DE202012013382U1 - Zusammensetzungen zur Behandlung von HCV - Google Patents

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Abstract

Zusammensetzung für die Verwendung zur Behandlung einer Genotyp 1 HCV Infektion, umfassend eine Verbindung 6und ferner umfassend eine zweite Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 4, Verbindung 5 und Verbindung 7,wobei die Behandlung weder die Verabreichung von Interferon noch von Ribavirin einschließt, und wobei die Behandlung von 28 Tagen bis etwa 24 Wochen, vorzugsweise von etwa 12 bis etwa 24 Wochen dauern kann.

Description

  • PRIORITÄT DER ERFINDUNG
  • Diese Anmeldung beansprucht Priorität aus der vorläufigen US-Patentanmeldung mit der Nummer 61/535,885, eingereicht am 16. September 2011, und der vorläufigen US-Patentanmeldung Nr. 61/561,753, eingereicht am 18. November 2011. Der gesamte Inhalt von jeder dieser vorläufigen Anmeldungen ist hier durch Bezugnahme aufgenommen.
  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft Kombinationen therapeutischer Moleküle, die zur Behandlung der Hepatitis C Virusinfektion brauchbar sind. Die vorliegende Erfindung betrifft Mittel zur Behandlung und Zusammensetzungen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Hepatitis ist eine weltweit auftretende Erkrankung. Hepatitis ist im Allgemeinen von viraler Natur, obwohl sie, falls sie als Zustand von chronischer Entzündung der Leber angesehen wird, auch andere bekannte nichtinfektiöse Ursachen haben kann. Virale Hepatitis ist bei weitem die häufigste Hepatitisform. Die US-Zentren zur Seuchenbekämpfung (U.S. Centers for Disease Control) schätzen, dass mindestens 1,8% der US-Bevölkerung serologische Anzeichen für eine HCV-Infektion aufweist, wobei diese in der Mehrzahl der Fälle mit chronischer aktiver Infektion zusammenhängen. HCV ist ein positivsträngiges RNA-Virus, das zur Familie der Flaviviridae gehört und mit den Pestiviren eng verwandt ist, zu denen das Schweinecholeravirus und das bovine virale Diarrhövirus gehören.
  • Das HCV-Genom ist ein einzelsträngiges RNA-Virus positiver Polarität mit etwa 9600 bp, das für ein Polyprotein mit 3009–3030 Aminosäuren kodiert, das während und nach der Translation durch zelluläre und zwei virale Proteinasen zu reifen viralen Proteinen gespalten wird (Kern, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B). Die Strukturproteine, E1 und E2, sind vermutlich in eine virale Lipidhülle eingebettet und bilden stabile Heterodimere. Das Strukturkernprotein tritt vermutlich mit dem viralen RNA-Genom in Wechselwirkung, um das Nukleocapsid zu bilden. Die als NS2 bis NS5 bezeichneten nichtstrukturellen Proteine schließen Proteine mit enzymatischen Funktionen ein, die an der Virusreplikation und Proteinverarbeitung beteiligt sind, einschließlich einer Polymerase, Protease und Helicase. HCV repliziert über die Produktion eines komplementären, negativsträngigen RNA-Templats.
  • HCV ist ein genetisch vielfältiges Virus. Innerhalb eines einzigen infizierten Patienten können viele Variantenviren identifiziert werden, was zu der Beschreibung „Virusschwarm” oder viralen Quasispezies geführt hat. HCV ist innerhalb der globalen menschlichen Population ebenfalls genetisch vielfältig, wobei mindestens 6 'Hauptgenotypen' (Genotypen 1–6) und zahlreiche Subtypen (d. h. HCV Genotyp 1a und 1b) identifiziert wurden. HCV-Genotypen werden durch genomische phylogenetische Analyse definiert und (bei einem gegebenen Patienten) durch diagnostische Assays auf Grundlage der HCV RNA-Sequenz diagnostiziert.
  • Der Hauptinfektionsweg ist bei HCV der Blutkontakt. Das Ausmaß der HCV-Infektion als gesundheitliches Problem wird durch die Prävalenz in Hochrisikogruppen illustriert. Einigen Umfragen zufolge sind beispielsweise 60% bis 90% der Hämophilen und mehr als 80% der Konsumenten von Drogen auf intravenösem Wege in den westlichen Ländern von einer chronischen HCV-Infektion betroffen. Bei intravenösen Drogenkonsumenten variiert die Prävalenz je nach untersuchter Population zwischen etwa 28% und 80%. Der Anteil der HCV-Neuinfektionen im Zusammenhang mit Blut- oder Blutprodukttransfusion wurde durch Fortschritte in der Pharmazie und weit verbreiteten Einsatz von sensitiven serologischen und RNA-Detektierungsassays, die zum Screening von Blutspendern eingesetzt wurden, deutlich reduziert, es ist jedoch bereits eine große Kohorte von alternden, chronisch infizierten Personen vorhanden.
  • Eine verfügbare Behandlung der HCV-Infektion erfolgt mit pegyliertem Interferon-α (PEG-IFN α1a oder PEG-IFN α1b), das gemäß aktuellen Behandlungsrichtlinien wöchentlich durch subkutane Injektion für 24 bis 48 Wochen behandelt wird, je nach behandeltem viralen HCV-Genotyp. Obwohl zu erwarten ist, dass bei mehr als 50% der Patienten mit HCV-Infektion des Genotyps 1 nach Abschluss der Therapie von 48 Wochen eine Suppression der HCV-Virämie eingetreten ist, erleidet ein erheblicher Anteil dieser Patienten einen viralen Rückfall. Demnach wird eine anhaltende virologische Ansprechrate (SVR, definiert als HCV RNA-Negativität 24 Wochen nach Behandlungsende und als gleichwertig mit „Heilung” angesehen) nur in 30–40% der HCV-Infektionen mit Genotyp 1 erreicht, die mit PEG-IFN allein behandelt wurden. Die Behandlung mit PEG-IFN + RBV wird zudem nicht gut vertragen, wobei das Profil der unerwünschten Ereignisse grippeartige Symptome, Thrombozytopenie, Anämie und schwerwiegende psychiatrische Nebenwirkungen einschließt. Obwohl die Behandlung mit dem aktuellen Therapiestandard nicht optimal ist, sind viele Patienten sogar aufgrund von Begleiterkrankungen, die bei HCV-infizierten Populationen häufig sind, einschließlich psychiatrischer Störungen, fortgeschrittener Lebererkrankung und Substanzmissbrauch, von vornherein von der Therapie ausgeschlossen.
  • Ribavirin ist ein antivirales Nukleosidanalog-Arzneimittel. Ribavirin wird typischerweise oral (durch den Mund) zwei Mal täglich eingenommen. Der genaue Mechanismus ist bei Ribavirin nicht bekannt. Es wird jedoch angenommen, dass Ribavirin phosphoryliert wird, wenn es in eine Zelle eintritt; es wirkt dann als Inhibitor von Inosin-5'-monophosphatdehydrogenase (IMPDH). IMPDN-Inhibitoren, wie Ribavirin, reduzieren die intrazelluläre Synthese und Speicherung von Guanidin, einem Nukleotid-„Baustein”, der für die DNA- und RNA-Produktion erforderlich ist, wodurch die virale Replikation inhibiert wird. IMPDH-Inhibitoren stören auch die Reproduktion rasch proliferierender Zellen und Zellen mit einer hohen Proteinumsatzrate. Die Behandlung mit Ribavirin-Monotherapie beeinflusst die HCV-RNA-Spiegel wenig, steht jedoch mit einer Abnahme der Serum-Alanintransferase (ALT) im Zusammenhang. Diese Beobachtung legt nahe, dass Ribavirin möglicherweise nicht als antivirales Mittel, sondern eher als Modulator der Immunsystemfunktion wirkt. Ribavirin ist nur in Kombination mit IFN für die Verwendung für HCV-Infektion zugelassen.
  • Die Behandlung mit der Kombination von PEG-IFN plus Ribavirin verbessert die SVR-Raten gegenüber denjenigen, die mit PEG-IFN allein beobachtet wurden, größtenteils aufgrund der Verringerung der Häufigkeit viraler Rückfälle nach Therapieende. Die SVR-Raten in großen klinischen Studien an PEG-IFN-Ribavirin-behandelten Patienten mit HCV-Infektion vom Genotyp 1 lagen im Bereich von 40–55%. Zurzeit wird die Therapie mit PEG-IFN/Ribavirin als ”Therapiestandard”-Behandlung für chronische HCV-Infektion angesehen. Es wird jedoch erwartet, dass sich der Therapiestandard in naher Zukunft durch Zulassung direkt wirkender antiviraler Mittel rasch ändern wird, die anfangs in Kombination mit PEG-IFN/Ribavirin verwendet werden.
  • Leider reagieren verschiedene HCV-Genotypen unterschiedlich auf die PEG-IFN/Ribavirin-Therapie, beispielsweise ist HCV Genotyp 1 therapieresistenter als die Typen 2 und 3. Zudem führen viele aktuelle Behandlungen für HCV zu unerwünschten Nebenwirkungen. Es besteht zurzeit daher ein Bedarf an neuen antiviralen Therapien. Insbesondere besteht ein Bedarf an neuen antiviralen Therapien, die zu weniger unerwünschten Nebenwirkungen führen, die wirksamer gegen einen Bereich von HCV-Genotypen sind oder die unkompliziertere Dosierschemata aufweisen, d. h. bei denen die Verabreichung der Mittel weniger oft während eines Tages erforderlich ist.
  • KURZFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Mittel bereit, die zur Behandlung viraler Infektionen brauchbar sind (z. B. HCV). Bestimmte Zusammensetzungen und Mittel der Erfindung führen zu weniger unerwünschten Nebenwirkungen, sind wirksamer gegen einen Bereich von HCV-Genotypen, reduzieren das Potential für viralen Rebound infolge von Resistenzselektion und haben verkürzte unkompliziertere Dosierschemata, verglichen mit zurzeit verfügbaren Therapien.
  • Gemäß einer Ausführungsform stellt die Erfindung somit eine Zusammensetzung bereit, die zwei oder mehr Verbindungen ausgewählt aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 und pharmazeutisch akzeptablen Salzen davon umfasst.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung Mittel zur Behandlung einer HCV-Infektion bei einem Menschen bereit, umfassend Verabreichung von zwei oder mehr Verbindungen ausgewählt aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 und pharmazeutisch akzeptablen Salzen davon an den Menschen.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung Mittel zur Linderung von einem oder mehreren Symptomen einer HCV-Infektion bei einem Menschen bereit, umfassend Verabreichung von zwei oder mehr Verbindungen ausgewählt aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 und pharmazeutisch akzeptablen Salzen davon an den Menschen.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung Mittel zur Reduktion der Viruslast bei einem Menschen mit HCV bereit, umfassend Verabreichung von zwei oder mehr Verbindungen ausgewählt aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 und pharmazeutisch akzeptablen Salzen davon an den Menschen.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispezies mit Resistenz gegen gemeinsam verabreichte orale antivirale Mittel bei einem Menschen bereit, umfassend Verabreichen von zwei oder mehr Verbindungen ausgewählt aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 und pharmazeutisch akzeptablen Salzen davon an den Menschen.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung von zwei oder mehr Verbindungen ausgewählt aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 und pharmazeutisch akzeptablen Salzen davon in der medizinischen Therapie bereit.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung von zwei oder mehr Verbindungen ausgewählt aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 und pharmazeutisch akzeptablen Salzen davon zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung einer viralen (z. B. HCV) Infektion bereit.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung einer viralen (z. B. HCV) Infektion bereit.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung von zwei oder mehr Verbindungen ausgewählt aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 und pharmazeutisch akzeptablen Salzen davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer viralen (z. B. HCV) Infektion bei einem Menschen bereit.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer viralen (z. B. HCV) Infektion bei einem Menschen bereit.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung von zwei oder mehr Verbindungen ausgewählt aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 und pharmazeutisch akzeptablen Salzen davon zur Herstellung eines Medikaments zur Linderung von einem oder mehreren Symptomen einer viralen (z. B. HCV) Infektion bei einem Menschen bereit.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments zur Linderung von einem oder mehreren Symptomen einer viralen (z. B. HCV) Infektion bei einem Menschen bereit.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung von zwei oder mehr Verbindungen ausgewählt aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 und pharmazeutisch akzeptablen Salzen davon zur Herstellung eines Medikaments zur Reduktion der Viruslast bei einem Menschen bereit.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments zur Reduktion der Viruslast bei einem Menschen bereit.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung von zwei oder mehr Verbindungen ausgewählt aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 und pharmazeutisch akzeptablen Salzen davon zur Herstellung eines Medikaments zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispezies mit Resistenz gegen gemeinsam verabreichte orale antivirale Mittel bei einem Menschen bereit.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispezies mit Resistenz gegen gemeinsam verabreichte orale antivirale Mittel bei einem Menschen bereit.
  • Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Mittel können „Synergie” und „synergistische Effekte” ergeben, d. h. den Effekt, der erreicht wird, wenn die Wirkung bei gemeinsamer Verwendung der Wirkstoffe (einschließlich zwei oder mehr Verbindungen in Kombination) größer als die Summe der Effekte ist, die aus der separaten Verwendung der Verbindungen resultiert.
  • Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Mittel sind vorteilhaft, da sie Behandlungen für einen weiten Bereich von HCV-Genotypen zur Verfügung stellen und weil sie weniger oder weniger schwerwiegende Nebenwirkungen als aktuelle HCV-Therapien verursachen (z. B. Behandlungen, die die Verabreichung von Interferon einschließen). Bestimmte Kombinationen von Verbindungen (z. B. Verbindungen 10 und 5, Verbindungen 10 und 6, sowie Verbindungen 10, 5 und 6) können darüber hinaus eine anhaltende virologische Ansprechrate (SVR) bereitstellen, die signifikant höher als diejenige ist, die von aktuellen Therapien (z. B. HCV-Therapien) erreicht wird. Einige Kombinationen von Verbindungen können beispielsweise eine SVR bereitstellen, die mindestens etwa 70% oder mindestens etwa 80% beträgt.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Definitionen
  • Die folgenden Begriffe und Formulierungen sollen hier, sofern nicht anders angegeben, die folgenden Bedeutungen haben. Die Tatsache, dass ein bestimmter Begriff oder eine bestimmte Formulierung nicht speziell definiert ist, soll nicht als Unbestimmtheit oder fehlende Klarheit gedeutet werden, sondern dass die Begriffe hier in ihrer gewöhnlichen Bedeutung verwendet werden. Wenn hier Handelsnamen verwendet werden, möchten die Anmelder das Handelsnamensprodukt und den pharmazeutischen Wirkstoff/die pharmazeutischen Wirkstoffe des Handelsnamensprodukts unabhängig einschließen.
  • Der Begriff ”Kombinationsverbindungen” bezieht sich hier auf Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16.
  • Verbindung 1 wie hier verwendet ist:
    Figure DE202012013382U1_0003
  • Verbindung 1 kann auch als 5-((6-(2,4-Bis(trifluormethyl)phenyl)pyridazin-3-yl)methyl)-2-(2-fluorphenyl)-5H-imidazo-[4,5-c]pyridin oder 5H-Imidazo[4,5-c]pyridin, 5-[[6-[2,4-bis(trifluormethyl)phenyl]-pyridazin-3-yl]methyl]-2-(2-fluorphenyl) bezeichnet werden.
  • Verbindung 2 wie hier verwendet ist:
    Figure DE202012013382U1_0004
  • Verbindung 2 kann auch als (2R,6S,13aR,14aS,16aS)-2-(8-Chlor-2-(2-(isopropylamino)thiazol-4-yl)-7-methoxychinolin-4-yloxy)-6-(cyclopentyloxycarbonylamino)-5,16-dioxooctadecahydrocyclopropa[e]pyrrolo-[1,2-a][1,4]diazacyclopentadecin-14a-yl(2,6-difluorbenzyl)phosphinsäure bezeichnet werden.
  • Verbindung 3 wie hier verwendet ist:
    Figure DE202012013382U1_0005
  • Verbindung 4 wie hier verwendet ist:
    Figure DE202012013382U1_0006
  • Verbindung 5 wie hier verwendet ist:
    Figure DE202012013382U1_0007
  • Verbindung 6 wie hier verwendet ist:
    Figure DE202012013382U1_0008
  • Verbindung 7 wie hier verwendet ist:
    Figure DE202012013382U1_0009
  • Verbindung 8 wie hier verwendet ist:
    Figure DE202012013382U1_0010
  • Verbindung 9 wie hier verwendet (Diastereomer am P) ist:
    Figure DE202012013382U1_0011
  • In Bezug auf Verbindung 9 wird auf US 7,964,580 und US 2010/0298257 verwiesen (beide durch Bezugnahme aufgenommen), was die Herstellung und Reinigung von Verbindung 9 betrifft.
  • Verbindung 10 wie hier verwendet (S-Isomer von Verbindung 9) ist:
    Figure DE202012013382U1_0012
  • In Bezug auf Verbindung 10 wird auf US 7,964,580 und US 2010/0298257 verwiesen (beide durch Bezugnahme aufgenommen), was die Herstellung und Reinigung von Verbindung 10 betrifft.
  • Verbindung 11 wie hier verwendet ist:
    Figure DE202012013382U1_0013
  • In Bezug auf Verbindung 11 wird auf US 2010/0081628 verwiesen (hier durch Bezugnahme aufgenommen), was die Herstellung und Reinigung von Verbindung 11 betrifft.
  • Verbindung 12 wie hier verwendet (Diastereomer am P) ist:
    Figure DE202012013382U1_0014
  • In Bezug auf Verbindung 12 wird auf US 20110015146 (die hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist) verwiesen, was die Herstellung und Reinigung von Verbindung 12 betrifft.
  • Verbindung 13 wie hier verwendet (S-Diastereomer von Verbindung 12 am P) ist:
    Figure DE202012013382U1_0015
  • In Bezug auf Verbindung 13 wird auf US 20110015146 verwiesen (hier durch Bezugnahme aufgenommen), was die Herstellung und Reinigung von Verbindung 13 betrifft. Verbindung 14 wie hier verwendet ist:
    Figure DE202012013382U1_0016
  • In Bezug auf Verbindung 14 wird auf US 7,964,580 verwiesen (hier durch Bezugnahme aufgenommen), was die Herstellung und Reinigung von Verbindung 14 betrifft.
  • Verbindung 15 wie hier verwendet ist:
    Figure DE202012013382U1_0017
  • In Bezug auf Verbindung 15 wird auf US 7,964,580 verwiesen (hier durch Bezugnahme aufgenommen), was die Herstellung und Reinigung von Verbindung 15 betrifft.
  • Verbindung 16 wie hier verwendet ist:
    Figure DE202012013382U1_0018
  • In Bezug auf Verbindung 16 wird auf US 7,429,572 verwiesen (hier durch Bezugnahme aufgenommen), was die Herstellung und Reinigung von Verbindung 16 betrifft.
  • In Bezug auf Ribavirin wird auf EP 0 093 401 B1 verwiesen, die hier in Hinsicht auf ein Verfahren zur Herstellung sowie der Nomenklatur in Bezug auf Ribavirin durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Ribavirin wie hier verwendet bezieht sich auf:
    Figure DE202012013382U1_0019
  • Ribavirin wird auch bezeichnet als 1-β-D-Ribofuranosyl-1H-1,2,4-triazol-3-carboxamid, 1-β-D-Ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-carboxyamid; 1-β-D-Ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-carboxamid; COPE-GUS (Roche); DRG-0028; HSDB 6513; ICN 1229; MegaRibavirin (z. B. in Formulierungen von 100 mg Ribavirin/mL); NSC 163039; RAVANEX (BioPartners); REBETOL (Schering-Plough; Aesca; Bayer Schering Pharma; Essex; Pfizer; Trading Pharma; Zuellig Pharma); Ribamid; RIBAMIDIL (Biopharma, Russland; RIBASPHERE (Three Rivers Pharmaceuticals); Ribavarin; Ribavirina; Tribavirin; VILONA (Valeant Pharmaceuticals; ION Pharmaceuticals); VIRAMID (ICN Pharmaceuticals; Alfa Wassermann); VIRAZOLE (Valeant Pharmaceuticals); und VIRIZADOLE (Uci-farma, Sao Bernardo do Campo, Sao Paulo, Brasilien). Ribavirin schließt wie hier verwendet zudem Analoga von Ribavirin ein, einschließlich Taribavirin (VIRAMIDINE, ICN 3142).
  • Der Begriff „Interferon” umfasst 1) Interferone, z. B. pegyliertes rIFN-alpha 2b (PEG-Intron, Merck & Co., Inc.), pegyliertes rIFN-alpha 2a (PEGASYS, Hoffmann-La Roche Inc.), rIFN-alpha 2b (INTRON® A, Merck & Co., Inc.), rIFN-alpha 2a (Roferon®-A, Hoffmann-La Roche Inc.), Interferon alpha (MULTIFERON® Viranative AB Corporation, OPC-18, Alfaferon, Alfanativ, Subalin), Interferon alfacon-1 (Valeant), Interferon alpha-n1 (WellferonTM, Glaxo Wellcome), Interferon alpha-n3 (ALFERON®-Hemispherx Biopharma, Inc.), Interferon-beta-1a (AVONEX® Biogen Idee, DL-8234 Daiichi Pharmaceutical Co. Ltd), Interferon-omega (omega DUROS®, Alza Corporation, Intarcia Therapeutics, Inc.; Biomed 510, Intarcia Therapeutics, Inc.), Albinterferon alpha-2b (ALBUFERON®, Human Genome Sciences, INC.), IFN alpha-2b XL, BLX-883 (LOCTERON®, Biolex Therapeutics, INC.), DA-3021, glycosyliertes Interferon alpha-2b (AVI-005), PEG-INFERGEN®, Amgen, Inc., pegyliertes Interferon lambda-1 (Typ III) (PEGyliertes IL-29), und BELEROFON®, Nautilus Biotech.
  • Der Begriff „Kombinationstherapie” bezeichnet Zusammensetzungen oder Mittel oder dergleichen, die zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen einbeziehen. Kombinationstherapie kann auch andere Wirkstoffe zusätzlich zu den zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen einbeziehen, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf: Ribavirin, ein Interferon, einen alpha-Glucosidase 1-Inhibitor, ein Leberschutzmittel, einen Toll-like Rezeptor(TLR)-7-Agonisten, einen Cyclophilininhibitor, einen HCV-Viruseintrittinhibitor, einen HCV-Reifungsinhibitor und einen HCV IRES-Inhibitor.
  • Der Begriff „Wirkstoff” bezeichnet eine Komponente einer Kombinationstherapie, die eine pharmazeutische Wirkung ausübt oder ausüben kann, einschließlich jedweder der Kombinationsverbindungen, Ribavirin, einem Interferon, einem alpha-Glucosidase 1-Inhibitor, einem Leberschutzmittel, einem TLR-7-Agonisten, einem Cyclophilininhibitor, einem HCV-Viruseintrittinhibitor, einem HCV-Reifungsinhibitor und einem HCV IH-RES-Inhibitor.
  • Der Begriff „Behandeln” und grammatikalische Äquivalente davon bedeutet im Kontext des Behandelns einer Erkrankung das Verlangsamen oder Stoppen der Progression einer Erkrankung oder Lindern von mindestens einem Symptom der Erkrankung, insbesondere das Lindern von mehr als einem Symptom einer Erkrankung. Ein HCV-Patient kann beispielsweise eine Verbesserung eines oder aller der folgenden Symptome aufweisen, die mit HCV-Infektion zusammenhängen können: Anstieg der Alanin-Aminotransferase(ALT)-Spiegel, Fieber, Kopfschmerzen, Muskelschmerzen, Gelbsucht, Erschöpfung, Appetitverlust, Übelkeit, Erbrechen und Diarrhö. Die Behandlung der Hepatitis C-Virusinfektion kann das Reduzieren der HCV-Viruslast in einem HCV-infizierten Menschen einschließen.
  • Bestimmte der hier beschriebenen Verbindungen enthalten ein oder mehrere chirale Zentren oder können anderweitig in der Lage sein, als mehrere Stereoisomere vorzuliegen. Der Umfang der vorliegenden Erfindung schließt Mischungen von Stereoisomeren sowie gereinigte Enantiomere oder enantiomer/diastereomer angereicherte Mischungen ein. In den Umfang der Erfindung sind auch die individuellen Isomere der Verbindungen eingeschlossen, die durch die hier gezeigten Formeln dargestellt sind, ebenso wie jedwede gänzlich oder teilweise äquilibrierte Mischungen davon. Die vorliegende Erfindung eschließt auch die individuellen Isomere der Verbindungen, die durch die hier gezeigte Formel dargestellt sind, sowie Mischungen mit deren Isomeren ein, in denen ein oder mehrere chirale Zentren invertiert sind. Die hier verwendeten stereochemischen Definitionen und Konventionen richten sich allgemein nach S. P. Parker, Hg., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; und Eliel, E. und Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York, hier in vollem Umfang durch Bezugnahme aufgenommen.
  • Viele organische Verbindungen liegen in optisch aktiven Formen vor, d. h. sie haben die Fähigkeit, die Ebene von eben polarisiertem Licht zu drehen. Zur Beschreibung einer optisch aktiven Verbindung werden die Präfixe D und L oder R und S verwendet, um die absolute Konfiguration des Moleküls an seinem chiralen Zentrum/seinen chiralen Zentren anzugeben. Die Präfixe d und I oder (+) und (–) werden zur Angabe des Vorzeichens der Rotation von eben polarisiertem Licht durch die Verbindung verwendet, wobei (–) oder I bedeutet, dass die Verbindung linksdrehend ist. Eine Verbindung mit dem Präfix (+) oder d ist rechtsdrehend.
  • Ein spezifisches Stereoisomer kann auch als Enantiomer bezeichnet werden, und eine Mischung derartiger Isomere wird oft als Enantiomerenmischung bezeichnet. Eine 50:50-Mischung von Enantiomeren wird als racemische Mischung oder Racemat bezeichnet, und diese kann vorliegen, wenn keine Stereoselektion oder Stereospezifität in einer chemischen Reaktion oder einem chemischen Prozess vorgelegen hat. Die Begriffe „racemische Mischung” und „Racemat” bezeichnen eine äquimolare Mischung von zwei enantiomeren Spezies, die frei von optischer Aktivität ist.
  • Kombinationen
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Kombinationen von zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen. Anschließend wird Tabelle I wiedergegeben, die mögliche Zweiwege-(Kombinationen 1–21), Dreiwege-(Kombinationen 22–56), Vierwege-(Kombinationen 57–92) und Fünfwege-(Kombinationen 93–113) Kombinationen von Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 der Erfindung zeigt. Verbindung 4, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 sind Nukleosidinhibitoren der HCV NS5b Polymerase, und Kombinationen von Kombinationsverbindungen schließen am häufigsten nur eine von Verbindung 4, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ein (Siehe Spalte 6 von Tabelle I).
  • TABELLE I
    Figure DE202012013382U1_0020
  • Figure DE202012013382U1_0021
  • Figure DE202012013382U1_0022
  • Zusammensetzungen
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung Verbindung 1 umfasst und ferner eine zweite Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 umfasst. In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung kann die zweite Verbindung Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5 oder Verbindung 6 sein.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung Verbindung 2 umfasst und ferner eine zweite Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, 15 Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 umfasst. Die zweite Verbindung kann in einer speziellen Ausführungsform der Erfindung Verbindung 4 sein. Die zweite Verbindung kann in einer speziellen Ausführungsform der Erfindung Verbindung 3 sein. In einer speziellen Ausführungsform der Verbindung kann die zweite Verbindung Verbindung 5 sein. 20 Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung Verbindung 3 umfasst und ferner eine zweite Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 umfasst. Die zweite Verbindung kann in einer speziellen Ausführungsform der Erfindung Verbindung 1 sein. In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung kann die zweite Verbindung Verbindung 4 sein. In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung kann die zweite Verbindung Verbindung 5 sein. In einer speziellen Ausführungsform der Verbindung kann die zweite Verbindung Verbindung 6 sein.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung eine erste Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 4 umfasst und ferner eine zweite Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 umfasst. Die zweite Verbindung kann in einer speziellen Ausführungsform der Erfindung Verbindung 1 oder Verbindung 2 oder Verbindung 3 oder Verbindung 6 sein. In einer speziellen Ausführungsform der Verbindung kann die zweite Verbindung Verbindung 1 sein. Die zweite Verbindung kann in einer speziellen Ausführungsform der Erfindung Verbindung 2 sein. In einer speziellen Ausführungsform der Verbindung kann die zweite Verbindung Verbindung 3 sein. Die zweite Verbindung kann in einer speziellen Ausführungsform der Erfindung Verbindung 5 sein. In einer speziellen Ausführungsform der Verbindung kann die zweite Verbindung Verbindung 6 sein.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung Verbindung 5 umfasst und ferner eine zweite Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 umfasst. Die zweite Verbindung kann in einer speziellen Ausführungsform der Erfindung Verbindung 1 sein. In einer speziellen Ausführungsform der Verbindung kann die zweite Verbindung Verbindung 6 sein.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung Verbindung 6 umfasst und ferner eine zweite Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 umfasst. In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung kann die zweite Verbindung Verbindung 1 sein. Die zweite Verbindung kann in einer speziellen Ausführungsform der Erfindung Verbindung 2 sein. In einer speziellen Ausführungsform der Verbindung kann die zweite Verbindung Verbindung 3 sein. In einer speziellen Ausfühungsform der Erfindung kann die zweite Verbindung Verbindung 4 sein.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung Verbindung 7 umfasst und ferner eine zweite Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 umfasst.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung eine erste Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 umfasst und ferner eine zweite Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 umfasst.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung Verbindung 1 umfasst und ferner eine zweite Verbindung und eine dritte Verbindung jeweils ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 umfasst. Die zweite Verbindung kann Verbindung 3 oder Verbindung 4 oder Verbindung 5 oder Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 2 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 4 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 3 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 4 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 2 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 3 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 4 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 2 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 3 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 2 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 5 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 3 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 5 sein.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung Verbindung 2 umfasst und ferner eine zweite Verbindung und eine dritte Verbindung jeweils ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 umfasst. Die zweite Verbindung kann Verbindung 4 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 4 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 4 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 3 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 4 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 3 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 5 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 3 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung Verbindung 3 umfasst und ferner eine zweite Verbindung und eine dritte Verbindung jeweils ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 umfasst. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 oder Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 4 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 4 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 4 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 5 sein.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung eine erste Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 4 umfasst und ferner eine zweite Verbindung und eine dritte Verbindung jeweils ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 umfasst. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3 oder Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 2 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 3 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 2 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 3 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 5 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 2 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 5 sein.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung Verbindung 5 umfasst und ferner eine zweite Verbindung und eine dritte Verbindung jeweils ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 umfasst. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung Verbindung 6 umfasst und ferner eine zweite Verbindung und eine dritte Verbindung jeweils ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 umfasst. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3 oder Verbindung 4 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 2 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 3 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 4 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 2 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 4 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 3 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 4 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 5 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 2 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 5 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 3 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 5 sein.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung Verbindung 7 umfasst, und eine zweite Verbindung und eine dritte Verbindung jeweils ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung eine erste Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 umfasst und ferner eine zweite Verbindung und eine dritte Verbindung jeweils ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 umfasst.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung Verbindung 1 umfasst und ferner eine zweite Verbindung, eine dritte Verbindung und eine vierte Verbindung jeweils ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 umfasst. Die zweite Verbindung kann Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5 oder Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 2 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 4 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 3 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 4 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 2 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 3 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 4 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 2 sein, die dritte Verbindung kann Verbindung 4 sein, und die vierte Verbindung kann Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 3 sein, die dritte Verbindung kann Verbindung 4 sein, und die vierte Verbindung kann Verbindung 6 sein.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung Verbindung 2 umfasst und ferner eine zweite Verbindung, eine dritte Verbindung und eine vierte Verbindung jeweils ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 umfasst. Die zweite Verbindung kann Verbindung 4 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 4 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 4 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung eine Verbindung 3 umfasst und ferner eine zweite Verbindung, eine dritte Verbindung und eine vierte Verbindung jeweils ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 umfasst. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 oder Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 4 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 4 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 4 sein, die dritte Verbindung kann Verbindung 5 sein, und die vierte Verbindung kann Verbindung 6 sein.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung eine erste Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 4 umfasst und ferner eine zweite Verbindung, eine dritte Verbindung und eine vierte Verbindung jeweils ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 umfasst. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3 oder Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 2 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 3 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 2 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 3 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung Verbindung 5 umfasst und ferner eine zweite Verbindung, eine dritte Verbindung und eine vierte Verbindung jeweils ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 umfasst. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung Verbindung 6 umfasst und ferner eine zweite Verbindung, eine dritte Verbindung und eine vierte Verbindung jeweils ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 umfasst. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3 oder Verbindung 4 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 2 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 3 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 4 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 2 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 4 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 3 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 4 sein.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung Verbindung 7 umfasst, und ferner eine zweite Verbindung, eine dritte Verbindung und eine vierte Verbindung jeweils ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 umfasst.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung eine erste Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 umfasst und ferner eine zweite Verbindung, eine dritte Verbindung und eine vierte Verbindung jeweils ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 umfasst.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung Verbindung 1 umfasst und ferner eine zweite Verbindung, eine dritte Verbindung, eine vierte Verbindung und eine fünfte Verbindung jeweils ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 umfasst. Die zweite Verbindung kann Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5 oder Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann 2 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 4 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 3 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 4 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 2 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 3 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 4 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung Verbindung 2 umfasst und ferner eine zweite Verbindung, eine dritte Verbindung, eine vierte Verbindung und eine fünfte Verbindung jeweils ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 umfasst. Die zweite Verbindung kann Verbindung 4 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 4 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 4 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung Verbindung 3 umfasst und ferner eine zweite Verbindung, eine dritte Verbindung, eine vierte Verbindung und eine fünfte Verbindung jeweils ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 umfasst. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 oder Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 4 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 4 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung eine erste Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 4 umfasst und ferner eine zweite Verbindung, eine dritte Verbindung, eine vierte Verbindung und eine fünfte Verbindung jeweils ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 umfasst. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3 oder Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 2 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 3 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 2 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 3 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung Verbindung 5 umfasst und ferner eine zweite Verbindung, eine dritte Verbindung, eine vierte Verbindung und eine fünfte Verbindung jeweils ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 umfasst.
  • Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung Verbindung 6 umfasst und ferner eine zweite Verbindung, eine dritte Verbindung, eine vierte Verbindung und eine fünfte Verbindung jeweils ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 umfasst. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3 oder Verbindung 4 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 2 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 1 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 3 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 4 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 6 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 2 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 4 sein. Die zweite Verbindung kann Verbindung 3 sein, und die dritte Verbindung kann Verbindung 4 sein.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung eine Verbindung 7 umfasst und ferner eine zweite Verbindung, eine dritte Verbindung, eine vierte Verbindung und eine fünfte Verbindung jeweils ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 umfasst.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt eine Zusammensetzung ein, z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung eine erste Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 umfasst und ferner eine zweite Verbindung, eine dritte Verbindung, eine vierte Verbindung und eine fünfte Verbindung jeweils ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 umfasst.
  • Salze
  • Die Kombinationspräparate und anderen Wirkstoffe können in Form eines Salzes vorliegen. Typischerweise – jedoch nicht in allen Fällen – handelt es sich bei den Salzen von Kombinationspräparaten und anderen Wirkstoffen um pharmazeutisch verträgliche Salze. Bei den von der Bezeichnung ”pharmazeutisch verträgliche Salze” abgedeckten Salzen handelt es sich um nichttoxische Salze der Kombinationspräparate bzw. anderen Wirkstoffe. Beispiele für geeignete pharmazeutisch verträgliche Salze sind u. a. anorganische Säureadditionssalze wie Chlorid, Bromid, Sulfat, Phosphat und Nitrat; organische Säureadditionssalze wie Acetat, Galactarat, Propionat, Succinat, Laktat, Glykolat, Malat, Tartrat, Citrat, Maleat, Fumarat, Methansulfonat, p-Toluolsulfonat und Ascorbat; Salze mit saurer Aminosäure wie Aspartat und Glutamat; alkalische Metallsalze wie Natriumsalz und Kaliumsalz; Alkalierdmetallsalze wie Magnesiumsalz und Calciumsalz; Ammoniumsalz; organische basische Salze wie Trimethylaminsalz, Triethylaminsalz, Pyridinsalz, Picolinsalz, Dicyclohexylaminsalz und N,N'-Dibenzylethylendiaminsalz, sowie Salze mit basischer Aminosäure wie Lysinsalz und Argininsalz. Bei den Salzen kann es sich in einigen Fällen um Hydrate oder Ethanolsolvate handeln.
  • Pharmazeutische Formulierungen
  • Die Kombinationspräparate bzw. anderen Wirkstoffe können mit konventionellen Trägersubstanzen oder Hilfsstoffen formuliert sein, die entsprechend der üblichen Praxis ausgewählt werden.
  • Tabletten enthalten typischerweise Hilfsstoffe, Gleitstoffe, Füllstoffe, Bindemittel und dergleichen. Wässrige Formulierungen können in steriler Form hergestellt werden und sind – sofern sie zur Zuführung auf anderem Weg als durch orale Verabreichung vorgesehen sind – im Allgemeinen isoton. Alle Formulierungen enthalten optional Hilfsstoffe, wie im Handbuch der pharmazeutischen Hilfsstoffe (1986) aufgeführt, das durch Verweis in seiner Gesamtheit Bestandteil dieses Schriftstücks ist. Zu Hilfsstoffen zählen Ascorbinsäure und andere Antioxidationsmittel, Komplexbildner wie EDTA, Kohlenhydrate wie Dextrin, Hydroxyalkylcellulose, Hydroxyalkylmethylcellulose, Stearinsäure und dergleichen.
  • Der pH-Wert der Formulierungen liegt zwischen ca. 3 und ca. 11, jedoch normalerweise bei ca. 7 bis 10.
  • Während ein Wirkstoff allein verabreicht werden kann, kann es günstiger sein, einen oder mehrere Wirkstoffe in Form von pharmazeutischen Formulierungen darzubieten. Die Formulierungen der Erfindung – für den Gebrauch in der Tiermedizin ebenso wie für den Humangebrauch – umfassen mindestens einen Wirkstoff zusammen mit einem oder mehreren verträglichen Trägern und optional anderen therapeutischen Bestandteilen. Der (die) Trägersubstanz(en) muss (müssen) ”verträglich” sein in dem Sinn, dass sie mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel und für den Empfänger physiologisch unschädlich sind.
  • Zu den Formulierungen zählen diejenigen, die für die nachstehend aufgeführten Verabreichungswege geeignet sind. Die Formulierungen können auf vorteilhafte Weise in Eindosisform dargeboten werden und können durch jedes der Verfahren nach dem Stand der pharmazeutischen Technik hergestellt werden. Die entsprechenden Techniken und Formulierungen sind im Allgemeinen enthalten in ”Remington's Pharmaceutical Sciences” (Mack Publishing Co., Easton, Pa.), das durch Verweis in seiner Gesamtheit Bestandteil dieses Schriftstücks ist. Diese Verfahren umfassen den Schritt, einen Wirkstoff mit der Trägersubstanz, die aus einem oder mehreren Hilfsbestandteilen besteht, in Verbindung zu bringen. Im Allgemeinen können die Formulierungen dadurch hergestellt werden, dass man einen oder mehrere Wirkstoffe mit flüssigen Trägersubstanzen oder fein verteilten festen Trägersubstanzen oder Beiden in Verbindung bringt und dann das Produkt bei Bedarf formt.
  • Die Formulierungen dieser Erfindung, die für orale Verabreichung geeignet sind, können als abgeschlossene Einheiten dargeboten werden, wie z. B. Kapseln, Oblatenkapseln oder Tabletten, die jeweils eine vorgegebene Menge eines Wirkstoffs als Pulver oder Granulat, als Lösung oder Suspension in einer wässrigen oder nichwässrigen Flüssigkeit oder als Öl-in-Wasser-Flüssigkeitsemulsion oder als Wasser-in-Öl-Flüssigkeitsemulsion enthalten. Ein Wirkstoff kann ebenfalls als Bolus, Elektuarium oder Paste verabreicht werden.
  • Eine Tablette kann durch Pressen oder Formen – optional mit einem oder mehreren Hilfsbestandteilen – hergestellt werden. Gepresste Tabletten können dadurch hergestellt werden, dass ein Wirkstoff in frei fließender Form – wie Pulver oder Granulat, das optional mit Bindemittel, Gleitstoff, inertem Diluens, Konservierungsmittel, einem grenzflächenaktiven Mittel oder Dispergens gemischt wird – in einer geeigneten Maschine gepresst wird. Die geformten Tabletten können durch Formen eines Gemisches des pulverförmigen Wirkstoffs, der mit einem inerten flüssigen Diluens befeuchtet ist, in einer geeigneten Maschine hergestellt werden. Die Tabletten können optional beschichtet oder mit Kerbe versehen und optional so formuliert werden, dass ein Wirkstoff langsam oder kontrolliert freigesetzt wird.
  • Zur Verabreichung am Auge oder anderen äußeren Geweben wie z. B. dem Mund oder der Haut können die Formulierungen vorzugsweise als topische Salbe oder Creme aufgebracht werden, die (einen) Wirkstoff(e) in einer Menge von z. B. 0,075 bis 20 Gew.-% (einschließlich Wirkstoff(en) in einem Bereich zwischen 0,1% und 20% in Schritten von 0,1 Gew.-%, wie z. B. 0,6 Gew.-%, 0.7 Gew-%, usw.), vorzugsweise 0,2 bis 15 Gew.-% und am besten 0,5 bis 10 Gew.-% enthalten. Bei Formulierung in einer Salbe kann ein Wirkstoff entweder mit einer paraffinischen oder mit Wasser mischbaren Salbengrundlage verwendet werden. Alternativ kann ein Wirkstoff als Creme mit einer Öl-in-Wasser-Cremebasis formuliert werden.
  • Auf Wunsch kann die wässrige Phase der Cremebasis z. B. mindestens 30 Gew.-% eines mehrwertigen Alkohols, d. h. eines Alkohols mit zwei oder mehr Hydroxylgruppen, wie z. B. Propylenglykol, 1,3-Butandiol, Mannitol, Sorbitol, Glycerol und Polyethylenglykol (einschl. PEG 400), sowie Gemische davon umfassen. Die topischen Formulierungen können wünschenswerterweise eine Verbindung umfassen, die die Absorption oder Penetration eines Wirkstoffs durch die Haut oder andere betroffene Bereiche verbessert. Beispiel für derartige Hautpenetrationsförderer sind u. a. Dimethylsulphoxid und verwandte Analoga.
  • Die Ölphase der Emulsionen von Kombinationspräparaten bzw. anderen Wirkstoffen kann auf bekannte Weise aus bekannten Bestandteilen bestehen. Während die Phase ggf. nur einen Emulgator umfasst (auch als Emulgierungsmittel bekannt), umfasst sie wünschenswerterweise ein Gemisch aus mindestens einem Emulgator mit einem Fett oder einem Öl oder mit einem Fett und einem Öl. Vorzugsweise ist ein hydrophiler Emulgator zusammen mit einem lipophilen Emulgator enthalten, der als Stabilisator wirkt. Vorzugsweise sollte auch ein Öl ebenso wie ein Fett enthalten sein. Zusammen bilden der(die) Emulgator(en) mit oder ohne Stabilisator(en) das sogenannte Emulgierwachs, und das Wachs bildet zusammen mit dem Öl und Fett die sogenannte emulgierende Salbenbasis, die die ölige dispergierte Phase der Cremeformulierungen bildet.
  • Zur Verwendung in der Formulierung nach der Erfindung geeignete Emulgiermittel und Emulsionsstabilisatoren zählen Tween® 60 (ICI Americas Inc.), Span 80, Cetylstearylalkohol, Benzylalkohol, Myristylalkohol, Glycerylmonostearat und Natriumlaurylsulfat.
  • Die Auswahl von geeigneten Ölen oder Fetten für die Formulierung basiert auf dem Erreichen der gewünschten kosmetischen Eigenschaften. Die Creme sollte vorzugsweise ein nicht-fettendes, nicht fleckendes und abwaschbares Produkt von geeigneter Konsistenz sein, um ungewolltes Austreten aus Tuben oder sonstigen Behältern zu vermeiden. Es können geradkettige oder verzweigte ein- oder zweibasige Alkylester, wie Diisoadipat, Isocetylstearat, Propylenglycoldiester von Kokosnussfettsäuren, Isopropylmeristat, Decyloleat, Isopropylpalmitat, Butylstearat, 2-Ethylhexylpalmitat, oder eine Mischung von verzweigten Estern, die unter der Bezeichnung Crodamol CAP bekannt sind, verwendet werden, wobei die drei letztgenannten Ester zu bevorzugen sind. Diese können allein oder in Kombination, in Abhängigkeit von den erforderlichen Eigenschaften, verwendet werden. Alternativ können hoch schmelzende Lipide, wie weißes Weichparaffin und/oder Flüssigparaffin, oder andere Mineralöle verwendet werden.
  • Pharmazeutische Formulierungen nach dieser Erfindung umfassen einen oder zwei Wirkstoffe zusammen mit einem/einer oder zwei pharmazeutisch verträglichen Trägern oder Hilfsstoffen und optional weiteren therapeutischen Wirkstoffen. Pharmazeutische Formulierungen, die Wirkstoffe enthalten, können auf eine beliebige Weise für die vorgesehene Verabreichungsform geeignet sein. Beim Gebrauch für orale Verabreichung können z. B. Tabletten, Pastillen, Lutschtabletten, wässrige oder ölige Suspensionen, dispergierbare Pulver oder Granulate, Emulsionen, Hart- oder Weichkapseln, Sirups oder Elixiere hergestellt werden. Die Zusammensetzungen für die orale Verabreichung können nach jedem in der Technik zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen bekannten Verfahren hergestellt werden, und diese Zusammensetzungen können einen oder mehrere Wirkstoffe enthalten, einschließlich Süßungsmittel, Aromastoffe, Farbstoffe und Konservierungsstoffe, um ein schmackhaftes Verbindung zu ergeben. Tabletten, die einen Wirkstoff als Zumischung von nichttoxischen pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen enthalten, die zur Herstellung von Tabletten geeignet sind, sind verträglich. Bei diesen Hilfsstoffen kann es sich z. B. um inerte Diluentien, wie z. B. Kalzium- oder Natriumkarbonat, Laktose, Laktosemonohydrat, Croscarmellose-Natrium, Povidon, Kalzium- oder Natriumphosphat; Granulier- und Aufschlussmittel wie Maisstärke oder Algininsäure; Bindemittel wie Zellulose, mikrokristalline Zellulose, Stärke, Gelatine oder Gummi Arabicum sowie Gleitstoffe wie Magnesiumstearat, Stearinsäure oder Talkum handeln. Die Tabletten können unbeschichtet oder mittels der bekannten Techniken einschl. Mikroverkapselung beschichtet sein, um das Zerfallen und die Adsorption im Magendarmtrakt zu verzögern und somit eine nachhaltige Wirkung über einen längeren Zeitraum zu bieten. So kann z. B. ein zeitverzögerndes Material wie Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat allein oder in Verbindung mit Wachs verwendet werden.
  • Es können auch Formulierungen für oralen Gebrauch in Form von Hartgelatinekapseln dargeboten werden, wobei (ein) Wirkstoff(e) mit einem inerten festen Diluens, z. B. Kalziumphosphat oder Kaolin, gemischt wird (werden), oder in Form von Weichgelatinekapseln, wobei ein Wirkstoff mit Wasser oder einem Ölmedium, wie z. B. Erdnussöl, Flüssigparaffin oder Olivenöl vermischt wird.
