JP2014526516A - Ｈｃｖを処置するための方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス感染を処置するために有用な治療用分子の組合せに関する。本発明は、方法、使用、投与レジメンおよび組成物に関する。本発明は、ウイルス感染（例えばＨＣＶ）を処置するために有用な組成物および治療方法を提供する。本発明のある種の組成物および方法は、望ましくない副作用がより少なく、幅広いＨＣＶ遺伝子型に対してより有効であり、耐性選択によるウイルスリバウンドの可能性を減少させ、現在利用可能な療法よりも短縮された、複雑でない投与スケジュールを有する。

Description

（発明の優先権）
本願は、２０１１年９月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／５３５，８８５号、および２０１１年１１月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／５６１，７５３号への優先権を主張する。この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
（発明の分野）
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス感染を処置するために有用な治療用分子の組合せに関する。本発明は、方法、使用、投与レジメンおよび組成物に関する。
（発明の背景）
肝炎は、世界中で生じている疾患である。肝炎は一般に、ウイルス性の性質のものであるが、肝臓の慢性炎症の状態を考慮すると、他の公知の非感染性原因が存在する。ウイルス性肝炎は、肝炎の格段に最も一般的な形態である。米国疾病管理センターは、米国人口の少なくとも１．８％がＨＣＶ感染の血清学的証拠を有し、症例の大部分が慢性活動性感染に関連していると推定している。ＨＣＶは、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科に属するプラス鎖ＲＮＡウイルスであり、ブタコレラウイルスおよびウシウイルス性下痢症ウイルスを含むペスチウイルスと緊密な関係を有する。
ＨＣＶゲノムは、細胞プロテイナーゼおよび２つのウイルスプロテイナーゼによって翻訳と同時に、および翻訳後に切断されて成熟ウイルスタンパク質（コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ）になる、３００９〜３０３０アミノ酸のポリタンパク質をコードする約９，６００ｂｐの一本鎖プラスセンスＲＮＡである。構造タンパク質であるＥ１およびＥ２は、ウイルス脂質エンベロープに埋め込まれて、安定なヘテロダイマーを形成すると考えられる。構造コアタンパク質は、ウイルスＲＮＡゲノムと相互作用して、ヌクレオカプシドを形成すると考えられる。ＮＳ２からＮＳ５と称される非構造タンパク質には、ポリメラーゼ、プロテアーゼおよびヘリカーゼを含むウイルス複製およびタンパク質プロセッシングに関与する酵素機能を有するタンパク質が含まれる。ＨＣＶは、相補的マイナス鎖ＲＮＡテンプレートの生成を介して複製する。
ＨＣＶは、遺伝的に多様なウイルスである。単一の感染患者内でも、多くの変異ウイルスを同定することができ、「ウイルス集落（ｓｗａｒｍ）」またはウイルス準種という記載に至っている。ヒト集団全体内でも、ＨＣＶは遺伝的に多様であり、少なくとも６種の主要な「遺伝子型」（遺伝子型１〜６型）および多数の亜型（即ち、ＨＣＶ遺伝子型１ａ型および１ｂ型）が同定されている。ＨＣＶ遺伝子型は、ゲノムの系統発生的分析によって定義され、ＨＣＶ ＲＮＡ配列をベースとする診断アッセイによって診断される（所定の患者において）。
ＨＣＶの主な感染経路は、血液曝露である。健康問題としてのＨＣＶ感染の規模は、ハイリスク群での有病率によって示される。例えば、一部の調査では、欧米諸国における血友病患者のうちの６０％から９０％および静脈内薬物乱用者の８０％超が慢性ＨＣＶ感染を有する。静脈内薬物乱用者については、有病率は、研究された集団に応じて約２８％から８０％まで変動する。血液または血液製剤輸注に関連した新たなＨＣＶ感染の割合は、薬学的進歩ならびに供血者をスクリーニングするために使用される高感度血清学的およびＲＮＡ検出アッセイの幅広い使用によって顕著に減少しているが、しかしながら、老年の慢性感染者の広いコホートが既に確立されている。
ＨＣＶ感染のための利用可能な処置の１つは、ペグ化インターフェロン−α（ＰＥＧ−ＩＦＮ α１ａまたはＰＥＧ−ＩＦＮ α１ｂ）であり、これは、現行の処置ガイドラインでは、処置されるＨＣＶウイルス遺伝子型に応じて、２４から４８週間にわたって毎週、皮下注射によって投与される。遺伝子型１型ＨＣＶ感染を有する患者のうちの５０％超が、４８週間の療法の完了の時点には、ＨＣＶウイルス血症の抑制を有すると期待され得るが、これらの患者のうちのかなりの割合が、ウイルス再発を有する。したがって、持続的ウイルス奏効（ＳＶＲ、処置休止の２４週間後にＨＣＶ ＲＮＡ陰性と定義され、「治癒」に等しいとみなされる）は、ＰＥＧ−ＩＦＮのみで処置された遺伝子型１型ＨＣＶ感染のうちの３０〜４０％でしか達成されない。加えて、インフルエンザ様症状、血小板減少症、貧血および重度の精神医学的副作用を含めた有害事象プロファイルを伴うので、ＰＥＧ−ＩＦＮ＋ＲＢＶでの処置は、十分には許容されない。現行の標準治療での処置が最適以下である一方で、多くの患者が、精神医学的障害、進行した肝臓疾患および物質乱用を含めた、ＨＣＶ感染集団に共通する共存症によって、療法の開始からさえも排除されている。
リバビリンは、ヌクレオシド類似体の抗ウイルス薬物である。リバビリンは典型的には、１日２回経口摂取される（口腔から）。リバビリンについての正確な機構は公知ではない。しかしながら、リバビリンが細胞に入ると、リン酸化され；次いで、イノシン５’−モノリン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＭＰＤＨ）のインヒビターとして作用すると考えられている。リバビリンなどのＩＭＰＤＨインヒビターは、グアニンの細胞内合成および貯蔵、ＤＮＡおよびＲＮＡ産生に必要なヌクレオチド「基本要素」を減少させて、これにより、ウイルス複製を阻害する。ＩＭＰＤＨインヒビターはまた、急速に増殖する細胞および高速のタンパク質代謝回転を有する細胞の複写に干渉する。リバビリン単剤療法での処置は、ＨＣＶ ＲＮＡレベルにはほとんど影響を及ぼさないが、血清アラニン転移酵素（ＡＬＴ）の減少に関連している。この観察は、リバビリンが抗ウイルス薬としては作用し得ず、むしろ、免疫系機能の調節因子として作用し得ることを示唆している。リバビリンは、ＨＣＶ感染に対して、ＩＦＮと組合せて使用することのみが承認されている。
ＰＥＧ−ＩＦＮおよびリバビリンの組合せによる処置は、大部分は療法の休止の時点でのウイルス再発の頻度の低下によって、ＰＥＧ−ＩＦＮのみを用いた場合に観察されるＳＶＲ率を上回って、ＳＶＲ率を改善する。ＰＥＧ−ＩＦＮ／リバビリン処置されたＨＣＶ遺伝子型１型感染患者での大規模臨床試験のＳＶＲ率は、４０〜５５％の範囲であった。現在、ＰＥＧ−ＩＦＮ／リバビリン療法は、慢性ＨＣＶ感染のための「標準治療」処置と考えられている。しかしながら、その標準治療は、ＰＥＧ−ＩＦＮ／リバビリンと組み合わせて当初は使用される直接作用性抗ウイルス薬の承認に伴って、近い将来に急激に変わると予測される。
残念なことに、ＨＣＶの別の遺伝子型は、ＰＥＧ−ＩＦＮ／リバビリン療法に対して異なって応答し；例えば、ＨＣＶ遺伝子型１型は、２型および３型よりも療法に対して耐性がある。加えて、ＨＣＶのための多くの現行の処置は、望ましくない副作用を生じる。したがって、現在、新たな抗ウイルス療法が必要とされている。詳細には、望ましくない副作用がより少ないか、幅広いＨＣＶ遺伝子型に対してより有効であるか、またはより複雑でない投与スケジュールを有する、即ち、一日の間により少ない回数での薬剤の投与を必要とする新たな抗ウイルス療法が必要とされている。
（発明の要旨）
本発明は、ウイルス感染（例えばＨＣＶ）を処置するために有用な組成物および治療方法を提供する。本発明のある種の組成物および方法は、望ましくない副作用がより少なく、幅広いＨＣＶ遺伝子型に対してより有効であり、耐性選択によるウイルスリバウンドの可能性を減少させ、現在利用可能な療法よりも短縮された、複雑でない投与スケジュールを有する。
したがって、一実施形態では、本発明は、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６ならびに薬学的に許容されるそれらの塩から選択される２種またはそれより多くの化合物を含む組成物を提供する。
他の実施形態では、本発明は、ヒトでのＨＣＶ感染を処置する方法を提供し、その方法は、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６ならびに薬学的に許容されるそれらの塩から選択される２種またはそれより多くの化合物を該ヒトに投与するステップを含む。
他の実施形態では、本発明は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法を提供し、その方法は、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６ならびに薬学的に許容されるそれらの塩から選択される２種またはそれより多くの化合物を該ヒトに投与するステップを含む。
他の実施形態では、本発明は、ＨＣＶを有するヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法を提供し、その方法は、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６ならびに薬学的に許容されるそれらの塩から選択される２種またはそれより多くの化合物を該ヒトに投与するステップを含む。
他の実施形態では、本発明は、ヒトにおいて共投与される経口抗ウイルス薬に対して耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を提供し、その方法は、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６ならびに薬学的に許容されるそれらの塩から選択される２種またはそれより多くの化合物を該ヒトに投与するステップを含む。
他の実施形態では、本発明は、医学的療法における化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６ならびに薬学的に許容されるそれらの塩から選択される２種またはそれより多くの化合物の使用を提供する。
他の実施形態では、本発明は、ウイルス（例えばＨＣＶ）感染を予防的または治療的処置するための化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６ならびに薬学的に許容されるそれらの塩から選択される２種またはそれより多くの化合物の使用を提供する。
他の実施形態では、本発明は、ウイルス（例えばＨＣＶ）感染を予防的または治療的処置するための本発明の組成物の使用を提供する。
他の実施形態では、本発明は、ヒトでのウイルス（例えばＨＣＶ）感染を処置するための医薬品を調製するための、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６ならびに薬学的に許容されるそれらの塩から選択される２種またはそれより多くの化合物の使用を提供する。
他の実施形態では、本発明は、ヒトでのウイルス（例えばＨＣＶ）感染を処置するための医薬品を調製するための本発明の組成物の使用を提供する。
他の実施形態では、本発明は、ヒトでのウイルス（例えばＨＣＶ）感染の１つまたは複数の症状を改善するための医薬品を調製するための、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６ならびに薬学的に許容されるそれらの塩から選択される２種またはそれより多くの化合物の使用を提供する。
他の実施形態では、本発明は、ヒトでのウイルス（ＨＣＶ）感染の１つまたは複数の症状を改善するための医薬品を調製するための本発明の組成物の使用を提供する。
他の実施形態では、本発明は、ヒトでのウイルス負荷を減少させるための医薬品を調製するための、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６ならびに薬学的に許容されるそれらの塩から選択される２種またはそれより多くの化合物の使用を提供する。
他の実施形態では、本発明は、ヒトでのウイルス負荷を減少させるための医薬品を調製するための本発明の組成物の使用を提供する。
他の実施形態では、本発明は、ヒトにおいて共投与される経口抗ウイルス薬に対して耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための医薬品を調製するための、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６ならびに薬学的に許容されるそれらの塩から選択される２種またはそれより多くの化合物の使用を提供する。
他の実施形態では、本発明は、ヒトにおいて共投与される経口抗ウイルス薬に対して耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための医薬品を調製するための本発明の組成物の使用を提供する。
本発明の組成物および方法は、「相乗作用」および「相乗効果」をもたらし得、即ち、活性成分（２種またはそれより多くの併用化合物を包含）が一緒に使用される場合に達成される効果は、それらの化合物を別々に使用することで生じる効果の合計よりも大きい。
本発明の組成物および方法は、幅広い範囲のＨＣＶ遺伝子型に対する処置を提供するので、かつ現行のＨＣＶ療法（例えば、インターフェロンの投与を包含する処置）よりも、もたらされる副作用の数が少ないか、またはもたらされる副作用の重症度が低いので、本発明の組成物および方法は有益である。加えて、化合物（例えば、化合物１０および５、化合物１０および６、ならびに化合物１０、５および６）のある特定の組合せは、現行の療法（例えばＨＣＶ療法）によって達成されるものより有意に高い持続的ウイルス奏効（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（ＳＶＲ）を提供し得る。例えば、化合物の一部の組合せは、少なくとも約７０％または少なくとも約８０％であるＳＶＲを提供することができる。
（発明の詳細な説明）
定義
別段に述べられていない限り、次の用語および語句は本明細書で使用される場合、次の意味を有することが意図されている。特定の用語または語句が具体的には定義されていないという事実は、不明確であることや、または明瞭性の欠如と関係づけられるべきではなく、むしろ、用語は本明細書中において、それらの通常の意味の範囲内で使用されている。商品名が本明細書中で使用されている場合、出願人は、商品名の製品および商品名の製品の医薬品活性成分（複数可）を独立に包含することを意図している。
本明細書で使用される場合、「併用化合物」という用語は、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６を指す。
本明細書で使用される場合、化合物１は下式：
である。
化合物１はまた、５−（（６−（２，４−ビス（トリフルオロメチル）フェニル）ピリダジン−３−イル）メチル）−２−（２−フルオロフェニル）−５Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジンまたは５Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン、５−［［６−［２，４−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］ピリダジン−３−イル］メチル］−２−（２−フルオロフェニル）とも称され得る。
本明細書で使用される場合、化合物２は下式：
である。
化合物２はまた、（２Ｒ，６Ｓ，１３ａＲ，１４ａＳ，１６ａＳ）−２−（８−クロロ−２−（２−（イソプロピルアミノ）チアゾール−４−イル）−７−メトキシキノリン−４−イルオキシ）−６−（シクロペンチルオキシカルボニルアミノ）−５，１６−ジオキソオクタデカヒドロシクロプロパ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアザシクロペンタデシン−１４ａ−イル（２，６−ジフルオロベンジル（ｄｉｆｌｕｒｏｂｅｎｚｙｌ））ホスフィン酸とも称され得る。
本明細書で使用される場合、化合物３は下式：
である。
本明細書で使用される場合、化合物４は下式：
である。
本明細書で使用される場合、化合物５は下式：
である。
本明細書で使用される場合、化合物６は下式：
である。
本明細書で使用される場合、化合物７は下式：
である。
本明細書で使用される場合、化合物８は下式：
である。
本明細書で使用される場合、化合物９（Ｐでのジアステレオ異性体）は下式：
である。
化合物９に関しては、化合物９の製造および精製に関するＵＳ７，９６４，５８０およびＵＳ２０１０／０２９８２５７（これらの両方が参照によって組み込まれる）が参照される。
本明細書で使用される場合、化合物１０（化合物９のＳ異性体）は下式：
である。
化合物１０に関しては、化合物１０の製造および精製に関するＵＳ７，９６４，５８０およびＵＳ２０１０／０２９８２５７（これらの両方が参照によって組み込まれる）が参照される。
本明細書で使用される場合、化合物１１は下式：
である。
化合物１１に関しては、化合物１１の製造および精製に関するＵＳ２０１０／００８１６２８（参照によって本明細書に組み込まれる）が参照される。
本明細書で使用される場合、化合物１２（Ｐでジアステレオ異性体）は下式：
である。
化合物１２に関しては、化合物１２の製造および精製に関するＵＳ２０１１００１５１４６（参照によって本明細書に組み込まれる）が参照される。
本明細書で使用される場合、化合物１３（Ｐでの化合物１２のＳジアステレオ異性体）は下式：
である。
化合物１３に関しては、化合物１３の製造および精製に関するＵＳ２０１１００１５１４６（参照によって本明細書に組み込まれる）が参照される。
本明細書で使用される場合、化合物１４は下式：
である。
化合物１４に関しては、化合物１４の製造および精製に関するＵＳ７，９６４，５８０（参照によって本明細書に組み込まれる）が参照される。
本明細書で使用される場合、化合物１５は下式：
である。
化合物１５に関しては、化合物１５の製造および精製に関するＵＳ７，９６４，５８０（参照によって本明細書に組み込まれる）が参照される。
本明細書で使用される場合、化合物１６は下式：
である。
化合物１６に関しては、化合物１６の製造および精製に関するＵＳ７，４２９，５７２（参照によって本明細書に組み込まれる）が参照される。
リバビリンに関しては、リバビリンに関する製造のためのプロセスならびに命名法に関して参照によって本明細書に組み込まれるＥＰ ０ ０９３ ４０１ Ｂ１が参照される。本明細書で使用される場合、リバビリンは下式：
を指す。
リバビリンはまた、１−β−Ｄ−リボフラノシル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド、１−β−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキシアミド；１−β−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド；ＣＯＰＥＧＵＳ（Ｒｏｃｈｅ）；ＤＲＧ−００２８；ＨＳＤＢ ６５１３；ＩＣＮ １２２９；ＭｅｇａＲｉｂａｖｉｒｉｎ（例えば、リバビリン１００ｍｇ／ｍＬの製剤で）；ＮＳＣ １６３０３９；ＲＡＶＡＮＥＸ（ＢｉｏＰａｒｔｎｅｒｓ）；ＲＥＢＥＴＯＬ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ；Ａｅｓｃａ；Ｂａｙｅｒ Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｈａｒｍａ；Ｅｓｓｅｘ；Ｐｆｉｚｅｒ；Ｔｒａｄｉｎｇ Ｐｈａｒｍａ；Ｚｕｅｌｌｉｇ Ｐｈａｒｍａ）；Ｒｉｂａｍｉｄｅ；ＲＩＢＡＭＩＤＩＬ（Ｂｉｏｐｈａｒｍａ、Ｒｕｓｓｉａ）；ＲＩＢＡＳＰＨＥＲＥ（Ｔｈｒｅｅ Ｒｉｖｅｒｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；Ｒｉｂａｖａｒｉｎ；Ｒｉｂａｖｉｒｉｎａ；Ｔｒｉｂａｖｉｒｉｎ；ＶＩＬＯＮＡ（Ｖａｌｅａｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＶＩＲＡＭＩＤ（ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；Ａｌｆａ Ｗａｓｓｅｒｍａｎｎ）；ＶＩＲＡＺＯＬＥ（Ｖａｌｅａｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；およびＶＩＲＩＺＡＤＯＬＥ（Ｕｃｉ−ｆａｒｍａ、Ｓａｏ Ｂｅｒｎａｒｄｏ ｄｏ Ｃａｍｐｏ、Ｓａｏ Ｐａｕｌｏ、Ｂｒａｚｉｌ）とも称される。加えて、本明細書で使用される場合、リバビリンには、タリバビリン（ＶＩＲＡＭＩＤＩＮＥ、ＩＣＮ ３１４２）を包含するリバビリンの類似体が包含される。
「インターフェロン」という用語には、１）インターフェロン、例えば、ペグ化ｒＩＦＮ−α２ｂ（ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）、ペグ化ｒＩＦＮ−α２ａ（ＰＥＧＡＳＹＳ、Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ．）、ｒＩＦＮ−α２ｂ（ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）Ａ、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）、ｒＩＦＮ−α２ａ（Ｒｏｆｅｒｏｎ（登録商標）−Ａ、Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ．）、インターフェロンα（ＭＵＬＴＩＦＥＲＯＮ（登録商標）Ｖｉｒａｎａｔｉｖｅ ＡＢ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＯＰＣ−１８、Ａｌｆａｆｅｒｏｎｅ、Ａｌｆａｎａｔｉｖｅ、スバリン（ｓｕｂａｌｉｎ））、インターフェロンアルファコン（ａｌｆａｃｏｎ）−１（Ｖａｌｅａｎｔ）、インターフェロンα−ｎ１（Ｗｅｌｌｆｅｒｏｎ（商標）、Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）、インターフェロンα−ｎ３（ＡＬＦＥＲＯＮ（登録商標）−Ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．）、インターフェロン−β−１ａ（ＡＶＯＮＥＸ（登録商標）Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ、ＤＬ−８２３４ Ｄａｉｉｃｈｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ． Ｌｔｄ）、インターフェロン−オメガ（ｏｍｅｇａ ＤＵＲＯＳ（登録商標）、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｔａｒｃｉａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｉｏｍｅｄ ５１０、Ｉｎｔａｒｃｉａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、アルブインターフェロンα−２ｂ（ＡＬＢＵＦＥＲＯＮ（登録商標）、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＩＮＣ．）、ＩＦＮ α−２ｂ ＸＬ、ＢＬＸ−８８３（ＬＯＣＴＥＲＯＮ（登録商標）、Ｂｉｏｌｅｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＩＮＣ．）、ＤＡ−３０２１、グリコシル化インターフェロンα−２ｂ（ＡＶＩ−００５）、ＰＥＧ−ＩＮＦＥＲＧＥＮ（登録商標）、Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．、ペグ化インターフェロンラムダ−１（ＩＩＩ型）（ペグ化ＩＬ−２９）、およびＢＥＬＥＲＯＦＯＮ（登録商標）、Ｎａｕｔｉｌｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈが包含される。
「併用療法」という用語は、併用化合物のうちの２種またはそれより多くが組み込まれている組成物または方法または使用などを意味する。併用療法はまた、併用化合物のうちの２種またはそれより多くに加えて、これらに限られないがリバビリン、インターフェロン、α−グルコシダーゼ１阻害薬、肝臓保護薬、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）−７アゴニスト、シクロフィリン阻害薬、ＨＣＶウイルス侵入阻害薬、ＨＣＶ成熟阻害薬、およびＨＣＶ ＩＲＥＳ阻害薬を包含する他の活性成分を組み込こんでいてもよい。
「活性成分」という用語は、併用化合物、リバビリン、インターフェロン、α−グルコシダーゼ１阻害薬、肝臓保護薬、ＴＬＲ−７アゴニスト、シクロフィリン阻害薬、ＨＣＶウイルス侵入阻害薬、ＨＣＶ成熟阻害薬およびＨＣＶ ＩＲＥＳ阻害薬のうちのいずれかを包含する、薬学的効果を発揮するか、または発揮し得る併用療法の構成要素を意味する。
「処置」という用語およびその文法的に同等な用語は、疾患を処置する文脈において使用される場合、疾患の進行を遅延もしくは停止させること、または疾患の症状の少なくとも１つを改善すること、より好ましくは疾患の１つを超える症状を改善することを意味する。例えば、ＨＣＶ患者は、ＨＣＶ感染に随伴し得る次の症状のうちの１つまたは全ての改善を経験し得る：アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルの上昇、発熱、頭痛、筋肉痛、黄疸、疲労、食欲不振、悪心、嘔吐および下痢。Ｃ型肝炎ウイルス感染の処置には、ＨＣＶに感染しているヒトにおけるＨＣＶウイルス負荷の減少が包含され得る。
ある種の本明細書に記載されている化合物は、１つまたは複数のキラル中心を含有するか、または他にも、複数の立体異性体として存在し得る。本発明の範囲には、立体異性体の混合物、さらには精製された鏡像異性体または鏡像異性的／ジアステレオ異性的に富化された混合物が包含される。他にも、本発明の範囲内には、本明細書に示されている式によって表される化合物の個々の異性体、さらには全部または一部のその平衡混合物のいずれもが包含される。本発明はまた、本明細書に示されている式によって表される化合物の個々の異性体を、１つまたは複数のキラル中心が反転しているその異性体との混合物として包含する。本明細書において使用される立体化学の定義および規則は一般に、参照によってその全体が本明細書に組み込まれるＳ．Ｐ．Ｐａｒｋｅｒ編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ（１９８４年）、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＥｌｉｅｌ，Ｅ．およびＷｉｌｅｎ，Ｓ．、Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（１９９４年） Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに従う。
多くの有機化合物が、光学的に活性な形態で存在し、即ち、それらは、平面偏光の面を回転する能力がある。光学的に活性な化合物を記載する場合、接頭辞のＤおよびＬまたはＲおよびＳを使用して、そのキラル中心（複数可）に対する分子の絶対配置を示す。接頭辞のｄおよびｌまたは（＋）および（−）を使用して、化合物による平面偏光の回転の符号を示すが、その際、（−）またはｌは、化合物が左旋性であることを意味している。（＋）またはｄの接頭辞を有する化合物は、右旋性である。
特定の立体異性体は他にも、鏡像異性体とも称され得、そのような異性体の混合物は多くの場合に、鏡像異性体混合物と呼ばれる。鏡像異性体の５０：５０混合物は、ラセミ混合物またはラセミ化合物と称され、それらは、化学反応またはプロセスにおいて立体選択または立体特異性が存在しない場合に生じ得る。「ラセミ混合物」および「ラセミ化合物」という用語は、光学活性のない２種の鏡像異性体種の等モル混合物を指す。
組合せ
本発明は、併用化合物のうちの２種またはそれより多くの組合せを包含する。本発明の化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６の可能な二元（ｔｗｏ−ｗａｙ）（組合せ１〜２１）、三元（組合せ２２〜５６）、四元（組合せ５７〜９２）および五元（組合せ９３〜１１３）組合せを示している表Ｉを下記に提供する。化合物４、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６は、ＨＣＶ ＮＳ５ｂポリメラーゼのヌクレオシド阻害薬であり、併用化合物の組合せには、最も多くの場合に、化合物４、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６の１つのみが包含される（表Ｉの６欄を参照されたい）。
組成物
本発明の一態様は、化合物１を含み、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群から選択される第２の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。本発明の具体的な一実施形態では、第２の化合物は化合物２、化合物３、化合物４、化合物５または化合物６であり得る。
本発明の他の態様は、化合物２を含み、化合物１、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群から選択される第２の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。本発明の具体的な一実施形態では、第２の化合物は化合物４であり得る。本発明の具体的な一実施形態では、第２の化合物は化合物３であり得る。本発明の具体的な一実施形態では、第２の化合物は化合物５であり得る。
本発明の他の態様は、化合物３を含み、化合物１、化合物２、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群から選択される第２の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。本発明の具体的な一実施形態では、第２の化合物は化合物１であり得る。本発明の具体的な一実施形態では、第２の化合物は化合物４であり得る。本発明の具体的な一実施形態では、第２の化合物は化合物５であり得る。本発明の具体的な一実施形態では、第２の化合物は化合物６であり得る。
本発明の他の態様は、化合物４からなる群から選択される第１の化合物を含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群から選択される第２の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。本発明の具体的な一実施形態では、第２の化合物は、化合物１または化合物２または化合物３または化合物６であり得る。本発明の具体的な一実施形態では、第２の化合物は化合物１であり得る。本発明の具体的な一実施形態では、第２の化合物は化合物２であり得る。本発明の具体的な一実施形態では、第２の化合物は化合物３であり得る。本発明の具体的な一実施形態では、第２の化合物は化合物５であり得る。本発明の具体的な一実施形態では、第２の化合物は化合物６であり得る。
本発明の他の態様は、化合物５を含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群から選択される第２の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。本発明の具体的な一実施形態では、第２の化合物は化合物１であり得る。本発明の具体的な一実施形態では、第２の化合物は化合物６であり得る。
本発明の他の態様は、化合物６を含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群から選択される第２の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。本発明の具体的な一実施形態では、第２の化合物は化合物１であり得る。本発明の具体的な一実施形態では、第２の化合物は化合物２であり得る。本発明の具体的な一実施形態では、第２の化合物は化合物３であり得る。本発明の具体的な一実施形態では、第２の化合物は化合物４であり得る。
本発明の他の態様は、化合物７を含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群から選択される第２の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。
本発明の他の態様は、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群から選択される第１の化合物を含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群から選択される第２の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。
本発明の他の態様は、化合物１を含み、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物および第３の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。第２の化合物は、化合物３、または化合物４、または化合物５または化合物６であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物３であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物５であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物５であってよい。
本発明の他の態様は、化合物２を含み、化合物１、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物および第３の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。第２の化合物は、化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物５であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の他の態様は、化合物３を含み、化合物１、化合物２、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物および第３の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。第２の化合物は、化合物１または化合物６であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物５であってよい。
本発明の他の態様は、化合物４からなる群から選択される第１の化合物を含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物および第３の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。第２の化合物は、化合物１、化合物２、化合物３または化合物６であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物２であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物３であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物５であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物５であってよい。
本発明の他の態様は、化合物５を含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物および第３の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。第２の化合物は、化合物１であってよい。
本発明の他の態様は、化合物６を含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物および第３の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。第２の化合物は、化合物１、化合物２、化合物３または化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物２であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物３であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物５であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物５であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物５であってよい。
本発明の他の態様は、化合物７を含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物および第３の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。
本発明の他の態様は、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群から選択される第１の化合物を含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物および第３の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。
本発明の他の態様は、化合物１を含み、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物および第４の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。第２の化合物は、化合物３、化合物４、化合物５または化合物６であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物４であってよく、第４の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物４であってよく、第４の化合物は化合物６であってよい。
本発明の他の態様は、化合物２を含み、化合物１、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物および第４の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。第２の化合物は、化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の他の態様は、化合物３を含み、化合物１、化合物２、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物および第４の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。第２の化合物は、化合物１または化合物６であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物５であってよく、第４の化合物は化合物６であってよい。
本発明の他の態様は、化合物４からなる群から選択される第１の化合物を含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物および第４の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。第２の化合物は、化合物１、化合物２、化合物３または化合物６であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物２であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物３であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の他の態様は、化合物５を含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物および第４の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。第２の化合物は、化合物１であってよい。
本発明の他の態様は、化合物６を含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物および第４の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。第２の化合物は、化合物１、化合物２、化合物３または化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物２であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物３であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。
本発明の他の態様は、化合物７を含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物および第４の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。
本発明の他の態様は、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群から選択される第１の化合物を含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物および第４の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。
本発明の他の態様は、化合物１を含み、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物、第４の化合物および第５の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。第２の化合物は、化合物３、化合物４、化合物５または化合物６であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の他の態様は、化合物２を含み、化合物１、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物、第４の化合物および第５の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。第２の化合物は、化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の他の態様は、化合物３を含み、化合物１、化合物２、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物、第４の化合物および第５の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。第２の化合物は、化合物１または化合物６であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の他の態様は、化合物４からなる群から選択される第１の化合物を含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物、第４の化合物および第５の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。第２の化合物は、化合物１、化合物２、化合物３または化合物６であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物２であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物３であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の他の態様は、化合物５を含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物、第４の化合物および第５の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。
第２の化合物は化合物１であってよい。
本発明の他の態様は、化合物６を含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物、第４の化合物および第５の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。第２の化合物は、化合物１、化合物２、化合物３および化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物２であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物３であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。
本発明の他の態様は、化合物７を含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物、第４の化合物および第５の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。
本発明の他の態様は、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群から選択される第１の化合物を含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物、第４の化合物および第５の化合物をさらに含む組成物、例えば薬学的組成物を包含する。
塩
併用化合物および他の活性成分は、塩の形態であり得る。典型であって、絶対ではないが、併用化合物および他の活性成分の塩は、薬学的に許容される塩である。「薬学的に許容される塩」という用語に包含される塩は、併用化合物および／または他の活性成分の非毒性の塩を指す。適切な薬学的に許容される塩の例には、塩化物、臭化物、硫酸塩、リン酸塩および硝酸塩などの無機酸付加塩；酢酸塩、ガラクタル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、グリコール酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩およびアスコルビン酸塩などの有機酸付加塩；アスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩などの酸性アミノ酸との塩；ナトリウム塩およびカリウム塩などのアルカリ金属塩；マグネシウム塩およびカルシウム塩などのアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、ジシクロヘキシルアミン塩およびＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩などの有機塩基塩；ならびにリシン塩およびアルギニン塩などの塩基性アミノ酸との塩が包含される。塩は、場合によっては、水和物またはエタノール溶媒和物であってよい。
医薬製剤
併用化合物および／または他の活性成分は、通常の実施に従って選択され得る慣用のキャリアまたは賦形剤と共に製剤化することができる。錠剤は典型的には、賦形剤、流動促進剤、充填剤、結合剤などを含有する。水性製剤は、滅菌形態で調製することができ、経口投与以外によって送達することが意図されている場合には一般に、等張性である。全ての製剤は必要に応じて、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（１９８６年）に示されているものなどの賦形剤を含有する。賦形剤には、アスコルビン酸および他の抗酸化剤、ＥＤＴＡなどのキレート化剤、デキストリンなどの炭水化物、ヒドロキシアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルメチルセルロース、ステアリン酸が包含される。
