ES2386161T3 - Proceso para separar una mezcla de enantiómeros de éster alquílico usando una enzima - Google Patents

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ES2386161T3 ES08075882T ES08075882T ES2386161T3 ES 2386161 T3 ES2386161 T3 ES 2386161T3 ES 08075882 T ES08075882 T ES 08075882T ES 08075882 T ES08075882 T ES 08075882T ES 2386161 T3 ES2386161 T3 ES 2386161T3
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Jeffrey Allen Campbell
Wenying Li
Stanley D'andrea
Zhizhen Barbara Zheng
Andrew Charles Good
David J. Carini
Barry L. Johnson
Paul Michael Scola
Kenneth M. Boy
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Abstract

Un proceso para separar una mezcla de enantiómeros de éster alquílico que comprende poner encontacto la mezcla con una enzima eficaz para estimular preferiblemente la hidrólisis de uno de losenantiómeros; caracterizado porque el contacto se lleva a cabo en presencia de un tampón, en el que el éster alquílico tiene la siguiente fórmula: en la que: R25 es un grupo protector del amino; y 10 R26 se selecciona entre el grupo constituido por alquilo C1-10, arilo C6-14, alquilarilo C7-16, cicloalquilo C3-7 o cicloalquil alquilo C3-10.

Description

Proceso para separar una mezcla de enantiómeros de éster alquílico usando una enzima
Campo de la invención
La presente invención se dirige a un proceso para separar una mezcla de enantiómeros de éster alquílico usandouna enzima en presencia de un tampón.
Antecedentes de la invención
El VHC es un patógeno humano grave, que infecta a aproximadamente 170 millones de personas en todo el mundo
-
aproximadamente 5 veces el número de infectados por el virus de inmunodeficiencia humana de tipo 1. Unafracción sustancial de estos individuos infectados con VHC desarrollan enfermedad hepática progresiva grave, queincluye cirrosis y carcinoma hepatocelular. (Lauer, G. M.; Walker, B. D. N. Engl. J. Med. (2001), 345, 41-52).
Actualmente, la terapia para el VHC más eficaz emplea una combinación de interferón-alfa y ribavirina, que conducea una eficacia continua en el 40 % de los pacientes. (Poynard, T. y col. Lancet (1998), 352, 1426-1432). Los resultados clínicos recientes demuestran que el interferón-alfa pegilado es mejor que el interferón-alfa no modificadocomo monoterapia (Zeuzem, S. y col. N. Engl. J. Med. (2000), 343, 1666-1672). Sin embargo, incluso con regímenesterapéuticos experimentales que implican combinaciones de interferón-alfa pegilado y ribavirina, una fracción sustancial de pacientes no tiene una reducción sostenida de la carga viral. Por tanto, existe una necesidad médicaclara y no satisfecha de desarrollar medicamentos eficaces para el tratamiento de infección de VHC.
El VHC es un virus ARN de cadena positiva. En base a una comparación de la secuencia de aminoácidos deduciday la similaridad exhaustiva en la región no traducida 5', se ha clasificado el VHC como un género separado en lafamilia Flaviviridae. Todos los miembros de la familia Flaviviridae tienen viriones envueltos que contienen un genoma ARN de cadena positiva que codifica todas las proteínas específicas de virus conocidas a través de la traducción deun marco de lectura abierto único e ininterrumpido.
Se observa heterogenicidad considerable dentro de la secuencia nucleotídica y de aminoácidos codificados por todoel genoma de VHC. Se han caracterizado al menos 6 genotipos fundamentales y se han descrito más de 50subtipos. Los genotipos fundamentales de VHC difieren en su distribución en todo el mundo y la significancia clínica de la heterogenicidad genética del VHC sigue siendo difícil de conseguir a pesar de los numerosos estudios de losefectos posibles de los genotipos en la patogénesis y la terapia.
El genoma ARN de VHC de cadena única tiene una longitud de aproximadamente 9500 nucleótidos y tiene un marcode lectura abierto único (ORF) que codifica una poliproteína grande única de aproximadamente 3000 aminoácidos.En las células infectadas, las proteasas celulares y virales escinden esta poliproteína en múltiples sitios para producir las proteínas estructurales y no estructurales (NS). En el caso del VHC, la generación de proteínas noestructurales maduras (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B) se logra mediante dos proteasas virales. La primeraescinde en el punto de unión NS2-NS3; la segunda es una serina proteasa contenida dentro de la región N-terminalde NS3 y media todas las escisiones posteriores cadena debajo de NS3, tanto en cis, en el sitio de escisión NS3-NS4A, como en trans, para los sitios restantes NS4A-NS4B, NS4B-NS5A, NS5A-NS5B. La proteína NS4A aparentemente sirve a múltiples funciones, actuando como un co-factor de la proteasa NS3 y posiblemente ayudando en la localización de membrana de NS3 y otros componentes de replicasa virales. La formación decomplejo entre el dominio de proteasa NS3 y su cofactor, NS4A, es esencial para escisión proteolítica eficaz de loscuatro sitios respectivos. La proteína NS3 también muestra actividades de nucleósido trifosfatasa y helicasa de ARN.La NS5B es una ARN polimerasa dependiente de ARN que está implicada en la replicación de VHC.
Entre los compuestos que han demostrado eficacia para inhibir la replicación de VHC, como inhibidores de serinaproteasa de VHC selectivos, están los compuestos peptídicos macrocíclicos descritos en la Solicitud InternacionalPCT/CAOO/00353 (Nº de Publicación WO 00/59929).
El documento WO 00/09543 describe compuestos para el tratamiento por infección con VHC y procesos para lasíntesis de esos compuestos que incluyen un proceso para la separación de una mezcla de enantiomeros del éster etílico del ácido (1R,2S)/(1S,2S)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico usando una esterasa.
La presente invención proporciona un proceso para separar una mezcla de enantiómeros de éster alquílico quecomprende poner en contacto la mezcla con una enzima eficaz para estimular preferiblemente la hidrólisis de uno delos enantiómeros; caracterizado porque el contacto se conduce en presencia de un tampón, en el que el éster alquílico tiene la siguiente fórmula:
en la que:
R25 es un grupo protector del amino; y R26 se selecciona entre el grupo constituido por alquilo C1-10, arilo C6-14, alquilarilo C7-16, cicloalquilo C3-7 o
cicloalquil alquilo C3-10. Además se describen en este documento compuestos de isoquinolina macrocíclicos de la siguiente fórmula: Un compuesto de fórmula I:
en la que:
(a)
R1, R2, R3, R4, R5 y R6 son cada uno independientemente H; alquilo C1-6; cicloalquilo C3-7; alcoxi C1-6; cicloalcoxi C3-7; halo-alcoxi C1-6; halo-alquilo C1-6; ciano; halo; hidroxilo; alcanoílo C1-6; nitro; amino; mono o dialquil (C1-6)-amina; mono o di-cicloalquil (C3-7)-amina; mono o di-alquil C1-6-amida; mono o di-cicloalquil (C3-7)amida; carboxilo; carboxiéster (C1-6); tiol; tioalquilo C1-6; alquilsulfóxido C1-6; alquil C1-6-sulfona; alquil C1-6sulfonamida; arilo C6-10 opcionalmente sustituido con Het; alquilarilo C7-14; ariloxi C6-10; alquilariloxi C7-14; heteroariloxi monocíclico de 5-7 miembros; o Het; dichos R1 a R6 opcionalmente unidos al grupo isoquinolina mediante un grupo enlazador alquilo C1-6;
(b)
R7 es NH2 o -NR10R11; donde R10 es alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, C(O)-NR12R13, C(O)-OR14, C(O)-SR15 o C(O)-R16; R11 es H, alquilo C1-6 o haloalquilo C1-6, con la condición de que si R12 o R13 es H entonces R11 sea H; R12 y R13 son cada uno independientemente H; alquilo C1-6, cicloalquilo C3-7 o alquilcicloalquilo C4-10, cada uno opcionalmente sustituido con halo, alcoxi C1-3, haloalcoxi C1-3, alquilo C1-3 o haloalquilo C1-3; o arilo; y donde R12 y R13 junto con el nitrógeno al que están unidos pueden formar un heterociclo de 4-7 miembros; R14 y R15 son cada uno independientemente alquilo C1-6, cicloalquilo C3-7 o alquilcicloalquilo C4-10, cada uno opcionalmente sustituido con halo, alcoxi C1-3, haloalcoxi C1-3, alquilo C1-3 o haloalquilo C1-3; arilo o Het; R16 es H; alquilo C1-6, cicloalquilo C3-7 o alquilcicloalquilo C4-10, cada uno opcionalmente sustituido con halo, alcoxi C1-3, haloalcoxi C13, alquilo C1-3 o haloalquilo C1-3; arilo o Het;
(c)
R8 y R9 son cada uno independientemente H o alquilo C1-3 opcionalmente sustituido con halo, o alcoxi C1-3,
o haloalcoxi C1-3;
(d)
Q es una cadena C3-9 saturada o insaturada que contiene opcionalmente de uno a tres heteroátomosseleccionados independientemente entre O, S(O)m; donde m es 0, 1 ó 2 o NR17, donde R17 es H; alquilo C1-6 o cicloalquilo C1-6, cada uno opcionalmente sustituido con halo, alcoxi C1-6, ciano o haloalcoxi C1-6; -C(O)-R18, C(O)-OR19, C(O)-NR20R21 o -SO2R22; R18, R20 y R21 son cada uno independientemente H; alquilo C1-6 o cicloalquilo C1-6, cada uno opcionalmente sustituido con halo, alcoxi C1-6, ciano o haloalcoxi C1-6; R19 es alquilo C1-6 o cicloalquilo C1-6, cada uno opcionalmente sustituido con halo, alcoxi C1-6, ciano o haloalcoxi C1-6; R22 es arilo, alquilo C1-6 o cicloalquilo C1-6, cada uno opcionalmente sustituido con halo, alcoxi C1-6, ciano o haloalcoxi C1-6; y
(e)
W es OH, -NH-SOn-R23 o NH-SOn-R24; donde n es 1 ó 2, R23 es alquilo C1-8, alquilcicloalquilo C4-10, cicloalquilo C3-7 sin sustituir, o ciclopropilo o ciclobutilo opcionalmente sustituido con alquil C7-9-arilo o alquilo C14 opcionalmente sustituido con halo, alcoxi C1-3, ciano, amina, mono o di-alquil C1-6-amina, mono o di-alquil C1-6amida o carboxilato; y R24 es arilo C6-10 o Het;
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o un enantiómero, diastereómero, sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo.
Además se describen en este documento las composiciones que comprenden los compuestos descritos en estedocumento, o sales farmacéuticamente aceptables, solvatos o profármacos de los mismos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en particular composiciones farmacéuticas útiles para inhibir la proteasa NS3 de HCVque comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto descrito en este documento, o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o profármaco del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Además se describen en este documento procedimientos para tratar pacientes infectados con HCV, que comprenden administrar al paciente una cantidad efectiva terapéuticamente o un compuesto descrito en estedocumento, o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o profármaco del mismo, y procedimientos para inhibirla proteasa NS3 de HCV, mediante el contacto de la proteasa NS3 con un compuesto descrito en este documento.
En virtud de la presente invención, ahora es posible proporcionar fármacos mejorados que comprenden los compuestos descritos en este documento que pueden ser eficaces en el tratamiento de pacientes infectados conHCV. Específicamente, los compuestos peptídicos descritos en este documento pueden inhibir el funcionamientode la proteasa NS3, por ejemplo, junto con la proteasa NS4A. Además es posible administrar una terapia decombinación a un paciente de manera que un compuesto descrito en este documento, que es eficaz para inhibir la proteasa NS3 de HCV, puede administrarse con otro compuesto que tiene actividad anti-HCV, por ejemplo, un compuesto que es eficaz para inhibir la función de una diana seleccionada entre el grupo constituido pormetaloproteasa de HCV, serina proteasa de HCV, polimerasa de HCV, helicasa de HCV, proteína NS4B de HCV,entrada de HCV, ensamblaje de HCV; salida de HCV, proteína NS5A de HCV, IMPDH y un análogo de nucleósidopara el tratamiento de una infección por HCV.
Descripción detallada de la invención
Las definiciones y convenciones estereoquímicas usadas en este documento generalmente siguen el McGraw-HillDictionary of Chemical Terms, S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Book Company, Nueva York (1984) y Stereochemistryof Organic Compounds, Eliel, E. y Wilen, S., John Wiley & Sons, Inc., Nueva York (1994). Existen muchos compuestos orgánicos en formas ópticamente activas, es decir, tienen la capacidad de rotar el plano de luz polarizada en el plano. En la descripción de un compuesto ópticamente activo, los prefijos D y L o R y S se usanpara indicar la configuración absoluta de la molécula alrededor de su centro o centros quirales. Los prefijos d y l o (+)y (-) se emplean para indicar el signo de rotación de luz polarizada en el plano por el compuesto, donde (-) o l significa que el compuesto es levorrotatorio y (+) o d significa que el compuesto es dextrorrotatorio. Para una estructura química dada, estos compuestos, denominados estereoisómeros, son idénticos, con la excepción de que son imágenes especulares entre sí. Un estereoisómero específico de un par de imágenes especulares tambiénpuede referirse como enantiómero, y normalmente una mezcla de estos isómeros se denomina mezcla enantiomérica. Con respecto a los casos en los que se usa (R) o (S), esto se hace para indicar la configuraciónabsoluta de un sustituyente en el contexto del compuesto entero y no en el contexto del sustituyente solo.
A menos que se indique específicamente otra cosa en este documento, los términos que se indican a continuación tienen las siguientes definiciones.
Las expresiones "mezcla racémica" y "racemato" se refieren a una mezcla equimolar de dos especies enantioméricas, desprovistas de actividad óptica.
El término "quiral" se refiere a moléculas que tienen la propiedad de no poder superponerse con el compañero deimagen especular, mientras que el término "aquiral" se refiere a moléculas que pueden superponerse sobre su compañero de imagen especular.
El término "estereoisómeros" se refiere a compuestos que tienen una composición química idéntica, pero quedifieren en la disposición de los átomos o grupos en el espacio.
El término "diastereómero" se refiere a un estereoisómero que no es un enantiómero, por ejemplo, unestereoisómero con dos o más centros de quiralidad y cuyas moléculas no son imágenes especulares entre sí. Los diastereómeros tienen propiedades físicas diferentes, por ejemplo puntos de fusión, puntos de ebullición, propiedades espectrales y reactividades. Las mezclas de diastereómeros pueden separarse en procedimientosanalíticos de alta resolución tales como electroforesis y cromatografía.
El término "enantiómeros" se refiere a dos estereoisómeros de un compuesto que no son imágenes especulares superimponibles entre sí.
El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad total de cada componente activo que essuficiente para mostrar un beneficio valioso para el paciente, por ejemplo, una reducción sostenida en la carga viral.Cuando se aplica a un ingrediente activo individual, administrado solo, el término se refiere a ese ingrediente solo.Cuando se aplica a una combinación, el término se refiere a cantidades combinadas de los ingredientes activos quedan como resultado el efecto terapéutico, si se administran en combinación, en serie o de forma simultánea.
El término "compuestos de la invención", y expresiones equivalentes, pretenden incluir compuestos de fórmula I, ysales enantioméricas y diastereoméricas farmacéuticamente aceptables, y solvatos, por ejemplo hidratos. De formaanáloga, las referencias a intermedios pretenden incluir sus sales, y solvatos, donde el contexto lo permita. Lasreferencias al compuesto de la invención también incluyen los compuestos preferidos, por ejemplo, de fórmula II y A-
M.
El término "derivado" se refiere a un compuesto modificado químicamente donde la modificación se considerarutinaria para los químicos especialistas, tal como un éster o una amida de un ácido, grupos protectores, tales comoun grupo bencilo para un alcohol o tiol, y un grupo terc-butoxicarbonilo para una amina.
El término "solvato" se refiere a una asociación física de un compuesto de esta invención con una o más moléculasdisolventes, orgánicas o inorgánicas. Esta asociación física incluye unión de hidrógeno. En ciertos casos, el solvatopodrá aislarse, por ejemplo cuando se incorporan una o más moléculas disolventes en la estructura reticularcristalina del sólido cristalino. "Solvato" incluye solvatos de fase en solución e insolubles. Solvatos a modo deejemplo incluyen hidratos, etanolatos, metanolatos, isopropanolatos y similares.
El término “profármaco” tal como se usa en este documento se refiere a derivados de los compuestos de lainvención que tienen grupos escindibles química- o metabólicamente, y transforman, mediante solviosis o bajocondiciones fisiológicas, los compuestos de la invención que son farmacéuticamente activos in vivo. Un profármacode un compuesto se puede formar de una manera convencional con un grupo funcional de los compuestos, talescomo grupos amino, hidroxi o carboxi cuando se presentan. La forma derivada del profármaco ofrece a menudoventajas de solubilidad, compatibilidad de tejido, o liberación retardada en un organismo mamífero (véase Bundgard,H., Design of Prodrugs, páginas 7-9, 21-24, Elsevier, Ámsterdam 1985). Los profármacos incluyen derivados deácido bien conocidos por los practicantes en la técnica, tales como por ejemplo los esteres preparados mediantereacción del compuesto de ácido primario con un alcohol apropiado, o amidas preparadas mediante reacción delcompuesto de ácido primario con una amida apropiada.
El término "paciente" incluye un ser humano y otros mamíferos.
El término "composición farmacéutica" se refiere a una composición que comprende un compuesto de la invenciónjunto con al menos un soporte farmacéutico adicional, es decir, adyuvante, excipiente o vehículo, tal como diluyentes, agentes conservantes, cargas, agentes reguladores de flujo, agentes disgregantes, agenteshumectantes, agentes emulsionantes, agentes de suspensión, agentes edulcorantes, agentes saporíferos, agentesperfumantes, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, agentes lubricantes y agentes de dispersión,dependiendo de la naturaleza de la vía de administración y de las formas de administración. Pueden usarse losingredientes indicados en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª ed., Mack Publishing Company, Easton, PA(1999) por ejemplo.
La expresión "farmacéuticamente aceptable" se emplea en este documento para referirse a los compuestos, materiales, composiciones, por ejemplo, los compuestos y sus enantiómeros, diastereómeros, sales o solvatos, y/oformas de dosificación que, dentro del alcance del juicio médico, son adecuados para el uso en contacto con lostejidos de pacientes para el tratamiento sin toxicidad, irritación o respuesta alérgica excesivas, u otro problema ocomplicación en proporción a una relación riesgo/beneficio razonable.
El término "tratar" se refiere a: (i) prevenir la aparición de una enfermedad, trastorno o afección en un paciente quepuede estar predispuesto a la enfermedad, trastorno y/o afección pero que aún no se ha diagnosticado que la tenga;
(ii) inhibir la enfermedad, trastorno o afección, es decir, detener su desarrollo; y (iii) aliviar la enfermedad, trastorno oafección, es decir, provocar la regresión de la enfermedad, trastorno y/o afección.
El término "sustituido", como se usa en este documento, incluye sustitución de uno al número máximo de sitios deunión posibles en el núcleo, por ejemplo, radical orgánico, al que está unido el sustituyente, por ejemplo, mono-, di-, tri- o tetra- sustituido, a menos que se indique específicamente otra cosa.
La nomenclatura usada para describir radicales orgánicos, por ejemplo, hidrocarbonos e hidrocarbonos sustituidos,sigue generalmente la nomenclatura convencional conocida en la técnica, a menos que se defina específicamente locontrario. Las combinaciones de grupos, por ejemplo, alquilalcoxiamina o arilalquilo, incluyen todas las configuraciones estables posibles, a menos que se indique específicamente lo contrario. Por lo tanto, un sustituyentealquilarilo puede unirse a un segmento del núcleo por la porción alquilo o la porción arilo del sustituyente alquilarilo,con la condición de que el compuesto resultante sea estable. Ciertos radicales y combinaciones se definen a continuación con fines de ilustración.
El término "halo", como se usa en este documento, se refiere a un sustituyente halógeno seleccionado entre bromo,cloro, fluoro o yodo. El término "haloalquilo" se refiere a un grupo alquilo que está sustituido con uno o más sustituyentes halo.
El término "alquilo", como se usa en este documento, se refiere a sustituyentes hidrocarbonados de cadena lineal oramificada, acíclicos, que tienen el número especificado de átomos de carbono e incluyen, por ejemplo, metilo, etilo,propilo, butilo, terc-butilo, hexilo, 1-metiletilo, 1-metilpropilo, 2-metilpropilo, 1,1-dimetiletilo. Por lo tanto, alquilo C1-6 se refiere a un grupo alquilo que tiene de uno a seis átomos de carbono. El término "alquilo inferior" se refiere a un grupo alquilo que tiene de uno a seis, preferiblemente de uno a cuatro, átomos de carbono. El término "alquiléster"se refiere a un grupo alquilo que contiene adicionalmente un grupo éster. En general, un intervalo numérico decarbonos indicado, por ejemplo, alquiléster C2-6, incluye todos los átomos de carbono en el radical.
El término "alquenilo", como se usa en este documento, se refiere a un radical alquilo que contiene al menos undoble enlace, por ejemplo, etenilo (vinilo) y alquilo.
El término "alcoxi", como se usa en este documento, se refiere a un grupo alquilo con el número indicado de átomosde carbono unido a un átomo de oxígeno. Alcoxi incluye, por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi, 1-metiletoxi, butoxi y 1,1-dimetil-etoxi. El último radical se denomina en la técnica terc-butoxi. El término "alcoxicarbonilo" se refiere a un grupo alcoxi que contiene adicionalmente un grupo carbonilo.
El término "cicloalquilo", como se usa en este documento, se refiere a un sustituyente hidrocarbonado cíclico quecontiene el número indicado de átomos de carbono e incluye, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo,ciclohexilo, cicloheptilo y grupos espirocíclicos tales como espirociclopropilo y espirociclobutilo. El término "cicloalcoxi", como se usa en este documento, se refiere a un grupo cicloalquilo unido a un átomo de oxígeno, talcomo, por ejemplo, ciclobutiloxi o ciclopropiloxi. El término "alquilcicloalquilo" se refiere a un grupo cicloalquilo unido
a un grupo alquilo. El intervalo numérico de carbonos indicado incluye el número total de carbonos en el radical, amenos que se indique específicamente lo contrario. Por lo tanto, un alquil C4-10-cicloalquilo puede contener 1-7átomos de carbono en el grupo alquilo y 3-9 átomos de carbono en el anillo, por ejemplo, ciclopropilmetilo ociclohexiletilo.
El término "arilo", como se usa en este documento, se refiere a un resto aromático que contiene el número indicado de átomos de carbono tal como fenilo, indanilo o naftilo. Por ejemplo, arilo C6-10 se refiere a un resto aromático quetiene de seis a diez átomos de carbono que pueden estar en forma de una estructura monocíclica o bicíclica. Eltérmino "haloarilo", como se usa en este documento, se refiere a un arilo mono, di o trisustituido con uno o más átomos de halógeno. Las expresiones "alquilarilo", "arilalquilo" y "aralquilo" se refieren a un grupo arilo sustituido conuno o más grupos alquilo. A menos que se especifique el intervalo de carbonos de cada grupo, el intervalo indicado se aplica al sustituyente entero. Por lo tanto, un grupo alquil C7-14-arilo puede tener 1-8 átomos de carbono en elgrupo alquilo para un aromático monocíclico y 1-4 átomos de carbono en el grupo alquilo para un aromáticocondensado. La unión del grupo al sitio de unión en la molécula puede estar en el grupo arilo o el grupo alquilo. Amenos que se especifique un radical arilo específico, por ejemplo, fluoro-fenilo, o se indique que el radical está sinsustituir, los radicales arilo, por ejemplo, en un sustituyente arilo o un sustituyente alquilarilo, incluyen los sustituidos con sustituyentes típicos conocidos por los especialistas en la técnica, por ejemplo, halógeno, hidroxi, carboxi, carbonilo, nitro, sulfo, amino, ciano, dialquilamino haloalquilo, CF3, haloalcoxi, tioalquilo, alcanoílo, SH, alquilamino,alquilamida, dialquilamida, carboxiéster, alquilsulfona, alquilsulfonamida y alquil(alcoxi)amina. Los ejemplos de grupos alquilarilo incluyen bencilo, butilfenilo y 1-naftilmetilo.
El término "alcanoílo", como se usa en este documento, se refiere a radicales 1-oxoalquilo lineales o ramificados que contienen el número indicado de átomos de carbono e incluyen, por ejemplo, formilo, acetilo, 1-oxopropilo (propionilo), 2-metil-1-oxopropilo, 1-oxohexilo y similares.
El término "alquilamida", como se usa en este documento, se refiere a una amida mono-sustituida con un alquilo, tal como
El término "heterociclo", también denominado "Het", como se usa en este documento, se refiere a heterociclos bicíclicos de 7-12 miembros y heterociclos monocíclicos de 4-7 miembros.