  • Wässrige Suspensionen nach der Erfindung enthalten die Wirkstoffe als Zumischung von Hilfsstoffen, die zur Herstellung von wässrigen Suspensionen geeignet sind. Zu derartigen Hilfsstoffen zählen ein Suspensionsmittel, wie z. B. Natrium-Carboxymethylcellulose, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcelluose, Natriumalginat, Polyvinylpyrrolidon, Tragacantgummi und Gummi Arabicum, sowie Dispersions- und Netzmittel wie in der Natur vorkommendes Phosphatid (z. B. Lecithin), ein Kondensationsprodukt aus einem Alkylenoxid mit einer Fettsäure (z. B. Polyoxyethylenstearat), ein Kondensationsprodukt aus Ethylenoxid mit einem langkettigen aliphatischen Alkohol (z. B. Heptadekaethylenoxycetanol), ein Kondensationsprodukt aus Ethylenoxid mit einem Teilester, der aus einer Fettsäure und einem Hexitolanhydrid (z. B. Polyoxyethylensorbitanmonooleat) abgeleitet ist. Die wässrige Suspension kann ebenfalls einen oder mehrere Konservierungsstoffe enthalten, wie z. B. Ethyl oder n-Propyl-p-hydroxybenzoat, einen oder mehrere Farbstoffe, einen oder mehrere Aromastoffe und einen oder mehrere Süßungsmittel, wie z. B. Saccharose oder Saccharin.
  • Ölsuspensionen können durch Suspendieren eines Wirkstoffs in einem Pflanzenöl, wie z. B. Erdnussöl, Olivenöl, Sesamöl oder Kokosöl oder in einem Mineralöl wie z. B. Flüssigparaffin formuliert werden. Die oralen Suspensionen können ein Eindickungsmittel, wie z. B. Bienenwachs, Hartparaffin oder Cetylalkohol enthalten. Süßungsmittel, wie die in diesem Schriftstück aufgeführten, und Aromastoffe können zugegeben werden, um eine schmackhafte orale Zubereitung herzustellen. Diese Zusammensetzungen können durch Zugabe eines Antioxidationsmittels, wie Ascorbinsäure, konserviert werden.
  • Dispergierbare Pulver und Granulate nach der Erfindung, die zur Herstellung einer wässrigen Suspension durch Zugabe von Wasser geeignet sind, ergeben einen Wirkstoff als Zumischung eines Dispersions- oder Netzmittels, eines Suspensionsmittels und von einem oder mehreren Konservierungsmittel(n). Die vorstehend genannten sind beispielhaft für geeignete Dispersions- oder Netz- und Suspensionsmittel. Es können auch zusätzliche Hilfsmittel, z. B. Süßungsmittel, Aromastoffe oder Farbstoffe vorhanden sein.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen nach der Erfindung können ebenfalls in Form von Öl-in-Wasser-Emulsionen vorliegen. Die Ölphase kann als Pflanzenöl, wie Olivenöl oder Erdnussöl, ein Mineralöl wie Flüssigparaffin, oder einem Gemisch daraus vorliegen. Geeignete Emulgiermittel sind u. a. natürlich vorkommende Gummiarten, wie Gummi Arabicum und Tragantgummi, natürlich vorkommende Phosphatide, wie Sojabohnen-Lecithin, aus Fettsäuren oder Hexitolanhydriden abgeleitete Ester oder Teilester, wie Sorbitanmonooleat, und Kondensationsprodukte aus diesen Teilestern mit Ethylenoxid, wie Polyoxyethylensorbitanmonooleat. Die Emulsion kann ebenfalls Süßungsmittel und Aromastoffe enthalten. Sirups und Elixire können mit Süßungsmitteln, wie Glycerol, Sorbitol oder Saccharose, formuliert sein. Diese Formulierungen können ebenfalls ein Linderungsmittel, ein Konservierungsmittel, einen Aroma- oder Farbstoff enthalten.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen nach der Erfindung können in Form eines sterilen Injektionspräparats, wie z. B. einer sterilen injizierbaren wässrigen oder öligen Suspension, vorliegen. Die Suspension kann nach den bekannten Verfahren formuliert werden, wobei die in diesem Schriftstück genannten geeigneten Dispersions- oder Netz- und Suspensionsmittel zur Anwendung kommen. Bei dem sterilen Injektionspräparat kann es sich auch um eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in einem nichttoxischen parenteral verträglichen Diluens oder Lösemittel handeln, wie z. B. in Form einer Lösung in 1,3-Butandiol oder Verbindung aus lyophilisiertem Pulver. Zu den verwendbaren verträglichen Vehikeln und Lösemitteln zählen Wasser, Ringerlösung und isotone Natriumchloridlösung. Zusätzlich können sterile nichtflüchtige Öle auf konventionelle Weise als Lösemittel oder Suspendiermedium verwendet werden. Zu diesem Zweck kann ein beliebiges mildes nichtflüchtiges Öl einschließlich synthetischer Mono- oder Diglyceride verwendet werden. Darüber hinaus können auch Fettsäuren, wie Oleinsäure, zur Herstellung von Injektionsmitteln verwendet werden.
  • Die Wirkstoffmengen, die mit dem Trägermaterial kombiniert werden können, um eine einzelne Dosierungsform zu erzeugen, variieren in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Wirt und der besonderen Verabreichungsart. So kann z. B. eine Time-Release-Rezeptur, die zur oralen Verabreichung an Menschen vorgesehen ist, ca. 1 bis 1000 mg eines Wirkstoffs in Verbindung mit einer geeigneten und angemessenen Menge eines Trägermaterial enthalten, das einen Anteil von ca. 5 bis ca. 95 Gew.-% der Gesamtzusammensetzung erreichen kann. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann in Form von zur Verabreichung leicht messbaren Mengen hergestellt werden. So kann z. B. eine wässrige Lösung, die für intravenöse Infusion vorgesehen ist, ca. 3 bis 500 μg eines Wirkstoffs pro Milliliter Lösung enthalten, um eine Infusion einer geeigneten Menge mit einer Rate von ca. 30 ml/h zu ermöglichen.
  • Zu den für die Verabreichung in die Augen geeigneten Formulierungen zählen Augentropfen, wobei ein Wirkstoff in einem geeigneten Träger, insbesondere einem wässrigen Lösemittel für einen Wirkstoff, gelöst oder suspendiert wird. Ein Wirkstoff ist in diesen Formulierungen vorzugsweise in einer Konzentration von 0,5 bis 20 Gew.-%, vorteilhafterweise 0,5 bis 10 Gew.-%, und insbesondere ca. 1.5 Gew.-% vorhanden.
  • Zu Formulierungen, die für die topische Verabreichung in den Mund geeignet sind, zählen Lutschtabletten, die einen Wirkstoff auf einer aromatisierten Basis, normalerweise Saccharose und Gummi Arabicum oder Tragantgummi, umfassen; Pastillen, die einen Wirkstoff auf einer inerten Basis wie Gelatine und Glycerin, oder Saccharose und Gummi Arabicum umfassen, und Mundspülungen, die einen Wirkstoff in einem geeigneten flüssigen Trägermaterial umfassen. Formulierungen zur rektalen Verabreichung können als Zäpfchen mit einer geeigneten Basis, z. B. aus Kakaobutter oder Salicylat, vorliegen.
  • Zur intrapulmonalen oder nasalen Darreichung geeignete Formulierungen weisen eine Teilchengröße z. B. im Bereich von 0,1 bis 500 μm auf (einschließlich Teilchengrößen in einem Bereich zwischen 0,1 und 500 μm in Schritten von 0,5 μm, 1 μm, 30 μm, 35 μm, usw.), die durch schnelles Inhalieren durch den Nasenkanal oder durch Inhalieren durch den Mund verabreicht werden, um die Lungenbläschen zu erreichen. Geeignete Formulierungen sind u. a. wässrige oder ölige Lösungen eines Wirkstoffs. Zur Verabreichung als Aerosol oder Trockenpulver geeignete Formulierungen können nach herkömmlichen Verfahren hergestellt werden und mit anderen therapeutischen Wirkstoffen abgegeben werden, wie z. B. Verbindungen, die vorstehend für die Behandlung oder Prophylaxe von Infektionen, wie in diesem Schriftstück beschrieben, verwendet werden.
  • Zur vaginalen Verabreichung geeignete Formulierungen können als Pessare, Tampons, Cremes, Gels, Pasten, Schäume oder Sprayformulierungen vorliegen, die zusätzlich zu einem Wirkstoff die in der Fachwelt als geeignet bekannten Trägersubstanzen enthalten.
  • Zur parenteralen Verabreichung geeignete Formulierungen enthalten wässrige und nichtwässrige sterile Injektionslösungen, die Antioxidationsmittel, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Substanzen enthalten können, die bewirken, dass die Formulierung isoton mit dem Blut des vorgesehenen Empfängers wird; und wässrige und nichtwässrige sterile Suspensionen, die Suspensions- und Eindickungsmittel umfassen können. Die Formulierungen können in Einzel- oder Multidosen-Behältern vorliegen, z. B. gesiegelten Ampullen und Fläschchen, und können gefriergetrocknet (lyophilisiert) gelagert werden, so dass nur die Zugabe der sterilen flüssigen Trägersubstanz unmittelbar vor dem Gebrauch erforderlich ist. Unvorbereitete Injektionslösungen und -Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulaten und Tabletten der vorstehend beschriebenen Art hergestellt werden. Zu bevorzugten Eindosis-Rezepturen zählen solche, die eine Tagesdosis oder eine Tages-Teildosiseinheit, wie vorstehend aufgeführt, oder einen geeigneten Bruchteil eines Wirkstoffs enthalten.
  • Es kann davon ausgegangen werden, dass die Formulierungen von Kombinationspräparaten bzw. anderen Wirkstoffen zusätzlich zu den vorstehend im Einzelnen aufgeführten Bestandteilen weitere im Hinblick auf die betreffende Formulierung in der Fachwelt übliche Mittel enthalten, z. B. können solche für orale Darreichung Aromastoffe enthalten.
  • Kombinationspräparate und andere Wirkstoffe können auch im Hinblick auf die kontrollierte Freisetzung eines Wirkstoffs formuliert sein, um weniger häufige Dosierung zu ermöglichen oder um das pharmakokinetische oder Toxizitätsprofil eines Wirkstoffs zu verbessern. Entsprechend bietet die Erfindung ebenfalls Zusammensetzungen mit zwei oder mehr der Kombinationspräparate, die für nachhaltige oder kontrollierte Freisetzung formuliert sind.
  • Dosierungen
  • Die effektive Dosis eines Wirkstoffs ist mindestens abhängig von der Art der zu behandelnden Beschwerden, der Toxizität, ob die Verbindungen prophylaktisch eingesetzt wird (niedrigere Dosierung) oder gegen eine aktive Erkrankung oder Beschwerden, die Art der Verabreichung und der pharmazeutischen Formulierung, und kann durch den Klinikarzt mittels konventioneller Dosensteigerungsstudien ermittelt werden.
  • So können beispielsweise Zusammensetzungen der Erfindung (z. B. Tabletten) dazu formuliert werden, effektive Dosen zu ergeben. Zum Beispiel kann in Bezug auf Verbindung 1 oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz von dieser die Zusammensetzung 1,0 mg bis 100 mg, 5 mg bis 40 mg, 30 mg bis 50 mg, oder 20 mg oder 40 mg davon enthalten und für die Verabreichung einmal oder mehrmals täglich an einen Menschen, der sie benötigt, in Kombination mit einer oder mehreren der folgenden Verbindungen ausgelegt sein: Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 6, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16. So kann in Bezug auf Verbindung 2 oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz von dieser die Zusammensetzung 25 mg bis 800 mg, 50 mg bis 400 mg, oder 60 mg bis 300 mg, oder 70 mg bis 200 mg oder ggf. 150 mg davon enthalten und für die Verabreichung einmal oder mehrmals täglich an einen Menschen, der sie benötigt, in Kombination mit einer oder mehreren der folgenden Verbindungen ausgelegt sein: Verbindung 1, Verbindung 3, Verbindung 6, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16. So kann in Bezug auf Verbindung 3 oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz von dieser die Zusammensetzung 10 mg bis 1000 mg, oder 50 mg bis 400 mg, oder 100 mg bis 400 mg, oder 200 mg bis 400 mg davon enthalten und für die Verabreichung einmal oder mehrmals täglich an einen Menschen, der sie benötigt, in Kombination mit einer oder mehreren der folgenden Verbindungen ausgelegt sein: Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 6, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16. So kann in Bezug auf Verbindung 4 oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz von dieser die Zusammensetzung 25 mg bis 400 mg oder 25 mg bis 200 mg enthalten und für die Verabreichung einmal oder mehrmals täglich an einen Menschen, der sie benötigt, in Kombination mit einer oder mehreren der folgenden Verbindungen ausgelegt sein: Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 6, Verbindung 5 und Verbindung 7. So kann in Bezug auf Verbindung 5 oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz von dieser die Zusammensetzung 50 mg bis 1000 mg, oder 100 mg bis 750 mg davon enthalten und für die Verabreichung einmal oder mehrmals täglich an einen Menschen, der sie benötigt, in Kombination mit einer oder mehreren der folgenden Verbindungen ausgelegt sein: Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 6, Verbindung 4, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und 16. So kann in Bezug auf Verbindung 6 oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz von dieser die Zusammensetzung 1 mg bis 500 mg, oder 3 mg bis 300 mg oder 3 mg bis 200 mg, oder 3 mg bis 100 mg, oder 10 mg bis 90 mg oder 30 mg bis 90 mg davon enthalten und für die Verabreichung einmal oder mehrmals täglich an einen Menschen, der sie benötigt, in Kombination mit einem oder mehreren der folgenden Verbindungen ausgelegt sein: Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16. So kann in Bezug auf Verbindung 7 oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz von dieser die Zusammensetzung 100 Mikrogramm bis 3000 mg, 25 mg bis 2000 mg, oder 50 mg bis 1000 mg davon enthalten und für die Verabreichung einmal oder mehrmals täglich (z. B. vier Mal pro Tag) an einen Menschen, der sie benötigt, in Kombination mit einem oder mehreren der folgenden Verbindungen ausgelegt sein: Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16. In Bezug auf Verbindungen 9 und 10 oder pharmazeutisch verträgliche Salze von diesen kann die Zusammensetzung 10 mg bis 1000 mg täglich (nach US 2010/0298257 ) enthalten. In Bezug auf Verbindung 11 oder pharmazeutisch verträgliche Salze von dieser kann die Zusammensetzung 1 mg bis 1000 mg täglich (nach US 2010/0081628 ) enthalten. Es kann erforderlich sein, eventuell gleichzeitig verabreichte Dosierungen der Verbindungen 1–7 anzupassen, um potenziellen Wechselwirkungen bei Medikamenten Rechnung zu tragen. Obwohl zum Beispiel Verbindung 1 den Stoffwechsel von Medikamenten anscheinend nicht beeinflusst, scheint Verbindung 2 dazu zu führen, dass die Einwirkung von Verbindung 1 um das 2-bis 3-fache erhöht wird. Daher wäre zu erwarten, dass die Dosis von Verbindung 1 (z. B. um das 2- bis 3-fache) vermindert wird, wenn Verbindung 1 mit Verbindung 2 kombiniert wird. In Kombination mit Verbindung 16 erscheint Verbindung 2 die Einwirkung von Verbindung 6 etwa um das 5-fache zu verstärken, so dass eine Verminderung der Dosis (z. B. um das 3- bis 5-fache) von Verbindung 16 zu erwarten wäre, wenn Verbindung 16 mit Verbindung 2 dosiert wird. Daher entspricht eine Dosis von 10 mg von Verbindung 6 bei gemeinsamer Verabreichung mit Verbindung 2 etwa einer Dosis von 30 mg.
  • Die zwei oder mehr Kombinationspräparate können gemeinsam mit Ribavirin in Mengen von ca. 800 mg, 1000 mg oder 1200 mg täglich in einer einzigen oder mehreren Dosierungen verabreicht werden (z. B. ca. 400 mg, 500 mg oder 600 mg zweimal täglich).
  • Kombinationen der Erfindung zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen
  • In der praktischen Anwendung dieses Aspekts der Erfindung können Kombinationspräparate in den vorstehend genannten Dosierungen eingesetzt werden.
  • Ein Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 1 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 1 in Kombination mit einer zweiten Verbindung verwendet wird, die aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt wird. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5 oder Verbindung 6 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 2 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 2 in Kombination mit einer zweiten Verbindung verwendet wird, die aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt wird. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 3 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 3 in Kombination mit einer zweiten Verbindung verwendet wird, die aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt wird. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 oder Verbindung 6 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 4 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 4 in Kombination mit einer zweiten Verbindung verwendet wird, die aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt wird. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 oder Verbindung 2 oder Verbindung 3 oder Verbindung 6 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 5 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 5 in Kombination mit einer zweiten Verbindung verwendet wird, die aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt wird. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 6 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 6 in Kombination mit einer zweiten Verbindung verwendet wird, die aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt wird. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3 oder Verbindung 4 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 7 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 7 in Kombination mit einer zweiten Verbindung verwendet wird, die aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt wird.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 9 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 9 in Kombination mit einer zweiten Verbindung verwendet wird, die aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt wird.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 10 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 10 in Kombination mit einer zweiten Verbindung verwendet wird, die aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt wird.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 11 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 11 in Kombination mit einer zweiten Verbindung verwendet wird, die aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt wird.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 12 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 12 in Kombination mit einer zweiten Verbindung verwendet wird, die aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt wird.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 13 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 13 in Kombination mit einer zweiten Verbindung verwendet wird, die aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt wird.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 14 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 14 in Kombination mit einer zweiten Verbindung verwendet wird, die aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt wird.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 15 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 15 in Kombination mit einer zweiten Verbindung verwendet wird, die aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt wird.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 16 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 16 in Kombination mit einer zweiten Verbindung verwendet wird, die aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt wird.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 1 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 1 in Kombination mit einer zweiten Verbindung und einer dritten Verbindung verwendet wird, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5 oder Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 2 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 2 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 2 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 2 in Kombination mit einer zweiten Verbindung und einer dritten Verbindung verwendet wird, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 3 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 3 in Kombination mit einer zweiten Verbindung und einer dritten Verbindung verwendet wird, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 oder Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 4 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 4 in Kombination mit einer zweiten Verbindung und einer dritten Verbindung verwendet wird, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3 oder Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 2 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 3 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 2 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 5 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 5 in Kombination mit einer zweiten Verbindung und einer dritten Verbindung verwendet wird, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 6 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 6 in Kombination mit einer zweiten Verbindung und einer dritten Verbindung verwendet wird, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3 oder Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 2 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 3 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 2 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 7 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 7 in Kombination mit einer zweiten Verbindung und einer dritten Verbindung verwendet wird, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 9 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 9 in Kombination mit einer zweiten Verbindung und einer dritten Verbindung verwendet wird, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt werden.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 10 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 10 in Kombination mit einer zweiten Verbindung und einer dritten Verbindung verwendet wird, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt werden.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 11 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 11 in Kombination mit einer zweiten Verbindung und einer dritten Verbindung verwendet wird, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt werden.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 1 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 1 in Kombination mit einer zweiten Verbindung, einer dritten Verbindung und einer vierten Verbindung verwendet wird, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5 oder Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 2 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 2 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 2 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 2 in Kombination mit einer zweiten Verbindung, einer dritten Verbindung und einer vierten Verbindung verwendet wird, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 3 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 3 in Kombination mit einer zweiten Verbindung, einer dritten Verbindung und einer vierten Verbindung verwendet wird, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 oder Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 4 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 4 in Kombination mit einer zweiten Verbindung, einer dritten Verbindung und einer vierten Verbindung verwendet wird, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3 oder Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 2 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 3 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 2 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 5 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 5 in Kombination mit einer zweiten Verbindung, einer dritten Verbindung und einer vierten Verbindung verwendet wird, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 6 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 6 in Kombination mit einer zweiten Verbindung, einer dritten Verbindung und einer vierten Verbindung verwendet wird, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3 oder Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 2 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 3 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 2 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 7 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 7 in Kombination mit einer zweiten Verbindung, einer dritten Verbindung und einer vierten Verbindung verwendet wird, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 9 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 9 in Kombination mit einer zweiten Verbindung, einer dritten Verbindung und einer vierten Verbindung verwendet wird, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt werden.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 10 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 10 in Kombination mit einer zweiten Verbindung, einer dritten Verbindung und einer vierten Verbindung verwendet wird, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt werden.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 11 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 11 in Kombination mit einer zweiten Verbindung, einer dritten Verbindung und einer vierten Verbindung verwendet wird, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt werden.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 1 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 1 in Kombination mit einer zweiten Verbindung, einer dritten Verbindung, einer vierten Verbindung und einer fünften Verbindung verwendet wird, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5 oder Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 2 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 2 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 2 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 2 in Kombination mit einer zweiten Verbindung, einer dritten Verbindung, einer vierten Verbindung und einer fünften Verbindung verwendet wird, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 3 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 3 in Kombination mit einer zweiten Verbindung, einer dritten Verbindung, einer vierten Verbindung und einer fünften Verbindung verwendet wird, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 oder Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 4 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 4 in Kombination mit einer zweiten Verbindung, einer dritten Verbindung, einer vierten Verbindung und einer fünften Verbindung verwendet wird, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3 oder Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 2 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 3 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 2 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 5 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 5 in Kombination mit einer zweiten Verbindung, einer dritten Verbindung, einer vierten Verbindung und einer fünften Verbindung verwendet wird, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 6 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 6 in Kombination mit einer zweiten Verbindung, einer dritten Verbindung, einer vierten Verbindung und einer fünften Verbindung verwendet wird, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12; Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3 oder Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 2 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 3 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 2 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 7 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 7 in Kombination mit einer zweiten Verbindung, einer dritten Verbindung, einer vierten Verbindung und einer fünften Verbindung verwendet wird, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 9 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 9 in Kombination mit einer zweiten Verbindung, einer dritten Verbindung, einer vierten Verbindung und einer fünften Verbindung verwendet wird, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt werden.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 10 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 10 in Kombination mit einer zweiten Verbindung, einer dritten Verbindung, einer vierten Verbindung und einer fünften Verbindung verwendet wird, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt werden.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Verbindung 11 zur Verwendung in Mitteln zur Behandlung von HCV-Infektionen, wobei Verbindung 11 in Kombination mit einer zweiten Verbindung, einer dritten Verbindung, einer vierten Verbindung und einer fünften Verbindung verwendet wird, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt werden.
  • Ein Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 1 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung, die aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt wird. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5 oder Verbindung 6 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 2 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung, die aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt wird. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 3 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung, die aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt wird. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 oder Verbindung 6 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 4 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung, die aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt wird. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 oder Verbindung 2 oder Verbindung 3 oder Verbindung 6 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 5 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung, die aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt wird. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 6 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung, die aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt wird. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3 oder Verbindung 4 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 7 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung, die aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt wird.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 9 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung, die aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt wird.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 10 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung, die aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt wird.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 11 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung, die aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt wird.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 1 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung und einer dritten Verbindung, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5 oder Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 2 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 2 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln.
  • Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 2 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung und einer dritten Verbindung, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 3 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung und einer dritten Verbindung, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 oder Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 4 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung und einer dritten Verbindung, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3 oder Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 2 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 3 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 2 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 5 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung und einer dritten Verbindung, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 6 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung und einer dritten Verbindung, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3 oder Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 2 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 3 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 2 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 7 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung und einer dritten Verbindung, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 9 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung und einer dritten Verbindung, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt werden.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 10 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung und einer dritten Verbindung, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt werden.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 11 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung und einer dritten Verbindung, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt werden.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 1 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung, eine dritten Verbindung und einer vierten Verbindung, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5 oder Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 2 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 2 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 2 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung, eine dritten Verbindung und einer vierten Verbindung, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 3 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung, eine dritten Verbindung und einer vierten Verbindung, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 oder Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 4 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung, eine dritten Verbindung und einer vierten Verbindung, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3 oder Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 2 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 3 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 2 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 5 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung, eine dritten Verbindung und einer vierten Verbindung, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 6 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung, eine dritten Verbindung und einer vierten Verbindung, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3 oder Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 2 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 3 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 2 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 7 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung, eine dritten Verbindung und einer vierten Verbindung, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 9 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung, eine dritten Verbindung und einer vierten Verbindung, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt werden.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 10 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung, eine dritten Verbindung und einer vierten Verbindung, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt werden.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 11 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung, eine dritten Verbindung und einer vierten Verbindung, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt werden.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 1 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung, einer dritten Verbindung, einer vierten Verbindung und einer fünften Verbindung, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5 oder Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 2 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 2 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln.
  • Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 2 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung, einer dritten Verbindung, einer vierten Verbindung und einer fünften Verbindung, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 3 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung, einer dritten Verbindung, einer vierten Verbindung und einer fünften Verbindung, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 oder um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 4 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung, einer dritten Verbindung, einer vierten Verbindung und einer fünften Verbindung, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3 oder Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 2 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 3 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln.
  • Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 2 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 5 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung, einer dritten Verbindung, einer vierten Verbindung und einer fünften Verbindung, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 6 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung, einer dritten Verbindung, einer vierten Verbindung und einer fünften Verbindung, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3 und Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 2 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 1 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 3 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 4 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 6 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 2 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln. Bei der zweiten Verbindung kann es sich um Verbindung 3 und bei der dritten Verbindung um Verbindung 4 handeln.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 7 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung, einer dritten Verbindung, einer vierten Verbindung und einer fünften Verbindung, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 ausgewählt werden.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 9 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung, einer dritten Verbindung, einer vierten Verbindung und einer fünften Verbindung, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt werden.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 10 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung, einer dritten Verbindung, einer vierten Verbindung und einer fünften Verbindung, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt werden.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Mittel zur Linderung von einem oder mehr Symptomen der HCV-Infektion beim Menschen, Mittel zur Verminderung der viralen Belastung bei einem Menschen, bei dem HCV diagnostiziert wurde, Mittel zur Behandlung von HCV bei einer Testperson und Mittel zur Reduktion des Auftretens von HCV-Quasispecies, die gegen gleichzeitig verabreichte orale antivirale Mittel resistent sind, wobei jedes Mittel die Verabreichung von Verbindung 11 umfasst, ferner die Verabreichung einer zweiten Verbindung, einer dritten Verbindung, einer vierten Verbindung und einer fünften Verbindung, die jeweils aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 5, Verbindung 6 und Verbindung 7 ausgewählt werden.
  • Wege und Arten der Verabreichung
  • Zwei oder mehr von Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 sowie etwaige weitere Bestandteile einer Kombinationstherapie können für jeden Verabreichungsweg, der für den zu behandelnden Zustand angemessen ist, angepasst werden. Geeignete Verabreichungswege sind unter anderem der orale, rektale, nasale, topische (einschließlich bukkale und sublinguale), vaginale und parenterale (einschließlich subkutane, intramuskuläre, intravenöse, intradermale, intrathekale und epidurale) Weg und dgl. Es liegt auf der Hand, dass der bevorzugte Verabreichungsweg je nach dem Zustand Empfängers unterschiedlich sein kann.
  • Ein synergistischer Effekt kann möglicherweise erzielt werden, wenn die aktiven Inhaltsstoffe sind wie folgt: (1) koformuliert (beispielsweise als einheitliche Dosierungsform) und gleichzeitig in einer Kombinationsformulierung verabreicht oder zugeführt werden; (2) durch alternierendes oder paralleles Verabreichen als separate Formulierungen zugeführt werden; oder (3) mittels eines anderen Therapieprotokolls zugeführt werden. Bei der Zufuhr als alternierende Therapie kann sich ein synergistischer Effekt möglicherweise einstellen, wenn die Verbindungen sequenziell in Folge verabreicht oder zugeführt werden, beispielsweise als separate Tabletten, Pillen oder Kapseln, oder als unterschiedliche Injektionen in separaten Spritzen. Allgemein wird bei einer Alternierungstherapie eine wirksame Dosis jedes aktiven Inhaltsstoffes sequenziell verabreicht, d. h. in Serie, während bei der Kombinationstherapie wirksame Dosierungen von zwei oder mehr aktiven Inhaltsstoffen gemeinsam verabreicht werden.
  • Die gemeinsame Verabreichung einer Kombinationsverbindung mit einer oder mehreren Kombinationsverbindungen bezieht sich allgemein auf die gleichzeitige oder sequenzielle Verabreichung einer oder mehrerer Kombinationsverbindungen, sodass therapeutisch wirksame Mengen von zwei oder mehr Kombinationsverbindungen im Körper des Patienten vorliegen. In manchen Fällen werden Kombinationsverbindungen (beispielsweise drei oder vier Kombinationsverbindungen) koformuliert, sodass sie zur gleichen Zeit verabreicht werden können. Mitunter können koformulierte Kombinationsverbindungen gemeinsam mit einem oder mehreren weiteren Kombinationsverbindungen verabreicht werden.
  • Eine Koverabreichung schließt ferner die Verabreichung von Einheitsdosierungen der Kombinationsverbindungen vor und nach der Verabreichung von Einheitsdosierungen eines oder mehrerer anderer aktiver Inhaltsstoffe ein, wie beispielsweise die Verabreichung von zwei oder mehr Kombinationsverbindungen innerhalb von Sekunden, Minuten oder Stunden nach der Verabreichung eines oder mehrerer anderer aktiver Inhaltsstoffe. Beispielsweise kann eine Einheitsdosis einer Kombinationsverbindung zuerst verabreicht werden, gefolgt innerhalb weniger Sekunden oder Minuten von der Verabreichung einer Einheitsdosis einer zweiten Kombinationsverbindung, gefolgt innerhalb von Sekunden oder Minuten von der Verabreichung einer Einheitsdosis einer oder mehrerer weiterer aktiven Inhaltsstoffe. Alternativ kann eine Einheitsdosis eines oder mehrerer aktiver Inhaltsstoffe zuerst verabreicht werden, gefolgt innerhalb von Sekunden oder Minuten von der Verabreichung einer Einheitsdosis einer Kombinationsverbindung, gefolgt innerhalb von Sekunden oder Minuten von der Verabreichung einer Einheitsdosis einer zweiten Kombinationsverbindung. In manchen Fällen kann es wünschenswert sein, eine Einheitsdosis einer Kombinationsverbindung zuerst zu verabreichen, gefolgt nach einem stundenweisen Zeitraum (beispielsweise 1–12 Stunden) durch die Verabreichung einer Einheitsdosis einer zweiten Kombinationsverbindung, gefolgt nach einem stundenweisen Zeitraum (beispielsweise 1–12 Stunden) von der Verabreichung einer Einheitsdosis eines oder mehrerer aktiver Inhaltsstoffe. In anderen Fällen kann es wünschenswert sein, eine Einheitsdosis eines oder mehrerer aktiver Inhaltsstoffe zuerst zu verabreichen, gefolgt nach einem stundenweisen Zeitraum (beispielsweise 1–12 Stunden) durch die Verabreichung einer Einheitsdosis einer Kombinationsverbindung, gefolgt nach einem stundenweisen Zeitraum (beispielsweise 1–12 Stunden) von der Verabreichung einer Einheitsdosis einer zweiten Kombinationsverbindung. In Fällen, wenn drei oder mehr Kombinationsverbindungen mit einem oder mehreren zusätzlichen aktiven Inhaltsstoffen verabreicht werden, können die Kombinationsverbindungen nacheinander innerhalb von Sekunden, Minuten oder Stunden (beispielsweise 1–12 Stunden) verabreicht werden und der eine oder die mehreren zusätzlichen aktiven Inhaltsstoffe können vor, während oder nach der Verabreichung der Kombinationsverbindungen verabreicht werden. In Fällen, wenn Kombinationsverbindungen koformuliert sind, können sie gleichzeitig oder vor oder nach der Verabreichung des einen oder der mehreren zusätzlichen aktiven Inhaltsstoffe verabreicht werden.
  • Sofern nichts Anderweitiges spezifiziert ist, kann die Kombinationstherapie in getrennten Dosierungsformen mit jedem aktiven Inhaltsstoff verabreicht werden, gemeinsam oder separat, sequenziell oder gleichzeitig, sowie in kurzen oder langen zeitlichen Abständen voneinander.
  • Die Behandlungsdauer kann sich beispielsweise über einen Zeitraum von 12 Wochen bis etwa 48 Wochen oder länger erstrecken, beispielsweise über einen Zeitraum von 12 Wochen bis etwa 24 Wochen.
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet eine Kombination therapeutisch wirksamer Komponenten zur Verbesserung mindestens eines Symptoms einer HCV-Infektion beim Menschen, einschließlich, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein, Übelkeit, Erbrechen, Appetitlosigkeit, Müdigkeit, Gelbsucht, Erbrechen, Durchfall, Dehydrierung, Bauchweh und Leberzirrhose. Zudem kann es bei manchen HCV-infizierten Personen durch den Einsatz der Kombinationstherapie zu einer statistisch signifikanten Reduzierung der Viruslast viraler HCV-Partikel im Körper der infizierten Person kommen. Die Viruslast kann beispielsweise durch die Messung der HCV-RNA-Werte in Plasma, beispielsweise mittels COBAS TaqMan HCV Assay (Roche Molecular Systems), ermittelt werden. In der Regel erfährt eine mit den erfindungsgemäßen Kombinationsverbindungen behandelte HCV-infizierte Person eine Verbesserung eines oder aller der mit der HCV-Infektion in Verbindung gebrachten Symptome.
  • Kombinationen von zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen und Ribavirin, jedoch ohne Interferon
  • Wie weiter oben besprochen, sehen manche der aktuellen HCV-Behandlungen unter anderem die Verabreichung von Interferon vor; jedoch ist diese Behandlung in der Regel mit unerwünschten Nebenwirkungen belastet. Demnach wäre es wünschenswert, wirksame HCV-Behandlungen zu finden, die ohne Interferon auskommen.
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht Zusammensetzungen, Mittel und dgl. für die Behandlung von HCV vor umfassend die Verabreichung von zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen oder der pharmazeutisch verträglichen Salze davon sowie von Ribavirin und ohne das Verabreichen eines oder mehrerer Interferone. Dieser Aspekt der Erfindung ist möglicherweise ganz besonders brauchbar, denn hierdurch wird eine effektive HCV-Behandlung ohne die Nebenwirkungen, die mit der Verabreichung eines oder mehrerer Interferone in Verbindung gebracht werden, ermöglicht.
  • In einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist die vereinte Menge von Ribavirin und der Kombinationsverbindungen oder pharmazeutisch verträglicher Salze davon, wahlweise mit einem oder mehreren weiteren Agenzien, in der Behandlung einer HCV-Infektion wirksam.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht unter anderem Mittel zur Verbesserung eines oder mehrerer der Symptome einer HCV-Infektion beim Menschen vor umfassend wie folgt: die Verabreichung von zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen oder der pharmazeutisch verträglichen Salze davon sowie von Ribavirin und ohne die gleichzeitige Verabreichung eines oder mehrerer Interferone. Die vorliegende Erfindung schließt eine potenzielle Dosierung eines oder mehrerer Interferone in dieser Hinsicht zwar nicht aus; stattdessen kann die vorliegende Erfindung gemeinsam mit einer anderen Therapie eingesetzt werden, die in der Tat ein oder mehrere Interferone einschließt. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht unter anderem eine wirksame Behandlung von HCV-Erkrankungen mit Ribavirin und ohne die Notwendigkeit eines oder mehrerer Interferone vor.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht unter anderem Mittel zur Herabsetzung der Viruslast bei einem mit einer HCV-Erkrankung diagnostizierten Menschen vor, umfassend; die Verabreichung von zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen davon sowie Ribavirin jedoch ohne ein oder mehr Interferone.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht unter anderem Mittel zur Behandlung von HCV-Erkrankungen beim Menschen vor, im Wesentlichen bestehend aus der Verabreichung von Ribavirin gemeinsam mit zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen davon.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht unter anderem Mittel zur Reduzierung des Entstehens von HCV-Quasispezies mit Resistenz gegen koverabreichte orale antivirale Agenzien vor umfassend: die Verabreichung von zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen davon sowie Ribavirin und ohne die gleichzeitige Verabreichung von einem oder mehreren Interferonen.
  • Ähnlich sieht ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung unter anderem eine Zusammensetzung vor, beispielsweise eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verbesserung eines oder mehrerer der Symptome der HCV-Infektion beim Menschen umfassend: zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen davon sowie Ribavirin und ohne Verabreichung von einem oder mehreren Interferonen. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht unter anderem eine Zusammensetzung zu Herabsetzung der Viruslast beim mit einer HCV-Erkrankung diagnostizierten Menschen vor umfassend: zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen davon sowie Ribavirin jedoch ohne ein oder mehr Interferone. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht unter anderem eine Zusammensetzung zur Behandlung einer HCV-Erkrankung beim Menschen vor bestehend im Wesentlichen aus Ribavirin gemeinsam mit einer oder mehreren der Kombinationsverbindungen oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen davon. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht unter anderem eine Zusammensetzung zur auf Ribavirin gestützten HCV-Therapie vor umfassend: zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen davon und mit dem Vorbehalt, dass diese Zusammensetzung nicht einen oder mehrere Interferone beinhaltet. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht unter anderem eine Zusammensetzung zur Reduzierung der Entstehung von HCV-Quasispezies mit Resistenz gegen koverabreichte orale antivirale Agenzien vor umfassend: ein oder mehrere Kombinationsverbindungen oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen davon sowie Ribavirin und ohne ein oder mehrere Interferone.
  • Ähnlich sieht ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung unter anderem die Verwendung wie folgt vor: von zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen davon sowie Ribavirin und ohne ein oder mehrere Interferone bei der Produktion eines Arzneimittels zur Verbesserung eines oder mehrerer Symptome einer HCV-Infektion beim Menschen; sowie die Verwendung von: zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen davon und Ribavirin jedoch ohne ein oder mehrere Interferone bei der Produktion eines Arzneimittels zur Herabsetzung der Viruslast beim mit einer HCV-Erkrankung diagnostizierten Menschen; sowie die Verwendung von Ribavirin gemeinsam mit zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen davon bei der Produktion eines Arzneimittels zur Behandlung von HCV-Erkrankungen beim Menschen, wobei diese Verwendung nicht die Gabe von einem oder mehreren Interferonen einschließt; sowie die Verwendung von zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen davon bei der Produktion eines Arzneimittels für eine auf Ribavirin gestützte HCV-Therapie, wobei im Rahmen dieser Verwendung die Verabreichung von einem oder mehreren Interferonen vermieden wird; sowie die Verwendung von zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen davon und Ribavirin ohne die Verwendung eines oder mehrerer Interferone bei der Produktion eines Arzneimittels zur Reduzierung des Entstehens von HCV-Quasispezien, die gegen koverabreichte orale antivirale Agenzien resistent sind.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht unter anderem eine Kombination vor, die Ribavirin und zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen davon umfasst, und wobei eine solche Kombination im Wesentlichen frei von einem oder mehreren Interferonen ist. In einem Ausführungsbeispiel kann die Kombination in separaten Dosierungsformen mit jedem aktiven Inhaltsstoff vorliegen, die gemeinsam oder getrennt, sequenziell oder gleichzeitig, in engen oder langen zeitlichen Abständen verabreicht werden.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht unter anderem ein Kit vor umfassend: Ribavirin, zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen und Anleitungen hinsichtlich eines Behandlungsprotokolls zur Behandlung, Reduzierung der Viruslast oder dem Aufschieben des Entstehens oder der Progression der HCV-Erkrankung, wobei das Behandlungsprotokoll unter anderem die Verabreichung von zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen und von Ribavirin ohne Verabreichung von einem oder mehreren Interferonen vorsieht. In einem Ausführungsbeispiel kann ein solches Kit unter anderem eine Verpackung enthalten, wie etwa eine Blisterpackung. Alternativ kann ein solches Kit individuelle, verschriebene Artikel und Dosierungen bereitstellen, wobei jede Komponente als separat verpacktes Arzneimittel vorliegt, die aber in Kombination mit den Anleitungen zur Durchführung des Behandlungsprotokolls zur Behandlung, Reduzierung der Viruslast oder dem Herausschieben des Symptomeintretens oder der Progression einer HCV-Erkrankung verwendet werden, was entsprechend in den Geltungsrahmen der vorliegenden Erfindung fällt.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht unter anderem eine pharmazeutische Zusammensetzung vor umfassend wie folgt: Ribavirin, zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen davon und von einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägermaterialien. In einem Ausführungsbeispiel kann die pharmazeutische Zusammensetzung als einheitliche Dosierungsform vorliegen.
  • Insofern nichts Anderweitiges spezifiziert ist, kann die Kombinationstherapie mit Ribavirin als separate Dosierungsform verabreicht werden, wobei jeder verabreichte aktive Inhaltsstoff (einschließlich der Kombinationsverbindungen) gemeinsam (beispielsweise als Einheitsdosierung, wie etwa als Tablette) oder getrennt, sequenziell oder gleichzeitig und in engen oder langen zeitlichen Abständen voneinander verabreicht werden können. Bei getrennter Verabreichung können alle Verbindungen jeweils zur gleichen Zeit mit den jeweils anderen oder vor oder nach einer solchen Verabreichung solcher anderer Verbindung(en) verabreicht werden. Die aktiven Inhaltsstoffe können täglich verabreicht werden. Bei einem Ausführungsbeispiel wird eine tägliche Dosierung aktiver Inhaltsstoffe in getrennten Unterdosierungen verabreicht, wie etwa einmal, zweimal, dreimal oder viermal am Tag.
  • Es ist von Vorteil, wenn die tägliche Dosierung der Kombinationsverbindungen oder der pharmazeutisch verträglichen Salze davon und von Ribavirin einmal pro Tag verabreicht werden darf.
  • Obwohl die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, Mittel und dgl. zur Behandlung von HCV-Erkrankungen umfassend die Verabreichung von zwei oder mehr Kombinationsverbindungen oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen davon sowie Ribavirin jedoch ohne ein oder mehrere Interferone vorsieht, schließt die vorliegende Erfindung das Potenzial der Dosierung eines oder mehrerer Interferone beim Menschen nicht aus. Stattdessen kann die vorliegende Erfindung gemeinsam mit einer anderen Therapie für eine andere Indikation verwendet werden, die in der Tat die Verwendung von einem oder mehreren Interferonen vorsieht.
  • Kombinationen von zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen mit Ribavirin und Interferon
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht Zusammensetzungen, Mittel und dgl. vor umfassend die Verabreichung von zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen davon sowie Ribavirin und von einem oder mehreren Interferonen zur Behandlung einer HCV-Erkrankung. Die Verabreichung von [einem oder] mehr Interferonen kann in einem zeitlichen Verhältnis zu der Verabreichung der Kombinationsverbindungen und Ribavirin stehen.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht unter anderem Mittel zur Verbesserung eines oder mehrerer der Symptome einer HCV-Infektion beim Menschen vor umfassend: die Verabreichung von zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen davon, Ribavirin und von einem oder mehreren Interferonen. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht unter anderem Mittel zur Reduzierung der Viruslast beim mit einer HCV-Erkrankung diagnostizierten Menschen vor umfassend: die Verabreichung von zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen davon gemeinsam mit Ribavirin und einem oder mehreren Interferonen.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht unter anderem Mittel einer auf Ribavirin gestützten HCV-Therapie vor umfassend: die Verabreichung von zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen davon gemeinsam mit Ribavirin und einem oder mehreren Interferonen.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht unter anderem Mittel zur Reduzierung des Auftretens von gegenüber koverabreichten oralen, antiviralen Agenzien resistenten HCV-Quasispezies vor umfassend die Verabreichung von zwei der mehr der Kombinationsverbindungen oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen davon gemeinsam mit Ribavirin und einem oder mehreren Interferonen.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht unter anderem die Verwendung von zwei oder mehr Kombinationsverbindungen oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen davon gemeinsam mit Ribavirin und einem oder mehreren Interferonen bei der Produktion eines Arzneimittels zur Verbesserung eines oder mehrerer Symptome einer HCV-Infektion beim Menschen vor. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht unter anderem die Verwendung von zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen davon gemeinsam mit Ribavirin und einem oder mehreren Interferonen bei der Produktion eines Arzneimittels zur Reduzierung der Viruslast beim mit einer HCV-Erkrankung diagnostizierten Menschen vor. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht unter anderem die Verwendung von Ribavirin gemeinsam mit zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen davon bei der Produktion eines Arzneimittels zur Behandlung einer HCV-Erkrankung beim Menschen vor, wobei diese Verwendung unter anderem die Verwendung eines oder mehrerer Interferone vorsieht. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht unter anderem die Verwendung von zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen davon bei der Produktion eines Arzneimittels für die auf Ribavirin gestützte HCV-Therapie vor, wobei diese Verwendung unter anderem die Verabreichung von einem oder mehreren Interferonen vorsieht. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht unter anderem die Verwendung von einer oder mehr der Kombinationsverbindungen oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen davon, von Ribavirin und einem oder mehreren Interferonen bei der Produktion eines Arzneimittels zur Reduzierung des Auftretens von gegenüber den koverabreichten oralen, antiviralen Agenzien resistenten HCV-Quasispezies vor. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht unter anderem eine Kombination umfassend: Ribavirin und zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen oder von pharmazeutisch verträglichen Salzen davon vor, wobei die Kombination unter anderem einen oder mehrere Interferone vorsieht.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht unter anderem ein Kit vor umfassend: Ribavirin, zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen und ein oder mehrere Interferone; sowie Anleitungen für ein Behandlungsprotokoll zur Behandlung, Reduzierung der Viruslast oder zum Aufschub des Auftretens oder der Progression der HCV-Erkrankung, wobei das Behandlungsprotokoll unter anderem die Verabreichung von zwei oder mehr Kombinationsverbindungen und Ribavirin sowie die Verabreichung von einem oder mehreren Interferonen vorsieht. In einem Ausführungsbeispiel kann als Bestandteil eines solchen Kits eine Verpackung vorgesehen sein, wie etwa eine Blisterpackung. Alternativ kann ein solches Kit individuelle Verschreibungen vorsehen und die Dosierung jedes Bestandteils kann als separat verpacktes Arzneimittel vorgesehen sein, jedoch in Kombination mit den Anleitungen und im Hinblick auf das Behandlungsprotokoll für die Behandlung, Reduzierung der Viruslast oder dem Aufschub des Auftretens oder der Progression der HCV-Erkrankung dienen, was auch in den Geltungsrahmen der Erfindung fallen soll.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht unter anderem eine pharmazeutische Zusammensetzung vor umfassend: zwei oder mehr der Kombinationsverbindungen oder pharmazeutisch verträgliche Salzen davon, Ribavirin und ein oder mehrere Interferone; sowie ein oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Trägermaterialien. In einem Ausführungsbeispiel kann die pharmazeutische Zusammensetzung eine einheitliche Dosierungsform sein.
  • Soweit nichts Anderweitiges spezifiziert ist, kann die Kombinationstherapie mit Ribavirin und mit einem oder mehreren Interferonen als getrennte Dosierungsformen vorliegen, wobei ein oder mehrere Interferone dem Patienten verabreicht werden und alle der verbleibenden im Rahmen der Kombinationstherapie (unter anderem die Kombinationsverbindungen) zu verwendenden aktiven Inhaltsstoffe gemeinsam verabreicht werden (beispielsweise als Einheitsdosis wie etwa in Form einer Tablette) oder separat, sequenziell oder gleichzeitig und in engen oder langen zeitlichen Abständen. Sofern die Verabreichung getrennt vorgenommen wird, kann jeder aktive Inhaltsstoff gleichzeitig mit dem bzw. den anderen verabreicht werden oder entweder vor oder nach der Verabreichung eines solchen jeweiligen Inhaltsstoffs. Die aktiven Inhaltsstoffe können täglich verabreicht werden. In einem Ausführungsbeispiel wird eine tägliche Dosis in getrennten Unterdosierungen verabreicht, wie etwa einmal, zweimal, dreimal oder viermal pro Tag.
