건조시켜 (50℃, 0.2 mmHg, 24 h), 74 g (45.7%) 의 순수 생성물 (화합물 9) 을 백색 포말로서 48:51 비율의 부분입체이성질체를 갖고 수득하였다. mp 약 75-85℃.
부분입체이성질체 혼합물의 무정형 고체를 제조하기 위해, 74 g 의 백색 포말을 t-부틸 메틸 에테르 (750 mL) 를 이용하여 교반하여 부분 용액으로 점성있는 고체 잔류물을 생성하였다. 교반하면서, 헵탄 (750 mL) 을 천천히 첨가하고, 대부분의 검이 백색 고체로 전환될 때까지 1 시간 동안 기계적으로 교반하였다. 고체를 스파츌라로 문지르고 생성 슬러리를 여과시켰다. 고체를 헵탄 (4x50mL) 을 이용하여 세척하고 진공 하에 건조시켜 (50℃, 0.2mmHg, 24 h) 약 70-80℃ 의 폭넓은 용융 범위의 백색의 무정형 분말 (64 g) 을 수득하였다. 1H 및 31P NMR 로 구조를 일치시켰고, HPLC 은 46:54 의 비율로 부분입체이성질체를 갖는 99.8% 순도를 나타냈다 (31P NMR 로 확인).
대안적인 방법으로 화합물 9 의 고체 혼합물을 제조하였다. 크로마토그래피 후, 잔류물을 디클로로메탄으로 2 회 공동-증발시키고 (5 mL/g) 24 h 동안 35-40℃ 에서 35-45 mTorr 에서 건조시켰다. 포말 잔류물을 250 마이크론 스크린을 통해 체질하고, 잔류하는 디클로로메탄이 헤드스페이스 GC 로 측정시 400 ppm 미만으로 떨어질 때까지 동일한 조건 하에서 추가로 건조시켰다. 회백색 내지 백색 무정형 분말의 미세 생성물은 53.7 내지 63.5℃ 유리 전이 온도를 갖는다.
화합물 9 의 특징화 (이성질체 혼합물):
Figure pct00093
-17.80 ppm 에서 트리페닐포스페이트에 대한 31P-NMR (CDCl3) 03.60 (Rp), 3.20 Sp. ES-MS M+1 530.2. 성분 분석: 계산치% (0.29% 물 포함, Karl Fisher 분석법) C, 49.75; H, 5.54; N, 7.90, F, 3.58, P, 5.84. 측정치%: C, 49.50; H, 5.44; N, 7.85; F, 3.62; P, 6.05.
2'-데옥시-2'-플루오로-2'-C-메틸우리딘 (US2010/0298257 실시예 1) 의 제조
10 L 플라스크에, 3',5'-O-디벤조일-2'데옥시-2'-플루오로-2'-C-메틸-N4-벤조일사이티딘 (500 g, 0.874 mol) 및 70% 수성 아세트산 (7.5 L) 을 첨가하였다. 용액을 20 시간 동안 환류로 가열시켰다 (110℃). TLC 로 반응이 완료되었음을 나타냈다 (디클로로메탄 (HCL) 중 5% 메탄올에서 RfO.6). 혼합물을 주위 온도로 냉각시키고 물 (2 L) 로 희석시켰다. 2 시간 동안 교반 후, 생성 침전물을 여과로 수집하고 고체를 물 (5 L) 로 헹구고 12 시간 동안 주위 온도 분위기에서 건조시켜 360 g (88%) 을 수득하였다. 이러한 디벤조일우리딘 중간체를 모두 0℃ 에서 신선하게 제조된 메탄올 암모니아 (5.4 L, 약 25%) 에 첨가함으로써 다음 단계에 직접 사용하였다. 이 온도를 3 시간 동안 유지하고 이어서 24 시간 동안 15℃ 로 가온시켰다. TLC 는 반응이 완료되었음을 나타냈다 (HCL 중 10% 메탄올에서 Rf 0.4). 반응 혼합물을 셀라이트 층을 통해 여과시키고 감압 하에 농축시켜 미정제 생성물 (216 g) 을 수득하였다. 미정제 생성물을 3 시간 동안 주위 온도에서 에틸 아세테이트 (325 mL) 를 이용하여 교반하였다. 생성 고체를 여과에 의해 수집하고 에틸 아세테이트 (216 mL) 로 세척하였다. 고체를 진공 하에 4 시간 동안 주위 온도에서 건조시켜 160 g (78%) 의 원하는 생성물을 98.7% HPLC 순도로 수득하였다.
Figure pct00094
실시예 10: 화합물 10 (US2010/0298257) 의 제조
Figure pct00095
화합물 10 (US2010/0298257; 실시예 4) 의 직접적인 침전: 디클로로메탄 (100 mL) 중 L-알라닌 이소프로필 에스테르 염화수소 (10.5 g, 61.5 mmol, 공비 건조, 2 배, 매회 50 mL 의 톨루엔 이용) 의 교반 용액에, 실온에서 페니디클로로포스페이트 (7.5 mL, 50 mmol) 를 첨가하였다. 혼합물을 -10℃ 로 냉각시키고 이어서 30 mL 의 디클로로메탄 중 N-메틸이미다졸 (30.5 mL, 384.3 mmol) 용액을 30 분에 걸쳐 첨가하였다. 첨가를 완료한 후, 혼합물을 1 시간 동안 -10 내지 -15℃ 에서 교반하였다. 상기 혼합물에, 2'-데옥시-2'-플루오로-2'-C-메틸우리딘 (10 g, 38.4 mmol) (US2010/0298257 실시예 1 참조) 을 한 부분으로 첨가하고 혼합물을 3 시간 동안 -10℃ 미만에서 교반하고 이어서 20℃ 로 가온시켰다 (6 h). 혼합물을 이 온도에서 밤새 (15 시간) 교반하고 이어서 10 mL 의 메탄올을 이용하여 켄칭시켰다. 용매를 증발시키고 잔류물을 EtOAc (200 mL) 에 재용해시켰다. EtOAc 층을 물 (100 mL), 1N HCl (3x75 mL), 2% 수성 NaHCO3 용액 (50 mL) 및 염수 (50 mL) 를 이용하여 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고 농축시켰다. 잔류물을 고진공 하에서 2 시간 동안 건조시켜 백색 포말을 수득하였다 (22 g).
상기 포말을 33 mL 의 HCl 에 용해시키고 이어서 65 mL 의 이소프로필 에테르를 첨가하여 포화용액을 수득하였다. 용액을 셀라이트의 작은 패드를 통과시켜 여과하고 여과액을 화합물 10 의 시드를 이용하여 72 시간 동안 주위 온도 (약 22℃ - 현탁액을 0℃로 냉각시키는 것은 미정제 생성물이 없는 오일화를 야기함을 주목)에서 교반하였다. 백색 고체를 여과하고, 이소프로필 에테르 (20 mL) 로 세척하고, 4.58 g (화합물 10:R이성질체 (31P NMR 에 의해 측정시 각각 P 에서) 의 ~85:15 혼합물) 의 백색 분말을 수득하였다. 상기 고체를 23 mL 의 HCL 에 현탁하고 이어서 3 시간 동안 환류하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 15 시간 동안 교반하였다. 백색 고체를 여과하고, 4.5 mL 의 저온 HCl 로 세척하고 고진공 하에서 45℃ 에서 건조시켜 순수 화합물 10 을 생성하였다. mp 93.9-104.7℃. HPLC 순도 99.74% (3.11 g, 우리딘 뉴클레오시드로부터 15.2%).
화합물 10:
Figure pct00096
실시예 11: 화합물 11 의 제조(US 2010/0081628)
Figure pct00097
6-에톡시-9-((4aR,6R,7R,7aR)-7-플루오로-2-이소프로폭시-7-메틸-2-옥소-테트라히드로-2,5-푸로[3,2-d][1,3,2]디옥사포스피닌-6-일)-9H-퓨린-2-일-아민 (화합물 11) 합성 (화합물 19, US 2010/0081628)
(2R,3R,4R,5R)-5-(2-아미노-6-에톡시-퓨린-9-일)-4-플루오로-2-히드록시메틸-4-메틸-테트라히드로-푸란-3-올 (150 mg, 0.46 mmol) 을 0℃ 에서 무수 피리딘 (2 ml) 에 용해시켰다. 아세토니트릴 (2.55 mL) 중 0.45 M lH-테트라졸 용액을 첨가하고 이어서 비스(N,N-디이소프로필아미노) 이소프로필포스포라미다이트 (0.16 mL, 0.55 mmol, 1.2 eq) 를 첨가하였다. 혼합물을 3 시간에 걸쳐 주위 온도로 천천히 가온시켰다. TLC 는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 물 (0.1 mL) 의 첨가로 반응을 켄칭시켰다. 반응 용액을 감압 하에 농축시키고 잔류물을 에틸 아세테이트 (5 mL) 를 이용하여 분쇄하였다. 생성되는 백색 침전물을 여과로 제거하고 여과액을 감압 하에 농축시켰다.
생성되는 중간체 시클릭 포스파이트 잔류물을 아세토니트릴 (2 mL) 에 용해시키고 5 시간 동안 주위 온도에서 t-부틸 히드로퍼옥시드로 처리하였다 (물 중 70%, 0.19 mL). TLC 는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 용액을 감압 하에 농축시키고 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다 (Analogix, HCL 중 0 내지 5% 구배 IPA 이용). 2 개의 부분입체이성질체 (화합물 11 및 R-이성질체 (P 에서)) 를 분리할 수 있었다. 각 부분입체이성질체를 함유하는 분획을 분리하여 결합시키고 감압 하에 백색 고체로 농축시켜 각각의 부분입체이성질체 20 mg 을 수득하였다 (결합된 수율 20%).
화합물 11
Figure pct00098
R-이성질체 (P 에서)
Figure pct00099
화합물 11 및 R-이성질체 (P 에서) 에 대한 구조를 하기에 나타냈다.
Figure pct00100
(2R,3R,4R,5R)-5-(2-아미노-6-에톡시-9H-퓨린-9-일)-4-플루오로-2-(히드록시메틸)-4-메틸테트라히드로-푸란-3-올의 합성 (화합물 16, US 2010/0081628)
500 mL 의 건조 둥근 바닥 플라스크에 (2R,3R,4R,5R)-5-(2-아미노-6-클로로-9H-퓨린-9-일)-2-(벤조일옥시메틸)-4-플루오로-4-메틸테트라히드로푸란-3-일 벤조에이트 (11 g, 20.92 mmol) 를 적재하였다. 무수 에탄올 (210 mL) 을 첨가하고 이어서 무수 K2CO3 (28.91 g, 209.2 mmol) 를 첨가하였다. 현탁액을 교반하고 질소 하에서 5.5 시간 동안 75℃ 에서 가열시켰다. TLC 시험으로, 모든 출발 물질을 소비하였음을 확인했다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 고체를 여과 제거하였다. 여과액을 빙초산 (2.52 g) 을 첨가하여 pH~7 로 중성화하고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 메탄올에 용해시키고 실리카 겔 (15 g) 과 혼합하였다. 미정제 생성물의 건조 혼합물 및 실리카 겔을 빈 카트리지로 이동시키고 컬럼 크로마토그래피를 통해 분리하여 (Analogix 220 g, 구배 DCM 중 0 내지 15% MeOH) 생성물 (DCM 중 5% MeOH) 을 백색 포말로서 고체 (3.73 g, 54.5%) 로서 수득하였다. 제 2 백색 고체를 컬럼으로부터 단리하였고 (DCM 중 10% MeOH, 1.44 g) 이는 뉴클레오시드의 2 개의 이량체의 혼합물이다. 더욱 극성인 제 3 의 백색 고체를 컬럼으로부터 수집하였고 (DCM 중 15% MeOH, 0.47 g) 이는 뉴클레오시드의 삼량체의 혼합물이었다. 생성물의 HPLC 순도는 99.94% 이었다.
Figure pct00101
(2R,3R,4R,5R)-5-(2-아미노-6-클로로-9H-퓨린-9-일)-2-(벤조일옥시메틸)-4-플루오로-4-메틸테트라히드로푸란-3-일 벤조에이트의 합성 (화합물 12, US 2010/0081628)
12 L 의 3목 둥근 바닥 플라스크에, 6-클로로-2-아미노퓨린 (225.4 g, 1.329 mol) 을 충전시켰다. 무수 tert-BuOH (4.5 L) 을 첨가하고 용액을 주위 온도에서 기계적 교반기를 이용하여 교반하였다. 칼륨 tert-부톡시드 (고체, 151.6 g, 1.35 mol) 를 교반 하에 질소 기체 흐름 하에서 부분적으로 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 추가 30 분 동안 교반하였다. 5 L 둥근 바닥 플라스크에 α-브로마이드 (10, 197 g, 0.451 mol) 및 3 L 의 무수 아세토니트릴을 주위 온도에서 적재하였다. 브로마이드 용액을 1 분에 걸쳐 주위 온도에서 퓨린 염기 현탁액에 첨가하였다. 5 L 플라스크를 아세토니트릴 (2x1 L) 를 이용하여 헹구고 브로마이드를 반응 혼합물에 완전히 옮겼다. 혼합물을 가열 맨틀 및 제어기를 이용하여 2 시간에 걸쳐 점차적으로 50℃ 로 가열하고 20 시간 동안 교반하였다. 반응이 거의 완료되었음을 TLC 베타에 의해 나타냈다 (R f 0.28, 헥산 중 30% EtOAc). 포화 NH4Cl (200 mL) 의 첨가하여 현탁액을 형성함으로써 반응을 켄칭시켰다. 2.5 L 포셀린 Buchner 깔때기에서 셀라이트 패드 (3 cm) 를 통해 현탁된 고체를 여과시켜 제거하였다. 고체를 톨루엔 (3x100 mL) 을 이용하여 세척하였다. 결합된 여과액을 pH 7 이 될 때까지 6 N HCl 용액을 첨가함으로써 (대략 220 mL) 중성화하였다. 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 혼합물의 부피가 약 1/3 부피로 감소되었을 때, 부가적인 침전 고체를 유사한 방식으로 여과 제거하였다. 여과액을 약 800 mL 의 부피로 추가적으로 농축시켰다. 잔류물을 플러그 컬럼 상에 적재하고 (6 L 소결 유리 유리 Buchner 깔때기에서 1.6 kg 플래시 등급 실리카 겔) 헥산 (6 L) 중 10% 구배의 에틸 아세테이트를 이용하여 용리하여 (흡인을 통해) 비극성 불순물을 제거하고, 헥산 중 30% 에틸 아세테이트를 이용하여 용리하여 소량의 락톨 (6 L) 을 수득하고, 이어서 헥산 (4 L) 중 40%-45% 에틸 아세테이트를 이용하여 다량의 생성물을 용리하였다. 분획을 함유하는 생성물을 결합시키고, 감압 하에 농축시키고 진공 하에 건조시켜 (0.2 mmHg, 24 h, 주위 온도), 백색 포말 고체를 수득하였다 (150.7 g, NMR 에 의해 β/α=14:1). 1H-NMR. (CDCl3)베타: δ 1.33 (d, 22.4 Hz, 2'-C-CH3), 알파: 1.55 (d, 22 Hz, 2'-C-CHH3).
생성물 혼합물 포말을 주위 온도에서 메탄올 (700 mL) 에 용해시켰다. 방치시, 2 시간에 걸쳐 고체가 천천히 형성되었다. 현탁액을 냉동고에서 17 시간 동안 -5℃ 로 냉각시켰다. 생성되는 백색 고체를 여과로 수집하고 저온 MeOH (-5℃, 3x60 mL) 및 에틸 에테르 (3x100 mL) 로 세척하였다. 고체를 진공 하에 건조시켜 (0.2 mmHg, 24 h, 주위 온도) 110.5 g 의 β-생성물을 수득하였다 (HPLC 에 의해 β/α 99.8:1). 여과액을 부분적으로 농축시키고 (약 400 mL) 60℃ 로 가열하면서 보다 다량의 MeOH (400 mL) 로 희석시켰다. 용액을 주위 온도로 냉각시키고, 시딩하고 -5℃ 로 냉각시켰다. 제 2 작업물을 수집하고, 세척하고 유사한 방식으로 건조시켜 보다 다량의 생성물을 백색 고체 (12.26 g) 로서 수득하였다 (유사한 부분입체이성질체 순도). 모액을 감압하에 건조 농축시켰다 (약 25 g). 잔류물은 β 및 α-이성질체의 혼합물이었다. 이를 자동처리되는 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 처리하여 (Analogix, 240 g 카트리지, 헥산 중 40% 내지 50% 에틸 아세테이트) 14.52 g 의 생성물 포말을 수득하고 이를 MeOH 로부터 재결정화하고, 세척하고 유사한 방식으로 건조시켜 부가적 8.46 g 의 생성물을 고 순도로 수득하였다.
3 개의 고체를 유사한 순도로 판단하였으며 이들을 결합시켜 131.2 g 의 백색 결정형 생성물을 수득하였다 (브로모당으로부터 55%, 락톨로부터 49%). Mp 160.5-162.0℃ 0.20% 알파를 포함하여 HPLC 순도 99.5%.
