KR100767432B1

KR100767432B1 - 포스포네이트 뉴클레오티드 유사체의 전구 약물과 그것의 선택 및 제조 방법

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Publication number: KR100767432B1
Application number: KR1020037000872A
Authority: KR
Inventors: 마크 더블유. 벡커; 할란 에이치 채프만; 토마스 키흘라; 유진 제이. 에이센베르그; 공신 헤; 마이클 알. 케르난; 윌리엄 에이. 리; 어니스트 제이. 프리스베; 존 씨. 로흐로프; 마크 엘. 스파라씨노
Original assignee: 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드
Priority date: 2000-07-21
Filing date: 2001-07-20
Publication date: 2007-10-17
Also published as: EE05366B1; JP2010174033A; IS6689A; HRP20030047B1; HRP20160074B1; NZ523438A; BG66037B1; BR0112646A; OA12393A; UA75889C2; US20080227754A1; SI1301519T1; HU230960B1; CN1706855A; JP4651264B2; ZA200210271B; FR16C0013I2; JP2004504402A; HRP20160074A8; CN100402539C

Abstract

신규 방법은 항바이러스 또는 항종양 활성을 갖는 목적하는 조직을 선택적으로 표적시키는 전구 약물을 확인할 수 있도록, 메톡시포스포네이트 뉴클레오티드 유사체의 전구 약물을 스크리닝을 위하여 제공된다. 본 방법에 의하여 레트로바이러스 또는 헤파드나바이러스를 치료할 수 있는, PMPA의 신규 혼합된 에스테르-아미데이트, 예컨대 본원에서 정의된 바와 같은 치환기기를 갖는 구조식 (5a)의 화합물을 확인할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제와 이러한 신규화합물의 조성물 및 치료와 예방에 있어서 그들의 용도가 제공된다. 또한 본원에서 사용하고자 하는 화합물과 출발 물질을 제조하는 마그네슘 알콕사이드의 사용을 위한 개선된 방법이 제공된다.

Description

포스포네이트 뉴클레오티드 유사체의 전구 약물과 그것의 선택 및 제조 방법 {PRODRUGS OF PHOSPHONATE NUCLEOTIDE ANALOGUES AND METHODS FOR SELECTING AND MAKING SAME}

본 출원은 메톡시포스포네이트 뉴클레오티드 유사체(methoxyphosphonate nucleotide analogue)의 전구 약물(prodrug)에 관한 것이다. 특히, 본 출원은 상기 전구 약물을 제조하고 확인하는 개선된 방법에 관한 것이다.

다수의 메톡시포스포네이트 뉴클레오티드 유사체가 공지되어 있다. 일반적으로, 그러한 화합물은 A가 뉴클레오시드 유사체의 잔기이고 R이 독립적으로 수소 또는 다양한 보호 또는 전구 약물 작용군인 A-OCH₂P(O)(OR)₂ 구조를 갖는다. 미국특허 제5,663,159호, 제5,977,061호 및 제5,798,340호, Oliyai 외, "Pharmaceutical Research"16 (11): 1687-1693 (1999), Stella 외,"J. Med. Chem."23 (12): 1275-1282 (1980), Aarons, L., Boddy, A. and Petrak, K. (1989) Novel Drug Delivery and Its Therapeutic Application (Prescott, L. F. and Nimmo, W. S., ed.), pp. 121-126; Bundgaard, H. (1985) Design of Prodrugs (Bundgaard, H., ed.) pp. 7074 and 79-92; Banerjee, P. K. and Amidon, G. L. (1985) Design of Prodrugs (Bundgaard, H., ed.) pp. 118-121; Notari, R. E. (1985) Design of Prodrugs (Bundgaard, H., ed.) pp. 135-156; Stella, V. J. and Himmelstein, K. J. (1985) Design of Prodrugs (Bundgaard, H., ed.) pp. 177-198 ; Jones, G. (1985) Design of Prodrugs (Bundgaard, H., ed.) pp. 199-241; Connors, T. A. (1985) Design of Prodrugs (Bundgaard, H., ed.) pp. 291-316를 참조한다. 모든 문헌과 특허 인용 문헌은 참고자료로서 명백히 본원의 내용으로 포함되어 있다.

발명의 요약

알려져 온 동안, 항바이러스 또는 항종양 요법을 위한 메톡시포스포네이트 뉴클레오티드 유사체의 전구 약물은 전통적으로 그 전신 효과 면에서 선택되어 왔다. 예를 들어, 그러한 전구 약물은 증강된 생체 이용률(bioavailability), 즉 위장관으로부터 흡수되어 모약물(parent drug)이 모든 조직에 이용 가능할 것을 보장하기 위하여 재빨리 모약물로 전환되는 능력 면에서 선택되어 왔다. 그러나, 이제 본원인은, 유사체가 HIV 감염의 편재화된 국소 부위에서 강화된다는 본원에 기재된 연구가 설명하는 바와 같이, 치료 부위에서 강화되는 전구 약물을 선택하는 것이 가능하다는 것을 밝혀 내었다. 본 발명의 목적은, 다른 이점 중에서도, 방관자(bystander) 조직에 대한 낮은 독성을 제공하고, 모(母) 메톡시포스포네이트 뉴클레오티드 유사체를 사용하는 치료의 표적인 조직에서의 모약물의 우수한 효능을 제공하는 데에 있다.

따라서, 이러한 관찰에 의거하여,

(a) 적어도 하나의 전구 약물을 제공하는 단계,

(b) 적어도 하나의 치료 표적 조직과 적어도 하나의 비표적 조직을 선택하는 단계,

(c) 전구 약물을 상기 표적 조직과 상기 적어도 하나의 비표적 조직에 투여하는 단계,

(d) 단계 (c)에서 조직에 투여된 전구 약물에 의하여 부여된 상대적 항바이러스 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 표적 조직에서 증강된 활성을 부여하는 메톡시포스포네이트 뉴클레오티드 유사체 전구 약물을 확인하기 위한 스크리닝 방법이 제공된다.

바람직한 구체예에서, 표적 조직은 HIV가 활발하게 복제되는 부위 및/또는 HIV 병원소(reservoir)로 작용하는 부위이며, 비표적 조직은 무손상(intact) 동물이다. 출원인은 HIV에 이러한 방법을 실행하기 위하여 표적 조직으로서 림프 조직을 선택한 것이 결국 그러한 조직에 활성 약물의 전달을 증강시키는 전구 약물을 확인할 수 있게 한다는 것을 예기치 않게 알게 되었다.

이러한 방법에 의하여 확인된, 본 발명의 바람직한 구체예는 하기 구조식 (1)을 갖는 화합물과, 키랄적으로 강화된(chirally enriched) 이들의 조성물, 염, 유리 염기 및 용매 화합물을 제공한다.

식 중에서, R_a는 H 또는 메틸이다.

본 발명의 바람직한 구체예는 하기 구조식 (2)를 갖는 화합물과, 이들의 강화된 부분 입체 이성질체(diastereomer), 염, 유리 염기(free base) 및 용매 화합물을 제공한다.

또한, 출원인은 아미데이트 치환기 및/또는 인(phosphorous) 원자 상의 치환기의 키랄성(chirality)이 본 발명의 실행시 관찰되는 강화(enrichment)에 영향을 미친다는 것을 예기치 않게 알게 되었다. 따라서, 본 발명의 또다른 구체예에서, 출원인은 실질적으로 하기 부분 입체 이성질체 (4)가 없는,

본 발명의 부분 입체 이성질체적으로 강화된 (diastereomerically enriched) 하기 구조식 (3)을 갖는 화합물과, 이들의 염, 유리 염기 및 용매 화합물을 제공한다.

식 중에서,

R¹은 생체내(in vivo)에서 가수분해될 수 있는 옥시에스테르, 또는 히드록실이고;

B는 헤테로고리 염기이며;

R²는 히드록실, 또는 아미노산의 아미노기를 통해 P 원자에 결합된 아미노산의 잔기로서 선택적으로 에스테르화되는 아미노산의 각 카르복시 치환기를 갖는 것이지만, R¹과 R² 모두가 히드록실은 아닌 것이고;

E는 -CH₂O(CH₂)₂-, -CH₂OCH(CH₃)CH₂-, -CH₂OCH(CH₂F)CH₂-, -CH₂OCH(CH₂0H)CH₂-, -CH₂OCH(CHCH₂)CH₂-, -CH₂OCH(C≡CH)CH₂-, -CH₂OCH(CH₂N₃)CH₂-,

-CH₂OCH(R⁶)OCH(R^6')-, -CH₂OCH(R⁹)CH₂O- 또는 -CH₂OCH(R⁸)O-로서, 우측 결합이 헤테로고리 염기와 연결되어 있는 것이고;

점선은 선택적 이중 결합을 나타내는 것이며;

R⁴와 R⁵는 독립적으로 수소, 히드록시, 할로, 아미노 또는 아실옥시, 알킬옥시, 알킬티오, 알킬아미노 및 디알킬아미노 중에서 선택되는 1-5개의 탄소 원자를 갖는 치환기이고;

R⁶와 R^6'은 독립적으로 H, C₁-C₆ 알킬, C₁-C₆ 히드록시알킬 또는 C₂-C₇ 알카노일이고;

R⁷은 독립적으로 H, C₁-C₆ 알킬이거나, 또는 함께 -O- 또는 -CH₂-를 형성하는 것이고,

R⁸은 H, C₁-C₆ 알킬, C₁-C₆ 히드록시알킬 또는 C₁-C₆ 할로알킬이고;

R⁹는 H, 히드록시메틸 또는 아실옥시메틸이다.

구조식 (3)의 부분 입체 이성질체는 인 키랄 중심(chiral center)에서 (S) 이성질체인 것을 나타낸다.

본 발명의 바람직한 구체예는 실질적으로 하기 부분 입체 이성질체 (5b)가 없는,

하기 구조식 (5a)를 갖는 부분 입체 이성질체적으로 강화된 화합물과, 이들의 염, 호변체(tautomer), 유리 염기 및 용매 화합물이다.

식 중에서,

R⁵는 메틸 또는 수소이고;

R⁶은 독립적으로 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴 또는 아릴알킬이거나, 또는 R⁶은 독립적으로 알킬아미노, 알킬아미노알킬, 디알킬아미노알킬, 디알킬아미노, 히드록실, 옥소, 할로, 아미노, 알킬티오, 알콕시, 알콕시알킬, 아릴옥시, 아릴옥시알킬, 아릴알콕시, 아릴알콕시알킬, 할로알킬, 니트로, 니트로알킬, 아지도, 아지도알킬, 알킬아실, 알킬아실알킬, 카르복실, 또는 알킬아실아미노 중에서 선택되는 1 내지 3개의 치환기로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴 또는 아릴알킬이고;

R⁷은 천연 또는 약제학적으로 허용 가능한 아미노산의 측쇄로서, 상기 측쇄가 카르복실을 포함하는 경우에 그 카르복실기는 선택적으로 알킬 또는 아릴기로 에스테르화된 것이고;

R¹¹은 아미노, 알킬아미노, 옥소 또는 디알킬아미노이고;

R¹²는 아미노 또는 H이다.

본 발명의 바람직한 구체예는 하기 구조식 (6)의 화합물인 9-[(R)-2-[[(S)-[[(S)-1-(이소프로폭시카르보닐)에틸]아미노]페녹시포스피닐]메톡시]프로필]아데닌으로서, 본원에서 GS-7340라 한다.

본 발명의 또다른 바람직한 구체예는 구조식 (5) (하기 구조식 (7))의 푸마레이트염, 9-[(R)-2-[[(S)-[[(S)-1-(이소프로폭시카르보닐)에틸]아미노]페녹시포스피닐]메톡시]프로필]아데닌 푸마레이트 (1:1)로, 본원에서 GS-7340-2라 한다.

구조식 (1)-(7)의 화합물은 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 함유하는 조성물로 배합된다. 그러한 조성물은 바이러스 (특히 HIV 또는 헤파드나바이러스) 감염의 치료 또는 예방에 유효 투여량으로 사용된다.

부가적인 구체예에 있어서, 9-(2-히드록시프로필)아데닌 또는 9-(2-히드록시에틸)아데닌, 보호된 ρ-톨루엔설포닐옥시메틸포스포네이트 및 마그네슘 알콕사이드를 혼합한 다음, 9-[2-(포스포노메톡시)프로필]아데닌 (이하 "PMPA"라 한다) 또는 9-[2-(포스포노메톡시)에틸]아데닌 (이하 "PMEA"라 한다)을 각각 회수하는 것을 포함하는, 마그네슘 알콕사이드를 이용하는, PMPA 또는 PMEA의 손쉬운 제조 방법이 제공된다.

도 1은 PBMC에서 TDF, GS-7340 및 PMPA에 대한 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.

도 2는 PMPA 전구 약물의 순수 부분 입체 이성질체를 경구 투여한 후 혈장과 PBMC 노출의 GS7340-2 대사 개요의 시간에 따른 진행을 보여준다.

도 3은 개에게 PMPA s.c., TDF와 아미데이트 에스테르 전구 약물을 투여한 후 PBMC 및 혈장 내 테노포비르에 대한 AUC(0-24시간)를 보여준다.

스크리닝 방법에 사용하기 위한 메톡시포스포네이트 뉴클레오티드 유사체 모약물은 구조식 A-OCH₂P(O)(OH)₂를 갖는 화합물이며, 여기서 A는 뉴클레오시드 유사체의 잔기이다. 이러한 화합물은 그 자체로 공지되어 있고 본 발명의 일부가 아니다. 보다 구체적으로, 모화합물은 헤테로고리 염기 B와 아글리콘(aglycon) E를 포함하며, 일반적으로 하기 구조식을 갖는다.

