PL213214B1 - Diastereoizomerycznie wzbogacone proleki fosfonianowych analogów nukleotydowych oraz kompozycje zawierajace takie zwiazki - Google Patents

Description

Wynalazek dotyczy diastereoizomeryczne wzbogaconych metoksyfosfonianowych proleków analogów nukleotydowych jak również kompozycji zawierających te związki.

Znanych jest wiele metoksyfosfonianowych analogów nukleotydowych. Związki te posiadają wzór ogólny A-OCH2P(O)(OR)2, gdzie A stanowi pozostałość analogu nukleozydu, a R niezależnie oznacza wodór lub różne grupy zabezpieczające lub funkcyjne proleku. Porównaj: opisy patentowe Stanów Zjednoczonych nr 5,663,159, 5,977,061 i 5,798,340, Oliyai i in., Pharmaceutical Research 16(11): 1687-1693 (1999), Stella i in., J.Med.Chem. 23(12):1275-1282 (1980); Aaarons L., Boddy A. Petrak K. (1989), Novel Drug Delivery and Its Therapeutic Application (wyd. Prescott, L.F. i Nimmo W.S.), str.121-126; Bundgaard H. (1985) Design of Prodrugs (wyd. Bundgaard H.), str.70-74 i 79-92; Banerjee P.K. i Amidon G.L. (1985) Design of Prodrugs (wyd. Bundgaard H..) str. 118-121; Notari R.E. (1985) Design of Prodrugs (wyd. Bundgaard H., str. 135-156; Stella V.J. i Himmelstein K.J. (1985) Design of Prodrugs (wyd. Bundgaard H.) str. 177-198; Jones G. (1985) Design of Prodrugs (Bundgaard H, wyd.) str. 199-241; Connors T.A. (1985) Design of Prodrugs (wyd. Bundgaard H.) str. 291316. Wszystkie cytowania literaturowe i patentowe zostają niniejszym włączone jako odnośniki.

Streszczenie wynalazku

Metoksyfosfonianowe proleki analogów nukleotydowych przeznaczone do terapii przeciwwirusowej lub przeciwnowotworowej, mimo iż dobrze znane, tradycyjnie wybiera się ze względu na ich działanie ogólnoustrojowe. Na przykład, proleki te wybiera się ze względu na ich większą biodostępność, to znaczy zdolność wchłaniania z układu pokarmowego i szybkość przekształcania w lek macierzysty, zapewniającą dostępność leku macierzystego we wszystkich tkankach. Jednakże obecnie zgłaszający stwierdzili, że możliwe jest wyselekcjonowanie proleków występujących w większym stopniu w ognisku choroby, jak to ilustrują opisane tutaj badania, zgodnie z którymi analogi te występują liczniej w miejscach zlokalizowanej infekcji HIV. Celem obecnego wynalazku, oprócz innych korzyści, jest powodowanie mniejszej toksyczności wobec tkanek sąsiadujących i silniejszego działania leku macierzystego w tkankach, na które ukierunkowana jest terapia, niż w przypadku macierzystych metoksyfosfonianów analogów nukleotydowych.

Przedmiotem wynalazku jest diastereoizomerycznie wzbogacony związek o wzorze (3) ο ιι -,

Β——Ε—OCH₂-Ρ '-ir1

R² (3) zawierający mniej niż 40% wagowych diastereoizomeru o wzorze (4) w którym

R¹ oznacza grupę fenoksylową, B oznacza grupę o wzorze

PL 213 214 B1

R² oznacza resztę aminokwasową przyłączoną do atomu P poprzez grupę aminową aminokwasu wybranego jest z grupy obejmującej alaninę, glicynę, fenyloalaninę, kwas α-aminomasłowy, przy czym podstawnik karboksylowy w aminokwasie jest zestryfikowany przez grupę etylową lub izopropylową,

E stanowi -CH2CH(CH3)-, oraz ich sole, wolne zasady i solwaty,

Korzystnie, powyższy związek zawiera mniej niż 20% wagowych diasteroizomeru o wzorze (4).

Korzystnie, powyższy związek zawiera mniej niż 5% wagowych diasteroizomeru o wzorze (4).

Korzystnie, związki o wzorach (3) i (4) obecne są w stosunku 95%:5%.

Korzystnie, powyższy związek występuje w postaci fumaranu.

Przedmiotem wynalazku jest również diastereoizomerycznie wzbogacony związek o wzorze (5a)

zawierający mniej niż 40% wagowych diasteroizomeru o wzorze (5b)

gdzie

R⁵ oznacza metyl,

R^6a oznacza grupę fenylową,

R⁶ oznacza grupę izopropylową albo metylową

R⁷ oznacza atom wodoru, grupę metylową, etylową lub fenylometylową;

R¹¹ oznacza grupę aminową, a

R¹² stanowi H;

oraz jego sole, tautomery, wolne zasady i solwaty.

Korzystnie, powyższy związek zawiera mniej niż 20% wagowych diasteroizomeru o wzorze (5b). Korzystnie, powyższy związek zawiera mniej niż 5% wagowych diasteroizomeru o wzorze (5b). Korzystnie, związki o wzorach (5a) i (5b) obecne są w stosunku 95%:5%.

Korzystnie, powyższy związek występuje w postaci fumaranu.

Przedmiotem wynalazku jest również diastereoizomerycznie wzbogacony związek o wzorze (6)

PL 213 214 B1

oraz jego sole i solwaty.

Przedmiotem wynalazku jest również diastereoizomerycznie wzbogacony związek o wzorze (7)

zawierający mniej niż 40% diastereoizomeru o wzorze (7a)

oraz jego sole i solwaty

Korzystnie, powyższy związek zawiera mniej niż 20% wagowych diasteroizomeru o wzorze (7a). Korzystnie, powyższy związek zawiera mniej niż 5% wagowych diasteroizomeru wzorze (7a). Korzystnie, związki o wzorach (7) i (7a) obecne są w stosunku 95%:5%.

Przedmiotem wynalazku jest także związek przedstawiony wzorem (1)

PL 213 214 B1

w którym Ra stanowi metyl, oraz jego sole, wolne zasady i solwaty.

Korzystnie, powyższy związek występuje w postaci fumaranu. Przedmiotem wynalazku jest również związek przedstawiony wzorem (2)

oraz jego sole, wolne zasady i solwaty.

Korzystnie, powyższy związek występuje w postaci fumaranu. Przedmiotem wynalazku jest również związek przedstawiony wzorem (III)

oraz jego sole, wolne zasady i solwaty.

Korzystnie, powyższy związek występuje w postaci fumaranu

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja zawierająca związki określone powyżej i farmaceutycznie skuteczną substancję pomocniczą.

Korzystnie, substancja pomocnicza stanowi żel.

Korzystnie, kompozycja jest kompozycją do stosowania miejscowego.

Przedmiotem wynalazku jest również dowolny z określonych powyżej związków do zastosowania jako lek.

PL 213 214 B1

Związki według wynalazku mogą być identyfikowane z wykorzystaniem metody badania przesiewowego metoksyfosfonianowych proleków analogów nukleotydowych, umożliwiającej identyfikację proleków zapewniających większą aktywność w tkance docelowej, która obejmuje:

(a) dostarczenie co najmniej jednego z takich proleków;

(b) wybranie co najmniej jednej tkanki docelowej i co najmniej jednej tkanki nie docelowej;

(c) podawanie proleku do tkanki docelowej i co najmniej jednej tkanki nie docelowej;

(d) określenie względnej aktywności przeciwwirusowej zapewnianej przez prolek w tkankach z etapu (c).

Korzystnie, tkanki docelowe stanowią miejsca, gdzie wirus HIV ulega aktywnej replikacji i/lub które służą jako zasobnik HIV, a tkankę nie docelową stanowi tkanka nie zmieniona. Nieoczekiwanie okazało się, że wybór do praktyki opisanej metody tkanki Iimfatycznej prowadzi do identyfikacji proleków, które wzmagają dostarczanie substancji aktywnej do tych tkanek.

Ponadto nieoczekiwanie stwierdziliśmy, że chiralność podstawników atomu fosforu i/lub podstawnika amidanowego ma wpływ na wzbogacenie obserwowane w praktyce wynalazku.

Diastereoizomery o wzorze (3) stanowią izomery o konfiguracji (S) na chiralnym centrum fosforowym.

Korzystny wariant wynalazku stanowi związek o wzorze (6), 9-[(R)-2-[[(S)-[[(S)-1-(izopropoksykarbonylo)etylo]amino]fenoksyfosfinylo]metoksy]propylo]adenina, oznaczana tutaj także symbolem GS-7340

Inny korzystny wariant wynalazku stanowi sól fumaranowa związku o wzorze (5) (wzór (7)), fumaran 9-[(R)-2-[[(S)-[[(S)-1-(izopropoksykarbonylo)etylo]amino]fenoksyfosfinylo]metoksy]propylo]adeniny (1:1), oznaczany tutaj także symbolem GS-7340-2

Związki o wzorach (1)-(7) ewentualnie przygotowuje się w postaci kompozycji zawierających farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze. Kompozycje te stosuje się w dawkach skutecznych w leczeniu i profilaktyce infekcji wirusowych (zwłaszcza HIV i hepadenowirusowych).

9-[2-(fosfonometoksy)propylo]adenina (tutaj „PMPA) lub 9-[2-(fosfonometoksy)etylo]adeniny (dalej „PMEA) mogą być wytwarzane prostym sposobem przy zastosowaniu alkoholanu magnezu, który obejmuje połączenie 9-(2-hydroksypropylo)adeniny lub 9-(2-hydroksyetylo)adeniny, zabezpiePL 213 214 B1 czonego p-toluenosulfonyloksymetylofosfonianu i alkoholanu magnezu, i wyodrębnienie odpowiednio PMPA lub PMEA.

Szczegółowy opis wynalazku

Macierzyste metoksyfosfonianowe analogi nukleotydowe stosowane w metodzie badania przesiewowego stanowią związki posiadające wzór A-OH2P(O)(OH)2, gdzie A stanowi resztę analogu nukleozydu. Związki te są znane per se i nie należą do obecnego wynalazku. W szczególności, związki macierzyste obejmują heterocykliczną zasadę B i aglikon E, o wzorze ogólnym ο

II

Β-Ε-Ρ-ΟΗ

I

OH w którym grupa B jest zdefiniowana poni ż ej, a grupa E został a zdefiniowana powyż ej. Przykł ady opisane zostały w amerykańskich dokumentach patentowych nr 4,659,825, 4,808,716, 4,724,233, 5,142,051, 5,130,427, 5,650,510, 5,663,159, 5,302,585, 5,476,938, 5,696,263, 5,744,600, 5,688,778, 5,386,030, 5,733,896, 5,352,786 i 5,798,340 oraz EP 821,690 i 654,037.

Proleki stosowane w opisanej powyżej metodzie badania przesiewowego stanowią kowalencyjnie modyfikowane analogi macierzystych metoksyfosfonianowych analogów nukleotydów opisane w poprzednim akapicie. Generalnie, atom fosforu leku macierzystego stanowi korzystne miejsce modyfikacji proleku, ale inne miejsca znajdują się w heterocyklicznej zasadzie B i aglikonie E. Wiele z tych proleków jest już znanych. Stanowią je przede wszystkim estry lub amidany atomu fosforu, ale obejmują również podstawienia zasady lub aglikonu. Żadna z tych modyfikacji nie stanowi części obecnego wynalazku per se i żadna nie może być uważana za ograniczenie zakresu wynalazku. Atom fosforu metoksyfosfonianu analogu nukleotydu ma dwie wartościowości umożliwiające kowalencyjne modyfikacje, takie jak amidowanie lub estryfikacja (chyba że jeden hydroksyl fosforytowy jest zestryfikowany podstawnikiem hydroksylowym aglikonu, wówczas tylko jedna wartościowość fosforu jest wolna do podstawienia). Estry zazwyczaj stanowią estry aryloksylowe. Amidany zazwyczaj stanowią naturalnie występujące monoaminokwasy posiadające wolną(e) grupę(y) karboksylową(e) zestryfikowaną(e) grupą alkilową lub arylową, zazwyczaj fenylową, cykloalkilową lub grupami tert-, n- lub s-alkilowymi. Proleki odpowiednie do stosowania w opisanej powyżej metodzie przesiewowej ujawnione są na przykład w amerykańskim dokumencie patentowym nr 5,798,340. Jednakże, dowolny prolek, potencjalnie uważany za zdolny do przekształcenia in vivo w obrębie komórek tkanki docelowej do wolnego macierzystego metoksyfosfonianowego analogu nukleotydu, na przykład w wyniku hydrolizy, utleniania lub innej transformacji kowalencyjnej będącej skutkiem ekspozycji w tkance biologicznej, należy uznać za odpowiedni do stosowania we wspomnianej metodzie. Proleki takie mogą nie być znane aktualnie, ale mogą zostać zidentyfikowane w przyszłości i w ten sposób stać się odpowiednimi kandydatami dostępnymi do testowania zgodnie z tą metodą. Ponieważ proleki są oczywistymi kandydatami do badania przesiewowego tą metodą, ich struktury nie mają znaczenia z punktu widzenia stosowania lub realizowania metody badania przesiewowego, jakkolwiek od ich struktur będzie ostatecznie zależeć, czy dany lek okaże się selektywny w tym teście.