Heterociclos bicíclicos preferidos son sistemas de anillos bicíclicos condensados de 7-12 miembros (ambos anillos comparten un par de átomos adyacentes) que contienen de uno a cuatro heteroátomos seleccionados entre nitrógeno, oxígeno y azufre, donde los dos anillos del heterociclo están totalmente insaturados. Los átomos que son heteroátomos de nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidados. El heterociclo bicíclico puede contenerlos heteroátomos en uno o los dos anillos. A menos que se especifique un heterociclo específico, por ejemplo, unheterociclo bicíclico fluorado de 7-12 miembros, o se indique que el heterociclo está sin sustituir, los heterociclosincluyen los que están sustituidos con sustituyentes típicos conocidos por los especialistas en la técnica. Porejemplo, el heterociclo bicíclico también puede contener sustituyentes sobre cualquiera de los átomos de carbono el anillo, por ejemplo, de uno a tres sustituyentes. Ejemplos de sustituyentes adecuados incluyen alquilo C1-6, cicloalquilo C3-7, alcoxi C1-6, cicloalcoxi C3-7, halo-alquilo C1-6, CF3, mono- o di-halo-alcoxi C1-6, ciano, halo, tioalquilo, hidroxi, alcanoílo, NO2, SH, amino, alquilamino C1-6, di-alquil (C1-6)-amino, di-alquil (C1-6)-amida, carboxilo, carboxiéster (C1-6), alquil C1-6-sulfona, alquil C1-6-sulfonamida, alquil C1-6-sulfóxido, di-alquil (C1-6)-(alcoxi)amina, arilo C6-10, alquilarilo C7-14 y un heterociclo monocíclico de 4-7 miembros. Cuando dos sustituyentes están unidos a átomos de carbono vecinales del heterociclo bicíclico, pueden unirse para formar un anillo, por ejemplo, un sistema de anillos de cinco, seis o siete miembros, que contiene hasta dos heteroátomos seleccionados entre oxígeno ynitrógeno. El heterociclo bicíclico puede unirse a la molécula, por ejemplo, R1 en la fórmula I, en cualquier átomo del anillo y preferiblemente carbono.
Ejemplos de heterociclos bicíclicos incluyen los siguientes sistemas de anillos:
Heterociclos monocíclicos preferidos son sistemas de anillos saturados, parcialmente saturados o totalmente insaturados de 4-7 miembros (este último subconjunto también se denomina en este documento heteroaromáticoinsaturado) que contienen en el anillo de uno a cuatro heteroátomos seleccionados entre nitrógeno, oxígeno yazufre, donde los heteroátomos de azufre y nitrógeno pueden estar opcionalmente oxidados. A menos que seespecifique el heterociclo específico, por ejemplo, un heterociclo monocíclico de 4-7 miembros sustituido con alcoxi C1-6, o se indique que el heterociclo está sin sustituir, los heterociclos incluyen los que están sustituidos consustituyentes típicos conocidos por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, el heterociclo monocíclico tambiénpuede contener sustituyentes en cualquiera de los átomos del anillo, por ejemplo, de uno a tres sustituyentes.Ejemplos de sustituyentes adecuados incluyen alquilo C1-6, cicloalquilo C3-7, alcoxi C1-6, cicloalcoxi C3-7, halo-alquilo C1-6, CF3, mono- o di-halo-alcoxi C1-6, ciano, halo, tioalquilo, hidroxi, alcanoílo, NO2, SH, amino, alquilamino C1-6, dialquil (C1-6)-amino, di-alquil (C1-6)-amida, carboxilo, carboxiéster (C1-6), alquil C1-6-sulfona, alquil C1-6-sulfóxido, alquil C1-6-sulfonamida, di-alquil (C1-6)-(alcoxi)amina, arilo C6-10, alquilarilo C7-14 y un heterociclo monocíclico de 4-7 miembros adicional. El heterociclo monocíclico puede unirse a la molécula, por ejemplo R1 en la fórmula I, en cualquier átomo del anillo.
Ejemplos de heterociclos monocíclicos incluyen los siguientes (y sus tautómeros):
Los especialistas en la técnica reconocerán que los heterociclos usados en los compuestos de la presente invencióndeben ser estables. En general, los compuestos estables son los que pueden sintetizarse, aislarse y formularseusando técnicas conocidas por los especialistas en la técnica sin degeneración del compuesto.
El término "sustituyente" con respecto a un aminoácido o derivado de aminoácido se refiere a un radical obtenido apartir del α-aminoácido correspondiente. Por ejemplo, los sustituyentes metilo, iso-propilo y fenilo representan losaminoácidos alanina, valina y fenilglicina, respectivamente.
Cuando se usan en la denominación de compuestos de la presente invención, las designaciones "P1', P1, P2, P3 yP4", como se usan en este documento, mapean las posiciones relativas de los restos de aminoácidos de un inhibidor de proteasa que se une de forma relativa a la unión del sustrato de escisión peptídica natural. La escisión se produce en el sustrato natural entre P1 y P1' donde las posiciones no primas designan aminoácidos partiendo delextremo terminal C del sitio de escisión peptídica natural que se extiende hacia el extremo N; mientras, las posiciones primas surgen del extremo terminal N de la designación del sitio de escisión y se extienden hacia elextremo C. Por ejemplo, P1' se refiere a la primera posición del extremo del lado derecho del extremo C del sitio de escisión (es decir, la posición del primer extremo N); mientras P1 parte de la numeración del lado izquierdo del sitiode escisión del extremo C, P2: segunda posición del extremo C, etc.) [véase Berger A. & Schechter I., Transactionsof the Royal Society London series (1970), B257, 249-264].
Se describen en este documento compuestos de fórmula I:
en la que:
(a)
R1, R2, R3, R4, R5 y R6 son cada uno independientemente H; alquilo C1-6; cicloalquilo C3-7; alcoxi C1-6; cicloalcoxi C3-7; halo-alcoxi C1-6; halo-alquilo C1-6; ciano; halo; hidroxilo; alcanoílo C1-6; nitro; amino; mono o dialquil (C1-6)-amina; mono o di-cicloalquil (C3-7)-amina; mono o di-alquil C1-6-amida; mono o di-cicloalquil (C3-7)amida; carboxilo; carboxiéster (C1-6); tiol; tioalquilo C1-6; alquilsulfóxido C1-6; alquil C1-6-sulfona; alquil C1-6sulfonamida; arilo C6-10 opcionalmente sustituido con Het; alquilarilo C7-14; ariloxi C6-10; alquilariloxi C7-14; heteroariloxi monocíclico de 4-7 miembros; o Het; dichos R1 a R6 opcionalmente unidos al grupo isoquinolina mediante un grupo enlazador alquilo C1-6;
(b)
R7 es NH2 o -NR10R11; donde R10 es alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, C(O)-NR12R13, C(O)-OR14, C(O)-SR15 o C(O)-R16; R11 es H, alquilo C1-6 o haloalquilo C1-6, con la condición de que si R12 o R13 es H entonces R11 sea H; R12 y R13 son cada uno independientemente H; alquilo C1-6, cicloalquilo C3-7 o alquilcicloalquilo C4-10, cada uno opcionalmente sustituido con halo, alcoxi C1-3, haloalcoxi C1-3, alquilo C1-3 o haloalquilo C1-3; o arilo; y donde R12 y R13 junto con el nitrógeno al que están unidos pueden formar un heterociclo de 4-7 miembros; R14 y R15 son cada uno independientemente alquilo C1-6, cicloalquilo C3-7 o alquilcicloalquilo C4-10, cada uno opcionalmente sustituido con halo, alcoxi C1-3, haloalcoxi C1-3, alquilo C1-3 o haloalquilo C1-3; arilo o Het; R16 es H; alquilo C1-6, cicloalquilo C3-7 o alquilcicloalquilo C4-10, cada uno opcionalmente sustituido con halo, alcoxi C1-3, haloalcoxi C13, alquilo C1-3 o haloalquilo C1-3; arilo o Het;
(c)
R8 y R9 son cada uno independientemente H o alquilo C1-3 opcionalmente sustituido con halo, o alcoxi C1-3,
o haloalcoxi C1-3;
(d)
Q es una cadena C3-9 saturada o insaturada que contiene opcionalmente de uno a tres heteroátomosseleccionados independientemente entre O, S(O)m; donde m es 0, 1 ó 2 o NR17, donde R17 es H; alquilo C1-6 o cicloalquilo C1-6; cada uno opcionalmente sustituido con halo, alcoxi C1-6, ciano o haloalcoxi C1-6; -C(O)-R18, C(O)-OR19, C(O)-NR20R21 o -SO2R22; R18, R20 y R21 son cada uno independientemente H; alquilo C1-6 o cicloalquilo C1-6, cada uno opcionalmente sustituido con halo, alcoxi C1-6, ciano o haloalcoxi C1-6; R19 es alquilo C1-6 o cicloalquilo C1-6, cada uno opcionalmente sustituido con halo, alcoxi C1-6, ciano o haloalcoxi C1-6; R22 es arilo, alquilo C1-6 o cicloalquilo C1-6, cada uno opcionalmente sustituido con halo, alcoxi C1-6, ciano o haloalcoxi C1-6; y
(e)
W es OH, -NH-SOn-R23 o NH-SOn-R24; donde n es 1 ó 2, R23 es alquilo C1-8, alquilcicloalquilo C4-10, cicloalquilo C3-7 sin sustituir, o ciclopropilo o ciclobutilo opcionalmente sustituido con alquil C7-9-arilo o alquilo C14 opcionalmente sustituido con halo, alcoxi C1-3, ciano, amina, mono o di-alquil C1-6-amina, mono o di-alquil C1-6amida o carboxilato; y R24 es arilo C6-10 o Het;
o un enantiómero, diastereómero, sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable de los mismos.
Preferiblemente, R1 se une a la posición C3 y se selecciona entre H; alquilo C1-6; cicloalquilo C3-7; alcoxi C1-6;
cicloalcoxi C3-7; halo-alcoxi C1-6; halo-alquilo C1-6; ciano; halo; alcanoílo C1-6; mono o di-alquil (C1-6)-amina; mono o dialquil C1-6-amida; carboxilo; arilo C6-10 opcionalmente sustituido con Het; alquilarilo C7-14; ariloxi C6-10 o Het. Preferiblemente, R2, R3, y R4 se unen a las posiciones C4, C5 y C6, respectivamente, y cada uno se selecciona independientemente entre H; alquilo C1-6; cicloalquilo C3-7; alcoxi C1-6; cicloalcoxi C3-7; halo-alcoxi C1-6; halo-alquilo C1-6; ciano; halo; hidroxilo; alcanoílo C1-6; mono o di-alquil (C1-6)-amina; mono o di-cicloalquil (C3-7)-amina; mono o dialquil C1-6-amida; mono o di-cicloalquil (C3-7)-amida; carboxilo; arilo C6-10 opcionalmente sustituido con Het; alquilarilo C7-14; ariloxi C6-10; o Het. Preferiblemente, R5 y R6 se unen a las posiciones C7 y C8, respectivamente, y cada uno se selecciona independientemente entre H; alquilo C1-3; cicloalquilo C3-4; alcoxi C1-3; cicloalcoxi C3-4; halo-alcoxi C1-3; halo-alquilo C1-3; ciano; halo; hidroxilo; alcanoílo C1-3; mono o di-alquil (C1-3)-amina; mono o di-cicloalquil (C3-4)amina; mono o di-alquil C1-3-amida; mono o di-cicloalquil (C3-4)-amida; o carboxilo. Si se desea, uno o más de los sustituyentes R1, R2, R3, R4, R5 y R6 puede unirse al grupo isoquinolina mediante un grupo enlazador alquilo C1-6, por ejemplo, un grupo metileno.
Preferiblemente, Q es una cadena C3-9 saturada o insaturada que contiene opcionalmente de uno a tres heteroátomos seleccionados independientemente entre O, S(O)m; donde m es 0, 1 ó 2 o NR17, donde R17 es H; alquilo C1-6, cicloalquilo C1-6, -C(O)-R18, C(O)-OR19, C(O)-NR20R21 o -SO2R22. Preferiblemente, R18, R20 y R21 son cada uno independientemente H; alquilo C1-6 o cicloalquilo C1-6; R19 es alquilo C1-6 o cicloalquilo C1-6; y R22 es arilo, alquilo C1-6 o cicloalquilo C1-6, cada uno opcionalmente sustituido con halo.
Preferiblemente, W es OH, -NH-SOn-R23 o NH-SOn-R24 donde n es 1 ó 2, R23 es cicloalquilo C3-7 sin sustituir, ciclopropilo o ciclobutilo opcionalmente sustituido con alquil C7-9-arilo o alquilo C1-4; y R24 es arilo C6-10 o Het.
Además se describen en este documento compuestos de fórmula II:
en la que:
(a)
R1 es H; alquilo C1-6; cicloalquilo C3-7; alcoxi C1-6; cicloalcoxi C3-7; halo-alcoxi C1-6; halo-alquilo C1-6; ciano; halo; alcanoílo C1-6; mono o di-alquil (C1-6)-amina; mono o di-alquil C1-6-amida; carboxilo; arilo C6-10 opcionalmente sustituido con Het; alquilarilo C7-14; ariloxi C6-10 o Het; dicho R1 opcionalmente unido al grupo isoquinolina mediante un grupo enlazador alquilo C1-6; R2, R3 y R4 son cada uno independientemente H; alquilo C1-6; cicloalquilo C3-7; alcoxi C1-6; cicloalcoxi C3-7; halo-alcoxi C1-6; halo-alquilo C1-6; ciano; halo; hidroxilo; alcanoílo C1-6; mono o di-alquil (C1-6)-amina; mono o di-cicloalquil (C3-7)-amina; mono o di-alquil C1-6-amida; mono o di-cicloalquil (C3-7)-amida; carboxilo; arilo C6-10 opcionalmente sustituido con Het; alquilarilo C7-14; ariloxi C6-10; o Het; dichos R2 a R4 opcionalmente unidos al grupo isoquinolina mediante un grupo enlazador alquilo C13; R5 y R6 son cada uno independientemente H; alquilo C1-3; cicloalquilo C3-4; alcoxi C1-3; cicloalcoxi C3-4; haloalcoxi C1-3; halo-alquilo C1-3; ciano; halo; hidroxilo; alcanoílo C1-3; mono o di-alquil (C1-3)-amina; mono o dicicloalquil (C3-4)-amina; mono o di-alquil C1-3-amida; mono o di-cicloalquil (C3-4)-amida; o carboxilo;
(b)
R7 es NH2 o -NR10R11; donde R10 es alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, C(O)-NR12R13, C(O)-OR14 o -C(O)-R16; R11 es H, alquilo C1-6 o haloalquilo C1-6, con la condición de que si R12 o R13 es H entonces R11 sea H; R12 y R13 son cada uno independientemente H; alquilo C1-6, cicloalquilo C3-7 o alquilcicloalquilo C4-10, cada uno opcionalmente sustituido con halo, alcoxi C1-3, haloalcoxi C1-3, alquilo C1-3 o haloalquilo C1-3; y donde R12 y R13 junto con el nitrógeno al que están unidos pueden formar un heterociclo de 4-7 miembros; R14 y R15 son cada uno independientemente alquilo C1-6, cicloalquilo C3-7 o alquilcicloalquilo C4-10, cada uno opcionalmente sustituido con halo, alcoxi C1-3, haloalcoxi C1-3, alquilo C1-3 o haloalquilo C1-3; R16 es H; alquilo C1-6, cicloalquilo C3-7 o alquilcicloalquilo C4-10, cada uno opcionalmente sustituido con halo, alcoxi C1-3, haloalcoxi C1-3, alquilo C1-3 o
haloalquilo C1-3; arilo o Het;
(c)
R8 y R9 son cada uno independientemente H o alquilo C1-3 opcionalmente sustituido con halo, o alcoxi C1-3 o haloalcoxi C1-3,
(d)
Q es una cadena C3-9 saturada o insaturada que contiene opcionalmente de uno a tres heteroátomos
5 seleccionados independientemente entre O, S(O)m; donde m es 0, 1 ó 2 o NR17, donde R17 es H; alquilo C1-6, cicloalquilo C1-6, -C(O)-R18, C(O)-OR19, C(O)-NR20R21 o -SO2R22; R18, R20 y R21 son cada uno independientemente H; alquilo C1-6 o cicloalquilo C1-6; R19 es alquilo C1-6 o cicloalquilo C1-6; R22 es arilo, alquilo C1-6 o cicloalquilo C1-6, cada uno opcionalmente sustituido con halo; y
(e) W es OH, -NH-SOn-R23 o NH-SOn-R24, donde n es 1 ó 2, R23 es cicloalquilo C3-7 sin sustituir, o ciclopropilo o 10 ciclobutilo opcionalmente sustituido con alquil C7-9-arilo o alquilo C1-4; y R24 es arilo C6-10 o Het;
o un enantiómero, diastereómero, sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable de los mismos.
Preferiblemente, R1 es H; alcoxi C1-3; mono o di-alquil (C1-6)-amina; un heterociclo monocíclico de 5 ó 6 miembros; o arilo C6-10 opcionalmente sustituido con un heterociclo monocíclico de 5 ó 6 miembros. Preferiblemente, R2, R3, R4 yR5 son cada uno independientemente H; alcoxi C1-6; halo-alcoxi C1-6; hidroxilo; o mono o di-alquil (C1-6)-amina.
15 Preferiblemente, R7 es NH2 o -NHR10; donde R10 es C(O)-N R12R13 o C(O)-OR14; y R12 y R13 son alquilo C1-6 opcionalmente sustituido con halo; y R14 es alquilo C1-6 o cicloalquilo C3-7 opcionalmente sustituido con halo.
Preferiblemente, Q es una cadena de C5-7 miembros que tiene un doble enlace que contiene opcionalmente unheteroátomo seleccionado independientemente entre O S(O)m; donde m es 0, 1 ó 2 o NR17, donde R17 es H; alquilo C1-6 o cicloalquilo C1-6. En un aspecto preferido de la invención, Q tiene la siguiente estructura:
en la que P es una cadena saturada C3 que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado independientemente entre O, S(O)m; donde m es 0, 1 ó 2 o NR17 (como se ha definido en el compuesto de Fórmula II).
En un aspecto de la invención, W es preferiblemente -NH-SOn-R23, donde n es 1 ó 2 y R23 es cicloalquilo C3-7 sin
25 sustituir, o ciclopropilo o ciclobutilo opcionalmente sustituido con alquil C7-9-arilo o alquilo C1-4. En otro aspecto de la invención, W es NH-SOn-R24, donde n es 1 ó 2 y R24 es Het.
Preferiblemente, cuando R24 es Het, el Het se selecciona entre el grupo constituido por:
Además se describen en este documento compuestos de fórmula III:
en la que:
(a) R1 es H; alcoxi C1-3; di-alquil (C1-6)-amina; un heterociclo monocíclico de 5 ó 6 miembros; o arilo C6-10
opcionalmente sustituido con un heterociclo monocíclico de 5 ó 6 miembros; R2, R3, R4 y R5 son cada uno 5 independientemente H; alcoxi C1-3; halo; o di-alquil (C1-6)-amina;
(b)
R7 es -NHR10; donde R10 es C(O)-NHR13 o C(O)-OR14; R13 y R14 son alquilo C1-6;
(c)
Q es una cadena de C5-7 miembros que tiene un doble enlace que contiene opcionalmente un heteroátomoseleccionado independientemente entre O, S(O)m; donde m es 0, 1 ó 2 o NR17, donde R17 es H; alquilo C1-6 o cicloalquilo C1-6; y
10 (d) R23 es cicloalquilo C3-7 sin sustituir, o ciclopropilo o ciclobutilo opcionalmente sustituido con alquil C7-9-arilo o alquilo C1-4;
o un enantiómero, diastereómero, sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable de los mismos.
Preferiblemente, R1 se selecciona entre el grupo constituido por piridina, pirrolidina, morfolina, piperazina, oxazol,isoxazol, tiazol, imidazol, pirrol y pirazol. En un aspecto preferido, R1 es fenilo opcionalmente sustituido con uno o
15 más miembros seleccionados entre el grupo constituido por alcoxi C1-3, halo, carboxilo, di-alquil (C1-3)-amina, haloalquilo C1-3, trifluorometilo, trifluorometoxi e hidroxi. En otro aspecto preferido, R1 es di-alquil (C1-3)-amina. En otro aspecto preferido, R1 es piperazina sustituida con uno o más miembros seleccionados entre el grupo constituido por alquilo C1-3, cicloalquilo C5-7 o piridina. Preferiblemente, R2 es cloro o fluoro. En un aspecto preferido, R2 es dialquil (C1-3)-amina o metoxi.
20 En un aspecto preferido, Q tiene una estructura seleccionada entre las siguientes:
En otro aspecto preferido, Q tiene una estructura seleccionada entre las siguientes:
Ejemplos de compuestos preferidos de acuerdo con la invención se seleccionan entre el grupo constituido por
Los compuestos descritos en este documento, que contienen un resto básico, pueden formar sales mediante laadición de un ácido farmacéuticamente aceptable. Las sales de adición de ácidos se forman a partir de uncompuesto de Fórmula I y un ácido inorgánico farmacéuticamente aceptable, incluyendo clorhídrico, bromhídrico,yodhídrico, sulfúrico, fosfórico, o un ácido orgánico tal como p-toluenosulfónico, metanosulfónico, acético, benzoico, cítrico, malónico, fumárico, maleico, oxálico, succínico, sulfámico o tartárico. Por lo tanto, los ejemplos de dichassales farmacéuticamente aceptables incluyen cloruro, bromuro, yoduro, sulfato, fosfato, metanosulfonato, citrato,acetato, malonato, fumarato, sulfamato y tartrato.
Las sales de un grupo amina también pueden comprender sales de amonio cuaternario en las que el nitrógeno del amino tiene un grupo orgánico adecuado tal como un resto alquilo, alquenilo, alquinilo o aralquilo.
Los compuestos descritos en este documento, que están sustituidos con un grupo ácido, pueden existir en forma desales formadas a través de adición de bases. Dichas sales de adición de bases incluyen las obtenidas a partir debases inorgánicas que incluyen, por ejemplo, sales de metales alcalinos (por ejemplo, sodio y potasio), sales demetales alcalinotérreos (por ejemplo, calcio y magnesio), sales de aluminio y sales de amonio. Además, las sales deadición de bases adecuadas incluyen sales de bases orgánicas fisiológicamente aceptables tales como trimetilamina, trietilamina, morfolina, piridina, piperidina, picolina, diciclohexilamina, N,N'-dibenciletilendiamina, 2hidroxietilamina, bis-(2-hidroxietil)amina, tri-(2-hidroxietil)amina, procaína, dibencilpiperidina, N-bencil-β-fenetilamina, dehidroabietilamina, N,N'-bishidroabietilamina, glucamina, N-metilglucamina, colidina, quinina, quinolina, etilendiamina, ornitina, colina, N,N'-bencilfenetilamina, cloroprocaína, dietanolamina, dietilamina, piperazina,tris(hidroximetil)aminometano e hidróxido de tetrametilamonio y aminoácidos básicos tales como lisina, arginina y Nmetilglutamina. Estas sales pueden prepararse por procedimientos conocidos por los especialistas en la técnica.
Listas de sales adecuadas se encuentran, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990, p. 1445.
Ciertos compuestos descritos en este documento, y sus sales, también pueden existir en forma de solvatos conagua, por ejemplo hidratos, o con disolventes orgánicos tales como metanol, etanol o acetonitrilo para formar, respectivamente, un metanolato, etanolato o acetonitrilato.
Además, los compuestos descritos en este documento, o una sal o solvato de los mismos, pueden mostrar polimorfismo.
Los compuestos descritos en este documento (Fórmula I, II o III) también contienen dos o más centros quirales yexisten en diferentes formas ópticamente activas. Por ejemplo, los compuestos de Fórmula I pueden incluir un grupo ciclopropilo como se representa en el fragmento P1 a continuación:
en el que cada uno de C1 y C2 representa un átomo de carbono asimétrico en las posiciones 1 y 2 del anillociclopropilo. A pesar de otros centros asimétricos posibles en otros segmentos de los compuestos de la invención, lapresencia de estos dos centros asimétricos significa que los compuestos pueden existir como mezclas de diastereómeros, tales como los diastereómeros de compuestos de Fórmula III en la que Q se configura syn con respecto a la amida o syn con respecto al carbonilo como se muestra a continuación.
Se describen en este documento ambos enantiómeros y mezclas de enantiómeros de los compuestos, tales comomezclas racémicas.
10 Los enantiómeros pueden separarse por procedimientos conocidos por los especialistas en la técnica, por ejemplo, por medio de la formación de sales diastereoisoméricas que pueden separarse por cristalización, cromatografía degas-líquido o de líquidos, reacción selectiva de un enantiómero con un reactivo específico de enantiómero. Seapreciará que cuando el enantiómero deseado se convierte en otra entidad química por una técnica de separación,entonces se requiere una etapa adicional para formar la forma enantiomérica deseada. Como alternativa, los
15 enantiómeros específicos pueden sintetizarse por síntesis asimétrica usando reactivos, sustratos, catalizadores o disolventes ópticamente activos, o convirtiendo un enantiómero en el otro por transformación asimétrica.
Ciertos compuestos descritos en este documento también pueden existir en diferentes formas conformacionales quepueden ser separables. La asimetría torsional debida a la rotación restringida alrededor de un enlace sencilloasimétrico, por ejemplo debido a la obstaculización estérica o carga del anillo, puede permitir la separación de
20 diferentes confórmeros. Ciertos compuestos descritos en este documento pueden existir en forma zwiteriónica y se describe en este documento cada forma zwiteriónica de estos compuestos y mezclas de los mismos.
Los materiales de partida útiles para sintetizar los compuestos descritos en este documento son conocidos por losespecialistas en la técnica y pueden fabricarse fácilmente o están disponibles en el mercado.