Figure pct00102
실시예 12: 화합물 12 의 제조(US20110015146)
Figure pct00103
(2S)-이소프로필2-((((2R,3R,4R,5R)-5(2-아미노-6-메톡시-9H-퓨린-9-일)-4-플루오로-3히드록시-4-메틸테트라히드로푸란-2-일)메톡시) (페녹시) 포스포릴아미노)프로파노에이트의 합성
250 mL 건조 둥근 바닥 플라스크에, 페닐 디클로로포스페이트 (2.66 g, 12.61 mmol) 및 무수 디클로로메탄 (40 mL) 을 적재하였다. 아미노 에스테르 염 (2.60 g, 15.53 mmol) 을 용액에 첨가하였고 혼합물을 -5℃ 로 냉각하였다. 이어서, -5℃ 에서 N-메틸 이미다졸 (7.7 mL, 97 mmol) 건조 주사기를 통해 신속하게 첨가하고 용액을 -5℃ 에서 1 시간 동안 교반하였다. 뉴클레오시드 ((2R,3R,4R,5R)-5-(2-아미노-6-메톡시-9H-퓨린-9-일)-4-플루오로-2-(히드록시메틸)-4-메틸테트라히드로푸란-3-올), 3.04 g, 9.7 mmol) 를 한번에 바이알로부터 -5℃ 에서 첨가하고 고체를 20 분 동안 천천히 용해시켰다. 반응 온도를 2 시간에 걸쳐 주위 온도로 상승시켰다. 17 시간 후, 반응이 완료되지 않았다. 더 많은 시약을 제조하고 (포스페이트 (2.66 g), 아미노에스테르 (2.60 g), 및 N-메틸 이미다졸 (3.8 mL, 48 mmol) 로부터) -5℃ 에서 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2 시간 이상 동안 교반하였다. TLC 로 반응이 거의 완료되었음이 나타났고 70 mL 의 디클로로메탄로 희석시켰다. HCI 용액 (1 N, 70 mL) 을 첨가하였다. 수성 층을 분리시키고 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기 층을 포화NaHCO3, 물, 염수로 세척하고 MgSO4 상에서 건조시켰다. 감압 하에 용매를 제거한 후, 끈적끈적한 잔류물을 240 g 카트리지 및 디클로로메탄 중 0-8% 구배 2-PrOH 를 사용하여 자동 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하여 생성물을 포말 고체로서 수득하였다 (4.16 g, 7.14mmol, 73% 수율). HPLC 순도 97.4%. 생성물의 NMR 스펙트럼으로, 이는 1.2:1 의 비율을 갖는 2 개의 입체이성질체인 것으로 나타났다.
1H-NMR (DMSO-d6 ): δ 7.98 (1H, s, 하나의 이성질체 중 8-H), 7.95 (1H, s, 또다른 이성질체 중 8-H), 7.37-7.32 (2H, m, arom-H), 7.22-7.15 (3H, m, arom-H), 6.6 (2H, s, NH2), 6.11 (1H, d, 하나의 이성질체 중 Cl'-H), 6.09 (1H, d, 또다른 이성질체 중 Cl'-H), 6.09-5.98 (1H, m, 아미드 NH), 5.88 (1H, d, 하나의 이성질체 중 3'-OH), 5.81 (1H, d, 또다른 이성질체 중 3'-H), 4.85-4.75 (1H, 헵타, 이소-프로필 중 메틴 H), 4.46-4.27 (2H, m, C4'-H, 아미노 에스테르 중 H), 4.15-4.07 (1H, m, C3'-H), 3.96 (3H, s, OCH3), 3.82-3.72 (2H, m, C5'-Ha 및 C5'Hb), 1.23-1.06 (9H, m, 아미노 에스테르 중 CH3'), 1.03 (3H, d,C2'-CH3).
31P-NMR (DMSO-d6 ): 0=4.91(하나의 이성질체), 4.72(또다른 이성질체).
대안적인 정제 방법은 크로마토그래피 분리를 단순화하기 위해 소량의 3' 포스포라미데이트 부산물을 화학적으로 변경하는 것이다. 미정제 포스포라미데이트 생성물을 무수 피리딘 (5 mL/g) 에 용해시키고, 0.5 몰 당량의 t-부틸디메틸실릴 클로라이드를 주위 온도에서 처리하여 자유 5' 주요 히드록시L 의 3' 이성질체 불순물로 선택적으로 반응하였다. 반응이 진행되는 것을 LC/MS 로 모니터링할 수 있었다. 일단 3' 이성질체가 5'-tBDMS-3'-포스포라미데이트 유도체로 전환되면, 반응을 메탄올 (3 eq) 로 켄칭하고, 감압 하에 농축시키고, 에틸 아세테이트와 5% 시트르산으로 분할하고, 이어서 유기 층을 농축시켰다. 이후, 잔류물을 크로마토그래피로 처리하여 이를 더 높은 적재 및 신속한 구배로 처리하여 더욱 높은 순도를 달성하였다.
실시예 13: 화합물 13 의 제조(US20110015146)
Figure pct00104
실시예 14: 화합물 14 의 제조 (US 7,964,580, 실시예 5)
Figure pct00105
2'-데옥시-2'-플루오로-2'-C-메틸우리딘-5'-페닐 메톡시-알라닐 포스페이트) 의 제조
3 mL 의 THF 에 용해된 페닐 메톡시알라니닐 포스포로클로라이데이트 (1 g, 6.5 eq) 를 실온에서 강한 교반 하에 3 mL THF 중에서 2'-데옥시-2'-플루오로-2'-C-메틸우리딘 (0.15 g, 1 eq) 및 N-메틸이미다졸 (0.3 g, 8 eq) 의 혼합물에 첨가하고, 이어서 반응물을 밤새 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 생성된 미정제 생성물을 물/아세토니트릴 구배 용리 이동 상을 사용하여 YMC 25x30x2 mm 컬럼 상에서 예비-HPLC 로 정제하였다. 아세토니트릴 및 물을 감압 하에 제거하여 원하는 생성물 (50.1 mg, 15.6%) 을 수득하였다.
Figure pct00106
실시예 15: 화합물 15 의 제조 (실시예 55, US 7,964,580)
Figure pct00107
Figure pct00108
뉴클레오시드 포스포라미데이트 유도체를 위한 일반적인 절차는 US 7,964,580 의 컬럼 461 에 보고되어 있다. 무수 테트라히드로푸란 (THF) 중 적절한 포스포로클로라이데이트 (6.5 당량) 의 용액을 밤새 교반된 반응 혼합물을 사용하여 실온에서 강한 교반 하에 무수 THF 중에서 N-메틸이미다졸 (8 당량) 및 뉴클레오시드 (1 당량) 의 혼합물에 첨가될 수 있다. 용매를 진공 하에 제거할 수 있고, 미정제 물질을 컬럼 크로마토그래피로 정제하고 제조용 박층 크로마토그래피로 정제하여 원하는 화합물을 수득할 수 있다.
실시예 16: 화합물 16 의 제조 (US 7,429,572)
Figure pct00109
사이티딘으로부터 출발하여 (2'R)-2'-데옥시-2'-플루오로-2'-C-메틸사이티딘의 합성
단계 1: DMF (2.06 L) 중 사이티딘 (100 g, 0.411 mol) 현탁액에, 벤조 무수물 (102.4 g, 0.452mol) 을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 20 h 동안 교반하였다. DMF 를 진공 하에 제거하고 잔류물을 디에틸 에테르를 이용하여 분쇄하였다. 생성되는 고체를 흡인 여과로 수집하고 디에틸 에테르 (2x200 mL) 로 세척하였다. 진공 하에서 실온에서 추가로 건조하여 N4 벤즈아미드 (140.6 g, 98.3%) 를 제공하였다. 이러한 물질 (139.3g, 0.401 mol) 의 일부를 무수 피리딘 (1.2 L) 에 용해시키고 실온에서 1,3-디클로로-1,1,3,3-테트라이소프로필-디실록산 (141.4 mL, 0.441 mol) 으로 처리하였다. 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 진공 하에 건조 농축시키고 톨루엔 (3x200 mL) 을 이용하여 공동증발시켰다. 잔류물을 EtOAc (1.8L) 로 처리하고 HCl (2x200 mL, 0.05 N), NaHCO3 (5%, 2x400 mL) 로 처리하였다. 유기 층을 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과시키고, 건조 증발시켰다. 화합물 16-1 (화합물 4-1, US 7,429,572) (256.5 g, >100%) 을 백색 포말로서 단리하고 추가의 정제 없이 사용하였다.
단계 2: 화합물 16-1 (236.5 g, 0.40 mol) 을 건조 THF (1.22 L) 에 용해시켰다. 무수 DMSO (180.8 mL, 2.1 mol) 을 첨가하고 생성 용액을 -20℃ 내지 -15℃ 로 냉각시켰다. 트리플루오로아세틱 무수물 (90.6 mL, 0.64 mol) 를 45 분에 걸쳐 적하 방식으로 첨가하고 용액을 2 시간 동안 -20℃ 내지 -15℃ 로 교반하고, 이후 무수 트리에틸아민 (223.5 mL, 1.6 mol) 을 20 분에 걸쳐 첨가하였다. 케톤 16-2 을 함유하는 미정제 반응물을 EtOAc (500 mL) 에 용해시키고, 생성 용액을 H2O (3x400 mL) 로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4) 용매를 진공 하에 제거하여 황색 고체를 수득하였으며 이를 헥산 중 단계 방식 구배 Et2O (0-60%) 이어서 헥산 중 단계 방식 구배의 EtOAc (50-100%) 로 용리하는 실리카 겔 컬럼 상에서 정제하였다. 이에 따라 수득된 미정제 케톤 (~192 g) 을 석유 에테르로부터 결정화하여 케톤 16-2 (화합물 4-2, US 7,429,572) (138.91 g, 사이티딘으로부터 57.5%) 를 백색 고체로서 생성하고 22 g 의 미반응 출발 물질, 16-1 을 황색 고체로서 수득하였다.
단계 3: 화합물 16-2 (48.57 g, 8.26 mmol) 을 무수 톨루엔 (~400 mL) 에 용해시키고 습기를 배제한 채 용매를 진공 하에 제거하였다. 이어서 잔류물을 추가 2 시간 동안 진공 하에 (오일 펌프) 추가 건조시켰다. 습기를 엄격하게 배제하고, 잔류하는 포말을 아르곤 하에서 무수 디에틸 에테르 (1.03 L) 에 용해시켰다. 생성 용액을 아르곤 하에서 -78℃ 로 냉각시키고 MeLi (1.6 M, 258.0 mL, 0.413 mol) 를 첨가 깔때기를 통해 적하 방식으로 첨가하였다. 첨가를 완료한 후, 혼합물을 2 시간 동안 -78℃ 에서 교반하였다. 수성 1M NH4Cl (500 mL) 를 천천히 첨가하였다. 실온으로 가온한 후, 혼합물을 H2O (2x500 mL) 로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 건조 농축시켜 갈색 포말을 수득하였다 (~60 g, >100%). 37.62 g 및 56.4 g 의 화합물 16-2 을 사용하여 2 회 이상 반응을 수행하였다. 결합된 미정제 생성물 (128.0 g, 0.212 mol) 을 THF (1.28 L) 에 용해시키고 농축 HOAc (23 mL, 0.402 mol) 로 처리하였다. 용액에 TBAF (384.0 mL, THF 중 1 M) 를 첨가하였다. 용액을 실온에서 0.75 h 동안 교반하고 혼합물을 실리카 겔 (750 g) 로 처리하고 건조 농축시켰다. 분말을 CH2Cl2 에 패킹된 실리카 겔 컬럼에 두었다. 1:7 EtOH-CH2Cl2 를 이용하는 용리로 실리카 겔 (300 g) 상에서 예비-흡착된 진한 왁스 고체를 수득하고 상기와 같이 크로마토그래피하였다. 화합물 16-3 (화합물 4-3, US 7,429,572) (46.4 g, 화합물 16-2 로부터 53.0%) 을 회백색 고체로서 단리하였다.
Figure pct00110
C17H19N3O6.0.5 H2O 에 대한 분석 계산치: C, 55.13; H, 5.44; N, 11.35. 측정치: C, 55.21; H, 5.47; N, 11.33.
단계 4: 화합물 16-3 (46.0 g, 0.13 mol) 을 무수 피리딘에 용해시키고 진공 하에 농축 건조시켰다. 생성 시럽을 아르곤 하에서 무수 피리딘에 용해시키고 교반 하에 0℃ 로 냉각시켰다. 갈색 용액을 10 분에 걸쳐 적하 방식으로 벤조일 클로라이드 (30 mL, 0.250 mol) 로 처리하였다. 빙욕을 제거하고 1.5 h 동안 교반을 지속하고, 이에 의해 TLC 는 잔류하는 출발 물질이 없음을 나타냈다. 물 (5 mL) 의 첨가에 의해 혼합물을 켄칭시키고 건조 농축시켰다. 잔류물을 최소량의 CH2Cl2 에 용해시키고 포화 NaHCO3(1x500 mL) 및 H2O (1x500mL) 로 세척하였다. 유기 상을 건조시키고 (Na2SO4) 여과하고, 건조 농축시키고 EtOAc-헥산의 단계 방식 구배로 (25-60%) 용리하는 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하여 화합물 16-4 을 황색 포말로서 수득하였다 (화합물 4-4, US 7,429,572) (48.5 g, 67%).
Figure pct00111
측정치: C, 65.59; H, 4.79; N, 7.16.
단계 5: 화합물 16-4 (7.50 g, 0.013 mol) 을 아르곤 하에서 무수 톨루엔 (150 mL) 에 용해시키고 -20℃ 로 냉각시켰다. DAST (2.5 mL, 18.9 mmol) 를 천천히 첨가하고 첨가 후 냉각욕을 제거하였다.
1 시간 동안 교반을 계속하고 혼합물을 포화 NaHCO3 (100 mL) 에 붓고 기체 변화가 중지될 때까지 세척하였다. 유기 상을 건조시키고 (Na2SO4), 농축시키고, 1:1 EtOAc-헥산으로 용리하면서 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다. 1.22 g (16.3%) 의 순수 화합물 16-5 (화합물 4-5, US 7,429,572) 을 백색 고체로서 수득하였다. mp 241℃ (CH2Cl2-헥산);
Figure pct00112
19F NMR (CDCl3):δ3.3 (m). C31H26FN3O7.O.7 H2O 에 대한 분석 계산치: C, 63.74; H, 4.72; N, 7.20. 측정치: C, 63.71; H, 4.54; N, 7.20.
단계 6: 화합물 16-5 (6.30 g, 0.011 mol) 을 메탄올 암모니아 (약 7 N, 150 mnL) 에서 현탁하고 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 진공 하에 제거하고, 메탄올 (1x20 mL) 을 이용하여 공동-증발시키고, 실리카 겔 상에서 예비-흡착시켰다. 백색 분말을 실리카 겔 컬럼 (CHCl3 에서 패킹됨) 상에 두고 컬럼을 9% EtOH 로 용리하고, 이어서 17% EtOH 및 최종적으로 25% EtOH (CHCl3 에서) 로 용리하였다.
생성물을 함유하는 분획을 농축시키고, 0.4 ㎛ 디스크를 통해 여과하고, 물로부터 동결건조시켜 화합물 16-6 (화합물 4-6, US 7,429,572), 2.18 g (76%) 을 수득하였다.
Figure pct00113
19F NMR (DMSO-d6):δ2.60 (m). C10H14FN3O4.4.1.4 H20 에 대안 분석 계산치: C, 44.22; H, 5.95; N, 14.77. 측정치: C, 42.24; H, 5.63; N, 14.54. 화합물 16-6 (0.10 g, 0.386 mmol) 을 물 (2 mL) 에 용해시킴으로써 염화수소 염으로 전환시키고 1 M HCl 를 이용하여 pH 를 대략 3.0 으로 조정하였다. 물을 진공 하에 제거하고 잔류물을 수성 EtOH 로부터 결정화하여 화합물 16-6 을 염화수소 염으로서 수득하였다 (71.0 mg). mp 243℃ (dec);
Figure pct00114
19F NMR (DMSO-d4):δ1.69 (m). C10H14FN3O4.HCl 에 대한 분석 계산치: C, 40.62; H, 5.11; N, 14.21. 측정치: C, 40.80; H, 5.09; N, 14.23.
생물학적 실시예
검정 프로토콜
고처리량 레플리콘 검정 (HTBS)
H77 (유전자형 1a) 또는 Con1 (유전자형 1b) HCV RNA 및 Renilla 발광효소 리포터를 갖는 레플리콘 세포를 G-418 을 배제하는, 90　mL 의 DMEM 배양 배지에서 웰 당 1.6×103 세포의 밀도로, 384-웰 블랙 플레이트에 시딩하였다. 화합물을 100% DMSO 중에서 연속물로 희석시키고 1:225 희석으로 세포에 첨가하여, Biotek μflow Workstation 를 이용하여 총 부피 90 ㎕ 의 0.44% DMSO 최종 부피를 달성하였다. 세포 플레이트를 5% CO2 를 이용하여 3 일 동안 37℃ 에서 인큐베이션하고, 이후 배양 배지를 제거하고 세포를 복제 수준에 대한 마커로서 발광효소 활성에 대해 검정하였다. 발광 효소 발현을 Dual-Glo 발광효소 검정 시약 (Promega, Madison, WI) 을 이용하여 측정하였다. 간단히 말하면, 20 ㎕ 의 Dual-Glo 발광효소 버퍼를 첨가하여 10 분 동안 세포를 용균시키고 이어서 20 ㎕ 의 희석된 Dual-Glo Stop & Glo 기질 (1:100) 을 각 웰에 첨가하였다. 10 분 동안 인큐베이션 후, 발광 신호를 Perkin Elmer Envision Plate 판독기 상에서 측정하였다. 발광 효소 수준을 비처리된 대조군 (100% 로 규정) 에 대한 백분율로 전환하고, 데이터를 XLFit4 소프트웨어 (IDBS, Emeryville, CA) 를 사용하여 지수 용량 반응 방정식 y　=　a/(1+(x/b)c) 에 핏팅하였다. EC50　값을 방정식으로부터 계산하였다.