Ugrupowania prolekowe przyłączone do leku macierzystego mogą być takie same lub różne. Jednakże, każdy prolek przewidziany do stosowania w teście przesiewowym będzie różnić się strukturalnie od innych leków mających podlegać badaniom. Różne, czyli odmienne strukturalnie proleki, wybiera się generalnie na podstawie albo ich stereochemii albo struktury kowalencyjnej, lub obu tych cech rozpatrywanych łącznie. Jednakże, każdy testowany prolek powinien być strukturalnie i stereochemicznie zasadniczo czysty, w przeciwnym przypadku wynik testu przesiewowego będzie mniej przydatny. Oczywiście możliwe jest testowanie w indywidualnym przypadku jedynie pojedynczego proleku, jakkolwiek zazwyczaj zwykle wyniki będą porównywane z wcześniejszymi badaniami innych proleków.

Stwierdziliśmy, ze stereochemia proleków może mieć wpływ na zwiększenie ilości związku w tkance docelowej. Centra chiralne występują przy atomie fosforu, mogą także znajdować się w podstawnikach. Na przykład, aminokwasy stosowane do otrzymywania amidanów mogą występować w postaci D lub L, a centra chiralne mogą również posiadać fosfonoestry lub estry aminokwasów. Centra chiralne znajdują się również na części analogu nukleozydowego cząsteczki, ale te zazwyczaj podyktowane są stereochemią leku macierzystego i nie mają wpływu na wynik testów przesiewowych. Na przykład izomer R PMPA jako bardziej aktywny jest korzystniejszy niż odpowiedni izomer S. Za8

PL 213 214 B1 zwyczaj te diastereoizomery lub enancjomery są chiralnie wzbogacone, jeśli nie czyste pod każdym względem, tak że rezultaty testu przesiewowego są bardziej znaczące. Jak wspomniano, zróżnicowanie stereoizomerów uzyskuje się przez wzbogacanie lub oczyszczanie stereoizomeru (w przypadku większości metoksyfosfonianowych analogów nukleotydów zazwyczaj jest to raczej diastereoizomer niż enancjomer), pozbawionego innych stereoizomerów na rzeczonym centrum chiralnym, tak ze każdy związek testowany jest zasadniczo homogeniczny. Za zasadniczo homogeniczny lub chiralnie wzbogacony uważa się związek, w którym pożądany stereoizomer stanowi więcej niż 60%, zazwyczaj więcej niż 80%, korzystnie więcej niż około 95% wagowych.

Nowa metoda badania przesiewowego

Po wyselekcjonowaniu przynajmniej jednego kandydata na prolek, stosuje się dalsze etapy opisanej metody badania przesiewowego dla zidentyfikowania proleku posiadającego wymaganą selektywność wobec tkanki docelowej. Najdogodniej, proleki znakuje się wykrywalnymi grupami, na przykład radioznakuje, w celu ułatwienia późniejszej detekcji w tkankach lub komórkach. Jednakże, znakowanie nie jest konieczne, ponieważ mogą być stosowane inne odpowiednie testy na obecność proleków lub ich metabolitów (w tym związków macierzystych). Testy te mogą obejmować na przykład spektrometrię masową, HPLC, testy biologiczne lub immunologiczne. Za pomocą testu może być oznaczany prolek, lub też jeden lub wszystkie jego metabolity, ale korzystnie badanie przeprowadza się w celu wykrycia jedynie rodzaju leku macierzystego. Opiera się to na założeniu (które nie w każ dym przypadku musi stanowić gwarancję ), ż e stopień i szybkość przekształ cenia proleku w aktywny przeciwwirusowo macierzysty difosofonian jest taka sama we wszystkich badanych tkankach. Inaczej, prowadzi się test na obecność difosfonianu.

Tkankę docelową w przypadku badania przesiewowego proleków użytecznych w terapii infekcji HIV korzystnie stanowić będzie tkanka limfatyczna. Tkanka Iimfatyczna jest znana specjalistom i obejmuje komórki CD4, limfocyty, wę z ł y chł onne, makrofagi i komórki podobne do makrofagów, w tym monocyty, takie jak monocyty komórek naczyń obwodowych (PBMC) i komórki glejowe. Tkanka Iimfatyczna obejmuje ponadto tkanki nie limfatyczne, które są wzbogacone w tkanki lub komórki limfatyczne, np. płuc, skóry czy śledziony. Inne cele dla innych leków przeciwwirusowych w pierwszym rzędzie stanowić będą miejsca replikacji lub utajenia poszczególnych omawianych wirusów, np. wątroba dla wirusów zapalenia wątroby i nerwy obwodowe dla HSV. Podobnie, tkanki docelowe dla nowotworów w istocie rzeczy będą stanowiły same guzy nowotworowe. Tkanki te są dobrze znane specjalistom i nie wymagają niepotrzebnego eksperymentowania w celu ich doboru. W przypadku badania przesiewowego pod kątem związków przeciwwirusowych, tkanka docelowa może być zainfekowana przez wirus.

Tkanki lub komórki nie docelowe również poddaje się badaniu przesiewowemu, stanowiącemu część opisanej metody. W tym kontekście może być stosowana dowolna liczba prób identyfikacji takich tkanek i komórek. Generalnie, jako tkanki nie docelowe będą stosowane tkanki, wobec których można oczekiwać toksycznego działania leku macierzystego. Wybór tkanki nie docelowej jest ściśle uzależniony od rodzaju proleku i aktywności związku macierzystego. Na przykład, dla proleków przeciw zapaleniu wątroby będą wybrane tkanki nie wątrobowe, a do badania przesiewowego proleku selektywnego przeciwnowotworowo będą służyć nie zmienione komórki tej samej tkanki co guz.

Należy zauważyć, że opisana metoda różni się od badań zazwyczaj podejmowanych w celu określenia doustnej biodostępności proleków. W badaniach biodostępności po podaniu doustnym, celem jest zidentyfikowanie proleku, który przechodzi do obiegu ogólnoustrojowego zasadniczo przekształcony w lek macierzysty. W obecnym wynalazku, celem jest znalezienie proleków, które nie są metabolizowane w układzie pokarmowym lub obwodowym. Zatem, tkanki docelowe mające podlegać ocenie opisaną metodą, generalnie nie obejmują jelita cienkiego, lub, jeśli tak, to obejmują dodatkowo tkanki inne niż jelito cienkie.

Tkanki docelowe i nie docelowe stosowane w opisanej metodzie przesiewowej zazwyczaj znajdują się w nie zmienionym organizmie żywym. Proleki zawierające estry najkorzystniej testuje się na psach, małpach i zwierzętach innych niż gryzonie; osocze myszy i szczurów zawiera wysokie poziomy esteraz obwodowych, które mogą powodować rezultaty wprowadzające w błąd, jeśli pożądany obiekt terapeutyczny stanowi człowiek lub wyższy ssak.

Nie ma konieczności próbowania tej metody na zwierzętach zdrowych. W zakresie wynalazku pozostaje także stosowanie organów poddanych perfuzji, hodowli i organów in vitro (np. przeszczepów skórnych) lub linii komórkowych pozostających w różnych formach hodowli tkankowej, np. obracanych butelek lub zawiesin w stanie nieważkości. Na przykład, komórki MT-2, można stosować jako

PL 213 214 B1 tkankę docelową do selekcji proleków przeciw HIV. Zatem, określenie „tkanka nie jest skonstruowane jako wymagające zorganizowanej struktury komórkowej bądź struktur tkankowych, jakie mogą występować w przyrodzie, jakkolwiek takie będą preferowane. Określenie „tkanka będzie raczej konstruowane jako synonim komórek ze specyficznego źródła, pochodzenia lub stadium zróżnicowania.

Tkanka docelowa i tkanka nie docelowa może w rzeczywistości stanowić tę samą tkankę, ale o różnym statusie biologicznym. Na przykład, opisana metoda mogłaby być stosowana do selekcji proleków zapewniających aktywność w tkankach zainfekowanych wirusem (tkanka docelowa), ale pozostających zasadniczo nieaktywnymi w komórkach nie zainfekowanych wirusem (odpowiednia tkanka nie docelowa). Ta sama strategia będzie miała zastosowanie do selekcji proleków profilaktycznych, czyli proleków metabolizowanych do form aktywnych przeciwwirusowo, związanych z infekcją wirusową, ale zasadniczo nie ulegających metabolizmowi w tkankach nie zainfekowanych. Podobnie, proleki mogłyby być poddawane badaniom przesiewowym w komórkach zmienionych i odpowiadającej im tkance nie zmienionej. Byłoby to szczególnie przydatne w testach porównawczych mających na celu wyselekcjonowanie proleków do terapii nowotworów złośliwych hematologicznych, np. białaczek.

Nie ograniczając się do żadnej konkretnej teorii działania, za proleki selektywne tkankowo uważa się proleki wchłaniane przez komórki docelowe i/lub metabolizowane w komórkach selektywnie w stosunku do innych komórek lub tkanek. Ta wyją tkowa zaleta obecnych proleków metoksyfosfonianowych polega na tym, że ich metabolizm przy pH fizjologicznym do dianionu gwarantuje, iż nie będą w stanie dyfundować z powrotem na zewną trz komórki. W ten sposób pozostają one skuteczne przez dłuższy okres czasu i utrzymują się w podwyższonych stężeniach wewnątrz komórek, tym samym wykazując większą moc. Mechanizm większej aktywności w tkance docelowej przypisuje się wzmożonemu wychwytowi przez komórki docelowe, zwiększonej retencji wewnątrzkomórkowej lub współdziałaniu obu tych mechanizmów. Jednakże sposób, w jaki selektywność lub nasilone dostarczanie objawia się w tkance docelowej nie ma znaczenia. Nie jest także istotne, aby wszystkie przekształcenia metaboliczne proleku w związek macierzysty zachodziły w tkance docelowej. Jedynie przekształcenie manifestujące się aktywnością leku końcowego powinno zachodzić w tkance docelowej; metabolizm w innych tkankach moż e zapewniać zwią zki poś rednie ostatecznie przekształ cane w formy przeciwwirusowe w tkance docelowej.

Wymagany stopień selektywności lub nasilenia dostarczania będzie się różnić w zależności od związku macierzystego i sposobu, w jaki jest mierzony (% dystrybucji dawki czy stężenia leku macierzystego). Generalnie, jeśli lek macierzysty już posiada bardzo dobre okno terapeutyczne, dla pożądanego proleku wystarczający może być niski stopień selektywności. Z drugiej strony, związki toksyczne mogą wymagać dla identyfikacji selektywnych proleków bardziej intensywnego badania przesiewowego. Stosunkowo wysoki koszt opisanej metody może być zredukowany przez ograniczenie badania przesiewowego jedynie do tkanki docelowej i tkanek, wobec których znane jest względne toksyczne działanie leku macierzystego, np. w przypadku PMEA, który jest nefrotoksyczny w wyższych dawkach, uwaga będzie koncentrować się na nerkach i tkance Iimfatycznej.

Oznaczenia względnej aktywności przeciwirusowej proleku w wybranych tkankach zazwyczaj dokonuje się badając tkankę docelową i nie docelową pod kątem występowania lub aktywności względnej metabolitu proleku znanego z jej posiadania albo ulegającego przekształceniu w metabolit posiadający aktywność przeciwwirusową lub przeciwnowotworową. I tak, zazwyczaj określa się ilość względną leku macierzystego w tkankach w tym samym czasie w celu zidentyfikowania proleków, które są korzystnie metabolizowane w tkance docelowej w metabolit o aktywności przeciwwirusowej lub przeciwnowotworowej lub jego prekursor, który w tkance docelowej niezawodnie wytwarza aktywny metabolit. W przypadku związków przeciwwirusowych, aktywny metabolit stanowi difosofonianowy lub fosfonianowy związek macierzysty. Jest to metabolit, który wnika do kwasu nukleinowego wirusa, przecinając wydłużającą się nić kwasu nukleinowego i powstrzymując replikację wirusa. Metabolity proleku mogą stanowić metabolity anaboliczne, metabolity kataboliczne lub produkty anabolizmu i katabolizmu jednocześ nie. Sposób, w jaki wytwarzany jest metabolit nie jest istotny dla praktycznego stosowania opisanej metody.