製剤のｐＨは、約３から約１１の範囲であるが、通常は、約７から１０である。
活性成分を単独で投与することは可能であるが、１種または複数の活性成分を医薬製剤として提示することが好ましいことがある。本発明の製剤は、獣医学用途およびヒト用途の両方について、少なくとも１種の活性成分を、１種または複数の許容されるキャリアおよび必要に応じて他の治療成分と一緒に含む。キャリア（複数可）は、製剤の他の成分と相容性であり、その受容者に対して生理学的に無害であるという意味において「許容され」なければならない。
製剤には、下記に示されている投与経路に適したものが包含される。製剤は、好都合なように単位剤形で提示され得、薬学の分野で周知の方法のいずれかによって調製され得る。技術および製剤は一般に、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．）に見出すことができる。そのような方法は、活性成分を、１種または複数の補助的成分を構成するキャリアと会合させるステップを包含する。一般に、製剤は、１種または複数の活性成分を、液体キャリアもしくは微粉固体キャリアまたはその両方と均一かつ密接に会合させ、次いで、必要ならば、生成物を成形することによって調製することができる。
経口投与に適した本発明の製剤は、所定の量の活性成分をそれぞれ含有するカプセル剤、カシェ剤または錠剤などの別個の単位として；散剤もしくは顆粒剤として；水性もしくは非水性液体での液剤または懸濁剤として；または水中油型液体乳剤または油中水型液体乳剤として提示することができる。活性成分はまた、ボーラス剤、舐剤またはペースト剤として投与することもできる。
錠剤は、必要に応じて１種または複数の補助的成分と一緒に、圧縮または成形することによって作製することができる。圧縮錠剤は、適切な装置（ｍａｃｈｉｎｅ）で、必要に応じて結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、界面活性剤または分散剤と混合された粉末または顆粒などの易流動性形態の活性成分を圧縮することによって調製することができる。成形錠剤は、適切な装置で、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化活性成分の混合物を成形することによって作製することができる。錠剤を必要に応じて、コーティングするか、または刻み目を入れることができ、必要に応じて、活性成分の緩慢放出または制御放出が得られるように製剤化することができる。
眼または他の外部組織、例えば、口腔および皮膚に投与するためには、製剤を好ましくは、活性成分（複数可）を例えば０．０７５から２０％ｗ／ｗ（０．６％ｗ／ｗ、０．７％ｗ／ｗなど、０．１％ｗ／ｗの増分で０．１％から２０％の間の範囲で活性成分（複数可）を包含する）、好ましくは０．２から１５％ｗ／ｗ、および最も好ましくは０．５から１０％ｗ／ｗの量で含有する局所軟膏剤またはクリーム剤として塗布することができる。軟膏剤で製剤化する場合には、活性成分を、パラフィン系または水混和性軟膏基剤のいずれかと共に使用することができる。別法では、活性成分を、水中油型クリーム基剤と共に、クリームで製剤化することができる。
所望の場合には、クリーム基剤の水性相は、例えば、少なくとも３０％ｗ／ｗの多価アルコール、即ち、プロピレングリコール、ブタン１，３−ジオール、マンニトール、ソルビトール、グリセロールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ４００を包含）およびその混合物などの２個以上のヒドロキシル基を有するアルコールを含んでよい。局所製剤は望ましくは、皮膚または他の罹患部位を介しての活性成分の吸収または透過を増強する化合物を含み得る。そのような皮膚透過促進剤の例には、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ）および関連類似体が挙げられる。
併用化合物および／または他の活性成分の乳剤の油性相は、公知の成分から公知の方法で構成され得る。相は乳化剤（別段にはエマルゲント（ｅｍｕｌｇｅｎｔ）として公知）のみを含み得るが、望ましくは、少なくとも１種の乳化剤と脂肪もしくは油との、または脂肪および油の両方との混合物を含む。好ましくは、親水性乳化剤は、安定剤として作用する親油性乳化剤と一緒に包含される。他にも、油および脂肪の両方を包含することが好ましい。安定剤（複数可）を伴うか、伴わない乳化剤（複数可）は一緒に、いわゆる乳化ろうを構成し、そのろうは油および脂肪と一緒に、クリーム製剤の油性分散相を形成するいわゆる乳化軟膏基剤を構成する。
本発明の製剤において使用するために適したエマルゲントおよび乳化安定剤には、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０（ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ．）、Ｓｐａｎ８０、セトステアリルアルコール、ベンジルアルコール、ミリスチルアルコール、グリセリルモノステアレートおよびラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。
製剤に適した油または脂肪の選択は、所望の美容特性の達成に基づく。クリーム剤は好ましくは、チューブまたは他の容器からの漏れを回避するのに適した粘稠度を有する脂ぎっておらず、非着色性で、洗浄可能な生成物であるべきである。ジイソアジペート、ステアリン酸イソセチル、ココヤシ脂肪酸のプロピレングリコールジエステル、ミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸デシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、パルミチン酸２−エチルヘキシルまたはＣｒｏｄａｍｏｌ ＣＡＰとして公知の分枝鎖エステルのブレンドなどの直鎖または分枝鎖の一塩基性または二塩基性アルキルエステルを使用することができ、ここで、最後の３種が好ましいエステルである。これらは、必要とされる特性に応じて単独で、または組合せて使用することができる。別法では、白色軟質パラフィンおよび／または流動パラフィンまたは他の鉱油などの高融点脂質を使用することができる。
本発明による医薬製剤は、１種または複数の活性成分を１種または複数の薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤および必要に応じて、他の治療薬と一緒に含む。活性成分を含有する医薬製剤は、意図されている投与方法に適した任意の形態であってよい。経口用途で使用する場合には例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性もしくは油性懸濁剤、分散性散剤もしくは顆粒剤、乳剤、硬質もしくは軟質カプセル剤、シロップ剤またはエリキシル剤を調製することができる。経口用途が意図されている組成物は、薬学的組成物を製造するために当技術分野で公知の任意の方法に従って調製することができ、そのような組成物は、味の良い調製物を提供するための甘味剤、香味剤、着色剤および保存剤を含めた１種または複数の剤（ａｇｅｎｔ）を含有し得る。錠剤を製造するために適した非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合されている活性成分を含有する錠剤が許容される。これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウムまたは炭酸ナトリウム、ラクトース、ラクトース一水和物、クロスカルメロースナトリウム、ポビドン、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤；トウモロコシデンプンまたはアルギン酸などの造粒剤および崩壊剤；セルロース、微晶質セルロース、デンプン、ゼラチンまたはアラビアゴムなどの結合剤；ならびにステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクなどの滑沢剤であってよい。錠剤は、コーティングされていなくてもよく、または胃腸管での崩壊および吸着を遅延させて、長期間にわたる持続作用をもたらすためのマイクロカプセル化を包含する公知の技術によってコーティングされていてよい。例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンなどの時間遅延物質を単独で、または蝋と共に使用することができる。
経口用途のための製剤はまた、活性成分（複数可）が不活性固体希釈剤、例えばリン酸カルシウムもしくはカオリンと混合されている、硬質ゼラチンカプセル剤として、または活性成分が水またはラッカセイ油、流動パラフィンもしくはオリーブ油などの油媒体と混合されている、軟質ゼラチンカプセル剤として提示することができる。
本発明の水性懸濁液は、水性懸濁剤を製造するために適した賦形剤と混合されている活性物質を含有する。そのような賦形剤には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアラビアゴムなどの懸濁化剤ならびに天然に存在するリン脂質（例えば、レシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンステアレート）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来する部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）などの分散化剤または湿潤剤が挙げられる。水性懸濁剤はまた、エチルまたはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ−ベンゾエートなどの１種または複数の保存剤、１種または複数の着色剤、１種または複数の香味剤およびスクロースまたはサッカリンなどの１種または複数の甘味剤を含有してよい。
油懸濁剤は、活性成分をラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはヤシ油などの植物油に、または流動パラフィンなどの鉱油に懸濁させることによって、製剤化することができる。経口懸濁剤は、蜜蝋、硬質パラフィンまたはセチルアルコールなどの増粘剤を含有してよい。本明細書に示されているものなどの甘味剤および香味剤を、味の良い経口調製物を提供するために加えることができる。これらの組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤を加えることによって保存することができる。
水を加えることによって水性懸濁剤を調製するために適した本発明の分散性散剤および顆粒剤は、分散化剤または湿潤剤、懸濁化剤および１種または複数の保存剤と混合されている活性成分を提供する。適切な分散化剤または湿潤剤および懸濁化剤は、上記に開示されているものによって例示される。追加の賦形剤、例えば甘味剤、香味剤および着色剤もまた存在してよい。
本発明の薬学的組成物はまた、水中油型乳剤の形態であってもよい。油相は、オリーブ油またはラッカセイ油などの植物油、流動パラフィンなどの鉱油またはこれらの混合物であってよい。適切な乳化剤には、アラビアゴムおよびトラガカントゴムなどの天然に存在するゴム、ダイズレシチンなどの天然に存在するリン脂質、ソルビタンモノオレエートなどの脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導されるエステルまたは部分エステルならびにポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどのこれらの部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物が挙げられる。乳剤はまた、甘味剤および香味剤を含有してよい。シロップ剤およびエリキシル剤は、グリセロール、ソルビトールまたはスクロースなどの甘味剤と共に製剤化することができる。そのような製剤はまた、粘滑剤、保存剤、香味剤または着色剤を含有してよい。
本発明の薬学的組成物は、滅菌注射用水性または油性懸濁剤などの滅菌注射用調製物の形態であってよい。この懸濁剤は、公知の技術に従って、本明細書において述べられている適切な分散化剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して製剤化することができる。滅菌注射用調製物はまた、１，３−ブタン−ジオール中の溶液など、非毒性の非経口で許容される希釈剤もしくは溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液であってもよいか、または凍結乾燥粉末として調製されていてよい。使用することができる許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル液および等張性塩化ナトリウム溶液がある。加えて、滅菌不揮発性油を、溶媒または懸濁媒として慣用的に使用することができる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含めた任意の無刺激の不揮発性油を使用することができる。加えて、オレイン酸などの脂肪酸も同様に、注射剤を調製する際に使用することができる。
単一剤形を生成するためにキャリア物質と組み合わせることができる活性成分の量は、処置されるホストおよび特定の投与方式に応じて変動する。例えば、ヒトへの経口投与が意図されている時間放出製剤は、活性物質約１から１０００ｍｇを、組成物全体の約５から約９５％（重量：重量）まで変動し得る適切かつ簡便な量のキャリア物質と混合されて含有してよい。薬学的組成物は、投与のために容易に計測可能な量を提供するために調製することができる。例えば、静脈内注入が意図されている水性液剤は、約３０ｍＬ／時間の速度で適切な体積の注入が生じ得るように、液剤１ミリリットル当たり活性成分約３から５００μｇを含有してよい。
眼に投与するのに適した製剤には、活性成分が活性成分用の適切なキャリア、特に水性溶媒に溶解または懸濁されている点眼剤が挙げられる。活性成分は好ましくは、０．５から２０％、有利には０．５から１０％、特には約１．５％ｗ／ｗの濃度でそのような製剤中に存在する。
口腔中への局所投与に適した製剤には、香味のある基剤、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカント中に活性成分を含むロゼンジ剤；ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤中に活性成分を含む香錠；ならびに適切な液体キャリア中に活性成分を含む洗口剤が包含される。
直腸投与用の製剤は、例えばカカオバターまたはサリチレートを含む適切な基剤を用いる坐剤として提示することができる。
肺内または鼻投与に適した製剤は、例えば０．１から５００μｍの範囲の粒径を有し（０．５μｍ、１μｍ、３０μｍ、３５μｍなどの増分で０．１から５００μｍの間の範囲の粒径を含む）、これを、鼻通路を介して急速に吸入するか、または口腔を介して吸入することによって投与して、肺胞嚢に達するようにする。適切な製剤には、活性成分の水性または油性液剤が挙げられる。エアロゾルまたは乾燥粉末投与に適した製剤は、慣用の方法に従って調製することができ、本明細書に記載されている感染を処置または予防する際に使用される従来の化合物などの他の治療薬と共に送達することができる。
膣投与に適した製剤は、活性成分に加えて、適切であると当技術分野で公知であるようなキャリアを含有する膣坐剤、タンポン剤、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、泡剤または噴霧製剤として提示することができる。
非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬および意図されている受容者の血液と製剤を等張性にする溶質を含有し得る水性および非水性滅菌注射液剤；ならびに懸濁化剤および増粘剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁剤が挙げられる。製剤は、単位用量または複数用量容器、例えば密閉アンプルおよびバイアルで提示することができ、使用直前に滅菌液体キャリア、例えば注射用の水を加えることだけを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）された状態で貯蔵することができる。即時注射液剤および懸濁剤は、前記した種類の滅菌散剤、顆粒剤および錠剤から調製することができる。好ましい単位投与製剤は、活性成分の、本明細書中の上記で列挙されたような一日用量もしくは一日用量未満の単位または適切なそのフラクションを含有するものであってよい。
上記で詳細に述べられた成分に加えて、併用化合物および／または他の活性成分の製剤は、該当する製剤のタイプに関連して、例えば香味剤を含み得る経口投与に適したものを有する当技術分野で慣用の他の薬剤を含み得ることは理解されるべきである。
併用化合物および他の活性成分はまた活性成分の制御放出を提供するように製剤化され、投与頻度を少なくするか、または活性成分の薬物動態または毒性プロファイルを改善することができる。したがって、本発明はまた、持続放出または制御放出のために製剤化された、２種以上の併用化合物を含む組成物を提供する。
投薬量
活性成分の有効な用量は、処置される状態の性質、毒性、化合物が予防的に（より低い用量）、または活動性の疾患もしくは状態に対して使用されるかどうか、送達方法および医薬製剤に少なくとも左右され、臨床家が慣用の用量漸増研究を使用して決定することができる。
例として、本発明の組成物（例えば錠剤）は、有効な用量をもたらすように製剤化することができる。例えば化合物１または薬学的に許容されるその塩については、組成物は、１．０ｍｇから１００ｍｇ、５ｍｇから４０ｍｇ、３０ｍｇから５０ｍｇ、または２０ｍｇまたは４０ｍｇを含んでよく、化合物２、化合物３、化合物６、化合物４、化合物５、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６のうちの任意の１種または複数と組み合わせて、投与を必要とするヒトに、毎日１回または複数回投与されるように適合させることができる。化合物２または薬学的に許容されるその塩については、組成物は、２５ｍｇから８００ｍｇ、５０ｍｇから４００ｍｇ、または６０ｍｇから３００ｍｇまたは７０ｍｇから２００ｍｇを含んでよいか、または１５０ｍｇであってよく、化合物１、化合物３、化合物６、化合物４、化合物５、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６のうちの任意の１種または複数と組み合わせて、投与を必要とするヒトに、毎日１回または複数回投与されるように適合させることができる。化合物３または薬学的に許容されるその塩については、組成物は、１０ｍｇから１０００ｍｇ、または５０ｍｇから４００ｍｇ、または１００ｍｇから４００ｍｇまたは２００ｍｇから４００ｍｇを含んでよく、化合物１、化合物２、化合物６、化合物４、化合物５、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６のうちの任意の１種または複数と組み合わせて、投与を必要とするヒトに、毎日１回または複数回投与されるように適合させることができる。化合物４または薬学的に許容されるその塩については、組成物は、２５ｍｇから４００ｍｇ、または２５ｍｇから２００ｍｇを含んでよく、化合物１、化合物２、化合物３、化合物６、化合物５および化合物７のうちの任意の１種または複数と組み合わせて、投与を必要とするヒトに、毎日１回または複数回投与されるように適合させることができる。化合物５または薬学的に許容されるその塩については、組成物は、５０ｍｇから１０００ｍｇ、または１００ｍｇから７５０ｍｇを含んでよく、化合物１、化合物２、化合物３、化合物６、化合物４、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６のうちの任意の１種または複数と組み合わせて、投与を必要とするヒトに、毎日１回または複数回投与されるように適合させることができる。化合物６または薬学的に許容されるその塩については、組成物は、１ｍｇから５００ｍｇ、３ｍｇから３００ｍｇ、または３ｍｇから２００ｍｇ、または３ｍｇから１００ｍｇ、または１０ｍｇから９０ｍｇ、または３０ｍｇから９０ｍｇを含んでよく、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６のうちの任意の１種または複数と組み合わせて、投与を必要とするヒトに、毎日１回または複数回投与されるように適合させることができる。化合物７または薬学的に許容されるその塩については、組成物は１００マイクログラムから３０００ｍｇまで、２５ｍｇから２０００ｍｇまで、または５０ｍｇから１０００ｍｇまでを含んでよく、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６のうちの任意の１種または複数と組み合わせて、投与を必要とするヒトに、毎日１回または複数回（例えば１日４回）投与されるように適合させることができる。化合物９および１０または薬学的に許容されるそれらの塩については、組成物は、１日当たり１０ｍｇから１０００ｍｇを含んでよい（ＵＳ２０１０／０２９８２５７による）。化合物１１または薬学的に許容されるその塩について、組成物は、１日当たり１ｍｇから１０００ｍｇを含んでよい（ＵＳ２０１０／００８１６２８による）。共投与される化合物１〜７の投薬量は、潜在的な薬物−薬物相互作用を考慮して調節される必要があり得る。例えば、化合物１は、薬物代謝システムに影響を及ぼさないのは明らかであるが、化合物２は、化合物１の曝露を約２〜３倍に上昇させる効果を有するようである。したがって、化合物１を化合物２と組み合わせる場合には、化合物１の用量減少（例えば２倍〜３倍）が予想される。化合物１６と組み合わせると、化合物２は、化合物６の曝露を約５倍に上昇させる効果を有するようなので、化合物１６を化合物２と共に投与する場合には、化合物１６の用量減少（例えば３倍〜５倍）が予想される。したがって、化合物２と共投与される場合化合物６の１０ｍｇ用量は、３０ｍｇ用量に近い。
２種またはそれより多くの併用化合物を、１日当たり約８００ｍｇ、１０００ｍｇまたは１２００ｍｇの量で単回または複数回投薬（例えば約４００ｍｇ、５００ｍｇまたは６００ｍｇを毎日２回）のリバビリンと組み合わせて投与することができる。
本発明の組合せの使用
本発明のこの態様の実施では、併用化合物を、上記に示されている投薬量で使用することができる。
本発明の一態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物１を含み、ここで、化合物１を、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群から選択される第２の化合物と組み合わせて使用する。第２の化合物は化合物３、化合物４、化合物５または化合物６であってよい。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物２を含み、ここで、化合物２を、化合物１、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群から選択される第２の化合物と組み合わせて使用する。第２の化合物は化合物４であってよい。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物３を含み、ここで、化合物３を、化合物１、化合物２、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群から選択される第２の化合物と組み合わせて使用する。第２の化合物は化合物１または化合物６であってよい。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物４を含み、ここで、化合物４を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群から選択される第２の化合物と組み合わせて使用する。第２の化合物は化合物１、または化合物２、または化合物３、または化合物６であってよい。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物５を含み、ここで、化合物５を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群から選択される第２の化合物と組み合わせて使用する。第２の化合物は化合物１であってよい。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物６を含み、ここで、化合物６を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群から選択される第２の化合物と組み合わせて使用する。第２の化合物は化合物１、化合物２、化合物３または化合物４であってよい。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物７を含み、ここで、化合物７を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群から選択される第２の化合物と組み合わせて使用する。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物９を含み、ここで、化合物９を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群から選択される第２の化合物と組み合わせて使用する。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物１０を含み、ここで、化合物１０を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群から選択される第２の化合物と組み合わせて使用する。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物１１を含み、ここで、化合物１１を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群から選択される第２の化合物と組み合わせて使用する。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物１２を含み、ここで、化合物１２を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群から選択される第２の化合物と組み合わせて使用する。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物１３を含み、ここで、化合物１３を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群から選択される第２の化合物と組み合わせて使用する。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物１４を含み、ここで、化合物１４を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群から選択される第２の化合物と組み合わせて使用する。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物１５を含み、ここで、化合物１５を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群から選択される第２の化合物と組み合わせて使用する。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物１６を含み、ここで、化合物１６を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群から選択される第２の化合物と組み合わせて使用する。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物１を含み、ここで、化合物１を、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物および第３の化合物と組み合わせて使用する。第２の化合物は化合物３、または化合物４、または化合物５または化合物６であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物２を含み、ここで、化合物２を、化合物１、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物および第３の化合物と組み合わせて使用する。第２の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物３を含み、ここで、化合物３を、化合物１、化合物２、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物および第３の化合物と組み合わせて使用する。第２の化合物は化合物１または化合物６であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物４を含み、ここで、化合物４を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物および第３の化合物と組み合わせて使用する。第２の化合物は化合物１、化合物２、化合物３または化合物６であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物２であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物３であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物５を含み、ここで、化合物５を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物および第３の化合物と組み合わせて使用する。第２の化合物は化合物１であってよい。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物６を含み、ここで、化合物６を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物および第３の化合物と組み合わせて使用する。第２の化合物は化合物１、化合物２、化合物３または化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物２であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物３であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物７を含み、ここで、化合物７を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物および第３の化合物と組み合わせて使用する。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物９を含み、ここで、化合物９を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物および第３の化合物と組み合わせて使用する。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物１０を含み、ここで、化合物１０を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物および第３の化合物と組み合わせて使用する。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物１１を含み、ここで、化合物１１を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物および第３の化合物と組み合わせて使用する。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物１を含み、ここで、化合物１を、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物および第４の化合物と組み合わせて使用する。第２の化合物は化合物３、化合物４、化合物５または化合物６であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物２を含み、ここで、化合物２を、化合物１、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物および第４の化合物と組み合わせて使用する。第２の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物３を含み、ここで、化合物３を、化合物１、化合物２、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物および第４の化合物と組み合わせて使用する。第２の化合物は化合物１または化合物６であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物４を含み、ここで、化合物４を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物および第４の化合物と組み合わせて使用する。第２の化合物は化合物１、化合物２、化合物３または化合物６であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物２であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物３であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物５を含み、ここで、化合物５を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物および第４の化合物と組み合わせて使用する。第２の化合物は化合物１であってよい。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物６を含み、ここで、化合物６を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物および第４の化合物と組み合わせて使用する。第２の化合物は化合物１、化合物２、化合物３または化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物２であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物３であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物７を含み、ここで、化合物７を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物および第４の化合物と組み合わせて使用する。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物９を含み、ここで、化合物９を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物および第４の化合物と組み合わせて使用する。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物１０を含み、ここで、化合物１０を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物および第４の化合物と組み合わせて使用する。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物１１を含み、ここで、化合物１１を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物および第４の化合物と組み合わせて使用する。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物１を含み、ここで、化合物１を、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物、第４の化合物および第５の化合物と組み合わせて使用する。第２の化合物は化合物３、化合物４、化合物５または化合物６であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物２を含み、ここで、化合物２を、化合物１、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物、第４の化合物および第５の化合物と組み合わせて使用する。第２の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物３を含み、ここで、化合物３を、化合物１、化合物２、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物、第４の化合物および第５の化合物と組み合わせて使用する。第２の化合物は化合物１または化合物６であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物４を含み、ここで、化合物４を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物、第４の化合物および第５の化合物と組み合わせて使用する。第２の化合物は化合物１、化合物２、化合物３または化合物６であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物２であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物３であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物５を含み、ここで、化合物５を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物、第４の化合物および第５の化合物と組み合わせて使用する。第２の化合物は化合物１であってよい。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物６を含み、ここで、化合物６を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物、第４の化合物および第５の化合物と組み合わせて使用する。第２の化合物は化合物１、化合物２、化合物３または化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物２であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物３であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物７を含み、ここで、化合物７を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物、第４の化合物および第５の化合物と組み合わせて使用する。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物９を含み、ここで、化合物９を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物、第４の化合物および第５の化合物と組み合わせて使用する。
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物１０を含み、ここで、化合物１０を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物、第４の化合物および第５の化合物と組み合わせて使用する。
本発明の他の態様は、ＨＣＶ感染症を処置する方法において使用するための化合物１１を含み、ここで、化合物１１を、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物、第４の化合物および第５の化合物と組み合わせて使用する。
本発明の一態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物１を投与するステップを含み、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群から選択される第２の化合物を投与するステップをさらに含む。第２の化合物は、化合物３、化合物４、化合物５または化合物６であってよい。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物２を投与するステップを含み、化合物１、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群から選択される第２の化合物を投与するステップをさらに含む。第２の化合物は、化合物４であってよい。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物３を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群から選択される第２の化合物を投与するステップをさらに含む。第２の化合物は、化合物１または化合物６であってよい。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物４を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群から選択される第２の化合物を投与するステップをさらに含む。第２の化合物は、化合物１、または化合物２、または化合物３、または化合物６であってよい。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物５を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群から選択される第２の化合物を投与するステップをさらに含む。第２の化合物は、化合物１であってよい。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物６を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群から選択される第２の化合物を投与するステップをさらに含む。第２の化合物は、化合物１、化合物２、化合物３または化合物４であってよい。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物７を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群から選択される第２の化合物を投与するステップをさらに含む。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物９を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群から選択される第２の化合物を投与するステップをさらに含む。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物１０を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群から選択される第２の化合物を投与するステップをさらに含む。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物１１を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群から選択される第２の化合物を投与するステップをさらに含む。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物１を投与するステップを含み、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物および第３の化合物を投与するステップをさらに含む。第２の化合物は、化合物３、または化合物４、または化合物５、または化合物６であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物２を投与するステップを含み、化合物１、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物および第３の化合物を投与するステップをさらに含む。第２の化合物は、化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物３を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物および第３の化合物を投与するステップをさらに含む。第２の化合物は、化合物１または化合物６であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物４を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物および第３の化合物を投与するステップをさらに含む。第２の化合物は、化合物１、化合物２、化合物３、または化合物６であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物２であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物３であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物５を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物および第３の化合物を投与するステップをさらに含む。第２の化合物は、化合物１であってよい。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物６を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物および第３の化合物を投与するステップをさらに含む。第２の化合物は、化合物１、化合物２、化合物３または化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物２であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物３であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物７を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物および第３の化合物を投与するステップをさらに含む。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物９を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物および第３の化合物を投与するステップをさらに含む。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物１０を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物および第３の化合物を投与するステップをさらに含む。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物１１を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物および第３の化合物を投与するステップをさらに含む。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物１を投与するステップを含み、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物および第４の化合物を投与するステップをさらに含む。第２の化合物は、化合物３、化合物４、化合物５または化合物６であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物２を投与するステップを含み、化合物１、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物および第４の化合物を投与するステップをさらに含む。第２の化合物は、化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物３を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物および第４の化合物を投与するステップをさらに含む。第２の化合物は、化合物１または化合物６であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物４を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物および第４の化合物を投与するステップをさらに含む。第２の化合物は、化合物１、化合物２、化合物３、または化合物６であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物２であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物３であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物５を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物および第４の化合物を投与するステップをさらに含む。第２の化合物は、化合物１であってよい。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物６を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物および第４の化合物を投与するステップをさらに含む。第２の化合物は、化合物１、化合物２、化合物３または化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物２であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物３であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物７を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物および第４の化合物を投与するステップをさらに含む。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物９を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物および第４の化合物を投与するステップをさらに含む。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物１０を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物および第４の化合物を投与するステップをさらに含む。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物１１を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物および第４の化合物を投与するステップをさらに含む。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物１を投与するステップを含み、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物、第４の化合物および第５の化合物を投与するステップをさらに含む。第２の化合物は、化合物３、化合物４、化合物５または化合物６であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物２を投与するステップを含み、化合物１、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物、第４の化合物および第５の化合物を投与するステップをさらに含む。第２の化合物は、化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物３を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物、第４の化合物および第５の化合物を投与するステップをさらに含む。第２の化合物は、化合物１または化合物６であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物４を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物、第４の化合物および第５の化合物を投与するステップをさらに含む。第２の化合物は、化合物１、化合物２、化合物３、または化合物６であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物２であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物３であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物５を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物、第４の化合物および第５の化合物を投与するステップをさらに含む。第２の化合物は、化合物１であってよい。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物６を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物、第４の化合物および第５の化合物を投与するステップをさらに含む。第２の化合物は、化合物１、化合物２、化合物３および化合物４であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物２であってよい。第２の化合物は化合物１であってよく、第３の化合物は化合物３であってよい。第２の化合物は化合物４であってよく、第３の化合物は化合物６であってよい。第２の化合物は化合物２であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。第２の化合物は化合物３であってよく、第３の化合物は化合物４であってよい。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物７を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物、第４の化合物および第５の化合物を投与するステップをさらに含む。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物９を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物、第４の化合物および第５の化合物を投与するステップをさらに含む。