식 중에서, B기는 이하에 정의되어 있고, E기는 앞에 정의되어 있다. 예는 미국특허 제4,659,825호, 제4,808,716호, 제4,724,233호, 제5,142,051호, 제5,130,427호, 제5,650,510호,제5,663,159호, 제5,302,585호, 제5,476,938호, 제5,696,263호, 제5,744,600호, 제5,688,778호, 제5,386,030호, 제5,733,896호, 제5,352,786호, 및 제5,798,340호 유럽특허 제821,690호 및 제654,037호에 기재되어 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에 사용하기 위한 전구 약물은 선행 문단에 기재한 모(母) 메톡시포스포네이트 뉴클레오티드 유사체의 공유 개조(covalently modified) 유사체이다. 일반적으로, 모약물의 인 원자가 전구 약물 개조를 위한 바람직한 부위이지만, 그 외의 부위가 헤테로고리 염기 B 또는 아글리콘 E 상에서 발견된다. 다수의 이와 같은 전구 약물은 이미 공지되어 있다. 기본적으로, 그러한 전구 약물은 인 원자의 에스테르 또는 아미데이트이지만, 또한 염기와 아글리콘에 대한 치환을 포함한다. 어떠한 개조도 그 자체로 본 발명의 일부는 아니며, 어떠한 것도 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 고려되지 않는다.

메톡시포스포네이트 뉴클레오티드 유사체의 인 원자는 아미데이트화 또는 에스테르화와 같은 공유 개조를 위한 2개의 원자가를 함유한다 (하나의 포스포릴 히드록실이 아글리콘 E 히드록실 치환기로 에스테르화되지 않는 한, 단지 하나의 인 원자가가 치환에 대하여 자유롭다). 통상 에스테르는 아릴옥시이다. 아미데이트는 보통 알킬기 또는 아릴기, 대개 페닐, 시클로알킬, 또는 t-, n- 또는 s-알킬기를 사용하여 에스테르화된 유리 카르복실기(들)을 갖는 천연 모노아미노산이다. 본 발명의 스크리닝 방법에 사용하기에 적합한 전구 약물은 예컨대 미국특허 제5,798,340호에 개시되어 있다. 그러나, 생체내(in vivo) 표적 조직세포에서 유리 메톡시포스포네이트 뉴클레오티드 유사체 모약물로, 예컨대 가수분해, 산화, 또는 생체조직에 대한 노출로 인한 그밖의 공유 변환(covalent transformation)에 의하여, 전환될 수 있는 것으로 잠재적으로 간주되는 임의의 전구 약물이 본 발명에 따른 방법에 사용하기에 적합하다. 그러한 전구 약물은 이 시점에서 공지될 수 있는 것이 아니라 장래에 확인될 수 있는 것이고, 따라서 본 발명의 방법을 시험하는 데에 이용 가능한 적합한 후보가 된다. 궁극적으로 전구 약물의 구조는 당해 전구 약물이 분석에서 선택적인 것으로 나타날 것인지를 결정하지만, 이들 전구 약물은 본 발명의 방법에 있어서 스크리닝을 위한 후보에 불과하므로, 이들의 구조는 스크리닝 방법을 실행하거나 또는 가능하게 하는 데에 적절한 것은 아니다.

모약물에 결합된 전-부분(pro-moieties)은 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 그러나, 스크리닝 분석에 사용될 각 전구 약물은 시험되는 다른 전구 약물과는 구조적으로 상이할 것이다. 구별되는(distinct), 즉, 구조적으로 상이한, 전구 약물은 일반적으로 그 전구 약물의 입체 화학 또는 그 공유 구조를 토대로 선택되거나, 또는 이러한 특징의 조합에 의하여 달라지게 된다. 그러나 시험된 각 전구 약물은 구조적으로 또는 입체 화학적으로 실질적으로 순수한 것이 바람직하며, 그렇지 않다면 스크리닝 분석의 결과(output)가 덜 유용할 것이다. 혹자가 그밖의 전구 약물을 사용한 이전 연구의 결과들과 통상적으로 대비한다 하더라도, 본 발명의 방법의 개별 구체예에서 단 하나의 전구 약물을 시험하는 것도 물론 본 발명의 범위 내이다.

본 발명자들은 전구 약물의 입체 화학이 표적 조직에서의 강화에 영향을 미칠 수 있다는 것을 발견하였다. 키랄 부위(chiral sites)는 인 원자에 있고 또한 그 치환기에서도 발견된다. 예를 들어, 아미데이트 제조에 사용된 아미노산은 D 또는 L 형일 수 있고, 그 포스포네이트 에스테르 또는 아미노산 에스테르 역시 키랄 중심을 가질 수 있다. 또한 키랄 부위는 분자의 뉴클레오시드 유사체 부분에서도 발견되지만, 이는 통상 모약물의 입체 화학에 의하여 이미 지시된 것이고, 스크린의 일부로서 달라지지는 않을 것이다. 예를 들어, PMPA의 R 이성질체는 대응하는 S 이성질체에 비하여 활성이 더 크기 때문에 바람직하다. 각 부위에서 순수하지 않은 경우, 이들 부분 입체 이성질체 또는 거울상 이성질체(enantiomer)는 통상 키랄적으로 강화될 것이고, 그 결과 스크린 결과를 보다 의미 있도록 할 것이다. 주목하는 바와 같이, 입체 이성질체의 구별성 (distinctiveness)은 해당 키랄 중심에서 다른 입체 이성질체로부터 유리된 입체 이성질체 (대부분의 메톡시포스포네이트 뉴클레오티드 유사체의 경우 거울상 이성질체보다는 대개 부분 입체 이성질체일 것이다)를 강화하거나 또는 정제하는 것에 의하여 부여되어, 각 시험 화합물은 실질적으로 동종(homogeneous)이다. 실질적으로 동종이거나 또는 키랄적으로 강화된다는 것은, 목적하는 입체 이성질체가 화합물의 약 60 중량% 이상, 보통 약 80 중량% 이상, 바람직하게는 95 중량% 이상을 차지한다는 것을 의미하는 것이다.

신규 스크리닝 방법

일단 적어도 하나의 후보 전구 약물이 선택되면, 본 발명의 스크리닝 방법의 나머지 단계가 표적 조직에 필요한 선택성(selectivity)을 갖는 전구 약물의 확인에 사용된다. 추후에 조직 또는 세포에서 검출을 용이하게 하기 위하여, 전구 약물을 검출가능기(detectable group)로 표지, 예컨대 방사능 표지(radiolabeled)하는 것이 가장 편리하다. 그러나, 전구 약물 또는 그 대사 산물 (모약물을 포함하여)을 분석하기 위한 다른 적합한 분석 또한 사용될 수 있기 때문에, 표지가 필수적인 것은 아니다. 이러한 분석에는 예를 들면 질량 분석법(mass spectrometry), HPLC, 바이오 분석법 (bioassay) 또는 면역 분석법(immunoassay) 등이 포함될 수 있다. 상기 분석은 전구 약물과 이들의 하나 이상의 대사 산물을 검출할 수도 있지만, 이러한 분석는 그 모약물의 생성만을 검출토록 하는 것이 바람직하다. 이는 전구 약물의 항바이러스 활성 모(母) 디포스페이트(parent diphosphate)로의 전환 정도와 속도는 시험된 모든 조직에서 동일하다는 가정(모든 경우에 보장되지는 않을 수 있다)에 기초한 것이다. 그렇지 않다면, 디포스페이트에 대하여 시험할 수 있다.

HIV 감염 치료에 유용한 전구 약물을 스크리닝할 때 바람직한 표적 조직은 림프 조직일 것이다. 림프 조직은 당업자에게 알려져 있을 것이며, CD4 세포, 림프구, 림프절, 매크로파이지(macrophage)와, 아교세포(glial cell) 및 말초혈액 단핵세포 (peripheral blood monocytic cells, PBMCs)와 같은 단구(monocyte)를 포함하는 대식구-유사 세포 등을 포함한다. 또한 림프 조직은 림프 조직 또는 세포, 예컨대 폐, 피부 및 비장에서 강화된 비-림프 조직을 포함한다. 물론 다른 항바이러스 약물의 다른 표적은 예컨대 간염에 있어서의 간과 HSV에 있어서의 말초신경과 같이, 당해 특정 바이러스에 있어서의 일차적인 복제 또는 잠복 부위가 될 것이다. 유사하게, 종양의 표적 조직은 사실상 종양 그 자체가 될 것이다. 이러한 조직 모두는 당업자 사이에 널리 알려져 있으며 선택을 위하여 과도한 실험을 필요로 하지는 않는다. 항바이러스 화합물을 스크리닝할 때, 표적 조직은 바이러스에 의하여 감염될 수 있다.

비표적 조직 또는 세포 역시 본 발명의 방법의 일부로서 스크린된다. 이와 관련하여, 이와 같은 조직 또는 세포는 어떠한 수 또는 정체를 갖는 것이라도 사용될 수 있다. 일반적으로, 모약물이 독성일 것으로 예상되는 조직은 비표적 조직으로 사용될 것이다. 비표적 조직의 선택은 전적으로 전구 약물의 본질 및 그 모약물의 활성에 따라 달라진다. 예를 들어, 간 이외의 조직(non-hepatic tissues)이 간염에 대한 전구 약물을 위하여 선택될 것이고, 종양과 동일한 조직의 비변형(untransformed) 세포가 항종양 선택성 전구 약물 스크린에 충분할 것이다.

본 발명의 방법은 전구 약물의 경구 생체 이용률을 측정하기 위하여 통상 수행되는 연구들과는 다르다는 것이 주목되어야 한다. 경구 생체 이용률 연구에서, 그 목적은 실질적으로 모약물로 전환되는 체순환으로 들어가는 전구 약물을 확인하는 것이다. 본 발명에 있어서, 그 목적은 위장관 또는 순환에서 대사되지 않는 전구 약물을 발견하는 것이다. 따라서, 본 발명의 방법에서 평가될 표적 조직은 일반적으로 소장을 포함하지 않거나, 또는 장이 포함되는 경우에 그 조직은 소장 이외의 추가적인 조직 역시 포함한다.

전형적으로 본 발명의 스크리닝 방법에 사용되는 표적 조직과 비표적 조직은 무손상의 살아있는 동물의 조직일 것이다. 에스테르를 갖는 전구 약물은 개, 원숭이, 또는 설치류를 제외한 다른 동물에서 시험되는 것이 바람직하다. 마우스와 래트 혈장은 목적하는 치료 환자가 사람이거나 고등 포유 동물인 경우에 그르치기 쉬운 결과를 낳을 수 있는 에스테라제를 고혈중 농도로 함유한다.

무손상 동물로 본 방법을 실행할 필요는 없다. 또한 관류 기관(perfused organ), 다양한 형태의 세포 배양, 예컨대 롤러병(roller bottle)이나 무중력 현탁액 체계(zero gravity suspension system)에서 유지되는 기관 또는 세포주의 생체외(in vitro) 배양을 이용하는 것 역시 본 발명의 범위 내이다. 예를 들어, MT-2 세포는 HIV 전구 약물을 선택하는 표적 조직으로 사용될 수 있다. 따라서, "조직"이라는 용어는, 조직된 세포 구조 또는 자연에서 발견될 수 있는 조직 구조인 것이 바람직하기는 하지만, 이것이 필수적인 것으로 해석되어서는 아니된다. 오히려, "조직"이라는 용어는 특정 근원, 기원 또는 분화 단계의 세포와 같은 것으로 해석되어야 한다.

표적 및 비표적 조직은 사실상 동일 조직이지만, 그 조직은 상이한 생물학적 상태에 있을 것이다. 예를 들어, 본원의 방법은 바이러스 감염 조직(표적 조직)에서 활성을 부여하는 전구 약물을 선택하는 데에 사용되지만, 이 방법은 바이러스에 감염되지 않은 세포(대응되는 비표적 조직)에서 실질적으로 비활성인 채로 남아있다. 동일한 전략이 예방적 전구 약물, 예컨대 바이러스 감염 시에는 항바이러스성 활성 형태로 대사되지만, 비감염 세포에서는 실질적으로 대사되지 않은 채 남아있는 전구 약물을 선택하는 데에 사용될 수 있다. 유사하게, 전구 약물은 변형 세포와 비변형 대응 조직에서 스크린될 수 있다. 이는 혈액학적 질병, 예컨대 백혈병을 치료하는 전구 약물을 선택하기 위한 대조 실험에 특히 유용하다.

어떠한 특정 작용 이론에 의하여 제한됨이 없이, 조직 선택적인 전구 약물은, 다른 조직이나 세포와 대비되는 바와 같이, 표적 세포에 의하여 선택적으로 흡수되거나 또는 세포 내에서 선택적으로 대사되는 것으로 여겨진다. 본 발명에 있어서 메톡시포스포네이트 전구 약물의 독특한 잇점은, 생리학적 pH에서 이들의 2가 음이온(dianion)으로의 대사가 이러한 전구 약물이 세포의 역행(back out)을 확산시키지 못할 것이라는 점을 보장한다는 데에 있다. 따라서 이러한 전구 약물은 오랜 시간 동안 유효하게 남아 있고, 높은 세포내 농도로 유지됨으로써, 향상된 효능을 나타낸다. 표적 조직내 증강된 활성 메카니즘은 표적 세포에 의한 증강된 흡수, 증강된 세포내 보유 또는 이들 양 메커니즘의 동시 작용을 포함한다. 그러나, 선택성 또는 증강된 전달이 표적 조직에서 발생하는 방법은 중요치 않다. 또한 모약물에 대한 전구 약물의 모든 대사 전환이 표적 조직 내에서 발생한다는 것은 중요하지 않다. 단지 최종 약물 활성-부여 전환이 표적 조직 내에서 일어는 것이 필요하다; 다른 조직 내 대사는 표적 조직내에서 항바이러스 형태로 최종 전환되는 중간물질을 생성할 수 있다.