Opisana metoda me ogranicza się do badania metabolitu, który posiada aktywność przeciwwirusową lub przeciwnowotworową per se. Zamiast tego można oznaczać nieaktywne prekursory aktywnych metabolitów. Prekursory przeciwwirusowo aktywnych metabolitów difosfonianów obejmują monofosfoniany leku macierzystego, monofosfoniany innych metabolitów leku macierzystego (np. pośrednie modyfikacje podstawnika zasady heterocyklicznej), związek macierzysty per se oraz metabolity generowane przez komórkę przy przekształcaniu proleku w związek macierzysty przed

PL 213 214 B1 fosforylacją. Struktury prekursorów mogą się znacznie różnić, jako że stanowią one rezultat metabolizmu komórkowego. Jednakże, informacja ta jest już znana lub może być łatwo dostępna dla specjalisty.

Jeśli badany prolek nie wykazuje aktywności przeciwwirusowej lub przeciwnowotworowej per se, może być potrzebne dostosowanie nie obrobionych rezultatów wyników oznaczeń. Na przykład, jeśli przekształcenie wewnątrzkomórkowe metabolitu nieaktywnego w metabolit aktywny zachodzi z róż n ą szybkoś cią w róż nych tkankach podlegają cych badaniu, nie obrobione rezultaty oznaczenia dla metabolitu nieaktywnego należy skorygować tak aby uwzględnić różnice pomiędzy rodzajami komórek, ponieważ odpowiedni parametr stanowi powstawanie aktywności w komórce docelowej, a nie gromadzenie się metabolitu nieaktywnego. Jednakże, określenie odpowiedniej poprawki pozostawia się specjalistom. Zatem, jeśli w etapie (d) opisanej metody potrzebne jest określenie aktywności, aktywność albo można mierzyć bezpośrednio, albo ekstrapolować. Nie oznacza to, że opisana metoda ograniczona jest jedynie do badania związków pośrednich, które są aktywne per se. Na przykład, może być również oceniana nieobecność lub spadek ilości proleku w tkance badanej. Etap (d) wymaga jedynie oceny aktywności wykazywanej przez prolek gdy oddziałuje on z omawianą tkanką, i może być ona oparta na ekstrapolacji lub innym pomiarze pośrednim.

Etap (d) opisanej metody wymaga określenia aktywności „względnej proleku. Zrozumiałe, że nie oznacza to wymagania, aby każde oznaczenie albo seria oznaczeń koniecznie obejmowała również eksperymenty z wybraną tkanką nie docelową. Przeciwnie, możliwe jest wykorzystanie historycznych badań kontrolnych tkanki docelowej i nie docelowej, lub algorytmów przedstawiających rezultaty oczekiwane od tkanek nie docelowych, w celu dostarczenia dowodów na aktywność nie docelową.

Rezultaty uzyskane w etapie (d) są następnie w optymalny sposób wykorzystywane do selekcjonowania lub identyfikacji proleku, który daje większą aktywność przeciwwirusową w tkance docelowej niż w tkance nie docelowej. Jest to prolek wybrany do dalszego opracowywania.

Jest jasne, że przed praktycznym zastosowaniem opisanej metody może być podejmowana wstępna ocena kandydatów na proleki. Na przykład, prolek powinien spełniać wymaganie przejścia w stanie zasadniczo nie zmetabolizowanym przez układ żołądkowo-jelitowy, zachowywać stabilność we krwi, a także posiadać w przynajmniej pewnym stopniu zdolność przenikania błony komórkowej. W większości przypadków powinien także spełniać warunek pierwszego przejścia w obiegu wątrobowym bez zasadniczego metabolizmu. Takie badania wstępne są fakultatywne i dobrze znane specjalistom.

Te same rozważania jak opisane powyżej dla aktywności przeciwwirusowej stosuje się także do przeciwnowotworowych metoksyfosfonianowych proleków analogów nukleotydowych. Obejmują one na przykład proleki PMEG, guanylowego analogu PMEA. W tym przypadku cytotoksyczne fosfoniany, takie jak PMEG, stanowią cennych kandydatów do monitorowania, jako że ich cytotoksyczność w rzeczywistoś ci konkuruje z aktywnoś cią przeciwnowotworową .

Związek zidentyfikowany opisaną metodą przesiewową może być następnie poddany tradycyjnym programom badań przedklinicznych i klinicznych, mających potwierdzić spełnienie stawianych mu wymagań. Zazwyczaj lek jest uważany za selektywny, jeśli aktywność lub stężenie leku macierzystego w tkance docelowej (% dystrybucji dawki) jest wyż sze niż 2 razy, korzystnie 5 razy od związku macierzystego w tkance nie docelowej. Alternatywnie, kandydat na prolek może być porównywany z ustalonym prolekiem. W tym przypadku, selektywność jest raczej wzglę dna niż absolutna. Proleki selektywne będą stanowić te, które wykazują stężenie lub aktywność 10 razy wyższą w tkance docelowej w porównaniu z prototypem, jakkolwiek stopień selektywności jest sprawą uznania.

Nowa metoda wytwarzania związków wyjściowych lub pośrednich

Korzystne związki wyjściowe (leki macierzyste) według wynalazku, PMEA i (R)-PMPA mogą być ogólnie wytwarzane sposobem obejmującym reakcję 9-(2-hydroksypropylo)adeniny (HPA) lub 9-(2-hydroksyetylo)adeniny (HEA) z alkoholanem magnezu, następnie dodanie zabezpieczonego syntonu p-tolueno-sulfonyloksymetylofosfonianu (tosylanu) aglikonu do mieszaniny reakcyjnej, i wyodrębnienie odpowiednio PMPA lub PMEA,

Korzystnie HPA stanowi wzbogacony lub wyodrębniony izomer R. Jeśli stosuje się mieszaninę chiralną HPA, R-PMPA może być wyodrębniony z mieszaniny chiralnego PMPA po zakończeniu syntezy.

Zazwyczaj tosylan zabezpieczony jest niższymi grupami alkilowymi, ale specjalistom znane są inne odpowiednie grupy. Może być wygodne stosowanie tosylanu wstępnie zabezpieczonego podstawnikami proleku fosfonianu, które mogą działać jako grupy zabezpieczające w reakcji tosylowania, w ten sposób umoż liwiają c w jednym przejś ciu przeprowadzenie etapu odbezpieczania i bezpoś redniego wyodrębnienia proleku lub jego związku pośredniego.

PL 213 214 B1

Grupa alkilowa alkoholanu magnezu nie jest decydująca i może stanowić dowolny prosty lub rozgałęziony alkil C1-C6, ale korzystnie stanowi ją tert-butyl (dla PMPA) lub izopropyl (dla PMEA). Warunki reakcji również nie są decydujące, ale korzystnie obejmują ogrzewanie mieszaniny reakcyjnej w temp. ok. 70-75°C podczas mieszania lub innego umiarkowanego poruszania.

Jeśli nie jest istotne zachowanie podstawników fosfonianowych, produkt poddaje się odbezpieczeniu (zazwyczaj za pomocą bromotrimetylosilanu, gdy grupę zabezpieczającą tosylan stanowi alkil), a następnie produkt wyodrębnia się przez krystalizację lub inną tradycyjną metodą znaną specjalistom.

Zasada heterocykliczna

W związkach według wynalazku oznaczonych wzorami (3) i (4), heterocykliczna zasada B stanowi grupę

B może wystę pować w postaci zabezpieczonej i nie zabezpieczonej. Grupy zabezpieczające dla amin egzocyklicznych i innych grup Iabilnych są znane (Greene i in., „Protective Groups in Organic Syntehesis'') i obejmują N-benzoil, izobutyryl, 4,4'-dimetoksytrytyl (DMT) i podobne. Wybór grup ochronnych jest oczywisty dla specjalisty i będzie zależeć od rodzaju grupy Iabilnej i rodzaju reakcji chemicznej, w jakiej grupa ma być użyta, tzn. od warunków kwaśnych, zasadowych, utleniających, redukujących czy innych.

Przykłady grup zabezpieczających stanowią N⁴-benzoilocytozyna, N⁶-benoziloadenina, N²-izobutyryloguanina i inne.

Grupy E reprezentują aglikony stosowane w metoksyfosfonianowych analogach nukleotydów. Grupa E stanowi -CH2CH(CH3)-. Ponadto korzystnie jest, aby grupy boczne na centrach chiralnych w aglikonie wystę pował y zasadniczo w konfiguracji R (z wyją tkiem hydroksymetylu, który stanowi wzbogacony enacjomer (S)).

R² stanowi resztę aminokwasu, ewentualnie zakładając, że dowolna grupa karboksy połączona z azotem amidanowym przez mniej ni ż 5 atomów jest zestryfikowana. R² zazwyczaj posiada strukturę

gdzie n stanowi 1 albo 2;

R¹¹ stanowi R⁶ lub H; korzystnie R⁶=C3-C9-aIkiI; C3-C9-alkil podstawiony niezależnie przez OH, halogen, O lub N; C3-C6-aryl, który jest niezależnie podstawiony przez OH, halogen, O lub N; lub C3-C6-arylalkil, który jest niezależnie podstawiony przez OH, halogen, O lub N;

R¹² niezależnie stanowi H lub C1-C9-alkil, który jest nie podstawiony lub podstawiony przez podstawniki niezależnie wybrane z grupy składającej się z OH, O, N, COOR¹¹ i halogen; C3-C6,-aryl, który jest nie podstawiony lub podstawiony przez podstawniki niezależnie wybrane z grupy składającej się z OH, O, N, COOR¹¹ i halogen lub C3-C6-arylo-alkil, który jest nie podstawiony lub podstawiony przez podstawniki niezależnie wybrane z grupy składającej się z OH, O, N, COOR¹¹ i halogenu;

R¹³ niezależnie oznacza C(O)-OR¹¹; amino; amido; guanidynylo; imidazolilo; indolilo; sulfotlenek; fosforylo; C1-C3-alkilamino; C1-C3-alkildiamino; C1-C6-alkenyloamino; hydroksy; tiol; C1-C3-alkoksy; C1-C3-alkiltiol; (CH2)nCOOR¹¹; C1-C6-alkill, który jest nie podstawiony lub podstawiony przez OH, halogen, SH, NH, fenyl, hydroksyfenyl lub C7-C10-alkoksyfenyl; C2-C6-alkenyl, który jest nie podstawiony lub podstawiony przez OH, halo, SH, NH, fenyl, hydroksyfenyl; a

PL 213 214 B1

R¹⁴ oznacza H lub C1-C9-alkil lub C1-C9-alkil niezależnie podstawiony przez OH, halogen, COOR¹¹, O lub N; C3-C6-aryl; C3-C6-aryl, który jest niezależnie podstawiony przez OH, halogen, COOR¹¹, O lub N; lub C3-C6-aryloalkil, który jest niezależnie podstawiony przez OH, halogen, COOR¹¹, O lub N.

R¹¹ korzystnie stanowi C1-C6-alkil, szczególnie korzystnie izopropyl, R¹³ stanowi łańcuch boczny naturalnie występujących aminokwasów, n=1, R¹² stanowi H, i R¹⁴ stanowi H. W związku o wzorze (2), wynalazek obejmuje metabolity, w których estry fenoksylowy i izopropylowy uległy hydrolizie do -OH. Podobnie, w zakresie wynalazku pozostają deestryfikowane wzbogacone metabolity fosfonoamidanowe o wzorach (5a), (5b) i 6.

Aryl i podstawienie przez „O^” lub „N^” są określone w kolumnie 16, wiersze 42-58, US 5,798,340.

Zazwyczaj, aminokwasy stanowią aminokwasy występujące w przyrodzie albo L-aminokwasy. Odpowiednie konkretne przykłady są zebrane w US 5,798,340, na przykład w Tabeli 4 i jej kolumnach 8-10.