  • Kombinationstherapie, einschließlich zusätzlicher Therapeutika
  • In einem anderen Ausführungsbeispiel schließen nicht einschränkende Beispiele geeigneter Kombinationen unter anderem die Kombinationen von zwei oder mehr von Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5, Verbindung 6, Verbindung 7, Verbindung 9, Verbindung 10, Verbindung 11, Verbindung 12, Verbindung 13, Verbindung 14, Verbindung 15 und Verbindung 16 mit einem oder mehreren zusätzlichen aktiven Inhaltsstoffen, einschließlich HCV-NS3-Protease-Inhibitoren, Alpha-Glucosidase 1 Inhibitoren, leberschützende Agenzien, Nukleosid- oder Nukleotid-Inhibitoren der HCV NS5B Polymerase, Nicht-Nukleosid-Inhibitoren der HCV NS5B-Polymerase, HCV NS5A-Inhibitoren, TLR-7 Agonisten, Cyclophilin-Inhibitoren, HCV IRES-Inhibitoren, HCV-Eingangshemmer, HCV-Maturationshemmer, HCV-Assemblierungshemmer, HCV-Infektivitätshemmer und pharmakokinetische Optimierer sowie andere Arzneimittel für die HCV-Behandlung, ein. Ferner ist es im Einzelnen möglich, eine oder mehrere Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit einer oder mehreren der aus der folgenden Gruppe ausgewählten Verbindungen zu kombinieren bestehend aus:
    • (i) HCV-NS3-Protease-Inhibitoren, beispielsweise Boceprevir (SCH-503034, SCH-7), Telaprevir (VX-950), TMC-435 (IUPAC N-[(2R,3aR,10Z,11aS,12aR,14aR)-2-[2-(4-Isopropylthiazol-2-yl)-7-methoxy-8-methylchinolin-4-yloxy]-5-methyl-4,14-dioxo-1,2,3,3a,4,5,6,7,8,9,11a,12,12a,13,14,14a-hexadecahydrocyclopenta[c]cyclopropa[g][1,6]diazacyclotetradecin-12a-ylcarbonyl]cyclopropansulfonamid], ABT-450, ACH-1625, ACH-2684, BI-201335, BI-1230, MK-5172, MK-7009, SCH-900518, VBY-376, VX-500, GS-9256, GS-9451, BMS-605339, PHX-1766, AS-101, YH-5258, YH-5530, YH-5531 und ITMN-191 (R-7227);
    • (ii) Alpha-Glucosidase-1-Inhibitoren, beispielsweise Celgosivir (MX-3253), UT-231B, Miglitol;
    • (iii) Schutzmittel für die Leber, beispielsweise Emericasan (IDN-6556), ME-3738, Silibilin und MitoQ;
    • (iv) Nucleosid- oder Nukleotid-Inhibitoren der HCV-NS5B-Polymerase, beispielsweise R1626, R7128 (R4048), IDX184, IDX-102, PSI-661, PSI-938, PSI-7851, PSI-7977, BCX-4678, Valopicitabin (NM-283), MK-0608 und TMC649128;
    • (v) Nicht-Nukleosid-Inhibitoren der HCV-NS5B-Polymerase, beispielsweise Filibuvir (PF-868554), ABT-333, ABT-072, BI-207127, VCH-759, VCH-916, JTK-652, MK-3281, VBY-708, VCH-222, A848837, ANA-598, GL60667, GL59728, A-63890, A-48773, A-48547, BC-2329, VCH-796 (Nesbuvir), GSK625433, BILN-1941, und XTL-2125;
    • (vi) HCV-NS5A-Inhibitoren, beispielsweise ACH-2928, AZD-2836 (A-831), AZD-7295 (A-689), BMS-766, BMS-790052, BMS-824393, and PPI-461;
    • (vii) TLR-7-Agonisten, beispielsweise Imiquimod, 852A, ANA-773, ANA-975, AZD-8848 (DSP-3025), PF-04878691 und SM-360320 sowie Verbindung 8;
    • (viii) Cyclophilin-Inhibitoren, beispielsweise DEBIO-025, SCY-635 und NIM811;
    • (ix) HCV-IRES-Inhibitoren, beispielsweise MCI-067;
    • (x) Pharmakokinetikoptimierer, beispielsweise Roxythromycin, BAS-100, SPI-452, PF-4194477, TMC-41629;
    • (xi) HCV-Eingangshemmer;
    • (xii) HCV-Assemblierungshemmer;
    • (xiii) HCV-Maturationshemmer;
    • (xiv) HCV-Infektivitätshemmer; und
    • (xv) Andere Arzneimittel zur Behandlung von HCV, beispielsweise Thymosin-Alpha-1 (Zadaxin), Nitazoxanid (Alinea, NTZ), BIVN-401 (Virostatikum), PYN-17 (Altirex), KPE02003002, Actilon (CPG-10101), KRN-7000, Civacir, GI-5005, XTL-6865, BIT225, PTX-111, ITX2865, TT-033i, ANA 971, NOV-205, Tarvacin, EHC-18, VGX-410C, EMZ-702, AVI 4065, BMS-650032, BMS-791325, Bavituximab, MDX-1106 (ONO-4538), Oglufanid, FK-788 und VX-497 (Merimepodib).
  • SYNTHESEBEISPIELE
  • Syntheseprotokolle für die Herstellung der Verbindungen 1, 2, 3, 6, 7 und 8 sind aus der Literatur bekannt. Zusätzlich wird ein Syntheseprotokoll für die Herstellung jeder der Kombinationsverbindungen in den Beispielen weiter unten angegeben.
  • Die Verbindung 1 kann unter Verwendung der Syntheseverfahren und Zwischenprodukte, die in US 7,754,720 beschrieben werden, hergestellt werden. Die Verbindung 1 kann auch unter Einhaltung der Beschreibung in dem nachstehenden Beispiel hergestellt werden. Beispiel 1: 5-({6-[2,4-Bis(trifluormethyl)phenyl]pyridazin-3-yl}methyl)-2-(2-fluorophenyl)-5H-imidazo[4,5c]pyridin 1
    Figure DE202012013382U1_0023
    Verbindung MW Menge Mol Äquivalente
    104 453,79 95 mg 0,209 1
    DME 500 μl
    2 N aq. Na2CO3 313 μl 0,626 3
    105 257,93 80,9 mg 0,313 1,5
    Pd(PPh3)4 1155 12 mg 0,0104 0,05
  • Die Verbindung 103 wurde in Dimethoxyethan (DME) gelöst. Diese Lösung wurde mit 2,4-Bis(trifluormethyl)phenylboronsäure 105 und a 2 N aq. einer Na2CO3 Lösung versetzt. Dem sich ergebenden biphasischen Gemisch wurde Pd(PPh3)4 zugesetzt, und die Reaktion wurde 72 Stunden auf 80°C erhitzt. Die Reaktion wurde danach auf RT abgekühlt und durch Celite gefiltert, wonach das Celite mit EtOAc gewaschen wurde. Das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde auf 6 g SiO2 gereinigt, wobei MeOH/CH2Cl2 zur Eluierung der Verbindung verwendet wurde. Die so erhaltene Verbindung wurde mit PPh3(O) kontaminiert. Das Produkt wurde auf einer 1 mm Chromatotron-Platte mit 0 bis 5% MeOH/CH2Cl2 in 1%-Schritten gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden vereint und im Vakuum eingeengt, danach im Hochvakuum 12 Stunden getrocknet. Erhalten wurde 11,8 mg der freien Base der Verbindung 1 ohne PPh3-Kontamination.
    1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 6.20 (s, 2), 7.32 (m, 3), 7.52 (m, 1), 7.78 (d, 1), 7.89 (d, 1), 7.95 (s, 2), 8.15 (m, 3), 8.35 (d, 1), 9.12 (s, 1); LC/MS M+H = 518.
  • Das Zwischenprodukt 104 wurde auf folgende Weise hergestellt. a. Herstellung der Verbindung 102.
    Figure DE202012013382U1_0024
    Verbindung MW Menge mmol Äquivalente
    101 128,56 5 g 38,9 1
    TCCA 232,41 3,62 g 15,6 0,4
    CHCl3 130 ml
  • Einer Lösung des im Handel erhältlichen Ausgangsmaterials 101 in CHCl3 wurde Trichlorisocyanursäure (TCCA) bei 60°C zugesetzt. Danach wurde die Lösung 1,5 Stunden gerührt, abgekühlt und mit HiFlo-Celite gefiltert. Das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt und getrocket. Es ergaben sich eine Ausbeute von 5,037 g der Verbindung 102. b. Herstellung der Verbindung 104.
    Figure DE202012013382U1_0025
    Verbindung MW Menge mmol Äquivalente
    102 163 5,073 g 31,12 1
    103 213,2 6,635 g 31,12 1
    NaOH (10%) 40 1,245 g 31,12 1
    DMF 320 ml
  • Einer Lösung der Verbindung 103 in DMF (Dimethylformamid) wurde mit NaOH zugesetzt. Die Verbindung 102 wurde in DMF (20 ml) gelöst und der Lösung langsam zugesetzt.
  • Die Reaktion wurde 3 Stunden gerührt, mit Wasser verdünnt und EtOAc ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde mit Na2SO4 getrocknet. Danach wurde das Lösungsmittel entfernt und das Produkt mit Dichlormethan umkristallisiert. Es wurde eine Ausbeute von 5,7 g der Verbindung 103 erhalten.
  • Die Verbindung 2 kann mittels Syntheseverfahren und Zwischenprodukten nach der Beschreibung in USSN 12/202319 ( US 20100051763 A1 ) hergestellt werden. Die Verbindung 2 kann auch entsprechend dem folgenden Beispiel hergestellt werden.
  • Beispiel 2: Herstellung der Verbindung 2.
    Figure DE202012013382U1_0026
  • Das Phosphinatester 206 (23,7 g, 24,05 mmol) wurde in CH3CN (240 ml) gelöst und auf 0°C abgekühlt. Iodtrimethylsilan (17,4 ml, 122,3 mmol) wurde rasch zugetropft, gefolgt nach 10 Minuten von 2,6-Lutidin (17,0 ml, 146,4 mmol). Das Reaktionsgemisch wurde langsam auf RT erwärmt und 1 Stunde gerührt, danach wieder auf 0°C abgekühlt, wonach 2,6-Lutidin (11,1 ml, 95,6 mmol) gefolgt von MeOH (24 ml) zugesetzt wurden. Die Lösung wurde im Vakuum eingeengt und der Rohrückstand mittels HPLC gereinigt, wonach man 12,68 g der Verbindung 2 in einer Ausbeute von 55% erhielt. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.35 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 8.28 (s, 1H), 7.85 (s, 1H), 7.64 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.35–7.22 (m, 1H), 7.02–6.89 (m, 2H), 5.85 (bs, 1H), 4.82–4.71 (m, 2H), 4.33 (bs, 1H), 4.28–3.99 (m, 3H), 4.16 (s, 3H), 3.57–3.28 (m, 2H), 2.90–2.78m, 1H), 2.63–2.50 (m, 1H), 2.08–1.91 (m, 1H), 1.91–170 (m, 2H), 1.70–1.13 (m, 22H), 1.37 (d, J = 6.9 Hz, 6H); 31P NMR (121.4 MHz, CD3OD) δ 42.4; LCMS (M+1): 957.35. g.
  • Das Zwischenprodukt 206 wurde auf folgende Weise hergestellt.
  • a. Herstellung der Verbindung 203.
    Figure DE202012013382U1_0027
  • Die Verbindung 201 (17,42 g, 28,30 mmol) wurde in THF (136 ml) gelöst und auf 0°C abgekühlt. Die Lösung wurde mit N-Methylmorpholin (4,7 mL, 42,7 mmol) versetzt. Nach 10 Minuten bei 0°C wurde i-butylchlorformiat (4,05 ml, 30,96 mmol) zugetropft. Nach einer weiteren Stunde wurde (1-Amino-2-vinylcyclopropyl)-(2,6-difluorbenzyl)-phosphinsäureethylester 202 (8,94 g, 29,70 mmol) langsam als Lösung in THF (20 ml) zugesetzt. Die Suspension wurde auf RT erwärmt und nach 2 Stunden zwischen H2O (400 ml) und Ethylacetat (200 ml) aufgeteilt. Die wässrige Phase wurde mit Ethylacetat (200 ml × 2) ausgeschüttelt und mit den organischen Phasen vereint, danach mit HCl (1 N, 225 ml) und H2O (200 ml) gewaschen. Die saure Waschung und die wässrige Waschung wurden vereint und mit Ethylacetat (175 ml × 2, 100 ml × 2) rückextrahiert. Die vereinten organischen wurden mit einer Salzlösung (400 ml) gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und im Vakuum eingeengt, wodurch 25,06 g von Dien 203 in 98,5% einer Rohausbeute erhalten wurden. LCMS (M+1): 898.06.
  • b) Herstellung der Verbindung 204.
    Figure DE202012013382U1_0028
  • Die Verbindung 203 (12,91 g, 14,36 mmol) wurde in CH2Cl2 (1440 ml) gelöst und die Lösung 30 Minuten lang entgast. Die Lösung wurde auf 40°C erhitzt und Grubbs-G1-Katalysator (2,95 g, 3,59 mmol) zugesetzt. Die Reaktion wurde 17 Stunden refluxiert, wonach Tris-hydroxymethylphosphin (22,3 g, 18,0 mmol), TEA (50 ml, 35,9 mmol) und H2O (400 ml) zugesetzt wurden und das Reaktionsgemisch dann weitere 16 Stunden am Rückfluss erhitzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf RT abgekühlt und die zwei Phasen getrennt. Die organische Phase wurde mit H2O (400 ml) und Salzlösung (300 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet und eingeengt. Der Rohrückstand wurde mittels Chromatographie über Kieselgel gereinigt, wodurch 8,30 g macrocyclisches Olefin 204 in 66% Ausbeute erhalten wurden. LCMS (M+1): 870.09
  • c. Herstellung der Verbindung 205.
    Figure DE202012013382U1_0029
  • Das makrocyclische Olefin 204 (7,34 g, 8,42 mmol) wurde in Ethylacetat (105 ml) gelöst und mit Rhodium/Alumina (5% Gew., 2,945 g, 0,40 Gew.-%) versetzt. Das System wurde evakuiert und mit H2 (1 atm, 3×) gespült. Nach 3 Stunden wurde dem System weiteres Rhodium/Alumina (5% Gew., 842 mg, 0,10 Gew.-%) zugesetzt, evakuiert und mit H2 (1 atm, 3×) gespült. Nach einer weiteren Stunde wurde die Suspension filtriert und im Vakuum eingeengt, wodurch 6,49 g des reduzierten Macrocyclus 205 in 88% Rohausbeute erhalten wurde. LCMS (M+1): 872.04.
  • d. Herstellung der Verbindung 206.
    Figure DE202012013382U1_0030
  • Der Brosylatmakrocyclus 205 (6,49 g, 7,67 mmol) wurde in N-Methylpyrrolidinon (25,0 ml) und 8-Chlor-2-(2-isopropylaminothiazol-4-yl)-7-methoxychinolin-4-ol 207 (2,564 g, 7,33 mmol) gelöst, wonach Cs2CO3 (4,40 g, 13,50 mmol) zugesetzt wurde. Das Gemisch wurde 6 Stunden auf 65°C erhitzt, dann mit Ethylacetat (200 ml) verdünnt und mit LiCl (5%, 250 ml) gewaschen. Die wässrige Phase wurde mit Ethylacetat (100 ml × 2) ausgeschüttelt und die vereinten organischen Phasen mit Salzlösung (150 ml) gewaschen, über Na2SO4/MgSO4 getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rohrückstand wurde mittels Chromatographie auf Kieselgel (Ethylacetatmethanol) gereinigt, wodurch 4,39 g Aminothiazol 206 in einer Ausbeute von 58% erhalten wurden. LCMS (M+1): 985.28.
  • Das Zwischenprodukt 201 kann auf folgende Weise hergestellt werden.
  • Figure DE202012013382U1_0031
  • Figure DE202012013382U1_0032
  • e. Herstellung der Verbindung 209.
  • Die Verbindung 208 (7,00 g, 28,55 mmol) und DABCO (5,13 g, 45,94 mmol) wurden in Toluol (30 ml) gelöst. Dem wurde eine Toluollösung (11 ml) mit Brosylchlorid (10,22 g, 40,01 mmol) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei RT über Nacht gerührt. Die Reaktion wurde dann mit EtOAc (210 ml) verdünnt und mit 0.5 N HCl (200 ml) versetzt. Die zwei Phasen wurden getrennt, und die wässrige Phase wurde mit EtOAc (2 × 200 ml) ausgeschüttelt. Die vereinten organischen Phasen wurden mit Salzlösung (200 ml) gewaschen, mit Na2SO4 getrocknet, filtriert und eingeengt. Das Rohprodukt wurde mittels CombiFlash gereinigt und es ergab sich 12,23 g der Verbindung 209 in einer Ausbeute von 92%.
  • f. Herstellung der Verbindungen 210 und 212.
  • Die Verbindung 209 (12,2 g, 26,3 mmol) wurde mit 4 N HCl/1,4-Dioxan (60 ml) behandelt und 1 Stunde gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde konzentriert und 20 Minuten im Vakuum getrocknet. Das rohe Amin-HCl-Salz der Verbindung 210 wurde in DMF (150 ml) gelöst und mit der Säure 211 (14,2 g, 52,6 mmol) versetzt. HATU (20,0 g, 52,6 mmol) und NMM (13,5 g, 131,5 mmol) wurden zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei RT über Nacht gerührt. Die Reaktion wurde mit EtOAc (300 ml) verdünnt, mit 1 N HCl (200 ml) und gesättigtem NaHCO3, Salzlösung gewaschen, mit Na2SO4 getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde mittels CombiFlash gereinigt und es ergab sich 15,1 g der Verbindung 212 mit einer Ausbeute von 93%.
  • g. Herstellung der Verbindung 213.
  • Einer Lösung 212 (12,8 g, 20,7 mmol) in CH2Cl2 (50 ml) wurde 4 N HCl in 1,4-Dioxan (50 ml, 200 mmol) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden bei RT gerührt, konzentriert, 20 Minuten im Vakuum getrocknet und dann in CH3CN (50 ml) gelöst. Gesättigtes NaHCO3 in H2O (50 ml) wurde zugesetzt, und es wurde 5 Minuten lang gerührt. Frisch zubereitetes Cyclopentylchlorformiat in THF (50 ml) wurde danach zugesetzt. Die Reaktion lief innerhalb 1 Stunde vollständig ab. Das Lösungsmittel wurde bei vermindertem Druck entfernt und der Rückstand mit EtOAc verdünnt. Das Gemisch wurde mit 1 N HCl auf einen pH = 2 eingestellt, wonach die beiden Phasen getrennt wurden. Die organischen Phasen wurden mit Salzlösung gewaschen, mit Na2SO4 getrocknet, filtriert und eingeengt, wobei sich eine Rohverbindung 213 (3.18 g) ergab.
  • h. Herstellung der Verbindung 201.
  • Das rohe Ester 213 (3,18 g, 5,07 mmol) wurde in THF (25 ml) gelöst, erst wurde H2O (25 ml), danach MeOH (6 ml) und LiOH (660 mg, 25,4 mmol) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei RT gerührt und danach mit EtOAc verdünnt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 1 N HCl auf einen pH-Wert von 2 aufgesäuert, und die beiden Phasen wurden getrennt. Die wässrige Phrase wurde mit EtOAc (2×) ausgeschüttelt. Die vereinten organischen Phasen wurden mit Salzlösung gewaschen, mit Na2SO4 getrocknet, eingeengt und im Vakuum getrocknet, wodurch 3,09 g der Säure 201 erhalten wurden.
  • Das Zwischenprodukt 8-Chlor-2-(2-isopropylaminothiazol-4-yl)-7-methoxychinolin-4-ol 207 kann auf folgende Weise hergestellt werden.
  • Figure DE202012013382U1_0033
  • i. Herstellung von 8-Chlor-4-hydroxy-7-methoxychinolin-2-carbonsäure 215.
  • Eine Lösung aus Methyl 8-chlor-4-hydroxy-7-methoxychinolin-2-carboxylat 214 (36,5 g, 0,145 mol) in einem Gemisch im Verhältnis von 1:1 von MeOH:THF (160 ml insgesamt) wurde mit einer Lösung LiOH (30,5 g, 0,725 mol) in H2O (80 ml) versetzt. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei RT gerührt, wonach eine LCMS-Analyse die vollständige Umsetzung zur Carbonsäure nachwies. Die Reaktion wurde durch Entfernung der flüchtigen Stoffe und unter Verwendung von wässrigem 6 N HCl Lösung aufbereitet, um den pH-Wertes auf 6 einzustellen.
  • Der erhaltene gummiartige Rückstand wurde filtriert und 2 Tage auf einem Gefriertrockenapparat getrocknet, wobei 34,4 g (99,6%) der Verbindung 215 als weißer Feststoff erhalten wurden. EI MS (m/z) 253.9 [M+H].
  • j. Herstellung von 2-(2-Diazo-I-oxo)-8-chlor-7-methoxychinolin-4-yl-isobutylcarbonat 216.
  • Eine Lösung von 8-Chlor-4-hydroxy-7-methoxychinolin-2-carbonsäure 215 (10,2 g, 0,04 mol) in THF (400 ml) wurde bei 0°C in einer Argon-Atmosphäre mit Triethylamin (12,3 ml, 0,088 mol) und i-butylchlorformiat (11,6 ml, 0,088 mol) versetzt. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei 0°C gerührt, wonach eine LCMS-Analyse den vollständigen Ablauf der Reaktion nachwies und sich das gewünschte gemischte Anhydrid ergeben hatte. EI MS (m/z) 454.0 [M+H]. Dem Reaktionsgemisch des Anhydrids wurde mittels eines Kunststofftrichters eine 1 M Lösung von Diazomethan (121 ml, 0,121 mol) in Diethylether 0°C zugesetzt. Während des Erwärmens auf RT wurde zugelassen, dass das Gemisch 2 Stunden lang weitergerührt wurde. Mit einer Analyse des Gemischs mittels LCMS wurde eine vollständige Umsetzung nachgewiesen. Die Trennwand wurde entfernt, und die Reaktion wurde noch 2 weitere Stunden gerührt, bevor das Lösungsmittel entfernt wurde. Der Rückstand wurde im Hochvakuum weiter getrocknet, um die Verbindung 216 zu erhalten, die in den nächsten Schritt übernommen wurde. EI MS (m/z) 377,9 [M+H].
  • k Herstellung von 8-Chlor-2-(2-(isopropylamino)thiazol-4-yl)-7-methoxychinolin-4-ol 207.
  • Eine gekühlte Lösung aus 2-(2-Diazo-I-oxo)-8-chlor-7-methoxychinolin-4-yl-isobutylcarbonat 216 (15,2 g, 0,040 mol) wurde langsam im Verlauf von 15 Minuten bei 0°C in THF (268 ml) mit 48% HBr (23 ml, 0,201 mol) versetzt. Die Lösung wurde bei 0°C für weitere 40 Minuten gerührt, wonach mittels einer LCMS-Analyse der vollständige Reaktionsabschluss nachgewiesen wurde. Eine weitere Aufbereitung der Reaktion erfolgte durch die Zugabe von wässrigem 1 N NaOH (180 ml) bei 0°C, um den pH-Wert der wässrigen Phase auf 9 einzustellen. Die Phasen wurden getrennt, die wässrige Phase wurde mit EtOAc (2 × 200 ml) gewaschen. Die vereinten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, wonach sich 17,7 g eines gelben Feststoffs ergaben. EI MS (m/z) 431. 9 [M+H].
  • Die Lösung des Bromketons, die man in der vorangegangenen Umsetzung erhalten hatte, wurde in i-Propanol (270 ml) und Isopropylisoharnstoff (9,4 g, 0,080 mol) suspendiert. Das Reaktionsgemisch wurde 32 Stunden auf 72°C erwärmt. Die LCMS-Analyse der Reaktion wies die vollständige Umsetzung zum gewünschten Produkt nach. Man ließ die Reaktion danach auf RT abkühlen, um eine Ausfällung des Produkts aus der Lösung zuzulassen. Die Reaktion wurde dann vor der Filtrierung für eine Dauer von 12 Stunden weiter bis auf 0°C abgekühlt. Das Filtrat wurde mit Ether gewaschen und auf einem Gefriertrockenapparat getrocknet, um 8,03 g der Verbindung 207 als orangefarbenen Feststoff zu erhalten. 1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 8.21 (d, J = 9 Hz, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.44 (d, J = 10 Hz), 1H), 7.07 (s, 1H), 4.05 (s, 3H), 3.92 (Pentett, J = 6 Hz, 1H), 1.25 (d, J = 7 Hz, 6H): EI MS (m/z) 350.0 [M+H].
  • Die Verbindung 3 kann durch Verwendung von Syntheseverfahren und Zwischenprodukten wie jenen, die in USSN 12/215,605 ( US 20090257978 A1 ) beschrieben werden, hergestellt werden. Die Verbindung 3 kann ferner, wie in dem folgenden Beispiel beschrieben wird, hergestellt werden.
  • Beispiel 3: Herstellung der Verbindung 3
    Figure DE202012013382U1_0034
  • Die Verbindung 315 (12 g, 13 mmol) wurde in THF (200 ml) gelöst und LiOH (11 g, 260 mmol) in H2O (200 ml), gefolgt von MeOH (200 ml) wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde 20 Stunden lang bei RT nachgerührt. Bei Reaktionsschluss wurde 4 N HCl in H2O zugesetzt, um den pH bei 0°C auf 7 einzustellen. Das Gemisch wurde dann mit EtOAc (2 × 400 ml) ausgeschüttelt. Die vereinten organischen Phasen wurden mit Salzlösung gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und im Vakuum eingeengt, um die Verbindung 3 in Form eines gelben Feststoffs zu erhalten (11 g, 93%). LC/MS = 911.52 (M++1). 1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 7.95 (d, 1H), 7.90 (s, 1H), 7.48 (s, 1H), 7.31 (d, 1H), 5.42 (s, 1H), 4.37 (dd, 1H), 4.20 (m, 2H), 3.83–3.56 (m, 7H), 3.50 (m, 2H), 3.39 (m, 2H), 2.45 (m, 1H), 2.27 (m, 1H), 1.62 (m, 2H), 1.50 (m, 1H), 1.33 (m, 2H), 1.18 (m, 1H), 1.05 (m, 8H), 0.90 (m, 3H), 0.76 (m, 11H), 0.14–0.04 (m, 2H)
  • Das Zwischenprodukt 315 wurde auf folgende Weise hergestellt.
  • Figure DE202012013382U1_0035
  • a. Herstellung der Verbindung 301.
  • Einem trockenen, mit Argon gespülten dreiarmigen Rundkolben (1000 ml) wurden bei 0°C wasserfreies Dichlormethan (100 ml) und Et2Zn (28 ml, 273 mmol) zugesetzt. (VORSICHT: Die Argonquelle darf nicht von einer Nadel sein. Nur die passenden Glasadapter verwenden. Eine zweite Glocke kann auch an den Kolben angeschlossen werden, um einen übermäßigen Druckaufbau zu vermeiden.)
  • Cyclopenten-3-ol (10,0 ml, 119 mmol) wurde danach zugetropft (wobei sich eine große Menge Ethangas bildeten), und man ließ das Reaktionsgemisch rühren, bis die Gasbildung aufgehört hatte. Diiodmethan (22 ml, 242 mmol) wurde sodann über einen Zeitraum von 30 Minuten zugetropft. Ein Erwärmen der Reaktion auf RT wurde dann zugelassen, und es wurde über Nacht unter einem positive Argonfluss weitergerührt, wonach eine DC-Analyse das vollständige Verschwinden der Ausgangsalkohols angezeigt hatte. Die Reaktion wurde dann mit CH2Cl2 verdünnt und mit 2 M HCl (der weiße Niederschlag sollte sich vollständig aufgelöst haben) gequencht. Das biphasische Gemisch wurde in einen Trenntrichter gegossen, wobei die organische Phase aufgefangen wurde. Das Lösungsmittel wurde bei vermindertem Druck entfernt, bis 100 ml des Materials, das die Verbindung 301 aufweist, zurückgeblieben waren.
  • b. Herstellung der Verbindung 302.
  • Wasserfreies Dichlormethan (525 ml) wurde dem Kolben zugegeben, gefolgt von zugetropftem Triethylamin (34 ml, 245 mmol). Die Reaktion wurde weiter bei RT und unter einem positive Stickstoffluss gerührt, zu welchem Zeitpunkt Disuccinimidylcarbonat (40.7 g, 159 mmol) dem Kolben portionsweise zugesetzt wurde. Man ließ die Reaktion weitergerühren, bis eine DC-Analyse das vollständige Verschwinden des Ausgangsmaterials anzeigte (2–3 Tage). Zum Abschluss wurde das Reaktionsgemisch mit 1 M HCl (200 ml × 2) gequencht und mit H2O (200 ml × 2) gewaschen. Das gewünschte Material wurde unter Verwendung von CH2Cl2 ausgeschüttelt, und die vereinten organischen Phasen wurden unter Verwendung von wasserfreiem MgSO4 getrocknet und durch einen Kieselstopfen gegeben. Das Lösungsmittel wurde bei vermindertem Druck entfernt und das Rohmaterial mittels Flash-Chromatographie gereinigt (Rf = 0.33, 1:1 Hex/EtOAc), um die Verbindung 302 (22 g, 75%) zu erhalten: 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 5.24 (t, 1H), 3.82 (s, 4H), 2.24 (m, 2H), 2.03 (d, 2H), 1.38 (m, 2H), 0.48 (m, 1H), 0.40 (m, 1H).
  • Figure DE202012013382U1_0036
  • Figure DE202012013382U1_0037
  • c. Herstellung der Verbindung 304.
  • N-t-Boc-cis-4-hydroxy-L-prolinmethylester 303 (100.0 g, 407,7 mmol) und DABCO (1.5 äq, 68,6 g, 611,6 mmol) wurden in einem dreiarmigen Rundkolben in wasserfreiem Toluol (200 ml) mittels mechanischem Rührer und Additionstrichter gelöst. Nach dem Abkühlen der Lösung auf 0°C unter N2 wurde eine Lösung von 4-Brombenzolsulfonylchlorid (1.3 äq, 135,6 g, 530,0 mmol) in 300 ml Toluol über 60 Minuten durch den Additionstrichter zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht gerührt und auf RT erhitzt (16 Stunden). Das Gemisch wurde langsam in 2 l 1 M Na2CO3(aq.) gegossen, wonach das Produkt mit EtOAc (2 l) ausgeschüttelt wurde. Nach dem Waschen der organischen Phase in 0.5 N HCl (2 l), H2O (1 l) und Salzlösung (1 l) wurde diese getrocknet (MgSO4) und eingeengt, wodurch 195,45 g eines gelben, öligen Brosylatprodukts erhalten wurden.
  • Einer Lösung des vorstehenden Brosylats (407,7 mmol) in Dichlormethan (300 ml) wurden langsam 4,0 M HCl in Dioxan (500 ml, 5 äq) zugesetzt, und die erhaltene Lösung wurde bei RT 2 Stunden nachgerührt. Nachdem Ether (500 ml) zu dem Reaktionsgemisch gegeben worden war, wurde das Gemisch 15 Minuten weitergerührt und der weiße Niederschlag mittels Filtration aufgefangen. Der Feststoff wurde mit Ether und Hexan gewaschen, dann über Nacht im Vakuum getrocknet, um 153,0 g des HCl-Aminsalzes der Verbindung 304, 381,8 mmol in einer Ausbeute von 94% für zwei Schritte zu erhalten.
  • d. Herstellung der Verbindung 305.
  • Eine Lösung von Boc-tert-butylglycin (97,0 g, 420,0 mmol) in DMF (200 ml) und Methylenchlorid (200 ml) wurde bei RT mit HATU (217,76 g, 572,7 mmol) und Hünig-Base (126 ml, 1145,4 mmol) versetzt. Nachdem das Gemisch 20 Minuten bei RT gerührt worden war, wurde eine Lösung des vorherigen HCl-Salzes (153,0 g, 381,8 mmol) und Hünig-Base (126 ml, 1145,4 mmol) in DMF (200 ml) und Dichlormethan (200 ml) dem vorstehenden Säuregemisch auf einmal zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden bei RT gerührt und mittels LCMS überwacht. Das Reaktionsgemisch wurde eingeengt, um das Dichlormethan bei vermindertem Druck zu entfernen, wonach der weiße Feststoff, der sich hierbei gebildet hatte, abfiltriert wurde. Die verbleibende DMF-Lösung wurde mit Ethylacetat (1 l) verdünnt, nacheinander mit 3% LiCl (aq) (3 × 650 ml), gesättigtem NH4Cl (2 × 500 ml), 0,5 N HCl (aq) (2 × 600 ml), Salzlösung (500 ml) gesättigtem NaHCO3 (3 × 500 ml) sowie Salzlösung gewaschen. Die sich ergebende organische Fraktion wurde getrocknet (MgSO4) und eingeengt, um die Verbindung 305 (111 g) zu erhalten.
  • e. Herstellung der Verbindung 306.
  • Einer Lösung von Methylester 305 (120 g, 207,8 mmol) in THF (300 ml), MeOH (75 ml) wurde eine Lösung bestehend aus LiOH (26,18 g, 623,4 mmol) in H2O (150 ml) zugesetzt. Die Lösung wurde 4 Stunden bei RT gerührt. Das Gemisch wurde während dem Aufsäuern mit 3 N HCl auf einen pH von etwa 5,5 in einem Eisbad gekühlt, danach 10 Minuten gerührt und die resultierenden weißen Feststoffe wurden mittels Filtrierung aufgefangen. Die Feststoffe wurden mit weiterem Wasser, Ether und Hexan gewaschen. Die Feststoffe wurden in einem Vakuum bei 40°C über Nacht getrocknet, und es wurden 95,78 g (82%) der Säure 306 erhalten.
  • f. Herstellung der Verbindung 307.
  • Eine Lösung Carbonsäure 306 (81,4 g, 144,27 mmol) in DMF (200 ml) und Dichlormethan (200 ml) wurde bei RT mit HATU (82,3 g, 216,4 mmol) und Hünig-Base (47,5 ml, 432,8 mmol) versetzt. Danach wurde das Gemisch 20 Minuten bei RT gerührt, es wurde eine Lösung bestehend aus Amin (158,7 mmol) und Hünig-Base (47,5 ml, 1145,4 mmol) in DMF (200 ml) sowie Dichlormethan (200 ml) dem Vorstehenden auf einmal zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden bei RT gerührt und mittels LCMS überwacht. Nachdem das Gemisch bei vermindertem Druck eingeengt worden war, um das Dichlormethan zu entfernen, wurden die weißen Feststoffe, die sich gebildet hatten, abfiltriert. Die zurückgebliebene DMF-Lösung wurde mit Ethylacetat (600 ml) verdünnt und nacheinander mit 3% LiCl (aq) (2 × 550 ml), gesättigtem NH4Cl (500 ml), 1 N HCl (aq) (500 ml), gesättigtem NaHCO3 (500 ml) und Salzlösung (300 ml) gewaschen. Die entstehende organische Fraktion wurde getrocknet (Na2SO4) und eingeengt, um die Verbindung 307 (111 g) zu erhalten.
  • g. Herstellung der Verbindung 308.
  • Die Verbindung 307 wurde bei RT in 4 N HCl in Dioxan (300 ml) gelöst und 2 Stunden lang gerührt. Danach wurde sie im Vakuum eingeengt und gemeinsam mit Dichlormethan (2 × 200 ml) zur Trockenen verdampft. Der Rückstand wurde in EtOAc (600 ml) und gesättigtem aq. NaHCO3 (1 l) gelöst. Es wurde heftig gerührt. Nach 10 Minuten wurde Carbonsäure-Bicyclo[3.1.0]hex-3-yl ester 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl ester 302 (41,4 g, 173,1 mmol) auf einmal zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde weitere 30 Minuten gerührt, die organische Phase wurde aufgefangen und mit Salzlösung (500 ml) gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und eingeengt. Das Rohprodukt wurde mittels Flash-Chromatographie auf Kieselgel mit Ethylacetat/Hexan gereinigt, um 94,44 g (92%) der Verbindung 308 zu erhalten.
  • Figure DE202012013382U1_0038
  • h. Herstellung der Verbindung 310.
  • 1-(2-Amino-3-chlor-4-hydroxyphenyl)ethanon 309 (70,7 g, 354 mmol) wurde bei 110°C für 72 Stunden in 48% aq. HBr (500 ml) vergerührt. Nachdem das Gemisch unter Rühren auf 0°C abgekühlt war, wurden die Feststoffe abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Die sich ergebenden Feststoffe wurden mit einer gesättigten NaHCO3 Lösung (ca. 350 ml) pulverisiert, filtriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet, wodurch ca. 40 g (61%) der Rohverbindung 310 als dunkelbrauner Feststoff erhalten wurden. LC/MS = 186 (M++1).
  • i. Herstellung der Verbindung 311.
  • 1-(2-Amino-3-chlor-4-hydroxyphenyl)ethanon 310 (40 g, 215 mmol) wurde in DMF (360 ml) gelöst. Cäsiumcarbonat (140 g, 430 mmol) wurde zugesetzt, gefolgt von Bromacetaldehyddimethylacetal (54,5 g, 323 mmol). Das Gemisch wurde danach 24 Stunden lang heftig bei 65°C gerührt. Beim Abkühlen auf RT wurden EtOAc (1 l) und H2O (1 l) dem Gemisch zugesetzt. Die organische Phase wurde mit EtOAc (1 × 400 ml) ausgeschüttelt. Die vereinte organische Phase wurde mit wässriger 3% LiCl Lösung (2 × 1 l) und Salzlösung gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittels Chromatographie auf Kieselgel gereinigt, um die Verbindung 311 als weißen Feststoff (39 g, 67%) zu erhalten.
  • j. Herstellung der Verbindung 312.
  • Einem Gemisch von 1-[2-Amino-3-chlor-4-(2,2-dimethoxyethoxy)phenyl]ethanon 311 (13 g, 47,5 mmol) und Isopropylaminothiazol-4-Carbonsäurehydrobromid (12,64 g, 47,5 mmol) in Pyridin (150 ml) wurde Phosphoroxychlorid (9,47 g, 61,8 mmol) bei –40°C langsam zugesetzt. Das Gemisch wurde im Anschluss daran 4 Stunden bei 0°C gerührt. Nach dem Abschluss der Reaktion wurde H2O (30 ml) zu dem Gemisch getropft. Das Gemisch wurde sodann weitere 15 Minuten bei 0°C nachgerührt. Das Gemisch wurde im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mit EtOAc verdünnt, mit einer gesättigten NaHCO3 wässrigen Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (Na2SO4) und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in CH2Cl2 gelöst, der Lösung wurden langsam Hexane zugesetzt und ein gelber Feststoff begann auszufallen. Weitere Hexane wurden zugesetzt, bis kaum noch Produkt in der Stammlösung zurückblieb, um so die Verbindung 312 (18 g, 85%) zu erhalten.
  • k. Herstellung der Verbindung 313.
  • 2-Isopropylaminothiazol-4-Carbonsäure-[6-acetyl-2-chlor-3-(2,2-dimethoxyethoxy)phenyl]amid 312 (18 g, 40,7 mmol) wurde in Toluol (400 ml) suspendiert. NaH (2,4 g, 61 mmol) wurde dem heftig gerührten Gemisch zugesetzt, während die H2-Bildung überwacht wurde. Das Gemisch wurde bei der Rückflusserhitzung zu einer klaren Lösung. Nach Refluxieren für eine Dauer von 3 Stunden war die Reaktion abgeschlossen. Das Gemisch wurde auf RT abgekühlt. Das Gemisch wurde mit einer Lösung aus AcOH (69,2 mmol) in H2O (3 Vol) versetzt. Nach einstündigem heftigem Rühren bei 0°C wurden die Feststoffe durch Filtration aufgefangen und zur weiteren Verwendung mit H2O gespült. Der Nasskuchen wurden im Hochvakuum auf ein konstantes Gewicht getrocknet, um die Verbindung 313 (15 g, 86%) bereitzustellen.
  • l. Herstellung der Verbindung 314.
  • Das Gemisch des Brosylat-Zwischenprodukts 303 (15 g, 35 mmol) und der Verbindung 313 (27,5 g, 38,5 mmol) in NMP (200 ml) wurde mit Cäsiumcarbonat (25.1 g, 77 mmol) versetzt. Das Gemisch wurde 5 Stunden bei 65°C gerührt. Die Reaktion wurde dann auf RT gekühlt und EtOAc (600 ml) und eine wässrige Lösung 3% LiCl (600 ml) wurden dem Gemisch zugesetzt. Die organische Phase wurde mit wässrigem 3% LiCl (1 × 600 ml), Salzlösung gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittels Chromatographie auf Kieselgel gereinigt, um das gewünschte Methylester als gelben Feststoff (23,6 g, 75%) zu erhalten. LC/MS = 900.13 (M++1).
  • m. Herstellung der Verbindung 315.
  • Das Methylester 314 (23,6 g, 26 mmol) wurde in Eisessig (200 ml) gelöst und 1,4 N HCl in H2O (75 ml) wurde der Lösung zugesetzt. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei 60°C gerührt. Nach dem Abschluss der Reaktion wurde das Gemisch eingeengt, um die Lösungsmittel zu entfernen, danach folgte gemeinsames Verdampfen mit Toluol (× 2), um zurückgebliebenen Eisessig zu entfernen. Der Rückstand wurde mit Überwachung der CO2-Bildung in EtOAc (500 ml) und gesättigter NaHCO3 wässriger Lösung aufgelöst (ausreichend, um das Gemisch zu neutralisieren). Die organische Phase wurde mit Salzlösung gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde im Hochvakuum noch 1 Stunde getrocknet und dann im nächsten Schritt verwendet. Das Rohmaterial wurde in CH2Cl2 (360 ml) gelöst, Morpholin (3,4 g, 39 mmol) und Natriumtriacetoxyborhydrid (7,2 g, 34 mmol) wurden dem Gemisch bei 0°C zugesetzt. Danach wurde Eisessig (0,47 g, 7,8 mmol) zugetropft. Die Reaktion lief vollständig ainnerhalb von 10 Minuten bei 0°C ab. Zum Quenchen der Reaktion wurde gesättigte NaHCO3 wässrige Lösung zugesetzt. Es wurde 20 Minuten nachgerührt und die organische Phase danach mit Salzlösung gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittels Kieselgel-Chromatographie gereinigt, um das gewünschte Aminprodukt 315 als gelben Feststoff zu erhalten (12 g, 50%). LC/MS = 924.63 (M++1).
  • Die Verbindung 4 kann wie in dem folgenden Beispiel beschrieben hergestellt werden.
  • Beispiel 4: Herstellung der Verbindung 4.
    Figure DE202012013382U1_0039
  • Das Diastereomergemisch 414 wurde in Heptan und Isopropanol (70%:30%, 230 mg in 4,5 ml der gemischten Lösungsmittel) gelöst und einer chiralen Säulentrennung (siehe Grafik: „chiral column separation”) unter den folgenden Bedingungen unterzogen:
    Säule: Chiralcel OD-H, 2 × 25 cm
    Lösungssystem: 70% Heptan und 30% Isopropanol
    Flussgeschwindigkeit: 6 ml/min.'
    Ladevolumen pro Lauf: 2,5 ml
  • Die Verbindung 4 hatte eine Durchlaufzeit von 20 Minuten. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.00 (s, 5 1H), 7.1–7.3 (m, 5H), 6.83 (d, 1H), 6.71 (d, 1H), 6.09 (brs, 2H), 5.95 (s, 1H), 5.04 (m, 2H), 4.67 (q, 1H), 4.35–4.52 (m, 2H), 4.00 (m, 2H), 2.74 (m, 1H), 1.40 (d, 3H), 1.2–1.3 (12H), 0.98 (s, 3H).
    31P NMR (121.4 MHz, CDCl3): δ 2.72 (s). Die Verbindung 4 wurde hiernach aus MTBE umkristallisiert, um Kristalle von Röntgenqualität zu erhalten.
  • Die Verbindung 4a hatte eine Durchlaufzeit von 50 min. 1H NMR (300 MHz, CDClo3): δ 7.98 (s, 1H), 7.1–7.3 (m, 5H), 6.83 (d, 1H), 6.73 (d, 1H), 6.02 (brs, 2H), 5.95 (s, 1H), 5.08 (d, 1H), 5.00 (m, 1H), 4.68 (q, 1H), 4.38–4.56 (m, 2H), 3.98 (m, 2H), 2.74 (m, 1H), 1.40 (d, 3H), 1.2–1.3 (12H), 0.99 (s, 3H). 31P NMR (121.4 MHz, CDCl3): δ 2.61 (s).
  • Das Zwischenprodukt-Diastereomergemisch 414 wurde auf folgende Weise hergestellt.
  • a. Herstellung der Verbindung 402.
    Figure DE202012013382U1_0040
  • Einer Lösung der Verbindung 401 (22,0 g, 54,9 mmol, die nach dem in J. O. C., 2004, 6257 beschriebenen Verfahren hergestellt worden war,) in Methanol (300 ml) wurde bei 0°C und unter Verwendung eines Tropftrichters über 30 Minuten Acetylchlorid (22 ml) zugetropft, wonach 16 Stunden bei RT gerührt wurde. Das Gemisch wurde konzentriert, noch einmal in Ethylacetat (400 ml) gelöst, mit eiskaltem 2 N NaOH gewaschen und bis zur Trockene eingeengt, um das rohe Methylether 402 in Form eines Öls zu erhalten. MS = 437,2 (M+Na+).
  • b. Herstellung der Verbindung 403.
    Figure DE202012013382U1_0041
  • Eine Lösung der Verbindung 402 in Methanol (300 ml) wurde mit 0,5 M Natriummethoxidlösung in Methanol (20 ml, 10 mmol) versetzt und 16 Stunden bei RT gerührt. Die Reaktion wurde mit 4.0 N HCl-Lösung in Dioxan (2,5 ml, 10 mmol) gequencht. Das Gemisch wurde dann eingeengt, wodurch die Rohverbindung 403 erhalten wurde. MS = 201.0 (M+Na+).
  • c. Herstellung der Verbindung 404.
    Figure DE202012013382U1_0042
  • Ein Gemisch der Verbindung 403, Tritron X-405 (70% in Wasser, 6,0 g), 50% KOH (in Wasser, 85 g) in Toluol (500 ml) wurde mit einem angebrachten Dean-Stark-Auffanggefäß unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Sammeln von 25 ml Wasser im Laufe einer Stunde wurde Benzylchlorid (33 g, 260 mmol) zugesetzt und die Reluxierung unter Rühren 16 Stunden lang fortgesetzt. Das Gemisch wurde danach abgekühlt und zwischen Ethylacetat (400 ml) und Wasser (300 ml) aufgeteilt. Die organische Phase wurde mit Wasser (300 ml) gewaschen und eingeengt. Der Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie auf Kieselgel (20% EtOAc/Hexane) gereinigt, wodurch das Methylether 404 als ein Öl erhalten wurde (22,0 g, 89% in drei Schritten). 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.3 (m, 15H), 4.5–4.9 (m, 7H), 4.37 (m, 1H), 3.87 (d, 1H), 3.56 (m, 2H), 3.52 (s, 3H), 1.40 (s, 3H).
  • d. Herstellung der Verbindung 405.
    Figure DE202012013382U1_0043
  • Eine Lösung von 404 (22,0 g, 49,0 mmol) in Eisessig (110 ml) wurde mit 3 M Schwefelsäure (durch Mischen von 4,8 g der konzentrierten Schwefelsäure mit 24 ml Wasser hergestellt) versetzt und 8 Stunden bei 70°C gerührt. Das Gemisch wurde auf ein Volumen von 20 ml konzentriert und zwischen Ethylacetat und eiskaltem 2 N NaOH aufgeteilt. Die Phase des Ethylacetats wurde eingeengt und mittels Säulenchromatographie auf Kieselgel (~35% EtOAc/Hexane) gereinigt, wodurch die Verbindung 405 als ein Öl erhalten wurde (17,0 g, 80%). MS = 457.2 (M+Na+).