本発明の別の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対する耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物１０を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物、第４の化合物および第５の化合物を投与するステップをさらに含む。
本発明の他の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷減少させるための方法、ヒト被験体においてＨＣＶを処置する方法、および共投与される経口抗ウイルス薬に対して耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、それぞれの方法は、化合物１１を投与するステップを含み、化合物１、化合物２、化合物３、化合物５、化合物６および化合物７からなる群からそれぞれ選択される第２の化合物、第３の化合物、第４の化合物および第５の化合物を投与するステップをさらに含む。
投与経路および方式
化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５、および化合物１６のうちの２種以上ならびに併用療法の任意の他の構成要素を、処置される状態に適した任意の経路によって投与されるように適合させることができる。適切な経路には、経口、直腸、鼻、局所（頬側および舌下を含む）、膣および非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内および硬膜外を含む）などが挙げられる。好ましい経路は例えば、受容者の状態に伴って変動し得ることは理解される。
活性成分が：（１）共製剤化され（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）（例えば単一剤形で）、組合せ製剤で同時に投与または送達されるか；（２）別々の製剤として交互にまたは並行して送達されるか；または（３）いくつかの他のレジメンによる場合に、相乗効果は達成され得る。交互療法で送達される場合、化合物が例えば別々の錠剤、丸剤もしくはカプセル剤で、または別々のシリンジ中の異なる注射剤によって、逐次的に投与または送達される場合に、相乗効果は達成され得る。一般に、交互療法の間は、有効な投薬量のそれぞれの活性成分を、逐次的に、即ち連続して投与するが、併用療法では、有効な投薬量の２種以上の活性成分を一緒に投与する。
１種の併用化合物と１種または複数の併用化合物との共投与は一般に、治療有効量の２種以上の併用化合物が、患者の体内に存在するような１種または複数の併用化合物の同時または逐次的投与を指す。場合によっては、併用化合物（例えば２種、３種または４種の併用化合物）を、同時に投与することができるように共製剤化する。場合によっては、共製剤化された併用化合物を、１種または複数の追加の併用化合物と共投与することができる。
共投与はまた、単位投薬量の併用化合物を、単位投薬量の１種または複数の他の活性成分の投与、例えば、２種以上の併用化合物の投与の前または後に、１種または複数の他の活性成分の投与から数秒、数分または数時間以内に投与することを包含する。例えば、単位用量の併用化合物を初めに投与し、続いて数秒または数分以内に、単位用量の第２の併用化合物を投与し、続いて数秒または数分以内に、単位用量の１種または複数の他の活性成分を投与することができる。別法では、単位用量の１種または複数の他の活性成分を初めに投与し、続いて数秒または数分以内に、単位用量の併用化合物を投与し、続いて数秒または数分以内に、単位用量の第２の併用化合物を投与することができる。場合によっては、単位用量の併用化合物を初めに投与し、続いて数時間（例えば、１〜１２時間）後に、単位用量の第２の併用化合物を投与し、続いて数時間（例えば、１〜１２時間）後に、単位用量の１種または複数の他の活性成分を投与することが望ましいことがある。他の場合には、単位用量の１種または複数の他の活性成分を初めに投与し、続いて数時間（例えば、１〜１２時間）後に、単位用量の併用化合物を投与し、続いて数時間（例えば、１〜１２時間）後に、単位用量の第２の併用化合物を投与することが望ましいことがある。３種以上の併用化合物を１種または複数の追加の活性成分と共に投与する場合には、併用化合物を、前後して互いに数秒、数分または数時間（例えば、１〜１２時間）以内に投与することができ、１種または複数の追加の活性成分を、併用化合物の投与の前、その間またはその後に投与することができる。併用化合物を共製剤化する場合には、それらを、１種または複数の追加の活性成分の投与と同時に、またはその前に、またはその後に投与することができる。
別段に規定されていない限り、併用療法は、それぞれの活性成分を有する別々の剤形として投与することができ、一緒に、または別々に、逐次的に、または同時に、互いに時間的に近接して、または時間を空けて投与することができる。
処置過程は、例えば、約１２週間から約４８週間、もしくはそれより長く、例えば、約１２週間から約２４週間に及び得る。
本発明は、これらに限られないが、悪心、嘔吐、食欲不振、疲労、黄疸、嘔吐、下痢、脱水、腹痛、肝硬変を含む、ヒトでのＨＣＶ感染の少なくとも１つの症状を改善するための、治療上有効な構成要素の組合せを包含する。加えて、一部のＨＣＶ感染した個体では、併用療法の使用は、感染者の体内に存在するＨＣＶウイルス粒子のウイルス負荷を統計的に有意な量まで減少させるのに有効である。例えば、ＣＯＢＡＳ ＴａｑＭａｎ ＨＣＶアッセイ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、例えば、血漿ＨＣＶ ＲＮＡレベルを測定することによって、ウイルス負荷を測定することができる。典型的には、併用化合物で本発明に従って処置されるＨＣＶ感染者は、ＨＣＶ感染に随伴する症状のうちの１つまたは全てにおいて改善を経験する。
併用化合物のうちの２種以上と、インターフェロンではなくリバビリンとの組合せ物
上記で検討されたとおり、一部の現行のＨＣＶ処置は、インターフェロンの投与を包含するが、この処置は典型的には、望ましくない副作用を生じる。したがって、インターフェロンの投与を必要としない有効なＨＣＶ処置を見出すことが望ましい。
本発明の一態様は、ＨＣＶを処置するための組成物、方法、使用などを提供し、それらは、１種または複数のインターフェロンを投与することなく、併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩のうちの２種以上およびリバビリンを投与することを含む。本発明のこの態様は特に有用であり得る。それというのも、それによって、１種または複数のインターフェロンの投与に随伴する副作用を伴うことなく、ＨＣＶを有効に処置することができるためである。
本発明の一実施形態では、リバビリンおよび併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩の組み合わせた量は、必要に応じて１種または複数の追加の薬剤と共に、ＨＣＶ感染を処置するために有効である。
本発明の他の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１種または複数の症状を改善するための方法を包含し、その方法は、１種または複数のインターフェロンを同時に投与することなく、併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩のうちの２種以上およびリバビリンを投与するステップを含む。このことに関して、本発明は、１種または複数のインターフェロンを投薬する可能性を除外するものではない。むしろ、本発明は、実際には１種または複数のインターフェロンを含めた他の療法と一緒に使用することができる。本発明の一態様は、１種または複数のインターフェロンを必要とすることのないリバビリンでのＨＣＶの有効な処置を包含する。
本発明の他の態様は、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法を包含し、その方法は、併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩のうちの２種以上およびリバビリンは投与するが、１種または複数のインターフェロンは投与しないステップを含む。
本発明の他の態様は、ヒト被験体においてＨＣＶを処置するための方法を包含し、その方法は、リバビリンを、併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩のうちの２種以上と共に投与するステップから本質的になる。
本発明の他の態様は、共投与される経口抗ウイルス薬に対して耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、その方法は、１種または複数のインターフェロンを同時に投与することなく、併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩のうちの２種以上およびリバビリンを投与するステップを含む。
同様に、本発明の他の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための組成物、例えば薬学的組成物を包含し、その組成物は、１種または複数のインターフェロンを含まずに、併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩のうちの２種以上およびリバビリンを含む。本発明の他の態様は、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための組成物を包含し、その組成物は、併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩のうちの２種以上およびリバビリンは含むが、１種または複数のインターフェロンは含まない。本発明の他の態様は、ヒト被験体においてＨＣＶを処置するための組成物を包含し、その組成物は、併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩のうちの２種以上と共に、リバビリンから本質的になる。本発明の他の態様は、リバビリンをベースとするＨＣＶ療法のための組成物を包含し、その組成物は、併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩のうちの２種以上を含むが、但し、前記組成物は、１種または複数のインターフェロンを含まない。本発明の他の態様は、共投与される経口抗ウイルス薬に対して耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための組成物を包含し、その組成物は、１種または複数のインターフェロンを含まずに、併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩のうちの２種以上およびリバビリンを含む。
同様に、本発明の他の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１種または複数の症状を改善するための医薬品を製造する際の、１種または複数のインターフェロンを使用することのない併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩のうちの２種以上およびリバビリンの使用；さらに、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための医薬品を製造する際の、１種または複数のインターフェロンを使用することのない併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩のうちの２種以上およびリバビリンの使用；さらに、ヒト被験体においてＨＣＶを処置するための医薬品を製造する際の、併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩のうちの２種以上に加えてリバビリンの使用であって、ここで、前記使用が１種または複数のインターフェロンを含まない使用；さらに、リバビリンをベースとするＨＣＶ療法のための医薬品を製造する際の、併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩のうちの２種以上の使用であって、ここで、前記使用が、１種または複数のインターフェロンの投与を回避する使用；さらに、共投与される経口抗ウイルス薬に対して耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための医薬品を製造する際の、１種または複数のインターフェロンを使用することのない併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩のうちの２種以上およびリバビリンの使用を包含する。
本発明の他の態様は、リバビリンおよび、併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩のうちの２種以上を含む組合せ物であって、１種または複数のインターフェロンを実質的に含まない組合せ物を包含する。一実施形態では、組合せ物は、一緒に、または別々に、逐次的に、または同時に、そして、互いに時間的に近接して、または時間を空けて投与される、それぞれの活性成分を含む別々の剤形として存在し得る。
本発明の他の態様は、キットを包含し、そのキットは、リバビリンと、併用化合物のうちの２種以上と、ＨＣＶを処置するか、ＨＣＶのウイルス負荷を減少させるか、またはＨＣＶの発症もしくは進行を遅延させるための処置レジメンに関する指示とを含み、ここで、その処置レジメンは、１種または複数のインターフェロンの投与なしで、併用化合物の２種以上およびリバビリンを投与することを包含する。一実施形態では、そのようなキットは他にも、ブリスターバックなどのパッケージングを含んでよい。別法では、そのようなキットは、別々にパッケージングされた医薬品（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ）としてのそれぞれの構成要素の個々の処方および投薬のために提供され得るが、ＨＣＶを処置するか、ＨＣＶのウイルス負荷を減少させるか、またはＨＣＶの発症もしくは進行を遅延させるための処置レジメンに関する指示と組み合わされる場合には、そのようなものは、本発明の範囲内であることが意図されている。
本発明の他の態様は、リバビリン；併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩のうちの２種以上および１種または複数の薬学的に許容されるキャリアを含む薬学的組成物を包含する。一実施形態では、薬学的組成物は、単一剤形であってよい。
別段に規定されていない限り、リバビリンとの併用療法は、投与されるそれぞれの活性成分を有する別々の剤形（併用化合物を含む）として投与することができるか、一緒に（例えば、錠剤などの単位投薬量の形態で）、または別々に、逐次的に、もしくは同時に、そして、互いに時間的に近接して、または時間を空けて投与することができる。別々に投与する場合には、それぞれの化合物を他のもの（複数可）と同時にか、または他のもの（複数可）のそのような投与の前または後のいずれかに投与することができる。活性成分は、毎日投与することができる。一実施形態では、活性成分の日用量を、１日当たり１回、２回、３回または４回などの別々の用量未満で投与する。有利には、併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩およびリバビリンの日用量は、１日１回で投与することができる。
本発明は、２種以上の併用化合物または薬学的に許容されるその塩；およびリバビリンは投与するが、１種または複数のインターフェロンは投与しないことを含む、ＨＣＶを処置するための組成物、方法、使用などを包含するが、本発明は、ヒトに１種または複数のインターフェロンを投薬する可能性を除外するものではない。むしろ、本発明は、実際には１種または複数のインターフェロンを含む、他の適用のための他の療法と共に使用することができる。
併用化合物のうちの２種以上と、リバビリンおよびインターフェロンとの組合せ物
本発明の他の態様は、ＨＣＶを処置するために、併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩のうちの２種以上およびリバビリンならびに１種または複数のインターフェロンを投与することを含む組成物、方法、使用などを提供する。さらなるインターフェロンの投与は、併用化合物およびリバビリンの投与に対して時間的関連を有し得る。
本発明の他の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための方法を包含し、その方法は、併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩のうちの２種以上と、リバビリンと、１種または複数のインターフェロンとを投与するステップを含む。本発明の他の態様は、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための方法を包含し、その方法は、併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩のうちの２種以上を、リバビリンおよび１種または複数のインターフェロンと共に投与するステップを含む。
本発明の他の態様は、リバビリンをベースとするＨＣＶ療法の方法を包含し、その方法は、併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩のうちの２種以上を、リバビリンおよび１種または複数のインターフェロンと共に投与するステップを含む。
本発明の他の態様は、共投与される経口抗ウイルス薬に対して耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法を包含し、その方法は、併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩のうちの２種以上を、リバビリンおよび１種または複数のインターフェロンと共に投与するステップを含む。
本発明の他の態様は、ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための医薬品を製造する際の、併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩のうちの２種以上と、リバビリンと、１種または複数のインターフェロンとの使用を包含する。本発明の他の態様は、ＨＣＶを有すると診断されたヒトでのウイルス負荷を減少させるための医薬品を製造する際の、リバビリンおよび１種または複数のインターフェロンに加えて併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩のうちの２種以上の使用を包含する。本発明の他の態様は、ヒト被験体においてＨＣＶを処置するための医薬品を製造する際の、併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩のうちの２種以上に加えてリバビリンの使用であって、前記使用が、１種または複数のインターフェロンの使用を含む使用を包含する。本発明の他の態様は、リバビリンをベースとするＨＣＶ療法のための医薬品を製造する際の、併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩のうちの２種以上の使用であって、前記使用が、１種または複数のインターフェロンの投与を含む使用を包含する。本発明の他の態様は、共投与される経口抗ウイルス薬に対して耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための医薬品を製造する際の、併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩のうちの２種以上と、リバビリンと、１種または複数のインターフェロンとの使用を包含する。
本発明の他の態様は、リバビリンおよび併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩のうちの２種以上を含む組合せ物であって、その組合せが、１種または複数のインターフェロンを含む組合せ物を包含する。
本発明の他の態様は、リバビリンと、併用化合物のうちの２種以上と、１種または複数のインターフェロンと；ＨＣＶを処置するか、ＨＣＶのウイルス負荷を減少させるか、またはＨＣＶの発症もしくは進行を遅延させるための処置レジメンに関する指示とを含むキットであって、その処置レジメンが、併用化合物の２種以上と、リバビリンとの投与および１種または複数のインターフェロンの投与を含むキット包含する。一実施形態では、そのようなキットは他にも、ブリスターバックなどのパッケージングを含んでよい。別法では、そのようなキットは、別々にパッケージングされた医薬品としてのそれぞれの構成要素の個々の処方および投薬のために提供されていてよいが、ＨＣＶを処置するか、ＨＣＶのウイルス負荷を減少させるか、またはＨＣＶの発症もしくは進行を遅延させるための処置レジメンに関する指示と組み合わされる場合には、そのようなものは、本発明の範囲内であることが意図されている。
本発明の他の態様は、併用化合物または薬学的に許容されるそれらの塩のうちの２種以上と、リバビリンと、１種または複数のインターフェロンと；１種または複数の薬学的に許容されるキャリアとを含む薬学的組成物を包含する。一実施形態では、薬学的組成物は、単一剤形であってよい。
別段に規定されていない限り、リバビリンおよび１種または複数のインターフェロンとの併用療法は、別々の剤形として、患者に投与される１種または複数のインターフェロンと共に投与することができ、併用療法で使用されるそれぞれの残りの活性成分（併用化合物を含む）は、一緒に（例えば、錠剤などの単一投薬量の形態で）、または別々に、逐次的に、もしくは同時に、そして、互いに時間的に近接して、または時間を空けて投与される。別々に投与する場合には、それぞれの活性成分を他のもの（複数可）と共に同時にか、または他のもの（複数可）のそのような投与の前もしくは後のいずれかに投与することができる。活性成分は、毎日投与することができる。一実施形態では、日用量を、１日当たり１回、２回、３回または４回などの別々の用量未満で投与する。
追加の治療剤を含む併用療法
他の実施形態では、適切な組合せの非限定的例には、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２、化合物１３、化合物１４、化合物１５および化合物１６のうちの２種またはそれより多くと、ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ阻害薬、α−グルコシダーゼ１阻害薬、肝臓保護薬、ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼのヌクレオシドまたはヌクレオチド阻害薬、ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼの非ヌクレオシド阻害薬、ＨＣＶ ＮＳ５Ａ阻害薬、ＴＬＲ−７アゴニスト、シクロフィリン阻害薬、ＨＣＶ ＩＲＥＳ阻害薬、ＨＣＶ侵入阻害薬、ＨＣＶ成熟阻害薬、ＨＣＶ集合阻害薬、ＨＣＶ感染性阻害薬および薬物動態促進剤、さらにＨＣＶを処置するための他の薬物を包含する１種または複数の追加の活性成分との組合せが挙げられる。より具体的には、１種または複数の本発明の化合物は：
（ｉ）ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ阻害薬、例えば、ボセプレビル（ＳＣＨ−５０３０３４、ＳＣＨ−７）、テラプレビル（ＶＸ−９５０）、ＴＭＣ−４３５（ＩＵＰＡＣ Ｎ−［（２Ｒ，３ａＲ，１０Ｚ，１１ａＳ，１２ａＲ，１４ａＲ）−２−［２−（４−イソプロピルチアゾール−２−イル）−７−メトキシ−８−メチルキノリン−４−イルオキシ］−５−メチル−４，１４−ジオキソ−１，２，３，３ａ，４，５，６，７，８，９，１１ａ，１２，１２ａ，１３，１４，１４ａ−ヘキサデカヒドロシクロペンタ［ｃ］［シクロプロパ［ｇ］［１，６］ジアザシクロテトラデシン−１２ａ−イルカルボニル］シクロプロパンスルホンアミド］、ＡＢＴ−４５０、ＡＣＨ−１６２５、ＡＣＨ−２６８４、ＢＩ−２０１３３５、ＢＩ−１２３０、ＭＫ−５１７２、ＭＫ−７００９、ＳＣＨ−９００５１８、ＶＢＹ−３７６、ＶＸ−５００、ＧＳ−９２５６、ＧＳ−９４５１、ＢＭＳ−６０５３３９、ＰＨＸ−１７６６、ＡＳ−１０１、ＹＨ−５２５８、ＹＨ−５５３０、ＹＨ−５５３１、およびＩＴＭＮ−１９１（Ｒ−７２２７）；
（ｉｉ）α−グルコシダーゼ１阻害薬、例えば、セルゴシビル（ＭＸ−３２５３）、ＵＴ−２３１Ｂ、ミグリトール；
（ｉｉｉ）肝臓保護薬、例えば、エメリカサン（ＩＤＮ−６５５６）、ＭＥ−３７３８、シリビリン、およびＭｉｔｏＱ；
（ｉｖ）ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼのヌクレオシドまたはヌクレオチド阻害薬、例えば、Ｒ１６２６、Ｒ７１２８（Ｒ４０４８）、ＩＤＸ１８４、ＩＤＸ−１０２、ＰＳＩ−６６１、ＰＳＩ−９３８、ＰＳＩ−７８５１、ＰＳＩ−７９７７、ＢＣＸ−４６７８、ヴァロピシタビン（ＮＭ−２８３）、ＭＫ−０６０８およびＴＭＣ６４９１２８；
（ｖ）ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼの非ヌクレオシド阻害薬、例えば、フィリブビル（ＰＦ−８６８５５４）、ＡＢＴ−３３３、ＡＢＴ−０７２、ＢＩ−２０７１２７、ＶＣＨ−７５９、ＶＣＨ−９１６、ＪＴＫ−６５２、ＭＫ−３２８１、ＶＢＹ−７０８、ＶＣＨ−２２２、Ａ８４８８３７、ＡＮＡ−５９８、ＧＬ６０６６７、ＧＬ５９７２８、Ａ−６３８９０、Ａ−４８７７３、Ａ−４８５４７、ＢＣ−２３２９、ＶＣＨ−７９６（ネスブビル）、ＧＳＫ６２５４３３、ＢＩＬＮ−１９４１、およびＸＴＬ−２１２５；
（ｖｉ）ＨＣＶ ＮＳ５Ａ阻害薬、例えば、ＡＣＨ−２９２８、ＡＺＤ−２８３６（Ａ−８３１）、ＡＺＤ−７２９５（Ａ−６８９）、ＢＭＳ−７６６、ＢＭＳ−７９００５２、ＢＭＳ−８２４３９３、およびＰＰＩ−４６１；
（ｖｉｉ）ＴＬＲ−７アゴニスト、例えば、イミキモド、８５２Ａ、ＡＮＡ−７７３、ＡＮＡ−９７５、ＡＺＤ−８８４８（ＤＳＰ−３０２５）、ＰＦ−０４８７８６９１、およびＳＭ−３６０３２０および化合物８；
（ｖｉｉｉ）シクロフィリン阻害薬、例えば、ＤＥＢＩＯ−０２５、ＳＣＹ−６３５、およびＮＩＭ８１１；
（ｉｘ）ＨＣＶ ＩＲＥＳ阻害薬、例えば、ＭＣＩ−０６７；
（ｘ）薬物動態促進剤、例えばロキシスロマイシン、ＢＡＳ−１００、ＳＰＩ−４５２、ＰＦ−４１９４４７７、ＴＭＣ−４１６２９；
（ｘｉ）ＨＣＶ侵入阻害薬
（ｘｉｉ）ＨＣＶ集合阻害薬；
（ｘｉｉｉ）ＨＣＶ成熟阻害薬；
（ｘｉｖ）ＨＣＶ感染性阻害薬；ならびに
（ｘｖ）ＨＣＶを処置するための他の薬物、例えば、サイモシンα１（Ｚａｄａｘｉｎ）、ニタゾキサニド（Ａｌｉｎｅａ、ＮＴＺ）、ＢＩＶＮ−４０１（ｖｉｒｏｓｔａｔ）、ＰＹＮ−１７（ａｌｔｉｒｅｘ）、ＫＰＥ０２００３００２、アクチロン（ＣＰＧ−１０１０１）、ＫＲＮ−７０００、シバシル、ＧＩ−５００５、ＸＴＬ−６８６５、ＢＩＴ２２５、ＰＴＸ−１１１、ＩＴＸ２８６５、ＴＴ−０３３ｉ、ＡＮＡ９７１、ＮＯＶ−２０５、タルバシン、ＥＨＣ−１８、ＶＧＸ−４１０Ｃ、ＥＭＺ−７０２、ＡＶＩ４０６５、ＢＭＳ−６５００３２、ＢＭＳ−７９１３２５、バビツキシマブ、ＭＤＸ−１１０６（ＯＮＯ−４５３８）、オグルファニド、ＦＫ−７８８、およびＶＸ−４９７（メリメポジブ）
からなる群から選択される１種または複数の化合物と組み合わせ得る。
合成実施例
化合物１、２、３、６、７および８を調製するための合成プロトコルは、文献において公知である。加えて、併用化合物それぞれを調製するための合成プロトコルを、下記の実施例において提供する。
化合物１は、米国特許第７，７５４，７２０号に記載されているものなどの合成方法および中間体を使用して調製することができる。化合物１はまた、次の実施例に記載されているとおりに調製することができる。
（実施例１）
５−（｛６−［２，４−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］ピリダジン−３−イル｝メチル）−２−（２−フルオロフェニル）−５Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン１
化合物１０３を、ジメトキシエタン（ＤＭＥ）に溶かした。この溶液に、２，４−ビス（トリフルオロメチル（ｔｒｉｆｌｕｒｏｍｅｔｈｙｌ））フェニルボロン酸１０５および２ＮのＮａ２ＣＯ３水溶液を加えた。生じた二相の混合物に、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４を加え、次いで、反応物を８０℃で７２時間加熱した。反応物を室温に冷却し、Ｃｅｌｉｔｅで濾過し、そのＣｅｌｉｔｅをＥｔＯＡｃで洗浄した。濾液を真空濃縮した。残渣をＳｉＯ２６ｇ上で、ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を使用して精製して、化合物を溶離した。そうして得られた化合物は、ＰＰｈ３（Ｏ）で汚染されていた。生成物を、１ｍｍ Ｃｈｒｏｍａｔｏｔｒｏｎプレート上で、１％のステップで０から５％のＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いて再精製した。純粋なフラクションを合わせ、真空濃縮し、次いで高真空で１２時間乾燥させた。ＰＰｈ３汚染のない、化合物１の遊離塩基１１．８ｍｇを得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ） δ ６．２０（ｓ， ２）， ７．３２（ｍ， ３）， ７．５２（ｍ， １）， ７．７８（ｄ， １）， ７．８９（ｄ， １）， ７．９５（ｓ， ２）， ８．１５（ｍ， ３）， ８．３５（ｄ， １）， ９．１２（ｓ， １）；ＬＣ／ＭＳ Ｍ＋Ｈ＝５１８。
中間体化合物１０４を次のとおりに調製した。
ａ．化合物１０２の調製
市販の出発物質１０１のＣＨＣｌ３中の溶液に、トリクロロイソシアヌル酸（ＴＣＣＡ）を６０℃で加えた。次いで、溶液を１．５時間撹拌し、冷却し、そしてＨｉＦｌｏ−Ｃｅｌｉｔｅで濾過した。濾液を濃縮し、真空で乾燥させた。収量は、化合物１０２ ５．０３７ｇであった。
ｂ．化合物１０４の調製
化合物１０３のＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）中の溶液に、ＮａＯＨを加えた。化合物１０２をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶かし、該溶液に徐々に加えた。反応物を３時間撹拌し、水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を除去し、生成物をジクロロメタンで再結晶化させた。収量は化合物１０３ ５．７ｇであった。
米国特許出願第１２／２０２３１９号（米国特許出願公開第２０１０００５１７６３ Ａ１号）に記載されているものなどの合成方法および中間体を使用して、化合物２は調製することができる。化合物２はまた、次の実施例に記載されているとおりに調製することができる。
（実施例２）
化合物２の調製
ホスフィン酸エステル２０６（２３．７ｇ、２４．０５ｍｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮ（２４０ｍＬ）に溶かし、０℃に冷却した。ヨードトリメチルシラン（１７．４ｍＬ、１２２．３ｍｍｏｌ）を迅速な滴下ペースで加え、続いて、１０分後に、２，６−ルチジン（１７．０ｍＬ、１４６．４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温に徐々に加温し、１時間撹拌し、次いで、０℃に再び冷却し、２，６−ルチジン（１１．１ｍＬ、９５．６ｍｍｏｌ）を、続いてＭｅＯＨ（２４ｍＬ）を加えた。溶液を真空濃縮し、粗製の残渣をＨＰＬＣによって精製して、化合物２ １２．６８ｇを収率５５％で得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ８．３５（ｄ， Ｊ＝９．３Ｈｚ， １Ｈ）， ８．２８（ｓ， １Ｈ）， ７．８５（ｓ， １Ｈ）， ７．６４（ｄ， Ｊ＝９．６Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３５−７．２２（ｍ， １Ｈ）， ７．０２−６．８９（ｍ， ２Ｈ）， ５．８５（ｂｓ， １Ｈ）， ４．８２−４．７１（ｍ， ２Ｈ）， ４．３３（ｂｓ，
１Ｈ）， ４．２８−３．９９（ｍ， ３Ｈ）， ４．１６（ｓ， ３Ｈ）， ３．５７−３．２８（ｍ， ２Ｈ）， ２．９０−２．７８ｍ， １Ｈ）， ２．６３−２．５０（ｍ， １Ｈ）， ２．０８−１．９１（ｍ， １Ｈ）， １．９１−１７０（ｍ， ２Ｈ）， １．７０−１．１３（ｍ， ２２Ｈ）， １．３７（ｄ， Ｊ＝６．９Ｈｚ，
６Ｈ）； ３１Ｐ ＮＭＲ（１２１．４ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） δ ４２．４；ＬＣＭＳ（Ｍ＋１）：９５７．３５ｇ。
中間体化合物２０６を、次のとおりに調製した。
ａ．化合物２０３の調製
化合物２０１（１７．４２ｇ、２８．３０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１３６ｍＬ）に溶かし、０℃に冷却した。溶液に、Ｎ−メチルモルホリン（４．７ｍＬ、４２．７ｍｍｏｌ）を加えた。０℃での１０分の後に、ｉ−ブチルクロロホルメート（４．０５ｍＬ、３０．９６ｍｍｏｌ）を滴加した。さらに１時間の後に、（１−アミノ−２−ビニル−シクロプロピル）−（２，６−ジフルオロ−ベンジル）−ホスフィン酸エチルエステル２０２（８．９４ｇ、２９．７０ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の溶液として徐々に加えた。懸濁物を室温に加温し、２時間後に、これをＨ２Ｏ（４００ｍＬ）と酢酸エチル（２００ｍＬ）とに分配した。水性層を酢酸エチル（２００ｍＬ×２）で抽出し、合わせた有機層をＨＣｌ（１Ｎ、２２５ｍＬ）およびＨ２Ｏ（２００ｍＬ）で洗浄した。酸洗浄液および水洗浄液を合わせ、酢酸エチル（１７５ｍＬ×２、１００ｍＬ×２）で逆抽出した。合わせた有機層をブライン（４００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、真空濃縮して、ジエン２０３ ２５．０６ｇを粗製物の収率９８．５％として得た。ＬＣＭＳ（Ｍ＋１）：８９８．０６。
ｂ．化合物２０４の調製
化合物２０３（１２．９１ｇ、１４．３６ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（１４４０ｍＬ）に溶かし、溶液を３０分間脱気した。溶液を４０℃に加熱し、グラブス（Ｇｒｕｂｂ’ｓ）Ｇ１触媒（２．９５ｇ、３．５９ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を１７時間還流させ、その後、トリス−ヒドロキシメチルホスフィン（２２．３ｇ、１８．０ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（５０ｍＬ、３５．９ｍｍｏｌ）およびＨ２Ｏ（４００ｍＬ）を加え、反応混合物をさらに１６時間加熱還流した。反応混合物を室温に冷却し、２層を分離した。有機層をＨ２Ｏ（４００ｍＬ）およびブライン（３００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮した。粗製の残渣をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、大環状オレフィン２０４ ８．３０ｇを収率６６％で得た。ＬＣＭＳ（Ｍ＋１）：８７０．０９。
ｃ．化合物２０５の調製
大環状オレフィン２０４（７．３４ｇ、８．４２ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（１０５ｍＬ）に溶かし、アルミナに担持されているロジウム（ｒｈｏｄｉｕｍ ｏｎ ａｌｕｍｉｎａ）（５重量％、２．９４５ｇ、０．４０重量％）を加えた。系を排気し、Ｈ２（１ａｔｍ、３×）でフラッシュした。３時間後にその系に、さらなるアルミナに担持されているロジウム（５重量％、８４２ｍｇ、０．１０重量％）を加え、排気し、Ｈ２（１ａｔｍ、３×）でフラッシュした。さらに１時間の後に、懸濁物を濾過し、真空濃縮して、還元大環状化合物２０５ ６．４９ｇを粗製収率８８％で得た。ＬＣＭＳ（Ｍ＋１）：８７２．０４。
ｄ．化合物２０６の調製
ブロシレート大環状化合物２０５（６．４９ｇ、７．６７ｍｍｏｌ）をＮ−メチルピロリジノン（２５．０ｍＬ）に溶かし、８−クロロ−２−（２−イソプロピルアミノ−チアゾール−４−イル）−７−メトキシ−キノリン−４−オール２０７（２．５６４ｇ、７．３３ｍｍｏｌ）を、続いてＣｓ２ＣＯ３（４．４０ｇ、１３．５０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を６５℃に６時間加熱し、次いで、酢酸エチル（２００ｍＬ）で希釈し、ＬｉＣｌ（５％、２５０ｍＬ）で洗浄した。水性層を酢酸エチル（１００ｍＬ×２）で抽出し、合わせた有機層をブライン（１５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４／ＭｇＳＯ４で乾燥し、真空濃縮した。粗製の残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル−メタノール）を介して精製して、アミノチアゾール２０６ ４．３９ｇを収率５８％で得た。ＬＣＭＳ（Ｍ＋１）：９８５．２８。
中間体化合物２０１は、次のとおりに調製することができる。
ｅ．化合物２０９の調製
化合物２０８（７．００ｇ、２８．５５ｍｍｏｌ）およびＤＡＢＣＯ（５．１３ｇ、４５．９４ｍｍｏｌ）をトルエン（３０ｍＬ）に溶かした。塩化ブロシル（１０．２２ｇ、４０．０１ｍｍｏｌ）のトルエン（１１ｍＬ）溶液を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応物をＥｔＯＡｃ（２１０ｍＬ）で希釈し、０．５ＮのＨＣｌ（２００ｍＬ）を加えた。２層を分離し、水性層をＥｔＯＡｃ（２×２００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗製の生成物をコンビフラッシュによって精製して、化合物２０９ １２．２３ｇを収率９２％で得た。
ｆ．化合物２１０および２１２の調製
化合物２０９（１２．２ｇ、２６．３ｍｍｏｌ）を４ＮのＨＣｌ／１，４−ジオキサン（６０ｍＬ）で処理し、１時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、真空下で２０分間乾燥させた。化合物２１０の粗製のアミンＨＣｌ塩をＤＭＦ（１５０ｍＬ）に溶かし、酸２１１（１４．２ｇ、５２．６ｍｍｏｌ）を加えた。ＨＡＴＵ（２０．０ｇ、５２．６ｍｍｏｌ）およびＮＭＭ（１３．５ｇ、１３１．５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応物をＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）で希釈し、１ＮのＨＣｌ（２００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗製の生成物をコンビフラッシュによって精製して、化合物２１２ １５．１ｇを収率９３％で得た。
ｇ．化合物２１３の調製
２１２（１２．８ｇ、２０．７ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）中の溶液に、１，４−ジオキサン中４ＮのＨＣｌ（５０ｍＬ、２００ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌し、濃縮し、真空下で２０分間乾燥させ、次いでＣＨ３ＣＮ（５０ｍＬ）に溶かした。Ｈ２Ｏ中の飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）を加え、５分間撹拌した。新たに調製されたＴＨＦ（５０ｍＬ）中のシクロペンチルクロロホルメートを加えた。反応は１時間以内に完了した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をＥｔＯＡｃで希釈した。１ＮのＨＣｌを用いて、混合物をｐＨ＝２にし、２層を分離した。有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、そして濃縮して、粗製の化合物２１３（３．１８ｇ）を得た。
ｈ．化合物２０１の調製
粗製のエステル２１３（３．１８ｇ、５．０７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２５ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（２５ｍＬ）に溶かし、次いで、ＭｅＯＨ（６ｍＬ）およびＬｉＯＨ（６６０ｍｇ、２５．４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌し、ＥｔＯＡｃで希釈した。１ＮのＨＣｌを用いて、反応混合物をｐＨ２まで酸性化し、２層を分離した。水性層をＥｔＯＡｃ（２×）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、真空下で乾燥させて、酸２０１ ３．０９ｇを得た。
中間体８−クロロ−２−（２−イソプロピルアミノ−チアゾール−４−イル）−７−メトキシ−キノリン−４−オール２０７は、次のとおりに調製することができる。
ｉ．８−クロロ−４−ヒドロキシ−７−メトキシキノリン−２−カルボン酸２１５の調製
メチル８−クロロ−４−ヒドロキシ−７−メトキシキノリン−２−カルボキシレート２１４（３６．５ｇ、０．１４５ｍｏｌ）の、１：１のＭｅＯＨ：ＴＨＦの混合物（全部で１６０ｍＬ）中の溶液に、ＬｉＯＨ（３０．５ｇ、０．７２５ｍｏｌ）のＨ２Ｏ（８０ｍＬ）中の溶液を加えた。混合物を１時間室温で撹拌したが、そのとき、ＬＣＭＳ分析によって、カルボン酸への完全な変換が示された。揮発性物質を除去し、６Ｎの水性ＨＣｌを使用して溶液のｐＨを６に調節することによって、反応物を後処理した。生じたゴム状の残渣を濾過し、凍結乾燥機で２日間乾燥させて、化合物２１５ ３４．４ｇ（９９．６％）を白色の固体として得た。ＥＩ ＭＳ（ｍ／ｚ）２５３．９［Ｍ＋Ｈ］。