바람직한 선택성 또는 증강된 전달의 정도는 모화합물과 측정 방법(% 투여량 분포 또는 모약물 농도)에 따라 다양할 것이다. 일반적으로, 모약물이 이미 폭넓은 치료 한계 범위(therapeutic window)를 가지고 있다면, 낮은 정도의 선택성으로도 목적하는 전구 약물에 충분할 수 있다. 반면, 독성 화합물은 선택적인 전구 약물을 확인하기 위하여 더욱 광범위한 스크리닝을 요구할 수 있다. 표적 조직과, 예컨대, 고용량에서 신독성 (nephrotoxic)이 있는 PMEA의 경우에 일차적인 초점이 신장과 림프 조직이 되는 것과 같이, 모화합물이 상대적으로 독성인 것으로 알려진 조직에 대해서만 스크리닝함으로써, 본 발명의 방법에 따른 상대적인 비용을 줄일 수 있다.

보통 선택된 조직 내 전구 약물의 상대적 항바이러스 활성을 측정하는 단계는 표적 및 비표적 조직에서의 전구 약물의 대사 산물의 상대적인 존재 또는 활성을 분석함으로써 달성되는데, 상기 대사 산물은 항바이러스 또는 항종양 활성을 갖는 것이거나 또는 그러한 대사 산물로 전환되는 것으로 알려진 것이다. 따라서, 표적 조직 내에서 항바이러스 또는 항종양 활성 대사 산물, 또는 궁극적으로 표적 조직 내에서 활성 대사 산물을 생성하는 그들의 전구체로 우선적으로 대사되는 전구 약물을 확인하기 위하여, 통상 실질적으로 동일한 시간 동안 조직 내 모약물의 상대량을 측정한다. 항바이러스 화합물의 경우에는, 활성 대사 산물이 포스포네이트 모화합물의 디포스페이트이다. 바이러스 핵산 내로 혼입되어, 연장되는 핵산 가닥의 끝을 잘라서(truncate) 바이러스 복제를 정지시키는 것이 바로 이 대사 산물이다. 전구 약물의 대사 산물은 동화(anabolic) 대사 산물, 이화(catabolic) 대사 산물, 또는 동화작용과 이화작용 양쪽 모두의 산물일 수 있다. 대사 산물이 생성되는 방법은 본 발명의 방법의 실행에서 중요한 것이 아니다.

본 발명의 방법은 항바이러스 또는 항종양 활성을 그 자체로 가지는 대사 산물을 분석하는 것으로 제한되지 않는다. 대신, 활성 대사 산물의 비활성 전구체를 분석할 수 있다. 항바이러스 활성 디포스페이트 대사 산물의 전구체는 모약물의 모노포스페이트, 모약물의 다른 대사 산물의 모노포스페이트(예컨대, 헤테로고리 염기 상의 치환기의 중간 개조 물질), 모약물 그 자체와 포스포릴화 (phosphorylation) 이전에 전구 약물의 모약물로의 전환시 세포에 의해 생겨나는 대사 산물을 포함한다. 전구체는 세포 대사의 결과물이기 때문에 그 구조는 상당히 다양할 수 있다. 그러나, 이러한 정보는 이미 당업자들에게 알려져 있거나 또는 그들에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

분석되는 전구 약물이 그 자체로 항종양 또는 항바이러스 활성을 나타내지 않는다면, 원분석(raw assay) 결과에 대한 조정이 요구될 수 있다. 예를 들어, 활성 대사 산물에 대한 비활성 대사 산물의 세포내 프로세싱(intracellular processing)이 시험되는 조직 사이에서 서로 다른 속도로 일어난다면, 비활성 대사 산물을 이용한 원분석 결과는 세포 형태 간의 차이를 고려하도록 조절될 필요가 있으며, 이는 그 관련 매개변수가 비활성 대사 산물의 축적이 아니라, 표적 조직 내 활성의 생성이기 때문이다. 그러나, 적당한 조정을 결정하는 것은 통상적인 기술의 범위 내이다. 따라서, 본원에 따른 방법의 단계 (d)가 그 활성의 측정을 필요로 하는 경우, 활성은 직접 측정되거나 또는 외삽될(extrapolate) 수 있다. 본원에 따른 방법이 그 자체로 활성이 있는 중간 물질을 분석하는 것에만 제한되는 것을 의미하지는 않는다. 예를 들어, 시험 조직 내의 전구 약물의 부재 또는 감소 역시 분석될 수 있다. 단계 (d)는 전구 약물이 관련 조직과 상호 작용함에 따라 그 전구 약물에 의하여 부여되는 활성의 평가만을 필요로 하며, 이는 외삽법 또는 다른 간접적인 측정법을 토대로 할 수 있다.

본 발명의 방법의 단계 (d)는 전구 약물의 "상대적" 활성을 측정하기 위한 것이다. 이는 각 분석과 모든 분석 또는 일련의 분석이 선택된 비표적 조직을 갖는 런(runs) 역시 필수적으로 함유하여야 할 필요는 없는 것으로 이해될 것이다. 대조적으로, 벤치 마크 비표적 활성을 제공하기 위하여, 비표적 조직 또는 조직, 또는 상기 비표적 조직으로부터 예상되는 결과를 나타내는 연산(algorithm)의 역사적인 제어(historical control)를 이용하는 것은 본 발명의 범위 내이다.

단계 (d)에서 얻은 결과는 그 후 비표적 조직보다 표적 조직 내에서 항바이러스 활성이 더욱 높은 전구 약물을 최적으로 선택 또는 확인하는 데에 사용된다. 추가적인 개발을 위하여 선택되는 것이 바로 이러한 전구 약물이다.

전구 약물 후보의 몇몇 예비 심사는 본 발명의 방법을 실행하기 전에 착수될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 전구 약물은 위장관을 통해 그다지 많이 대사되지 않은 채 통과할 수 있는 것이 필요할 것이고, 혈액에서 실질적으로 안정할 필요가 있을 것이며, 적어도 어느 정도 세포를 투과할 수 있어야 한다. 또한 대부분의 경우에 실질적인 대사 없이 간순환의 초회 통과(first pass)를 마칠 필요가 있을 것이다. 그러한 예비 연구는 선택적인 것으로서, 당업자들에게 널리 알려져 있다.

항바이러스 활성에 대해 상기 기술한 바와 같은 추론이 메톡시포스포네이트 뉴클레오티드 유사체의 항종양 전구 약물에도 또한 동일하게 적용될 수 있다. 이는 예를 들어, PMEA의 구아닐 유사체, PMEG의 전구 약물을 포함한다. 이런 경우에, PMEG와 같은 세포 독성이 있는 포스포네이트는 그 세포 독성이 사실상 항종양 활성을 부여하기 때문에 추구할만한 후보이다.

그 다음으로, 본 발명의 신규한 스크리닝 방법에 의하여 확인된 화합물은 통상적인 전임상 또는 임상 프로그램에 도입되어 원하는 목적이 충족되는지 여부를 확인할 수 있다. 전형적으로, 표적 조직 내 모약물의 활성 또는 농도(% 투여량 분포)가 비표적 조직 내 모화합물보다 2×, 바람직하게는 5× 이상 큰 경우에 전구 약물은 선택적인 것으로 간주된다. 다른 방편으로, 전구 약물 후보는 벤치마크(benchmark) 전구 약물과 비교될 수 있다. 이러한 경우, 선택성은 절대적이라기보다는 상대적이다. 선택성의 정도는 자유재량(discretion)의 문제이기는 하지만, 선택적 전구 약물은 그 원형 (prototype)에 비하여, 표적 조직 내에서 약 10× 농도 또는 활성보다 더 높은 결과를 가져올 것이다.

출발 물질 또는 중간체의 신규한 제조 방법

또한 본원은 본 발명의 바람직한 출발 물질(모약물), PMEA 및 (R)-PMPA의 개선된 제조방법을 포함한다. 전형적으로, 본 방법은 9-(2-히드록시프로필)아데닌 (HPA) 또는 9-(2-히드록시에틸)아데닌 (HEA)을 마그네슘 알콕사이드와 반응시키고, 이어서 보호된 아글리콘 합성 단위체(synthon) ρ-톨루엔-설포닐옥시메틸포스포네이트(토실레이트)를 그 반응 혼합물에 첨가하여, PMPA 또는 PMEA를 각각 회수하는 것을 포함한다.

바람직하게는, HPA는 강화된 또는 분리된 R 거울상 이성질체이다. 키랄성 HPA 혼합물이 사용되는 경우에는, 합성이 완료된 후 R-PMPA가 키랄성 PMPA 혼합물로부터 분리될 수 있다.

통상 토실레이트는 저급 알킬기에 의하여 보호되지만, 다른 적합한 기는 당업자에게 명백할 것이다. 토실화 반응에서 보호기로 작용할 수 있는 전구 약물 포스포네이트 치환기로 사전 치환된(presubstituted) 토실레이트를 사용함으로써, 탈보호 단계를 피하고 전구 약물 또는 중간체를 직접 회수할 수 있도록 하는 것이 편리할 수 있다.

마그네슘 알콕사이드의 알킬기는 중요하지 않으며 임의의 C₁-C₆ 가지형 (branched) 또는 노르말(normal) 알킬이면 되지만, t-부틸 (PMPA의 경우) 또는 이소프로필 (PMEA의 경우)이 바람직하다. 반응 조건 또한 중요하지 않으나, 반응 혼합물을 교반 또는 다른 적당한 휘저음과 함께 약 70-75℃에서 가열하는 것이 바람직하다.

포스포네이트 치환기를 보유하지 않을 경우, 그 생성물은 (대개 토실레이트 보호기가 알킬인 브로모트리메틸실란으로) 탈보호되고, 그런 다음 그 생성물은 결정화 또는 당업자에게 명백한 다른 통상적인 방법으로 회수된다.

헤테로고리 염기

구조식 (3) 및 (4)에 기술된 본 발명의 화합물에서, 헤테로고리 염기 B는 하기 구조식 중에서 선택된다.

식 중에서,

R¹⁵는 H, OH, F, Cl, Br, I, OR¹⁶, SH, SR¹⁶, NH₂, 또는 NHR ¹⁷이고;

R¹⁶은 CH₃, CH₂CH₃, CH₂CCH, CH₂CHCH ₂ 및 C₃H₇을 포함하는 C₁-C₆ 알킬 또는 C₂-C₆ 알케닐이고;

R¹⁷은 CH₃, CH₂CH₃, CH₂CCH, CH₂CHCH ₂ 및 C₃H₇을 포함하는 C₁-C₆ 알킬 또는 C₂-C₆ 알케닐이고;

R¹⁸은 N, CF, CCl, CBr, CI, CR¹⁹, CSR¹⁹, 또는 COR¹⁹이고;

R¹⁹는 H이거나, 또는 OH, F, Cl, Br 또는 I로 치환되거나 또는 치환되지 않은 C_l-C₉ 알킬, C₂-C₉ 알케닐, C₂-C₉ 알키닐, C_l-C₉ 알킬-C₁-C₉ 알콕시 또는 C₇-C₉ 아릴-알킬이고, 따라서 R¹⁹는 -CH₃, -CH₂CH₃, -CHCH₂, -CHCHBr, -CH₂CH₂Cl, -CH₂CH₂F, -CH₂CCH, -CH₂CHCH₂, -C₃H₇, -CH₂0H, -CH₂0CH₃, -CH₂0C₂H₅, -CH₂0CCH, -CH₂0CH₂CHCH₂, -CH₂C₃H₇, -CH₂CH₂0H, -CH₂CH₂0CH₃, -CH₂CH₂OC₂H₅, -CH₂CH₂OCCH, -CH₂CH₂OCH₂CHCH₂ 및 -CH₂CH₂0C₃H₇을 포함하고;

R²⁰은 N 또는 CH이고;

R²¹은 N, CH, CCN, CCF₃, CC≡CH 또는 CC(O)NH₂이고;

R²²는 H, OH, NH₂, SH, SCH₃, SCH₂CH₃, SCH₂CCH, SCH₂CHCH₂, SC₃H₇,

NH(CH₃), N(CH₃)₂, NH(CH₂CH₃), N(CH₂CH ₃)₂, NH(CH₂CCH), NH(CH₂CHCH₂), NH(C₃H ₇), 할로겐 (F, Cl, Br 또는 I) 또는 X이고, 여기서 X는 -(CH₂)_m(O)_n(CH₂) _mN(R¹⁰)₂이고, 여기서 각각의 m은 독립적으로 0-2, n은 0-1이고,

R¹⁰은 독립적으로

H이거나,

C_l-C_l5 알킬, C₂-C₁₅ 알케닐, C₆-C_l5 아릴알케닐, C₆-C₁₅ 아릴알키닐, C₂-C₁₅ 알키닐, C₁-C₆-알킬아미노-C₁-C₆ 알킬, C₅-C_l5 아르알킬, C₆-C₁₅ 헤테로아르알킬, C₅-C₆ 아릴, C₂-C₆ 헤테로시클로알킬이거나,

C₂-C₁₅ 알킬, C₃-C₁₅ 알케닐, C₆-C₁₅ 아릴알케닐, C₃-C₁₅ 알키닐, C₇-C₁₅ 아릴알키닐, C₁-C₆-알킬아미노-C₁-C₆ 알킬, C₅-C₁₅ 아르알킬, C₆-C₁₅ 헤테로알킬 또는 C₃-C₆ 헤테로시클로알킬로서, N⁶에 이웃하지 않은 알킬 부분의 메틸렌이 -O-로 대체된 것,

선택적으로 2개의 R¹⁰이 N과 함께 결합하여 1 또는 2개의 N 헤테로 원자 및 선택적으로 부가적인 O 또는 S 헤테로 원자를 함유하는 포화 또는 불포화 C₂-C₅ 헤테로고리를 형성하는 것,

또는 1 내지 3개의 할로, CN 또는 N₃로 치환된 전술한 R¹⁰기 중의 하나이지만, 선택적으로 적어도 하나의 R¹⁰기는 H가 아닌 것이며;

R²³은 H, OH, F, Cl, Br, I, SCH₃, SCH₂CH₃, SCH₂CCH, SCH₂CHCH₂, SC₃H₇, OR¹⁶, NH₂, NHR¹⁷ 또는 R²²이고;

R²⁴는 O, S 또는 Se이다.