  • e. Herstellung der Verbindung 406.
    Figure DE202012013382U1_0044
  • Einer Lösung der Verbindung 405 (45 g, 104 mmol) in DMSO (135 ml) wurde Essigsäureanhydrid (90 ml, 815 mmol) unter Argon bei RT zugetropft. Das Gemisch wurde 16 Stunden bei RT gerührt und dann unter Rühren in Eiswasser gegossen (1 l). Nachdem das Eiswasser vollständig geschmolzen war (30 Minuten) wurde Essigester (500 ml) zugesetzt. Die organische Phase wurde abgetrennt. Dieser Extraktionsprozess wurde 3× wiederholt (3 × 500 ml). Die organischen Extrakte wurden vereint und eingeengt. Der Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie auf Kieselgel gereinigt (20% EtOAc/Hexane), wodurch die Verbindung 406 als ein Öl erhalten wurde (39 g, 88%). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 7.3 (m, 15H), 4.4–4.8 (m, 7H), 4.08 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 3.75 (dd, J = 2,4, 11.4 Hz, 1H), 3.64 (dd, J = 5.4, 11.4 Hz, 1H), 1.51 (s, 3H).
  • f. Herstellung der Verbindung 407.
    Figure DE202012013382U1_0045
  • 7-Brom-pyrrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-ylamin (234 mg, 1.10 mmol) (nach WO2007056170 hergestellt) und wasserfreies THF (1,5 ml) wurden einem trockenen, mit Argon gereinigten Kolben (100 ml) zugeführt. Danach wurde TMSCl (276 μl, 2,2 mmol) zugesetzt und das Reaktionsgemisch 2 Stunden gerührt. Der Kolben wurde in ein Trockeneis/Acetonbad (–78°C) gestellt und BuLi (2,5 ml, 4.0 mmol, 1,6 M in Hexanen) wurde zugetropft. Nach 1 Stunde wurde eine Lösung der Verbindung 406 (432,5 mg, 1,0 mmol) in THF auf 0°C gekühlt und dann dem Reaktionskolben zugetropft. Nach 1 Stunde Rühren bei –78°C wurde der Kolben auf 0°C erwärmt und mit gesättigtem NH4Cl (5 ml) versetzt, um die Reaktion zu quenchen. Die organischen Phasen wurden mittels EtOAc (3 × 10 ml) ausgeschüttelt und die vereinten Phasen dann mittels MgSO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wurde bei vermindertem Druck entfernt und das Rohmaterial mit Hilfe von Flash-Chromatographie (Hexane/EtOAc) gereinigt. 560 mg (90%) der Verbindung 407 wurden so als ein Gemisch von zwei Anomeren isoliert. LC/MS = 567.2 (M+H+). 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.85 (m, 1H), 7.27 (m, 15H), 7.01 (m, 1H), 6.51 (m, 1H), 4.66 (m, 8H), 4.40 (m, 2H), 3.79 (m, 3H), 1.62 (s, 2'-CH3 von dem einen Anomer), 1.18 (s, 2'-CH3 von dem anderen Anomer).
  • g. Herstellung der Verbindung 408.
    Figure DE202012013382U1_0046
  • Eine Lösung der Verbindung 407 (1 g, 1,77 mmol) in CH2Cl2 (20 ml) wurde bei 0°C mit TMSCN (1,4 ml, 10,5 mmol) und BF3-Et2O (1 ml, 8,1 mmol) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 0,5 Stunden bei 0°C gerührt, bei RT wurde noch 0,5 Stunden nachgerührt. Die Reaktion wurde mit NaHCO3 bei 0°C gequencht, dann mit CH3CO2Et verdünnt. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit Salzlösung gewaschen, über Na2SO4 getrocknet, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde mittels Chromatographie auf Kieselgel gereinigt, mit CH3CO2Et-Hexanen eluiert (1:1 bis 2:1), um die Verbindung 408 (620 mg, 61%) als Isomergemisch zu erhalten. MS = 576.1 (M+H+).
  • h. Herstellung der Verbindung 409.
    Figure DE202012013382U1_0047
  • Eine Lösung der Verbindung 408 (150 mg, 0,26 mmol) in CH2Cl2 (4 ml) wurde bei –78°C mit BCl3 (2 ml, 1 M in CH2Cl2) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei –78°C gerührt. Die Reaktion wurde bei –78°C durch Zutropfen von TEA (2 ml) und MeOH (5 ml) gequencht. Man ließ das Gemisch sich danach auf RT erwärmen, es wurde verdampft und mehrere Male mit MeOH gemeinsam verdampft. Der Rückstand wurde mit NaHCO3 (1 g in 10 ml H2O) behandelt, eingeengt und mittels HPLC gereinigt, wodurch das gewünschte Produkt als Verbindung 409 anfiel (48 mg, 60%). 1H NMR (300 MHz, D2O): δ 7.74 (s 1H), 6.76 (d, J = 5 Hz, 1H), 6.73 (d, J = 5 Hz, 1H), 4.1 (m, 1H), 3.9 (m, 1H), 3.8 (m, 2H), 0.84 (s, 3H). MS = 305.9 (M+H+). Der andere Alpha-Anomer wurde auch erhalten (9 mg, 11%): 1H NMR (300 MHz, D2O): δ 7.70 (s 1H), 6.8 (d, J = 5 Hz, 1H), 6.7 (d, J = 5 Hz, 1H), 4.25 (d, J = 9 Hz, 1H), 4.07 (m, 1H), 3.85 (m, 1H), 3.7 (m, 1H), 1.6 (s, 3H). MS 306.1 (M+H+).
  • i. Herstellung der Verbindung 412.
    Figure DE202012013382U1_0048
  • Die Verbindung 410 (im Handel erhältlich, 4,99 g, 23,8 mmol) wurde in Dichlormethan (100 ml) gelöst und mit Alaninisopropylesterhydrochlorid 411 (3,98 g, 23,8 mmol) veresetzt. Die sich ergebende Lösung wurde 30 Minuten auf –78°C abgekühlt. Triethylamin (6,63 ml, 47,5 mmol) wurde über 15 Minuten zugetropft. Man gestattete es dem Gemisch danach, sich auf RT zu erwärmen. Nach 16 Stunden wurde das Lösungsmittel mit Hilfe eines Argonflusses entfernt. Der Rückstand wurde noch einmal in MTBE (25 ml) gelöst und Nichtlösliches wurde durch Filtration unter Argon entfernt. Das Filtrat wurde mittels Argonfluss eingeengt und das Rohprodukt 412 ohne weitere Aufreinigung in der nächsten Reaktion verwendet. 1H NMR (300. MHz, CDCl3): 7.1–7.4 (m, 5H), 5.1 (m, 1H), 4.35 (m, 1H), 4.15 (m, 1H), 1.5 (d, 3H), 1.2 (m, 6H). 31P NMR (121.4 MHz, CDCl3): δ 7.8 und 8.4 (2 s).
  • j. Herstellung der Verbindung 413.
    Figure DE202012013382U1_0049
  • Eine Lösung der Verbindung 409 (1,03 g, 3,37 mmol) in Trimethylphosphat (2,0 ml) und THF (20 ml) wurde bei 0°C mit N-Methylimidazol (1,5 g, 18,3 mmol) versetzt. Eine Lösung der Verbindung 412 (2,5 g, 8,18 mmol) in THF (3 ml) wurde zugetropft. Man ließ das resultierende Gemisch sich über 1,5 Stunden auf RT erwärmen. Das Gemisch wurde zwischen Ethylacetat und Wasser aufgeteilt. Die Ethylacetatphase wurde eingeengt und der Rückstand mittels Chromatographie auf Kieselgel gereinigt (Ethylacetat zu 10% Ethanol/Ethylacetat), wodurch 1,15 g (59%) der Verbindung 413 als 1:1 Diastereomergemisch/Phosphor erhalten wurden. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.02 (s, 1H), 7.1–7.4 (m, 5H), 6.8 (2d, 1H), 6.7 (2d, 1H), 6.08 (brs, 2H), 5.03 (m, 1H), 4.6 (m, 1H), 4.4 (m, 2H), 3.9–4.1 (m, 3H), 1.31 (d, 3H), 1.2 (m, 6H), 0.83 (s, 3H). 31P NMR (121.4 MHz, CDCl3): δ 2.78 (s). MS = 575.1 (M+H+).
  • k. Herstellung der Verbindung 414.
    Figure DE202012013382U1_0050
  • Eine Lösung der Verbindung 413 (175 mg, 0,305 mmol) in Acetonitril (2 ml) wurde mit N,N-Dimethylformamid-Dimethylacetal (41 μL, 0,34 mmol, 1,1 äq.) versetzt und 1 Stunde bei RT gerührt. Die Reaktion lief vollständig ab (LCMS). Das Gemisch wurde zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde mit DCC (250 mg, 1,21 mmol, 4 äq.), Acetonitril (5 ml) und Isobuttersäure (55 mg, 58 μl, 2 äq.) versetzt. Das Gemisch wurde 48 Stunden bei RT gerührt. Wasser (0,2 ml) und Trifluoressigsäure (0,1 ml) wurden bei 0°C zugesetzt, und es wurde 64 Stunden bei RT gerührt. Natriumhydrogencarbonat (500 mg) wurde bei 0°C zugesetzt. Das Gemisch wurde 0,5 Stunden bei RT gerührt, dann filtriert. Das Filtrat wurde eingeengt und der Rückstand mittels Säulenchromatographie auf Kieselgel gereinigt (5% Methanol/Dichlormethan), wodurch 144 mg (73%) der Verbindung 414 als 1:1 Diastereomergemisch/Phosphor erhalten wurde. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.00 (s, 1H), 7.1–7.4 (m, 5H), 6.83 (d, 1H), 6.71 (2d, 1H), 5.97 (brs, 2H), 5.94 (d, 1H), 5.07 (2d, 1H), 5.01 (m, 1H), 4.68 (m, 1H), 4.4 (m, 2H), 4.0 (m, 2H), 2.74 (m, 1H), 1.4 (2d, 3H), 1.2–1.3 (12H), 0.98 and 0.99 (2s, 3H). 31P NMR (121.4 MHz, CDCl3): δ 2.56 and 2.65 (2 s). MS = 645.1 (M+H+).
  • Verbindung 5 kann wie in dem folgenden Beispiel beschrieben hergestellt werden.
  • Beispiel 5: Herstellung von 5: 5-(3,3-Dimethylbut-1-in-1-yl)-3-[(cis-4-hydroxy-4-{[(3S)-tetrahydrofuran-3-yl-oxy]methyl}cyclohexyl){[(1R)-4-methylcyclohex-3-en-1-yl]carbonyl}amino]thiophen-2-carbonsäure 5.
    Figure DE202012013382U1_0051
  • 5-(3,3-Dimethyl-but-1-inyl)-3-[((1R)-4-methyl-cyclohex-3-encarbonyl)-(1-oxaspiro[2.5]oct-6-yl)-ami no]-thiophen-2-carbonsäuremethylester 508 (132 mg, 0,28 mmol) und (S)-Tetrahydrofuran-3-ol 509 (247 mg, 2,8 mmol) wurden in 1-Methylpyrrolidin-2-on (3 ml) mit Kalium-tert.-butoxid (251 mg, 2,24 mmol) behandelt, wobei 16 Stunden lang versiegelt und auf 40°C erwärmt wurde. Die Mischung wurde nach dem Abkühlen mit 2 M HCl bis auf pH 3 behandelt, zwischen Ethylacetat und Wasser partitioniert und getrennt. Die organische Phase wurde mit 5% Lithiumchloridlösung, Wasser, Salzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Filtration und Konzentration wurde der Rückstand durch HPLC mit CH3CN (0,1% TFA)/H2O (0,1% TFA) behandelt, um 107 mg (70% Ausbeute) von Verbindung 5 als weißes Pulver zu ergeben: MS (m/z): 544,0 [M+H]+; HPLC-Retentionszeit 4,22 Min (2–98% Acetonitril: Wasser mit 0,05% Trifluoressigsäure).
  • Die Intermediatverbindung 508 wurde wie folgt hergestellt.
  • Figure DE202012013382U1_0052
  • a. Herstellung von Verbindung 502.
  • (S)-3-Hydroxy-4,4-dimethyldihydrofuran-2(3H)-on (2,60 g, 20 mmol) und Diisopropylethylamin (5,2 mL, 30 mmol) in Dichlormethan (25 mL) wurden auf –10°C gekühlt und tropfenweise mit Acryloylchlorid (2,03 mL, 25 mmol) behandelt und 2 Stunden lang gerührt. 1 M HCl (20 mL) wurde zugegeben, und die organische Phase wurde mit Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und konzentriert. Flash-Chromatographie (10–40% EtOAc, Hexane) ergaben 2,09 g (57% Ausbeute) des gewünschten (S)-4,4-Dimethyl-2-oxotetrahydrofuran-3-ylacrylats 501 als klares Öl.
  • (S)-4,4-Dimethyl-2-oxotetrahydrofuran-3-ylacrylat 501 (2,05 g, 11,1 mmol) in Dichlormethan (17,5 mL) und Hexanen (2,5 ml) wurden auf –10°C gekühlt und mit Titantetrachlorid (2,2 mL, 1 M in Dichlormethan, 2,2 mmol) behandelt. Die gelbe Lösung wurde 15 Minuten lang gerührt und tropfenweise im Verlauf von 5 Minuten mit Isopren (1,67 mL, 16,7 mmol) behandelt. Nachdem 2 Stunden gerührt worden war, wurde eine zusätzliche Portion Isopren (1,67 mL, 16,7 mmol) zugegeben und die Reaktionsmischung 3,5 Stunden lang von –10 bis 0°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ammoniumchlorid (gesättigt, wässrig) gequencht. Wasser und Ethylacetat:Hexane (1:1) wurden zugegeben. Die organische Phase wurde abgetrennt und die wässrige Phase erneut mit Ethylacetat:Hexanen (1:1) extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (10–50% EtOAc:Hex, 80 g Säule) gereinigt, um 1,30 g (46% Ausbeute) (R)-((S)-4,4-Dimethyl-2-oxotetrahydrofuran-3-yl)-4-methylcyclohex-3-encarboxylat 502 als klares Öl zu ergeben.
  • b. Herstellung von Verbindung 503.
  • (R)-((S)-4,4-Dimethyl-2-oxotetrahydrofuran-3-yl) 4-methylcyclohex-3-encarboxylat 502 (1,30 g, 5,15 mmol) wurde in THF (10 mL), Wasser (1 mL) und Methanol (1 mL) mit Lithiumhydroxidmonohydrat (2,16 g, 51,5 mmol) behandelt und unter Rühren auf 50°C erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde nach 1 Stunde mit 1 M HCl behandelt. Die Mischung wurde mit Hexanen:THF (10:1) extrahiert, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und auf 0,738 g (quantitative Ausbeute) (R)-4-Methylcyclohex-3-encarbonsäure 503 als weißes Pulver konzentriert.
  • c. Herstellung von Verbindung 504.
    Figure DE202012013382U1_0053
  • (R)-4-Methylcyclohex-3-encarbonsäure 503 (371 mg, 2,65 mmol), azeotrop durch Verdampfen aus Toluol getrocknet, wurde mit Trikaliumphosphat (1,13 g, 7,94 mmol) behandelt, in Dichlormethan (7,6 mL) suspendiert und mit Dimethylformamid (4 Tropfen) behandelt. Die Reaktionsmischung wurde auf 0°C abgekühlt und tropfenweise mit Oxalylchlorid (0,75 mL, 7,9 mmol) behandelt. Die Reaktionsmischung wurde unter Rühren für 2 Stunden auf Umgebungstemperatur erwärmen gelassen. Nachdem die Feststoffe abfiltriert worden waren, wurde die Lösung konzentriert, mit Hexanen behandelt und erneut konzentriert, um (R)-4-Methylcyclohex-3-encarbonylchlorid 504 als hellgelbes Öl zu ergeben, das unmittelbar darauf in der nächsten Stufe verwendet wurde.
  • d. Herstellung von Verbindung 506.
    Figure DE202012013382U1_0054
  • (R)-4-Methylcyclohex-3-encarbonylchlorid 504 (2,65 mmol), 5-(3,3-Dimethyl-but-1-inyl)-3-(1,4-dioxaspiro-[4.5]dec-8-ylamino)-thiophen-2-carbonsäuremethylester 505 (250 mg, 0,66 mmol) und Trikaliumphosphat (562 mg, 2,65 mmol) wurden in Dichlorethan (1,7 ml) suspendiert, mit einem Verschluss versiegelt und auf 90°C erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde nach 16 Stunden gekühlt und zwischen Ethylacetat und Wasser partitioniert. Die organische Phase wurde abgetrennt und die wässrige Phase erneut mit Ethylacetat extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und konzentriert. Flash-Chromatographie (10–40% EtOAc:Hexane) ergab 220 mg (67% Ausbeute) des gewünschten 5-(3,3-Dimethylbut-1-inyl)-3-[(1,4-dioxaspiro[4.5]dec-8-yi)-((1R)-4-methylcyclohex-3-encarbonyl)-amino]-thiophen-2-carbonsäuremethylesters 506 als beigefarbenen Schaum.
  • e. Herstellung von Verbindung 507.
    Figure DE202012013382U1_0055
  • 5-(3,3-Dimethylbut-1-inyl)-3-[(1,4-dioxaspiro[4.5]dec-8-yl)-((1R)-4-methylcyclohex-3-encarbonyl)-amino]-thiophen-2-carbonsäuremethylester 506 (219 mg, 0,438 mmol) wurde in THF (3,5 mL) gelöst und mit 4 M HCl (1,75 mL, 7,01 mmol) getrocknet. Die Reaktionsmischung wurde auf 45°C erwärmt und 2 Stunden gerührt. Ethylacetat wurde zugefügt, und die organische Phase wurde getrennt, danach mit Wasser, Natriumbicarbonat (gesättigt, wässrig), Wasser und Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zu 0,190 g (95% Ausbeute) des gewünschten 5-(3,3-Dimethyl-but-1-inyl)-3-[((1R)-4-methylcyclohex-3-encarbonyl)-(4-oxocyclohexyl)-amino]-thiophen-2-carbonsäuremethylesters 507 als weißem Schaum konzentriert.
  • f. Herstellung von Verbindung 508.
    Figure DE202012013382U1_0056
  • Trimethylsulfoxoniumchlorid (79 mg, 0,62 mmol) in DMSO (1,5 mL) wurde mit Natriumhydrid (21 mg, 60% Öldispersion, 0,53 mmol) behandelt und bei Umgebungstemperatur 10 Minuten lang gerührt. 5-(3,3-Dimethylbut-1-inyl)-3-[((1R)-4-methylcyclohex-3-encarbonyl)-(4-oxocyclohexyl)-amino]-thiophen-2-carbonsäuremethylester 507 in THF (1 mL + 0,5 mL) wurde tropfenweise zugefügt und die Reaktionsmischung 45 Minuten lang gerührt. Die orange Lösung wurde mit 5% Citronensäure behandelt, bis der pH-Wert 3 betrug, und wurde zwischen Wasser und Ethylacetat partitioniert. Die organische Phase wurde abgetrennt und die wässrige Phase erneut mit Ethylacetat extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden mit 5% LiCl, Wasser und Salzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Filtration und Konzentration wurde der Rückstand durch Flash-Chromatographie (20–75% EtOAc:Hexane) gereinigt, um 0,134 g (70% Ausbeute) 5-(3,3-Dimethylbut-1-inyl)-3-[((1R)-4-methylcyclohex-3-encarbonyl)-(1-oxaspiro[2.5]oct-6-yl)-amino]-thiophen-2-carbonsäuremethylester 508 als weißes Pulver zu ergeben.
  • Verbindung 6 kann nach synthetischen Verfahren und mit Intermediaten ähnlich denjenigen hergestellt werden, die in der US-Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 12/779,023 ( US 20100310512 A1 ) beschrieben sind. Verbindung 6 kann auch wie in dem folgenden Beispiel beschrieben hergestellt werden.
  • Beispiel 6: Herstellung von (1-{3-[6-(9,9-Difluor-7-{2-[5-(2-methoxycarbonylamino-3-methylbutyryl)-5-azaspiro-[2.4]hept-6-yl]-3H-imidazol-4-yl}-9H-fluoren-2-yl)-1H-benzoimidazol-2-yl]-2-azabicyclo[2.2.1]heptan-2-carbonyl}-2-methylpropyl)-carbaminsäuremethylester 6.
    Figure DE202012013382U1_0057
  • 3-[6-(9,9-Difluor-7-{2-[5-(2-methoxycarbonylamino-3-methylbutyryl)-5-azaspiro[2.4]hept-6-yl]-3H-imidazol-4-yl}-9H-fluoren-2-yl)-1H-benzoimidazol-2-yl]-2-azabicyclo[2.2.1]heptan-2-carbonsäure-tert.-butylester 614 (115 mg, 0,138 mmol) wurde in Methylenchlorid (2 mL) gelöst, und HCl in Dioxan (4 M, 2 mL) wurde zugefügt und weiter bei Raumtemperatur gerührt. Nach 20 Minuten wurden alle flüchtigen Materialien im Vakuum entfernt. Das Rohmaterial wurde in der nächsten Stufe ohne weitere Reinigung verwendet. Das Rohmaterial wurde in DMF gelöst (1,5 mL), und es wurde DIEA (53,4 mg, 0,414 mmol) zugefügt. Eine Lösung von 2-(L)-Methoxycarbonylamino-3-methyl-buttersäure 611 (24,2 mg, 0,138 mmol), HATU (52,4 mg, 0,138 mmol) und DIEA (17,8 mg, 0,138 mmol) in DMF (1 mL) wurde zugefügt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur gerührt. Nach 20 Minuten wurde die Reaktion mit EtOAc verdünnt und mit wässriger Bicarbonatlösung, wässriger LiCl-Lösung (5%), Salzlösung gewaschen und wurde über Natriumsulfat getrocknet. Filtration und Entfernung der Lösungsmittel im Vakuum ergab das Rohmaterial, das durch RP-HPLC (Eluent: Wasser/MeCN mit 0,1% TFA) gereinigt wurde, um Verbindung 6 (76 mg) zu ergeben. LCMS-ESI+: berechnet für C49H54F2N8O6: 888,9 (M+); gefunden: 890,0 (M+H+). 1H-NMR: 300 MHz, (DMSO-d6) δ: 8,20–7,99 (m, 8H), 7,73 (s, 2H), 7,37–7,27 (m, 2H), 5,25 (dd, J = 7,2 Hz, 1H), 4,78 (s, 1H), 4,54 (s, 1H), 4,16 (m, 1H), 4,02 (m, 1H), 3,87 (m, 1H), 3,74 (m, 1H), 3,55 (s, 3H), 3,53 (s, 3H), 2,75 (m, 1H), 2,25 (m, 2H), 2,09–2,04 (m, 2H), 1,88–1,79 (m, 2H), 1,54 (m, 1H), 0,94–0,77 (m, 15H) 0,63 (m, 4H) ppm. 19F-NMR: 282 MHz, (DMSO-d6) δ: –109,1 ppm [–74,8 ppm TFA],
  • Die Intermediatverbindung 614 wurde wie folgt hergestellt.
  • Figure DE202012013382U1_0058
  • a. Herstellung der Verbindung 4-Methylenpyrrolidin-1,2-dicarbonsäure-1-benzylester-2-methylester 602.
  • 4-Methylenpyrrolidin-1,2-dicarbonsäure-1-tert.-butylester 601 (10,0 g, 44 mmol) wurde bei Raumtemperatur in MeOH (75 mL) gelöst, und es wurde Hcl (4 M in Dioxan, 75 mL) zugefügt. Es wurde bei Raumtemperatur weitere 4 Stunden gerührt. Alle flüchtigen Materialien wurden im Vakuum entfernt, und es wurde ein beiger Feststoff erhalten. Das Rohmaterial wurde in Methylenchlorid (100 mL) suspendiert, und N-Methylmorpholin (13,3 g, 132 mmol) wurde zugefügt. Die Mischung wurde auf 0°C abgekühlt, und unter Rühren wurde Benzylchlorformiat (8,26 g, 48,4 mmol) zugefügt. Nach 30 Minuten wurde die Reaktion auf Raumtemperatur erwärmt, und die Lösung wurde mit Wasser und wässriger HCl (1 M) gewaschen. Die Lösung wurde über Natriumsulfat getrocknet. Filtration und Verdampfen von Lösungsmitteln ergab Rohprodukt, das durch Chromatographie an Silikagel (Eluierungsmittel: EtOAc/Hexane) gereinigt wurde, um Verbindung 602 (10,2 g) zu ergeben. LCMS-ESI+: berechnet für C15H17NO4: 275,3 (M+); Gefunden: 276,4 (M+H+).
  • b. Herstellung einer Mischung von Verbindungen 603 und 604.
  • Ein ofengetrockneter Dreihalsrundkolben wurde mit einem Stickstoffeinlassadapter und einem 250 mL Zugabetrichter ausgestattet. Der dritte Hals wurde mit einem Septum versiegelt. Der Kolben wurde mit einem Rührstäbchen, Dichlormethan (120 mL und Diethylzink (1,0 M in Hexan, 118 mL, 118 mmol) beschickt, danach in einem Eisbad auf 0°C abgekühlt. Der Zugabetrichter wurde mit Dichlormethan (40 mL) und Trifluoressigsäure (9,1 mL, 118 mmol) beschickt. Nachdem die Diethylzinklösung auf 0°C abgekühlt worden war (etwa 25 Minuten), wurde die Trifluoressigsäurelösung im Verlauf von 20 Minuten tropfenweise zu der gerührten Reaktionsmischung gegeben. Nachdem weitere 20 Minuten bei 0°C gerührt worden war, wurde langsam im Zeitverlauf von 4 Minuten Diiodmethan (9,5 mL, 118 mmol) zugegeben. Nach weiteren 20 Minuten wurde 4-Methylenpyrrolidin-1,2-dicarbonsäure-1-benzylester-2-methylester 602 (8,10 g, 29,4 mmol) in 30 mL Dichlormethan mittels Kanüle zugegeben. Der 4-Methylenpyrrolidin-1,2-dicarbonsäure-1-benzylester-2-methylester enthaltende Kolben wurde dann mit weiteren 10 mL Dichlormethan gespült, und diese Lösung wurde auch mittels Kanüle in die Reaktionsmischung überführt.
  • Die Reaktionsmischung wurde auf RT erwärmen gelassen und 110 Stunden (etwa 5 Tage) gerührt, danach wurden die Reagenzien mit gesättigtem wässrigem Ammoniumchlorid (~150 mL) gequencht. Der Inhalt des Kolbens wurde langsam in einen 2 L Scheidetrichter gegossen, der gesättigtes wässriges Natriumbicarbonat (800 mL) enthielt. Die wässrige Phase wurde drei Mal mit 300 mL Ethylacetat extrahiert. Die kombinierten organischen Materialien wurden über Magnesiumsulfat getrocknet und konzentriert, um eine Mischung der Verbindungen 603 und 604 zu liefern.
  • c. Herstellung von Verbindung 603.
  • Das Rohmaterial für den untergeordneten Teil b wurde in 3:1:1 THF/Wasser/Aceton (165 mL) gelöst, dann mit N-Methylmorpholin-N-oxid (3,45 g, 29,4 mmol) und Osmiumtetroxid (4 Gew.-% in Wasser, 5 mL, 0,818 mmol) behandelt. Nachdem 7 Stunden bei RT gerührt worden war, wurden die Reagenzien mit 1 M wässrigem Natriumthiosulfat (~100 mL) gequencht. Der Inhalt des Kolbens wurde dann in einen 1 L Scheidetrichter gegossen, der Wasser (~300 mL) enthielt. Die wässrige Phase wurde drei Mal mit 300 mL Dichlormethan extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet und konzentriert. Der rohe Rückstand wurde durch Chromatographie an einer Silikasäule (5% bis 45% EtOAc/Hexan) gereinigt, um 5-Azaspiro-[2.4]heptan-5,6-dicarbonsäure-5-benzylester-6-methylester 603 als klares Öl (5,54 g, 19,15 mmol, 65%) zu ergeben. 1H-NMR (CDCl3) δ 7,36–7,29 (m, 5H), 5,21–5,04 (m, 2H), 4,56–4,47 (m, 1H), 3,75 (s, 1,5H), 3,60 (m, 1,5H), 3,51–3,37 (m, 2H), 2,32–2,25 (m, 1H), 1,87–1,80 (m, 1H), 0,64–0,51 (m, 4H).
  • d. Herstellung von 5-Aza-spiro[2.4]heptan-5,6-dicarbonsäure-5-benzylester 606.
  • 5-Azaspiro[2.4]heptan-5,6-dicarbonsäure-5-benzylester-6-methylester 603 (244 mg, 0,840 mmol) wurde in THF (2,0 mL)/MeOH (1,5 mL) gelöst. Eine wässrige Lösung von LiOH (35,5 mg, 0,84 mmol) wurde zugefügt, und es wurde weiter bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde nach 3 Stunden mit wässriger HCl (1 M) neutralisiert, und die organischen Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt. Die rohe Mischung wurde mit Wasser und EtOAc verdünnt und die organische Phase aufgefangen. Alle flüchtigen Materialien wurden im Vakuum entfernt, und die rohe Säure 606 wurde ohne weitere Reinigung verwendet. LCMS-ESI+: berechnet für C15H17NO4: 275,3 (M+); Gefunden: 276,3 (M+H+).
  • Figure DE202012013382U1_0059
  • Figure DE202012013382U1_0060
  • e. Herstellung eines 2,7-Dibrom-9,9-difluor-9H-fluorens 608.
  • 2,7-Dibromfluoren-9-on 607 (4,0 g, 11,8 mmol) wurde bei Raumtemperatur in Deoxofluor (12 mL) suspendiert, und EtOH (4 Tropfen) wurde zugefügt. Die gerührte Suspension wurde 24 Stunden auf T = 90°C erwärmt (VORSICHT: Die Verwendung von Deoxofluor bei erhöhten Temperaturen wie oben beschrieben muss vorsichtig erfolgen, da schnelle und heftige Exothermen auftreten können). Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur gekühlt und auf Eis gegossen, welches Natriumbicarbonat enthielt. Es bildete sich ein Feststoff, der mittels Filtration aufgefangen wurde. Das Rohmaterial wurde in EtOAc aufgenommen und mit wässriger HCl (1 M) und Salzlösung gewaschen. Die Lösung wurde über Natriumsulfat getrocknet. Filtration und Verdampfen von Lösungsmitteln ergab Rohprodukt, das durch Chromatographie an Silikagel (Eluierungsmittel: EtOAc/Hexane) gereinigt wurde, um 608 (3,2 g) zu ergeben. 19F-NMR: 282 MHz, (DMSO-d6) δ: –111,6 ppm. Bevor das Material in der nächsten Stufe verwendet wurde, wurde es als Lösung in EtOAc mit Kohle behandelt.
  • f. Herstellung von 5-Aza-spiro[2.4]heptan-5,6-dicarbonsäure-5-benzylester-6-[2-(7-brom-9,9-difluor-9H-fluoren-2-yl)-2-oxoethyl]ester 609.
  • 2,7-Dibrom-9,9-difluor-9H-fluoren 608 (372 mg, 1,04 mmol), Pd(PPh3)4 (30,0 mg, 0,026 mmol), PdCl2(PPh3)2 (18,2 mg, 0,026 mmol), As(PPh3)3 (5,0 mg) wurden unter einer Argonatmosphäre in Dioxan (10 mL) gelöst. Ethoxyvinyltributylzinn (376,4 mg, 1,04 mmol) wurde zugegeben. Die Mischung wurde 140 Minuten auf 85°C erwärmt (Ölbad). Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur abgekühlt. N-Bromsuccinimid (177 mg, 1,0 mmol) wurde zugefügt, gefolgt von Wasser (2 mL). Die Reaktion wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, danach wurde der überwiegende Teil des Dioxans im Vakuum entfernt. Die rohe Reaktionsmischung wurde mit EtOAc verdünnt und mit Wasser gewaschen. Alle flüchtigen Materialien wurden im Vakuum entfernt. Es wurde Toluol zugefügt, und alle flüchtigen Materialien wurden ein zweites Mal im Vakuum entfernt. Das Rohmaterial wurde bei Raumtemperatur in DMF/MeCN (2 mL, 1:1) gelöst. Eine Lösung von N-Cbz-4-cyclopropyl(L)prolin 606 (0,84 mmol) und DIEA (268 mg, 2,08 mmol) in MeCN (2 mL) wurde zugefügt und das Rühren bei Raumtemperatur fortgesetzt. Das meiste des MeCN wurde nach 14 Stunden im Vakuum entfernt, und die rohe Reaktionsmischung wurde mit EtOAc verdünnt. Die Mischung wurde mit wässriger HCl (1 M), wässriger LiCl-Lösung (5%), Salzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Filtration und Eindampfen der Lösungsmittel ergab das rohe Reaktionsprodukt, das mittels Chromatographie an Silikagel (Eluierungsmittel: EtOAc/Hexane) gereinigt wurde, um Verbindung 609 (176 mg) zu ergeben. LCMS-ESI+: berechnet für C30H24BrF2NO5: 596,4 (M+); gefunden: 595,2/597,2 (M+H+).
  • g. Herstellung von 6-[5-(7-Brom-9,9-difluor-9H-fluoren-2-yl)-1H-imidazol-2-yl]-5-azaspiro[2.4]heptan-5-carbonsäurebenzylester 610.
  • 5-Azaspiro[2.4]heptan-5,6-dicarbonsäure-5-benzylester-6-[2-(7-brom-9,9-difluor-9H-fluoren-2-yl)-2-oxoethyl]ester 609 (172 mg, 0,293 mmol) wurde in m-Xylolen (6,0 mL) gelöst. Es wurde Ammoniumacetat (226 mg, 2,93 mmol) zugefügt, und die Reaktion wurde bei 140°C 60 Minuten unter Mikrowellenbedingungen gerührt. Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur gekühlt, und alle flüchtigen Materialien wurden im Vakuum entfernt. Das Rohmaterial wurde mittels Chromatographie an Silikagel (Eluierungsmittel: EtOAc/Hexane) gereinigt, um Verbindung 610 (80,3 mg) zu ergeben. LCMS-ESI+: berechnet für C30H24BrF2N3O2: 576,4 (M+); gefunden: 575,2/577,2 (M+H+).
  • h. Herstellung von (1-{6-[5-(7-Brom-9,9-difluor-9H-fluoren-2-yl)-1H-imidazol-2-yl]-5-azaspiro[2.4]heptan-5-carbonyl}-2-methylpropyl)-carbaminsäuremethylester 612.
  • 6-[5-(7-Brom-9,9-difluor-9H-fluoren-2-yl)-1H-imidazol-2-yl]-5-azaspiro[2.4]heptan-5-carbonsäurebenzylester 610 (800 mg, 1,38 mmol) wurde in Methylenchlorid (15 mL) gelöst, und HBr in AcOH (37%, 2 mL) wurde zugegeben und das Rühren bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die Suspension wurde nach 180 Minuten mit Hexanen verdünnt, und der Feststoff wurde mittels Filtration aufgefangen und mit Hexanen gewaschen und Vakuum ausgesetzt. Das Rohmaterial wurde in der nächsten Stufe ohne weitere Reinigung verwendet. Das Rohmaterial wurde in DMF (4,0 mL) gelöst, und es wurde DIEA (356 mg, 2,76 mmol) zugegeben. Eine Lösung von 2-(L)-Methoxycarbonylamino-3-methylbuttersäure 611 (242 mg, 1,38 mmol), HATU (524 mg, 1,38 mmol) und DIEA (178 mg, 1,38 mmol) in DMF (1 mL) wurde zugegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde nach 50 Minuten mit EtOAc verdünnt und mit wässriger Bicarbonatlösung, wässriger LiCl-Lösung (5%), Salzlösung gewaschen und wurde über Natriumsulfat getrocknet. Filtration und Entfernung der Lösungsmittel im Vakuum ergab das Rohmaterial, das mittels Chromatographie an Silikagel (Eluierungsmittel: EtOAc/Hexane) gereinigt wurde, um die leicht verunreinigte Verbindung 612 (878 mg) zu ergeben. LCMS-ESI+: berechnet für C29H29BrF2N4O3: 599,5 (M+); Gefunden: 598,5/600,5 (M+H+).
  • i. Herstellung von 3-[6-(9,9-Difluor-7-{2-[5-(2-methoxycarbonylamino-3-methylbutyryl)-5-azaspiro-[2.4]-hept-6-yl]-3H-imidazol-4-yl}-9H-fluoren-2-yl)-H-benzoimidazol-2-yl]-2-azabicyclo[2.2.1]heptan-2-carbonsäure-tert.-butylester 614.
  • (1-{6-[5-(7-Brom-9,9-difluor-9H-fluoren-2-yl)-1H-imidazol-2-yl]-5-azaspiro[2.4]heptan-5-carbonyl}-2-methylpropyl)-carbaminsäuremethylester 612 (840 mg, 1,4 mmol), 3-[6-(4,4,5,5-Tetramethyl-[1,3,2]dioxaborolan-2-yl)-1H-benzoimidazol-2-yl]-2-azabicyclo[2.2.1]heptan-2-carbonsäure-tert.-butylester 613 (615 mg, 1,4 mmol), Pd(PPh3)4 (161 mg, 0,14 mmol), K2CO3 (579 mg, 4,2 mmol) wurden unter einer Argonatmosphäre in DME (15 mL)/Wasser (3 mL) gelöst. Die Mischung wurde 120 Minuten auf 85–90°C erwärmt (Ölbad). Nach 120 Minuten wurde weiterer Boronatester (61 mg, 0,14 mmol) zugefügt und weiter erwärmt. Die Reaktion wurde nach 3 Stunden auf Raumtemperatur abgekühlt. Das meiste des DME wurde nach 14 Stunden im Vakuum entfernt, und die rohe Reaktionsmischung wurde mit EtOAc verdünnt. Die Mischung wurde mit Salzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Filtration und Eindampfen der Lösungsmittel ergab das rohe Reaktionsprodukt, das mittels Chromatographie an Silikagel (Eluierungsmittel: EtOAc/Hexane) gereinigt wurde, um Verbindung 614 (878 mg) zu ergeben. LCMS-ESI+: berechnet für C47H51F2N7O5: 831,9 (M+); gefunden: 832,7 (M+H+).
  • Die Intermediatverbindung 613 kann wie folgt hergestellt werden:
    Figure DE202012013382U1_0061
  • j. Herstellung von 3-(2-Amino-4-bromphenylcarbamoyl)-2-azabicyclo[2.2.1]heptan-2-carbonsäure-tert.-butylester 617.
  • Zu einer Lösung von 2-Azabicyclo[2.2.1]heptan-2,3-dicarbonsäure-2-tert.-butylester 616 (0,327 g, 1,36 mmol, 1 Äq.), 4-Brombenzol-1,2-diamin 615 (0,507 g, 2,71 mmol, 2 Äq.) und 4-Methylmorpholin (0,299 mL, 2 Äq.) in 10 mL DMF wurde HATU (0,543 g, 1,05 Äq.) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, dann konzentriert. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt und mit verdünnter wässriger NaHCO3-Lösung und Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde konzentriert und durch Flash-Säulenchromatographie (Silikagel, 20 bis 80% Ethylacetat/Hexan) gereinigt, um eine Mischung des Regioisomers 3-(2-Amino-4-bromphenylcarbamoyl)-2-azabicyclo[2.2.1]heptan-2-carbonsäure-tert.-butylester 617 zu ergeben.
  • k. Herstellung von 3-(6-Brom-1H-benzoimidazol-2-yl)-2-azabicyclo[2.2.1]heptan-2-carbonsäure-tert.-butylester 618.
  • Die obige Mischung des Regioisomers 3-(2-Amino-4-bromphenylcarbamoyl)-2-azabicyclo[2.2.1]heptan-2-carbonsäure-tert.-butylester 617 wurde in Ethanol gelöst und in einem versiegelten Rohr über Nacht auf 130°C erhitzt und weitere 3 Tage auf 170°C erhitzt. LC-MS zeigte das gewünschte Produkt und Boc-Spaltprodukt (Verhältnis etwa 1:1). Die Mischung wurde konzentriert und in HCl gelöst. Di-tert.-butyldicarbonat (0,6 Äq.) wurde zugefügt, und die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert und durch Flash-Säulenchromatographie (Silikagel, 20 bis 80% Ethylacetat/Hexan) gereinigt, um 3-(6-Brom-1H-benzoimidazol-2-yl)-2-azabicyclo[2.2.1]heptan-2-carbonsäure-tert.-butylester 618 (0,383 g, 72%) als orangen Schaum zu ergeben.
  • l. Herstellung von Verbindung 613.
  • Eine Mischung von 3-(6-Brom-1H-benzoimidazol-2-yl)-2-azabicyclo[2.2.1]heptan-2-carbonsäure-tert.-butylester 618 (264 mg, 0,673 mmol), Benzol-1,4-diboronsäuredipinakolester (5 Äq., 3,36 g, 6,95 mmol), Tetrakis-(triphenylphosphin)palladium (5%, 39 mg) und 2 M wässrige Kaliumcarbonatlösung (3 Äq., 1,01 mL) in 5 mL DME wurde unter Argon 4 Stunden lang auf 90°C erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde gekühlt und in Ethylacetat verdünnt und mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO4), konzentriert und durch Flash-Säulenchromatographie (Silikagel, 20 bis 60% Ethylacetat/Hexan) gereinigt, um 3-{6-[4-(4,4,5,5-Tetramethyl-[1,3,2]dioxaborolan-2-yl)-phenyl]-1H-benzoimidazol-2-yl}-2-azabicyclo[2.2.1]heptan-2-carbonsäure-tert.-butylester 613 (295 mg, Ausbeute 85%) zu ergeben. LCMS-ESI+: berechnet für C30H38BN3O4: 515,45; gefunden: 516,1 (M+H+).
  • Verbindung 7 kann nach synthetischen Methoden und Intermediaten wie in US 7,429,572 beschrieben hergestellt werden. Verbindung 7 kann auch wie in dem folgenden Beispiel beschrieben hergestellt werden.
  • Beispiel 7: Herstellung von Verbindung 7.
    Figure DE202012013382U1_0062
  • Zu einer eiskalten Suspension von Verbindung 701 (970 g, 3,74 mol) und DMAP (50 g, 0,412 mol) in THF (10 L) wurde TEA (2,3 kg, 16,5 mol) und Wasser (7 L) gegeben, was eine klare Lösung ergab. Isobutyrylchlorid (3 Äquivalente) wurde langsam zu der gerührten Mischung gegeben, während die Temperatur auf etwa 1°C gehalten wurde. Es wurden weitere 1,2, dann 0,7 Äquivalente Isobutyrylchlorid zugegeben, bis HPLC zeigte, dass die Reaktion im Wesentlichen vollständig abgelaufen war (insgesamt etwa 1,95 kg). Die Reaktionsmischung wurde mit konzentrierter HCl auf einen pH-Wert von etwa 6,4 angesäuert, und die organische Phase wurde mit EtOAc (2 × 10 L) gewaschen. Die kombinierten Extrakte wurden mit Wasser (1 × 15 L) gewaschen. Die organische Phase wurde filtriert und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde in IPA (ca. 20 kg) gelöst, und Heptan (14,2 kg) wurde zugefügt. Die Lösung wurde auf etwa 74–75°C erwärmt, um eine klare Lösung zu erzeugen, dann wurden etwa 5 L durch Destillation entfernt. Die resultierende Lösung wurde langsam auf RT abgekühlt. Bei etwa 42–43°C bildete sich ein Niederschlag. Es wurde langsam auf 5°C weiter gekühlt, dann über Nacht gerührt. Der resultierende Feststoff wurde filtriert und das Filtrat mit IPA/Heptan(1:8)-Mischung (13,4 kg) gewaschen und unter Vakuum bei etwa 60–70°C getrocknet, um 1,295 kg (86,65%) Verbindung 7 zu ergeben, die gemäß HPLC 99,45% rein war.
  • Die Intermediatverbindung 706 kann wie folgt hergestellt werden:
    Figure DE202012013382U1_0063
  • a. Herstellung von Verbindung 701.
  • Zu einer Suspension von Cytidin (100 g, 0,411 mol) in DMF (2,06 L) wurde Benzoesäureanhydrid (102,4 g, 0,452 mol) gegeben. Die Mischung wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das DMF wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mit Diethylether trituriert. Der resultierende Feststoff wurde durch Saugfiltration aufgefangen und mit Diethylether (2 × 200 mL) gewaschen. Weiteres Trocknen im Vakuum bei Raumtemperatur ergab das N4-Benzamid (140,6 g, 98,3%). Ein Teil dieses Materials (139,3 g, 0,401 mol) wurde in wasserfreiem Pyridin (1,2 L) gelöst und mit 1,3-Dichlor-1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxan (141,4 mL, 0,441 mol) bei Raumtemperatur behandelt. Die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde im Vakuum bis nahezu zur Trockne konzentriert und gemeinsam mit Toluol eingedampft (3 × 200 mL). Der Rückstand wurde mit EtOAc (1,8 L) behandelt und mit HCl (2 × 200 mL, 0,05 N), NaHCO3 (5%, 2 × 400 mL) gewaschen. Die organische Phase wurde gewaschen, getrocknet (Na2SO4), filtriert und zur Trockne eingedampft. Verbindung 701 (256,5 g, > 100%) wurde als weißer Schaum isoliert und ohne weitere Reinigung verwendet.
  • b. Herstellung von Verbindung 702.
  • Verbindung 701 (236,5 g, 0,40 mol) wurde in trockenem THF (1,22 L) gelöst. Wasserfreies DMSO (180,8 mL, 2,1 mol) wurde zugegeben, und die resultierende Lösung wurde auf zwischen –20°C und –15°C gekühlt.
  • Trifluoressigsäureanhydrid (90,6 mL, 0,64 mol) wurde tropfenweise über 45 Minuten zugegeben, die Lösung wurde 2 Stunden lang zwischen –20°C und –15°C gerührt, danach wurde wasserfreies Triethylamin (223,5 mL, 1,6 mol) über 20 Minuten zugegeben. Die rohe Reaktion, die Keton 702 enthielt, wurde in EtOAc (500 mL) gelöst, und die resultierende Lösung wurde mit H2O (3 × 400 mL) gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und die Lösungsmittel im Vakuum entfernt, um einen gelben Feststoff zu ergeben, der an einer Säule mit Silikagel gereinigt wurde, wobei mit einem stufenweisen Gradienten von Et2O (0–60%) in Hexanen, gefolgt von einem stufenweisen Gradienten von EtOAc (50–100%) in Hexanen, eluiert wurde. Das so erhaltene rohe Keton (~192 g) wurde aus Petrolether kristallisiert, um Keton 702 (138,91 g, 57,5% aus Cytidin) als weißen Feststoff und 22 g nicht-umgesetztes Ausgangsmaterial, 701, als gelben Feststoff zu ergeben.
  • c. Herstellung von Verbindung 703.
  • Verbindung 702 (48,57 g, 8,26 mmol) wurde in wasserfreiem Toluol (~400 mL) gelöst, und das Lösungsmittel wurde unter Feuchtigkeitsausschluss im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde dann im Vakuum (Ölpumpe) weitere 2 Stunden getrocknet. Unter striktem Feuchtigkeitsausschluss wurde der restliche Schaum unter Argon in wasserfreiem Diethylether (1,03 L) gelöst. Die resultierende Lösung wurde unter Argon auf –78°C gekühlt, und über einen Zugabetrichter wurden tropfenweise MeLi (1,6 M, 258,0 mL, 0,413 mol) zugegeben. Nachdem die Zugabe abgeschlossen war, wurde die Mischung 2 Stunden bei –78°C gerührt. Langsam wurde wässrige 1 M NH4Cl (500 mL) zugegeben. Die Mischung wurde nach Erwärmen auf Raumtemperatur mit H2O (2 × 500 mL) gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und dann zur Trockne konzentriert, um einen braunen Schaum (~60 g, > 100%) zu ergeben.
