HU230960B1 - Foszfonát nukleotid analógok előgyógyszerei és ezeket tartalmazó készítmények - Google Patents

Description

A találmány kiterjed az új vegyületet vagy sóját gyögyászatilag elfogadható segédanyagokban tartalmazó készítményekre, továbbá azok vírusfertőzések, így HÍV fertőzés vagy hepadnavírus fertőzés terápiájában vagy megelőzésében való felhasználására.

Foszfonát nukleotid analógok előgyógyszerei és ezeket tartalmazó készítmények

A jelen találmány metoxifoszfonát nukleotid analógok elógyógyszereire és ezeket tartalmazó készítményekre vonatkozik.

Számos metoxifoszfonát nukleotid analóg ismert. Általában az ilyen vegyületek szerkezete az A-OCHjP(0)(OR)₂ általános képletnek megfelelő, ahol A a nukleozid analóg maradéka, és R jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy különböző védőcsoport vagy előgyógyszer funkciós csoport. Lásd az 5 663 159 számú, az 5 977 061 számú és az 5 798 340 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást; és az Oliyai et al., Pharmaceutical Research 16(11), 1687-1693 (1999); Stella et al·., <J. Pled. Chem., 2 3 (12), 1275-1282 (1980); Aarons L., Boddy A. and Petrák K., Novel Drug Delivery and Its Therapeutic Application (Prescott 1. F. and Nimmo W. S., ed.), 121-126 (1989); Bundgaard H., Design of Prodrugs (Bundgaard H., ed.}, 70-72 és 79-92 (1985); Banerjee P. K. and Ariidon G. L. , Design of Prodrugs” (Bundgaard H., ed.), 118-121 (1985);

Notari R. E., Design of Prodrugs (Bundgaard H., ed.) 135-156· (1985); Stella V. J. és Himmelstein K. J., Design of Prodrugs (Bundgaard H., ed.) 177-198 (1985); Jones G.,

Design of Prodrugs (Bundgaard H., ed.) 199-241 (1985);

Connors T. A., Design of Prodrugs (Bundgaard H., ed.), 291316 (1985) irodalmi helyet.

Az 5,977,089 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás fcszfono-metoxi-nukleotid. analógok karbonátokkal és karbamátokkal alkotott észtereit ismerteti. Az észterek orálisan beadhatók vírusellenes terápia vagy

.A 481 214 számú európai szabadalmi .leírás foszfonát nukleotid analógok orálisan beadható e.lővegyületeit ismertetik, amelyek fiziológiás körülmények között hídrólizálnak és a vírusellenes hatású hatóanyagokká alakulnak.

A WO 95/07920 számon publikált nemzetközi szabadalmi bejelentésből foszfoamidát- vagy észterkötést tartalmazó nukleotid analógok ismertek. A vegyületek in vivo hidrolízálnak és a megfelelő, vírusellenes hatású foszfonát nukleotid analóggá alakulnak.

A WO 96/29336 számon publikált nemzetközi szabadalmi bejelentés maszkírozott monofoszfát nukleozid analógokat ismertet, amelyek felhasználhatók vírusfertőzés, különösen Hív mege1özéséné1 és kezelésénél.

A metoxifoszfonát nukleotid analógok elögyógyszereit, amelyeket vírusellenes vagy daganatellenes terápiára szántak, amennyire ismerjük, hagyományosan szisztémás hatásuk miatt választották. Az ilyen előgyógyszerek például fokozott biológiai hasznosíthatósággal rendelkeznek, azaz a gasztrointesztinális traktusból képesek felszívódni és gyorsan az eredeti vegyületté alakulni, ami biztosítja, hogy az eredeti hatóanyag minden szövet számára hozzáférhető. Most azonban azt találtuk, hogy lehetséges olyan előgyógyszereket választani, amelyek az analógokhoz hasonlóan a terápiás helyeken, amint azt az itt leírt vizsgálatok szemléltetik, a HÍV fertőzés lokalizált fokális helyein dúsainak fel. A jelen találmány célja, más előnyök mellett, hogy a környező szöveteket kisebb toxikus hatás érje és nagyobb legyen az. eredeti hatóanyag potenciája azokban a szövetekben, amelyek az eredeti metoxifoszfonát nukleotid analóggal végzett terápiának a cé1szovetei.

A fentieknek megfelelően, ezeket a megfigyeléseket követve, egy szűrési eljárást választottunk olyan metoxifoszfonát nukleotid analóg elögyógyszer azonosítására, amely fokozott hatást biztosít egy célszövetben, az eljárás szerint (a) legalább egy fenti előgyógyszerről gondoskodunk.;

(b) kiválasztunk legalább egy célszövetet és legalább egy nemcélszövetet;

(c) az előgyőgyszert a célszövetre és legalább egy nemcélszövetre adagoljuk; és (d) meghatározzuk a relatív vírusellenes hatást, amelyet az előgyógyszer a (c) lépés szerinti szövetekben biztosit.

Az előnyös megvalósítási módokban a célszövet olyan hely, ahol a HÍV aktivan replikálódík és/vagy amely HÍV rezervoárként szolgál, és a nem-célszövet egy érintetlen állat. Váratlan módon azt találtuk, hogy ezen eljárás gyakorlati megvalósítására a nyirokszövet célszövetként való választása a HÍV esetében olyan előgyógyszerek azonosításához vezetett, amelyek fokozzák a hatóanyagok ilyen szövetekhez v a 1 ó e 1 j u 11 a t á s á t.

Ezen túlmenően váratlanul azt találtuk, hogy a foszforatomon és/vagy az amidét helyettesítőn levő szubsztituensek kiralitása befolyásolja a találmány gyakorlati megvalósításában megfigyelt dúsulást.

Ά találmány értelmében az enantiomerben gazdag, (3) általános képletű o

P*..............

(3) vegyületet ismertetjük, amely 40 tömeg %~nál kevesebb (4) általános kéoletű

(4) enantiomert tartalmaznak, ahol a képletekben

Pú jelentése oxiészter, amely in vivo hidrolizálható, vagy hidroxilcsoport;

B jelentése heterociklusos bázis;

R'·'· jelentése hidroxilcsoport vagy egy a foszforatomhoz az aminosav aminocsoportján keresztül kapcsolódó aminosavmaradék, amely aminosav mindégyi k k ét r b o z í les o p őrt helyettesitője adott esetben észterezett, azonban R^; és R'~ nem mindegyike hidroxilcsoport;

-CH (R*) OCH (R' ) -, -CH (R³) CH?O- vagy -CH(R*)O~ képle tű vagy általános képletű csoport, amelyekben a jobb oldali vegyérték kötés a heterociklusos bázishoz kapcsolódik;

a szaggatott vonal adott esetben jelenlevő kettős kötést jelent;

R⁴ és R⁵ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, halogénatom, hidroxilcsoport, aminocsoport vagy 1-5 szénatomos aciloxi-, alkiloxi-, alkiltio-, alkil-amino- vagy dialkilR* és R^ö' jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, 1-6 szénatomos alkil·-, 1-6 szénatomos hidroxi-alkil- vagy 2-7 s z é n a t onto s a 1 k an o i 1 c s ο p o r t;

R' jelentése egymástól· függetlenül hidrogénatom., 1-6 szénatomos alk.ilesöpört, vagy együtt -0- vagy -CHj- csoport;

R⁸ jelentése hidrogénatom, 1-6 szénatomos alkil-, 1-6 szénatomos hidroxi-alkil- vagy 1-6 szénatomos halogéna 1 k i .1 c s ορο r t; é s

R^v jelentése hidrogénatom, hidroxi-metil- vagy aciloxime t i1-c s oport, továbbá a vegyületek sói, szabad bázis alakjai és szolvátjai.

A (3) általános képletü diasztereomereket a foszfor királis centrumnál (S)-izomerekként jelöljük.

A találmány értelmében ismertetjük az enantiomerben gazdag (5a) általános képletü vegyületet

(5a) amely 40 tömeg %-nál kevesebb (5b) általános képletü

(5b) enantiomert tartalmaz, ahol a képletekben

P? jelentése metilcsoport vagy hidrogénatom;

R^c jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, alkil-, alkenil-, alkinil-, aril- vagy arllalkilcsoport, vagy R⁶ jelentése egymástól függetlenül alkil-, alkenil- alkinil-, aril- vagy aril-alkil-csoport, amely a halogénatom, az alkil am i η o -, a 1 k i 1 - am i η o ~ a 1 k i 1 -, d .i alkil-amino-alkil-, dialkilamino-, hidroxil-, oxo-, amino-, alkiltio-, alkoxi-, alkoxialkil-, ariloxi-, ariloxi-alkil-, aril-alkoxi-, aril-alkoxialkil-, halogén-alkil-, nit.ro-, nit ro-alkil-, azido-, azido

a.lkil·-, alkil-acil-, alkil-aciΙ-alkil-, karboxil- vagy alkilacil-arninocsoport közül választott 1-3 csoporttal, helyettesített;

R' jelentése bármely természetben előforduló vagy gyógyászatflag elfogadható aminosav oldallánca, amelyben, ha az oldallánc karboxilesöpörtót tartalmaz, a karboxilcsoport adott esetben egy alkil- vagy árucsoporttá! észterezett.;

R¹¹ jelentése amino-, alkil-amino-, oxo- vagy dialkil amino-csoport; és

R^i<; jelentése aminocsoport vagy hidrogénatom;

és a vegyületek sói, tautomerjei, szabad bázis alakja és szolvátj ai.

A találmány kiterjed a (6) képletű vegyületre

(6) amely 9-[(R)-2-[í(S)-[[(S)-1-(izopropoxi-karbonil)-etil]amino] -fenoxi-foszf inil] -metoxi] -propil] -adenin, amelyet GS-7340 jelű vegyületnek is nevezünk, továbbá sóira.

A találmány körébe tartozik a (6) képletű vegyület (7) k é p 1 e t ű f urna r á t s ó j a

azaz 9- [ (R; -2 - [ [ (S) ~ [ [ (S) -1- (izopropox1-karboni 1) -éti.1 ] amino]-fenoxi-foszfinil]-metoxi]-propil]-adenin-fnmarát (1:1), amelyet GS-7340-2 jelű vegyületnek is nevezünk.

A (6)-(7) képletü vegyületeket adott esetben gyógyászatilag elfogadható segédanyagokat tartalmazó készítményekké alakítjuk. Az ilyen készítményeket hatékony dózisokban használjuk vírusos (különösen HÍV vagy hepadnavírusos) fertőzések terápiájában vagy megelőzésében.

A fent említett szűrési eljárásban alkalmazható ismert metozi-foszfonát nukleotid analóg hatóanyagok az A-CHsPfO) (OK) _s képletnek megfelelő szerkezetűek, ahol egy nukleotid analóg maradékát jelenti. Ezek a vegyületek maguk ismertek, és nem képezik a találmány részét. Közelebbről az ismert vegyületek egy B heterociklusos bázist és egy E agiikont tartalmaznak, és a (9) általános képlettel j e11emezhét ők

ahol a B csoport jelentése a későbbiekben meghatározott, és az E csoport jelentése az előzőekben meghatározott. Az ismert vegyületekre példákat a 4 659 825 számú, a 4 808 716 számú, a

4 7	24 233 számú,	az 5 142 051 számú,	az 5 130 4 2.7 számú, az 5
6 5 0	510 számú, a	z 5 663 159 számú,	az 5 302 585 számú, az 5
4 / &	938 számú, a	z 5 696 263 számú,	az 5 744 600 számú, az 5
688	778 s z ámú, a	z o 38 o üju szama,	az 5 7 33 8 96 számú, az 5
3 3 2	786 számú	és az 5 798 340	számú amerikai egyesült
s..», ,κ-	amokbeli, és	a 821 690 számú és	a 654 037 számú európai
S 2 &	badalmi leírás	ok ismertetnek.
	A j el. en t.	ilálmány szerinti	előgyógyszerek az ismert

metozifoszfonát nukleotid analógok kovalensen módosított analógjai, amelyeket az előző bekezdésben írtunk le. Általában az ismert vegyület foszforatomja az előgyógyszerré alakítás előnyös helye, de a heterociklusos B bázison vagy az E aglikonon is találunk további alkalmas helyeket. Számos ilyen előgyógyszer már ismert. Elsősorban ezek a foszforatom.

észterei vagy amidátjai, de idetartoznak a bázison és az aglikonon szubsztituált származékok is. Ezen módosítások egyike sem képezi a találmány részét, és ezek egyike sem korlátozza a jelen találmány körét.

A metoxifoszfonát. nukleotid analógok foszforatomja két vegyértéket tartalmaz kovalens módosításhoz, így amidáláshoz vagy észtrezéshez (hacsak egy foszforil-hidroxilcsoport nincs észterezve egy E-aglikon hídroxil-szubsztituenssel, ekkor csak egy foszfor vegyérték szabad a helyettesítésre). Az észterek jellemzően ariloxi-észterek. Az amidátok rendszerint.

természetben előforduló monoarainosavak, amelyeknek a szabad karboxilcsoportja(i) alkil- vagy arilcsoporttal, általában fenil-, cikloalkil- vagy tere-, n- vagy szek-alkilcsoporttal észterezett(ek), A szűrési eljárásban való alkalmazásra megfelelő előgyógyszereket például az 5 798 340 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetnek. Sármilyen elögyógyszer alkalmazható az eljárásban, amelyről potenciálisan úgy gondoljuk, hogy képes in vivo a célszövet sejtjeiben a szabad metoxifoszfonát nukleotid analóg eredeti hatóanyaggá alakulni például hidrolízis, oxidáció vagy más kovalens átalakulás révén, a biológiai szövetek hatásának kitéve. Az ilyen előgyógyszerek lehet hogy még nem ismertek, de a jövőben azonosításra kerülhetnek, és akkor az eljárásban való kipróbálásra megfelelő jelöltekké válnak. Mivel az előgyógyszerek egyszerűen jelöltek az eljárásokban való szűrésre, szerkezetük nem releváns a szűrési eljárás gyakorlati megvalósítása vagy lehetővé tétele szempontjából, noha természetesen a szerkezetük végül is meghatározza, hogy egy elögyógyszer szelektívnek, rautatkozik-e a vizsgálatban vagy nem.

Az eredeti hatóanyaghoz kapcsolódó elő-molekularészek lehetnek azonosak vagy eltérőek. A szűrési vizsgálatban alkalmazandó mindegyik elögyógyszer azonban szerkezetileg különbözni fog más kipróbálandó előgyógyszerektől. A különböző, azaz szerkezetileg eltérő előgyógyszereket általában azok sztereokémiája vagy kovalens szerkezete, vagy ezen jellemzők különböző kombinációi alapján választjuk ki. Mindegyik kipróbált elögyógyszer azonban kívánatosán szerkezetileg és sztereokémiailag lényegében tiszta, egyébként a szűrési vizsgálat eredménye kevésbé használható.

Megvalósítható természetesen csak egyetlen előgyógy szexkipróbálása az eljárás egy egyedi megvalósítási módjában, azonban jellemzően ezután az eredményeket összehasonlítjuk korábbi, más előgyógyszerekkel végzett vizsgálatok eredményelvel.

