PT1301519E - Profármacos de análogos de nucleótidos de fosfonato e métodos para selecionar e preparar os mesmos - Google Patents

Profármacos de análogos de nucleótidos de fosfonato e métodos para selecionar e preparar os mesmos Download PDF

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Gong-Xin He
William A Lee
Mark W Becker
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Eugene J Eisenberg
Michael R Kernan
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Description

DESCRIÇÃO
PROFÁRMACOS DE ANÁLOGOS DE NUCLEOTIDOS DE FOSFONATO E MÉTODOS PARA SELECIONAR E PREPARAR OS MESMOS
Este pedido refere-se a profármacos de análogos de nucleósidos de metoxifosfonato. Em particular, esta refere-se a métodos melhorados para preparar e identificar os ditos profármacos.
Conhecem-se muitos análogos de nucleótidos de metoxifosfonato. Em geral, os ditos compostos têm a estrutura A-OCH2P (0) (OR) 2 onde A é o resíduo de um análogo de nucleósido e R é independentemente hidrogénio ou diversas funcionalidades protetoras ou de profármacos. Vejam-se as Patentes dos Estados Unidos N° 5.663.159, 5.977.061 e 5.798.340, Oliyai et al, "Pharmaceutical Research" 16(11):1687-1693 (1999), Stella et al.f (J. M ed. Chem, 23(12) :1275-1282 (1980) . Aarons, L.,
Boddy, A, e Petrak, K. (1989) Novel Drug Delivery and Its Therapeutic Application (Prescott, L. F. e Nimmo, W. S., ed., páginas. 121-126; Bundgaard, H. (1985) Design of Prodrugs (Bundgaard, H., ed.) páginas 70-74 e 79-92; Banerjee, P. K. e Amidon, G. L. (1985) Design of Prodrugs (Bundgaard, H., ed.) páginas. 118-121; Notari, R. E. (1985) Design of Prodrugs (Bundgaard, H., ed.) páginas 135-156; Stella, V. J. arid Himmelstein, K. J. (1985) Design of Prodrugs (Bundgaard, H., ed.) páginas 177-198; Jones, G. (1985) Design of Prodrugs (Bundgaard, H., ed.) páginas 199-241; Connors, T. A. (1985) Design of Prodrugs (Bundgaard, H., ed.) páginas 291-316. O documento US 5.977.089 divulga ésteres de análogos de nucleótidos de fosfonometoxi com carbonatos ou carbamatos. Os ésteres são úteis para a terapêutica ou profilaxia antiviral oral. O documento EP 481 214 divulga profármacos orais de análogos de nucleótidos de fosfonato que são hidrolisáveis em condições fisiológicas para produzir agentes antivirais. 0 documento WO 95/07920 divulga análogos de nucleótidos que compreendem uma ligação fosfoamidato ou éster que se hidrolisa in vivo para produzir um análogo de nucleótido de fosfonato antiviral correspondente. O documento WO 96/29336 divulga análogos de nucleósidos de monofosfato mascarados e sua utilização na profilaxia e o tratamento de uma infeção virai, em particular VIH.
Sumário da invenção
Os profármacos de análogos de nucleótidos de metoxifosfonato que se destinam à terapêutica antiviral ou antitumoral, embora sejam conhecidos, foram selecionados tradicionalmente por seu efeito sistémico. Por exemplo, ditos profármacos foram selecionados por sua biodisponibilidade potenciada, isto é, sua capacidade para ser absorvidos do trato gastrointestinal e se converter rapidamente no fármaco parental para garantir que o fármaco parental está disponível em todos os tecidos. No entanto, os depositantes descobriram atualmente que é possível selecionar profármacos que se enriquecem nos locais terapêuticos, tal como é ilustrado pelos estudos que são descritos no presente documento em que os análogos estão enriquecidos em locais focais localizados de infeção por VIH. O objetivo desta invenção é, entre outras vantagem, produzir menos toxicidade para os tecidos circundantes e maior potência do fármaco parental em tecidos que são os alvos da terapêutica com o análogo de nucleótidos de metoxifosfonato parental.
Por conseguinte, em virtude destas observações, foi utilizado um método de exploração para identificar um profármaco de um análogo de nucleótido de metoxifosfonato que conferia uma atividade potenciada num tecido alvo que compreende: (a) proporcionar pelo menos um de ditos profármacos; (b) selecionar pelo menos um alvo tissular terapêutico e pelo menos um tecido não alvo; (c) administrar o profármaco ao tecido alvo e a dito pelo menos um tecido não alvo; e (d) determinar a atividade antiviral relativa conferida pelo profármaco nos tecidos na etapa (c).
Em formas de realização preferentes, os tecidos alvo são locais onde o VIH se replica ativamente e/ou que servem como reservatório do VIH, e o tecido não alvo é um animal intato. Inesperadamente, descobriu-se que a seleção do tecido linfoide como tecido alvo para a por em prática de este método para VIH levou à identificação de profármacos que potenciam o fornecimento de fármaco ativo a ditos tecidos.
Além disso, descobriu-se inesperadamente que a quiralidade dos substituintes do átomo de fósforo e/ou o substituinte amidato influem no enriquecimento observado em por em prática desta invenção.
Divulgam-se compostos enriquecidos diastereomericamente que têm a estrutura (3)
que compreende menos de 40 % em peso do diastereómero (4) em que
R1 é um oxiéster que é hidrolisável in vivo, ou hidroxilo; B é uma base heterociclica; R2 é hidroxilo, ou o resíduo de um aminoácido unido ao átomo de P através de um grupo amino do aminoácido e que tem cada substituinte carboxi do aminoácido opcionalmente esterifiçado, mas ambos R1 e R2 não são hidroxilo; E é -(CH2)2-, -ch (CH3) ch2-, -CH (CH2F) ch2-, -CH (CH2OH) ch2-, -CH (CH=CH2) CH2—, -CH (C=CH) CH2-, -CH (CH2N3) CH2-,
-CH (R6) OCH (R6)-, -CH(R9)CH20- ou -CH(R8)0-, em que a ligação da derecha está unido à base heterocíclica; a linha descontínua representa uma dupla ligação opcional; R4 e R5 são independentemente hidrogénio, hidroxi, halo, amino ou um substituinte que tem 1-5 átomos de carbono selecionados a partir de aciloxi, alquiloxi, alquiltio, alquilamino e dialquilamino; R6 e R6 são independentemente H, alquilo Ci-C6, hidroxialquilo Ci-C6 ou alcanoílo C2-C7; R7 é independentemente H, alquilo C2-C6, ou se toman conjuntamente para formar -0- ou -CH2-; R8 é H, alquilo Ci-C6, hidroxialquilo Ci-C6 ou haloalquilo Ci-C6; e R9 é H, hidroximetilo ou aciloximetilo; e seus sais, bases livres, e solvatos.
Os diastereómeros de estrutura (3) são designados como isómeros (S) no centro quiral do fósforo.
Divulgam-se os compostos enriquecidos diastereoméricamente que têm a estrutura (5a)
que compreende menos do 40 % em peso do diastereómero (5b)
em que R5 é metilo ou hidrogénio; R6 é independentemente H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo ou arilalquilo, ou R6 é independentemente alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo ou arilalquilo que é substituído com de 1 a 3 substituintes selecionados a partir de alquilamino, alquilaminoalquilo, dialquilaminoalquilo, dialquilamino, hidroxilo, oxo, halo, amino, alquiltio, alcoxi, alcoxialquilo, ariloxi, ariloxialquilo, arilalcoxi, arilalcoxialquilo, haloalquilo, nitro, nitroalquilo, azido, azidoalquilo, alquilacilo, alquilacilalquilo, carboxilo ou alquilacilamino; R7 é a cadeia lateral de qualquer aminoácido de origem natural ou farmaceuticamente aceitável e no qual, se a cadeia lateral compreender um carboxilo, o grupo carboxilo está esterificado opcionalmente com um grupo alquilo ou arilo; R11 é amino, alquilamino, oxo, ou dialquilamino; e R12 é amino ou H, e seus sais, tautómeros, bases livres e solvatos. A presente invenção é definida nas reivindicações. Especificamente, esta invenção proporciona o composto de estrutura (6), 9-[ (R)-2-[[ (S)- [ [ (S)-1- (isopropoxicarbonil)etil]amino]fenox ifosfinil]metoxi]propil]adenina, também denominado no presente documento como GS-7340.
e seus sais e solvatos.
Esta invenção também proporciona a sal de fumarato da estrutura (6) (estrutura (7)), fumarato de 9-[ (R)-2-[ (S)-[[ (S)-1-(isopropoxicarbonil)etil]amino]fenoxi fosfinil]metoxi]propil]adenina (1:1), também denominada no presente documento como GS-7340-2.
Os compostos das estruturas (6)-(7) são formulados opcionalmente em composições que contêm excipientes farmaceuticamente aceitáveis. As ditas composições são utilizadas em doses eficazes na terapêutica ou profilaxia das infeções virais (particularmente por VIH e hepadnavirais). Descrição detalhada da invenção
Os fármacos parentais dos análogos de nucleótidos de metoxifosfonato para utilização neste método de exploração são compostos que têm a estrutura A-CH2P (0) (OH) 2 em que A é o resíduo de um análogo de nucleósido. Estes compostos conhecem-se de por si e não são parte desta invenção. Mais em particular, os compostos parentais compreendem uma base heterocíclica B e um aglicão E, que em geral tem a
estrutura em que o grupo B é definido a seguir e o grupo E é definido anteriormente. São descritos exemplos nas Patentes dos Estados Unidos N° 4.659.825, 4.808.716, 4.724.233, 5.142.051, 5.130.427, 5.650.510, 5.663.159, 5.302.585, 5.476.938, 5.696.263, 5.744.600, 5.688.778, 5.386.030, 5.733.896, 5.352.786 e 5.798.340 e os documentos EP 821.690 e 654.037.
Os profármacos desta invenção são análogos covalentemente modificados dos análogos de nucleótidos de metoxifosfonato parentais descritos no parágrafo anterior. Em geral, o átomo de fósforo do fármaco parental é o local preferido para a modificação do profármaco, mas encontram-se outros locais na base heterocí clica B ou do aglicão E. muitos de ditos profármacos já são conhecidos. Principalmente, estes são ésteres ou amidatos do átomo de fósforo, mas também incluem substituições na base e o aglicão. Nenhuma destas modificações em si são parte desta invenção e nenhuma se considerará limitativa do âmbito da invenção do presente documento. O átomo de fósforo dos análogos de nucleótidos de metoxifosfonato contém duas valências para as modificações covalentes tais como a amidação ou esterificação (a menos que um fosforil hidroxilo seja esterificado com um substituinte hidroxilo do aglicão E, depois do qual somente fica uma valência do fósforo livre para a substituição) . Os ésteres são tipicamente ariloxi. Os amidatos geralmente são monoaminoácidos de origem natural que têm grupo (s) carboxilo(s) livre(s) esterifiçados com um grupo alquilo ou arilo, habitualmente grupos fenilo, cicloalquilo, ou grupos t-, n- ou s^ alquilo. Divulgam-se profármacos adequados para utilização no método de rastreio, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos N° 5.798.340. No entanto, qualquer profármaco que é criado que é potencialmente capaz de se converter in vivo, dentro das células do tecido alvo, no fármaco parental do análogo de nucléotido de metoxifosfonato livre, por exemplo, por meio de hidrólise, oxidação, ou outra transformação covalente que seja o resultado da exposição a tecidos biológicos, é adequado para utilização no método desta invenção. Pode ser que ditos profármacos não sejam conhecidos neste momento, mas sejam identificados no futuro e, portanto, se convertam em candidatos adequados disponíveis para testar no método. Dado que os profármacos são simplesmente candidatos para o rastreio nos métodos, suas estruturas não são relevantes para praticar ou permitir o método de rastreio, embora, obviamente, suas estruturas finalmente sejam dispositivas se um profármaco mostrará ou não seletividade no ensaio.