  • Die Reaktion wurde zwei weitere Male unter Verwendung von 37,62 g und 56,4 g von Verbindung 702 durchgeführt. Die kombinierten Rohprodukte (128,0 g, 0,212 mol) wurden in THF (1,28 L) gelöst und mit konzentrierter HOAc (23 mL, 0,402 mol) behandelt. Der Lösung wurde TRAF (384,0 mL, 1 M in THF) zugegeben. Die Lösung wurde 0,75 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, und die Mischung wurde mit Silikagel (750 g) behandelt und zur Trockne konzentriert. Das Pulver wurde auf eine Silikagelsäule gegeben, die in CH2Cl2 gepackt war. Eluierung mit 1:7 EtOH-CH2Cl2 ergab einen dunklen wachsartigen Feststoff, der auf Silikagel (300 g) voradsorbiert und wie zuvor chromatographiert wurde. Verbindung 703 (46,4 g, 53,0% von 702) wurde als schmutzigweißer Feststoff isoliert. 1H-NMR (DMSO-d6): δ 1,20 (s, 3H, CH3), 3,62–3,69 (m, 2H,), 3,73–3,78 (m, 2H,), 5,19 (t, 1H, J = 5,4 Hz, OH-5'), 5,25 (s, 1H, OH-2'), 5,52 (d, 1H, J = 5,0 Hz, OH-3'), 5,99 (s, 1H, H-1'), 7,32 (d, 1H, J = 5,8 Hz), 7,50 (Ψt, 2H, J = 7,7 Hz), 7,62 (Ψ, 1H, J = 7,3 Hz), 8,00 (d, 2H, J = 7,3 Hz), 8,14 (d, 1H, J = 6,9 Hz), 11,22 (s, 1H, NH). Anal. berechnet für C17H19N3O6·0,5H2O: C, 55,13; H, 5,44; N, 11,35. Gefunden: C, 55,21; H, 5,47; N, 11,33.
  • d. Herstellung von Verbindung 704.
  • Verbindung 703 (46,0 g, 0,13 mol) wurde in wasserfreiem Pyridin gelöst und im Vakuum zur Trockne konzentriert. Der resultierende Sirup wurde unter Argon in wasserfreiem Pyridin gelöst und unter Rühren auf 0°C abgekühlt.
  • Die braune Lösung wurde über 10 Minuten tropfenweise mit Benzoylchlorid (30 mL, 0,250 mol) behandelt. Das Eisbad wurde entfernt und das Rühren 1,5 Stunden fortgesetzt, woraufhin DC kein verbleibendes Ausgangsmaterial zeigte. Die Mischung wurde durch Zugabe von Wasser (5 mL) gequencht und zur Trockne konzentriert. Der Rückstand wurde in einer minimalen Menge CH2Cl2 gelöst und mit gesättigter NaHCO3 (1 × 500 ml) und H2O (1 × 500 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (Na2SO4) und filtriert, zur Trockne konzentriert und an Silikagel chromatographiert, wobei mit einem stufenweisen Gradienten von EtOAc-Hexanen (25–60%) eluiert wurde, um Verbindung 704 als gelben Schaum bereitzustellen (48,5 g, 67%). 1H-NMR (CDCl3): δ 1,64 (s, 3H, CH3), 4,50 (m, 1H, H-4), 4,78–4,85 (m, 2H, H-5', 5a'), 5,50 (d, 1H, J = 3,4 Hz, H-3'), 6,42 (s, 1H, H-1'), 7,44–7,54 (m, 7H, Ar), 7,57–7,66 (m, 3H, Ar), 7,94 (d, 2H, J = 7,8 Hz), 8,05–8,09 (m, 4H, Ar), 8,21 (d, 1H, J = 7,3 Hz). Anal. berechnet für C31H27NO8: C, 65,37; H, 4,78; N, 7,38. Gefunden: C, 65,59; H, 4,79; N, 7,16.
  • e. Herstellung von Verbindung 705.
  • Verbindung 704 (7,50 g, 0,013 mol) wurde unter Argon in wasserfreiem Toluol (150 mL) gelöst und auf –20°C gekühlt. DAST (2,5 mL, 18,9 mmol) wurde langsam zugegeben, und nachdem die Zugabe abgeschlossen war, wurde das Kühlbad entfernt. Das Rühren wurde 1 Stunde fortgesetzt und die Mischung in gesättigte NaHCO3 (100 mL) gegossen und gewaschen, bis die Gasentwicklung sistierte. Die organische Phase wurde getrocknet (Na2SO4), konzentriert und durch Chromatographie an Silikagel gereinigt, wobei mit 1:1 EtOAc-Hexanen eluiert wurde. Die Ausbeute betrug 1,22 g (16,3%) reines 705 als weißer Feststoff, Schmelzpunkt 241°C (CH2Cl2-Hexane);
    1H-NMR (CDCl3): δ 1,49 (d, 3H, J = 22,4 Hz, CH3), 4,64 (dd, 1H, J = 3,44, 12,9 Hz, H-5'), 4,73 (d, 1H, J = 9,5 Hz, H-4'), 4,90 (dd, 1H, J = 2,4, 12,7 Hz, H-5a'), 5,56 (dd, 1H, J = 8,6, 20,7 Hz, H-3'), 6,52 (d, 1H, J = 18,0 Hz, H-1'), 7,47–7,57 (m, 7H, Ar), 7,62–7,71 (m, 3H, Ar), 7,89 (d, 2H, J = 6,9 Hz), 8,07–8,11 (m, 5H, Ar), 8,67 (bs, 1H, NH). 19F-NMR (CDCl3): δ 3,3 (m). Anal. berechnet für C31H26FN3O7·0,7H2O: C, 63,74; H, 4,72; N, 7,20. Gefunden: C, 63,71; H, 4,54; N, 7,20.
  • f. Herstellung von Verbindung 706.
  • Verbindung 705 (6,30 g, 0,011 mol) wurde in methanolischem Ammoniak (ca. 7 N, 150 mL) suspendiert und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, gemeinsam mit Methanol (1 × 20 mL) verdampft und an Silikagel voradsorbiert. Das weiße Pulver wurde auf eine Silikagelsäule (gepackt in CHCl3) gegeben, und die Säule wurde mit 9% EtOH in CHCl3, danach 17% EtOH und schließlich 25% EtOH in CHCl3 eluiert. Konzentration der produkthaltigen Fraktionen, Filtration durch eine 0,4 μm Platte und Lyophilisierung aus Wasser ergab Verbindung 706, 2,18 g (76%). 1H-NMR (DMSO-d6): δ 1,17 (d, 3H, J = 22,3 Hz, CH3), 3,63 (dd, 1H, J = 2,7, 13,7 Hz, H-5'), 3,70–3,84 (m, 3H, H-3', H-4', H-5a'), 5,24 (scheinbares s, 1H, OH-3'), 5,60 (d, 1H, J = 5,4 Hz, H-5'), 5,74 (d, 1H, J = 7,71 Hz, H-5), 6,07 (d, 1H, J = 18,9 Hz, H-1'), 7,31 (s, 1H, NH2), 7,42 (s, 1H, NH2), 7,90 (d, 1H, J = 7,3 Hz, H-6). 19F-NMR (DMSO-d6): δ 2,60 (m). Anal. berechnet für C10H14FN3O4·1,4H2O: C, 44,22; H, 5,95; N, 14,77.
  • Gefunden: C, 42,24; H, 5,63; N, 14,54. Verbindung 706 (0,10 g, 0,386 mmol) wurde in das Hydrochloridsalz überführt, indem sie in Wasser (2 mL) gelöst und der pH mit 1 M HCl auf ungefähr 3,0 eingestellt wurde. Das Wasser wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde aus wässrigem EtOH kristallisiert, um Verbindung 706 als Hydrochloridsalz (71,0 mg) zu ergeben. Schmelzpunkt 243°C (Zersetzung); 1H-NMR (DMSO-d6): δ 1,29 (d, 3H, J = 22,6 Hz, CH3), 3,65 (dd, 1H, J = 2,3, 12,7 Hz, H-5'), 3,76–3,90 (m, 3H, H-3', H-4', H-5a'), 5,96 (d, 1H, J = 17,3 Hz, H-1') 6,15 (d, 1H, J = 7,9 Hz, H-5), 8,33 (d, 1H, J = 7,9 Hz, H-6), 8,69 (s, 1,5H, NH), 9,78 (s, 1,5H, NH).
    19F-NMR (DMSO-d6): δ 1,69 (m). Anal. berechnet für C10H14FN3O4·HCl: C, 40,62; H, 5,11; N, 14,21. Gefunden: C, 40,80; H, 5,09; N, 14,23.
  • Verbindung 8 kann nach synthetischen Methoden und Intermediaten wie in US 12/632,194 beschrieben hergestellt werden. Verbindung 8 kann auch wie in dem folgenden Beispiel beschrieben hergestellt werden.
  • Beispiel 8: Herstellung von 4-Amino-2-n-butoxy-8-[3'-(pyrrolidin-1''-ylmethyl)-benzyl]-5,6,7,8-tetra-hydropteridin-6-on 8. (R = n-Butyl)
    Figure DE202012013382U1_0064
  • Zu einer Lösung der Nitroverbindung 807 (730 mg, 1,5 mmol) in MeOH (10 mL) wurde Raney-Nickel gegeben (~200 μL, Aufschlämmung in H2O). Das Reaktionsgefäß wurde mit H2 gespült und danach 1,5 Stunden unter einer H2-Atmosphäre gerührt. Die Mischung wurde mit CH2Cl2 und MeOH (1:1) durch Celite filtriert. Das Filtrat wurde unter Vakuum konzentriert und über Nacht auf dem Lyophilisierer gelassen. Die freie Base von Verbindung 8 wurde als weißer Feststoff erhalten. Um das HCl-Salz von 8 zu erhalten, wurde eine Probe des obigen Filtrats mit 1,0 M HCl auf pH = 1–2 versetzt und lyophilisiert. 1H-NMR (CD3OD, 300 MHz): δ 7,65 (s, 1H), 7,50 (m, 3H), 4,96 (s, 2H), 4,44 (t, J = 7 Hz, 2H), 4,40 (s, 2H), 4,16 (s, 2H), 3,48 (m, 2H), 3,19 (m, 2H), 2,02–2,17 (m, 4H), 1,74 (m, 2H), 1,45 (m, 2H), 0,94 (t, J = 7 Hz, 3H) – [HCl-Salz], LCMS-ESI+: berechnet für C22H31N6O2: 411,5 (M+); gefunden: 411,3 (M+H+).
  • Die Intermediatverbindung 807 wurde wie folgt hergestellt:
    Figure DE202012013382U1_0065
  • a. Herstellung von Verbindung 802.
  • Zu einer Lösung von Verbindung 801 (2,46 g, 10,2 mmol) in THF (34 mL) bei –20°C wurde Et3N (3,14 mL, 22,5 mmol) gegeben, gefolgt von einer Lösung von NH3 (2,0 M in MeOH, 5,4 mL, 11 mmol). Die Mischung wurde 1,5 Stunden unter Erwärmen auf 0°C gerührt (LC/MS zeigte Verbrauch des Ausgangsmaterials). Die Verbindung 802 enthaltende Reaktionsmischung wurde ohne Aufarbeitung weiter verwendet.
  • b. Herstellung von Verbindung 803.
  • Figure DE202012013382U1_0066
  • Zu einer Lösung von 3-((1-Pyrrolidinylmethyl)phenyl)methanamin 806 (1,95 g, 10,2 mmol) in THF (34 mL) bei 0°C wurde Et3N (3,14 mmol, 22,5 mmol) gegeben, gefolgt von tropfenweiser Zugabe von Methylbromacetat (1,04 mL, 22,3 mmol. Die Reaktionsmischung wurde gerührt, bis LC/MS den Verbrauch der Ausgangsmaterialien zeigte, ungefähr 2 Stunden. Die Verbindung 803 enthaltende Reaktionsmischung wurde ohne Aufarbeitung weiter verwendet.
  • c. Herstellung von Verbindung 804.
  • Die Verbindung 803 enthaltende Reaktionsmischung wurde bei 0°C zu der Reaktionsmischung gegeben, die Verbindung 802 enthielt. Die Reaktionsmischung wurde gerührt, bis LC/MS den Verbrauch von Verbindung 802 zeigte, ungefähr 45 Minuten. Es wurde eine gesättigte Lösung von NH4Cl (50 mL) zugefügt. Die Phasen wurden getrennt und die wässrige Phase mit EtOAc (2 × 30 mL) extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet, filtriert und unter Vakuum konzentriert. Reinigung mittels Silikagelchromatographie lieferte 2,11 g Verbindung 804. 1H-NMR (CD3OD, 300 MHz): δ (ppm) 7,32–7,16 (m, 4H), 4,69 (s, 2H), 4,19 (q, J = 7 Hz, 2H), 4,07 (s, 2H), 3,60 (s, 2H), 2,49 (m, 4H), 2,40 (s, 3H), 1,78 (m, 4H), 1,23 (t, 3H, J = 7 Hz). LCMS-ESI+ berechnet für C21H29N6O4S: 461,2 (Mt); Gefunden: 461,0 (M+H+).
  • d. Herstellung von Ethyl-Na-[4-amino-2-methansulfonyl-5-nitropyrimidin-6-yl],Na-[3'-(pyrrolidin-1''-yl-methyl)-benzyl]-glycinat 805.
    Figure DE202012013382U1_0067
  • Zu einer Lösung einer Suspension des Sulfids 804 (3,68 g, 8,00 mmol) in EtOH (40 mL) bei 0°C wurden sequentiell Natriumwolframatdihydrat (792 mg, 2,40 mmol), Essigsäure (4,6 mL, 80 mmol) und Wasserstoffperoxid (3,4 mL, ~40 mmol, 35% Gew./Gew. in H2O) gegeben. Nach drei Stunden wurden weitere Essigsäure (4,6 mL) und Wasserstoffperoxid (3,4 mL) zugegeben. Die Reaktion wurde 16 Stunden lang auf 0°C gehalten. Vorsichtig wurde eine gesättigte Lösung von Na2SO3 (50 mL) zugegeben, während die Reaktion auf 0°C war, gefolgt von CH2Cl2 (75 mL). Die Phasen wurden getrennt und die wässrige Phase wurde mit CH2Cl2 (4 × 50 mL) extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet, filtriert und unter Vakuum konzentriert, um ein Verbindung 805 enthaltendes Material zu liefern, das ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
  • e. Herstellung von Verbindung 807. (R = n-Butyl)
    Figure DE202012013382U1_0068
  • Zu einer Lösung von Sulfon 805 (1,0 g, 2,0 mmol) in n-Butanol (10 mL) wurde TFA (470 μL, 6,1 mmol) gegeben. Die Reaktion wurde 1 Stunde lang bei 100°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde auf eine gesättigte Lösung von NaHCO3 (20 mL) und CH2Cl2 (30 mL) gegossen Die Phasen wurden getrennt und die wässrige Phase wurde mit CH2Cl2 (30 mL) extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet, filtriert und unter Vakuum konzentriert. Die Reinigung wurde mittels Silikagelchromatographie (1 g Substrat/10 g SiO2) (2–15% MeOH/CH2Cl2) durchgeführt, um Verbindung 807 zu liefern.
  • Beispiel 9: Vorbereitung von Verbindung 9 (aus US 2010/0298257 )
    Figure DE202012013382U1_0069
  • Vorbereitung von (S)-2-{[(1R,4R,5R)-5-(2,4-Dioxo-3,4-dihydro-2H-pyrimidin-1-yl)-4-(R)-fluoro-3-hydroxy-4-methyl-tetrahydrofuran-2-yl-methoxy]-phenoxyphosphorylamino}-Propionsäure Isopropylester (aus US2010/0298257 Beispiel 2)
  • Synonym: 5'-O-(Isopropyl-L-alanate, phenyl phosphoramidyl)-2'-deoxy-2'-fluoro-2'-C-Methyluridin-Diastereoisomer-Mischung.
  • Eine 5-Liter-Dreihalsflasche wurde mit einem mechanischen Rührwerk, einem Soleeisbad, internem Thermometer und einer Stickstoffatmosphäre ausgestattet. Die Flasche wurde mit L-Alanin Isopropylester-Hydrochlorid (82,0 g, 0,490 Mol) und wasserfreiem Dichlormethan (0,80 l) befüllt. Während des Rührens wurde Phenyldichlorphosphat (85,0 g, 0,40 Mol) auf einmal zugeführt und gerührt. Unter Aufrechterhaltung der internen Temperatur zwischen –5 und 5°C wurde über einen Zeitraum von einer halben Stunde eine Lösung von N-Methylimidazol (NMI, 250 g, 3,07 Mol) in Dichlormethan (250 ml) hinzugefügt. Die Lösung wurde eine Stunde lang in diesem Temperaturbereich gerührt. Bei 0°C wurde 2'-Deoxy-2'-fluoro-2'-C-Methyluridin (3,80.0 g, 0,307 Mol auf einmal zugegeben und eine langsame Erwärmung der Reaktionsflasche im Solebad zugelassen. Nach einer Stunde betrug die interne Temperatur bis zu –2°C. DC (5% Methanol in HCl) nach einer Stunde zeigte, das mehr als 50% des Nucleosids aufgenommen wurde. Das Bad wurde entfernt und die Reaktionsflasche erreichte innerhalb einer weiteren Stunde Umgebungstemperatur. DC nach drei Stunden und nach fünf Stunden zeigte, das 95% des Anfangsnucleosids aufgenommen wurde. Die Reaktionsmischung wurde durch Hinzufügen von Methanol (100 ml) und fünf Minuten langes Rühren der Reaktion gequencht. Die Reaktionsmischung wurde mit 1 N HCl (2 × 500 ml) und dann mit einer gesättigten Natriumbikarbonatlösung (2 × 500 ml) gewaschen. Die abgetrennte organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat (50 g) getrocknet und gefiltert. Die Lösung wurde unter reduziertem Druck und dann unter Hochvakuum bis zur Trockenheit verdampft, um das Rohprodukt als zähflüssiges Öl (170 g) zu erzielen. Es wurden NMRs des Rohprodukts (31P und 1H) durchgeführt. Das 31P-NMR wies darauf hin, dass etwa 1% der gesamten Phosphorintegration durch das Vorhandensein des 3' Isomer 5 begründet war.
  • Zum Rohprodukt wurde wasserfreies Pyridin (1.700 ml) hinzugefügt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck und anschließend unter Hochvakuum verdampft, um den Wasseranteil der Rohmischung durch Koevaporation zu verringern. Das dadurch entstehende Öl wurde in wasserfreiem Pyridin (500 ml) wieder aufgelöst, dann wurde überschüssiges t-butyldimethylsilyl-Chlorid (9,0 g, 60 mmol) hinzugefügt. Die Reaktion wurde bei Umgebungstemperatur gerührt. Der Reaktionsfortschritt wurde über UPLC/MS überwacht. Nach drei Stunden konnte die 3' Verunreinigung 5 nicht mehr nachgewiesen werden und die Reaktion wurde durch Zugabe von Methanol (50 ml) gequencht. Die Reaktion wurde unter reduziertem Druck zu einem Öl verdampft. Die Rückstände wurden in Ethylacetat (1,5 l) aufgelöst und mit 1 N HCl (2 × 500 ml) und anschließend mit einer gesättigten Natriumbikarbonatlösung (2 × 500 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat (50 g) getrocknet, gefiltert und unter reduziertem Druck verdampft, um das Rohprodukt in Form eines hellgelben Öls zu erzielen. Das Rohöl wurde mit dem gleichen Anteil von Dichlormethan verdünnt und in einem radialen Kompressionsmodul bei 100 psi Luftdruck auf eine 2,5 kg Silikagelkartusche aufgebracht. Mithilfe einer Gradientenpumpe wurde die Kartusche bei 60 psi und einer Durchflussrate von 400 ml/min mit Methylenchlorid (4 l) und anschließend mit von 1% bis 4% ansteigende Methanol in Methylenchlorid (48 l) gewaschen. Der Großteil der wichtigsten Verunreinigungen (di-(isopropylalanyl)-Phenylphosphat, 3',5'-bis-Phosphoramidat, 3'-Phosphoramidat-5'-TBDMS-Addukt (7)) eluierte mit ~3% Gradient. Das gewünschte Produkt eluierte zwischen 3% und 4% Methanol. Die das Produkt enthaltenden Anteile wurden in zwei Chargen sortiert. Die erste enthielt geringe Mengen von oberen Verunreinigungen und das zweite war reines Produkt. Die erste Reihe von Anteilen enthielt geringe Menge von weniger polaren Verunreinigungen (obere Verunreinigungen) wie 3',5'-bis-Phosphoramidat und di-Aanylphenylphosphat sowie hauptsächlich das Rp-Diastereoisomer und erforderte eine Reinigung über eine zweiten Trennsäule. (Die entsprechende Terminologie obere bzw. untere bezieht sich auf die Eluierung auf normalphasigen Silikagel-Chronomatographen, wobei unter ”oberes Isomer” das als erstes eluierende Isomer zu verstehen ist.) Die zweite Reihe von Anteilen wies keine signifikante Menge von Verunreinigungen auf – lediglich das verbleibende Rp und hauptsächlich die Sp-Diastereoisomere. Sie wurde später wieder mit den zweifach getrennten Anteilen zusammengeführt. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck verdampft und der entstehende weiße Schaum wurde eine Stunde lang weiter getrocknet (0,20 mmHG), um 42 g der verunreinigten Charge (4:1 oberes vs. unteres Isomer auf Basis 31p-NMR) und 38 g der puren Charge (1:3 oberes vs. unteres Isomer) zu erhalten. Die verunreinigte Charge wurde auf ähnliche Weise erneut getrennt, um 3,8 g von 97% reinem oberen Isomer (Anteil aufbewahrt) und 36 g pures Produkt im Verhältnis 4:1 zu erhalten. Die beiden Hauptchargen wurden in HCl aufgelöst, kombiniert, unter verringertem Druck verdampft und getrocknet (50°C, 0,2 mmHg, 24 h), um 74 g (45,7%) reines Produkt (Verbindung 9) mit einem Diastereoisomerverhältnis von 48:51 als weißen Schaum, Temp. etwa 75–85°C zu erhalten. Um eine amorphe Flüssigkeit aus der Diastereoisomermischung zu erzeugen, wurden 74 g des weißen Schaums mit t-Butylmethylether (750 ml) gerührt, was zu einer teilweisen Lösung und einem gummiartigen festen Rückstand führte. Während des Rührens wurden langsam Heptane (750 ml) zugegeben und die Suspension wurde eine Stunde lang mechanisch gerührt, bis sich der Großteil des Gummis in einen weißen Festtstoff verwandelt hatte. Der Festtstoff wurde mit einem Spatel abgekratzt und die entstehende Aufschlämmung gefiltert. Der Festtstoff wurde mit Heptanen (4 × 50 ml) gewaschen und unter Vakuum getrocknet (50°C, 0,2 mmHg, 24 h), um ein weißes, amorphes Pulver (64 g) mit einem breiten Schmelzbereich von 70–80°C zu erhalten. 1H- und 31P-NMR in Übereinstimmung mit der Struktur und HPLC zeigten eine Reinheit von 99,8% mit einem Diastereoisomerverhältnis von 46:54 (durch 31P-NMR ebenfalls bestätigt).
  • Alternative Methode zur Herstellung einer festen Mischung von Verbindung 9. Nach der Chronomatographie wurde der Rückstand zweimal gemeinsam mit Dichlormethan (5 ml/g) verdampft und 24 h bei 35–40°C und 35–45 mTorr getrocknet. Der Schaumrückstand wurde durch ein 250 μ-Sieb gesiebt und unter denselben Bedingungen weiter getrocknet, bis der Dichlormethanrückstand unter 400 ppm, gemessen durch Headspace-GC gefallen war. Das entstehende feine grauweiße bis weiße amorphe Pulver verfügt über einen Glasübergangstemperaturbereich von 53,7 bis 63,5°C.
  • Charakterisierung von Verbindung 9 (Isomermischung):
    • 1H-NMR (CDCl3) 010,05 (brs, 1H, NH, Sp), 10,00 (brs, 1H, NH, Rp), 7,49 (d, 1H, C6-H, Sp), 7,36 (m, 5H, C6-H, Rp, aromatisch), 7,23–7,14 (m, 6H, Rp/Sp, aromatisch), 6,18 (brd, 2H, Cl'-H, Rp/Sp), 5,63 (d, 1H, C5-H, Sp), 5,58 (d, 1H, C5-H, Rp), 5,01 (m, 2H, CH-(CH3)2 Rp/Sp), 4,46-(m, 8H, C-5'-H2, ala-NH, C3'-OH, Rp/Sp), 4,12 (m, 2H, ala-CHCH3, Rp/Sp), 4,01–3,85 (m, 4H, C3'-H, C4'-H, Rp/Sp), 1.391,22 (m, 12H, alle CH3, Rp/Sp).
    • 31P-NMR (CDCl3) 03,60 (Rp), 3,20 Sp relativ zu Triphenylphosphat bei –17,80 ppm. ES-MS M+1 530,2. Elementaranalyse: Berechnete % (inklusive 0,29% Wasser entsprechend der Karl Fisher-Analyse) C, 49,75; H, 5,54; N 7,90; F, 3,58; P, 5,84. Gefundene %: C, 49,50; H, 5,44; N, 7,85; F, 3,62; P, 6,05.
  • Vorbereitung von 2'-deoxy-2'-fluoro-2'-C-Methyluridin (aus US2010/0298257 Beispiel 1)
  • In einer 10 l-Flasche wurden 3',5'-O-dibenozyl-2'deoxy-2'-fluoro-2'-C-methyl-N4-Benzoylcytidin (500 g, 0,874 Mol) und 70% wässrige Essigsäure (7,5 l) gemischt. Die Lösung wurde zum Refluxieren für 20 h erhitzt (110 C). TLC zeigte eine vollständige Reaktion (Rf 0,6 in 5% Methanol in Dichlormethan (HCl)). Die Mischung wurde auf Umgebungstemperatur abgekühlt und mit Wasser (2 l) verdünnt. Nach zweistündigem Rühren wurde der entstehende Niederschlag durch Filterung aufgenommen und der Festtstoff mit Wasser (5 l) gespült und in der Atmosphäre bei Umgebungstemperatur 12 h getrocknet, um 360 g hervorzubringen (88%). Dieser Zwischenstoff Dibenzoluridin wurde direkt im nächsten Schritt verwendet, indem er vollständig dem frisch vorbereiteten methanolischen Ammoniak (5,4 l, ca. 25% bei 0°C) zugegeben wurde. Diese Temperatur wurde drei Stunden lang aufrecht erhalten und anschließend eine Erwärmung auf 15°C innerhalb von 24 h zugelassen. TLC zeigte eine vollständige Reaktion an (Rf 0,4 in 10% Methanol in HCl). Die Reaktionsmischung wurde durch ein Celite-Bett gefiltert und unter verringertem Druck konzentriert, um das Rohprodukt (216 g) zu erhalten. Das Rohprodukt wurde mit Ethylacetat (325 ml) 3 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Der dadurch entstehende Festtstoff wurde durch Filtration aufgenommen und mit Ethylacetat (216 ml) gewaschen. Der Festtstoff wurde unter Vakuum bei Umgebungstemperatur 4 h lang getrocknet, um 160 g (78%) des gewünschten Produkts in 98,7% HPLC-Reinheit hervorzubringen. 1H-NMR (DMSO-d6) 011,44 (br s, 1H, NH), 7,95 (d, 1H, C-6H), 5,97 (d, 1H, C-1'H), 5,64 (d, 1H, C-5H), 3,84–3,77 (m, 3H, C-5'-Ha, C-3'H. C-4'H), 3,63–3,60 (m, 1H, C5'-Hb), 1,23 (d, 3H, C-2'-CH3). ES-MS M-I 259.
  • Beispiel 10: Vorbereitung von Verbindung 10 (aus US 2010/0298257 )
    Figure DE202012013382U1_0070
  • Direkte Ausfällung von Verbindung 10 (aus US2010/0298257 , Beispiel 4): Einer gerührten Lösung von L-Alanin Isopropylester Hydrochlorid (10,5 g, 61,5 mmol, azeotrop getrocknet, zweifach, mit jeweils 50 ml Toluol) in Dichlormethan (100 ml) wurde bei Raumtemperatur Phenydichlorphosphat (7,5 ml, 50 mmol) hinzugefügt. Die Mischung wurde auf –10°C abgekühlt und anschließend wurde über einen Zeitraum von 30 min. eine Lösung von N-Methylimidazol (30,5 ml, 384,3 mmol) in 30 ml Dichlormethan hinzugefügt. Nachdem die Zugabe abgeschlossen war, wurde die Mischung eine Stunde lang zwischen –10°C und –15°C gerührt. Der obigen Mischung wurde 2'-deoxy-2'-fluoro-2'-C-Methyluridin (10 g, 38,4 mmol) (siehe US2010/0298257 , Beispiel 1) in einer Charge hinzugefügt, und die Mischung wurde unterhalb von –10°C 3 h lang gerührt und anschließend wurde eine langsame Erwärmung auf 20°C zugelassen (6 h). Bei dieser Temperatur wurde die Mischung über Nacht (15 h) gerührt und dann mit 10 ml Methanol gequencht. Das Lösungsmittel wurde verdampft und der Rückstand wieder in Ethylacetat (200 ml) aufgelöst. Die Ethylacetatschicht wurde mit Wasser (100 ml), 1 N HCl (3 × 75 ml), 2% wässriger NaHCO3-Lösung (50 ml) und Sole (50 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Na2SO4 getrocknet, gefiltert und konzentriert. Der Rückstand wurde 2 h lang unter Hochvakuum getrocknet, um weißen Schaum (22 g) zu erhalten. Der obige Schaum wurde in 33 ml HCl aufgelöst, anschließend wurden 65 ml Isopropylether hinzugefügt, um eine gesättigte Lösung zu erzielen. Die Lösung wurde durch ein kleines Celite-Kissen gefiltert, und das Filtrat wurde mit Keimen von Verbindung 10 72 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt (etwa 22°C – Beachten Sie, dass die Kühlung der Suspension auf 0°C zum Ausölen des Rohprodukts führte). Der weiße Festtstoff wurde gefiltert, mit Isopropylether (20 ml) gewaschen und getrocknet, um 4,58 g (85:15 Mischung von Verbindung 10 und R-Isomer bei P wie jeweils durch 31P-NMR bestimmt) eines weißen Pulvers zu erhalten. Der obige Festtstoff wurde in 23 ml HCl suspendiert und anschließend 3 h lang refluxiert. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und 15 h lang gerührt. Der weiße Festtstoff wurde gefiltert, mit 4,5 ml kalter HCl gewaschen und unter Hochvakuum bei 45°C getrocknet, um eine pure Verbindung 10 zu erzielen, FP 93,9–104,7°C, HPLC-Reinheit 99,74% (3,11 g, 15,2% des Uridin-Nucleosids). Verbindung 10: 1H-NMR (CDCl3) δ 8,63 (brs, 1H, NH), 7,47 (d, 1H, C6-H), 7,30 (m, 2H, o-aromatisch), 7,26–7,18 (m, 3H, m,p-aromatisch), 6,18 (br d, IH, Cl'-H), 5,70 (d, IH, C5-H), 5,02 (sept, CH-(CH3)2), 4,53 (m, 2H, C-5'-H2), 4,11 (d, IH, C3'-H), 3,97 (m, 3H, C3'-OH, C4'-H, ala-CH-CH3), 3,77 (br s, IH, ala-NH), 1,39 (d, 3H, C2'-CH3), 1,37 (d, 3H, ala-CH3) 1,24 (d, 6H, CH-(CH3)2).
  • Beispiel 11: Vorbereitung von Verbindung 11 (aus US 2010/0081628 )
    Figure DE202012013382U1_0071
  • Synthese von 6-Ethoxy-9-((4aR,6R,7R,7aR)-7-fluoro-2-isopropoxy-7-methyl-2-oxo-tetrahydro-2,5-furo[3,2-d][1,3,2]dioxaphosphinin-6-yl)-9H-purin-2-yl-amine (Verbindung 11) (Verbindung 19, US 2010/0081628)
  • (2R,3R,4R,5R)-5-(2-Amino-6-ethoxy-purin-9-yl)-4-fluoro-2-hydroxymethyl-4-methyl-tetrahydro-furan-3-ol (150 mg, 0,46 mmol) wurde in wasserfreiem Pyridin (2 ml) bei 0°C aufgelöst. Eine Lösung von 0,45 M IH-Tetrazol in Essigsäurenitril (2,55 ml) wurde hinzugefügt und anschließend bis (N,N-diisopropylamino) Ispropylphosphoramidit (0,16 ml, 0,55 mmol, 1,2 eq) beigefügt. Ein langsames Erwärmen der Mischung auf Umgebungstemperatur über 3 h wurde zugelassen. TLC wies auf eine vollständige Reaktion hin. Die Reaktion wurde nach Zugabe von Wasser (0,1 ml) gequencht. Die Reaktionslösung wurde unter verringertem Druck konzentriert, und der Rückstand anschließend mit Ethylacetat (5 ml) pulverisiert. Das daraus entstehende weiße Präzipitat wurde durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde unter verringertem Druck konzentriert. Das daraus entstehende Zwischenprodukt in Form von zyklischem Phosphitrückstand wurde in Essigsäurenitril (2 ml) aufgelöst und dann bei Umgebungstemperatur mit t-butyl-Hydroperoxid (70% in Wasser, 0,19 ml) 5 h lang behandelt. TLC wies auf eine vollständige Reaktion hin. Die Reaktionslösung wurde unter verringertem Druck konzentriert und der Rückstand durch Säulenchromatographie gereinigt (Analogix unter Verwendung eines Anstiegs von 0 auf 5% IPA in HCL). Die beiden Diastereoisomere (Verbindung 11 und R-Isomer bei P) waren trennbar. Anteile, die jedes Diastereoisomer enthielten, wurden separat kombiniert und unter verringertem Druck zu weißen Fettstoffen konzentriert, um 20 mg von jedem Diastereomer zu erzielen (kombinierter Ertrag 20 mg).
  • Verbindung 11
    • 31P_NMR (162 MHz, DMSO): δ –6,49;
    • 1H-NMR (400 MHz, DMSO): δ = 8,17 (s, 1H), 6,47 (bs, 2H), 6,27 (d, J = 21,2 Hz, 1H), 4,73–4,62 (m, 4H), 4,45 (q, J = 7,0 Hz, 2H), 4,27–4,21 (m, 1H), 1,39–1.34 (m, 9H), 1,20 (d, J = 22,8 Hz, 3H). MS (ESI): m/z 432,4 [M+H]+
  • R-Isomer bei P
    • 31P_NMR (162 MHz, DMSO): δ = –4,68;
    • 1H-NMR (400 MHz, DMSO): δ = 8,15 (s, 1H), 6,63 (s, 2H), 6,27 (d, J = 21,2 Hz, 1H), 4,74–4,58 (m, 4H), 4,45 (q, J = 6,4 Hz, 2H), 4,42–4,37 (m, 1H), 1,36 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 1,32 (d, J = 3,6 Hz, 3H), 1,30 (d, J = 3,6 Hz, 3H), 1,22 (d, J = 22,8 Hz, 3H).
    • MS (ESI): m/z 432,4 [M+H]+
  • Die Strukturen für Verbindung 11 und das R-Isomer bei P werden nachfolgend dargestellt.
  • Figure DE202012013382U1_0072
  • Synthese von (2R,3R,4R,5R)-5-(2-amino-6-ethoxy-9H-purin-9-yl)-4-fluoro-2-(hydroxymethyl)-4-methyltetrahydro-furan-3-ol (Verbindung 16, US 2010/0081628)
  • Eine trockene 500 ml Rundflasche wurde mit (2R,3R,4R,5R)-5-(2-amino-6-chloro-9H-purin-9-yl)-2-(benzoyloxymethyl)-4-fluoro-4-methyltetrahydrofuran-3-yl Benzoesäureester (11 g, 20,92 mmol) befüllt. Wasserfreies absolutes Ethanol (210 ml) und anschließend wasserfreies K2CO3 (28,91 g, 209,2 mmol) wurden hinzugefügt. Die Suspension wurde gerührt und 5,5 h lang unter Stickstoff auf 75° erwärmt. Laut TLC-Test wurde das gesamte Anfangsmaterial zu diesem Zeitpunkt aufgenommen. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und die Feststoffe ausgefiltert. Das Filtrat wurde unter verringertem Druck durch Zugabe von Eisessig (2,52 g) auf pH-7 neutralisiert. Der Rückstand wurde in Methanol aufgelöst und mit Silikagel (15 g) vermischt. Die getrocknete Mischung von Rohprodukt und Silikagel wurde in eine leere Kartusche umgefüllt und mithilfe von Säulenchromatographie getrennt (Analogix 220 g, unter Verwendung eines Anstiegs von 0 auf 5% MeOH in DCM) um ein Produkt (5% MeOH in DCM) als weißen, schaumförmigen Festtstoff (3,73 g, 54,5%) hervorzubringen. Ein zweiter weißer Festtstoff wurde aus der Säule isoliert (10% MeOH in DCM, 1,44 g) und besteht aus einer Mischung von zwei Nucleosid-Dimeren. Ein polarerer dritter weißer Festtstoff wurde aus der Säule entnommen (15% MeOH in DCM, 0,47 g) und besteht aus einer Mischung von Nucleosid-Trimeren. Die HPLC-Reinheit des Produkts beträgt 99,94%.
    1H-NMR (DMSO-d6): δ 8,16 (s, IH, 8-H), 6,55 (s, 2H, NH2), 6,04 (d, IH, C1'-H), 5,66 (d, IH, 3'-OH), 5,24 (m, IH, 5'-OH), 4,44 (q, 2H, 6-OCH2), 4,23–4,08 (m, IH, C3'-H), 3,91–3,82 (m, 2H, C4'-H und C5'-Ha,), 3,71–3,66 (m, IH, C5'-Hb), 1,36 (t, 3H, CH3 von Ethyl), 1,06 (d, 3H, C2'-CH3).
  • Synthese von (2R,3R,4R,5R)-5-(2-amino-6-chloro-9H-purin-9-yl)-2-(benzoyloxymethyl)-4-fluoro-4-methyltetrahydrofuran-3-yl Benzoesäureester (Verbindung 12 US 2010/0081628)
  • Eine 12 l-dreihalsige Rundflasche wurde mit 6-chloro-2-aminopurine (225,4 g, 1,329 Mol) befüllt. Wasserfreies tert-BuOH (4,5 l) wurde hinzugefügt und die Lösung wurde bei Umgebungstemperatur mit einem mechanischen Rührgerät gerührt. Kalium tert-Butoxid (fest, 151,6 g, 1,35 Mol) wurde portionsweise unter Rühren und Zufuhr von Stickstoffgas hinzugefügt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur weitere 30 Min. lang gerührt. Eine 5 l-Rundflasche wurde mit dem a-Bromid (10,197 g, 0,451 Mol und 3 l wasserfreiem Acetonitril bei Umgebungstemperatur befüllt. Die Bromidlösung wurde bei Umgebungstemperatur über 1 Min. zur Purin-Basissuspension hinzugefügt. Die 5 l-Flasche wurde mit Acetonitril (2 × 1 l) gespült, um das Bromid vollständig in die Reaktionsmischung zu überführen. Die Mischung wurde während der Dauer von 2 h mithilfe eines Heizmantels und einer Steuerung schrittweise auf 50°C erwärmt und 20 h lang gerührt. Die Reaktion war laut TLC Beta (Rf 0,28, 30% Ethylacetat in Hexan) beinahe vollständig abgeschlossen. Die Reaktion wurde durch Zugabe von gesättigtem NH4Cl (200 ml) gequencht, um eine Lösung zu bilden. Die Schwebstoffe wurden durch Filtration durch ein 3 cm-Celite-Kissen in einem 2,5 l-Porzellan-Büchnertrichter entfernt. Der Festtstoff wurde mit Toluol (3 × 100 ml) gewaschen. Das kombinierte Filtrat wurde durch Zugabe von einer 6 N HCl-Lösung bis auf PH 7 neutralisiert (etwa 220 ml). Die Mischung wurde unter reduziertem Druck konzentriert. Nachdem das Volumen der Mischung auf etwa ein Drittel reduziert war, wurden zusätzlich abgeschiedene Feststoffe auf ähnliche Weise durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde weiter auf ein Volumen von etwa 800 ml konzentriert. Der Rückstand wurde in eine Stecksäule (1,6 kg hochwertiges Silikagel in einem 6 l-Büchnertrichter aus Sinterglas) gefüllt und (mittels Absaugen) mit einem Gradient von 10 Ethylacetat in Hexanen (6 l) eluiert, um nichtpolare Verunreinigungen zu entfernen, 30% Ethylacetat in Hexanen, um eine geringe Menge Lactol (6 l) zu erzielen, und dann 10%–45% Ethylacetat in Hexanen (4 l), um den Hauptanteil des Produkts zu eluieren. Die das Produkt enthaltenden Anteile wurden kombiniert, unter reduziertem Druck konzentriert und unter Vakuum (0,2 mmHG, 24 h, Umgebungstemperatur) zu einem weißen, schaumförmigen Festtstoff (150,7 g, β/α = 14,1 durch NMR) getrocknet. 1H-NMR. (CDCl3) beta: δ = 1,33 (d, 22,4 Hz, 2'-C-CH3), alpha: 1,55 (d, 22 Hz, 2'-C-CH3). Der Schaum der Produktmischung wurde bei Umgebungstemperatur in Methanol (700 ml) aufgelöst. Während des Stehens entstand im Laufe von 2 h langsam ein Festtstoff. Die Suspension wurde 17 h lang bei –5°C in einem Kühler gekühlt. Der dadurch entstehende weiße Festtstoff wurde durch Filtration gesammelt und mit kaltem MeOH (–5°C, 3 × 60 ml) und Ethylether (3 × 100 ml) gewaschen. Der Festtstoff wurde unter Vakuum (0,2 mmHG, 24 h, Umgebungstemperatur) getrocknet, um 110,5 g des β-Produkts mit hervorragendem de (β/α 99,8:1 durch HPLC) zu erzielen. Das Filtrat wurde teilweise konzentriert (ca. 400 ml) und anschließend bei gleichzeitiger Erwärmung auf 60°C mit weiterem MeOH (400 ml) verdünnt. Die Lösung wurde auf Umgebungstemperatur abgekühlt, ausgesät und auf –5°C gekühlt. Die zweite Ernte wurde auf ähnliche Weise gesammelt, gewaschen und getrocknet, um mehr Produkt als weißen Festtstoff (12,26 g) mit ähnlicher diastereomerer Reinheit zu erzielen. Die Mutterflüssigkeit wurde unter reduziertem Druck bis zur Trockenheit konzentriert (ca. 25 g). Der Rückstand bestand aus einer Mischung von β- und α-Isomeren.
  • Er wurde einer automatischen Säulenchromatographie mit Silikagel unterzogen (Analogix, 240 g-Kartusche, 40% bis 50% Ethylacetat in Hexanen), um 14,52 g des Produktschaums zu erzielen, der auf ähnliche Weise aus MeOH rekristallisiert, gewaschen und getrocknet wurde, um zusätzliche 8,46 g des Produkts in hoher Qualität zu erzielen.
  • Die drei Feststoffe wurden als von ähnlicher Reinheit bewertet und miteinander kombiniert, um 131,2 g weißes kristallines Produkt (55% aus Bromzucker, 49% aus Lactol) zu erzielen. FP 160,5–162,0°C, HPLC-Reinheit 99,5% inklusive 0,20% Alpha.
    1H-NMR (pure 3-Anomer, CDCl3): δ = 8,03 (m, 2H, arom.), 7,93 (m, 2H, arom.), 7,88 (s, 1H, C8-H), 7,60 (m, 1H, arom.), 7,50 (m, 1H, arom.), 7,44 (m, 2H, arom.), 7,33 (m, 2H, arom.), 6,44 (dd, 1H, Cli'-H), 6,12 (d, 1H, C3'-H), 5,35 (s, 2H, NH2), 5,00 (dd, 1H, C5'-Ha), 4,76 (m, 1H, C4'-H), 4,59 (dd, 1H, C5'-Hb), 1,33 (d, 3H, CH3).
  • Beispiel 12: Vorbereitung von Verbindung 12 (aus US20110015146 )
    Figure DE202012013382U1_0073
  • Synthese von (2S)-isopropyl2-((((2R,3R,4R,5R)-5(2-amino-6-methoxy-9H-purin-9-yl)-4-fluoro-3hydroxy-4-methyltetrahydrofuran-2-yl)methoxy)(phenoxy)phosphorylamino)propanoate
  • Eine trockene 250 ml-Rundhalsflasche wurde mit Phenyldichlorphosphat (2,66 g, 12,61 mmol) und wasserfreiem Dichlormethan (40 ml) befüllt. Das Aminoestersalz (2,60 g, 15,53 mmol) wurde zur Lösung hinzugefügt und die Mischung wurde auf –5°C gekühlt. Anschließend wurde über eine trockene Spritze bei –5°C rasch N-Methylimidazol (7,7 ml, 97 mmol) hinzugefügt. Das Nucleosid ((2R,3R,4R,5R)-5-(2-amino-6-methoxy-9H-purin-9-yl)-4-fluoro-2-(hydroxymethyl)-4-methyltetrahydrofuran-3-ol), 3,04 g, 9,7 mmol) wurde aus einer Phiole bei –5°C auf einmal zugegeben und der Festtstoff wurde innerhalb von 20 Minuten langsam aufgelöst. Im Zeitraum von 2 h wurde ein Anstieg der Reaktionstemperatur auf Umgebungstemperatur zugelassen. Nach 17 h war die Reaktion nicht abgeschlossen. Weitere Reagenzien wurden (aus Phosphat (2,66 g), Aminoester (2,60 g) und N-Methylimidazol (3,8 ml, 48 mmol)) hergestellt und bei –5°C zur Reaktionsmischung hinzugefügt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur weitere 2 h lang gerührt. Die Reaktion war laut TLC-Ergebnis beinahe abgeschlossen und wurde mit 70 ml Dichlormethan verdünnt. HCl-Lösung (1 N, 70 ml) wurde hinzugefügt. Die wasserhaltige Schicht wurde abgetrennt und mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Schicht wurde mit gesättigtem NaHCO3, Wasser und Sole gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Nach der Entfernung des Lösungsmittels unter verringertem Druck wurde der klebende Rückstand mithilfe von automatisierter Säulenchromatographie unter Verwendung einer 240 g-Kartusche und einem Anstieg von 0–8% 2-PrOH gereinigt, um das Produkt als schaumförmigen Festtstoff zu erzielen (4,16 g, 7,14 mmol, 73% Ertrag). HPLC-Reinheit 97,4%. Ein NMR-Spektrum des Produkts zeigte, dass es aus einer Mischung von zwei Diastereoisomeren mit einem Verhältnis von 1,2:1 besteht.
    1H-NMR (DMSO-d6): δ = 7,98 (1H, s, 8-H des einen Isomers), 7,95 (1H, s, 8-H eines anderen Isomers), 7,37–7,32 (2H, m, arom-H), 7,22–7,15 (3H, m, arom-H), 6,6 (2H, s, NH2), 6,11 (1H, d, Cl'-H des einen Isomers), 6,09 (1H, d, Cl'-H eines anderen Isomers), 6,09–5,98 (1H, m, amide NH), 5,88 (1H, d, 3'-OH des einen Isomers), 5,81 (1H, d, 3'-H eines anderen Isomers), 4,85–4,75 (1H, hepta, Methin H von Isopropyl), 4,46–4,27 (2H, m, C4'-H, a-H von Aminoester), 4,15–4,07 (1H, m, C3'-H), 3,96 (3H, s, OCH3), 3,82–3,72 (2H, m, C5'-Ha und C5'Hb), 1,23–1,06 (9H, m, CH3's von Aminoester), 1,03 (3H, d, C2'-CH3).