Azt találtuk, hogy az előgyógyszerek sztereokémiája képes befolyásolni a célszövetekben való feldúsulást. A királis helyek a foszforatomnál vannak és annak helyettesítőiben is előfordulnak. Az amidét ok előállításához használt, aminosavak például D vagy L formájúak, és a foszfonát-észterek vagy az aminosav-észterek is tartalmazhatnak királis centrumokat. Királis helyek a molekula nukleozid analóg részében is találhatók, de ezeket jellemzően az eredeti hatóanyag sztereoKémiaja natarozza meg, es ezeket nem valtoztatius meg a szűrés során. A PMPA esetében például az R-izomert részesítjük előnyben, mivel aktívabb, mint a megfelelő S~izomer. Ezeket a diasztereomereket vagy enantiomereket jellemzően királisan dúsítjuk, hacsak nem tiszták minden helyen, úgyhogy a szűrés eredménye így többet mond. Amint azt az előzőekben me gjegyeztük, a s zt ere o izome r e k megkü1Önböztethetőségét azáltal biztosítjuk, hogy dúsítjuk vagy tisztítjuk a sztereoizomert (jellemzően ezt inkább egy diasztereomerrel,

mint enantiomerrel	tesszük a legtöbb meto	xifoszf	'onát	nu	kl.eoti.ci
analóg esetében),	hogy mentes legyen	a kér	•;dése	:S	királis
centrumnál más	s zt ereo izome réktől,	úgyhoí		mi	ndegyik

tesztvegyület lényegében homogén. A lényegében homogén vagy királisan dúsított meghatározáson azt értjük, hogy a kívánt sztereoizoiaer alkotja a vegyület nagyobb, kb. 60 tömeg%-nál nagyobb, rendszerint kb. 80 tÖmeg%~nál nagyobb, és előnyösen kb. 95 tömeg%-nál nagyobb részét.

Amikor legalább egy jelölt előgyógyszert kiválasztottunk, a szűrési eljárás fennmaradó lépéseit arra használjuk, hogy a bélszövet szempontjából kívánt szelektivitással rendelkező előgyógyszert azonosítsuk. Legkényelmesebben az előgyógyszereket egy kimutatható csoporttal, például radioaktív izotóppal jelzett csoporttal jelöljük, hogy a későbbiekben a szövetekben vagy a sejtekben a kimutatást megkönnyítsük. Egy jelzés azonban nem feltétlenül szükséges, mivel más alkalmas módszereket is használhatunk az előgyógyszernek vagy metabolitjainak (ezen belül az eredeti hatóanyagnak) a meghatározására. Ezek a módszerek többek között például tömegspektrometriás és HPLC eljárások, biológiai vagy immunmeghatározások lehetnek. A vizsgálat során kimutathatjuk az elögyógyszert és bármelyik vagy több metabolitját, azonban előnyösen a meghatározást úgy végezzük, hogy csak az eredeti hatóanyag képződését detektáljuk. Ez azon a feltételezésen alapul (amely lehet, hogy nem minden esetben megalapozott) , hogy az előgyógyszer vírusellenes hatású eredeti difoszfáttá való átalakulásának mértéke és sebessége minden vizsgált .szövetben azonos. Egyébként vizsgálhatjuk a difoszfátot is.

A célszövet előnyösen nyirokszövet, amikor HÍV fertőzés kezelésében használható előgyógyszereket szűrünk. A nyirokszövetet a szakember ismeri, ez a szövet CD4 sejteket, limfocitákat, nyirokcsomókat, makrofágokat és makrofágszerű sejteket, így monocitákat, például perifériás vér monocita sejteket (peripheral blood monocytic cells, PBMC-ket) és gliasejteket foglal magában. A nyirokszövetek körébe olyan nem-nyirokszovetek is tartoznak, amelyek nyirokszövetekben vagy -sejtekben gazdagok, például a tüdő, bőr és lép. Más vírusellenes szerek esetében a célszövetek természetesen az adott vírus reputációjának vagy látenciájának primer helyei, például májgyulladás esetében a máj, és HSV esetében a perifériás idegek. Hasonlóképpen, tumorok esetében a célszövetek maguk a tumorok. Ezek a szövetek a szakember által jól ismertek, és nem igényel túlzott mértékű kísérletezést a kiválasztásuk. Amikor vírusellenes vegyületekre szűrünk, a célszövet lehet vírussal fertőzött.

A jelen eljárás részeként nem-célszöveteket vagy -sejteket is szűrünk. Bármilyen számú vagy minőségű ilyen szövet vagy sejt alkalmazható ebben a tekintetben. Általában olyan szöveteket használunk nem-célszövetként, amelyekre az eredeti .hatóanyagot toxikusnak várjuk. A nem-cél szövet kiválasztása lényegében az előgyógyszer természetétől és az eredeti vegyület aktivitásától függ. Nem-máj szöveteket választunk az előgyógyszerhez májgyulladás ellen, és a tumorral azonos, nem transzformált sejtek lesznek megfelelőek a daganatellenes hatás szempontjából szelektív előgyógyszer szűrésére.

Megjegyezzük, hogy az eljárás különbözik azoktól a vizsgálatoktól, amelyeket általában az előgyógyszerek orális biológiai hasznos 1thatóságának meghatározására végeznek. Az orális biológiai hasznosíthatóság! vizsgálatok célja olyan előgyógyszer azonosítása, amely a szisztémás keringésbe lényegében az eredeti hatóanyaggá alakulva jut be. A jelen találmányban a cél olyan előgyógyszer megtalálása, amely nem métábólízálódik a gasztrointesztinális traktusban vagy a keringésben. Ily módon az eljárásban értékelendő célszövetek közé általában nem tartoznak a vékonybelek, vagy, ha a vékonybelek beletartoznak, akkor a szövetek további, a vékonybelektől eltérő szöveteket is tartalmaznak.

A szűrési eljárásban használt célszövetek és nemcélszövetek jellemzően egy érintetlen élő állatban vannak. Az észtereket tartalmazó előgyógyszereket jobb kutyákban, majmokban vagy más, a rágcsálóktól eltérő állatokban vizsgálni; az egerek és a patkány plazmája észterázokat nagy keringő szinten tartalmaz, ami félrevezető eredményt produkálhat, ha a kívánt terápiás egyed ember vagy magasabbrendű emlős.

Az eljárást nem szükséges érintetlen állatokban végezni.

Megvalósítható perfundált szervek, szervek in vitro tenyészeteinek (például bőrgraftok} vagy különféle s e j 11 e n y é s z e t - f o rmá kb a n f e η n t a r t o 11 s e j t vo na 1 a k, p é 1 dá u 1 forgatott lombikok, súlytalanság állapotában levő szuszpenziórendszerek alkalmazása is. MT-2 sejteket például használhatunk célszövetként HÍV előgyógyszerek kiválasztására. Ily módon a szövet-nek nem kell feltétlenül szervezett sejtes szerkezeteknek vagy olyan szövet-szerkezeteknek lennie, amilyenek a természetben találhatók, noha ez lenne az előnyös. A szövet.” fogalom inkább egy adott forrásból származó, eredetű vagy differenciálódási stádiumban levő sejtek sz inonírnája.

A célszövet és a nem-célszövet valójában lehet ugyanaz a szövet, de a szövetek biológiai státuszukat tekintve különbözőek. Az eljárást például használhatjuk olyan előgyógyszerek kiválasztására, amelyek vírussal. fertőzött szövetben fejtenek ki hatást (célszövet), de lényegében inaktívak maradnak a vírussal nem fertőzött sejtekben (amely a nem-célszövetnek felel meg). Ugyanezt a stratégiát alkalmazhatjuk a megelőző előgyógyszerek, azaz az olyan előgyógyszerek esetében, amelyek vírusellenes aktív formákká métábólizálódnak vírusos fertőzés hatására, de lényegében metabolizálatlanok maradnak nem fertőzött sejtekben. Hasonlóképpen, az előgyógyszereket transzformált sejtekben és a megfelelő nem-transzformált sejtekben is szűrhetjük. Ez különösen előnyös lenne Összehasonlító vizsgálatra hematológiai malignanciák, például leukémiák kezelésére alkalmas előgyógyszerek kiválasztásához.

Anélkül, hogy bármilyen speciális működési elmélet korlátozna bennünket, a szövetszelektív előgyógyszerekről azt gondoljuk, hogy ezeket a célsejtek szelektíven felveszik és/vagy ezek a sejten belül szelektíven metabolizálódnak más szövetekhez vagy sejtekhez hasonlítva. A jelen találmány szerinti metoxifoszfonát előgyógyszerek egyedülálló előnye, hogy a fiziológiás pH-η dianionná történő metabolí zmusuk biztosítja, hogy nem lesznek képesek visszafelé, a sejtből kifelé diffundálni. Ezért hosszabb időn át hatékonyak és emelt intracelluláris koncentrációban maradnak, ezáltal megnövekedett hatást fejtenek ki. A célszövetben a megnövekedett hatás mechanizmusáról úgy gondoljuk, hogy magában foglalja a célsejtek által történő fokozott felvételt, a fokozott intracelluláris retenciót, vagy a két mechanizmus együtt működik. Az azonban nem fontos, hogy a célszövetben a szelektivitás vagy fokozott célbajutás milyen módon történik. Az sem fontos, hogy az előgyógyszer eredeti hatóanyaggá történő teljes metabolikus átalakulása a célszövetben menjen végbe. Csak a végső hatóanyag hatását biztositó átalakulásnak kell a célszövetben történnie; más szövetekben végbemenő métábólizmus eredményezhet olyan közbenső termékeket, amelyek végül a célszövetben alakulnak vírusellenes formákká.

A kívánt szelektivitás vagy fokozott célbajuttatás mértéke az eredeti vegyülettöl és a mérési módtól függően változik (fees dóziseloszlás vagy eredeti hatóanyag-koncentráció)Általában, ha az eredeti hatóanyag már megfelelő terápiás hatásszélességgel rendelkezik, a szelektivitás kis mértéke elég lehet a kívánt előgyógyszer számára. Másrészt a toxikus vegyületek kiterjedtebb szűrést igényelhetnek a szelektív elogyógyszerek azonosításához. Az eljárás relatív költsége csökkenthető, ha csak a célszövetben és olyan szövetekben végzünk szűrést, amelyekkel szemben az eredeti vegyületről ismert, hogy aránylag toxikus, például a PME.A esetében, amely nagyobb dózisokban veseméreg, a figyelem elsősorban a vese- és a n y i r o k s z ö v e t e k r e i r á n y u 1.

Egy előgyógyszer relatív vírusellenes hatásának meghatározási lépése a kiválasztott szövetekben rendszerint ügy valósul meg, hogy megvizsgáljuk a célszövetet és a nemcélszövetet az előgyógyszer egy metabcl.it jónak relatív jelenléte vagy hatása szempontjából, amely metabolitrol ismert, hogy rendelkezik olyan metabolittai, vagy átalakul olyan métabolittá, amelynek vírusellenes vagy daganatellenes hatása van. Ily módon jellemzően a szövetekben az eredeti hatóanyag relatív mennyiségét határozzuk meg lényegében ugyanolyan időtartam alatt azoknak az előgyógyszereknek az azonosítására, amelyek főként a célszövetben metabolizálódnak egy vírusellenes vagy daganatellenes hatású métabolittá vagy annak egy olyan prekurzorává, amely a célszövetben végül a hatásos metabolitot produkálja. Vírusellenes hatású vegyületek esetében a hatásos metabolit az eredeti foszfonát vegyületek difoszfátja. Ez az a metabolit, amely a vírus nukleinsavába beépül, ezáltal csonkolja a nukleinsav-szál meghosszabbodását és akadályozza a vírus replikációját. Az előgyógyszer raetabolitjai lehetnek anabolikus metabolítok, katabolitikus. metabolítok vagy anabol.izmus és katabolizmus együttes termékei. Az eljárás gyakorlati megvalósításában nem fontos, hogy a metabolit milyen módon képződik.

Az eljárás nem korlátozódik egy olyan metabolit meghatározására, amely Önmagában vírusellenes vagy daganatellenes hatással rendelkezik. Ehelyett meghatározhatjuk a hatásos metabolítok inaktív prekurzorait is. A vírusellenes hatású difoszfát metabolit prekurzora többek között az eredeti hatóanyag monofoszfátja, az eredeti hatóanyag más metabolitjainak monofoszfátjai (például a heterociklusos bázis egy helyettesítőjének közbenső módosulata), maga az eredeti molekula és az eredeti hatóanyagnak az előgyógyszerré való alakítása folyamán a foszforilezés előtt a sejt által generált metabolítok. A prekurzor szerkezetek jelentősen változhatnak, mivel ezek sejtmetabolizmus eredményei. Hz az információ azonban már ismert vagy a szakember által könnyen meghatározható.

Ha az előgyógyszer, amelyet vizsgálunk, önmaga nem rendelkezik daganatellenes vagy vírusellenes hatással, akkor a nyers vizsgálati eredmények módosítása lehet szükséges. Ha az inaktív metabolit aktív metabolittá való intracelluláris átalakítása a vizsgált szövetek között különböző sebességgel megy végbe, a nyers vizsgálati eredményeket, amelyeket az inaktív metabolittal kapunk, korrigálni kell·, hogy figyelembe vegyük a különböző sejttípusok közötti különbséget, mivel a releváns paraméter a célszövetben az aktivitás kialakulása, és nem az inaktív metabolitok felhalmozódása. A megfelelő korrekciók meghatározása azonban a szakember számára rutin feladat. Ily módon, amikor a jelen eljárás (d) lépésében az aktivitást kell meghatározni, azt közvetlenül mérhetjük vagy extrapolálhatjuk. Ez nem jelenti azt, hogy a jelen eljárás csak önmagában hatásos közbenső termékek vizsgálatára korlátozódik. Az előgyógyszer hiányát vagy csökkenését a teszt szövetekben szintén vizsgálhatjuk. A (d) lépés csak annak az aktivitásnak a meghatározását igényli, amelyet az előgyógyszer fejt ki, amikor a szóban forgó szövettel kölcsönhatásba lép, és ez alapulhat extrapoláláson vagy más közvetett mérésen is.

Az eljárás (d) lépésében az előgyógyszer relatív hatását határozzuk meg. Természetesen ehhez nincs arra szükség, hogy minden egyes és minden meghatározás vagy meghatározás-sorozat tartalmazzon vizsgálatokat a kiválasztott nem-célszövettel. Ezzel ellentétben, ide tartozik a nem-célszövet vagy szövetek történeti kontrolijainak vagy az ilyen nem-célszövetektől várható eredményeket reprezentáló algoritmusoknak az alkalmazása annak érdekében, hogy az alapérték nem-célszövet aktivitást megkapjuk.

A (d) lépésben kapott eredményeket ezután optimálisan az olyan előgyógyszerek kiválasztására vagy azonosítására használjuk, amelyek a célszövetben nagyobb vírusellenes hatást mutatnak, mint a nem-cél szövetben. Ez az az előgyógyszer, amelyet továbbfejlesztésre kiválasztunk.