ｊ．２−（２−ジアゾ−ｌ−オキソ）−８−クロロ−７−メトキシキノリン−４−イルイソブチルカルボネート２１６の調製
８−クロロ−４−ヒドロキシ−７−メトキシキノリン−２−カルボン酸２１５（１０．２ｇ、０．０４ｍｏｌ）のＴＨＦ（４００ｍＬ）中の溶液に、トリエチルアミン（１２．３ｍＬ、０．０８８ｍｏｌ）およびｉ−ブチルクロロホルメート（１１．６ｍＬ、０．０８８ｍｏｌ）を０℃でアルゴン雰囲気下で加えた。混合物を０℃で１時間撹拌したが、そのとき、ＬＣＭＳ分析によって、反応の完了が証明されて、所望の混合無水酸が得られた。ＥＩ ＭＳ（ｍ／ｚ）４５４．０［Ｍ＋Ｈ］。無水物の反応混合物に、ジエチルエーテル中の１Ｍのジアゾメタン溶液（１２１ｍＬ、０．１２１ｍｏｌ）を、プラスチック製漏斗を介して０℃で加えた。この混合物を室温まで加温させながらさらに２時間撹拌した。ＬＣＭＳによる混合物の分析によって、反応の完了が証明された。隔膜を除去し、反応物をさらに２０分間撹拌し、その後、溶媒を除去した。残渣をさらに高真空下で乾燥させて、化合物２１６を得、これを次のステップへと続けた。ＥＩ ＭＳ（ｍ／ｚ）３７７．９［Ｍ＋Ｈ］。
ｋ．８−クロロ−２−（２−（イソプロピルアミノ）チアゾール−４−イル）−７−メトキシキノリン（ｍｅｔｈｏｘｙｑｕｉｎｏｉｉｎ）−４−オール２０７の調製
０℃に冷却された２−（２−ジアゾ−ｌ−オキソ）−８−クロロ−７−メトキシキノリン−４−イルイソブチルカルボネート２１６（１５．２ｇ、０．０４０ｍｏｌ）のＴＨＦ（２６８ｍＬ）中の溶液に、４８％ＨＢｒ（２３ｍＬ、０．２０１ｍｏｌ）を１５分間にわたって徐々に加えた。溶液を０℃でさらに４０分間撹拌したが、そのとき、ＬＣＭＳ分析によって、反応の完了が証明された。０℃で１ＮのＮａＯＨ水溶液（１８０ｍＬ）を加えて水性層のｐＨを９に調節することによって、反応物を後処理した。層を分離して、水性層をＥｔＯＡｃ（２×２００ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機抽出物をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を真空で除去して、黄色の固体１７．７ｇを得た。ＥＩ
ＭＳ（ｍ／ｚ） ４３１．９［Ｍ＋Ｈ］。
上記の反応から得られたブロモケトンの溶液をｉ−プロパノール（２７０ｍＬ）およびイソプロピルイソ尿素（９．４ｇ、０．０８０ｍｏｌ）に懸濁させた。反応混合物を７２℃で３２時間加熱した。反応物のＬＣＭＳ分析によって、所望の生成物への完全な変換が証明された。反応物を室温に冷却し、生成物を溶液から沈殿させた。反応物を０℃に１２時間さらに冷却し、その後、濾過した。濾液をエーテルで洗浄し、凍結乾燥機で乾燥させて、化合物２０７ ８．０３ｇをオレンジ色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ８．２１（ｄ， Ｊ＝９Ｈｚ， １Ｈ）， ７．７４（ｓ， １Ｈ）， ７．４４（ｄ， Ｊ＝１０Ｈｚ）， １Ｈ）， ７．０７（ｓ， １Ｈ）， ４．０５（ｓ， ３Ｈ）， ３．９２（五重線， Ｊ＝６Ｈｚ， １Ｈ）， １．２５（ｄ， Ｊ＝７Ｈｚ， ６Ｈ）：ＥＩ ＭＳ（ｍ／ｚ） ３５０．０［Ｍ＋Ｈ］。
化合物３は、米国特許出願第１２／２１５，６０５号（米国特許出願公開第２００９０２５７９７８ Ａ１号）に記載されているものなどの合成方法および中間体を使用して調製することができる。化合物３もまた、次の実施例に記載されているとおりに調製することができる。
（実施例３）
化合物３の調製
化合物３１５（１２ｇ、１３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２００ｍｌ）に溶かし、Ｈ２Ｏ（２００ｍｌ）中のＬｉＯＨ（１１ｇ、２６０ｍｍｏｌ）を、続いてＭｅＯＨ（２００ｍｌ）を加えた。混合物を室温で２０時間撹拌し続けた。反応が完了したら、０℃でＨ２Ｏ中４ＮのＨＣｌを加えて、ｐＨを７に調節した。混合物をＥｔＯＡｃ（２×４００ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空濃縮して、化合物３を黄色の固体（１１ｇ、９３％）として得た。ＬＣ／ＭＳ＝９１１．５２（Ｍ＋＋１）。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） δ ７．９５（ｄ， １Ｈ）， ７．９０（ｓ， １Ｈ）， ７．４８（ｓ， １Ｈ）， ７．３１（ｄ， １Ｈ），
５．４２（ｓ， １Ｈ）， ４．３７（ｄｄ， １Ｈ）， ４．２０（ｍ， ２Ｈ）， ３．８３−３．５６（ｍ， ７Ｈ）， ３．５０（ｍ， ２Ｈ）， ３．３９（ｍ， ２Ｈ）， ２．４５（ｍ， １Ｈ）， ２．２７（ｍ， １Ｈ）， １．６２（ｍ， ２Ｈ）， １．５０（ｍ， １Ｈ）， １．３３（ｍ， ２Ｈ）， １．１８（ｍ， １Ｈ）， １．０５（ｍ， ８Ｈ）， ０．９０（ｍ， ３Ｈ）， ０．７６（ｍ， １１Ｈ）， ０．１４−０．０４（ｍ， ２Ｈ）。
中間体化合物３１５を次のとおりに調製した。
ａ．化合物３０１の調製
アルゴンでパージされた乾燥している三つ口丸底フラスコ（１０００ｍＬ）に、無水ジクロロメタン（１００ｍＬ）およびＥｔ２Ｚｎ（２８ｍＬ、２７３ｍｍｏｌ）を０℃で加えた（注意：アルゴン供給源は、ニードルからであってはならない。適切なガラスアダプターだけを使用すること。第２の気泡管をフラスコに装着して、過剰な圧力形成を防ぐこともできる）。次いで、シクロペンテン−３−オール（１０．０ｍＬ、１１９ｍｍｏｌ）をフラスコに滴加し（大量のエタンガスが生じた）、反応混合物を、ガスの発生が止まるまで撹拌した。次いで、ジヨードメタン（２２ｍＬ、２４２ｍｍｏｌ）を３０分間にわたって滴加した。反応物を室温に加温し、アルゴンの正流下で一晩撹拌し続けたが、その時点で、ＴＬＣ分析によって、出発アルコールの完全な消失が示された。次いで、反応物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、２ＭのＨＣｌ（白色の沈澱物を完全に溶かすべきである）でクエンチした。二相の混合物を分離漏斗に注ぎ、有機層を収集した。化合物３０１を含有する物質１００ｍＬが残るまで、溶媒を減圧下で除去した。
ｂ．化合物３０２の調製
無水ジクロロメタン（５２５ｍＬ）をフラスコに加え、続いて、トリエチルアミン（３４ｍＬ、２４５ｍｍｏｌ）を滴加した。反応物を窒素の正流下で室温で撹拌し続けたが、その時点で、ジスクシンイミジルカルボネート（４０．７ｇ、１５９ｍｍｏｌ）をフラスコに少量ずつ加えた。ＴＬＣ分析によって出発物質の完全な消失が示されるまで、反応物を撹拌した（２〜３日間）。完了したら、反応混合物を１ＭのＨＣｌ（２００ｍＬ×２）でクエンチし、Ｈ２Ｏ（２００ｍＬ×２）で洗浄した。所望の物質を、ＣＨ２Ｃｌ２を使用して抽出し、合わせた有機層を、無水ＭｇＳＯ４を使用して乾燥させ、シリカプラグに通した。溶媒を減圧下で除去し、粗製物質を、フラッシュクロマトグラフィーを使用して精製して（Ｒｆ＝０．３３、１：１のＨｅｘ／ＥｔＯＡｃ）、化合物３０２（２２ｇ、７５％）を得た：１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ５． ２４（ｔ，
１Ｈ）， ３．８２（ｓ， ４Ｈ）， ２．２４（ｍ， ２Ｈ）， ２．０３（ｄ， ２Ｈ）， １．３８（ｍ， ２Ｈ）， ０．４８（ｍ， １Ｈ）， ０．４０（ｍ， １Ｈ）。
ｃ．化合物３０４の調製
２Ｌ三つ口丸底フラスコ内で機械攪拌機および添加漏斗を用いて、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−ｃｉｓ−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンメチルエステル３０３（１００．０ｇ、４０７．７ｍｍｏｌ）およびＤＡＢＣＯ（１．５当量、６８．６ｇ、６１１．６ｍｍｏｌ）を無水トルエン（２００ｍＬ）に溶かした。溶液を０℃にＮ２下で冷却した後に、４−ブロモ−ベンゼンスルホニルクロリド（１．３当量、１３５．６ｇ、５３０．０ｍｍｏｌ）のトルエン３００ｍＬ中の溶液を添加漏斗を介して６０分間かけて加えた。反応混合物を撹拌し、室温に一晩（１６時間）加温した。混合物を１ＭのＮａ２ＣＯ３（水溶液）２Ｌにゆっくりと注ぎ、生成物をＥｔＯＡｃ（２Ｌ）で抽出した。有機相を０．５Ｎ ＨＣｌ（２Ｌ）、Ｈ２Ｏ（１Ｌ）およびブライン（１Ｌ）で洗浄した後に、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濃縮して、黄色の油性のブロシレート生成物１９５．４５ｇを得た。
上記のブロシレート（４０７．７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３００ｍＬ）中の溶液に、ジオキサン中４．０ＭのＨＣｌ（５００ｍＬ、５当量）を徐々に加え、生じた溶液を室温で２時間撹拌した。エーテル（５００ｍＬ）を反応混合物に加えた後に、混合物を１５分間撹拌し、濾過によって、白色の沈澱物を収集した。固体をエーテルおよびヘキサンで洗浄し、次いで、真空下で一晩乾燥させて、化合物３０４のＨＣｌアミン塩１５３．０ｇ、３８１．８ｍｍｏｌを２ステップで収率９４％で得た。
ｄ．化合物３０５の調製
Ｂｏｃ−ｔｅｒｔ−ブチル−グリシン（９７．０ｇ、４２０．０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２００ｍＬ）および塩化メチレン（２００ｍＬ）中の溶液に、ＨＡＴＵ（２１７．７６ｇ、５７２．７ｍｍｏｌ）およびＨｕｎｉｇ塩基（１２６ｍＬ、１１４５．４ｍｍｏｌ）を室温で加えた。混合物を室温で２０分間撹拌した後に、上記のＨＣｌ塩（１５３．０ｇ、３８１．８ｍｍｏｌ）およびＨｕｎｉｇ塩基（１２６ｍＬ、１１４５．４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２００ｍＬ）およびジクロロメタン（２００ｍＬ）中の溶液を上記の酸混合物に一度に加えた。ＬＣＭＳによって監視しながら、反応混合物を室温で３時間撹拌した。反応混合物を濃縮してジクロロメタンを減圧下で除去し、形成した白色の固体を濾別した。残りのＤＭＦ溶液を酢酸エチル（１Ｌ）で希釈し、３％ＬｉＣｌ（水溶液）（３×６５０ｍＬ）、飽和ＮＨ４Ｃｌ（２×５００ｍＬ）、０．５ＮのＨＣｌ（水溶液）（２×６００ｍＬ）、ブライン（５００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（３×５００ｍＬ）およびブライン（５００ｍＬ）で連続的に洗浄した。生じた有機フラクションを乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濃縮して、化合物３０５（１１１ｇ）を得た。
ｅ．化合物３０６の調製
メチルエステル３０５（１２０ｇ、２０７．８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３００ｍＬ）、ＭｅＯＨ（７５ｍＬ）中の溶液に、ＬｉＯＨ（２６．１８ｇ、６２３．４ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（１５０ｍＬ）中の溶液を加えた。溶液を室温で４時間撹拌した。混合物を氷浴中で冷却し、その間に、３ＮのＨＣｌを用いてｐＨ約５．５に酸性化し、１０分間撹拌し、生じた白色の固体を濾過によって収集した。固体をさらなる水、エーテルおよびヘキサンで洗浄した。固体を真空下、４０℃で一晩乾燥させて、酸３０６ ９５．７８ｇ（８２％）を得た。
ｆ．化合物３０７の調製
カルボン酸３０６（８１．４ｇ、１４４．２７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２００ｍＬ）およびジクロロメタン（２００ｍＬ）中の溶液に、ＨＡＴＵ（８２．３ｇ、２１６．４ｍｍｏｌ）およびＨｕｎｉｇ塩基（４７．５ｍＬ、４３２．８ｍｍｏｌ）を室温で加えた。混合物を２０分間室温で撹拌した後に、アミン（１５８．７ｍｍｏｌ）およびＨｕｎｉｇ塩基（４７．５ｍＬ、１１４５．４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２００ｍＬ）およびジクロロメタン（２００ｍＬ）中の溶液を、上記の酸混合物に一度に加えた。反応混合物を室温で３時間撹拌し、ＬＣＭＳによって監視した。混合物を減圧下で濃縮してジクロロメタンを除去した後に、形成した白色の固体を濾別した。残りのＤＭＦ溶液を酢酸エチル（６００ｍＬ）で希釈し、３％ＬｉＣｌ（水溶液）（２×５５０ｍＬ）、飽和ＮＨ４Ｃｌ（５００ｍＬ）、１ＮのＨＣｌ（水溶液）（５００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（５００ｍＬ）およびブライン（３００ｍＬ）で連続的に洗浄した。生じた有機フラクションを乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮して化合物３０７（１１１ｇ）を得た。
ｇ．化合物３０８の調製
化合物３０７を、ジオキサン中４ＮのＨＣｌ（３００ｍＬ）に室温で溶かし、２時間撹拌した。次いで、これを真空下で濃縮し、ジクロロメタン（２×２００ｍＬ）と共蒸発させて（ｃｏ−ｅｖａｐｏｒａｔｅｄ）乾燥させた。残渣をＥｔＯＡｃ（６００ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１Ｌ）に溶かした。これを激しく撹拌した。１０分後に、炭酸ビシクロ［３．１．０］ヘキサ−３−イルエステル２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル３０２（４１．４ｇ、１７３．１ｍｍｏｌ）を一度に加えた。生じた混合物をさらに３０分間撹拌した後に、有機層を収集し、ブライン（５００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮した。酢酸エチル／ヘキサンを用いるシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーによって、粗製の生成物を精製して、化合物３０８ ９４．４４ｇ（９２％）を得た。
ｈ．化合物３１０の調製
１−（２−アミノ−３−クロロ−４−ヒドロキシ−フェニル）−エタノン３０９（７０．７ｇ、３５４ｍｍｏｌ）を４８％ＨＢｒ水溶液（５００ｍＬ）中、１１０℃で７２時間撹拌した。撹拌しながら、混合物を０℃に冷却した後に、固体を濾過し、水で洗浄した。生じた固体を飽和ＮａＨＣＯ３溶液（約３５０ｍＬ）で摩砕し、濾過し、水で洗浄し、真空下で乾燥させて、粗製３１０約４０ｇ（６１％）を暗茶色の固体として得た。ＬＣ／ＭＳ＝１８６（Ｍ＋＋１）。
ｉ．化合物３１１の調製
１−（２−アミノ−３−クロロ−４−ヒドロキシ−フェニル）−エタノン３１０（４０ｇ、２１５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３６０ｍｌ）に溶かした。炭酸セシウム（１４０ｇ、４３０ｍｍｏｌ）を、続いて、ブロモアセトアルデヒドジメチルアセタール（５４．５ｇ、３２３ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、混合物を６５℃で２４時間激しく撹拌した。室温に冷却したら、ＥｔＯＡｃ（１Ｌ）およびＨ２Ｏ（１Ｌ）を混合物に加えた。有機層をＥｔＯＡｃ（１×４００ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を３％ＬｉＣｌ水溶液（２×１Ｌ）、ブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、化合物３１１を白色の固体（３９ｇ、６７％）として得た。
ｊ．化合物３１２の調製
１−［２−アミノ−３−クロロ−４−（２，２−ジメトキシ−エトキシ）−フェニル］−エタノン３１１（１３ｇ、４７．５ｍｍｏｌ）およびイソプロピルアミノチアゾール−４−カルボン酸臭化水素酸塩（１２．６４ｇ、４７．５ｍｍｏｌ）のピリジン（１５０ｍｌ）中の混合物に、オキシ塩化リン（９．４７ｇ、６１．８ｍｍｏｌ）を−４０℃で徐々に加えた。次いで、混合物を０℃で４時間撹拌した。反応が完了したら、Ｈ２Ｏ（３０ｍｌ）を混合物に滴加した。次いで、混合物を０℃でさらに１５分間撹拌した。混合物を真空濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄した。有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空濃縮した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２に溶かし、ヘキサンを溶液に徐々に加えると、黄色の固体が急に析出し始めた。もはや母液中に生成物が残されていなくなるまで、さらなるヘキサンを加えて、化合物３１２（１８ｇ、８５％）を得た。
ｋ．化合物３１３の調製
２−イソプロピルアミノ−チアゾール−４−カルボン酸［６−アセチル−２−クロロ−３−（２，２−ジメトキシ−エトキシ）−フェニル］−アミド３１２（１８ｇ、４０．７ｍｍｏｌ）をトルエン（４００ｍｌ）に懸濁させた。ＮａＨ（２．４ｇ、６１ｍｍｏｌ）を激しく撹拌されている混合物に加えたが、その間、Ｈ２発生を監視した。混合物は、加熱還流している間に透明な溶液になった。３時間還流させた後に、反応が完了した。混合物を室温に冷却した。ＡｃＯＨ（６９．２ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ中の溶液（３容）を、混合物に加えた。０℃で１時間激しく撹拌した後に、濾過によって、固体を収集し、Ｈ２Ｏですすいだ。湿ったケーキを高真空下で恒量まで乾燥させて、化合物３１３（１５ｇ、８６％）を得た。
ｌ．化合物３１４の調製
ブロシレート中間体３０３（１５ｇ、３５ｍｍｏｌ）および化合物３１３（２７．５ｇ、３８．５ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（２００ｍｌ）中の混合物に、炭酸セシウム（２５．１ｇ、７７ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を６５℃で５時間撹拌した。反応物を室温に冷却し、ＥｔＯＡｃ（６００ｍｌ）および３％ＬｉＣｌ水溶液（６００ｍｌ）を混合物に加えた。有機層を３％水性ＬｉＣｌ（１×６００ｍｌ）、ブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、所望のメチルエステルを黄色の固体（２３．６ｇ、７５％）として得た。ＬＣ／ＭＳ＝９００．１３（Ｍ＋＋１）。
ｍ．化合物３１５の調製
メチルエステル３１４（２３．６ｇ、２６ｍｍｏｌ）を氷酢酸（２００ｍｌ）に溶かし、Ｈ２Ｏ中１．４ＮのＨＣｌ（７５ｍｌ）を溶液に加えた。混合物を６０℃で１時間撹拌した。反応が完了したら、混合物を濃縮して溶媒を除去し、トルエン（×２）と共に共蒸発させて、残りの酢酸を除去した。次いで、残渣をＥｔＯＡｃ（５００ｍｌ）および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（混合物を中和するのに十分なほど）に溶かしたが、その間、ＣＯ２発生を監視した。有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、かつ真空濃縮した。残渣を高真空下で１時間さらに乾燥させて、そのまま次のステップのために使用した。粗製物をＣＨ２Ｃｌ２（３６０ｍｌ）に溶かし、モルホリン（３．４ｇ、３９ｍｍｏｌ）およびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（７．２ｇ、３４ｍｍｏｌ）を混合物に０℃で加えた。次いで、氷酢酸（０．４７ｇ、７．８ｍｍｏｌ）を混合物に滴加した。反応は０℃では１０分間で完了した。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を加えて、反応物をクエンチした。さらに２０分間撹拌した後に、有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、所望のアミン生成物３１５を黄色の固体（１２ｇ、５０％）として得た。ＬＣ／ＭＳ＝９２４．６３（Ｍ＋＋１）。
化合物４は、次の実施例に記載されているとおりに調製することができる。
（実施例４）
化合物４の調製
ジアステレオ異性体混合物４１４をヘプタンおよびイソプロパノール（７０％：３０％、混合溶媒４．５ｍＬ中に２３０ｍｇ）に溶かし、次の条件下でキラルカラム分離に供した：
カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＤ−Ｈ、２×２５ｃｍ
溶媒系：ヘプタン７０％およびイソプロパノール３０％
流速：６ｍＬ／分
１ラン当たりの負荷体積：２．５ｍＬ
化合物４は、２０分の保持時間を有した。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ８．００（ｓ， １Ｈ）， ７．１−７．３（ｍ， ５Ｈ）， ６．８３（ｄ， １Ｈ）， ６．７１（ｄ， １Ｈ）， ６．０９（ｂｒｓ， ２Ｈ）， ５．９５（ｓ， １Ｈ）， ５．０４（ｍ， ２Ｈ）， ４．６７（ｑ， １Ｈ）， ４．３５−４．５２（ｍ， ２Ｈ）， ４．００（ｍ， ２Ｈ）， ２．７４（ｍ， １Ｈ）， １．４０（ｄ， ３Ｈ）， １．２−１．３（１２Ｈ）， ０．９８（ｓ， ３Ｈ）。 ３１Ｐ ＮＭＲ（１２１．４ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ２．７２（ｓ）。続いて、化合物４を、Ｘ線品質の結晶のために、ＭＴＢＥから再結晶化させた。
化合物４ａは、保持時間５０分を有した。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ７．９８（ｓ， １Ｈ）， ７．１−７．３（ｍ， ５Ｈ）， ６．８３（ｄ， １Ｈ）， ６．７３（ｄ， １Ｈ）， ６．０２（ｂｒｓ， ２Ｈ）， ５．９５（ｓ， １Ｈ）， ５．０８（ｄ， １Ｈ）， ５．００（ｍ， １Ｈ）， ４．６８（ｑ， １Ｈ）， ４．３８−４．５６（ｍ， ２Ｈ）， ３．９８（ｍ， ２Ｈ）， ２．７４（ｍ， １Ｈ）， １．４０（ｄ， ３Ｈ）， １．２−１．３（１２Ｈ）， ０．９９（ｓ， ３Ｈ）。 ３１Ｐ ＮＭＲ（１２１．４ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ２．６１（ｓ）。
中間体ジアステレオ異性体混合物４１４を次のとおりに調製した。
ａ．化合物４０２の調製
化合物４０１（２２．０ｇ、５４．９ｍｍｏｌ、Ｊ．Ｏ．Ｃ．、２００４年、６２５７頁に記載されている手順に従って調製）のメタノール（３００ｍＬ）中の溶液に、塩化アセチル（２２ｍＬ）を０℃で、滴下漏斗を使用して、３０分間かけて滴加し、次いで、室温で１６時間撹拌した。混合物を濃縮し、酢酸エチル（４００ｍＬ）に再び溶かし、氷冷の２ＮのＮａＯＨで洗浄し、乾燥するまで濃縮して、粗製のメチルエーテル４０２をオイルとして得た。ＭＳ＝４３７．２（Ｍ＋Ｎａ＋）。
ｂ．化合物４０３の調製
化合物４０２のメタノール（３００ｍＬ）中の溶液に、メタノール中０．５Ｍのナトリウムメトキシド溶液（２０ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で１６時間撹拌した。反応物をジオキサン中４．０ＮのＨＣｌ溶液（２．５ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）でクエンチした。次いで、混合物を濃縮し、粗製の化合物４０３を得た。ＭＳ＝２０１．０（Ｍ＋Ｎａ＋）。
ｃ．化合物４０４の調製
化合物４０３、Ｔｒｉｔｒｏｎ Ｘ−４０５（水中７０％、６．０ｇ）、５０％ＫＯＨ（水中、８５ｇ）のトルエン（５００ｍＬ）中の混合物を、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋトラップを取り付けて加熱還流した。水２５ｍＬを１時間収集した後に、塩化ベンジル（３３ｇ、２６０ｍｍｏｌ）を加え、撹拌しながら１６時間還流を続けた。次いで、混合物を冷却し、酢酸エチル（４００ｍＬ）と水（３００ｍＬ）とに分配した。有機層を水（３００ｍＬ）で洗浄し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して、メチルエーテル４０４をオイル（２２．０ｇ、３ステップで８９％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ７．３（ｍ， １５Ｈ）， ４．５−４．９（ｍ， ７Ｈ）， ４．３７（ｍ， １Ｈ）， ３．８７（ｄ， １Ｈ）， ３．５６（ｍ， ２Ｈ）， ３．５２（ｓ， ３Ｈ）， １．４０（ｓ， ３Ｈ）。
ｄ．化合物４０５の調製
４０４（２２．０ｇ、４９．０ｍｍｏｌ）の酢酸（１１０ｍＬ）中の溶液に、３Ｍの硫酸（濃硫酸４．８ｇを水２４ｍＬと混合することによって調製）を加え、７０℃で８時間撹拌した。混合物を２０ｍＬの体積まで濃縮し、酢酸エチルと氷冷の２ＮのＮａＯＨとに分配した。酢酸エチル層を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（約３５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して、化合物４０５をオイル（１７．０ｇ、８０％）として得た。ＭＳ＝４５７．２（Ｍ＋Ｎａ＋）。
ｅ．化合物４０６の調製
化合物４０５（４５ｇ、１０４ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（１３５ｍＬ）中の溶液に、無水酢酸（９０ｍＬ、８１５ｍｍｏｌ）を室温、アルゴン下で滴加した。混合物を室温で１６時間撹拌し、次いで、撹拌しながら氷水（１Ｌ）に注いだ。氷が完全に溶けた後に（３０分）、酢酸エチル（５００ｍＬ）を加えた。有機層を分離した。この抽出プロセスを３回（３×５００ｍＬ）繰り返した。有機抽出物を合わせ、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して、化合物４０６をオイル（３９ｇ、８８％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ ７．３（ｍ， １５Ｈ）， ４．４−４．８（ｍ， ７Ｈ）， ４．０８（ｄ， Ｊ＝７．５Ｈｚ， １Ｈ）， ３．７５（ｄｄ， Ｊ＝２，４， １１．４Ｈｚ，
１Ｈ）， ３．６４（ｄｄ， Ｊ＝５．４， １１．４Ｈｚ， １Ｈ）， １．５１（ｓ， ３Ｈ）。
ｆ．化合物４０７の調製
乾燥している、アルゴンパージされた丸底フラスコ（１００ｍＬ）に、７−ブロモ−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−４−イルアミン（２３４ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ）（ＷＯ２００７０５６１７０号に従って調製）および無水ＴＨＦ（１．５ｍＬ）を加えた。次いで、ＴＭＳＣｌ（２７６μＬ、２．２ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を２時間撹拌した。フラスコをドライアイス／アセトン浴（−７８℃）に入れ、ＢｕＬｉ（２．５ｍＬ、４．０ｍｍｏｌ、ヘキサン中１．６Ｍ）を滴加した。１時間後に、化合物４０６（４３２．５ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ中の溶液を０℃に冷却し、次いで、反応フラスコに滴加した。−７８℃で１時間撹拌した後に、フラスコを０℃に加温し、飽和ＮＨ４Ｃｌ（５ｍＬ）を加えて、反応物をクエンチした。有機物を、ＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）を使用して抽出し、合わせた有機層を、ＭｇＳＯ４を使用して乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、粗製物質を、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）を使用して精製した。化合物４０７ ５６０ｍｇ（９０％）を２種のアノマーの混合物として単離した。ＬＣ／ＭＳ＝５６７．２（Ｍ＋Ｈ＋）。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，
ＣＤＣｌ３）： δ ７．８５（ｍ， １Ｈ）， ７．２７（ｍ， １５Ｈ）， ７．０１（ｍ， １Ｈ）， ６．５１（ｍ， １Ｈ）， ４．６６（ｍ， ８Ｈ）， ４．４０（ｍ， ２Ｈ）， ３．７９（ｍ， ３Ｈ）， １．６２（ｓ、１つのアノマーからの２’−ＣＨ３）， １．１８（ｓ、他のアノマーからの２’−ＣＨ３）。
ｇ．化合物４０８の調製
化合物４０７（１ｇ、１．７７ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中の溶液に０℃で、ＴＭＳＣＮ（１．４ｍＬ、１０．５ｍｍｏｌ）およびＢＦ３−Ｅｔ２Ｏ（１ｍＬ、８．１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を０℃で０．５時間撹拌し、次いで、室温でさらに０．５時間撹拌した。反応物をＮａＨＣＯ３で０℃でクエンチし、ＣＨ３ＣＯ２Ｅｔで希釈した。有機相を分離し、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮した。ＣＨ３ＣＯ２Ｅｔ−ヘキサン（１：１から２：１）で溶離するシリカゲルのクロマトグラフィーによって、残渣を精製して、化合物４０８（６２０ｍｇ、６１％）を異性体混合物として得た。ＭＳ＝５７６．１（Ｍ＋Ｈ＋）。
ｈ．化合物４０９の調製
化合物４０８（１５０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）中の溶液に−７８℃で、ＢＣｌ３（２ｍＬ、ＣＨ２Ｃｌ２中１Ｍ）を加えた。反応混合物を−７８℃で１時間撹拌した。ＴＥＡ（２ｍＬ）およびＭｅＯＨ（５ｍＬ）を滴加することによって、反応物を−７８℃でクエンチした。混合物を室温に加温し、蒸発させ、ＭｅＯＨと数回、共蒸発させた。残渣をＮａＨＣＯ３（Ｈ２Ｏ１０ｍＬ中に１ｇ）で処理し、濃縮し、ＨＰＬＣによって精製して、所望の生成物である化合物４０９（４８ｍｇ、６０％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ）： δ ７．７４（ｓ １Ｈ）， ６．７６（ｄ， Ｊ＝５Ｈｚ， １Ｈ）， ６．７３（ｄ， Ｊ＝５Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１（ｍ， １Ｈ）， ３．９（ｍ， １Ｈ）， ３．８（ｍ， ２Ｈ）， ０．８４（ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ＝３０５．９（Ｍ＋Ｈ＋）。他のα−アノマーもまた得られた（９ｍｇ、１１％）：１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ）： δ ７．７０（ｓ １Ｈ）， ６．８（ｄ， Ｊ＝５Ｈｚ， １Ｈ）， ６．７（ｄ， Ｊ＝５Ｈｚ， １Ｈ）， ４．２５（ｄ， Ｊ＝９Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０７（ｍ， １Ｈ）， ３．８５（ｍ， １Ｈ）， ３．７（ｍ， １Ｈ）， １．６（ｓ， ３Ｈ）。ＭＳ＝３０６．１（Ｍ＋Ｈ＋）。
ｉ．化合物４１２の調製
化合物４１０（市販、４．９９ｇ、２３．８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶かし、アラニンイソプロピルエステルヒドロクロリド４１１（３．９８ｇ、２３．８ｍｍｏｌ）を加えた。生じた透明な溶液を−７８℃に３０分間冷却した。トリエチルアミン（６．６３ｍＬ、４７．５ｍｍｏｌ）を１５分間かけて滴加した。次いで、混合物を室温に加温した。１６時間後に、溶媒をアルゴン流によって除去した。残渣をＭＴＢＥ（２５ｍＬ）に再び溶かし、不溶性物質をアルゴン下で濾過することによって除去した。濾液をアルゴン流によって濃縮し、粗製の生成物４１２をさらに精製することなく、次の反応で使用した。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： ７．１−７．４（ｍ，
５Ｈ）， ５．１（ｍ， １Ｈ）， ４．３５（ｍ， １Ｈ）， ４．１５（ｍ， １Ｈ）， １．５（ｄ， ３Ｈ）， １．２（ｍ， ６Ｈ）． ３１Ｐ ＮＭＲ（１２１．４ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ７．８および８．４（２ｓ）。
ｊ．化合物４１３の調製
化合物４０９（１．０３ｇ、３．３７ｍｍｏｌ）のリン酸トリメチル（２．０ｍＬ）およびＴＨＦ（２０ｍＬ）中の溶液に、Ｎ−メチルイミダゾール（１．５ｇ、１８．３ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。化合物４１２（２．５ｇ、８．１８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３ｍＬ）中の溶液を滴加した。生じた混合物を１．５時間にわたって室温に加温した。混合物を酢酸エチルと水とに分配した。酢酸エチル層を濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチルから１０％エタノール／酢酸エチル）によって精製して、化合物４１３ １．１５ｇ（５９％）をリン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ）での１：１のジアステレオ異性体混合物として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ８．０２（ｓ， １Ｈ）， ７．１−７．４（ｍ， ５Ｈ）， ６．８（２ｄ， １Ｈ）， ６．７（２ｄ， １Ｈ）， ６．０８（ｂｒｓ， ２Ｈ）， ５．０３（ｍ， １Ｈ）， ４．６（ｍ， １Ｈ）， ４．４（ｍ， ２Ｈ）， ３．９−４．１（ｍ， ３Ｈ）， １．３１（ｄ， ３Ｈ）， １．２（ｍ， ６Ｈ）， ０．８３（ｓ， ３Ｈ）。 ３１Ｐ
ＮＭＲ（１２１．４ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ２．７８（ｓ）。ＭＳ＝５７５．１（Ｍ＋Ｈ＋）。
ｋ．化合物４１４の調製
化合物４１３（１７５ｍｇ、０．３０５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（２ｍＬ）中の溶液に、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジメチルアセタール（４１μＬ、０．３４ｍｍｏｌ、１．１当量）を加え、室温で１時間撹拌した。反応は完了した（ＬＣＭＳによって）。次いで、混合物を乾燥するまで濃縮した。残渣に、ＤＣＣ（２５０ｍｇ、１．２１ｍｍｏｌ、４当量）、アセトニトリル（５ｍＬ）およびイソ酪酸（５５ｍｇ、５８μＬ、２当量）を加えた。混合物を室温で４８時間撹拌した。水（０．２ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸（０．１ｍＬ）を０℃で加え、室温で６４時間撹拌した。重炭酸ナトリウム（５００ｍｇ）を０℃で加えた。混合物を室温で０．５時間撹拌し、濾過した。濾液を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（５％メタノール／ジクロロメタン）によって精製して、化合物４１４ １４４ｍｇ（７３％）をリン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ）での１：１ジアステレオ異性体混合物として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ８．００（ｓ， １Ｈ）， ７．１−７．４（ｍ， ５Ｈ）， ６．８３（ｄ，
１Ｈ）， ６．７１（２ｄ， １Ｈ）， ５．９７（ｂｒｓ， ２Ｈ）， ５．９４（ｄ， １Ｈ）， ５．０７（２ｄ， １Ｈ）， ５．０１（ｍ， １Ｈ）， ４．６８（ｍ， １Ｈ）， ４．４（ｍ， ２Ｈ）， ４．０（ｍ， ２Ｈ）， ２．７４（ｍ， １Ｈ）， １．４（２ｄ， ３Ｈ）， １．２−１．３（１２Ｈ）， ０．９８および０．９９（２ｓ， ３Ｈ）。 ３１Ｐ ＮＭＲ（１２１．４ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ
２．５６および２．６５（２ｓ）．ＭＳ＝６４５．１（Ｍ＋Ｈ＋）。
化合物５は、次の実施例に記載されているとおりに調製することができる。
（実施例５）
５：５−（３，３−ジメチルブタ−１−イン−１−イル）−３−［（ｃｉｓ−４−ヒドロキシ−４−｛［（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ］メチル｝シクロヘキシル）｛［（１Ｒ）−４−メチルシクロヘキサ−３−エン−１−イル］カルボニル｝アミノ］チオフェン−２−カルボン酸５の調製
１−メチル−ピロリジン−２−オン（３ｍＬ）中の５−（３，３−ジメチル−ブタ−１−イニル）−３−［（（１Ｒ）−４−メチル−シクロヘキサ−３−エンカルボニル）−（１−オキサ−スピロ［２．５］オクタ−６−イル）−アミノ］チオフェン−２−カルボン酸メチルエステル５０８（１３２ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）および（Ｓ）−テトラヒドロ−フラン−３−オール５０９（２４７ｍｇ、２．８ｍｍｏｌ）をカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（２５１ｍｇ、２．２４ｍｍｏｌ）で処理し、密閉し、４０℃に１６時間加熱した。冷却した後に、混合物をｐＨ３まで、２ＭのＨＣｌで処理し、酢酸エチルと水とに分配し、分離した。有機層を５％塩化リチウム溶液、水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過し、濃縮した後に、残渣をＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）／Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）を用いるＨＰＬＣによって精製して、化合物５ １０７ｍｇ（収率７０％）を白色の粉末として得た：ＭＳ（ｍ／ｚ）：５４４．０［Ｍ＋Ｈ］＋；ＨＰＬＣ保持時間４．２２分（２〜９８％のアセトニトリル：水、トリフルオロ酢酸０．０５％含有）。
中間体化合物５０８は、次のとおりに調製した。
ａ．化合物５０２の調製
ジクロロメタン（２５ｍＬ）中の（Ｓ）−３−ヒドロキシ−４，４−ジメチルジヒドロフラン−２（３Ｈ）−オン（２．６０ｇ、２０ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（５．２ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）を−１０℃に冷却し、塩化アクリロイル（２．０３ｍＬ、２５ｍｍｏｌ）で滴下処理し、２時間撹拌した。１ＭのＨＣｌ（２０ｍＬ）を加え、有機層を重炭酸ナトリウムおよび水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（１０〜４０％ＥｔＯＡｃ、ヘキサン）によって、所望の（Ｓ）−４，４−ジメチル−２−オキソテトラヒドロフラン−３−イルアクリレート５０１ ２．０９ｇ（収率５７％）を透明なオイルとして得た。
ジクロロメタン（１７．５ｍＬ）およびヘキサン（２．５ｍＬ）中の（Ｓ）−４，４−ジメチル−２−オキソテトラヒドロフラン−３−イルアクリレート５０１（２．０５ｇ、１１．１ｍｍｏｌ）を−１０℃に冷却し、四塩化チタン（２．２ｍＬ、ジクロロメタン中１Ｍ、２．２ｍｍｏｌ）で処理した。黄色の溶液を１５分間撹拌し、イソプレン（１．６７ｍＬ、１６．７ｍｍｏｌ）で５分間にわたって滴下処理した。２時間撹拌した後に、追加の分割のイソプレン（１．６７ｍＬ、１６．７ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を−１０から０℃で３．５時間撹拌した。反応混合物を塩化アンモニウム（飽和水溶液）でクエンチした。水および酢酸エチル：ヘキサン（１：１）を加えた。有機層を分離し、水性層を再び酢酸エチル：ヘキサン（１：１）で抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（１０〜５０％ＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ、８０ｇカラム）によって精製して、（Ｒ）−（（Ｓ）−４，４−ジメチル−２−オキソテトラヒドロフラン−３−イル）４−メチルシクロヘキサ−３−エンカルボキシレート５０２ １．３０ｇ（収率４６％）を透明なオイルとして得た。
ｂ．化合物５０３の調製
ＴＨＦ（１０ｍＬ）、水（１ｍＬ）およびメタノール（１ｍＬ）中の（Ｒ）−（（Ｓ）−４，４−ジメチル−２−オキソテトラヒドロフラン−３−イル）４−メチルシクロヘキサ−３−エンカルボキシレート５０２（１．３０ｇ、５．１５ｍｍｏｌ）を水酸化リチウム一水和物（２．１６ｇ、５１．５ｍｍｏｌ）で処理し、撹拌しながら５０℃に加温した。１時間後に、反応混合物を１ＭのＨＣｌで処理した。混合物をヘキサン：ＴＨＦ（１０：１）で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮して、白色の粉末としての（Ｒ）−４−メチルシクロヘキサ−３−エンカルボン酸５０３ ０．７３８ｇ（定量的収量）にした。
ｃ．化合物５０４の調製
トルエンから蒸発させることによって共沸乾燥させた（Ｒ）−４−メチルシクロヘキサ−３−エンカルボン酸５０３（３７１ｍｇ、２．６５ｍｍｏｌ）を三塩基性リン酸カリウム（１．１３ｇ、７．９４ｍｍｏｌ）で処理し、ジクロロメタン（７．６ｍＬ）に懸濁させ、ジメチルホルムアミド（４滴）で処理した。反応混合物を０℃に冷却し、塩化オキサリル（０．７５ｍＬ、７．９ｍｍｏｌ）で滴下処理した。反応混合物を撹拌しながら、周囲温度に２時間加温した。固体を濾過した後に、溶液を濃縮し、ヘキサンで処理し、再び濃縮して、（Ｒ）−４−メチルシクロヘキサ−３−エンカルボニルクロリド５０４を薄黄色のオイルとして得、これを直ちに次のステップで使用した。
ｄ．化合物５０６の調製
（Ｒ）−４−メチルシクロヘキサ−３−エンカルボニルクロリド５０４（２．６５ｍｍｏｌ）、５−（３，３−ジメチル−ブタ−１−イニル）−３−（１，４−ジオキサ−スピロ［４．５］デカ−８−イルアミノ）−チオフェン−２−カルボン酸メチルエステル５０５（２５０ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）および三塩基性リン酸カリウム（５６２ｍｇ、２．６５ｍｍｏｌ）をジクロロエタン（１．７ｍＬ）に懸濁させ、蓋で密閉し、９０℃に加熱した。１６時間後に、反応混合物を冷却し、酢酸エチルと水とに分配した。有機層を分離し、水性層を再び酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（１０〜４０％ＥｔＯＡｃ：ヘキサン）によって、所望の５−（３，３−ジメチル−ブタ−１−イニル）−３−［（１，４−ジオキサ−スピロ［４．５］デカ−８−イル）−（（１Ｒ）−４−メチル−シクロヘキサ−３−エンカルボニル）−アミノ］チオフェン−２−カルボン酸メチルエステル５０６ ２２０ｍｇ（収率６７％）をベージュ色の泡として得た。
ｅ．化合物５０７の調製
５−（３，３−ジメチル−ブタ−１−イニル）−３−［（１，４−ジオキサ−スピロ［４．５］デカ−８−イル）−（（１Ｒ）−４−メチル−シクロヘキサ−３−エンカルボニル）−アミノ］−チオフェン−２−カルボン酸メチルエステル５０６（２１９ｍｇ、０．４３８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３．５ｍＬ）に溶かし、４ＭのＨＣｌ（１．７５ｍＬ、７．０１ｍｍｏｌ）で処理した。反応混合物を４５℃に加熱し、２時間撹拌した。酢酸エチルを加え、有機層を分離し、次いで、水、重炭酸ナトリウム（飽和水溶液）、水およびブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮して、白色の泡としての所望の５−（３，３−ジメチル−ブタ−１−イニル）−３−［（（１Ｒ）−４−メチル−シクロヘキサ−３−エンカルボニル）−（４−オキソ−シクロヘキシル）−アミノ］−チオフェン−２−カルボン酸メチルエステル５０７ ０．１９０ｇ（収率９５％）にした。
ｆ．化合物５０８の調製
ＤＭＳＯ（１．５ｍＬ）中のトリメチルスルホキソニウムクロリド（７９ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を水素化ナトリウム（２１ｍｇ、６０％油分散物、０．５３ｍｍｏｌ）で処理し、周囲温度で１０分間撹拌した。ＴＨＦ（１ｍＬ＋０．５ｍＬ）中の５−（３，３−ジメチル−ブタ−１−イニル）−３−［（（１Ｒ）−４−メチル−シクロヘキサ−３−エンカルボニル）−（４−オキソ−シクロヘキシル）−アミノ］−チオフェン−２−カルボン酸メチルエステル５０７を滴加し、反応混合物を４５分間撹拌した。オレンジ色の溶液をｐＨ３まで５％クエン酸で処理し、水と酢酸エチルとに分配した。有機層を分離し、水性層を再び酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層を５％ＬｉＣｌ、水およびブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過および濃縮した後に、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（２０〜７５％ＥｔＯＡｃ：ヘキサン）によって精製して、５−（３，３−ジメチル−ブタ−１−イニル）−３−［（（１Ｒ）−４−メチル−シクロヘキサ−３−エンカルボニル）−（１−オキサ−スピロ［２．５］オクタ−６−イル）−アミノ］−チオフェン−２−カルボン酸メチルエステル５０８ ０．１３４ｇ（収率７０％）を白色の粉末として得た。
化合物６は、米国特許出願第１２／７７９，０２３号（米国特許出願公開第２０１００３１０５１２ Ａ１号）に記載されているものなどの合成方法および中間体を使用して調製することができる。化合物６はまた、次の実施例に記載されているとおりに調製することもできる。
（実施例６）
（１−｛３−［６−（９，９−ジフルオロ−７−｛２−［５−（２−メトキシカルボニルアミノ−３−メチル−ブチリル）−５−アザ−スピロ［２．４］ヘプタ−６−イル］−３Ｈ−イミダゾール−４−イル｝−９Ｈ−フルオレン−２−イル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル］−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボニル｝−２−メチル−プロピル）−カルバミン酸メチルエステル６の調製
３−［６−（９，９−ジフルオロ−７−｛２−［５−（２−メトキシカルボニルアミノ−３−メチル−ブチリル）−５−アザ−スピロ［２．４］ヘプタ−６−イル］−３Ｈ−イミダゾール−４−イル｝−９Ｈ−フルオレン−２−イル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル］−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル６１４（１１５ｍｇ、０．１３８ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（２ｍＬ）に溶かし、ジオキサン中のＨＣｌ（４Ｍ、２ｍＬ）を加え、室温での撹拌を続けた。２０分後に、全ての揮発性物質を真空で除去した。粗製物質をさらに精製することなく次のステップで使用した。粗製物質をＤＭＦ（１．５ｍＬ）に溶かし、ＤＩＥＡ（５３．４ｍｇ、０．４１４ｍｍｏｌ）を加えた。２−（Ｌ）メトキシカルボニルアミノ−３−メチル−酪酸６１１（２４．２ｍｇ、０．１３８ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（５２．４ｍｇ、０．１３８ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１７．８ｍｇ、０．１３８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）中の溶液を加えた。反応物を室温で撹拌した。２０分後に、反応物をＥｔＯＡｃで希釈し、重炭酸塩水溶液、ＬｉＣｌ水溶液（５％）、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過し、溶媒を真空で除去して、粗製物質を得、これをＲＰ−ＨＰＬＣ（溶離剤：水／ＭｅＣＮ、０．１％ＴＦＡ含有）によって精製して、化合物６（７６ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ−ＥＳＩ＋：Ｃ４９Ｈ５４Ｆ２Ｎ８Ｏ６での算出値：８８８．９（Ｍ＋）；実測値：８９０．０（Ｍ＋Ｈ＋）。１Ｈ−ＮＭＲ： ３００ＭＨｚ，（ｄｍｓｏ−ｄ６） δ： ８．２０−７．９９（ｍ， ８Ｈ）， ７．７３（ｓ， ２Ｈ）， ７．３７−７．２７（ｍ， ２Ｈ）， ５．２５（ｄｄ， Ｊ＝７．２Ｈｚ， １Ｈ）， ４．７８（ｓ， １Ｈ） ４．５４（ｓ， １Ｈ）， ４．１６（ｍ， １Ｈ）， ４．０２（ｍ， １Ｈ）， ３．８７（ｍ，１Ｈ）， ３．７４（ｍ， １Ｈ）， ３．５５（ｓ， ３Ｈ）， ３．５３（ｓ， ３Ｈ）， ２．７５（ｍ， １Ｈ）， ２．２５（ｍ， ２Ｈ）， ２．０９−２．０４（ｍ， ２Ｈ）， １．８８−１．７９（ｍ， ２Ｈ）， １．５４（ｍ， １Ｈ）， ０．９４−０．７７（ｍ， １５Ｈ） ０．６３（ｍ， ４Ｈ） ｐｐｍ。