B 또한 보호 및 비보호 헤테로고리 염기 양쪽 모두를, 특히 퓨린 및 피리딘 염기를 포함한다. 엑소고리(exocyclic) 아민 및 다른 불안정기(labile group)를 위한 보호기는 공지되어 있으며 (Greene et al. "Protective Groups in Organic Synthesis"), 이들은 N-벤조일, 이소부티릴, 4,4'-디메톡시트리틸(DMT) 등을 포함한다. 보호기를 선택하는 문제는 보통 당업자에게 명백할 것이며, 불안정기의 본질 및 그 보호기가 만날 것으로 기대되는 화학 작용, 예컨대 산성, 염기성, 산화, 환원 또는 기타 조건에 따라 달라질 것이다. 보호 종의 예로는 N⁴-벤조일시토신, N⁶-벤조일아데닌, N²-이소부티릴구아닌 등을 들 수 있다.

보호된 염기는 구조식 Xa.1, XIa.1, XIb.1, XIIa.1 또는 XIIIa.1을 갖는다.

식 중에서, R¹⁸, R²⁰, R²¹, R²⁴는 앞서 정의한 바와 같으며; R²²가 NH₂가 아닌 것을 조건으로 R^22A는 R³⁹ 또는 R²²이고, R²³이 NH₂가 아닌 것을 조건으로 R^23A는 R³⁹ 또는 R²³이고; R³⁹는 NHR⁴⁰, NHC(O)R³⁶, 또는 CR⁴¹N(R³⁸)₂이고, 여기서 R³⁶은 할로겐, 메틸, 에틸, 메톡시, 에톡시, 히드록시 및 시아노 중에서 선택되는 1 또는 2개의 원자 또는 기로 치환된 C₁-C₁₉ 알킬, C₁-C₁₉ 알케닐, C₃-C₁₀ 아릴, 아다만토일, 알킬아닐, 또는 C₃-C₁₀ 아릴이고; R³⁸은 C₁-C₁₀ 알킬이거나, 또는 2개의 R³⁸이 함께 1-모르포리노, 1-피페리딘 또는 1-피롤리딘이고; R⁴⁰은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 헥실, 옥틸 및 데카닐을 포함하는 C₁-C_1a 알킬이고; 및 R⁴¹은 수소 또는 CH₃이다.

구조식 XIa.1 및 XIb.1의 염기에서, R³⁹가 R^22A 또는 R^23A에 존재하면, 동일 염기 상에 있는 R³⁹기 둘다는 일반적으로 같아지게 동일할 것이다. R³⁶의 예로는 페닐, 전술한 R³⁶ 아릴 치환기 중의 하나로 치환된 페닐, -C₁₀H₁₅ (C₁₀H₁₅가 2-아다만토일), -CH₂-C₆H₅, -C₆H₅, -CH(CH₃)₂, -CH₂CH₃, 메틸, 부틸, t-부틸, 헵타닐, 노나닐, 운데카닐 또는 운데세닐을 들 수 있다.

구체적인 염기는 히포크산틴, 구아닌, 아데닌, 시토신, 이노신, 티민, 우라실, 크산틴, 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 2-아미노-6-클로로퓨린, 히포크산틴, 이노신 및 크산틴의 8-아자 유도체; 아데닌, 구아닌, 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 2-아미노-6-클로로퓨린, 히포크산틴, 이노신 및 크산틴의 7-데아자(deaza)-8-아자 유도체; 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 2-아미노-6-클로로퓨린, 히포크산틴, 이노신 및 크산틴의 1-데아자 유도체; 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 2-아미노-6-클로로퓨린, 히포크산틴, 이노신 및 크산틴의 7-데아자 유도체; 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 2-아미노-6-클로로퓨린, 히포크산틴, 이노신 및 크산틴의 3-데아자 유도체; 6-아자시토신; 5-플루오로시토신; 5-클로로시토신; 5-요오도시토신; 5-브로모시토신; 5-메틸시토신; 5-브로모비닐우라실; 5-플루오로우라실; 5-클로로우라실; 5-요오도우라실; 5-브로모우라실; 5-트리플루오로메틸우라실; 5-메톡시메틸우라실; 5-에티닐우라실 및 5-프로피닐우라실을 포함한다.

바람직하게는, B는 구아닐, 3-데아자구아닐, 1-데아자구아닐, 8-아자구아닐, 7-데아자구아닐, 아데닐, 3-데아자아데닐, 1-데아자아데닐, 8-아자아데닐, 7-데아자아데닐, 2,6-디아미노퓨리닐, 2-아미노퓨리닐, 6-클로로-2-아미노퓨리닐 및 6-티오-2-아미노퓨리닐 중에서 선택되는 9-퓨리닐 잔기이거나, 또는 B'은 시토시닐, 5-할로시토시닐, 및 5-(C₁-C₃-알킬)시토시닐 중에서 선택되는 1-피리미디닐 잔기이다.

바람직한 B기는 하기 구조식을 갖는다.

식 중에서,

R²²는 독립적으로 할로, 산소, NH₂, X 또는 H이나, 선택적으로 적어도 하나의 R²²는 X이고;

X는 (CH₂)_m(O)_n(CH₂)_mN(R^1O)2이고 여기서 m은 0-2, n은 0-1이고,

R¹⁰은 독립적으로

H이거나,

C₂-C₁₅ 알킬, C₃-C₁₅ 알케닐, C₆-C₁₅ 아릴알케닐, C₃-C₁₅ 알키닐, C₇-C₁₅ 아릴알키닐, C₁-C₆-알킬아미노-C₁-C₆ 알킬, C₅-C₁₅ 아르알킬, C₆-C₁₅ 헤테로알킬 또는 C₃-C₆ 헤테로시클로알킬인 것으로서, N⁶에 이웃하지 않은 알킬 부분의 메틸렌이 -O-로 대체된 것,

선택적으로 2개의 R¹⁰이 N과 함께 결합되어 1 또는 2개의 N 헤테로 원자 및 선택적으로 부가적인 O 또는 S 헤테로 원자를 함유하는 포화 또는 불포화 C₂-C₅ 헤테로고리를 형성하는 것이거나,

또는 전술한 R¹⁰기 중의 하나는 1 내지 3개의 할로, CN 또는 N₃로 치환된 것이지만, 선택적으로 적어도 하나의 R¹⁰기는 H가 아닌 것이고;

헤테로고리 핵이 퓨린에서 하나 이하의 Z로 변하는 것을 조건으로, Z는 N 또는 CH이고;

E기는 메톡시포스포네이트 뉴클레오티드 유사체에 사용되는 아글리콘을 나타낸다. 바람직하게는, E기는 -CH₂OCH(CH₃)CH₂- 또는 -CH₂OCH₂CH₂-이다. 또한, 아글리콘의 키랄 중심의 측기는 실질적으로 오로지 (R) 구조인 것 (강화된 (S) 거울상 이성질체인 히드록시메틸의 경우는 제외)이 바람직하다 .

R¹은 구조 -OR³⁵ 또는 -OR⁶을 갖는 생체내에서 가수분해될 수 있는 옥시에스테르이며, 여기서 R³⁵는 참고문헌으로 본원의 내용에 포함되는 미국특허 제5,798,340호의 칼럼 64, 49줄에 정의되어 있는 것이며, R⁶은 앞에 정의되어 있다. 바람직하게는, R¹은 아릴옥시, 보통 (R⁶에서 정의된 것과 같은) 파라-치환 또는 비치환 페녹시이다.

선택적으로 약 5개 미만의 원자에 의하여 아미데이트 N에 연결된 임의의 카르복시기가 에스테르화되는 것을 조건으로 R²는 아미노산 잔기이다. R²는 대개 하기 구조식을 갖는다.

식 중에서,

n은 1 또는 2이고;

R¹¹은 R⁶ 또는 H이고; 바람직하게는 R⁶ C₃-C₉ 알킬; OH, 할로겐, O 또는 N으로 독립적으로 치환된 C₃-C₉ 알킬; C₃-C₆ 아릴; OH, 할로겐, O 또는 N으로 독립적으로 치환된 C₃-C₆ 아릴; 또는 OH, 할로겐, O 또는 N으로 독립적으로 치환된 C₃-C₆ 아릴알킬이고;

R¹²는 독립적으로 H이거나, 또는 OH, O, N, COOR¹¹ 및 할로겐으로 구성된 군 중에서 독립적으로 선택되는 치환기로 치환되거나 또는 치환되지 않은 C₁-C₉ 알킬; OH, O, N, COOR¹¹ 및 할로겐으로 구성된 군 중에서 독립적으로 선택되는 치환기로 치환되거나 또는 치환되지 않은 C₃-C₆ 아릴; 또는 OH, O, N, COOR¹¹ 및 할로겐으로 구성된 군 중에서 독립적으로 선택되는 치환기로 치환되거나 또는 치환되지 않은 C₃-C₉ 아릴-알킬이고;

R¹³은 독립적으로 C(O)-OR¹¹; 아미노; 아미드; 구아니디닐; 이미다졸릴; 인돌릴; 설폭사이드; 포스포릴; C_l-C₃ 알킬아미노; C_l-C₃ 알킬디아미노; C_l-C₆ 알케닐아미노; 히드록시; 티올; C_l-C₃ 알콕시; C_l-C₃ 알크티올; (CH₂)_nCOOR¹¹ ; OH, 할로겐, SH, NH₂, 페닐, 히드록시페닐 또는 C₇-C₁₀ 알콕시페닐로 치환된 또는 비치환된 C_l-C₆ 알킬; OH, 할로겐, SH, NH₂, 페닐, 히드록시페닐 또는 C₇-C₁₀ 알콕시페닐로 치환된 또는 비치환된 C₂-C₆ 알케닐; 및 OH, 할로겐, SH, NH₂, 페닐, 히드록시페닐 또는 C₇-C₁₀ 알콕시페닐로 치환된 또는 비치환된 C₆-C₁₂ 아릴이고; 및

R¹⁴는 H 또는 C₁-C₉ 알킬, 또는 OH, 할로겐, COOR¹¹, O 또는 N으로 독립적으로 치환된 C_l-C₉ 알킬; C₃-C₆아릴; OH, 할로겐, COOR¹¹, O 또는 N으로 독립적으로 치환된 C₃-C₆ 아릴; 또는 OH, 할로겐, COOR¹¹, O 또는 N으로 독립적으로 치환된 C₃-C₆ 아릴알킬이다.

바람직하게는, R¹¹은 C₁-C₆ 알킬, 가장 바람직하게는 이소프로필이고, R¹³은 천연 아미노산 측쇄, n=1, R¹²는 H이고, R¹⁴는 H이다. 구조식 (2)의 화합물에 있어서, 본 발명은 페녹시 에스테르와 이소필 에스테르가 -OH로 가수분해되어 있는 대사 산물을 포함한다. 유사하게, 화합물 (5a), (5b) 및 (6)의 탈에스테르화 강화 포스포노아미데이트 대사 산물이 본 발명의 범위에 포함된다.

아릴과 "O" 또는 "N" 치환은 미국특허 제5,798,340호의 칼럼 16, 42 내지 58줄에 정의되어 있다.

전형적으로, 아미노산은 천연 아미노산 또는 l 아미노산이다. 적합한 특정예들이 미국특허 제5,798,340호, 예컨대 표 4와 칼럼 8 내지 10에 기재되어 있다.

반대로 명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 알킬은 노르말, 2차, 3차 또는 고리(cyclic) 탄화수소이다. 반대로 명시되지 않는 한, 알킬은 C₁-C₁₂이다. 예로는 -CH₃, -CH₂CH₃, -CH₂CH₂CH₃, -CH(CH₃)₂, -CH₂CH₂CH₂CH₃), -CH₂CH(CH₃)₂, -CH(CH₃)CH₂CH₃, -C(CH₃)₃, -CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃, -CH(CH₃)CH₂CH₂CH₃, -CH(CH₂CH₃)₂, -C(CH₃)₂CH₂CH₃), -CH(CH₃)CH(CH₃)₂, -CH₂CH₂CH(CH₃)₂), -CH₂CH(CH₃)CH₂CH₃, -CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃, -CH(CH₃)CH₂CH₂CH₂CH₃, -CH(CH₂CH₃)(CH₂CH₂CH₃),-C(CH₃)₂CH₂CH₂CH₃, -CH(CH₃)CH(CH₃)CH₂CH₃, -CH(CH₃)CH₂CH(CH₃)₂, -C(CH₃)(CH₂CH₃)₂, -CH(CH₂CH₃)CH(CH₃)₂, -C(CH₃)₂CH(CH₃)₂, 및 -CH(CH₃)C(CH₃)₃을 들 수 있다. 알케닐과 알키닐은 동일한 양상으로 정의되지만, 각각 적어도 하나의 이중 결합 또는 삼중 결합을 함유한다.