대안적으로는, 항바이러스 활성을 HCV NS3 Protease IC50 Determination 으로 분석할 수 있다. HCV NS3 프로테아제 활성을 Taliani 방법 (Taliani M, Bianchi E, Narjes F, Fossatelli M, Urbani A, Steinkuhler C, et al., A continuous assay or hepatitis C virus protease based on resonance energy transfer depsipeptide substrates. Anal. Biochem. 1996; 240 (1):60-7; 상기 검정을 수행하는데 있어서 본원에 참조로 포함되어 있음) 을 기초로 하여 형광 공명 에너지 이동 (FRET) 뎁시펩티드 기질 (RET S1, Anaspec, San　Jose, CA) 을 사용하여 모니터링하였다.
간단히 말하면, 2-10 nM 의 정제된 NS3 프로테아제 도메인을 20μM 이소제닉 NS4A 펩티드 보조인자 (Sigma, St.　Louis, MO) 를 이용하여 50　mM HEPES pH　7.5 및 10　mM DTT 를 갖는 40% 글리세롤 버퍼 중에서 10 분 동안 37℃ 에서 예비인큐베이션하였다. 화합물을 DMSO 중에서 연속물로서 1:3 으로 희석시키고, 10 분 동안 효소/보조인자 혼합물을 이용하여 인큐베이션하고 반응을 2　μM RET S1 기질 (최종 농도) 의 첨가에 의해 개시하였다. Victor 3 V 형광 플레이트 판독기를 사용하여 1 시간에 걸쳐 형광 증가를 지속적으로 측정하였다. 최대 기울기 알고리즘을 이용하는 Workout 1.5 소프트웨어 (DAzDAQ, East Sussex, UK) 를 사용하여 각 저해제 농도에 대해 초기 속도를 계산하였다. 속도 데이터를 미처리된 대조군 (100% 로 규정) 에 대한 백분율로 전환하고 50% 저해 농도 (IC50) 를 계산하기 위해 비-선형 회귀를 수행하였다.
NS3 효소적 효능: 정제된 NS3 프로테아제를 NS4A 펩티드와 착물화하고, 이어서 일련의 희석된 화합물 (용매로서 DMSO 사용) 을 이용하여 인큐베이션하였다. 이중-라벨링된 펩티드 기질의 첨가 및 발생 동역학에 의해 반응을 개시하고 형광에서의 증가를 측정하였다. 속도 데이터의 비-선형 회귀를 수행하여 IC50 를 계산하였다. 유전자형 1b 프로테아제에 대항하는 활성을 초기에 시험하였다. 유전자형 1b 에 대항하여 수득되는 효능에 의존적으로, 부가적 유전자형 (1a, 2a, 3) 및 또는 프로테아제 저해인자 저항성 효소 (D168Y, D168V, 또는 A156T 돌연변이체) 를 시험할 수 있다. BILN-2061 을 모든 검정 동안 대조군으로서 사용하였다. 실시예의 화합물을 이 검정으로 평가하였고 약 1 μM 미만의 IC50 값을 갖는 것으로 밝혀졌다.
레플리콘 효능 및 세포독성: Huh-luc 세포 (Bartenschlager 의 I389luc-ubi-neo/NS3-3'/ET 유전자형 1b 레플리콘을 안정적으로 복제함) 를 72 시간 동안 일련의 희석 화합물 (용매로서 DMSO 사용) 을 이용하여 처리하였다. 레플리콘 복사 수를 생물발광에 의해 측정하고 비-선형 회귀를 수행하여 EC50 를 계산하였다. 동일한 약물 희석물로 처리된 평행적 플레이트를 Promega CellTiter-Glo cell 생존력 검정을 이용하여 세포독성에 대해 검정하였다. 1b 레플리콘에 대항하여 달성되는 효능에 의존적으로, D168Y 또는 A156T 돌연변이를 인코딩하는 유전자형 1a 레플리콘 및/또는 저해인자 저항성 레플리콘에 대항하여 화합물을 시험할 수 있었다. BILN-2061 을 모든 검정 동안 대조군으로서 사용하였다. 실시예의 화합물을 이러한 검정으로 평가하였고 약 5 μM 미만의 EC50 값을 갖는 것으로 밝혀졌다.
레플리콘 효능에 대해 혈청 단백질의 효과
레플리콘 검정을 인간 혈청 알부민 (40 mg/mL) 또는 α-산 당단백질 (1 mg/mL) 의 생리학적 농도로 보충된 정상 세포 배양 배지 (DMEM + 10%FBS) 에서 수행하였다. 인간 혈청 단백질의 존재 하에서 EC50 을 효능면에 있어서의 폴드 시프트를 결정하기 위해 정상 배지에서의 EC50 과 비교하였다.
효소 선택성: 'Porcine Pancreatic Elastase', 'Human Leukocyte Elastase', 'Protease 3', 및 'Cathepsin D' 를 비롯한 포유동물 프로테아제의 저해를 각 효소에 대해 각 기질에 대한 Km 에서 측정하였다. 각 효소에 대한 IC50 을 NS3 1b 프로테아제로 수득된 IC50 과 비교하여 선택성을 계산하였다.
MT-4 세포 세포독성: MT4 세포를 5 일 기간 동안 일련의 희석 화합물로 처리하였다. 세포 생존력을 Promega CellTiter-Glo 검정을 이용하여 처리 기간 마지막에 측정하고 비-선형 회귀를 수행하여 CC50 를 계산하였다.
EC 50 에서 세포와 연계된 화합물 농도: Huh-luc 배양액을 EC50 와 동일한 농도로 화합물을 이용하여 인큐베이션하였다. 여러 시점에서 (0-72 시간), 세포를 저온 배지로 2X 세척하고 85% 아세토니트릴로 추출하고; 각 시점에서의 배지 샘플을 또한 추출하였다. 세포 및 배지 추출물을 LC/MS/MS 로 분석하여 각 분획에서 화합물의 몰 농도를 결정하였다.
용해도 및 안정도: 10 mM DMSO 저장 용액의 분취액을 채취하고 총 1% 의 DMSO 농도를 갖는 시험 배지 용액 (PBS, pH 7.4 및 0.1 N HCl, pH 1.5) 에서 100 μM 의 최종 농도에서 화합물을 제조함으로써 용해도를 결정하였다. 시험 배지 용액을 1 시간 동안 진탕하여 실온에서 인큐베이션하였다. 이후, 용액을 원심분리하고 회수된 상청액을 HPLC/UV 상에서 검정하였다. 동일한 농도에서 DMSO 에서 검출되는 양과 비교하여 규정된 시험 용액에서 검출되는 화합물의 양을 비교함으로써 용해도를 계산할 수 있다. 37℃ 에서 시험 배지에서 1 시간 인큐베이션 후 화합물의 용해도를 또한 결정하였다.
저온보존된 인간, 개 및 래트 간세포에서의 안정도:
각 화합물을 37℃ 에서 간세포 현탁액 (100 ㎕, 웰 당 80,000 세포) 에서 1 시간 이하 동안 인큐베이션하였다. 저온보존된 간세포를 혈청-미함유 인큐베이션 배지에서 재구성하였다. 현탁액을 96-웰 플레이트 (50 ㎕/웰) 로 이동시켰다. 화합물을 인큐베이션 배지에서 2 μM 인큐베이션 배지에 희석시키고 이어서 간세포 현탁액에 첨가하여 인큐베이션을 시작하였다. 인큐베이션 0, 10, 30 및 60 분 후 샘플을 채취하고 90% 아세토니트릴/10% 물 중에서 0.3% 포름산으로 이루어진 혼합물을 이용하여 반응을 켄칭시킬 수 있었다. 각 샘플에서 화합물의 농도를 LC/MS/MS 를 이용하여 분석하였다. 간세포 현탁액에서 화합물이 없어지는 반감기를, 단일상 지수함수 방정식을 이용하여 농도-시간 데이터를 핏팅함으로써 결정하였다. 또한, 데이터는 고유의 간의 클리어런스 및/또는 총 간 클리어런스까지 규모를 점차 증가시켰다.
인간, 개 및 래트에서 간 S9 분획에서 안정성: 각각의 화합물을 37℃ (n　=　3) 에서 S9 현탁액 (500 ㎕, 3 mg 단백질/mL) 에서 1 시간 이하 동안 인큐베이션하였다. 화합물을 S9 현탁액에 첨가하여 인큐베이션을 시작하였다. 인큐베이션 시작 0, 10, 30, 및 60 분 후 샘플을 채취하였다. 각 샘플에서 화합물의 농도를 LC/MS/MS 를 이용하여 분석하였다. S9 현탁액에서 화합물이 없어지는 반감기를, 단일상 지수함수 방정식을 이용하여 농도-시간 데이터를 핏팅함으로써 결정하였다.
카카오-2 투과도:
둘 모두의 진행방향 (A 에서 B 로) 및 역방향 (B 에서 A 로) 투과도를 측정하였다. 카카오-2 단일층을 12-웰 Costar Transwell® 플레이트에서 콜라겐-코팅된, 미세다공성, 폴리카르보네이트 막 상에서 합류로 성장시켰다. 화합물을 진행방향 투과도 (A 에서 B 로) 에 대해 정점의 측면으로 투여하고, 역방향 투과도 (B 에서 A 로) 에 대해 기저측막 상에서 투여하였다. 세포를 습기가 있는 인큐베이터에서 5% CO2 를 이용하여 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시작시, 인큐베이션 1 시간 후 및 2 시간 후, 200-㎕ 분취액을 수용 챔버로부터 채취하고 신선한 검정 버퍼로 대체하였다. 각 샘플에서 화합물의 농도를 LC/MS/MS 를 이용하여 측정하였다. 겉보기 투과도 (Papp) 를 계산하였다.
혈장 단백질 결합: 혈장 단백질 결합을 평형 투석에 의해 측정하였다. 각 화합물을 2 μM 의 최종 농도에서 블랭크 혈장으로 스파이킹하였다. 스파이킹된 혈장 및 포스페이트 버퍼를 조립된 투석 세포의 반대면에 두고, 이어서 37℃ 수욕에서 천천히 회전시켰다. 인큐베이션 마지막에, 혈장 및 포스페이트 버퍼 내 화합물의 농도를 결정하였다. 비결합도% 를 하기 방정식으로 계산하였다:
Figure pct00115
[식 중,
Cf 및 Cb 는 투석후 버퍼 및 혈장 농축물로서 측정시 각각 유리 농도 및 결합 농도임].
CYP450 프로파일링: 각각의 화합물을 NADPH 의 존재 및 부재 하에 CYP1A2, CYP2C9, CYP3A4, CYP2D6 및 CYP2C19 를 비롯한 5 개의 재조합 인간 CYP450 로 인큐베이션하였다. 일련의 시료를 인큐베이션 시작시, 인큐베이션 시작 5, 15, 30, 45 및 60 분 후 인큐베이션 혼합물로부터 채취할 수 있었다. 인큐베이션 혼합물에서 화합물의 농도를 LC/MS/MS 로 측정하였다. 매 시점에서 인큐베이션 후 남아 있는 화합물의 백분율을 인큐베이션 시작시 샘플링과 비교함으로써 계산하였다.
래트, 개, 원숭이 및 인간 혈장에서 안정성: 화합물을 37℃ 에서 혈장에서 (래트, 개, 원숭이 또는 인간) 2 시간 이하 동안 인큐베이션하였다. 1 및 10 mg/mL 의 최종 농도로 화합물을 혈장에 첨가하였다. 화합물을 첨가한 0, 5, 15, 30, 60, 및 120 분 후 분취액을 채취하였다. 각 시점에서 화합물의 농도 및 주요 대사산물을 LC/MS/MS 로 측정하였다. 생물학적 데이터 (항바이러스 효능 [EC50] 을 Renilla 발광효소 (RLuc)-기재 HCV 레플리콘 리포터 검정 - HCV 1b RLuc 을 이용하여 결정함).
생물학적 실시예 1: 화합물 1 및 화합물 2 의 조합의 항-HCV 활성
재료 및 방법
화합물 1 및 화합물 2 은 Foster　City, CA 소재의 Gilead Sciences 에서 합성했다.
세포주
HCV 유전자형 1b 레플리콘 세포 (Huh-luc) 를 Reblikon (Mainz, 독일) 에서 입수했다. 그러한 세포에서의 레플리콘은 I389luc-ubi-neo/NS3-3'/ET 로 정했으며, 선별가능한 내성 마커 (네오마이신 포스포트랜스퍼라아제) 뿐만 아니라 개똥벌레 루시퍼라아제 리포터 유전자를 인코딩한다. Huh-luc 세포는 10% 우태아 혈청 (FBS; Hyclone, Logan,　UT) 및 0.5　mg/mL 의 G-418 (GIBCO) 를 보충한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; GIBCO, Carlsbad, CA) 에서 유지했다. 세포를 1 주 2 회 계대배양하고, 서브컨플루언트 수준에서 유지했다.
EC50 결정
레플리콘 세포를, G418 를 제외하고, 100 ㎕ 의 DMEM 배양 배지 중에 웰 당 5×103 개 세포의 밀도로 96 웰 플레이트에 시딩했다. 화합물 1 및 2 를 100% DMSO (Sigma) 중에 1:3 로 연쇄적으로 희석했다. 그러한 연쇄 희석물을 세포에 1:200 희석으로 첨가해 최종 부피 200 ㎕ 중에 최종 농도 0.5% DMSO 를 달성했다. 플레이트를 37℃ 에서 3 일간 인큐베이션한 후, 배양 배지를 제거하고, 세포를 해리시키고, 시판 루시퍼라아제 검정 (Promega, Madison, WI) 을 이용해 루시퍼라아제 활성에 대해 검정했다. 약물 처리된 시료에서의 HCV 복제 수준을 미처리 대조군 (100% 로 정의) 의 것에 대한 백분율로 나타냈고, XLFit4 소프트웨어 (IDBS, Emeryville, CA) 를 이용해 대수적 투여량 응답성 등식 y=a/(1+(x/b)c) 에 맞추었다. EC50 값은 선행기술 (Delaney, W.E., et al., Antimicrobial Agents Chemotherapy, 45(6):1705-1713 (2001)) 에 기재된 바와 같이 결과물인 등식으로부터 산출되었다.
항바이러스 조합 연구
레플리콘 세포를 100 ㎕ 의 배양 배지 중에 웰 당 5×103 개 세포의 밀도로 96 웰 플레이트에 시딩했다. 화합물 1 및 2 를 상기 기재된 바와 같이 100% DMSO 중에 연쇄적으로 희석하고, 96-웰 플레이트에 매트릭스 포맷으로 첨가하여, 최종 부피 200 ㎕ 및 최종 DMSO 농도 0.5% 중에 상이한 약물 농도의 정해진 셋트를 제공하게 된다. 각 개별 약물에 대해, EC50 값은 시험한 농도 범위에 대한 중간값으로 선택했다. 세포를 3 일 동안 인큐베이션하고, 상기 기재된 바와 같이 루시퍼라아제 발현에 대해 분석했다. 조합 연구를 위해, 3 개씩 2 회의 독립적인 실험을 실시했다.
조합 데이터 분석
Prichard and Shipman 에서 개발한 MacSynergy II 프로그램을 이용해 데이터를 분석했다 (Prichard MN, Aseltine KR, Shipman C, Jr., MacSynergyTM II, Version 1.0. University of Michigan, Ann Arbor, Michigan, 1993; Prichard M.N., Shipman C., Jr., Antiviral Res 14 (4-5):181-205 (1990); Prichard M.N., Shipman C, Jr., Antivir Ther 1 (1):9-20 (1996); Prichard M.N., et al., Antimicrob Agents Chemother 37 (3):540-5 (1993). 소프트웨어는 약물들간의 가산적인 상호작용 (Bliss Independence 모델을 기반으로 함) 을 가정하여 이론적 억제값을 산출하고, 이론 및 관찰된 억제값 사이의 통계적으로 유의한 차이를 정량한다. 3 차원에서 그러한 차이를 그래프화하는 것으로, Z-평면에서 볼록한 곳이 항바이러스 상승작용을 나타내고, 오목한 곳은 화합물들간의 항바이러스 길항작용을 나타내는 표면을 제공하게 된다. 표면 편차의 산출된 부피는 nM2% 로 나타낸다. Prichard 및 Shipman 에 따르면, 조합 효과는 다음과 같이 정의된다:
Figure pct00116
부피 > 100 nM2 인 경우, 매우 상승작용적임.
Figure pct00117
부피가 > 50 및 ≤100 nM2 인 경우, 약간 상승작용적임.
Figure pct00118
부피가 > -50 nM2 및 ≤50 nM2 인 경우, 가산성임.
Figure pct00119
부피가 > -100 nM2 및 ≤-50 nM2 인 경우, 약간 길항작용적임.