１９Ｆ−ＮＭＲ： ２８２ＭＨｚ，（ｄｍｓｏ−ｄ６） δ： −１０９．１ ｐｐｍ ［−７４．８ ｐｐｍ ＴＦＡ］。
中間体化合物６１４を次のとおりに調製した。
ａ．化合物４−メチレン−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−ベンジルエステル２−メチルエステル６０２の調製
４−メチレン−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル６０１（１０．０ｇ、４４ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（７５ｍＬ）に室温で溶かし、ＨＣｌ（ジオキサン中４Ｍ、７５ｍＬ）を加えた。室温での撹拌を４時間続けた。全ての揮発性物質を真空で除去し、ベージュ色の固体を得た。粗製物質を塩化メチレン（１００ｍＬ）に懸濁させ、Ｎ−メチルモルホリン（１３．３ｇ、１３２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を０℃に冷却し、撹拌しながら、クロロギ酸ベンジル（８．２６ｇ、４８．４ｍｍｏｌ）を加えた。３０分後に、反応物を室温に加温し、溶液を水および水性ＨＣｌ（１Ｍ）で洗浄した。溶液を硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過し、溶媒を蒸発させて、粗製の生成物を得、これをシリカゲルクロマトグラフィー（溶離剤：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して、化合物６０２（１０．２ｇ）を得た。ＬＣＭＳ−ＥＳＩ＋：Ｃ１５Ｈ１７ＮＯ４での算出値：２７５．３（Ｍ＋）；実測値：２７６．４（Ｍ＋Ｈ＋）。
ｂ．化合物６０３および６０４の混合物の調製
オーブン乾燥させた三つ口丸底フラスコに、窒素注入口アダプターおよび２５０ｍＬ添加漏斗を備え付けた。３番目の口は、隔膜で密閉した。フラスコに撹拌棒、ジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｒｍｅｔｈａｎｅ）（１２０ｍＬ）およびジエチル亜鉛（ヘキサン中１．０Ｍ、１１８ｍＬ、１１８ｍｍｏｌ）を入れ、次いで、氷浴中で０℃に冷却した。添加漏斗にジクロロメタン（４０ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸（９．１ｍＬ、１１８ｍｍｏｌ）を入れた。ジエチル亜鉛溶液を０℃に冷却した後に（約２５分）、トリフルオロ酢酸溶液を２０分かけて撹拌されている反応混合物に滴加した。０℃でさらに２０分間撹拌した後に、ジヨードメタン（９．５ｍＬ、１１８ｍｍｏｌ）を４分間かけて徐々に加えた。さらに２０分後に、４−メチレン−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−ベンジルエステル２−メチルエステル６０２（８．１０ｇ、２９．４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン３０ｍＬ中でカニューレによって加えた。次いで、４−メチレン−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−ベンジルエステル２−メチルエステルを含有したフラスコをさらなるジクロロメタン１０ｍＬですすぎ、この溶液をまた、カニューレによって反応混合物に移した。反応混合物を室温に加温し、１１０時間（約５日間）撹拌し、その後、反応物を、飽和水性塩化アンモニウム（約１５０ｍＬ）でクエンチした。フラスコの内容物を、飽和水性重炭酸ナトリウム（８００ｍＬ）を含有する２Ｌ分離漏斗に徐々に注いだ。水性相を酢酸エチル３００ｍＬで３回抽出した。合わせた有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮して、化合物６０３および６０４の混合物を得た。
ｃ．化合物６０３の調製
サブパートｂからの粗製物質を３：１：１のＴＨＦ／水／アセトン（１６５ｍＬ）に溶かし、次いで、Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド（３．４５ｇ、２９．４ｍｍｏｌ）および四酸化オスミウム（水中４重量％、５ｍＬ、０．８１８ｍｍｏｌ）で処理した。室温で７時間撹拌した後に、反応物を１Ｍのチオ硫酸ナトリウム水溶液（約１００ｍＬ）でクエンチした。次いで、フラスコの内容物を、水（約３００ｍＬ）を含有する１Ｌ分離漏斗に注いだ。水性相をジクロロメタン３００ｍＬで３回抽出した。合わせた有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。粗製の残渣をシリカカラムクロマトグラフィー（５％から４５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して、５−アザ−スピロ［２．４］ヘプタン−５，６−ジカルボン酸５−ベンジルエステル６−メチルエステル６０３を透明なオイル（５．５４ｇ、１９．１５ｍｍｏｌ、６５％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３） δ ７．３６−７．２９（ｍ， ５Ｈ）， ５．２１−５．０４（ｍ， ２Ｈ），
４．５６−４．４７（ｍ， １Ｈ）， ３．７５（ｓ， １．５Ｈ）， ３．６０（ｍ， １．５Ｈ）， ０３．５１−３．３７（ｍ， ２Ｈ）， ２．３２−２．２５（ｍ，
１Ｈ）， １．８７−１．８０（ｍ， １Ｈ）， ０．６４−０．５１（ｍ， ４Ｈ）。
ｄ．５−アザ−スピロ［２．４］ヘプタン−５，６−ジカルボン酸５−ベンジルエステル６０６の調製
５−アザ−スピロ［２．４］ヘプタン−５，６−ジカルボン酸５−ベンジルエステル６−メチルエステル６０３（２４４ｍｇ、０．８４０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２．０ｍＬ）／ＭｅＯＨ（１．５ｍＬ）に溶かした。ＬｉＯＨ（３５．５ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）の水溶液を加え、室温での撹拌を続けた。３時間後に、反応物を水性ＨＣｌ（１Ｍ）で中和し、有機溶媒を真空で除去した。粗製の混合物を水およびＥｔＯＡｃで希釈し、有機層を収集した。全ての揮発性物質を真空で除去し、粗製の酸６０６をさらに精製することなく使用した。ＬＣＭＳ−ＥＳＩ＋：Ｃ１５Ｈ１７ＮＯ４での算出値：２７５．３（Ｍ＋）；実測値：２７６．３（Ｍ＋Ｈ＋）。
ｅ．２，７−ジブロモ−９，９−ジフルオロ−９Ｈ−フルオレン６０８の調製
２，７−ジブロモ−フルオレン−９−オン６０７（４．０ｇ、１１．８ｍｍｏｌ）をデオキソフルオル（ｄｅｏｘｏｆｌｕｏｒ）（１２ｍＬ）に室温で懸濁させ、ＥｔＯＨ（４滴）を添加した。撹拌された懸濁物をＴ＝９０℃で２４時間加熱した（注意：急速で激しい発熱が生じ得るので、上記のとおりの高温でのデオキソフルオルの使用には注意すること）。反応物を室温に冷却し、重炭酸ナトリウムを含有する氷に注いだ。固体が形成し、それを濾過によって収集した。粗製物質をＥｔＯＡｃに入れ、水性ＨＣｌ（１Ｍ）およびブラインで洗浄した。溶液を硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過し、溶媒を蒸発させて、粗製の生成物を得、これをシリカゲルクロマトグラフィー（溶離剤：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して、６０８（３．２ｇ）を得た。１９Ｆ−ＮＭＲ：２８２ＭＨｚ、（ｄｍｓｏ−ｄ６）δ：−１１１．６ｐｐｍ。次のステップでその物質を使用する前に、これをＥｔＯＡｃ中の溶液として炭にさらした。
ｆ．５−アザ−スピロ［２．４］ヘプタン−５，６−ジカルボン酸５−ベンジルエステル６−［２−（７−ブロモ−９，９−ジフルオロ−９Ｈ−フルオレン−２−イル）−２−オキソ−エチル］エステル６０９の調製
２，７−ジブロモ−９，９−ジフルオロ−９Ｈ−フルオレン６０８（３７２ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（３０．０ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）、ＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２（１８．２ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）、Ａｓ（ＰＰｈ３）３（５．０ｍｇ）をジオキサン（１０ｍＬ）にアルゴン雰囲気下で溶かした。エトキシビニル−トリブチルスズ（３７６．４ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１４０分間８５℃（油浴）で加熱した。反応物を室温に冷却した。Ｎ−ブロモスクシンイミド（１７７ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を、続いて水（２ｍＬ）を加えた。反応物を室温で３時間撹拌し、その後、ジオキサンの大部分を真空で除去した。粗製の反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、水で洗浄した。全ての揮発性物質を真空で除去した。トルエンを加え、全ての揮発性物質を真空で、２回目で除去した。粗製物質をＤＭＦ／ＭｅＣＮ（２ｍＬ、１：１）に室温で溶かした。Ｎ−Ｃｂｚ−４−シクロプロピル（Ｌ）プロリン６０６（０．８４ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（２６８ｍｇ、２．０８ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（２ｍＬ）中の溶液を加え、室温での撹拌を続けた。１４時間後に、大部分のＭｅＣＮを真空で除去し、粗製の反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈した。混合物を水性ＨＣｌ（１Ｍ）、ＬｉＣｌ水溶液（５％）、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過し、溶媒を蒸発させて、粗製の反応生成物を得、これをシリカゲルクロマトグラフィー（溶離剤：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）を介して精製して、化合物６０９（１７６ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ−ＥＳＩ＋：Ｃ３０Ｈ２４ＢｒＦ２ＮＯ５での算出値：５９６．４（Ｍ＋）；実測値：５９５．２／５９７．２（Ｍ＋Ｈ＋）。
ｇ．６−［５−（７−ブロモ−９，９−ジフルオロ−９Ｈ−フルオレン−２−イル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−５−アザ−スピロ［２．４］ヘプタン−５−カルボン酸ベンジルエステル６１０の調製
５−アザ−スピロ［２．４］ヘプタン−５，６−ジカルボン酸５−ベンジルエステル６−［２−（７−ブロモ−９，９−ジフルオロ−９Ｈ−フルオレン−２−イル）−２−オキソ−エチル］エステル６０９（１７２ｍｇ、０．２９３ｍｍｏｌ）をｍ−キシレン（６．０ｍＬ）に溶かした。酢酸アンモニウム（２２６ｍｇ、２．９３ｍｍｏｌ）を加え、反応物を１４０℃で６０分間、マイクロ波条件下で撹拌した。反応物を室温に冷却し、全ての揮発性物質を真空で除去した。粗製物質をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離剤：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）を介して精製して、化合物６１０（８０．３ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ−ＥＳＩ＋：Ｃ３０Ｈ２４ＢｒＦ２Ｎ３Ｏ２での算出値：５７６．４（Ｍ＋）；実測値：５７５．２／５７７．２（Ｍ＋Ｈ＋）。
ｈ．（１−｛６−［５−（７−ブロモ−９，９−ジフルオロ−９Ｈ−フルオレン−２−イル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−５−アザ−スピロ［２．４］ヘプタン−５−カルボニル｝−２−メチル−プロピル）−カルバミン酸メチルエステル６１２の調製
６−［５−（７−ブロモ−９，９−ジフルオロ−９Ｈ−フルオレン−２−イル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−５−アザ−スピロ［２．４］ヘプタン−５−カルボン酸ベンジルエステル６１０（８００ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１５ｍＬ）に溶かし、ＡｃＯＨ中のＨＢｒ（３７％、２ｍＬ）を加え、室温での撹拌を続けた。１８０分後に、懸濁物をヘキサンで希釈し、固体を濾過を介して収集し、ヘキサンで洗浄し、真空に供した。粗製物質をさらに精製することなく次のステップで使用した。粗製物質をＤＭＦ（４．０ｍＬ）に溶かし、ＤＩＥＡ（３５６ｍｇ、２．７６ｍｍｏｌ）を加えた。２−（Ｌ）−メトキシカルボニルアミノ−３−メチル−酪酸６１１（２４２ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（５２４ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１７８ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）中の溶液を加えた。反応物を室温で撹拌した。５０分後に、反応物をＥｔＯＡｃで希釈し、重炭酸塩水溶液、ＬｉＣｌ水溶液（５％）、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過し、溶媒を真空で除去して、粗製物質を得、これをシリカゲルクロマトグラフィー（溶離剤：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して、僅かに不純な化合物６１２（８７８ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ−ＥＳＩ＋：Ｃ２９Ｈ２９ＢｒＦ２Ｎ４Ｏ３での算出値：５９９．５（Ｍ＋）；実測値：５９８．５／６００．５（Ｍ＋Ｈ＋）。
ｉ．３−［６−（９，９−ジフルオロ−７−｛２−［５−（２−メトキシカルボニルアミノ−３−メチル−ブチリル）−５−アザ−スピロ［２．４］ヘプタ−６−イル］−３Ｈ−イミダゾール−４−イル｝−９Ｈ−フルオレン−２−イル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル］−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル６１４の調製
（１−｛６−［５−（７−ブロモ−９，９−ジフルオロ−９Ｈ−フルオレン−２−イル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−５−アザ−スピロ［２．４］ヘプタン−５−カルボニル｝−２−メチル−プロピル）−カルバミン酸メチルエステル６１２（８４０ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）、３−［６−（４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］ジオキサボロラン−２−イル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル］−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル６１３（６１５ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（１６１ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（５７９ｍｇ、４．２ｍｍｏｌ）をＤＭＥ（１５ｍＬ）／水（３ｍＬ）にアルゴン雰囲気下で溶かした。混合物を８５〜９０℃（油浴）で１２０分間加熱した。１２０分後に、追加のボロン酸エステル（６１ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を加え、加熱を続けた。３時間後に、反応物を室温に冷却した。大部分のＤＭＥを真空で除去し、粗製の反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈した。混合物をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過し、溶媒を蒸発させて、粗製の反応生成物を得、これをシリカゲルクロマトグラフィー（溶離剤：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）を介して精製して、化合物６１４（８７８ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ−ＥＳＩ＋：Ｃ４７Ｈ５１Ｆ２Ｎ７Ｏ５での算出値：８３１．９（Ｍ＋）；実測値：８３２．７（Ｍ＋Ｈ＋）。
中間体化合物６１３は、次のとおりに調製することができる
ｊ．３−（２−アミノ−４−ブロモ−フェニルカルバモイル）−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル６１７の調製
２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２，３−ジカルボン酸２−ｔｅｒｔ−ブチルエステル６１６（０．３２７ｇ、１．３６ｍｍｏｌ、１当量）、４−ブロモ−ベンゼン−１，２−ジアミン６１５（０．５０７ｇ、２．７１ｍｍｏｌ、２当量）および４−メチルモルホリン（０．２９９ｍＬ、２当量）のＤＭＦ１０ｍＬ中の溶液に、ＨＡＴＵ（０．５４３ｇ、１．０５当量）を加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌し、次いで濃縮した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、希ＮａＨＣＯ３水溶液およびブラインで洗浄した。有機層を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、２０から８０％酢酸エチル／ヘキサン）によって精製して、位置異性体３−（２−アミノ−４−ブロモ−フェニルカルバモイル）−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル６１７の混合物を得た。
ｋ．３−（６−ブロモ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル６１８の調製
位置異性体３−（２−アミノ−４−ブロモ−フェニルカルバモイル）−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル６１７の上記混合物をエタノールに溶かし、密閉管中で１３０℃に一晩加熱し、加熱を１７０℃で３日間継続した。ＬＣ−ＭＳによって、所望の生成物およびＢｏｃ切断された生成物（約１：１の比）が示された。混合物を濃縮し、ＨＣＬに溶かした。二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（ｄｉ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ ｄｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）（０．６当量）を加え、反応物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、２０から８０％酢酸エチル／ヘキサン）によって精製して、３−（６−ブロモ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル６１８（０．３８３ｇ、７２％）をオレンジ色の泡として得た。
ｌ．化合物６１３の調製
３−（６−ブロモ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル６１８（２６４ｍｇ、０．６７３ｍｍｏｌ）、ベンゼン−１，４−ジボロン酸ジピノカル（ｄｉｐｉｎｏｃａｌ）エステル（５当量、３．３６ｇ、６．９５ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（５％、３９ｍｇ）および２Ｍの炭酸カリウム水溶液（３当量、１．０１ｍＬ）のＤＭＥ５ｍＬ中の混合物を９０℃にＡｒ下で４時間加熱した。反応混合物を冷却し、酢酸エチル中で希釈し、飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、２０から６０％酢酸エチル／ヘキサン）によって精製して、３−｛６−［４−（４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］ジオキサボロラン−２−イル）−フェニル］−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル｝−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル６１３（２９５ｍｇ、収率８５％）を得た。ＬＣＭＳ−ＥＳＩ−：Ｃ３０Ｈ３８ＢＮ３Ｏ４での算出値：５１５．４５；実測値：５１６．１（Ｍ＋Ｈ＋）。
化合物７は、米国特許第７，４２９，５７２号に記載されているものなどの合成方法および中間体を使用して調製することができる。化合物７はまた、次の実施例に記載されているとおりに調製することもできる。
（実施例７）
化合物７の調製
化合物７０１（９７０ｇ、３．７４ｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（５０ｇ、０．４１２ｍｏｌ）のＴＨＦ（１０Ｌ）中の氷冷懸濁物に、ＴＥＡ（２．３ｋｇ、１６．５ｍｏｌ）および水（７Ｌ）を加えると、透明な溶液が生じる。温度を約０℃で維持しながら、塩化イソブチリル（３当量）を撹拌されている混合物に徐々に加える。ＨＰＬＣによって、反応が実質的に完了まで進行したことが示されるまで、追加の１．２当量、次いで０．７当量の塩化イソブチル（全部で約１．９５ｋｇ）を加える。濃ＨＣｌを用いて、反応混合物を約６．４のｐＨに酸性化し、有機相をＥｔＯＡｃ（２×１０Ｌ）で洗浄する。合わせた抽出物を水（１×１５Ｌ）で洗浄する。有機相を濾過し、真空濃縮する。残渣をＩＰＡ（約２０ｋｇ）に溶かし、ヘプタン（１４．２ｋｇ）を加える。溶液を約７４〜７５℃に加熱して、透明な溶液を生じさせ、次いで、約５Ｌを蒸留によって除去する。生じた溶液を室温に徐々に冷却する。沈澱物が約４２〜４３℃で形成する。冷却を徐々に５℃まで継続し、次いで一晩撹拌する。生じた固体を濾過し、濾液をＩＰＡ／ヘプタン（１：８）混合物（１３．４ｋｇ）で洗浄し、真空下で約６０〜７０℃で乾燥させて、化合物７ １．２９５ｋｇ（８６．６５％）を得るが、これは、ＨＰＬＣによると純度９９．４５％である。
中間体化合物７０６は、次のとおりに調製することができる。
ａ．化合物７０１の調製
シチジン（１００ｇ、０．４１１ｍｏｌ）のＤＭＦ（２．０６Ｌ）中の懸濁物に、無水安息香酸（１０２．４ｇ、０．４５２ｍｏｌ）を加える。混合物を室温で２０時間撹拌した。ＤＭＦを真空で除去し、残渣をジエチルエーテルで摩砕した。生じた固体を吸引濾過によって収集し、ジエチルエーテル（２×２００ｍＬ）で洗浄した。真空で、室温でさらに乾燥させて、Ｎ４ベンズアミド（１４０．６ｇ、９８．３％）を得た。この物質の一部（１３９．３ｇ、０．４０１ｍｏｌ）を無水ピリジン（１．２Ｌ）に溶かし、１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピル−ジシロキサン（１４１．４ｍＬ、０．４４１ｍｏｌ）で室温で処理した。溶液を室温で一晩撹拌した。混合物をほぼ乾燥するまで真空で濃縮し、トルエン（３×２００ｍＬ）と共蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ（１．８Ｌ）で処理し、ＨＣｌ（２×２００ｍＬ、０．０５Ｎ）、ＮａＨＣＯ３（５％、２×４００ｍＬ）で洗浄した。有機層を洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、乾燥するまで蒸発させた。化合物７０１（２５６．５ｇ、１００％超）を白色の泡として単離し、さらに精製することなく使用した。
ｂ．化合物７０２の調製
化合物７０１（２３６．５ｇ、０．４０ｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（１．２２Ｌ）に溶かした。無水ＤＭＳＯ（１８０．８ｍＬ、２．１ｍｏｌ）を加え、生じた溶液を−２０℃から−１５℃に冷却した。トリフルオロ酢酸無水物（９０．６ｍＬ、０．６４ｍｏｌ）を４５分かけて滴加し、溶液を−２０℃から−１５℃の間で２時間撹拌し、その後、無水トリエチルアミン（２２３．５ｍＬ、１．６ｍｏｌ）を２０分かけて加えた。ケトン７０２を含有する粗製の反応物をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）に溶かし、生じた溶液をＨ２Ｏ（３×４００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒を真空で除去して、黄色の固体を得、これを、ヘキサン中のＥｔ２Ｏ（０〜６０％）の段階的勾配、続くヘキサン中のＥｔＯＡｃ（５０〜１００％）の段階的勾配で溶離するシリカゲルカラムで精製した。そうして得られた粗製のケトン（約１９２ｇ）を石油エーテルから結晶化させ、白色の固体としてのケトン７０２（１３８．９１ｇ、シチジンから５７．５％）および黄色の固体としての未反応の出発物質７０１ ２２ｇを得た。
ｃ．化合物７０３の調製
化合物７０２（４８．５７ｇ、８．２６ｍｍｏｌ）を無水トルエン（約４００ｍＬ）に溶かし、水分を排除しながら溶媒を真空で除去した。次いで、残渣をもう２時間、さらに真空乾燥させた（オイルポンプ）。水分を厳密に排除しながら、残留した泡を無水ジエチルエーテル（１．０３Ｌ）にアルゴン下で溶かした。生じた溶液を−７８℃にアルゴン下で冷却し、ＭｅＬｉ（１．６Ｍ、２５８．０ｍＬ、０．４１３ｍｏｌ）を添加漏斗を介して滴加した。添加が完了した後に、混合物を−７８℃で２時間撹拌した。１Ｍの水性ＮＨ４Ｃｌ（５００ｍＬ）を徐々に加えた。室温に加温した後に、混合物をＨ２Ｏ（２×５００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、次いで、乾燥するまで濃縮して、茶色の泡（約６０ｇ、１００％超）を得た。
化合物７０２ ３７．６２ｇおよび５６．４ｇを使用して、反応をさらに２回行った。合わせた粗製の生成物（１２８．０ｇ、０．２１２ｍｏｌ）をＴＨＦ（１．２８Ｌ）に溶かし、濃ＨＯＡｃ（２３ｍＬ、０．４０２ｍｏｌ）で処理した。溶液に、ＴＢＡＦ（３８４．０ｍＬ、ＴＨＦ中１Ｍ）を加えた。溶液を室温で０．７５時間撹拌し、混合物をシリカゲル（７５０ｇ）で処理し、乾燥するまで濃縮した。粉末をＣＨ２Ｃｌ２中に充填されているシリカゲルカラムに入れた。１：７のＥｔＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２で溶離して、暗色のろう状固体を得、それをシリカゲル（３００ｇ）上に予め吸着させ、以前のとおりにクロマトグラフィーを行なった。化合物７０３（４６．４ｇ、７０２から５３．０％）をオフホワイト色の固体として単離した。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ １．２０（ｓ， ３Ｈ， ＣＨ３）， ３．６２−３．６９（ｍ， ２Ｈ，）， ３．７３−３．７８（ｍ， ２Ｈ，）， ５．１９（ｔ， １Ｈ， Ｊ＝５．４Ｈｚ， ＯＨ−５’）， ５．２５（ｓ， １Ｈ， ＯＨ−２’）， ５．５２（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝５．０Ｈｚ，
ＯＨ−３’）， ５．９９（ｓ， １Ｈ， Ｈ−１’）， ７．３２（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝５．８Ｈｚ）， ７．５０（Ψｔ， ２Ｈ， Ｊ＝７．７Ｈｚ）， ７．６２（Ψ，
１Ｈ， Ｊ＝７．３Ｈｚ）， ８．００（ｄ， ２Ｈ， Ｊ＝７．３Ｈｚ）， ８．１４（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝６．９Ｈｚ）， １１．２２（ｓ， １Ｈ， ＮＨ）。分析：Ｃ１７Ｈ１９Ｎ３Ｏ６・０．５Ｈ２Ｏでの計算値：Ｃ、５５．１３；Ｈ、５．４４；Ｎ、１１．３５。実測値：Ｃ、５５．２１；Ｈ、５．４７；Ｎ、１１．３３。
ｄ．化合物７０４の調製
化合物７０３（４６．０ｇ、０．１３ｍｏｌ）を無水ピリジンに溶かし、真空で乾燥するまで濃縮した。生じたシロップを無水ピリジンにアルゴン下で溶かし、撹拌しながら０℃に冷却した。茶色の溶液を塩化ベンゾイル（３０ｍＬ、０．２５０ｍｏｌ）で１０分かけて滴下処理した。氷浴を外し、撹拌を１．５時間継続したところ、ＴＬＣによって残存する出発物質は示されなかった。混合物を、水（５ｍＬ）を加えることによってクエンチし、乾燥するまで濃縮した。残渣を最小量のＣＨ２Ｃｌ２に溶かし、飽和ＮａＨＣＯ３（１×５００ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１×５００ｍＬ）で洗浄した。有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、乾燥するまで濃縮して、ＥｔＯＡｃ−ヘキサン（２５〜６０％）の段階的勾配で溶離するシリカゲルのクロマトグラフィーを行い、化合物７０４を黄色の泡（４８．５ｇ、６７％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ １．６４（ｓ， ３Ｈ， ＣＨ３）， ４．５０（ｍ， １Ｈ， Ｈ−４）， ４．７８−４．８５（ｍ， ２Ｈ， Ｈ−５’，５ａ’）， ５．５０（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝３．４Ｈｚ， Ｈ−３’）， ６．４２（ｓ， １Ｈ， Ｈ−１’）， ７．４４−７．５４（ｍ， ７Ｈ， Ａｒ）， ７．５７−７．６６（ｍ， ３Ｈ， Ａｒ）， ７．９４（ｄ， ２Ｈ，
Ｊ＝７．８Ｈｚ）， ８．０５−８．０９（ｍ， ４Ｈ， Ａｒ）， ８．２１（ｄ，
１Ｈ， Ｊ＝７．３Ｈｚ）。分析：Ｃ３１Ｈ２７ＮＯ８での計算値：Ｃ、６５．３７；Ｈ、４．７８；Ｎ、７．３８。実測値：Ｃ、６５．５９；Ｈ、４．７９；Ｎ、７．１６。
ｅ．化合物７０５の調製
化合物７０４（７．５０ｇ、０．０１３ｍｏｌ）を無水トルエン（１５０ｍＬ）にアルゴン下で溶かし、−２０℃に冷却した。ＤＡＳＴ（２．５ｍＬ、１８．９ｍｍｏｌ）を徐々に加え、添加が完了した後に、冷却浴を外した。撹拌を１時間継続し、混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）に注ぎ、ガスの発生が止まるまで洗浄した。有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮し、１：１のＥｔＯＡｃ−ヘキサンで溶離するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。収量は白色の固体としての純粋な７０５ １．２２ｇ（１６．３％）であった。融点２４１℃（ＣＨ２Ｃｌ２−ヘキサン）；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３））： δ １．４９（ｄ， ３Ｈ， Ｊ＝２２．４Ｈｚ， ＣＨ３）， ４．６４（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ＝３．４４， １２．９Ｈｚ， Ｈ−５’）， ４．７３（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝９．５Ｈｚ， Ｈ−４’）， ４．９０（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４，
１２．７Ｈｚ， Ｈ−５ａ’）， ５．５６（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ＝８．６， ２０．７Ｈｚ， Ｈ−３’）， ６．５２（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１８．０Ｈｚ， Ｈ−１’），
７．４７−７．５７（ｍ， ７Ｈ， Ａｒ）， ７．６２−７．７１（ｍ， ３Ｈ， Ａｒ）， ７．８９（ｄ， ２Ｈ， Ｊ＝６．９Ｈｚ）， ８．０７−８．１１（ｍ， ５Ｈ， Ａｒ）， ８．６７（ｂｓ， １Ｈ， ＮＨ）。 １９Ｆ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３））： δ ３．３（ｍ）。分析：Ｃ３１Ｈ２６ＦＮ３Ｏ７・０．７Ｈ２Ｏでの計算値：Ｃ、６３．７４；Ｈ、４．７２；Ｎ、７．２０。実測値：Ｃ、６３．７１；Ｈ、４．５４；Ｎ、７．２０。
ｆ．化合物７０６の調製
化合物７０５（６．３０ｇ、０．０１１ｍｏｌ）をアンモニアのメタノール溶液（約７Ｎ、１５０ｍＬ）中に懸濁させ、室温で一晩撹拌した。溶媒を真空で除去し、メタノール（１×２０ｍＬ）と共蒸発させ、シリカゲルに予め吸着させた。白色の粉末をシリカゲルカラムに入れ（ＣＨＣｌ３中に充填）、カラムをＣＨＣｌ３中９％のＥｔＯＨ）、次いでＣＨＣｌ３中１７％のＥｔＯＨ、最後にＣＨＣｌ３中２５％のＥｔＯＨ）で溶離した。生成物を含有する画分を濃縮し、０．４μｍディスクで濾過し、水から凍結乾燥させて、化合物７０６、２．１８ｇ（７６％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６；）： δ １．１７（ｄ， ３Ｈ， Ｊ＝２２．３Ｈｚ， ＣＨ３）， ３．６３（ｄｄ， １Ｈ，
Ｊ＝２．７， １３．７Ｈｚ， Ｈ−５’）， ３．７０−３．８４（ｍ， ３Ｈ， Ｈ−３’， Ｈ−４’， Ｈ−５ａ’）， ５．２４（ａｐｐ ｓ， １Ｈ， ＯＨ−３’）， ５．６０（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝５．４Ｈｚ， Ｈ−５’）， ５．７４（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝７．７１Ｈｚ， Ｈ−５）， ６．０７（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１８．９Ｈｚ， Ｈ−１’）， ７．３１（ｓ， １Ｈ， ＮＨ２）， ７．４２（ｓ， １Ｈ， ＮＨ２）， ７．９０（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝７．３Ｈｚ， Ｈ−６）。 １９Ｆ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６；）： δ ２．６０（ｍ）。分析：Ｃ１０Ｈ１４ＦＮ３Ｏ４・１．４Ｈ２Ｏでの計算値：Ｃ、４４．２２；Ｈ、５．９５；Ｎ、１４．７７。実測値：Ｃ、４２．２４；Ｈ、５．６３；Ｎ、１４．５４。水（２ｍＬ）中に溶かし、１ＭのＨＣｌを用いてｐＨを約３．０に調節することによって、化合物７０６（０．１０ｇ、０．３８６ｍｍｏｌ）を塩酸塩に変換した。水を真空で除去し、残渣を水性ＥｔＯＨから結晶化させて、化合物７０６を塩酸塩（７１．０ｍｇ）として得た。融点２４３℃（分解）；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６；）： δ １．２９（ｄ， ３Ｈ， Ｊ＝２２．６Ｈｚ， ＣＨ３）， ３．６５（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．３， １２．７Ｈｚ， Ｈ−５’）， ３．７６−３．９０（ｍ， ３Ｈ， Ｈ−３’， Ｈ−４’， Ｈ−５ａ’）， ５．９６（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１７．３Ｈｚ， Ｈ−１’）， ６．１５（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝７．９Ｈｚ， Ｈ−５）， ８．３３（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝７．９Ｈｚ， Ｈ−６）， ８．６９（ｓ， １．５Ｈ， ＮＨ）， ９．７８（ｓ， １．５Ｈ， ＮＨ）。 １９Ｆ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６；）： δ １．６９（ｍ）。分析：Ｃ１０Ｈ１４ＦＮ３Ｏ４・ＨＣｌでの計算値：Ｃ、４０．６２；Ｈ、５．１１；Ｎ、１４．２１。実測値：Ｃ、４０．８０；Ｈ、５．０９；Ｎ、１４．２３。
化合物８は、米国特許出願第１２／６３２，１９４号に記載されているものなどの合成方法および中間体を使用して調製することができる。化合物８はまた、次の実施例に記載されているとおりに調製することもできる。
（実施例８）
４−アミノ−２−ｎ−ブトキシ−８−［３’−（ピロリジン−１”−イルメチル）−ベンジル］−５，６，７，８−テトラヒドロプテリジン−６−オン８の調製。（Ｒ＝ｎ−ブチル）
ニトロ化合物８０７（７３０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中の溶液に、ラネーニッケル（約２００μＬ、Ｈ２Ｏ中のスラリー）を加えた。反応容器をＨ２でフラッシュし、次いで、Ｈ２雰囲気下で１．５時間撹拌した。混合物をセライトで、ＣＨ２Ｃｌ２およびＭｅＯＨ（１：１）を用いて濾過した。濾液を真空下で濃縮し、凍結乾燥機上に一晩放置した。化合物８の遊離塩基を白色の固体として得た。８のＨＣｌ塩を得るために、上記の濾液の試料を、１．０ＭのＨＣｌでｐＨ＝１〜２までスパイクし、凍結乾燥させた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ， ３００ＭＨｚ）： δ ７．６５（ｓ， １Ｈ）， ７．５０（ｍ， ３Ｈ）， ４．９６（ｓ， ２Ｈ）， ４．４４（ｔ， Ｊ＝７Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．４０（ｓ， ２Ｈ）， ４．１６（ｓ， ２Ｈ）， ３．４８（ｍ， ２Ｈ）， ３．１９（ｍ， ２Ｈ）， ２．０２−２．１７（ｍ， ４Ｈ）， １．７４（ｍ， ２Ｈ）， １．４５（ｍ， ２Ｈ）， ０．９４（ｔ， Ｊ＝７Ｈｚ， ３Ｈ）−［ＨＣＩ塩］。ＬＣＭＳ−ＥＳＩ＋：Ｃ２２Ｈ３１Ｎ６Ｏ２での算出値：４１１．５（Ｍ＋Ｈ＋）；実測値：４１１．３（Ｍ＋Ｈ＋）。
中間体化合物８０７を次のとおりに調製した。
ａ．化合物８０２の調製
化合物８０１（２．４６ｇ、１０．２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３４ｍＬ）中の溶液に−２０℃で、Ｅｔ３Ｎ（３．１４ｍＬ、２２．５ｍｍｏｌ）を、続いて、ＮＨ３の溶液（ＭｅＯＨ中２．０Ｍ、５．４ｍＬ、１１ｍｍｏｌ）を加えた。０℃まで加温しながら、混合物を１．５時間撹拌した（ＬＣ／ＭＳによって、出発物質の消費が示された）。化合物８０２を含有する反応混合物を後処理せずに次に進めた。
ｂ．化合物８０３の調製
３−（（１−ピロリジニルメチル）フェニル）メタンアミン８０６（１．９５ｇ、１０．２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３４ｍＬ）中の溶液に０℃で、Ｅｔ３Ｎ（３．１４ｍｍｏｌ、２２．５ｍｍｏｌ）を、続いてブロモ酢酸メチル（１．０４ｍＬ、２２．３ｍｍｏｌ）を滴加した。ＬＣ／ＭＳによって、出発物質の消費が示されるまで約２時間、反応混合物を撹拌した。化合物８０３を含有する混合物を後処理せずに次に進めた。
ｃ．化合物８０４の調製
化合物８０３を含有する反応混合物を、化合物８０２を含有する反応混合物に０℃で加えた。ＬＣ／ＭＳによって化合物８０２の消費が示されるまで、約４５分間、反応混合物を撹拌した。ＮＨ４Ｃｌの飽和溶液（５０ｍＬ）を加えた。層を分離し、水性層をＥｔＯＡｃ（２×３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、化合物８０４ ２．１１ｇを得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ， ３００ＭＨｚ）： δ（ｐｐｍ） ７．３２−７．１６（ｍ， ４Ｈ）， ４．６９（ｓ， ２Ｈ）， ４．１９（ｑ， Ｊ＝７Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．０７（ｓ， ２Ｈ）， ３．６０（ｓ， ２Ｈ）， ２．４９（ｍ，
４Ｈ）， ２．４０（ｓ， ３Ｈ）， １．７８（ｍ， ４Ｈ）， １．２３（ｔ， ３Ｈ， Ｊ＝７Ｈｚ）。ＬＣＭＳ−ＥＳＩ＋：Ｃ２１Ｈ２９Ｎ６Ｏ４Ｓでの算出値：４６１．２（Ｍ＋Ｈ＋）；実測値：４６１．０（Ｍ＋Ｈ＋）。
ｄ．エチル−Ｎα−［４−アミノ−２−メタンスルホニル−５−ニトロピリミジン−６−イル］，Ｎα−［３’−（ピロリジン−１”−イルメチル）−ベンジル］−グリシネート８０５の調製
硫化物８０４（３．６８ｇ、８．００ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（４０ｍＬ）中の溶液懸濁物（ａ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）に０℃で、タングステン酸ナトリウム二水和物（７９２ｍｇ、２．４０ｍｍｏｌ）、酢酸（４．６ｍＬ、８０ｍｍｏｌ）および過酸化水素（３．４ｍＬ、約４０ｍｍｏｌ、Ｈ２Ｏ中３５％ｗ／ｗ）を順次加えた。３時間後に、追加の酢酸（４．６ｍＬ）および過酸化水素（３．４ｍＬ）を加えた。反応物を０℃で１６時間維持した。０℃の間に、Ｎａ２ＳＯ３（５０ｍＬ）の飽和溶液を慎重に加え、続いてＣＨ２Ｃｌ２（７５ｍＬ）を加えた。層を分離し、水性層をＣＨ２Ｃｌ２（４×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮して、化合物８０５を含有する物質を得、これをさらに精製することなく使用した。
ｅ．化合物８０７の調製。（Ｒ＝ｎ−ブチル）
スルホン８０５（１．０ｇ、２．０ｍｍｏｌ）のｎ−ブタノール（１０ｍＬ）中の溶液に、ＴＦＡ（４７０μＬ、６．１ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を１００℃で１時間撹拌した。反応混合物をＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）およびＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）の飽和溶液に注いだ。層を分離し、水性層をＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮した。精製をシリカゲルクロマトグラフィー（基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）１ｇ／ＳｉＯ２１０ｇ）（２〜１５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）によって行って、化合物８０７を得た。
（実施例９）
化合物９の調製（ＵＳ２０１０／０２９８２５７から）
（Ｓ）−２−｛［（１Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミジン−１−イル）−４−（Ｒ）−フルオロ−３−ヒドロキシ−４−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル−メトキシ］−フェノキシホスホリルアミノ｝−プロピオン酸イソプロピルエステルの調製（ＵＳ２０１０／０２９８２５７実施例２から）
異名：５’−Ｏ−（イソプロピル−Ｌ−アラネート、フェニルホスホルアミジル）−２’−デオキシ−２’−フルオロ−２’−Ｃ−メチル−ウリジンジアステレオ異性体混合物。
５Ｌの３つ口フラスコに、機械攪拌機、ブライン氷浴、内部温度計を取り付け、かつ窒素雰囲気にした。フラスコに、Ｌ−アラニンイソプロピルエステルヒドロクロリド（８２．０ｇ、０．４９０モル）および無水ジクロロメタン（０．８０Ｌ）を入れた。これを撹拌している間に、ジクロロリン酸フェニル（８５．０ｇ、０．４０モル）を１ロットで加え、撹拌した。−５から５℃の間の内部温度を維持しながら、Ｎ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ、２５０ｇ、３．０７モル）のジクロロメタン（２５０ｍＬ）中の溶液を、半時間にわたって加えた。溶液を１時間この温度範囲で撹拌した。２’−デオキシ−２’−フルオロ−２’−Ｃ−メチル−ウリジン（３，８０．０ｇ、０．３０７モル）を０℃で一度に加え、次いで、反応フラスコをブライン浴中で徐々に加温した。１時間で、内部温度は−２℃に上がった。ＴＬＣ（ＨＣＬ中５％メタノール）は１時間で、５０％を超えるヌクレオシドが消費されたことを示した。浴を外し、反応フラスコは、もう１時間かけて周囲温度に達した。ＴＬＣは３時間後および合計５時間で９５％の出発ヌクレオシドが消費されたことを示した。反応混合物を、メタノール（１００ｍＬ）を加えること、および反応物を５分間撹拌することによってクエンチした。
反応混合物を１ＮのＨＣｌ（２×５００ｍＬ）、続いて飽和重炭酸ナトリウム溶液（２×５００ｍＬ）で洗浄した。分離した有機層を無水硫酸ナトリウム（５０ｇ）で乾燥させ、濾過した。溶液を減圧下および次いで高真空下で乾燥するまで蒸発させて、粗製の生成物を粘性オイル（１７０ｇ）として得た。粗製の生成物のＮＭＲ（３１Ｐおよび１Ｈ）を得た。３１Ｐ−ＮＭＲは、全リン集積の約１％が３’異性体５の存在によるものであることを示した。
粗製の生成物に、無水ピリジン（１７００ｍＬ）を加えた。溶媒を減圧下でおよび次いで高真空下で蒸発させて、共蒸発を介して粗製の混合物の水含有量を減少させた。生じたオイルを無水ピリジン（５００ｍｌ）に再び溶かし、次いで過剰なｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（９．０ｇ、６０ｍＭ）を加えた。反応物を周囲温度で撹拌した。反応の進行をＵＰＬＣ／ＭＳによって監視した。３時間後、３’不純物５はもはや検出できず、反応物をメタノール（５０ｍＬ）の添加によってクエンチした。
反応物を減圧下でオイルに蒸発させた。残渣を酢酸エチル（１．５Ｌ）に溶かし、１ＮのＨＣｌ（２×５００ｍＬ）、続いて飽和重炭酸ナトリウム溶液（２×５００ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム（５０ｇ）で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させて、粗製の生成物を淡黄色のオイルとして得た。
粗製のオイルを同じ体積のジクロロメタンで希釈し、１００ｐｓｉの空気圧で放射圧縮モジュール内の２．５Ｋｇのシリカゲルカートリッジに負荷した。勾配ポンプを６０ｐｓｉおよび４００ｍｌ／分の流速で使用し、カートリッジを塩化メチレン（４Ｌ）、続いて塩化メチレン（４８Ｌ）中勾配１〜４％のメタノールで洗浄した。主な不純物（ジ−（イソプロピルアラニル）フェニルホスフェート、３’，５’−ビスホスホロアミデート、３’−ホスホロアミデート−５’−ＴＢＤＭＳ付加物（７））の大部分を約３％の勾配で溶離させた。所望の生成物を３から４％の間のメタノールで溶離させた。画分を含有する生成物を２つのロットに分別した。第１のロットは少量の上部の不純物を含有し、後者は純粋な生成物であった。第１セットの画分は、３’，５’−ビスホスホロアミデートおよびジ−アラニルフェニルホスフェートおよび大部分はＲｐジアステレオ異性体など、少量のより小さい極性の不純物（上部の不純物）を含有し、第２のカラム精製を必要とした。（相対用語、上部対下部は、順相シリカゲルクロマトグラフィーでの溶離を指し、ここで、「上部の異性体」は第１の溶離する異性体を意味する。）第２セットの画分は有意な量の不純物を有さず、残りはＲｐおよび大部分はＳｐジアステレオ異性体だけであった。それを後に、２回カラムした画分と組み換えた。溶媒を減圧下で蒸発させ、生じた白色の泡状物（ｆｏａｍ）を１時間さらに乾燥させて（０．２０ｍｍＨｇ）、不純なロット４２ｇ（３１Ｐ−ＮＭＲに基づいて４：１の上部対下部の異性体）および純粋なロット３８ｇ（１：３の上部対下部の異性体）を得た。不純なロットを同様の方法で再カラムして、９７％純粋な上部の異性体３．８ｇ（画分を除外）および純粋な生成物３６ｇを４：１比で得た。２つの主なロットをＨＣＬに溶かし、合わせ、減圧下で蒸発させ、乾燥させて（５０℃、０．２ｍｍＨｇ、２４時間）、純粋な生成物７４ｇ（４５．７％）（化合物９）を４８：５１のジアステレオ異性体比で白色の泡状物、融点約７５〜８５℃として得た。