Los compuestos descritos en este documento pueden fabricarse por procedimientos conocidos por los especialistas
25 en la técnica. Los siguientes procedimientos que se muestran a continuación se proporcionan con fines ilustrativos y no tienen la intención de limitarse al campo de acción de la invención reivindicada. Por ejemplo, los compuestos quetienen la estructura de Fórmula I, II o III pueden sintetizarse, como se muestra en el siguiente esquema, a partir decompuestos de Fórmula IV, Fórmula VIIA o VIIB. Se apreciará que puede preferirse o ser necesario preparar dichocompuesto en el que un grupo funcional se protege usando un grupo protector convencional para retirar después el
30 grupo protector y proporcionar un compuesto de la presente invención. Los detalles referentes al uso de grupos
protectores de acuerdo con la presente invención son conocidos por los especialistas en la técnica.
El ácido α-carboxílico de un compuesto de Fórmula VIIA o VIIB se acopla con R23SO2NH2 (R23 como se ha definido anteriormente) en presencia de un agente de acoplamiento de péptidos, tal como CDI o EDAC, y en presencia deuna base, tal como 4-dimetilaminopiridina (4-DMAP) y/o 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU), para formar un5 compuesto de Fórmula I, II o III. En la construcción de compuestos de Fórmula I, el extremo P1' se incorpora en las moléculas usando uno de los procedimientos generales indicados anteriormente y que se describen con más detallea continuación. En algunos ejemplos, los elementos P1', que son las cicloalquilsulfonamidas, alquilsulfonamidas oheteroarilsulfonamidas, están disponibles en el mercado o pueden prepararse a partir del cloruro de alquil-ocicloalquil-sulfonilo correspondiente por tratamiento de dicho cloruro de sulfonilo con amoniaco. Como alternativa,10 estas sulfonamidas pueden sintetizarse usando el procedimiento general indicado en el siguiente Esquema. En él, el cloruro de 3-cloro-propilsulfonilo (1) disponible en el mercado se convierte en una sulfonamida protegida adecuada,por ejemplo, por tratamiento con terc-butil amina. Después, la sulfonamida obtenida (2) se convierte en la cicloalquilsulfonamida correspondiente por tratamiento con dos equivalentes de una base tal como butil litio en undisolvente tal como THF a baja temperatura. La cicloalquilsulfonamida resultante puede desprotegerse por15 tratamiento con un ácido para proporcionar la cicloalquilsulfoamida desprotegida deseada. Dicho fragmento P1'
puede incorporarse en compuestos de Fórmula I.
Los compuestos que tienen la estructura de Fórmula IV, VI, VIIA o VIIB pueden prepararse, por ejemplo, como sedescribe en este documento, y en la Solicitud Internacional Número PCT/US01/45145, Publicación N.º WO
02/060926, publicada el 8 de agosto de 2002; Solicitud Internacional Número PCT/CA00/00353, Publicación N.º WO00/59929, publicada el 12 de octubre de 2000; y Patente de Estados Unidos 6.323.180 concedida el 27 de noviembre de 2001.
Los compuestos que tienen la estructura de Fórmula IV también pueden prepararse acoplando el precursor químicoA con el precursor químico B como se muestra a continuación.
El precursor químico B, que también se ha mostrado anteriormente, puede sintetizarse, por ejemplo, como se indicaa continuación.
10 El tratamiento de la imina (B1) disponible en el mercado o fácilmente sintetizable con 1,4-dihalobuteno (B2) en presencia de una base proporciona la imina (B3). La hidrólisis ácida de B3 proporciona después B, que tiene unsustituyente de vinilo syn con respecto al grupo carboxilo. Se prefiere que para los compuestos B3 y B el grupo vinilosea syn con respecto al éster. El resto amina de B puede protegerse usando un grupo Boc para proporcionar elaminoácido totalmente protegido B4. Este intermedio es un racemato que puede separarse por un proceso
15 enzimático en el que el resto éster de B4 se escinde para proporcionar el ácido carboxílico correspondiente. Sin unirse a ninguna teoría particular, se cree que esta reacción es selectiva en que uno de los enantiómeros B4 (1S,2R) experimenta la reacción a una velocidad mucho mayor que su imagen especular B4 (1R, 2S) proporcionando una separación cinética del racemato intermedio. En el ejemplo citado anteriormente, el estereoisómero más preferido para la integración en los tripéptidos es B4 (1R, 2S). En presencia de la enzima, este enantiómero noexperimenta escisión del éster y por lo tanto este enantiómero B5 se recupera de la mezcla de reacción. Sinembargo, el enantiómero menos preferido B4 (1S, 2R) experimenta escisión del éster, es decir, hidrólisis catalizadacon enzimas, para proporcionar el ácido libre B6. El éster (B5) puede separarse del producto ácido (B6) por
5 procedimientos convencionales tales como, por ejemplo, procedimientos de extracción acuosa o cromatografía.
Los compuestos de Fórmula 1 también pueden convertirse en otros compuestos de Fórmula I como se describe eneste documento. Un ejemplo de dicho procedimiento es el Esquema que se muestra a continuación, en el que uncompuesto de Fórmula I(1) que tiene un grupo Boc en la posición P4 se convierte en un compuesto de Fórmula I (3)en el que dicho compuesto tiene un grupo urea en la posición P4. La conversión de (1) en (3) puede realizarse en un10 procedimiento de dos etapas, la primera de las cuales es la conversión de (1) en la amina (2) por tratamiento de (1) con un ácido tal como TFA en un disolvente tal como cloruro de metileno. La sal TFA de amina resultante puedetratarse con un isocianato en presencia de un equivalente de base para proporcionar un compuesto de Fórmula I (3)en la que el resto P3 se tapa con una urea. Como se ha indicado previamente, un especialista en la técnicareconocerá que el intermedio (2) puede usarse como material de partida para la preparación de compuestos de
15 Fórmula I en la que el grupo P3 se tapa con una amida o un carbamato. La construcción de dichos compuestos de Fórmula I puede conseguirse usando condiciones convencionales para la formación de dichas funcionalidades P4 a partir de aminas.
Se muestran en los siguientes Esquemas procedimientos para preparar intermedios P2 y compuestos de Fórmula I.
20 Debe observarse que en muchos casos las reacciones se representan para una sola posición de un intermedio. Sin embargo, debe entenderse que dichas reacciones pueden usarse para otorgar modificaciones a otras posicionesdentro de este intermedio. Además, dichos intermedios, condiciones de reacción y procedimientos dados en losejemplos específicos pueden aplicarse ampliamente a compuestos con otros patrones de sustitución. Los Esquemasgenerales que se muestran a continuación se siguen de los ejemplos de este documento. Los ejemplos generales y
25 de síntesis no son limitantes.
El Esquema anterior muestra el acoplamiento de un resto C4-hidroxiprolina N-protegido con un heterociclo deisoquinolina para formar el intermedio (4) y la posterior modificación de dicho intermedio (4) para dar un compuestode Fórmula I por el procedimiento de elongación de péptido y una reacción de metátesis de olefina con cierre delanillo como se describe en este documento. Debe observarse que en la primera etapa, que es el acoplamiento del grupo C4-hidroxi prolina con el elemento de isoquinolina, se emplea una base. Un especialista en la técnicareconocerá que este acoplamiento puede realizarse usando bases tales como terc-butóxido potásico o hidrurosódico, en un disolvente tal como DMF o DMSO o THF. Este acoplamiento con el sistema de anillos de isoquinolinase produce en la posición C1 (numeración para el sistema de anillos de isoquinolina mostrada en el intermedio 2) yse dirige por el grupo cloro que se desplaza en este procedimiento. Debe observarse que pueden usarse grupos salientes alternativos en esta posición tales como un fluoro como se muestra en el Esquema. Dichos intermedios defluoro (3) están disponibles a partir del compuesto de cloro correspondiente usando procedimientos bibliográficosdescritos en este documento.
En un subconjunto de ejemplos de este documento, se incorporan isoquinolinas en los compuestos finales yespecíficamente en la región P2 de dichos compuestos. Un especialista en la técnica reconocerá que hay disponibles varios procedimientos generales para la síntesis de isoquinolinas. Además, dichas isoquinolinasgeneradas por estos procedimientos pueden incorporarse fácilmente en los compuestos finales de Fórmula I usando los procedimientos descritos en este documento. En el siguiente esquema se muestra una metodología general parala síntesis de isoquinolinas, donde derivados de ácido cinnámico, mostrados en forma general como la estructura (2)
se convierten en 1-cloroisoquinolinas en un procedimiento de cuatro etapas. Dichas cloroisoquinolinas puedenusarse posteriormente en reacciones de acoplamiento con derivados de C4-hidroxiprolina como se describe en estedocumento. La conversión de ácidos cinnámicos en cloroquinolinas comienza con el tratamiento de ácido cinnámicocon un cloroformiato de alquilo en presencia de una base. Después, el anhídrido resultante se trata con azidasódica, lo que da como resultado la formación de una acilazida (3) como se muestra en el Esquema. Otros procedimientos alternativos están disponibles para la formación de acilazidas a partir de ácidos carboxílicos, porejemplo, dicho ácido carboxílico puede tratarse con difenilfosforilazida (DPPA) en un disolvente aprótico tal comocloruro de metileno en presencia de una base. En la siguiente etapa de la secuencia de reacción, la acilazida (3) seconvierte en la isoquinolona correspondiente (4) como se muestra en el Esquema. En ese caso, la acilazida secalienta a una temperatura de aproximadamente 190 ºC en un disolvente con alto punto de ebullición tal como el difenilmetano. Esta reacción es general y proporciona rendimientos de moderados a buenos de la isoquinolonasustituida a partir de los derivados de ácido cinnámico correspondientes. Debe observarse que dichos derivados deácido cinnámico están disponibles en el mercado o pueden obtenerse a partir del derivado de benzaldehído correspondiente (1) por condensación directa con ácido malónico o derivados del mismo y también empleando una reacción de Wittig. Las isoquinolonas intermedias (4) pueden convertirse en la 1-cloroisoquinolina correspondiente por tratamiento con oxicloruro de fósforo. Esta reacción es general y puede aplicarse a cualquiera de las isoquinolonas mostradas en este documento para convertir un sustituyente hidroxi en el compuesto de cloro correspondiente.
Un procedimiento alternativo para la síntesis del sistema de anillos de isoquinolina es el procedimiento de Pomeranz-Fritsh. Este procedimiento general se resume a continuación. El procedimiento comienza con laconversión de un derivado de benzaldehído (1) en una imina funcionalizada (2). Después, dicha imina se convierteen el sistema de anillos de isoquinolina por tratamiento con ácido a temperatura elevada.
10 Esta síntesis de isoquinolina que se ha indicado anteriormente es general, y debe observarse que este procedimiento es particularmente útil en la producción de intermedios de isoquinolina que están sustituidos en laposición C8 (nota: en el intermedio (3) del Esquema anterior, la posición C8 del anillo de isoquinolina está sustituidacon el sustituyente R6). Las isoquinolinas intermedias (3) pueden convertirse en las 1-cloroquinolinascorrespondientes (5) en un procedimiento de dos etapas como el mostrado. La primera etapa en esta secuencia es
15 la formación del N-óxido de isoquinolina (4) por tratamiento de la isoquinolina (3) con ácido meta-cloroperbenzoico en un disolvente aprótico tal como diclorometano. El intermedio (4) puede convertirse en la 1-cloroisoquinolinacorrespondiente por tratamiento con oxicloruro de fósforo en cloroformo a la temperatura de reflujo.
A continuación se muestra otro procedimiento para la síntesis del sistema de anillos de isoquinolina. En esteprocedimiento, un derivado de orto-alquilbenzamida (1) se trata con una base fuerte
tal como terc-butil litio en un disolvente tal como THF a baja temperatura. Después, a esta mezcla de reacción se le
añade un derivado de nitrilo, que experimenta una reacción de adición con el anión obtenido a partir de la
desprotonación de (1), dando como resultado la formación de (2). Esta reacción es general y puede usarse para la
formación de isoquinolinas sustituidas. El intermedio (2) del esquema anterior puede convertirse en la 125 cloroisoquinolina correspondiente por los procedimientos descritos en este documento. A continuación se muestra
un procedimiento adicional para la síntesis de isoquinolinas. La desprotonación del intermedio (1) usando terc-butil
litio se ha descrito anteriormente. Sin embargo, en presente procedimiento, dicho anión intermedio se purga con un
éster, dando como resultado la formación del intermedio (2) como se muestra a continuación. En una reacción
posterior, la cetona (2) se condensa con acetato de amonio a temperatura elevada, proporcionando la formación de30 la quinolona (3). Esta reacción es general y puede aplicarse para la construcción de isoquinolonas sustituidas que
después se convierten en las 1-cloroisoquinolinas correspondientes como se describe en este documento.
Otro método adicional para la construcción de isoquinolinas se encuentra en el siguiente esquema. En la primeraetapa de este procedimiento, un derivado de orto-alquilarilimina tal como (1) se somete a condiciones de desprotonación (sec-butil litio, THF) y el anión resultante se inactiva
5 mediante la adición de un derivado de ácido carboxílico activado tal como una amida de Weinreb. La ceto imina resultante (2) puede convertirse en la isoquinolina correspondiente por condensación con acetato de amonio atemperaturas elevadas. Este procedimiento es general y puede usarse para la síntesis de isoquinolinas sustituidas.Dichas isoquinolinas pueden convertirse en la 1-cloroisoquinolina correspondiente por los procedimientos descritosen este documento.
10 La construcción de sistemas de anillos de isoquinolina funcionalizada también es posible empleando reacciones de cicloadición [4+2]. Por ejemplo, como se muestra a continuación, el uso de isociantos de vinilo (1) en reacciones decicloadición con precursores de bencino (2) proporciona isoquinolonas funcionalizadas (3). Dichas isoquinolinaspueden incorporarse en compuestos de Fórmula I usando los procedimientos descritos en este documento.
15 Las isoquinolinas descritas en este documento, y que se incorporan en los compuestos de Fórmula I, pueden funcionalizarse adicionalmente. Es evidente para un especialista en la técnica que la funcionalización adicional dedichos heterociclos puede realizarse antes o después de la incorporación de estas funcionalidades en compuestosde Fórmula I. Los siguientes esquemas ilustran este punto. Por ejemplo, el siguiente esquema muestra la conversiónde una 1-cloro-6-fluoro-isoquinolina
en la especie de 1-cloro-6-alcoxi-isoquinolina correspondiente, por tratamiento de (1) de (ec. 1) con una especie dealcóxido sódico o potásico en el disolvente alcohólico del que se obtiene el alcóxido a temperatura ambiente. Enalgunos casos, puede ser necesario calentar la reacción para completarla. El intermedio (2) de la ecuación 1 puede incorporarse en compuestos de Fórmula I por las enseñanzas de este documento. Como se muestra en la ecuación2, la reacción análoga también puede realizarse sobre un sustrato en el que el elemento 6-fluoro-isoquinolina se ha incorporado en el macrociclo. Aquí, el tratamiento del intermedio 2 de la ecuación 2 con una especie de alcóxidosódico o potásico en el disolvente alcohólico a partir del cual se obtiene el alcóxido puede proporcionar compuestosde Fórmula 1.
El esquema que se muestra a continuación proporciona un ejemplo general para la modificación de isoquinolinasque se han definido en este documento empleando reacciones de acoplamiento de paladio. Dichos acoplamientos pueden emplearse para funcionalizar una isoquinolina en cada posición del sistema de anillos, con la condición deque dicho anillo se active o funcionalice adecuadamente, como por ejemplo con un cloruro, como se muestra en el esquema. Esta secuencia comienza con la 1-cloroisoquinolina (1) que, después del tratamiento con ácido metacloroperbenzoico, puede convertirse en el N-óxido correspondiente (2). Dicho intermedio (2) puede convertirseen la 1,3-dicloroisoquinolina correspondiente (3) por tratamiento con oxicloruro de fósforo en cloroformo a la temperatura de reflujo. el intermedio (3) puede acoplarse con N-Boc-4-hidroxiprolina por los procedimientos descritosen este documento para proporcionar el intermedio (5) que se muestra en el Esquema. El intermedio (5) puedeexperimentar un acoplamiento de Suzuki con un ácido arilborónico, en presencia de un reactivo de paladio y unabase, y en un disolvente tal como THF o tolueno o DMF para proporcionar el intermedio de C3-arilisoquinolina (6).Los ácidos heteroarilborónicos también pueden emplearse en este procedimiento de acoplamiento de Pd para proporcionar C3-heteroarilisoquinolinas. El intermedio (6) puede convertirse en los compuestos finales de Fórmula Ipor los procedimientos descritos en este documento.
Los acoplamientos mediados con paladio de sistemas de heteroarilo con elementos arilo o heteroarilo tambiénpueden emplearse en una etapa sintética posterior en la construcción de compuestos de Fórmula I como se muestra a continuación. Aquí, el intermedio de acilsulfonamida de tripéptido de macrociclo (1) se acopla con una 1-cloro-3bromoisoquinolina (2) usando el procedimiento descrito previamente de desplazamiento de alcóxido de un restoheteroarilhalo para proporcionar el intermedio (3). El acoplamiento de (1) y (2) puede excluirse en presencia de uncatalizador tal como cloruro de lantanio. El sistema de anillos de isoquinolina del intermedio (3) puede funcionalizarse adicionalmente empleando acoplamientos de Suzuki (Procedimiento 1: someter (3) a ácidos heteroaril o aril borónicos en presencia de un catalizador de paladio tal como tetraquis(trifenilfosfina)paladio y unabase tal como carbonato de cesio en disolventes tales como DMF) o acoplamientos de Stille (Procedimiento 2:someter (3) a derivados de heteraril o aril estaño en presencia de catalizadores de paladio tales como tetraquis(trifenilfosfina) paladio en disolventes tales como tolueno).
Además se describen composiciones que comprenden un compuesto de la presente invención o un enantiómero farmacéuticamente aceptable, un diastereómero, sal, solvato o profármaco del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas descritas en este documento comprenden unacantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto descrito en este documento o un enantiómero farmacéuticamente aceptable, un diastereómero, sal, solvato o profármaco del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable, con un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, excipiente o diluyentevehículo.
El ingrediente activo, es decir, el compuesto, en tales composiciones normalmente comprende del 0,1 al 99,9 porciento en peso de la composición y con frecuencia comprende de aproximadamente del 5 al 95 por ciento en peso.
Una composición puede comprender el compuesto de fórmula I y un vehículo farmacéuticamente aceptable.Preferiblemente, la composición comprende además un compuesto que tiene actividad anti-VHC. Como se usa eneste documento, la expresión "actividad anti-VHC" significa que el compuesto es eficaz para inhibir la función de unadiana seleccionada entre el grupo constituido por metaloproteasa de VHC, serina proteasa de VHC, polimerasa deVHC, helicasa de VHC, proteína NS4B de VHC, entrada VHC, conjunto de VHC, salida de VHC, proteína NS5A de VHC, IMPDH y un análogo de nucleósido para el tratamiento de una infección de VHC. Frecuentemente, el otrocompuesto que tiene actividad anti-VHC es eficaz para inhibir la función de diana en el ciclo de vida de VHCdiferente a la proteína proteasa NS3 de VHC.
Preferiblemente, el compuesto que tiene actividad anti-VHC es un interferón. Preferiblemente, el interferón seselecciona entre el grupo constituido por interferón alfa 2B, interferón alfa pegilado, interferón de consenso, interferón alfa 2A e interferón Iinfoblastoide tau.
El compuesto que tiene actividad anti-VHC se selecciona entre el grupo constituido por interleuquina 2, interleuquina6, interleuquina 12, un compuesto que mejora el desarrollo de una respuesta de células T ayudantes de tipo 1, ARNinterferente, ARN anti-sentido, Imiquimod, ribavirina, un inhibidor de la inosina 5' monofosfato deshidrogenasa,amantadina y rimantadina.
Preferiblemente, la composición comprende un compuesto descrito en este documento, un interferón y ribavirina.
Preferiblemente, el compuesto que tiene actividad anti-VHC es un compuesto de molécula pequeña. Como se usaen este documento, la expresión "compuesto de molécula pequeña" significa un compuesto que tiene un pesomolecular de menos de 1500 daltons, preferiblemente menos de 1000 daltons. Preferiblemente, el compuesto demolécula pequeña es eficaz para inhibir la función de una diana seleccionada entre el grupo constituido por metaloproteasa de VHC, serina proteasa de VHC, polimerasa de VHC, helicasa de VHC, proteína NS4B de VHC,entrada de VHC, conjunto de VHC, salida de VHC, proteína NS5A de VHC, inosina monofosfato deshidrogenasa("IMPDH") y un análogo de nucleósido para el tratamiento de una infección de VHC.
Ciertos compuestos inhibidores de VHC ilustrativos que se pueden administrar con los compuestos de la presenteinvención incluyen los descritos en las publicaciones siguientes: el documento WO 02/04425 A2 publicado el 17 de enero de 2002, el documento WO 03/007945 A1 publicado el 30 de enero de 2003, el documento WO 03/010141 A2publicado e 6 de febrero de 2003, el documento WO 03/010142 A2 publicado el 6 de febrero de 2003, el documentoWO 03/010143 A1 publicado el 6 de febrero de 2003, el documento WO 03/000254 A1 publicado el 3 de enero de2003, el documento WO 01/32153 A2 publicado el 10 de mayo de 2001, el documento WO 00/06529 publicado el 10de febrero de 2000, el documento WO 00/18231 publicado el 6 de abril de 2000, el documento WO 00/10573 publicado el 2 de marzo de 2000, el documento WO 00/13708 publicado el 16 de marzo de 2000, el documento WO
5 documento WO 99/01582 publicado el 14 de enero de 1999, el documento WO 00/09543 publicado el 24 de febrero de 2000.
La Tabla 1 más adelante enumera algunos ejemplos ilustrativos de compuestos que se pueden administrar con loscompuestos de esta invención. Los compuestos de la invención se pueden administrar con otros compuestos deactividad anti-VHC en terapia de combinación tanto conjuntamente como separadamente o combinando los
10 compuestos en una composición.
TABLA 1

01/85172 A1 publicado el 15 noviembre de 2001, el documento WO 03/037893 A1 publicado el 8 de mayo de 2003,documento WO 03/037894 A1 publicado el 8 de mayor de 2003, el documento WO 03/037895 A1 publicado el 8 demayo de 2003, el documento WO 02/100851 A2 publicado el 19 de diciembre de 2002, el documento WO 02/100846 A1 publicado el 19 de diciembre de 2002, el documento EP 1256628 A2 publicado el 13 de noviembre de 2002, el
Nombre Comercial
Tipo de Inhibidor o Diana Compañía Proveedora
Omega IFN
INF-ω Biomedicinas Inc., Emeryville CA
BILN-2061
inhibidor de serina proteasa Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim, Alemania
Summetrel
antiviral Endo Pharmaceuticals Holdings Inc., Chadds Ford, PA
Roferon A
IFN-α2a F. Hoffmann-La Roche LTD, Basel, Suiza
Pegasys
IFN-α2a PEGilado F. Hoffmann-La Roche LTD, Basel, Suiza
Pepasys y Ribavirina
IFN-α2a PEGilado /ribavirina F. Hoffmann-La Roche LTD, Basel, Suiza
CellCept
inmunosupresor IgG de VHC F. Hoffmann-La Roche LTD, Basel, Suiza
Wellferon
IFN Iinfoblastoide-an1 GlaxoSmithKline plc, Uxbridge, RU
Albuferon-α
albúmina IFN-α2b Human Genome Sciences Inc., Rockville, MD
Levovirina
ribavirina ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA
IDN-6556
inhibidor de caspasa Idun Pharmaceuticals Inc., San Diego, CA
IP-501
antifibrótico Indevus Pharmaceuticals Inc., Lexington, MA
Actimmune
INF-γ InterMune Inc., Brisbane, CA
Infergen A
IFN alfacon-1 InterMune Pharmaceuticals Inc., Brisbane, CA
ISIS 14803
antisentido ISIS Pharmaceuticals Inc, Carlsbad, CA/Elan Phamaceuticals Inc., Nueva York, NY
JTK-003
inhbidor de RdRp Japan Tobacco Inc., Tokio, Japón
Pegasys y Ceplene
IFN-α2a PEGilado / modulador immune Maxim Pharmaceuticals Inc., San Diego, CA
Ceplene
modulador inmune Maxim Pharmaceuticals Inc., San Diego, CA
Civacir
Inmunosupresor IgG de VHC Nabi Biopharmaceuticals Inc., Boca Raton, FL
Intrón A y Zadaxin
IFN-α2b/α1-timosina RegeneRx Biopharmiceuticals Inc., Bethesda MD/SciClone Pharmaceuticals Inc, San Mateo, CA
Levovirina
inhibidor de IMPDH Ribapharm Inc., Costa Mesa, CA
Viramidina
inhibidor de IMPDH Ribapharm Inc., Costa Mesa, CA
Heptazyme
ribozima Ribozyme Pharmaceuticals Inc., Boulder, CO
Intrón A
IFN-α2b Schering-Plough Corporation, Kenilworth, NJ
PEG-Intrón
IFN-α2b PEGilado Schering-Plough Corporation, Kenilworth, NJ
40 (continuación)
Nombre Comercial
Tipo de Inhibidor o Diana Compañía Proveedora
Rebetron
IFN-α2b/ribavirina Schering-Plough Corporation, Kenilworth, NJ
Ribavirina
ribavirina Schering-Plough Corporation, Kenilworth, NJ
PEG-Intrón/Ribavirina
INF-α2b PEGilado/ribavirina Schering-Plough Corporation, Kenilworth, NJ
Zadazim
modulador inmune SciClone Pharmaceuticals Inc., San Matero, CA
Rebif
IFN-β1a Serono, Geneva, Suiza
IFN-β y EMZ701
IFN-β y EMZ701
Transition Therapeutics Inc" Ontario, Canadá
T67
inhibidor de β-tubulina Tularik Inc" South San Francisco, CA
VX-497
inhibidor de IMPDH Vertex Pharmaceuticals Inc., Cambridge, MA
VX-950/LY-570310
inhibidor de serina proteasa Vertex Pharmaceuticals Inc., Cambridge, MA Eli Lilly and Co. Inc. Indianápolis, IN
Omniferon
IFN-α natural Viragen Inc., Plantation, FL
XTL-002
anticuerpo monoclonal XTL Biopharmaceuticals Ltd., Rehovot, Isreal
Las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden administrar por vía oral, parenteral o por un depósitoimplantado. Se prefieren la administración oral o la administración mediante inyección. En algunos casos, se puede ajustar el pH de la formulación con ácidos, bases o tampones farmacéuticamente aceptables para mejorar la estabilidad del compuesto formulado o su forma de administración. El término parenteral como se usa en estedocumento incluye técnicas de inyección o infusión subcutáneas, intracutáneas, intravenosas, intramusculares,intraarticulares, intrasinoviales, intraesternales, intratecales e intralesionales.