Figure pct00120
부피가 ≤-100 nM2 인 경우, 길항작용적임.
결과
조합 실험 개시 전, Huh-luc 레플리콘 세포에서의 EC50 값은 화합물 1 및 화합물 2 에 대해 결정되었고, 결과를 표 II 에 제시한다. 두 화합물 모두 항바이러스 효과를 가졌다.
표 II
Huh-luc 레플리콘 세포에서 항-HCV 화합물 1 및 2 에 대한 개별 EC50
Figure pct00121
a EC50 는 2 회 이상의 독립적인 실험에 대한 평균±표준 편차를 나타냄.
화합물 1 및 화합물 2 의 조합의 항바이러스 효과를 측정하고, 결과로 제공된 데이터를 MacSynergy　II 를 이용해 분석하여, 가산성으로부터 유의한 편차를 나타내는 표면 그래프를 제공하게 된다. 부가성으로부터 통계적으로 유의한 편자의 정량은 화합물 1 및 2 의 조합이 -50 nM2 내지 50　nM2 의 상승작용/길항작용 부피를 갖는다는 점을 나타내어, 표 III 에 제시된 바와 같이 가산적 항바이러스 효과를 나타낸다.
표 III
화합물 1 및 화합물 2 의 조합에 대한 항바이러스 상승작용 및 길항작용 및 약물 상호작용의 정량
Figure pct00122
a 값들은 3 개씩 실시되는 두 번의 독립적 실험의 평균±표준 편차를 나타냄
표 III 에 제시된 시험관내 실험의 결과는 화합물 2 가 화합물 1 과 조합될 때 가산적인 항바이러스 활성을 갖는다는 점을 나타낸다.
생물학적 실시예 2: 화합물 3 과의 조합
재료 및 방법
항바이러스 화합물
화합물 1 및 화합물 3 을 Foster　City, CA 소재의 Gilead Sciences 에서 합성했다. 리바비린 및 IFN-α 은 Sigma (St.　Louis,　MO) 에서 구매했다.
세포주
HCV 유전자형 1b 레플리콘 세포 (Huh-luc) 를 Reblikon (Mainz, 독일) 로부터 입수했다. 그러한 세포들에서의 레플리콘을 I389luc-ubi-neo/NS3-3'/ET 로 지정하고, 선별가능한 내성 마커 (네오마이신 포스포트랜스퍼라아제) 뿐만 아니라 개똥벌레 루시퍼라아제 리포터 유전자를 인코딩한다. Huh-luc 세포를 10% 우태아 혈청 (FBS, Hyclone, Logan, UT) 및 0.5　mg/mL 의 G-418 (Invitrogen) 을 보충한 GlutaMAXTM(Invitrogen, Carlsbad, CA) 가 있는 Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) 에서 유지했다. 세포를 1 주 2 회 계대배양하고, 서브컨플루언트 수준에서 유지했다.
EC50 결정
레플리콘 세포를 G-418 를 제외한, 100　㎕ 의 DMEM 및 10% FBS 배양 배지 중의 웰 당 5×103 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩했다. 화합물을 100% DMSO (Sigma) 중에 1:3 로 연쇄적으로 희석했다. 그러한 연쇄 희석물을 1:200 희석으로 세포에 첨가해 200 ㎕ 의 총 부피 중에 최종 농도가 0.5% DMSO 이 되도록 했다. 플레이트를 37℃ 에서 3　일간 인큐베이션한 후, 배양 배지를 제거하고, 세포를 해리시키고, 시판 루시퍼라아제 검정 (Promega, Madison,　WI) 을 이용해 루시퍼라아제 활성에 대해 검정했다. 약물-처리 시료에서의 HCV 복제 수준을 미처리 대조군 (100% 로 정의됨) 중 그들의 백분율로 나타내고, 데이터를 XLFit4 소프트웨어 (IDBS, Emeryville,　CA) 를 이용해 로지스틱 투여량 응답성 등식 y=a/(1+(x/b)c) 에 맞췄다. EC50 값은 상기 기재된 결과로 제시된 등식으로부터 산출되었다.
항바이러스 조합 연구
레플리콘 세포를 G-418 를 제외하고, 100 ㎕ 의 배양 배지 중에 웰 당 5×103　세포의 밀도로 96=웰 플레이트에 시딩했다. 화합물 3 및 여타 화합물들을 상기 기재된 바와 같이 100% DMSO 중에 연쇄적으로 희석하고, 96-웰 플레이트에 매트릭스 포맷으로 첨가하여, 최종 부피 200 ㎕ 및 최종 DMSO 농도 0.5% 중에 상이한 약물 농도 및 비율의 정해진 셋트를 수득했다. 각 개별 약물 (리바비린은 제외) 에 대해, EC50 값은 시험한 농도 범위에 대한 중간값으로 선택되었다. 리바비린에 대해서는, 선택된 항바이러스 유효성을 갖고 있지 않았는데, 6.2 μM 은 세포 독성이 관찰되기 시작한 농도의 약 3 배 미만이었기 때문에, 최고 투여량을 6.2 μM 으로 선택했다. 세포를 3 일간 약물과 인큐베이션하고, 상기 기재된 바와 같이 루시퍼라아제 발현에 대해 분석했다. 각 조합 연구에 대해, 2 회의 독립적 실험을 3 개씩 실시했다.
조합 데이터 분석
데이터는 Prichard and Shipman 에서 개발한 MacSynergy II 프로그램을 이용해 분석했다. 상기 소프트웨어는 약물들간의 가산적 상호작용 (Bliss Independence 모델을 근거로 함) 을 가정하여 이론적인 저해를 산출하며, 이론 및 실측 저해값 사이의 통계적으로 유의한 차이를 정량한다. 3 차원에서 그러한 차이를 그래프화하는 것으로, Z-평면에서 볼록한 곳이 항바이러스 상승작용을 나타내고, 오목한 곳은 화합물들간의 항바이러스 길항작용을 나타내는 표면을 제공하게 된다. 표면 편차의 산출된 부피는 nM2% 로 나타낸다. Prichard 및 Shipman 에 따르면, 조합 효과는 다음과 같이 정의된다:
Figure pct00123
부피 > 100 nM2 인 경우, 강력한 상승작용; 이러한 분량의 상승작용은 아마도 생체내에서 중요할 수 있음
Figure pct00124
부피가 > 50 및 ≤100 nM2 인 경우, 중도의 상승작용; 이러한 분량의 상승작용은 생체내에서 중요할 수 있음
Figure pct00125
부피가 > 25 nM2 및 ＜50 nM2 인 경우, 경미한 상승작용.
Figure pct00126
부피가 > -25 nM2 및 ≤25 nM2 인 경우, 부가적임
Figure pct00127
부피가 > -25 nM2 및 > -50 nM2 인 경우,
Figure pct00128
부피가 > -100 nM2 및 ≤-50 nM2 인 경우, 중도의 길항작용; 이러한 분량의 길항작용은 생체내에서 중요할 수 있음.
Figure pct00129
부피가 ≤-100 nM2 인 경우, 강력한 길항작용; 이러한 분량의 길항작용은 아마도 생체내에서 중요할 수 있음.
결과
Huh-luc 레플리콘 세포에서 개별 화합물에 대한 EC50 값.
조합 실험 개시 전, 표 IV 에 제시된 바와 같이 Huh-luc 레플리콘 세포에서의 EC50 값을 결정했다. 세포독성을 나타내기 시작한 농도 이하에서는 항바이러스 활성을 갖지 않던 리바비린을 제외한 모든 화합물은 항바이러스 활성을 갖고 있었다.
표 IV
Huh-luc 레플리콘 세포에서의 항-HCV 화합물에 대한 개별 EC50
Figure pct00130
a EC50 는 2 회 이상의 독립적 실험에 대한 평균±표준편차를 나타냄.
b INF-α EC50 는 나노몰 농도 대신 밀리리터 (mL) 당 단위 (U) 로 나타냄.
조합 항바이러스 효과 및 약물 상호작용
IFN-α, 리바비린, 및 화합물 1 과 조합했을 때 화합물 3 의 항바이러스 효과를 검정했다. 결과로 수득한 데이터를, 부가성으로부터의 유의한 편차를 보여주는 표면 그래프를 제공하는 MacSynergy　II 를 이용해 분석했다. 부가성으로부터의 통계적으로 유의한 편차의 정량은 화합물 3 과 IFN-α 와의 조합이 경미한 상승작용을 제공함을 나타냈다 (상승작용 부피가 각각 32 및 36.5 nM2; 표 V). 화합물 3 과 비-뉴클레오시드 NS5B 저해인자 화합물 1 과의 조합이, 가산적 항바이러스 상호작용을 나타내는 상승작용 부피 14.5 nM2 를 제공했다. 표 V 에 제시된 바와 같이, 화합물 중 그 어느 것도 화합물 3 과 조합했을 때 가산적 범위 (> -25 nM2) 를 벗어나는 항바이러스 길항작용 부피를 제공하지 않았다.
표 V
화합물 3 과의 약물 조합에 대한 항바이러스 상승작용 및 길항작용 및 약물 상호작용의 정량
Figure pct00131
a 값들은 3 개씩 2 회 실시된 독립적 실험의 평균±표준 편차를 나타냄
그러한 시험관내 항바이러스 조합 실험은 신규한 HCV NS3 프로테아제 저해인자 화합물 3 이 IFN-α 와 조합되는 경우 경미한 상승작용을 갖게 되며, 리바비린과 조합되는 경우 중도의 상승작용을 갖는다는 것을 나타낸다. 그러한 결과는, 임의의 개별 약물의 효능을 감소시키지 않고 강화된 바이러스 부하 억제를 달성하기 위해 화합물 3 이 HCV 환자에서의 케어의 현재 표준 (PEG-IFN-α　와　리바비린) 과 조합하여 잠재적으로 사용될 수 있음을 시사한다. 화합물 3 의 비-뉴클레오시드 (화합물 1) NS5B 폴리머라아제 저해인자와의 조합 결과 가산성이 제공되었다. 그러한 결과는, 화합물 3 이 환자에서 다중 클래스의 특이적 HCV 저해인자를 포함하여 이루어지는 약물 조합 탐사에 적합할 수 있음을 나타낸다.
생물학적 실시예 3: 화합물 4 조합
재료 및 방법
항-HCV 작용제
화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4, 화합물 5, 및 화합물 6 을 Gilead Sciences (Foster　City, CA) 에서 합성했다. 퓨로마이신, IFN-α 및 리바비린은 Sigma (St. Louis, MO) 에서 구입했다. Calcein AM 은 Anaspec (Fremont, CA) 에서 구입했다.
세포주 및 세포 배양
본 연구에 이용한 HCV 유전자형 1a 레플리콘 세포주는 상기 기재한 바 있다. 세포를 10%　FBS (HyClone, Logan, UT, Cat#SH30071.03), 100 Units/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 (Gibco, Carlsbad, CA, Cat# 15140-122), 및 0.1 mM 비필수 아미노산 (Gibco, Carlsbad, CA, Cat#11140-050) 을 보충한, GlutaMAX (Gibco, Carlsbad, CA, Cat# 10569-044) 가 있는 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 을 포함하는 세포 배양 배지에서 생장시켰다. 레플리콘 세포를 0.5 mg/mL Geneticin (Invitrogen, Carlsbad, CA, Cat# 10131-035) 중에 유지하여 HCV 레플리콘의 소실을 방지했다. 세포를 컨플루언트한 상태에 도달하기 전에 3 내지 4 일마다 계대배양했다.
EC50, CC50 결정 및 조합 연구를 위한 HCV 레플리콘 검정
제조사 (Sigma, St. Louis, MO, Cat#I4276) 에서 특정화한 완충액 중에 공급되는 IFN-α 를 제외한 모든 화합물들을 100% DMSO 중에 공급했다. 화합물 연쇄 희석은, 섹션 3.2 에서 기재한 세포 배양 배지에서 연쇄적으로 희석하는 IFN-α 를 제외하고는 100% DMSO 에서 실시했다. 모든 연쇄 희석은 Biomek FX Workstations 을 이용해 384-웰 폴리프로필렌 플레이트 (Thermo Scientific, Hudson, NH, Cat#4341) 에서 실시했다. EC50 및 CC50 결정을 위해, 시험 화합물을 384-웰 플레이트의 컬럼 3 내지 20 에 1:3 희석으로 10 단계에 걸쳐 연쇄적으로 희석했다. 조합의 연구를 위해, 한 화합물을 수평 방향으로는 1:2 희석으로 9 단계에 걸쳐 연쇄적으로 희석하는 한편, 다른 화합물을 수직 방향으로는 1:2 희석으로 7 단계에 걸쳐 연쇄적으로 희석했다. 이는 상이한 약물 농도 및 비율의 정해진 셋트를 제공했다. 각 개별 약물에 대해, EC50 값은 시험한 농도 범위의 중간값으로 선택했다. 모든 연쇄 희석을 동일한 384-웰 플레이트에서 화합물마다 4 개씩 실시했다. 100% DMSO 를 각 연쇄 희석 384-웰 플레이트의 컬럼 1 내지 2 에 첨가했다. 100 μM 의 HCV 프로테아제 저해인자 ITMN-191 를 HCV 복제의 100% 억제 대조군으로 컬럼 34 에 첨가하는 한편, 10 mM 의 푸로마이신을 100% 세포독성의 대조군으로 컬럼 24 에 첨가했다.
흑색 폴리스티렌 384-웰 플레이트 (Greiner Bio-one, Monroe, NC, Cat#781086, 처리된 세포 배양) 의 각 웰에, 2000 개의 현탁된 HCV 레플리콘 세포를 포함하고 있는 90 ㎕ 의 세포 배양 배지 (제네티신 부재) 를 Biotek μFlow Workstation 을 이용해 첨가했다. 세포 배양 플레이트로의 화합물 수송을 위해, 화합물 연쇄 희석 플레이트로부터의 0.4 ㎕ 의 화합물 용액을 Biomek FX Workstation 상의 세포 배양 플레이트로 이동시켰다. 최종 검정 웰 중의 DMSO 농도는 0.44% 였다. 플레이트를 3 일간 5% CO2 및 85% 습도 하에 37℃ 에서 인큐베이션했다.
HCV 레플리콘 검정은 동일한 웰로부터 세포독성 및 항-레플리콘 활성을 모두 평가할 수 있는 다중복합적 검정이다. CC50 검정을 가장 먼저 실시했다. 384-웰 세포 배양 플레이트 내 배지를 흡출하고, 웰을 Biotek ELX405 플레이트 워셔를 이용해 각각 100　㎕ 1 X PBS 로 4 회 세척했다. 400 nM calcein AM (Anaspec, Fremont, CA, Cat#25200-056) 을 1　X　PBS 중에 포함하는 용액 50 ㎕ 를 Biotek μFlow Workstation 을 사용해 플레이트의 각 웰에 첨가했다. 플레이트를 30 분간 실온에서 인큐베이션한 후, 형광 신호 (여기 490 nm, 발광 520 nm) 를 Perkin Elmer Envision Plate Reader 를 이용해 측정했다.
EC50 검정은 CC50 검정과 동일한 웰에서 실시했다. 384-웰 세포 배양 플레이트 중의 calcein-PBS 용액을 Biotek ELX405 플레이트 워셔를 이용해 흡출시켰다. 부피 20 ㎕ 의 Dual-Glo 루시퍼라아제 완충액 (Promega, Madison, WI, Cat#E298B) 을 Biotek μFlow Workstation 을 이용해 플레이트의 각 웰에 첨가했다. 플레이트를 실온에서 10 분간 인큐베이션했다. 이어서, Dual-Glo Stop & Glo 기질 (Promega, Madison, WI, Cat#E313B) 및 Dual-Glo Stop & Glo 완충액 (Promega, Madison, WI, Cat#E314B) 의 1:100 혼합물을 포함하는 부피 20 ㎕ 의 용액을 Biotek μFlow Workstation 을 이용해 플레이트의 각 웰에 첨가했다. 이어서, 플레이트를 실온에서 10 분간 인큐베이션한 후, 발광 신호를 Perkin Elmer Envision Plate Reader 로 측정했다.
데이터 분석
세포독성 효과는 형광 생성물로의 calcein AM 변환에 의해 측정되었다. 백분율 세포독성을 등식 1 로 산출했다:
Figure pct00132
식 중, X C 은 화합물-처리 웰로부터의 형광 신호이고; M B 은 푸로마이신-처리 웰로부터의 평균 형광 신호이고; M D 은 DMSO-처리 웰로부터의 평균 형광 신호임. 항-HCV 복제 활성은 HCV 레플리콘의 리포터 레닐라 루시퍼라아제로부터 생성된 발광 신호에 의해 결정되었다. HCV 레플리콘에 대한 억제 백분율은 등식 1 을 이용해 산출되었는데, 여기서 X C 는 화합물-처리 웰로부터의 발광 신호이고; M B 은 ITMN-191-처리 웰로부터의 평균 발광 신호이고; M D 은 DMSO-처리 웰로부터의 평균 발광 신호이다.