에놀기 또는 케토기가 개시되는 경우, 대응하는 호변체 역시 교시되는 것으로 해석된다.

본 발명의 전구 약물 화합물은 유리 염기 또는 미국특허 제5,798,340호에 열거되어 있는 다양한 염의 형태로 제공되며, 미국특허 제5,798,340호에 기술된 것과 같은 약제학적 제품으로서 사용하기 위하여 약제학적으로 허용 가능한 부형제 또는 용매화 희석제와 배합된다. 이들 전구 약물은 모약물에 대하여 이미 확립된 활용도와 항바이러스성을 갖는다 (미국특허 제5,798,340호와 메톡시포스포네이트 뉴클레오티드 유사체에 관한 다른 인용문헌 참조). 구조식 (4)의 부분 입체 이성질체는 적어도, 본원의 연구에서 밝혀진 바와 같은 상대적으로 비선택적인 특성에 무관하게, 생체내에서의 가수분해에 의한 모약물의 화학적 생산의 중간체로서 유용하다.

본 발명은 다음의 실시예를 참고로 하여 더욱 완전하게 이해될 것이다.

실시예 1a

마그네슘 이소프로폭사이드를 이용하여 아데닌에서 PMEA로. DMF(41.9ml) 중 아데닌(16.8g, 0.124mol)의 현탁액에 에틸렌 카보네이트(12.1g, 0.137mol)와 수산화나트륨(.100g, 0.0025mol)을 첨가하였다. 혼합물을 130℃에서 밤새도록 가열하였다. 반응물을 50℃ 이하로 냉각시키고 톨루엔(62.1ml)을 첨가하였다. 슬러리를 2시간 동안 5℃로 추가 냉각시키고, 여과, 및 톨루엔(2x)으로 세척하였다. 습윤 고체를 진공으로 65℃에서 건조시켜 회색이 도는 흰색 고체로서 20.0g(90%)의 9-(2-히드록시에틸)아데닌을 얻었다. Mp: 238-240℃.

9-(2-히드록시에틸)아데닌(HEA)(20.0g, 0.112mol)을 DMF(125ml)중에 현탁시켜 80℃까지 가열하였다. 마그네슘 이소프로폭사이드(11.2g, 0.0784mol), 또는 선택적으로 마그네슘 t-부톡사이드를 혼합물에 첨가하고 이어서 한시간에 걸쳐 디에틸 p-톨루엔설포닐옥시메틸포스포네이트(66.0g, 0.162mol)를 첨가하였다. 혼합물을 80℃에서 7시간 동안 교반하였다. 30ml의 휘발성 물질을 진공 증류를 통해 제거하고, 반응물에 30ml의 새로운 DMF를 더 넣었다. 실온까지 냉각시킨 후, 브로모트리메틸실란(69.6g, 0.450mol)을 첨가하고 혼합물을 6시간 동안 80℃로 가열하였다. 반응물을 농축시켜 진한 검(gum)을 얻었다. 이 검을 360ml 물에 용해시키고, 120ml의 디클로로메탄을 이용하여 추출하였으며, 수산화나트륨으로 pH 3.2로 조절한 다음, 생성된 슬러리를 실온에서 밤새도록 교반하였다. 슬러리를 한시간 동안 4℃로 냉각시켰다. 여과하여 고체를 분리하고, 물(2x)로 세척한 다음 56℃에서 진공으로 건조시켜 20g(65.4%)의 9-[2-(포스포노메톡시)에틸]아데닌(PMEA)을 백색 고체로서 얻었다. Mp:>200℃dec. ¹H NMR(D₂O)·3.49(t,2H); 3.94(t,2H); 4.39(t,2H); 8.13(s,1H); 8.22(s,1H).

실시예 1b

마그네슘 t-부톡사이드를 이용하여 아데닌에서 PMPA로. DMF(41.9ml) 중 아데닌(40g, 0.296mol)의 현탁액에 (R)-프로필렌 카보네이트(34.5g, 0.338mol)와 수산화나트륨(.480g, 0.012mol)을 첨가하였다. 혼합물을 130℃에서 밤새도록 가열하였다. 반응물을 100℃까지 냉각시키고 톨루엔(138ml)을 첨가한 다음 반응 온도를 100-110℃로 유지하면서 메탄설폰산(4.7g, 0.049mol)을 첨가하였다. 균질한 용액을 얻기 위하여 추가로 톨루엔(114ml)을 첨가하였다. 용액을 7시간에 걸쳐 3℃까지 냉각시킨 다음 3℃에서 한시간 동안 유지시켰다. 생성된 고체를 여과하여 분리하고 아세톤(2x)으로 세척하였다. 습윤 고체를 진공으로 80℃에서 건조시켜 회색이 도는 흰색 고체로서 42.6g(75%)의 (R)-9-[2-(히드록시)프로필]아데닌(HPA)을 얻었다. Mp: 188-190℃.

(R)-9-[2-(히드록시)프로필]아데닌(HPA)(20.0g, 0.104mol)을 DMF(44.5ml)중에 현탁시켜 65℃까지 가열하였다. 마그네슘 t-부톡사이드(14.2g, 0.083mol), 또는 선택적으로 마그네슘 이소프로폭사이드를 한시간 동안 혼합물에 첨가하고 이어서 온도를 78℃에서 유지시키며 두시간에 걸쳐 디에틸 p-톨루엔설포닐옥시메틸포스포네이트(66.0g, 0.205mol)를 첨가하였다. 혼합물을 75℃에서 4시간 동안 교반하였다. 50℃ 이하로 냉각시킨 후, 브로모트리메틸실란(73.9g, 0.478mol)을 첨가하고 혼합물을 3시간 동안 77℃로 가열하였다. 종료시, 반응물을 80℃까지 가열하고 대기압 증류를 통해 휘발성 물질을 제거시켰다. 50℃에서 잔사를 물(120ml)에 용해시킨 다음, 에틸 아세테이트(101ml)로 추출하였다. 수산화나트륨을 이용하여 수성상의 pH를 pH 1.1까지 조절하고, 인증 (R)-PAPA로 시드(seed)하며, 수성층의 pH를 수산화나트륨으로 pH 2.1까지 조절하였다. 생성된 슬러리를 실온에서 밤새도록 교반하였다. 슬러리를 세시간 동안 4℃로 냉각시켰다. 여과하여 고체를 분리하고, 물(60ml)로 세척한 다음 56℃에서 진공으로 건조시켜 18.9g(63.5%)의 조 (R)-9-[2-(포스포노메톡시)프로필]아데닌(PMPA)을 회색이 도는 백색 고체로서 얻었다.

모든 고체가 물(255ml) 중에 용해될 때까지 조 (R)-9-[2-(포스포노메톡시)프로필]아데닌(PMPA)을 환류에서 가열하였다. 용액을 4시간에 걸쳐 실온까지 냉각시켰다. 생성된 슬러리를 세시간 동안 4℃에서 냉각시켰다. 여과하여 고체를 분리하고, 물(56ml)로 세척한 다음 50℃에서 진공으로 건조시켜 15.0g(50.4%)의 (R)-9-[2-(포스포노메톡시)프로필]아데닌(PMPA)을 백색 고체로서 얻었다. Mp: 278-280℃.

실시예 2

GS-7171(III)의 제조

유리속 입힌 반응기에 무수 PMPA, (I)(14.6kg, 50.8mol), 페놀(9.6kg, 102mol) 및 1-메틸-2-피롤리디논(39kg)을 담았다. 혼합물을 85℃까지 가열하고 트리에틸아민(6.3kg, 62.3mol)을 첨가하였다. 그 다음 1-메틸-2-피롤리디논(1.6kg) 중 1,3-디시클로헥실카르보디이미드(17.1kg, 82.9mol)의 용액을 100℃에서 6시간에 걸쳐 첨가하였다. 16시간 동안 가열을 지속하였다. 반응물을 45℃까지 냉각하고, 물(29kg)을 첨가한 다음 25℃까지 냉각시켰다. 여과에 의해 반응물로부터 고체를 제거하고 물(15.3kg)로 세척하였다. 혼합 여과물 및 세척물을 감압하에 황갈색 슬러리로 농축시키고, 물(24.6kg)을 첨가시켰으며 NaOH(물 중 25%)를 이용하여 pH=11까지 조절하였다. 규조토(2kg)를 통한 여과에 의해 미세물질을 제거하고 물(4.4kg)로 세척하였다. 에틸 아세테이트(28kg)를 이용하여 혼합 여과물 및 세척물을 추출하였다. 수성 용액의 pH를 HCl(물 중 37%)(4kg)로써 3.1까지 조절하였다. 여과에 의해 조 II를 분리하고 메탄올(12.7kg)로 세척하였다. 조 II 습윤 케이크를 메탄올(58kg) 중에 슬러리화하였다. 여과하여 고체를 분리하고, 메탄올(8.5kg)로 세척한 다음 감압하에 건조시켜 9.33kg의 II를 백색 분말로서 얻었다: ¹H NMR(D₂O) δ1.2 (d,3H), 3.45(q,2H), 3.7(q,2H), 4(m,2H), 4.2(q,2H), 4.35(dd,2H), 6.6(d,2H), 7(t,1H), 7.15(t,2H), 8.15(s,1H), 8.2(s,1H); ³¹P NMR(D₂O) δ15.0(분리됨).

GS-7171(III). (반응식 1) 유리속 입힌 반응기에 모노페닐 PMPA, (II)(9.12kg, 25.1mol) 및 아세토니트릴(30.7kg)을 담았다. 티오닐 클로라이드(6.57kg, 56.7mol)를 50℃ 미만으로 첨가하였다. 고체가 용해될 때까지 혼합물을 75℃에서 가열하였다. 반응 온도를 80℃까지 올리고 질소하에 대기압 증류에 의해 휘발성 물질(11.4kg)을 수집하였다. 포트 잔사를 25℃까지 냉각시키고, 디클로로메탄(41kg)을 첨가한 다음 -29℃까지 냉각시켰다. 디클로로메탄(36kg) 중 (L)-알라닌 이소프로필 에스테르(7.1kg, 54.4mol) 용액을 -18℃에서 60분에 걸쳐 첨가시킨데 이어, -18 내지 -11℃에서 30분에 걸쳐 트리에틸아민(7.66kg, 75.7mol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온까지 가온시키고 소듐 디하이드로겐포스페이트 용액(물 중 10%, 각 세척당 15.7kg)을 이용하여 5회 세척하였다. 유기 용액을 무수 황산나트륨(18.2kg)으로 건조시키고, 여과한 다음 디클로로메탄(28kg)으로 세척하고 감압하에 오일로 농축시켰다. 오일에 아세톤(20kg)을 채우고 감압하에 혼합물을 농축시켰다. 생성된 오일에 아세톤(18.8kg)을 채웠다. 생성 용액의 절반을, 22kg 실리카겔 60, 230 내지 400 메시의 38x38cm 베드를 통하여 크로마토그래피로 정제하였다. 480kg 아세톤으로 칼럼을 용출시켰다. 새로운 실리카겔 및 아세톤을 이용하여 오일의 절반에 대한 두번째 정제를 반복하였다. 분획을 포함하는 깨끗한 생성물을 감압하에 오일로 농축시켰다. 오일에 아세토니트릴(19.6kg)을 채우고 혼합물을 감압하에 농축시켰다. 아세토니트릴(66.4kg)을 채우고 용액을 0 내지 -5℃에서 16시간 동안 냉장하였다. 여과하여 고체를 제거하고 감압하에 여과물을 농축시켜 진한 오일로서 5.6kg의 III을 얻었다: ¹H NMR(CDCl₃) δ1.1(m,12H), 3.7(m,1H), 4.0(m,5H), 4.2(m,1H), 5.0(m,1H), 6.2(s,2H), 7.05(m,5H), 8.0(s,1H), 8.25(d,1H); ³¹P NMR(CDCl₃) δ21.0, 22.5(분리됨).

GS-7171(III)을 얻는 선택적인 방법

모노페닐 PMPA(II). 환류 응축기와 질소 주입구가 있는 둥근 바닥 플라스크를 70℃ 오일 전해조에 놓았다. 플라스크에 무수 PMPA(I)(19.2g, 67mmol), N,N-디메틸포름아미드(0.29g, 3.3mmol) 및 테트라메틸렌 설폰(40ml)을 채웠다. 티오닐 클로라이드(14.2g, 119mmol)를 4시간에 걸쳐 첨가하였다. 동일한 시간에 걸쳐 100℃까지 가열을 증가시켰다. 균질한 용액이 생성되었다. 페녹시트리메틸실란(11.7g, 70mmol)을 5분 동안 용액에 첨가하였다. 100℃ 오일 전해조에서의 가열을 2시간 동안 더 지속시켰다. 반응물을 0℃에서 냉각시키며 빠르게 교반중인 아세톤(400ml)에 부었다. 여과하여 고체를 분리하고, 감압하에 건조시켰으며 메탄올(75ml) 중에 용해시켰다. 포타슘 히드록사이드 용액(45% aq.)을 이용하여 얼음/물 중에 냉각시키며 용액의 pH를 3.0까지 조절하였다. 생성된 고체를 여과하여 분리하고, 메탄올로 세척한 다음 감압하에 건조시켜 백색 분말로서 20.4g의 II를 얻었다(반응식 2).