Cuando se administran por vía oral, las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden administrar encualquier forma farmacéutica oralmente aceptable que incluye, pero no se limita a, cápsulas, comprimidos, y suspensiones y soluciones acuosas. En el caso de comprimidos para uso oral, los vehículos que se usan comúnmente incluyen lactosa y almidón de maíz. También se añaden normalmente agentes lubricantes, tales comoestearato de magnesio. Para la administración oral en una forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen lactosa yalmidón de maíz seco. Cuando se administran oralmente suspensiones acuosas, el ingrediente activo se combinacon agentes emulsificantes y de suspensión. Si de desea, se pueden añadir ciertos agentes edulcorantes y/o saporíferos y/o colorantes. Otros vehículos adecuados para las composiciones mencionadas anteriormente sepueden observar en textos farmacéuticos convencionales, por ejemplo en "Remington's Pharmaceutical Sciences"19ª ed. Marck Publishing Company, Easton, Penn., 1995.
Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar mediante procedimientos conocidos usando ingredientes bienconocidos y fácilmente disponibles. Las composiciones de esta invención se pueden formular para proporcionar la liberación rápida, sostenida o retardada del ingrediente activo después de la administración al paciente empleandoprocedimientos bien conocidos en la técnica. En la preparación de las composiciones de la presente invención, elingrediente activo habitualmente se mezclará con un vehículo o se diluirá con un vehículo o se incluirá dentro de unvehículo que puede estar en forma de una cápsula, bolsita, papel u otro recipiente. Cuando el vehículo sirve comoun diluyente, puede ser un material sólido, semisólido o líquido que actúa como un vehículo, excipiente o medio para el ingrediente activo. Por tanto, las composiciones pueden estar en forma de comprimidos, píldoras, polvos, perlasmicroencapsuladas, grageas, bolsitas, elíxires, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, aerosoles (como unsólido o en un medio líquido), cápsulas de gelatina suave y dura, supositorios, soluciones inyectables estériles,polvos envasados estériles y similares. Los especialistas en la técnica conocen los detalles adicionales queconciernen al diseño y preparación de formas de administración adecuadas de las composiciones farmacéuticas de la invención.
Niveles de dosis de entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 1000 miligramos por kilogramo ("mg/kg") depeso corporal por día, preferiblemente entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 250 mg/kg de peso corporalpor día de los compuestos de la invención son típicos en una monoterapia para la prevención y el tratamiento deenfermedad mediada por VHC. Normalmente, las composiciones farmacéuticas de esta invención se administrarán de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 veces por día o alternativamente, como una infusión continua. Taladministración se puede usar como una terapia crónica o aguda. La cantidad del ingrediente activo que se puede combinar con los materiales de vehículo para producir una forma farmacéutica única variará dependiendo delhuésped tratado y de la vía de administración particular.
Como lo apreciarán los especialistas en la técnica, se pueden requerir dosis mayores o menores que las enumeradas anteriormente. Los regímenes de dosificación y tratamiento específicos para cualquier paciente particular dependerán de una diversidad de factores, que incluyen la actividad del compuesto específico empleado,la edad, peso corporal, estado de salud general, sexo, dieta, tiempo de administración, tasa de excreción, combinación de fármacos, la gravedad y ciclo de la infección, la predisposición del paciente a la infección y el criterio
del médico tratante. Generalmente, el tratamiento se inicia con dosis pequeñas sustancialmente menores que ladosis óptima del péptido. A partir de entonces, la dosis se aumenta mediante incrementos pequeños hasta que seconsigue el efecto óptimo en las circunstancias. En general, el compuesto se administra de manera más deseable aun nivel de concentración que generalmente proporcionará resultados anti-viralmente eficaces sin causar ningúnefecto secundario dañino o nocivo.
Cuando las composiciones de esta invención comprenden una combinación de un compuesto de la invención y uno
o más agentes terapéuticos o profilácticos adicionales, tanto el compuesto como el agente adicional habitualmenteestán presentes en niveles de dosis de entre aproximadamente el 10 y el 100 % y más preferiblemente entreaproximadamente el 10 y el 80 % de la dosis administrada normalmente en un régimen de monoterapia.
Cuando estos compuestos o sus enantiómeros, diastereómeros, sales, solvatos o profámacos farmacéuticamente aceptables se formulan junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, la composición resultante se puede administrar in vivo a mamíferos, tales como el ser humano, para inhibir la proteasa NS3 de VHC o para tratar oprevenir la infección por virus de VHC.
Además se describen en este documento procedimientos para inhibir la actividad proteasa NS3 de VHC en pacientes, de un compuesto de la presente invención o un enantiómero farmacéuticamente aceptable, diastereómero, sal o solvato del mismo.
Un procedimiento para tratar una infección de VHC en un paciente puede comprender la administración al paciente de una cantidad efectiva terapéuticamente del compuesto de la invención o un enantiómero farmacéuticamenteaceptable, diastereómero, solvato, profármaco o sal del mismo.
Preferiblemente, el procedimiento de administración del compuesto es eficaz para inhibir la función de la proteína proteasa NS3 de VHC. Preferiblemente , el procedimiento puede comprender además administrar otro compuestoque tiene actividad anti-VHC (como se ha descrito anteriormente) antes de, después o simultáneamente con un compuesto descrito en este documento.
Los compuestos descritos en este documento también se pueden usar como compuestos reactivos de laboratorio ypueden contribuir decisivamente para proporcionar herramientas de investigación para el diseño de ensayos de replicación viral, la validación de sistema de ensayo animal y estudios de biología estructural para mejorar adicionalmente el conocimiento de los mecanismos de la enfermedad de VHC. Además, los compuestos descritos en este documento son útiles para establecer o determinar el sitio de unión de otros compuestos anti-virales, porejemplo, mediante inhibición competitiva.
Los compuestos descritos en este documento también se pueden usar para tratar o evitar la contaminación viral de materiales y por lo tanto reducir el riesgo de infección viral para el personal de laboratorio o médico o para lospacientes que se ponen en contacto con tales materiales, por ejemplo, sangre, tejido, instrumentos e indumentariaquirúrgica, instrumentos e indumentaria de laboratorio y aparatos y materiales de recolección o transfusión de sangre.
Además, los compuestos y las composiciones descritos en este documento se pueden usar para la preparación de un medicamento para tratar la infección de VHC en un paciente.
La presente invención proporciona los procesos para separar una mezcla de enantiómeros de éster alquílico quecomprende poner en contacto la mezcla con una enzima eficaz para estimular preferiblemente la hidrólisis de uno delos enantiómeros; caracterizado por que el contacto se conduce en presencia de un tampón y tiene la siguiente Fórmula:
donde:
R25 es un grupo protector del amino, tal como, por ejemplo carbamatos, por ejemplo iminas BOC o amidas; y
R26 se selecciona entre el grupo constituido por alquilo C1-10, arilo C6-14, alquilarilo C7-16, cicloalquilo C3-7 o cicloalquil alquilo C3-10.
Una mezcla de este tipo de enantiómeros de éster de alquilo se puede producir como resultado de la preparación delprecursor químico B, descrito anteriormente.
El tampón particular usado en el procedimiento de la presente invención no es crítico. Normalmente, el tampóntendrá un pKa de ± 1 del pH al que se conduce la hidrólisis, por ejemplo, pH de aproximadamente 7,0 a 11. Por tanto, si la hidrólisis se conduce, por ejemplo, a un pH de 8,0, se puede usar un tampón con un pKa de aproximadamente 7,0 a 9,0. Tampones típicos son fosfatos, boratos y carbonatos. Ejemplos de tampones adecuados incluyen: ácido 2-[(2-amino-2-oxoetil)amino]etanosulfónico, ácido N-(2-acetamido)-2-imino-diacético, n,n
bis(2-hidroxietil)glicina, 1,3-bis[tris(hidroximetil)metilamino]propano, ácido o-Bórico, ácido carbónico, ácido 2(ciclohexilamino)etanosulfónico, ácido dietilmalónico, Glicilglicina, ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico (HEPES), ácido N-2-hidroxictilpiperazina-N'-3-propano-sulfónico, imidazol, ácido 3-(N-morfolino) propanosulfónico, ácido o-fosfórico, piperazina-N-N'-bis(ácido 2-etanosulfónico), piperazina-1,4-bis(ácido 2-hidroxipropanosulfónico), ácido 3-[tris(hidroximetil)metil]amino propanosulfónico, ácido 2-[tris(hidroximetil)metil]amino etanosulfónico, N-[tris(hidroximetil)metil]glicina y tris(hidroxilmetil)aminometano.
Se puede usar cualquier enzima eficaz para hidrolizar preferiblemente el enantiómero del éster de alquilo deseado.Con frecuencia se usan proteasas, lipasas y esterasas para la hidrólisis de uniones de éster carboxílicos. Lasenzimas adecuadas para el uso, independientemente de su origen o pureza, se pueden emplear en estado libre,formas tanto líquidas como secas, o inmovilizadas sobre un soporte tal como, por ejemplo, mediante adsorción física
o inmovilización. Ejemplos de lipasas incluyen lipasas de Candida rugosa, Germen de Trigo, Páncreas Porcino, Rhizopus arrhizus, Candida antarctica, Mucor miehei, Aspergillus niger, especies de Pseudomonas, Candida lipolytica, Humicola langinosa y Mucor javanicus. Ejemplos de esterasas incluyen esterasa de hígado de cerdo(PLE), esterasa de hígado de caballo (HLE), acetilcolina esterasa (ACE), colesterol esterasa y esterasa del Bacillus subtilis (carboxil esterasa NP). Las proteasas generalmente se definen como hidrolasas que actúan sobre uniones peptídicas como sus sustratos naturales, pero que tienen la capacidad de escindir una unión de éster carboxílico yaque una unión de éster es mucho más débil que una unión peptídica (amida). Los ejemplos de proteasas incluyen αquimotripsina, termolisina, papaína, proteasas de Aspergillus sp., Bacillus sp., Rhizopus sp., Penicillum sp.,Streptomyces griseus.
En el éster de la Fórmula VIII, el centro quiral en el resto ácido está completamente sustituido. Esto representa unadiana difícil para las enzimas hidrolíticas ya que sus sustratos naturales (tales como aminoácidos naturales) habitualmente contienen al menos un α-hidrógeno. Con gran sorpresa, se ha observado que ciertas proteasasfueron altamente eficaces para la hidrólisis enantioselectiva del éster VIII. Las proteasas típicas incluyen proteasasde cepas seleccionadas entre el grupo constituido por Bacillus globigii, Bacillus licheniformis, Bacillus halodurans, Bacillus clausii y Aspergillus oryzae. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen las seleccionadas entre el grupo constituido por Alcalase® (subtilisina, proteasa alcalina, Novozymes North America Inc., Franklington, NC), Savinase® (subtilisina, proteasa alcalina, Novozymes), ChiroCLECTM- BL (subtilisina, proteasa alcalina, Altus Biologics, Inc.,), Proteasa N (subtilisina, proteasa alcalina, Amano) y FlavourzymeTM (proteasa fúngica/peptidasa,Novozymes). En la técnica se conocen los detalles adicionales de tales enzimas. Tales enzimas están disponibles enel mercado. Estas enzimas se pueden emplear solas o usar como mezclas de las mismas.
La hidrólisis del éster conduce a la liberación de un alcohol y un ácido carboxílico, que puede disminuirsignificativamente el pH si no hay tampón presente. Se ha observado que incluir tampón en la mezcla de reacciónpuede estabilizar el pH en el ciclo de hidrólisis, contribuyendo de ese modo a una mayor actividad y estabilidadenzimática.
Además, es posible conducir la hidrólisis a temperaturas elevadas, preferiblemente, aproximadamente de 30 a 60 ºC y durante periodos de tiempo cortos, preferiblemente menos de aproximadamente siete días, más preferiblementede aproximadamente dos horas a tres días.
Ejemplos
Los ejemplos específicos que se muestran a continuación ilustran la síntesis de los compuestos descritos en estedocumento.
Las abreviaturas químicas usadas habitualmente para identificar compuestos químicos descritos en este documentoincluyen Bn: bencilo; Boc: terc-butiloxicarbonilo {Me3COC(O)}; BSA: albúmina de suero bovino; CDI: carbonildiimidazol; DBU: 1,8-diazabiciclo[5.4.0]-undec-7-eno; CH2Cl2=DCM: cloruro de metileno; TBME: terc-butil metil éter; DEAD: azodicarboxilato de dietilo; DIAD: azodicarboxilato de diisopropilo; DIEA: diisopropiletilamina; DIPEA: diisopropiletilamina; 4-DMAP: 4-dimetil-aminopiridina; DCC: 1,3-diciclohexilcarbodiimida; DMF: dimetilformamida; DMSO: dimetilsulfóxido; DPPA: difenilfosforil azida; Et: etilo; EtOH: etanol; EtOAc: acetato de etilo; Et2O: éter dietílico; Catalizador de Grubb: dicloruro de bis(triciclohexilfosfina)bencilideno rutenio (IV); Catalizador deGrubb de 2ª Generación: dicloruro de triciclohexilfosfina[1,3-bis(2,4,6-trimetilfenil)-4,5-dihidroimidazol-2ilideno][bencilideno]rutenio (IV); HATU: hexafluorofosfato de [O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio; HBTU: hexafluorofosfato de [O-(1H-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio; HOBT, 1-hidroxibenzotriazol; HOAT, 1-hidroxi-7-azabenzotriazol; HPLC: cromatografía líquida de alta resolución; EM: espectrometría de masas; Me:metilo; MeOH: metanol; NMM: N-metilmorfolina; NMP: N-metilpirrolidina; Pr: propilo; PPA: ácido polifosfórico; TBAF: fluoruro de tetra-n-butilamonio; 1,2-DCE o DCE: 1,2-dicloroetano; TFA: ácido trifluoroacético; THF: tetrahidrofurano.
Los porcentajes en solución expresan una relación de peso a volumen, y las proporciones de solución expresan una relación de volumen a volumen, a menos que se indique lo contrario. Los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) se registraron en un espectrómetro Bruker de 300, 400 ó 500 megahertzios (MHz); los desplazamientos químicos (5) se indican en partes por millón. La cromatografía ultrarrápida se realizó sobre gel de sílice (SiO2) evidente para un especialista en la técnica. Todos los datos de Cromatografía Líquida (CL) seregistraron en un cromatógrafo de líquidos Shimadzu LC-10AS usando un detector SPD-IOAV UV-Vis y los datos deEspectrometría de Masas (EM) se determinaron con una Plataforma Micromass para CL en modo de electronebulización (ES+).
A menos que se indique otra cosa, cada compuesto se analizó por CL/EM, usando una de tres metodologías, que tienen las siguientes condiciones.
Columnas: Procedimiento A) - YMC Xterra ODS S7 micrómetros ("µm") 3,0 x 50 milímetros ("mm") es decir, 3,0mm de diámetro por 50 mm de longitud.
Gradiente: 100 % de Disolvente A/0 % de Disolvente B a 0 % de Disolvente A/100 % de Disolvente B
Tiempo de gradiente: 4 min (A)
Tiempo de mantenimiento: 1 min (A); 2 min
Caudal: 4 ml/min
Longitud de Onda del Detector: 220 nanómetros ("nm")
Disolvente A: MeOH al 10 %/H2O al 90 %/TFA al 0,1 %
Disolvente B: H2O al 10 %/MeOH al 90 %/TFA al 0,1 %.
Columnas: Procedimiento B) - YMC Xterra ODS S7 3,0 x 50 mm
Gradiente: 100 % de Disolvente A/0 % de Disolvente B a 0 % de Disolvente A/100 % de Disolvente B
Tiempo de gradiente: 2 min
Tiempo de mantenimiento: 1 min
Caudal: 5 ml/min
Longitud de Onda del Detector: 220 nm
Disolvente A: MeOH al 10 %/H2O al 90 %/TFA al 0,1 %
Disolvente B: H2O al 10 %/MeOH al 90 %/TFA al 0,1 %.
Columnas: Procedimiento D) - YMC Xterra C18 5 mM 3,0 x 50 mm
Gradiente: 100 % de Disolvente A/0 % de Disolvente B a 0 % de Disolvente A/100 % de Disolvente B
Tiempo de gradiente: 3 min
Tiempo de mantenimiento: 1 min
Caudal: 5 ml/min
Longitud de Onda del Detector: 220 nm
Disolvente A: MeOH al 10 %/H2O al 90 %/TFA al 0,1 %
Disolvente B: H2O al 10 %/MeOH al 90 %/TFA al 0,1 %. A menos que se indique otra cosa, la HPLC preparativa se realizó en las siguientes condiciones.
Tiempo de gradiente: 10 min
Tiempo de mantenimiento: 2 min
Caudal: 25 ml/min
Longitud de Onda del Detector: 220 nM
Disolvente A: MeOH al 10 %/H2O al 90 %/TFA al 0,1 %
Disolvente B: H2O al 10 %/MeOH al 90 %/TFA al 0,1 % Las fracciones puras se combinaron y se usó NaOH 0,1 N para llevar el pH a 7. La solución se concentró al vacío ydespués el pH se redujo cuidadosamente a pH 3-4 usando HCl 0,1 N. La mezcla se extrajo rápidamente con acetatode etilo (3 x). Los extractos combinados se secaron (MgSO4) y se concentraron al vacío para dar los productos purificados.
Los compuestos e intermedios químicos , descritos en los siguientes ejemplos, se prepararon de acuerdo con lossiguientes procedimientos.
Ejemplo 1 Preparación de Intermedios Representativos
Preparación de intermedios de isoquinolina P2 para la incorporación en compuestos de Fórmula 1 Procedimiento A
Etapa 1:
A una solución de ácido 3-metoxicinnámico (11,04 g, 62 mmol) y trietilamina (12,52 g, 124 mmol) en acetona (80 ml)se le añadió gota a gota cloroformiato de etilo (aproximadamente 1,5 equivalentes) a 0 ºC. Después de agitar a estatemperatura durante 1 h, se añadió gota a gota NaN3 acuoso (6,40 g, 100 mmol en 35 ml de H2O; deben tomarse las precauciones apropiadas cuando se usa azida sódica) y la mezcla de reacción se agitó durante 16 h a latemperatura ambiente. A la mezcla se le añadió agua (100 ml) y el volátil se retiró al vacío. La suspensión resultantese extrajo con tolueno (3 x 50 ml) y las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4. Esta solución seca se añadió gota a gota a una solución caliente de difenilmetano (50 ml) y tributilamina (30 ml) a 190 ºC. El tolueno seretiró por destilación según se añadía. Después de que se completara la adición, la temperatura de reacción se aumentó hasta 210 ºC durante 2 h. Después de un periodo de refrigeración, el producto precipitado se recogió porfiltración, se lavó con hexano (2 x 50 ml) y se secó para producir el producto deseado en forma de un sólido de colorblanco (5,53 g, 51 %) (Nicolas Briet y col., Tetrahedron, 2002, 5761-5766). CL-EM (tiempo de retención: 0,82 min,procedimiento B), EM m/z 176 (M++H).
Un procedimiento alternativo al anterior emplea difenilfosforil azida para la conversión del ácido carboxílico en la acilazida correspondiente. Después, en un procedimiento de una sola etapa, el ácido se convierte en la quinolonacorrespondiente. Este procedimiento se describe a continuación para la preparación de 4-metil-2H-isoquinolin-1-ona a partir de ácido 3-fenil-but-2-enoico:
Una solución de ácido 3-fenil-but-2-enoico (16,2 g), difenilfosforil azida (27,5 g) y trietilamina (10,1 g) enbenceno (100 ml) se agitó durante 1 h. Después de la filtración a través de un lecho de gel de sílice lavando con benceno y de la concentración, el residuo se disolvió en difenilmetano (80 ml) y se calentó a reflujo durante3 h. Después de enfriar a ta, los sólidos se recogieron a través de un lecho lavando con benceno y se secaronpara dar 10 g (63 %) de la 4-metil-2H-isoquinolin-1-ona deseada en forma de un sólido. 1H RMN (400 MHz, CD3OD) 5 ppm 2,30 (s, 3 H), 7,00 (s, 1 H), 7,54 (m, 1 H), 7,77 (m, 2 H), 8,33 (d, J = 7,34 Hz, 1 H).
Etapa 2:
Se calentó 6-metoxi-2H-isoquinolin-1-ona (5,0 g, 28,4 mmol) en POCl3 (10 ml) a suave reflujo durante 3 h y seevaporó al vacío (Nicolas Briet y col., Tetrahedron, 2002, 5761-5766). El residuo se vertió en agua enfriada con hielo(20 ml) y se neutralizó a pH 10 con NaOH 10 M. Se extrajo con CHCl3. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO4, se filtró y se evaporó. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (1:1 de hexano-EtOAc) para producir 4,41 g (80 %) del producto deseado en forma de un sólido de color blanco. 1H RMN (CD3OD) 5 3,98 (s, 3H), 7,34-7,38 (m, 2H), 7,69 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,10 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 8,23 (d, J = 9,5 Hz, 1H); CL-EM (tiempo de retención: 1,42 min, procedimiento B), EM m/z 194 (M++H).
Etapa 3:
A una solución de N-BOC-3-(R)-hidroxi-L-prolina (892 mg, 3,89 mmol) en DMSO (40 ml) a la temperatura ambiente se le añadió en una porción terc-butóxido potásico (1,34 g, 12,0 mmol). La suspensión formada se agitó a esta temperatura durante 30 min antes de enfriarse a 10 ºC. Se añadió en una porción 1-cloro-6-metoxi-isoquinolina(ejemplo 11, Etapa 2) (785 mg, 4,05 mmol) en forma de un sólido y la mezcla final se agitó a la temperaturaambiente durante 12 h. Se inactivó ácido cítrico al 5 % enfriado con hielo (ac.) y se extrajo con EtOAc (100 ml). Lafase acuosa se extrajo de nuevo con EtOAc. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con ácido cítrico al 5 %(ac.) y salmuera respectivamente, se secaron sobre MgSO4 y se filtraron. El filtrado se evaporó al vacío a sequedad para producir 1,49 g (99 %) del producto deseado en forma de una espuma de color blanquecino. Este material seusó en bruto en la siguiente etapa de reacción sin purificación adicional. 1H RMN (CD3OD) 5 1,42, 1,44 (rotámeros,9H), 2,38-2,43 (m, 1H), 2,66-2,72 (m, 1H), 3,80-3,87 (m, 2H), 3,92 (s, 3H), 4,44-4,52 (m, 1H), 5,73 (a, 1H), 7,16-7,18(m, 2H), 7,24-7,25 (m, 1H), 7,87-7,88 (m, 1H), 8,07 (d, J = 8,5 Hz, 1H); CL-EM (tiempo de retención: 1,62 min, procedimiento B), EM m/z 389 (M++H).
Los siguientes intermedios se prepararon como se ha descrito en este documento y pueden incorporarse encompuestos de Fórmula 1
Etapa 1:
Modificación: se usaron 15 g de ácido 3-metoxi-3-fenil-acrílico, se obtuvieron 250 mg de producto (2 % de rendimiento). Producto:
1H RMN (400 MHz, CD3COCD3) 5 ppm 3,85 (s, 3 H), 6,96 (s, 1 H), 7,54 (m, 1 H), 7,71 (m, 1 H), 7,86 (d, J = 8,07 Hz, 1 H), 8,31 (d, J = 8,07 Hz, 1 H). Etapa 2: 10 Modificaciones: Se usaron 200 mg 4-metoxi-2H-isoquinolin-1-ona, se obtuvieron 150 mg de producto (68 % de rendimiento). Producto:
1H RMN (400 MHz, CDCl3) 5 ppm 4,05 (s, 2 H), 7,71 (m, 1 H), 7,72 (m, 2 H), 7,80 (s, 1 H), 8,23 (dd, J = 18,71, 7,70 15 Hz, 2 H).
Etapa 3: Modificaciones: se usaron 122 mg de 1-cloro-4-metoxi-isoquinolina, se obtuvieron 218 mg de producto (89 % de rendimiento).
Producto:
EM: (M+Na)+ 411.
Los siguientes intermedios se prepararon como se ha descrito en este documento y pueden incorporarse encompuestos de Fórmula 1
Etapa 1: Modificaciones: se usaron 20 g de ácido 2-metilcinnámico, se obtuvieron 14,3 g del producto (72 % de rendimiento) Producto:
10 Datos: 1H RMN (400 MHz, CD3OD) 5 ppm 2,54 (s, 1 H), 6,69 (d, J = 7,3 Hz, 1 H), 7,23 (d, J = 7,3 Hz, 1 H), 7,39 (t, J = 7,8 Hz, 1 H), 7,50 (d, J = 7,1 Hz, 1 H), 8,30 (d, J = 8,1 Hz, 1 H), 11,62 (s, 1 H); EM: (M+H)+ 160.