CC50 값은 세포 생존력의 50% 감소를 초래하는 시험 화합물 농도로 결정되었다. EC50 값은 HCV 복제에서 50% 감소를 초래하는 시험 화합물 농도로 결정되었다. CC50 및 EC50 값은 모두 Pipeline Pilot 5.0 소프트웨어 패키지 (Accelrys, San Diego, CA) 를 이용해 등식 2 에 대한 실험 데이터의 비선형 회귀 핏팅에 의해 수득되었다:
Figure pct00133
식 중, y 는 화합물의 농도 x 에서의 HCV 레플리콘의 실측된 억제율% 이고; d 는 화합물 농도 0 에서 추산된 응답성이고; a 는 무한대의 화합물 농도에서 추산되는 응답성이고; c 는 중간-범위 농도 (CC50 또는 EC50) 이고; b 는 Hill 기울기 인수 (slope factor) 임.
조합 연구 실험 데이터는 Prichard and Shipman 에서 개발한 MacSynergy II 프로그램을 이용해 분석했다. 상기 소프트웨어 (MacSynergy II, University of Michigan, MI) 는 약물들간의 가산적 상호작용 (Bliss Independence 모델을 근거로 함) 을 가정하여 이론적인 억제를 산출하며, 이론 및 실측 저해값 사이의 통계적으로 유의한 차이를 정량한다. 3 차원에서 그러한 차이를 그래프화하는 것으로, Z-평면에서 볼록한 곳이 항바이러스 상승작용을 나타내고, 오목한 곳은 화합물들간의 항바이러스 길항작용을 나타내는 표면을 제공하게 된다. 표면 편차의 산출된 부피는 nM2% 로 나타낸다. Prichard 및 Shipman 에 따르면, 조합 효과는 다음과 같이 정의된다:
Figure pct00134
강력한 상승작용: > 100 nM2%
Figure pct00135
중도의 상승작용: > 50 및 ≤100 nM2%
Figure pct00136
경미한 상승작용: > 25 및 ≤ 50 nM2%
Figure pct00137
가산성: ≤ 25 및 > -25 nM2%
Figure pct00138
경미한 길항작용: ≤ -25 및 > -50 nM2%
Figure pct00139
중도의 길항작용: ≤ -50 및 >-100 nM2%
Figure pct00140
강력한 길항작용: ≤ -100 nM2%
각 조합 연구에 대해, 각 실험에 대해 4 개씩 3 회의 독립적 실험을 실시했다.
결과
HCV 유전자형 1a 레플리콘 검정에서의 개별 화합물들의 항바이러스 활성 및 세포독성.
화합물 4 및 여타 화합물들의 항-HCV 활성 및 세포독성을 HCV 유전자형 1a 레플리콘을 보유하는 Huh-7 세포에서 시험했다. EC50 및 CC50 값을 표 VI 에 수록했다. 시험한 최고 농도까지는 모든 화합물에 대해 유의할 세포독성이 관찰되지 않았다.
표 VI
HCV 유전자형 1a 레플리콘에 대한 본 연구에 이용된 화합물들의 EC50 및 CC50
Figure pct00141
a 값들은 3 회 이상의 독립적인 실험들에 대한 평균±표준 편차임.
b IFN-α 값은 나노몰 농도 대신 밀리리터 (mL) 당 단위 (U) 로 나타냄.
화합물 4 의 여타 클래스의 항-HCV 작용제와의 조합에서의 항바이러스 활성 및 세포독성.
화합물 4 의 여타 항-HCV 화합물들과의 조합의 항바이러스 효과를 HCV 유전자형 1a 레플리콘을 이용해 평가했다. 결과는 부가성으로부터 유의한 편차를 나타내는 표면 그래프를 제공하는 MacSynergy II 를 이용해 분석했다. 가산적 표면으로부터의 편차로부터 산출된 상승작용 및 길항작용 부피 (nM2%) 를 표 VII 에 요약했다. 95% 의 신뢰 구간에서, 화합물 4 를 IFN-α, 화합물 2 및 화합물 6 과 조합했을 때, 그러한 화합물들과의 가산적 상호작용을 가리키는 평균 상승작용 및 길항작용 부피는 25 내지 -25　nM2 % 였다. 나아가, 화합물 4 는 화합물 1, 화합물 5 또는 화합물 3 과 조합했을 때 25 내지 50 nM2% 범위의 상승작용 부피를 나타내, 경미한 상승작용 상호작용을 시사했다.
표 VII
화합물 4 와의 약물 조합에 대한 항바이러스 상승작용 및 길항작용 및 약물 상호작용의 정량
Figure pct00142
값들은 4 개씩 3 회 실시한 독립적 실험의 평균±표준 편차를 나타냄
표 VIII 에 제시된 바와 같이, 모든 조합 연구에서 세포 생존력은 모든 농도 비율에서 85% 를 초과했고, 모든 약물 조합이 세포독성에 대해 가산적 효과를 나타냈다.
표 VIII
화합물 4 과의 약물 조합에 대한 세포독성 상승작용 및 길항작용 및 약물 상호작용의 정량
Figure pct00143
a 값들은 4 개씩 3 회 실시한 독립적 실험의 평균±표준 편차를 나타냄
그러나, 화합물 4 는 리바비린과 조합시 -43 nM2% 의 길항작용 부피를 나타내, 경미한 길항작용적 상호작용을 시사했다.
표 IX
리바비린과의 약물 조합에 대한 세포독성 상승작용 및 길항작용 및 약물 상호작용의 정량
Figure pct00144
a 값들은 4 개씩 3 회 실시한 독립적 실험의 평균±표준 편차를 나타냄
화합물 4 과 최고의 길항작용을 나타내는 리바비린 농도는 약 0.5 내지 1 μM 인데, 이는 800 mg/1 일의 투여량으로 인간에서 관찰되는 리바비린의 정상-상태 혈장 농도 (6 내지 11 μM) 보다 약 10 배 더 낮다. 리바비린의 그러한 생리학적 농도 (6 내지 11 μM) 에서, 리바비린 및 화합물 4 사이의 길항작용적 상호작용은 넓은 범위의 화합물 4 농도 (0 내지 0.44　μM) 에서 최소한으로 교차된다. 따라서, 시험관내 레플리콘 시스템에서의 리바비린 및 화합물 4 사이에서 관찰된 경미한 길항작용은 임상적 유의성을 가질 공산이 적다.
결론
화합물 4 (거울상이성질체 혼합물) 의 항바이러스 활성을 케어의 현재 표준 (IFN-α/리바비린), 뿐만 아니라 Gilead　Sciences 사의 내부 개발 후보약물 화합물 1 및 화합물 5 (비-뉴클레오시드 NS5B 저해인자), 화합물 2 및 화합물 3 (NS3 프로테아제 저해인자), 및 화합물 6 (NS5A　저해인자) 와 조합하여 시험했다. 표 VIII 에 요약한 바와 같이, 화합물 4 는 IFN-α/화합물 2 및 화합물 6 와의 조합에서 가산적인 항바이러스 활성을 나타냈고, 화합물 1, 화합물 5 및 화합물 3 과는 경미한 상승작용을 나타냈다.
화합물 4 의 리바비린과의 조합은, 인간 혈장에서의 그의 정상-상태 생리학적 농도 (6 내지 11 μM) 보다 약 10 배 더 낮은, 0.5 내지 1 μM 의 리바비린 농도에서 경미한 길항 작용을 제공했다. 임상적으로 관련있는 리바비린 농도에서, 두 화합물 사이의 길항작용적 상호작용은 무시할 수 있게 되었다.
생물학적 실시예 4: 화합물 5 조합
화합물 5 의 항바이러스 활성은 GT-1b Huh-lunet 세포 (화합물 4 에 대한 검정과 실질적으로 동일한 방법 이용) 에서, 내부에서 개발한 화합물 화합물 1, 화합물 2 및 화합물 3 (NS3 프로테아제 저해인자), 화합물 6 (NS5A 저해인자), 화합물 4 (C-nuc NS5B 저해인자) 및 또한 승인된 HCV 치료제 PEG-IFN-α 및 리바비린과 조합하여 시험했다. 조합 데이터는 Bliss Independence 모델을 기반으로 하여 MacSynergy II 소프트웨어를 이용해 분석했다. 조합 검정의 결과를 3 개씩 실시한 2 회의 독립적 실험으로부터 95% 신뢰 수준에서 산출된 평균 상승작용 및 길항작용 부피 (nM2) 로 나타냈다. 조합 효과는 다음과 같이 정의된다:
Figure pct00145
부피 > 100 nM2 인 경우 강력한 상승작용; 이러한 분량의 상승작용은 아마도 생체내에서 중요함.
Figure pct00146
부피 > 50 이고 ≤ 100 nM2 인 경우 중도의 상승작용; 이러한 분량의 상승작용은 생체내에서 중요할 수 있음.
Figure pct00147
부피 > 25 이고 < 50 nM2 인 경우 경미한 상승작용
Figure pct00148
부피 > -25 이고 ≤ 25 nM2 인 경우 부가성
Figure pct00149
부피 < -25 이고 > -50 nM2 인 경우 경미한 길항작용
Figure pct00150
부피 > -100 nM2 이고 ≤ -50 nM2 인 경우 중도의 길항작용; 이러한 분량의 길항작용은 생체내에서 중요할 수 있음.
Figure pct00151
부피 ≤ -100 nM2 인 경우 강력한 길항작용; 이러한 분량의 길항작용은 아마도 생체내에서 중요함.
알로스테릭 NS5B 저해인자 화합물 1 및 화합물 5 의 조합은 레플리콘 검정에서 중도의 상승작용을 제공하게 된다. PEG-IFN-α 및 리바비린을 포함한 여타 HCV 저해인자를 이용한 연구는 경미한 상승작용적 상호작용에 대한 가산성을 밝혀냈다.
표 X
1b Huh-luc 레플리콘 세포에서의 여타 항-HCV 약물과의 조합에서의 화합물 5 의 항바이러스 효과
Figure pct00152
a.값들은 3 개씩 2 회 실시된 독립적 실험의 평균±표준 편차를 나타냄
생물학적 실시예 5: 화합물 6, 조합
재료 및 방법
화합물
화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 6 및 화합물 7 을 Gilead Sciences (Foster　City, CA) 에서 합성했다. IFN-α 및 리바비린은 Sigma (St.　Louis,　MO) 에서 구매했다.
세포주
HCV 유전자형 1b 레플리콘 세포 (Huh-luc) 은 Reblikon (Mainz, 독일) 로부터 입수했다. 이들 세포의 레플리콘은 I389luc-ubi-neo/NS3-3'/ET 로 지정되었으며, 선별가능한 내성 마커 (네오마이신 포스포트랜스퍼라아제) 뿐만 아니라 개똥벌레 루시퍼라아제 리포터 유전자를 인코딩한다. Huh-luc 세포를 10% 우태아 혈청 (FBS; Hyclone, Logan,　UT), 1X 페니실린/스트렙토마이신, 1X 비필수 아미노산 및 0.5　mg/mL 의 G-418 (전부 Invitrogen 사 제품, Carlsbad, CA) 을 보충한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium GlutaMax (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA) 에서 유지했다. 세포는 주 2 회 계대배양하고, 서브컨플루언트 수준에서 유지했다.
검정
HCV Huh-luc 레플리콘 세포에서의 항바이러스 활성 검정
레플리콘 세포를 G-418 를 제외하고, 100 ㎕ 의 DMEM 배양 배지 중에 웰 당 7×103 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩했다. 화합물을 100%　DMSO 중에 1:2 로 연쇄적으로 희석했다. 연쇄 희석물을 세포에 1:200 희석으로 첨가하여, 총 200 ㎕ 의 부피 중에 0.5% DMSO 의 최종 농도를 달성했다. 플레이트를 37℃ 에서 3 일간 인큐베이션한 후, 배양 배지를 제거하고, 세포를 해리시키고, 시판 루시퍼라아제 검정 (Promega, Madison,　WI) 을 이용해 루시퍼라아제 활성에 대해 검정했다.
항바이러스 조합 연구
레플리콘 세포를 G-418 를 제외하고, 100 ㎕ 배양 배지 중에 웰 당 7×103　세포의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩했다. 화합물 6 및 여타 화합물들을 100% DMSO 중에 1:2 로 연쇄적으로 희석하고, 96-웰 플레이트에 매트릭스 포맷으로 첨가하여, 최종 부피 200　㎕ 및 최종 DMSO 농도 0.5% 에서 상이한 약물 농도 및 비율의 정해진 셋트를 제공했다. 각 개별 약물에 대해, EC50 값은 시험한 농도 범위의 중간값으로 선택했다. 세포를 3 일간 인큐베이션하고, 시판 루시퍼라아제 검정 (Promega) 을 이용해 루시퍼라아제 발현에 대해 분석했다. 각 조합 연구를 위해, 3 개씩 2 회의 독립적 실험을 실시했다.
세포의 세포독성 결정
상기 항바이러스 조합 연구에 대해 기재된 바와 같이 레플리콘 세포를 시딩하고, 약물로 처리했다. 37℃ 에서 3 일간의 인큐베이션 후, 배양 배지를 제거하고, 세포를 해리시키고, CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) 를 이용해 제조사의 지시사항에 따라 세포독성에 대해 검정했다. 상대적 광 단위 (Relative Light Units) 를 미처리 대조군 (100% 로 정함) 에 대한 백분율로 변환시켰다.
데이터 분석
EC50 산출
EC50 검정에 후속하여, 약물-처리 시료에서의 루시퍼라아제 수준을 미처리 대조군 (100% 으로 정함) 중의 그들의 백분율로 나타냈다. EC50 값은 XLfit 4 소프트웨어 (IDBS, Emeryville, CA) 를 이용한 반복 데이터 셋트의 비선형 회귀 분석에 의해 산출했다.
항바이러스 상승작용 및 길항작용의 산출
조합 검정에 후속하여, 약물-처리 시료에서의 루시퍼라아제 수준을 미처리 대조군 (100% 로 정함) 중의 그들의 백분율로 나타냈다. 이어서, 반복 데이터 셋트를 Prichard and Shipman 에서 개발한 MacSynergy II 프로그램을 이용해 분석했다. 상기 소프트웨어는 약물들간의 가산적 상호작용 (Bliss Independence 모델을 근거로 함) 을 가정하여 이론적인 저해를 산출하며, 이론 및 실측 저해값 사이의 통계적으로 유의한 차이를 정량한다. 3 차원에서 그러한 차이를 그래프화하는 것으로, Z-평면에서 볼록한 곳이 항바이러스 상승작용을 나타내고, 오목한 곳은 화합물들간의 항바이러스 길항작용을 나타내는 표면을 제공하게 된다. 표면 편차의 산출된 부피는 nM2% 로 나타낸다. Prichard 및 Shipman 에 따르면, 조합 효과는 다음과 같이 정의된다:
Figure pct00153
부피 >　100 nM2 인 경우, 강력한 상승작용; 이러한 분량의 상승작용은 아마도 생체내에서 중요함
Figure pct00154
부피 >　50 및 ≤100 nM2 인 경우 중도의 상승작용; 이러한 분량의 상승작용은 생체내에서 중요할 수 있음
Figure pct00155
부피 >　25 및 <　50 nM2 인 경우, 경미한 상승작용
Figure pct00156
부피 >　-25 nM2 및 ≤25 nM2 인 경우, 부가성
Figure pct00157
부피 <　-25 및 >　-50 nM2 인 경우, 경미한 길항작용
Figure pct00158
부피 >　-100 nM2 및 ≤-50 nM2 인 경우, 중도의 길항작용; 이러한 분량의 길항작용은 생체내에서 중요할 수 있음
Figure pct00159
부피 ≤ -100 nM2 인 경우, 강력한 길항작용; 이러한 분량의 길항작용은 아마도 생체내에서 중요함.
결과
Huh-luc 레플리콘 세포에서 개별 화합물들의 항바이러스 활성.
조합 실험 개시 전에, 개별 화합물들의 항바이러스 활성을 Huh-luc 레플리콘 세포에서 결정했다. 역대의 결과와 일치하는 EC50 값들이 모든 7 가지 화합물에서 관찰되었다.
표 XI
Huh-luc 레플리콘 세포에서의 항-HCV 화합물에 대한 개별 EC50 값들
Figure pct00160
a EC50 는 3 회 이상의 독립적 실험들에 대한 산술 평균±표준 편차를 나타냄.
b IFN-α EC50 는 나노몰 농도 대신 밀리리터 (mL) 당 단위 (U) 로 표현함.
조합 항바이러스 효과 및 약물 상호작용
화합물 6 의 여타 HCV 저해인자와 조합한 항바이러스 효과는 HCV 1b 레플리콘 시스템을 이용해 평가했다. 결과로서 수득한 데이터는 가산성의 유의한 편차를 보여주는 표면 그래프를 제공하는 MacSynergy II 를 이용해 분석했다. 두 독립적 실험으로부터의 가산성으로부터의 통계적으로 유의한 편차의 정량은 표 XII 에 요약해 두었다. 화합물 6 의 IFN-α 또는 화합물 1 과의 조합은 각각 32 및 34 nM2 의 상승작용 부피를 제공하게 되어, 경미한 상승작용을 나타냈다. 리바비린, 화합물 2 및 화합물 7 은 화합물 6 과 조합시 각각 61, 52 및 51 의 상승작용 부피를 나타내어, 화합물 6 과 이들 세가지 HCV 저해인자 사이의 중도의 상승작용 상호작용을 나타냈다. 화합물 6 의 화합물 3 과의 조합은 132 nM2 % 의 상승작용 부피를 나타내게 되어, 강력하게 상승작용적인 항바이러스 상호작용을 의미했다. 화합물 6 과 조합시 그 어느 화합물도 가산적 범위 (>　-25　nM) 를 벗어나는 항바이러스 길항작용 부피를 제공하지 않았다.