Os pro-resíduos unidos ao fármaco parental podem ser os mesmos ou distintos. No entanto, cada profármaco que a ser utilizado no ensaio de rastreio diferirá estruturalmente dos outros profármacos a ser testado. Em geral, são selecionados profármacos diferentes, isto é, distintos estruturalmente, com base em sua estereoquímica ou em sua estrutura covalente, ou estas características variam em combinação. Cada profármaco testado, no entanto, de modo desejável, é estrutural e estereoquimicamente substancialmente puro, do contrário o resultado do ensaio de rastreio será de menos utilidade. Está, obviamente, dentro do âmbito desta invenção testar unicamente um único profármaco numa forma de realização individual do método desta invenção, embora tipicamente depois os resultados seriam comparados com estudos anteriores com outros profármacos.
Descobriu-se que a estereoquímica dos profármacos é capaz de influir no enriquecimento nos tecidos alvo. Os locais quirais estão no átomo de fósforo e também encontram-se em seus substituintes. Por exemplo, os aminoácidos que são utilizados na preparação de amidatos podem estar nas formas D ou L, e os ésteres de fosfonato ou os ésteres de aminoácidos também podem conter centros quirais. Também se encontram locais quirais na parte do análogo de nucleósido das moléculas, mas estes tipicamente já estão ditados pela estereoquímica do fármaco parental e não variarão como parte do rastreio. Por exemplo, prefere-se o isómero R de PMPA, já que este é mais ativo que o isómero S correspondente. Tipicamente, estes diastereómeros ou enantiómeros serão enriquecidos quiralmente se não puros em cada local de modo que os resultados do rastreio serão mais significativos. Tal como foi indicado, a distinção dos estereoisómeros é conferida por meio de enriquecimento ou purificação do estereoisómero (tipicamente este será um diastereómero em vez de um enantiómero no caso da maior parte dos análogos de nucleótidos de metoxifosfonato) livre de outros estereoisómeros no centro quiral em questão, de modo que cada composto de ensaio seja substancialmente homogéneo. Por substancialmente homogéneo ou quiralmente enriquecido, entende-se que o estereoisómero desejado constitui mais de cerca de 60 % em peso do composto, geralmente mais de cerca de 80 % e preferentemente mais de cerca de 95 %.
Novo Método de Rastreio
Uma vez que foi selecionado pelo menos um profármaco candidato, são utilizadas as etapas restantes do método de rastreio para identificar um profármaco que tenha a seletividade requerida para o tecido alvo. Mais convenientemente, os profármacos são marcados com um grupo detetável, por exemplo, são marcados radioativamente, com a finalidade de facilitar a deteção mais tarde nos tecidos ou células. No entanto, não é requerido um marcador dado que podem ser utilizados também outros ensaios adequados para o profármaco ou seus metabolitos (incluindo o fármaco parental). Estes ensaios poderiam incluir, por exemplo, espetrometria de massas, HPLC, bioensaios ou imunoensaios. O ensaio pode detetar o profármaco e qualquer um ou mais de seus metabolitos, mas preferentemente o ensaio é levado a cabo para detetar unicamente a geração do fármaco parental. Isto baseia-se na suposição (que poderia não estar garantida em todos os casos) de que o grau e a velocidade de conversão do profármaco no difosfato parental antiviralmente ativo é a mesma em todos os tecidos testados. Por outro lado, pode ser testado para o difosfato. 0 tecido alvo será preferentemente tecido linfoide quando a rastreio seja para profármacos úteis no tratamento de uma infeção por VIH. 0 tecido linfoide é conhecido pelo perito e inclui células CD4, linfócitos, gânglios linfáticos, macrófagos e células similares a macrófagos incluindo monócitos tais como células monociticas de sangue periférico (PBMC) e células gliais. 0 tecido linfoide também inclui tecidos não linfoides que estão enriquecidos em tecidos ou células linfoides, por exemplo, pulmão, pele e bazo. Outros alvos para outros fármacos antivirais serão, obviamente, os locais principais de replicação ou latência do vírus particular concernente, por exemplo, fígado para a hepatite e nervos periféricos para o VHS. De maneira similar, os tecidos alvo para os tumores serão, de facto, os tumores em si. Estes tecidos são bem conhecidos pelo perito e poderiam não requerer experimentação excessiva para a seleção. Quando é feito o rastreio para compostos antivirais, o tecido alvo pode estar infetado pelo vírus.
Também são rastreados os tecidos ou células não alvo como uma parte do método do presente documento. Pode ser utilizado qualquer número ou identidade de ditos tecidos ou células neste respeito. Em geral, serão utilizados os tecidos para os quais espera-se que o fármaco parental seja tóxico como tecidos não alvo. A seleção de um tecido não alvo depende completamente da natureza do profármaco e da atividade do parental. Por exemplo, os tecidos não hepáticos seriam selecionados para os profármacos contra a hepatite, e as células não transformadas do mesmo tecido como o tumor serão suficientes para o rastreio seletivo de profármacos antitumorais.
Cabe destacar que o método é diferente do que é estudado tipicamente para levar a cabo na determinação da biodisponibilidade oral de profármacos. Nos estudos de biodisponibilidade oral, o objetivo é identificar um profármaco que passa à circulação sistémica substancialmente convertido no fármaco parental. Na presente invenção, o objetivo é encontrar profármacos que não sejam metabolizados no trato gastrointestinal ou a circulação. Portanto, os tecidos alvo a avaliar no método geralmente não incluem ao intestino delgado ou, se o intestino fosse incluído, então os tecidos também incluiriam outros tecidos adicionais distintos ao intestino delgado.
Os tecidos alvo e não alvo que são utilizadas no método de rastreio tipicamente estarão num animal vivo intato. Os profármacos que contêm ésteres são testados mais desejavelmente em cães, macacos ou outros animais diferentes de roedores; o plasma de ratinhos e ratos contém altos níveis circulantes de esterases que podem produzir um resultado enganoso se o sujeito terapêutico é um ser humano ou um mamífero superior.
No é necessário praticar este método com animais intatos. Também está dentro do âmbito desta invenção utilizar órgãos perfundidos, cultura in vitro de órgãos (por exemplo, enxertos de pele) ou linhas celulares mantidas em diversas formas de cultura celular, por exemplo, frascos rotatórios ou sistemas de suspensão de gravidade zero. Por exemplo, podem ser utilizados células MT-2 como um alvo tissular para selecionar profármacos para VIH. Portanto, não deve ser interpretado que o termo "tecido" requeira de estruturas celulares organizadas, ou as estruturas de tecidos tal como estes podem ser encontradas na natureza, embora tais seriam preferíveis. Em vez disso, o termo "tecido" deve ser interpretado como um sinónimo de células de uma fonte, origem ou estágio de diferenciação particular. 0 tecido alvo e o não alvo podem ser de facto o mesmo tecido, mas os tecidos estarão num estado biológico diferente.
Por exemplo, o método do presente documento poderia ser utilizado para selecionar profármacos que conferem atividade num tecido infetado com vírus (tecido alvo) , mas que permanecem substancialmente inativos em células não infetadas com vírus (correspondentes ao tecido não alvo). Poderia se utilizada a mesma estratéqia para selecionar profármacos profiláticos, isto é, profármacos que são metabilizados a formas ativas antivirais incidentais para a infeção virai, mas que seguem sem ser metabolizadas substancialmente nas células não infetadas. De maneira similar, poderiam ser rastreados os profármacos em células transformadas e no tecido homólogo não transformado. Isto seria particularmente útil no ensaio comparativo para selecionar profármacos para o tratamento de neoplasias hematológicas, por exemplo, leucemias.
Sem estar limitados por nenhuma teoria particular do funcionamento, acredita-se que os profármacos tissulares seletivos sejam absorvidos seletivamente pelas células alvo e/ou sejam metabolizados seletivamente dentro da célula, em comparação com outros tecidos ou células . A vantagem que é única dos profármacos de metoxifosfonato do presente documento é que seu metabolismo para o dianião a pH fisiológico assegura que estes serão incapazes de voltar a difundir para o exterior da célula. Portanto, estes continuam sendo eficazes durante longos períodos de tempo e são mantidos a concentrações intracelulares elevadas, mostrando deste modo uma potência aumentada. Acredita-se que os mecanismos para aumentar a atividade no tecido alvo incluem a captação aumentada pelas células alvo, retenção intracelular potenciada, ou ambos mecanismos trabalhando conjuntamente. No entanto, o modo por meio do qual ocorre a seletividade ou fornecimento potenciado no tecido alvo não é importante. Também não é importante que todas as conversões metabólicas do profármaco ao composto parental ocorram dentro do tecido alvo. Somente é necessário que ocorra a última conversão que confere atividade no tecido alvo; o metabolismo em outros tecidos pode proporcionar intermediários que se convertem em formas antivirais no tecido alvo. 0 grau de seletividade ou do fornecimento potenciado desejado variará dependendo do composto parental e do modo em que se meça (% de distribuição de dose ou concentração de fármaco parental). Em geral, se o fármaco parental já possui uma janela terapêutica generosa, pode ser suficiente um baixo grau de seletividade para o profármaco desejado. Por outro lado, os compostos tóxicos podem requerer um rastreio mais exaustivo para identificar profármacos seletivos. Pode ser reduzido o gasto relativo do método desta invenção explorando somente no tecido alvo e em tecidos contra os quais se sabe que o composto parental é relativamente tóxico, por exemplo, para PMEA, que é nefrotóxico a dose mais altas, o foco principal estará no rim e os tecidos linfoides. A etapa de determinação da atividade antiviral relativa de um profármaco nos tecidos selecionados é levada a cabo geralmente testando os tecidos alvo e não alvo para a presença ou atividade relativa de um metabolito do profármaco, cujo metabolito sabe-se que tem, ou se converte em, um metabolito que tem atividade antiviral ou antitumoral. Portanto, tipicamente a quantidade relativa do fármaco parental poderia ser determinada nos tecidos ao longo de substancialmente o mesmo curso temporal com a finalidade de identificar profármacos que são metabolizados preferentemente no tecido alvo num metabolito antiviral ou antitumoralmente ativo ou num precursor do mesmo que produz finalmente o metabolito ativo no tecido alvo. No caso dos compostos antivirais, o metabolito ativo é o difosfato dos compostos de fosfonato parentais. Este metabolito é o que se incorpora no ácido nucleico virai, truncando deste modo a alongamento da cadeia de ácido nucleico e interrompendo a replicação viral. Os metabolitos do profármaco podem ser metabolitos anabólicos, metabolitos catabólicos, ou o produto conjunto do anabolismo e catabolismo. 0 modo por meio do qual se produz o metabolito não é importante na prática do método desta invenção. 0 método não se limita a testar um metabolito que possui em si atividade antiviral ou antitumoral. Em seu lugar, podem ser testados os precursores inativos dos metabolitos ativos. Os precursores do metabolito de difosfato antiviralmente ativo incluem o monofosfato do fármaco parental, monofosfatos de outros metabolitos do fármaco parental (por exemplo, uma modificação intermediária de um substituinte na base heterocíclica), o parental em si mesmo e metabolitos gerados pela célula na conversão do profármaco no parental antes da fosforilação. As estruturas precursoras podem variar consideravelmente já que estas são o resultado do metabolismo celular. No entanto, esta informação já é conhecida ou poderia ser determinada facilmente por um perito na especialidade.