GS-7171(III). 모노페닐 PMPA(II)(3g, 8.3mmol), 테트라메틸렌 설폰(5ml) 및 N,N-디메틸포름아미드(한방울)를 40℃ 오일 전해조에 위치한 둥근 바닥 플라스크에서 혼합시켰다. 티오닐 클로라이드(1.96g, 16.5mmol)를 첨가하였다. 20분 후, 투명한 용액을 열로부터 이동시키고, 디클로로메탄(10ml)으로 희석시킨 다음 -10℃에서 디클로로메탄(20ml) 중 (L)-알라닌 이소프로필 에스테르(5g, 33mmol)와 디이소프로필에틸아민(5.33g, 41mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온까지 가온시키고 소듐 디하이드로겐포스페이트 용액(10% aq., 각 세척 당 10ml)으로 3회 세척하였다. 무수 황산나트륨를 통해 유기 용액을 건조시키고 감압하에 오일로 농축시켰다. 오일을 푸마르산(0.77g, 6.6mmol) 및 아세토니트릴(40ml)과 혼합시켜 환류로 가열시킴으로써 균질한 용액을 얻었다. 용액을 얼음 전해조에서 냉각시키고 여과하여 고체를 분리하였다. 고체 GS-7171 푸마레이트 염을 감압하에 3.7g으로 건조시켰다. 이 염(3.16g, 5.3mmol)을 디클로로메탄(30ml) 중에 현탁시키고 고체가 용해될 때까지 탄산칼륨 용액(5ml, 2.5M 수용액)과 함께 교반하였다. 유기층을 분리한 다음, 물(5ml)로 세척하고, 무수 황산나트륨를 통해 건조시켰으며, 감압하에 농축시켜 황갈색 포말로서 2.4g의 III을 얻었다.

실시예 3

A. 회분 용출 크로마토그래피에 의한 부분 입체 이성질체 분리

GS-7171(III)의 부분 입체 이성질체들을, Chiralpak AS, 20㎛, 21x50mm 가드(guard) 칼럼을 갖는 시판 Chiralpak AS, 20㎛, 21x50mm 세미-프랩(semi-preparative) HPLC 칼럼을 사용하여, 회분 용출 크로마토그래피로 분리하였다. ChiralpakAS는 Diacel사에서 제조되는 독점적인 충전 물질로서, Chiral Technologies, Inc.에 의하여 북미에서 판매된다(미국 특허 5,202,433, RE 35,919, 5,434,298, 5,434,299 및 5,498,752호). Chiralpak AS는 실리카겔 지지체상에 코팅된 아밀로세트리스[(S)-α-메틸벤질 카바메이트]로 구성된 키랄 고정상(CSP)이다.

GS-7171 부분 입체 이성질체 혼합물을 이동상에 용해시키고, 약 1g 분취량의 GS-7171을 크로마토그래피 시스템상에 펌핑하였다. GS-7339로 표시된, 소망하지 않는 부분 입체 이성질체가 칼럼으로부터 용출되는 첫번째 주요 넓은(약 15분 지속) 피크를 이룬다. GS-7339 피크의 용출이 완료되면, 이동상을 즉시 100% 메틸 알코올로 바꾸어, 이는 GS-7340(IV)로 표시된, 소망하는 부분 입체 이성질체가 메틸 알코올 용매 전면과 함께 칼럼으로부터 뾰족한 피크로 용출되도록 하였다. 총체적인 순환 시간을 단축시키기 위하여 메틸 알코올을 사용하였다. 첫번째 쌍을 주입한 후에, 부분 입체 이성질체 양자 모두는 정제된 부분 입체 이성질체 중 하나를 함유하는 큰 단일 분획으로서 수집되었다(>99.0% 단일 부분 입체 이성질체). 진공으로 이동상 용매를 제거하여, 무른 포말 형태로 정제된 부분 입체 이성질체를 얻었다.

출발 GS-7172 질량의 약 95%가 2종의 부분 입체 이성질체 분획으로 회수되었다. GS-7340 분획이 회수된 총 질량의 약 50%를 구성한다.

크로마토그래피 조건은 다음과 같았다:

이동상 (초기) : GS-7171-아세토니트릴:이소프로필 알코올(90:10)

(최종) : 100% 메틸 알코올

유출량 : 10ml/분

실행시간 : 약 45분

검출 : 275nm에서 UV

온도 : 주위 온도

용출 프로파일 : GS-7339 (부분 입체 이성질체 B)

: GS-7340 (부분 입체 이성질체 A; (IV))

B. SMB 크로마토그래피에 의한 GS-7171의 부분 입체 이성질체 분리

모의 동작 베드(SMB) 크로마토그래피에 대한 일반적인 설명은 Strube 등, "Organic Process Research and Development" 2:305-319(1998)을 참고한다.

GS-7340(IV). 10cm x 5cm 베드 패킹(Chiral Technologies Inc., 실리카겔 위에 코팅된 20 미크론 Chiralpak AS)(1.2kg) 위에서 모의 동작 베드 크로마토그래피로 GS-7171(III) 2.8kg을 정제하였다. 생성물 함유 분획을 IV의 아세토니트릴(2.48kg) 용액으로 농축시켰다. 상기 용액을 방치하여, 아세토니트릴로 젖은 결정성 덩어리로 응고시켰다. 결정성 덩어리를 감압하에 건조시켜 황갈색 결정성 분말, 1.301kg IV, 98.7% 부분 입체 이성질체 순도를 얻었다: mp 117-120℃; ¹H NMR(CHCl₃) δ1.15(m,12H), 3.7(t,1H), 4.0(m,5H), 4.2(dd,1H), 5.0(m,1H), 6.05(s,2H), 7.1(m,5H), 8.0(s,1H), 8.2(s,1H); ³¹P NMR(CDCl₃) δ21.0(분리됨).

C. C18 RP-HPLC에 의한 부분 입체 이성질체 분리

GS-7171(III)을 다음의 약식 프로토콜에 따라 역상 HPLC로 크로마토그래피하여, 부분 입체 이성질체들을 분리하였다.

크로마토그래피 칼럼: Phenomenex Luna™C18(2), 5㎛, 포어 크기 100Å, (Phenomenex, Torrance, CA) 또는 등가물

가드 칼럼: Pellicular C18 (Alltech, Deerfield, IL) 또는 등가물

이동상: A-0.02%(85%) H₃PO₄ 수용액 : 아세토니트릴 (95:5)

B-0.02%(85%) H₃PO₄ 수용액 : 아세토니트릴 (50:50)

이동상 구배

실행시간 50분

평형 지연시간 100% 이동상 A에서 10분

유속 1.2ml/분

온도 주위 온도

검출 260nm에서 UV

시료 용액 20mM 소듐 포스페이트 완충액, pH 6

보류 시간 GS-7339, 약 25분

GS-7340, 약 27분

D. 결정화에 의한 부분 입체 이성질체 분리

GS-7340(IV). GS-7171의 아세토니트릴 용액을 감압하에 호박색 포말(14.9g)로 농축시켰다. 포말을 아세토니트릴(20ml)에 용해시키고 IV 결정으로 시드(seed)하였다. 혼합물을 밤새도록 교반하고, 5℃까지 냉각시킨 다음 여과하여 고체를 분리시켰다. 고체를 건조시켜, 백색 결정으로서 2.3g IV, 98% 부분 입체 이성질체 순도(³¹P NMR)로 얻었다: ¹H NMR(CDCl₃) δ1.15(m,12H), 3.7(t,1H), 3.95(m,2H), 4.05(m,2H), 4.2(m,2H), 5.0(m,1H), 6.4(s,2H), 7.1(m,5H), 8.0(s,1H), 8.2(s,1H),; ³¹P NMR(CHCl₃) δ19.5(분리됨). 이 생성물로부터 선택된 단결정의 X-선 결정 분석으로 다음과 같은 데이터를 얻었다:

결정 색, 습성(Habit) 무색, 칼럼

결정 크기 0.25 x 0.12 x 0.08mm

결정계 사방정계

격자형 원시형

격자 매개변수 a = 8.352(1)Å

b = 15.574(2)Å

c = 18.253(2)Å

d = 2374.2(5)

공간군 P2₁2₁2₁(#19)

Z 수치 4

D_calc 1.333g/cm³

F₀₀₀ 1008.00

μ(MoKα) 1.60cm^-1

실시예 4

GS-7340 푸마레이트 염의 제조

GS-7340-02(V). (반응식 1) 유리속 입힌 반응기에 GS-7340(IV)(1.294kg, 2.71mol), 푸마르산(284g, 2.44mol) 및 아세토니트릴(24.6kg)을 담았다. 고체가 용해되도록 혼합물을 환류로 가열하고, 뜨거운 동안 여과한 다음 16시간 동안 5℃까지 냉각시켰다. 생성물을 여과하여 분리하고, 아세토니트릴(9.2kg)을 이용하여 세척하였으며 백색 고체로서 1329g (V)로 건조시켰다: mp 119.7-121.1℃; [α]_D ²⁰-41.7°(c 1.0, 아세트산).

실시예 5

GS-7120(VI)의 제조

5L 둥근 바닥 플라스크에 모노페닐 PMPA, (II)(200g, 0.55mol) 및 아세토니트릴(0.629kg)을 담았다. 티오닐 클로라이드(0.144kg, 1.21mol)를 27℃ 이하로 첨가하였다. 고체가 용해될 때까지 70℃에서 혼합물을 가열하였다. 질소하 대기압 증류에 의해 휘발성 물질(0.45L)을 제거하였다. 포트 잔사를 25℃까지 냉각시키고, 디클로로메탄(1.6kg)을 첨가한 다음 혼합물을 -20℃까지 냉각시켰다. 디클로로메탄(1.33kg) 중 (L)-α아미노부티르산 에틸 에스테르(0.144kg, 1.1mol) 용액을 -20 내지 -10℃에서 18분에 걸쳐 첨가시킨데 이어 트리에틸아민(0.17kg, 1.65mol)을 -8 내지 -15℃에서 15분에 걸쳐 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온까지 가온시키고 소듐 디하이드로겐포스페이트 용액(10% aq., 각 세척 당 0.31L)을 이용하여 4회 세척하였다. 무수 황산나트륨(0.5kg)로써 유기 용액을 건조 및 여과시켰다. 디클로로메탄(0.6kg)으로 고체를 세척하고 혼합 여과물 및 세척물을 감압하에 오일로 농축시켰다. 1.2kg 실리카겔 60, 230 내지 400 메시의 15 x 13cm 베드위에서 크로마토그래피에 의해 오일을 정제하였다. 디클로로메탄 및 메탄올 구배로 칼럼을 용출시켰다. 분획을 포함하는 생성물을 감압하에 농축시켜 황갈색 포말로서 211g VI(반응식 3)을 얻었다.

실시예 5a

회분 용출 크로마토그래피에 의한 GS-7120의 부분 입체 이성질체 분리

실시예 3A에서, 다음을 제외하고, GS-7171에 대하여 기술한 조건을 이용하여 부분 입체 이성질체 혼합물을 정제하였다.

이동상 (초기): GS-7120-아세토니트릴 : 이소프로필 알코올(98:2)

(최종): 100% 메틸 알코올

용출 프로파일 : GS-7341 (부분 입체 이성질체 B)

: GS-7342 (부분 입체 이성질체 A)

실시예 6

결정화에 의한 GS-7120의 부분 입체 이성질체 분리

1L 둥근 바닥 플라스크에 모노페닐 PMPA, (II)(50g, 0.137mol) 및 아세토니트릴(0.2L)을 담았다. 고체가 용해될 때까지 혼합물을 가열 환류하였다. 질소하 대기압 증류에 의해 휘발성 물질(0.1L)을 제거하였다. 포트 잔사를 25℃까지 냉각하고, 디클로로메탄(0.2kg)을 첨가한 다음 혼합물을 -20℃까지 냉각시켰다. 디클로로메탄(0.67kg) 중 (L)-α아미노부티르산 에틸 에스테르(0.036kg, 0.275mol) 용액을 -20 내지 -8℃에서 30분에 걸쳐 첨가하고, 이어서 트리에틸아민(0.042kg, 0.41mol)을 -6℃ 미만에서 10분에 걸쳐 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온까지 가온시키고 소듐 디하이드로겐포스페이트 용액(10% 수용액, 각 세척 당 0.075L)으로 4회 세척하였다. 유기 용액을 무수 황산나트륨(0.1kg)으로 건조시키고 여과하였다. 에틸 아세테이트(0.25L)를 이용하여 고체를 세척하고 혼합 여과물 및 세척물을 감압하에 오일로 농축시켰다. 오일을 에틸 아세테이트(0.25L)로 희석시키고, 시드(seed), 밤새도록 교반 및 -15℃까지 냉각을 수행하였다. 여과하여 고체를 분리하고 감압하에 건조시켜 황갈색 분말로서 17.7g의 GS-7342(표 5)를 얻었다: ¹H NMR(CDCl₃) δ0.95(t,3H), 1.3(m,6H), 1.7(m,2H), 3.7(m,2H), 4.1(m,6H), 4.4(dd,1H), 5.8(s,2H), 7.1(m,5H), 8.0(s,1H), 8.4(s,1H); ³¹P NMR(CDCl₃) δ21(분리됨).