Etapa 2: Modificaciones: se usaron 14,4 g de 5-metil-2H-isoquinolin-1-ona, se obtuvieron 10,6 g del producto (66 % de rendimiento).
15 Producto:
Datos: 1H RMN (400 MHz, CDCl3) 5 ppm 2,67 (s, 3 H), 7,55 (m, 2 H), 7,70 (dd, J = 5,9, 1,0 Hz, 1 H), 8,19 (m, 1 H), 8,28 (d, J = 5,9 Hz, 1 H); EM: (M+H)+ 178.
Etapa 3:
Modificaciones: se usaron 533 mg de 1-cloro-5-metil-isoquinolina, se obtuvieron 1116 mg del producto (100 % de rendimiento). Producto:
Datos: EM: (M+H)+ 373.
Los siguientes intermedios se prepararon como se ha descrito en este documento y pueden incorporarse encompuestos de Fórmula 1
10 Etapa 1: Modificaciones: se usaron 10 g de ácido 2-metoxicinnámico, se obtuvieron 5,3 g del producto (53 % de rendimiento). Producto:
Datos: 1H RMN (400 MHz, CD3OD) 5 ppm 3,95 (s, 3 H), 6,94 (d, J = 7,3 Hz, 1 H), 7,08 (d, J = 8,1 Hz, 1 H), 7,14 (d, J 15 = 7,3 Hz, 1 H), 7,43 (t, J = 8,1 Hz, 1 H), 7,99 (d, J = 8,1 Hz, 1 H), 10,92 (s, 1 H); EM: (M+H)+ 176.
Etapa 2: Modificaciones: se usaron 5,3 g de 5-metoxi-2H-isoquinolin-1-ona, se obtuvieron 5,38 g del producto (92 % de rendimiento).
Producto:
Datos: 1H RMN (400 MHz, CDCl3) 5 ppm 4,01 (s, 3 H), 7,04 (d, J = 7,8 Hz, 1 H), 7,57 (t, J = 8,1 Hz, 1 H), 7,88 (d, J = 8,6 Hz, 1 H), 7,97 (d, J = 5,9 Hz, 1 H), 8,25 (d, J = 5,9 Hz, 1 H); EM: (M+H)+ 194.
Etapa 3: Modificaciones: se usaron 581 mg de 1-cloro-5-metoxi-isoquinolina, se obtuvieron 1163 mg del producto (100 % de rendimiento).
Producto:
Datos: EM: (M+H)+ 389.
10 Los siguientes intermedios se prepararon como se ha descrito en este documento y pueden incorporarse en compuestos de Fórmula 1
Etapa 1:
Modificaciones: se usaron 25 g de ácido 2-clorocinnámico, se obtuvieron 14,6 g del producto (59 % de rendimiento). 15 Producto:
Datos: 1H RMN (400 MHz, CD3OD) 5 ppm 7,22 (d, J = 7,3 Hz, 1 H), 7,42 (t, J = 7,8 Hz, 1 H), 7,73 (d, J = 7,8 Hz, 1 H), 8,34 (d, J = 8,1 Hz, 1 H), 10,61 (s, 1 H); EM: (M+H)+ 180.
Etapa 2:
Modificaciones: se usaron 14,2 g de 5-cloro-2H-isoquinolin-1-ona, se obtuvieron 8,28 g del producto (53 % de rendimiento). Producto:
5 Datos: 1H RMN (400 MHz, CDCl3) 5 ppm 7,60 (dd, J = 8, 6, 7,6 Hz, 1 H), 7,83 (m, 1 H), 8,00 (d, J = 5,9 Hz, 1 H), 8,29 (dt, J = 8,9, 1,0 Hz, 1 H), 8,38 (d, J = 5,9 Hz, 1 H); EM: (M+H)+ 198. Etapa 3: Modificaciones: se usaron 594 mg de 1,5-dicloro-isoquinolina, se obtuvieron 1174 mg del producto (100 % de10 rendimiento). Producto:
Datos: EM: (M+H)+ 393.
Los siguientes intermedios se prepararon como se ha descrito en este documento y pueden incorporarse en15 compuestos de Fórmula 1
Etapa 1: Modificaciones: se usaron 16,6 g de ácido 2-fluorocinnámico, se obtuvieron 8,55 g del producto (51 % derendimiento). 20 Producto:
Datos: 1H RMN (400 MHz, CD3COCD3) 5 ppm 6,62 (d, J = 7,3 Hz, 1 H), 7,32 (d, J = 7,3 Hz, 1 H), 7,47 (m, 2 H), 8,09 (m, 1 H).
Etapa 2: Modificaciones: se usaron 8,4 g de 5-fluoro-2H-isoquinolin-1-ona, se obtuvieron 7,5 g del producto (80 % de rendimiento).
Producto:
Datos: 1H RMN (400 MHz, CDCl3) 5 ppm 7,43 (ddd, J = 9,7, 7,8, 0,9 Hz, 1 H), 7,62 (td, J = 8,2, 5,4 Hz, 1 H), 7,84 (d, 10 J = 5,6 Hz, 1 H), 8,14 (d, J = 8,6 Hz, 1 H), 8,33 (d, J = 5,9 Hz, 1 H); EM: (M+H)+ 182.
Etapa 3: Modificaciones: se usaron 203 mg de 1-cloro-5-fluoro-isoquinolina, se obtuvieron 384 mg de producto (90 % de rendimiento).
Producto:
Datos: 1H RMN (400 MHz, CD3SOCD3) 5 ppm 1,34, 1,36 (2s, 9 H, rotámeros), 2,35 (m, 1 H), 2,61 (m, 1 H), 3,65 (d, J = 12,23 Hz, 1 H), 3,80 (m, 1 H), 4,35 (m, 1 H), 5,70 (s, 1 H), 7,48 (d, J = 6,11 Hz, 1 H), 7,63 (m, 2 H), 7,99 (m, 1 H), 8,10
(d, J = 5,87 Hz, 1 H); EM: (M+Na)+ 399.
20 Los siguientes intermedios se prepararon como se ha descrito en este documento y pueden incorporarse en compuestos de Fórmula 1
Etapa 1:
Modificaciones: se usaron 16,6 g de ácido 4-fluorocinnámico, se obtuvieron 8,2 g del producto (49 % de rendimiento). Producto:
Datos: 1H RMN (400 MHz, CD3COCD3) 5 ppm 6,57 (d, J = 7,09 Hz, 1 H), 7,21 (d, J = 7,09 Hz, 1 H), 7,50 (m, 1 H), 7,72 (dd, J = 8,68, 5,26 Hz, 1 H), 7,90 (dd, J = 9,54, 2,93 Hz, 1 H). Etapa 2: 10 Modificaciones: Se usaron 8,15 g de 7-fluoro-2H-isoquinolin-1-ona, se obtuvieron 7,6 g del producto (84 % de rendimiento). Producto:
Datos: 1H RMN (400 MHz, CDCl3) 5 ppm 7,52 (td, J = 8,6, 2,6 Hz, 1 H), 7,59 (d, J = 5,6 Hz, 1 H), 7,86 (dd, J = 9,1, 15 5,4 Hz, 1 H), 7,95 (dd, J = 9,5, 2,5 Hz, 1 H), 8,26 (d, J = 5,6 Hz, 1 H); EM: (M+H)+ 182.
Etapa 3: Modificaciones: se usaron 191 mg de 1-cloro-7-fluoro-isoquinolina, se obtuvieron 350 mg de producto (93 % de rendimiento).
Producto:
Datos: EM: (M+Na)+ 399.
Los siguientes intermedios se prepararon como se ha descrito en este documento y pueden incorporarse encompuestos de Fórmula 1
Etapa 1: Modificaciones: se usaron 9,13 g de ácido 4-clorocinnámico, se obtuvieron 4 g del producto (44 % de rendimiento). Producto:
Datos: 1H RMN (400 MHz, CD3SOCD3) 5 ppm 6,58 (d, J = 7,1 Hz, 1 H), 7,20 (dd, J = 7,1, 5,9 Hz, 1 H), 7,72 (m, 2 H),
8,10 (m, 1 H).
Etapa 2:
Modificaciones: se usaron 3,5 g de 7-cloro-2H-isoquinolin-1-ona, se obtuvieron 2,8 g del producto (72 % de10 rendimiento).
Producto:
Datos: 1H RMN (500 MHz, CDCl3) 5 ppm 7,59 (d, J = 5,5 Hz, 1 H), 7,69 (dd, J = 8,9, 2,1 Hz, 1 H), 7,80 (d, J = 8,6 Hz, 1 H), 8,29 (d, J = 5,5 Hz, 1 H), 8,34 (s, 1 H); EM: (M+H)+ 198.
15 Etapa 3: Modificaciones: se usaron 208 mg de 1,7-dicloro-isoquinolina, se obtuvieron 350 mg de producto (89 % de rendimiento).
Producto:
20 Datos: EM: (M+Na)+ 415.
Los siguientes intermedios se prepararon como se ha descrito en este documento y pueden incorporarse encompuestos de Fórmula 1
Etapa 1: Modificaciones: se usaron 25 g de ácido 4-metilcinnámico, se obtuvieron 15,3 g del producto (62 % de rendimiento). Producto:
Datos: 1H RMN (400 MHz, CD3OD) 5 ppm 2,50 (s, 3 H), 6,54 (d, J = 7,1 Hz, 1 H), 7,13 (d, J = 7,1 Hz, 1 H), 7,49 (m, 2
H), 8,22 (s, 1 H), 11,49 (s, 1 H); EM: (M+H)+ 160.
Etapa 2:
Modificaciones: se usaron 15,3 g de 7-metil-2H-isoquinolin-1-ona, se obtuvieron 5,15 g del producto (30 % de 10 rendimiento).
Producto:
Datos: 1H RMN (400 MHz, CDCl3) 5 ppm 2,58 (s, 3 H), 7,56 (m, 2 H), 7,73 (d, J = 8,3 Hz, 1 H), 8,09 (s, 1 H), 8,20 (d, J = 5,6 Hz, 1 H); EM: (M+H)+ 178.
15 Etapa 3: Modificaciones: se usaron 205 mg de 1-cloro-7-metil-isoquinolina, se obtuvieron 350 mg de producto (89 % derendimiento).
Producto:
20 Datos: EM: (M+H)+ 373.
Los siguientes intermedios se prepararon como se ha descrito en este documento y pueden incorporarse encompuestos de Fórmula 1
Etapa 1: Modificaciones: se usaron 33 g de ácido 4-metoxicinnámico, se obtuvieron 7 g del producto (33 % de rendimiento). Producto:
Datos: 1H RMN (500 MHz, CD3COCD3) 5 ppm 3,90 (s, 3 H), 6,49 (d, J = 7,0 Hz, 1 H), 7,10 (d, J = 7,3 Hz, 1 H), 7,28
(dd, J = 8,6, 2,8 Hz, 1 H), 7,57 (d, J = 8,9 Hz, 1 H), 7,71 (d, J = 2,8 Hz, 1 H).
Etapa 2:
Modificaciones: se usaron 4 g de 7-metoxi-2H-isoquinolin-1-ona, se obtuvieron 3 g del producto (68 % de 10 rendimiento).
Producto:
Datos: 1H RMN (400 MHz, CDCl3) 5 ppm 3,98 (s, 3 H), 7,38 (dd, J = 8,9, 2,6 Hz, 1 H), 7,52 (m, 2 H), 7,73 (d, J = 8,8 Hz, 1 H), 8,16 (d, J = 5,4 Hz, 1 H).
15 Etapa 3: Modificaciones: se usaron 533 mg de 1-cloro-7-metoxi-isoquinolina, se obtuvieron 1115 mg del producto (100 % derendimiento).
Producto:
20 Los siguientes intermedios se prepararon como se ha descrito en este documento y pueden incorporarse en compuestos de Fórmula 1
Etapa 1:
Modificaciones: se usaron 19,6 g de ácido 4-fluoro-3-metoxicinnámico, se obtuvieron 9,5 g del producto (48 % de rendimiento). Producto:
Datos: 1H RMN (400 MHz, CD3COCD3) 5 ppm 4,00 (s, 1 H), 6,49 (d, J = 7,34 Hz, 1 H), 7,19 (d, J = 7,09 Hz, 1 H), 7,29 (d, J = 8,07 Hz, 1 H), 7,86 (d, J = 11,74 Hz, 1 H). Etapa 2: 10 Modificaciones: se usaron 9 g de 7-fluoro-6-metoxi-2H-isoquinolin-1-ona, se obtuvieron 7 g del producto (70 % de rendimiento). Producto:
Datos: 1H RMN (400 MHz, CDCl3) 5 ppm 4,04 (s, 3 H), 7,17 (d, J = 8,07 Hz, 1 H), 7,48 (d, J = 5,62 Hz, 1 H), 7,94 (d, 15 J = 11,49 Hz, 1 H), 8,20 (d, J = 5,62 Hz, 1 H).
Etapa 3:
Modificaciones: se usaron 222 mg de 1-cloro-7-fluoro-6-metoxi-isoquinolina, se obtuvieron 406 mg del producto.
Productos: Los siguientes intermedios se prepararon como se ha descrito en este documento y pueden incorporarse encompuestos de Fórmula 1
Etapa 1:
Modificaciones: se usaron 3,8 g de ácido 3-(2,3-dihidro-benzofuran-7-il)-acrílico, se obtuvieron 2 g del producto (53 % de rendimiento). Producto:
Datos: 1H RMN (400 MHz, CD3OD) 5 ppm 3,37 (t, J = 9,05 Hz, 1 H), 4,73 (t, J = 9,05 Hz, 2 H), 6,67 (d, J = 7,09 Hz, 1 10 H), 7,10 (d, J = 7,09 Hz, 1 H), 7,37 (d, J = 8,07 Hz, 1 H), 7,81 (d, J = 8,07 Hz, 1 H); EM: (M+H)+ 188.
Etapa 2: Modificaciones: se usaron 1,87 g de 2,3-dihidro-7H-furo[2,3-f]isoquinolin-6-ona, se obtuvieron 1,84 g del producto (90 % de rendimiento).
Producto:
Datos: 1H RMN (400 Hz, CDCl3) 5 ppm 3,43 (t, J = 9,05 Hz, 2 H), 4,82 (t, J = 9,05 Hz, 2 H), 7,52 (d, J = 8,56 Hz, 1
H), 7,66 (d, J = 5,62 Hz, 1 H), 7,84 (d, J = 8,31 Hz, 1 H), 8,19 (d, J = 5,62 Hz, 1 H); EM (M+H)+ 206.
Etapa 3:
Modificaciones: se usaron 206 mg de 6-cloro-2,3-dihidro-furo[2,3-f]isoquinolina, se obtuvo una mezcla de 300 de los20 productos.
Productos: Los siguientes intermedios se prepararon como se ha descrito en este documento y pueden incorporarse encompuestos de Fórmula 1
Etapa 1:
Modificaciones: se usaron 1,14 g de ácido 3-(2,3-dihidro-benzofuran-4-il)-acrílico, se obtuvieron 600 mg de producto (52 % de rendimiento). Producto:
10 Datos: 1H RMN (400 MHz, CD3OD) 5 ppm 3,35 (t, J = 8,93 Hz, 2 H), 4,74 (t, J = 8,93 Hz, 2 H), 6,49 (d, J = 7,09 Hz, 1 H), 6,95 (d, J = 8,56 Hz, 1 H), 7,25 (d, J = 7,09 Hz, 1 H), 8,13 (d, J = 8,80 Hz, 1 H); EM (M+H)+ 188.
Etapa 2: Modificaciones: se usaron 560 mg de 1,7-dihidro-2H-furo[3,2-f]isoquinolin-6-ona, se obtuvieron 380 mg de producto (48 % de rendimiento).
15 Producto:
Datos: 1H RMN (400 Hz, CDCl3) 5 ppm 3,47 (t, J = 9,05 Hz, 2 H), 4,84 (t, J = 9,05 Hz, 2 H), 7,24 (d, J = 8,56 Hz, 1 H), 7,33 (d, J = 5,87 Hz, 1 H), 8,20 (m, 2 H); EM (M+H)+ 206.
Etapa 3:
Modificaciones: se usaron 105 mg de 6-cloro-1,2-dihidro-furo[3,2-f]isoquinolina, se obtuvo una mezcla de 390 de los productos. Productos:
Los siguientes intermedios se prepararon como se ha descrito en este documento y pueden incorporarse encompuestos de Fórmula 1
Etapa 1:
10 Modificaciones: Una mezcla de 6-metoxi-2H-isoquinolin-1-ona (700 mg) y NCS (532 mg) en MeCN (10 ml) se calentó a reflujo durante 3 h. La filtración dio 600 mg (72 %) del producto deseado en forma de un sólido. Producto:
Datos: 1H RMN (400 MHz, CD3OD) 5 ppm 3,96 (s, 1 H), 7,19 (dd, J = 8,80, 2,45 Hz, 1 H), 7,28 (d, J = 2,45 Hz, 1 H), 15 7,34 (s, 1 H), 8,25 (d, J = 9,05 Hz, 1 H); EM: (M+H)+ 210.
Etapa 2:
Modificaciones: se usaron 500 mg de 4-cloro-6-metoxi-2H-isoquinolin-1-ona, se obtuvieron 400 mg del producto.
Producto:
20 Datos: 1H RMN (400 Hz, CDCl3) 5 ppm 4,01 (s, 3 H), 7,35 (d, J = 2,45 Hz, 1 H), 7,41 (d, J = 2,45 Hz, 1 H), 8,24 (d, J = 9,29 Hz, 1 H), 8,27 (s, 1 H); EM: (M+H)+ 229.
Procedimiento B
Etapa 1:
Una mezcla de ácido 4-metoxi-2-metil-benzoico (5,00 g, 30,1 mmol) y cloruro de tionilo (20,0 g, 0,17 mol) se calentóa reflujo durante 30 min. El volátil se retiró al vacío. Después de bombear durante una noche, el aceite viscoso cloruro de ácido se usó en bruto para la siguiente reacción sin purificación.
A una solución de cloruro de 4-metoxi-2-metil-benzoílo en CH2Cl2 (60 ml) a 0 ºC se le añadió gota a gota dietilamina.La mezcla formada se dejó calentar a la temperatura ambiente durante 2 h con agitación. Los volátiles se retiraron alvacío. El residuo se trituró con EtOAc (100 ml) y se filtró. El filtrado se lavó con HCl 1 M, NaOH 1 M y salmuera y sesecó sobre MgSO4. La evaporación del disolvente produjo 6,51 g (98 %) del producto deseado en forma de un aceite viscoso. CL-EM (tiempo de retención: 1,20 min, procedimiento B), EM m/z 222 (M++H).
Etapa 2:
A una solución de N,N-dietil-4-metoxi-2-metil-benzamida (221 mg, 1,0 mmol) en THF (2 ml) a -78 ºC se le añadiógota a gota n-BuLi (0,84 ml de 2,5 M en hexano, 2,10 mmol). La solución de color naranja formada se mantuvo aesta temperatura durante 30 min más antes de la adición gota a gota de benzonitrilo (103 mg, 1,0 mmol). La solución final se dejó calentar a la temperatura ambiente durante una noche con agitación. Se inactivó con ácido cítrico al 5 %enfriado con hielo. Se filtró, se lavó con agua y se secó. La trituración con 2:1 de hexano-EtOAc (5 ml) produjo 205mg (82 %) del producto deseado en forma de un sólido de color blanco. 1H RMN (d6-DMSO) 5 3,89 (s, 3H), 6,84 (s, 1H), 7,05-7,07 (m, 1H), 7,18 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 7,44-7,51 (m, 3H), 7,78 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 8,11 (d, J = 9,0 Hz, 1H); CL-EM (tiempo de retención: 1,20 min, procedimiento B), EM m/z 252 (M++H).
Etapa 3:
Este producto, 1-cloro-6-metoxi-3-fenil-isoquinolina, se preparó por el mismo procedimiento que se ha descritoanteriormente con la excepción de que se usó 6-metoxi-3-fenil-2H-isoquinolin-1-ona.
1H RMN (CDCl3) 5 3,97 (s, 3H), 7,12 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 7,23-7,26 (m, 1H), 7,40-7,42 (m, 1H ), 7,46-7,50 (m, 2H), 7,89 (s, 1H), 8,08 (d, J = 7,0 Hz, 2H), 8,21 (d, J = 9,0 Hz, 1H); CL-EM (tiempo de retención: 1,90 min, procedimiento B), EM m/z 270, 271
(M++H).
Los siguientes intermedios se prepararon como se ha descrito en este documento y pueden incorporarse encompuestos de Fórmula 1
A una solución de N,N-Dietil-4-metoxi-2-metil-benzamida (332 mg, 1,5 mmol) en THF (15 ml) a -78 ºC se le añadió t-BuLi (solución 1,7 M en pentano, 1,3 ml, 2,25 mmol). La solución de color rojo resultante se agitó a -78 ºC durante10 min y después se añadió 2-cianopiridina (156 mg, 1,5 mmol). Después, la mezcla de reacción se calentó a ta y se agitó durante una noche. La reacción se interrumpió con una solución saturada de NH4Cl y se extrajo dos veces con
acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se secaron (MgSO4) y se concentraron. El producto en bruto sepurificó por HPLC Prep. para dar un sólido de color amarillento en forma de la sal TFA. (85 mg, 15 % de rendimiento)
1H RMN (400 MHz, CD3OD) 5 3,91 (m, 3 H), 7,09 (dd, J = 9,05, 2,45 Hz, 1 H), 7,17 (d, J = 2,45 Hz, 1 H), 7,37 (s, 1 H), 7,42 (m, 1 H), 7,92 (m, 1 H), 8,08 (d, J = 8,07 Hz, 1 H), 8,18 (d, J = 9,05 Hz, 1 H), 8,65 (d, J = 4,89 Hz, 1 H). CL-EM (tiempo de retención: 2,14 min.), EM m/z 253 (MH+).
Etapa 2 (Esquema 3, Etapa 1):
Se calentó a reflujo sal TFA de 6-metoxi-3-piridin-2-il-2H-isoquinolin-1-ona (85 mg, 0,232 mmol) con POCl3 (3,0 ml) durante 2 días. Después, el POCl3 se retiró por destilación y el residuo se inactivó con hielo. Después, se neutralizócon una solución 10 N de NaOH y el sólido de color pardo se recogió en forma de un producto puro. (62 mg, 99 % de rendimiento)
CL-EM (tiempo de retención: 2,063 min.), EM m/z 271 (MH+).
Los siguientes intermedios se prepararon como se ha descrito en este documento y pueden incorporarse encompuestos de Fórmula 1
A una solución de N,N-Dietil-4-metoxi-2-metil-benzamida (332 mg, 1,5 mmol) en THF (15 ml) a -78 ºC se le añadió t-BuLi (solución 1,7 M en pentano, 1,3 ml, 2,25 mmol). La solución de color rojo resultante se agitó a -78 ºC durante10 min y después se añadió 4-cianopiridina (164 mg, 1,575 mmol). Después, la mezcla de reacción se calentó a ta yse agitó durante una noche. La reacción se interrumpió con una solución saturada de NH4Cl y el precipitado de color amarillo se recogió en forma de un producto puro. (145 mg, 38 % de rendimiento)
1H RMN (CD3OD, 400 MHz) 5 3,91 (s, 3 H), 7,18 (dd, J = 8,8 Hz, 2,8 Hz, 1 H), 7,26 (m, 2 H), 8,06 (d, J = 6,0 Hz, 2H), 8,16 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 8,84 (d, J = 6,0 Hz, 2H). CL-EM (tiempo de retención: 1,300 min.), EM m/z 253 (MH+).
Etapa 2 (Esquema 3, etapa 1):
Se calentó a reflujo 6-Metoxi-3-piridin-4-il-2H-isoquinolin-1-ona (134 mg, 0,531 mmol) con POCl3 (6,0 ml) durante 5 días. Después, el POCl3 se retiró por destilación y el residuo se inactivó con hielo. Después, se neutralizó con unasolución saturada de NaHCO3 y el sólido de color pardo se recogió en forma de un producto puro. (125 mg, 87 % de rendimiento)
1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz) 5 3,99 (s, 3 H), 7,53 (dd, J = 9,04 Hz, 2,44 Hz, 1 H), 7,59 (d, J = 2,69 Hz, 1 H), 8,26 (d, J = 9,05 Hz, 1 H), 8,30 (d, J = 5,38 Hz, 2 H), 8,73 (s, 1 H), 8,85 (d, J = 6,36 Hz, 2 H).
CL-EM (tiempo de retención: 2,027 min.), EM m/z 271 (MH+).
Los siguientes intermedios se prepararon como se ha descrito en este documento y pueden incorporarse encompuestos de Fórmula 1
A una solución de N,N-Dietil-4-metoxi-2-metil-benzamida (332 mg, 1,5 mmol) en THF (15 ml) a -78 ºC se le añadió t-BuLi (solución 1,7 M en pentano, 1,3 ml, 2,25 mmol). La solución de color rojo resultante se agitó a -78 ºC durante10 min y después se añadió 4-dimetilamino benzonitrilo (219 mg, 1,5 mmol). Después, la mezcla de reacción se
5 calentó a ta y se agitó durante una noche. La reacción se interrumpió con una solución saturada de NH4Cl y el precipitado de color amarillo se recogió y se trituró con éter para dar un sólido de color blanquecino en forma de unproducto puro. (247 mg, 56 % de rendimiento)
1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz) 5 2,97 (s, 6 H), 3,87 (s, 3 H), 6,72 (s, 1 H), 6,78 (d, J = 8,80 Hz, 2 H), 6,97 (dd, J = 8,80, 2,45 Hz, 1 H), 7,10 (d, J = 2,45 Hz, 1 H), 7,65 (d, J = 8,80 Hz, 2 H), 8,05 (d, J = 8,80 Hz, 1 H), 11,11 (s, 1 H).