Se o produto que a ser testado não mostra atividade antitumoral ou antiviral em si, então, podem ser requeridos ajustes nos resultados em bruto do ensaio. Por exemplo, se o processamento intracelular do metabolito inativo a um metabolito ativo ocorre a distintas velocidades entre os tecidos testados, os resultados em bruto com o metabolito inativo necessitariam um ajuste para levar em consideração as diferenças entre os tipos celulares que são devido a que o parâmetro relevante é a geração de atividade no tecido alvo, não a acumulação de metabolitos inativos. No entanto, a determinação dos ajustes adequados poderia estar dentro da capacidade geral. Portanto, quando a etapa (d) do método do presente documento requer a determinação da atividade, a atividade pode ser medida diretamente ou ser extrapolada. Isto não significa que o método do presente documento esteja limitado a testar unicamente intermediários que são ativos em si. Por exemplo, também poderia ser testada a ausência ou diminuição do profármaco nos tecidos testados. A etapa (d) unicamente requer a avaliação da atividade conferida pelo profármaco em tanto este interage com o tecido concernente, e esta pode se basear na extrapolação ou outra medição indireta. A etapa (d) do método requer a determinação da atividade "relativa" do profármaco. Será entendido que esta não requer que cada um dos ensaios ou séries de ensaios devam conter também necessariamente execuções com o tecido não alvo selecionado. Pelo contrário, está dentro do âmbito desta invenção utilizar controlos históricos do tecido ou tecidos não alvo, ou algoritmos que representam resultados esperáveis de ditos tecidos não alvo, com a finalidade de proporcionar o ponto de referência da atividade não alvo.
Os resultados obtidos na etapa (d) são utilizados então para selecionar ou identificar de um modo ótimo um profármaco que produz maior atividade antiviral no tecido alvo que no tecido não alvo. Este é o profármaco que é selecionado para o desenvolvimento posterior.
Será apreciado, que pode ser realizada alguma avaliação preliminar dos fármacos candidatos antes de por em prática o método desta invenção. Por exemplo, será necessário que o profármaco seja capaz de passar sem ser metabolizado em grande medida ao longo do trato gastrointestinal, será necessário que seja substancialmente estável em sangue, e deveria ser capaz de permear as células pelo menos até certo grau. Na maior parte dos casos também será necessário que completar um primeiro passo pela circulação hepática sem metabolismo substancial. Os ditos estudos preliminares são opcionais e conhecem-se bem pelos peritos na especialidade. 0 mesmo raciocínio que foi descrito anteriormente para a atividade antiviral, é também aplicável aos profármacos antitumorais de análogos de nucleótidos de metoxifosfonato. Estes incluem, por exemplo, profármacos de PMEG, o análogo de guanilo de PMEA. Neste caso, os fosfonatos citotóxicos tais como PMEG, são candidatos valiosos em virtude do qual sua citotoxicidade confere, de facto, sua atividade antitumoral.
Um composto identificado por meio deste novo método de rastreio pode ser introduzido então num programa preclínico ou clínico tradicional para confirmar que são cumpridos os objetivos desejados. Tipicamente, se considera que um profármaco é seletivo se a atividade ou concentração do fármaco parental no tecido alvo (% de distribuição da dose) é 2x, e preferentemente 5x maior que a do composto parental no tecido não alvo. Como alternativa, um profármaco candidato pode ser comparado com um profármaco de referência. Neste caso, a seletividade é relativa em vez de absoluta. Os profármacos seletivos serão aqueles que dão como resultado uma concentração ou atividade cerca de lOx maior no tecido alvo em comparação com o protótipo, embora o grau de seletividade seja um aspeto discrecional.
Novo Método para a Preparação dos Materiais de Partida ou Intermediários
Também se inclui no presente documento um método melhorado para o fabrico dos materiais de partida preferidos (fármacos parentais) desta invenção, PMEA e (R)-PMPA. Tipicamente, este método compreende fazer reagir 9-(2-hidroxipropil)adenina (HPA) ou 9-(2-hidroxietil)adenina (HEA) com um alcóxido de magnésio, adicionar posteriormente o aglicão sintão p-tolueno-sulfoniloximetilfosfonato (tosilato) protegido à mistura de reação, e recuperar PMPA ou PMEA, respectivamente.
Preferentemente, o HPA é o enantiómero R enriquecido ou isolado. Se for utilizada uma mistura quiral de HPA, pode ser isolado o R-PMPA da mistura quiral de PMPA depois de completar a síntese.
Tipicamente o tosilato está protegido por alquilo de cadeia curta, mas outros grupos adequados serán evidentes para o perito. Pode ser conveniente utilizar o tosilato presubstituído com os substituintes do profármaco de fosfonato que são capazes de agir como grupos protetores na reação de tosilação, permitiendo deste modo evitar a etapa de desproteção e recuperar, portanto, diretamente o profármaco ou um intermediário. 0 grupo alquilo do alcóxido de magnésio não é crítico e pode ser qualquer alquilo C1-C6 ramificado ou normal, mas preferentemente é t-butilo (para PMPA) ou isopropilo (para PMEA) . Também não são críticas as condições de reação, mas preferentemente compreendem aquecer a mistura de reação a cerca de 70-75 °C com agitação ou outra agitação moderada.
Se não há um interesse na retenção dos substituintes de fosfonato, se desprotege o produto (habitualmente com bromotrimetilsilano quando o grupo protetor do tosilato é alquilo), e depois se recupera o produto por meio de cristalização ou outro método convencional tal como será evidente para o perito.
Base Heterocíclica
Nos compostos representados nas estruturas (3) e (4) , a base heterocíclica B é selecionado das estruturas
em que R15 é H, OH, F, Cl, Br, I, OR16, SH, SR16, NH2, ou NHR17; R16 é alquilo Ci-C6 ou alquenilo C2-C6 incluindo CH3, CH2CH3, CH2CCH, CH2CHCH2 e C3H7, R17 é alquilo Ci-C6 ou alquenilo C2-C6 incluindo CH3, CH2CH3, CH2CCH, CH2CHCH2, e C3H7; R18 é N, CF, CC1, CBr, Cl, CR19, CSR19 ou COR19; R19 é H, alquilo Ci-C9, alquenilo C2-C9, alquinilo C2-C9, alquil-Ci-C9-alcoxi C2-C9, ou aril-alquilo C7-C9 não substituído ou substituído por OH, F, Cl, Br ou I, incluindo R19 portanto -CH3, -CH2CH3, -CHCH2, -CHCHBr, -CH2CH2C1, -CH2CH2F, -CH2CCH, -ch2chch2, -c3h7, -ch2oh, -ch2och3, -ch2oc2h5, -ch2occh, -ch2och2chch2, -ch2c3h7, ch2ch2oh, -ch2ch2och3, - CH2CH2OC2H5, -ch2ch2occh, -ch2ch2och2chch2 e -CH2CH2OC3H7; R20 é N ou CH; R21 é N, CH, CCN, CCF3, CC=CH ou CC(0)NH2; R22 é H, OH, ΝΗ2, SH, SCH3, SCH2CH3, SCH2CCH, SCH2CHCH2, SC3H7, NH(CH3), N(CH3)2, NH(CH2CH3), N(CH2CH3)2, NH(CH2CCH), NH (CH2CHCH2) , NH(C3H7), halogéneo (F, Cl, Br ou I) ou X em que X é - (CH2) m (0) n (CH2) mN (R10) 2 em que cada m é independentemente 0-2, n é 0-1, e R10 independentemente é H, alquilo C1-C15, alquenilo C2-Ci5, arilalquenilo C6-Ci5, arialquinilo C6-C15, alquinilo C2-Cis, alquilamino C2-C6- alquilo Ci-C6, aralquilo C5-C15, heteroaralcilo C6-Ci5, arilo C5-C6, heterocicloalquilo C2-C6, alquilo C2-Ci5, alquenilo C3-Ci5, arilalquenilo C6-Ci5, alquinilo C3-Ci5, arilalquinilo C7-Ci5, alquilamino Ci-C6-alquilo -Ci-C6, aralquilo C5-C15, heteroalcilo C6-Ci5 ou heterocicloalquilo C3-C6 em que o metileno do resíduo alquilo não adjacente a N6 foi substituído por -O-, opcionalmente ambos R10 estão unidos entre si com N para formar um heterociclo C2-C5 saturado ou insaturado que contém um ou dois heteroátomos de N e opcionalmente um heteroátomo do ou S adicional, ou um dos grupos R10 anteriores que está substituído com de 1 a 3 halo, CN ou N3; mas opcionalmente pelo menos um grupo R10 não é H; R23 é H, OH, F, Cl, Br, I, SCH3, SCH2CH3, SCH2CCH, SCH2CHCH2, SC3H7, OR15, NH2, NHR17 ou R22; e R24 é 0, S ou Se. B também inclui bases heterocíclicas tanto protegidas como não protegidas, particularmente bases de purina e de pirimidina. Conhecem-se grupos protetores para aminas exocíclicas e outros grupos lábeis (Greene et al. "Protetive Groups in Organic Synthesis") e incluem N-benzoílo, isobutirilo, 4,4' -dimetoxitritilo (DMT) e similares. A seleção do grupo protetor será evidente para o perito habitual e dependerá da natureza do grupo lábil e da química que se espera encontrar para o grupo protetor, por exemplo, ácida, básica, oxidativa, redutora ou outras condições. As espécies protegidas ilustrativas são N4-benzoilcitosina, N6-benzoiladenina, N2-isobutirilguanina e similares.
As bases protegidas têm as fórmulas Xa.l, Xla.l, Xlb.l, XIIa.1 ou XIIIa.1
em que R18, R20, R21, R24 têm os significados que são definidos anteriormente; r22a é R39 ou R22 desde que R22 não seja NH2; r23a é R39 ou R23 desde que R23 não seja NH2; R39 é NHR40, NHC(0)R36 ou CR41N(R38)2 em que R36 é alquilo Cq-Cig, alquenilo Cq-Cig, arilo C3-C10, adamantoilo, alquilanilo, ou arilo C3-C10 substituído com 1 ou 2 átomos ou grupos selecionados a partir de halogéneo, metilo, etilo, metoxi, etoxi, hidroxi e ciano; R38 é alquilo C1-C10, ou ambos R38 conjuntamente são 1-morfolino, 1-piperidina ou 1-pirrolidina; R40 é alquilo C1-C10, incluindo metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, t-butilo, pentilo, hexilo, octilo e decanilo; e R41es hidrogénio ou CH3.