Nyilvánvaló, hogy az előgyógyszer jelöltekkel, bizonyos elővizsgálatokat végezhetünk az eljárás gyakorlati alkalmazása előtt. Az előgyógyszernek például képesnek kell lennie arra, hogy a gasztro.íntesztinális traktuson nagy mértékben metabolizálatlanul haladjon át, lényegében stabilnak kell lennie a vérben, és képesnek kell lennie a sejtekbe legalább bizonyos mértékben behatolni. A legtöbb esetben lényeges metabolizmus nélkül kellene teljesítenie a máj-cirkuláción való első áthaladást (first pass). Az ilyen elővizsgálatok adott esetben végzendők, és a szakemberek által jól ismertek.

A fentebb a vírusellenes hatásra leírt fejtegetés érvényes a metoxifoszfonát nukleotid analógok daganatellenes előgvegyszereire is. Ezek többek között a PMEG előgyógyszerei, a PMEA guanil analógjai. Ebben az esetben citotoxikus fosztanátok, így a PMEG az olyan jelöltek, amelyeket érdemes tovább vizsgálni, mivel citotoxioitásuk valójában biztosítja daganatellenes hatásukat.

Ezzel, az új szűrési módszerrel azonosított vegyületet ezután a hagyományos preklínikai vagy klinikai programba vonhatjuk be annak bizonyítására, hogy a kívánt célokat elértük. Egy előgyógyszert jellemzően akkor tekintünk szelektívnek, ha az eredeti hatóanyag aktivitása vagy koncentrációja a célszövetben (a dózis %-os eloszlása) 2x, és előnyösen 5x nagyobb, mint az eredeti vegyületé a nemcélszövetben. Más esetben egy elögyógyszer jelölt egy alapszintet jelentő előgyógyszerhez hasonlítható. Ebben az esetben a szelektivitás inkább relatív, mint abszolút. Azok lesznek a szelektív előgyógyszerek, amelyek a célszövetben kb. lOx. nagyobb koncentrációt vagy aktivitást eredményeznek a prototípushoz viszonyítva, noha a szelektivitás mértéke megítélés kérdése.

Üj eljárás kiindulási anyagok és közbenső termékek Θ -L 08 ,L 1. .1Ό ci. S 3 .Γ 3

Egy javított eljárást is ismertetünk az előnyös kiindulási anyagok (eredeti hatóanyagok), a PMEA és az (R)-PMPA előállítására. Ez az eljárás jellemzően abból áll, hogy 9-(2hidroxi-prop.il) -adenint (HPA-t) vagy 9-(2-hidroxi-etil) adenint. magnézium-alkoxiddal reagálhatunk, majd védett ágiikon szinton p-toluol-szulfoniloxi-metil-foszfonátot (tozilátot) adunk a reakcióelegyhez, és a PMPA-t vagy a PMEA-t kinyerj ük.

A HPA előnyösen dúsított vagy elkülönített R enantiomer. Ha egy királis HPA ©legyet használunk, az R-PMPA-t a királ is PMPA elegyből a szintézis befejezése után különíthetjük el.

A tozilátot jellemzően kevés szénatomos alkilcsoportokkal védjük, de lehetnek ezek a védőcsoportok a szakember által megfelelőnek talált más csoportok is. Kényelmes lehet olyan tozilátot alkalmazni, amely már az előgyógyszer foszforát szabsz.tituense.it hordozza, amelyek a tozilezési reakcióban védőcsoportokként képesek működni, ezáltal lehetővé válik a védőcsoport-eltávolítás! lépés elkerülése, és az előgyógyszer vagy az előgyógyszer közbenső termékének a követlen kinyerése.

A magnézium-aIkoxíd alkilcsoportjárak milyensége nem döntő, és bármely 1-6 szénatomos egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport lehet, de előnyösen terc-butilesöpört a PMPA ©.setében vagy izopropi lesöpört a PMEA esetében. A reakciókörülményeknek szintén nincs döntő jelentőségük, de előnyösen a reakcióelegyet keverés közben vagy más elegyítés! mód alkalmazása közben kb. 70-75 °c-on melegítjük.

Ha nem áll érdekünkben a foszfonát helyettesítők megtartása, a termékről a védőcsoportot (rendszerint brómtrimetil-szilánnal, ahol a tozilát-védőcsoport alkilcsoport) eltávolítjuk, és a terméket kristályosítással vagy a szakember számára nyilvánvaló más hagyományos eljárással elkülönítjük.

A (3) vagy (4) általános képletnek megfelelő szerkezetekben a B bázist az alábbi általános képletű csoportok közül választjuk

R²¹ jelentése -N-, -CH-, -C(CN)=, ~C(CF₃)==, -C(CHsCH)« vagy -C (C (0) NHz) = csoport;

R'' jelentése H, -OH, -Ntn, —SH, -SC'H₃, —SCH₂CH₃, —SCH₂CCH, -SCH2CHCH2, “SC₃H₇, -NH(CH₃), -N(CH₃)₂, ~NH(CH₂CH₃), -N(CH₂CH₃)₂, -NH(CH₂CCH), -NH(CH2CHCH2) , -NH(C₃H·?), halogénatom (F, Cl, Br vagy I), vagy X, ahol X jelentése - (CH₂)_m(0) _n (CH₂)(R^w) ₂ általános képletű csoport, amelyben m értéke egymástól függetlenül 0, 1 vagy 2, n értéke 0 vagy 1, és

R^xV jelentése egymástól függetlenül

H

1- 15 szénatomos alkil-, 2-15 szénatomos alkenil-, 6-15 szénatomos aril-alkeni.1-, 6-15 szénatomos aril-alkinil-, 2-15 szénatomos alkinil-, (1-6 szénatomos alkil-amlno)(1-6 szénatomos alkil)-, 5-15 szénatomos aralkil-, 6-15 szénatomos heteroaralkil-, 5-6 szénatomos aril-, 2-6 szénatomos heterocikloalkil-,

2- 15 szénatomos alkil-, 3-15 szénatomos alkenil-, 6-15 szénatomos aril-alkenil-, 3-15 szénatomos alkin.il-, 7-15 szénatomos ar.il-alkin.il-, (1-6 szénatomos alkil-amino) (1-6 szénatomos alkil)-, 5-15 szénatomos aralkil-, 6-15 szénatomos heteroalkil- vagy 3-6 szénatomos heterocikloalkilcsoport, ahol az alkilcsoportban azt a metiléncsoportot, amely az N^v-tal nem s z om szád o s, o z i g é na t om h e 1 y e 11 e s í1 i, adott esetben a két R^xl1 a nitrogénatommal együtt, amelyhez kapcsolódnak, telitett vagy telítetlen 2-5 szénatomos heterociklust alkot, amely egy vagy két nitrogén heteroatomot és adott esetben további oxigén vagy kén heteroatomot tartalmaz, vagy az R^x'^; csoportok egyike 1-3 halogénatommal, -CN vagy -N₃ csoporttal helyettesített; azonban adott esetben legalább egy R^i!·' csoport jelentése hidrogénatomtól eltérő; és

R²³ jelentése H, -OH, F, Cl, Br, I, -SCH3, -SCH2CH3, -SCH2CCH, -SCH2CHCH2, -SC3H?z ~0Rⁱ⁵, -NH2, -NHR^r? vagy R²² csoport, és

R'^;íi jelentése -Ο-, -S-- vagy -Se-.

B jelenthet védett és nemvédett heterociklusos bázisokat, ülönösen purin és pirimidin bázisokat. Az exociklusos aminek adócsoportjai és más .labilis csoportok ismertek (Greene et

1., ’’Protective Groups ín Organic Synthesis), ilyen csoport öbbek között az N-benzoil-, izobutiril-, 4,4’-dímetoxi- itil- (DMT) és a hasonló csoportok. A védőcsoport elválasztása a szakember számára nyilvánvaló, és a labilis söpört természetétől és a kémiától függ, amivel a védöcsoport áthatóan találkozik, például savas, bázikus, oxidatív, eduktív vagy más körülmények. A védett vegyületekre példa az ^<!-benzoil -citozin, az hb-benzoil-adenin és az fctó-izöbutír 11uaninA védett bázisok szerkezete a (Xa.l), (Xla.l), (Xlb.l),

két R·”⁵ együtt l-morfolino~, 1-piper.idin- vagy 1pirrolidincsoportot alkot; R^:;0 jelentése 1-la szénatomos alkilcsoport_r így metál-, izobut.il-, terc-butil-, deka n i 1 c s op o r t; é s R '*' etil-, propil-, izopropil-, butil-, pentil-, hexil-, okti.1- vagy jelentése hidrogénatom vagy -CH3

A (Xl’a.l) és (Xlb.l) általános képletű bázisok esetében, amennyiben R^ií! jelen van az R^2zA vagy R'^;helyén, mindkét R^íí5 je.·.entése ugyanazon a bázison általában azonos. R^JÍ' jelentése például fenilcsoport, vagy egy fenti R^3t; aril-helyettesitővel helyettesített feni lesöpört, -Cicms csoport (ahol a -0·οΗ·ι% söpört 2-adamantoilcsoport), ~CH₂-C.₃H5, ~C_€H<j, -CH(CH₃)₂, “CH2CH3, met.il-, butil-, terc-butil-, heptan.il-, nonanil-, undek.ani.l- vagy undecenilcsoport.

Speciális bázisok a hipoxantin, guanin, adenín, cítozin, ínozíri, timin, uracil xantin; a 2-amino-purin, a

6-diaminopurin, a 2-amino-6-klór-purin, a hipoxantin, az inozín és a xantin 8-aza~szárraazékaí; az adenin, a guanin, a 2-aminopurin, a 2,6-diamino-purin, a 2-amíno-6-klőr-purin, a hipoxantin, az inozin és a xantin 7-deaza~8—aza-származékai; a 2-amino-purin, a 2, β-diamino-purln, a 2-a.mino-6-tlór-purín, a hipoxantin, az inozin és a xantin 1-deaza-származékai; a 2amino-purin, a 2,6-diami.no-purin, a 2-amino-6~klór-purin,a hipoxantin, az inozin és a xantin 7-deazaszármazékaí; a2amino-purin, a 2,6-diamino-purin, a 2-amino-6~klót-purin,a hipoxantin, az inozin és a xantin 3-deazaszármazékai; 6-azacitozin; 5-f luor-citozin; 5-klór-citozin; 5-jód-citozin.; 5 bróm-cí tozin; 5-me ti 1 ~o.it ozin; 5-bróm-v in.il-uracil;

uracil; 5-klór-uracil;

(t rif luor-metil) -uraci.1;

5-jód-uracil; 5-bróm-uracil;55- (metoxi-metí 1.) -uracil; 5-etínil uracil és 5-propinil-uracil.

B előnyösen egy 9-purini.l-maradék, amelyet a guan.il-, deaza~guan.il-, Ι-deaza-guanil-, 8-aza-guanil-, 7-deaza

3 guanil-, adenil-, 3-deaza-adenil.-, 1-deazaadenil-, 8-azaaden.il-, 7~deaza-adenil-, 2,6~diamino~pur.inil.-, 2-aminopurinil-, 6-klór-2-am.ino-purinil- és a 6-tio-2-amino-purin.ilcsoport közül választunk, vagy egy B’ csoport egy 1pirimidini1-maradék, amelyet a citozinil-, 5-halogéncitozinil- és az 5-(1-3 szénatomos alkil)-citozinil-csoport kö z ü 1. v á 1 a s z t un k.

Az előnyös B csoport az alábbi általános képletnek meg fe1elő s zerke z e t ű

a képletben

R ^{Λ 4} j e1e nté se egymást ó1 fü gg e11enü1 ha1ogéna t om, oxigénatom, aminocsoport, X vagy hidrogénatom, de adott esetben az R⁴⁴ csoportok legalább egyikének a jelentése X;

X jelentése - (0¾)(O) _n(CH₂) (Rr^;5) ? általános képletű csoport, amelyben ra értéke 0, 1 vagy 2, n értéke 0 vagy 1, és jelentése egymástól függetlenül

1- 15 szénatomos alkil·-, 2-15 szénatomos alkenil·-, 6-15 szénatomos arilalkenil-, 6-15 szénatomos arilaikinil-, 2-15 szénatomos alkinil-, (1-6 szénatomos alkilamino)(1-6 szénatomos alkil)-, 5-15 szénatomos aralkil-, 6-15 szénatomos heteroaralkil-, 5-6 szénatomos aril-, 2-6 szénatomos heterocikloa lk.il-,

2- 15 szénatomos alkil-, 3-15 szénatomos alkenil-, 6-15 szénatomos arilalkenil-, 3-15 szénatomos alkinil-, 7-15 szénatomos arilaikinil-, (1-6 szénatomos alkilamino) (1-6 szénatomos alkil)-, 5-15 szénatomos aralkil-, 6-15 szénatomos heteroalkil- vagy 3-6 szénatomos heterocikloalkilosoport, ahol az alkilcsoportban azt a metiléncsoportot, amely az N°~tal nem szomszédos, oxigénatom helyettesíti, adott esetben a két R¹⁰ a nitrogénatommal együtt, amelyhez kapcsolódnak, telített vagy telítetlen 2-5 szénatomos heterociklust alkot, amely egy vagy két nitrogén heteroatomot és adott esetben további oxigén vagy kén heteroatomot tartalmaz, vagy az R^1V csoportok egyike 1-3 halogénatommal, -CN vagy -N;_$ csoporttal helyettesített; azonban adott esetben legalább egy R^iV csoport jelentése hidrogénatomtól eltérő; és

Z jelentése nitrogénatom vagy -CH= csoport, azzal a megkötéssel, hogy a heterociklusos mag a purintól egynél nem tοbb Z-ve1 különbö zik.

Az E csoportok a metoxifoszfonát nukleotid analógokban alkalmazott aglikonokat képviselik. Az E csoport előnyösen -CH (CH-j) CH?~ vagy -CH2CH2- csoport. Az is előnyös, ha az aglikonban a ki.rális centrumoknál az oldallánc-csoportok lényegében kizárólag (R) konfigurációban vannak (kivéve a hidroximetilcsoportot, amely a dúsított (S) enantiomer).