    31P-NMR (DMSO-d6): 0 = 4,91 (ein Isomer), 4,72 (anderes Isomer).
  • Eine alternative Reinigungsmethode besteht in der chemischen Veränderung des kleinen 3'-Phosphoramidat-Nebenprodukts, um die chronomatographische Trennung zu vereinfachen. Das rohe Phosphoramidate-Produkt wird in wasserfreiem Pyridin (5 ml/g) aufgelöst und bei Umgebungstemperatur mit 0,5 Molekularäquivalenten von t-Butyldimethylsilylchlorid behandelt, um ausgewählt mit dem freien 5' Primärhydroxyl der 3' Isomer-Verunreinigung zu reagieren. Der Reaktionsfortschritt kann über LC/MS überwacht werden. Sobald das 3'-Isomer in ein 5'-tBDMS-3'-Phosphoramidat-Dermatitis umgewandelt wurde, wird die Reaktion mit Methanol (3 eq) gequencht, unter verringertem Druck konzentriert, zwischen Ethylacetat und 5% Zitronensäure aufgeteilt, und die organische Schicht anschließend konzentriert. Der Rückstand wird anschließend einer Chronomatographie unterzogen, die dann mit einer höheren Ladung und einem schnelleren Anstieg durchgeführt werden kann und eine höhere Reinheit erreicht.
  • Beispiel 13: Vorbereitung von Verbindung 13 (aus US20110015146 )
    Figure DE202012013382U1_0074
  • Beispiel 14: Vorbereitung von Verbindung 14 (aus US 7.964.580 , Beispiel 5)
    Figure DE202012013382U1_0075
  • Vorbereitung von 2'-Deoxy-2'-fluoro-2'-C-Methyluridin-5'-phenyl methoxy-Aanylphenylphosphat)
  • In 3 ml THF aufgelöstes Phenol Methylenchlorid Phosphoramidat (1 g, 6,5 eq) wurde zu einer Mischung aus 2'-Deoxy-2'-fluoro-2'-C-Methyluridin (0,15 g, 1 eq) und N-Methylimidazol (0,3 g, 8 eq) in 3 ml THF hinzugefügt und bei Raumtemperatur kräftig gerührt; anschließend wurde die Reaktion über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde durch verringerten Druck entfernt. Das daraus entstehende Rohprodukt wurde in Methanol aufgelöst, das durch präp-HPCL auf einer YMC 25 × 30 × 2 mm-Säule mithilfe einer mobilen Wasser-Acetonitril-Phase mit stufenweiser Eluierung gereinigt wurde. Acetonitril und Wasser wurden unter verringertem Druck entfernt, um das gewünschte Produkt (50,1 mg, 15,6%) zu erzielen. 1H NMR (DMSO-d6) δ 1,20–1,27 (m, 6H), 3,58 (d, J = 16.0 Hz, 3H), 3,75–3,92 (m, 2H), 4,015–4,379 (m, 2H), 5,54 (t, J = 10,2 Hz, 1H), 5.83–5,91 (m, 1H), 6,00–616 (m, 1H), 7,18 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,22 (s, 1H), 7,35 (t, J = 4,4 Hz, 2H), 7,55 (s, 1H), 11,52 (s, 1H); MS, m/e 502 (M+1)+.
  • Beispiel 15: Vorbereitung von Verbindung 15 (Beispiel 55 aus US 7.964.580 )
    Figure DE202012013382U1_0076
    • 1H NMR (DMSO-d6) δ > 1,20–1,44 (m, 12H), 1,60–1,71 (m, 4H), 3,75–4,02 (m, 2H), 3,94–4,02 (m, 1H), 4,19–4,26 (m, 2H), 4,59–4,61 (m, 1H), 5,57 (t, J = 8,4 Hz, 1H), 5,85–6,06 (m, 3H), 7,17–7,23 (m, 4H), 7,54 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 11,50 (s, 1H); MS, m/e 587,92 (M+1)+
  • Figure DE202012013382U1_0077
  • Eine allgemeine Prozedur für Nucleosid-Phosphoramidat-Derivative wird in Spalte 461 von US 7.964.580 berichtet. Eine Lösung des entsprechenden Phosphorochloridats (6,5 Äquivalente) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (THF) kann zu einer Mischung von Nucleosid (1 Äquivalent) und N-Methylimidazol (8 Äquivalente) in wasserfreiem THF mit kräftigem Rühren bei Raumtemperatur hinzugefügt werden, wobei die Reaktionsflüssigkeit über Nacht gerührt wird. Das Lösungsmittel kann im Vakuum entfernt werden und das Rohprodukt mithilfe von Säulenchromatographie und/oder präparativer Dünnschichtchronomatographie gereinigt werden, um die gewünschte Verbindung zu erzielen.
  • Beispiel 16: Vorbereitung von Verbindung 16 (aus US 7.429.572 )
    Figure DE202012013382U1_0078
  • Synthese von (2'R)-2'-Deoxy-2'-Fluoro-2'-C-Methylzytidin ausgehend von Zytidin
    • 1. Schritt: Einer Suspension von Zytidin (100 g, 0,411 Mol) in DMF (2,06 l) wird Benzoeanhydrid (102,4 g, 0,452 Mol) beigefügt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 20 h lang gerührt. Das DMF wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde mit Diethylether pulverisiert. Der dadurch entstehende Festtstoff wurde durch Absaugen aufgenommen und mit Diethylether (2 × 200 ml) gewaschen. Durch weiteres Trocknen im Vakuum bei Raumtemperatur entstand das N4-Benzamid (140,6 g, 98,3%). Ein Teil dieses Materials (139,3 g, 0,401 Mol) wurde in wasserfreiem Pyridin (1,2 l) aufgelöst und mit Dichlor-1,1,3,3-Tetraisopropyl-Disiloxan (141,4 ml, 0,441 Mol) bei Raumtemperatur behandelt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Mischung wurde bis zur beinahe vollständigen Trockenheit im Vakuum gerührt und gemeinsam mit Toluol (3 × 200 ml) verdampft. Der Rückstand wurde mit Ethylacetat (1,8 l) behandelt und mit HCl (2 × 200 ml, 0,05 N), NaHCO3 (5%, 2 × 400 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde gewaschen, getrocknet (Na2SO4), gefiltert und bis zur Trockenheit verdampft. Verbindung 16-1 (Verbindung 4-1 aus US 7.429.572 ) (256,5 g > 100%) wurde als weißer Schaum isoliert und ohne weitere Reinigung verwendet.
    • 2. Schritt: Verbindung 16-1 (236,5 g, 0,40 Mol) wurde in trockenem THF (1,22 l) aufgelöst. Wasserfreies DMSO (180,8 ml, 2,1 Mol) wurde hinzugefügt und die entstehende Lösung wurde zwischen –20°C und –15°C gekühlt. Trifluoressigsäureanhydrid (90,6 ml, 0,64 Mol) wurde im Verlauf von 45 Minuten tropfenweise hinzugefügt, und die Lösung wurde zwischen –20°C und –15°C 2 Stunden lang gerührt, worauf im Laufe von 20 min wasserfreies Triethylamin (223,5 ml, 1,6 Mol) hinzugefügt wurde. Die Keton 16-2 enthaltende Rohreaktion wurde in Ethylacetat (500 ml) aufgelöst, und die daraus entstehende Lösung wurde mit H2O (3 × 400 ml) gewaschen, getrocknet (Na2SO4), und die Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt, um einen gelben Festtstoff zu erzielen, der auf einer Silikagel-Säulenelution mit einem stufenweisen Anstieg von Et2O (0–60%) in Hexanen, gefolgt von einem stufenweisen Anstieg von Ethylacetat (50–100%) in Hexanen gereinigt wurde. Das so erhaltene Rohketon (~192 g) wurde aus Petrolether kristallisiert, um Keton 16-2 (Verbindung 4-2 aus US 7.429.572 ) (138,91 g, 57,5% aus Zytidin) als weißen Feststoff und 22 g nicht reagiertes Ausgangsmaterial 16-1 als gelben Feststoff zu erzielen.
    • 3. Schritt: Verbindung 16-2 (48,57 g, 8,26 mmol) wurde in wasserfreiem Toluol (~400 ml) aufgelöst, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum mit Ausnahme von Feuchtigkeit entfernt. Der Rückstand wurde anschließend im Vakuum (Ölpumpe) nochmals zwei Stunden lang weiter getrocknet. Mit strikter Ausnahme von Feuchtigkeit wurde der schaumförmige Rückstand in wasserfreiem Diethylether (1,03 l) unter Argon aufgelöst. Die daraus entstehende Lösung wurde unter Argon auf –78°C gekühlt, und MeLi (1,6 M, 258,0 ml, 0,413 Mol) wurde tropfenweise über einen zusätzlichen Trichter hinzugefügt. Nach vollständiger Reaktion wurde die Mischung 2 h lang bei –78°C gerührt. 1 M wasserhaltiges NH4Cl (500 ml) wurde langsam hinzugefügt. Nach Erwärmung auf Raumtemperatur wurde die Mischung mit H2O (2 × 500 ml) gewaschen, getrocknet (Na2SO4), und dann bis zur Trockenheit konzentriert, um einen braunen Schaum zu erzielen (~60 g, > 100%). Die Reaktion wurde unter Verwendung von 37,62 g und 56,4 g von Verbindung 16-2 zwei weitere Male durchgeführt. Die kombinierten Rohprodukte (128,0 g, 0,212 Mol) wurden in THF (1,28 l) aufgelöst und mit konzentriertem HOAc (23 ml, 0,402 Mol) behandelt. Zur Lösung wurde TRAF (384,0 ml, 1 m in THF) hinzugefügt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 0,75 h gerührt, und die Mischung wurde mit Silikagel (750 g) behandelt und bis zur Trockenheit konzentriert. Das Pulver wurde auf eine in CH2CL2 gepackte Silikagelsäule platziert. Eluierung mit 1:7 EtOH-CH2CL2 erzielte eine dunkle, wachsartige Lösung, die auf Silikagel (300 g) vorabsorbiert und wie zuvor chronomatografiert wurde. Verbindung 16-3 (Verbindung 4-3 aus US 7.429.572 ) (46,4 g, 53,0% aus 16-2) wurde als grauweißer Feststoff isoliert. 1H NMR (DMSO-d6): δ 1,20 (s, 3H, CH3), 3,62–3,69 (m, 2H,), 3,73–3,78 (m, 2H,), 5,19 (t, 1H, J = 5,4 Hz, OH-5'), 5,25 (s, 1H, OH-2'), 5,52 (d, 1H, J = 5,0 Hz, OH-3'), 5,99 (s, 1H, H-1'), 7,32 (d, 1H, J = 5,8 Hz), 7,05 (Ψt, 2H, J = 7,7 Hz), 7,62 (Ψt, 1H, J = 7,3 Hz), 8,00 (d, 2H, J = 7,3 Hz), 8,14 (d, 1H, J = 6,9 Hz), 11,22 (s, 1H, NH). Anal. Berechn. für C17H19N3O6·0,5H2O: C, 55,13; H, 5,44; N, 11,35. Gefunden: C, 55,21; H, 5,47; N, 11,33.
    • 4. Schritt: Verbindung 16-3 (46,0 g, 0,13 Mol) wurde in wasserfreiem Pyridin aufgelöst und bis zur Trockenheit im Vakuum konzentriert. Der dadurch entstehende Sirup wurde in wasserfreiem Pyridin unter Argon aufgelöst und unter Rühren auf 0°C abgekühlt. Die braune Lösung wurde mit Benzoylchlorid (30 ml, 0,250 Mol) im Verlauf von 10 min tropfenweise behandelt. Das Eisbad wurde entfernt und das Rühren wurde für weiter 1,5 h fortgesetzt, wobei TLC kein verbliebenes Ausgangsmaterial zeigte. Die Mischung wurde durch Zugabe von Wasser (5 ml) gequencht und bis zur Trockenheit konzentriert. Der Rückstand wurde in einer minimalen Menge CH2CL2 aufgelöst und mit gesättigtem NaHCO3 (1 × 500 ml) und H2O (1 × 500 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (Na2SO4) und gefiltert, bis zur Trockenheit gefiltert und auf mit einer schrittweisen Zunahme von Ethylacetat-Hexanen (25%–60%) eluierendem Silikagel getrocknet, um Verbindung 16-4 als gelben Schaum zu erzielen (Verbindung 4-4 aus US 7.429.572 ) (48,5 g, 67%). 1H NMR (CDCl3): δ 1,64 (s, 3H, CH3), 4,50 (m, 1H, H-4), 4,78–4,85 (m, 2H, H-5', 5a'), 5,50 (d, IH, J = 3,4 Hz, H-3'), 6,42 (s, IH, H-1), 7,44–7,54 (m, 7H, Ar), 7,57–7,66 (m, 3H, Ar), 7,94 (d, 2H, J = 7,8 Hz), 8,05–8,09 (m, 4H, Ar), 8,21 (d, 1H, J = 7,3 Hz). Anal. Berechn. für C31H27N3O8: C, 65,37; 4,78; N, 7,38. Gefunden: C, 65,59; H, 4,79; N, 7,16.
    • 5. Schritt: Verbindung 16-4 (7,50 g, 0,013 Mol) wurde in wasserfreiem Toluol (150 ml) unter Argon aufgelöst und auf –20°C abgekühlt. DAST (2,5 ml, 18,9 mmol) wurde langsam hinzugefügt, und das Kühlbad wurde nach Abschluss der Zugabe entfernt. Das Rühren wurde 1 h lang fortgesetzt, und die Mischung wurde in gesättigtes NaHCO3 (100 ml) und gewaschen, bis die Gasentwicklung stoppte. Die organische Phase wurde getrocknet (NA2SO4), konzentriert und mithilfe von 1:1 Ethylacetat-Hexane eluierender Silikagel-Chronomatographie gereinigt. Der Ertrag war 1,22 g (16,3%) pures 16,5 (Verbindung 4-5 aus US 7.429.572 als weißer Feststoff, FP 241°C. (CH2Cl2-Hexane); 1H NMR (CDCl3): δ 1,49 (d, 3H, J = 22,4 Hz, CH3), 4,64 (dd, 1H, J = 3,44, 12,9 Hz, H-5'), 4,73 (d, 1H, J = 9,5 Hz, H-4'), 4,90 (dd, 1H, J = 2,4, 12,7 Hz, H-5a'), 5,56 (dd, 1H, J = 8,6, 20,7 Hz, H-3'), 6,52 (d, 1H, J = 18,0 Hz, H-1'), 7,47–7,57 (m, 7H, Ar), 7,62–7,71 (m, 3H, Ar), 7,89 (d, 2H, J = 6,9 Hz), 8,07–8,11 (m, 5H, Ar), 8,67 (bs, 1H, NH). 19F NMR (CDCl3): δ 3,3(m). Anal. Berechn. für C31H26FN3O7·O·7H2O: C, 63,74; H, 4,72; N, 7,20. Gefunden: C, 63,71; H, 4,54; N, 7,20.
    • 6. Schritt: Verbindung 16-5 (6,30 g, 0,011 Mol) wurde in methanolischem Ammoniak (ca. 7 N, 150 ml) suspendiert und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, zusammen mit Methanol (1 × 20 ml) verdampft und auf Silikagel vorabsorbiert. Das weiße Pulver wurde auf eine Silikagel-Säule (in CHCl3 gepackt), und die Säule wurde mit 9 EtOH in CHCl3, anschließend mit 17% EtOH und schließlich mit 25% EtOH in CHCl3 eluiert. Konzentration der Anteile mit dem Produkt, Filtration durch eine 0,4 l am- Scheibe und Getriertrocknung aus Wasser erzielte Verbindung 16-6 (Verbindung 4-6 aus US 7.429.572 ), 2,18 g (76%). 1H NMR (DMSO-d6): δ 1,17 (d, 3H, J = 22,3 Hz, CH3), 3,63 (dd, 1H, J = 2,7, 13,7 Hz, H-5'), 3,70–3,84 (m, 3H, H-3', H-4', H-5a'), 5,24 (Anw s, 1H, OH-3'), 5.60 (d, 1H, J = 5,4 Hz, H-5'), 5,74 (d, 1H, J = 7,71 Hz, H-5), 6,07 (d, 1H, J = 18,9 Hz, H-1'), 7,31 (s, 1H, NH2), 7,42 (s, 1H, NH2), 7,90 (d, 1H, J = 7,3 Hz, H-6). 19F NMR (DMSO-d6): δ 2,60 (m). Anal. Berechn. C10H14FN3O4·4·1· 4H2O: C, 44,22; H, 5,95; N, 14,77. Gefunden: C, 42,24; H, 5,63; N, 14,54. Verbindung 16-6 (0,10 g, 0,386 mmol) wurde durch Auflösen in Wasser (2 ml) und Anpassen des pH auf etwa 5,0 mit 1 M HCl in das Hydrochloridsalz umgewandelt. Das Wasser wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde aus wasserhaltigem EtOH kristallisiert, um 16-6 als Hydrochloridsalz (71,0 mg), FP 243°C zu erzielen; 1H NMR (DMSO-d6): δ 1,29 (d, 3H, J = 22,6 Hz, CH3), 3,65 (dd, 1H, J = 2,3, 12,7 Hz, H-5'), 3,76–3,90 (m, 3H, H-3', H-4', H-5a'), 5,96 (d, 1H, J = 17,3 Hz, H-1'), 6,15 (d, 1H, J = 7,9 Hz, H-5), 8,33 (d, 1H, J = 7,9 Hz, H-6), 8,69 (s, 1,5H, NH), 9,78 (s, 1,5H, NH). 19F NMR (DMSO-d4): δ 1,69 (m). Anal. Berechn. für C10H14FN3O4. HCl: C, 40,62; H, 5,11; N, 14,21. Gefunden: C, 40,80; H, 5,09; N, 14,23.
  • BIOLOGISCHE BEISPIELE
  • Assayprotokoll
  • Replikonassay mit hohem Durchsatz (HTBS)
  • Replikonzellen mit H77 (Genotyp 1a) oder Con1 (Genotyp 1b) HCV RNA und Renilla-Luciferase-Reporter wurden in schwarze 384-Well-Platten mit einer Dichte von 1,6 × 103 Zellen pro Well in 90 μL DMEM-Kulturmedium angesiedelt, ausschließlich G-418. Die Verbindungen wurden in 100% DMSO seriell verdünnt und Zellen mit einer Verdünnung von 1:225 zugegeben, wodurch eine Endkonzentration von 0,44% DMSO in einem Gesamtvolumen von 90 μL mit einer Biotek μFlow Workstation erreicht wurde. Die Zellplatten wurden bei 37°C mit 5% CO2 3 Tage lang inkubiert, wonach die Kulturmedien entfernt und die Zellen auf Luciferaseaktivität als Marker für das Replikationslevel getestet wurden. Die Luciferaseexpression wurde unter Verwendung von Dual-Glo-Luciferaseassayreagenzien (Promega, Madison, WI) gemessen. Kurz wurden 20 μL Dual-Glo-Luciferase-Puffer zum Lysieren der Zellen für 10 min zugegeben und danach 20 μL eines verdünnten Dual-Glo-Stop & Glo-Substrats (1:100) jedem Well zugegeben. Das Lumineszenzsignal wurde auf einem Perkin Elmer Envision-Plattenlesegerät nach 10 min Inkubation gemessen. Die Luciferaselevel wurden in Prozentanteile in Bezug auf die unbehandelten Kontrollen (die als 100% definiert wurden) gemessen und die Daten auf die logistische Dosis-Antwort-Gleichung y = a/(1 + (x/b)c) unter Verwendung der XLFit4-Software (IDBS, Emeryville, CA) angepasst. Die EC50-Werte wurden aus den resultierenden Gleichungen berechnet. Alternativ kann die Antivirusaktivität durch die HCV-NS3-Protease-IC50-Bestimmung analysiert werden. Die HCV NS3-Proteaseaktivität wurde unter Verwendung eines Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer-Depsipeptidsubstrats (FREI-RET S1, Anaspec, San Jose, CA) basierend auf einem Verfahren von Taliani, Taliani M, Bianchi E, Narjes F, Fossatelli M, Urbani A, Steinkuhler C, et al. A continuous assay of hepatitis C virus protease based on resonance energy transfer depsipeptide substrates. Anal. Biochem. 1996; 240 (1): 60–7, überwacht, das hierin durch Verweis darauf im Hinblick auf die Durchführung eines solchen Assays aufgenommen wird.
  • Kurz wurden 2–10 nM gereinigte NS3-Proteasedomänen bei 37°C 10 Minuten lang mit 20 μM isogenen NS4A Peptid-Cofaktoren (Sigma, St. Louis, MO) in 40% Glycerolpuffer mit 50 mM HEPES, pH-Wert 7,5 und 10 mM DTT vorinkubiert. Die Verbindungen wurden 1:3 in DMSO seriell verdünnt, mit der Enzym-/Cofaktormischung 10 Minuten lang inkubiert und die Reaktionen durch Zugabe von 2 μM RET S1-Substrat (Endkonzentration) gestartet. Die Fluoreszenzzunahme wurde kontinuierlich über eine Stunde unter Verwendung eines Victor3 V-Fluoreszenz-Plattenlesegeräts (Perkin Elmer, Waltham, MA) gemessen. Die anfänglichen Geschwindigkeiten wurden für jede Hemmerkonzentration unter Verwendung der Workout 1.5-Software (DAZDAQ, East Sussex, UK) mit maximalem Neigungsalgorithmus berechnet. Die Geschwindigkeitsdaten wurden in Prozentsätze in Bezug auf die unbehandelte Kontrolle (die als 100% definiert wurde) umgewandelt und die nicht lineare Regression zum Berechnen der 50%-igen Hemmkonzentrationen (IC50-Werte) durchgeführt. NS3-Enzympotenz: Gereinigte NS3 Protease wurde mit NS4A Peptid komplexiert und dann mit seriellen Verdünnungen der Verbindungen inkubiert (DMSO wurde als Lösemittel verwendet). Die Reaktionen wurden durch Zugabe von doppelt markiertem Peptidsubstrat gestartet und die resultierende Kinesezunahme der Fluoreszenz gemessen. Die nicht lineare Regression der Geschwindigkeitsdaten wurde zum Berechnen der IC50 durchgeführt. Die Aktivität wurde anfangs auf Genotyp 1b-Protease getestet. Je nach Potenz gegen Genotyp 1b können zusätzliche Genotypen (1a, 2a, 3) und/oder proteasehemmerresistente Enzyme (D168V, D168V, oder A156T-Mutanten) getestet werden. BILN-2061 wird bei allen Assays als Kontrolle verwendet. Die Verbindungen der Beispiele wurden in diesem Assay bewertet und es wurde gefunden, dass die IC50-Werte unterhalb etwa 1 μM lagen. Replikonpotenz und -zytotoxizität: Huh-luc-Zellen (stabile Replikation von Bartenschlager I389lucubi-neo/NS3-3'/ET-Genotyp 1b Replikon) wurden 72 Stunden lang mit seriellen Verdünnungen der Verbindung (DMSO wird als Lösemittel verwendet) behandelt. Die Replikonexemplarzahl wird per Biolumineszenz gemessen und die nicht lineare Regression zum Berechnen der EC50 durchgeführt. Parallel mit den gleichen Arzneimittelverdünnungen behandelte Platten werden unter Verwendung des Promega CellTiter-Glo-Zellviabilitätsassays auf Zytotoxizität getestet. Je nach der gegen das 1b Replikon erreichten Potenz können die Verbindungen gegen ein Genotyp 1a Replikon und/oder hemmerresistente Replikone, die D168Y- oder A156T-Mutationen codieren, gestestet werden. BILN-2061 wird bei allen Assays als Kontrolle verwendet. Die Verbindungen der Beispiele wurden in diesem Assay bewertet und es wurde gefunden, dass die EC50-Werte unter 5 μM lagen.
  • Auswirkung von Serumproteinen auf die Replikonpotenz
  • Die Replikonassays wurden in einem normalen Zellkulturmedium (DMEM + 10%FBS) durchgeführt, das mit physiologischen Konzentrationen humanen Serumalbumins (40 mg/mL) oder einem A-Säure-Glycoprotein (1 mg/mL) ergänzt wurde. Die EC50 in Gegenwart von humanen Serumproteinen werden mit der EC50 in normalem Medium zum Bestimmen des Vielfachen des Wechsels der Potenz verglichen. Enzymatische Selektivität: Die Hemmung von Säugerproteasen wie Schweinepankreaselastase, humane Leukozytenelastase, Protease 3 und Cathepsion D wurden bei Km auf die zugehörigen Substrate für jedes Enzym gemessen. Die IC50 für jedes Enzym wird mit der IC50 verglichen, die über die NS3 1b-Protease zum Berechnen der Selektivität erhalten wurde. MT-4-Zellzytoxizität: Die MT4-Zellen wurden mit seriellen Verdünnungen der Verbindungen für einen Zeitraum von 5 Tagen behandelt. Die Zellviabilität wird am Ende des Behandlungszeitraums unter Verwendung des Promega CellTiter-Glo-Assays gemessen und die nicht lineare Regression zum Berechnen der CC50 durchgeführt. Verbindungskonzentration in Verbindung mit Zellen bei ECsn: Huh-luc-Kulturen werden mit der Verbindung bei Konzentration gleich EC50 inkubiert. Zu mehreren Zeitpunkten (0 bis 72 Stunden) werden die Zellen 2× mit kaltem Medium gewaschen und mit 85% Acetornitril entnommen; eine Probe der Medien wird zu jedem Zeitpunkt ebenfalls entnommen. Die Zellen- und Medienextrakte werden per LC/MS/MS zum Bestimmen der molaren Konzentration der Verbindungen in jeder Fraktion analysiert. Löslichkeit und Stabilität: Die Löslichkeit wird durch Nehmen eines Aliquots von 10 mM-DMSO-Bestandslösung bestimmt und die Verbindung bei einer Endkonzentration von 100 μM in den Testmedienlösungen (PBS, pH-Wert 7,4 und 0,1 N HCl, pH-Wert 1,5) bei einer Gesamt-DMSO-Konzentration von 1% hergestellt. Die Testmedien-Lösungen wurden bei Raumtemperatur bei 1-stündigem Schütteln inkubiert. Die Lösungen wurden dann zentrifugiert und die wiedergewonnenen Überstände auf HPLC/UV getestet. Die Löslichkeit kann durch Vergleichen der Menge der Verbindung, die in der definierten Testlösung im Vergleich zu der Menge, die in DMSO der gleichen Konzentration nachgewiesen wurde, berechnet werden. Die Stabilität der Verbindungen nach einer Stunde Inkubation im Testmedium bei 37°C wird ebenfalls bestimmt. Stabilität in kyrokonservierten Menschen-, Hund- und Ratten-Hepatozyten: Jede Verbindung wird für bis zu einer Stunde in Hepatozytsuspensionen (100 pi, 80.000 Zellen pro Well) bei 37°C inkubiert. Die kyrokonservierten Hepatozyten werden in dem serumlosen Inkubationsmedium wiederhergestellt. Die Suspension wird in 96-Wellplatten (50 μL/Well) gegeben. Die Verbindungen werden in 2 μM Inkubationsmedium verdünnt und dann den Hepatozytsuspensionen zum Starten der Inkubation zugegeben. Die Proben werden nach 0, 10, 30 und 60 Minuten nach Inkubationsstart entnommen und die Reaktion mit einer Mischung, bestehend aus 0,3% Ameisensäure in 90% Acetonnitril/10% Wasser abgeschreckt. Die Konzentration der Verbindung in jeder Probe wird unter Verwendung von LC/MS/MS analysiert. Das Verschwinden der Halbwertzeit der Verbindung in Hepatozytsuspension wird durch Anpassen der Konzentrationszeitdaten mithilfe einer monophasigen Exponentialgleichung bestimmt. Die Daten werden aufskaliert, um den intrinsischen hepatischen Abstand und/oder den gesamten hepatischen Abstand darzustellen. Stabilität in der hepatischen S9-Fraktion von Mensch, Hund und Ratte: Jede Verbindung wird bis zu eine Stunde in S9-Suspension (500 μL, 3 mg Protein/mL) bei 37°C (n = 3) inkubiert. Die Verbindungen werden der S9-Suspension zugegeben, um die Inkubation zu starten. Die Proben werden 0, 10, 30 und 60 Minuten nach Inkubationsstart entnommen. Die Konzentration der Verbindung in jeder Probe wird unter Verwendung von LC/MS/MS analysiert. Das Verschwinden der Halbwertzeit der Verbindung in der S9-Suspension wird durch Anpassen der Konzentrationszeitdaten mithilfe einer monophasigen Exponentialgleichung bestimmt. Caco-2-Durchlässigkeit: Es werden die Vorwärts-(A-zu-B) und Rückwärts-(B-zu-A)Durchlässigkeit gemessen. Caco-2-Monoschichten werden zum Zusammenführen auf kollagenbeschichteten, mikroporösen, Polycarbonatmembranen in 12-Well Costar Transwell®-Platten gezüchtet. Die Verbindungen werden auf der apikalen Seite für die Vorwärtsdurchlässigkeit (A-zu-B) dosiert und werden auf der basolateralen Seite für die Rückwärtsdurchlässigkeit (B-zu-A) dosiert. Die Zellen werden bei 37°C mit 5% CO2 in einem befeuchteten Inkubator inkubiert. Zu Beginn der Inkubation bei 1 Stunde und 2 Stunden nach Inkubation wird ein 200 μL Aliquot aus der Aufnahmekammer genommen und gegen einen frischen Assaypuffer ersetzt. Die Konzentration der Verbindung in jeder Probe wird per LC/MS/MS bestimmt. Die offensichtliche Durchlässigkeit, Papp, wird berechnet. Plasmaproteinbindunq: Die Plasmaproteinbindung wird durch Äquilibriumdialyse gemessen. Jede Verbindung wird in Rohplasma mit einer Endkonzentration von 2 μM eingebracht. Das eingebrachte Plasma und Phosphatpuffer werden auf gegenüberliegenden Seiten der assemblierten Dialysezellen angeordnet und dann langsam in einem 37°C-Wasserbad gedreht. Am Ende der Inkubation wird die Konzentration der Verbindung in Plasma und Phosphatpuffer bestimmt. Der entbundene Prozentsatz wird mit Hilfe der folgenden Gleichung berechnet:
    Figure DE202012013382U1_0079
    worin Cf bzw. Cb freie und gebundene Konzentrationen sind, die als der Postdialyse-Puffer bzw. Plasmakonzentrationen bestimmt wurden. CYP450-Profilierung: Jede Verbindung wird mit jedem der 5 rekombinanten humanen CYP450-Enzyme inkubiert, einschließlich CYP1A2, CYP2C9, CYP3A4, CYP2D6 und CYP2C19 in Gegenwart und Abwesenheit von NADPH. Serielle Proben können von der Inkubationsmischung zu Beginn der Inkubation und bei 5, 15, 30, 45 und 60 Minuten nach Start der Inkubation genommen werden. Die Konzentration der Verbindung in der Inkubationsmischung wird per LC/MS/MS bestimmt. Der Prozentsatz der Verbindung, die nach der Inkubation an jedem Zeitpunkt verbleibt, wird durch Vergleichen der Probenahme zu Beginn der Inkubation berechnet. Stabilität in Ratten-, Hunde-, Affen- und Menschenplasma: Verbindungen werden bis zu 2 Stunden in Plasma (Ratte, Hund, Affe oder Mensch) bei 37°C inkubiert. Die Verbindungen werden dem Plasma bei Endkonzentrationen von 1 und 10 μg/mL zugegeben. Aliquote werden bei 0, 5, 15, 30, 60 und 120 min nach Zugeben der Verbindung genommen. Die Konzentration der Verbindungen und Hauptmetaboliten zu jedem Zeitpunkt werden per LC/MS/MS gemessen. Die biologischen Daten (Antiviruspotenz [EC50] wird unter Verwendung eines Renilla-Luciferase (RLuc) basierten HCV-Replikonreporter-Assays – HCV 1b RLuc) bestimmt.
  • Biologisches Beispiel 1: Anti-HCV-Aktivität der Kombination aus Verbindung 1 und Verbindung 2
  • Materialien und Verfahren
  • Verbindung 1 und Verbindung 2 wurden von Gilead Sciences (Foster City, CA) synthetisiert. Zelllinien
  • HCV-Genotyp 1b Replikonzellen (Huh-luc) wurden von Reblikon (Mainz, Deutschland) erhalten. Das Replikon in diesen Zellen nennt sich 1389luc-ubi-neo/NS3-3'/ET und codiert einen auswählbaren Resistenzmarker (Neomycinphosphotransferase) sowie das Firefly-Luciferase-Reportergen. Huh-luc-Zelllinien wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; GIBCO, Carlsbad, CA) gehalten, das mit 10%fötalem Kalbsserum (FBS, Hyclone, Logan, UT) und 0,5 mg/mL G-418 (GIBCO) ergänzt wurde. Zellen wurden zweimal pro Woche übertragen und auf subkonfluenten Levels gehalten.
  • EC50-Bestimmungen
  • Die Replikonzellen wurden in 96-Well-Patten bei einer Dichte von 5 × 103 Zellen pro Well in 100 μL DMEM-Kulturmedium angesiedelt, ausschließlich G-418. Die Verbindungen 1 und 2 wurden 1:3 in 100% DMSO (Sigma) seriell verdünnt. Diese seriellen Verdünnungen wurden den Zellen bei einer Verdünnung von 1:200 zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,5% DMSO in einem Gesamtvolumen von 200 μL zu erreichen. Die Platten wurden bei 37°C drei Tage lang inkubiert, wonach die Kulturmedien entfernt und die Zellen lysiert und auf Luciferaseaktivität unter Verwendung eines herkömmlichen Luciferase-Assays (Promega, Madison, WI) getestet wurden. Die HCV-Replikationslevel in den arzneibehandelten Proben wurden als Prozentsatz in Bezug auf die unbehandelten Kontrollen (die als 100% definiert wurden) exprimiert und die Daten auf die logistische Dosis-Antwort-Gleichung y = a/(1 + (x/b)c) unter Verwendung der XLFit4-Software (IDBS, Emeryville, CA) angepasst. Die EC50-Werte wurden aus den resultierenden Gleichungen wie zuvor beschrieben (Delaney, W. E. et al., Antimicrobial Agents Chemotherapy, 45(6): 1705–1713 (2001)), berechnet.
  • Antiviral Combination Studies.
  • Die Replikonzellen wurden in 96-Well-Patten bei einer Dichte von 5 × 103 Zellen pro Well in 100 μL Kulturmedium angesiedelt. Die Verbindungen 1 und 2 wurden in 100% DMSO wie oben beschrieben seriell verdünnt und in einem Matrixformat zu 96-Well-Platten zugegeben, wodurch ein definierter Satz unterschiedlicher Arzneimittelkonzentrationen und -verhältnissen in einem Endvolumen von 200 μL und eine End-DMSO-Konzentration von 0,5% erhalten wurden. Für jedes einzelne Arzneimittel wurde der EC50-Wert als Mittelpunkt für den getesteten Konzentrationsbereich ausgewählt. Die Zellen wurden drei Tage lang inkubiert und auf Luciferaseexpression wie oben beschrieben analysiert. Für die Kombinationsstudie wurden zwei unabhängige Experimente dreifach durchgeführt.
  • Kombinationsdatenanalyse
  • Die Daten wurden unter Verwendung des MacSynergy II-Programms analysiert, das von Prichard and Shipman (Prichard MN, Aseltine KR, Shipman C, Jr., MacSynergyTM II, Version 1.0. University of Michigan, Ann Arbor, Michigan, 1993; Prichard M. N., Shipman C., Jr., Antiviral Res 14 (4-5): 181–205 (1990); Prichard M. N., Shipman C, Jr., AntivirTher 1 (1): 9–20 (1996); Prichard M. N., et al., Antimicrob Agents Chemother 37 (3): 540–5 (1993) entwickelt wurde. Die Software berechnet die theoretische Hemmung unter Voraussetzung der Additivinteraktion zwischen Arzneimitteln (basierend auf dem Bliss-Unabhängigkeitsmodell) und quantifiziert statistisch bedeutende Unterschiede zwischen den theoretischen und beobachteten Hemmwerten. Das Aufzeichnen dieser Unterschiede in drei Dimensionen resultiert in einer Oberfläche, bei der Erhöhungen in der Z-Ebene eine antivirale Synergie darstellen und Vertiefungen einen antiviralen Antagonismus zwischen Verbindungen darstellen. Die berechneten Volumina der Oberflächenabweichungen sind in nM2% ausgedrückt. Laut Prichard und Shipman werden Kombinationsauswirkungen wie folgt definiert:
    • • Hoch synergistisch bei Volumina von > 100 nM2
    • • Leicht synergistisch bei Volumina von > 50 und > 100 nM2
    • • Additiv bei Volumina von > –50 nM2 und < 50 nM2
    • • Leicht antagonistisch bei Volumina von > –100 nM2 und > –50 nM2
    • • Antagonistisch bei Volumina von < –100 nM2
  • Ergebnisse
  • Vor Beginn der Kombinationsexperimente wurden die EC50-Werte in Huh-luc-Replikonzellen für Verbindung 1 und Verbindung 2 bestimmt und die Ergebnisse in Tabelle II aufgeführt. Beide Verbindungen besaßen eine antivirale Wirkung. Tabelle II Einzelne EC50 für Anti-HCV-Verbindungen 1 und 2 in Huh-luc-Replikonzellen
    Verbindung EC50 (nM)a
    Verbindung 1 3 ± 2
    Verbindung 2 11 ± 3
    a EC50 zeigt den Durchschnitt ± Standardabweichung für zwei oder mehrere unabhängige Experimente an.
  • Die antivirale Wirkung der Kombination aus Verbindung 1 und Verbindung 2 wurde gemessen und die resultierenden Daten unter Verwendung von MacSynergy II analysiert, das Oberflächenaufzeichnungen bereitstellt, die signifikante Abweichungen von der Additivität anzeigen.
  • Die Quantifizierung von statistisch signifikanten Additivitätsabweichungen zeigte, dass die Kombination von Verbindung 1 und Verbindung 2 Synergie-/Antagonismus-Volumina zwischen –50 nM2 und 50 nM2 aufwiesen, die additive Antiviruswirkungen wie in Tabelle III aufgeführt zeigten. Tabelle III Quantifizierung der antiviralen Synergie und Antagonismus und Arzneimittelinteraktionen der Kombination von Verbindung 1 und Verbindung 2
    Arzneimittel, das/die in Kombination mit Verbindung 2 verwendet wurde(n) Synergievolumen (nM2)a Antagonismusvolumen (nM2)a Interaktion
    Verbindung 1 13,5 ± 10,5 0,07 ± 0,07 Additiv
    a Die Werte repräsentieren das Mittel ± Standardabweichung von zwei unabhängigen Experimenten, die jeweils dreifach durchgeführt wurden
  • Die Ergebnisse der in vitro-Experimente aus Tabelle III zeigen, dass Verbindung 2 eine zusätzliche antivirale Aktivität aufweist, wenn sie mit Verbindung 1 kombiniert wird.
  • Biologisches Beispiel 2: Kombinationen mit Verbindung 3
  • Materialien und Verfahren
  • Antivirale Verbindungen
  • Verbindung 1 und Verbindung 3 wurden von Gilead Sciences (Foster City, CA) synthetisiert. Ribavirin und IFN-α wurden von Sigma (St. Louis, MO) käuflich erworben.
  • Zelllinien
  • HCV-Genotyp 1b Replikonzellen (Huh-luc) wurden von Reblikon (Mainz, Deutschland) erhalten. Das Replikon in diesen Zellen nennt sich 1389luc-ubi-neo/NS3-3'/ET und codiert einen auswählbaren Resistenzmarker (Neomycinphosphotransferase) sowie das Firefly-Luciferase-Reportergen. Huh-luc-Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (D-MEM) mit GlutaMAXTM (Invitrogen, Carlsbad, CA) gehalten, das mit 10% fötalem Kalbsserum (FBS, Hyclone, Logan, UT) und 0,5 mg/mL G-418 (Invitrogen) ergänzt wurde. Zellen wurden zweimal pro Woche übertragen und auf subkonfluenten Levels gehalten.
  • EC50-Bestimmungen
  • Die Replikonzellen wurden in 96-Well-Patten bei einer Dichte von 5 × 103 Zellen pro Well in 100 μL DMEM plus 10% FBS-Kulturmedium angesiedelt, ausschließlich G-418. Die Verbindungen wurden 1:3 in 100% DMSO (Sigma) seriell verdünnt. Diese seriellen Verdünnungen wurden den Zellen bei einer Verdünnung von 1:200 zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,5% DMSO in einem Gesamtvolumen von 200 μL zu erreichen. Die Platten wurden bei 37°C drei Tage lang inkubiert, wonach die Kulturmedien entfernt und die Zellen lysiert und auf Luciferaseaktivität unter Verwendung eines herkömmlichen Luciferase-Assays (Promega, Madison, WI) getestet wurden. Die HCV-Replikationslevel in den arzneibehandelten Proben wurden als Prozentsatz in Bezug auf die unbehandelten Kontrollen (die als 100% definiert wurden) exprimiert und die Daten auf die logistische Dosis-Antwort-Gleichung y = a/(1 + (x/b)c) unter Verwendung der XLFit4-Software (IDBS, Emeryville, CA) angepasst. Die EC50-Werte wurden aus den resultierenden Gleichungen wie zuvor beschrieben berechnet.
  • Antivirale Kombinationsstudien
  • Die Replikonzellen wurden in 96-Well-Patten bei einer Dichte von 5 × 103 Zellen pro Well in 100 μL Kulturmedium angesiedelt, ausschließlich G-418. Die Verbindung 3 und andere Verbindungen wurden in 100% DMSO wie oben beschrieben seriell verdünnt und in einem Matrixformat zu 96-Well-Platten zugegeben, wodurch ein definierter Satz unterschiedlicher Arzneimittelkonzentrationen und -verhältnisse in einem Endvolumen von 200 μL und eine End-DMSO-Konzentration von 0,5% erhalten wurde. Für jedes einzelne Arzneimittel (außer Ribavirin) wurde der EC50-Wert als Mittelpunkt für den getesteten Konzentrationsbereich ausgewählt. Für Ribavirin, das keine selektive antivirale Wirkung aufwies, wurde eine höchste Dosierung von 6,2 μM ausgewählt, weil diese etwa das dreifache weniger als die Konzentration beträgt, bei der Zytotoxizität begann, nachgewiesen zu werden.
  • Die Zellen wurden drei Tage lang mit Arzneimitteln inkubiert und auf Luciferaseexpression wie oben beschrieben analysiert. Für jede Kombinationsstudie wurden zwei unabhängige Experimente dreifach durchgeführt.
  • Kombinationsdatenanalyse
  • Die Daten wurden unter Verwendung des MacSynergy II-Programms analysiert, das von Prichard und Shipman entwickelt wurde. Die Software berechnet die theoretische Hemmung unter Voraussetzung der Additivinteraktion zwischen Arzneimitteln (basierend auf dem Bliss-Unabhängigkeitsmodell) und quantifiziert statistisch bedeutende Unterschiede zwischen den theoretischen und beobachteten Hemmwerten. Das Aufzeichnen dieser Unterschiede in drei Dimensionen resultiert in einer Oberfläche, bei der Erhöhungen in der Z-Ebene eine antivirale Synergie darstellen und Vertiefungen einen antiviralen Antagonismus zwischen Verbindungen darstellen. Die berechneten Volumina der Oberflächenabweichungen sind in nM2% ausgedrückt. Laut Prichard und Shipman werden Kombinationswirkungen wie folgt definiert:
    • • Starke Synergie bei Volumina > 100 nM2; diese Synergiemenge ist wahrscheinlich in vivo von Bedeutung
    • • Moderate Synergie bei Volumina von > 50 und < 100 nM2; diese Synergiemenge kann in vivo von Bedeutung sein
    • • Leichte Synergie bei Volumina von > 25 und > 50 nM2
    • • Additivität bei Volumina von > –25 nM2 und < 25 nM2
    • • Leichter Antagonismus bei Volumina von < –25 und > –50 nM2
    • • Moderater Antagonismus bei Volumina von > –100 und < –50 nM2; diese Antagonismusmenge kann in vivo von Bedeutung sein
    • • Starker Antagonismus bei Volumina < –100 nM2; diese Antagonismusmenge ist wahrscheinlich in vivo von Bedeutung
  • Ergebnisse
  • Die EC50-Werte für einzelne Verbindungen in Huh-luc-Replikonzellen
  • Vor Beginn der Kombinationsexperimente wurden die EC50-Werte in Huh-luc-Replikonzellen für jede Verbindung bestimmt, wie in Tabelle IV dargestellt. Alle Verbindungen hatten eine antivirale Wirkung, mit Ausnahme von Ribavirin, das keine antivirale Wirkung bis zu Konzentrationen zeigt, bei denen die Zytotoxizität einsetzt. Tabelle IV Einzelne EC50 für Anti-HCV-Verbindungen in Huh-luc-Replikonzellen
    Verbindung EC50 (nM)a
    Verbindung 3 2,3 ± 2,6
    IFN-α 0,105 ± 0,003 (U/mL)b
    Ribavirin > 12.500
    Verbindung 1 0,4 ± 0,14
    a EC50 zeigt den Durchschnitt ± Standardabweichung für zwei oder mehrere unabhängige Experimente an.
    b INF–α EC50 wird in Einheiten (U) pro Milliliter (ml) ausgedrückt, nicht als nanomolare Konzentration.
  • Kombination der antiviralen Wirkungen und der Arzneimittelinteraktionen
  • Die antiviralen Wirkungen der Verbindung 3 bei Kombination mit IFN-α, Ribavirin und Verbindung 1 wurden getestet. Die resultierenden Daten wurden unter Verwendung des MacSynergy II analysiert, der Oberflächenaufzeichnungen bereitstellt, die signifikante Abweichungen von der Additivität anzeigen. Die Quantifizierung von statistisch signifikanten Abweichungen von der Additivität zeigte, dass die Kombinationen von Verbindung 3 mit IFN-α zu einer geringeren Synergie führten (Synergievolumina von 32 bzw. 36,5 nM2; Tabelle V). Die Kombination von Verbindung 3 mit der Nicht-Nucleosid NS5B-Inhibitor Verbindung 1 ergab ein Synergievolumen von 14,5 nM2, was eine additive antivirale Interaktion anzeigt. Keine der Verbindungen ergab antivirale Antagonismusvolumina außerhalb des Additivbereichs (> –25 nM2) bei Kombination mit Verbindung 3, wie in Tabelle V dargestellt. Tabelle V Quantifizierung der antiviralen Synergie und Antagonismus und Arzneimittelinteraktionen Arzneimittel Kombinationen mit Verbindung 3
    Arzneimittel, das/die in Kombination mit Verbindung 3 verwendet wurde(n) Synergievolumen (nM2)a Antagonismusvolumen (nM2)a Interaktion
    IFN-α 32 ± 4,2 0.15 + 0,2 Geringe Synergie
    Ribavirin 54 + 14,1 1,6 ± 2,3 Moderate Synergie
    Verbindung 1 14,5 + 0,7 4,22 ± 5,0 Additiv
    a Die Werte repräsentieren das Mittel ± Standardabweichung von zwei unabhängigen Experimenten, die jeweils dreifach durchgeführt wurden
  • Diese antiviralen Kombinationsexperimente in vitro zeigen an, dass die neuartige HCV NS3 Proteasehemmer-Verbindung 3 eine geringere Synergie bei Kombination mit IFN-α besitzt und eine moderate Synergie bei Kombination mit Ribavirin. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Verbindung 3 möglicherweise in Kombination mit dem derzeitigen Therapiestandard (PEG-IFN-α plus Ribavirin) bei HCV-Patienten zum Erreichen einer verbesserten Viruslastunterdrückung verwendet werden kann, ohne die Wirkung der einzelnen Arzneimittel zu reduzieren. Kombinationen der Verbindung 3 mit Nicht-Nucleosid (Verbindung 1) NS5B Polymerasehemmern führt zu Additivität. Diese Ergebnisse zeigen an, dass Verbindung 3 auch zum Ausschöpfen von Arzneimittelkombinationen aus mehreren Klassen von spezifischen HCV-Inhibitoren bei Patienten geeignet sind.