Para as bases de estruturas Xla.l e Xlb.l, se R estiver presente em R22A ou R23A, ambos grupos R39 na mesma base geralmente serão o mesmo. Os R36 ilustrativos são fenilo, fenilo substituído com um dos substituintes arilo R36 anteriores, -Ci0H15 (onde C10H15 é 2-adamantoílo) , -CH2C6H5 -C6H5, -CH(CH3)2, -CH2CH3, metilo, butilo, t-butilo, heptanilo, nonanilo, undecanilo, ou undecenilo.
As bases específicas incluem hipoxantina, guanina, adenina, citosina, inosina, timina, uracilo, xantina, derivados 8-aza de 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina e xantina; derivados 7-desaza-8-aza de adenina, guanina, 2-aminopurina, 2, 6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina e xantina; derivados 1-desaza de 2-aminopurina, 2, 6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina e xantina; derivados 7-desaza de 2-aminopurina, 2, 6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina e xantina; derivados 3-desaza de 2-aminopurina, 2, 6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina e xantina; 6-azacitosina; 5-fluorocitosina, 5-clorocitosina; 5-yodocitosina; 5-bromocitosina; 5-metilcitosina, 5-bromoviniluracilo, 5-fluorouracilo, 5-clorouracilo; 5-yodouracilo; 5-bromouracilo; 5-trifluorometiluracilo; 5-metoximetiluracilo; 5- etiniluracilo e 5-propiniluracilo.
Preferentemente, B é um resíduo de 9-purinilo selecionado de guanilo, 3-desazaguanilo, 1-desazaguanilo, 8-azaguanilo, 7- desazaguanilo, adenilo, 3-desazaadenilo, 1-desazadenilo, 8- azaadenilo, 7-desazaadenilo, 2,6-diaminopurinilo, 2-aminopurinilo, 6-cloro-2-aminopurinilo e 6- tio-2-aminopurinilo ou um B' é um resíduo de 1-pirimidinilo selecionado de citosinilo, 5-halocitosinilo, e 5-(alquilo Ci-C3) citosinilo.
Os grupos B preferidos têm a fórmula
em que R22 independentemente é halo, oxigénio, NH2, X ou H, mas opcionalmente pelo menos um R22 é X; X é - (CH2) m (0) n (CH2) mN (R10) 2 em que m é 0-2, n é 0-1, e R10 independentemente é H, alquilo C1-C15, alquenilo C2-Ci5, arilalquenilo C6-Ci5, arilalquinilo C6-Ci5, alquenilo C2-Ci5, alquilamino Ci-C6-alquilo-Ci-C6, aralquilo C5-Ci5, heteroaralcilo C6-Ci5, arilo C5-C6, heterocicloalquilo C2-C6, alquilo C2-Ci5, alquenilo C3-C15, arilalquenilo C6-Ci5, alquinilo C3-C15, arilalquinilo C7-C15, alquilamino Ci-C6-alquilo-Ci-C6, aralquilo C5-C15, heteroalquilo C6-Ci5 ou heterocicloalquilo C3-C6 em que 0 metileno no resíduo alquilo não adjacente a N6 foi substituído por -0-, opcionalmente ambos R10 estão unidos entre si com N para formar um heterociclo C2-Cs saturado ou insaturado que contém um ou dois heteroátomos de N e opcionalmente um heteroátomo do ou S adicional, ou um dos grupos R10 anteriores é substituído com de 1 a 3 halo, CN ou N3; mas opcionalmente pelo menos um grupo R10 não é H; e Z é N ou CH, desde que os núcleos heterocíclicos variem da purina em não mais de um Z.
Os grupos E representam os aglucões utilizados nos análogos de nucleótidos de metoxifosfonato. Preferentemente, o grupo E é -CH(CH3)CH2- ou -CH2CH2-. Também, prefere-se que os grupos laterais nos centros quirais no aglicão estejam substancialmente unicamente na configuração (R) (exceto para o hidroximetilo, que é o enantiómero (S) enriquecido). R1 é um oxiéster hidrolisável in vivo que tem a estrutura -OR35 ou -OR6 em que R35 é definido na coluna 64, linha 49 da Patente dos Estados Unidos 5,798,340, incorporada ao presente documento a modo de referência, e R6 é definido anteriormente. Preferentemente R1 é ariloxi, geralmente fenoxi não substituído ou para-substituido (tal como é definido em R6) . R2 é um resíduo de aminoácido, opcionalmente desde que qualquer grupo carboxi unido por menos de 5 átomos ao amidato de N este esterifiçado. R2 tipicamente tem a estrutura em que
n é 1 ou 2; R11 é R6 ou H; preferentemente R6 = alquilo C3-C9; alquilo C3-C9 independentemente substituído com OH, halogéneo, 0 ou N; arilo C3-C6; arilo C3-C6 que está substituído independentemente com OH, halogéneo, 0 ou N; ou C3-C6 arilalquilo que está substituído independentemente com OH, halogéneo, 0 ou N; R12 independentemente é H ou alquilo C1-C9 que está não substituído ou substituído por substituintes selecionados independentemente do grupo que consiste em OH, 0 N, COOR11 e halogéneo; arilo C3-C6 que está não substituído ou substituído por substituintes selecionados independentemente do grupo que consiste em OH, 0, N, COOR11 e halogéneo; ou aril-alquilo C3-C9 que está não substituído ou substituído por substituintes selecionados independentemente do grupo que consiste em OH, 0, N, COOR11 e halogéneo; R13 independentemente é CÍOJ-OR11; amino; amida, guanidinilo; imidazolilo, indolilo, sulfóxido; fosforilo; alquilamino C1-C3, alquildiamino C1-C3; alquenilamino C1-C6; hidroxi; tiol, alcoxi C1-C3, alctiol Ci-C3; (CH2) nCOOR11; alquilo Ci-C6 que está não substituído ou substituído com OH, halogéneo, SH, NH2, fenilo, hidroxifenilo ou alcoxifenilo C7-Ci0; alquenilo C2-C6, que está não substituído ou substituído com OH, halogéneo, SH, NH2, fenilo, hidroxif enilo ou alcoxifenilo C7-C10; e arilo C6-C22 que está não substituído ou substituído com OH, halogéneo, SH, NH2, fenilo, hidroxif enilo ou alcoxifenilo C7-Ci0; e R14 é H ou alquilo C1-C9 ou alquilo C1-C9 substituído independentemente com OH, halogéneo, COOR11, 0 ou N; arilo C3-C6; arilo C3-C6 que está substituído independentemente com OH, halogéneo, COOR11, 0 ou N; ou arilalquilo C3-C6 que está substituído independentemente com OH, halogéneo, COOR11, 0 ou N.
Preferentemente, R11 é alquilo C1-C6, mais preferentemente isopropilo, R13 é a cadeia lateral de um aminoácido de origem natural, n = 1, R12 é H e R14 é H. no composto de estrutura (2) , a invenção inclui metabolitos nos quais os ésteres de fenoxi e de isopropilo foram hidrolisados a -OH. De maneira similar, os metabolitos desesterifiçados enriquecidos de fosfonoamidato dos compostos (5a), 5(b) e (6) estão incluídos dentro do âmbito desta invenção.
Arilo e substituição de "0" ou "N" são definidos na coluna 16, linhas 42-58, da patente dos Estados Unidos N° 5,798,340.
Tipicamente, os aminoácidos estão nos aminoácidos naturais ou I. São expostos exemplos específicos adequados na Patente dos Estados Unidos N° 5.798.340, por exemplo o Quadro 4 e col. de 8-10 do mesmo.
Alquilo tal como é utilizado no presente documento, a menos que se indique o contrário, é um hidrocarboneto secundário, terciário ou cíclico normal. Amenos que se indique os contrário alquilo é C1-C12. Os exemplos são -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, -ch (CH3) 2, -CH2CH2CH2CH3, -CH2CH (CH3) 2, -CH (CH3) ch2ch3, -C(CH3)3, -ch2ch2ch2ch2ch3, -ch (CH3) ch2ch2ch3, -CH (CH2CH3) 2, -C (CH3) 2ch2ch3, -CH (CH3) CH (CH3) 2, -CH2CH2CH (CH3) 2, -CH2CH (CH3) CH2CH3, -CH2CH2CH2CH2CH2CH3, -ch (CH3) ch2ch2ch2ch3, -CH(CH2CH3) (CH2CH2CH3), -c (CH3) 2ch2ch2ch3, -CH (CH3) CH (CH3) CH2CH3, -CH (CH3) CH2CH (CH3) 2, -C (CH3) (CH2CH3) 2, -CH (CH2CH3) ch (CH3) 2, -c (CH3) 2ch (CH3) 2 e -CH (CH3) C (CH3) 3. 0 alquenilo e alquinilo são definidos do mesmo modo, mas contêm pelo menos uma ligação dupla ou tripla, respetivamente.
Nos casos onde divulgam-se grupos enol ou ceto, deve ser interpretado que também são ensinados os tautómeros correspondentes.
Os compostos de profármacos desta invenção são proporcionados na forma de base livre ou os diversos sais enumeradas na Patente dos Estados Unidos N° 5.798.340, e são formulados com excipientes farmaceuticamente aceitáveis ou diluentes solvatantes para utilização como produtos farmacêuticos também como é exposto na Patente dos Estados Unidos N° 5.798.340. Estes profármacos têm as utilidades antivirais e as anteriormente estabelecidas para os fármacos parentais (veja-se a Patente dos Estados Unidos 5.798.340 e outras citações relacionadas com os análogos de nucleótidos de metoxifosfonato). Será entendido que o diastereómero de estrutura (4) pelo menos é útil como um intermediário na produção química do fármaco parental por meio de hidrólise in vitro, sem importar seu carácter relativamente não seletivo tal como se revela nos estudos do presente documento. A invenção será entendida mais completamente com referência aos seguintes exemplos.
Exemplo 1 a;
De adenina a PMEA utilizando Isopropóxido de Magnésio. A uma suspensão de adenina (16,8 g, 0,124 mol) em DMF (41,9 ml) foi adicionado carbonato de etileno (12,1 g, 0,137 mol) e hidróxido de sódio (0,100 g, 0,0025 mol) . A mistura foi aquecida a 130 °C durante a noite. A reação foi arrefecida abaixo de 50 °C e foi adicionado tolueno (62,1 ml) . A suspensão foi arrefecida adicionalmente a 5 °C durante 2 horas, foi filtrada e enxaguada com tolueno (2x) . O sólido húmido foi seco in vacuo a 65 °C para produzir 20,0 g (90 %) de 9-(2-hidroxietil)adenina em forma de um sólido branco pérola. Pf: 238-240 °C.