10 CL-EM (tiempo de retención: 2,023 min.), EM m/z 295 (MH+).
Se calentó a reflujo 3-(4-Dimetilamino-fenil)-6-metoxi-2H-isoquinolin-1-ona (245 mg, 0,83 mmol) con POCl3 (10,0 ml)
15 durante 2 días. Después, el POCl3 se retiró por destilación y el residuo se inactivó con hielo. Después, se neutralizó con una solución 10 N de NaOH y se extrajo dos veces con acetato de etilo. Las fases orgánicas se combinaron y se secaron (MgSO4). La evaporación del disolvente dio un sólido de color naranja como producto (215 mg, 83 % de rendimiento)
1H RMN (400 MHz, CD3OD) 5 3,01 (s, 6 H), 3,96 (s, 3 H), 6,88 (d, J = 9,05 Hz, 2 H), 7,20 (dd, J = 9,17, 2,57 Hz, 1 20 H), 7,28 (d, J = 2,45 Hz, 1 H), 7,94 (s, 1 H), 7,96 (d, J = 9,05 Hz, 2 H), 8,13 (d, J = 9,29 Hz, 1 H).
CL-EM (tiempo de retención: 2,543 min.), EM m/z 313 (MH+).
Una mezcla de [4-(1-Cloro-6-metoxi-isoquinolin-3-il)-fenil]-dimetil-amina (110 mg, 0,35 mmol) e hidrogenodifluorurode tetrabutilfosfonio (0,5 g) se calentó a 140 ºC en un reactor de microondas Smith durante 20 min. Después, se25 añadió agua y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se separó, se lavó con agua y se secó (MgSO4). Laevaporación del disolvente dio un sólido de color parduzco como producto. (85 mg, 82 % de rendimiento)
CL-EM (tiempo de retención: 2,320 min.), EM m/z 297 (MH+).
Procedimiento C
Etapa 1:
A una solución de N-BOC-3-(R)-hidroxi-L-prolina (6,22 g, 26,9 mmol) en DMF (250 ml) a 0 ºC se le añadió en variasporciones NaH (al 60 %, 3,23 g, 80,8 mmol). La suspensión formada se agitó a esta temperatura durante 30 min. Se añadió 1,3-dicloro-isoquinolina (5,33 g, 26,9 mmol) en forma de un sólido en una porción y la mezcla final se agitó a la temperatura ambiente durante 12 h. Se inactivó con ácido cítrico al 5 % enfriado con hielo (ac.) y se extrajo conEtOAc (300 ml). La fase acuosa se extrajo de nuevo con EtOAc. Las fases orgánicas combinadas se lavaron conácido cítrico al 5 % (ac.) y salmuera respectivamente, se secaron sobre MgSO4 y se filtraron. El filtrado se evaporó alvacío a sequedad para producir 10,53 g (99,8 %) de 1-terc-butil éster del ácido 4-(6-metoxi-isoquinolin-1-iloxi)pirrolidina-1,2-dicarboxílico en forma de una espuma de color blanquecino. Este material se usó en la siguiente etapa de reacción en bruto sin purificación adicional.
1H RMN (CD3OD) 5 1,43, 1,44 (rotámeros, 9H), 2,39-2,44 (m, 1H), 2,68-2,72 (m, 1H), 3,80-3,90 (m, 2H), 4,44-4,52(m, 1H), 5,77 (a, 1H), 7,39 (s, 1H), 7,58 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 7,71-7,78 (m, 2H), 8,16 (d, J = 7,5 Hz, 1H);
CL-EM (tiempo de retención: 1,80 min, procedimiento B), EM m/z 392 (M++H).
Etapa 2:
Una mezcla de 1-terc-butil éster del ácido 4-(6-metoxi-isoquinolin-1-iloxi)-pirrolidina-1,2-dicarboxílico (39 mg, 0,10mmol), ácido fenilborónico (14,6 mg, 0,12 mmol), terc-butóxido sódico (38 mg, 0,40 mmol) y ((t-Bu)2POH)2PdCl2 (POPd) (5 mg, 0,01 mmol) en THF (2 ml) se calentó a reflujo durante 4 h. Después de enfriar, la mezcla formada seinactivó con ácido cítrico al 5 % (ac.) y se extrajo con EtOAc (20 ml). La fase orgánica se lavó con salmuera, se secósobre MgSO4, se filtró y se evaporó. El residuo se purificó por HPLC prep. para producir 36 mg (83 %) del producto deseado en forma de una espuma de color blanquecino.
1H RMN (CD3OD) 5 1,43, 1,45 (rotámeros, 9H), 2,51-2,56 (m, 1H), 2,74-2,82 (m, 1H), 3,88-3,92 (m, 1H), 3,98-4,01(m, 1H), 4,50-4,57 (m, 1H), 5,95 (a, 1H), 7,36-7,39 (m, 1H), 7,45-7,48 (m, 2H), 7,55 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 7,70 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 7,84-7,89 (m, 2H), 8,14-8,17 (m, 3H), 9,05 (a, 1H);
CL-EM (tiempo de retención: 1,97 min, procedimiento B), EM m/z 435 (M++H).
Los siguientes intermedios se prepararon como se ha descrito en este documento y pueden incorporarse encompuestos de Fórmula 1
Preparado usando ácido 4-metoxifenilborónico
1H RMN (CD3OD) 5 1,40, 1,45 (rotámeros, 9H), 2,50-2,55 (m, 1H), 2,73-2,81 (m, 1H), 3,81-3,89 (m, 4H), 3,98-4,01 (m, 1H), 4,50-4,57 (m, 1H), 5,93 (a, 1H), 7,02 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 7,50 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 7,67 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 7,73 (s, 1H), 7,83 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 8,09 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 8,15 (d, J = 8,0 Hz, 1H); CL-EM (tiempo de retención:
2,00 min, procedimiento B), EM m/z 465 (M++H). El siguiente intermedio se preparó como se ha descrito anteriormente:
Preparado usando ácido 4-piridilborónico
5 1H RMN (CD3OD) 5 1,43, 1,46 (rotámeros, 9H), 2,53-2,56 (m, 1H), 2,80-2,89 (m, 1H), 3,90-3,93 (m, 1H), 4,00-4,05 (m, 1H), 4,50-4,57 (m, 1H), 6,00, 6,05 (rotámeros, 1H), 7,80 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 7,87 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 8,08 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 8,32 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 8,49 (s, 1H), 8,84 (d, J = 6,0 Hz, 2H), 8,84 (d, J = 6,5 Hz, 2H); CL-EM (tiempo de retención: 1,39 min, procedimiento B), EM m/z 436 (M++H).
Los siguientes intermedios se prepararon como se ha descrito en este documento y pueden incorporarse en10 compuestos de Fórmula 1
Preparado usando ácido 4-N,N-dimetilamino-fenilborónico CL-EM (tiempo de retención: 1,64 min, procedimiento B), EM m/z 478 (M++H). Procedimiento D
Etapa 1:
A una solución de N,N-dietil-4-metoxi-2-metil-benzamida (633 mg, 2,9 mmol) en THF (15 ml) a -78 ºC se le añadiógota a gota n-BuLi (2,3 ml de 2,5 M en hexano, 5,74 mmol). La solución de color rojo formada se mantuvo a estatemperatura durante 30 min más antes de canularse a una solución de éster etílico del ácido tiazol-2-carboxílico (A. Medici y col., Tetrahedron Lett. 1983, p2901) (450 mg, 2,9 mmol) en THF (5 ml) a -78 ºC. La solución final de colorverde oscuro se mantuvo a esta temperatura durante 2 h con agitación. Se inactivó con NH4Cl sat. (ac.) y se extrajo con EtOAc (50 ml). La fase orgánica se lavó con NH4Cl sat. (ac.) y salmuera, se secó y se purificó por cromatografíaen columna ultrarrápida, eluyendo con 2:1 de EtOAc:hexano para proporcionar 405 mg (45 %) del producto deseadoen forma de un aceite viscoso de color blanquecino.
1H RMN (CDCl3) 5 1,08 (t, J = 7,0 Hz, 6H), 3,22 (a, 2H), 3,44 (a, 2H), 3,79 (s, 3H), 4,59 (s, 2H), 6,79-6,81 (m, 1H), 6,86 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 7,16 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,66 (d, J = 3,0 Hz, 1H), 8,00 (d, J = 3,0 Hz, 1H); CL-EM (tiempo de retención: 1,30 min, procedimiento B), EM m/z 333 (M++H).
Etapa 2:
Una mezcla de N,N-dietil-4-metoxi-2-(2-oxo-2-tiazol-2-il-etil)-benzamida (405 mg, 1,22 mmol) y NH4OAc (3,0 g, 38,9 mmol) se calentó a 140 ºC en un tubo cerrado herméticamente durante 1 h. La solución fundida se vertió en aguaenfriada con hielo, se filtró y la torta se lavó minuciosamente con agua. El sólido secado de color parduzco (240 mg,76 %) se usó en bruto para la siguiente reacción sin purificación adicional. CL-EM (tiempo de retención: 1,24 min,procedimiento B), EM m/z 259 (M++H).
Etapa 3:
Este producto, 1-cloro-6-metoxi-3-tiazol-2-il-isoquinolina, se preparó como se ha descrito anteriormente con la excepción de que se usó 6-metoxi-3-tiazol-2-il-2H-isoquinolin-1-ona.
1H RMN (CDCl3) 5 3,97 (s, 3H), 7,16 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 7,27-7,31 (m, 1H), 7,46 (d, J = 5,0 Hz, 1H ), 7,93 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 8,22 (d, J = 15,5 Hz, 1H), 8,39 (s, 1H);
CL-EM (tiempo de retención: 1,66 min, procedimiento B), EM m/z 277 (M++H).
Etapa 4:
Este producto se preparó por el mismo procedimiento que se ha descrito anteriormente con la excepción de que seusó 1-cloro-6-metoxi-3-tiazol-2-il-isoquinolina.
1H RMN (CD3OD) 5 0,97-1,09 (m, 12H), 1,24-1,29 (m, 10H), 1,44-1,46 (m, 1H), 1,87-1,90 (m, 1H), 2,20-2,26 (m, 1H),2,30-2,36 (m. 1H), 2,65-2,71 (m, 1H), 2,93-2,96 (m, 1H), 3,96 (s, 3H), 4,12-4,27 (m, 2H), 4,38-4,52 (m, 2H), 5,12 (d, J = 10,5 Hz, 1H), 5,29 (d, J = 17,5 Hz, 1H), 5,69-5,74 (m, 1H), 5,99 (a, 1H), 7,14 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 7,33 (s, 1H), 7,66 (d, J = 3,5 Hz, 1H), 7,93 (d, J = 3,0 Hz, 1H), 8,05 (s, 1H), 8,11 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 9,14 (a, 1H); CL-EM (tiempo de retención: 1,89 min, procedimiento B), EM m/z 797 (M++H).
Los siguientes intermedios se prepararon como se ha descrito en este documento y pueden incorporarse encompuestos de Fórmula 1
Se preparó 6-metoxi-3-(3-metoxi-isoxazol-5-il)-2H-isoquinolin-1-ona usando N,N-dietil-4-metoxi-2-[2-(3-metoxiisoxazol-5-il)-2-oxo-etil]-benzamida.
1H RMN (DMSO-d6) 5 3,89 (s, 3H), 3,97 (s, 3H), 7,01 (s, 1H), 7,14-7,16 (m, 2H), 7,43 (s, 1H), 8,13 (d, J = 8,5 Hz, 1H); CL-EM (tiempo de retención: 1,31 min, procedimiento B), EM m/z 273 (M++H).
Se preparó 1-cloro-6-metoxi-3-(3-metoxi-isoxazol-5-il)-isoquinolina usando 6-metoxi-3-(3-metoxi-isoxazol-5-il)-2Hisoquinolin-1-ona
1H RMN (CDCl3) 5 3,97 (s, 3H), 4,04 (s, 3H), 6,60 (s, 1H), 7,17 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 7,31-7,33 (m, 1H), 8,02 (s, 1H), 10 8,23 (d, J = 9,0 Hz, 1H);
CL-EM (tiempo de retención: 1,73 min, procedimiento B), EM m/z 291, 293 (M++H)
Los siguientes intermedios se prepararon como se ha descrito en este documento y pueden incorporarse encompuestos de Fórmula 1
15 Se preparó N,N-dietil-4-metoxi-2,[2-(5-metoxi-oxazol.2,il)-2-oxo-etil]-benzamida usando éster etílico del ácido 5metoxi-oxazol-2-carboxílico CL-EM (tiempo de retención: 1,24 min, procedimiento B), EM m/z 347 (M++H).
Se preparó 6-metoxi-3-(5-metoxi-oxazol-2-il)-2H-isoquinolin-1-ona usando N,N-dietil-4-metoxi-2-[2-(5-metoxi-oxazol2-il)-2-oxo-etil]-benzamida.
20 1H RMN (DMSO-d6) 5 3,94 (s, 3H), 4,01 (s, 3H), 6,34 (s, 1H), 6,99 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,12-7,14 (m, 1H), 7,25 (s, 1H), 8,32 (d, J = 9,0 Hz, 1H);
CL-EM (tiempo de retención: 1,22 min, procedimiento B), EM m/z 274 (M++H).
Se preparó 1-cloro-6-metoxi-3-(5-metoxi-oxazol-2-il)-isoquinolina usando 6-metoxi-3-(5-metoxi-oxazol-2-il)-2Hisoquinolin-1-ona.
1H RMN (CDCl3) 5 3,96 (s, 3H), 4,00 (s, 3H), 6,34 (s, 1H), 7,12 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 7,28-7,31 (m, 1H), 8,13 (s, 1H), 8,23 (d, J = 9,0 Hz, 1H);
CL-EM (tiempo de retención: 1,58 min, procedimiento B), EM m/z 291, 293 (M++H).
Los siguientes intermedios se prepararon como se ha descrito en este documento y pueden incorporarse encompuestos de Fórmula 1
10 A una solución de N,N-Dietil-4-metoxi-2-metil-benzamida (332 mg, 1,5 mmol) en THF (15 ml) a -78 ºC se le añadió t-BuLi (solución 1,7 M en pentano, 2,12 ml, 3,6 mmol). La solución de color rojo resultante se agitó a -78 ºC durante10 min y después se añadió nicotinato de metilo (206 mg, 1,5 mmol). La mezcla de reacción se agitó a -78 ºCdurante 2 h. Después, la reacción se interrumpió con una solución saturada de NH4Cl y se extrajo dos veces con acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se secaron (MgSO4) y se concentraron. El producto en bruto se
15 purificó por HPLC Prep. para dar un aceite espeso de color amarillento en forma de la sal TFA. (124 mg, 19 % de rendimiento)
CL-EM (tiempo de retención: 1,740 min.), EM m/z 349 (M+Na+).
Se calentó N,N-Dietil-4-metoxi-2-(2-oxo-2-piridin-3-il-etil)-benzamida (120 mg, 0,272 mmol) con acetato de amonio (1
20 g) durante 3 h. Después, se enfrió y se añadió agua. Se extrajo con acetato de etilo y la fase orgánica se separó. Después, se secó (MgSO4) y se concentró para dar un sólido de color parduzco como producto. (65 mg, 95 % de rendimiento) 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 3,89 (s, 3 H), 6,93 (s, 1 H), 7,10 (dd, J = 8,80, 2,45 Hz, 1 H), 7,19 (d, J = 2,45 Hz, 1 H), 7,52 (dd, J = 7,46, 4,77 Hz, 1 H), 8,15 (m, 2 H), 8,64 (dd, J = 4,89, 1,47 Hz, 1 H), 8,96 (d, J = 1,71 Hz, 1 H), 11,51 (s, 1 H). CL-EM (tiempo de retención: 1,377 min.), EM m/z 253 (MH+).
Se calentó a reflujo 6-Metoxi-3-piridin-3-il-2H-isoquinolin-1-ona (65 mg, 0,258 mmol) con POCl3 (2,5 ml) durante 7 días. Después, el POCl3 se retiró por destilación y el residuo se inactivó con hielo. Después, se neutralizó con unasolución 10 N de NaOH y se extrajo dos veces con acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se secaron(MgSO4) y se concentraron para dar un sólido de color amarillo como producto. (27 mg, 39 % de rendimiento)
CL-EM (tiempo de retención: 2,090 min.), EM m/z 271 (MH+).
Los siguientes intermedios se prepararon como se ha descrito en este documento y pueden incorporarse encompuestos de Fórmula 1
A una solución de N,N-Dietil-4-metoxi-2-metil-benzamida (332 mg, 1,5 mmol) en THF (15 ml) a -78 ºC se le añadió t-BuLi (solución 1,7 M en pentano, 2,2 ml, 3,75 mmol). La solución de color rojo resultante se agitó a -78 ºC durante 10 min y después se añadió éster metílico del ácido N,N-dimetilantranílico (269 mg, 1,5 mmol). La mezcla dereacción se agitó a -78 ºC durante 2 h. Después, la reacción se interrumpió con una solución saturada de NH4Cl y se extrajo dos veces con acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se secaron (MgSO4) y se concentraron. Elproducto en bruto se purificó por HPLC Prep. para dar un aceite espeso de color amarillento como producto. (256mg, 46 % de rendimiento)
1H RMN (400 MHz, CD3OD) 5 0,99-1,13 (m, 6 H), 3,23-3,31 (m, 8 H), 3,39 (m, 2 H), 3,82 (s, 3 H), 4,35 (s, 2 H), 6,91 (dd, J = 8,44, 2,57 Hz, 1 H), 6,99 (d, J = 2,45 Hz, 1 H), 7,22 (d, J = 8,56 Hz, 1 H), 7,69 (t, J = 7,70 Hz, 1 H), 7,84 (m, 1 H), 7,96 (d, J = 8,31 Hz, 1 H), 8,18 (d, J = 7,83 Hz, 1 H). CL-EM (tiempo de retención: 1,557 min.), EM m/z 369 (MH+).
Se calentó 2-[2-(2-Dimetilamino-fenil)-2-oxo-etil]-N,N-dietil-4-metoxi-benzamida (250 mg, 0,678 mmol) con acetatode amonio (1,5 g) durante 2 h. Después, se enfrió y se añadió agua. Se extrajo con acetato de etilo y la faseorgánica se separó. Después, se secó (MgSO4) y se concentró para dar un sólido de color amarillento como producto. (125 mg, 63 % de rendimiento)
1H RMN (400 MHz, CD3OD) 5 2,95 (s, 6 H), 3,92 (s, 3 H), 6,92 (s, 1 H), 7,12 (dd, J = 8,80, 2,45 Hz, 1 H), 7,16 (d, J = 2,45 Hz, 1 H), 7,35 (m, 1 H), 7,55 (m, 2 H), 7,63 (d, J = 7,83 Hz, 1 H), 8,20 (d, J = 9,05 Hz, 1 H).
CL-EM (tiempo de retención: 2,097 min.), EM m/z 295 (MH+).
Se calentó a reflujo 3-(2-Dimetilamino-fenil)-6-metoxi-2H-isoquinolin-1-ona (125 mg, 0,425 mmol) con POCl3 (4,0 ml) durante un día. Después, el POCl3 se retiró por destilación y el residuo se inactivó con hielo. Después, se neutralizó con una solución 10 N de NaOH y se extrajo dos veces con acetato de etilo. Las fases orgánicas se combinaron y se secaron (MgSO4). La evaporación del disolvente dio un sólido de color parduzco como producto (82 mg, 62 % de rendimiento)
CL-EM (tiempo de retención: 2,040 min.), EM m/z 313 (MH+).
Una mezcla de [2-(1-Cloro-6-metoxi-isoquinolin-3-il)-fenil]-dimetil-amina (82 mg, 0,262 mmol) e hidrogenodifluorurode tetrabutilfosfonio (1,0 g) se calentó a 140 ºC en un reactor de microondas Smith durante 20 min. Después, seañadió agua y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se separó, se lavó con agua y se secó (MgSO4). La
5 evaporación del disolvente dio el producto en bruto que se purificó por HPLC Prep. para producir un aceite de color amarillento como producto. (85 mg)
1H RMN (400 MHz, CD3OD) 5 3,41 (s, 6 H), 4,00 (s, 3 H), 7,42 (dd, J = 9,05, 2,45 Hz, 1 H), 7,53 (s, 1 H), 7,71 (m, 2 H), 7,99 (m, 1 H), 8,16 (m, 2 H), 8,31 (s, 1 H).
CL-EM (tiempo de retención: 1,873 min.), EM m/z 297 (MH+).
10 Los siguientes intermedios se prepararon como se ha descrito en este documento y pueden incorporarse en compuestos de Fórmula 1
A una solución de N,N-Dietil-4-metoxi-2-metil-benzamida (332 mg, 1,5 mmol) en THF (15 ml) a -78 ºC se le añadió t-
BuLi (solución 1,7 M en pentano, 2,2 ml, 3,75 mmol). La solución de color rojo resultante se agitó a -78 ºC durante15 10 min y después se añadió éster metílico del ácido (3-dimetilamino)benzoico (269 mg, 1,5 mmol). La mezcla de
reacción se agitó a -78 ºC durante 2 h. Después, la reacción se interrumpió con una solución saturada de NH4Cl y se
extrajo dos veces con acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se secaron (MgSO4) y se concentraron. El
producto en bruto se purificó por HPLC Prep. para dar un aceite espeso de color amarillento en forma de la sal TFA.
(245 mg, 33 % de rendimiento) 1H RMN (400 MHz, CD3OD) 5 1,01 (t, J = 6,85 Hz, 3 H), 1,09 (m, 3 H), 3,11 (s, 6H),20 3,21 (m, 2 H), 3,40 (m, 2 H), 3,79 (s, 3 H), 4,39 (s, 2 H), 6,84-6,91 (m, 2 H), 7,19 (d, J = 8,32 Hz, 1 H), 7,35 (m, 1 H),
7,49 (t, J = 8,07 Hz, 1 H), 7,66-7,71 (m, 2 H). CL-EM (tiempo de retención: 1,930 min.), EM m/z 369 (MH+).
Se calentó 2-[2-(3-Dimetilamino-fenil)-2-oxo-etil]-N,N-dietil-4-metoxi-benzamida (240 mg, 0,497 mmol) con acetatode amonio (2,0 g) durante 2,5 h. Después, se enfrió y se añadió agua. A sólido de color parduzco se recogió en25 forma del producto puro. (95 mg, 65 % de rendimiento)
1H RMN (400 MHz, CD3OD) 5 2,98 (s, 6 H), 3,88 (s, 3 H), 6,74-6,87 (m, 2 H), 7,01-7,07 (m, 3 H), 7,18 (d, J = 2,44 Hz, 1 H), 7,28 (t, J = 7,82 Hz, 1 H), 8,10 (d, J = 8,80 Hz, 1 H).
CL-EM (tiempo de retención: 1,773 min.), EM m/z 295 (MH+).
Se calentó a reflujo 3-(3-Dimetilamino-fenil)-6-metoxi-2H-isoquinolin-1-ona (92 mg, 0,312 mmol) con POCl3 (3,0 ml) durante 2 días. Después, el POCl3 se retiró por destilación y el residuo se inactivó con hielo. Después, se neutralizó con una solución saturada de NaHCO3 y se extrajo dos veces con acetato de etilo. Las fases orgánicas se combinaron y se secaron (MgSO4). La evaporación del disolvente dio un aceite espeso de color parduzco como producto. (72 mg, 74 % de rendimiento)
CL-EM (tiempo de retención: 2,297 min.), EM m/z 313 (MH+).
Una mezcla de [3-(1-Cloro-6-metoxi-isoquinolin-3-il)-fenil)-dimetilamina (72 mg, 0,23 mmol) y hidrogenodifluoruro de
10 tetrabutilfosfonio (0,5 g) se calentó a 140 ºC en un reactor de microondas Smith durante 20 min. Después, se añadió agua y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se separó, se lavó con agua y se secó (MgSO4). Laevaporación del disolvente dio un aceite de color parduzco como producto. (58 mg, 85 % de rendimiento)
CL-EM (tiempo de retención: 2,193 min.), EM m/z 297 (MH+).
Los siguientes intermedios se prepararon como se ha descrito en este documento y pueden incorporarse en15 compuestos de Fórmula 1
La condensación de bromopiruvato de etilo con etil tiourea en dioxano a la temperatura de reflujo produjo elmonoalquilamino tiazol en forma de la sal HBr con rendimiento cuantitativo. La alquilación de éster etílico del ácido2-etilamino-tiazol-4-carboxílico con EtI en DMF proporcionó éster etílico del ácido 2-dietilamino-tiazol-4-carboxílico.
20 CL/EM m/z 229 (MH)+
Procedimiento E
Etapa 1:
Una suspensión de éster metílico del ácido 2-cianometil-4-metoxi-benzoico (1,9 g y TsOH·H2O (0,15 g, mmol) enmorfolina 5 ml) se calentó a reflujo durante 4 h y el disolvente se retiró al vacío. El residuo se recristalizó en5 EtOAc/hexanos con gotas de MeOH para proporcionar el producto (0,43 g, 17 %): CL-EM tiempo de retención: 1,07 procedimiento H), EM m/z 266 (M++1).