실시예 7

GS-7097의 부분 입체 이성질체 분리

다음을 제외하고, GS-7171에 대하여 기술한 조건(실시예 3A)을 이용하여 부분 입체 이성질체 혼합물을 정제하였다:

이동상 (초기): GS-7120-아세토니트릴 : 이소프로필 알코올 (95:5)

(최종): 100% 메틸 알코올

용출 프로파일 : GS-7115 (부분 입체 이성질체 B)

: GS-7114 (부분 입체 이성질체 A)

실시예 8

GS-7097의 선택적인 제조 방법

GS-7097: 페닐 PMPA, 에틸 L-알라닐 아미데이트. 페닐 PMPA(15.0g, 41.3mmol), L-알라닌 에틸 에스테르 하이드로클로라이드(12.6g, 83mmol) 및 트리에틸아민(11.5ml, 83mmol)을 건조 N₂ 하에 500ml 피리딘 중에 함께 현탁시켰다. 이 현탁액을 트리페닐포스핀(37.9g, 145mmol), 알드리티올2 (2,2'-디피리딜 디설파이드)(31.8g, 145mmol) 및 120ml 피리딘의 용액과 혼합시켰다. 혼합물을 내부 온도 57℃에서 15시간 동안 가열하였다. 완전한 반응물을 진공하에 황색 페이스트, 100g으로 농축시켰다. 페이스트를 1.1kg 실리카겔 60, 230 내지 400 메시의 25x11cm 베드 위에서 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다. 칼럼을 2% 메탄올 디클로로메탄 용액 8 리터로 용출시키고, 이어서 26 리터의 용출이 진행되는 동안 메탄올의 최종 조성이 13%가 될 때까지 선형 구배로 용출시켰다. 깨끗한 생성물을 함유하는 분획을 농축시켜 12.4g의 조 생성물 (5), 65% 이론치를 얻었다. ¹H NMR에 의하면 이 물질은 약 15(중량)%의 트리에틸아민 하이드로클로라이드로 오염되어 있었다. 생성물을 350ml 에틸 아세테이트에 용해시키고 20ml의 물로 추출하고, 무수 황산나트륨를 통해 유기 용액을 건조 및 농축시켜 오염물을 제거하였으며, 백색 고체로서 순수한 GS-7097 11.1g을 58% 수율로 얻었다. GS-7003a와 GS-7003b(페닐알라닐 아미데이트)의 부분 입체 이성질체 혼합물 및 GS-7119와 GS-7335(글리실 아미데이트)의 혼합물을 합성하기 위하여 또한 이 방법을 적용한다. 실시예 3A, 6 및 7에서 기술한 회분 용출 방법을 이용하여 이들 부분 입체 이성질체를 분리한다.

실시예 9

전구 약물 부분 입체 이성질체의 생체외 연구

MT-2 세포에서 생체외 항-HIV-1 활성 및 세포 독성과, GS-7340(프리베이스) 및 테노포비르 디소프록실 푸마레이트(TDF)의 MT-2 세포 추출물 및 사람의 혈장에서의 안정성을 표 1에 표시한다. GS-7340은 TDF와 비교하여 항바이러스 활성에서 10배 증가를, 혈장 안정성에서 200배 증가를 나타낸다. 이와 같이 더 큰 혈장 안정성으로 인하여 경구 투여 후 TDF에 비하여 GS-7340의 혈중 농도(circulating level)가 보다 높을 것으로 예상된다.

TDF의 세포내 대사에서 초래된 상대적인 세포내 PMPA를 GS-7340으로부터의 것과 비교 측정하기 위하여, 양쪽 전구 약물과 PMPA를 방사 표지화하고, 동일한 몰 농도로 사람의 완전한 전체 혈액내에 스파이크시켰다. 1시간 후에 혈장, 적혈구(RBC) 및 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 분리하고, 방사 분석 검출을 이용하는 HPLC로 분석하였다. 그 결과를 표 2에 표시한다.

1시간 후, GS-7340은 TDF 및 PMPA와 비교하여 PBMC에서 각각 10x 및 30x의 총 세포내 PMPA 농도를 야기시켰다. 1시간 후에 혈장에서는 84%의 방사능이 완전한 GS-7340에 기인하는 것인 반면에, 1시간 시점에서 TDF는 검출되지 않았다. 혈장에서 완전한 TDF가 검출되지 않았으므로, 1시간 시점에서 TDF와 GS-7340간 10x 차이는 생체내에서 예상되는 최소한의 차이가 된다. PBMC에서 세개의 모든 화합물에 대한 HPLC 크로마토그램을 도 1에 표시한다.

Met.X 및 Met.Y(대사 산물 X와 Y)를 표 5에 표시한다. 아래 첨자 "p"는 인산화를 나타낸다. 1시간 후 사람의 혈장으로부터 이 결과를 얻었다. 84%의 GS-7340이 한시간 후에도 혈장에서 여전히 완전하므로, 시간을 증가시키면 생체외 차이가 증가할 것으로 예상된다. 완전한 GS-7340이 경구 투여 후 혈장에 존재하기 때문에 상대적인 임상 효능은 생체외에서 관찰된 IC₅₀수치와 관련이 있다.

이하 표 3에는 테노포비르, TDF, GS-7340, 여러 가지 뉴클레오사이드 및 프로테아제 억제제 넬피나비르의 IC₅₀ 수치를 정리하였다. 제시된 바와 같이, 넬피나비르와 GS-7340은 모든 그밖의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드보다 2-3등급 더 유효하다.

추가로 본 발명에 따라 분리된 부분 입체 이성질체의 생체외 세포 배양 항-HIV-1 활성 및 CC₅₀에 대한 연구가 수행되었고, 그 결과를 이하에 도표화하였다.

"Phe-메틸에스테르"는 메틸페닐알라니닐 모노아미데이트, 테노포비르의 페닐 모노에스테르이고; "gly-메틸에스테르"는 메틸글리실 모노아미데이트, 테노포비르의 페닐 모노에스테르이다.

상기 각 실례에서, 이성질체 A는 GS-7340(S)과 동일한 절대 입체 화학을 갖는 것으로, 이성질체 B는 GS-7339와 동일한 절대 입체 화학을 갖는 것으로 믿어진다.

분리된 부분 입체 이성질체의 생체외 대사 및 안정성을 PLCE, MT-2 추출물 및 사람의 혈장에서 측정하였다. 후술하는 생물 시료 80㎕를 스크류-캡 원심분리 튜브로 옮기고 37℃에서 5분간 배양하였다. 실험 화합물 0.2mg/ml를 함유하는 적절한 완충액 20㎕를 생물 시료에 첨가하고 혼합시켰다. 상기 반응 혼합물 20㎕를 즉시 시료로 하여, HPLC 분석의 내부 기준 물질로서 0.015mg/ml의 2-히드록시메틸나프탈렌을 함유하는 60㎕의 메탄올과 혼합하였다. 이 시료를 0-시간 시료로서 취하였다. 그 다음, 특정 시점에서 반응 혼합물 20㎕를 시료로 만들고, 내부 기준물을 함유하는 60㎕의 메탄올과 혼합하였다. 이와 같이 얻어진 혼합물을 15,000G에서 5분간 원심분리하고, 상등액을 후술하는 조건하에 HPLC로 분석하였다.

평가된 생물 시료는 다음과 같다.

(1) PBS(인산완충 식염수)로 20배 희석시킨 PLCE (Sigma 사의 돼지간 카르복시에스테라제, 160u/mg 단백질, 21mg 단백질/ml)

(2) 배지로서 후술하는 HEPES를 이용한 것 이외에는 공개 방법 [A.Pompon, I. Lefebvre, J.-L. Imbach, S. Kahn 및 D. Farquhar, "Antiviral Chemistry & Chemotherapy", 5:91-98(1994)]에 따라, MT-2 세포 추출물을 MT-2 세포로부터 제조하였다.

(3) 사람의 혈장 (George King Biomedical Systems, Inc.의 혼주된 정상 사람의 혈장)

연구에 이용된 완충계는 다음과 같다.

PLCE 연구에서, 실험 화합물을 PBS에 용해시켰다. PBS(인산완충 식염수, Sigma)는 0.01M 포스페이트, 0.0027M 염화칼륨 및 0.137M 염화나트륨을 포함한다. 37℃에서 pH 7.4.

MT-2 세포 추출물 연구에서, 실험 화합물을 HEPES 완충액에 용해시켰다. HEPES 완충액은 0.010M HEPES, 0.05M 염화칼륨, 0.005M 마그네슘 클로라이드 및 0.005M dl-디티오트레이톨을 포함한다. 37℃에서 pH 7.4.

사람의 혈장 연구에서, 실험 화합물을 TBS에 용해시켰다. TBS(트리스-완충 식염수, Sigma)는 0.05M 트리스, 0.0027M 염화칼륨 및 0.138M 염화나트륨을 포함한다. 37℃에서 pH 7.5.

다음 조건하에 HPLC 분석을 수행하였다.

칼럼: Zorbax R_x-C₈, 4.6 x 250mm, 5μ

(MAC-MOD Analytical, Inc. Chadds Ford, PA)

검출: 260nm에서 UV

유속: 1.0ml/분

실행시간: 30분

주입 용적: 20㎕

칼럼온도: 상온

이동상 A: 50mM 인산칼륨(pH 6.0)/(CH₃CN = 95/5(v/v)

이동상 B: 50mM 인산칼륨(pH 6.0)/(CH₃CN = 50/50(v/v)

구배 흐름: 0분 100% 이동상 A

25분 100% 이동상 B

30분 100% 이동상 B

이 결과를 하기 표 5에 표시한다 (또한 표 4에서 선택된 IC₅₀ 수치 포함).

실시예 10

전구 약물 부분 입체 이성질체를 비글개(beagle dog)에 경구 투여한 후의 혈장 및 PBMC 노출

10 mg-eq/kg 투여량을 경구 투여한 후의 개를 대상으로 GS7340의 약동학을 연구하였다.

제제화. 전구 약물을 투여 전 0.5 시간 이내에 50mM 시트르산 용액으로서 제제화하였다. 연구에 사용된 모든 화합물은 길리애드 사이언스사에서 합성되었다. 하기 롯트가 사용되었다:

투여 및 시료 수집. 본 연구의 생체 임상(in-life phase)은 "실험실 동물의 관리 및 사용 안내" (National Institutes of Health publication 86-23)의 권고에 따라 수행되었으며, 동물 관리 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았다. 절식시킨 수컷 비글개(10 ±2kg)를 연구에 사용하였다. 각각의 약물을 1회 투여량으로서 경구 섭식(oral gavage)에 의하여 투여하였다(1.5-2ml/kg). 투여량은 10mg-당량/kg의 PMPA이었다. PBMC 분석용으로, 0(투여전), 2, 8, 및 24시간 투여 경과 시에 혈액 시료를 수집하였다. 혈장 분석용으로, 0(투여전), 5, 15, 및 30분과, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 및 24시간 투여 경과 시에 혈액 시료를 수집하였다. 혈장 분석용의 혈액(1.0ml)을 즉시 2,000rpm에서 10분간 원심분리시켰다. 혈장 시료를 동결시켜 분석 때까지 70℃에서 유지하였다.

말초혈액 단핵세포(PBMC) 제조. 특정 시점에 채취한 전혈(8ml)를 같은 비율의 인산 완충 식염수(PBS)와 혼합하고, 15ml의 피콜-파크 용액(Pharmacia Biotech) 상에 층상화한 다음, 40분간 400 ×g로 원심분리시켰다. PBMC 층을 분리하여 PBS로 1회 세척하였다. 형성된 PMBC 펠렛(pellet)을 PBS 0.5ml 용액으로 재구성하고, 세포를 재현탁시켜 혈구 계수기(hemocytometer)를 사용하여 계수한 다음, 분석 때까지 70℃로 유지하였다. 평균 단일 세포 용적과 곱한 세포의 수를 세포내 농도의 계산에 이용하였다. 보고치(reported value) 200펨토리터/세포를 휴지(resting) PBMC 용적으로 사용하였다 (B.L.Robins, R.V.Srinivas, C.Kim, N.Bischofberger, and A.Fridland, Antimicrob. Agent Chemother. 42, 612(1998).

혈장과 PBMC 내 PMPA와 전구 약물의 측정. PMPA를 클로로아세트알데히드로 유도체화하여 고형광의 N1,N6-에테노아데닌 유도체를 얻는 것에 의하여, 개의 혈장 시료 내 PMPA 농도를 결정하였다 (L.Naesens, J.Balzarini, and E.De Clercq, Clin. Chem. 38, 480(1992). 요약하면, 혈장(100μl)을 아세토니트릴 200μl와 혼합하여 단백질을 침전시켰다. 그 다음, 시료를 실온, 감압 하에서 증발시켜 건조하였다. 건조 시료를 200μl 유도체화 반응 혼합액 (0.34% 클로로아세트알데히드의 100mM의 소듐 아세테이트 용액, pH 4.5)에 다시 용해시키고, 와류시키고, 원심분리하였다. 그 다음, 상등액을 깨끗한 스크류-캡 튜브(screw-cap tube)로 옮겨 95℃에서 40분간 배양하엿다. 그 다음, 유도체화된 시료를 증발시켜 건조하고, HPLC 분석을 위하여 100μl의 물에 다시 용해시켰다.

세포내 PMPA를 HPLC로 측정하기 전에, PBMC 추출물에 존재하는 다량의 아데닌 관련 리보뉴클레오티드를 선택적 산화에 의하여 제거해야 하였다. 본 발명자들은 Tanaka 등이 사용한 방법을 변형하여 사용하였다 (K. Tanaka, A. Yoshioka, S. Tanaka, and Y. Wataya, Anal. Biochem., 139, 35(1984). 요약하면, PBMC 시료를 메탄올과 1:2로 혼합하고, 감압 하에서 증발시켜 건조하였다. 건조 시료를 혈장 분석에 기재된 방법으로 유도체화하였다. 유도체화된 시료를 20μl의 1M 람노스 및 30μl의 0.1M 소듐 퍼요오데이트와 혼합하고, 5분간 37℃에서 배양시켰다. 배양에 이어, 4M 메틸아민 40μl와 0.5M 이노신 20μl를 첨가하였다. 30분간 37℃에서 배양하고, 시료를 감압 하에 증발시켜 건조한 다음, HPLC 분석을 위하여 물에 다시 용해시켰다.