표 XII
화합물 6 과의 약물 조합에 대한 항바이러스 상승작용 및 길항작용 및 약물 상호작용의 정량
Figure pct00161
a 값들은 3 개씩 2 회 실시된 독립적 실험의 산술 평균±표준 편차를 나타냄.
화합물 6 의 여타 HCV 저해인자와의 조합시 세포 생존력 백분율
항바이러스 조합 결과가 조합 세포독성에 의해 혼동되지 않음을 보장하기 위해, 항바이러스 검정에서 시험한 동일한 화합물 농도 (표 XIII) 를 이용해 병렬적으로 세포독성을 조사했다. 모든 화합물들에 대해, 세포 생존력은 시험한 최고 농도에서의 조합에 대해 미처리 대조군의 98% 이상이었다. 따라서, 화합물 6 을 단독으로 또는 그러한 작용제들과 조합하여 시험하면서 현저한 시험관내 세포독성은 관찰되지 않았다.
표 XIII
Huh-luc 레플리콘 세포에서 조합된 화합물 6 에 대한 세포 생존력 백분율
Figure pct00162
a 세포 생존력% 는 3 개씩 2 회 이상 실시된 독립적 실험에 대한 산술 평균±표준 편차를 나타냄.
b IFN-α 는 나노몰 농도 대신 밀리리터 (mL) 당 단위 (U) 로 표현함.
결론
이들 시험관내 실험 결과들은 화합물 6 이 IFN-α 또는 비-뉴클레오시드 NS5B 폴리머라아제 저해인자 화합물 1 과 조합시 경미한 항바이러스 상승작용을 갖는다는 것을 나타낸다. 화합물 6 의 리바비린, NS3 프로테아제 저해인자 화합물 2 또는 뉴클레오시드 NS5B 폴리머라아제 저해인자 화합물 7 과의 조합은 중도의 항바이러스 상승작용을 작용하는 결과를 제공했다. 화합물 6 및 NS3 프로테아제 저해인자 화합물 3 사이에서는 강력한 항바이러스 상승작용이 관찰되었다. 이들 약물 조합을 시험하는 동안에는 유의할 시험관내 세포독성이 밝혀지지 않았다. 이러한 결과는, 화합물 6 이 현재 케어 표준과 합리적으로 조합될 수 있음을 시사한다.
생물학적 실시예 6:
화합물
화합물 1, 화합물 3, 화합물 4, 및 화합물 6 을 Foster City, CA 소재의 Gilead Sciences, Inc. 에서 합성했다.
세포주
HCV 유전자형 1b 레플리콘 세포 (Huh-luc) 를 Reblikon (Mainz, 독일) 로부터 입수했다. 그러한 세포의 레플리콘은 I389luc-ubi-neo/NS3-3'/ET 로 지정되어 있고, 선별가능한 내성 마커 (네오마이신 포스포트랜스퍼라아제) 뿐만 아니라 개똥벌레 루시퍼라아제 리포터 유전자를 인코딩한다. Huh-luc 세포는 10% 우태아 혈청 (FBS; Hyclone, Logan,　UT), 1X 페니실린/스트렙토마이신, 1X 비필수 아미노산 및 0.5　mg/mL 의 G-418 (전부 Invitrogen 사 제품, Carlsbad, CA) 을 보충한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium GlutaMax (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA) 에서 유지했다. 세포를 주 2 회 계대배양하고, 서브컨플루언트 수준에서 유지했다.
검정
6 일간 처리 동안 1 내지 1.5 log 로 레플리콘 RNA 를 억제하기 위해 필요한 화합물 농도의 결정
유전자형 1b 레플리콘 세포를 G418 를 제외하고, 2.5x10 5 세포/플라스크의 세포 밀도로 T-75 플라스크에 시딩했다. 화합물을 개별적으로 세포에 다양한 농도로 첨가했다: 화합물 6 을 1pM, 2pM, 4pM, 6pM, 8pM, 또는 12pM 의 농도로 첨가하고, 화합물 4 를 125nM, 250nM, 375nM, 500nM 또는 1000nM 의 농도로 첨가하고, 화합물 1 을 1.25nM, 2.5nM, 5nM, 2.75nM 또는 10nM 의 농도로 첨가하고, 화합물 3 을 3.75nM, 7.5nM, 11.25nM, 15nM, 30nM 또는 60nM 의 농도로 첨가했다. 플라스크를 37℃ 에서 인큐베이션하고, 배지 및 화합물은 이틀마다 교체했다. 인큐베이션 6 일 후, 레플리콘 세포를 RNA 추출 및 레플리콘 RNA QRT-PCR 분석용으로 수집했다.
화합물 조합 레플리콘 케어 검정
유전자형 1b 레플리콘 세포를 T-75 플라스크에 2.5x10 5 세포/플라스크의 밀도로 시딩했다. 화합물을 T-75 플라스크에 하기 농도로 첨가했다: 화합물 6 은 4pM, 화합물 4 는 1000nM, 화합물 1 은 10nM, 및 화합물 3 은 26.25nM. 플라스크를 37℃ 에서 인큐베이션하고, 화합물 및 배지를 이틀마다 갈았다. 모든 실험은 2 개씩 실시하여, 플라스크 1 및 플라스크 2 로 표시했다. 6 일째에, 플라스크 1 유래의 모든 세포를 RNA 추출 및 HCV 레플리콘 특이적 QRT-PCR 분석용으로 수집하고, 플라스크 2 유래의 세포는 G418 존재 하에 14 일간 10cm 조직 배양 디쉬 상에 다시 플레이팅하여 케어되지 않은 레플리콘 세포의 콜로니 형성을 기록했다.
QRT-PCR 검정
전체 RNA 를 RiboPure 키트 (AM1924 Life Technologies Corporation Carlsbad, CA) 를 이용해 제조사의 프로토콜에 따라 추출했다. 추출된 RNA 시료는 사용할 때까지 -80℃ 에서 저장했다. 정량적 RT-PCR 검정을 위해, Qiagen One-step QRT-PCR 키트를 제조사 (Qiagen, Valencia CA) 의 프로토콜에 따라 이용했다. 유전자형 1b HCV NS3 유전자 특이적 프라이머로서, 정방향 프라이머 NS3_180FL 5'-CGGCGGACTGTCTATCATGGTGC[FAM]G-3' (서열 식별 번호: 1) 및 역방향 NS3_180 5'-GGTCCTGGTCCACATTGGTGT-3' (서열 식별 번호: 2) 및 18S rRNA LUX TM [FAM] 내재 대조군 프라이머 셋트 (115HM-01) 는 Invitrogen corporation (Carlsbad, CA) 사에서 제공했다. 역방향 전사 단계를 위해, 반응물은 44℃ 에서 30 분간 인큐베이션하고, 이어서 역방향 트랜스크립타아제 효소는 시료를 94℃ 에서 10 분간 가열하여 분해시켰다. Q-PCR 단계는 94℃ 에서 15 초 및 58℃ 에서 30 초의 38 싸이클을 포함했다.
결과
조합 레플리콘 치유 실험 개시에 앞서, 유전자형 1b 레플리콘 RNA 을 1 내지 1.5 log 만큼 억제하기 위해 필요한 화합물 농도를 화합물 6, 화합물 4, 화합물 1, 및 화합물 3 에 대해 결정했다. 레플리콘 RNA log 강하는 6 일 동안 유지된 DMSO 대조군 처리 레플리콘 세포에서의 RNA 수준에 대비되는 것이다.
표 XIV
6 일 검정에서 레플리콘 RNA 1 내지 1.5 log 강하를 유도할 수 있는 개별 화합물 투여량
Figure pct00163
조합 유전자형 1b 레플레콘 치유 검정
화합물들, 화합물 6, 화합물 4, 화합물 1 및 화합물 3 에 의한 레플리콘 RNA 억제는 개별 화합물로서, 그리고 다양한 이중, 삼중 및 사중 조합에서의 6 일 검정에서 결정되었다. 레플리콘 RNA log 강하는 처리 플라스크와 병렬적으로 6 일간 유지된 DMSO 대조군 처리 레플리콘 세포에서의 RNA 세포와 비교되는 것이다. HCV 레플리콘으로부터 세포를 치유하는 다양한 화합물 조합의 능력은 콜로니 형성에 의해 결정되었다. 화합물 처리 후 나타난 콜로니 형성을 제거하고, G418 압은 14 일 동안 되돌아왔다. 화합물 조합이 HCV 레플리콘 유래의 세포 집단을 완전히 치유하는 경우, 세포는 G418 에 대한 저항성이 결핍되기 때문에 콜로니가 발생하지 않을 것이다.
표 XV
레플리콘 치유 검정에서의 화합물 조합의 검정
Figure pct00164
결론
그러한 시험관내 실험 결과들은 두 화합물의 조합이 6 일간의 처리 동안 바이러스 RNA log 강하를 증가시켜, 치유된 레플리콘 세포의 비율을 증가시킴을 나타낸다. 화합물 6 의 화합물 4 또는 화합물 3 과의 이중 조합은 모든 여타 이중 화합물 조합에 비해 더 큰 레플리콘 RNA log 억제 및 가장 낮은 수의 치유되지 않은 콜로니를 결과물로 제공한다. 세가지 또는 네가지 화합물들의 조합이 모든 레플리콘 세포를 치유하며, 조합 처리가 레플리콘 RNA 수준을 검출 검정 한계까지 억제한다.
생물학적 실시예 7: 화합물 10 및 화합물 6 교차-저항성
본 연구는 화합물 10 및 화합물 6 의 시험관내 교차-저항성 프로파일 결정을 위해 실시되었다. 특징적인 NS5B 뉴클레오시드 HCV 약물 저항성 돌연변이 S282T 또는 가장 보편적인 시험관내 및 생체내 NS5A HCV 약물 저항성 돌연변이를 보유하고 있는 HCV 돌연변이 레플리콘의 패널을 임시적 레플리콘 검정을 통해 조사하여 화합물 10 또는 화합물 6 에 대한 감소된 감응성을 부여하는 돌연변이들 사이에 교차-저항성이 존재하는지 여부를 결정했다. 이들 화합물과, 화합물 6 에 대해 완전한 감응성을 유지하고 있는 S282T 돌연변이 레플리콘 및 화합물 10 에 대한 감소된 감응성을 나타내지 않는 NS5A 돌연변이 사이에는 교차-저항성이 관찰되지 않았다.
재료 및 방법
시약
화합물
화합물 6 및 화합물 10 은 Foster City, CA 소재의 Gilead Sciences, Inc. 에서 합성했다.
세포주
HCV 복제에 대해 매우 관용적인 Huh-7 클론인 Huh-lunet 를 ReBLikon GmbH (Mainz, 독일) 로부터 입수했다. Huh-lunet 세포를 10% 우태아 혈청 (FBS; Hyclone, Logan, UT) 를 보충한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; GIBCO, Carlsbad, CA) 에서 유지했다. 세포를 가습 인큐베이터 (85% 습도) 에서 5% CO2 분위기 하에 37℃ 에서 유지했다.
폴리오 (polio) IRES 의 레닐라 루시퍼라아제 (Renilla luciferase) 유전자 다운스트림 및 EMCV IRES 의 유전자형 1b (Con-1 strain) HCV 비구조성 (nonstructural) 유전자 (NS3 - NS5B) 다운스트림을 인코딩하는 비시스트로닉 (bicistronic) 레플리콘인 PI-hRluc 를 일시적 형질주입 연구에 이용했다. 플라스미드 pPI-hRluc 를, 유전자형 1b (Con-1 균주) 서브게놈 (subgenomic) 레플리콘을 인코딩하는 플라스미드 pFKI341 PI-Luc/NS3-3'/ET 로부터 생성했으며, ReBLikon (Friebe et al., J Virol 2001;75 (24):12047-57) 로부터 입수했다. hRluc 유전자는 pF9 CMV hRluc-neo Flexi(R) (Promega, Madison, WI) 로부터 Accuprime Super Mix I (Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 프라이머 PV_Rluc_Top 및 3'-Rluc(NotI) 를 이용하는 PCR 에 의해 PCR 증폭했다. 그러한 두 프라이머는 하기 서열을 갖고 있으며, 후속 클로닝을 위한 제한 부위를 보유하고 있다: PV_Rluc_Top: 5'-ATC AGA CAA TTG TAT CAT AAT GGC TTC CAA GGT GTA CG-3' (서열 식별 번호: 3); 3'-Rluc(NotI): 5'-ACG TCA CTA TCT ACG CGG CCG CTT ACT GCT CGT TCT TC-3'(NotI 부위에 밑줄) (서열 식별 번호: 4). T7 프로모터, 5'UTR 및 Polio 바이러스 IRES 를 플라스미드 pFKI341 PI-Luc/NS3-3'/ET 로부터 프라이머 5'-P7(SbfI) 및 PV_Rluc_Bottom 를 이용해 PCR 증폭했다. 그러한 두 프라이머는 하기 서열을 갖고 있으며, 후속 클로닝을 위한 제한 부위를 보유하고 있다: 5'-P7(SbfI): 5'-CAA GCT AAG CTG CCT GCA GG T-3' (SbfI 부위에 밑줄) (서열 식별 번호: 5); PV_Rluc_Bottom: 5'-CGT ACA CCT TGG AAG CCA TTA TGA TAC AAT TGT CTG AT (서열 식별 번호: 6). 이어서, 상기 두 반응 유래의 후속 PCR 절편들은 중복 PCR 및 프라이머 5'-P7(SbfI) 및 3'-Rluc(NotI) 을 이용해 함께 합해졌다. 완전한 P7-5'UTR-Polio 바이러스 IRES-hRluc 증폭 생성물을 pCR2.1-TOPO 에 서브클로닝했다. 결과로서 수득한 플라스미드를 SbfI 및 NotI 로 소화시키고, 잘라낸 절편 (P7-5'UTR-Polio 바이러스 IRES-hRluc) 을 T4 DNA 리가아제를 이용해, 동일한 효소로 소화시킨 pFKI341 PI-Luc/NS3-3'/ET 에 라이게이션시켰다. 결과로서 수득한 벡터, pPI-hRluc 를 서열분석하여 플라스미드의 P75'UTR-Polio 바이러스 IRES-hRluc 영역의 올바른 방향 및 서열을 확인했다.
hRluc 을 포함하는 GT 1a 및 2a 레플리콘은 선행기술에서 기재된 바 있다 (Robinson M, Yang H, Sun SC, Peng B, Tian Y, Pagratis N, et al. Novel HCV Reporter Replicon Cell Line Enable Efficient Antiviral Screening against Genotype 1a. Antimicrob Agents Chemother 2010.)
PI-hRluc 레플리콘을 키메라 구축을 위한 골격으로 이용했다. 복제 결핍이 제공되도록 NS5B 내부에 복제 결실을 만들었다. 1b-con-1 NS5A 의 최종 413 염기쌍들 (최종 137 NS5A 아미노산을 인코딩함) 을 유전자형 2b, 3a, 4a, 5a 및 6a (Genscript Inc. Piscataway NJ) 유래의 NS5B 서열을 이용해 프레임 내에서 합성했다. 그들 유전자형 각각에 대한 컨센서스 NS5B 서열들은 유럽 HCV 데이터베이스에 있는 서열들을 정렬하고 컨센서스를 추출함으로써 구동시켰다. NS5B 에 대한 그러한 신규한 컨센서스 서열들 뿐만 아니라 개별 임상 분리물들로부터 유도된 서열들 (Herlihy et al., Antimicrob 작용제 Chemother 2008;52 (10):3523-31) 을 NS5B 키메라 레플리콘 구축에 이용했다. 5' 말단의 특징적인 XhoI 부위 및 3' 말단의 특징적인 AseI 부위를 이용해 표준 분자생물학적 기법을 통해 1b-hRLuc/NeoR NS5B 벡터로 방향성있게 클로닝했다.
NS5B S282T 돌연변이를 QuikChange II XL 돌연변이유발 키트를 이용해 제조사 (Stratagene, La Jolla, CA) 의 지시사항에 따라 레플리콘 플라스미드에 도입했다. 완전한 돌연변이화된 레플리콘을 서열분석하여 S282T 돌연변이의 존재성 및 임의의 2 차적 부위 돌연변이의 부재성을 확인했다.
5' 및 3' BsrGI 및 EcoRI 부위를 각각 양옆에 둔 원하는 돌연변이를 포함하는 NS5A 의 첫번째 149 아미노산을 인코딩하는 서열을 합성함으로써, NS5A 돌연변이 레플리콘을 만들었다 (Genscript, Piscataway, NJ). 이어서, 합성된 절편들을 표준 분자생물학 기법에 의해, 독특한 BsrGI 및 EcoRI 제합 부위로 클로닝할 수 있도록 개질된 1a Rlu 레플리콘 플라스미드에 클로닝했다. 돌연변이는 DNA 서열분석으로 확인했다.
레플리콘은 하기 효소들을 이용해 선형화했다: Spe I (1b PI-Rluc-기반의 레플리콘), Hpa I (1a-Rluc-기반의 레플리콘), 및 XbaI/HpaI (2a Rluc 레플리콘). 레플리콘 RNA 를 T7 Ribomax 시험관내 전사 키트 (Promega; Madison, WI) 를 이용해 레플리콘-인코딩 플라스미드로부터 시험관내 전사한 후, RNAeasy 컬럼 (Qiagen; Valencia, CA) 을 이용해 정제했다.