Alkil, jeśli nie powiedziano inaczej, stanowi węglowodór prosty, drugorzędowy, trzeciorzędowy lub cykliczny węglowodór. Jeśli nie powiedziano inaczej, alkil stanowi C1-C12. Przykłady obejmują -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, -CH(CH3)2, -CH2CH2CH2CH3, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2CH3, -C(CH3)3, -CH2CH2CH2CH2CH3, -CH(CH3)CH2CH2CH3, -CH(CH2CH3)2, -C(CH3)CH2CH3, -CH(CH3)CH(CH3)2, -CH2CH2CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)CH2CH3, -CH2CH2CH2CH2CH2CH3, -CH(CH3)CH2CH2CH2CH3, -CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3), C(CH3)2CH2CH2CH3, -CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3, -C(CH3)CH(CH2CH3)2, -CH(CH2CH3)CH(CH3)2, -C(CH3)2CH(CH3)2 i -CH(CH3)C(CH3)3. Alkenyl i alkinyl są definiowane w ten sam sposób, ale zawierają odpowiednio co najmniej jedno wiązanie podwójne lub potrójne.

Jeśli ujawnione są grupy enolowe lub ketonowe, można również konstruować odpowiednie tautomery.

Proleki według wynalazku występują w postaci wolnej zasady lub różnych soli wymienionych w US 5,798,340 i przed użyciem jako leki są preparowane z różnymi farmaceutycznie dopuszczalnymi substancjami pomocniczymi lub solwatującymi rozcieńczalnikami, także zebranymi w US 5,798,340. Proleki te mają własności przeciwwirusowe i użytkowe już ustalone dla leków macierzystych (porównaj US 5,798,340 i inne odnośniki odnoszące się do metoksyfosfonianów analogów nukleotydowych). Należy rozumieć, że diastereoizomer o wzorze (4) jest przydatny co najmniej jako związek pośredni w syntezie chemicznej leku macierzystego przez hydrolizę in vivo, niezależ nie od jego stosunkowo nie selektywnego charakteru ujawnionego w dalszych badaniach.

Wynalazek zostanie dokładniej objaśniony w odniesieniu do następujących przykładów.

P r z y k ł a d 1a

Przekształcenie adeniny w PMEA przy użyciu izopropanolanu magnezu.

Do zawiesiny adeniny (16,8 g, 0,124 mola) w DMF (41,9 ml) dodano węglan etylenu (12,1 g, 0,137 mola) i wodorotlenek sodu (100 g, 0,0025 mola). Mieszaniną ogrzewano przez noc w temp. 130°C. Całość ochłodzono do temp. poniżej 50°C i dodano toluenu (62,1 ml). Zawiesinę chłodzono w ciągu 2 godzin do temp. 5°C, odsączono i przemyto toluenem (2x). Wilgotny osad suszono pod próżnią w 65°C, uzyskując 20,0 g (90%) 9-(2-hydroksyetylo)adeniny w postaci białego proszku. T.t. 238-240°C.

9-(2-Hydroksyetylo)adeninę (HEA) (20,0 g, 0,112 mola) przeprowadzono w zawiesinie w DMF (125 ml) i ogrzano do 80°C. Do mieszaniny dodawano izopropanolan magnezu (11,2 g, 0,0784 mola)

PL 213 214 B1 lub alternatywnie t-butanolan magnezu, a następnie w ciągu godziny p-toluenosulfonyloksymetylofosfonian dietylu (66,0 g, 0,162 mola). Mieszaninę mieszano w temp, 80°C przez 7 godzin. Oddestylowano pod próżnią 30 ml składników lotnych i uzupełniono objętość reakcyjną, dodając 30 ml świeżego DMF. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej, dodano bromotrimetylosilan (69,6 g, 0,450 mola) i mieszaninę ogrzewano do temp. 80°C w ciągu 6 godzin. Całość zatężono, uzyskując gęstą żywicę. Żywicę rozpuszczono w 360 ml wody, ekstrahowano 120 ml dichlorometanu, zobojętniono do pH 3,2 za pomocą wodorotlenku sodu i otrzymaną zawiesinę mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Zawiesinę schłodzono w ciągu godziny do temp. 4°C, Odsączono osad, przemyto wodą (2x) i suszono pod próżnią w temp. 56°C, otrzymując 20 g (65,4%) 9-[2-(fosfonometoksy)etylo]adeniny (PMEA) w postaci białego osadu. T.t.>200°C (rozkł.). ¹H-NMR (D2O): 3,49 (t, 2H); 3,94 (t, 2H); 4,39 (t, 2H); 8,13 (s, 1H); 8,22 (s, 1H).

Przekształcenie adeniny w PMPA przy użyciu t-butanolanu magnezu

Do zawiesiny adeniny (40 g, 0,296 mola) w DMF (41,9 ml) dodano węglan (R)- propylenu (34,5 g, 0,338 mola) i wodorotlenek sodu (0,480 g, 0,012 mola). Mieszaninę ogrzewano w temp. 130°C przez noc. Całość ochłodzono do 100°C i dodano toluen (138 ml), a następnie kwas metanosulfonowy (4,7 g, 0,049 mola), utrzymując temperaturę reakcji w granicach 100-110°C. Dodano dodatkową ilość toluenu (114 ml) do utworzenia homogenicznego roztworu. Roztwór schłodzono w ciągu 7 godzin do 3°C, po czym utrzymywano w temp. 3°C przez godzinę. Otrzymany osad odsączono i przemyto acetonem (2x). Wilgotny osad wysuszono pod próżnią w temp. 80°C, otrzymując 42,6 g (75%) (R)-9-[2-(hydroksy)propylo]adeniny (HPA) w postaci białego proszku. T.t. 188-190°C.

(R)-9-[2-(hydroksy)propylo]adeninę (HPA) (20,0 g, 0,104 mola) przeprowadzono w zawiesinę w DMF (44,5 ml) i ogrzewano do 65°C. Do mieszaniny w ciągu godziny dodawano t-butanolan magnezu (14,2 g, 0,083 mola) lub alternatywnie izopropanolan magnezu, a następnie przez 2 godziny p-toluenosulfonyloksymetylofosfonian dietylu (66,0 g, 0,205 mola), utrzymując temperaturę 78°C. Mieszaninę mieszano w temp. 75°C przez 4 godziny. Po schłodzeniu do temp, poniżej 50°C, dodano bromotrimetylosilan (73,9 g, 0,478 mola) i mieszaninę ogrzewano przez 3 godziny w temp. 77°C. Po zakończeniu, mieszaninę ogrzano do 80°C i oddestylowano pod normalnym ciśnieniem składniki lotne. Pozostałość rozpuszczono w wodzie (120 ml) w temp. 50°C, po czym ekstrahowano octanem etylu (101 ml). pH fazy wodnej doprowadzono do wartości 1,1 za pomocą wodorotlenku sodu, zaszczepiono oryginalnym (R)-PMPA, po czym ponownie nastawiono pH fazy wodnej na 2,1 za pomocą wodorotlenku sodu. Otrzymaną zawiesinę mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Zawiesinę schłodzono w ciągu 3 godzin do temp. 4°C Osad odsączono, przemyto wodą (60 ml) i suszono pod próżnią w temp. 50°C, otrzymując 18,9 g (63,5%) surowej (R)-9-[2-(fosfonometoksy)propyIo]adeniny (PMPA) w postaci białego proszku.

Surową (R)-9-[2-(fosfonometoksy)propylo]adeninę ogrzewano w wodzie (255 ml) w temperaturze wrzenia do rozpuszczenia proszku. Roztwór schłodzono w ciągu 4 godzin do temperatury pokojowej. Otrzymaną zawiesinę schłodzono w ciągu 3 godzin do temp. 4°C. Osad odsączono,

PL 213 214 B1 przemyto wodą (56 ml) i acetonem (56 ml) i suszono pod próżnią w temp. 50°C, uzyskując 15,0 g (50,4%) (R)-9-[2-(fosfonometoksy)propylo]adeniny (PMPA) w postaci białego proszku. T.t. 278-280°C.

P r z y k ł a d 2

(9,6 kg, 102 mola) i 1-metylo-2-pirolidonem (39 kg). Mieszaninę ogrzano do temp. 85°C, dodano trietyloaminę (6,3 kg, 62,3 mola). W ciągu 6 godzin w temp. 100°C dodano roztwór 1,3-dicykloheksylokarbodiimidu (17,1 kg, 82,9 mola) w 1-metylo-2-pirolidynonie (1,6 kg). Ogrzewanie kontynuowano przez 16 godzin. Mieszaninę schłodzono do temp. 45°C, dodano wodę (29 kg) i schłodzono do 25°C. Osad odsączono i przemyto wodą (15,3 kg). Połączone przesącz i roztwór z przemycia zatężono pod próżnią, uzyskując brązowawą zawiesinę, dodano wody (24,6 kg) i doprowadzono pH do wartości 11 za pomocą NaOH (25% roztwór wodny). Drobny osad usunięto przez filtrację przez ziemię okrzemkową (2 kg), a następnie przemyto wodą (4,4 kg). Połączony przesącz i roztwór z przemycia ekstrahowano octanem etylu (28 kg). pH roztworu wodnego doprowadzono do wartości 3,1 za pomocą HCI (37% roztwór wodny) (4 kg). Surowy wilgotny osad II przekształcono w zawiesinę w metanolu (58 kg). Osad odsączono, przemyto metanolem (8,5 kg) i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując 9,33 kg II w postaci białego proszku. ¹H-NMR (D2O), δ: 1,2 (d, 3H); 3,45 (q, 2H); 3,7 (q, 2H);

PL 213 214 B1 (m., 2H); 4,2 (q, 2H); 4,35 (dd, 2H); 6,6 d, 2H); 7 (t, 1H); 7,15 (t, 2H); 8,15 (s, 1H); 8,2 (s, 1H);

³¹P-NMR (D2O), δ: 15,0 (rozprzężenie) GS-7171 (III) (Schemat 1).

Wyłożony szkłem reaktor napełniono monofenylo-PMPA, (II), (9,12 kg, 25,1 mola) i acetonitrylem (30,7 kg). W temp. poniżej 50°C dodano chlorku tionylu (6,57 kg, 56,7 mola). Mieszaninę ogrzewano w temp. 75°C aż do rozpuszczenia osadu. Temperaturę reakcji podniesiono do 80°C i składniki lotne oddestylowano pod normalnym ciśnieniem (11,4°C) pod poduszką azotu. Pozostałość schłodzono do temp. 25°C, dodano dichlorometan (41 kg) i schłodzono do temp. -29°C. W ciągu 60 minut przy temp. -18°C dodano roztwór estru izopropylowego (L)-alaniny (7,1 kg, 54,4 mola) w dichlorometanie, a nastę pnie w cią gu 30 minut przy temp. -18°C do -11°C trietyloaminę (7,66 kg, 75,7 mola). Mieszaninę reakcyjną ogrzano do temperatury pokojowej i przemyto pięciokrotnie roztworem diwodorofosforanu sodu (10% roztwór wodny, 15,7 kg każde przemycie). Roztwór organiczny wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu (18,2 kg), odsączono, przemyto dichlorometanem (28 kg) i zatężono pod próżnią otrzymując olej. Do oleju dodano acetonu (20 kg) i mieszaninę zatężano pod zmniejszonym ciśnieniem. Do uzyskanego oleju dodano acetonu (18,8 kg). Połowę roztworu produktu oczyszczano chromatograficznie na złożu 38 x 38 cm, 22 kg żelu krzemionkowego 60, 230 do 400 mesh. Kolumnę eluowano 480 kg acetonu. Oczyszczanie powtórzono z drugą połową oleju, stosując świeży żel krzemionkowy i aceton. Do oleju dodano acetonitrylu (19,6 kg) i mieszaninę zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Dodano acetonitrylu (66,4 kg) i roztwór chłodzono w ciągu 16 godzin w temp. 0°C do -5°C. Osad odsączono i zatężono przesącz pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując 5,6 kg III w postaci ciemnego oleju: ¹H-NMR (CDCI3), δ: 1,1 (m., 12H); 3,7 (m., 1H); 4,0 (m., 5H); 4,2 (m., 1H); 5,0 (m., 1H); 6,2 (s, 2H); 7,05 (m., 5H); 8,0 (s, 1H); 8,25 (d, 1H); ³¹P-NMR (CDCI3), δ: 21,0; 22,5 (rozprzężenie).