무손상 전구 약물은 어떠한 PBMC 시료에서도 검출되지 않았다. 무손상 전구 약물을 잠재적으로 함유하는 혈장 시료에 대하여, 실험을 수행하여, 유도체화 중에 PMPA로의 추가적인 전환이 일어나지 않았다는 것을 확인하였다. 전구 약물 표준 물질을 약물이 없는 혈장에 첨가하여, 기술한 바와 같이 유도체화하였다. 어떠한 혈장 시료에서도 검출 가능한 수준의 PMPA가 존재하지 않았고, 예측된 전환 %는 1% 미만이었다.

HPLC 체계는 AS3000 자동 주입기와 F2000 형광 검출기를 갖는 P4000 용매 전달 체계로 구성되었다 (Thermo Separation, San Jose, CA). 칼럼은 Inertsil ODS-2 칼럼이었다 (4.6 ×150 mm). 사용된 이동상은 다음과 같았다: A, 5mM 테트라부틸 암모늄 브로마이드(TBABr)를 함유하는 25mM 인산칼륨 완충액에 용해된 5% 아세토니트릴, pH 6.0; B, 5mM TBABr을 함유하는 25mM 인산칼륨 완충액에 용해된 60% 아세토니트릴, pH 6.0. 유속은 2ml/분이었고, 칼럼 온도는 칼럼 오븐에 의해 35℃로 유지하였다. 구배 프로파일은 PMPA의 경우 10분간 90% A/10% B이었고, 전구 약물의 경우 10분간 65% A/35% B이었다. 236nm에서의 여기(excitation)와 420nm에서의 방출(emission)을 갖는 형광에 의하여 검출하였고, 주입 용적은 10μl이었다. 데이터를 얻고, 실험 데이타 획득 체계(laboratory data acquisition system)으로 저장하였다 (PeakPro, Beckman, Allendale, NJ).

약동학 계산. PMPA와 전구 약물 노출을 0 내지 24시간에 걸쳐 혈장 또는 PBMC 내 농도 곡선 아래의 면적으로서 표현하였다(AUC). AUC 값은 사다리꼴 법칙을 사용하여 계산하였다.

혈장과 PBMC 농도. 도 2와 도 3에 본 연구의 결과를 도시하였다. 도 2는 PMPA 전구 약물의 순수 부분 입체 이성질체를 경구 투여한 후 혈장과 PBMC 노출의 GS7340-2 대사 개요의 시간에 따른 진행을 보여준다.

도 2의 막대 그래프는 PMPA s.c., TDF와 아미데이트 에스테르 전구 약물의 투여 후 개의 PBMC와 혈장 내 테노포비르의 AUC(0-24 시간)를 보여준다. 모든 아미데이트 전구 약물이 PBMC 노출에서 증가를 나타내었다. 예를 들어, GS 7340은 PMPA s.c.와 TDF와 대비하여 PBMC 노출이 ~ 21배 증가하였고; 혈장 노출은 각각 6.25배와 1.29배 감소하였다.

이러한 데이타는 GS7340이 경구로 전달되어, PMPA에 대한 전신 노출(systemic exposure)을 최소화하고, HIV 복제에 일차적으로 책임이 있는 세포 내에서 PMPA의 세포내 농도를 크게 증가시킬 수 있다는 것을 생체내(in vivo)에서 확립하는 것이다.

실시예 11

GS-7340의 체내 분포(biodistribution)

GS-7340의 전임상(preclinical) 특성의 일부로서, 개의 체내 분포를 측정하였다. GS-7340 (이소프로필 알라니닐 모노아미데이트, 테노포비르의 페닐 모노에스테르)의 조직 분포를 비글개에게 경구 투여하여 조사하였다. 수컷 2마리에게 ¹⁴C=GS-7340 (8.85mg-당량의 PMPA/kg, 33.2μCi/kg; 아데닌의 8-탄소를 표지화) 수용액(50 mM 시트르산, pH 2.2)을 경구 투여하였다. 혈장과 말초혈액 단핵세포 (PBMC)를 24 시간에 걸쳐 얻었다. 뇨와 분변을 24 시간 동안 케이지 수집(cage collected)하였다. 투여 후 24 시간 경과 시에, 동물을 치사시켜 분석을 위하여 조직을 떼어냈다. 조직 내 총 방사능 활성을 산화 및 액체 섬광 계수기(liquid scintillation counting)로 측정하였다.

방사능 표지된 GS7340을 1회 경구 투여하고 24 시간 경과 후의 PMPA의 체내 분포를, TDF (GS-4331)로 수행한 이전 연구 데이터와 함께 표 4에 제시하였다. TDF의 경우에는, 혈장 내 전구 약물의 농도가 분석 검출의 수준 이하이며, 혈장 내에서 관찰된 주요 종은 모약물이다. 림프 조직, 골수, 및 골격근 내의 PMPA 수준은 GS-7340 투여 후 10 배 증가된다.

림프 조직은 기본적으로 림프구로 구성되므로, 림프 조직 내의 축적은 PBMC 분석에서 관찰된 데이타와 일치한다. 마찬가지로, 골수 내의 축적은 아마도 이 조직 내 림프구의 높은 퍼센트(70%)에서 비롯된다.

* 통상 회수율 15 ×10⁶총세포 및 평균 PMBC 용적 0.2 피코리더/세포를 사용하여 계산

n.s.= 무시료, n.a.= 적용불가, n.d.= 측정불가.

Claims

(a) 1종 이상의 메톡시포스포네이트 뉴클레오티드 유사체 전구 약물을 제공하는 단계,

(b) 하나 이상의 치료 표적 조직과 하나 이상의 비표적 조직을 선택하는 단계,

(c) 상기 전구 약물을 상기 표적 조직 및 상기 하나 이상의 비표적 조직에 투여하되, 상기 치료 표적 조직과 비표적 조직은 인간의 생체 내에 존재하는 것이 아닌 단계, 및

(d) 단계 (c)의 조직에서 전구 약물에 의하여 부여되는 상대적인 항바이러스 활성 또는 항종양 활성을 측정하는 단계를 포함하는,

표적 조직 내에서 향상된 활성을 부여하는 메톡시포스포네이트 뉴클레오티드 유사체 전구 약물을 확인하는 스크리닝 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 활성은 항바이러스 활성인 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 활성은 항 인간 면역 결핍 바이러스 또는 항 B형 간염 바이러스 활성인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 전구 약물은 9-[2-(포스포노메톡시)프로필]아데닌 또는 9-[2-(포스포노메톡시)에틸]아데닌의 전구 약물인 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 전구 약물은 포스포노아미데이트, 포스포노에스테르 또는 혼합된 포스포노아미데이트/포스포노에스테르인 것인 방법.
제6항에 있어서, 상기 아미데이트는 아미노산 아미데이트인 것인 방법.
제6항에 있어서, 상기 에스테르는 아릴 에스테르인 것인 방법.
제1항에 있어서, 비표적 조직에서의 상대적인 항바이러스 활성 또는 항종양 활성에 비하여 표적 조직에서의 상대적인 항바이러스 활성 또는 항종양 활성이 10배 이상 큰 전구 약물을 선택하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 표적 조직과 비표적 조직은 동물 내에 있는 것이고, 상기 전구 약물을 동물에게 투여하여, 전구 약물을 투여한 후에 동물 조직을 분석하는 것에 의하여 상대적인 항바이러스 활성 또는 항종양 활성을 측정하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 표적 조직과 비표적 조직 내에서의 활성은 상기 표적 조직과 비표적 조직 내 전구 약물의 대사 산물 1종 이상의 양을 분석하는 것에 의하여 측정되는 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 대사 산물은 모약물인 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 대사 산물은 모약물의 디포스페이트인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 표적 조직은 바이러스에 감염된 조직이고, 상기 비표적 조직은 바이러스에 감염되지 않은 동일 조직인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 표적 조직은 림프 조직이고, 상기 활성은 항 인간 면역 결핍 바이러스 활성인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 표적 조직은 간이고, 상기 활성은 항 B형 간염 바이러스 활성인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 표적 조직은 혈액작용성 조직이고, 상기 활성은 항종양 활성인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 표적 조직은 악성 조직이고, 상기 비표적 조직은 악성이 아닌 동일 조직인 것인 방법.
Ra가 H 또는 메틸인 하기 구조식 (1)을 갖는 화합물 또는 한 가지 부분 입체 이성질체가 나머지 부분 이성질체에 비하여 풍부한 것인 하기 구조식 (1) 화합물의 부분 입체 이성질체의 혼합물, 또는 이들의 염, 유리 염기 또는 용매 화합물.
하기 구조식 (2)를 갖는 화합물 또는 한 가지 부분 입체 이성질체가 나머지 부분 이성질체에 비하여 풍부한 하기 구조식 (2)의 화합물, 또는 이의 염, 유리 염기 또는 용매 화합물.
하기 부분 입체 이성질체 (4)가 없는,

한 가지 부분 입체 이성질체의 순도가 높은 하기 구조식 (3)의 화합물, 또는 이의 염, 유리 염기 또는 용매 화합물.

식 중에서,

R¹은 생체 내에서 가수분해될 수 있는 옥시에스테르 또는 히드록실이고;

B는 헤테로고리 염기이며;

R²는 히드록실, 또는 아미노산의 아미노기를 통하여 P 원자에 결합되는 아미노산의 잔기로서, 선택적으로 에스테르화되는 아미노산의 각각의 카르복시 치환기를 갖는 것이지만, R¹과 R² 모두가 히드록실은 아닌 것이고;

E는 -CH₂O(CH₂)₂-, -CH₂OCH(CH₃)CH₂-, -CH₂OCH(CH₂F)CH₂-, -CH₂OCH(CH₂0H)CH₂-, -CH₂OCH(CHCH₂)CH₂-, -CH₂OCH(C≡CH)CH₂-, -CH₂OCH(CH₂N₃)CH₂-,

-CH₂OCH(R⁶)OCH(R^6')-, -CH₂OCH(R⁹)CH₂O- 또는 -CH₂OCH(R⁸)O-로서, 우측 결합이 헤테로고리 염기와 연결되는 것이고;

점선은 선택적 이중결합을 나타내는 것이며;

R⁴와 R⁵는 독립적으로 수소, 히드록시, 할로, 아미노, 또는 아실옥시, 알킬옥시, 알킬티오, 알킬아미노 및 디알킬아미노 중에서 선택되는 1-5개의 탄소 원자를 갖는 치환기이고;

R⁶과 R^6'는 독립적으로 H, C₁-C₆ 알킬, C₁-C₆ 히드록시알킬 또는 C₂-C₇ 알카노일이고;

R⁷은 독립적으로 H, C₁-C₆ 알킬이거나, 또는 함께 -O- 또는 -CH₂-를 형성하는 것이고,

R⁸은 H, C₁-C₆ 알킬, C₁-C₆ 히드록시알킬 또는 C₁-C₆ 할로알킬이고;

R⁹는 H, 히드록시메틸 또는 아실옥시메틸이다.
하기 부분 입체 이성질체 (5b)가 없는,

한 가지 부분 입체 이성질체의 순도가 높은 하기 구조식 (5a)의 화합물, 또는 이의 염, 호변체, 유리 염기 또는 용매 화합물.

식 중에서,

R⁵는 메틸 또는 수소이고;

R⁶은 독립적으로 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴 또는 아릴알킬이거나, 또는 R⁶은 독립적으로 알킬아미노, 알킬아미노알킬, 디알킬아미노알킬, 디알킬아미노, 히드록실, 옥소, 할로, 아미노, 알킬티오, 알콕시, 알콕시알킬, 아릴옥시, 아릴옥시알킬, 아릴알콕시, 아릴알콕시알킬, 할로알킬, 니트로, 니트로알킬, 아지도, 아지도알킬, 알킬아실, 알킬아실알킬, 카르복실 또는 알킬아실아미노 중에서 선택되는 1 내지 3개의 치환기로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴 또는 아릴알킬이고;

R⁷은 천연 또는 약제학적으로 허용 가능한 아미노산의 측쇄이며, 상기 측쇄가 카르복실을 포함하는 경우에 그 카르복실기는 선택적으로 알킬 또는 아릴기로 에스테르화된 것이고;

R¹¹은 아미노, 알킬아미노, 옥소 또는 디알킬아미노이고;

R¹²는 아미노 또는 H이다.
하기 구조식 (6)을 갖는 화합물, 이의 염 또는 용매 화합물.
하기 구조식 (7)을 갖는 화합물.
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하기 구조식 (6b)로 표시되는 부분 입체 이성질체가 없는,

한 가지 부분 입체 이성질체의 순도가 높은 구조식 (6a) 화합물, 이의 염 또는 용매 화합물.
하기 구조식 (7b)로 표시되는 부분 입체 이성질체가 없는,

한 가지 부분 입체 이성질체의 순도가 높은 구조식 (7a) 화합물, 이의 염 또는 용매 화합물.
제19항 내지 제24항, 제34항 및 제35항 중 어느 한 항에 따른 화합물과 약제학적으로 유효한 부형제를 포함하는, 항바이러스 치료 또는 예방용 조성물.
제36항에 있어서, 상기 부형제는 젤인 조성물.
제36항에 있어서, 국소 투여에 적합한 것인 조성물.
제19항 내지 제24항, 제34항 및 제35항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에게 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는, 항바이러스 치료 또는 예방용 조성물.