ジアステレオ異性体混合物の非晶質固体を生成するため、白色の泡状物７４ｇをｔ−ブチルメチルエーテル（７５０ｍＬ）と一緒に撹拌して、部分溶液およびゴム状の固体残渣が得られた。撹拌しながら、ヘプタン（７５０ｍＬ）を徐々に加え、ゴムの大部分が白色の固体に変換するまで懸濁液を１時間機械的に撹拌した。固体をスパチュラで擦り、生じたスラリーを濾過した。固体をヘプタン（４×５０ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させて（５０℃、０．２ｍｍＨｇ、２４時間）、約７０〜８０℃の広い融解範囲を有する白色の非晶質の粉末（６４ｇ）を得た。１Ｈおよび３１Ｐ ＮＭＲは構造で一致し、ＨＰＬＣによって、４６：５４のジアステレオ異性体比で９９．８％の純度が示された（３１Ｐ ＮＭＲによっても確認された）。
化合物９の固体混合物を作製するための代替（ａｌｔｅｍａｔｉｖｅ）方法。クロマトグラフィーの後、残渣をジクロロメタンで２回（５ｍＬ／ｇ）共蒸発させ、２４時間３５〜４０℃にて３５〜４５ｍＴｏｒｒで乾燥させた。泡状物残渣を２５０ミクロンスクリーンに通して篩分けし、ヘッドスペースＧＣによって測定された場合に残渣のジクロロメタンが４００ｐｐｍを下回るまで同じ条件下でさらに乾燥させた。生じた微細なオフホワイト色から白色の非晶質粉末は、５３．７から６３．５℃のガラス転移温度範囲を有する。
化合物９（異性体の混合物）の特徴決定：
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３） ０１０．０５（ｂｒｓ， １Ｈ， ＮＨ， Ｓｐ）， １０．００（ｂｒｓ， １Ｈ， ＮＨ， Ｒｐ）， ７．４９（ｄ， １Ｈ， Ｃ６−Ｈ， Ｓｐ）， ７．３６（ｍ， ５Ｈ， Ｃ６−Ｈ， Ｒｐ， 芳香族）， ７．２３−７．１４（ｍ， ６Ｈ， Ｒｐ／Ｓｐ， 芳香族）， ６．１８（ｂｒ ｄ， ２Ｈ， ＣＩ’−Ｈ， Ｒｐ／Ｓｐ）， ５．６３（ｄ， １Ｈ， Ｃ５−Ｈ， Ｓｐ）， ５．５８（ｄ， １Ｈ， Ｃ５−Ｈ， Ｒｐ）， ５．０１（ｍ， ２Ｈ， ＣＨ−（ＣＨ３）２ Ｒｐ／Ｓｐ）， ４．４６−４．３３（ｍ， ８Ｈ， Ｃ−５’−Ｈ２， ａｌａ−ＮＨ， Ｃ３’−ＯＨ， Ｒｐ／Ｓｐ）， ４．１２（ｍ， ２Ｈ， ａｌａ−ＣＨＣＨ３， Ｒｐ／Ｓｐ）， ４．０１−３．８５（ｍ， ４Ｈ， Ｃ３’−Ｈ， Ｃ４’−Ｈ， Ｒｐ／Ｓｐ）， １．３９１．２２（ｍ， １２Ｈ， すべてのＣＨ３， Ｒｐ／Ｓｐ）。
３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）０３．６０（Ｒｐ）、−１７．８０ｐｐｍでのトリフェニルホスフェートに対して３．２０Ｓｐ。ＥＳ−ＭＳ Ｍ＋１ ５３０．２。分析：算出％（Ｋａｒｌ Ｆｉｓｈｅｒ分析によって見出されるように０．２９％の水を含む）Ｃ、４９．７５；Ｈ、５．５４；Ｎ、７．９０、Ｆ、３．５８、Ｐ、５．８４。実測（ｆｏｕｎｄ）％：Ｃ、４９．５０；Ｈ、５．４４；Ｎ、７．８５；Ｆ、３．６２；Ｐ、６．０５。
２’−デオキシ−２’−フルオロ−２’−Ｃ−メチルウリジンの調製（ＵＳ２０１０／０２９８２５７実施例１から）
１０Ｌのフラスコに、３’，５’−Ｏ−ジベンゾイル（ｄｉｂｅｎｏｚｙｌ）−２’デオキシ−２’−フルオロ−２’−Ｃ−メチル−Ｎ４−ベンゾイルシチジン（５００ｇ、０．８７４ｍｏｌ）および７０％水性酢酸（７．５Ｌ）を加えた。溶液を２０時間加熱還流（１１０℃）した。ＴＬＣによって、反応の完了（ジクロロメタン（ＨＣＬ）中の５％メタノールにおいてＲｆ ０．６）が示された。混合物を周囲温度に冷却し、水（２Ｌ）で希釈した。２時間撹拌した後、生じた沈澱物を濾過によって収集し、固体を水（５Ｌ）ですすぎ、大気にて周囲温度で１２時間乾燥させて、３６０ｇ（８８％）を得た。このジベンゾイルウリジン中間体を、新たに調製されたアンモニアのメタノール溶液（５．４Ｌ、約２５％）に０℃でそれを全て加えることによって、次のステップで直接使用した。この温度を３時間維持し、次いで１５℃に２４時間加温した。ＴＬＣによって、反応の完了（ＨＣＬ中の１０％メタノールにおいてＲｆ ０．４）が示された。反応混合物をＣｅｌｉｔｅベッドに通して濾過し、減圧下で濃縮して、粗製の生成物（２１６ｇ）を得た。粗製の生成物を酢酸エチル（３２５ｍＬ）とともに３時間周囲温度にて撹拌した。生じた固体を濾過によって収集し、酢酸エチル（２１６ｍＬ）で洗浄した。固体を真空下で周囲温度にて４時間乾燥させて、所望の生成物１６０ｇ（７８％）を９８．７％のＨＰＬＣ純度で得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６） ０１１．４４（ｂｒ ｓ， １Ｈ， ＮＨ）， ７．９５（ｄ， １Ｈ， Ｃ−６Ｈ）， ５．９７（ｄ， １Ｈ， Ｃ−１’Ｈ）， ５．６４（ｄ， １Ｈ， Ｃ−５Ｈ）， ３．８４−３．７７（ｍ， ３Ｈ， Ｃ−５’−Ｈａ， Ｃ−３’Ｈ． Ｃ−４’Ｈ）， ３．６３−３．６０（ｍ， １Ｈ， Ｃ５’−Ｈｂ）， １．２３（ｄ， ３Ｈ， Ｃ−２’−ＣＨ３）。ＥＳ−ＭＳ Ｍ−Ｉ ２５９。
（実施例１０）
化合物１０の調製（ＵＳ２０１０／０２９８２５７から）
化合物１０の直接沈澱（ＵＳ２０１０／０２９８２５７；実施例４から）：Ｌ−アラニンイソプロピルエステルヒドロクロリド（１０．５ｇ、６１．５ｍｍｏｌ、毎回トルエン５０ｍＬで２回共沸乾燥させた）のジクロロメタン（１００ｍＬ）中の撹拌溶液に、フェニルジクロロホスフェート（ｐｈｅｎｙｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（７．５ｍＬ、５０ｍｍｏｌ）を室温で加えた。混合物を−１０℃に冷却し、次いでＮ−メチルイミダゾール（３０．５ｍＬ、３８４．３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン３０ｍＬ中の溶液を３０分間にわたって加えた。添加の完了後、混合物を−１０から−１５℃の間で１時間撹拌した。上記の混合物に、２’−デオキシ−２’−フルオロ−２’−Ｃ−メチルウリジン（１０ｇ、３８．４ｍｍｏｌ）（ＵＳ２０１０／０２９８２５７実施例１を参照のこと）を１ロットで加え、混合物を−１０℃未満で３時間撹拌し、次いで２０℃に徐々に（６時間）加温した。混合物をこの温度で一晩（１５時間）撹拌し、次いでメタノール１０ｍＬでクエンチした。溶媒を蒸発させ、残渣をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）に再び溶かした。ＥｔＯＡｃ層を水（１００ｍＬ）、１ＮのＨＣｌ（３×７５ｍＬ）、２％のＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）およびブライン（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣を高真空下で２時間乾燥させて、白色の泡状物（２２ｇ）を得た。
上記泡状物を３３ｍＬのＨＣｌに溶かし、次いでイソプロピルエーテル６５ｍＬを加えて、飽和溶液を得た。該溶液をＣｅｌｉｔｅの小パッドに通して濾過し、濾液を化合物１０のシードと一緒に７２時間周囲温度で（約２２℃。−懸濁液を０℃に冷却することで、粗製の生成物のオイリングアウトをもたらしたことを留意されたい）撹拌した。白色の固体を濾過し、イソプロピルエーテル（２０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させて、白色の粉末４．５８ｇ（３１Ｐ ＮＭＲによって決定されたとおりの、それぞれＰでの化合物１０：Ｒ異性体の約８５：１５混合物）を得た。上記固体を２３ｍＬのＨＣＬに懸濁し、次いで３時間還流させた。混合物を室温に冷却し、１５時間撹拌した。白色の固体を濾過し、４．５ｍＬの冷ＨＣｌで洗浄し、高真空下にて４５℃で乾燥させて、純粋な化合物１０、融点９３．９〜１０４．７℃、ＨＰＬＣ純度９９．７４％（３．１１ｇ、ウリジンヌクレオシドから１５．２％）を得た。
化合物１０：１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３） δ ８．６３（ｂｒ ｓ， １Ｈ， ＮＨ）， ７．４７（ｄ， １Ｈ， Ｃ６−Ｈ）， ７．３０（ｍ， ２Ｈ， ｏ−芳香族）， ７．２６−７．１８（ｍ， ３Ｈ， ｍ，ｐ−芳香族）， ６．１８（ｂｒ ｄ， １Ｈ， Ｃｌ’−Ｈ）， ５．７０（ｄ， １Ｈ， Ｃ５−Ｈ）， ５．０２（七重線， ＣＨ−（ＣＨ３）２）， ４．５３（ｍ， ２Ｈ， Ｃ−５’−Ｈ２）， ４．１１（ｄ， １Ｈ， Ｃ３’−Ｈ）， ３．９７（ｍ， ３Ｈ， Ｃ３’−ＯＨ， Ｃ４’−Ｈ， ａｌａ−ＣＨ−ＣＨ３）， ３．７７（ｂｒ ｓ， １Ｈ， ａｌａ−ＮＨ）， １．３９（ｄ， ３Ｈ，Ｃ２’− ＣＨ３）， １．３７（ｄ， ３Ｈ， ａｌａ− ＣＨ３） １．２４（ｄ， ６Ｈ， ＣＨ−（ＣＨ３）２）。
（実施例１１）
化合物１１の調製（ＵＳ２０１０／００８１６２８から）
６−エトキシ−９−（（４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，７ａＲ）−７−フルオロ−２−イソプロポキシ−７−メチル−２−オキソ−テトラヒドロ−２，５−フロ［３，２−ｄ］［１，３，２］ジオキサホスフィニン−６−イル）−９Ｈ−プリン−２−イル−アミン（化合物１１）の合成（化合物１９、ＵＳ２０１０／００８１６２８）
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−エトキシ−プリン−９−イル）−４−フルオロ−２−ヒドロキシメチル−４−メチル−テトラヒドロ−フラン−３−オール（１５０ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）を、無水ピリジン（２ｍｌ）に０℃で溶かした。０．４５ＭのＩＨ−テトラゾールのアセトニトリル（２．５５ｍＬ）中の溶液、続いてビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）イソプロピルホスホルアミダイト（ｉｓｐｒｏｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）（０．１６ｍＬ、０．５５ｍｍｏｌ、１．２当量）を加えた。混合物を周囲温度に３時間かけて徐々に加温した。ＴＬＣによって、反応の完了が示された。反応物を水（０．１ｍＬ）の添加でクエンチした。反応溶液を減圧下で濃縮し、次いで残渣を酢酸エチル（５ｍＬ）で摩砕した。生じた白色の沈澱物を濾過によって除去し、濾液を減圧下で濃縮した。
生じた中間体環状ホスファイト残渣をアセトニトリル（２ｍＬ）に溶かし、次いでをｔ−ブチルヒドロペルオキシド（水中７０％、０．１９ｍＬ）で５時間周囲温度にて処置した。ＴＬＣによって反応の完了が示された。反応溶液を減圧下で濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ＨＣＬ中０から５％のＩＰＡの勾配を使用するＡｎａｌｏｇｉｘ）によって精製した。２種のジアステレオ異性体（化合物１１およびＰでのＲ異性体）は分離可能であった。各ジアステレオ異性体を含有する画分を別々に組み合わせ、減圧下で白色の固体に濃縮させて、各ジアステレオ異性体２０ｍｇを得た（組み合わせ収率２０％）。
化合物１１
３１Ｐ＿ＮＭＲ（１６２ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ）： δ−６．４９；
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ）： δ ＝８．１７（ｓ， １Ｈ）， ６．４７（ｂｓ， ２Ｈ）， ６．２７（ｄ， Ｊ＝２１．２Ｈｚ， １Ｈ）， ４．７３−４．６２（ｍ， ４Ｈ）， ４．４５（ｑ， Ｊ＝７．０Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．２７−４．２１（ｍ， １Ｈ）， １．３９−１．３４（ｍ， ９Ｈ）， １．２０（ｄ， Ｊ＝２２．８Ｈｚ， ３Ｈ）。
ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ ４３２．４［Ｍ＋Ｈ］＋。
ＰでのＲ異性体
３１Ｐ＿ＮＭＲ（１６２ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ）： δ ＝−４．６８；
１Ｈ −ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ）： δ ＝８．１５（ｓ， １Ｈ）， ６．６３（ｓ， ２Ｈ）， ６．２７（ｄ， Ｊ＝２１．２Ｈｚ， １Ｈ）， ４．７４−４．５８（ｍ， ４Ｈ）， ４．４５（ｑ， Ｊ＝６．４Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．４２−４．３７（ｍ， １Ｈ）， １．３６（ｔ， Ｊ＝７．２Ｈｚ， ３Ｈ）， １．３２（ｄ， Ｊ＝３．６Ｈｚ， ３Ｈ）， １．３０（ｄ， Ｊ＝３．６Ｈｚ， ３Ｈ）， １．２２（ｄ， Ｊ＝２２．８Ｈｚ， ３Ｈ）。
ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ ４３２．４［Ｍ＋Ｈ］＋
化合物１１およびＰでのＲ異性体に関する構造を下記に表す。
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−エトキシ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−フルオロ−２−（ヒドロキシメチル）−４−メチルテトラヒドロ−フラン−３−オールの合成（化合物１６、ＵＳ２０１０／００８１６２８）
５００ｍＬの乾燥丸底フラスコに、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−クロロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−２−（ベンゾイルオキシメチル）−４−フルオロ−４−メチルテトラヒドロフラン−３−イルベンゾエート（１１ｇ、２０．９２ｍｍｏｌ）を負荷した。無水の無水エタノール（２１０ｍＬ）、および続いて無水Ｋ２ＣＯ３（２８．９１ｇ、２０９．２ｍｍｏｌ）を加えた。懸濁液を撹拌し、７５℃で窒素下５．５時間加熱した。全ての出発材料を、その時ＴＬＣ試験によって消費した。混合物を室温に冷却し、固体を濾別した。濾液を氷酢酸（２．５２ｇ）の添加によってｐＨ約７に中和し、減圧下で濃縮した。残渣をメタノールに溶かし、シリカゲル（１５ｇ）と混合した。粗製の生成物およびシリカゲルの乾燥混合物を空のカートリッジに移し、カラムクロマトグラフィー（Ａｎａｌｏｇｉｘ ２２０ｇ、ＤＣＭ中０から１５％のＭｅＯＨの勾配）を介して分離して、生成物（ＤＣＭ中５％のＭｅＯＨ）を白色の泡状物固体として得た（３．７３ｇ、５４．５％）。第２の白色の固体をカラムから単離し（ＤＣＭ中１０％のＭｅＯＨ、１．４４ｇ）、それはヌクレオシドの２種のダイマーの混合物である。より極性の第３の白色の固体をカラムから収集し（ＤＣＭ中１５％のＭｅＯＨ、０．４７ｇ）、それはヌクレオシドのトリマーの混合物である。生成物９９．９４％のＨＰＬＣ純度。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ ８．１６（ｓ， １Ｈ， ８−Ｈ）， ６．５５（ｓ， ２Ｈ， ＮＨ２）， ６．０４（ｄ， １Ｈ， Ｃ１’−Ｈ）， ５．６６（ｄ， １Ｈ， ３’−ＯＨ）， ５．２４（ｍ， １Ｈ， ５’−ＯＨ）， ４．４４（ｑ， ２Ｈ， ６−０ＣＨ２）， ４．２３−４．０８（ｍ， １Ｈ， Ｃ３’−Ｈ）， ３．９１−３．８２（ｍ， ２Ｈ， Ｃ４’−ＨおよびＣ５’−Ｈａ，）， ３．７１−３．６６（ｍ， １Ｈ， Ｃ５’−Ｈｂ）， １．３６（ｔ， ３Ｈ， エチルのＣＨ３）， １．０６（ｄ， ３Ｈ， Ｃ２’−ＣＨ３）。
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−クロロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−２−（ベンゾイルオキシメチル）−４−フルオロ−４−メチルテトラヒドロフラン−３−イルベンゾエートの合成（化合物１２、ＵＳ２０１０／００８１６２８）
１２Ｌの三口丸底フラスコに、６−クロロ−２−アミノプリン（２２５．４ｇ、１．３２９ｍｏｌ）を入れた。無水ｔｅｒｔ−ＢｕＯＨ（４．５Ｌ）を加え、溶液を機械攪拌機で周囲温度にて撹拌した。カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（固体、１５１．６ｇ、１．３５ｍｏｌ）を少量ずつ窒素ガス流下で、撹拌しながら加えた。混合物をＲＴでさらに３０分間撹拌した。５Ｌ丸底フラスコに、α−臭化物（１０、１９７ｇ、０．４５１ｍｏｌ）および無水アセトニトリル３Ｌを周囲温度で負荷した。臭化物溶液をプリンベースの懸濁液に１分間かけて周囲温度で加えた。５Ｌフラスコをアセトニトリル（２×１Ｌ）ですすいで、臭化物を完全に反応混合物に移した。混合物を徐々に５０℃に２時間かけて加熱マントルおよびコントローラを用いて加熱し、２０時間撹拌した。ＴＬＣベータ（Ｒｆ ０．２８、ヘキサン中３０％のＥｔＯＡｃ）によって示されたとおりに反応はほとんど完了した。反応物を飽和ＮＨ４Ｃｌ（２００ｍＬ）の添加によってクエンチして、懸濁液を形成した。懸濁固体を、２．５ＬのポーセレンＢｕｃｈｎｅｒ漏斗中のＣｅｌｉｔｅの３ｃｍパッドを介する濾過によって除去した。固体をトルエン（３×１００ｍＬ）で洗浄した。合わせた濾液を、６ＮのＨＣｌ溶液を加えることによってｐＨ７まで中和した（約２２０ｍＬ）。混合物を減圧下で濃縮した。混合物の体積が約１／３の体積に減少したときに、さらに沈澱固体を濾過によって同様の方法で除去した。濾液を約８００ｍＬの体積にさらに濃縮した。残渣をプラグカラム（６Ｌの焼結ガラスＢｕｃｈｎｅｒ漏斗中に１．６ｋｇのフラッシュグレードシリカゲル）に負荷し、ヘキサン（６Ｌ）中１０％の酢酸エチルの勾配で溶離（吸引を介する）して非極性の不純物を除去し、ヘキサン中３０％の酢酸エチルで少量のラクトール（６Ｌ）を得、次いでヘキサン（４Ｌ）中４０％〜４５％の酢酸エチルで主量の生成物を溶離した。画分を含有する生成物を合わせ、減圧下で濃縮し、真空下で白色の泡状物固体に乾燥させた（０．２ｍｍＨｇ、２４時間、周囲温度）（１５０．７ｇ、ＮＭＲによりβ／α＝１４：１。１Ｈ−ＮＭＲ。（ＣＤＣｌ３）β：δ＝１．３３（ｄ、２２．４Ｈｚ、２’−Ｃ−ＣＨ３）、α：１．５５（ｄ、２２Ｈｚ、２’−Ｃ−ＣＨ３）。
生成物混合物の泡状物をメタノール（７００ｍＬ）に周囲温度で溶かした。静置させると、固体が２時間かけて徐々に形成した。懸濁液を冷凍庫内で−５℃に１７時間冷却した。生じた白色の固体を濾過によって収集し、冷ＭｅＯＨ（−５℃、３×６０ｍＬ）およびエチルエーテル（３×１００ｍＬ）で洗浄した。固体を真空下で乾燥させて（０．２ｍｍＨｇ、２４時間、周囲温度）、優れたｄｅ（ＨＰＬＣによりβ／α ９９．８：１）を有するβ−生成物１１０．５ｇを得た。濾液を部分的に濃縮し（約４００ｍＬ）、次いで６０℃に加熱しながら、より多くのＭｅＯＨ（４００ｍＬ）で希釈した。溶液を周囲温度に冷却し、シードをまき、−５℃に冷却した。第２の収穫物を収集し、洗浄し、同様の方法で乾燥させて、より多くの生成物を白色の固体（１２．２６ｇ）として同様のジアステレオ異性体純度で得た。母液を減圧下で乾燥するまで濃縮した（約２５ｇ）。残渣は、βおよびα−異性体の混合物であった。それを自動シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ａｎａｌｏｇｉｘ、２４０ｇのカートリッジ、ヘキサン中４０％から５０％の酢酸エチル）に供し、生成物の泡状物１４．５２ｇを得、これをＭｅＯＨから再結晶化し、洗浄し、同様の方法で乾燥させて、さらに８．４６ｇの生成物を高純度で得た。
３つの固体は同様の純度であると判断し、それらを合わせて、白色の結晶生成物１３１．２ｇを得た（ブロモ糖から５５％、ラクトールから４９％）。融点１６０．５〜１６２．０℃、０．２０％のαを含むＨＰＬＣ純度９９．５％。
１Ｈ−ＮＭＲ（純粋なβ−アノマー， ＣＤＣｌ３）： δ＝８．０３（ｍ， ２Ｈ， 芳香族）， ７．９３（ｍ， ２Ｈ， 芳香族）， ７．８８（ｓ， １Ｈ， Ｃ８−Ｈ）， ７．６０（ｍ， １Ｈ， 芳香族）， ７．５０（ｍ， １Ｈ， 芳香族）， ７．４４（ｍ， ２Ｈ， 芳香族）， ７．３３（ｍ， ２Ｈ， 芳香族）， ６．４４（ｄｄ， １Ｈ， ＣＩｌ’−Ｈ）， ６．１２（ｄ， １Ｈ， Ｃ３’−Ｈ）， ５．３５（ｓ， ２Ｈ， ＮＨ２）， ５．００（ｄｄ， １Ｈ， Ｃ５’−Ｈａ）， ４．７６（ｍ， １Ｈ， Ｃ４’−Ｈ）， ４．５９（ｄｄ， １Ｈ， Ｃ５’−Ｈｂ）， １．３３（ｄ， ３Ｈ， ＣＨ３）。
（実施例１２）
化合物１２の調製（ＵＳ２０１１００１５１４６から）
（２Ｓ）−イソプロピル２−（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５（２−アミノ−６−メトキシ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−フルオロ−３ヒドロキシ−４−メチルテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（フェノキシ）ホスホリルアミノ）プロパノエートの合成
２５０ｍＬの乾燥丸底フラスコに、ジクロロリン酸フェニル（２．６６ｇ、１２．６１ｍｍｏｌ）および無水ジクロロメタン（４０ｍＬ）を負荷した。アミノエステル塩（２．６０ｇ、１５．５３ｍｍｏｌ）を溶液に加え、混合物を−５℃に冷却した。次いで、素早く乾燥シリンジを介して−５℃でＮ−メチルイミダゾール（７．７ｍＬ、９７ｍｍｏｌ）を加え、溶液を−５℃で１時間撹拌した。ヌクレオシド（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−メトキシ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−フルオロ−２−（ヒドロキシメチル）−４−メチルテトラヒドロフラン−３−オール）、３．０４ｇ、９．７ｍｍｏｌ）をバイアルから一度に−５℃で加え、固体を２０分で徐々に溶かした。反応温度を周囲温度に２時間かけて上昇させた。１７時間後、反応は完了しなかった。より多くの試薬を（ホスフェート（２．６６ｇ）、アミノエステル（２．６０ｇ）、およびＮ−メチルイミダゾール（３．８ｍＬ、４８ｍｍｏｌ）から）作製し、反応混合物に−５℃で加えた。反応物を室温でさらに２時間撹拌した。ＴＬＣ結果によって示されたとおりに反応はほとんど完了し、ジクロロメタン７０ｍＬで希釈した。ＨＣｌ溶液（１Ｎ、７０ｍＬ）を加えた。水性層を分離し、ジクロロメタンで抽出した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３、水、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。減圧下での溶媒の除去後、２４０ｇのカートリッジおよびジクロロメタン中０〜８％の２−ＰｒＯＨの勾配を使用する自動カラムクロマトグラフィーを介して、粘着性残渣を精製して、生成物を泡状物の固体として得た（４．１６ｇ、７．１４ｍｍｏｌ、７３％の収率）。ＨＰＬＣ純度９７．４％。生成物のＮＭＲスペクトルによって、それが１．２：１の比を有する２種のジアステレオ異性体の混合物であることが示された。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ＝７．９８（１Ｈ， ｓ， 一方の異性体の８−Ｈ）， ７．９５（１Ｈ， ｓ， 他方の異性体の８−Ｈ）， ７．３７−７．３２（２Ｈ， ｍ， 芳香族−Ｈ）， ７．２２−７．１５（３Ｈ， ｍ， 芳香族−Ｈ）， ６．６（２Ｈ， ｓ， ＮＨ２）， ６．１１（１Ｈ， ｄ， 一方の異性体のＣｌ’−Ｈ）， ６．０９（１Ｈ， ｄ， 他方の異性体のＣＩ’−Ｈ）， ６．０９−５．９８（１Ｈ， ｍ， アミドＮＨ）， ５．８８（１Ｈ， ｄ， 一方の異性体の３’−ＯＨ）， ５．８１（１Ｈ， ｄ， 他方の異性体の３’−Ｈ）， ４．８５−４．７５（１Ｈ， 七重線， イソ−プロピルのメチンＨ）， ４．４６−４．２７（２Ｈ， ｍ， Ｃ４’−Ｈ， アミノエステルのα−Ｈ）， ４．１５−４．０７（１Ｈ， ｍ， Ｃ３’−Ｈ）， ３．９６（３Ｈ， ｓ， ＯＣＨ３）， ３．８２−３．７２（２Ｈ， ｍ， Ｃ５’−ＨａおよびＣ５’Ｈｂ）， １．２３−１．０６（９Ｈ， ｍ， アミノエステルのＣＨ３）， １．０３（３Ｈ， ｄ，Ｃ２’−ＣＨ３）。
３１Ｐ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）： ０＝４．９１（一方の異性体）， ４．７２（他方の異性体）。
代替の精製方法は、クロマトグラフィー分離を簡便にするために微量の３’ホスホロアミデート副生成物を化学的に変えることである。粗製のホスホロアミデート生成物を無水ピリジン（５ｍＬ／ｇ）に溶かし、ｔ−ブチルジメチルシリルクロリド０．５モル当量で周囲温度にて処理して、３’異性体不純物の遊離５’一級ヒドロキシルと選択的に反応させる。反応の進行はＬＣ／ＭＳによって監視することができる。３’異性体を５’−ｔＢＤＭＳ−３’−ホスホロアミデート誘導体に変換すると、反応物をメタノール（３当量）でクエンチし、減圧下で濃縮し、酢酸エチルと５％のクエン酸とに分配し、次いで有機層を濃縮する。次いで、残渣をクロマトグラフィーに供す。そのクロマトグラフィーは、より高い負荷およびより早い勾配で今や行うことができるとともにより高い純度を達成できる。
（実施例１３）
化合物１３の調製（ＵＳ２０１１００１５１４６から）
（実施例１４）
化合物１４の調製（ＵＳ７，９６４，５８０、実施例５から）
２’−デオキシ−２’−フルオロ−２’−Ｃ−メチルウリジン−５’−フェニルメトキシ−アラニルホスフェート）の調製
３ｍＬのＴＨＦに溶かしたフェニルメトキシアラニニルホスホロクロリデート（１ｇ、６．５当量）を、２’−デオキシ−２’−フルオロ−２’−Ｃ−メチルウリジン（０．１５ｇ、１当量）およびＮ−メチルイミダゾール（０．３ｇ、８当量）の３ｍＬのＴＨＦ中混合物に、室温で激しく撹拌しながら加え、次いで反応物を一晩撹拌した。溶媒を減圧によって除去した。生じた粗製の生成物をメタノールに溶かし、分取−ＨＰＬＣによってＹＭＣ ２５×３０×２ｍｍのカラム上で水／アセトニトリル勾配溶離移動相を使用して精製した。アセトニトリルおよび水を減圧下で除去して、所望の生成物を得た（５０．１ｍｇ、１５．６％）。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６） δ １．２０−１．２７（ｍ， ６Ｈ）， ３．５８（ｄ， Ｊ＝１６．０Ｈｚ， ３Ｈ）， ３．７５−３．９２（ｍ， ２Ｈ）， ４．０１５−４．３７９（ｍ， ２Ｈ）， ５．５４（ｔ， Ｊ＝１０．２Ｈｚ， １Ｈ）， ５．８３−５．９１（ｍ， １Ｈ）， ６．００−６１６（ｍ， １Ｈ）， ７．１８（ｄ， Ｊ＝８．０Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．２２（ｓ， １Ｈ）， ７．３５（ｔ， Ｊ＝４．４Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．５５（ｓ， １Ｈ）， １１．５２（ｓ， １Ｈ）；ＭＳ，ｍ／ｅ ５０２（Ｍ＋１）＋。
（実施例１５）
化合物１５の調製（ＵＳ７，９６４，５８０からの実施例５５）
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６） δ＞ １．２０−１．４４（ｍ， １２Ｈ）， １．６０−１．７１（ｍ， ４Ｈ）， ３．７５−４．０２（ｍ， ２Ｈ）， ３．９４−４．０２（ｍ， １Ｈ）， ４．１９−４．２６（ｍ， ２Ｈ）， ４．５９−４．６１（ｍ， １Ｈ）， ５．５７（ｔ， Ｊ＝８．４Ｈｚ， １Ｈ）， ５．８５−６．０６（ｍ， ３Ｈ）， ７．１７−７．２３（ｍ，４Ｈ）， ７．５４（ｄ， Ｊ＝８．４Ｈｚ， １Ｈ）， １１．５０（ｓ， １Ｈ）；ＭＳ，ｍ／ｅ ５８７．９２（Ｍ＋１）＋
ヌクレオシドホスホロアミデート誘導体のための一般手順は、ＵＳ７，９６４，５８０の４６１欄に報告されている。適切なホスホロクロリデート（６．５当量）の無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中の溶液を、ヌクレオシド（１当量）およびＮ−メチルイミダゾール（８当量）の無水ＴＨＦ中の混合物に、室温で激しく撹拌しながら加えて、反応混合物を一晩撹拌してよい。溶媒を真空で除去し、粗製物をカラムクロマトグラフィーおよび／または分取薄層クロマトグラフィーによって精製して、所望の化合物を得てよい。
（実施例１６）
化合物１６の調製（ＵＳ７，４２９，５７２から）
シチジンから出発する（２’Ｒ）−２’−デオキシ−２’−フルオロ−２’−Ｃ−メチルシチジンの合成
ステップ１：シチジン（１００ｇ、０．４１１ｍｏｌ）のＤＭＦ（２．０６Ｌ）中の懸濁液に、無水安息香酸（１０２．４ｇ、０．４５２ｍｏｌ）を加える。混合物を室温で２０時間撹拌した。ＤＭＦを真空で除去し、残渣をジエチルエーテルで摩砕した。生じた固体を吸引濾過によって収集し、ジエチルエーテル（２×２００ｍＬ）で洗浄した。さらに室温にて真空で乾燥することにより、Ｎ４ベンズアミド（１４０．６ｇ、９８．３％）を得た。この物質の一部（１３９．３ｇ、０．４０１ｍｏｌ）を無水ピリジン（１．２Ｌ）に溶かし、１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピル−ジシロキサン（１４１．４ｍＬ、０．４４１ｍｏｌ）で室温にて処理した。溶液を室温で一晩撹拌した。混合物をほぼ乾燥するまで真空で濃縮し、トルエン（３×２００ｍＬ）と共蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ（１．８Ｌ）で処理し、ＨＣｌ（２×２００ｍＬ、０．０５Ｎ）、ＮａＨＣＯ３（５％、２×４００ｍＬ）で洗浄した。有機層を洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、乾燥するまで蒸発させた。化合物１６−１（ＵＳ７，４２９，５７２からの化合物４−１）（２５６．５ｇ、１００％超）を白色の泡状物として単離し、さらに精製することなく使用した。
ステップ２：化合物１６−１（２３６．５ｇ、０．４０ｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（１．２２Ｌ）に溶かした。無水ＤＭＳＯ（１８０．８ｍＬ、２．１ｍｏｌ）を加え、生じた溶液を−２０℃から−１５℃の間に冷却した。トリフルオロ酢酸無水物（９０．６ｍＬ、０．６４ｍｏｌ）を４５分間かけて滴下して加え、溶液を−２０℃から−１５℃の間で２時間撹拌し、その後、無水トリエチルアミン（２２３．５ｍＬ、１．６ｍｏｌ）を２０分間かけて加えた。ケトン１６−２を含有する粗製の反応物をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）に溶かし、生じた溶液をＨ２Ｏ（３×４００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒を真空で除去して、黄色の固体を得、これを、ヘキサン中のＥｔ２Ｏ（０〜６０％）の段階的勾配、続くヘキサン中のＥｔＯＡｃ（５０〜１００％）の段階的勾配で溶離するシリカゲルカラムで精製した。そうして得られた粗製のケトン（約１９２ｇ）を石油エーテルから結晶化させ、ケトン１６−２（ＵＳ７，４２９，５７２からの化合物４−２）（１３８．９１ｇ、シチジンから５７．５％）を白色の固体として、および２２ｇの未反応の出発材料１６−１を黄色の固体として得た。
ステップ３：化合物１６−２（４８．５７ｇ、８．２６ｍｍｏｌ）を無水トルエン（約４００ｍＬ）に溶かし、水分を排除しながら溶媒を真空で除去した。次いで、残渣をもう２時間、さらに真空乾燥させた（オイルポンプ）。水分を厳密に排除しながら、残留した泡状物を無水ジエチルエーテル（１．０３Ｌ）にアルゴン下で溶かした。生じた溶液を−７８℃にアルゴン下で冷却し、添加漏斗を介してＭｅＬｉ（１．６Ｍ、２５８．０ｍＬ、０．４１３ｍｏｌ）を滴下して加えた。添加が完了した後に、混合物を２時間−７８℃で撹拌した。１Ｍの水性ＮＨ４Ｃｌ（５００ｍＬ）を徐々に加えた。室温に加温した後に、混合物をＨ２Ｏ（２×５００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、次いで乾燥するまで濃縮して、茶色の泡状物（約６０ｇ、１００％超）を得た。
３７．６２ｇおよび５６．４ｇの化合物１６−２を使用して、反応をさらに２回行った。合わせた粗製の生成物（１２８．０ｇ、０．２１２ｍｏｌ）をＴＨＦ（１．２８Ｌ）に溶かし、濃ＨＯＡｃ（２３ｍＬ、０．４０２ｍｏｌ）で処理した。その溶液に、ＴＢＡＦ（３８４．０ｍＬ、ＴＨＦ中１Ｍ）を加えた。溶液を室温で０．７５時間撹拌し、混合物をシリカゲル（７５０ｇ）で処理し、乾燥するまで濃縮した。粉末をＣＨ２Ｃｌ２中に充填されているシリカゲルカラム上に置いた。１：７のＥｔＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２で溶離して、暗色のろう状固体を得、それをシリカゲル（３００ｇ）上に予め吸着させ（ｐｒｅ−ａｄｓｏｒｂｅｄ）、上記のとおりにクロマトグラフィーを行なった。化合物１６−３（ＵＳ７，４２９，５７２からの化合物４−３）（４６．４ｇ、１６−２から５３．０％）をオフホワイト色の固体として単離した。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ １．２０（ｓ， ３Ｈ， ＣＨ３）， ３．６２−３．６９（ｍ， ２Ｈ，）， ３．７３−３．７８（ｍ， ２Ｈ，）， ５．１９（ｔ， １Ｈ， Ｊ＝５．４Ｈｚ， ＯＨ−５’）， ５．２５（ｓ， １Ｈ， ＯＨ−２’）， ５．５２（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝５．０Ｈｚ， ＯＨ−３’）， ５．９９（ｓ， １Ｈ， Ｈ−１’）， ７．３２（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝５．８Ｈｚ）， ７．０５（Ψｔ， ２Ｈ， Ｊ＝７．７Ｈｚ）， ７．６２（Ψｔ， １Ｈ， Ｊ＝７．３Ｈｚ）， ８．００（ｄ， ２Ｈ， Ｊ＝７．３Ｈｚ）， ８．１４（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝６．９Ｈｚ）， １１．２２（ｓ， １Ｈ， ＮＨ）。
分析：Ｃ１７Ｈ１９Ｎ３Ｏ６．０．５ Ｈ２Ｏの計算値： Ｃ， ５５．１３； Ｈ， ５．４４； Ｎ， １１．３５。 実測値： Ｃ， ５５．２１； Ｈ， ５．４７； Ｎ， １１．３３。
ステップ４：化合物１６−３（４６．０ｇ、０．１３ｍｏｌ）を無水ピリジンに溶かし、乾燥するまで真空で濃縮した。生じたシロップを無水ピリジンにアルゴン下で溶かし、撹拌しながら０℃に冷却した。茶色の溶液をベンゾイルクロリド（３０ｍＬ、０．２５０ｍｏｌ）で１０分間かけて滴下処理した。氷浴を外し、撹拌を１．５時間継続したところ、ＴＬＣによって残存する出発材料は示されなかった。混合物を水（５ｍＬ）の添加によってクエンチし、乾燥するまで濃縮した。残渣を最小量のＣＨ２Ｃｌ２に溶かし、飽和ＮａＨＣＯ３（１×５００ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１×５００ｍＬ）で洗浄した。有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、乾燥するまで濃縮し、ＥｔＯＡｃ−ヘキサン（２５〜６０％）の段階的勾配で溶離するシリカゲルでクロマトグラフィーを行い、化合物１６−４を黄色の泡状物として得た（ＵＳ７，４２９，５７２からの化合物４−４）（４８．５ｇ、６７％）。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ １．６４（ｓ， ３Ｈ， ＣＨ３）， ４．５０（ｍ， １Ｈ， Ｈ−４）， ４．７８−４．８５（ｍ， ２Ｈ， Ｈ−５’，５ａ’）， ５．５０（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝３．４Ｈｚ， Ｈ−３’）， ６．４２（ｓ， １Ｈ， Ｈ−１）， ７．４４−７．５４（ｍ， ７Ｈ， Ａｒ）， ７．５７−７．６６（ｍ， ３Ｈ， Ａｒ）， ７．９４（ｄ， ２Ｈ， Ｊ＝７．８Ｈｚ）， ８．０５−８．０９（ｍ， ４Ｈ， Ａｒ）， ８．２１（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝７．３Ｈｚ）。分析：Ｃ３１Ｈ２７Ｎ３Ｏ８の計算値： Ｃ， ６５．３７； Ｈ， ４．７８； Ｎ， ７．３８。
実測値： Ｃ， ６５．５９； Ｈ， ４．７９； Ｎ， ７．１６。
ステップ５：化合物１６−４（７．５０ｇ、０．０１３ｍｏｌ）を無水トルエン（１５０ｍＬ）にアルゴン下で溶かし、−２０℃に冷却した。ＤＡＳＴ（２．５ｍＬ、１８．９ｍｍｏｌ）を徐々に加え、添加が完了した後に、冷却浴を外した。
撹拌を１時間継続し、混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）に注ぎ、ガスの発生が止まるまで洗浄した。有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮し、１：１のＥｔＯＡｃ−ヘキサンで溶離するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。白色の固体としての純粋な１６−５（ＵＳ７，４２９，５７２からの化合物４−５）の収量は１．２２ｇ（１６．３％）であった。融点２４１℃（ＣＨ２Ｃｌ２−ヘキサン）；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ １．４９（ｄ， ３Ｈ， Ｊ＝２２．４Ｈｚ， ＣＨ３）， ４．６４（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ＝３．４４， １２．９Ｈｚ， Ｈ−５’）， ４．７３（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝９．５Ｈｚ， Ｈ−４’）， ４．９０（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．４， １２．７Ｈｚ， Ｈ−５ａ’）， ５．５６（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ＝８．６， ２０．７Ｈｚ， Ｈ−３’）， ６．５２（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１８．０Ｈｚ， Ｈ−１’）， ７．４７−７．５７（ｍ， ７Ｈ， Ａｒ）， ７．６２−７．７１（ｍ， ３Ｈ， Ａｒ）， ７．８９（ｄ， ２Ｈ， Ｊ＝６．９Ｈｚ）， ８．０７−８．１１（ｍ， ５Ｈ， Ａｒ）， ８．６７（ｂｓ， １Ｈ， ＮＨ）。 １９Ｆ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ ３．３（ｍ）。 分析：Ｃ３１Ｈ２６ＦＮ３Ｏ７．Ｏ．７ Ｈ２Ｏの計算値： Ｃ， ６３．７４； Ｈ， ４．７２； Ｎ， ７．２０。 実測値： Ｃ， ６３．７１； Ｈ， ４．５４； Ｎ， ７．２０。
ステップ６：化合物１６−５（６．３０ｇ、０．０１１ｍｏｌ）をアンモニアのメタノール溶液（約７Ｎ、１５０ｍｎＬ）中に懸濁させ、室温で一晩撹拌した。溶媒を真空で除去し、メタノール（１×２０ｍＬ）と共蒸発させ、シリカゲルに予め吸着させた。白色の粉末をシリカゲルカラム（ＣＨＣｌ３中に充填）上に置き、カラムをＣＨＣｌ３中９％のＥｔＯＨ、次いでＣＨＣｌ３中１７％のＥｔＯＨ、最後にＣＨＣｌ３中２５％のＥｔＯＨで溶離させた。生成物を含有する画分を濃縮し、０．４ １ａｍディスクで濾過し、水から凍結乾燥させて、化合物１６−６（ＵＳ７，４２９，５７２からの化合物４−６）、２．１８ｇ（７６％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ １．１７（ｄ， ３Ｈ， Ｊ＝２２．３Ｈｚ， ＣＨ３）， ３．６３（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．７， １３．７Ｈｚ， Ｈ−５’）， ３．７０−３．８４（ｍ， ３Ｈ， Ｈ−３’， Ｈ−４’， Ｈ−５ａ’）， ５．２４（ａｐｐ ｓ， １Ｈ， ＯＨ−３’）， ５．６０（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝５．４Ｈｚ， Ｈ−５’）， ５．７４（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝７．７１Ｈｚ， Ｈ−５）， ６．０７（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１８．９Ｈｚ， Ｈ−１’）， ７．３１（ｓ， １Ｈ， ＮＨ２）， ７．４２（ｓ， １Ｈ， ＮＨ２）， ７．９０（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝７．３Ｈｚ， Ｈ−６）。 １９Ｆ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ ２．６０（ｍ）．分析：Ｃ１０Ｈ１４ＦＮ３Ｏ４．４．１．４ Ｈ２０の計算値： Ｃ， ４４．２２； Ｈ， ５．９５； Ｎ， １４．７７。 実測値： Ｃ， ４２．２４； Ｈ， ５．６３； Ｎ， １４．５４。水（２ｍＬ）中に溶かし、１ＭのＨＣｌを用いてｐＨを約３．０に調節することによって、化合物１６−６（０．１０ｇ、０．３８６ｍｍｏｌ）を塩酸塩に変換した。水を真空で除去し、残渣を水性ＥｔＯＨから結晶化させて、１６−６を塩酸塩（７１．０ｍｇ）として得た。融点２４３℃（分解）；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ １．２９（ｄ， ３Ｈ， Ｊ＝２２．６Ｈｚ， ＣＨ３）， ３．６５（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．３， １２．７Ｈｚ， Ｈ−５’）， ３．７６−３．９０（ｍ， ３Ｈ， Ｈ−３’， Ｈ−４’， Ｈ−５ａ’）， ５．９６（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１７．３Ｈｚ， Ｈ−１’）， ６．１５（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝７．９Ｈｚ， Ｈ−５）， ８．３３（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝７．９Ｈｚ， Ｈ−６）， ８．６９（ｓ， １．５Ｈ， ＮＨ）， ９．７８（ｓ， １．５Ｈ， ＮＨ）。 １９Ｆ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ４）： δ １．６９（ｍ）。分析：Ｃ１０Ｈ１４ＦＮ３Ｏ４．ＨＣｌの計算値： Ｃ， ４０．６２； Ｈ， ５．１１； Ｎ， １４．２１。 実測値： Ｃ， ４０．８０； Ｈ， ５．０９； Ｎ， １４．２３。
生物学的実施例
アッセイプロトコル
ハイスループットレプリコンアッセイ（ＨＴＢＳ）
Ｈ７７（遺伝子型１ａ型）またはＣｏｎ１（遺伝子型１ｂ型）ＨＣＶ ＲＮＡおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼレポーターを持つレプリコン細胞を３８４ウェル黒色プレートに、１ウェル当たり細胞１．６×１０３個の密度で、Ｇ−４１８を除いたＤＭＥＭ培地９０μＬ中に播種した。Ｂｉｏｔｅｋ μＦｌｏｗ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを用いて、化合物を１００％ＤＭＳＯ中で連続希釈し、細胞に１：２２５希釈で加えて、全体積９０μＬ中で０．４４％ＤＭＳＯの最終濃度を達成した。細胞プレートを３７℃で、５％ＣＯ２と共に３日間インキュベーションし、その後、培地を除去し、細胞を、複製レベルのマーカーとしてのルシフェラーゼ活性についてアッセイした。Ｄｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、ルシフェラーゼ発現を測定した。簡単には、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼ緩衝液２０μＬを加えて細胞を１０分間溶解し、その後、希釈したＤｕａｌ−Ｇｌｏ Ｓｔｏｐ ＆ Ｇｌｏ基質（１：１００）２０μＬを各ウェルに加えた。１０分間のインキュベーションの後に、ルミネセンスシグナルをＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒで測定した。ルシフェラーゼレベルを未処理の対照（１００％と定義）に対する百分率に変換し、ＸＬＦｉｔ４ ソフトウェア（ＩＤＢＳ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を使用して、データをロジスティック用量反応式ｙ＝ａ／（１＋（ｘ／ｂ）ｃ）に当てはめた。得られた式からＥＣ５０値を算出した。別法では、抗ウイルス活性を、ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼＩＣ５０決定によって分析することができる。Ｔａｌｉａｎｉの方法（そのようなアッセイを行うことに関して参照によって本明細書に組み込まれるＴａｌｉａｎｉ Ｍ、Ｂｉａｎｃｈｉ Ｅ、Ｎａｒｊｅｓ Ｆ、Ｆｏｓｓａｔｅｌｌｉ Ｍ、Ｕｒｂａｎｉ Ａ、Ｓｔｅｉｎｋｕｈｌｅｒ Ｃら、Ａ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ａｓｓａｙ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ． Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９６年；２４０巻（１号）：６０〜７頁）に基づく蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）デプシペプチド基質（ＲＥＴ Ｓ１、Ａｎａｓｐｅｃ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して、ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ活性を監視した。
簡単には、２〜１０ｎＭの精製ＮＳ３プロテアーゼドメインを３７℃で１０分間、２０μＭの同質遺伝子型のＮＳ４Ａペプチド補因子（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と共に、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５および１０ｍＭのＤＴＴを含む４０％グリセロール緩衝液中でプレインキュベートした。化合物をＤＭＳＯ中で１：３で連続希釈し、酵素／補因子混合物と共に１０分間インキュベートし、２μＭのＲＥＴ Ｓ１基質（最終濃度）を加えることによって、反応を開始した。１時間にわたって、Ｖｉｃｔｏｒ３ Ｖ蛍光プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、蛍光の増大を連続的に測定した。最大傾斜アルゴリズムを用いるＷｏｒｋｏｕｔ １．５ソフトウェア（ＤＡＺＤＡＱ、Ｅａｓｔ Ｓｕｓｓｅｘ、ＵＫ）を使用して、各インヒビター濃度についての初速度を算出した。速度データを未処理の対照（１００％と定義）に対する百分率に変換し、非線形回帰を行って５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を算出した。
ＮＳ３酵素効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）：精製ＮＳ３プロテアーゼをＮＳ４Ａペプチドと複合させ、次いで、化合物の連続希釈物（溶媒としてＤＭＳＯを使用）と共にインキュベートする。二重標識されたペプチド基質を加えることによって、反応を開始し、その結果生じる蛍光の動的増大を測定する。速度データの非線形回帰を行って、ＩＣ５０を算出する。活性を初めに、遺伝子型１ｂ型プロテアーゼに対して試験する。遺伝子型１ｂ型に対して得られた抗力に応じて、追加の遺伝子型（１ａ型、２ａ型、３型）およびまたはプロテアーゼインヒビター耐性酵素（Ｄ１６８Ｙ、Ｄ１６８ＶまたはＡ１５６Ｔ変異体）を試験することができる。全てのアッセイを通じて、ＢＩＬＮ−２０６１を対照として使用する。実施例の化合物をこのアッセイで評価し、約１μＭ未満のＩＣ５０値を有することを見出した。