검정
일시적 형질주입 레플리콘 검정을 이용한 약물 감응성 결정
Lohmann et al. (Lohmann et al., Science 1999;285 (5424):110-3) 의 방법을 이용해 RNA 를 Huh-lunet 세포로 형질주입했다. 간략히, 세포를 트립신처리하고, PBS 로 2 회 세척했다. 4 x 106 개 세포의 400 ㎕ 의 PBS 중 현탁액을 5 ㎍ 의 RNA 와 혼합하고, 960 μF 및 270 V 로 설정을 이용한 전기영동에 적용했다. 세포를 40 mL 의 미리 승온시킨 배양 배지에 이동시킨 후, 96-웰 또는 384-웰 플레이트에 시딩했다. 화합물을 100% DMSO 중에 3-배 연쇄적으로 희석시키고, 세포에 첨가하여 최종 DMSO 농도가 0.5% 이 되도록 했다. 세포를 3 일간 처리한 후, 배양 배지를 제거하고, 세포를 해리시키고, 레닐라 루시퍼라아제 활성을 시판 시약 (Promega) 및 Victor 또는 Envision 기기 (Perkin Elmer, Waltham, MA) 를 이용해 정량했다.
데이터 분석
데이터는 미처리 대조군 (100% 로 정의함) 에 대비한 백분율로 변환시키고, EC50 값은 GraphPad Prism 소프트웨어 또는 Pipeline Pilot 를 이용해 2 회 반복 데이터의 비-선형적 회귀로 산출했다. 내성 배수 변화를 돌연변이 대 야생형 레플리콘 EC50 의 비율로 산출했다.
결과
S282T 에 대한 화합물 10 및 화합물 6 의 활성
화합물 10 을 이용한 선행기술의 시험관내 저항성 선별은 다중 유전자형에서의 1 차적 돌연변이 (GT 1b, 1a 및 2a) 로서의 NS5B 에서의 S282T 를 일관성있게 밝혀냈다. 후속하여, NS5B S282T 돌연변이는 전장 GT 1a, 1b, 및 2a 레플리콘 및 GT1b 골격으로 클로닝된 2b, 3a, 또는 4a NS5B 서열을 포함하는 키메라 레플리콘으로 도입되었다. 화합물 10, 화합물 6, 및 리바비린 (RBV) 에 대한 감응성은 일시적 복제 검정을 이용해 평가했다. S282T 돌연변이는 117.1 nM 내지 346.1 nM 의 범위인 모든 다섯가지 유전자형의 EC50 값을 통틀어 화합물 10 에 대해 감소된 감응성을 나타냈다. S282T 에 대한 EC50 에서의 배수 증가는 상응하는 유전자형 유래의 야생형에 비해 2.4 내지 16.0 의 범위여서, NS5B S282T 돌연변이가 존재할 때 화합물 10 에 대한 감소되는 레플리콘 감응성을 증명한다.
야생형 레플리콘에 대해, RBV 에 대한 EC50 값은 또한 GT 2b에 대한 최저 EC50 값으로 시험한 다섯가지 유전자형을 통들어 유사했다. 흥미롭게도, S282T 레플리콘에 대한 EC50 값은 RBV 로 처리하는 것에 대해 그의 모든 다섯가지 유전자형에 대한 상응하는 야생형에 비해 5- 내지 10-배 더 감응성이다. 야생형 및 S282T 레플리콘 사이에서는 화합물 6 EC50 에서 유의한 차이가 관측되지 않아, 상기 돌연변이가 화합물 6 에 대한 감응성을 변경시키지 않음을 나타냈다. 결론적으로, S282T 레플리콘이 화합물 10 에 대한 감소된 감응성을 제공하는 반면, 돌연변이 레플리콘은 화합물 6 에 대한 야생형 감응성 및 RBV 에 의한 억제에 대해 야생형에 비해 증가된 감응성을 갖는다는 것을 증명했다.
표 7.1. GT1b, 2a, 2b, 3a 및 4a 의 야생형 및 S282T 돌연변이에 대한 화합물 10 및 RBV 의 항바이러스 활성
Figure pct00165
a EC50 는 2 회 이상의 독립적 실험들에 대한 평균을 나타냄.
b 상응하는 야생형으로부터의 배수 변화.
NS5A 돌연변이에 대한 화합물 10 및 화합물 6 의 활성
NS5A 약물 저항성 돌연변이가 화합물 10 에 대해 교차저항성인지 여부를 결정하기 위해, NS5A 돌연변이 레플리콘의 패널을 화합물 6 및 화합물 10 의 두가지 모두에 대한 감응성에 대해 검정했다. 모든 일곱가지 NS5A 돌연변이가 25- 내지 3029-배 범위로 EC50 에서의 증가가 있어 화합물 6 에 대한 감소된 감응성을 나타냈다. 대조적으로, 화합물 10 또는 RBV 대조군에 대해서는 NS5A 돌연변이에 대해 EC50 에서의 유의한 변동이 관찰되지 않았다.
표 7.2 유전자형 1a 에서의 NS5A 돌연변이에 대한 화합물 10 또는 화합물 6 의 시험관내 활성
Figure pct00166
결론
본 실시예에서, 화합물 10 및 화합물 6 의 교차-저항성 프로파일을 화합물 6 및 화합물 10 에 대해 각각 감소된 감응성을 제공하는 NS5A 및 NS5B 에서의 공지된 저항성 돌연변이를 인코딩하는 일시적 HCV 레플리콘을 이용해 평가했다. NS5B S282T 레플리콘은 화합물 10 에 대한 감소된 감응성을 제공하는 한편, 야생형 및 S282T 레플리콘으로부터 측정된 화합물 6 EC50 에서는 유의할 차이점이 없었다. 상반되게, 화합물 6 에 대해 감소된 감응성을 제공하는 돌연변이는 화합물 10 에 의한 처리에 대해 감응성인 채로 남아 있었다.
전체적으로, 상기 결과들은 화합물 10 및 화합물 6 에 대한 저항성 돌연변이가 교차-저항성을 입증하지 않았고 HCV 처리를 위한 장래의 조합 치료요법에서 이들 화합물들의 사용을 뒷받침함을 나타낸다.
생물학적 실시예 8: 조합 활성
화합물 10 의, NS5A 저해인자 화합물 6, 비-뉴클레오시드 저해인자 화합물 1 또는 화합물 5, 프로테아제 저해인자 화합물 3, 또는 리바비린 (RBV) 을 이용한 조합 연구 데이터가 HCV 저해인자의 세포-기반의 항바이러스 활성을 평가하기 위한 표준을 유지하고 있는 시험관내 레플리콘 검정에 대해 제시된다. 그러한 결과들은 화합물 10 이 화합물 6, 화합물 1, 화합물 5, 또는 화합물 3 과 조합되었을 때 가산적인 항바이러스 활성을 갖는다는 것을 나타낸다. 추가로, 화합물 10 은 시험관내에서의 RBV 와의 조합시 경미한 상승작용을 나타냈다.
재료 및 방법
세포주 및 세포 배양
본 연구에서 이용한 HCV 유전자형 1a 레플리콘 세포주는 선행기술에서 기재된 바 있다 (Robinson M, Yang H, Sun SC, Peng B, Tian Y, Pagratis N, et al. Novel HCV Reporter Replicon Cell Line Enable Efficient Antiviral Screening against Genotype 1a. Antimicrob Agents Chemother 2010). 세포를 10%　FBS (HyClone, Logan, UT, Cat# SH30071.03), 100 Units/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 (Gibco, Carlsbad, CA, Cat# 15140-122), 및 0.1 mM 비필수 아미노산 (Gibco, Carlsbad, CA, Cat#11140-050) 을 보충한, GlutaMAX 가 있는 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco, Carlsbad, CA, Cat# 10569-044) 을 포함하는 세포 배양 배지에서 생장시켰다. 레플리콘 세포를 0.5 mg/mL 제네티신 (Invitrogen, Carlsbad, CA, Cat# 10131-035) 중에 유지하여, HCV 레플리콘의 소실을 방지했다. 컨플루언트 상태에 이를 때까지 세포를 3 내지 4 일마다 계대배양했다.
EC50, CC50 결정 및 조합 연구를 위한 HCV 레플리콘 검정
모든 화합물들은 100% DMSO 중에 제공했다. 화합물 연쇄 희석을 100% DMSO 중에 실시했다. 모든 연쇄 희석은 384-웰 폴리프로필렌 플레이트 (Thermo Scientific, Hudson, NH, Cat#4341) 에서 Biomek FX Workstation 을 이용하여 실시했다. EC50 및 CC50 결정을 위해, 시험 화합물을 384-웰 플레이트의 컬럼 3 내지 20 에서 1:3 희석으로 10 단계에 걸쳐 연쇄적으로 희석했다. 조합 연구를 위해, 한 화합물을 수평 방향으로는 1:2 희석으로 9 단계에 걸쳐 연쇄적으로 희석하는 한편, 다른 화합물은 수직 방향으로 1:2 희석으로 7 단계에 걸쳐 연쇄적으로 희석했다. 이는 상이한 약물 농도 및 비율의 정해진 셋트를 제공하게 되었다. 각 개별 약물에 대해, EC50 값은 시험한 농도 범위에 대한 중간값으로 선택했다. 모든 연쇄 희석은 동일한 384-웰 플레이트에서 화합물마다 4 개씩 실시했다. 100% DMSO 를 각 연쇄 희석 384-웰 플레이트의 컬럼 1 내지 2 에 첨가했다. 100 μM 의 HCV 프로테아제 저해인자 ITMN-191 를 HCV 복제의 100% 억제 대조군으로서 컬럼 23 에 첨가했고, 10 mM 의 푸로마이신을 100% 세포독성의 대조군으로 컬럼 24 에 첨가했다.
흑색 폴리스티렌 384-웰 플레이트 (Greiner Bio-one, Monroe, NC, Cat#781086, 처리된 세포 배양) 의 각 웰에, 2000 개의 현탁된 HCV 레플리콘 세포를 포함하는 세포 배양 배지 (제네티신 부재) 90 ㎕ 를 Biotek μFlow Workstation 을 이용해 첨가했다. 화합물의 세포 배양 플레이트로의 이동을 위해, 화합물 연쇄 희석 플레이트 유래의 화합물 용액 0.4 ㎕ 를 Biomek FX Workstation 상의 세포 배양 플레이트에 이동시켰다. 최종 검정 웰 내의 DMSO 농도는 0.44% 였다. 플레이트를 3 일간 5% CO2 및 85% 습도로 하여 37℃ 에서 인큐베이션했다.
HCV 레플리콘 검정은 동일한 웰 유래의 세포독성 및 항-레플리콘 활성을 모두 평가할 수 있는 다중복합적 검정이다. CC50 검정을 가장 먼저 실시했다. 84-웰 세포 배양 플레이트 중의 배지를 흡출하고, 웰을 Biotek ELX405 플레이트 워셔를 이용해 각각 100　mL 1 X PBS 로 4 회 세척했다. 400 nM calcein AM (Anaspec, Fremont, CA, Cat#25200-056) 를 1　X　PBS 중에 포함하는 용액 50 mL 의 부피를 Biotek μFlow Workstation 를 이용해 플레이트의 각 웰에 첨가했다. 플레이트를 30 분간 실온에서 인큐베이션한 후, 형광 신호 (여기 490 nm, 발광 520 nm) 를 Perkin Elmer Envision Plate Reader 로 측정했다.
EC50 검정을 CC50 검정과 동일한 웰에서 실시했다. 384-웰 배양 배지 플레이트 중의 calcein-PBS 용액을 Biotek ELX405 플레이트 워셔로 흡출시켰다. 20 ㎕ 부피의 Dual-Glo 루시퍼라아제 완충액 (Promega, Madison, WI, Cat#E298B) 을 Biotek μFlow Workstation 을 이용해 플레이트의 각 웰에 첨가했다. 플레이트를 10 분간 실온에서 인큐베이션했다. 이어서, 20 ㎕ 부피의, Dual-Glo Stop & Glo substrate (Promega, Madison, WI, Cat#E313B) 및 Dual-Glo Stop & Glo buffer (Promega, Madison, WI, Cat#E314B) 의 1:100 혼합물을 포함하는 용액을 Biotek μFlow Workstation 을 이용해 플레이트의 각 웰에 첨가했다. 이어서, 플레이트를 실온에서 10 분간 인큐베이션한 후, 발광 신호를 Perkin Elmer Envision Plate Reader 를 이용해 측정했다.
데이터 분석
세포독성 유효성을 형광 생성물에 대한 calcein AM 변환에 의해 결정했다. 백분율 세포독성을 등식 1 로 산출했다:
Figure pct00167
식 중, X C 은 화합물-처리 웰로부터의 형광 신호이고; M B 은 푸로마이신-처리 웰로부터의 평균 형광 신호이고; M D 은 DMSO-처리 웰로부터의 평균 형광 신호임. 항-HCV 복제 활성은 HCV 레플리콘의 리포터 레닐라 루시퍼라아제로부터 생성된 발광 신호에 의해 결정되었다. HCV 레플리콘에 대한 억제 백분율은 등식 1 을 이용해 산출되었는데, 여기서 X C 는 화합물-처리 웰로부터의 발광 신호이고; M B 은 ITMN-191-처리 웰로부터의 평균 발광 신호이고; M D 은 DMSO-처리 웰로부터의 평균 발광 신호이다.
CC50 값은 세포 생존력의 50% 감소를 초래하는 시험 화합물 농도로 결정되었다. EC50 값은 HCV 복제에서 50% 감소를 초래하는 시험 화합물 농도로 결정되었다. CC50 및 EC50 값은 모두 Pipeline Pilot 5.0 소프트웨어 패키지 (Accelrys, San Diego, CA) 를 이용해 등식 2 에 대한 실험 데이터의 비선형 회귀 핏팅에 의해 수득되었다:
Figure pct00168
식 중, y 는 화합물의 농도 x 에서의 HCV 레플리콘의 실측된 억제율% 이고; d 는 화합물 농도 0 에서 추산된 응답성이고; a 는 무한대의 화합물 농도에서 추산되는 응답성이고; c 는 중간-범위 농도 (CC50 또는 EC50) 이고; b 는 Hill 기울기 인수임.
조합 연구 실험 데이터는 Prichard and Shipman 에서 개발한 MacSynergy II 프로그램을 이용해 분석했다. 상기 소프트웨어 (MacSynergy II, University of Michigan, MI) 는 약물들간의 가산적 상호작용 (Bliss Independence 모델을 근거로 함) 을 가정하여 이론적인 저해를 산출하며, 이론 및 실측 저해값 사이의 통계적으로 유의한 차이를 정량한다. 3 차원에서 그러한 차이를 그래프화하는 것으로, Z-평면에서 볼록한 곳이 항바이러스 상승작용을 나타내고, 오목한 곳은 화합물들간의 항바이러스 길항작용을 나타내는 표면을 제공하게 된다. 표면 편차의 산출된 부피는 μM2% 로 나타낸다. Prichard 및 Shipman 에 따르면, 조합 효과는 다음과 같이 정의된다:
Figure pct00169
강력한 상승작용: > 100 μM2%
Figure pct00170
중도의 상승작용: > 50 및 ≤100 μM2%
Figure pct00171
경미한 상승작용: > 25 및 ≤ 50 μM2%
Figure pct00172
부가성: ≤ 25 및 > -25 μM2%
Figure pct00173
경미한 길항작용: ≤ -25 및 > -100 μM2%
Figure pct00174
중도의 길항작용: ≤ -50 및 >-100 μM2%
Figure pct00175
강력한 길항작용: ≤ -100 μM2%
각 조합 연구에 대해, 각 실험에 대해 4 개씩 3 회의 독립적 실험을 실시했다.
결과
HCV 유전자형 1a 레플리콘 검정에서의 개별 화합물들의 항바이러스 활성 및 세포독성
여타 항-HCV 화합물들과 조합한 화합물 10 의 항-HCV 활성 및 세포독성을 HCV 유전자형 1a 레플리콘을 보유하는 Huh-7 세포에서 시험했다. 모든 화합물들에 대한 EC50 및 CC50 값들을 하기 표에 수록했다. 조합 검정에서 시험한 최고 농도까지 모든 개별 화합물들에 대해 유의할 세포독성은 관찰되지 않았다.
표 8.1. HCV 유전자형 1a 레플리콘에 대한 본 연구에서 이용된 화합물의 EC 50 및 CC 50
Figure pct00176
a 값들은 3 회 이상의 독립적 실험들의 기하 평균이다.
여타 클래스의 항-HCV 작용제와 조합한 화합물의 항바이러스 활성 및 세포독성.
여타 항-HCV 화합물들과 조합한 화합물 10 의 항바이러스 효과를 HCV 유전자형 1a 레플리콘을 이용해 평가했다. 결과는 가산성으로부터 유의한 편차를 나타내는 표면 그래프를 제공하는 MacSynergy　II 를 이용해 분석했다. 가산적 표면으로부터의 편차로부터 산출된 상승작용 및 길항작용 부피 (μM2%) 를 하기 표에 요약해 두었다. 95% 신뢰 구간에서, 평균 상승작용 및 길항작용 부피는 화합물 10 을 화합물 6, 화합물 1, 화합물 5, 또는 화합물 3 과 조합했을 때, 25 내지 ≤ 50 μM2% 였으므로, 화합물 10 과의 가산적 상호작용을 나타냈다. 나아가, 화합물 10 은 RBV 와 조합했을 때 25 내지 50 μM2% 범위의 상승작용 부피를 나타내는데, 이는 경미한 상승작용적 상호작용을 시사한다. 화합물 10 을 이용한 직접 작용 항바이러스성을 이용한 조합 연구에서, 세포 생존력은 시험한 화합물 조합의 최고 농도에서 93% 을 초과한 반면, 화합물 10 및 RBV 의 조합한 효과를 분석한 연구에서는 최고 조합 약물 농도에서 85% 를 초과하는 세포 생존력을 나타냈다.