Okrągłodenną kolbę zaopatrzoną w chłodnicę zwrotną i wlot azotu umieszczono na łaźni olejowej o temp. 70°C. Kolbę napełniono bezwodnym PMPA (I) (19,2 g, 67 mmoli), N,N-dimetylo-formamidem (0,29 g, 3,3 mola) i sulfonem tetrametylenu (40 ml). W ciągu 4 godzin dodawano chlorek tionylu (14,2 g, 119 mmola). W tym samym czasie temperaturę podwyższono do 100°C. Otrzymano jednorodny roztwór. Do roztworu w ciągu 5 minut dodano fenoksytrimetylosilan (11,7 g, 700 mmoli). Ogrzewanie na łaźni olejowej w temp. 100°C kontynuowano przez kolejne 2 godziny. Mieszaninę reakcyjną wylano do energicznie mieszanego acetonu (400 ml), chłodząc do temp. 0 C. Osad odsączono, wysuszono pod obniżonym ciśnieniem i rozpuszczono w metanolu (75 ml). pH roztworu doprowadzono do wartości 3,0 za pomocą roztworu wodorotlenku

PL 213 214 B1 sodu (45% roztw. wodny), chłodząc na łaźni woda/lód. Otrzymany osad odsączono, przemyto metanolem i suszono pod obniżonym ciśnieniem, otrzymując 20,4 g II (Schemat 2) w postaci białego proszku.

GS-7171 (III).

MonofenyIo-PMPA (II) (3 g, 8,3 mmola), sulfon tetrametylenu (5 ml) i N,N-dimetyloformamid (1 kropla) mieszano razem w okrągłodennej kolbie na łaźni olejowej o temp. 40°C. Dodano chlorek tionylu (1,96 g, 16,5 mmola). Po 20 minutach klarowny roztwór usunięto z łaźni, rozcieńczono dichlorometanem (10 ml), i dodano do roztworu estru izopropylowego (L)-alaniny (5 g, 33 mole) i diizopropyloetyloaminy (5,33 g, 41 mmola) w dichlorometanie (20 ml) o temp. -10°C. Mieszaninę reakcyjną ogrzano do temperatury pokojowej i przemyto trzykrotnie roztworem diwodorofosforanu sodu (10% roztw. wodny, 10 ml każde przemycie). Roztwór organiczny wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i zatężono pod obniżonym ciśnieniem, otrzymując olej. Olej wymieszano z kwasem fumarowym (0,77 g, 6,6 mmola) i acetonitrylem (40 ml) i ogrzewano do wrzenia, aż uzyskano klarowny roztwór. Roztwór schłodzono na łaźni z lodem i osad odsączono. Stałą sól fumaranową GS-7171 wysuszono pod obniżonym ciśnieniem, uzyskując 3,7 g produktu. Sól (3,16 g, 5,3 mmola) przeprowadzono w zawiesinę w dichlorometanie (30 ml) i mieszano z roztworem wę glanu potasu (5 ml, 2,5 M. w wodzie), aż do rozpuszczenia osadu. Warstwę organiczną oddzielono, po czym przemyto wodą (5 ml), wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i zatężono pod obniżonym ciśnieniem, uzyskując 2,4 g III w postaci brązowawej pianki.

P r z y k ł a d 3

A. Rozdział diastereoizomerów przez periodyczną chromatografię elucyjną

Diastereoizomery GS-7171 (III) rozdzielano metodą periodycznej chromatografii elucyjnej, stosując dostępne w handlu zabezpieczone kolumny półpreparatywne Chiralpak AS, 20 μm., 21 x 50 mm. ChiraIpak® AS stanowi zastrzeżone wypełnienie produkowane przez Diacel, sprzedawane w Ameryce Północnej przez Chiral Technologies, Inc. (amerykańskie dokumenty patentowe nr 5,202,433, RE 35,919, 5,434,298, 5,434,299 i 5,498,752), Chiralpak AS stanowi chiralną fazę stacjonarną (CSP) składającą się z amylozo-tris[(S)-a-metylobenzylokarbaminianu], naniesionego na nośnik żelu krzemionkowego.

Mieszaninę diastereoizomerów GS-7171 rozpuszczano w fazie ruchomej i do układu chromatograficznego podawano za pomocą pompki porcje po ok. 1 g GS-7171. Diastereoizomer niepożądany, oznaczony GS-7339, stanowił pierwszy główny szeroki pik (czas wymywania ok. 15 min) wymywany z kolumny. Po zakończeniu wymywania piku GS-7339, fazę ruchomą natychmiast zmieniano na 100% alkohol metylowy, który powodował wymycie diasteroizomeru pożądanego, oznaczonego jako GS-7340, w postaci ostrego piku z kolumny na czele rozpuszczalnika alkoholu metylowego. Alkohol metylowy stosowano do skrócenia czasu pełnego cyklu. Po pierwszej parze iniekcji, odbierano obydwa diastereoizomery jako pojedyncze duże frakcje zawierające jeden z oczyszczonych diastereoizomerów (>99,0% pojedynczego diasteroizomeru). Rozpuszczalniki fazy ruchomej usuwano pod próżnią, otrzymując oczyszczony diastereoizomer w postaci kruchej pianki.

Rozdzieleniu na dwie frakcje diastereoizomerów uległo ok. 95% wyjściowej ilości GS-7171. Frakcja GS-7340 stanowiła około 50% całkowitej uzyskanej ilości.

Warunki chromatograficzne były następujące:

Faza ruchoma (początkowa): GS-7171 - acetonitryl: alkohol izopropylowy (90:10) (końcowa): alkohol metylowy 100% przepływ: 10 ml/min czas przebiegu: ok. 45 minut detekcja: UV przy 275 nm temperatura: otoczenia profil elucji: GS-7339 (diastereoizomer B)

GS-7340 (diastereoizomer A; (IV))

B. Rozdział diastereoizomerów GS-7171 przez chromatografię SMB

Opis ogólny chromatografii z symulowanym złożem ruchomym (SMB) znajduje się w Strube i in., „Organic Process Research and Developement 2:305-319 (1998).

GS-7340 (IV), GS-7171 (III), 2,8 kg, oczyszczano metodą chromatografii z symulowanym złożem ruchomym z wypełnieniem 10 x 5 cm (Chiral Technologies Inc., 20 μ Chiralpak AS naniesiony na żel krzemionkowy) (1,2 kg). Kolumny eluowano 30% metanolu w acetonitrylu (2,48 kg). W trakcie przechowywania roztwór z acetonitrylem ulegał zestaleniu do wilgotnej krystalicznej masy. Krystaliczną masę suszono pod obniżonym ciśnieniem, otrzymując brązowawy krystaliczny proszek, 1,301 kg IV, czystość diasteroizomeryczna 98,7%: t.t. 117-120°C, ¹H-NMR (CDCI3) δ: 1,15 (m., 12H); 3,7 (t, 1H); 4,0 (m., 5H); 4,2 (dd, 1H); 5,0 (m., 1H); 6,05 (s, 2H); 7,1 (m., 5H); 8,0 (s, 1H); 8,2 (s, 1H); ³¹P-NMR (CDCI3) δ: 21,0 (rozprzężenie).

PL 213 214 B1

C. Rozdział diastereoizomerów przez C18 RP-HPLC W celu rozdzielenia diastereoizomerów, GS-7171 poddawano chromatografii HPLC w odwróconym układzie faz, zgodnie z następującym protokołem:

Kolumna chromatograficzna: Phenomenex Luna™ C18(2), 5 μm., wielkość porów 100 A (Phenomenex, Torrance, CA) lub równoważna

Kolumna zabezpieczona: Pellicular C18 (Alltech, deerfield, IL) lub równoważna

Faza ruchoma: A - 0,02% (85%) H3PO4 w mieszaninie woda:acetonitryl (95:5)

B - 0,02% (85%) H3PO4 w mieszaninie woda:acetonitryl (50:50)

Gradient fazy ruchomej:

Czas	% fazy ruchomej	% fazy ruchomej
0	100	0
5	100	0
7	70	30
32	70	30
40	0	100
50	0	100

Czas przebiegu:

Opóźnienie stanu równowagi: Szybkość przepływu: Temperatura:

Detekcja:

Roztwór próbki:

Czasy retencji:

minut min przy 100% fazy ruchomej A 1,2 ml/min otoczenia UV przy 260 nm mM bufor fosforanu sodu, pH 6 GS-7339, ok. 25 minut GS-7340, ok. 27 minut

D. Rozdzielanie diastereoizomerów przez krystalizację

GS-7340 (IV). Roztwór GS-7171 (III) w acetonitrylu zatężono pod obniżonym ciśnieniem, uzyskując bursztynową piankę (14,9 g). Piankę rozpuszczono w acetonitrylu (20 ml) i zaszczepiono kryształami IV. Mieszaninę mieszano przez noc, ochłodzono do temp. 5°C i osad odsączono. Osad wysuszono, otrzymując 2,3 g białych kryształów, czystość diasteroizomeryczna 98% (³¹P-NMR): ¹H-NMR (CDCI3) δ: 1,15 (m., 12H); 3,7 (t, 1H); 3,95 (m., 2H); 4,05 (m., 2H); 4,2 (m., 2H); 5,0 (m., 1H); 6,4 (s, 2H); 7,1 (m., 5H); 8,0 (s, 1H); 8,2 (s, 1H); ³¹P-NMR (CDCI3) δ: 19,5 (rozprzężenie)

Wyniki analizy rentgenograficznej pojedynczego kryształu tego produktu są następujące:

Kolor kryształu, pokrój Rozmiary kryształu Układ krystaliczny Typ siatki Parametry siatki

Grupa przestrzenna Wartość Z ^Dcalc ^F000 μ(ΜϋΚα)

P r z y k ł a d 4 bezbarwny, słupkowy 0,25 x 0,12 x 0,08 mm rombowy prymitywna a = 8,352(1)A b = 15,574(2)A c = 18,253(2)A V = 2374,2(5)A P212121 (#19)

1,333 g/cm³

1008,00 1,60 cm^-1

Wytwarzanie soli fumaranowej GS-7340

GS-7340-02 (V). (Schemat 1). Wyłożony szkłem reaktor napełniono GS-7340 (IV), (1,294 kg, 2,71 mola), kwasem fumarowym (284 g, 2,44 mola) i acetonitrylem (24,6 kg). Mieszaninę ogrzewano do temperatury wrzenia do rozpuszczenia osadu, przesączono na gorąco i chłodzono w 5°C przez

PL 213 214 B1 godzin. Produkt odsączono, przemyto acetonitrylem (9,2 kg) i wysuszono, uzyskując 1329 g (V), w postaci białego proszku: t.t. 119,7-121,1°C; [α ]D²⁰ - 41,7 (c 1,0, kwas octowy).

P r z y k ł a d 5 Wytwarzanie GS-7120 (VI)

Pięciolitrową kolbę okrągłodenną napełniono monofenylo-PMPA, (II), (200 g), 0,55 mola) i acetonitrylem (0,629 kg). Dodano w temp. poniżej 27°C chlorek tionylu. Mieszaninę ogrzewano w temp. 70°C do rozpuszczenia osadu. Oddestylowano pod normalnym ciś nieniem skł adniki lotne (0,45 I). Pozostałość schłodzono do temp. 25°C, dodano dichlorometan (1,6 kg) i mieszaninę ochłodzono do temp. -20°C. Dodawano roztwór estru etylowego kwasu (L)-a-aminomasłowego (0,144 kg, 1,1 mola) w dichlorometanie (1,33 kg) w ciągu 15 minut przy temp. -20°C do -10°C, a następnie trietyloaminę (0,17 kg, 1,65 mola) w ciągu 15 minut przy temp. -8°C do -15°C. Mieszaninę reakcyjną ogrzano do temperatury pokojowej i przemyto czterokrotnie roztworem diwodoroforsforanu sodu (10% roztw. wodny, 0,3 I każde przemycie). Roztwór organiczny wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu (0,5 kg) i odsączono. Osad przemyto dichlorometanem (0,6 kg) i połączony przesącz i roztwór z przemycia zatężono pod obniżonym ciśnieniem, otrzymując olej. Olej oczyszczano chromatograficznie nad złożem 15 x 13 cm 1,2 kg żelu krzemionkowego 60, 230 do 400 mesh. Kolumnę eluowano gradientem rozpuszczalników dichlorometan/metanol. Frakcje zawierające produkt zatężono pod obniżonym ciśnieniem, uzyskując 211 g VI (Schemat 3) w postaci brązowawej pianki.