レプリコン効力および細胞毒性：Ｈｕｈ−ｌｕｃ細胞（ＢａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒのＩ３８９ｌｕｃ−ｕｂｉ−ｎｅｏ／ＮＳ３−３’／ＥＴ遺伝子型１ｂ型レプリコンを安定に複製）を、化合物（溶媒としてＤＭＳＯを使用）の連続希釈物で７２時間処理する。レプリコンコピー数を生物発光によって測定し、非線形回帰を行って、ＥＣ５０を算出する。Ｐｒｏｍｅｇａ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ細胞生存率アッセイを使用して、同じ薬物希釈物で処理された平行プレートを細胞毒性についてアッセイする。１ｂ型レプリコンに対して達成された効力に応じて、化合物を、遺伝子型１ａ型レプリコンおよび／またはＤ１６８ＹもしくはＡ１５６Ｔ変異をコードするインヒビター耐性レプリコンに対して試験することができる。全てのアッセイを通じて、ＢＩＬＮ−２０６１を対照として使用する。実施例の化合物をこのアッセイで評価し、約５μＭ未満のＥＣ５０値を有することを見出した。
レプリコン効力に対する血清タンパク質の効果
レプリコンアッセイを、生理学的濃度のヒト血清アルブミン（４０ｍｇ／ｍＬ）またはα−酸糖タンパク質（１ｍｇ／ｍＬ）が補充された標準細胞培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中で行う。ヒト血清タンパク質の存在下でのＥＣ５０を標準培地中でのＥＣ５０と比較して、効力におけるシフトの倍率を決定する。
酵素選択性：ブタ膵臓エラスターゼ、ヒト白血球エラスターゼ、プロテアーゼ３およびカテプシンＤを包含する哺乳動物プロテアーゼの阻害を、それぞれの酵素の個々の基質に対するＫｍで測定する。それぞれの酵素についてのＩＣ５０をＮＳ３ １ｂプロテアーゼで得られたＩＣ５０と比較して、選択性を算出する。
ＭＴ−４細胞の細胞毒性：ＭＴ４細胞を、化合物の連続希釈物で５日間にわたって処理する。Ｐｒｏｍｅｇａ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイを使用して、細胞生存率を処理期間の終了のときに測定し、非線形回帰を行って、ＣＣ５０を算出する。
ＥＣ５０で細胞に結合する化合物濃度：Ｈｕｈ−ｌｕｃ培養物を、ＥＣ５０に等しい濃度の化合物と共にインキュベートする。複数の時点で（０〜７２時間）、細胞を冷たい培地で２回洗浄し、８５％アセトニトリルで抽出し；それぞれの時点での培地の試料もまた抽出する。細胞および培地抽出物をＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析して、それぞれの画分における化合物のモル濃度を決定する。
溶解性および安定性：１０ｍＭのＤＭＳＯ原液のアリコット（ａｌｉｑｕｏｔ）を取り、試験培地溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４および０．１ＮのＨＣｌ、ｐＨ１．５）中１００μＭの最終濃度の化合物を１％の全ＤＭＳＯ濃度で調製することによって、溶解性を決定する。試験培地溶液を振盪しながら室温で１時間インキュベートする。次いで、溶液を遠心分離し、回収された上清をＨＰＬＣ／ＵＶでアッセイする。比較される、定義された試験溶液中で検出される化合物の量と、同じ濃度のＤＭＳＯ中で検出される量とを比較することによって、溶解性を算出することができる。試験培地中、３７℃で１時間インキュベーションした後の化合物の安定性もまた決定する。
凍結保存されたヒト、イヌおよびラット肝細胞での安定性：それぞれの化合物を１時間まで、肝細胞懸濁物（１００μＬ、１ウェル当たり８０，０００細胞）中、３７℃でインキュベートする。凍結保存された肝細胞を、血清不含のインキュベーション培地中で再構成する。懸濁物を９６ウェルプレート（５０μＬ／ウェル）に移す。化合物をインキュベーション培地中で２μＭまで希釈し、次いで、肝細胞懸濁物に加えて、インキュベーションを開始する。インキュベーションの開始から０、１０、３０および６０分目に、試料を採取して、９０％アセトニトリル／１０％水中の０．３％ギ酸からなる混合物で、反応物をクエンチすることができる。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを使用して、それぞれの試料中での化合物の濃度を分析する。濃度−時間データを単相指数方程式（ｍｏｎｏｂａｓｉｃ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｑｕａｔｉｏｎ）に当てはめることによって、肝細胞懸濁物中の化合物の消失半減期を決定する。また、データを拡大して、固有肝クリアランスおよび／または全体肝クリアランスを表す。
ヒト、イヌおよびラットからの肝Ｓ９画分中での安定性：それぞれの化合物をＳ９懸濁物（５００μＬ、タンパク質３ｍｇ／ｍＬ）中、３７℃（ｎ＝３）で１時間までインキュベートする。化合物をＳ９懸濁物に加えて、インキュベーションを開始する。インキュベーションの開始から０、１０、３０および６０分目に、試料を採取する。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを使用して、それぞれの試料中での化合物の濃度を分析する。濃度−時間データを単相指数方程式に当てはめることによって、Ｓ９懸濁物中の化合物の消失半減期を決定する。
Ｃａｃｏ−２透過性：順方向（ＡからＢへ）および逆方向（ＢからＡへ）透過性の両方を測定する。１２ウェル Ｃｏｓｔａｒ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）プレート内で、コラーゲンコーティングされた微孔性ポリカーボネート膜上に、Ｃａｃｏ−２単層を集密まで成長させる。化合物を、順方向透過性（ＡからＢへ）では先端面に投与し、逆方向透過性（ＢからＡへ）では基底外側上に投与する。細胞を加湿インキュベーター内で、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。インキュベーションの開始時、インキュベーションから１時間目および２時間目に、２００μＬアリコットを受器チャンバーから採取し、新鮮なアッセイ緩衝液に交換する。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳで、それぞれの試料中の化合物の濃度を決定する。見掛け透過性であるＰａｐｐを算出する。
血漿タンパク質結合性：血漿タンパク質結合性を、平衡透析法によって測定する。それぞれの化合物をブランクの血漿に、２μＭの最終濃度でスパイクする。スパイクされた血漿およびリン酸緩衝液を、組み合わせた透析セルの反対側に入れ、次いでこれを、３７℃の水浴中でゆっくりと回転させる。インキュベーションの終了時に、血漿およびリン酸緩衝液中での化合物の濃度を決定する。次の式を使用して、未結合のパーセントを算出する：
［式中、ＣｆおよびＣｂはそれぞれ、透析後の緩衝液濃度および血漿濃度として決定された、遊離および結合濃度である］。
ＣＹＰ４５０プロファイリング：それぞれの化合物を、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９を含む５種の組換えヒトＣＹＰ４５０酵素それぞれと共に、ＮＡＤＰＨの存在下、および不在下でインキュベートする。インキュベーションの開始時ならびにインキュベーションを開始してから５、１５、３０、４５および６０分目に、連続試料をインキュベーション混合物から採取することができる。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって、インキュベーション混合物中での化合物の濃度を決定する。インキュベーションの開始時のサンプリングと比較することによって、インキュベーション後の各時点で残っていた化合物の百分率を算出する。
ラット、イヌ、サルおよびヒト血漿中での安定性：化合物を、血漿（ラット、イヌ、サルまたはヒト）中、３７℃で２時間までインキュベートする。化合物を血漿に、１および１０μｇ／ｍＬの最終濃度で加える。化合物を加えてから０、５、１５、３０、６０および１２０分目に、アリコットを採取する。それぞれの時点での化合物および主要な代謝産物の濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって測定する。生物学的データ（Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）ベースのＨＣＶレプリコンレポーターアッセイ−ＨＣＶ１ｂ型ＲＬｕｃを使用して、抗ウイルス効力［ＥＣ５０］を決定した）。
生物学的実施例１：化合物１および化合物２の組合せの抗ＨＣＶ活性
材料および方法
化合物１および化合物２は、Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）が合成した。
細胞系
ＨＣＶ遺伝子型１ｂ型レプリコン細胞（Ｈｕｈ−ｌｕｃ）をＲｅｂｌｉｋｏｎ（Ｍａｉｎｚ、ドイツ）から得た。これらの細胞におけるレプリコンはＩ３８９ｌｕｃ−ｕｂｉ−ｎｅｏ／ＮＳ３−３’／ＥＴと称され、選択的耐性マーカー（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）、さらにホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードする。Ｈｕｈ−ｌｕｃ細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）および０．５ｍｇ／ｍＬのＧ−４１８（ＧＩＢＣＯ）が補充されているダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＧＩＢＣＯ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で維持した。細胞を週に２回継代し、サブコンフルエントなレベルで維持した。
ＥＣ５０決定
レプリコン細胞を、９６ウェルプレートに、１ウェル当たり細胞５×１０３個の密度で、Ｇ−４１８を除いたＤＭＥＭ培地１００μＬ中に播種した。化合物１および２を１００％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）中で１：３で連続希釈した。これらの連続希釈物を細胞に１：２００希釈で加えて、０．５％ＤＭＳＯの最終濃度を、２００μＬの全体積で達成した。プレートを３７℃で３日間インキュベートし、その後、培地を除去し、細胞を溶解させ、市販のルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。薬物処理された試料のＨＣＶ複製レベルを未処理の対照（１００％と定義）での値に対する百分率として表し、ＸＬＦｉｔ４ ソフトウェア（ＩＤＢＳ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を使用して、データをロジスティック用量反応式ｙ＝ａ／（１＋（ｘ／ｂ）ｃ）に当てはめた。以前に記載されたとおりに（Ｄｅｌａｎｅｙ， Ｗ．Ｅ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、４５巻（６号）：１７０５〜１７１３頁（２００１年））、ＥＣ５０値を、得られた式から算出した。
抗ウイルス組合せ研究
レプリコン細胞を９６ウェルプレートに、１ウェル当たり細胞５×１０３個の密度で、培地１００μＬ中に播種した。化合物１および２を１００％ＤＭＳＯ中で上記のとおりに連続希釈し、９６ウェルプレートにマトリックス様式で加え、２００μＬの最終体積および０．５％の最終ＤＭＳＯ濃度中に種々の薬物濃度および比を有する定義されたセットを達成した。それぞれ個々の薬物について、ＥＣ５０値を、試験される濃度範囲の中点として選択した。細胞を３日間インキュベートし、上記に示されているとおりにルシフェラーゼ発現について分析した。組合せ研究のために、２つの独立した実験を３回繰り返して行った。
組み合わせデータ分析
ＰｒｉｃｈａｒｄおよびＳｈｉｐｍａｎ（Ｐｒｉｃｈａｒｄ ＭＮ、Ａｓｅｌｔｉｎｅ
ＫＲ、Ｓｈｉｐｍａｎ Ｃ， Ｊｒ．、ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙＴＭ ＩＩ、Ｖｅｒｓｉｏｎ １．０． Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ、１９９３年； Ｐｒｉｃｈａｒｄ Ｍ．Ｎ．、Ｓｈｉｐｍａｎ Ｃ．， Ｊｒ．、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ １４巻（４〜５号）：１８１〜２０５頁（１９９０年）； Ｐｒｉｃｈａｒｄ Ｍ．Ｎ．、Ｓｈｉｐｍａｎ Ｃ， Ｊｒ．、Ａｎｔｉｖｉｒ Ｔｈｅｒ １ （１巻）：９〜２０号（１９９６年）； Ｐｒｉｃｈａｒｄ Ｍ．Ｎ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ３７巻（３号）：５４０〜５頁（１９９３年）によって開発されたＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ ＩＩプログラムを使用して、データを分析した。そのソフトウェアは理論阻害を算出して、薬物間の相加的相互作用を推測し（Ｂｌｉｓｓ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅモデルに基づく）、理論阻害値と観察された阻害値との間の統計的に有意差を定量化する。三次元でこれらの差違をプロットすると、Ｚ面での上昇が化合物間の抗ウイルス相乗作用を表し、低下が抗ウイルス拮抗作用を表す表面が生じる。表面偏差の算出ボリュームは、ｎＭ２％で表される。ＰｒｉｃｈａｒｄおよびＳｈｉｐｍａｎによると、組合せ効果は次のとおりに定義される：
・ ボリュームが１００ｎＭ２超であれば、高度に相乗的。
・ ボリュームが５０ｎＭ２超および１００ｎＭ２以下であれば、やや相乗的。
・ ボリュームが−５０ｎＭ２超および５０ｎＭ２以下であれば、相加的。
・ ボリュームが−１００ｎＭ２超および−５０ｎＭ２以下であれば、やや拮抗的。
・ ボリュームが−１００ｎＭ２以下であれば、拮抗的。
結果
組合せ実験を開始する前に、Ｈｕｈ−ｌｕｃレプリコン細胞でのＥＣ５０値を化合物１および化合物２について決定し、結果を表ＩＩに示す。両方の化合物が抗ウイルス効果を有した。
化合物１および化合物２の組合せの抗ウイルス効果を測定し、相加作用からの有意な偏差を表す表面プロットをもたらすＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ ＩＩを使用して、得られたデータを分析した。相加作用からの統計的に有意な偏差の定量化によって、化合物１および２の組合せは、表ＩＩＩに示されているとおりの相加的抗ウイルス効果を示す−５０ｎＭ２から５０ｎＭ２の間の相乗作用／拮抗作用ボリュームを有することが示された。
表ＩＩＩに示されるインビトロ実験の結果は、化合物２が、化合物１と組み合わせた場合に、相加的抗ウイルス活性を有することを示している。
生物学的実施例２：化合物３との組合せ
材料および方法
抗ウイルス化合物
化合物１および化合物３は、Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）が合成した。リバビリンおよびＩＦＮ−αは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。
細胞系
ＨＣＶ遺伝子型１ｂ型レプリコン細胞（Ｈｕｈ−ｌｕｃ）をＲｅｂｌｉｋｏｎ（Ｍａｉｎｚ、ドイツ）から得た。これらの細胞におけるレプリコンはＩ３８９ｌｕｃ−ｕｂｉ−ｎｅｏ／ＮＳ３−３’／ＥＴと称され、選択的耐性マーカー（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）、さらにホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードする。Ｈｕｈ−ｌｕｃ細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）および０．５ｍｇ／ｍＬのＧ−４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補充されていて、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）中で維持した。細胞を週に２回継代し、サブコンフルエントレベルで維持した。
ＥＣ５０決定
レプリコン細胞を９６ウェルプレートに、１ウェル当たり細胞５×１０３個の密度で、Ｇ−４１８を除いたＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地１００μＬ中に播種した。化合物を１００％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）中で１：３で連続希釈した。これらの連続希釈物を細胞に１：２００希釈で加えて、０．５％ＤＭＳＯの最終濃度を、２００μＬの全体積で達成した。プレートを３７℃で３日間インキュベートし、その後、培地を除去し、細胞を溶解させ、市販のルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。薬物処理された試料でのＨＣＶ複製レベルを未処理の対照（１００％と定義）での値に対する百分率として表し、ＸＬＦｉｔ４ ソフトウェア（ＩＤＢＳ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を使用して、データをロジスティック用量反応式ｙ＝ａ／（１＋（ｘ／ｂ）ｃ）に当てはめた。以前に記載されたとおりに、ＥＣ５０値を、得られた式から算出した。
抗ウイルス組合せ研究
レプリコン細胞を９６ウェルプレートに、１ウェル当たり細胞５×１０３個の密度で、Ｇ−４１８を除いた培地１００μＬ中に播種した。化合物３および他の化合物を１００％ＤＭＳＯ中で上記のとおりに連続希釈し、９６ウェルプレートにマトリックス様式で加え、２００μＬの最終体積および０．５％の最終ＤＭＳＯ濃度中に種々の薬物濃度および比を有する定義されたセットを達成した。それぞれ個々の薬物について（リバビリンは除外）、ＥＣ５０値を、試験される濃度範囲の中点として選択した。選択的抗ウイルス効果を有さなかったリバビリンでは、６．２μＭの最高用量を選択したが、それというのも、これが、細胞毒性が観察され始めた濃度より約３倍低いものであったためである。細胞を薬物と共に３日間インキュベートし、上記に示されているとおりにルシフェラーゼ発現について分析した。それぞれの組合せ研究について、２つの独立した実験を３回繰り返して行った。
組み合わせデータ分析
ＰｒｉｃｈａｒｄおよびＳｈｉｐｍａｎによって開発されたＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ ＩＩプログラムを使用して、データを分析した。そのソフトウェアは理論阻害を算出して、薬物間の相加的相互作用を推測し（Ｂｌｉｓｓ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅモデルに基づく）、理論阻害値と観察された阻害値との間の統計的に有意差を定量化する。三次元でこれらの差違をプロットすると、Ｚ面での上昇が化合物間の抗ウイルス相乗作用を表し、低下が抗ウイルス拮抗作用を表す表面が生じる。表面偏差の算出ボリュームは、ｎＭ２％で表される。ＰｒｉｃｈａｒｄおよびＳｈｉｐｍａｎによると、組合せ効果は次のとおりに定義される：
・ ボリュームが１００ｎＭ２超であれば、強い相乗作用；この量の相乗作用がおそらくインビボでは重要である
・ ボリュームが５０ｎＭ２超および１００ｎＭ２以下であれば、中等度の相乗作用；こ
の量の相乗作用がインビボでは重要であり得る
・ ボリュームが２５ｎＭ２超および５０ｎＭ２未満であれば、弱い相乗作用
・ ボリュームが−２５ｎＭ２超および２５ｎＭ２以下であれば、相加作用
・ ボリュームが−２５ｎＭ２未満および−５０ｎＭ２超であれば、弱い拮抗作用
・ ボリュームが−１００ｎＭ２超および−５０ｎＭ２以下であれば、中等度の拮抗作用；この量の拮抗作用がインビボでは重要であり得る
・ ボリュームが−１００ｎＭ２以下であれば、強い拮抗作用；この量の拮抗作用がおそらくインビボでは重要である。
結果
Ｈｕｈ−ｌｕｃレプリコン細胞における個々の化合物についてのＥＣ５０値
組合せ実験を開始する前に、Ｈｕｈ−ｌｕｃレプリコン細胞におけるＥＣ５０値を、表ＩＶに示されているとおりにそれぞれの化合物について決定した。細胞毒性を示し始めている濃度まで抗ウイルス活性を有さなかったリバビリンを除いて、全ての化合物が抗ウイルス効果を有した。
組合せの抗ウイルス効果および薬物相互作用
ＩＦＮ−α、リバビリンおよび化合物１と組み合わせた場合の化合物３の抗ウイルス効果をアッセイした。相加作用からの有意な偏差を表す表面プロットをもたらすＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ ＩＩを使用して、得られたデータを分析した。相加作用からの統計的に有意な偏差の定量化によって、化合物３とＩＦＮ−αとの組合せが弱い相乗作用をもたらすことが示された（それぞれ３２および３６．５ｎＭ２の相乗作用ボリューム；表Ｖ）。化合物３と非ヌクレオシドＮＳ５Ｂインヒビターの化合物１との組合せは、相加的抗ウイルス相互作用を示す１４．５ｎＭ２の相乗作用ボリュームをもたらした。表Ｖに示されているとおり、化合物のいずれも、化合物３と組み合わせた場合に、相加範囲外（−２５ｎＭ２超）の抗ウイルス拮抗作用ボリュームをもたらさなかった。
これらのインビトロ抗ウイルス組合せ実験は、新規なＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼインヒビターの化合物３が、ＩＦＮ−αと組み合わせた場合には弱い相乗作用を、リバビリンと組み合わせた場合には中等度の相乗作用を有することを示している。これらの結果は、個々の薬物のいずれの有効性も減少させることなくウイルス負荷抑制の増大を達成するために、ＨＣＶ患者における現行の標準治療（ＰＥＧ−ＩＦＮ−αおよびリバビリン）と組合せて、化合物３が使用される可能性が潜在的にあることを示唆している。化合物３と非ヌクレオシド（化合物１）ＮＳ５Ｂポリメラーゼインヒビターとの組合せは、相加作用をもたらした。これらの結果は、化合物３が他にも、複数の群の特異的ＨＣＶインヒビターからなる薬物組合せを患者において探るのにも適し得ることを示している。
生物学的実施例３：化合物４の組合せ
材料および方法
抗ＨＣＶ剤
化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５および化合物６は、Ｇｉｌｅａｄ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）が合成した。ピュロマイシン、ＩＦＮ−αおよびリバビリンはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。カルセインＡＭはＡｎａｓｐｅｃ（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）から購入した。
細胞系および細胞培地
この研究で使用されるＨＣＶ遺伝子型１ａ型レプリコン細胞系は、以前に記載されている。細胞を、１０％ ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、Ｃａｔ＃ＳＨ３００７１．０３）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、Ｃａｔ＃１５１４０−１２２）および０．１ｍＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、Ｃａｔ＃１１１４０−０５０）が補充されている、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、Ｃａｔ＃１０５６９−０４４）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含有する細胞培地中で成長させた。レプリコン細胞を０．５ｍｇ／ｍＬのジェネティシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、Ｃａｔ＃１０１３１−０３５）中に維持して、ＨＣＶレプリコンの喪失を防いだ。集密に達する前に、細胞を３〜４日毎に継代した。
ＥＣ５０、ＣＣ５０決定および組合せ研究のためのＨＣＶレプリコンアッセイ
製造者（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、Ｃａｔ＃Ｉ４２７６）が定めた緩衝液中に供給されているＩＦＮ−αを除いて、全ての化合物を１００％ＤＭＳＯに供給した。セクション３．２に記載されている細胞培地中で連続的に希釈されるＩＦＮ−αを除いて、化合物の連続希釈を１００％ＤＭＳＯ中で行った。Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを使用して、全ての連続希釈を３８４ウェルポリプロピレンプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＨ、Ｃａｔ＃４３４１）で行った。ＥＣ５０およびＣＣ５０の決定については、試験化合物を、３８４ウェルプレートのカラム３〜２０で１：３希釈の１０のステップで連続希釈した。組合せ研究のために、水平方向へ１：２希釈の９つのステップで化合物１種を連続希釈し、その際、他の化合物は、垂直方向へ１：２希釈の７つのステップで連続希釈した。これによって、種々の薬物濃度および比からなる定義されたセットが達成された。それぞれ個々の薬物のために、ＥＣ５０値を、試験される濃度範囲の中点として選択した。全ての連続希釈を、同じ３８４ウェルプレート内の化合物１種当たり４回反復して行った。１００％ＤＭＳＯをそれぞれの連続希釈３８４−ウェルプレートのカラム１〜２に加えた。１００μＭでのＨＣＶプロテアーゼインヒビターＩＴＭＮ−１９１をカラム２３に、ＨＣＶ複製の１００％阻害の対照として加える一方で、１０ｍＭのピュロマイシンをカラム２４に、１００％細胞毒性の対照として加えた。
Ｂｉｏｔｅｋ μＦｌｏｗ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを用いて、黒色ポリスチレン３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−ｏｎｅ、Ｍｏｎｒｏｅ、ＮＣ、Ｃａｔ＃７８１０８６、細胞培養処理済み）の各ウェルに、２０００個の懸濁ＨＣＶレプリコン細胞を含有する細胞培地（ジェネティシン不含）９０μＬを加えた。細胞培養プレートに化合物を移すために、Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎで、化合物連続希釈プレートからの化合物溶液０．４μＬを細胞培養プレートに移した。最終アッセイウェル中のＤＭＳＯ濃度は０．４４％であった。プレートを３７℃、５％ＣＯ２および湿度８５％で３日間インキュベートした。
ＨＣＶレプリコンアッセイは、同じウェルから細胞毒性および抗レプリコン活性の両方を評価することができるマルチプレックスアッセイであった。ＣＣ５０アッセイを初めに行った。Ｂｉｏｔｅｋ ＥＬＸ４０５プレート洗浄機を使用して、３８４ウェル細胞培養プレート中の培地を吸引し、ウェルをそれぞれ１×ＰＢＳ１００μＬで４回洗浄した。Ｂｉｏｔｅｋ μＦｌｏｗ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを用いて、１×ＰＢＳ中４００ｎＭのカルセインＡＭ（Ａｎａｓｐｅｃ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、Ｃａｔ＃２５２００−０５６）を含有する溶液の５０μＬ体積をプレートの各ウェルに加えた。プレートを室温で３０分間インキュベートし、その後、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを用いて、蛍光シグナル（励起４９０ｎｍ、発光５２０ｎｍ）を測定した。
ＥＣ５０アッセイを、ＣＣ５０アッセイと同じウェルで行った。Ｂｉｏｔｅｋ ＥＬＸ４０５プレート洗浄機を用いて、３８４ウェル細胞培養プレート中のカルセイン−ＰＢＳ溶液を吸引した。Ｂｉｏｔｅｋ μＦｌｏｗ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを用いて、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、Ｃａｔ＃Ｅ２９８Ｂ）の２０μＬ体積を、プレートの各ウェルに加えた。プレートを室温で１０分間インキュベートした。次いで、Ｂｉｏｔｅｋ μＦｌｏｗ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを用いて、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ Ｓｔｏｐ ＆ Ｇｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、Ｃａｔ＃Ｅ３１３Ｂ）およびＤｕａｌ−Ｇｌｏ Ｓｔｏｐ ＆ Ｇｌｏ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、Ｃａｔ＃Ｅ３１４Ｂ）の１：１００混合物を含有する溶液の２０μＬ体積をプレートの各ウェルに加えた。次いで、プレートを室温で１０分間インキュベートし、その後、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを用いて、ルミネセンスシグナルを測定した。
データ分析
蛍光生成物へのカルセインＡＭの変換によって、細胞毒性効果を決定した。細胞毒性パーセントを式１によって算出した：
［式中、Ｘｃは、化合物処理されたウェルからの蛍光シグナルであり；ＭＢは、ピュロマイシン処理されたウェルからの平均蛍光シグナルであり；ＭＤはＤＭＳＯ処理されたウェルからの平均蛍光シグナルである］。ＨＣＶレプリコンのレポーターｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼから生じたルミネセンスシグナルによって、抗ＨＣＶ複製活性を決定した。Ｘｃが化合物処理されたウェルからのルミネセンスシグナルであり；ＭＢがＩＴＭＮ−１９１処理されたウェルからの平均ルミネセンスシグナルであり；ＭＤがＤＭＳＯ処理されたウェルからの平均ルミネセンスシグナルである式１を使用して、ＨＣＶレプリコンでの阻害パーセントを算出した。
細胞生存率の５０％低減をもたらす試験化合物濃度として、ＣＣ５０値を決定した。ＨＣＶ複製の５０％低減をもたらす試験化合物濃度として、ＥＣ５０値を決定した。Ｐｉｐｅｌｉｎｅ Ｐｉｌｏｔ ５．０ソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、実験データを式２に非線形回帰フィッティングさせることによって、ＣＣ５０値およびＥＣ５０値の両方を得た：
［式中、ｙは、ｘ濃度の化合物で観察されたＨＣＶレプリコンの阻害％であり；ｄは、０の化合物濃度での推定応答であり；ａは、無限化合物濃度での推定応答であり；ｃは、中点濃度（ＣＣ５０またはＥＣ５０）であり；ｂは、Ｈｉｌｌ傾斜因子である］。
ＰｒｉｃｈａｒｄおよびＳｈｉｐｍａｎによって開発されたＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ ＩＩプログラムを使用して組合せ研究実験データを分析した。ソフトウェア（ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ（商標）ＩＩ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ、ＭＩ）は、理論阻害を算出して、薬物間の相加的相互作用を推測し（Ｂｌｉｓｓ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅモデルに基づく）、理論阻害値と観察された阻害値との間の統計的に有意差を定量化する。三次元でこれらの差違をプロットすると、Ｚ面での上昇が化合物間の抗ウイルス相乗作用を表し、低下が化合物間の抗ウイルス拮抗作用を表す表面が生じる。表面偏差の算出ボリュームは、ｎＭ２％で表される。ＰｒｉｃｈａｒｄおよびＳｈｉｐｍａｎによると、組合せ効果は次のとおりに定義される：
・ 強い相乗作用： １００ｎＭ２％超
・ 中等度の相乗作用： ５０ｎＭ２％超および１００ｎＭ２％以下
・ 弱い相乗作用： ２５ｎＭ２％超および５０ｎＭ２％以下
・ 相加作用： ２５ｎＭ２％以下および−２５ｎＭ２％超
・ 弱い拮抗作用： −２５ｎＭ２％以下および−５０ｎＭ２％超
・ 中等度の拮抗作用： −５０ｎＭ２％以下および−１００ｎＭ２％超
・ 強い拮抗作用： −１００ｎＭ２％以下
それぞれの組合せ研究について、３つの独立した実験を、それぞれの実験において４回反復して行った。
結果
ＨＣＶ遺伝子型１ａ型レプリコンアッセイにおける個々の化合物の抗ウイルス活性および細胞毒性
化合物４および他の化合物の抗ＨＣＶ活性および細胞毒性を、ＨＣＶ遺伝子型１ａ型レプリコンを有するＨｕｈ−７細胞で試験した。ＥＣ５０値およびＣＣ５０値を表ＶＩに列挙する。有意な細胞毒性は全ての化合物について、試験された最高濃度まで観察されなかった。
他の群の抗ＨＣＶ剤と組み合わせた化合物４の抗ウイルス活性および細胞毒性
ＨＣＶ遺伝子型１ａ型レプリコンを使用して、他の抗ＨＣＶ化合物と組み合わせた化合物４の抗ウイルス効果を評価した。相加作用からの有意な偏差を表す表面プロットをもたらすＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ ＩＩを使用して、結果を分析した。相加性表面からの偏差から算出される相乗作用ボリュームおよび拮抗作用ボリューム（ｎＭ２％）を表ＶＩＩにまとめる。９５％の信頼区間で、平均相乗作用ボリュームおよび平均拮抗作用ボリュームは、化合物４をＩＦＮ−α、化合物２および化合物６と組み合わせた場合、２５から−２５ｎＭ２％の間であり、このことは、それらの化合物との相加的相互作用を示している。さらに、化合物４は、化合物１、化合物５または化合物３と組み合わせた場合、２５から５０ｎＭ２％の範囲の相乗作用ボリュームを示し、このことは、弱い相乗的相互作用を示唆している。
全ての組み合わせ研究において、細胞生存率は、全ての濃度比で８５％超であり、全ての薬物組合せは、表ＶＩＩＩに示されているとおりの細胞毒性に対して相加的効果を示している。
しかしながら、化合物４は、リバビリンと組み合わせた場合、−４３ｎＭ２％の拮抗作用ボリュームを示し、このことは、弱いアンタゴニスト相互作用を示唆している。
化合物４と共に最も高い拮抗作用を示すリバビリン濃度は、約０．５から１μＭであり、これは、８００ｍｇ／日の用量でヒトで観察されるリバビリンの定常状態血漿濃度（６〜１１μＭ）よりも約１０倍低い。リバビリン（６〜１１μＭ）のこの生理学的濃度では、リバビリンと化合物４とのアンタゴニスト相互作用は、広範な化合物４濃度範囲（０〜０．４４μＭ）にわたって最小である。したがって、インビトロレプリコンシステムにおいてリバビリンと化合物４との間で観察された軽度の拮抗作用は、臨床的重要性を有しそうにない。
結論
化合物４（ジアステレオ異性体混合物における）の抗ウイルス活性を、現行の標準治療（ＩＦＮ−α／リバビリン）、さらにはＧｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの内部開発候補化合物１および化合物５（非ヌクレオシドＮＳ５Ｂインヒビター）、化合物２および化合物３（ＮＳ３プロテアーゼインヒビター）および化合物６（ＮＳ５Ａインヒビター）と組み合わせて試験した。表ＶＩＩＩにまとめたとおり、化合物４は、ＩＦＮ−α、化合物２および化合物６と組み合わせると相加的抗ウイルス活性を示し、化合物１、化合物５および化合物３とでは弱い相乗作用を示した。
化合物４とリバビリンとの組合せは、０．５から１μＭの間のリバビリン濃度で弱い拮抗作用をもたらし、これは、ヒト血漿中での定常状態生理学的濃度（６〜１１μＭ）のよりも約１０倍低い。臨床的に適切なリバビリン濃度では、２種の化合物間でのアンタゴニスト相互作用は、些少なものとなった。
生物学的実施例４：化合物５の組合せ
化合物５の抗ウイルス活性をＧＴ−１ｂ Ｈｕｈ−ｌｕｎｅｔ細胞（化合物４についてのアッセイにおけるのと実質的に同じ方法を使用）で、内部開発化合物の化合物１、化合物２および化合物３（ＮＳ３プロテアーゼインヒビター）、化合物６（ＮＳ５Ａインヒビター）、化合物４（Ｃ−ｎｕｃ ＮＳ５Ｂインヒビター）、他にも認可されているＨＣＶ治療剤であるＰＥＧ−ＩＦＮ−αおよびリバビリンと組み合わせて試験した。ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ ＩＩソフトウェアを使用して、組合せデータをＢｌｉｓｓ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅモデルに基づき分析した。組合せアッセイの結果を、３回繰り返して行われた２つの独立した実験から９５％の信頼度で算出された平均相乗作用ボリュームおよび平均拮抗作用ボリューム（ｎＭ２）として表した。組合せ効果は次のとおりに定義される：
・ ボリュームが１００ｎＭ２超であれば、強い相乗作用；この量の相乗作用がインビボではおそらく重要である
・ ボリュームが５０ｎＭ２超および１００ｎＭ２以下であれば、中等度の相乗作用；この量の相乗作用がインビボでは重要であり得る
・ ボリュームが２５ｎＭ２超および５０ｎＭ２未満であれば、弱い相乗作用
・ ボリュームが−２５ｎＭ２超および２５ｎＭ２以下であれば、相加作用
・ ボリュームが−２５ｎＭ２未満および−５０ｎＭ２超であれば、弱い拮抗作用
・ ボリュームが−１００ｎＭ２超および−５０ｎＭ２以下であれば、中等度の拮抗作用；この量の拮抗作用がインビボでは重要であり得る
・ ボリュームが−１００ｎＭ２以下であれば、強い拮抗作用；この量の拮抗作用がインビボではおそらく重要である。
アロステリックＮＳ５Ｂインヒビターである化合物１および化合物５の組合せは、レプリコンアッセイにおいて中等度の相乗作用をもたらした。ＰＥＧ−ＩＦＮ−αおよびリバビリンを包含する他のＨＣＶインヒビターとの研究によって、相加的から弱い相乗的相互作用が明らかになった。
生物学的実施例５：化合物６の組合せ
材料および方法
化合物
化合物１、化合物２、化合物３、化合物６および化合物７は、Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）が合成した。ＩＦＮ−αおよびリバビリンはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。
細胞系
ＨＣＶ遺伝子型１ｂ型レプリコン細胞（Ｈｕｈ−ｌｕｃ）をＲｅｂｌｉｋｏｎ（Ｍａｉｎｚ、ドイツ）から得た。これらの細胞におけるレプリコンはＩ３８９ｌｕｃ−ｕｂｉ−ｎｅｏ／ＮＳ３−３’／ＥＴと称され、選択的耐性マーカー（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）、さらにホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードする。Ｈｕｈ−ｌｕｃ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、１× ペニシリン／ストレプトマイシン、１× 非必須アミノ酸および０．５ｍｇ／ｍＬのＧ−４１８（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が補充されているダルベッコ変法イーグル培地 ＧｌｕｔａＭａｘ（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で維持した。細胞を週に２回継代し、サブコンフルエントレベルで維持した。
アッセイ
ＨＣＶ Ｈｕｈ−ｌｕｃレプリコン細胞での抗ウイルス活性アッセイ
レプリコン細胞を、９６ウェルプレートに、１ウェル当たり細胞７×１０３個の密度で、Ｇ−４１８を除いたＤＭＥＭ培地１００μＬ中に播種した。化合物を１００％ＤＭＳＯ中で１：２で連続希釈した。連続希釈物を細胞に１：２００希釈で加えて、０．５％ＤＭＳＯの最終濃度を２００μＬの全体積で達成した。プレートを３７℃で３日間インキュベートし、その後、培地を除去し、細胞を溶解させ、市販のルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。
抗ウイルス組合せ研究
レプリコン細胞を９６ウェルプレートに、１ウェル当たり細胞７×１０３個の密度で、Ｇ−４１８を除いた培地１００μＬに播種した。化合物６および他の化合物を１００％ＤＭＳＯ中で１：２で連続希釈し、９６ウェルプレートにマトリックス様式で加え、２００μＬの最終体積および０．５％の最終ＤＭＳＯ濃度中に種々の薬物濃度および比を有する定義されたセットを達成した。それぞれ個々の薬物について、ＥＣ５０値を、試験される濃度範囲の中点として選択した。細胞を３日間インキュベートし、市販のルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ルシフェラーゼ発現について分析した。それぞれの組合せ研究のために、２つの独立した実験を３回繰り返して行った。
細胞での細胞毒性決定
レプリコン細胞を播種し、上記の抗ウイルス組合せ研究について記載されたとおりに薬物で処理した。３７℃での３日間のインキュベーションの後に、培地を除去し、細胞を溶解させ、製造者の指示に従って、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ
Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、細胞毒性についてアッセイした。相対光単位を、未処理の対照（１００％と定義）に対する百分率に変換した。
データ分析
ＥＣ５０算出
ＥＣ５０アッセイに続いて、薬物処理された試料でのルシフェラーゼレベルを、未処理の対照でのレベル（１００％と定義）に対する百分率として表した。ＸＬｆｉｔ ４ソフトウェア（ＩＤＢＳ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を使用して、ＥＣ５０値を、反復データセットの非線形回帰分析によって算出した。
抗ウイルス相乗作用および拮抗作用の算出
組合せアッセイに続いて、薬物処理された試料でのルシフェラーゼレベルを、未処理の対照でのレベル（１００％と定義）に対する百分率として表した。次いで、ＰｒｉｃｈａｒｄおよびＳｈｉｐｍａｎによって開発されたＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ ＩＩプログラムを使用して、反復データセットを分析した。ソフトウェア（ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ（商標）ＩＩ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ、ＭＩ）は、理論阻害を算出して、薬物間の相加的相互作用を推測し（Ｂｌｉｓｓ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅモデルに基づく）、理論阻害値と観察された阻害値との間の統計的に有意差を定量化する。三次元でこれらの差違をプロットすると、Ｚ面での上昇が化合物間の抗ウイルス相乗作用を表し、低下が化合物間の抗ウイルス拮抗作用を表す表面が生じる。表面偏差の算出ボリュームは、ｎＭ２％で表される。ＰｒｉｃｈａｒｄおよびＳｈｉｐｍａｎによると、組合せ効果は次のとおりに定義される：
・ ボリュームが１００ｎＭ２超であれば、強い相乗作用；この量の相乗作用がインビボではおそらく重要である
・ ボリュームが５０ｎＭ２超および１００ｎＭ２以下であれば、中等度の相乗作用；この量の相乗作用がインビボでは重要であり得る
・ ボリュームが２５ｎＭ２超および５０ｎＭ２未満であれば、弱い相乗作用
・ ボリュームが−２５ｎＭ２超および２５ｎＭ２以下であれば、相加作用
・ ボリュームが−２５ｎＭ２未満および−５０ｎＭ２超であれば、弱い拮抗作用
・ ボリュームが−１００ｎＭ２超および−５０ｎＭ２以下であれば、中等度の拮抗作用；この量の拮抗作用がインビボでは重要であり得る
・ ボリュームが−１００ｎＭ２以下であれば、強い拮抗作用；この量の拮抗作用がインビボではおそらく重要である。
結果
Ｈｕｈ−ｌｕｃレプリコン細胞における個々の化合物の抗ウイルス活性
組合せ実験を開始する前に、個々の化合物の抗ウイルス活性を、Ｈｕｈ−ｌｕｃレプリコン細胞において決定した。背景結果と一致するＥＣ５０値が、７種全ての化合物で観察された。
組合せの抗ウイルス効果および薬物相互作用
ＨＣＶ１ｂ型レプリコンシステムを使用して、他のＨＣＶインヒビターと組み合わせた場合の化合物６の抗ウイルス効果を評価した。相加作用からの有意な偏差を示す表面プロットをもたらすＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ ＩＩを使用して、得られたデータを分析した。２つの独立した実験からの相加作用からの統計的に有意な偏差の定量化を表ＸＩＩにまとめる。化合物６とＩＦＮ−αまたは化合物１との組合せは、弱い相乗作用を示しているそれぞれ３２および３４ｎＭ２の相乗作用ボリュームをもたらした。リバビリン、化合物２および化合物７は、それぞれ化合物６と組み合わせた場合に、６１、５２および５１の相乗作用ボリュームを与え、これは、化合物６とこれら３種のＨＣＶインヒビターとの間の中等度の相乗的相互作用を示している。化合物６と化合物３との組合せは、強度に相乗的な抗ウイルス相互作用を表す１３２ｎＭ２％の相乗作用ボリュームをもたらした。いずれの化合物も、化合物６と組み合わせた場合には、相加的範囲（−２５ｎＭ超）外の抗ウイルス拮抗作用ボリュームを与えなかった。
他のＨＣＶインヒビターと組み合わされた化合物６での細胞生存百分率
抗ウイルス組合せ結果が組合せ細胞毒性によって混乱しないことを保証するために、抗ウイルスアッセイで試験されたのと同じ化合物濃度を使用して、細胞毒性を並行して調査した（表ＸＩＩＩ）。全ての化合物で、細胞生存率は、試験された最高濃度での組合せについて、未処理の対照に対して少なくとも９８％であった。したがって、化合物６を単独でか、またはこれらの作用物質（ａｇｅｎｔ）と組み合わせて試験しても、有意なインビトロ細胞毒性は観察されなかった。
結論
これらのインビトロ実験の結果は、ＩＦＮ−αまたは非ヌクレオシドＮＳ５Ｂポリメラーゼインヒビターの化合物１と組み合わせた場合に、化合物６が弱い抗ウイルス相乗作用を有することを示している。化合物６とリバビリン、ＮＳ３プロテアーゼインヒビターの化合物２またはヌクレオシドＮＳ５Ｂポリメラーゼインヒビターの化合物７との組合せは、中等度の抗ウイルス相乗作用をもたらした。強い抗ウイルス相乗作用は、化合物６とＮＳ３プロテアーゼインヒビターの化合物３との間で観察された。これらの薬物組合せを試験している間に、有意なインビトロ細胞毒性は同定されなかった。これらの結果は、化合物６を、現行の標準治療と合理的に組み合わせることができることを示唆している。
生物学的実施例６：
化合物
化合物１、化合物３、化合物４および化合物６は、Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）が合成した。
細胞系
ＨＣＶ遺伝子型１ｂ型レプリコン細胞（Ｈｕｈ−ｌｕｃ）をＲｅｂｌｉｋｏｎ（Ｍａｉｎｚ、ドイツ）から得た。これらの細胞におけるレプリコンはＩ３８９ｌｕｃ−ｕｂｉ−ｎｅｏ／ＮＳ３−３’／ＥＴと称され、選択的耐性マーカー（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）、さらにホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードする。Ｈｕｈ−ｌｕｃ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、１× ペニシリン／ストレプトマイシン、１× 非必須アミノ酸および０．５ｍｇ／ｍＬのＧ−４１８（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が補充されているダルベッコ変法イーグル培地 ＧｌｕｔａＭａｘ（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で維持した。細胞を週に２回継代し、サブコンフルエントレベルで維持した。
アッセイ
６日間の処理にわたって、１〜１．５ｌｏｇほどレプリコンＲＮＡを抑制するのに必要な化合物濃度の決定
遺伝子型１ｂ型レプリコン細胞をＴ−７５フラスコに、細胞２．５×１０５個／フラスコの細胞密度でＧ４１８を除いて播種した。化合物を個々に、多様な濃度で細胞に加えた：化合物６を１ｐＭ、２ｐＭ、４ｐＭ、６ｐＭ、８ｐＭまたは１２ｐＭのいずれかの濃度で加え、化合物４を１２５ｎＭ、２５０ｎＭ、３７５ｎＭ、５００ｎＭまたは１０００ｎＭで加え、化合物１を１．２５ｎＭ、２．５ｎＭ、５ｎＭ、２．７５ｎＭまたは１０ｎＭで加え、化合物３を３．７５ｎＭ、７．５ｎＭ、１１．２５ｎＭ、１５ｎＭ、３０ｎＭまたは６０ｎＭの濃度で加えた。フラスコを３７℃でインキュベートし、培地および化合物を２日毎に新しくした。６日間のインキュベーションの後に、レプリコン細胞をＲＮＡ抽出およびレプリコンＲＮＡ ＱＲＴ−ＰＣＲ分析のために収集した。