표 8.2. 화합물 10 과의 약물 조합에 대한 항바이러스 상승작용 및 길항작용 및 약물 상호작용의 정량
Figure pct00177
a 값은 4 개씩 3 회 실시한 독립적 실험의 평균±표준 편차를 나타냄
표 8.3. 화합물 조합에서의 세포독성의 정량
Figure pct00178
a 값은 4 개씩 3 회 실시한 독립적 실험의 평균±표준 편차를 나타냄
결론
화합물 10 의 항바이러스 활성을 화합물 6, 화합물 1, 화합물 5, 화합물 3, 또는 RBV 와의 조합에서 시험했다. 화합물 10 은 화합물 6, 화합물 1, 화합물 5, 또는 화합물 3 와의 조합에서는 가산적인 항바이러스 활성을, RBV 와의 조합에서는 경미한 상승작용을 나타냈다.
요약하면, 이러한 발견사실들은 임의의 개별 약물의 효능을 감소시키지 않고 강화된 바이러스 억제력을 발휘하는, 화합물 6, 화합물 1, 화합물 5, 화합물 3 또는 RBV 와의 조합에 이용되는 화합물 10 의 잠재력을 뒷받침한다.
임상 실시예 1: 화합물 1 및 화합물 2 의 조합의 항-HCV 활성의 임상적 시험
본 임상 실시예는 화합물 1 및 화합물 2 과 리바비린과의 조합이 HCV 바이러스 부하를 줄이고, HCV 바이러스의 반동을 억제하면서도, 리바비린 없이 화합물 1 및 화합물 2 만을 조합한 것에 비해 더욱 유효하다는 것을 보여준다.
임상 시도 디자인:
만성 유전자형 1 HCV 감염이 있는 처리-나이브 대상체 (treatment-naive subjects) 에서의, 화합물 2 및 화합물 1 만으로 그리고 이들과 리바비린의 조합으로 한 28 일간의 제 2 상의, 무작위화한, 오픈-라벨 시도. Arm 1 의 대상체에게는 매일 2 회 투여 (BID) 하는 75 mg 의 화합물 2 + 40 mg 의 화합물 1 (이중 투여계획) 을 제공했고, Arm 2 의 대상체에게는 BID 투여의 75 mg 의 화합물 2 + 40 mg 의 화합물 1 뿐만 아니라 BID 투여의 리바비린 (삼중 투여계획) 을 28 일간 제공했다.
28 일째에, 모든 대상체들은 PEG/리바비린을 개시했다. 부가적으로, 프로토콜에서는 불충분한 바이러스학적 응답성 (제 5 일까지 기준선 HCV RNA 로부터 2 log10 IU/mL 미만의 감소) 또는 바이러스학적 반동 (1000 IU/mL 를 초과하는 절대값을 갖고, 제 5 일 후 발생하는 2 개의 시점에서 확인되는 최저점으로부터 0.5 log10 IU/mL 를 초과하는 HCV RNA 증가) 이 있는 대상체를 호출해 제 28 일 전에 PEG/RIBA 를 개시했다.
불충분한 바이러스학적 응답성이 있는 대상체에 대해서는, peg화된 인터페론 (PEG) 및 리바비린 (RIBA) 의 조합을, 계속적인 화합물 2 + 화합물 1 의 존재 또는 부재 하에 제 28 일 전에 개시했다. 그 결과, 연구 제 28 일까지, 대상체는 하기 네가지 처리 중 한가지를 제공받게 되었다:
(i) 화합물 2 + 화합물 1,
(ii) 화합물 2 + 화합물 1 + RIBA,
(iii) 화합물 2 + 화합물 1 + PEG/RIBA, 또는
(iv) PEG/RIBA.
총 31 명의 대상체가 참여했으며, 투여를 시작했다 (16 명의 대상체는 Arm 1 에서 이중 투여계획을, 15 명의 대상체는 Arm 2 에서 삼중 투여계획을 실시함). 예비 대상체 인구통계 및 기준선 특징 (표 XVI) 은, Arm 2 에서 유전자형 1b 인 대상체의 수가 더 많다는 점을 제외하면, Arms 1 및 2 사이에서 필적할 만하다. 스크리닝시 4 명의 대상체가 HCV 유전자형 1b 인 것으로 밝혀졌지만 (1 명의 대상체는 이중 투여계획에서, 3 명의 대상체는 삼중 투여계획에서), 추가 분석시 추가적인 평가 진행에서는 유전자형 1a 또는 1b 로서 확인되지 않았다.
대상체들은 심각한 부작용 이벤트를 경험한 바 없다. 연구 의약들은, 약물 중단을 초래한 유일한 치료 응급 부작용 이벤트였던 단일한 등급 3 의 피로감을 제외하고는, 등급 1 내지 2 의 심각성을 가진 부작용 이벤트없이 전반적으로 잘 용인되었다. PEG/리바비린 개시 전에, 1 명을 초과한 대상체에서 발생하는 가장 보편적인 처리-응급 부작용 이벤트가 Arm 1 에서는 두통 (n=5), 및 설사 또는 구토 (각각 n=3) 였으며, Arm 2 에서는 두통 (n=7), 설사 또는 피로감 (각각 n=3), 구토, 무기력, 소양증 또는 불면증 (각각 n=2) 이었다. 화합물 2 + 화합물 1 을 PEG/RIBA 와 조합하여 제공하는 경우, 1 명 초과의 대상체에서 유일하게 발생하는 부작용 이벤트는 인플루엔자형 병 (n=5) 및 근육통 (n=3) 인데, 이들은 모두 PEG/RIBA 치료요법시 보편적인 부작용 이벤트이다. 실험실의 비정상과 관련하여, 28-일 처리 기간 동안에는 등급 4 의 이벤트가 전혀 없었다. 연구 약물을 제공받는 대상체들 중, Arm 2 을 포함하는 리바비린에서의 전체 빌리루빈에서 2 회의 치료-응급 등급 3 상승이 있었다 (제 7 일에 발생, 연구 약물의 계속 투여는 수반함). 상기 투여 Arm 의 여타 대상체들 중에서 전체 빌리루빈에서 2 회의 등급-1 상승 및 단일한 등급-2 상승이 있었다 (리바비린 존재시). Arm-1 에서의 대상체들 중 (리바비린 부재), 4 회의 등급-1 전체 빌리루빈 상승이 있었다. ALT 값들은 제 14 일까지 두 편에서 기준선으로부터 약 40 U/L 감소했다. 중간값 QTcF 는 그 어느 연구 편에서도 기준선으로부터 유의하게 변하지 않았으며, QTc 비정상으로 인해 연구 약물을 중단한 대상체는 없었다. 예비 안전성 데이터를 표 XVIII 에 요약해 두었다.
혈장 HCV RNA 는 PEG/RIBA 의 조기 개시에 대한 프로토콜-특이적인 기준과 관련하여 바이러스학적 응답성을 가늠하기 위해 대략 주 2 회 모니터링했다. HCV RNA 값의 예비 분석으로부터, HCV RNA 에서의 중앙 최대값 감소는 이중 투여계획에 대해서는 3.9 log10 IU/mL 였고, 삼중 투여계획에 대해서는 5.0 log10 IU/mL 였다. HCV RNA 에서의 최대 감소에 대한 중위 시간은 이중 투여계획에 대해서는 7 일이고, 삼중 투여계획에 대해서는 14 일이었으며, 그러한 차이는 리바비린 포함 편에서의 바이러스 해결의 발생 및 안착을 지연시키는데 기여했다. 이중 투여계획을 제공받은 15 명의 대상체들 중 3 명 (20%) 및 삼중 투여계획을 제공받는 13 명 중 10 명 (77%) 은 최저점 HCV RNA 값이 30 IU/mL 이하였다 (비-GT1 대상체 제외). 화합물 2/화합물 1 를 제공받은 13/16 (81%) 대상체 및 화합물 2/화합물1/리바비린을 제공받은 6/15 (40%) 은 연구 제 28 일의 예정된 출발 전에 PEG 또는 PEG/리바비린을 개시했다. 바이러스학적 결과의 부가적 상세사항들은 하기에 제공된다.
결과. 화합물 2 + 화합물 1 만을 제공한 것 및 그것을 RIBA 와 조합해 제공한 것은 PEG 또는 PEG/리바비린의 첨가 전후에 모두 본 연구에서 HCV 대상체에 의해 28 일까지는 용인되었다. 두 투여계획은 모두 HCV RNA 의 강력한 억제를 제공했으며, 세가지 약물 투여계획에서는 더 크고 더욱 지속적인 활성을 가졌다.
표 XVI 예비 대상체 인구통계 및 기준선 특징들
Figure pct00179
표 XVII 예비 안전성 결과
Figure pct00180
표 XVIII 예비 바이러스학적 결과
Figure pct00181
* GT1 는 HCV 유전자형 1 에 대한 약어임.
프랑스 연구 센터 중 하나에서의 대상체 1011, 1012, 및 1043 는 제외함;
대상체 1004 는 제외하지 않음
** 해결은 최저점 상의 HCV RNA 에서의 1 초과의 로그 증가, 또는 25 IU/mL 미만인 최저점에 대해 25 IU/mL 를 초과하는 HCV RNA 로 정의됨.
표 XVIII 에 제시된 데이터는, 리바비린이 부재하는 것에 비해, 리바비린 존재시 화합물 2 + 화합물 1 의 조합에 응답하여 중간값 최대 HCV RNA 수준 및 평균 최대 HCV RNA 수준의 두가지 모두에서 약 10 배 초과하더 더 큰감소가 있음을 보여준다. 또한, 50 IU/mL 미만의 HCV RNA 최저점을 가진 연구 대상체 수는 리바비린 부재시보다 리바비린 존재시에 더 크다. 그러한 결과는, 인터페론 부재시 리바비린이 화합물 1 및 화합물 2 의 조합의 항바이러스 활성을 유의하게 강화한다는 것을 보여준다.
부가적으로, 바이러스가 돌연변이화하고 항바이러스 약물에 덜 감응성이 됨에 따라 HCV 바이러스 부하에서의 일시적인 증가의 측정값인 HCV 해결까지의 평균 시간이, 리바비린의 부재시보다 리바비린의 존재시에 더 길다. 나아가, 바이러스의 해결을 보이는 대상체의 수는 리바비린의 부재시보다 리바비린의 존재하에 실질적으로 더 적다. 그러한 결과는, HCV 바이러스가 리바비린의 존재시 화합물 1 및 화합물 2 의 조합에 대한 저항성을 발생시킬 수 있음을 보여준다.
나아가, 표 XVIII 에 제시된 데이터는 리바비린의 존재 하에 신속한 바이러스학적 응답성 (Rapid Virologic Response (RVR)) 을 달성하는 환자 수는 리바비린 부재시보다 현저히 더 많다는 것을 보여준다. RVR 의 달성은 HCV 감염의 치료와 양의 상관관계를 갖고 있다.
표 XVIII 에 제시된 데이터를 취합하면, 화합물 1, 화합물 2, 및 리바비린의 조합이, 심지어 인터페론의 투여없이도, 바이러스 반발을 줄이면서도 HCV 바이러스 부하의 신속하며 임상적으로 유의한 감소를 제공한다는 것을 알 수 있다.
본 발명의 특별한 양상이 본원에 설명되어 있고 상세히 기재되어 있지만, 본 발명은 이에 한정되지 않는다. 상기 상세한 설명은 본 발명의 예시로 제공되며, 본 발명을 임의로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 진의를 벗어나지 않는 변형이 당업자에게는 자명할 것이며, 그러한 변형은 첨부된 특허청구범위의 범위에 포함되는 것을 의도로 한다.

Claims (46)

1) 화합물 10 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 2) 화합물 5 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 화합물 6 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 1) 화합물 10 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 2) 화합물 5 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 1) 화합물 10 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 2) 화합물 6 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 1) 화합물 10 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 2) 화합물 5 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 3) 화합물 6 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
제 5 항에 있어서, 1 일 1 회 투여를 위한 단위 투여 형태로서 제형화되는 조성물.
제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 경구 투여를 위해 제형화되는 조성물.
제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 정제로서 제형화되는 조성물.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 리바비린을 추가로 포함하는 조성물.
인간에게 1) 화합물 10 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 2) 화합물 5 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 화합물 6 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 HCV 감염을 치료하는 방법.
제 10 항에 있어서, 1) 화합물 10 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 2) 화합물 5 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이 투여되는 방법.
제 10 항에 있어서, 1) 화합물 10 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 2) 화합물 6 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이 투여되는 방법.
제 10 항에 있어서, 1) 화합물 10 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 2) 화합물 5 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 3) 화합물　6 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이 투여되는 방법.
제 10 항에 있어서, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 조성물이 인간에게 투여되는 방법.
인간에게 1) 화합물 10 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 2) 화합물 5 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 화합물 6 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법.
제 15 항에 있어서, 1) 화합물 10 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 2) 화합물 5 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이 투여되는 방법.
제 15 항에 있어서, 1) 화합물 10 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 2) 화합물 6 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이 투여되는 방법.
제 15 항에 있어서, 1) 화합물 10 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 2) 화합물 5 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 3) 화합물　6 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이 투여되는 방법.
제 15 항에 있어서, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 조성물이 인간에게 투여되는 방법.
인간에게 1) 화합물 10 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 2) 화합물 5 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 화합물 6 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 것을 포함하는, HCV 를 갖는 인간에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법.
제 20 항에 있어서, 1) 화합물 10 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 2) 화합물 5 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이 투여되는 방법.
제 20 항에 있어서, 1) 화합물 10 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 2) 화합물 6 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이 투여되는 방법.
제 20 항에 있어서, 1) 화합물 10 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 2) 화합물 5 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 3) 화합물　6 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이 투여되는 방법.
제 20 항에 있어서, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 조성물이 인간에게 투여되는 방법.
인간에게 1) 화합물 10 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 2) 화합물 5 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 화합물 6 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 동시투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키는 방법.
제 25 항에 있어서, 1) 화합물 10 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 2) 화합물 5 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이 투여되는 방법.
제 25 항에 있어서, 1) 화합물 10 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 2) 화합물 6 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이 투여되는 방법.
제 25 항에 있어서, 1) 화합물 10 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 2) 화합물 5 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 3) 화합물　6 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이 투여되는 방법.
제 25 항에 있어서, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 조성물이 인간에게 투여되는 방법.
제 10 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 인터페론이 인간에게 투여되지 않는 방법.
제 10 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 리바비린을 인간에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 10 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 리바비린, 인터페론, 알파-글루코시다제 1 저해인자, 헤파토프로텍탄트, TLR-7 아고니스트, 시클로필린 저해인자, HCV 바이러스 진입 저해인자, HCV 성숙 저해인자, 및 HCV IRES 저해인자로부터 선택되는 하나 이상의 부가적 작용제를 인간에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 의학 요법에서 사용하기 위한 조성물.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, HCV 감염의 예방적 또는 치료적 처리를 위한 조성물.
인간에서 HCV 감염을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한, 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
인간에서 HCV 감염의 하나 이상의 증상을 개선하기 위한 약제를 제조하기 위한, 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 부하를 감소시키기 위한 조성물.
인간에서 바이러스 부하를 감소시키기 위한 약제를 제조하기 위한, 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 동시투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키기 위한 조성물.
인간에서 동시투여된 경구 항바이러스제에 대해 저항성을 갖는 HCV 준종의 출현을 감소시키기 위한 약제를 제조하기 위한, 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
제 34 항, 제 37 항 또는 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 인터페론과 함께 투여하기 위한 것이 아닌 조성물.
제 34 항, 제 37 항 또는 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 리바비린과 함께 투여하기 위한 것인 조성물.
제 34 항, 제 37 항 또는 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 리바비린, 인터페론, 알파-글루코시다제 1 저해인자, 헤파토프로텍탄트, TLR-7 아고니스트, 시클로필린 저해인자, HCV 바이러스 진입 저해인자, HCV 성숙 저해인자, 및 HCV IRES 저해인자로부터 선택되는 하나 이상의 부가적 작용제와 함께 투여하기 위한 것인 조성물.
제 35 항, 제 36 항, 제 38 항 또는 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 약제가 인터페론과 함께 투여하기 위한 것이 아닌 용도.
제 35 항, 제 36 항, 제 38 항 또는 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 약제가 리바비린과 함께 투여하기 위한 것인 용도.
제 35 항, 제 36 항, 제 38 항 또는 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 약제가 리바비린, 인터페론, 알파-글루코시다제 1 저해인자, 헤파토프로텍탄트, TLR-7 아고니스트, 시클로필린 저해인자, HCV 바이러스 진입 저해인자, HCV 성숙 저해인자, 및 HCV IRES 저해인자로부터 선택되는 하나 이상의 부가적 작용제와 함께 투여하기 위한 것인 용도.
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