9-(2-Hidroxietil)adenina (HEA) (20,0 g, 0,112 mol) foi suspenso em DMF (125 ml) e foi aquecido a 80 °C. Foi adicionado isopropóxido de magnésio (11,2 g, 0,0784 mol), ou como alternativa t-butóxido de magnésio, à mistura seguido de p-toluenossulfoniloximetilfosfonato de dietilo (66,0 g, 0, 162 mol) ao longo de uma hora. A mistura de reação foi agitada a 80 °C durante 7 horas. Foram retirados 30 ml de voláteis por meio de destilação a vácuo e a reação foi recarregada com 30 ml de DMF fresco. Depois de arrefecer a temperatura ambiente, foi adicionado bromotrimetilsilano (69,9 g, 0,450 mol), e a mistura foi aquecida a 80 °C durante 6 h. A reação foi concentrada para produzir uma goma espessa. A goma foi dissolvida em 360 ml de água, foi extraída com 120 ml de diclorometano, foi ajustada a pH 3,2 com hidróxido de sódio, e a suspensão resultante foi removida a temperatura ambiente durante a noite. A reação foi arrefecida a 4 °C durante 1 hora. Os sólidos foram eliminados por meio de filtração, foram lavados com água (2x), e foram secos in vacuo a 56 °C para produzir 20 g (65,4 % ) de 9-[2-(fosfonometoxi)etil]adenina (PMEA) em forma de um sólido branco. Pf: > 200 °C dec. RMN ΤΗ (D20) · 3,49 (t, 2H) ; 3,94 (t, 2H) ; 4,39 (t, 2H) ; 8,13 (s, 1H) ; 8,22 (s, 1H) .
Exemplo lb
De adenina a PMPA utilizando t-Butóxido de Magnésio. A uma suspensão de adenina (40 g, 0,296 mol) em DMF (41,9 ml) foi adicionado carbonato de (R)-propileno (34,5 g, 0,338 mol) e hidróxido de sódio (0,480 g, 0,012 mol). A mistura foi aquecida a 130 °C durante a noite. A reação foi arrefecida a 100 °C e foi adicionado tolueno (138 ml) seguido de ácido metanossulfónico (4,7 g, 0,049 mol) enquanto era mantida a temperatura de reação a 100-110 °C. Foi adicionado tolueno adicional (114 ml) para criar uma solução homogénea. A solução foi arrefecida a 3 °C ao longo de 7 horas e depois mantida a 3 °C durante de uma hora. O sólido resultante foi isolado por meio de filtração e foi enxaguado com acetona (2x). O sólido húmido foi seco in vacuo a 80 °C para produzir 42,6 g (75 % ) de -9-[2-(hidroxi)propil]adenina (HPA) em forma de um sólido branco pérola. Pf: 188-190 °C.
A (R)-9-[2-(hidroxi)propil]adenina (HPA) (20,0 g, 0, 104 mol) foi suspensa em DMF (44,5 ml) e foi aquecida a 65 °C. Foi adicionado t-butóxido de magnésio (14,2 g, 0,083 mol) ou como alternativa isopropóxido de magnésio, à mistura ao longo de uma hora seguido por p-toluenossulfoniloximetilfosfonato de dietilo (66,0 g, 0,205 mol) ao longo de duas horas enquanto que a temperatura foi mantida a 78 °C. A mistura foi removida a 75 °C durante 4 horas. Depois de arrefecer abaixo de 50 °C, foi adicionado bromotrimetilsilano (73,9 g, 0,478 mol) e foi aquecida a mistura a 77 °C durante 3 horas. Quando foi concluída, a reação foi aquecida a 80 °C e foram retirados os voláteis por meio de destilação atmosférica. O resíduo foi dissolvido em água (120 ml) a 50 °C e depois foi extraída com acetato de etilo (101 ml) . O pH da fase aquosa foi ajustada a 1,1 com hidróxido de sódio, foi semeada com (R)-PMPA autêntico e foi reajustado o pH da camada aquosa a pH 2,1 com hidróxido de sódio. A solução resultante foi removida a temperatura ambiente durante a noite. A reação foi arrefecida a 4 °C durante 6 horas. O sólido foi isolado por filtração. Foi lavado com água (60 ml), e foi seco in vacuo a 50 °C para produzir 18,9 g (63,5 %) de (R)-9-[2-(fosfonometoxi)propil]adenina (PMPA) bruta em forma de um sólido branco pérola. A (R)-9-[2-(fosfonometoxi)propil]adenina bruta foi aquecida a refluxo em água (255 ml) até que foram dissolvidos todos os sólidos. A solução foi arrefecida a temperatura ambiente ao longo de quatro 4 horas. A mistura resultante foi agitada a 4 °C durante três horas. 0 sólido foi isolado por meio de filtração, foi lavado com água (56 ml) e acetona (56 ml), e foi seco in vacuo a 50 °C para produzir 15,0 g, (50,4 % ) de (R)-9-[2-(fosfonometoxi)propil]adenina (PMPA) em forma de um sólido branco. Pf: 278-280 °C.
Exemplo 2
Preparação de GS-7171 (III)
Foi carregado um reator revestido de vidro com PMPA anidro, (I) (14,6 kg, 50,8 mol) fenol (9,6 kg, 102 mol) e 1-metil-2-pirrolidinona (39 kg) . A mistura foi aquecida a 85 °C e foi adicionado trietilamina (6,3 kg, 62,3 mol) Depois foi adicionado uma solução de 1,3-diciclohexilcarbodiimida (17,1 kg, 82,9 mol) em 1-metil-2-pirrolidinona (1,6 kg) ao longo de 6 horas a 100 °C. O aquecimento continuou durante 16 horas. A reação foi arrefecida a 45 °C, foi adicionado água (29 kg), e foi arrefecida a 25 °C. Foram retirados os sólidos da reação por meio de filtração e foram enxaguados com água (15,3 kg) . O combinado filtrado e enxaguado foi concentrado até uma suspensão de cor canela sob pressão reduzida, foi adicionado água (24,6 kg), e foi ajustada a pH = 11 com NaOH (25 % em água) . Foram retirados os finos por meio de filtração através de terra de diatomáceas (2 kg) seguidas por um enxágue em água (4,4 kg) . O filtrado combinado e enxaguado foi extraído com acetato de etilo (28 kg). A solução aquosa foi ajustada a pH = 3,1 com HC1 (37 % em água) (4 kg) . O bruto II foi isolado por meio de filtração e foi lavado com metanol (12,7 kg) . A torta húmida de bruto II foi suspensa em metanol (58 kg). Os sólidos foram isolados por meio de filtração, foram lavados com metanol (8,5 kg) , e foram secos sob pressão reduzida para obter 9,33 kg de II em forma de um pó branco: RMN ΤΗ (CD2OD) δ 1,2 (d, 3H) , 3,45 (c, 2H) , 3,7 (c, 2H) , 4 (m, 2H) , 4,2 (c, 2H) , 4,35 (dd, 2H) , 6,6 (d, 2H) , 7 (t, 1H) , 7,15 (t, 2H) , 8,15 (s, 1H) , 8,2 (s, 1H) ; RMN 31P (D20) δ 15,0 (desacoplado) . GS-7171 (III). (Esquema 1) Foi carregado um reator revestido com vidro com monofenil PMPA, (II) (9,12 kg, 25,1 mol) e acetonitrilo (30,7 kg) . Foi adicionado cloreto de tionilo (6,57 kg, 56,7 mol) abaixo dos 50 °C. A mistura foi aquecida a 75 °C até que foram dissolvidos os sólidos. A temperatura de reação aumentou até 80 °C e os voláteis (11,4 kg) foram recolhidos por meio de destilação atmosférica sob azoto. O resíduo do recipiente foi arrefecido a 25 °C foi adicionado diclorometano (41 kg), e foi arrefecido a -29 °C.
Foi adicionado uma solução de éster isopropílico de (L) -alanina (7,1 kg, 54,4 mol) em diclorometano (36 kg) ao longo de 60 minutos a -18 °C seguido de trietilamina (7,66 kg, 75,7 mol) ao longo de 30 minutos de -18 a -11 °C. A mistura de reação foi aquecida a temperatura ambiente e foi lavada cinco vezes com uma solução de dihidrogenofosfato (10 % em água, 15,7 kg em cada lavagem) . A solução orgânica foi seca com sulfato de sódio anidro (18,2 kg), foi filtrada, foi enxaguada com diclorometano (28 kg) , e foi concentrada até um óleo sob pressão reduzida. Foi carregado acetona (29 kg) no óleo e a mistura foi concentrada sob pressão reduzida. Foi carregado acetona (18,8 kg) no óleo resultante. Foi purificado a metade do produto por meio de cromatografia ao longo de um leito de 38 x 38 cm de 22 kg de silica gel com uma malha de 60,230 a 400. Foi eluida a coluna com 480 kg de acetona. Foi repetida a purificação na segunda metade do óleo utilizando sílica gel fresca e acetona. O produto limpo que portava frações foi concentrado sob pressão reduzida até um óleo. Foi carregado acetonitrilo (19, 6 kg) no óleo e a mistura foi concentrada sob pressão reduzida. Foi carregado acetonitrilo (66,4 kg) e a solução foi arrefecida a de 0 a -5 °C durante 16 horas. Foram retirados os sólidos por filtração e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida a 5,6 kg III em forma de um óleo escuro: RMN 3Η (CDC13) δ 1,1 (m 12H) , 3,7 (m, 1H) , 4,0 (m, 5H) , 4,2 (m, 1H) , 5,0 (m, 1H) , 6,2 (s, 2H) , 7,05 (m, 5H) , 8,0 (s, 1H) , 8,25 (d, 1H) ; RMN 31P (CDC13) δ 21,0, 22,5 (desacoplado) . Método alternativo para GS-7171 (III)
Monofenil PMPA (II) . Foi colocado um balão de fundo redondo com condensador de refluxo e uma entrada de azoto num banho de óleo a 70 °C. O balão foi carregado com PMPA anidro (I) (19,2 g, 67 mmol), foram adicionados N, N-dimetilformamida (0,29 g, 3,3 mmol) e sulfona de tetrametileno (40 ml). Foi adicionado cloreto de tionilo (14,2 g, 119 mmol) ao longo de 4 horas. Se aumentou o calor a 100 °C ao longo do mesmo tempo. Foi obtido como resultado uma solução homogénea. Foi adicionado fenoxitrimetilsilano (11,7 g, 70 mmol) à solução ao longo de 5 minutos. O aquecimento no banho de óleo a 100 °C continuou durante duas horas mais. A reação foi deitada em acetona que foi removida rapidamente (400 ml) com arrefecimento a 0 °C. Foram isolados os sólidos por meio de filtração, secos sob pressão reduzida, e dissolvidos em metanol (75 ml). O pH da solução foi ajustado a 3,0 com uma solução de hidróxido de potássio (45 % aq.) com arrefecimento em gelo/água. Os sólidos resultantes foram isolados por meio de filtração, foram lavados com metanol, e foram secos sob pressão reduzida a 20,4 g II (Esquema 2) em forma de um pó branco. GS-7171 (III) . Foram combinados monofenil PMPA (II) (3 g, 8,3 mmol), sulfona de tetrametileno (5 ml) e N,N-dimetilformamida (1 gota) num balão de fundo arredondado num banho de óleo a 40 °C. Foi adicionado cloreto de tionilo (1,96 g, 16,5 mmol) . Depois de 20 minutos a solução clara foi retirada do calor, foi diluída com diclorometano (10 ml) e adicionada a uma solução de éster isopropílico de (L)-alanina (5 g, 33 mmol) e diisopropiletilamina (5,33 g, 41 mmol) em diclorometano (20 ml) a -10 °C. A mistura de reação foi aquecida a temperatura ambiente e foi lavada três vezes com uma solução de dihidrogenofosfato de sódio (1 % aq., 10 ml cada lavagem). A solução orgânica foi seca sobre sulfato de sódio anidro e foi concentrada sob pressão reduzida até um óleo. O óleo foi combinado com ácido fumárico (0,77 g, 6,6 mmol) e acetonitrilo (40 ml) e aquecido até o refluxo para dar uma solução homogénea. A solução foi arrefecida num banho com gelo e os sólidos foram isolados por meio de filtração. O sal de fumarato sólido de GS-7171 foi seco sob pressão reduzida até 3,7 g. O sal (3,16 g, 5,3 mmol) foi suspenso em diclorometano (30 ml) e foi removido juntamente com uma solução de carbonato de potássio (5 ml, 2,5 M em água) até que o sólido foi dissolvido. A camada orgânica foi isolada, depois foi lavada com água (5 ml) , seca sobre sulfato de sódio anidro, e concentrada sob pressão reduzida para proporcionar 2,4 g de III em forma de uma espuma de cor canela.