R^x jelentése in vivo hídrólizálható oxiészter, amelynek a szerkezete az -OR³'’ vagy -OR* általános képletnek megfelelő, ahol R·' jelentése az 5 798 340 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás 64. oszlopának 49. sorában adott meghatározás szerint hidrogénatom, 1-20 szénatomos alkilcsoport, amely szubsztituálatlan vagy az OH, 0, N és halogénatomok (F, Cl, Br, I) közül egymástól függetlenül kiválasztott szubsztítuensekkel szubsztituált, 3-20 szénatomos arilcsoport, amely szubsztituálatlan vagy az 1-6 szénatomos alkil-, 1-6 szénatomos alkoxi-, 1-6 szénatomos halogén-alkil(amely 1-3 halogéncsoportot tartalmaz) , ciano-, nit.ro-, hidroxilcsoport, oxigén-, nitrogén- és halogénatom közül egymástól függetlenül kiválasztott szubsztítuensekkel szubsztituált, vagy R.³³ jelentése 4-20 szénatomos aril-alkil amely szubsztitnálatlan vagy az arilcsoport az 1-6 szénatomos alkil-, 1-6 szénatomos alkoxi-, 1-6 szénatomos halogén-alkil(amely 1-3 halogénatomot tartalmaz), ciano-, nitro-, hidroxilcsoport, oxigén-, nitrogén- és halogénatom közül eg ymástó1 függetlenül kiválasztott szubsztituensekke1 szubsztituált, vagy R^J~' jelentése 1-(C2-24~aciloxi)-1~ (Ci-galkil) -csoport, 1- (Cs_24~aciloxi) -1- (Cs-g-aril) -1- (Ci-4~alkil) csoport, 1- (Cj.-24~aciloxi) -2- (Ci-g-alkoxi-l- (C-.„s-a.lkil) -csoport vagy 1-(C2-24-aciloxr)-2-[halogén-(Ci-3-alkil) j-csoport, amely Ιο halogénatomot tartalmaz, 2,3-dihidro~6~hídroxi-indén, szezamol, katechol-monoészter, -CH2-C (0)-N (R^iX) 2, ahol mindegyik R’^íl azonos vagy különböző, -CH?-S(O) (R^3:), -CH2-S (0) 2 (R^J1) , -Crí2CH (OC (0) CH₂R³ⁱ) -Cü₂-CH (OC (0) CH₂R³¹) , koleszteril-, 5- vagy 6szénatomos monoszacharid, diszacharid vagy oligoszaoharid (3-9 monoszacharidból), enolpiruvát (HOOC-C(~CH₂)0) , glicerin, o-D β-digliceride k (ahol, a glicerid-lipideket alkotó zsírsavak általában a természetben előforduló, telitett vagy telítetlen 6-26 szénatomos, 6-18 szénatomos vagy 6-10 szénatomos zsírsavak, mint a lenolajsav, laurinsav, mirisztinsav, palmitinsav, sztearlnsav, olaj sav, palmítolajsav, linolénsav stb.), trimetoxi-benzil-, trietoxí-benzil-, 2-(C.i..₄-alkil)-

vagy jelentése 3-6 szénatomos arilcsoport. (.beleértve a feni!-, 2- és 3-pirrolil-, 2- és 3-tienil-, 2- és 42 6 imidazoli 1.-, 2-, 4- és 5-oxazolil-, 3- és 4-izoxazol.il-, 2-, 4- és 5-tiazolil-, 3-, 4- és 5-izotiazolil-, 3- és 4pirazolil-, 2-, 3- és 4-piridinil- és 2-, 4- és 5-pirimidini'lcsoportot), ahol az arilcsoport 3, 4 vagy 5 halogénatommal, vagy 1 vagy 2 szubsztituenssel van szubsztituálva a halogénatom, 1-12 szénatomos alkcxi- (beleértve a metoxi-, etcxi-, 2,3-, 2,4-, 2,5~, 2,6-, 3,4- és 3,5-dimetoxi- és 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- és 3,5-dietoxi-fenil-csoporto.t) , ciano-, nitro-, hidroxil-, 1-12 szénatomos halogén-alkil(amely 1-6 halogénatomot tartalmaz), 1-12 szénatomos alkil(közöttük metil- és etilcsoport) , 2-12 szénatomos alkenil- és 2-12 szénatomos alkinilcsoport közül; vagy R^:' jelentése (C1-4— alkilén) - (C3-é-aril)-csoport (ideértve a benzil-, CH₂-pirro.lil-, CH₂-tienil-, CH2-imidaz0l.il-, CH2-0xaz0l.il-, CH^-izoxazolil-, Crh-tiazolil-, CH_;;-izot iazolil-, CH₂-pirazolil-, CH₂-pi r idinilés CH₂-pirimidiniicsoportot) , ahol az arilcsoport 3-5 halogénatómmal vagy 1 vagy 2 szubsztituenssel van szubsztituálva a halogénatom, 1-12 szénatomos alkoxi-

(közöttük	metoxi- és etoxi-) , ci<	mo~, nitr	0-, hidr	oxi.!-, 1-12
szénatomos	halogén-alkil- (amely	1-6 halog	énatomot	tartalmaz,
ideértve	a -CHs-CCl-j csoportoi	t), 1-12	szénám	jüíos alkil
(ideértve	a metil- és etilcsoport	ot), 2-12	szénatom	.0 0 t'i ,ΐ. R. v? 11 x
é s 2 ·~ .1.2 s	.ena t omos al kim lesöpört	közül.

Az 5 798 340 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás új nukleotid analóg amidátokat és észtereket ismertet, amelyek különösen daganatellenes és mikrobaellenes hatással rendelkeznek.

A koleszteril-, szacharid- és más csoportok reakcióképes csoportokhoz való kapcsolására szolgáló módszerek ismertek [Hadfield, Adv. Pharmacol. Chemother., 20:21 (1984·; Gouyette, Tét. Lett., 30:6019 (1989); Ksander, J. Med. Chem., 37:1823 (1994)1.

jelentése hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos alkílcsoport.

R^c jelentése az előzőekben meghatározott. R¹ jelentése előnyösen ariloxicsoport, rendszerint helyettesítetlen vagy para-helyzetben helyettesített fenoxicsoport (amint, azt R^fe-ban meghatároztuk).

R² jelentése aminosavmaradék, adott esetben feltéve, hogy bármelyik karboxilcsoport, amely kb. 5 atomnál kevesebbel kapcsolódik az amidét N-hez, észterezett. R szerkezete jellemzően a (8) általános képletű csoportnak felel meg

A képletben n értéke 1 vagy 2;

R¹¹ jelentése R° vagy hidrogénatom; előnyösen R⁶ jelentése

3-9 szénatomos alkilcsoport; 3-9 szénatomos, alkilcsoport, amely egymástól függetlenül hidroxilcsoporttal, halogénatómmal, oxigénatommal vagy nitrogénatommal helyettesített; 3-6 szénatomos arílcsoport; 3-6 szénatomos arílcsoport, amely egymástól függetlenül hidroxilcsoporttal, halogénatommal, oxigénatommal vagy nitrogénatommal helyettesített; vagy 3-6 szénatomos arilalkilcsoport, amely egymástól függetlenül hidroxilcsoporttal, halogénatommal, oxigénatommal vagy nitrogénatommal helyettesített;

R^t2 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy 1-9 szénatomos alkilcsoport, amely helyettesítetlen vagy a hidroxilcsoport, az oxigénatom, a nitrogénatom, a -COOR^:i általános képletű csoport és a halogénatom közül egymástól függetlenül választott csoporttal helyettesített; 3-6 szénatomos arilcsoport, amely helyettesítetlen vagy a hidroxilcsoport, az oxigénatom, a nitrogénatom, a -COOR¹’¹ általános képletű csoport és a halogénatom közül egymástól függetlenül választott csoporttal helyettesített; vagy 3-9 szénatomos arilalkilcsoport, amely helyettesítetlen vagy a hidroxilcsoport, az oxigénatom, a nitrogénatom, a -COOR¹¹ általános képletű csoport és a halogénatom közül egymástól függetlenül választott csoporttal helyettesített;

R¹’ jelentése egymástól függetlenül -C(O)-OR^U általános képletű csoport; aminocsoport; amidcsoport; guanidinilcsoport; imidazolilcsoport; indolilcsoport; szulfoxidcsoport ; foszforilcsoport; 1-3 szénatomos alkilaminocsoport; 1-3 szénatomos alkildiaminocsoport; 1-6 szénatomos alkenilaminocsoport;

hidroxilcsoport;

tiolesöpört, 1-3 szénatomos alkoxiesoport; 1-3 szénatomos alkiltiolcsoport; - (CH₂) „COOR¹¹ általános képletű csoport; 1-6 szénatomos alkilcsoport, amely helyettesítetlen vagy halogénatommal, hidroxil-, fenil-, hidroxifenil- vagy '7-10 alkoxifenilesöpörttál helyettesített; 2-6 szénatomos a1kenilesöpört amely helyettesítetlen vagy halogénatommal·, hidroxil-, -SH, -MHz, fenil-, hidroxifenilvagy 7-10 szénatomos: alkoxifenilcsoporttal helyettesített;

vagy 6-12 szénatomos arilcsoport, amely helyettesítetlen vagy halogénatommal, hidroxil-, -SH, -NH₂, fenil-, hid r o xi fenilvagy 7-10 szénatomos alkoxifenilcsoporttal helyettesített; és

Rⁱ⁴ jelentése hidrogénatom vagy 1-9 szénatomos alkilcsoport, vagy 1-9 szénatomos alkilcsoport, amely egymástól függetlenül hidroxilcsoporttal, halogénatommal, -COOR^14, általános képletű csoporttal, oxigénatommal vagy nitrogénatommal helyettesített; 3-6 szénatomos arilcsoport; amely egymástól függetlenül hidroxilcsoporttal, halogénatommal, -COOR¹¹ általános képletű csoporttal, oxigénatommal vagy nitrogénatommal helyettesített; vagy 3-6 szénatomos arilalkilcsoport, amely egymástól függetlenül hidroxiIcsoporttal, halogénatcmmal, -COOR^U általános képletű soporttal, oxigénatommal vagy nitrogénatommal helyettesített.

R^u jelentése előnyösen 1-6 szénatomos alkilcsoport, legelőnyösebben 1 zoprop.il csoport, R^Z4 jelentése egy természetben előforduló aminosav oldalláncú, η ~ 1, P?'^; jelentése hidrogénatom és R¹⁴ jelentése hidrogénatom.

Az arilcsoport és az O vagy N helyettesítés jelentése az 5 798 340 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás 16. oszlopának 42-58. sorában meghatározott. Eszerint az arilcsoport jelentése átfogja az N-, S- vagy O-heteroarlit is, beleértve a következőket: fenii-, 2- és 3-pirrclil-, 2- és

3- tienil-, 2- és 4-iraidazolil-, 2-, 4- és 5-oxazolil-, 3~ és

4- izoxaríi-, 2 — , 4- és b~tíazolix~, 3—, 4— és n— izGLiaZQii 1.,

3~ és 4-pirazolil-, 2-, 3- és 4-pir.idin.il-, 2-, 4- és 5pirimidinilcsoport. Az „0 vagy „N helyettesítés azt jelenti, hogy az aromás gyűrű vagy az alkillánc macin- illetve metiléncsoportja helyett 0, N vagy NH van jelen.

Az aminosavak jellemzően a természetben előforduló vagy Iaminosavak. Alkalmas speciális példák az 5 798 340 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, például a

4. táblázatban és annak 8-10. oszlopában vannak felsorolva.

A jelen leírásban az alkilcsoport, amennyiben másképpen

nem natarozzux meg,	normális, s	zekender,	tercier vagy gyűrűs
szénhidrogéncsoport.	Amennyiben	másképpen	nem határozzuk meg,
az alkilcsoport 1-12	szénatomos.	Példaként	a -CH>, -CHjCtp,
-CH2CH2CH3, -CH(CH3)2,	-CHj-CHjCHjCH:	y A A .3 A A \ k.	:h3)2, -CH (CHp ch2ch3,
-C(CH3)·:, -CH2CH2CH2CH;	3ch3, ~ch(CH3;	JCH2CH2CH3,	-CH (CH2CH3) 2,

-C(CH₃) 2CH2CH3, -CH (CH₃) CH (CH₃) ?, -CH2CH2CH (CH₃) 2,

-CH2CH (CH·· , -CHíCH^CH-CH^CH^CH., -CH (CH₃) CH^CH^CH^CHj,

-CH(CH₂CH₃) (CH₂CH₂CH₃) , ~C (CH,; -íCbbCHsCFh, C (CH·:) CH (CH₂) CH_?CH<, -CH (CHd CH-CH (CH₃) ·.>,

-CH (CHj) C (CH-.?) 3 csoportot említ jük. Az alkenil- és az alkinilcsoportot ugyanilyen módon határozzuk meg, de legalább egy kettős vagy hármas kötést tartalmaznak.

Ahol enol- vagy ketocsoportokat említünk, a megfelelő tautomerek is említettnek tekintendők.

A jelen találmány szerinti előgyógyszer vegyületeket szabad bázis vagy különféle sók formájában bocsátjuk rendelkezésre, amelyek az 5 798 340 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi. leírásban vannak felsorolva, és gyógyászatilag elfogadható segédanyagokkal vagy szolvatáló hígítószerekkel formuláijuk gyógyászati termékekként való alkalmazásra, amelyek szintén az 5 798 340 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban vannak, ismertetve.

Ezek. az. előgyógyszerek. vírusellenes hatással rendelkeznek, és felhasználhatóságukat már az eredeti hatóanyagokra megállapították (lásd az 5 798 340 számú amerikai egyesült.

államokbeli szabadalmi leírást és más, a metoxifoszfonát nukleotid analógokra vonatkozó hivatkozásokat) .

Természetesen a (4) általános képletnek megfelelő szerkezetű diasztereomer legalább közbenső termékként használható az eredet hatóanyag kémiai előállításában ín vitro végzett hidrolízis révén, függetlenül annak aránylag nem szelektív jellegétől, amint, az az itteni vizsgálatokból kiderült.

A találmány jobban megérthető a következő példákra törté utalással.

Adenin átalakítása foszfonomatoxietiladenínné (PMEA) magnézium-i zopropoxid alkalmazásával

NaOH □MF

-:30¾

16,8 g (0,124 mól) adenin 41,9 ml dimetilformamiddal készült szuszpenziójához 12,1 g (0,137 mól) etilén-karbonátot és 0,100 g (0,0025 mól) nátrium-hidroxidot adunk. Az elegyet 130 °C-on melegítjük egy éjszakán át. Ezután 50 °C alatti hőmérsékletre hütjük, és 62,1 ml toluoit adunk hozzá. A zagyo még 2 órán át 5 °C-on hűtjük, majd szűrjük és két alkalommal toluollal utánaöblítjük. A nedves szilárd anyagot vákuumban 6 ⁵C-on szárítjuk, így 20,0 g (90¾) 9-(2-hidroxietiI)adenint kapunk szürkésfehér szilárd anyag alakjában, amely 238-240 ®C on olvad.