P r z y k ł a d 5a

Rozdział diastereoizomerów GS-7120 przez okresową chromatografię elucyjną

Mieszaninę diastereoizomeryczną oczyszczano stosując warunki opisane dla GS-7171 w przykładzie 3a, z następującą różnicą:

Faza ruchoma (początkowa): GS-7120 - acetonitryl: alkohol izopropylowy (98:2) (końcowa): 100% alkohol metylowy profil elucji: GS-7341 (diasteroizomer B)

GS-7342 (diastereoizomer A)

P r z y k ł a d 6

Rozdział diastereoizomerów GS-7120 przez krystalizację

Litrową kolbę okrągłodenną napełniono monofenylo-PMPA, II (50 g, 0,137 mola) i acetonitrylem (0,2 I). Dodano chlorek tionylu (0,036 kg, 0,303 mola) z efektem egzotermicznym 10°C, Mieszaninę mieszano do temperatury wrzenia aż do rozpuszczenia osadu. Składniki lotne (0,1 I) oddestylowano pod normalnym ciśnieniem pod poduszką azotu. Pozostałość ochłodzono do temp. 25°C, dodano dichlorometan (0,2 kg) i mieszaninę ochłodzono do -20°C. Dodawano roztwór estru etylowego kwasu (L) -α-aminomasłowego (0,036 kg, 0,275 mola) w dichlorometanie (0,67 kg) w ciągu 30 minut przy temp. -20°C do -8°C, a następnie trietyloaminę (0,042 kg, 0,41 mola) w ciągu 10 minut przy temp. do -6°C. Mieszaninę reakcyjną ogrzano do temp. pokojowej i przemyto czterokrotnie roztworem diwodorofosforanu sodu (10% roztwór wodny, 0,075 I każde przemycie). Roztwór organiczny wysuszono nad

PL 213 214 B1 bezwodnym siarczanem sodu (0,1 kg) i odsączono. Osad przemyto octanem etylu (0,25 I) i połączony przesącz i roztwór z przemycia zatężono pod obniżonym ciśnieniem, otrzymując olej. Olej rozcieńczono octanem etylu (0,25 I), zaszczepiono kryształami, mieszano przez noc i oziębiono do temp. -15°C. Osad odsączono i wysuszono pod obniżonym ciśnieniem, uzyskując 17,7 g GS-7342 (tabela 50 w postaci brą zowawego proszku: ¹H-NMR (CDCI3) δ : 0,95 (t, 3H); 1,3 (m., 6H); 1,7 (m., 02H); 3,7 (m., 2H); 4,1 (m., 6H); 4,4 (dd, 1H); 5,8 (s, 2H); 7,1 (m., 5H); 8,0 (s, 1H); 8,4 (s, 1H); ³¹P-NMR (CDCI3) δ: 21 (rozprzężenie).

P r z y k ł a d 7

Rozdział diastereoizomerów GS-7097

Mieszaninę diastereoizomerów oczyszczano stosując warunki opisane dla GS-7171 (przykład 3A) z następującą różnicą :

Faza ruchoma (początkowa): GS-7120 - acetonitryl: alkohol izopropylowy (95:5) (koń cowa): alkohol metylowy 100% profil elucji: GS-7115 (diastereoizomer B)

GS-7114 (diastereoizomer A)

P r z y k ł a d 8

Alternatywna procedura wytwarzania GS-7097

GS-7097: Etylo-L-alanyloamidan fenylo-PMPA. FenyIo-PMPA (15,0 g, 41,3 mmola), chlorowodorek estru etylowego L-alaniny (12,6 g, 83 mmola) i trietyloaminę zdyspergowano razem z 500 ml pirydyny w atmosferze suchego azotu. Zawiesinę tę połączono z roztworem trifenylofosfiny (37,9 g, 145 mmola), Aldrithiolem 2 (disulfotlenek 2,2'-dipirydylu) (31,8 g, 145 mmola) i 120 ml pirydyny. Mieszaninę ogrzewano przez 15 godzin w temperaturze wewnątrz reaktora 57°C. Po zakończeniu reakcji mieszaninę zatężono pod próżnią, uzyskując żółtą pastę, 100 g. Pastę oczyszczano metodą chromatografii kolumnowej nad złożem 25 x 11 cm 1,1 kg żelu krzemionkowego 60, 230 i 400 mesh. Kolumnę eluowano 8 litrami 2% metanolu w dichlorometanie, a następnie w gradiencie liniowym zużywając 26 litrów eluenta, aż do końcowego składu zawierającego 13% metanolu. Frakcje zawierające czysty produkt zatężono, uzyskując 12,4 g surowego produktu (5), z wydajnością 65% wydajności teoretycznej. Produkt był zanieczyszczony 15% (wag) chlorowodorku trietyloaminy oznaczonej na podstawie ¹H-NMR. Zanieczyszczenie usunięto rozpuszczając produkt w 350 ml octanu etylu, ekstrahując 20 ml wody, susząc roztwór organiczny nad bezwodnym siarczanem sodu i zatężając do 11,1 czystego GS-7097 w postaci białego proszku, wydajność 58%.

Proces ten stosuje się także do syntezy mieszaniny diastereoizomerów GS-7003a i GS-7003b (fenyloalanyloamidan) oraz mieszaniny GS-7119 i GS-7335 (glicyloamidan). Diastereoizomery te rozdziela się stosując periodyczną chromatografię elucyjną, opisaną w przykładach 3A, 6 i 7.

P r z y k ł a d 9

Badania diastereoizomerów proleków in vitro

Aktywność wobec HIV-1 oraz cytotoksyczność w komórkach MT-2 i trwałość w osoczu ludzkim oraz ekstrakcie komórek MT-2 in vitro dla GS-7340 (wolna zasada) oraz dla fumaranu dizoproksylu tenofoviru (tenofovir disoproxil fumarate) (TDF) przedstawiono w Tabeli 1. GS-7340 wykazuje 10-krotny wzrost aktywności przeciwwirusowej i 200-krotny wzrost trwałości w osoczu w porównaniu z TDF. Ta większa trwałość w osoczu, jak można oczekiwać, może powodować wyższy poziom GS-7340 w krwiobiegu po podaniu doustnym niż TDF.

T a b e l a 1. Aktywność i trwałość in vitro

	Aktywność Hiv-1	Cytotoksyczność	Trwałość T 1Z (min)
	IC50 μΜ	CC50 μΜ	Osocze ludzkie	Ekstrakt komórkowy MT-2	(P/MT-2)
GS-7340	0,005	>40	90,0	28,3	3,2
TDF	0,05	70	0,41	70,7	0,006
Tenofovir	5	6000	-	-	-

W celu okreś lenia względnego stężenia wewną trzkomórkowego PMPA bę d ą cego wynikiem metabolizmu wewnątrzkomórkowego TDF w porównaniu z pochodzącym z GS-7340, obydwa proleki i PMPA znaczono radioaktywnie i wstrzykiwano w równomolowych stężeniach do nie zmienionej peł20

PL 213 214 B1 nej krwi ludzkiej. Po 1 godzinie izolowano osocze, krwinki czerwone (RBC) i komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) i analizowano metodą HPLC z detekcją radiometryczną. Rezultaty przedstawiono w Tabeli 2.

Po 1 godzinie GS-7340 powodował odpowiednio 10-cio i 30-krotny wzrost całkowitego stężenia wewnątrzkomórkowego pochodnych PMPA w PBMC w stosunku do TDF i PMPA. 84% radioaktywności w osoczu po 1 godzinie było rezultatem nie zmienionego GS-7340, natomiast TDF był niewykrywalny. Ponieważ w osoczu nie wykryto nie zmienionego TDF, 10-krotna różnica pomiędzy TDF a GS-7340 po 1 godzinie stanowi minimalną róż nicę spodziewaną in vivo. Chromatogram HPLC dla wszystkich trzech związków w PBMC przedstawiono na fig. 1.

T a b e l a 2. Metabolity PMPA w osoczu, PBMC i RBC po 1 godz. inkubacji proleków PMPA lub

PMPA w krwi ludzkiej.

Związek	Matryca	Sumaryczny odzyskany C-14, Mg-eq	Metabolity (% powierzchni całkowitej piku)
PMPA %	PMPAp %	PMPApp %	Met. X %	Met Y %	TGS:7340 %
GS-7340	Osocze/FP	43,0	1	-	-	2	13	84
(60 pg-eq)	PBMC RBC/FP	1,25	45	16	21	18
		8	8	-	-	24	11	57
			PMPA	PMPAp	PMPApp	Mono-	GS-
						POC	4331
GS-4331	Osocze/FP	48,1	11	-	-	89	-
(TDF)	PBMC						-
(60 pg-eq)	RBC/FP	0,133	50	25	18	7	-
		10,5	93	7,0	-	-
			PMPA	PMPAp	PMPApp
PMPA	Osocze/FP
(60 pg-eq)	PNMC	55,7	100	-	-
	RBC/FP	0,033	86	14	-
		3,72	74	10	16

Fig. 1. Ślady C-14 w HPLC ekstraktów PBMC z krwi ludzkiej inkubowanych przez 1 godz.

w temp. 37°C z TDF, GS-7340 lub PMPA.

Met, X i Met. Y (metabolity X i Y) są przedstawione w Tabeli 5. Indeks dolny „p wskazuje stopień fosforylacji. Rezultaty te uzyskano po 1 godzinie w osoczu ludzkim. Z upływem czasu można oczekiwać wzrostu różnic in vitro, ponieważ 84% GS-7340 w osoczu pozostaje nie zmienione po goPL 213 214 B1 dzinie. Ponieważ nie zmieniony GS-7340 występuje w osoczu po podaniu doustnym, względna skuteczność kliniczna powinna być odnoszona do wartości IC50 obserwowanych in vitro.

W Tabeli 3 poniżej zebrano wartości IC50 dla tenofoviru, TDF, GS-7340, kilku inhibitorów nukleozydowych i inhibitora proteazy - nelfinaviru. Jak widać, nelfinavir i GS-7340 są o 2-3 rzędy wielkości silniejsze niż pozostałe nukleotydy i nukleozydy.

T a b e l a 3. Aktywność przeciw HIV-1 związków przeciwretrowirusowych in vitro

Związek	IC50 (μΜ.)
Adefovir (PMEA)	13,4 ± 4,21
Tenofovir (PMPA)	6,3 ± 3,31
AZT	0,17 ± 0,081
3TC	1,8 ± 0,251
D4T	8 ± 2,51
Nelfinavir	0,006 ± 0,0021
TDF	0,05
GS-7340	0,005

1. A.S. Mulato i J.M. Cherrington, Antiviral Research 36, 91 (1997)

Przeprowadzono dodatkowe badania in vitro aktywności przeciw HIV-1 i CC50 hodowli komórkowych wyodrębnionych diastereoizomerów według wynalazku i rezultaty zebrano poniżej.

T a b e l a 4. Efekt diastereoizomery

Związek	Diastereoizomer	IC50 (μΜ.)	Zmiana	Aktywność A/B	CC50 (μΜ.)
PMPA	-	5	1x	-	6000
Ala-metyloester	Mieszanina 1:1	0,025	200x	20x	80
GS-6957a	A	0,0075	670x
GS 6957b		0,15	33x
Phe-metyloester	Mieszanina 1:1	0,03	170x	10x	60
GS-7003a	A	0,01	500x
GS-7003b	B	0,1	50x
Gly-etyloester	Mieszanina 1:1	0,5	10x	20x
GS-7119	A	0,05	100x		>100
GS-7335	B	1,0	5x
Ala-izopropyl
GS-7340	A	0,005	1.000x		40
GS-7339	B	0,06	83x		>100
ABA-etyl	Mieszanina 1:1	0,008	625x	7,5x	>100
GS-7342	A	0,004	1.250x
GS-7341	B	0,03	170x
Ala-etyl	Mieszanina 1:1	0,02	250x	10x	60
GS-7114	A	0,005	1.000x
GS-7115	B	0,05	100x

Odnośnik literaturowy: Arimilli, M.N. i in. (1997) Synthesis, in vitro biological evaluation and oral bioavailability of 9-[2-(phosphonomethoxy)propyl]adenine (PMPA) prodrugs. Antiviral Chemistry and Chemotherapy 8(6): 557-564.

PL 213 214 B1 „Phe-metyloester oznacza monoester fenylowy monoamidanu metylofenyloalaninylowego tenofoviru; „gly-metyloester oznacza monoester fenylowy monoamidanu metyloglicylowego tenofoviru.

W każdym z powyższych przypadków, izomer A posiada tę samą konfigurację absolutną jak GS-7340 (S), a izomer B ma taką samą konfigurację absolutną jak GS-7339.