Exemplo 3 A. Separação d e Diastereómeros por meio de Cromatografia de Eluição em Semi-descontínua
Os diastereómeros de GS-7171 (III) foram resolvidos por meio de cromatografia de eluição semi-descontínua utilizando uma coluna de HPLC semi-preparativa comercialmente disponível Chiralpak AS, 20 pm, de 21 x 250 mm com uma coluna de segurança Chiralpak AS, 20 pm, de 21 x 50 mm. Chiralpak® AS é um material de empacotado patenteado fabricado por Diacel e vendido na América do Norte por Chiral Technologies, Inc. (Patentes dos Estados Unidos 5.202.433, RE 35.919, 5.434,298, 5.434.299 e 5.498.752) . Chiralpak AS é uma fase estacionária quiral (FEQ) compreendida por amilosetris[ (S)-a-metilbenzil carbamato] que reveste um suporte de sílica gel. A mistura diastereomérica de GS-7171 foi dissolvida na fase móvel, e foram bombeadas alíquotas de cerca de 1 g de GS-7171 no sistema cromatográfico. O diastereómero não desejado, designado como GS-7339, foi o primeiro pico de maior amplitude (aprox. 15 min. de duração) em ser eluído da coluna. Quando o pico de GS-7339 tinha acabado de ser eluído, a fase móvel foi comutada imediatamente por álcool metílico ao 100 %, que fez com que o diastereómero desejado, designado como GS-7340 (IV), fosse eluído como um pico agudo da coluna com o fronte de solvente de álcool metílico. O álcool metílico foi utilizado para reduzir o tempo de ciclo total. Depois do primeiro par de injeções, foram recolhidos ambos os diastereómeros como uma única fração grande que continha um dos diastereómeros purificados (>99,0 % de um único diastereómero) . Os solventes da fase móvel foram retirados in vacuo para produzir o diastereómero em forma de uma espuma friável.
Cerca de 95 % da massa do GS-7171 de partida foi recuperada nas duas frações diastereoméricas. A fração de GS-7340 compreendeu cerca de 50 % da massa total recuperada.
As condições cromatográficas foram as seguintes: :GS-7120 - Acetonitrilo: Álcool
Fase móvel (Inicial) , . _
Isopropilico (90:10) (Final) : Álcool Metílico a 100 %
Fluxo : 10 ml/minuto
Tempo de Execução : cerca de 45 minutos,
Deteção : UV a 275 nm.
Temperatura: : Ambiente
Perfil de Eluição : GS-7115 (diastereómero B) : GS-7340 (diastereómero A; (IV) )
B. Separação dos Diasterómeros de GS-7171 por meio de Cromatografia LMS
Para uma descrição geral da cromatografia de leito de movimento simulado (LMS), veja-se Strube et al., "Organic Process Research and Development" 2:305-319 (1998). O GS-7340 (IV). GS-7171 (III), 2,8 kg, foi purificado por meio de cromatografia de leito de movimento simulado ao longo de 10 cm por meio de leitos de 5 cm de empacotado (Chiral Technologies Inc., Chiralpak AS de 20 micrómetros que reveste a silica gel) (1,2 kg). As colunas foram eluidas com metanol a 30 % em acetonitrilo. As frações que portavam o produto foram concentradas até uma solução de IV em acetonitrilo (2,48 kg) . A solução foi solidificada até uma massa cristalina húmida com acetonitrilo em repouso. A massa cristalina foi seca sob pressão reduzida até um pó cristalino de cor canela, 1,301 kg de IV, pureza diastereomérica do 98,7 %: pf 117 - 120 °C; RMN 3Η (CDC13) δ 1,15 (s, 3,7 (t, 1H) , 4,0 (m, 5H) , 4,2 (dd, 1H) , 5,0 (m, 1H) , 6,05 (s, 2H) , 7,1 (m, 5H) , 8,0 (s, 1H) , 8,2 (s, 1H) ; RMN 31P (CDC13) δ 21,0 (desacoplado) .
C. Separação de Diastereómeros por meio de C18 RP-HPLC O GS-7171 (III) foi submetido a cromatografia por meio de HPLC de fase inversa para separar os diastereómeros utilizando o seguinte protocolo resumido.
Coluna cromatográfica: Phenomenex Luna™ C18(2), 5 pm, tamanho de poro 100 A, (Phenomenex, Torrance, CA), ou equivalente
Coluna de Segurança: Pellicular C18 (Alltech, Deerfield, IL), ou equivalente
Fase móvel: A - 0,02 % (85 %) H3P04 em água: acetonitrilo (95:5) B - 0,02 % (85 %) H3P04 em água: acetonitrilo (50:50)
Gradiente de Fase Móvel:
Tempo de Execução: 50 minutos
Atraso no equilíbrio: 10 min a 100 % da fase móvel A
Velocidade de Fluxo: 1,2 ml/min
Temperatura: Ambiente
Deteção UV a 260 nm.
Solução da amostra: tampão de fosfato de sódio 20 mM, pH 6.
Tempos de retenção: GS-7339, cerca de 25 minutos GS-7340, cerca de 27 minutos D. Separação do Diastereómero por meio de Cristalização GS-7340 (IV) . Uma solução de GS-7171 (III) em acetonitrilo foi concentrada até uma espuma âmbar (14,9 g) sob pressão reduzida. A espuma foi dissolvida em acetonitrilo (20 ml) e foi semeada com um cristal de IV. A mistura foi removida durante a noite, foi arrefecida a 5 °C, e os sólidos foram isolados por meio de filtração. Os sólidos Foram secos até 2,3 g de IV em forma de cristais brancos de 98 % de pureza diastereomérica (RMN 31P: RMN 3H (CDC13) δ 1,15 (s, 3,7 (t, 1H) , 3,95 (m, 2H) , 4,05 (m, 2H) , 4,2 (m, 2H) , 5,0 (m, 1H) , 6,4 (s, 2H) , 7,1 (m, 5H) , 8,0 (s, 1H) , 8,2 (s, 1H) ; RMN 31P (CDC13) δ 19,5 (desacoplado) O análise do cristal por raio X de um único cristal selecionado deste produto deu os seguintes dados: Cor do cristal, Hábito incolor, coluna
Dimensiones do Cristal 0,25 X 0,12 X0,08 mm
Sistema Cristalina ortorrômbico
Tipo de reticulação Primitiva
Parâmetros de Reticulação a = 8,352(1) Á
b = 15,574(2) A
c = 18,253 (2) A V = 2374,2 (5) A3
Grupo Espaçador P2i2i2i (#19) valor Z 4 D caie 1,333 g/cm3 F ooo 1008, 00 μ (ΜοΚα) 1,60 citT1
Exemplo 4
Preparação da Sal de Fumarato de GS-7340 GS-7340-02 (V) . (E squema 1) Foi carregado um reator revestido de vidro com GS-7340 (IV) (1,294 kg, 2,71 mol) com ácido fumárico (284 g, 2,44 mol) e acetonitrilo (24,6 kg) . A mistura foi aquecida até o refluxo para dissolver os sólidos, foi filtrada enquanto estava quente e foi arrefecida a 5 °C durante 16 horas. O produto foi isolado por meio de filtração, foi enxaguado com acetonitrilo (9,2 kg) , e foi seco até 1329 g (V) em forma de um pó branco: pf 119,7 - 121,1 °C; [a] D20 -41,7o (c 1,0, ácido acético).
Exemplo 5
Preparação de GS-7120 (VI)
Foi carregado um balão de fundo arredondado de 5 1 com monofenil PMPA, (II) (200 g, 0,55 mol) e acetonitrilo (20 ml) . Foi adicionado cloreto de tionilo (0,144 kg, 1,21 mol) abaixo de 27 °C. A mistura foi aguecida a 70 °C até gue foram dissolvidos os sólidos. Foram retirados os voláteis (0,45 1) por meio de destilação atmosférica sob azoto. O resíduo do recipiente foi arrefecido a 25 °C, foi adicionado diclorometano (1, 6 kg) e a mistura foi arrefecida a 20 °C. Foi adicionado uma solução de éster etílico do ácido (L) -a aminobutírico (0,144 kg, 1,1 mol) em diclorometano (1,33 kg) ao longo de 18 minutos de -20 a -10 °C seguido de trimetilamina (0,17 kg, 1,65 mol) ao longo de 15 minutos a de -8 a -15 °C. A mistura de reação foi aguecida a temperatura ambiente e foi lavada guatro vezes com uma solução de dihidrogenofosfato de sódio (10 % aq., 0,3 1 cada lavagem). A solução orgânica foi seca com sulfato de sódio anidro (0,5 kg) e filtrada. Os sólidos foram enxaguados com diclorometano (0,6 kg) e o filtrado combinado e enxaguado foi concentrado até um óleo sob pressão reduzida. O óleo foi purificado por meio de cromatografia ao longo de um leito de 15 x 13 cm de 1,2 kg de sílica gel 60 com uma malha de 230 a 400. A coluna foi eluída com um gradiente de diclorometano e metanol. As frações que portavam o produto foram concentradas sob pressão reduzida para proporcionar 211 g de VI (Esquema 3) em forma de uma espuma de cor canela. Exemplo 5a:
Separação dos Diastereómeros de GS-7120 por meio de Cromatografia de Eluição Semi-descontinua A mistura diastereomérica foi purificada utilizando as condições descritas para GS-7171 no Exemplo 3A exceto pelo seguinte: : GS-7120 - Acetonitrilo: Álcool
Fase móvel (Inicial)
Isopropilico (98:2) (Final) : Álcool M etílico a 100 %
Perfil de Eluição : GS-7341 (diastereómero B) : GS-7342 (diastereómero A)
Exemplo 6
Separação dos Diastereómeros de GS-7120 por meio de Cristalização
Foi carregado um balão de fundo arredondado de 1 1 com monofenil PMPA, (II) (50 g, 0,137 mol) e acetonitrilo (0,2 1) . Foi adicionado cloreto de tionilo (0,036 kg, 0,303 mol) com uma exoterma de 10 °C. A mistura foi aquecida até o refluxo até que foram dissolvidos os sólidos. Os voláteis foram retirados (0, 1 1) por meio de destilação atmosférica sob azoto. O resíduo do recipiente foi arrefecido a 25 °C foi adicionado diclorometano (0,2 kg), e a mistura foi arrefecida a -20 °C. Foi adicionado uma solução de éster etílico do ácido (L) -a aminobutírico (0,036 kg, 0,275 mol) em diclorometano (0,67 kg) ao longo de 30 minutos a de -20 a -8 °C seguido de trietilamina (0,042 kg, 0,41 mol) ao longo de 10 minutos a até -6 °C. A mistura de reação foi aquecida a temperatura ambiente e foi lavada quatro vezes com uma solução de dihidrogenofosfato (10 % aq., 0,075 1 cada lavagem). A solução orgânica foi seca com sulfato de sódio anidro (0,1 kg) e foi filtrada. Os sólidos foram enxaguados com acetato de etilo (0,25 1, e o filtrado combinado e enxaguado foi concentrado até um óleo sob pressão reduzida. 0 óleo foi diluído com acetato de etilo (0,25 1) , foi semeado, foi removido durante a noite e foi arrefecido até -15 °C. Os sólidos foram isolados por meio de filtração e foram dessecados sob pressão reduzida para proporcionar 17,7 g de GS-7342 (Quadro 5) em forma de um pó de cor canela: RMN ΤΗ (CDCI3) δ 0,95 (s, 3H) , 1,3 (m, 6H) , 1,7. (m, 2H) , 3,7 (m, 2H) , 4,1 (m, 6H), 4,4 (dd, 1H), 5,8 (s, 2H), 7,1 (m, 5H), 8,0 (s, 1H), 8,4 (s, 1H) ; RMN 31P (CDC13) δ 21 (desacoplado) .