20,0 g (0,112 mol) 9-(2-hidroxietil)adenint (HEA-t) 125 ml dimetiformamidban szuszpendálunk, a szuszpenziót 80 °C-ra melegítjük, és 11,2 g (0,0784 mol) magnózium-izpropoxidot vágymás esetben magnézium-terc-butoxi-dot, majd egy óra alatt 66,0 g (0,162 mól) dietil-p-toluolszulfoniloximetilfoszfonátot adunk az elegyhez. Az elegyek 7 órán át 80 °C-on keverjük, ezután 30 ml illékony komponenst vákuumdesztillációval eltávolítunk, és a maradékhoz 30 ml friss dimetilformamidot adunk. Az elegyek szobahőmérsékletre hűtjük, és 69,6 g (0,450 mól) brómtrimetilszilán hozzáadása után 6 órán át 80 ⁹C-on melegítjük. Ezt követően bepároljuk. A visszamaradó sűrű gumit 360 ml vízben oldjuk, a vizes oldatot 120 ml diklórmetánnal extraháljuk, majd a pH-ját nátrium-hidroxiddal 3,2-re állítjuk be, és a képződött zagyot szobahőmérsékleten keverjük egy éjszakán át. Ezután 4 °C-on tartjuk 1 órán át. A szilárd anyagot szűréssel összegyűjtjük, két alkalommal vízzel mossuk és vákuumban 56 °C-on szárítjuk, így 20 g (65,4 %) 9-(2(főszfonometoxi)etil]adenint (PMEA-t) kapunk fehér szilárd anyag alakjában. Op.: >200 °C (bomlik). ¹H-NMR (D₂O): δ 3,49 (t, 2H); 3,94 (t, 2H); 4,39 (t, 2H) ; 8,13 (s, 1H); 8,22 (s, 1H) .

lb) példa

Adenin átalakítása foszfonometoxipropiladeninné (PMPA) magnézium-terc-butoxid alkalmazásával

g (0,296 mol; adenin 41,9 ml dimetilformamiddal készül szusz-penziójához 34,5 g (0,338 mol·) (R)-propilén-karbonátot és

0,480 g (0,012 mol) nátrium-hidrozidot adunk. Az elegyet egy éjszakán át 130 °C-on melegítjük. Ezután 100 °C-ra hüíjük és

138 ml toluolt, majd g (0,049 mól) metánszulfonsavat adunk hozzá, miközben a reakcióelegy hőmérsékletét 100-110 ^eC-on ártjuk. Ezután további 114 ml toluol, hozzáadásával homogén oldatot állítunk elő. Az oldatot 7 óra alatt 3 *C-ra hűtjük, majd egy órán át 3 °C-on tartjuk. A képződött szilárd anyagot szűréssel elkülönítjük és két alkalommal acetonnal mossuk. A nedves szilárd anyagot vákuumban 80 °C-on szárítjuk, így 42,6 g (75 %) ÍR)-9-[2-(hidroxi)propil]adenínt (HPA~t) kapunk szürkésfehér szilárd anyag alakjában, öp. 188-190 °C.

20,0 g (0,104 mol) (R)-9-[2-(hidroxi)propil]adenint (HPAt) 44,5 ml dimetilformamidban szuszpendálunk, és a szuszpenziót 65 ^wC-ra melegítjük. Az elegyhez egy óra alatt

14,2 g (0,083 mól) magnézium-tero-butoxidot vagy más esetben magnézium-izopropoxidot, majd két óra alatt 66,0 g (0, 205 mól) dietil-p-toluolszufoniloxiraetilfoszfonátot adunk, miközben a hőmérsékletet 78 °C-on tartjuk. Az elegyet 75 °C-on 4 órán át keverjük. Ezután 50 °C alatti hőmérsékletre hűtjük, 73,9 g (0,478 mól) brómtrimetilszilánt adunk hozzá, és 77 °C-on 3 órán át melegítjük. Amikor a reakció befejeződik, az elegyet 80 °C melegítjük, és az illékony komponenseket atmoszferikus desztíilációval eltávolítjuk. A maradékot 120 ml vízben 50 ^cCon oldjuk, majd 101 ml etil-acetáttal extraháljuk. A vizes fázis pH-ját nátrium-hidroxiddal 1,1-re állítjuk be, autentikus (R)-PMPA mintával beoltjuk, és a vizes réteg pH-ját nátrium-hidroxíddal 2,l~re állítjuk be. A képződött zagyot szobahőmérsékleten egy éjszakán át keverjük. Ezután három órán át 4 ^cC-on hűtjük. A szilárd anyagot szűréssel elkülönítjük, 60 ml vízzel mossuk és vákuumban 50 °C-on szárítjuk, így 18,9 g (63,5 %) nyers (R)-9~(2-(foszfonometoxi)propil]adenint (PMPA-t) kapunk szürkésfehér szilárd anyag alakjában.

A nyers (R)-9-[2-(foszfonometoxi)propil]adenint 255 ml vízzel visszafolyatás közben forraljuk, amíg az összes szilárd anyag feloldódik. Az oldatot 4 óra alatt szobahőmérsékletre hűtjük. A képződött zagyot 3 órán át 4 ’C-on tartjuk. A szilárd anyagot szűréssel elkülönítjük, 56 ml vízzel és 56 ml acetonnal mossuk és vákuumban 50 °C~on szárítjuk, így 15,0 g (50,4 %) (R)-9-[2-(foszfonometoxi)propiljadenint (PMFA-t) kapunk fehér szilárd anyag alakjában. Op. 278-280 °C.

2. példa

GS-7171 (ΙΣΙ) előállítása

1. re a ke i óvá z1a t

(vízmentes)

I Π

1. reákeióváz1at (folytatás)

GS-7171

GS-734Ö GS-7340V2

Egy üvegbélésű reaktorba 14,6 kg (50,8 mól) vízmentes

PMPA~t (I), 9,6 kg (102 mól) fenolt és 39 kg l-metll-2pírrolídinont mérünk. Az elegyek 85 °C-ra melegítjük, és 6,3 kg (62,3 mól) trletilamint adunk hozzá. Ezután 6 óra alatt 100 ^sC-on 17,1 kg (82,9 mol) 1,3-dicíklohexilkarbodiimid 1,6 kg 1metil-2~pirrolidinonnal készült oldatát adjuk az elegyez. A melegítést még 16 órán át folytatjuk. A reakcióelegyet 45 °Cra hütjük, 29 kg vizet adunk hozzá, és 25 ^cC-ra hűtjük. A szilárd anyagot a reakcióelegyből szűréssel eltávolítjuk és

15,3 kg vízzel utánaöblítjük. Az egyesített szürletet és mosófolyadékot csökkentett nyomáson cser színű zaggyá koncentráljuk, majd 24,6 kg vizet adunk hozzá, és a pH-t 25 %os vizes nátrium-hidroxid-oldattal 11-re állítjuk be. A szilárd anyagot 2 kg diatómaföldön át végzett szűréssel eltávolítjuk, majd 4,4 kg vízzel utánaöblítjük. Az egyesített szűrletet és mosófolyadékot 28 kg etil-acetáttal extraháljuk. A vizes oldat pH~ját 4 kg 37 %-os sósavval 3,1-re állítjuk. A (II) nyers termékből álló nyers szürőpogácsát 58 kg metanollal feliszapoljuk, A szilárd anyagot szűréssel elkülönítjük, 8,5 kg metanollal mossuk és csökkentett nyomáson szárítjuk, így 9,33 kg (II)~t kapunk fehér por alakjában. Ül-NMR (D2O) Ö .1,2 (d, 3H) ; 3,45 (q, 2H) ;

3,7 (q, 2H) ; 4 (m, 2H); 4,2 (q, 2H); 4,35 idd, 2H); 6,6 (d, 2H) ; 7 (t, 1H) ; 7,15 (t, 2H) ; 8,15 (s, 1H) ; 8,2 (s, 1H) ; ³'^:PNMR (DzO) 8 15,0 (szétkapcsolt).

GS-7171 (III) (1. reakcióvázlat}

Egy üvegbélésű reaktorba 9,12 kg (25,1 mól) monofeni1PMPA-t (II) és 30,7 kg acetonitrilt mérünk. Az elegyhez 6,57 kg (56,7 mól) tionil-kloridot adunk 50 °C alatti hőmérsékleten. Ezután az elegyet 75 °C-on melegítjük az összes szilárd anyag feloldódásáig. Ezt követően a hőmérsékletet 80 '’C-ra emeljük, és nitrogén alatt végzett atmoszférikus desztillációval 11,4 kg illékony komponenst eltávolítunk. A maradékot 25 °C-ra hűtjük, 41 kg diklórmetánt adunk hozzá, majd -29 ^,JC-ra hűtjük. 60 perc alatt -18 °C-on 7,1 kg (54,4 mol) (L) -alanin-izopropil-észtert 36 kcj diklórmetánnal készült oldat formájában, majd 30 perc alatt -18°C és - 1.1 °C közötti hőmérsékleten?,66 kg (75,7 mól) trietilamint adunk hozzá. A reakcióelegyet szobahőmérsékletre melegítjük és öt alkalommal, alkalmanként 15,7 kg 10 %-os vizes nátrium-dihidrogén-foszfátoldattal mossuk. A szerves oldatot 18,2 kg vízmentes nátriumszulfáton szárítjuk, szűrjük, 28 kg díklórmetánnai mossuk és csökkentett nyomáson bepároljuk. A visszamaradó olajhoz 20 kg acetont mérünk, és az elegyek csökkentett nyomáson bepároljuk. A visszamaradó olajhoz 18,8 kg acetont adunk. A termék oldatának felét. 38 x 38 cm-es, 22 kg szilikagél 60-ból (230-400 mesh) készült ágyon kromatográfiásan tisztítjuk. Az oszlopot 480 kg acetonnal eluáljuk. A tisztítást megismételjük az olaj második felével friss szilíkagélt és acetont alkalmazva. .A tiszta terméket tartalmazó frakciókat csökkentett nyomáson bepároljuk. A visszamaradó olajhoz 19,6 kg acetonitrilt adunk, és az elegyet csökkentett nyomáson bepároljuk. Ezután a maradékhoz 66,4 kg acetonitrilt adunk, és az oldatot 16 órán ár 0 ’C és -5 °C közötti hőmérsékleten hűtjük. A szilárd anyagot szűréssel eltávolítjuk, és a szűrletet csökkentett nyomáson bepároljuk, így 5,6 kg (III.)-t kapunk sötét olaj alakjában. ‘H-NMR (CDCI3) δ 1.,1 (m, 12H); 3,7 (m, 1H) ; 4,0 (ra, 5H) ; 4,2 (m, 1H) ; 5,0 (m, 1H) ; 6,2 (s, 2H) ; 7,05 (m, 5H) ; 8,0 (s, 1H) ; 8,25 (d, 1H) ; ^3:PNMR (CDC1₂) δ 21,0; 22,5 (szétkapcsolt) ,

Alternatív eljárás GS-7171 (III) előállítására

Π

2. reá ke i óvá slat (folytatás)

Monofenil-PMPA (II)

GS-7171

Egy visszafolyató hűtővel és nitrogén-bevezetővel ellátott gömblombikot 70 °C-os olaj fürdőbe helyezünk. A lombikba 19,2 g (67 mmol) PMPA-t (I), 0,29 g (3,3 mmol) N,N~dimetilformamidot és 40 ml tetrametílénszulfont mérünk, majd az elegyhez 4 óra alatt 14,2 g (.119 mmol) tionil-kloridot adunk. Az elegy hőmérsékletét eközben 100 °C-ra emeljük. Homogén oldat képződik. Ehhez 11,7 g (70 mmol) fenoxitrimetíIszílánt adunk 5 perc alatt. A melegítést a 100 ⁹C-os olaj fürdőben további 2 órán át folytatjuk. Ezután a reakcióelegyet gyors keverés közben és 0 °C-on való hűtés közben 400 ml acetonba öntjük. A szilárd anyagot szűréssel elkülönítjük, csökkentett nyomáson szárítjuk és 75 ml metanolban oldjuk. Az oldat pH-ját 45 %-os vizes kálium-hidroxid-oldattal jeges vízzel való hűtés közben 3,0-re állítjuk be. A képződött szilárd anyagot szűréssel elkülönítjük, metanollal mossuk és csökkentett nyomáson szárítjuk, így 20,4 g Il-t (2. reakcióvázlat) kapunk fehér por alakjában.

GS-7171 (III) g monofenil-PMPA-t (II), 5 ml tetrametilénszulfont és 1 csepp N,N~dimetilformamidot egy 40 °C-os ola j fürdőben levő lombikba mérünk. Az elegyhez 1,96 g (16,5 mmol) tionilkloridot adunk. 20 perc eltelte után a tiszta oldatot a fürdőből kivesszük, 10 ml diklórmetánnal hígítjuk és 5 g (33 mmol) (L)-alanin-izopropil-észter és 5,33 g (41 romol) diizopropiletilamin 20 ml diklórmetánnal készült és -10 °C-ra hűtött, oldatához adjuk. A reakcióelegyet szobahőmérsékletre melegítjük és három alkalommal 10-10 ml 10 %~os vizes nátriumdihidrogén-foszfát-oldattal mossuk. A szerves oldatot vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk és csökkentett nyomáson bepároljuk. A visszamaradó olajhoz 0,77 g (6,6 mmol) fumársavat és 40 ml acetonitri.lt adunk, és az elegyet visszafolyatás közben forraljuk, így homogén oldatot kapunk.

Az oldatot jégfürdőben hütjük, és a szilárd anyagot szűréssel elkülönítjük. A szilárd GS-7171 fumarátsót csökkentett nyomáson szárítjuk, így 3,7 g terméket kapunk. 3,16 g (5,3 mmol) sót 30 ml diklórmetánban szuszpendálunk,. és a szuszpenziót 5 ml 2,5 mólos vizes kálium-karbonát-oldattal keverjük, amíg a szilárd anyag feloldódik. A szerves réteget elkülönítjük, majd 5 ml vízzel mossuk, vízmentes nátriumszulfáton szárítjuk és csökkentett nyomáson bepároljuk, így

2,4 g Ill-t kapunk cser színű hab alakjában.

3. példa

A) Diasztereomer-szétválasztás szakaszos elúciós kromatográfiás eljárással

A GS-7171 (II) díasztereomerjeit szakaszos elúciós kromatográfiás éljárással rezolváljuk, amelyhez kereskedelemben kapható Chiralpak AS, 20 pm, 21 x 250 rom-es félpreparatív HPLC oszlopot és egy Chiralpak AS, 20 pm, 21 x 50 mm-es kísérő oszlopot használunk. A Chiralpak® AS egy töltőanyag, amelyet a Diacel gyárt és Észak-Amerlkában a Chiral Technologies, Inc. forgalmaz (5 202 433, RE 35 919, 5 434 298, 5 434 299 és 5 498 752 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások). A Chiralpak AS egy királis állófázis (chiral stationary phase, CSP), amely amilóz-trisz[(S)-α-metilbenzil-karbamát]-bői áll, amellyel egy szilikagél hordozó van bevonva.

A GS-7171 diasztereomer elegyet a mozgó fázisban feloldjuk, és a GS-7171 megközelítőleg 1 g-os részleteit a kromatográfiás rendszerbe szivattyúzzuk. A nemkivánt, a GS7339 jelű diasztereomer az első fő, széles (megközelítőleg 15 percig eluálódó) csúcs, amely az oszlopról lejön. Amikor a GS7339 csúcs eluálódása befejeződik, a mozgó fázist azonnal 100 % metilalkoholra cseréljük, ami a kívánt, GS-7340 jelű (IV) diasztereomert éles csúcs formájában eluálja az oszlopról a metil-alkohol oldószerfronttal. A metil-alkoholt a teljes ciklusidő rövidítésére használjuk. Az első néhány injektálás után mindkét diasztereomert egyetlen nagy frakció formájában gyűjtjük össze, amely a tisztított diasztereomerek egyikét (>99,0 % egyetlen diasztereomer) tartalmazza. A mozgó fázis oldószereket vákuumban eltávolítjuk, így a tisztított diasztereomert laza hab alakjában kapjuk.