Metabolizm i trwałość wyodrębnionych diasteroizomerów in vitro określano w PLCE, ekstrakcie MT-2 i osoczu ludzkim. Materiał biologiczny wymieniony poniżej, w ilości 80 μΙ, przenoszono do zakręcanej probówki ultrawirówki i inkubowano w temp. 37°C przez 5 minut. Do materiału biologicznego dodawano roztwór zawierający 0,2 mg/ml związku badanego w odpowiednim buforze (20 μθ i mieszano. Natychmiast pobierano próbkę mieszaniny reakcyjnej (20 μθ i mieszano z 60 μΙ metanolu zawierającego 0,015 mg/ml 2-hydroksymetylonaftalenu jako wzorca wewnętrznego do analizy HPLC. Próbkę pobieraną przyjmowano jako wzorzec dla czasu 0. Następnie w określonych odstępach czasu pobierano próbki po 20 μΙ mieszaniny reakcyjnej i mieszano z 60 μΙ metanolu zawierającego wzorzec wewnętrzny. Otrzymaną w ten sposób mieszaninę wirowano przy 15000 G przez 5 minut i ciecz klarowną znad osadu analizowano metodą HPLC w warunkach określonych poniżej.

Ocenie poddawano następujący materiał biologiczny:

(1) PLCE (karboksyesteraza z wątroby świńskiej, Sigma, 160 u/mg białka, 21 mg białka/ml) rozcieńczona 20-krotnie PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem) (2) Ekstrakt komórek MT-2 przygotowany z komórek MT-2 zgodnie z procedurą opublikowaną w A.Pompon, I.Lefebvre, J.-L.Imbach, S.Khan i D.Farquehar, „Antiviral Chemistry & Chemotherapy, 5: 91-98 (1994), z tą różnica, że jako środowisko używano bufor HEPES opisany poniżej (3) Osocze ludzkie (połączone zwykłe osocze ludzkie z George King Biomedical System, Inc.). W badaniach stosowano następujące układy buforujące.

W badaniu PLCE związek badany rozpuszczano w PBS. PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem, Sigma) zawiera 0,01 M fosforanu, 0,0027 M chlorku potasu i 0,137 M chlorku sodu. pH 7,4 w 37°C.

W badaniu ekstraktów komórek MT-2 związek badany rozpuszczano w buforze HEPES. Bufor HEPES zawiera 0,010 M HEPES, 0,05 M chlorku potasu, 0,005 M chlorku magnezu i 0,005 M dl-ditiotreitolu. pH 7,4 w 37°C.

W badaniu osocza ludzkiego związek badany rozpuszczano w TBS. TBS (sól fizjologiczna buforowana buforem Tris, Sigma) zawiera 0,05 M Tris, 0,0027 M chlorku potasu i 0,138 M chlorku sodu, pH 7,5 w 37°C.

Analizę HPLC prowadzono w warunkach następujących.

Kolumna: Zorbax Rx-C8, 4,6 x 250 mm, 5 μ (MAC-MOD Analytical, Inc. Chadds Ford, PA) detekcja: UV przy 260 nm objętość przepływu: 1,0 ml/min czas przebiegu: 30 min objętość wstrzyku: 20 μl temperatura kolumny: temp. otoczenia faza ruchoma A: 50 mM fosforanu potasu (pH 6,0)/CH3CN = 95/5 (obj/obj) faza ruchoma B: 50 mM fosforanu potasu (pH 6,0)/CH3CN = 50/50 (obj/obj) gradient: 0 min 100% fazy ruchomej A min 100% fazy ruchomej B 30 min 100% fazy ruchomej B

Rezultaty przedstawiono w poniższej Tabeli 5 (zawierającej także wybrane dane IC50 z Tabeli 4)

PL 213 214 B1

Tabela 5. Metabolizm izomerów A i B monoamidanu PMPA w temp. 37°C in vitro

Lp	Struktura monoamidanu PMPA	IC50 HIV (μΜ.)	Szybkość i produkt hydrolizy PLCE	Szybkość i produkt hydrolizy ekstraktu MT- 2	Trwałość w osoczu ludzkim (HP)
1	iA	o ch3	0,005	T1/2=2,9 min	Ti/2=2z9 min	Ti/2=148 min
		P—NH—CHCOOEt
		OPh		Met.X i PMPA	Met.X i PMPA	Met.Y
	izomer A	GS7114
2	iA	0 ch3	0,05	T1/2=8,0 min	T1/2=150,6	Tl,'2=495 min
		^P-NH -CHCOOEt
		OPh		Met.X i PMPA	min	Met.Y
	izomer B GS7115			Met.X i PMPA
3	,A	0 ch3	0,005	T1/2=3,3 min	Ti/2=28,3 min	Ti/2=90,0 min
		.P-NH-CHCOOi Pr
		OPh		Met.X i PMPA	Met.X i PMPA	Met. Y
	izomer A	GS7340
4	.A	O ch3	0,06	Ti/2=10,l min	T1/2>1000	T1/2=231 min
		^P-NH-CHCOOiPr
		OPh		Met.X i PMPA	min	Met. Y
	izomer B	GS7339
5	iA	0 ch2ch3	0,004	Ti/2=3,9 min	Ti/2=49,2 min	TV2=103 min
		P-NH-CHCOOEt
		OPh		Met.X	Met.X i PMPA	Met.Y
	izomer A	GS7342
6	iA	0 ch,ch3	0,03	Ti/2=11,3 min	Ti/2> 1000	Ti/2=257 min
		P-NH-CHCOOEt
		OPh		Met.X	min	Met.Y
	izomer B	GS7341
7	A	0 0	0,05	Ti/2<0,14 min	Ti/2=70,7 min	Ti/2=0,41 min
		,P—OCH2OCOiPr
		\ ?		MonoPOC	MonoPOC	MonoPOC
		OCH2OCOiPr
	GS4331			PMPA	PMPA	PMPA

PL 213 214 B1

P r z y k ł a d 10

Ekspozycja osocza i PBMC po podaniu doustnym diastereoizomerów proleków psom Beagle Badano farmakokinetykę GS 7340 u psów po podaniu doustnym dawki 10 mg-eq/kg.

Preparaty. Proleki przygotowywano w postaci roztworów w 50 mM kwasu cytrynowego na

0,5 godziny przed podaniem. Wszystkie związki stosowane w badaniach były syntetyzowane przez Gilead Science. Stosowano następujące serie:

GSI	Aminokwas amidanu	Ester AA	Diastereoizomer	Nr serii
GS-7340-2	Alanina	Izopropyl	Izomer A	1504-187-19
GS-7339	Alanina	Izopropyl	Izomer B	1509-185-31
GS 7114	Alanina	Etyl	Izomer A	1509-181-26
GS-7115	Alanina	Etyl	Izomer B	1509-181-22
GS7119	Glicyna	Etyl	Izomer A	1428-163-28
GS-7342	Kwas α-amino-masłowy	Etyl	Izomer A	1509-191-12
GS-7341	Kwas α-amino-masłowy	Etyl	Izomer B	1509-191-7

Podawanie dawki i pobieranie próbek. Fazę badań na organizmach żywych prowadzono zgodnie z zaleceniami „Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (publikacja National Institutes of Health 86-23), po zatwierdzeniu przez Komitet Institutional Animal Care and Use. W badaniach stosowano psy samce rasy Beagle (10 ± 2 kg) na czczo. Każdemu psu podawano przez zgłębnik doustny pojedynczą dawkę (1,5-2 ml/kg). Dawka stanowiła równoważnik 10 mg PMPA/kg. Dla PBMC, próbki krwi pobierano w czasie 0 (pre-dose), 2, 8 i 24 godz. (post-dose). Dla osocza, próbki krwi pobierano w czasie 0 (pre-dose), 5, 15 i 30 minut oraz 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12 i 24 godz. (post-dose). Krew (1,0 ml) natychmiast przetwarzano przez odwirowanie przy 2000 obr/min przez 10 minut. Próbki osocza zamrażano i utrzymywano w temp. 70°C do czasu analizy.

Preparat jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC).

Pełną krew (8 ml) pobraną w poszczególnych punktach czasu mieszano z taką samą ilością soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), nanoszono warstwę na 15 ml roztworu Ficoll-Paque (Pharmacia Biotech) i wirowano przy 400 g przez 40 minut. Warstwę PBMC usuwano i przemywano jednokrotnie PBS. Utworzoną tabletkę PMBC roztwarzano w 0,5 ml PBS, komórki ponownie zawieszano, liczono stosując hemocytometr i utrzymywano w temp. 70°C do czasu analizy. Do obliczeń stężeń wewnątrzkomórkowych stosowano ilość komórek pomnożoną przez średnią objętość pojedynczej komórki. Jako objętość spoczynkowa PBMC stosowana była literaturowa wartość 200 femtolitrów/komórkę (B.L.Robins, R.V.Srinivas, C.Kim, N.Bischofberger i A.Fridland, Antimicrob. Agents Chemother. 42, 612 (1998).

PL 213 214 B1

Oznaczenie PMPA i proleków w osoczu i PBMC. Stężenie PMPA w próbkach osocza psa określano otrzymując pochodną PMPA za pomocą aldehydu chlorooctowego do silnie fluorescencyjnej pochodnej N¹,N⁶-etenoadeniny (L.Naesens, J.Balzarini i E.De Clercq, Clin. Chem. 38, 480 (1992). W skrócie, osocze (100 μΙ) mieszano z 200 μΙ acetonitrylu w celu wytrącenia białka. Następnie próbki odparowywano do sucha pod obniżonym ciśnieniem w temperaturze pokojowej. Wysuszone próbki roztwarzano w 200 μΙ mieszaniny po derywatyzacji (0,34% chloroacetaldehydu w 100 mM octanu sodu, pH 4,5), wstrząsano i odwirowywano. Ciecz klarowną znad osadu przenoszono następnie do czystej zakręcanej probówki i inkubowano przez 40 minut w temp. 95°C. Derywatyzowane próbki odparowywano następnie do sucha i roztwarzano w 100 μΙ wody do analizy HPLC.

Przed oznaczeniem wewnątrzkomórkowego PMPA za pomocą HPLC, należało usunąć przez selektywne utlenianie duże ilości rybonukleotydowych pochodnych adeniny występujących w ekstraktach PBMC. Zastosowano zmodyfikowaną procedurę Tanaki i in. (K.Tanaka, A.Yoshioka, S.Tanaka i Y.Wataya, Anal. Biochem., 139, 35 (1984). W skrócie, próbki PBMC mieszano w stosunku 1:2 z metanolem i odparowywano do sucha pod obniżonym ciśnieniem. Wysuszone próbki derywatyzowano zgodnie z opisem dla oznaczenia osocza. Derywatyzowane próbki mieszano z 20 μΙ 1M ramnozy i 30 μΙ 0,1 M nadjodanu sodu i inkubowano przez 5 minut w temp. 37°C. Po inkubacji, dodano 40 μΙ 4M metyloaminy i 20 μΙ 0,5 M inozyny. Po inkubowaniu przez 30 minut w temp. 37°C próbki odparowano do sucha pod obniżonym ciśnieniem i roztwarzano w wodzie do analizy HPLC.

W żadnej z próbek PBMC nie wykryto nie zmienionego proleku. Dla próbek osocza, mogących potencjalnie zawierać nie zmienione proleki, przeprowadzono eksperymenty mające na celu weryfikację, ze podczas derywatyzacji nie zachodzi dalsza konwersja do PMPA. Proleki wzorcowe dodawano do osocza pozbawionego leku i derywatyzowano zgodnie z opisem.

Nie stwierdzono wykrywalnych poziomów PMPA w żadnej z próbek osocza, a procent konwersji był mniejszy niż 1%.

Układ HPLC składał się z układu dostarczania rozpuszczalnika P4000 z autoinjektorem AS3000 i detektorem fluorescencyjnym F2000 (Thermo Separation, San Jose, CA). Stosowano kolumnę Intersil ODS-2 (4,6 x 150 mm). Fazy ruchome stanowiły: A, 5% acetonitrylu w 25 mM buforze fosforanowym z 5 mM bromku tetrabutyloamoniowego (TBABr), pH 6,0; B, 60% acetonitrylu w 25 mM buforze fosforanowym z 5 mM TBABr, pH 6,0. Objętość przepływu wynosiła 2 ml/min., a temperatura kolumny utrzymywana była na poziomie 35°C za pomocą pieca grzejnego kolumny. Profil gradientu wynosił 90% A/10% B przez 10 min. dla PMPA i 65% A/35% B przez 10 min. dla proleku. Detekcji dokonywano na podstawie pomiaru fluorescencji z pobudzeniem przy 236 nm i emisji fali przy 420 nm, oraz przy objętości wtrysku 10 μΙ. Dane uzyskiwano i przechowywano w systemie zdobywania danych laboratoryjnych (PeakPro, Beckman, Allendale, NJ).