Exemplo 7
Separação dos Diastereómeros de GS-7097 A mistura diastereomérica foi purificada utilizando as condições descritas para GS-7171 (Exemplo 3A) exceto pelo seguinte: : GS-7120 - Acetonitrilo: Álcool
Fase móvel (Inicial)
Isopropílico (95:5) (Final) : Álcool Metílico a 100 %
Perfil de Eluição : GS-7115 (diastereómero B) : GS-7114 (diastereómero A)
Exemplo 8
Procedimento Alternativo para a Preparação de GS-7097 O GS-7097: Fenil PMPA, Etil L-Alanil Amidato, Fenil PMPA (15,0 g, 41,3 mmol) cloridrato de etil éster de L-alanina (12,6 g, 83 mmol) e trietilamina (11,5 ml, 83 mmol) foram suspensos conjuntamente em 500 ml de piridina baixo N2 seco. Esta suspensão foi combinada com uma solução de trifenilfosfina (37,9 g, 145 mmol), Aldritiol 1 (2,2'-dipiridil dissulfureto) (31,8 g, 145 mmol) e 120 ml de piridina. A mistura foi aquecida a uma temperatura interna de 57 °C durante 15 horas. A reação completa foi concentrada a vácuo até uma pasta amarela 100 g. A pasta foi purificada por meio de cromatografia em coluna ao longo de um leito de 25 x 11 cm de 1,1 kg de sílica gel com uma malha de 60,230 a 400. A coluna foi eluída com 8 litros de metanol ao 2 % em diclorometano seguidos de um gradiente lineal ao longo de um curso de 26 litros de eluente até uma composição final de metanol a 13 %. As frações limpas que portavam o produto foram concentradas para produzir 12,4 g de bruto (5), em teoria o 65 %. Este material estava contaminado com cerca de 15 % (em peso) de cloridrato de trimetilamina pela RMN 1H. A contaminação foi retirada dissolvendo o produto em 350 ml de acetato de etilo, extraindo com 20 ml de água, secando a solução orgânica sobre sulfato de sódio anidro, e concentrando para produzir 11,1 g de GS-7097 puro em forma de um sólido branco, rendimento de 58 %. O processo também é utilizado para sintetizar a mistura diastereomérica de GS-7003a e GS-7003b (o amidato de fenilalanilo) e a mistura de GS-7119 e GS-7335 (o amidato de glicilo). Estes diastereómeros são separados utilizando um procedimento de eluição semi-descontinua tal como é mostrado no Exemplo 3A, 6 e 7.
Exemplo 9
Estudos In vitro dos Diastereómeros do Profármaco A atividade anti-VIH-1 e a citotoxicidade in vitro em células e a estabilidade em plasma humano e extratos de células MT-2 de GS-7340 (base livre) e fumarato de tenofovir diisoproxilo (TDF), são mostradas no Quadro 1. O GS-7340 muestra um aumento de 10 vezes na atividade antiviral com respecto a TDF e um aumento de 200 vezes na estabilidade em plasma. Se espera que esta maior estabilidade em plasma seja o resultado de níveis mais altos de GS-7340 na circulação que os de TDF depois da administração oral.
Com a finalidade de estimar o PMPA intracelular relativo que resulta do metabolismo intracelular do TDF em comparação com a do GS-7340, foram marcados radioativamente tanto os profármacos como o PMPA e foram enriquecidos dentro do sangue completo humano a quantidades equimolares. Depois de 1 hora, foram isolados o plasma, os glóbulos vermelhos (RBC) e as células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e foram analisadas por meio de HPLC com deteção radiométrica. Os resultados são mostrados na Figura 2.
Depois de 1 hora, o GS-7340 dá como resultado lOx e 30x a concentração das espécies de PMPA nos PBMC em comparação com TDF e PMPA, respetivamente. Em plasma, depois de 1 hora, 84 % da radioatividade se deve ao GS-7340 intato, enquanto que não se deteta TDF depois de 1 hora. Dado que não se deteta TDF intato em plasma, a diferença de lOx a 1 hora entre TDF e GS-7340 é a mínima diferença esperada in vivo. 0 cromatograma de HPLC para os três compostos nos PBMC é mostrado na Figura 1.
Figura 1. Traços na HPLC/C-14 de Extratos de PBMC de Sangue Humano Incubados durante 1 h a 37 SC com TDF, GS-7340 ou PMPA.
Os Met, X e Met E (metabolitos X e E) são mostradas no Quadro 5. 0 "p" minúsculo designa a fosforilação. Estes resultados foram obtidos depois de 1 hora em sangue humano. Aumentando o tempo, espera-se que aumentem as diferenças in vitro, dado que 84 % do GS-7340 ainda está intato no plasma depois de uma hora. Devido a que o GS-7340 está presente em plasma depois da administração oral, a eficácia clinica relativa deveria estar relacionada com os valores de CI50 observados in vitro.
No Quadro 3 a seguir, são enumerados os valores de CI50 de tenofovir, TDF, GS-7340, vários nucleósidos e do inibidor de proteases nelfinavir. Tal como é mostrado, nelfinavir e GS-7340 são de 2-3 ordens de magnitude mais potentes que o resíduo dos nucleótidos ou nucleósidos.
Quadro 3. Atividades Anti-VIH-1 dos Compostos Antirretrovirais
In vitro
Foram levados a cabo estudos de culturas celulares adicionais in vitro da atividade anti-VIH-1 e a CC50 de diastereómeros separados desta invenção e os resultados são tabulados a seguir.
Quadro 4. Efeito do Diastereómero
Referência do ensaio: Arimilli, MN), et al. , 1997 & Synthesis, in vitro biological evaluation and oral bioavailability of 9-[2-(phosphonomethoxy) propyl]adenine (PMPA) prodrugs. Antiviral Chemistry and Chemotherapy 8 (6) :557-564. "Phe-metiléster" é o metilfenilalaninil monoamidato, fenil monoéster de fenofovir; "Gly-metiléster" é o metigicil monoamidato, fenil monoéster de tenofovir.
Em cada caso anterior, acredita-se que o isdmero A tern a mesma estereoquimica absoluta que GS-7340 (S), e acredita-se que o isdmero B tem a mesma estereoquimica absoluta que a de GS-7339 . 0 metabolismo in vitro e a estabilidade dos diastereómeros separados foram determinados em PLCE, extrato de MT-2 e plasma humano. Uma amostra biológica enumerada a seguir, 80 μΐ, foi transferida a um tubo de centrífuga com tampa de rosca e foi incubada a 37 °C durante 5 min. Foi adicionado à amostra biológica uma solução que continha 0,2 mg/ml do composto de ensaio num tampão adequado, 20 μΐ, e foi misturado. A mistura de reação, 20 μΐ, foi amostrada imediatamente e foi misturada com 60 μΐ de metanol que continham 0,015 mg/ml de 2-hidroximetilnaftaleno como um padrão interno para a análise por HPLC. A amostra foi tomada como a amostra de tempo zero. Depois, em pontos de tempo específicos, a mistura de reação, 20 μΐ, foi amostrada e foi misturada com 60 μΐ de metanol que continha o padrão interno. A amostra obtida deste modo foi centrifugada a 15.000 G durante 5 min e o sobrenadante foi analisado com HPLC nas condições que são descritas a seguir.
As amostras biológicas foram avaliadas do seguinte modo. (1) PLCE (carboxieterase de fígado suíno de Sigma, 160 ou/mg de proteína, 21 mg de proteína/ml) diluído 20 vezes com PBS (solução salina tamponada com fosfato). (2) Foi preparado o extrato de células MT-2 a partir de células MT-2 de acordo com o procedimento publicado [A. Pompon, I. Lefebvre, J.-L. Imbach, S. Kahn, eD. Farquhar, "Antiviral Chemistry & Chemotherapy", 5:91-98 (1994)] exceto em que foi utilizado o tampão HEPES que é descrito a seguir como o meio. (3) Plasma Humano (plasma humano normal combinado de George King Biomedical Systems, Inc.).
Os sistemas tampão utilizados nos estudos são os seguintes.
No estudo para o PLCE, o composto de ensaio foi dissolvido em PBS. O PBS (solução salina tamponada com fosfato, Sigma) contém fosfato 0, 01 M, cloreto de potássio 0, 0027 M e cloreto de sódio 0,137 M, pH 7,4 a 37 °C.
No estudo para os extratos de células MT-2, foi dissolvida o composto de ensaio em tampão HEPES. O tampão HEPES contém HEPES 0,010 M, cloreto de potássio 0,05 M, cloreto de magnésio 0, 005 M, e dl-ditiotreitol 0, 005 M, pH 7,4 a 37 °C. No estudo para plasma humano, o composto de ensaio foi dissolvida em TBS. O TBS (solução salina tamponada com tris, Sigma) contém Tris 0,05 M, cloreto de potássio 0,0027 M e cloreto de sódio 0,138 M, pH 7,5 a 37 °C. A análise por HPLC foi levada a cabo nas seguintes condições.
Zorbax Rx-C8, 4, 6 x 250 mm. 5 μ Coluna: (MAC-MOD Analytical, Inc. Chadds
Ford, PA).
Deteção UV a 260 nm.
Velocidade de fluxo:1,0 ml/min Tempo de Execução: 30 min
Volume de injeção: 20 μΐ,
Temperatura da
Temperatura Ambiente:
Coluna:
fosfato de potássio 50 mM (pH
Fase móvel A:
6.0) /CH3CN = 95/5 (v/v) fosfato de potássio 50 mM (pH
Fase móvel B: 6.0) /CH3CN = 50/50 (v/v)
Gradiente Executado: 0 min Fase móvel A a 100 % 25 minFase móvel B a 100 % 30 minFase móvel B a 100 %
A seguir, são mostrados os resultados no Quadro 5 (incluindo também dados das IC50 selecionadas a partir da Quadro 4). Quadro 5. Metabolismo In vitro dos Isómeros A e B do PMPA
monoamidato a 37 SC
Exemplo 10
Exposições a plasma e PBMC Depois da Administração oral de Diastereómeros de Profármacos a Cães Beagle A farmacocinética de GS 7340 foi estudada em cães depois da administração oral de uma dose de 10 mg-eq/kg.