化合物の組合せによるレプリコンのキュア（ｃｕｒｅ）アッセイ
遺伝子型１ｂ型レプリコン細胞をＴ−７５フラスコに、細胞２．５×１０５個／フラスコの密度で播種した。化合物をＴ−７５フラスコに、次の濃度で加えた：化合物６は４ｐＭで、化合物４は１０００ｎＭで、化合物１は１０ｎＭで、かつ化合物３は２６．２５ｎＭで。フラスコを３７℃でインキュベートし、化合物および培地を２日毎に新しくした。全ての実験を２回繰り返して行い、フラスコ１およびフラスコ２として示す。６日目に、全ての細胞をフラスコ１から、ＲＮＡ抽出、続くＨＣＶレプリコン特異的ＱＲＴ−ＰＣＲ分析のために収集し、フラスコ２からの細胞を、Ｇ４１８の存在下の１０ｃｍ組織培養ディッシュに蒔いて、１４日間、キュアされなかったレプリコン細胞のコロニー形成を記録した。
ＱＲＴ−ＰＣＲアッセイ
製造者のプロトコルに従って、ＲｉｂｏＰｕｒｅキット（ＡＭ１９２４ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で、全ＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡ試料を、使用するまで−８０℃で貯蔵した。定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイのために、製造者のプロトコルに従って（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）、Ｑｉａｇｅｎ Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＱＲＴ−ＰＣＲキットを使用した。遺伝子型１ｂ型ＨＣＶ ＮＳ３遺伝子特異的プライマーである、フォワードプライマーＮＳ３＿１８０ＦＬ ５’−ＣＧＧＣＧＧＡＣＴＧＴＣＴＡＴＣＡＴＧＧＴＧＣ［ＦＡＭ］Ｇ−’３およびリバースＮＳ３＿１８０ ５’− ＧＧＴＣＣＴＧＧＴＣＣＡＣＡＴＴＧＧＴＧＴ−’３および１８Ｓ ｒＲＮＡ ＬＵＸ（商標）［ＦＡＭ］内在性コントロールプライマーセット（１１５ＨＭ−０１）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が作製した。リバーストランスクリプターゼステップのために、反応物を４４℃で３０分間インキュベートし、次いで、リバーストランスクリプターゼ酵素を、試料を９４℃に１０分間加熱することによって分解した。Ｑ−ＰＣＲステップは、９４℃で１５秒間および５８℃で３０秒間の３８サイクルを含んだ。
結果
組合せによるレプリコンのキュア実験を開始する前に、１〜１．５ｌｏｇほど遺伝子型１ｂ型レプリコンＲＮＡを抑制するのに必要な化合物濃度を、化合物６、化合物４、化合物１および化合物３について決定した。レプリコンＲＮＡのｌｏｇ低下は、６日間維持された、ＤＭＳＯ対照処理されたレプリコン細胞におけるＲＮＡレベルに対してのものである。
組合せによる遺伝子型１ｂ型レプリコンのキュアアッセイ
化合物６、化合物４、化合物１および化合物３の化合物によるレプリコンＲＮＡ抑制を６日のアッセイにおいて、個々の化合物として、および様々な２つ、３つおよび４つの組合せ物で決定した。レプリコンＲＮＡのｌｏｇ低下は、処理フラスコと並んで６日間維持された、ＤＭＳＯ対照処理されたレプリコン細胞におけるＲＮＡレベルに対してのものである。ＨＣＶレプリコンからの細胞をキュアするための様々な化合物の組合せの能力を、コロニー形成によって決定した。化合物処理を除いた後に、コロニー形成が生じ、Ｇ４１８の圧迫が１４日間再発した。ある化合物の組合せがＨＣＶレプリコンからの細胞集団を完全にキュアするならば、細胞がＧ４１８に対する耐性を欠いているので、コロニーは発生しない。
結論
これらのインビトロ実験の結果は、２種の化合物の組合せは、６日の処理にわたってウイルスＲＮＡのｌｏｇ低下を増大させ、キュアされたレプリコン細胞の率を増大させることを示している。化合物６と化合物４または化合物３との二重の組合せによって、他の全ての二重の化合物の組合せと比較してより大きなレプリコンＲＮＡのｌｏｇ抑制と、最も少ない数のキュアされなかったコロニーとが結果として生じる。３種または４種の化合物の組合せは、全てのレプリコン細胞をキュアし、それらの組合せ処理は、レプリコンＲＮＡレベルをアッセイ検出限界まで抑制する。
生物学的実施例７：化合物１０および化合物６交差耐性
この研究は、化合物１０および化合物６のインビトロ交差耐性プロファイルを決定するために行われた。化合物１０または化合物６に感受性低下をもたらす変異間に交差耐性が存在するかどうかを決定するために、一過性レプリコンアッセイ（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｒｅｐｌｉｃｏｎ ａｓｓａｙ）を介して、シグネチャＮＳ５ＢヌクレオシドＨＣＶ薬物耐性変異Ｓ２８２Ｔまたは最も一般的なインビトロおよびインビボＮＳ５Ａ ＨＣＶ薬物耐性変異を保有するＨＣＶ変異体レプリコンのパネルを調査した。化合物６に対して完全に感受性のままであるＳ２８２Ｔ変異体レプリコン、および化合物１０に対して感受性低下を示さないＮＳ５Ａ変異体と、これらの化合物間に交差耐性は観察されなかった。
材料および方法
試薬
化合物
化合物６および化合物１０をＦｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡのＧｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．で合成した。
細胞系
ＨＣＶ複製に高許容性であるＨｕｈ−７クローンのＨｕｈ−ｌｕｎｅｔを、ＲｅＢＬｉｋｏｎ ＧｍｂＨ（Ｍａｉｎｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。Ｈｕｈ−ｌｕｎｅｔ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）が補充されているダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＧＩＢＣＯ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で維持した。細胞を３７℃で加湿インキュベーター内（８５％湿度）および５％のＣＯ２雰囲気下で維持した。
Ｐｏｌｉｏ ＩＲＥＳの下流のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子、およびＥＭＣＶ ＩＲＥＳの下流の遺伝子型１ｂ（Ｃｏｎ−１株）ＨＣＶ非構造遺伝子（ＮＳ３−ＮＳ５Ｂ）をコードするバイシストロン性レプリコンのＰＩ−ｈＲｌｕｃを、一過性形質移入研究に使用した。遺伝子型１ｂ（Ｃｏｎ−１株）サブゲノムレプリコンをコードし、ＲｅＢＬｉｋｏｎ（Ｆｒｉｅｂｅら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００１年；７５巻（２４号）：１２０４７〜５７頁）から得たプラスミドｐＦＫＩ３４１ ＰＩ−Ｌｕｃ／ＮＳ３−３’／ＥＴから、プラスミドｐＰＩ−ｈＲｌｕｃを生じさせた。ｈＲｌｕｃ遺伝子は、ｐＦ９ ＣＭＶ ｈＲｌｕｃ−ｎｅｏ Ｆｌｅｘｉ（Ｒ）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ Ｓｕｐｅｒ Ｍｉｘ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）およびプライマーＰＶ＿Ｒｌｕｃ＿Ｔｏｐおよび３’−Ｒｌｕｃ（ＮｏｔＩ）を使用するＰＣＲによってＰＣＲ増幅させた。これらの２つのプライマーは以下の配列を有し、続くクローニングのための制限部位を持つ：
。Ｔ７プロモーター、５’ＵＴＲおよびＰｏｌｉｏ Ｖｉｒｕｓ ＩＲＥＳは、プラスミドｐＦＫＩ３４１ ＰＩ−Ｌｕｃ／ＮＳ３−３’／ＥＴから、プライマー５’−Ｐ７（ＳｂｆＩ）およびＰＶ＿Ｒｌｕｃ＿Ｂｏｔｔｏｍを使用してＰＣＲ増幅させた。これらの２つのプライマーは以下の配列を有し、続くクローニングのための制限部位を持つ：
。次いで、オーバーラップＰＣＲおよびプライマー５’−Ｐ７（ＳｂｆＩ）および３’−Ｒｌｕｃ（ＮｏｔＩ）を使用して、２つの上記反応からの続くＰＣＲフラグメントを連結させた。完成したＰ７−５’ＵＴＲ−Ｐｏｌｉｏ Ｖｉｒｕｓ ＩＲＥＳ−ｈＲｌｕｃ増幅生成物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにサブクローニングした。生じたプラスミドをＳｂｆＩおよびＮｏｔＩで消化し、切除フラグメント（Ｐ７−５’ＵＴＲ−Ｐｏｌｉｏ Ｖｉｒｕｓ ＩＲＥＳ−ｈＲｌｕｃ）を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、同じ酵素で消化されたｐＦＫＩ３４１ ＰＩ−Ｌｕｃ／ＮＳ３−３’／ＥＴにライゲーションした。プラスミドのＰ７５’ＵＴＲ−Ｐｏｌｉｏ Ｖｉｒｕｓ ＩＲＥＳ−ｈＲｌｕｃ領域の正確な配向および配列を確認するため、生じたベクターのｐＰＩ−ｈＲｌｕｃを配列決定した。
ｈＲｌｕｃを含有するＧＴ １ａおよび２ａ レプリコンは以前に記載されている（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｍ、Ｙａｎｇ Ｈ、Ｓｕｎ ＳＣ、Ｐｅｎｇ Ｂ、Ｔｉａｎ Ｙ、Ｐａｇｒａｔｉｓ Ｎ、ら、Ｎｏｖｅｌ ＨＣＶ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｒｅｐｌｉｃｏｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｅｎａｂｌｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｇａｉｎｓｔ Ｇｅｎｏｔｙｐｅ １ａ。Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ２０１０年。）
ＰＩ−ｈＲｌｕｃレプリコンをキメラ構築のための骨格として使用した。内部欠失がＮＳ５Ｂにおいて行われ、それに複製欠損を与えた。１ｂ−ｃｏｎ−１ ＮＳ５Ａの最後の４１３ベースペア（最後の１３７ ＮＳ５Ａアミノ酸をコードする）を、遺伝子型２ｂ、３ａ、４ａ、５ａおよび６ａからのＮＳ５Ｂ配列とフレームを合わせて合成した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｉｎｃ． Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）。これらの遺伝子型のそれぞれについてのコンセンサスＮＳ５Ｂ配列は、ヨーロッパＨＣＶデーターベースに寄託された配列を比較すること、およびコンセンサスを抽出することによって得た。ＮＳ５Ｂについてのこれらの新規コンセンサス配列、さらには個々の臨床分離株由来の配列（Ｈｅｒｌｉｈｙら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ２００８年；５２巻（１０号）：３５２３〜３１頁）を使用して、ＮＳ５Ｂキメラレプリコンを構築した。独特のＸｈｏＩ部位を５’末端に、および独特のＡｓｅＩ部位を３’末端に使用して、標準的分子生物学技術を介して１ｂ−ｈＲＬｕｃ／ＮｅｏＲ ＮＳ５Ｂベクターに方向性クローニングした。
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ変異誘発キットを製造者の指示（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）に従って使用して、ＮＳ５Ｂ Ｓ２８２Ｔ変異をレプリコンプラスミドに導入した。Ｓ２８２Ｔ変異の存在および任意の二次的部位変異の非存在を確認するため、完全に変異したレプリコンを配列決定した。
それぞれ５’および３’のＢｓｒＧＩならびにＥｃｏＲＩ部位に隣接した所望の変異を含有するＮＳ５Ａの最初の１４９アミノ酸をコードする配列を合成することによって、ＮＳ５Ａ変異体レプリコンを作製した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）。次いで、標準的分子生物学技術によって、独特のＢｓｒＧＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位へのクローニングを可能にするように改変された１ａ Ｒｌｕｃレプリコンプラスミドへと、合成されたフラグメントをクローン化した。変異をＤＮＡ配列決定によって確認した。
以下の酵素：Ｓｐｅ Ｉ（１ｂ ＰＩ−Ｒｌｕｃベースのレプリコン）、Ｈｐａ Ｉ（１ａ−Ｒｌｕｃベースのレプリコン）、およびＸｂａＩ／ＨｐａＩ（２ａ Ｒｌｕｃレプリコン）を使用して、レプリコンを直線化した。レプリコンＲＮＡをインビトロでレプリコンコードプラスミドから、Ｔ７ Ｒｉｂｏｍａｘインビトロ転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して転写し、続いてＲＮＡｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して精製した。
アッセイ
一過性形質移入レプリコンアッセイを使用する薬物感受性決定
Ｌｏｈｍａｎｎら（Ｌｏｈｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９年；２８５巻（５４２４号）：１１０〜３頁）の方法を使用して、ＲＮＡをＨｕｈ−ｌｕｎｅｔ細胞に形質移入した。簡単には、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄した。４×１０６細胞の４００μＬのＰＢＳ中の懸濁液を、５μｇのＲＮＡと混合し、９６０μＦおよび２７０Ｖの設定を使用する電気穿孔に供した。予備加温した培養培地４０ｍＬに細胞を移し、次いで９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレートに播種した。化合物を１００％ＤＭＳＯで３倍に連続希釈し、細胞に加えて、０．５％の最終ＤＭＳＯ濃度を達成した。細胞を３日間処理し、その後、培養培地を除去し、細胞を溶解し、市販の試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＶｉｃｔｏｒまたはＥｎｖｉｓｉｏｎ装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用してＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性を定量化した。
データ分析
データを未処理対照（１００％と定義）に対する百分率に変換し、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰｒｉｓｍソフトウェアまたはＰｉｐｅｌｉｎｅ Ｐｉｌｏｔを使用する２つの反復データセットの非線形回帰によってＥＣ５０値を算出した。耐性倍数変化を野生型レプリコンＥＣ５０に対する変異体の比として算出した。
結果
Ｓ２８２Ｔに対する化合物１０および化合物６の活性
化合物１０を用いる以前のインビトロ耐性選択は、ＮＳ５ＢにおけるＳ２８２Ｔを複数の遺伝子型（ＧＴ １ｂ、１ａおよび２ａ）における一次変異として一貫して同定した。続いて、全長のＧＴ１ａ、１ｂおよび２ａレプリコン、ならびにＧＴ１ｂ骨格にクローン化された２ｂ ＮＳ５Ｂ配列、３ａ ＮＳ５Ｂ配列または４ａ ＮＳ５Ｂ配列を含有するキメラレプリコンに、ＮＳ５Ｂ Ｓ２８２Ｔ変異を導入した。一過性の複製アッセイを使用して、化合物１０、化合物６、およびリバビリン（ＲＢＶ）に対する感受性を評価した。Ｓ２８２Ｔ変異は、全ての５種の遺伝子型にわたって、１１７．１ｎＭから３４６．１ｎＭを範囲とするＥＣ５０値を有して化合物１０に対する感受性低下を表した。Ｓ２８２ＴについてのＥＣ５０の倍数増加は、対応する遺伝子型由来の野生型と比較して２．４から１６．０の範囲であり、ＮＳ５Ｂ Ｓ２８２Ｔ変異が存在する場合の化合物１０に対するレプリコン感受性低下を証明した。
野生型レプリコンに関し、ＲＢＶについてのＥＣ５０値も試験した５種の遺伝子型にわたって同様であり、ＧＴ ２ｂに対するＥＣ５０が最も低くかった。興味深いことに、Ｓ２８２ＴレプリコンについてのＥＣ５０値は、ＲＢＶでの処置に対して、全ての５種の遺伝子型についてそれらの対応する野生型より５倍から１０倍高い感受性であった。野生型およびＳ２８２Ｔレプリコンの間で化合物６のＥＣ５０の有意な差異は観察されず、この変異は化合物６に対する感受性を変えることがないことを示した。結論として、Ｓ２８２Ｔレプリコンは化合物１０に対する感受性低下をもたらす一方で、該変異体レプリコンは、化合物６に対する野生型の感受性を証明し、ならびにＲＢＶによる阻害に対して野生型を超える感受性増大を証明した。
ＮＳ５Ａ変異体に対する化合物１０および化合物６の活性
ＮＳ５Ａ薬物耐性変異が化合物１０に対して交差耐性であるか決定するため、ＮＳ５Ａ変異体レプリコンのパネルを化合物６および化合物１０の両方に対する感受性についてアッセイした。全ての７種のＮＳ５Ａ変異体が化合物６に対する感受性低下を表し、ＥＣ５０の増加は２５倍から３０２９倍の範囲であった。対照的に、化合物１０またはＲＢＶ対照に対するＮＳ５Ａ変異体についてのＥＣ５０における有意なシフトは観察されなかった。
結論
化合物６および化合物１０にそれぞれ感受性低下を付与するＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂにおける公知の耐性変異をコードする一過性のＨＣＶレプリコンを使用して、この実施例において、化合物１０および化合物６の交差耐性プロファイルを評価した。ＮＳ５ＢＳ２８２Ｔレプリコンは化合物１０に感受性低下をもたらす一方で、野生型およびＳ２８２Ｔレプリコンから測定した化合物６のＥＣ５０に有意な差異はなかった。相反的に、化合物６に感受性低下をもたらす変異は、化合物１０での処置に感受性のままであった。
全体的に、これらの結果は、化合物１０および化合物６に対する耐性変異は交差耐性を証明しておらず、ＨＣＶの処置のための将来の併用療法におけるこれらの化合物の使用を支持している。
生物学的実施例８：組合せ活性
ＨＣＶ阻害薬の細胞ベースの抗ウイルス活性を評価するための、依然として標準であるインビトロレプリコンアッセイについて、化合物１０と、ＮＳ５Ａ阻害薬の化合物６、非ヌクレオシド阻害薬の化合物１もしくは化合物５、プロテアーゼ阻害薬の化合物３またはリバビリン（ＲＢＶ）との組合せ研究データを示す。これらの結果は、化合物６、化合物１、化合物５または化合物３と組み合わせる場合、化合物１０が相加的抗ウイルス活性を有することを示した。加えて、化合物１０は、ＲＢＶと組み合わせるとインビトロで弱い相乗作用を証明した。
材料および方法
細胞系および細胞培養
この研究で使用したＨＣＶ遺伝子型１ａレプリコン細胞系は以前に記載された（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｍ、Ｙａｎｇ Ｈ、Ｓｕｎ ＳＣ、Ｐｅｎｇ Ｂ、Ｔｉａｎ Ｙ、Ｐａｇｒａｔｉｓ Ｎ、ら、Ｎｏｖｅｌ ＨＣＶ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｒｅｐｌｉｃｏｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｅｎａｂｌｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｇａｉｎｓｔ Ｇｅｎｏｔｙｐｅ １ａ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ２０１０年）。細胞は、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、Ｃａｔ＃ＳＨ３００７１．０３）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、Ｃａｔ＃１５１４０−１２２）、および０．１ｍＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、Ｃａｔ＃１１１４０−０５０）が補充されている、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、Ｃａｔ＃１０５６９−０４４）を有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含有する細胞培養培地で成長させた。レプリコン細胞を０．５ｍｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、Ｃａｔ＃１０１３１−０３５）中で維持して、ＨＣＶレプリコンの喪失を防いだ。集密に達する前に、細胞を３〜４日毎に継代した
ＥＣ５０、ＣＣ５０決定および組合せ研究のためのＨＣＶレプリコンアッセイ
全ての化合物を１００％ＤＭＳＯで供給した。化合物の連続希釈を１００％ＤＭＳＯ中で行った。Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを使用して、全ての連続希釈を３８４ウェルポリプロピレンプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＨ、Ｃａｔ＃４３４１）で行った。ＥＣ５０およびＣＣ５０の決定については、試験化合物を、３８４ウェルプレートの列３〜２０で１：３希釈の１０のステップで連続希釈した。組合せ研究のために、１種の化合物を水平方向へ１：２希釈の９つのステップで連続希釈し、他の化合物は垂直方向へ１：２希釈の７つのステップで連続希釈した。これによって、種々の薬物濃度および比からなる定義されたセットが達成された。それぞれ個々の薬物について、ＥＣ５０値を、試験される濃度範囲の中点として選択した。全ての連続希釈を、同じ３８４ウェルプレート内の化合物１種当たり４回反復して行った。１００％ＤＭＳＯをそれぞれの連続希釈３８４−ウェルプレートの列１〜２に加えた。１００μＭのＨＣＶプロテアーゼインヒビターであるＩＴＭＮ−１９１を列２３に、ＨＣＶ複製の１００％阻害の対照として加える一方で、１０ｍＭのピュロマイシンを列２４に、１００％細胞毒性の対照として加えた。
Ｂｉｏｔｅｋ μＦｌｏｗ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを用いて、黒色ポリスチレン３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−ｏｎｅ、Ｍｏｎｒｏｅ、ＮＣ、Ｃａｔ＃７８１０８６、細胞培養処理済み）の各ウェルに、２０００個の懸濁ＨＣＶレプリコン細胞を含有する細胞培養培地（ジェネティシン不含）９０μＬを加えた。細胞培養プレートに化合物を移すために、Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎで、化合物連続希釈プレートからの化合物溶液０．４μＬを細胞培養プレートに移した。最終アッセイウェル中のＤＭＳＯ濃度は０．４４％であった。プレートを３７℃、５％ＣＯ２および湿度８５％で３日間インキュベートした。
ＨＣＶレプリコンアッセイは、同じウェルから細胞毒性および抗レプリコン活性の両方を評価することができるマルチプレックスアッセイであった。ＣＣ５０アッセイを初めに行った。Ｂｉｏｔｅｋ ＥＬＸ４０５プレート洗浄機を使用して、３８４ウェル細胞培養プレート中の培地を吸引し、ウェルをそれぞれ１００μＬの１×ＰＢＳで４回洗浄した。Ｂｉｏｔｅｋ μＦｌｏｗ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを用いて、１×ＰＢＳ中４００ｎＭのカルセインＡＭ（Ａｎａｓｐｅｃ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、Ｃａｔ＃２５２００−０５６）を含有する溶液の５０μＬ体積をプレートの各ウェルに加えた。プレートを室温で３０分間インキュベートし、その後、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを用いて、蛍光シグナル（励起４９０ｎｍ、発光５２０ｎｍ）を測定した。
ＥＣ５０アッセイを、ＣＣ５０アッセイと同じウェルで行った。Ｂｉｏｔｅｋ ＥＬＸ４０５プレート洗浄機を用いて、３８４ウェル細胞培養プレート中のカルセイン−ＰＢＳ溶液を吸引した。Ｂｉｏｔｅｋ μＦｌｏｗ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを用いて、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、Ｃａｔ＃Ｅ２９８Ｂ）の２０μＬ体積を、プレートの各ウェルに加えた。プレートを室温で１０分間インキュベートした。次いで、Ｂｉｏｔｅｋ μＦｌｏｗ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを用いて、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ Ｓｔｏｐ ＆ Ｇｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、Ｃａｔ＃Ｅ３１３Ｂ）およびＤｕａｌ−Ｇｌｏ Ｓｔｏｐ ＆ Ｇｌｏ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、Ｃａｔ＃Ｅ３１４Ｂ）の１：１００混合物を含有する溶液の２０μＬ体積をプレートの各ウェルに加えた。次いで、プレートを室温で１０分間インキュベートし、その後、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを用いて、ルミネセンスシグナルを測定した。
データ分析
蛍光生成物へのカルセインＡＭの変換によって、細胞毒性効果を決定した。細胞毒性パーセントを式１によって算出した：
［式中、ＸＣは、化合物処理されたウェルからの蛍光シグナルであり；ＭＢは、ピュロマイシン処理されたウェルからの平均蛍光シグナルであり；ＭＤはＤＭＳＯ処理されたウェルからの平均蛍光シグナルである］。ＨＣＶレプリコンのレポーターｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼから生じたルミネセンスシグナルによって、抗ＨＣＶ複製活性を決定した。ＸＣが化合物処理されたウェルからのルミネセンスシグナルであり；ＭＢがＩＴＭＮ−１９１処理されたウェルからの平均ルミネセンスシグナルであり；ＭＤがＤＭＳＯ処理されたウェルからの平均ルミネセンスシグナルである式１を使用して、ＨＣＶレプリコンでの阻害パーセントを算出した。
細胞生存率の５０％低減をもたらす試験化合物濃度として、ＣＣ５０値を決定した。ＨＣＶ複製の５０％低減をもたらす試験化合物濃度として、ＥＣ５０値を決定した。Ｐｉｐｅｌｉｎｅ Ｐｉｌｏｔ ５．０ソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、実験データを式２に非線形回帰フィッティングさせることによって、ＣＣ５０値およびＥＣ５０値の両方を得た：
［式中、ｙは、ｘ濃度の化合物で観察されたＨＣＶレプリコンの阻害％であり；ｄは、０の化合物濃度での推定応答であり；ａは、無限の化合物濃度での推定応答であり；ｃは、中点濃度（ＣＣ５０またはＥＣ５０）であり；ｂは、Ｈｉｌｌ傾斜因子である］。
ＰｒｉｃｈａｒｄおよびＳｈｉｐｍａｎによって開発されたＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ ＩＩプログラムを使用して組合せ研究実験データを分析した（Ｐｒｉｃｈａｒｄ ＭＮ、Ａｓｅｌｔｉｎｅ ＫＲ、Ｓｈｉｐｍａｎ Ｃ、Ｊｒ． ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ商標ＩＩ、Ｖｅｒｓｉｏｎ １．０。 Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ、１９９３年）。ソフトウェア（ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ（商標）ＩＩ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ、ＭＩ）は、理論阻害を算出して、薬物間の相加的相互作用を推測し（Ｂｌｉｓｓ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅモデルに基づく）、理論阻害値と観察された阻害値との間の統計的に有意差を定量化する。三次元でこれらの差違をプロットすると、Ｚ面での上昇が化合物間の抗ウイルス相乗作用を表し、低下が化合物間の抗ウイルス拮抗作用を表す表面が生じる。表面偏差の算出ボリュームは、μＭ２％で表される。ＰｒｉｃｈａｒｄおよびＳｈｉｐｍａｎによると、組合せ効果は次のとおりに定義される：
・ 強い相乗作用： １００μＭ２％超
・ 中等度の相乗作用： ５０μＭ２％超および１００μＭ２％以下
・ 弱い相乗作用： ２５μＭ２％超および５０μＭ２％以下
・ 相加作用： ２５μＭ２％以下および−２５μＭ２％超
・ 弱い拮抗作用： −２５μＭ２％以下および−５０μＭ２％超
・ 中等度の拮抗作用： −５０μＭ２％以下および−１００μＭ２％超
・ 強い拮抗作用： −１００μＭ２％以下
それぞれの組合せ研究について、３つの独立した実験を、それぞれの実験において４回反復して行った。
結果
ＨＣＶ遺伝子型１ａ型レプリコンアッセイにおける個々の化合物の抗ウイルス活性および細胞毒性
他の抗ＨＣＶ化合物と組み合わせた化合物１０の抗ＨＣＶ活性および細胞毒性を、ＨＣＶ遺伝子型１ａレプリコンを有するＨｕｈ−７細胞で試験した。全ての化合物についてのＥＣ５０値およびＣＣ５０値を以下の表に列挙する。有意な細胞毒性は全ての個々の化合物について、組合せアッセイにおいて試験された最高濃度まで観察されなかった。
他のクラスの抗ＨＣＶ剤と組み合わせた化合物１０の抗ウイルス活性および細胞毒性
ＨＣＶ遺伝子型１ａ型レプリコンを使用して、他の抗ＨＣＶ化合物と組み合わせた化合物１０の抗ウイルス効果を評価した。相加作用からの有意な偏差を表す表面プロットを提供するＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ ＩＩを使用して、結果を分析した。相加性表面からの偏差から算出される相乗作用ボリュームおよび拮抗作用ボリューム（μＭ２％）を以下の表にまとめる。９５％信頼区間で、平均相乗作用ボリュームおよび拮抗作用ボリュームは、化合物１０を、化合物１０との相加的相互作用を示す、化合物６、化合物１、化合物５または化合物３と組み合わせた場合、２５から−２５μＭ２％の間であった。さらに、化合物１０は、ＲＢＶと組み合わせた場合に２５から５０μＭ２％の範囲で相乗作用ボリュームを示し、これは弱い相乗的相互作用を示唆している。直接作用抗ウイルス剤を使用する化合物１０との組合せ研究において、細胞生存率は、試験された化合物組合せの最高濃度で９３％超である一方で、化合物１０およびＲＢＶの組合せ効果を分析する研究は、組み合わせた薬物最高濃度で８５％超の細胞生存率を示した。
結論
化合物１０の抗ウイルス活性を、化合物６、化合物１、化合物５、化合物３またはＲＢＶと組み合わせて試験した。化合物１０は、化合物６、化合物１、化合物５または化合物３と組み合わせて相加的抗ウイルス活性を示し、ＲＢＶとは弱い相乗作用を示した。
要約すると、これらの発見は、個々の薬物のいずれの効力も減少させることなくウイルス抑制増大を達成するために、化合物１０が化合物６、化合物１、化合物５、化合物３またはＲＢＶと組み合わせて使用される潜在性を支持している。
臨床的実施例１：化合物１および化合物２の組合せの抗ＨＣＶ活性の臨床試験
この臨床的実施例は、化合物１および化合物２＋リバビリンの組合せがＨＣＶウイルス負荷を減少させるのに、およびＨＣＶウイルスリバウンドを抑制するのに、リバビリンがない化合物１＋化合物２の組合せより有効であることを示す。
臨床試験の設計：
慢性遺伝子型１型ＨＣＶ感染を有する処置未経験の被験体における２８日間の、化合物２および化合物１単独およびリバビリンと組合せた化合物２および化合物１のフェーズ２無作為化非盲検試験。２８日間にわたって、アーム１（Ａｒｍ１）の被験体は、両方とも１日２回（ＢＩＤ）投与される７５ｍｇの化合物２＋４０ｍｇの化合物１を受け（２剤レジメン）、アーム２の被験体は、両方ともＢＩＤ投与される７５ｍｇの化合物２＋４０ｍｇの化合物１に加えて、ＢＩＤ投与されるリバビリンも受けた（３剤レジメン）。
２８日目に、全ての被験体が、ＰＥＧ／リバビリンを開始することとした。加えて、そのプロトコルは、不十分なウイルス学的応答（５日目までにベースラインのＨＣＶ ＲＮＡからの２ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍＬ未満の減少）またはウイルスリバウンド（絶対値が１０００ＩＵ／ｍＬ超であって、５日目以降に存在する２つの時点にわたって確認された最下点からの０．５ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍＬ超のＨＣＶ ＲＮＡ上昇）を有する被験体が、２８日目の前にＰＥＧ／ＲＩＢＡを開始することをを要求した。
不十分なウイルス学的応答を有する被験体では、ペグ化インターフェロン（ＰＥＧ）およびリバビリン（ＲＩＢＡ）の組合せを２８日目の前に、化合物２＋化合物１を継続しながら、また継続せずに開始した。結果として、試験の２８日目までに、被験体は４つの処置のうちの１つを受けた：
（ｉ）化合物２＋化合物１
（ｉｉ）化合物２＋化合物１＋ＲＩＢＡ
（ｉｉｉ）化合物２＋化合物１＋ＰＥＧ／ＲＩＢＡまたは
（ｉｖ）ＰＥＧ／ＲＩＢＡ。
全部で３１例の被験体を登録し、投薬を開始した（１６例の被験体がアーム１において２剤レジメンを受け、１５例の被験体がアーム２において３剤レジメンを受けた）。予備的な被験体の人口統計およびベースラインの特徴（表ＸＶＩ）は全般的に、アーム２の方が遺伝子型１ｂ型を有する被験体の人数が多かったことは別として、アーム１と２とで匹敵した。４例の被験体がスクリーニングでＨＣＶ遺伝子型１ｂ型と同定されたが（１例の被験体は２剤レジメンで、３例の被験体は３重レジメンで）、さらに分析したところ、遺伝子型１ａ型または１ｂ型として確認されず、さらなる評価を進めているところである。
重大な有害事象を経験した被験体はいない。試験薬物療法は全般的に耐容性が良好であり、その際、試験薬物の中止に至った唯一の、処置により発現した有害事象であった１例のグレード３の疲労を除いて、全ての有害事象が重症度においてグレード１〜２であった。ＰＥＧ／リバビリンを開始する前に、１例を超える被験体で生じた最も一般的な、処置により発現した有害事象は、アーム１で頭痛（ｎ＝５）および下痢もしくは悪心（それぞれｎ＝３）、ならびにアーム２で頭痛（ｎ＝７）、下痢もしくは疲労（それぞれｎ＝３）、悪心、無力症、そう痒症（ｐｒｕｒｉｔｉｓ）または不眠症（それぞれｎ＝２）であった。化合物２＋化合物１を、ＰＥＧ／ＲＩＢＡと組み合わせて与え、その際、１人を超える被験体で生じた唯一の有害事象は、両方ともＰＥＧ／ＲＩＢＡ療法で一般的な有害事象であるインフルエンザ様疾病（ｎ＝５）および筋肉痛（ｎ＝３）であった。検査値異常（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙ）に関しては、２８日の処置期間の間に、グレード４の事象はなかった。試験薬物を受けた被験体のうち、リバビリンを含有するアーム２において、２件の、処置により発現した総ビリルビンにおけるグレード３の上昇があった（７日目に生じたが、試験薬物の継続投与で解消）。他にも、この投薬アーム（リバビリンを含む）における他の被験体のうち、総ビリルビンの、２例のグレード−１の上昇および１例のグレード−２の上昇があった。アーム−１（リバビリンなし）における被験体では、４件のグレード−１の総ビリルビン上昇があった。ＡＬＴ値は、両方のアームにおいて１４日目までにベースラインから約４０Ｕ／Ｌ減少した。中央値ＱＴｃＦは、いずれの試験アームにおいてもベースラインから有意に変化せず、ＱＴｃ異常によって、試験薬物を中止した被験体はいなかった。予備的安全性データを表ＸＶＩＩＩにまとめる。
血漿ＨＣＶ ＲＮＡを週に約２回監視して、ＰＥＧ／ＲＩＢＡの早期開始のために、プロトコル規定の診断基準に関連するウイルス学的応答を測定した。ＨＣＶ ＲＮＡ値の予備的分析から、ＨＣＶ ＲＮＡにおける最大低下の中央値は、２剤レジメンでは３．９ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍＬ、３剤レジメンでは５．０ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍＬであった。ＨＣＶ ＲＮＡの最大低下までの時間の中央値は、２剤レジメンでは７日間、３剤レジメンでは１４日間であり、この際、その差違は、リバビリン含有アームにおけるウイルスブレークスルーの発生および発症の遅延によった。２剤レジメンを受けた１５例の被験体のうち３例（２０％）および３剤レジメンを受けた１３例の被験体のうち１０例（７７％）は、最低のＨＣＶ ＲＮＡ値≦３０ＩＵ／ｍＬ（非ＧＴ１被験体は除く）を有した。化合物２／化合物１を受けた１３例／１６例（８１％）の被験体および化合物２／化合物１／リバビリンを受けた６例／１５例（４０％）の被験体は、試験の２８日目に予定されていた開始の前に、ＰＥＧまたはＰＥＧ／リバビリンを開始した。ウイルス学的転帰の追加の詳細は、次に示される。
結果
化合物２＋化合物１単独およびＲＩＢＡと組み合わせた化合物２＋化合物１は、ＰＥＧまたはＰＥＧ／リバビリンを加える前と後の両方で、この試験におけるＨＣＶ被験体によって最大２８日間にわたり耐容性が良好であった。両方のレジメンがＨＣＶ ＲＮＡの強力な抑制をもたらし、活性は３薬レジメンでより大きく、かつより持続的であった。
表ＸＶＩＩＩに示されているデータは、リバビリンの不在と比較して、リバビリンの存在下での化合物２＋化合物１の組合せに応答して、最大ＨＣＶ ＲＮＡレベルの中央値および最大ＨＣＶ ＲＮＡレベルの平均値の両方において約１０倍超の低下があったことを示している。他にも、５０ＩＵ／ｍＬ未満のＨＣＶ ＲＮＡ最低値を有する研究対象の人数は、リバビリンの不在下よりも、リバビリンの存在下において多い。これらの結果は、インターフェロンの不在下で、リバビリンが、化合物１および化合物２の組合せの抗ウイルス活性を有意に強化することを示している。
加えて、ＨＣＶが変異して、抗ウイルス薬物に対する感受性が低くなったときに結果として生じるＨＣＶウイルス負荷の増大の尺度であるＨＣＶブレークスルーまでの平均時間は、リバビリンの不在下よりもリバビリンの存在下でのほうが長い。さらに、ウイルスブレークスルーを示した被験体の人数は、リバビリンの不在下よりもリバビリンの存在下でのほうがかなり少ない。これらの結果は、ＨＣＶウイルスが、リバビリンの存在下では化合物１および化合物２の組合せに対して耐性を発生しにくいことを示している。
さらに、表ＸＶＩＩＩに示されているデータは、リバビリンの存在下では急速なウイルス学的応答（ＲＶＲ）を達成した患者の人数が、リバビリンの不在下においてよりも有意に多いことを示している。ＲＶＲの達成は、ＨＣＶ感染の治癒と正に相関している。
まとめると、表ＸＶＩＩＩに表されているデータは、化合物１、化合物２およびリバビリンの組合せは、インターフェロンの投与の不在下であっても、ＨＣＶウイルス負荷の急速かつ臨床的に有意な減少をウイルスリバウンドの減少と共にもたらすことを示している。
本明細書では、本発明の具体的な実施形態を例示し、かつ詳細に記載したが、本発明は、それらの実施形態に限定されない。上記で詳述した記載は、本発明の例示として提供したものであって、本発明の何らかの制限を構成するとは解釈されるべきではない。変更形態は当業者には明白であり、本発明の趣旨から逸脱していない全ての変更形態が、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。

Claims (46)

  1. １）化合物１０または薬学的に許容されるその塩、および２）化合物５または薬学的に許容されるその塩、または化合物６または薬学的に許容されるその塩を含む組成物。
  2. １）化合物１０または薬学的に許容されるその塩、および２）化合物５または薬学的に許容されるその塩を含む、請求項１に記載の組成物。
  3. １）化合物１０または薬学的に許容されるその塩、および２）化合物６または薬学的に許容されるその塩を含む、請求項１に記載の組成物。
  4. １）化合物１０または薬学的に許容されるその塩、２）化合物５または薬学的に許容されるその塩、および３）化合物６または薬学的に許容されるその塩を含む、請求項１に記載の組成物。
  5. １種または複数の薬学的に許容される希釈剤またはキャリアをさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 毎日１回投与のための単位剤形として製剤化される、請求項５に記載の組成物。
  7. 経口投与のために製剤化される、請求項５から６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 錠剤として製剤化される、請求項５から７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. リバビリンをさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. ヒトでのＨＣＶ感染を処置する方法であって、１）化合物１０または薬学的に許容されるその塩、および２）化合物５または薬学的に許容されるその塩、または化合物６または薬学的に許容されるその塩を該ヒトに投与するステップを含む方法。
  11. １）化合物１０または薬学的に許容されるその塩、および２）化合物５または薬学的に許容されるその塩を投与する、請求項１０に記載の方法。
  12. １）化合物１０または薬学的に許容されるその塩、および２）化合物６または薬学的に許容されるその塩を投与する、請求項１０に記載の方法。
  13. １）化合物１０または薬学的に許容されるその塩、２）化合物５または薬学的に許容されるその塩、および３）化合物６または薬学的に許容されるその塩を投与する、請求項１０に記載の方法。
  14. 請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物を前記ヒトに投与する、請求項１０に記載の方法
  15. ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善する方法であって、１）化合物１０または薬学的に許容されるその塩、および２）化合物５または薬学的に許容されるその塩、または化合物６または薬学的に許容されるその塩を該ヒトに投与するステップを含む方法。
  16. １）化合物１０または薬学的に許容されるその塩、および２）化合物５または薬学的に許容されるその塩を投与する、請求項１５に記載の方法。
  17. １）化合物１０または薬学的に許容されるその塩、および２）化合物６または薬学的に許容されるその塩を投与する、請求項１５に記載の方法。
  18. １）化合物１０または薬学的に許容されるその塩、２）化合物５または薬学的に許容されるその塩、および３）化合物６または薬学的に許容されるその塩を投与する、請求項１５に記載の方法。
  19. 請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物を前記ヒトに投与する、請求項１５に記載の方法。
  20. ＨＣＶを有するヒトでのウイルス負荷を減少させる方法であって、１）化合物１０または薬学的に許容されるその塩、および２）化合物５または薬学的に許容されるその塩、または化合物６または薬学的に許容されるその塩を該ヒトに投与するステップを含む方法。
  21. １）化合物１０または薬学的に許容されるその塩、および２）化合物５または薬学的に許容されるその塩を投与する、請求項２０に記載の方法。
  22. １）化合物１０または薬学的に許容されるその塩、および２）化合物６または薬学的に許容されるその塩を投与する、請求項２０に記載の方法。
  23. １）化合物１０または薬学的に許容されるその塩、２）化合物５または薬学的に許容されるその塩、および３）化合物６または薬学的に許容されるその塩を投与する、請求項２０に記載の方法。
  24. 請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物を前記ヒトに投与する、請求項２０に記載の方法。
  25. ヒトにおいて共投与される経口抗ウイルス薬に対して耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための方法であって、１）化合物１０または薬学的に許容されるその塩、および２）化合物５または薬学的に許容されるその塩、または化合物６または薬学的に許容されるその塩を該ヒトに投与するステップを含む方法。
  26. １）化合物１０または薬学的に許容されるその塩、および２）化合物５または薬学的に許容されるその塩を投与する、請求項２５に記載の方法。
  27. １）化合物１０または薬学的に許容されるその塩、および２）化合物６または薬学的に許容されるその塩を投与する、請求項２５に記載の方法。
  28. １）化合物１０または薬学的に許容されるその塩、２）化合物５または薬学的に許容されるその塩、および３）化合物６または薬学的に許容されるその塩を投与する、請求項２５に記載の方法。
  29. 請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物を前記ヒトに投与する、請求項２５に記載の方法。
  30. インターフェロンを前記ヒトに投与しない、請求項１０から２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. リバビリンを前記ヒトに投与するステップをさらに含む、請求項１０から２９のいずれか一項に記載の方法。
  32. リバビリン、インターフェロン、α−グルコシダーゼ１阻害薬、肝臓保護薬、ＴＬＲ−７アゴニスト、シクロフィリン阻害薬、ＨＣＶウイルス侵入阻害薬、ＨＣＶ成熟阻害薬、およびＨＣＶ ＩＲＥＳ阻害薬から選択される１種または複数の追加の薬剤を前記ヒトに投与するステップをさらに含む、請求項１０から２９のいずれか一項に記載の方法。
  33. 医学的療法における使用ための、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
  34. ＨＣＶ感染の予防的処置または治療的処置のための、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
  35. ヒトでのＨＣＶ感染を処置するための医薬品を調製するための、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  36. ヒトでのＨＣＶ感染の１つまたは複数の症状を改善するための医薬品を調製するための、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  37. ウイルス負荷を減少させるための、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
  38. ヒトでのウイルス負荷を減少させるための医薬品を調製するための、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  39. 共投与される経口抗ウイルス薬に対して耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
  40. ヒトにおいて共投与される経口抗ウイルス薬に対して耐性を有するＨＣＶ準種の出現を減じるための医薬品を調製するための、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  41. インターフェロンと一緒の投与用ではない、請求項３４、３７または３９に記載の組成物。
  42. リバビリンと一緒の投与用である、請求項３４、３７または３９に記載の組成物。
  43. リバビリン、インターフェロン、α−グルコシダーゼ１阻害薬、肝臓保護薬、ＴＬＲ−７アゴニスト、シクロフィリン阻害薬、ＨＣＶウイルス侵入阻害薬、ＨＣＶ成熟阻害薬、およびＨＣＶ ＩＲＥＳ阻害薬から選択される１種または複数の追加の薬剤と一緒の投与用である、請求項３４、３７または３９に記載の組成物。
  44. 前記医薬品がインターフェロンと一緒の投与用ではない、請求項３５、３６、３８および４０のいずれか一項に記載の使用。
  45. 前記医薬品がリバビリンと一緒の投与用である、請求項３５、３６、３８および４０のいずれか一項に記載の使用。
  46. 前記医薬品が、リバビリン、インターフェロン、α−グルコシダーゼ１阻害薬、肝臓保護薬、ＴＬＲ−７アゴニスト、シクロフィリン阻害薬、ＨＣＶウイルス侵入阻害薬、ＨＣＶ成熟阻害薬、およびＨＣＶ ＩＲＥＳ阻害薬から選択される１種または複数の追加の薬剤と一緒の投与用である、請求項３５、３６、３８および４０のいずれか一項に記載の使用。
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