A kiindulási GS-7171 tömegének megközelítőleg 95 %-át visszanyerjük a két diasztereomer frakcióban. A GS-7340 frakció kb. 50 %-a a teljes visszanyert tömegnek.

A kromatográfiás körülmények a következők:

Μozgó fázás (Kézdeti)	GS-7171 - acetonitríl: izopropi1-alkohol - 9 0:10
(Végső)	100 % met 11-alkohol
Átfolyási sebesség	10 ml/perc
futtatási idő	kb. 45 perc
DtS t Θ k 13 X 3 S	UV 275 nm-en
Hőmérséklet	Környezeti
Elúciós profil:	GS-7339 (B diasztereomer) GS-7340 (A diasztereomer; (IV) )

B) A GS-7171 diasztereomerjeinek elválasztása SMB kromatográfiás eljárással

A szimulált mozgóágyas (simulated muvíng bed, SMB) kromatográfiás eljárás általános leírását lásd a Strube et al., Organic Process Research and Development, 2, 305-319 (1998) irodalmi helyen.

GS-7340 (IV)

2,8 kg GS-7171-t (III) 10 x 5 cm-es Chiral Technologic Inc., 20 mikron Chiralpak AS bevonatú szilik.agélbő.l készült ágyakon (1,2 kg) tisztítunk. Az oszlopokat 30 % metanolt tartalmazó acetonitrillel eluáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat bepároljuk a (IV) 2,48 kg tömegű acetonitriles oldatává. Az oldat acetonitríItől nedves kristályos tömeggé szilárdul állás közben. A kristályos tömeget csökkentett nyomáson szárítjuk, így 1,301 kg (IV)-et kapunk cser színű kristályos por alakjában, 98,7 %-os diasztereomer

tisztasággal. ορ:	il ’-izu c;	(CDCló	δ 1,15 (	m, 12 H
3,7 (t, 1H); 4,0	(m, 5H); 4,2	(dd, 1H); 5,0	(m, 1H);	6, 05
2H); 7,1 (m, 5H);	8,0 (s, 1H);	8,2 (s, 1H) ;	31P-NMR i	(CDClj)

21,0 (szétkapcsolt).

C) Diasztereoxner elválasztás C18 RP-HPLC eljárással

GS-7171 (I.T.I)-t fordított fázisú HPLC eljárással kromatografálunk a díasztereomerek elválasztására a következő előiratot követve.

Kromatográfiás osxlop:	Phenomenex Luna'í>! C18(2), 5 pm, 100 A pórusméret (Phenomenex, Torrance, CA) vagy ezzel ekvivalens
Kísérő oszlop:	Perlzoular Cia tAritech, Deerfield, IL) vagy ezzel ekvivalens
Mozgó fázis	A - 0, 02 % (85%) H3PO4 vízben:acetonitril (95:5) B - 0,02 % (85%) H3PO4 vízben:acetonitril (50:50)

Mozgó fázis gradiens:

Idő	% A mozgó fázis	% B mozgó fázis
0	10 0	0
5	100	0
'7	7 0	30
32	7 0	30
0	0	100
50	0	100

Futtatási idő:	50 perc
Egyensúlybahozási késés:	10 perc 100 % A mozgó fázisnál
A t .f 01 y á s 1. s eb esség:	1,2 ml./'perc
Hőmérséklet:	Környezeti
Detektálás:	üV 260 nm-en
Minta-oldat:	20 mmol/liter nátrium- foszfát puffer, pH 6
Retenciós idők:	GS-7339, kb. 25 perc GS-7340, kb. 27 perc

D) Diasztereaaer elválasztás kristályosítással

GS-7340 (IV)

GS-7171 (III) acetonitriles oldatát 14,9 g borostyán szín; habbá pároljuk be csökkentett nyomáson. A habot 20 ml acetonítriloen oldjuK és egy (I\7,> kristállyal bsoiriüK. Az eregyev. “gy éjszakán «1 keverjük, 5 “C-ra hutjük, és a szilárd anyagot szűréssel elkülönítjük. Ezt követően szárítjuk, így

2.3 g (IV)-et kapunk fehér kristályos anyag alakjában, 98 %-os díasztereomer tisztasággal 'H-NMR (CDCI3) δ 1,15 (m, 12H); 3,7 (t, 1H); 3,95 (m, 2H); 4,05 (m, 2H); 4,2 (m, 2H); 5,0 (m, 1H);

6.4 (s, 2H); 7,1 (m, 5H) ; 8,0 (s, iH) ; 8,2 (s, 1H) ; P-NMR (CDC.I3) δ 19,5 (szétkapcsolt) , Az ebből a termékből kivett egyetlen kristály röntgensugár-analízisével a következő adatokat kapjuk:

*	kri st	ály színe, habitusa	színt	eien, os	zlop
	krist	ály méretei	0,25	X <· f 1 z. X	0,08 mm
;n	x«. Ά- 1. k.	ályrendszer	őrt or
Λ	rács	típusa	primi
A	X' öl C S	paraméterei	a - 8	, 352(1)	A
			b ~ 1	5, 57 4 (2)	Á
			-A.	8,253(2)	A
			\ r — n	7 4 7 - }	A'
A.	érosop	Olt	p - C	1 (#19)
ζύ	-érték		4
ΓΧ	1,333	g/cnr'
ÍP k-	000		1008,	Q 0
μ(Moha)	1,60	cm”5

4. példa

A GS-7340 fuxnarátsójának előállítása

GS-7340-02 (V) (1. reakcióvázlat)

Üvegbélésű reaktorba 1,294 kg (2,71 mól) GS-7340-t (IV), 284 g (2,44 mól) fumársavat és 24,6 kg acetonitri.lt mérünk. Az elegyet visszafolyatás közben forraljuk a szilárd anyagok feloldódásáig, majd az oldatot forrón szűrjük és 5 °C-on 16 órán át hűtjük. A terméket szűréssel elkülönítjük, 9,2 kg acetonitrillel mossuk, ezután szárítjuk, így 1329 g (V)-t kapunk fehér por alakjában. Op. 119,7 - 121,1 °C; [α]ο²'^; - 41,7° (c - 1,0, ecetsav).

5. példa

GS-7120 (VI) előállítása

3. reá kólóvázlat

Egy 5-literes gömblombíkba 200 g (0,55 mól) foszfonoetoxipropiladenint (II) és 0,629 kg acetonitrilt mérünk. Az elegyhez 0,144 kg (1,21 mól) tionil-kloridot adunk 27 °C alatti hőmérsékleten. Ezután az elegyet 70 ’C-on melegítjük a szilárd anyag feloldódásáig, majd nitrogén alatt végzett atmoszferikus desztillációval 0,45 liter illékony komponenst eltávolítunk. A maradékot 25 °C-ra hűtjük, 1,6 kg díklórmetánt

5 adunk hozzá, és -20 ’C-ra hűtjük. Ezután 18 perc alatt -20 °C és -10 °C közötti hőmérsékleten 0,144 kg (1,1 mol) (L)-aaminovajsav-etil-észtert 1,33 kg diklórmetánnal készült oldat alakjában, majd 15 perc alatt -8°C és -15 °C közötti hőmérsékleten 0,17 kg (.1,65 mól) trietil-amint adunk hozzá. A reakcióelegyet szobahőmérsékletre melegítjük, és négy alkalommal, alkalmanként 0,3 liter 10 %-os vizes nátriumdihidrogén-foszfát-oldattal mossuk. Ά szerves oldatot 0,5 kg vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, majd szűrjük. A szilárd anyagot 0,6 kg diklórmetánnal utánaöblitjük, és az egyesített szürletet és mosófolyadékot csökkentett nyomáson bepároljuk. A visszamaradó olajat 15 x 13 cm-es, 1,2 kg szilikagél 60-ból (230-400 mesh) készült ágyon kromatográfiásan tisztítjuk. Az oszlop eluálását diklórmetán és metanol gradienselegyével végezzük. A terméket tartalmazó frakciókat csökkentett nyomáson bepároljuk, így 211 g (Vl)-ot (3. reakcióvázlat) kapunk cser színű hab alakjában.

5a) példa

GS-7120 diasztereomerjeinek elválasztása szakaszos elúciós kromatográfiás eljárással

A diasztereomer elegyet a 3A) példában a GS-7171-re leírt körülmények között tisztítjuk a következő eltérésekkel:

Mozgó fázis (Kezdeti): (Végső):	GS-7120 - acetonitril:izopropil- alkohol = 98:2 100 % metil-alkohol
Elúciós profil	GS-7341 (B diasztereomer) GS-7342 (A diasztereomer)

6. példa

A GS-7120 diasztereomerjelnek elválasztása kristályosítással

Egy 1-literes gömblombikba 50 g (0,137 mól) monofenilPMPA-t (II) és 0,2 liter acetonitrilt mérünk, majd az elegyhez 0,036 kg (0,303 mól) tionil-kloridot adunk 10 °C hőmérsékletemelkedés mellett. A képződött elegyek visszafolyatás közben forraljuk a szilárd anyag feloldódásáig. Ezután nitrogén alatt végzett atmoszferikus desztillációval 0,1 liter illékony komponenst eltávolítunk. A lombikban maradt anyagot 25 °C-ra, és 0,2 kg diklórmetán hozzáadása után -20 °C-ra hűtjük. Ezt követően 30 perc alatt és -20 °C és -8 °C közötti hőmérsékleten 0,036 kg (0,275 mol) (L)-α-aminovajsavetil-észtert 0,67 kg diklórmetánnal készült oldat formájában, majd 10 perc alatt, legfeljebb -6 °C hőmérsékleten 0,042 kg (0,41 mól) trietilamint adunk hozzá. A reakcióelegyet szobahőmérsékletre melegítjük és négy alkalommal, alkalmanként 0,075 liter 10 %-os vizes nátrium-dihidrogén-foszfát-oldattal mossuk. A szerves oldatot 0,1 kg vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, majd szűrjük. A szilárd anyagot 0,25 liter etilacetáttal utánamossuk, és az egyesített szűrletet és mosófolyadékot csökkentett nyomáson bepároljuk. A visszamaradó olajat 0,25 liter etil-acetáttal hígítjuk, beoltjuk, egy éjszakán át keverjük, majd -15 °C-ra hűtjük. A szilárd anyagot szűréssel elkülönítjük és csökkentett nyomáson szárítjuk, így

17,7 g GS-7342-t (5. táblázat) kapunk cser színű por alakjában. ¹H-NMR (CDC1₃) δ 0,95 (t, 3H) ; 1,3 (m, 6H) ; 1,7 (m, 2H); 3,7 (m, 2H); 4,1 (m, 6H); 4,4 (dd, 1H); 5,8 (s, 2H) ;

7

7,1 (m, 5H) ; 8,0 (s, 1H) ; 8,4 (s, 1H) ; ^3IP-NMR (CDC1₃) δ 21 (szétkapcsolt).

7. példa

A GS-7097 diasztereomerjelnek elválasztása

A diasztereomer elegyet a GS-7171-re a 3A) példában leírt körülmények között tisztítjuk a következő eltérésekkel:

Mozgó fázis (Kezdeti): (Végső):	GS-7097 - acetonitr.il: izopropil alkohol. = 95:5 100 % metil-alkohol
Elúciós profil	GS-7115 (B diasztereomer) GS-7114 (A diasztereomer)

8. példa

Alternatív eljárás GS-7097 előállítására

GS-7097 t Fenil-PMPA- (etil-L-alani.l~amidát)

15,0 g (4.1,3 mmol) fenil-PMPA-t, 12,6 g (83 mmol) Lalanin-etil-észter-hidrokloridot és 11,5 ml (83 mmol) trlet 11.amint száraz nitrogén alatt 500 ml píridinben szuszpendálunk. Ehhez a szuszpenzióhoz 37,9 g (145 mól) trifenilfoszfin és 31,8 g (145 mmol.) aldritiol 2 (2,2’dipiridí1-díszulfid) 120 ml pirídinnel készült oldatát adjuk. Az elegyet 5'7 °C belső hőmérséklet mellett 15 órán át melegítjük. A teljes reakcióelegyet vákuumban bepároljuk. A visszamaradó 100 ej sárga pasztát 25 x 11 cm~.es, 1,1 kg szilikagél 60-ból (230-400 raesh) készült ágyon oszlopkromatográfiásan tisztítjuk. Eluálószerként 8 liter 2 % metanolt tartalmazó diklórmetánt, majd 26 liter metanol diklórmetán gradienselegyet használunk, amelynek végső összetétele 13 % metanolt tartalmazó diklórmetán. A tiszta terméket tartalmazó frakciókat bepároljuk, így 12,4 g nyers (5) vegyületet kapunk, ami 65 % elméleti hozamnak felel meg. Az anyagot kb. 15 tömeg! trieti1-amin-hidroklorid szennyezi az ‘H-NMR alapján. A szennyezést úgy távolitjuk el, hogy a terméket 350 ml etil-acetátban oldjuk, az oldatot 20 ml vízzel extraháljuk, a szerves oldatot vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk és bepároljuk, így 11,1 g tiszta GS-7097-et kapunk fehér szilárd anyag alakjában, 58 %-os hozammal·. Az eljárást GS-7003a és GS-7003b diasztereomer elegyének (a fenilalanilamidátnak) és a GS-7119 és GS-7335 elegyének (a glicilamidátnak) az. előállítására is használjuk. Ezeket a diasztereoméreket szakaszos elúciós eljárással, a 3A) , a 6. és a 7. példában leírtak szerint különítjük el.

9. példa

Az előgyógyszer diasztereomerek irt vitro vizsgálata

A GS-7340 (szabad bázis) és a tenofovir-dizoproxil-fumarát (TöF) in vitro HIV-1 ellenes hatását és az MT-2 sejtekben, mutatott citotoxicitását, valamint a humán plazmában és MT-2 sejtextraktumokban mutatott stabilitását: az 1. táblázatban foglaljuk össze. A GS-7340 a TDF-hez viszonyítva 10-szeres vírusellenes hatást és 200-szoros plazma-stabilitás növekedést mutat. Ettől a nagyobb plazma-stabilitástól azt várjuk, hogy orális adagolást követően a GS-7340-nek a TDF-nél nagyobb keringő szintjét eredményezi.

1. ta.ola.zat

In vitro aktivitás és stabilitás

	HIV-1	Cito-	Stabilitás Tl/2	(perc)
	aktivitás	toxxcitás
	IC5Ö pmol/l	CCS0 pmol/l	Humán	MT-2 sejt-	(P/MT-2)
			plazma	extráktűm
GS-7340	0,003	>40	90, 0	9 S Λ ··· ·- f ->	/7 y d
TDF	0,05	70	0,41	1 Λ '7	0,006
Tenofovir	5	6000	—	...

A TDF int race .11 uláris métából izmus a következtében képződött intracelluláris PMPA GS-7340-hez viszonyított relatív mennyislégének becslésére mindkét elógyógyszert és a PMPA-t radiojeleztük és érintetlen humán teljes vérbe injektáltuk ekvimoláris koncentrációkban. 1 óra eltelte után plazmát, a vörös vérsejteket (RBC-ket) és a perifériás vér mononukleáris sejtjeket (PBMC-ket; elkülönítettük és HPLC eljárással, radíometriás detektálás mellett analizáltuk. Az eredmények a 2. táblázatban láthatók.