Obliczenia farmakokinetyczne.

Ekspozycję na PMPA i prolek wyrażano w postaci pola powierzchni pod krzywą stężenia w osoczu lub PBMC w czasie od 0 do 24 godzin (AUC). Wartości AUC obliczano stosując regułę trapezu.

Stężenia osocza i PBMC.

Rezultaty tego badania przedstawiono na Fig. 2 i 3. Fig. 2 przedstawia przebieg w czasie ekspozycji osocza i PBMC w wyniku metabolizmu GS-7340-2 po podaniu doustnym czystych diastereoizomerów proleków PMPA.

PL 213 214 B1

Wykres słupkowy na Fig. 3 przedstawia AUC (0-24 h) tenofoviru w PBMC i osoczu psa po podaniu PMPA (s.c.), TDF i proleków estrów amidanów. Zaobserwowano zwiększenie ekspozycji w PBMC wszystkich proleków amidanów. Na przykład, GS-7340 powoduje ok. 24-krotny wzrost ekspozycji w PBMC w porównaniu z PMPA s.c. i TDF; oraz odpowiednio 6,25-krotny i 1,29-krotny spadek ekspozycji w osoczu.

Fig.3. Wykres ekspozycji na tenofovir PBMC i osocza po podaniu dawki 10 mg/kg u psów.

AUC (0-24 h) PMPA w PBMC i osoczu po podaniu psu dawki doustnej 10 mg-eq/kg proleku

PMPA.

PL 213 214 B1

Dane ustalone in vivo wskazują, że GS-7340 można podawać doustnie, minimalizuje on ogólnoustrojową ekspozycję na PMPA i znacząco zwiększa stężenie wewnątrzkomórkowe PMPA w komórkach odpowiadających w pierwszym rzędzie za replikację wirusa HIV.

T a b e l a 6.

Ekspozycja PBMC i osocza na PMPA po podaniu doustnym proleków PMPA u psów

GS#	Reszta	AUC PMPA w osoczu	AUC PMPA w PBMC:	Prolek w osoczu	Współczynnik ekspozycji PBMC /osocze/
Śr.	SD	N	Śr.	SD	N
GS-7114	Mono-Ala-Et-A	5,8	0,9	2	706	331	5	Tak	122
GS-7115	Mono-Ala-Et-B	6,6	1,5	2	284	94	5	Tak	43
GS-7340-2	Mono-Ala-iPr-A	5,0	1,1	5	805	222	5	Tak	161
GS-7339	Mono-Ala-iPr-B	6,4	1,3	2	200	57	5	Tak	31
GS-7119	Mono-Gly-Et-A	6,11	1,86	2	530	304	5	Tak	87
GS-7342	Mono-ABA-Et-A	4,6	1,2	2	1060	511	5	Tak	230
GS-7341	Mono-ABA-Et-B	5,8	1,4	2	199	86	5	Tak	34

P r z y k ł a d 11

Biodystrybucja GS-7340

Jako część charakterystyki przedklinicznej GS-7340 określono jego biodystrybucję u psów. Badano biodystrybucję GS-7340 (monoester fenylowy izopropyloalaninylomonoamidanu tenofoviru) w tkankach po podaniu doustnym u psów rasy Beagle. Dwa zwierzęta samce otrzymały doustnie ¹⁴CGS-7340 (8,85 mg-eq. PMPA/kg, 33,2 μθΐ/kg; znaczony radioaktywnie atom C-8 adeniny) w roztworze wodnym (50 mM kwasu cytrynowego, pH 2,2). Osocze i jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) zbierano przez 24 godziny. Mocz i odchody z klatki zbierano przez 24 godziny. Po 24 godzinach od podania dawki zwierzęta uśmiercano i pobierano tkanki do analizy. Radioaktywność całkowitą w tkankach oznaczano przez utlenianie i liczenie licznikiem scyntylacyjnym cieczowym.

Biodystrybucję PMPA po 24 godzinach od podania pojedynczej dawki doustnej znaczonego radioaktywnie GS-7340 przedstawiono w Tabeli 7, razem z danymi z poprzednich badań obejmujących TDF (GS-4331). W przypadku TDF stężenie proleku w osoczu jest poniżej poziomu wykrywalności, a główną jednostkę obserwowaną w osoczu stanowi lek macierzysty. Poziomy PMPA w tkance limfatycznej, szpiku kostnym i mięśniach szkieletowych wzrastają po podaniu GS-7340 10-krotnie.

Nagromadzenie w tkance limfatycznej jest zgodne z danymi obserwowanymi w analizie PBMC, ponieważ tkanki te zbudowane są głównie z limfocytów. Podobnie, nagromadzenie w szpiku kostnym wynika prawdopodobnie z wysokiego udziału limfocytów (70%) w tej tkance.

T a b e l a 7. Wydalanie i dystrybucja znaczonego radioaktywnie GS-7340 w tkankach psów (średnia, n=2) po podaniu dawki doustnej 10 mg-eq. PMPA/kg.

Tkanka / płyn		GS-4331	GS-7340	Stos. stęż. w tkance GS-7340 /GS-4331
% dawki	Stęż. (ug-eq/g)	% dawki	Stęż, (ug-eq/g)
1	2	3	4	5	6
Wątroba	12,40	38,30	16,45	52,94	1,4
Nerki	4,58	87,90	3,78	80,21	0,9
Płuca	0,03	0,53	0,34	4,33	8,2

PL 213 214 B1 cd tabeli 7

1	2	3	4	5	6
Węzły chłonne biodrowe Węzły chłonne pachy	0,00	0,51	0,01	5,42	10,6
Węzły chłonne pachwiny Węzły chłonne krezkowe	0,00	0,37	0,01	5,54	14,8
	0,00	0,28	0,00	4,12	15,0
	0,00	1,20	0,04	6,88	5,7
T arczyca	0,00	0,30	0,00	4,78	15,8
Przysadka	0,00	0,23	0,00	1,80	7,8
Gruczoł ślinowy (L+P)	0,00	0,45	0,03	5,54	12,3
Nadnercze	0,00	1,90	0,00	3,47	1,8
Śledziona	0,00	0,63	0,17	8,13	12,8
T rzustka	0,00	0,57	0,01	3,51	6,2
Gruczoł krokowy	0,00	0,23	0,00	2,14	9,1
Jądra (L+P)	0,00	1,95	0,02	2,01	1,0
Mięśnie szkieletowe	0,00	0,11	0,01	1,12	10,1
Serce	0,00	0,46	0,15	1,97	4,3
Kość udowa	0,00	0,08	0,00	0,28	3,5
Szpik kostny	0,00	0,20	0,00	2,05	10,2
Skóra	0,00	0,13	0,00	0,95	7,2
Tłuszcz brzuszny	0,00	0,16	0,00	0,90	5,8
Oko (L+P)	0,00	0,06	0,00	0,23	3,7
Mózg Płyn mózgowo-rdzeniowy	0,00	<LOD	0,00	<LOD	n.d.
Rdzeń kręgowy;	0,00	<LOD	0,00	0,00	n.d.
	0,00	<LOD	0,00	0,04	n.d.
Żołądek	0,11	1,92	0,26	2,68	1,4
Jelito czcze	1,34	3,01	0,79	4,16	1,4
Dwunastnica	0,49	4,96	0,44	8,77	1,8
Jelito kręte	0,01	0,50	0,16	4,61	9,2
Jelito grube	1,63	5,97	2,65	47,20	7,9
Pęcherzyk żółciowy	0,00	3,58	0,04	25,02	7,0
Żółć	0,00	9,63	0,22	40,48	4,2
Odchody Całkowita treść	40,96	n.d.	0,19	n.d.	n.a.
żołądkowa	5,61	n.d.	21,64	n.d.	n.a.
Mocz	23,72	n.d.	14,73	n.d	n.a.
Osocze po 24 h	0,00	0.20	00	0,20	1,0
Osocze po 0,25 h	n.a.	3,68	n.a.	3,48	0,9
PBMC*	0,00	n.d.	0,00	63,20	n.d.
Krew pełna	0,00	0,85	0,16	0,20	0,2
Odzysk całkowity	81,10		68,96

* obliczone na podstawie typowego odzysku cał kowitej liczby komórek 15 x 10⁶ oraz średniej objętości PBMC 0,2 pikolitrów/komórkę

n.s. = brak próbki, n.a. = nie stosowane, n.d. = nie oznaczane

Claims (25)

1. Diastereoizomerycznie wzbogacony związek o wzorze (3) ο

II

Β—Ε—OCH,-Ρ ·

L

R²

-|R1 (3) zawierający mniej niż 40% wagowych diastereoizomeru o wzorze (4)

R² oznacza resztę aminokwasową przyłączoną do atomu P poprzez grupę aminową aminokwasu wybranego jest z grupy obejmującej alaninę, glicynę, fenyloalaninę, kwas α-aminomasłowy, przy czym podstawnik karboksylowy w aminokwasie jest zestryfikowany przez grupę etylową lub izopropylową,

E stanowi -CH2CH(CH3)-, oraz ich sole, wolne zasady i solwaty.

2. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera mniej niż 20% wagowych diasteroizomeru o wzorze (4).

3. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera mniej niż 5% wagowych diasteroizomeru o wzorze (4).

4. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że związki o wzorach (3) i (4) obecne są w stosunku 95%:5%.

5. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że występuje w postaci fumaranu.

6. Diastereoizomerycznie wzbogacony związek o wzorze (5a)

PL 213 214 B1 zawierający mniej niż 40% wagowych diasteroizomeru o wzorze (5b) gdzie

R⁵ oznacza metyl,

6a

R^6a oznacza grupę fenylową,

R⁶ oznacza grupę izopropylową albo metylową

R⁷ oznacza atom wodoru, grup ę metylową , etylową lub fenylometylową ;

R¹¹ oznacza grupę aminową, a 12

R¹² stanowi H;

oraz ich sole, tautomery, wolne zasady i solwaty.

7. Związek według zastrz. 6, znamienny tym, ż e zawiera mniej niż 20% wagowych diasteroizomeru o wzorze (5b).

8. Zwią zek według zastrz. 6, znamienny tym, ż e zawiera mniej niż 5% wagowych diasteroizomeru o wzorze (5b).

9. Związek według zastrz. 6, znamienny tym, że związki o wzorach (5a) i (5b) obecne są w stosunku 95%:5%.

10. Związek według zastrz. 6, znamienny tym, że występuje w postaci fumaranu.

11. Diastereoizomerycznie wzbogacony związek o wzorze (6)

12. Diastereoizomerycznie wzbogacony związek o wzorze (7)

PL 213 214 B1 zawierający mniej niż 40% diastereoizomeru o wzorze (7a) oraz jego sole i solwaty

13. Związek według zastrz. 12, znamienny tym, że zawiera mniej niż 20% wagowych diasteroizomeru o wzorze (7a).

14. Związek według zastrz. 12, znamienny tym, że zawiera mniej niż 5% wagowych diasteroizomeru o wzorze (7a),

15. Związek według zastrz. 12, znamienny tym, że związki o wzorach (7) i (7a) obecne są w stosunku 95%:5%.

16. Związek przedstawiony wzorem (1) w którym Ra stanowi metyl, oraz jego sole, wolne zasady i solwaty.

17. Związek według zastrz. 16, znamienny tym, że występuje w postaci fumaranu.

18. Związek przedstawiony wzorem (2)

PL 213 214 B1 oraz jego sole, wolne zasady i solwaty.

19. Związek według zastrz. 18, znamienny tym, że występuje w postaci fumaranu.

20. Związek przedstawiony wzorem (III) oraz jego sole, wolne zasady i solwaty.

21. Związek według zastrz. 20, znamienny tym, że występuje w postaci fumaranu

22. Kompozycja zawierająca związek określony w dowolnym z zastrzeżeń 1-21 i farmaceutycznie skuteczną substancję pomocniczą.

23. Kompozycja według zastrz. 22, znamienna tym, że substancja pomocnicza stanowi żel.

24. Kompozycja według zastrz. 22, znamienna tym, że jest kompozycją do stosowania miejscowego.

25. Związek określony w dowolnym z zastrz. 1-21 do zastosowania jako lek.

Departament Wydawnictw UP RP