Etapa 2:
Una mezcla de 6-metoxi-3-morfolin-4-il-isoquinolin-1-ol (0,298 g, 1,15 mmol) en POCl3 (20 ml) se calentó a reflujo durante 2 h, el disolvente se retiró al vacío y se añadió agua fría. El pH se ajustó a >11 mediante la adición de
10 NaOH 1,0 N. La fase acuosa se extrajo con EtOAc. El extracto se secó (MgSO4) y el disolvente se retiró al vacío para proporcionar el producto (0,299 g, 94 %): CL-EM tiempo de retención: 1,68 procedimiento H), EM m/z 279 (M++1).
Etapa 3:
Una mezcla de 1-Cloro-6-metoxi-3-morfolin-4-il-isoquinolina (0,050 g, 0,18 mmol) e hidrogenodifluoruro de
15 tetrabutilfosfonio (0,8 g, 2,8 mmol) [Synlett 1992, (4), 345-6] se calentó a 140 ºC en el microondas durante 10 min. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se filtró a través de una precolumna ISCO de 25 g con una capa de gel desilicio en la parte superior, y el disolvente se retiró para proporcionar el producto (0,037 mg, 77 %): 1H RMN (CLOROFORMO-D) 5 ppm 3,48 (m, 4 H), 3,84 (m, 4 H), 3,89 (s, 3 H), 6,46 (d, J = 1,22 Hz, 1 H), 6,85 (s, 1 H), 6,90 (dd, J = 9,16, 2,44 Hz, 1 H), 7,82 (d, J = 8,85 Hz, 1 H). CL-EM tiempo de retención: 1,56 procedimiento H), EM m/z
20 263 (M++1).
Procedimiento F
Se prepararon 6-fluoro y 6-alquil isoquinolinas en la preparación de compuestos de Fórmula 1 mediante una síntesisde Pomeranz-Fritsch (Procedimiento típico: Preparación de 1,1-biisoquinolina 8,8-disustituida ópticamente activa, K.Hirao, R. Tsuchiya, Y. Yano, H. Tsue, Heterocycles 42(1) 1996, 415-422) como se indica a continuación. Los
25 productos se convirtieron en los derivados de 1-cloro mediante intermedios de N-óxido.
Esquema de Síntesis General
Reactivos y condiciones de reacción: (a) calentamiento a reflujo en benceno, retirada azeotrópica del agua; (b)primera etapa: cloroformiato de etilo, fosfito de trimetilo en THF, segunda etapa: tetracloruro de titanio en cloroformo;30 (c) MCPBA en CH2Cl2; (d) POCl3 en benceno
R
Isoquinolina, Rendimiento 1-Cloruro,combinado rendimiento
F
20 43
Et
76 65
i-Pr
14 18
t-Bu
47 55
Preparación de intermedios de 6-isopropoxil y 6-terc-butoxil isoquinolina:
Algunas 6-alcoxi-1-cloro isoquinolinas se prepararon por un desplazamiento ipso directo de la 6-fluoro-1cloroisoquinolina con los iones metálicos de alcóxido correspondientes tales como terc-butóxido potásico (al 53 %) e isopropóxido sódico (al 54 %).
Esquema de Síntesis General
R = aniones de alcóxido tales como terc-Bu, iso-Pr
La 6-fluoro-1-cloroisoquinolina se sometió a un desplazamiento nucleófilo aromático con isopropóxido sódico y terc
10 butóxido potásico en DMF para dar las 6-isopropoxil (al 54 %): 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 1,43 (d, J = 6,11 Hz, 6 H) 4,76 (m, J = 6,11 Hz, 1 H) 7,08 (d, J = 2,45 Hz, 1 H) 7,29 (dd, J = 9,29, 2,45 Hz, 1 H) 7,50 (d, J = 5,62 Hz, 1 H) 8,18 (d, J = 5,87 Hz, 1 H) 8,24 (d, J = 9,29 Hz, 1 H) y 6-terc-butoxil-1-cloro isoquinolinas correspondientes (al 55 %): 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 1,48 (s, 9 H) 7,31 (m, 2 H) 7,47 (d, J = 5,62 Hz, 1 H) 8,18 (d, J = 5,62 Hz, 1 H) 8,21 (d, J = 9,78 Hz, 1 H) como producto principal, respectivamente. Estas 6
15 alcoxil-1-cloro isoquinolinas se incorporaron en compuestos de Fórmula 1 como se describe en este documento.
Procedimiento G
Esquema de Síntesis General
Esta síntesis hace uso de las tecnologías descritas, en parte, en las siguientes referencias: 20 (1) Hojo, Masaru; Masuda, Ryoichi; Sakaguchi, Syuhei; Takagawa, Makoto, Synthesis (1986), (12), 1016-17
(2) Rigby, James H.; Holsworth, Daniel D.; James, Kelly. Vinyl Isocianates In Synthesis. [4 + 2] CicloadditionReactions With Benzyne Addends. Journal Of Organic Chemistry (1989), 54(17), 4019-20
(3) Uchibori, Y.; Umeno, M.; Yoshiokai, H.; Heterocycles, 1992, 34 (8), 1507-1510 Etapa 1d: Preparación declorhidrato de éster etílico del ácido (1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico racémico (ProcedimientoA y Procedimiento B) y separación quiral de este racemato para la preparación de clorhidrato de éster etílico delácido N-(1R, 2S)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico (Procedimiento C)
El compuesto nombrado se hizo (Etapa d) racémico por cada uno de los siguientes procedimientos A y B. Esteracemato también puede separarse para producir éster del ácido Boc-(1R, 2S)-1-amino-2-vinilciclopropilcarboxílicoquiral que se desprotegió en condiciones ácidas para producir clorhidrato de éster del ácido (1R,2S)-1-amino-2vinilciclopropano (Procedimiento C).
Procedimiento A
A.1 Preparación de N-Bencil Imina de Éster Etílico de Glicina
Se suspendió clorhidrato de éster etílico de glicina (303,8 g, 2,16 mol) en terc-butilmetil éter (1,6 l). Se añadieron benzaldehído (231 g, 2,16 mol) y sulfato sódico anhidro (154,6 g, 1,09 mol) y la mezcla se enfrió a 0 ºC usando unbaño de hielo-agua. Se añadió gota a gota trietilamina (455 ml, 3,26 mol) durante 30 min y la mezcla se agitó durante 48 h a ta. Después, la reacción se interrumpió mediante la adición de agua enfriada con hielo (1 l) y la faseorgánica se separó. La fase acuosa se extrajo con terc-butilmetil éter (0,5 l) y las fases orgánicas combinadas se lavaron con una mezcla de NaHCO3 acuoso saturado (1 l) y salmuera (1 l). La solución se secó sobre MgSO4 y se concentró al vacío para producir 392,4 g del producto de N-bencil imina en forma de un aceite espeso de color amarillo que se usó directamente en la siguiente etapa. 1H RMN (CDCl3, 300 MHz) 5 1,32 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 4,24 (c, J = 7,1 Hz, 2H), 4,41 (d, J = 1,1 Hz, 2H), 7,39-7,47 (m, 3H), 7,78-7,81 (m, 2H), 8,31 (s, 1H).
A.2 Preparación de éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclpropanocarboxílico racémico
A una suspensión de terc-butóxido de litio (84,06 g, 1,05 mol) en tolueno seco (1,2 l) se le añadió gota a gota una mezcla de la N-bencil imina de éster etílico de glicina (100,4 g, 0,526 mol) y trans-1,4-dibromo-2-buteno (107,0 g,0,500 mol) en tolueno seco (0,6 l) durante 60 min. Después de que se completara la adición, la mezcla de color rojooscuro se inactivó mediante la adición de agua (1 l) y terc-butilmetil éter (TBME, 1 l). La fase acuosa se separó y seextrajo una segunda vez con TBME (1 l). La fase orgánicas se combinaron, se añadió HCl 1 N (1 l) y la mezcla seagitó a temperatura ambiente durante 2 h. La fase orgánica se separó y se extrajo con agua (0,8 l). Las fases acuosas se combinaron, se saturaron con sal (700 g), se añadió TBME (1 l) y la mezcla se enfrió a 0 ºC. Después, lamezcla agitada se basificó a pH 14 mediante la adición gota a gota de NaOH 10 N, la fase orgánica se separó y lafase acuosa se extrajo con TBME (2 x 500 ml). Los extractos orgánicos combinados se secaron (MgSO4) y se concentraron hasta un volumen de 1 l. A esta solución de amina libre se le añadió BOC2O o dicarbonato de di-tercbutilo (131,0 g, 0,6 mol) y la mezcla se agitó 4 días a ta. A la reacción se le añadió más cantidad de dicarbonato de di-terc-butilo (50 g, 0,23 mol) y la mezcla se calentó a reflujo durante 3 h y después se dejó enfriar a temperaturaambiente durante una noche. La mezcla de reacción se secó sobre MgSO4 y se concentró al vacío para producir 80g de material en bruto. Este residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (2,5 kg de SiO2, eluyendo con MeOH del 1 % al 2 %/CH2Cl2) para producir 57 g (53 %) de éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-264 5
vinilciclopropanocarboxílico racémico en forma de un aceite de color amarillo que solidificó mientras reposaba en elfrigorífico: 1H RMN (CDCl3, 300 MHz) 5 1,26 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 1,46 (s, 9H), 1,43-1,49 (m, 1H), 1,76-1,82 (m a, 1H), 2,14 (c, J = 8,6 Hz, 1H), 4,18 (c, J = 7,2 Hz, 2H), 5,12 (dd J = 10,3, 1,7 Hz, 1H), 5,25 (s a, 1H), 5,29 (dd, J = 17,6, 1,7 Hz, 1H), 5,77 (ddd, J = 17,6, 10,3, 8,9 Hz, 1H); EM m/z 254,16 (M-1)
A.3 Preparación de clorhidrato de éster etílico del ácido (1R,2S)/(1S,2R) 1-amino-2vinilciclopropanocarboxílico racémico
Se disolvió éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico (9,39 g, 36,8 mmol) en HCl 4 N/dioxano (90 ml, 360 mmol) y se agitó durante 2 h a ta. La mezcla de reacción se concentró parasuministrar clorhidrato de éster etílico del ácido (1R, 2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico con rendimiento cuantitativo (7 g, 100 %). 1H RMN (metanol-d4) 5 1,32 (t, J = 7,1, 3H), 1,72 (dd, J = 10,2, 6,6 Hz, 1H), 1,81 (dd, J = 8,3, 6,6 Hz, 1H), 2,38 (c, J = 8,3 Hz, 1H), 4,26-4,34 (m, 2H), 5,24 (dd, 10,3, 1,3 Hz, 1H) 5,40 (d, J = 17,2, 1H), 5,69-5,81 (m, 1H).
B.1 Preparación de clorhidrato de éster etílico del ácido N-Boc-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico racémico
Procedimiento B
A una solución de terc-butóxido potásico (11,55 g, 102,9 mmol) en THF (450 ml) a -78 ºC se le añadió la N,Ndibencil imina disponible en el mercado de éster etílico de glicina (25,0 g, 93,53 mmol) en THF (112 ml). La mezclade reacción se calentó a 0 ºC, se agitó durante 40 min y después se enfrió de nuevo a -78 ºC. A esta solución se le añadió trans-1,4-dibromo-2-buteno (20,0 g, 93,50 mmol) y la mezcla se agitó durante 1 h a 0 ºC y se enfrió de nuevoa -78 ºC. Se añadió terc-butóxido potásico (11,55 g, 102,9 mmol) y la mezcla se calentó inmediatamente a 0 ºC y seagitó una hora más antes de concentrarse al vacío. El producto en bruto se recogió en Et2O (530 ml), se añadió unasolución ac. 1 N de HCl (106 ml, 106 mmol) y la mezcla bifásica resultante se agitó durante 3,5 h a ta. Las fases sesepararon y la fase acuosa se lavó con Et2O (2 x) y se basificó con una solución ac. saturada de NaHCO3. La amina deseada se extrajo con Et2O (3 x) y el extracto orgánico combinado se lavó con salmuera, se secó (MgSO4) y seconcentró al vacío para obtener la amina libre. Este material se trató con una solución 4 N de HCl en dioxano (100 ml, 400 mmol) y se concentró para producir clorhidrato de éster etílico del ácido (1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2vinilciclopropanocarboxílico en forma de un semisólido de color pardo (5,3 g, 34 % de rendimiento) idéntico almaterial obtenido en el procedimiento A, con la excepción de la presencia de una pequeña impureza aromática no identificada (al 8 %).
Procedimiento C
C.1 Separación de éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico
racemato: mezcla 1:1 de (1R, 2S) y (1S, 2R)
Separación A
A una solución acuosa de tampón fosfato sódico (0,1 M, 4,25 litros ("l"), pH 8) en un reactor con camisa calefactora
5 de 12 litros, mantenido a 39 ºC y agitado a 300 rpm se le añadieron 511 gramos de Alcalasa 2,4L (aproximadamente 425 ml) (Novozymes North America Inc.). Cuando la temperatura de la mezcla alcanzó 39 ºC, el pH se ajustó a 8,0mediante la adición de NaOH al 50 % en agua. Después, se añadió una solución del éster etílico del ácido N-Boc(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico racémico (85 g) en 850 ml de DMSO durante un periodo de40 min. Después, la temperatura de reacción se mantuvo a 40 ºC durante 24,5 h, tiempo durante el cual el pH de la
10 mezcla se ajustó a 8,0 en los puntos temporales 1,5 h y 19,5 h usando NaOH al 50 % en agua. Después de 24,5 h, se determinó que el exceso enantiomerico del éster era del 97,2 % y la reacción se enfrió a temperatura ambiente(26 ºC) y se agitó durante una noche (16 h), después de lo cual se determinó que el exceso enantiomérico del ésterera del 100 %. Después, el pH de la mezcla de reacción se ajustó a 8,5 con NaOH al y la mezcla resultante seextrajo con MTBE (2 x 2 l). Después, el extracto de MTBE combinado se lavó con NaHCO3 al 5 % (3 x 100 ml) y
15 agua (3 x 100 ml) y se evaporó al vacío para dar el éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico enantioméricamente puro en forma de un sólido de color amarillo claro (42,55 g; pureza: 97% @ 210 nm, que no contiene ácido; 100 % de exceso enantiomérico ("ee").
Después, la fase acuosa del proceso de extracción se acidificó a pH 2 con H2SO4 al 50 % y se extrajo con MTBE (2x 2 l). El extracto de MTBE se lavó con agua (3 x 100 ml) y se evaporó para dar el ácido en forma de un sólido de
20 color amarillo claro (42,74 g; pureza: 99 % @ 210 nm, que no contiene éster).
éster
Ácido
Espec. de Masas de AltaResolución
(+) ESI, Cl3H22NO4, [M+H]+ , cal. 256,1549, encontrado 256, 1542 (-) ESI, C11H16NO4, [M-H], cal. 226,1079, encontrado 226,1089
Cambio químico observado por RMN. Disolvente: CDCI3 (protón 5 7,24 ppm, C-13 5 77,0 ppm) Bruker DRX-500C: protón 500,032 MHZ, carbono 125,746 MHz.
Posición
Protón (patrón) ppm C-13 ppm Protón (patrón) ppm C-13 ppm
1
-- 40,9 -- 40,7
2
2,10 (c, J = 9,0 Hz) 34,1 2,17 (c, J = 9,0 Hz) 35,0
3a
1,76 (a) 23,2 1,79 (a) 23,4
3b
1,46 (a) 1,51, (a)
4
--- 170,8 -- 175,8
5
5,74 (ddd, J = 9,0, 10,0, 17,0 Hz) 133,7 5,75 (m) 133,4
6a
5,25 (d, J = 17,0 Hz) 117,6 5,28 (d, J = 17,0 Hz) 118,1
6b
5,08 (dd, J = 10,0,1,5 Hz) 5,12 (d, J = 10,5 Hz)
7
-- 155,8 -- 156,2
8
-- 80,0 -- 80,6
9
1,43 (s) 28,3 1,43 (s) 28,3
10
4,16 (m) 61,3 -- --
11
1,23 (t, J = 7,5 Hz) 14,2 -- --
Separación B
A 0,5 ml de tampón Heps·Na 100 mM (pH 8,5) en un pocillo de una placa de 24 pocillos (capacidad: 10 ml/pocillo) sele añadieron 0,1 ml de Savinase 16,0L (proteasa de Bacillus clausii) (Novozymes North America Inc.) y una solución del éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico racémico (10 mg) en 0,1 ml de DMSO. La placa se cerró herméticamente y se incubó a 250 rpm a 40 ºC. Después de 18 h, se determinó que elexceso enantiomérico del éster era del 44,3 % como se indica a continuación: se retiraron 0,1 ml de la mezcla de reacción y se mezclaron bien con 1 ml de etanol; después de la centrifugación, se analizaron 10 microlitros ("μl") delsobrenadante con la HPLC quiral. A la mezcla de reacción restante se le añadieron 0,1 ml de DMSO y la placa seincubó durante 3 días a 250 rpm a 40 ºC, después de lo cual se añadieron cuatro ml de etanol al pocillo. Después de la centrifugación, se analizaron 10 ml del sobrenadante con la HPLC quiral y se determinó que el exceso enantiomérico del éster era del 100 %.
Separación C
A 0,5 ml de tampón Heps·Na 100 mM (pH 8,5) en un pocillo de una placa de 24 pocillos (capacidad: 10 ml/pocillo) sele añadieron 0,1 ml de Esperase 8,0L, (proteasa de Bacillus halodurans) (Novozymes North America Inc.) y una solución del éster etílico del ácido N-Boc-(1R, 2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico racémico (10 mg) en 0,1 ml de DMSO. La placa se cerró herméticamente y se incubó a 250 rpm a 40 ºC. Después de 18 horas, sedeterminó que el exceso enantiomérico del éster era del 39,6 % como se indica a continuación: se retiraron 0,1 mlde la mezcla de reacción y se mezclaron bien con 1 ml de etanol; después de la centrifugación, se analizaron 10 mldel sobrenadante con la HPLC quiral. A la mezcla de reacción restante se le añadieron 0,1 ml de DMSO y la placa se incubó durante 3 días más a 250 rpm a 40 ºC, después de lo cual se añadieron cuatro ml de etanol al pocillo.Después de la centrifugación, se analizaron 10 µl del sobrenadante con la HPLC quiral y se determinó que el excesoenantiomérico del éster era del 100 %.
El análisis de las muestras se realizó de la siguiente manera:
1) Preparación de muestra: Se mezclaron bien aproximadamente 0,5 ml de la mezcla de reacción con 10 volúmenes de EtOH. Después de la centrifugación, se inyectaron 10 ml del sobrenadante sobre la columna deHPLC.
2) Determinación de la conversión:
Columna: YMC ODS A, 4,6 x 50 mm, S-5 µm
Disolvente: A, HCl 1 mM en agua; B, MeCN
Gradiente: 30 % de B durante 1 min; de 30 % a 45 % de B durante 0,5 min; 45 % de B durante 1,5 min; de 45 % a 30 % de B durante 0,5 min.
Caudal: 2 ml/min
Detección UV: 210 nm
Tiempo de retención: ácido, 1,2 min; éster, 2,8 min.
3) Determinación del exceso enantiomérico para el éster:
Columna: CHIRACEL OD-RH, 4,6 x 150 mm, S-5 µm 67
Fase móvil: MeCN/HClO4 50 mM en agua (67/33)
Caudal: 0,75 ml/min.
Detección UV: 210 nm.
Tiempo de retención:
ácido (1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico 5,2 min; Racemato éster etílico del ácido (1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico 18,5 min y 20,0 min; éster etílico del ácido (1R,2S)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico 18,5 min.
Separación D
Se mantuvieron 5 l de tampón fosfato sódico 0,3 M (pH 8) a 38 ºC en un reactor con camisa calefactora de 20 litros,agitado a 130 rpm. Al reactor se le añadieron cuatro litros de Alcalasa 2,4L (Novozymes North America Inc.) y 1 litro de agua DI. Cuando la temperatura de la mezcla alcanzó 38 ºC, el pH se ajustó a 7,8 con NaOH 10 N. Al reactor sele añadió una solución del éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílicoracémico (500 gramos) en 5 litros de DMSO durante un periodo de 1 hora mediante un embudo de adición. Después la temperatura de reacción se ajustó a 48 ºC. Después de 21 horas, el exceso enantiomérico del éster alcanzo el99,3 %. El calentamiento se interrumpió a las 24 horas y la reacción se enfrió lentamente a temperatura ambiente (aproximadamente 25 ºC) y se agitó durante una noche. El pH de la mezcla de reacción se ajustó a 8,5 con NaOH10 N y la mezcla se extrajo con MTBE (2 x 4 l). El extracto de MTBE se lavó con NaHCO3 al 5 % (3 x 400 ml) y agua (3 x 400 ml) y se evaporó para dar éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílicoenantioméricamente puro en forma de un cristal de color amarillo claro (259 g; pureza: 96,9 % @ 210 nm, que nocontiene ácido; 100 % de ee).
Separación E
Se mantuvieron 10 l de tampón fosfato sódico 0,1 M (pH 8) a 40 ºC en un reactor con camisa calefactora de 20 litrosy se agitó a 360 rpm. Al reactor se le añadieron 1,5 litros de Alcalasa 2,4L (Novozymes North America Inc.). Cuando la temperatura de la mezcla alcanzó 38 ºC, el pH se ajustó a 8,0 con NaOH 10 N. Al reactor se le añadió unasolución del éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico racémico (200 gramos) en 2 litros de DMSO durante un periodo de 1 hora mediante un embudo de adición. Después, latemperatura de reacción se ajustó a 40 ºC. Después de 3 horas, el pH se ajustó a 8,0 con NaOH 10 N. Después de21 horas, la reacción se enfrió a 25 ºC. El pH de la mezcla de reacción se ajustó a 8,5 con NaOH 10 N y la mezcla se extrajo con MTBE (2 x 5 l). El extracto de MTBE combinado se lavó con NaHCO3 al 5 % (3 x 500 ml) y agua (3 x200 ml) y se evaporó para dar 110 gramos de un aceite de color amarillo. El aceite se ajustó a temperatura ambiente al vacío y dio éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico enantioméricamente puroen forma de un cristal de varilla larga incoloro (101 g; pureza: 97,9 % @ 210 nm, que no contiene ácido; 100 % deee).
La estructura cristalina de éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílicoenantioméricamente puro se ha caracterizado por análisis de cristal único (rayos X NB#: 52795-093, código de ref.: 634592N1). La configuración absoluta no se ha establecido por la carencia de un centro quiral conocido o de átomosmás pesados. Se forma una estructura de cadena junto al eje a cristalográfico por unión de hidrógeno intermolecularentre el grupo amida y el átomo de oxígeno del carbonilo (N...O 3,159 A).
Estructura de éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico:
Datos del Cristal: Fórmula química: C13H21N1O4 Sistema cristalino: Ortorrómbico
Experimental: Cristalización Fuente de cristal: MTBE
68
Grupo Espaciador: P212121 Descripción de cristal: varilla incolora
a = 5,2902(1) Å α = 90º Tamaño de cristal (mm): 0,12 x 0,26 x 0,30
b = 13,8946(2) Å β = 90º Colección de datos
c = 19.9768(3) Å γ = 90º
V = 1468,40(4) Å Temperatura (K): 293
Z = 4 dx = 1,155 g cm-3 θmáx (º): 65,2 (Cu Kα)
Nº de reflexiones para parámetros de laNº de reflexiones medidas: 7518
estructura cristalina: 6817 Nº de reflexiones independientes: 2390 (Rint = 0,0776)
θmáx tanto para parámetros de estructura Nº de reflexiones observadas (I � 2σ): 2284
cristalina (º): 2,2-65,2
Coeficiente de absorción (mm-1): 0,700 Corrección de absorción (Tmín-Tmáx): 0,688-1,000
Separación F
Se mantuvieron 5 l de tampón borato sódico 0,2 M (pH 9) a 45 ºC en un reactor con camisa calefactora de 20 litros yse agitó a 400 rpm. Al reactor se le añadieron tres litros de agua DI y cuatro litros de Savinase 16L, tipo EX (Novozymes North America Inc.). Cuando la temperatura de la mezcla alcanzó 45 ºC, el pH se ajustó a 8,5 con NaOH10 N. Al reactor se le añadió una solución del éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2vinilciclopropanocarboxílico racémico (200 gramos) en 2 litros de DMSO durante un periodo de 40 min, mediante unembudo de adición. Después, la temperatura de reacción se ajustó a 48 ºC. Después de 2 horas, el pH se ajustó apH 9,0 con NaOH 10 N. A las 18 horas, el exceso enantiomérico del éster alcanzó el 72 % y el pH se ajustó a 9,0con NaOH 10 N. A las 24 horas, la temperatura se disminuyó hasta 35 ºC. A las 42 horas, la temperatura se aumentó hasta 48 ºC y el pH se ajustó a 9,0 con NaOH 10 N. El calentamiento se interrumpió a las 48 horas y lareacción se enfrió lentamente a temperatura ambiente (aproximadamente 25 ºC) y se agitó durante una noche. A las66 horas, el pH de la mezcla de reacción era de 8,6. La mezcla se extrajo con MTBE (2 x 4 l). El extracto de MTBE combinado se lavó con NaHCO3 al 5 % (6 x 300 ml) y agua (3 x 300 ml) y se evaporó para dar éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico enantioméricamente puro en forma de un cristal de color amarillo claro (101A g; pureza: 95,9 % @ 210 nm, que no contiene ácido; 98,6 % de ee).