óra eltelte után a GS-7340 10-szeres és 30-szoros öss; .intracelluláris PfíPA koncentrációt eredményez a PSMC-kben a TDF-hez illetve a PMPA-hoz viszonyítva. A plazmában 1 óra eltelte után a radioaktivitás 84 %~át az érintetlen GS-7340 adja, míg 1 óra eltelte után TDF nem volt kimutatható. Mivel nem volt érintetlen TDF kimutatható a plazmában, az 1 óra eltelte után a TDF és GS-7340 koncentrációiban mutatkozó tízszeres különbséa az in vivo várható minimális különösé©.

HPLC kromatogramm adatait a három vegyületre a PBMC-kben az 1 ábra mutatja.

2. táblázat

PMPA metabolitok plazmában, PBMC-kben és RBC-kben a PMPA vagy

PMPA előgyógyszerek humán vérben való 1 órás inkubálása után

		összes	Metabolitok	(a teljes csúcs	alatti terület
		kinyert			%	-a)
Vegyület	Mátrix	C-14 pg-	PMPA	PMPAp	PMPApp	Met.X	Met.Y	GS-7340,
		ekv.	%	%	%	%	%	%
GS-7340	Plazma/	4 3,0	1	-	-		13	S 4
(60 pg-	FP
ekv.)	PSMC	A f <- 0	4 5	16	•d A
	RBC/FP	.1 A y «..*	θ	-		Z t».	·: ·;
			PMPA	PMPAp	PMPApp	Mono-	GS-
						POC	4331
GS-4331	Plazma/	4 8, 1	.4.	-
CTOS'}	FP
(60 pg-	PBMC	0, 133	c 0	2 5	18	7
skv.)	RBC/FP	•A? y O	$3	7 Q	-	-
			PMPA	PMPAp	PMPApp
PMPA (60	Plasma/	? .5 t /	100
pg-ekv.)	ET?
í i	PBMC	0, 033	86	: /.	-
i 1	jRBC/FP	3,72	7 4	A L·	16

Az 1. ábrán szereplő Met.X és Met.Y (X és Y metabol.it) látható az 5. táblázatban. A kis p” betű fosztorilezést jelent. Ezeket az eredményeket 1 óra elteltével humán vérben kaptuk. Az idő előrehaladásával az in vitro különbségek feltehetően növekednek, mivel a GS-7340 34 %-a még érintetlenül van jelen a plazmában egy óra eltelte után. Mivel érintetlen GS-7340 van jelen a plazmában orális adagolást követően, a relatív klinikai hatékonyságnak az in vitro mutatott IC.ss értékekkel összefüggésben kell lennie.

A 3. táblázatban a tenofovir, a TDF, a GS-7340, néhány nukleozid és a proteáz gátló nelfinavir IC-sn értékeit soroljuk fel. Amint az látható, a nelflnavlr és a GS-7340 2-3 nagyságrenddel hatékonyabb az összes többi nukleotidnál vagy nukleozidnál.

Retrovirusellenes vegyületek in sritxo HIV-l-ellenes hatása

Vegyület	ICSO (μΜ)
Ade fovir (PMEA)	13,4+4,21
Tenofovir (PMPA)	6 / 3 X 3 /3'
	0,1710,081
3TC	1,810,251
d4T	8 ± 2 5'
Kelvinavir	0,006+0,0021
’Τ' Ό P	0, 0 5
GS-7340	0,005

¹ A. S. Mulató és J. M. Cherrington/ Antiviral

Research, 36, 91 (1997)

A jelen találmány szerinti, elkülönített diaszeteromerek in vitro sejttenyészetben mutatott HIV-l-ellenes hatásának és CC5.3 értékének további vizsgálatával kapott eredményeket a következő 4. táblázatban foglaljuk össze.

A meghatározásra vonatkozó irodalmi hely: Arimilli Μ. N. et al., Synthesis, in vitro biological evaluation and oral bioavallability of 9-[2-(phosphonomethoxi) propyl]adenin (ΡΜΡΆ prodrugs Antiviral Chemistry and Chemotherapy, 8,(6), 557-564' (1997) .

A Phe-metil-észter a tenofovir fenil-monoészterének a metil-fenilalaninil-monoamidátja; a gly-metil-észter a tenofovir fenil-monoészterének a metilglicil-monoamidátja.

4. táblázat

A diasztereomer hatása

Vegyület	Diasztereomer	ICso (μΜ)	X változás	A/B aktivitás	cc50 (μΜ)
PMPA	-	5	lx	-	6000
Ala-metil-	1:1	0, 025	200x	2 Ox	8 0
észter	keverék
GS-6957a	A	0,0075	67 Ox
GS~6957b		0, 15	33x
Phe-metil-	1:1	0, 03	17 Ox	lOx	60
észter	keverék
GS-7003a	A	0, 01	500x
GS-7003b	B	0, 1	50x

Gly-etil- észter	1:1 keverék	π <r	lux	20x
GS-7119	A	0,0 5	100.x		>100
GS-7335	B	1,0	5x
Ala- izopropil	1:1 keverék	0, 01	500x	12x
GS-7340	A	0, 0 0 ö	lOOOx		40
GS-7339	B	0,06	33x		>100
ABA-etil	1:1 keverék	0,003	62 5x	’7 ü;	>100
GS-7342	A	0,004	1250x
GS-7341	B	0,03	17 0x
ADA-etil	·· ·*· keverék	0, 0 2	2 50x	1 Qy	60
GS-7114	A	0,00 5	ICJOOx
GS-7115		0,05	lOOx

Mindegyik fenti esetben az A izomerről azt feltételezzük, hogy abszolút sztereokémiája megegyezik a GS-7340 (S) sztereokémiájával, és a B izomer abszolút sztereokémiája megegyezik a GS-7339 sztereokémiájával.

Az elkülönített diasztereomerek in vit.ro metabolizmu· és stabilitását PLCE-ben, MT-2 extraktumban és humán plazmában határoztuk meg. Az alább felsorolt biológiai mintákból 80 μΐ-t egy csavaros fedelű centrifagacsőbe vittünk át és 37 ^QC-on 5 percig inkubáltunk. Ezután 0,2 mg/ml vizsgálandó vegyületet megfelelő pufferben tartalma 20 pl oldatot adtunk a biológiai mintához, és a komponenseket összekevertük. A reákeióelégyből 20 pl-t azonnal kivettünk és 60 μΐ metanollal elegyítettünk, amel 0,015 mg/ml 2-hidroximetilnaftalint tartalmazott belső standardként a HPLC analízishez. Ez a minta volt a 0 időpontban vett minta. Ezután meghatározott időpontokban a reakcióelegyből 20 pl-es részleteket vettünk ki, és belső standardot tartalmazó 60 pl metanollal elegyítettünk. Az így kapott elegyet 15 000 g~n 5 percig centrifugáltuk, és a felüiúszót HPLC eljárással a következőkben leírt körülmények között analizáltuk. Az értékelt biológiai minták a következők voltak:

(1> PLCE (sertésmáj karboxieszteráz /a Sigma cégtől, 160 u/mg fehérje, 21 mg fehérje/ml), amelyet foszfáttal puffereit sóoldattal (PBS) 20-szorosra hígítottunk.

(2) MT-2 sejtextraktum, amelyet MT--2 sejtekből készítettünk A.

Pompon, I. Lefebvre, J.-L. Imbach, S. Kahn és D. Farquhar által az Antiviral Chemistry & Chemotherapy 5, 91-98 (1994) irodalmi helyen leírt módon, azzal az eltéréssel, hogy a következőkben leírt. HEPES puffért használtuk közegként.

(3) Humán plazma (összegyűjtött normális humán plazma a George King Biomedical Systems, Inc. cégtől).

A vizsgálatokhoz a következő puffer-rendszereket használtuk.

A PLCE tanulmányozásához a vizsgálandó vegyületet PSS-ben oldottuk. A PBS (foszfáttal puffereit sóoldat, Sigma) 0,01 mol/liter foszfátot, 0,0027 mol/liter kálíum-kloridot és 0,137 mol/liter nátrium-klorídot tartalmaz. pH-ja 37 ^c-on 7,4.

Az MT-2 sejtextraktumokkal végzett kísérletekhez a vizsgálandó vegyületet HEPES pufferben oldottuk. A HEPES puffer 0,010 mol/liter HEPES-t, 0,05 mol/liter kálium-kloridöt, 0,005 mol/liter magnéziumkioridot és 0,005 mol/liter cü-ditiotreitet tartalmaz. pH-ja 37 '’C on 7,4.

A humán plazmával végzett kísérletekhez a vizsgálandó vegyületet TBS-ben oldottuk. A TBS (írisszel puffereit sóoldat,

Sigma) 0,05 mcl/liter Tris-t, 0,0027 mol/liter kálium-kloridot és 0,138 mol/liter nátriura-kloridot tartalmaz. pH-ja 37 °C~on

A HPLC analízist a következő körülmények között végeztük

Os z .1. op'	Zorbax Rz-Cg, 4, 6 x 250 mm, 5 μ (MAC-MOD Analytical, Inc. Chadds Ford, PA)
Θ kt cl Iá S *	UV 2 60 rim-en
.At f 01 y á s i s eb esség:	1,0 ml/perc
Futtatási idő:	30 perc
Injektált térfogat:	20 pl
0 s z 10 p hőm é r s é k .1 e t:	környezeti hőmérséklet
A mozgó fázis:	50 mmol/1. kálium-foszfát (pH €,0)/CH3CN - 95:5 (tért./térf. )
B mozgó fázis:	50 mmol/1 kálium-foszfát (pH 6,0)/CH2CN - 50/50 (térf./térf.)

A gradienselegy összetételének változás

0 perc	100 % A mozgó fázis
2esi	100 % B mozgó fázis
3 0 Ό 6 Γ c	100 % B mozgó fázis

Az eredményeket az 5. táblázatban foglaltuk össze (néhány, a 4. táblázatból kiválasztott. IC30 értéket is feltüntettünk).

Iá

A PMPA monoamidát A és B izomerjelnek in vitro métábólizmusa °C-on

				........1	PLCE hidrolízis	............ ............... MT-2 extraktum.	Humán
Szára	FMF.A ucncaardát	Htv	ICsa j	sebesség es	hidrolízis	pXa-Xjna
		szerkezete	<pM)	termék	sebesség és	stabilitás {HE1) ;
						fcertaék
		9 9Ha ^O^á-NH-CHCQO.a	0?	OC 5 !	ti/2 » 2,9 pere	tr/j ® 2,9 perc	ύ,/a ~ 148 perc >
		.¾ Q?h		•	Mex .a £ P.KAA	bit'19 » S. \·	MET.E :
	ív	12 eme r C: S 7.17.4
• ·>	t	9 ch3 ^A^R-NH-CHCOOB	ö,	!	i/t “ 8,0 perc	t;/.z 150, ó perc	C......0 - 4 95 ptro
		i ÖPh			Miit,X 5	Mer.X -k PHPA	KÉT. Ϊ 1
! j	ιΛ	i z aser GS 7i1 5		ΐ !			í
ί i 3	t	V 9¾ ^zO^S^WH-CHCOOiPr	h· t	335 |	tx/a ~ 3,3 pőre	tx/a - 23,3 perc	7-m 30,0 peroj
|		ΐ OPh			Met.X í FÍ£?A	Mer. X & ?XS?A	ME T v T :
	A	isomer GS7340
1	t	9 9^ ^O^NH-CHCOOiPr		OS	txzc 3.0,1 perc	tVa > lOöö perc	tx/j “ 231 perc
1		I. OPh					5-íst . 1’ j
		IXOX&SX GS7339					!
	$. 0 . CH2CH3 Ü^Q^R-NH-CHCOOSt	k‘ X		é* . jj- T7 C* · ’.’. v**/*· -J . ..·	7-1x2 * ρ^ΧΌ	tx/a - Ke perc i
		|. OPít			λ·^Λ v V	Met -λ Λ. PMVA	MET.Y
	A	i s.oisse r G s 7 3 -$ 2					i

ere

Metro ?Oi üí-U

QOHgOCOfP;

Plazma és E*BMC expozíciók előgyógyszer diasztereomerek beagle kutyáknak való orális adagolását követően

A GS-7340 farmakokinetikáját kutyákban tanulmányoztuk 10 mg-ekv./kg dózis orális beadása után.

Készítmény ek

Az elögyógy-szerekből 50 mmólos citromsav-oldattal oldatot készítettünk 0,5 órával az adagolás előtt. A vizsgálatokban használt minden vegyületet a Gilead Sciences szintetizált. A következő sarzsokat használtuk:

GSI	Amidát aminosav	Amidétaminosav~ észter	Diaszte- reoizomer	Sarzsszám
(SS ** / 3 4 0 “ 2	A1anin	Izopropi1	A izomer	.1504-187-19
GS-7339	Alanin	Izopropi1	B izomer	1509-185-31
GS-7114	Alanin	Etil	A izomer	1509-181-25
GS“ /115	Alánin	Et í 1	B Izomer	1509-181.-22
ΐ *ϊ * /' ; ;	Gliein	11* 1^ U. 1.	A izomer	1428-163-23
GB-7342	a --Ami n o - va j s a v	& :.. .j. .L	A izomer	1.509-191-12
G 3 - 7 3 4 1	a-Amiηo-va j sav	Etil	B izomer	1509-191-7

A dózis beadása és mintagyűjtés

A jelen vizsgálat élő-fázisát a Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Institutes of Health publication 86—23} ajánlásai szerint és az Institutional Animal Care and Use Committee engedélyével végeztük. Eheztetett him beagle kutyákat (10±2 kg) használtunk a vizsgálatokhoz.

Mindegyik hatóanyagot egyszeri 1,5-2 ml/kg dózisként orálisan, szonda segítségével adtuk be. A dózis 10 reg-ekvivalens PMPA/kq volt. A PBMC-khez a vérmintákat a 0. órában (a dózis beadása előtt; és 2, 8 és 24 óra elteltével (a dózis beadása után) gyűjtöttük. A plazmához a vérmintákat a 0. órában (a dózis beadása előtt), majd 5, 15 és 30 perc, és 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12 és 24 óra elteltével (a dózis beadása után) gyűjtöttük. 1,0 ml vért közvetlenül feldolgoztunk plazmára 2000 fordulatszám mellett 10 percig végzett centrifugatással. A plazmamintákat lefagyasztottuk és -70 °C-on tartottuk az analízis θ .1. v Θ CT θ S Θ 1. O «

Perifériás vér mononukleáris sejt (PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cell) készítmény ml teljes vért vettünk le különböző időpontokban, és azonos térfogatú foszfáttal puffereit sóoldattal (PBS) elegyítettünk, majd 15 ml Ficol.1 -Paque oldatra (Pharmacia Eíotech) rétegeztünk, és 400 x g-n 40 percig centrifugáltunk. A PBMC réteget el távolífőttük, és egy alkalommal PBS-sel mostuk. A képződött PMBC pelletet 0,5 ml PBS-ben szuszpendáltuk, és a reszuszpendált sejteket heraocitométer segítségével számláltuk, majd az analízis elvégzéséig -70 °C.on tartottuk. Az intracelluláris koncentrációk kiszámításához a közepes egysejt-térfogatot szoroztuk meg a sejtek számával. Egy közleményben szereplő 200 femtoliter/sejt értéket használtunk a nyugalmi PBMC térfogatataként [B. L. Robins, R. V. Srinivas, C. Kim, N. Bischofberger és A. Fridland, Zintimícrob. Agents Chemether., 42, 612 (1998)].