Formulações. Os profármacos foram formulados como soluções em ácido cítrico 50 mM dentro das 0,5 horas antes da dose. Todos os compostos utilizados nos estudos foram sintetizados por Gilead Sciences. Foram utilizados os seguintes lotes:
Administração de Dose e Recolha de Amostras. A fase in vivo deste estudo foi levada a cabo de acordo com as recomendações da "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (National Institutes of Healthpublication 86-23) e foi aprovado por um Comité Institucional de Cuidado e Utilização de Animais. Foram utilizados cães beagle macho (10 ± 2 kg) em jejum para os estudos. Foi administrado cada fármaco como uma única dose por meio de administração oral forçada (1,5-2 ml/kg). A dose foi o equivalente a 10 mg de PMPA/kg. Para os PBMC, foram recolhidos amostras de sangue às 0 (pré-dose) , 2, 8 e 24 h pós-dose. Para o plasma, foram recolhidas amostras de sangue a 0 (pré-dose), 5, 15 e 30 min, e 1, 2, 3. 4. 6. 8. 12 e 24 h pós-dose. O sangue (1,0 ml) foi processado imediatamente para o plasma por meio de centrifugação a 2000 rpm durante 10 min. As amostras de plasma foram congeladas e foram mantidas a 10 °C até a análise.
Preparação de Células Mononucleares de Sangue periférico (PBMC). Foi misturado o sangue completo (8 ml) recolhido em pontos de tempo especificados em proporções iguais com solução salina tamponada com fosfato (PBS), foi estratificado sobre 15 ml de solução de Ficoll-Paque (Pharmacia Biotech,) e foi centrifugada a 400 x g durante 40 min. Foi retirada a camada de PBMC e foram lavados uma vez com PBS. O sedimento de PMBC formado foi reconstituído em 0,5 ml de PBS, as células foram ressuspensas, foram contadas utilizando um hemocitómetro e foram mantidas a 70 °C até a análise. O número de células multiplicado pelo Volume médio de uma única célula foi utilizado para calcular as concentrações intracelulares. Foi utilizado um valor notificado de 200 femtolitros/célula como o Volume em repouso dos PMBC (B. L. Robins, R.V. Srinivas, Kim, N. Bischofberger, e A. Fridland, Antimicrob. Agents Chemother. 42, 612 (1998) .
Determinação de PMPA e Profármacos em plasma e PBMC. A concentração de PMPA nas amostras de plasma de cães foi determinada derivando o PMPA com cloracetaldeído para produzir um derivado de N1, N6-etenoadenina altamente fluorescente (L. Naesens, J. Balzarini, e E. De Clercq, Clin. Chem. 38,480 (1992) . Brevemente, foi misturado o plasma (100 μΐ) com 200 μΐ de acetonitrilo para precipitar as proteínas. Depois, as amostras foram evaporadas até a secura sob pressão reduzida a temperatura ambiente. As amostras secas foram reconstituídas em 200 μΐ de coquetel de derivação (cloracetaldeído a 0,34 % em acetato de sódio 100 mM, pH 4,5), foram agitados com vórtice e foram centrifugados. Depois o sobrenadante foi transferido a um tubo com tampa de rosca limpo e foi incubado a 95 °C durante 40 min. Depois, as amostras derivadas foram evaporadas até a secura e foram reconstituídas em 100 μΐ de água para a análise por HPLC.
Antes de que o PMPA intracelular pudesse ser determinado por meio de HPLC, as grandes quantidades de ribonucleótidos de adenina relacionados presentes nos extratos de PBMC tiveram que ser retiradas por meio de oxidação seletiva. Foi utilizado um procedimento modificado de Tanaka et al (K. Tanaka, A. Yoshioka, S. Tanaka, e. Wataya, Anal. Biochem. 139. 35 (1984) . Brevemente, as amostras de PMBC 1:2 foram misturadas com metanol e foram evaporadas até a secura sob pressão reduzida. As amostras secas foram derivadas tal como é descrito no ensaio do plasma. As amostras derivadas foram misturadas com 20 μΐ de ramnose 1 M e 30 μΐ de periodato de sódio 0,1 M e foram incubadas a 37 °C durante 5 min. Depois da incubação, foram adicionados 40 μΐ de metilamina 4 M e 20 μΐ de inosina 0,5 M. Depois incubação a 37 °C durante 30 min, as amostras foram evaporadas até a secura sob pressão reduzida e foram reconstituídas em água para o análise por HPLC. Não foi detetado o profármaco intato em nenhuma das amostras de PBMC. Para as amostras de plasma que continham potencialmente profármacos intatos, foram realizados experiências para verificar que não ocorreu conversão adicional a PMEA durante a derivação. Foram adicionados os padrões dos profármacos ao plasma livre de fármacos e foram derivados tal como é descrito. Não houve níveis detetáveis de PMPA presentes em nenhuma das amostras de plasma, e a % de conversão projetada foi menor de 1 %. 0 sistema HPLC estava compreendido por sistema de fornecimento de solvente P4000 com um autoinjetor AS3000 e um detetor de fluorescência F2000 (Thermo Separation, San José, CA) . A coluna era uma coluna Inertsil ODS-2 (4,6 x 150 mm) . As fases móveis utilizadas foram: A, acetonitrilo a 5 % em tampão de fosfato de potássio 25 mM com brometo de tetrabutilamónio (TBABr) 5 mM, pH 6,0, B, acetonitrilo ao 60 % em tampão de fosfato de potássio 25 mM com TBABr 5 mM, pH 6,0. A velocidade de fluxo foi de 2 ml/min e a temperatura da coluna foi mantida a 35 °C por meio de um forno de coluna. O perfil de gradiente foi A a 90 %/B a 10 % durante 10 min para PMPA e A a 65 %/B a 35 % durante 10 min para o profármaco. A deteção foi por fluorescência com excitação a 236 nm e emissão a 420 nm e o Volume de injeção foi 10 μΐ. Os dados foram obtidos e armazenados num sistema de adquisição de dados de laboratório (PeakPro, Beckman, Allendale, NY). Cálculos Farmacocinéticos. As exposições do PMPA e profármacos foram expressos como áreas sob a curva de concentração em plasma ou PMBC das zero às 24 horas (ABC) . Os valores de ABC foram calculados utilizando a regra trapezoidal.
Concentrações em plasma e PBMC. Os resultados deste estudo são mostrados nas Figuras 2 e 3. A figura 2 amostra o curso de tempo do metabolismo resumido do GS 7340-2 das exposições de plasma e PMBC depois da administração oral de diastereoisómeros puros dos profármacos de PMPA.
Figura 2. PMPA e Concentração de Profármaco em Plasma e PBMC Depois da Administração Oral de GS 7340-2 a Cães a 10 mg-eq/kg.
0 gráfico de barras da Figura 2 amostra a ABC (0-24 h) para o tenofovir nos PMBC e o plasma de cão depois da administração s.c. de PMPA, TDF e profármacos de ésteres de amidato. Todos os profármacos de amidato mostraram aumentos na exposição aos PMBC. Por exemplo, o GS 7340 da como resultado um aumento de ~21 vezes na exposição aos PBMC em comparação com o PMPA s.c. e TDF; e uma diminuição de 6,25 vezes e 1,29 vezes na exposição a plasma, respetivamente.
Figura 3. Representação da Exposição a Tenofovir em PBMC e Plasma Depois da Administração de 10 mg-eq/kg em cães ABC (0-24 h) para o PMPA em PBMC e Plasma depois de uma dose oral de 10 mg-eq/Kg dos prófarmacos de PMPA a cães
Estes dados estabelecem in vivo que GS 7340 pode ser fornecido por via oral, minimizando a exposição sistémica a PMPA e potenciando em grande medida a concentração intracelular de PMPA nas células principalmente responsáveis da replicação do VIH.
Exemplo 11
Biodistribuição de GS-7340
Como uma parte da caracterização pré-clínica de GS-7340, foi determinada seu biodistribuição em cães. A distribuição nos tecidos de GS-7340 (monoamidato de alanilisopropilo, fenil monoéster de tenofovil) foi examinada depois da administração oral a cães beagle. A dois animais macho foi administra 14C=GS-7340 por via oral (8,85 mg-equiv. de PMPA/kg, 33,2 yCi/kg; o carbono 8 da adenina está marcado) numa solução aquosa (ácido cítrico 50 mM, pH 2,2). O plasma e as células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram obtidos ao longo de um período de 24 horas. As fezes e a urina foram recolhidas da jaula ao longo de 24 h. A as 48 h depois da dose, os animais foram sacrificados e foram retirados os tecidos para a análise. Foi determinada a radioatividade dos tecidos por meio de oxidação e contagem por cintilação líquida. A biodistribuição do PMPA após 24 horas depois de uma única dose oral do GS 7340 marcado radioativamente é mostrada no Quadro 4 juntamente com os dados de um estudo anterior com TDF (GS-4331) . No caso do TDF, a concentração de profármaco no plasma está abaixo do nível de deteção do ensaio e a principal espécie observada em plasma é o fármaco parental. Os níveis de PMPA nos tecidos linfáticos, a médula óssea e o músculo esquelético aumentam 10 vezes depois da administração de GS-7340 . A acumulação em tecidos linfáticos é coerente com os dados observados a partir da análise dos PBMC, dado que estes tecidos estão compostos principalmente de linfócitos. Do mesmo modo, a acumulação em médula óssea provavelmente é devido à alta percentagem de linfócitos (70 %) neste tecido.
Quadro 7. Excreção e Distribuição Tissular de GS-7340 Marcado Radioativamente em Cães (Media, N=2) Depois de uma Dose Oral a 10 mg-eq. PMPA/kg.
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
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Lisboa, 14 de Maio de 2015

Claims (10)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Um composto de estrutura (6):
    ou seus sais e solvatos.
  2. 2. Um composto de acordo com a reivindicação 1 de estrutura (7) :
  3. 3. Uma composição que compreende um composto da reivindicação 1 ou 2 e um excipiente farmaceuticamente eficaz.
  4. 4. A composição da reivindicação 3 em que o excipiente é um qel.
  5. 5. A composição da reivindicação 3 que é adequada para a administração tópica.
  6. 6. Um composto da reivindicação 1 ou 2 para utilização para tratar terapêutica ou profilaticamente infeções virais.
  7. 7. Um composto da reivindicação 1 ou 2 para utilização em terapêutica.
  8. 8. Uma composição da reivindicação 3 para utilização para tratar terapêutica ou profilaticamente infeções virais.
  9. 9. A composição para utilização de acordo com a reivindicação 8 em que a infeção virai é uma infeção por VIH.
  10. 10 . A composição para utilização de acordo com a reivindicação 8 em que a infeção virai é uma infeção hepadnaviral. Lisboa, 14 de Maio de 2015
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