  • Biologisches Beispiel 3: Kombinationen der Verbindung 4
  • Materialien und Verfahren
  • Anti-HCV-Mittel
  • Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 4, Verbindung 5 und Verbindung 6 wurden von Gilead Sciences (Foster City, CA) synthetisiert. Puromycin, IFN-α und Ribavirin wurden von Sigma (St. Louis, MO) käuflich erworben. Calcein AM wurde von Anaspec (Fremont, CA) käuflich erworben.
  • Zelllinie und Zellkultur
  • Die HCV Genotyp 1a-Replikonzelllinie, die in dieser Studie verwendet wurde, wurde zuvor beschrieben. Die Zellen wurden in Zellkulturmedium, enthaltend Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit GlutaMAX (Gibco, Carlsbad, CA, Kat. Nr. 10569-044) gezüchtet, mit 10% FBS (HyClone, Logan, UT, Kat. Nr. SH30071.03), 100 Einheiten/mL Penicillin, 100 ng/mL Streptomycin (Gibco, Carlsbad, CA, Kat. Nr. 15140-122) und 0,1 mM nicht essentiellen Aminosäuren (Gibco, Carlsbad, CA, Kat. Nr. 11140-050) ergänzt. Die Replikonzellen wurden in 0,5 mg/mL Geneticin (Invitrogen, Carlsbad, CA, Kat. Nr. 10131-035) gehalten, um den Verlust des HCV-Replikons zu verhindern. Die Zellen wurden alle 3 bis 4 Tage vor Erreichen der Konfluenz übertragen.
  • HCV-Replikonassay für EC50-, CC50-Bestimmungen und Kombinationsstudien
  • Alle Verbindungen wurden 100% DMSO zugeführt, außer IFN-α, das in vom Hersteller angegebenen Puffer zugeführt wurde (Sigma, St. Louis, MO, Kat. Nr. 14276). Die seriellen Verbindungsverdünnungen wurden in 100% DMSO durchgeführt, mit Ausnahme von IFN-α, das seriell in Zellkulturmedium verdünnt wurde, wie in Abschnitt 3.2 beschrieben. Alle seriellen Verdünnungen wurden unter Verwendung einer Biomek FX Workstation in 384-Well-Polypropylenplatten (Thermo Scientific, Hudson, NH, Kat. Nr. 4341) durchgeführt. Zur EC50- und CC50-Bestimmung wurden die Testverbindungen in zehn Schritten mit Verdünnungen 1:3 in Säulen 3 bis 20 der 384-Well-Platten seriell verdünnt. Für die Kombinationsstudien wurde eine Verbindung in neun Schritten mit 1:2-Verdünnungen in horizontale Richtung seriell verdünnt und die andere Verbindung in sieben Schritten mit 1:2-Verdünnungen in vertikale Richtung seriell verdünnt. Dadurch wurde ein definierter Satz unterschiedlicher Arzneimittelkonzentrationen und -verhältnisse erreicht. Für jedes einzelne Arzneimittel wurde der EC50-Wert als Mittelpunkt für den getesteten Konzentrationsbereich ausgewählt. Alle seriellen Verdünnungen wurden in vier Replikaten pro Verbindung innerhalb der gleichen 384-Well-Platten durchgeführt. 100% DMSO wurde in die Säule 1 bis 2 jeder seriellen Verdünnung in die 384-Well-Platte zugegeben. Ein HCV-Proteasehemmer ITMN-191 bei 100 nM wurde in die Säule 23 als Kontrolle der 100%-igen Hemmung der HCV-Replikation zugegeben, während Puromycin bei 10 mM in Säule 24 als Kontrolle der 100%-igen Zytotoxizität zugegeben wurde.
  • Jedem Well einer schwarzen Polystyrol-384-Well-Platte Greiner Bio-one, Monroe, NC, Kat. Nr. 781086, zellkulturbehandelt) wurde 90 μL Zellkulturmedium (ohne Geneticin), enthaltend 2000 suspendierte HCV-Replikonzellen mit einer Biotek FXFlow Workstation zugegeben. Für den Verbindungstransfer in die Zellkulturplatten wurde in einer Biomek FX Workstation 0,4 μL der Verbindungslösung von der Verbindungsplatte der seriellen Verdünnung zu der Zellkulturplatte übertragen. Die DMSO-Konzentration in den Endassaywells betrug 0,44%. Die Platten wurden 3 Tage bei 37°C mit 5% CO2 und 85% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Das HCV Replikonassay war ein Multiplexassay, das sowohl die Zytotoxizität als auch die Anti-Replikonaktivität im gleichen Well beurteilen kann. Zuerst wurde das CC50-Assay durchgeführt. Die Medien in der 384-Well-Zellkulturplatte wurden aspiriert und die Wells unter Verwendung eines Biotek ELX405-Plattenwäschers jeweils vier Mal mit 100 μL 1 × PBS gewaschen. Ein Volumen von 50 μL einer Lösung, enthaltend 400 nM Calcein AM (Anaspec, Fremont, CA, Kat. Nr. 25200-056) in 1 × PBS wurde jedem Well der Platte mit der Biotek μFlow Workstation zugegeben. Die Platte wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, bevor das Fluoreszenzsignal (Anregung 490 nm, Emission 520 nm) mit einem Perkin Elmer Envision Plattenlesegerät gemessen wurde.
  • Das EC50-Assay wurden in den gleichen Wells wie das CC50-Assay durchgeführt. Die Calcein-PBS-Lösung in den 384-Well-Zellkulturplatten wurde mit einem Biotek ELX405-Plattenwäscher aspiriert. Ein Volumen von 20 μL Dual-Glo Luciferasepuffer (Promega, Madison, WI, Kat. Nr. E298B) wurde jedem Well der Platte mithilfe der Biotek μFlow Workstation zugegeben. Die Platte wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Ein Volumen von 20 μL einer Lösung, enthaltend eine 1:100 Mischung von Dual-Glo Stop & Glo-Substrat (Promega, Madison, WI, Kat. Nr. E313B) und Dual-Glo Stop & Glo-Puffer (Promega, Madison, WI, Kat. Nr. E314B) wurde dann jedem Well der Platte mit einer Biotek μFlow Workstation zugegeben. Die Platte wurde dann bei Raumtemperatur 10 Minuten inkubiert, bevor das Lumineszenzsignal mit einem Perkin Elmer Envision-Plattenlesegerät gemessen wurde.
  • Datenanalyse
  • Die zytotoxische Wirkung wurde durch Calcein AM-Umwandlung zu einem fluoreszenten Produkt bestimmt. Der Prozentsatz der Zytotoxizität wurde mithilfe von Gleichung 1 berechnet:
    Figure DE202012013382U1_0080
    worin Xc das Fluoreszenzsignal des verbindungsbehandelten Wells ist; MB ist das durchschnittliche Fluoreszenzsignal aus puromycinbehandelten Wells, MD ist das durchschnittliche Fluoreszenzsignal aus DMSO-behandelten Wells. Die Anti-HCV-Replikationsaktivität wurde von dem Lumineszenzsignal bestimmt, das von der Reporter Renilla-Luciferase des HCV-Replikons erzeugt wurde. Die prozentuale Hemmung des HCV-Replikons wurde unter Verwendung von Gleichung 1 berechnet, worin Xc das Lumineszenzsignal des verbindungsbehandelten Wells ist; MB ist das durchschnittliche Lumineszenzsignal aus den ITMN-191-behandelten Wells, MD ist das durchschnittliche Lumineszenzsignal aus DMSO-behandelten Wells. Die CC50-Werte wurden als die Testverbindungskonzentration bestimmt, die einen 50%-igen Rückgang der Zellviabilität verursachte. Die EC50-Werte wurden als die Testverbindungskonzentration bestimmt, die einen 50%-igen Rückgang der HCV-Replikation verursachte. Sowohl die CC50- als auch EC50-Werte wurden unter Verwendung des Pipeline Pilot 5.0-Softwarepakets (Accelrys, San Diego, CA) durch nicht lineare Regressionsanpassung der experimentellen Daten auf Gleichung 2 erhalten.
    Figure DE202012013382U1_0081
    worin y der beobachtete% Hemmung des HCV-Replikons bei x Konzentration der Verbindung ist; d ist die geschätzte Antwort bei null Verbindungskonzentration; a ist die geschätzte Antwort bei infiniter Verbindungskonzentration; c ist die Mittelbereich-Konzentration (CC50 oder EC50); b ist der Hill-Neigungsfaktor.
  • Die experimentellen Daten der Kombinationsstudie wurden unter Verwendung des MacSynergy II-Programms analysiert, das von Prichard und Shipman entwickelt wurde. Die Software (MacSynergyTM II, University of Michigan, MI) berechnet die theoretische Hemmung unter Voraussetzung der Additivinteraktion zwischen Arzneimitteln (basierend auf dem Bliss-Unabhängigkeitsmodell) und quantifiziert statistisch bedeutende Unterschiede zwischen den theoretischen und beobachteten Hemmwerten. Das Aufzeichnen dieser Unterschiede in drei Dimensionen resultiert in einer Oberfläche, bei der Erhöhungen in der Z-Ebene eine antivirale Synergie darstellen und Vertiefungen einen antiviralen Antagonismus zwischen Verbindungen darstellen. Die berechneten Volumina der Oberflächenabweichungen sind in nM2% ausgedrückt. Laut Prichard und Shipman werden Kombinationsauswirkungen wie folgt definiert:
    • Starke Synergie: > 100 nM2%
    • Moderate Synergie: > 50 und < 100 nM2%
    • Geringe Synergie: > 25 und < 50 nM2%
    • Additivität: < 25 und > –25 nM2%
    • Geringer Antagonismus: < –25 und > –50 nM2%
    • Moderater Antagonismus: < –50 und > –100 nM2%
    • Starker Antagonismus: < –100 nM2%
  • Für jede Kombinationsstudie wurden drei unabhängige Experimente mit vier Replikaten in jedem Experiment durchgeführt.
  • Ergebnisse
  • Antivirale Wirkung und Zytotoxizität der einzelnen Verbindungen im HCV Genotyp 1a Replikonassay
  • Die Anti-HCV-Aktivität und Zytotoxizität von Verbindung 4 und anderen Verbindungen wurde in Huh-7 Zellen getestet, die ein HCV Genotyp 1a Replikon trugen. Die EC50- und CC50-Werte sind in Tabelle VI aufgeführt. Es konnte keine signifikante Zytotoxizität für alle Verbindungen bis hin zu den höchsten getesteten Konzentrationen nachgewiesen werden. Tabelle VI EC50 und CC50 der Verbindungen, die in dieser Studie gegen HCV Genotyp 1a Replikon verwendet wurden
    Verbindungen EC50 a (nM) CC50 a (nM)
    Verbindung 1 19 ± 8 > 44400
    Verbindung 2 496 + 135 > 22200
    Verbindung 3 49 ± 18 > 22200
    Verbindung 4 201 ± 74 > 44400
    Verbindung 5 15 ± 2,4 > 44400
    Verbindung 6 0,033 ± 0,011 > 44400
    IFN-α 14 ± 03b > 50b
    Ribavirin 36482 ± 17507 > 88800
    a Werte sind Durchschnitt ± Standardabweichung für drei oder mehrere unabhängige Experimente
    b INF-α-Werte sind in Einheiten (U) pro Milliliter (ml) ausgedrückt, nicht als nanomolare Konzentration
  • Antivirale Aktivität und Zytotoxizität der Verbindung 4 in Kombination mit anderen Klassen von Anti-HCV-Mitteln
  • Die antiviralen Wirkungen von Verbindung 4 in Kombination mit anderen Anti-HCV-Verbindungen wurden unter Verwendung des HCV Genotyp 1a Replikons bewertet. Die Ergebnisse wurden unter Verwendung der MacSynergy II analysiert, die Oberflächenaufzeichnungen bereitstellt, die signifikante Abweichungen von der Additivität anzeigen. Die Synergie und Antagonismus-Volumina (nM2%), die aus den Abweichungen der Additivoberfläche berechnet wurden, sind in Tabelle VII zusammengefasst. Bei einem Konfidenzintervall von 95% liegen die mittleren Synergie- und Antagonismusvolumina zwischen 25 und –25 nM2%, wenn die Verbindung 4 mit IFN-α, Verbindung 2 und Verbindung 6 kombiniert wurde, was eine Additivinteraktion mit diesen Verbindungen anzeigt. Des Weiteren zeigt Verbindung 4 Synergievolumina in dem Bereich von 25 bis 50 nM2%, wenn mit Verbindung 1, Verbindung 5 oder Verbindung 3 kombiniert, was eine geringe synergistische Interaktion nahelegt. Tabelle VII Quantifizierung der antiviralen Synergie und Antagonismus und Arzneimittelinteraktionen Arzneimittel Kombinationen mit Verbindung 4
    Arzneimittel, das/die in Kombination mit Verbindung 4 verwendet wurde(n) Synergievolumen (nM2%)a Antagonismusvolumen (nM2%)a Interaktion
    Verbindung 1 34 ± 26 –1 ± 2 Geringe Synergie
    Verbindung 2 22 ± 14 –2 ± 3 Additivität
    Verbindung 3 26 ± 6 –3 ± 2 Geringe Synergie
    Verbindung 5 26 ± 28 –1 ± 3 Geringe Synergie
    Verbindung 6 19 ± 17 –7 ± 7 Additivität
    IFN-α 12 ± 6 0 ± 0 Additivität
    Ribavirin 1 ± 1 –43 ± 20 Geringer Antagonismus
    Die Werte zeigen das Mittel ± Standardabweichung der drei unabhängigen Experimente, die in vier Replikaten durchgeführt wurden
  • In allen Kombinationsstudien ist die Zellviabilität höher als 85% bei allen Konzentrationsverhältnissen und alle Arzneimittelkombinationen zeigen additive Wirkungen auf die Zytotoxizität, wie in Tabelle VIII dargestellt. Tabelle VIII Quantifizierung der zytotoxischen Synergie und Antagonismus und Arzneimittelinteraktionen für Arzneimittel Kombinationen mit Verbindung 4
    Arzneimittel, das/die in Kombination mit Verbindung 4 verwendet wurde(n) Synergievolumen (nM2%)a Antagonismusvolumen (nM2%)a Interaktion
    Verbindung 1 13 ± 11 0 ± 1 Additivität
    Verbindung 2 17 ± 14 0 ± 0 Additivität
    Verbindung 3 3 ± 5 0 ± 0 Additivität
    Verbindung 5 15 ± 8 –10 ± 7 Additivität
    Verbindung 6 8 ± 4 0 ± 0 Additivität
    IFN-α 8 ± 12 –7 ± 13 Additivität
    Ribavirin 4 ± 3 –1 ± 2 Additivität
    a Die Werte zeigen das Mittel ± Standardabweichung der drei unabhängigen Experimente, die in vier Replikaten durchgeführt wurden
  • Die Verbindung 4 zeigt jedoch ein Antagonismusvolumen von –43 nM2%, wenn mit Ribavirin kombiniert, was eine geringe Antagonismusinteraktion nahelegt. Tabelle IX Quantifizierung der zytotoxischen Synergie und Antagonismus und Arzneimittelinteraktionen für Arzneimittel Kombinationen mit Ribavirin
    Arzneimittel, das in Kombination mit Ribavirin verwendet wird Synergievolumen (μM2%)a Antagonismusvolumen (μM2%)a Interaktion
    Verbindung 4 4 ± 3 –1 ± 2 Additivität
    a Die Werte zeigen das Mittel ± Standardabweichung der drei unabhängigen Experimente, die in vier Replikaten durchgeführt wurden
  • Die Ribavirinkonzentration, die den höchsten Antagonismus mit Verbindung 4 zeigt, liegt bei etwa 0,5 bis 1 μM, was ungefähr 10-mal weniger ist als die gleichbleibende Plasmakonzentration von Ribavirin (6 bis 11 μM), die beim Menschen bei einer Dosierung von 800 mg/Tag beobachtet wird. Bei dieser physiologischen Konzentration von Ribavirin (6 bis 11 μM) ist die antagonistische Interaktion zwischen Ribavirin und Verbindung 4 über einen breiten Bereich der Konzentrationen von Verbindung 4 (0 bis 0,44 μM) minimal. Daher besitzt der beobachtete geringe Antagonismus zwischen Ribavirin und Verbindung 4 in dem Replikonsystem in vitro wahrscheinlich keine klinische Bedeutung.
  • Schlussfolgerungen
  • Die antivirale Aktivität der Verbindung 4 (in einer diastereomeren Mischung) wurde in Kombination mit dem derzeitigen Therapiestandard (IFN-α/Ribavirin) sowie mit den internen Entwicklungskandidaten von Gilead Sciences Verbindung 1 und Verbindung 5 (Nicht-Nucleosid NS5B-Inhibitoren), Verbindung 2 und Verbindung 3 (NS3 Proteasehemmer) und Verbindung 6 (NS5A Inhibitor) getestet. Wie in Tabelle VIII zusammengefasst, zeigte Verbindung 4 eine additive antivirale Wirkung in Kombination mit IFN-α, Verbindung 2 und Verbindung 6 und eine geringe Synergie mit Verbindung 1, Verbindung 5 und Verbindung 3.
  • Die Kombination von Verbindung 4 mit Ribavirin ergab einen geringen Antagonismus bei Ribavirinkonzentrationen zwischen 0,5 bis 1 μM, was etwa 10-mal weniger war als die gleichbleibende physiologische Konzentration (6 bis 11 μM) in menschlichem Plasma. Bei der klinisch relevanten Ribavirinkonzentration wurde die antagonistische Interaktion zwischen den zwei Verbindungen unerheblich.
  • Biologisches Beispiel 4: Kombinationen von Verbindung 5
  • Die antivirale Wirkung von Verbindung 5 wurde in GT-1b Huh-lunet Zellen (unter Anwendung im Wesentlichen der gleiche Verfahren wie den in Assays für Verbindung 4 angewandten) in Kombination mit den internen Entwicklungsverbindungen Verbindung 1, Verbindung 2 und Verbindung 3 (NS3 Protease-Hemmer), Verbindung 6 (NS5A-Hemmer), Verbindung 4 (C-nuc NS5B-Hemmer) wie auch der freigegebenen HCV-Therapeutik PEG-IFN-α und Ribavirin erprobt. Die Kombinationsdaten wurden auf der Grundlage des Bliss-Independence-Modells mithilfe des Softwareprogramms MacSynergy II untersucht. Die Ergebnisse der Kombinations-Assays wurden als Mittelwert der Synergie- und Antagonismusvolumina (nM2) ausgedrückt, berechnet mit einem Konfidenzniveau von 95% aus zwei voneinander unabhängigen und dreifach durchgeführten Experimenten. Kombinationseffekte werden wie folgt definiert:
    • • Hohe Synergie bei Volumina > 100 nM2; diese Quantität von Synergie ist wahrscheinlich in vio wichtig
    • • Mäßige Synergie bei Volumina > 50 und ≤ 100 nM2; diese Quantität von Synergie ist wahrscheinlich in vivo wichtig
    • • Geringe Synergie bei Volumina > 25 und < 50 nM2
    • • Additivität bei Volumina > –25 und ≤ 25 nM2
    • • Geringer Antagonismus bei Volumina < –25 und > –50 nM2
    • • Mäßiger Antagonismus bei Volumina > –100 nM2 und ≤ –50 nM2; diese Quantität von Antagonismus ist wahrscheinlich in vivo wichtig
    • • Hoher Antagonismus bei Volumina < –100 nM2; diese Quantität von Antagonismus ist wahrscheinlich in vivo wichtig
  • Die Kombination der allosterischen NS5B-Hemmer Verbindung 1 und Verbindung 5 resultierte im Replikon-Assay in einer mäßigen Synergie. Studien mit anderen HCV-Hemmern, einschließlich PEG-IFN-25-α und Ribavirin, ließen additive Interaktionen zu geringen synergetischen Interaktionen erkennen. Tabelle X Antivirale Effekte von Verbindung 5 in Kombination mit anderen Anti-HCV-Arzneistoffen in 1b Huh-luc Replikon-Zellen
    In Kombination mit Verbindung 5 verwenete Arzneistoffe Synergievolumen (nM2)a Antagonismusvolumen (nM2)a Interaktion
    Verbindung 1 70 ± 26 0 ± 0 Mäßige Synergie
    Verbindung 2 22 ± 12 –7 ± 7 additiv
    Verbindung 3 19 ± 13 –2 ± 2 additiv
    Verbindung 4 26 ± 28 –1 ± 3 Geringe Synergie
    Verbindung 6 34 ± 19 0 ± 0 Geringe Synergie
    PEG-IFN-α 31 ± 23 –2 ± 4 Geringe Synergie
    Ribavirin 12 ± 8 –12 ± 9 additiv
    a Werte stellen die mittlere ± Standardabweichung von zwei voneinander unabhängigen und dreifach durchgeführten Experimenten dar.
  • Biologisches Beispiel 5: Kombinationen von Verbindung 6
  • Material und Methoden
  • Verbindungen
  • Verbindung 1, Verbindung 2, Verbindung 3, Verbindung 6 und Verbindung 7 wurden bei Gilead Sciences (Foster City, Kalifornien) synthetisch hergestellt. IFN-α und Ribavirin wurden bei Sigma (St. Louis, Missouri) bezogen.
  • Zelllinien
  • Replikon-Zellen des HCV-Genotyps 1b (Huh-luc) wurden bei Reblikon (Mainz, Deutschland) bezogen. Das Replikon in diesen Zellen wird als 1389luc-ubi-neo/NS3-37ET bezeichnet; es verschlüsselt einen Resistenz-Selektionsmarker (Neomycin-Phosphotransferase) wie auch das Reporter-Gen der Firefly-Luciferase. Huh-luc-Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium GlutaMax (DMEM, von Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien), ergänzt durch 10% Fetal Bovine Serum (FBS, von Hyclone, Logan, Utah), 1 × Penecillin/Streptomycin, 1 × nicht-essentiellen Aminosäuren und 0,5 mg/ml G-418 (alle von Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien) gehalten. Zellen wurden zweimal wöchentlich passagiert und auf subkonfluentem Niveau gehalten.
  • Assays
  • Assay antiviraler Aktivitäten bei HCV Huh-luc-Replikonzellen
  • Replikonzellen wurden in 96-Loch-Titerplatten mit einer Dichte von 7 × 103 Zellen pro Loch in 100 μl DMEM-Nährlösung ohne G-418 gesät. Verbindungen wurden in 100% DMSO im Verhältnis 1:2 seriell verdünnt. Serielle Verdünnungen wurden den Zellen in einer Verdünnung von 1:200 zugegeben, um in einem Gesamtvolumen von 200 μl eine Endkonzentration von 0,5% DMSO zu erzielen. Die Platten wurden 3 Tage lang bei 37°C inkubiert, anschließend wurden die Nährlösungen entfernt, die Zellen lysiert und mithilfe eines handelsüblichen Luciferase-Assays (Promega, Madison, Wisconsin) auf Luciferase-Aktivität untersucht.
  • Studien antiviraler Kombinationen
  • Replikonzellen wurden in 96-Loch-Titerplatten mit einer Dichte von 7 × 103 Zellen pro Loch in 100 μL DMEM-Nährlösung ohne G-418 gesät. Verbindung 6 und andere Verbindungen wurden in 100% DMSO im Verhältnis 1:2 verdünnt und 96-Loch-Titerplatten in einem Matrix-Format zugegeben, wodurch eine festgelegte Gruppe unterschiedlicher Arzneistoffkonzentrationen und -verhältniswerte in einem Endvolumen von 200 μl und in einer endgültigen DMSO-Konzentration von 0,5% erzielt wurde. Für jeden einzelnen Arzneistoff wurde der EC50-Wert als Mittelwert des getesteten Konzentrationsbereichs gewählt. Zellen wurden 3 Tage lang inkubiert und mithilfe eines handelsüblichen Luciferase-Assays (Promega) auf Luciferase-Expressionen untersucht. Für jede Kombinationsstudie wurden zwei voneinander unabhängige Experimente dreifach durchgeführt.
  • Bestimmung der zellulären Zytotoxizität.
  • Replikonzellen wurden, wie für die obigen Studien antiviraler Kombinationen beschrieben, gesät und mit Arzneistoffen behandelt. Nach dreitägiger Inkubation bei 37°C wurde die Nährlösung entfernt und die Zellen mithilfe eines CellTiter-Glo Luminescent Cellviability Assays (Promega) nach Herstelleranweisungen lysiert und auf Zytotoxizität untersucht. Die relativen Lichteinheiten („Relative Light Units”) wurden in Prozentsätze der (als 100% definierten) unbehandelten Kontrollen umgewandelt.
  • Datenanalyse
  • EC50-Berechnungen
  • Im Anschluss an die EC50-Assays wurden die Luciferase-Konzentrationen in den mit Arzneistoff behandelten Proben als Prozentsätze der in den (als 100% definierten) unbehandelten Kontrollen vorhandenen ausgedrückt. EC50-Werte wurden durch nichtlineare Regressionsanalyse replizierter Datasets mithilfe des Softwareprogramms XLfit 4 (IDBS, Emeryville, Kalifornien) berechnet.
  • Berechnung antiviraler Synergien und Antagonismen
  • Im Anschluss an die Kombinations-Assays wurden die Luciferase-Konzentrationen in den mit Arzneistoff behandelten Proben als Prozentsätze der in den (als 100% definierten) unbehandelten Kontrollen vorhandenen ausgedrückt. Replizierte Datensätze wurden dann mithilfe des von Prichard und Shipman entwickelten Programms MacSynergy II analysiert. Das Softwareprogramm (MacSynergyTM II, University of Michigan) berechnet die theoretische Inhibition unter Annahme einer additiven Interaktion zwischen Arzneistoffen (auf Basis des Bliss-Independence-Modells) und quantifiziert statistisch signifikante Differenzen zwischen den theoretischen und den beobachteten Inhibitionswerten. Die dreidimensionale grafische Darstellung dieser Differenzen resultiert in einer Oberfläche, bei der Erhebungen in der Z-Ebene antivirale Synergien zwischen den Verbindungen und Vertiefungen antivirale Antagonismen zwischen ihnen darstellen. Die berechneten Volumina der Oberflächenabweichungen werden in nM2% ausgedrückt. Nach Prichard und Shipman werden Kombinationseffekte wie folgt definiert:
    • • Hohe Synergie bei Volumina > 100 nM2; diese Quantität von Synergie ist wahrscheinlich in vivo wichtig
    • • Mäßige Synergie bei Volumina > 50 nM2 und ≤ 100 nM2; diese Quantität von Synergie ist wahrscheinlich in vivo wichtig
    • • Geringe Synergie bei Volumina > 25 und < 50 nM2
    • • Additivität bei Volumina > –25 nM2 und ≤ 25 nM2
    • • Geringer Antagonismus bei Volumina < –25 und > –50 nM2
    • • Mäßiger Antagonismus bei Volumina > –100 nM2 und ≤ –50 nM2; diese Quantität von Antagonismus ist wahrscheinlich in vivo wichtig
    • • Hoher Antagonismus bei Volumina < –100 nM2; diese Quantität von Antagonismus ist wahrscheinlich in vivo wichtig
  • Ergebnisse
  • Antivirale Wirkung einzelner Verbindungen in Huh-luc Replikonzellen.
  • Vor der Einleitung von Kombinationsexperimenten wurde die antivirale Wirkung einzelner Verbindungen bei Huh-luc Replikon-Zellen bestimmt. Bei allen sieben Verbindungen wurden EC50-Werte beobachtet, die mit den Werten in der Vergangenheit übereinstimmten. Tabelle XI Individuelle EC50-Werte von Anti-HCV-Verbindungen in Huh-luc Replikonzellen
    Verbindung EC50 (nM)a
    IFN-αb 0,05 E/ml ± 0,04
    Ribavirin > 12 ± 2,4
    Verbindung 1 0,96 ± 0,39
    Verbindung 2 5,0 ± 0,0
    Verbindung 3 3,0 ± 1,2
    Verbindung 6 0,0018 ± 0,0007
    Verbindung 7 1245 ± 341
    a EC50 zeigt das arithmetische Mittel der ± Standardabweichung bei drei oder mehr unabhängigen Experimenten an.
    b IFN-α EC50 wird nicht in einer nanomolaren Konzentration sondern in Einheiten (E, Units) pro Milliliter (ml) ausgedrückt.
  • Antivirale Wirkung und Wechselwirkungen von Kombinationen
  • Die antivirale Wirkung von Verbindung 6 in Kombination mit anderen HCV-Hemmern wurde unter Anwendung des HCV 1b Replikonsystems beurteilt. Die Ergebnisdaten wurden mithilfe von MacSynergy II analysiert, welches grafische Oberflächendarstellungen liefert, die signifikante Abweichungen von der Additivität anzeigen. Die Quantifizierung statistisch signifikanter Abweichungen von der Additivität aus zwei voneinander unabhängigen Experimenten ist in Tabelle XII zusammengefasst. Kombinationen von Verbindung 6 mit IFN-α oder Verbindung 1 resultierten in Synergievolumina von 32 bzw. 34 nM2 und kennzeichnen damit eine geringe Synergie. Ribavirin, Verbindung 2 und Verbindung 7 ergaben bei Kombination mit Verbindung 6 Synergievolumina von 61, 52 bzw. 51, was auf eine mäßige synergistische Interaktion zwischen Verbindung 6 und diesen drei HCV-Hemmern hinweist. Die Kombination aus Verbindung 6 mit Verbindung 3 resultierte in einem Synergievolumen von 132 nM2% und kennzeichnet damit eine stark synergistische antivirale Interaktion.
  • Keine der Verbindungen ergab bei Kombination mit Verbindung 6 außerhalb des additiven Bereichs (> –25 nM) liegende antivirale Antagonismusvolumina. Tabelle XII Quantifizierung antiviraler Synergien, Antagonismen und Arzneistoff-Interaktionen für Arzneistoff-Kombinationen mit Verbindung 6
    In Kombination mit Verbindung 6 verwendete(s) Arzneimittel Synergievolumen (nM2)a Antagonismusvolumen (nM2)a Interaktion
    IFN-α 32 ± 1,4 0,0 ± 0,0 Geringe Synergie
    Ribavirin 61 ± 0,5 –0,5 ± 0,1 Mäßige Synergie
    Verbindung 1 34 ± 9,9 –17 ± 0,7 Geringe Synergie
    Verbindung 2 52 ± 5,1 –0,7 ± 0,7 Mäßige Synergie
    Verbindung 3 132 ± 44 –0,1 ± 0,2 Hohe Synergie
    Verbindung 7 51 ± 7,8 –0,2 ± 0,1 Mäßige Synergie
    a Werte stellen das arithmetische Mittel der ± Standardabweichung von zwei voneinander unabhängigen und dreifach durchgeführten Experimenten dar.
  • Prozentzahlen der Zellviabilität von Verbindung 6 in Kombination mit anderen HCV-Hemmern
  • Um zu gewährleisten, dass die Ergebnisse antiviraler Kombinationen nicht durch Kombinations-Zytotoxizität verzerrt werden, wurde die Zytotoxizität parallel unter Verwendung der gleichen Verbindungskonzentrationen untersucht, wie sie in den antiviralen Assays getestet wurden (Tabelle XIII). Bei allen Verbindungen betrug die Zellviabilität von Kombinationen mit den höchsten getesteten Konzentrationen mindestens 98% der unbehandelten Kontrollgruppen. Daher wurde bei der Erprobung von Verbindung 6 allein oder in Kombination mit diesen Wirkstoffen keine In-vitro-Zytotoxizität beobachtet. Tabelle XIII Prozentzahlen der Zellviabilität von Verbindung 6, Kombinationen bei Huh-luc Replikonzellen
    Verbindungen Konzentration(en) (nM) Zellviabilität%a
    Verbindung 6 0,014 99 ± 1
    Verbindung 6 + IFN-αb 0,014 + 0,8 102 ± 3
    Verbindung 6 + Ribavirin 0,014 + 8000 105 ± 4
    Verbindung 6 + Verbindung 1 0,014 + 4,0 99 ± 3
    Verbindung 6 + Verbindung 2 0,014 + 24,0 103 ± 3
    Verbindung 6 + Verbindung 3 0,014 + 12,8 104 ± 4
    Verbindung 6 + Verbindung 7 0,014 + 8800 103 ± 3
    a Prozentzahl der Zellviabilität stellt das arithmetische Mittel der ± Standardabweichung von mindestens zwei voneinander unabhängigen und dreifach durchgeführten Experimenten dar.
    b IFN-α wird nicht in einer nanomolaren Konzentration sondern in Einheiten (E, Units) pro Milliliter (ml) ausgedrückt.
  • Schlussfolgerungen
  • Ergebnisse dieser In-vitro-Experimente lassen erkennen, dass Verbindung 6 bei einer Kombination mit IFN-α oder dem nicht-nukleosiden NS5B Polymerase-Hemmer Verbindung 1 eine geringe antivirale Synergie aufweist. Kombinationen von Verbindung 6 mit Ribavirin, dem NS3 Protease-Hemmer Verbindung 2 oder dem nukleosiden NS5B Polymerase-Hemmer Verbindung 7 resultierten in einer mäßigen antiviralen Synergie. Eine hohe antivirale Synergie wurde zwischen Verbindung 6 und dem NS3 Protease-Hemmer Verbindung 3 beobachtet. Bei der Erprobung dieser Arzneistoffkombinationen wurde keine signifikante In-vitro-Zytotoxizität festgestellt. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass Verbindung 6 nach vernünftigen Maßstäben mit dem gegenwärtigen Therapiestandard kombiniert werden könnte.
  • Biologisches Beispiel 6: Verbindungen
  • Verbindung 1, Verbindung 3, Verbindung 4 und Verbindung 6 wurden bei Gilead Sciences (Foster City, Kalifornien) synthetisch hergestellt.
  • Zelllinien
  • Replikon-Zellen des HCV-Genotyps 1b (Huh-luc) wurden bei Reblikon (Mainz, Deutschland) bezogen. Das Replikon in diesen Zellen wird als 1389luc-ubi-neo/NS3-37ET bezeichnet und verschlüsselt einen Resistenz-Selektionsmarker (Neomycin-Phosphotransferase) wie auch das Reporter-Gen der Firefly-Luciferase.
  • Huh-luc-Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium GlutaMax (DMEM, von Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien), ergänzt durch 10% Fetal Bovine Serum (FBS, von Hyclone, Logan, Utah), 1 × Penecillin/Streptomycin, 1 × nicht-essentiellen Aminosäuren und 0,5 mg/ml G-418 (alle von Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien) gehalten. Zellen wurden zweimal wöchentlich passagiert und auf subkonfluentem Niveau gehalten.
  • Assays
  • Die Bestimmung der Verbindungskonzentration machte die Suppression von Replikon RNA mit 1–1,5log über 6 Tage der Behandlung erforderlich.
  • Replikon-Zellen des Genotyps 1b wurden in Zellkulturflaschen T-75 mit einer Zelldichte von 2,5 × 105 Zellen/Flasche ohne G418 gesät. Die Verbindungen wurden den Zellen individuell in variablen Konzentrationen beigegeben: Verbindung 6 wurde in Konzentrationen von 1 pM, 2 pM, 4 pM, 6 pM, 8 pM oder 12 pM beigegeben, Verbindung 4 mit 125 nM, 250 nM, 375 nM, 500 nM oder 1000 nM, Verbindung 1 mit 1,25 nM, 2,5 nM, 5 nM, 2,75 nM oder 10 nM, und Verbindung 3 in Konzentrationen von 3,75 nM, 7,5 nM, 11,25 nM, 15 nM, 30 nM oder 60 nM. Die Flaschen wurden bei 37°C inkubiert, Nährlösungen und Verbindungen wurden alle zwei Tage aufgefrischt. Nach 6 Tagen Inkubation wurden die Replikon-Zellen zur RNA-Extraktion und Replikon RNA QRT-PCR-Analyse gesammelt.
  • Verbindungskombination Replikon Heilungs-Assay
  • Replikon-Zellen des Genotyps 1b wurden in Zellkulturflaschen T-75 mit einer Zelldichte von 2,5 × 105 Zellen/Flasche gesät. Den Flaschen T-75 wurden Verbindungen in folgenden Konzentrationen beigegeben: Verbindung 6 mit 4 pM, Verbindung 4 mit 1000 nM, Verbindung 1 mit 10 nM und Verbindung 3 mit 26,25 nM. Die Flaschen wurden bei 37°C inkubiert, Nährlösungen und Verbindungen wurden alle zwei Tage aufgefrischt. Alle Experimente wurden im Doppel durchgeführt und werden nachfolgend als Flasche 1 und Flasche 2 bezeichnet. An Tag 6 wurden alle Zellen aus Flasche 1 zur RNA-Extraktion gesammelt, gefolgt von einer HCV-Replikon-spezifischen QRT-PCR-Analyse; die Zellen aus Flasche 2 wurden auf 10 cm Gewebekulturgefäße bei Vorhandensein von G418 für 14 Tage umgetischt, um die Koloniebildung ungeheilter Replikon-Zellen aufzuzeichnen.
  • QRT-PCR-Assay
  • Die Gesamt-RNA wurde mithilfe des RiboPure-Kits (AM1924 Life Technologies Corporation Carlsbad, Kalifornien) gemäß Herstellerprotokoll extrahiert. Die extrahierten RNA-Proben wurden bis zur Verwendung bei –80°C gelagert. Für den quantitativen RT-PCR-Assay wurde der Qiagen One-step QRT-PCR-Kit gemäß Herstellerprotokoll (Qiagen, Valencia, Kalifornien) eingesetzt. Die HCV NS3 genspezifischen Primer des Genotyps 1b, Vorwärtsprimer NS3_180FL 5'-CGGCGGACTGTCTATCATGGTGC[FAM]G-'3 (SEQ ID NR: 1) und Rückwärtsprimer NS3_180 5'-GGTCCTGGTCCACATTGGTGT-'3 (SEQ ID NR: 2) sowie der endogene Control-Primer-Set 18S rRNA LUXTM [FAM] (115HM-01) wurden von Invitrogen Corporation (Carlsbad, Kalifornien) hergestellt.
  • Für den Schritt der Umkehrtranskriptase wurden die Reaktionen 30 Min. bei 44°C inkubiert, das Umkehrtranskriptase-Enzym wurde dann durch eine 10-minütige Erwärmung der Probe auf 94°C abgebaut. Der Q-PCR-Schritt umfasste 38 Zyklen von je 15 s bei 94°C und von je 30 s bei 58°C.
  • Ergebnisse
  • Vor der Einleitung der Heilungsexperimente von Kombinations-Replikon wurde für Verbindung 6, Verbindung 4, Verbindung 1 und Verbindung 3 die zur Suppression von Replikon-RNA des Genotyps 1b um 1–1,5log erforderliche Verbindungskonzentration bestimmt. Der Replikon RNA-Logarithmus-Abfall steht im Verhältnis zu den RNA-Konzentrationen in DMSO-kontrollbehandelten Replikon-Zellen, die über 6 Tage konstant gehalten wurden. Tabelle XIV Individuelle Verbindungsdosis, die in 6-Tage-Assay bei Replikon RNA einen Logarithmus-Abfall von 1–1,5 herbeiführen kann.
    Verbindung Replikon RNA Logarithmis-Abfall Konzentration d. Verbindung (nM)
    Verbindung 1 –1,0 10
    Verbindung 3 –0,9 26,25
    Verbindung 4 –1,2 1000
    Verbindung 6 –1,4 0,004
    Kombination Genotyp 1b Replikon Heilungs-Assay
  • Die Replikon RNA-Suppression durch die Verbindungen Verbindung 6, Verbindung 4, Verbindung 1 und Verbindung 3 wurde in einem 6-tägigen Assay als Einzelverbindungen und in verschiedenen Doppel-, Dreifach- und Vierfachkombinationen bestimmt. Der Replikon RNA-Logarithmus-Abfall steht im Verhältnis zu den RNA-Konzentrationen in DMSO-kontrollbehandelten Replikon-Zellen, die über 6 Tage neben den Behandlungsflaschen konstant gehalten wurden. Die Fähigkeit der verschiedenen Verbindungskombinationen, die Zellen aus dem HCV-Replikon zu heilen, wurde durch Koloniebildung bestimmt. Die Koloniebildung trat ein, nachdem die Behandlung mit der Verbindung eingestellt und G418-Druck über 14 Tage wiederhergestellt wurde. Wenn eine Verbindungskombination die Zellpopulation vollständig vom HCV-Replikon heilt, entwickeln sich keine Kolonien, da den Zellen die Resistenz gegen G418 fehlt. Tabelle XV Quantifizierung der Berbindungskombination im Replikon Heilungs-Assay
    Verbindungen Replikon RNA Logarithmus-Abfall Anzahl ungeheilter Kolonien
    Verbindung 6 –1,4 634
    Verbindung 4 –1,2 1054
    Verbindung 1 –1,0 657
    Verbindung 3 –0,9 989
    Verbindung 4 + Verbindung 6 –2,67 15
    Verbindung 1 + Verbindung 4 –2,022 14
    Verbindung 3 + Verbindung 4 –2,26 23
    Verbindung 1 + Verbindung 6 –2,3 148
    Verbindung 3 + Verbindung 6 –2,62 13
    Verbindung 1 + Verbindung 3 –1,8 113
    Verbindung 1 + Verbindung 4 + Verbindung 6 –2,66 0
    Verbindung 3 + Verbindung 4 + Verbindung 6 –2,71 0
    Verbindung 1 + Verbindung 3 + Verbindung 4 –2,69 0
    Verbindung 1 + Verbindung 3 + Verbindung 6 –2,69 0
    Verbindung 1 + Verbindung 3 + Verbindung 4 + Verbindung 6 –2,71 0
    DMSO (0,2% zur Entsprechung der Vierfach-Kombination) 0 6330
  • Schlussfolgerungen
  • Die Ergebnisse dieser In-vitro-Experimente lassen den Schluss zu, dass eine Kombination aus zwei Verbindungen den viralen RNA-Logarithmus-Abfall über eine 6-tägige Behandlung steigert und die Rate geheilter Replikon-Zellen erhöht. Die Doppelkombinationen aus Verbindung 6 mit Verbindung 4 oder Verbindung 3 resultieren im Vergleich zu allen anderen Doppelverbindungskombinationen in einer stärkeren Replikon RNA-Logarithmus-Suppression und der niedrigsten Anzahl ungeheilter Kolonien. Die Kombination aus drei oder vier Verbindungen heilt alle Replikon-Zellen, während die Kombinationsbehandlungen die Replikon RNA-Konzentrationen auf die Detektionsgrenze des Assays unterdrücken.
  • Biologisches Beispiel 7: Kreuzresistenz zwischen Verbindung 10 und Verbindung 6
  • Diese Studie wurde durchgeführt, um die In-vitro-Kreuzresistenzprofile von Verbindung 10 und Verbindung 6 zu bestimmen. Eine Platte mit HCV Mutant-Replikonen, welche die charakteristische NS5B Nukleosid HCV-Arzneistoffresistenzmutation S282T oder die häufigsten In-vitro- und In-vivo-NS5A HCV-Arzneistoffresistenzmutationen aufweist, wurde über einen transienten Replikon-Assay untersucht, um festzustellen, ob zwischen den Mutationen, die auf Verbindung 10 oder Verbindung 6 eine reduzierte Suszeptibilität übertragen, eine Kreuzresistenz besteht.
  • Zwischen diesen Verbindungen wurde keine Kreuzresistenz beobachtet, wobei die Mutant-Replikonen S282T gegenüber Verbindung 6 vollständig empfindlich blieben und die NS5A-Mutanten gegenüber Verbindung 10 keine reduzierte Suszeptibilität aufwiesen.
  • Material und Methoden
  • Reagenzien Verbindungen
  • Verbindung 6 und Verbindung 10 wurden bei Gilead Sciences in Foster City, Kalifornien, synthetisch hergestellt.
  • Zelllinien
  • Huh-lunet, ein Huh-7-Klon, welcher HCV-Replikation in hohem Maß zulässt, wurde bei ReBLikon GmbH (Mainz, Deutschland) bezogen. Huh-lunet-Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, von GIBCO, Carlsbad, Kalifornien), ergänzt durch 10% Fetal Bovine Serum (FBS, von Hyclone, Logan, Utah) gehalten. Die Zellen wurden bei 37°C in befeuchteten Inkubatoren (85% Luftfeuchte) und unter einer Atmosphäre mit 5% CO2 gehalten.
  • PI-hRluc, ein bicistronisches Replikon, welches das Renilla Luciferase-Gen nachgelagert vom Polio IRES-Gen und die nichtstrukturierten HCV-Gene (NS3 – NS5B) des Genotyps 1b (Con-1 Stamm) nachgelagert von EMCV IRES kodiert, wurde für transiente Transfektionsstudien verwendet. Das Plasmid pPI-hRluc wurde aus dem Plasmid pFKI341 PI-Luc/NS3-37ET generiert, welches ein subgenomisches Replikon des Genotyps 1b (Con-1 Stamm) kodiert, es wurde bei ReBLikon bezogen (Friebe et al., J Virol 2001; 75 (24): 12047–57). Das hRluc-Gen wurde aus pF9 CMV hRluc-neo Flexi(R) (Promega, Madison, Wisconsin) PCR-amplifiziert, wobei für PCR Accuprime Super Mix I (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien) und die Primer PV_Rluc_Top und 3'-Rluc(NotI) für PCR verwendet wurde. Diese beiden Primer weisen folgende Sequenzen auf und tragen Restriktionsstellen für das anschließende Klonieren: PV_Rluc_Top: 5' ATC AGA CAA TTG TAT CAT AAT GGC TTC CAA GGT GTA CG 3' (SEQ ID NR: 3); 3'-Rluc(NotI): 5' ACG TCA CTA TCT ACG CGG CCG CTT ACT GCT CGT TCT TC3' (NotI-Site unterstrichen) (SEQ ID NR: 4). Der T7-Promoter, 5'UTR und Poliovirus IRES wurden aus dem Plasmid pFKI341 PI-Luc/NS3-37ET unter Verwendung von 5'-P7(SbfI) und PV_Rluc_Bottom PCR-amplifiziert. Diese beiden Primer weisen folgende Sequenzen auf und tragen Restriktionsstellen für das anschließende Klonieren: 5'-P7(SbfI): 5' CAA GCT AAG CTG OCT GCA GG T3' (SbfI-Site unterstrichen) (SEQ ID NR: 5); PV_Rluc_Bottom: 5' CGT ACA OCT TGG AAG CCA TTA TGA TAC AAT TGT CTG AT (SEQ ID NR: 6). Die nachfolgenden PCR-Fragmente aus den beiden obigen Reaktionen wurden dann mithilfe überlappender PCR sowie der Primer 5'-P7(SbfI) und 3'-Rluc(NotI) zusammengefügt. Das fertiggestellte P7-5'UTR-Poliovirus IRES-hRluc Amplifizierungsprodukt wurde zu pCR2.1-TOPO subkloniert. Das entstandene Plasmid wurde mit SbfI und NotI aufgeschlossen und das exzidierte Fragment (P7-5'UTR-Poliovirus IRES-hRluc) mithilfe von T4 DNA-Ligase in mit den gleichen Enzymen aufgeschlossenes pFKI341 PI-Luc/NS3-37ET ligiert. Der daraus entstandene Vektor pPI-hRluc wurde zur Sicherstellung der korrekten Ausrichtung und Sequenz der P75'UTR-Poliovirus IRES-hRluc Region des Plasmids sequenziert.