A PMPA és az előgyógyszerek meghatározása a plazmában és a

PBMC-kben

A PFJPA koncentrációját a kutyából származó plazma mintákban úgy határoztuk meg, hogy a PMPA-t klőracetaldehidde egy nagyon fluoreszcens N¹,bT-etenoadenin-származékká alakítottuk [L. Naesens, J. Ba.lzar.inl és E. De Clercq, Clin. Chem., 38, 480 (1992)]. Röviden összefoglalva úgy jártunk el, hogy 100 pl plazmát 200 pl acetonitrille.1 elegyítettünk a fehérje kicsapására. Ezután a mintákat, csökkentett nyomáson é szobahőmérsékleten szárazra pároltuk. A száraz mintákat 200 μ származékká alakító eieggyel (0,34 % klóracetaldehíd 100 mmólos nátrium-acetát-oldatban, pH 4,5; vortexe.lt ük, majd centrifugáltuk. A. feiülűszót egy tiszta, csavaros fedelű csöb vittük át és 40 percig 9.5 °C-on inkubáltuk. A származékká alakított mintákat, ezután szárazra pároltuk, és 100 pl vízben feloldottuk a HPLC analízishez.

Mielőtt az intracelluláris PMPA-t. meg tudtuk volna HPLC eljárással határozni, a PBMC-extraktumokban nagy mennyiségben jelen levő, adeninnel rokon ribonukleotidokat szelektív oxidációval el kellett távolítani. Tanaka és munkatársai eljárásának [K. Tanaka, A. Yoshioka, S. Tanaka és Y. Wataya, Arai. Siocrem. 139, 35 (1984)] egy módosított változatát használtuk. Röviden összefoglalva úgy jártunk el, hogy a PBMC mintákat 1:2 arányban metanollal elegyítettük és csökkentett nyomáson szárazra pároltuk. A száraz mintákat a fentebb a plazma vizsgálatnál leírt módon származékká alakítottuk. A származékká alakított mintákhoz 20 pl 1 mólos ramnóz-oldatot és 30 pl 0,1 mólos nátrium-perjodát-oldatot adtunk, és az elegyet 37 °C-on 5 percig inkubáltuk. Az ínkubálást követően 40 pl 4 mólos metilamin-oidatot és 20 pl 0,5 mólos inozin oldatot adtunk a mintához. Az elegyet 3 7 ’C-on .30 percig inkubáltuk, majd csökkentett nyomáson szárazra pároltuk, végül vízben oldottuk a HPLC analízishez.

Egyik PBMC mintában sem mutattunk ki érintetlen előgyógyszert. A plazmamintákkal, amelyek potenciálisan érintetlen előgyógyszereket tartalmaztak, kísérleteket végeztünk annak bizonyítására, hogy a származékká alakítás alatt további PMPA konverzió nem történt. Előgyógyszer standardokat adtunk a hatóanyag-mentes plazmához, és a származékká alakítást az előzőekben leírt módon elvégeztük. Egyik plazmamintában sem volt jelen PMPA kimutatható mennyiségben, és a konverzió %-a 1-nél kisebb volt.

A HPLC rendszer egy P4000 típusú oldószeradagoló rendszerből állt, amely AS3000 típusú autoinjektorral és F2000 típusú fluoreszcencia detektorral volt ellátva (Thermo Separation, San Hose, CA). Az oszlop 4,6 x 150 mm-es Inertsil ODS-2. oszlop volt. A következő mozgó fázisokat alkalmaztuk: A: 5 % acetonitril 25 mmol/liter kálium-foszfát pufferben, amely 5 mmol/liter tetrabutilammónium-bromidot (TBABr) tartalmazott, pH 6,0; B: 60 % acetonitril 25 mmol/liter kálium-foszfát pufferben, amely 5 mmol/liter tetrabutilammónium-bromidot tartalmazott, pH 6,0. Az átfolyási sebesség 2 ml/perc volt, és az oszlophőmérsékletet egy oszlopkemencével 35 °C-on tartottuk. A gradiens profil a következő volt: 90 % A/10 % B 10 percig a PMPA esetében, és 65 % A/35 % B 10 percig az előgyógyszer esetében. A detektálás fluoreszcenciával történt 236 nm gerjesztési és 420 nm kibocsátási hullámhosszon, és az injektált térfogat 10 pl volt. Az adatokat laboratóriumi adatgyűjtő rendszerrel (PeakPro, Beckman, Allendale, NJ) gyűjtöttük és tároltuk.

Farmakokinetikai számítások

A PM PA és az előgyógyszer expozívióját a plazmában vagy

PBMC-ben a 0-24 óra közötti koncentrációs görbék alatti területként (AUC) fejeztük ki. Az AUC értékeket trapezoídos s z a ba .1 y a i ka ima z a s a v a .1 számítottuk.

A plazma és PBMC koncentrációk

Ezen vizsgálat eredményeit a 2. és 3. ábra mutatja. A 2. ábrán látható a GS-7340-2 metabolizmusának időbeli lefutása, a plazmában és a PBMC-kben mutatott koncentrációk összefoglalása PMPA. előgyógyszerek tiszta diasztereoizoraerjelnek orális adagolását követően.

A 3. ábra szerinti oszlopdiagramm a tenofovir görbe alatt (A.UC, 0-24 óra) területeit mutatja kutyából származó PBMC-kben és plazmában PMPA szubkután, TDF és amidát-észter előgyógyszerek adagolását követően. Az összes amidét előgyógyszer növekedést mutatott a PBMC-expozícióban. A G 7340 például kb. 21-szeres növekedést idézett elő a PBMCexpozícióban a PMPA-hoz (s.c.) és a TDF-hez viszonyítva; 6,25-szÖrös illetve 1,29-szeres csökkenést a plazma expozícióban.

Ezek az in vivő adatok alátámasztják, hogy a GS-7340 orálisan adagolható, minimalizálja a szisztémás PMPA-tartalmat és nagy mértékben fokozza a PMPA intracelluláris koncentrációját a HÍV replikációért elsősorban felelős sej tökben.

6. táblázat

PMPA-expozició PBMC-ben és plazmában PMPA előgyógyszerek orális adagolását követően kutyákban

OS» j	Molekula	FMPA AUC plazmában	2MPA AVC PBMCben	Előgycgysssex a plazmában	PBMC/plajma arány
M	Sth	N	M	Sth	N
GS-	Mono-Ma-	S, 8	'.· f d	•ü	’? 0 6	331	c-	IGEN	a 2 2
7114	el
GS-	Mgh-WiI-í-	6 f 6	1 f 5	2	el 7 ‘i	2 4		IGEÍJ	4 »5
7115
GS-	Morio-A.· a-	<·' f V	.1 f J.	r;	875	í. c. íL	5	IGEN	1 bl
7340-2	; tv'... A
GS-	Mono·*· A 1 ·ΐ“·	6 ? 4	·: υ -- < '·ι	2	200			IGl’N	< 1
7339
GS-	Mobg-GIy“	ΐ;, 11	t, 8 6	2	53 0			IGEN	sí'?
7119	Et-A
GS-	Motso-ABA-	6	X .<·	•7	1060	5.11	ü,	IGEN	/..1 U
7342	Et-A
GS-	Mono-ΑΒΑ-	5,8	1, 4	2	2 9	08	ς:		34
7341	Ec-B

11. példa

A GS-7340 biológiai eloszlása

A GS-7340 preklinikai jellemzésének részeként meghatároztuk kutyákban a biológiai eloszlást. A GS-7340 (tenniovir-feniImonoésztér-izoprop11-alanil-monoamidát) szöveteloszlását orális adagolást követően beagle kutyákban ekvivalens PMPA/kg, 33,2 pCi/kg; az adenin 8-as szénatomja jelzett) adtunk be 50 mmólos vizes citromsav-oldattal (pH 2,2) készült oldat formájában. Plazmát és perifériás vér mononukleáris sejteket (PBMC-ket) 24 órás perióduson át gyűjtöttünk. Vizeletet és ürüléket a ketrecben gyűjtöttünk 24 órán át. A beadás után 24 órával az állatokat leöltük és a szöveteket analízis céljára eltávolítottuk. A szövetekben a teljes radioaktivitást oxidációval és folyadék szcintillációs számlálással határoztuk meg.

A PMPA bioeloszlását 24 óra eltelte után egyszeri radiojelzett GS-7340 orális dózis beadását követően a 4. táblázatban foglaltuk össze a TDF-fel (GS-4331) végzett korábbi vizsgálati adatokkal együtt. A TDF esetében az elögyógyszer koncentrációja a plazmában a vizsgálat kimutatási szintje alatt volt, és a fő komponens, amit a plazmában megfigyeltünk, az eredeti hatóanyag volt. A PMPA szintjei a nyirokszövetekben, a csontvelőben és a vázizomban 10~szeresére növekedtek a GS-7340 adagolása után.

A nyirokszövetekben való felhalmozódás megfelel azoknak az adatoknak, amelyeket a PBMC analízisekből kaptunk, mivel ezek a szövetek elsősorban limfocitákból állnak. Hasonlóképpen a csontvelőben való felhalmozódás is az ebben a szövetben jelen levő limfocíták nagy százalékának (70 %) tudható be.

» táblaz a t

Radiojelzett GS-7340 kiválasztása és szövet-eloszlása kutyákban (középérték, N ~ 2) 10 mg-ekvivalens PMPA/kg dózis orális adagolását követően

Szővet/Nedv	GB-4 33 i.	GS-7340	Szóvetkoncentráció arány GS-7340/GS-4331
5 Dózis	Konc. ípg- ekv./g;	1 Bősis	Konc.tag- ekv./g;
Máj	12,40	38, 3 0	16, 45	52,94	1,4
Vese	4, 58	87,90	3, 7 8	80, 21	0, 9
Tüdők	0, 03	0,53	0,34	4, 33	8, 2
Nyi rokcsomók Cs 1 r ő	ö, 00	0,51	0,01	5, 42	10, 6
•lóiial j i	0,00	0, 37	0,01	5, 54	14, 8
.ágyéki.	0, 0 c	0,28	0,00	4,12	15, 0
Bélfodor	o, oo	1,20	0,04	6, 86	5, 7
?c j ;:sí«irigy	0, 00	0, 30	0, 00	4,78	15,8
I-i ipofizis	0,00	0,2 3	0,00	1, 80	7,8
N y á 1 m 1 r 1 g y (B : j i	0,00	0,4 5	0,03	5, 54	12,3
Mellékvese	0,0 0	1, 90	0,00	3,47	1,8
:,ép	0,00	0,63	0, 17	8, 13	12, 8
Ha a :\y álmi r így	0, 00	C ,57	0,01	3,51	6, 2
Pros;: tat a	0, 00	0,23	0,00	2,14	9, 1
Herék (B+-J}	0, 02	1,95	0,02	2, 01	1,0
Vázizom	0, 00	0,11	0,01	1, 12	10, 1.
S:-:ív	0,03	0,4 6	0, 15	1, 97	4,3
Eemorális osont	0,00	0,08	0,00	0, 28	3, 5
Csontvelő	0, 00	0,20	0,00	2, 05	10, 2
Bőr	0, 00	0,13	0, 00	0, 95	7 7'
ALhasi zíslr	0, 0 0	0, 16	0, 00	0, 90	5, 8
Saem (3-tJ)	0, 00	0,06	0, 00	0, 23	3, '7
Agy	0, 00	<: 1.0 D	0, 00	<1,00	n. d *
.Agy-gerincvelő	0, 00	<:1.0:1	0,00	0, 00	n. d ♦
fel yadék Gerincvelő	0, 00	<LOB	0,00	0,04	r;. d *

7. táblázat (folytatás)

Szövőt/Nedv	jlD'	' i Z S X	GS“	- 7 3 4 0'	Szövés koncontráció
% Dózis	p; Íz íy r ·y \	3 Döz:ts	akv./g;
ΟνΟ'ΣηΟ Γ	' 2 f Λ. 4.	1 <> O	•2 '4 6	21 6 8	— f '•k
£·ΊΧΧί .1	1,34	3,01	0, 7 9	4 f 11;	1/4
ixyCiubé 1	01 4 3	4,96	W j *3 '}	21 >	f ó
v· S x	6 t v X	-.y ' 2	0, 16	4, 61	-’ f X-
'•/•uS? x	.1/ (.u;	a ·/ ^.· / ..· .	2 f 6 3	ű ?, zs	f 9
epehólyagok	v f V S	. j t . > ' j	<-· , V -i	2 5 f '2 2:	’ r ’··
ihk.'Z	S f í.; u	$), 63	t .<. A.	• J 0 f -'k s	•3 » .·:’.
ür'-i 1<SK	40, 96	n. d.	t? f x .;·	n. <i,	El . 3 .
T\: .1 ή <·: s qvorucr~	3, 61	n, d.	2 x ( 6 4	n v <i	il » .
jn <:·. j ·£ rj y r : x
t. -h.r t-Ü lOíst
i o' >· · í> r	'- ·' ·’ ··-·	•Ί. d.	14 ·' 3	n d	Γ;«. ;:1 *
Ρ.ί aZmii 2 4 ÓI3	·'; t	ü f 2 0	0,00	A jj	.1 f (.·
eltelte után
t ·> 2 Vöd	n. ti.	3Z 63	0. * 3.»	3,4 8	.-1 O ·.· f
X X 5¾ •it'Ul’í
	S f u s	n. d.	Ω 3 ·?	O.5 í a k··	n - d,
vé r	V/ f \:·	0,8 3	0,16		'·’ f X·
\.'S S Z6SÖ:1	81 1 v		68,96

*A jellemző 15 x 10° összes sejt visszanyeréssel, és a PBMC 0,2 pikoliter/sejt közepes térfogatává1 számítva.

n.s. ^::: nem volt minta, n.a. ^::: nem alkalmazható, n.d. ~ nem határoztuk meg.

Claims (5)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. A (6) képletű vegyület

   vagy
2. 2. Az 1. igénypont szerinti (7) képletű vegyület
3. 3. Készítmény, amely az 1. vagy 2. igénypont szerinti vegyületet és gyógyászatilag hatékony segédanyagot tartalmaz.
4. 4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti vegyület vírusfertőzés kezelésében történő alkalmazásra, ahol a vírusfertőzés HIVfertőzés.
5. 5. A 3. igénypont szerinti készítmény vírusfertőzés kezelésében történő alkalmazásra, ahol a vírusfertőzés HÍV fertőzés.