  • Die hRluc enthaltenden GT1a und 2a Replikone wurden bereits früher beschrieben (Robinson M, Yang H, Sun SC, Peng B, Tian Y, Pagratis N, et al. Novel HCV Reporter Replicon Cell Lines Enable Efficient Antiviral Screening against Genotype 1a. Antimicrob Agents Chemother 2010.) Das PI-hRluc Replikon wurde als Hauptstrang für den Chimärenaufbau verwendet. In NS5B wurde eine interne Deletion vorgenommen, die zur Replikationsdefizienz führte. Die letzten 413 Basenpaare von 1b-con-1 NS5A (welche mindestens 137 NS5A-Aminosäuren kodieren) wurden auf der Platte mit NS5B-Sequenzen aus den Genotypen 2b, 3a, 4a, 5a und 6a (Genscript Inc. Piscataway, New Jersey) hergestellt. Für jeden dieser Genotypen wurden NS5B-Consensussequenzen durch Ausrichtung der in der europäischen HCV-Datenbank hinterlegten Sequenzen und Extraktion eines Consensus abgeleitet. Diese neuartigen Consensussequenzen für NS5B wie auch die aus den individuellen klinischen Isolaten abgeleiteten Sequenzen (Herlihy et al., Antimicrob Agents Chemother 2008; 52 (10): 3523–31) wurden für den Aufbau der chimären NS56-Replikonen verwendet. Für das direktionale Klonieren in den 1b-hRLuc/NeoR NS5B-Vektor über Standardmethoden der Molekularbiologie wurden am 5'-Ende eine eindeutige XhoI-Site und am 3'-Ende eine eindeutige Asel-Site verwendet.
  • Mithilfe des nach Anweisungen des Herstellers (Stratagene, La Jolla, Kalifornien) verwendeten Mutagenese-Kits QuikChange II XL wurden Replikon-Plasmide in NS5B S282T-Mutationen eingeführt. Das gesamte mutierte Replikon wurde sequenziert, um sich vom Vorhandensein der S282T-Mutation und dem Fehlen sekundärer Site-Mutationen zu vergewissern.
  • Mutante NS5A-Replikonen wurden durch Synthetisieren einer Sequenz erzeugt, in welcher die ersten 149 Aminosäuren von NS5A kodiert wurden, die die gewünschte Mutation enthielten, flankiert von einer 5' und 3' BsrGl- bzw. EcoRI-Site (Genscript, Piscataway, New Jersey). Synthetisierte Fragmente wurden dann nach Standardmethoden der Molekularbiologie zu einem 1a Rluc Replikon-Plasmid kloniert, welches modifiziert wurde, um das Klonieren in eindeutige BsrGI- und EcoRI-Restriktionsstellen zu ermöglichen. Mutationen wurden durch DNA-Sequenzierung abgesichert.
  • Replikone wurden unter Verwendung folgender Enzyme linearisiert. SpeI (1b PI-Rluc-basierte Replikone), HpaI (1a-Rluc-basierte Replikone) und XbaI/HpaI (2a Rluc Replikon). Replikon RNAs wurden in vitro aus Replikon-kodierenden Plasmiden mithilfe eines T7 Ribomax in vitro Transcription Kit (Promega; Madison, Wisconsin) transkribiert, gefolgt durch eine Aufreinigung mithilfe einer RNAeasy-Säule (Qiagen, Valencia, Kalifornien).
  • Assays
  • Bestimmung von Arzneimittelsuszeptibilität unter Verwendung von Replikon-Assays transienter Transfektionen
  • RNA wurde nach einer Methode von Lohmann et al. (Lohmann et al., Science 1999; 285 (5424): 110–3) in Huh-lunet-Zellen transfiziert. Zellen wurden kurz trypsiniert und zweimal mit PBS gewaschen. Eine Suspension von 4 × 106 Zellen in 400 μl PBS wurde mit 5 μg RNA und bei Einstellungen von 960 μF und 270 V einer Elektroporation unterzogen. Die Zellen wurden in 40 ml vorgewärmte Nährlösung übertragen und dann in 96-Loch- oder 384-Loch-Titerplatten gesät.
  • Die Verbindungen wurden in 100% DMSO seriell dilutiert und den Zellen beigegeben, so dass eine abschließende DMO-Konzentration von 0,5% erzielt wurde. Die Zellen wurden drei Tage lang behandelt, anschließend die Nährlösung entfernt, die Zellen lysiniert und die Aktivität der Renilla-Luciferase mit handelsüblichen Reagenzien (Promega) und einem Victor- oder Envision-Instrument (Perkin Elmer, Waltham, Massachusetts) quantifiziert.
  • Datenanalyse
  • Daten wurden in Prozentzahlen im Verhältnis zu (als 100% definierten) unbehandelten Kontrollgrößen umgewandelt, während die EC50-Werte durch nichtlineare Regression von zwei replizierten Datasets mithilfe des Softwareprogramms GraphPad Prism oder Pipeline Pilot umgewandelt wurden. Fold Changes der Resistenz wurden als Verhältnis von mutantem Replikon- zum Wild-Typ EC50-Wert berechnet.
  • Ergebnisse
  • Aktivität von Verbindung 10 und Verbindung 6 gegen S282T
  • Bei früheren In-vitro-Resistenzselektionen mit Verbindung 10 wurde S282T in NS5B durchgängig als primäre Mutation in mehreren Genotypen (GT1b, 1a und 2a) bestimmt. Die NS5B S282T-Mutation wurde anschließend in die Replikone und chimären Replikone von voller Länge des Genotyps 1a, 1b und 2a eingeführt, die eine in einen GT1b-Hauptstrang klonierte 2b, 3a, oder 4a NS5B-Sequenz enthielten. Die Suszeptibilität gegenüber Verbindung 10, Verbindung 6 und Ribavirin (RBV) wurde mithilfe eines transienten Replikations-Assays beurteilt. Die Mutation S282T wies eine verminderte Suszeptibilität gegenüber Verbindung 10 auf, wobei die EC50-Werte bei allen fünf Genotypen von 117,1 nM bis 346,1 nM reichten. Der Steigerungsfaktor von EC50 bei S282T lag im Vergleich zum Wild-Typ der entsprechenden Genotypen im Bereich von 2,4 bis 16,0 und belegte damit eine verringerte Replikon-Suszeptibilität gegenüber Verbindung 10 bei Vorhandensein der NS5B S282T-Mutation.
  • Beim Wild-Typ-Replikon waren die EC50-Werte von RBV bei den 5 getesteten Genotypen ebenfalls ähnlich, wobei der niedrigste EC50-Wert bei GT2b verzeichnet wurde. Interessanterweise wiesen die EC50-Werte von S282T-Replikonen bei allen 5 Genotypen für die Behandlung mit RBV 5 eine 5- bis 10-fach höhere Empfindlichkeit auf als ihre entsprechenden Wild-Typen. Bei den EC50-Werten von Verbindung 6 wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen dem Wild-Typ und den S282T-Replikonen beobachtet, was den Schluss zulässt, dass diese Mutation keine Veränderung der Suszeptibilität gegen Verbindung 6 hervorruft. Abschließend kann gesagt werden, dass, wiewohl das S282T-Replikon eine verminderte Suszeptibilität gegen Verbindung 10 übertrug, das mutante Replikon gegenüber Verbindung 6 Wild-Typ-Sensibilität und eine im Vergleich zum Wild-Typ gesteigerte Sensibilität gegen Hemmung durch RBV aufwies. Tabelle 7.1. Antivirale Wirkung von Verbindung 10 und RBV gegen Wild-Typ und S282T-Mutant von GT1b, 2a, 2b, 3a und 4a
    Figure DE202012013382U1_0082
    a EC50 zeigt Durchschnittswerte von zwei oder mehr voneinander unabhängigen Experimenten an.
    b Fold Change gegenüber entsprechendem Wild-Typ
  • Wirksamkeit von Verbindung 10 und Verbindung 6 gegen NS5A-Mutanten
  • Um zu bestimmen, ob Mutationen von NS5A-Arzneistoffresistenzen eine Kreuzresistenz zu Verbindung 10 aufweisen, wurde eine Platte mutanter NS5A-Replikone auf Suszeptibilität gegen Verbindung 6 wie auch gegen Verbindung 10 untersucht. Alle sieben NS5A-Mutanten wiesen eine verringerte Suszeptibilität gegenüber Verbindung 6 auf, bei einem 25- bis 3029-fachen Anstieg des EC50-Werts. Im Gegensatz dazu wurde bei den NS5A-Mutanten gegenüber Verbindung 10 oder einer RBV-Kontrollgruppe keine signifikante Verschiebung der EC50-Werte verzeichnet. Tabelle 7.2 In-vitro-Aktivität von Verbindung 10 oder Verbindung 6 gegenüber NS5A-Mutanten bei Genotyp 1a
    Verbindung Verschiebungsfaktor bei EC50 (DRM EC50/1α-H77 EC50)
    M28T Q30H Q30R Q30E L31M Y93C Y93H
    Verbindung 6 25 73 170 997 140 327 3029
    Verbindung 10 0,9 1,0 0,8 1,0 1,1 ND 0,7
    RBV 0,4 0,7 0,8 0,8 0,5 1,0
  • Schlussfolgerungen
  • In diesem Beispiel wurden die Kreuzresistenzprofile von Verbindung 10 und Verbindung 6 mithilfe transienter HCV-Replikone bewertet, welche bekannte Resistenzmutationen bei NS5A und NS5B kodierten und eine verringerte Suszeptibilität zu Verbindung 6 bzw. Verbindung 10 mit sich brachten. NS5B S282T-Replikone übertrugen eine verringerte Suszeptibilität gegen Verbindung 10, während bei den EC50-Werten von Verbindung 6, gemessen aus den-Wild-Typ- und S282T-Replikonen, keine signifikanten Unterschiede festgestellt wurden.
  • Umgekehrt behielten Mutationen, die eine verringerte Suszeptibilität gegen Verbindung 6 übertrugen, die Sensibilität gegenüber der Behandlung mit Verbindung 10.
  • Insgesamt weisen die Ergebnisse darauf hin, dass Resistenz-Mutationen bei Verbindung 10 und Verbindung 6 kein Nachweis für eine Kreuzresistenz sind und die Verwendung dieser Verbindungen in zukünftigen Kombinationstherapien zur Behandlung von HCV unterstützen.
  • Biologisches Beispiel 8: Kombinationsaktivität
  • Kombinationsstudiendaten von Verbindung 10 mit dem NS5A-Hemmer Verbindung 6, den nicht-nukleosidischen Hemmern Verbindung 1 oder Verbindung 5, dem Protease-Hemmer Verbindung 3, oder mit Ribavirin (RBV) sind für ein In-vitro-Replikon Assay dargestellt, welches Standard für die Beurteilung der zellbasierten antiviralen Aktivität von HCV-Hemmern bleibt. Diese Ergebnisse lassen erkennen, dass Verbindung 10 bei einer Kombination mit Verbindung 6, Verbindung 1, Verbindung 5 oder Verbindung 3 additive antivirale Wirkung aufweist. Daneben zeigte Verbindung 10 in Kombination mit RBV in vitro eine geringe Synergie.
  • Material und Methoden
  • Zelllinie und Zellkultur
  • Die in dieser Studie verwendete Replikon-Zelllinie vom HCV-Genotyp 1a wurde bereits früher beschrieben (Robinson M, Yang H, Sun SC, Peng B, Tian Y, Pagratis N, et al. Novel HCV Reporter Replicon Cell Lines Enable Efficient Antiviral Screening against Genotype 1a. Antimicrob Agents Chemother 2010). Die Zellen wurden in einer Zellkultur-Nährlösung kultiviert, welche Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit GlutaMAX (Gibco, Carlsbad, Kalifornien, Kat.-Nr. 10569-044) enthielt, ergänzt durch 10% FBS (HyClone, Logan, Utah, Kat.-Nr. SH30071.03), 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin (Gibco, Carlsbad, Kalifornien, Kat.-Nr. 15140-122) und 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren (Gibco, Carlsbad, Kalifornien, Kat.-Nr. 11140-050). Zur Vorbeugung gegen den Verlust von HCV-Replikon wurden Replikonzellen in 0,5 mg/ml Geneticin (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, Kat.-Nr. 10131-035) gehalten. Die Zellen wurden alle 3–4 Tage passagiert, bis sie Konfluenz erreichten.
  • HCV-Replikon-Assay für EC50-, CC50-Bestimmungen und Kombinationsstudien
  • Alle Verbindungen wurden in 100% DMSO geliefert. Serielle Verdünnungen der Verbindungen wurden in 100% DMSO vorgenommen. Alle seriellen Verdünnungen wurden auf 384-Loch-Polypropylenplatten (Thermo Scientific, Hudson, New Hampshire, Kat.-Nr. 4341) unter Einsatz einer Biomek FX Workstation vorgenommen. Für EC50- und CC50-Bestimmungen wurden Testverbindungen in zehn Schritten von Verdünnungen 1:3 in Säulen 3–20 der 384-Loch-Titerplatten seriell verdünnt. Für Kombinationsstudien wurde eine Verbindung in neun Schritten von Verdünnungen 1:2 in horizontale Richtung seriell verdünnt, während die andere Verbindung in sieben Schritten von Verdünnungen 1:2 in vertikale Richtung seriell verdünnt wurde. Auf diese Weise wurde eine festgelegte Gruppe verschiedener Arzneistoffkonzentrationen und -verhältnisse erzielt.
  • Für jeden einzelnen Arzneistoff wurde der EC50-Wert als Mittelwert des getesteten Konzentrationsbereichs gewählt. Alle seriellen Verdünnungen wurden in vier Replikaten pro Verbindung innerhalb derselben 384-Loch-Titerplatte vorgenommen. In Säule 1–2 jeder 384-Loch-Titerplatte mit serieller Verdünnung wurde 100% DMSO beigegeben. Ein HCV Protease-Hemmer ITMN-191 wurde mit 100 nM Säule 23 als Kontrolle von 100% Hemmung der HCV-Replikation zugegeben, während Säule 24 Puromycin bei 10 mM als Kontrolle von 100% Zytotoxizität zugegeben wurde.
  • Jedem Loch einer schwarzen 384-Loch-Titerplatte aus Polystyrol (Greiner Bio-one, Monroe, Nort Carolina, Kat.-Nr. 781086, Zellkultur behandelt) wurde 90 μl Zellkultur-Nährlösung (ohne Geneticin), welche 2000 suspendierte HCV-Replikon-Zellen enthielt, mittels einer Biotek μFlow Workstation zugegeben. Für die Übertragung der Verbindung auf Zellkulturplatten wurde 0,4 μl Verbindungslösung von der seriellen Verdünnungsplatte der Verbindung mittels Biomek FX Workstation auf die Zellkulturplatte übertragen. Die DMSO-Konzentration in den endgültigen Assay-Löchern betrug 0,44%. Die Platten wurden 3 Tage lang bei 37°C mit 5% CO2 und 85% Luftfeuchte inkubiert.
  • Bei dem HCV-Replikon-Assay handelte es sich um ein Multiplex-Assay, mit dem sowohl die Zytotoxizität als auch die Anti-Replikon-Aktivität aus demselben Loch bestimmt werden kann. Der CC50-Assay wurde zuerst vorgenommen. Die Nährlösung in der 384-Loch-Zellkulturplatte wurde abgesaugt; die Löcher wurden vier Mal mit je 100 μl 1 × PBS unter Verwendung eines Plattenwäschers Biotek ELX405 gewaschen. Ein Volumen von 50 μl einer Lösung, welche 400 nM Calcein AM (Anaspec, Fremont, Kalifornien, Kat.-Nr. 25200-056) in 1 × PBS enthielt, wurde jedem Loch der Platte mit einer Biotek μFlow Workstation zugegeben. Die Platte wurde 30 min lang bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend das Fluoreszenzsignal (Erregung 490 nm, Emission 520 nm) mithilfe eines Perkin Elmer Envision Plate Readers gemessen.
  • Der EC50-Assay wurde in denselben Löchern wie der CC50-Assay vorgenommen. Die Calcein-PBS-Lösung in der 384-Loch-Zellkulturplatte wurde mit einem Plattenwäscher Biotek ELX405 abgesaugt. Ein Volumen von 20 μl Dual-Glo Luciferase-Puffer (Promega, Madison, Wisconsin, Kat.-Nr. E298B) wurde jedem Loch der Platte mittels einer Biotek μFlow Workstation zugegeben. Die Platte wurde 10 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Ein Volumen von 20 μl einer Lösung, welche eine Mischung aus Dual-Glo Stop & Glo Substrat (Promega, Madison, Wisconsin, Kat.-Nr. E313B) und Dual-Glo Stop & Glo Puffer (Promega, Madison, Wisconsin, Kat.-Nr. E314B) im Verhältnis 1:100 enthielt, wurde dann jedem Loch der Platte mittels Biotek μFlow Workstation zugegeben. Die Platte wurde 10 min lang bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend das Lumineszenzsignal mithilfe eines Perkin Elmer Envision Plate Readers gemessen.
  • Datenanalyse
  • Der Zytotoxizitätseffekt wurde durch Calcein AM-Umwandlung in ein fluoreszierendes Produkt bestimmt. Der Prozentanteil der Zytotoxizität wurde nach Gleichung 1 berechnet:
    Figure DE202012013382U1_0083
    wobei Xc das Fluoreszenzsignal des mit der Verbindung behandelten Lochs ist, MB das durchschnittliche Fluoreszenzsignal der mit Puromycin behandelten Löcher, und MD das durchschnittliche Fluoreszenzsignal der DMSO-behandelten Löcher.
  • Die Anti-HCV-Replikationsaktivität wurde durch das von der Reporter-Renilla-Luciferase des HCV-Replikons generierte Lumineszenzsignal bestimmt. Die Prozentzahl der Hemmung auf das HCV-Replikon wurde mithilfe von Gleichung 1 berechnet, wobei Xc das Lumineszenzsignal des mit der Verbindung behandelten Lochs ist, MB das durchschnittliche Lumineszenzsignal der mit ITMN-191 behandelten Löcher, und MD das durchschnittliche Lumineszenzsignal der DMSO-behandelten Löcher.
  • Die CC50-Werte wurden als die Konzentration der Prüfungsverbindung bestimmt, die eine Abnahme der Zellviabilität um 50% verursachte. Die EC50-Werte wurden als die Konzentration der Prüfungsverbindung bestimmt, die eine Abnahme der HCV-Replikation um 50% verursachte. Sowohl die CC50- abs auch die EC50-Werte wurden unter Verwendung des Softwarepakets Pipeline Pilot 5.0 (Accelrys, San Diego, Kalifornien) durch nichtlineare Regressionsanpassung experimenteller Daten an Gleichung 2 ermittelt:
    Figure DE202012013382U1_0084
    wobei y die beobachtete Prozentzahl der HCV-Replikon-Hemmung bei Verbindungskonzentration x ist, d die geschätzte Reaktion bei Verbindungskonzentration Null, a die geschätzte Reaktion bei unendlicher Verbindungskonzentration, c die Konzentration im mittleren Bereich (CC50 oder EC50), und b der Hill-Steigungsfaktor.
  • Die experimentellen Daten der Kombinationsstudie wurden dann mithilfe des von Prichard und Shipman entwickelten Programms MacSynergy II (Prichard MN, Aseltine KR, Shipman C, Jr. MacSynergyTM II, Version 1.0. University of Michigan, Ann Arbor, Michigan, 1993) analysiert. Das Softwareprogramm (MacSynergyTM II, University of Michigan) berechnet die theoretische Inhibition unter Annahme einer additiven Interaktion zwischen Arzneistoffen (auf Basis des Bliss-Independence-Modells) und quantifiziert statistisch signifikante Differenzen zwischen den theoretischen und den beobachteten Inhibitionswerten. Die dreidimensionale grafische Darstellung dieser Differenzen resultiert in einer Oberfläche, bei der Erhebungen in der Z-Ebene antivirale Synergien zwischen den Verbindungen und Vertiefungen antivirale Antagonismen zwischen ihnen darstellen. Die berechneten Volumina der Oberflächenabweichungen werden in μM2% ausgedrückt. Nach Prichard und Shipman werden Kombinationseffekte wie folgt definiert:
    • Hohe Synergie: > 100 μM2%
    • Mäßige Synergie: > 50 und ≤ 100 μM2%
    • Geringe Synergie: > 25 und ≤ 50 μM2%%
    • Additivität: ≤ 25 und > –25 μM2%%
    • Geringer Antagonismus: ≤ -25 und > –50 μM2%
    • Mäßiger Antagonismus: ≤ -50 und > –100 μM2%
    • Hoher Antagonismus: ≤ –100 μM2%
  • Für jede Kombinationsstudie wurden drei voneinander unabhängige Experimente mit jeweils vier Replikaten pro Experiment durchgeführt.
  • Ergebnisse
  • Antivirale Wirkung und Zytotoxizität einzelner Verbindungen im HCV Genotyp 1a Replikon-Assay
  • Die Anti-HCV-Wirkung und Zytotoxizität von Verbindung 10 in Kombination mit anderen Anti-HCV-Verbindungen wurden in Huh-7 Zellen getestet, die ein HCV-Genotyp 1a Replikon trugen. Die EC50- und CC50-Werte aller Verbindungen sind in der Tabelle unten aufgeführt. Bei allen einzelnen Verbindungen wurde bis in die höchsten im Kombinations-Assay getesteten Konzentrationen keine signifikante Zytotoxizität beobachtet. Tabelle 8.1 EC50 und CC50-Werte der in dieser Studie verwendeten Verbindungen gegen HCV Genotyp 1a Replikon
    Verbindungen Klasse EC50 a (nM) CC50 a (nM)
    Verbindung 10 NSSB Nukleosid-Propharmakon 39 > 82446
    Verbindung 6 NS5A-Hemmer 0,032 > 44400
    Verbindung 1 NSSB Nichtnukleosid 18 > 44400
    Verbindung 5 NSSB Nichtnukleosid 14 > 44400
    Verbindung 3 NS3 Protease-Hemmer 46 > 22200
    RBV Nukleosidanalogon 33626 > 88800
    a Werte sind geometrische Mittelwerte von drei oder mehr voneinander unabhängigen Experimenten
  • Antivirale Wirkung und Zytotoxizität von Verbindung 10 in Kombination mit anderen Klassen von Anti-HCV-Wirkstoffen.
  • Die antivirale Wirkung von Verbindung 10 in Kombination mit anderen Anti-HCV-Verbindungen wurde unter Anwendung des HCV Genotyp 1a Replikons beurteilt. Die Ergebnisse wurden mithilfe von MacSynergy II analysiert, welches grafische Oberflächendarstellungen liefert, die signifikante Abweichungen von der Additivität anzeigen. Die aus Abweichungen von der additiven Oberfläche errechneten Synergie- und Antagonismusvolumina (μM2%) sind in nachstehender Tabelle zusammengefasst. Wenn Verbindung 10 mit Verbindung 6, Verbindung 1, Verbindung 5 oder Verbindung 3 kombiniert wurde, lagen bei einem Konfidenzintervall von 95% die Mittelwerte der Synergie- und Antagonismusvolumina zwischen 25 und –25 μM2% und waren somit Hinweis auf eine additive Interaktion mit Verbindung 10. Darüber hinaus zeigt Verbindung 10 bei Kombination mit RBV ein Synergievolumen im Bereich von 25 bis 50 μM2%, was auf eine geringe synergistische Interaktion schließen lässt. In Kombinationsstudien, in denen direkt wirkende antivirale Wirkstoffe mit Verbindung 10 eingesetzt wurden, lag die Zellviabilität beiden höchsten Konzentrationen der getesteten Verbindungskombinationen über 93%, während Studien, in denen die kombinierten Effekte von Verbindung 10 und RBV untersucht wurden, bei den höchsten Konzentrationen kombinierter Arzneistoffe eine Zellviabilität von mehr als 85% ergaben. Tabelle 8.2 Quantifizierung antiviraler Synergien und Antagonismen sowie von Arzneistoffinteraktionen bei Arzneistoffkombinationen mit Verbindung 10
    In Kombination mit Verbindung 10 verwendete Verbindung Klasse Synergievolumen (nM2)a Antagonismusvolumen (nM2)a Interaktion
    Verbindung 6 NS5A-Hemmer 3,3 ± 4,2 –7,7 ± 13,3 additiv
    Verbindung 1 NS5B nicht-nukleosid 4,7 ± 8,1 –11,7 ± 10,0 additiv
    Verbindung 5 NS5B nicht-nukleosid 1,3 ± 2,3 –5,7 ± 9,0 additiv
    Verbindung 3 NS3 Protease-Hemmer 1,0 ± 1,7 –3,0 ± 4,4 additiv
    RBV Nukleosidanalogen 35,3 ± 3,2 –2,0 ± 2,0 Geringe Synergie
    a Werte stellen die mittlere ± Standardabweichung von drei voneinander unabhängigen und vierfach durchgeführten Experimenten dar Tabelle 8.3 Quantifizierung von Zytotoxizität in Verbindungskombinationen
    In Kambination mit Verbindung 10 verwendete Verbildung Höchstkonzentration der mit der höchsten Konzentration (320 nM) von Verbindung 10 verwendeten Verbindung Zytotoxizität bei der Höchstkonzentration von Verbindungskombinationen (% der Hemmung von Zellwachstum)
    Verbindung 6 0,16 nM 5,0 ± 5,0
    Verbindung 1 120 nM 7,0 ± 4,6
    Verbindung 5 64 nM 4,3 ± 2,9
    Verbindung 3 240 nM 2,0 ± 3,5
    RBV 16000 nM 14,0 ± 4,4
    a Werte stellen die mittlere ± Standardabweichung von drei voneinander unabhängigen und vierfach durchgeführten Experimenten dar
  • Schlussfolgerungen
  • Die antivirale Aktivität von Verbindung 10 wurde in Kombination mit Verbindung 6, Verbindung 1, Verbindung 5, Verbindung 3 oder RBV getestet. Verbindung 10 zeigte in Kombination mit Verbindung 6, Verbindung 1, Verbindung 5 oder Verbindung 3 additive antivirale Wirkung, und mit RBV geringe Synergie.
  • Zusammengefasst ist festzuhalten, dass diese Erkenntnisse das Potenzial von Verbindung 10 zur Verwendung in Kombination mit Verbindung 6, Verbindung 1, Verbindung 5, Verbindung 3 oder RBV unterstützen, mit der eine verbesserte virale Unterdrückung erreicht werden soll, ohne die Wirksamkeit eines der einzelnen Arzneistoffe zu mindern.
  • Klinisches Beispiel 1: Klinische Erprobung der Anti-HCV-Wirkung der Kombination aus Verbindung 1 und Verbindung 2
  • Dieses klinische Beispiel belegt, dass die Kombination aus Verbindung 1 und Verbindung 2 plus Ribavirin bei der Verringerung der Belastung durch HCV-Viren und bei der Unterdrückung des Rebounds des HCV-Virus wirksamer ist als die Kombination aus Verbindung 1 und Verbindung 2 ohne Ribavirin.
  • Aufbau der klinischen Studie:
  • Eine randomisierte Open-Label-Studie der Phase 2 von Verbindung 2 plus Verbindung 1 allein und in Kombination mit Ribavirin über 28 Tage bei Behandlungs-naiven Studienteilnehmern mit chronischer HCV-Infektion des Genotyps 1. Probanden in Arm 1 erhielten Verbindung 2 mit 75 mg + Verbindung 1 mit 40 mg, beide zweimal täglich verabreicht (BID) (Doppeldosisschema), während Probanden in Arm 2 über 28 Tage Verbindung 2 mit 75 mg + Verbindung 1 mit 40 mg erhielten, beide zweimal täglich verabreicht, plus Ribavirin, ebenso zweimal täglich (BID) verabreicht (Dreifachdosisschema).
  • Am Tag 28 hatten alle Probanden PEG/Ribavirin einzuleiten. Darüber hinaus sah der Prüfplan vor, dass Probanden mit ungenügendem virologischen Ansprechen (< 2log10 IE/ml Verringerung gegenüber Baseline HCV RNA zum Tag 5) oder bei erneutem Virus-Rebound (HCV RNA-Anstieg von > 0,5log10 IE/ml vom Tiefpunkt, bestätigt über zwei nach dem Tag 5 liegende Zeitpunkte mit einem Absolutwert von > 1000 IE/ml) PEG/RIBA vor Tag 28 einleiten.
  • Bei Probanden mit ungenügendem virologischen Ansprechen wurde die Kombination aus pegy-liertem Interferon (PEG) und Ribavirin (RIBA) vor Tag 28 mit oder ohne Fortführung von Verbindung 2 + Verbindung 1 eingeleitet. Somit erhielten zum Tag 28 der Studie die Probanden eine der folgenden vier Behandlungen:
    • (i) Verbindung 2 + Verbindung 1
    • (ii) Verbindung 2 + Verbindung 1 + RIBA,
    • (iii) Verbindung 2 + Verbindung 1 + PEG/RIBA, oder
    • (iv) PEG/RIBA.
  • Insgesamt wurden 31 Probanden eingeschrieben und begannen die Dosierung (16 Probanden erhielten die Doppeldosis in Arm 1, während 15 Probanden die Dreifachdosis in Arm 2 erhielten). Die vorläufigen demographischen Daten und Baseline-Merkmale der Probanden (Tabelle XVI) waren, abgesehen von einer größeren Anzahl von Probanden mit Genotyp 1b in Arm 2, zwischen Arm 1 und Arm 2 generell vergleichbar. Vier Probanden wurden beim Screening als HCV-Genotyp 1b identifiziert (ein Proband auf Doppeldosis und 3 Probanden auf Dreifachdosis); bei weiterer Analyse konnten die Genotypen 1a oder 1b nicht bestätigt werden, wobei eine weitere Bewertung läuft.
  • Bei keinem der Probanden traten schwerwiegende unerwünschte Wirkungen auf. Die Prüfsubstanzen wurden allgemein gut toleriert, wobei sämtliche unerwünschten Wirkungen ihrer Stärke nach unter Grad 1–2 fielen, ausgenommen eine Müdigkeit nach Grad 3; Letztere war das einzige behandlungsbedingte unerwünschte Ereignis, das zum Absetzen der Prüfsubstanz führte. Vor der Einleitung von PEG/Ribavirin waren als häufigste behandlungsbedingte unerwünschte Ereignisse in Arm 1 Kopfschmerzen (n = 5) und Diarrhoe oder Übelkeit (n = je 3) zu verzeichnen, in Arm 2 Kopfschmerzen (n =7), Diarrhoe oder Müdigkeit (n = je 3), Übelkeit, Asthenie, Pruritus (Juckreiz) oder Schlaflosigkeit (n = je 2).
  • Wenn Verbindung 2 + Verbindung 1 in Kombination mit PEG/RIBA verabreicht wurden, waren als einzige bei mehreren Probanden auftretende unerwünschte Ereignisse eine grippeähnliche Erkrankung (n = 5) und Myalgie (Rheumatismus) (n = 3) zu verzeichnen, beides häufige unerwünschte Ereignisse bei PEG/RIBA-Therapie. Was Laboranomalien anbetrifft, traten während des 28-tägigen Behandlungszeitraums keine Ereignisse von Grad 4 auf. Bei den Probanden, denen die Prüfsubstanz verabreicht wurde, waren im Ribavirin enthaltenden Arm 2 zwei Fälle eines behandlungsbedingten Grad-3-Anstiegs des Gesamt-Bilirubins zu verzeichnen (die an Tag 7 auftraten, jedoch mit fortgeführter Dosis der Prüfsubstanz verschwanden). Ebenso gab es bei anderen Probanden in diesem Dosis-Arm (mit Ribavirin) zwei Fälle eines Grad-1-Anstiegs und einen Einzelfall eines Grad-2-Anstiegs des Gesamt-Bilirubins. Bei den Probanden in Arm 1 (kein Ribavirin) waren vier Fälle eines Grad-1-Anstiegs des Gesamt-Bilirubins festzustellen. In beiden Armen waren bis Tag 14 die ALT-Werte um 400 U/L gegenüber Baseline verringert. Der Median-QTcF war in keinem Studienarm gegenüber Baseline signifikant verändert; auch hat kein Proband die Prüfsubstanzen aufgrund von QTc-Anomalien abgesetzt. Vorläufige Sicherheitsdaten sind in Tabelle XVIII zusammengefasst.
  • Die HCV-RNA-Werte im Plasma wurden etwa zweimal wöchentlich kontrolliert, um das virologische Ansprechverhalten in Bezug auf prüfplanspezifische Kriterien für die vorzeitige Einleitung von PEG/RIBA abschätzen zu können. Nach vorläufiger Analyse der HCV-RNA-Werte betrug der Medianwert des maximalen Rückgangs von HCV-RNA bei der Doppeldosierung 3,9log10 IE/ml und bei der Dreifachdosierung 5,0log10 IE/ml. Der Mittelwert der Zeit bis zum maximalen Rückgang von HCV-RNA betrug im Doppeldosierungsprogramm 7 Tage und im Dreifachdosierungsprogramm 14 Tage, wobei der Unterschied der verzögerten Inzidenz und dem Einsetzen des viralen Durchbruchs im Ribavirin-enthaltenden Arm zugeschrieben wurde. Drei von 15 (20%) Probanden, die die Doppeldosis erhielten, und 10 von 13 (77%) Probanden, die die Dreifachdosis erhielten, hatten HCV-RNA-Tiefstwerte von ≤ 30 IE/ml (nicht-GT1-Probanden ausgeschlossen). 13/16 (81%) Probanden, die Verbindung 2/Verbindung 1 erhielten, sowie 6/15 (40%) Probanden, die Verbindung 2/Verbindung1/Ribavirin erhielten, leiteten PEG oder PEG/Ribavirin vor dem planmäßigen Start an Tag 28 der Studie ein. Nähere Details der virologischen Ergebnisse sind unter Ergebnisse nachzulesen. Verbindung 2 + Verbindung 1 allein und in Kombination mit RIBA wurden von den HCV-Probanden in dieser Studie bis zu 28 Tage, sowohl vor als auch nach der Zugabe von PEG oder PEG/Ribavirin, gut toleriert. Beide Dosisprogramme führten zu einer wirksamen Unterdrückung von HCV-RNA, wobei die größere und nachhaltigere Wirkung im Programm mit drei Arzneistoffen festzustellen war. Tabelle XVI Vorläufige demografische Daten und Baseline-Merkmale d. Probanden
    Arm Nr. 1: Verbindung 2 zu 75 mg BID + Verbindung 1 zu 40 mg BID (n = 16) Arm Nr. 2: Verbindung 2 zu 75 mg BID + Verbindung 1 zu 40 mg BID (n = 15)
    Alter in Jahren-Median (Bereich) 47 (30, 66) 55 (27, 63)
    Geschlecht 14 männlich 2 weiblich 11 männlich 4 weiblich
    Ethnische Herkunft 16 nicht-hispanisch/lateinamerikanisch 15 nicht-hispanisch/lateinamerikanisch
    Rasse 13 weiß 2 schwarz 1 asiatisch 13 weiß 2 schwarz 0 asiatisch
    Gewicht in kg bei Baseline-Median (Bereich) 86,1 (57,8, 110,5) 79,0 (51, 127,5)
    BMI in kg/M2 bei Baseline-Median (Bereich) 27,1 (21,5, 34,1) 24,7 (19,9, 37,6)
    Baseline Log10 HCV-RNA (IE/ml) aus Zentrallabor-Median (Bereich) Zentrallabor 6,17 (5,25, 7,26) 6,34 (5,41, 7,19)
    Baseline HCV-Genotyp 81a 81b 31a 121b
    Tabelle XVII Vorläufige Sicherheitsresultate
    Arm 1: Verbindung 2 zu 75 mg BID + Verbindung 1 zu 40 mg BID (n = 16) Arm 2: Verbindung 2 zu 75 mg BID + Verbindung 1 zu 40 mg BID + RIBA (n = 15)
    Unerwünschte Ereignisse (UE) Grad 3: 1 0
    Müdigkeit
    Grad 1/Grad 2 (UE):
    Kopfschmerzen 5 (31%) 7 (47%)
    Diarrhoe 3 (19%) 3 (20%)
    Übelkeit 3 (19%) 2 (13%)
    Müdigkeit 0 3 (20%)
    Asthenie 0 2 (13%)
    Pruritis 1 (6%) 2 (13%)
    Schlaflosigkeit 0 2 (13%)
    Laborwert-Anomalien Grad 3: Bilirubin 0 2
    Laborwerte Grad 1/Grad 2
    Anomalien:
    Bilirubin 4 3
    Hämoglobin 0 2
    Blutzucker (nicht nüchtern) 8 5
    Tabelle XVIII Vorläufige virologische Ergebnisse
    Arm 1: Verbindung 2 zu 75 mg BID + Verbindung 1 zu 40 mg BID (n = 16) Arm 1: Verbindung 2 zu 75 mg BID + Verbindung 1 zu 40 mg BID Nicht bestätigte GT1-Probanden ausgeschlossen (n = 15)* Arm 2: Verbindung 2 zu 75 mg BID + Verbindung 1 zu 40 mg BID + Ribavirin (n = 15) Arm 2: Verbindung 2 zu 75 mg BID + Verbindung 1 zu 40 mg BID + Ribavirin Nicht bestätigte GT1-Probanden ausgeschlossen (n = 13)
    Median maximale HCV-RNA-Schwächung Mittlere maximale HCV-RNA-Schwächung –3,9log10 IE/ml –3,4log10 IE/ml –4,0log10 IE/ml –3,6log10 IE/ml –5,0log10 IE/ml –4,5log10 IE/ml –5,0log10 IE/ml –4,9log10 IE/ml
    Mittlere Zeit bis Durchbruch 16 Tage 16 Tage 23 Tage 23 Tage
    Probanden mit HCV-RNA-Tiefstwert < 50 IE/ml 3/16 (19%) 3/15 (20%) 10/15 (63%) 10/13 (77%)
    Probanden mit Durchbruch** 12 (75%) 12/15 (80%) 6/15 (40%) 6/13 (46%)
    Ansprechen Tag 28: RVR zu < 25 IE/ml RVR zu < 50 IE/ml 1/16 (6%) 1/16 (6%) 1/15 (7%) 1/15 (7%) 5/15 (33%) 6/15 (40%) 5/13 (38%) 6/13 (46%)
    * GT1 ist eine Abkürzung von HCV-Genotyp 1.
    Probanden 1011 und 1043 an einem französischen Studienzentrum wurden ausgeschlossen Proband 1004 wurde nicht ausgeschlossen
    ** „Durchbruch” wird definiert als ein Anstieg des HCV-RNA von > 1log über Tiefstwert oder HCV
    RNA > 25 IE/ml nach einem Tiefstwert von < 25 IE/ml
  • Die in Tabelle XVIII dargestellten Daten belegen, dass als Reaktion auf die Kombination aus Verbindung 2 + Verbindung 1 bei Vorhandensein von Ribavirin im Vergleich zum Fehlen von Ribavirin ein etwa 10-fach größerer Rückgang des Medians der maximalen HCV-RNA-Konzentration und des Mittelwerts der maximalen HCV-RNA-Konzentration stattfand. Auch ist die Anzahl der Probanden mit einem HCV-RNA-Tiefstwert unter 50 IE/ml bei Vorhandensein von Ribavirin höher als bei Nichtvorhandensein von Ribavirin. Diese Ergebnisse zeigen, dass Ribavirin bei Nichtvorhandensein von Interferon die antivirale Wirkung der Kombination aus Verbindung 1 und Verbindung 2 signifikant potenziert.
  • Zusätzlich dazu ist die mittlere Zeit bis zum HCV-Durchbruch, die ein Maß für den abschließenden Anstieg der viralen Belastung durch HCV aufgrund der Mutation des Virus und der abnehmenden Suszeptibilität zu antiviralen Arzneistoffen ist, bei Vorhandensein von Ribavirin größer als bei fehlendem Ribavirin. Außerdem ist die Anzahl der Probanden, bei denen ein viraler Durchbruch verzeichnet wird, bei Vorhandensein von Ribavirin erheblich niedriger als bei Nichtvorhandensein von Ribavirin. Diese Ergebnisse belegen, dass das HCV-Virus bei Vorhandensein von Ribavirin in geringerem Maße imstande ist, eine Resistenz gegen die Kombination aus Verbindung 1 und Verbindung 2 aufzubauen.
  • Daneben zeigen die Daten in Tabelle XVIII, dass die Anzahl der Patienten, die eine rasche virologische Reaktion (Rapid Virologic Response, RVR) erzielen, bei Vorhandensein von Ribavirin signifikant größer ist als bei Nichtvorhandensein von Ribavirin. Zwischen dem Erreichen der RVR und der Heilung einer HCV-Infektion besteht eine eindeutige Korrelation. In Summe beweisen die in Tabelle XVIII vorgelegten Daten, dass die Kombination aus Verbindung 1, Verbindung 2 und Ribavirin selbst bei Nichtverabreichung von Interferon eine rasche und klinisch signifikante Minderung der viralen Belastung durch HCV und einen Rückgang des viralen Rebounds hervorruft.
  • Zwar sind in diesem Dokument spezifische Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dargestellt und im Detail beschrieben, die Erfindung ist jedoch nicht auf diese beschränkt. Die obigen detaillierten Beschreibungen verstehen sich als beispielhaft für die vorliegende Erfindung, sind jedoch nicht so auszulegen, dass sie eine Einschränkung der Erfindung darstellen. Änderungen werden dem Fachmann offensichtlich sein, wobei alle Änderungen, die nicht vom Grundprinzip der Erfindung abweichen, in den Geltungsbereich der beigelegten Ansprüche fallen sollen.
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Claims (14)

  1. Zusammensetzung für die Verwendung zur Behandlung einer Genotyp 1 HCV Infektion, umfassend eine Verbindung 6
    Figure DE202012013382U1_0085
    und ferner umfassend eine zweite Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 4, Verbindung 5 und Verbindung 7,
    Figure DE202012013382U1_0086
    wobei die Behandlung weder die Verabreichung von Interferon noch von Ribavirin einschließt, und wobei die Behandlung von 28 Tagen bis etwa 24 Wochen, vorzugsweise von etwa 12 bis etwa 24 Wochen dauern kann.
  2. Zusammensetzung für die Verwendung zur Behandlung einer Genotyp 1 HCV Infektion, einbeziehend: eine Verbindung 6
    Figure DE202012013382U1_0087
    und ferner eine zweite Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 4, Verbindung 5 und Verbindung 7,
    Figure DE202012013382U1_0088
    wobei die Zusammensetzung zusätzlich zu den beiden Verbindungen auch andere aktive Inhaltsstoffe einschließlich, aber nicht begrenzt auf: Ribavirin, ein Interferon, einen alpha-Glucosidase 1 Inhibitor, ein Leberschutzmittel, einen Toll-like-Rezeptor(TLR)-7 Agonisten, einen Cyclophilininhibitor, einen HCV-Viruseintrittinhibitor, einen HCV-Reifungsinhibitor, und einen HCV IRES Inhibitor, einbeziehen kann, und wobei die Behandlung von 28 Tagen bis etwa 24 Wochen, vorzugsweise von etwa 12 bis etwa 24 Wochen dauern kann.
  3. Zusammensetzung für die Verwendung zur Behandlung einer Genotyp 1 HCV Infektion, umfassend eine Verbindung 6
    Figure DE202012013382U1_0089
    und ferner umfassend eine zweite Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 4, Verbindung 5 und Verbindung 7,
    Figure DE202012013382U1_0090
    wobei die Behandlung weder die Verabreichung von Interferon noch von Ribavirin einschließt, und wobei die Behandlung von 28 Tagen bis 24 Wochen, vorzugsweise von 12 bis 24 Wochen dauern kann.
  4. Zusammensetzung für die Verwendung zur Behandlung einer Genotyp 1 HCV Infektion, einbeziehend: eine Verbindung 6
    Figure DE202012013382U1_0091
    und ferner eine zweite Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 4, Verbindung 5 und Verbindung 7,
    Figure DE202012013382U1_0092
    wobei die Zusammensetzung zusätzlich zu den beiden Verbindungen auch andere aktive Inhaltsstoffe einschließlich, aber nicht begrenzt auf: Ribavirin, ein Interferon, einen alpha-Glucosidase 1 Inhibitor, ein Leberschutzmittel, einen Toll-like-Rezeptor(TLR)-7 Agonisten, einen Cyclophilininhibitor, einen HCV-Viruseintrittinhibitor, einen HCV-Reifungsinhibitor, und einen HCV IRES Inhibitor, einbeziehen kann, und wobei die Behandlung von 28 Tagen bis 24 Wochen, vorzugsweise von 12 bis 24 Wochen dauern kann.
  5. Zusammensetzung für die Verwendung zur Behandlung einer Genotyp 1 HCV Infektion, umfassend eine Verbindung 6
    Figure DE202012013382U1_0093
    und ferner umfassend eine zweite Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 4, Verbindung 5 und Verbindung 7,
    Figure DE202012013382U1_0094
    wobei die Behandlung die Verabreichung von Ribavirin, aber nicht Interferon, einschließt, und wobei die Behandlung von 28 Tagen bis etwa 24 Wochen, vorzugsweise von etwa 12 bis etwa 24 Wochen dauern kann.
  6. Zusammensetzung für die Verwendung zur Behandlung einer Genotyp 1 HCV Infektion, im Wesentlichen bestehend aus einer Verbindung 6
    Figure DE202012013382U1_0095
    und ferner einer zweiten Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 4, Verbindung 5 und Verbindung 7,
    Figure DE202012013382U1_0096
    und Ribavirin, wobei die Behandlung von 28 Tagen bis etwa 24 Wochen, vorzugsweise von etwa 12 bis etwa 24 Wochen dauern kann.
  7. Zusammensetzung für die Verwendung zur Behandlung einer Genotyp 1 HCV Infektion, umfassend eine Verbindung 6
    Figure DE202012013382U1_0097
    und ferner umfassend eine zweite Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 4, Verbindung 5 und Verbindung 7,
    Figure DE202012013382U1_0098
    wobei die Behandlung die Verabreichung von Ribavirin, aber nicht Interferon, einschließt, und wobei die Behandlung von 28 Tagen bis 24 Wochen, vorzugsweise von 12 bis 24 Wochen dauern kann.
  8. Zusammensetzung für die Verwendung zur Behandlung einer Genotyp 1 HCV Infektion, im Wesentlichen bestehend aus einer Verbindung 6
    Figure DE202012013382U1_0099
    und ferner einer zweiten Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindung 1, Verbindung 4, Verbindung 5 und Verbindung 7,
    Figure DE202012013382U1_0100
    und Ribavirin, wobei die Behandlung von 28 Tagen bis 24 Wochen, vorzugsweise von 12 bis 24 Wochen dauern kann.
  9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Zusammensetzung einmal täglich verabreicht wird.
  10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Verbindungen der Zusammensetzung in einer einheitlichen Dosierungsform koformuliert werden und gleichzeitig in einer Kombinationsformulierung verabreicht oder zugeführt werden.
  11. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die zweite Verbindung Verbindung 4 ist und die Zusammensetzung für die Verwendung zur Behandlung einer Genotyp 1a HCV Infektion ist.
  12. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Zusammensetzung für die Verwendung zur Behandlung einer Genotyp 1b HCV Infektion ist.
  13. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Patient ein Behandlungs-naiver Patient ist.
  14. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Zusammensetzung ferner ein oder mehrere zusätzliche aktive Bestandteile einschließlich HCV NS3 Protease Inhibitoren, alpha-Glucosidase 1 Inhibitoren, leberschützende Agenzien, Nukleosid oder Nucleotid Inhibitoren der HCV NS5B Polymerase, nicht-Nukleosid Inhibitoren der HCV NS5B Polymerase, HCV NS5A Inhibitoren, TLR-7 Agonisten, Cyclophilin Inhibitoren, HCV IRES Inhibitoren, HCV-Eingangshemmer, HCV-Maturationshemmer, HCV-Assemblierungshemmer, HCV-Infektivitätshemmer und pharmakokinetische Optimierer, einschließt.
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