C.2 Preparación de clorhidrato de éster etílico del ácido (1R,2S)-1-amino-2-vinilclopropanocarboxílico quiral
Se agitó éster etílico del ácido N-BOC-(1R,2S)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico (8,5 g, 33,3 mmol) en una atmósfera de N2 con 200 ml de HCl 4 N/dioxano (Aldrich) a ta durante 3 h. El disolvente se retiró a presión reducida manteniendo la temperatura por debajo de 40 C. Esto dio 6,57 g (~100 %) de clorhidrato de éster etílico del ácido(1R,2S)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico en forma de un sólido de color castaño claro. 1H RMN (300 MHz, CD3OD) 5 1,31 (t, J = 7,0 Hz, 3 H), 1,69-1,82 (m, 2 H), 2,38 (c, J = 8,8 Hz, 1 H), 4,29 (c, J = 7,0 Hz, 2 H), 5,22 (d, J = 10,3 Hz, 1 H), 5,40 (d, J = 17,2 Hz, 1 H), 5,69-5,81 (m, 1 H). CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 0,58 min), EM m/z 156 (M++1).
Ejemplo 2. Preparación del Compuesto 1, ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15dioxo-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico
Etapa 2A. Preparación de éster terc-butílico del ácido 2-(1-etoxicarbonil-2-vinil-ciclopropilcarbamoil)-4(isoquinolin-1-iloxi)-pirrolidina-1-carboxílico
5 Una suspensión agitada de 1-terc-butil éster del ácido 4-(isoquinolin-1-iloxi)-pirrolidina-1,2-dicarboxílico (5,69 g, 15,9 mmol) en 200 ml de cloruro de metileno se trató secuencialmente con diisopropiletilamina (13,8 ml, 79,0 mmol),HBTU (7,10 g, 18,7 mmol), HOBT·H2O (2,86 g, 18,7 mmol) y clorhidrato de éster etílico del ácido 1R,2S-1-amino-2vinilciclopropanocarboxílico (3,19 g, 16,7 mmol). La solución homogénea de color dorado se agitó a ta en unaatmósfera de N2 durante 18 h y después se concentró al vacío para dar 10 g de un aceite pardo. Éste se repartió
10 entre acetato de etilo y NaHCO3 ac. sat. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó (MgSO4) y se concentró al vacío. La cromatografía ultrarrápida (MeOH al 2-5 % en cloruro de metileno) dio 5,5 g (70 %) de éster terc-butílicodel ácido 2-(1-etoxicarbonil-2-vinil-ciclopropilcarbamoil)-4-(isoquinolin-1-iloxi)-pirrolidina-1-carboxílico: CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 3,42 min), EM m/z 496 (M++1).
Etapa 2B. Preparación de éster etílico del ácido 1-{[4-(isoquinolin-1-iloxi)-pirrolidina-2-carbonil]-amino}-215 vinil-ciclopropanocarboxílico, bis clorhidrato
Una suspensión agitada de éster terc-butílico del ácido 2-(1-etoxicarbonil-2-vinil-ciclopropilcarbamoil)-4-(isoquinolin1-iloxi)-pirrolidina-1-carboxílico (5,40 g, 10,9 mmol) se trató con HCl 2 N/éter (Aldrich) (250 ml) durante 24 h. La mezcla de reacción se concentró al vacío para dar 5,3 g (~100 %) de éster etílico del ácido 1-{[4-(isoquinolin-1-iloxi)20 pirrolidina-2-carbonil]-amino}-2-vinil-ciclopropanocarboxílico, bis clorhidrato en forma de un sólido de color blanco:
CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 2,40 min), EM m/z 396 (M++1).
Etapa 2C. Preparación de éster etílico del ácido 1-{[-(2-terc-butoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4-(isoquinolin1-iloxi)-pirrolidina-2-carbonil]-amino}-2-vinilciclopropanocarboxílico
Se trató secuencialmente ácido 2(S)-terc-butoxicarbonilamino-8-nonenoico (adquirido en RSP Amino Acids) (1,0 g, 3,68 mmol) disuelto en 100 ml de DMF secuencialmente con éster etílico del ácido 1-{[4-(isoquinolin-1-iloxi)pirrolidina-2-carbonil]-amino}-2-vinilciclopropanocarboxílico, bis clorhidrato (1,46 g, 3,68 mmol), N-metil morfolina (1,4 ml, 12,9 mmol) y HATU (PE biosystems) (1,68 g, 4,42 mmol). La mezcla de reacción se agitó a ta en una atmósferade N2 durante 24 h y después se concentró al vacío. El residuo se repartió entre acetato de etilo y tampón a pH 4(biftalato). La fase orgánica se lavó con NaHCO3 ac. sat., se secó (MgSO4) y se concentró al vacío para dar 2,2 g del producto en bruto. La cromatografía ultrarrápida (acetato de etilo al 20-50 %/hexano) dio 1,9 g (79 %) de éster etílicodel ácido 1-{[1-(2-terc-butoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4-(isoquinolin-1-iloxi)-pirrolidina-2-carbonil]-amino}-2-vinilciclopropanocarboxílico en forma de un sólido incoloro vidrioso: CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 3,72min), EM m/z 649 (M++1).
Etapa 2D. Preparación de éster etílico del ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(isoquinolin-l-iloxi)-2,15dioxo-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico
Una solución de éster etílico del ácido (1-{[1-(2-terc-butoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4-(isoquinolin-1-iloxi)pirrolidina-2-carbonil]-amino}-2-vinilciclopropanocarboxílico 1,72 g, 2,65 mmol) y dicloruro de triciclohexilfosfina[1,3bis(2,4,6-trimetilfenil)-4,5-dihidroimidazol-2-ilideno][bencilideno]rutenio (IV) (Strem) (225 mg, 0,265 mmol) en 650 ml de cloruro de metileno se calentó a reflujo en una atmósfera de N2. La solución homogénea de color naranja claro secalentó a reflujo durante 24 h para dar una solución de color naranja oscuro. La mezcla de reacción se enfrió a ta yse concentró al vacío para dar 1,7 g de un aceite de color naranja. La cromatografía ultrarrápida (acetato de etilo al20-40 %/hexano) dio 1,4 g (85 %) de éster etílico del ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15dioxo-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]-nonadec-7-eno-4-carboxílico en forma de un sólido de color blanco: 1H RMN (300 MHz, CD3Cl3) 5 1,29 (t, J = 7,3 Hz, 3 H), 1,34 (s, 9 H), 1,35-1,71 (m, 9 H), 1,86-1,97 (m, 2 H), 2,08-2,27 (m, 2H), 2,38-2,47 (m, 1 H), 2,96-3,04 (m, 1 H), 4,02-4,23 (m, 4 H), 4,55 (m, 1 H), 4,91 (dd, J = 8,4 Hz, 4,0 Hz, 1 H), 5,25 (t, J = 9,5 Hz, 1 H), 5,32 (d, J = 8,8 Hz, 1 H), 5,50 (m, 1 H), 5,81 (m, 1 H), 6,96 (s, 1 H), 7,23 (m, 1 H), 7,51 (t, J = 7,3 Hz, 1 H), 7,65 (t, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,73 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,93 (d, J = 5,9 Hz, 1 H), 8,17 (d, J = 8,4 Hz, 1 H). CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 3,52 min), EM m/z 621 (M++1).
Etapa 2E. Preparación del Compuesto 1, ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15dioxo-3,16-diaza-triciclo[4,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico
Se disolvió éster etílico del ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]-nonadec-7-eno-4-carboxílico (1,10 g, 1,77 mmol) en el sistema disolvente mixto; THF (18 ml),metanol (8 ml) y agua (2 ml). Se añadió hidróxido de litio hidrato en polvo (744 mg, 17,7 mmol). La suspensión decolor amarillo claro se agitó a ta en una atmósfera de N2 durante 24 h y después se concentró al vacío. El residuo se repartió entre éter y agua. La fase de éter se desechó y la fase acuosa se trató con HCl 4 N hasta que el pH fue de
4. Esta solución ácida se extrajo cuatro veces con éter. Los extractos de éter combinados se secaron (MgSO4) y seconcentraron al vacío para dar 0,95 g (90 %) de ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]-nonadec-7-eno-4-carboxílico en forma de un sólido de color blanco: 1H RMN (300 MHz, CD3Cl3) 5 1,30 (s, 9 H), 1,34-1,46 (m, 4 H), 1,52-1,68 (m, 2 H), 1,84 (m, 2 H), 2,08-2,58 (m, 6 H), 2,78-2,87 (m, 1 H), 4,07 (m, 1 H), 4,32 (d, J = 11,3 Hz, 1 H), 4,41 (m, 1 H), 4,79 (t, J = 7,3 Hz, 1 H), 5,14 (t, J = 9,5 Hz, 1 H), 5,23 (d, J = 7,3 Hz, 1 H), 5,60 (c, J = 8,8 Hz, 1 H), 5,86 (s, 1 H), 7,08 (s, 1 H), 7,22 (d, J = 6,2 Hz, 1 H), 7,48 (t, J = 7,7 Hz, 1 H), 7,64 (t, J = 8,0 Hz, 1 H), 7,72 (d, J = 8,1 Hz, 1 H), 7,94 (d, J = 5,9 Hz, 1 H), 8,17 (s, J = 8,4 Hz, 1 H). CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 3,32 min), EM m/z 593 (M++1)
Ejemplo 3a. Preparación de Ciclopropilsulfonamida
Procedimiento A:
Una solución de 100 ml de THF enfriada a 0 ºC se burbujeó en amoniaco gaseoso hasta que se alcanzó lasaturación. A esta solución se le añadió una solución de 5 g (28,45 mmol) de cloruro de ciclopropilsulfonilo(adquirido en Array Biopharma) en 50 ml de THF y la solución se calentó a ta durante una noche y se agitó durante un día más. La mezcla se concentró hasta que quedaron 1-2 ml de disolvente y se aplicó a un lecho de 30 g de SiO2 (eluyendo con EtOAc del 30 % al 60 %/Hexanos) para producir 3,45 g (100 %) de ciclopropil sulfonamida en formade un sólido de color blanco. 1H RMN (Metanol-d4) 5 0,94-1,07 (m, 4H), 2,52-2,60 (m, 1H); 13C RMN (metanol-d4) 5 5,92, 33,01.
Procedimiento B:
Etapa 1: Preparación de N-terc-Butil-(3-cloro)propilsulfonamida
Se disolvió terc-butilamina (3,0 mol, 315,3 ml) se disolvió en THY (2,5 l). La solución se enfrió a -20 ºC. Se añadiólentamente cloruro de 3-cloropropanosulfonilo (1,5 mol, 182,4 ml). La mezcla de reacción se dejó calentar a ta y seagitó durante 24 h. La mezcla se filtró y el filtrado se concentró al vacío. El residuo se disolvió en CH2Cl2 (2,0 l). La solución resultante se lavó con HCl 1 N (1,0 l), agua (1,0 l) y salmuera (1,0 l) y se secó sobre Na2SO4. Se filtró y seconcentró al vacío para dar un sólido de color ligeramente amarillo, que se cristalizó en hexano para producir elproducto en forma de un sólido de color blanco (316,0 g, 99 %). 1H RMN (CDCl3) 5 1,38 (s, 9H), 2,30-2,27 (m, 2H), 3,22 (t, J = 7,35 Hz, 2H), 3,68 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 4,35 (a, 1H).
Etapa 2: preparación de terc-butilamida del ácido ciclopropanosulfónico
A una solución de N-terc-butil-(3-cloro)propilsulfonamida (2,14 g, 10,0 mmol) en THF (100 ml) se le añadió n-BuLi(2,5 M en hexano, 8,0 ml, 20,0 mmol) a -78 ºC. La mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambientedurante un periodo de 1 h. Los volátiles se retiraron al vacío. El residuo se repartió entre EtOAc y agua (200 ml, 200 ml). La fase orgánica separada se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró al vacío. Elresiduo se recristalizó en hexano para producir el producto deseado en forma de un sólido de color blanco (1,0 g, 56%). 1H RMN (CDCl3) 5 0,98-1,00 (m, 2H), 1,18-1,19 (m, 2H), 1,39 (s, 9H), 2,48-2,51 (m, 1H), 4,19 (a, 1H).
Etapa 3: preparación de ciclopropilsulfonamida
Una solución de terc-butilamida del ácido ciclopropanosulfónico (110,0 g, 0,62 mol) en TFA (500 ml) se agitó atemperatura ambiente durante 16 h. El volátil se retiró al vacío. El residuo se recristalizó en EtOAc/hexano (60ml/240 ml) para producir el producto deseado en forma de un sólido de color blanco (68,5 g, 91 %). 1H RMN (DMSOd6) 5 0,84-0,88 (m, 2H), 0,95-0,98 (m, 2H), 2,41-2,58 (m, 1H), 6,56 (a, 2H).
15 Ejemplo 3b. Preparación de ciclopropilsulfonamidas C1-sustituidas
Preparación de N-terc-butil-(1-metil)ciclopropil-sulfonamida.
Etapa 1a Preparación de N-terc-butil-(3-cloro)propilsulfonamida.
20 Como se ha mostrado anteriormente.
Etapa 1b. Preparación de N-terc-Butil-(1-metil)ciclopropil-sulfonamida.
Una solución de N-terc-butil-(3-cloro)propilsulfonamida (4,3 g, 20 mmol) se disolvió en THF seco (100 ml) y se enfrióa -78 ºC. A esta solución se le añadió lentamente n-BuLi (17,6 ml, 44 mmol, 2,5 M en hexano). El baño de hielo seco25 se retiró y la mezcla de reacción se dejó calentar a ta durante un periodo de 1,5 h. Después, esta mezcla se enfrió a -78 ºC y se añadió una solución de n-BuLi (20 mmol, 8 ml, 2,5 M en hexano). La mezcla de reacción se calentó a ta,se enfrió de nuevo a -78 ºC durante un periodo de 2 h y se añadió una solución pura de yoduro de metilo (5,68 g, 40mmol). La mezcla de reacción se dejó calentar a ta durante una noche, se inactivó con NH4Cl saturado (100 ml) a ta.Se extrajo con EtOAc (100 ml). La fase orgánica se lavó con salmuera (100 ml), se secó (MgSO4) y se concentró al
vacío para dar un aceite de color amarillo que se cristalizó en hexano para producir el producto en forma de unsólido de color ligeramente amarillo (3,1 g, 81 %): 1H RMN (CDCl3) 5 0,79 (m, 2H), 1,36 (s, 9H), 1,52 (m, 2H), 1,62 (s, 3H), 4,10 (s a, 1H).
Etapa 1c: Preparación de 1-metilclpropilsulfonamida
5 Una solución de N-terc-butil-(1-metil)ciclopropilsulfonamida (1,91 g, 10 mmol) se disolvió en TFA (30 ml) y la mezclade reacción se agitó a ta durante 16 h. El disolvente se retiró al vacío para dar un aceite de color amarillo que secristalizó en EtOAc/hexano (1:4, 40 ml) para producir el Ejemplo 3, 1-metilciclopropilsulfonamida, en forma de unsólido de color blanco (1,25 g,96 %): 1H RMN (CDCl3) 5 0,84 (m, 2H), 1,41 (m, 2H), 1,58 (s, 3H), 4,65 (s a, 2H). Anál.
10 calc. para C4H9NO2S: C, 35,54; H, 6,71; N, 10,36, Encontrado: C, 35,67; H, 6,80; N, 10,40.
Preparación de 1-Bencilciclopropilsulfonamida
Etapas 1b: Preparación de N-terc-Butil-(1-bencil)ciclopropil-sulfonamida.
15 Este compuesto se obtuvo con un rendimiento del 60 % usando el procedimiento descrito para la síntesis de N-tercbutil-(1-metil)ciclopropilsulfonamida con la excepción de que se usaron 1,05 equivalentes de bromuro de bencilo,seguido de trituración con EtOAc al 10 % en hexano: 1H RMN (CDCl3) 550,92 (m, 2H),1,36 (m, 2H), 1,43 (s, 9H), 3,25 (s, 2H),4,62 (s a, 1H), 7,29-7,36 (m, 5H).
Etapas 1c: Preparación de 1-Bencilciclo-propilsulfonamida
Este compuesto 1-bencilciclopropilsulfonamida se obtuvo con un rendimiento del 66 % a partir de N-terc-butil(1bencil)ciclo-propilsulfonamida usando el procedimiento descrito para la síntesis de 1-metilciclopropilsulfonamida,seguido de recristalización en la cantidad mínima de EtOAc al 10 % en hexano: 1H RMN (CDCl3) 5 0,90 (m, 2H), 1,42 (m, 2 H), 3,25 (s, 2 H), 4,05 (s, 2 H), 7,29 (m, 3 H), 7,34 (m, 2 H); 13C RMN (CDCl3) 5 11,1, 36,8, 41,9, 127,4,
25 128,8, 129,9, 136,5.
Preparación de 1-Propilciclopropilsulfonamida
Etapas 1b: Preparación de N-terc-Butil-(1-bencil)ciclopropil-sulfonamida.
Este compuesto se preparó usando el procedimiento descrito para la preparación de 1-metilciclopropilsulfonamidacon la excepción de que se usó haluro de propilo en lugar de yoduro de metilo en la segunda etapa de esteprocedimiento.
Preparación de N-terc-Butil-(1-alil)ciclopropilsulfonamida.
Este compuesto, N-terc-Butil-(1-alil)ciclopropilsulfonamida, se obtuvo con un rendimiento del 97 % de acuerdo con elprocedimiento descrito en la síntesis de N-terc-Butil-(1-metil)ciclopropilsulfonamida con la excepción de que seusaron 1,25 equivalentes de bromuro de alilo como electrófilo. El compuesto se recogió directamente en la siguiente
10 reacción sin purificación: 1H RMN (CDCl3) 5 0,83 (m, 2H), 1,34 (s, 9H), 1,37 (m, 2H), 2,64 (d, J = 7,3 Hz, 2H), 4,25 (s a, 1H), 5,07-5,10 (m, 2H), 6,70-6,85 (m, 1H).
Preparación de 1-alilciclopropilsulfonamida.
Este compuesto, 1-alilciclopropilsulfonamida, se obtuvo con un rendimiento del 40 % a partir de N-terc-butil-(1
15 alil)ciclopropilsulfonamida de acuerdo con el procedimiento descrito en la síntesis de 1-Metilciclopropilsulfonamida. El compuesto se purificó por cromatografía en columna sobre SiO2 usando MeOH al 2 % en CH2Cl2 como eluyente: 1H RMN (CDCl3) 5 0,88 (m, 2 H), 1,37 (m, 2 H), 2,66 (d, J = 7,0 Hz, 2 H), 4,80 (s, 2 H), 5,16 (m, 2 H), 5,82 (m, 1 H); 13C RMN (CDCl3) 5 11,2, 35,6, 40,7, 119,0, 133,6.
Preparación de N-terc-Butil-[1-(1-hidroxi)ciclohexil]-ciclopropilsulfonamida.
Este compuesto se obtuvo con un rendimiento del 84 % usando el procedimiento descrito para la síntesis de N-tercButil-(1-metil)ciclopropilsulfonamida con la excepción de que se usaron 1,30 equivalentes de ciclohexanona, seguidode recristalización en la cantidad mínima de EtOAc al 20 % en hexano: 1H RMN (CDCl3) 5 1,05 (m, 4H), 1,26 (m, 2H), 1,37 (s, 9H), 1,57-1,59 (m, 6H), 1,97 (m, 2H), 2,87 (s a, 1H), 4,55 (s a, 1H).
25 Preparación de 1-(1-ciclohexenil)ciclopropil-sulfonamida.
Este compuesto, 1-(1-ciclohexenil)-ciclopropilsulfonamida, se obtuvo con un rendimiento del 85 % a partir de N-tercbutil-[1-(1-hidroxi)ciclohexil]-ciclopropilsulfonamida usando el procedimiento descrito para la síntesis de 1metilciclopropilsulfonamida, seguido de recristalización en la cantidad mínima de EtOAc y hexano: 1H RMN (DMSO
30 d6) 5 0,82 (m, 2 H), 1,28 (m, 2 H), 1,51 (m, 2 H), 1,55 (m, 2 H), 2,01 (s, 2 H), 2,16 (s, 2 H), 5,89 (s, 1 H), 6,46 (s, 2 H); 13C RMN (DMSO-d6) 5 11,6, 21,5, 22,3, 25,0, 27,2, 46,9, 131,6, 132,2; EM-BR (ESI): 200 (M+-1).
Preparación de N-terc-Butil-(1-benzoil)ciclopropil-sulfonamida.
Este compuesto se obtuvo con un rendimiento del 66 % usando el procedimiento descrito para la síntesis de N-tercButil-(1-metil) ciclopropilsulfonamida con la excepción de que se usaron 1,2 equivalentes de benzoato de metilocomo electrófilo. El compuesto se purificó por cromatografía en columna sobre SiO2 usando CH2Cl2 del 30 % al 100 % en hexano: 1H RMN (CDCl3) 5 1,31 (s, 9H), 1,52 (m, 2H), 1,81 (m, 2H), 4,16 (s a, 1H), 7,46 (m, 2H), 7,57 (m, 1H), 8,05 (d, J = 8,5 Hz, 2H).
Preparación de 1-benzoilciclo-propilsulfonamida.
Este compuesto, 1-benzoilciclopropil-sulfonamida, se obtuvo con un rendimiento del 87 % a partir de N-terc-butil(1benzoil)ciclopropilsulfonamida usando el procedimiento descrito para la síntesis de 1-Metilciclopropilsulfonamida,seguido de recristalización en la cantidad mínima de EtOAc en hexano: 1H RMN (DMSO-d6) 5 1,39 (m, 2 H), 1,61 (m, 2 H), 7,22 (s, 2 H), 7,53 (t, J = 7,6 Hz, 2 H), 7,65 (t, J = 7,6 Hz, 1 H), 8,06 (d, J = 8,2 Hz, 2 H); 13C RMN (DMSO-d6) 5 12,3, 48,4, 128,1, 130,0, 133,4, 135,3, 192,0.
Preparación de N-terc-Butil-(1-fenilaminocarboxi)-ciclopropilsulfonamida
Este compuesto se obtuvo con un rendimiento del 42 % usando el procedimiento descrito para la síntesis de N-tercButil-(1-metil)ciclopropilsulfonamida usando 1 equivalente de isocianato de fenilo, seguido de recristalización en lacantidad mínima de EtOAc en hexano 1H RMN (CDCl3) 5 1,38 (s, 9H), 1,67-1,71 (m, 4H), 4,30 (s a, 1H), 7,10 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 7,34 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 7,53 (t, J = 7,5 Hz, 2H).
Ejemplo 4. Preparación de cicloalquilsulfonamidas a partir de bromuros de cicloalquilo
Preparación de ciclobutilsulfonamida a partir de bromuro de ciclobutilo
A una solución de 5,0 g (37,0 mmol) de bromuro de ciclobutilo en 30 ml de éter dietílico anhidro (Et2O) enfriada a -78 ºC se le añadieron 44 ml (74,8 mmol) de terc-butil litio 1,7 M en pentanos y la solución se calentó lentamente a -35 ºC durante 1,5 h. Esta mezcla se canuló lentamente en una solución de 5,0 g (37,0 mmol) de cloruro de sulfurilorecién destilado en 100 ml de hexanos, se enfrió a -40 ºC, se calentó a 0 ºC durante 1 h y se concentrócuidadosamente al vacío. Esta mezcla se disolvió de nuevo en Et2O, se lavó una vez con una pequeña cantidad de agua enfriada con hielo, se secó (MgSO4) y se concentró cuidadosamente. Esta mezcla se disolvió de nuevo en 20ml de THF, se añadió gota a gota a 500 ml de NH3 saturado en THF y se dejó en agitación durante una noche. La mezcla se concentró al vacío para dar un sólido de color amarillo en bruto y se recristalizó en la cantidad mínima deCH2Cl2 en hexanos con 1-2 gotas de MeOH para producir 1,90 g (38 %) de ciclobutilsulfonamida en forma de unsólido de color blanco. 1H RMN (CDCl3) 5 1,95-2,06 (m, 2H), 2,30-2,54 (m, 4H), 3,86 (p, J = 8 Hz, 1H), 4,75 (s a, 2H); 13C RMN (CDCl3) 5 16,43, 23,93, 56,29, EMAR m/z (M-H)- calc. para C4H8NSO2: 134,0276, encontrado 134,0282.
Preparación de ciclopentil sulfonamida
Una solución de 18,5 ml (37,0 mmol) de cloruro de ciclopentil-magnesio 2 M en éter se añadió gota a gota a unasolución de 3,0 ml (37,0 mmol) de cloruro de sulfurilo recién destilado (obtenido en Aldrich) en 100 ml de hexanos yse enfrió a -78 ºC. La mezcla se calentó a 0 ºC durante 1 h y después se concentró cuidadosamente al vacío. Esta mezcla se disolvió de nuevo en Et2O (200 ml), se lavó una vez con un poco de agua enfriada con hielo (200 ml), se secó (MgSO4) y se concentró cuidadosamente. Esta mezcla se disolvió de nuevo en 35 ml de THF, se añadió gota agota a 500 ml de NH3 saturado en THF y se dejó en agitación durante una noche. La mezcla se concentró al vacíopara dar un sólido amarillo en bruto, el residuo se filtró a través de 50 g de gel de sílice usando EtOAc al 70 %hexanos como eluyente y después la solución se concentró. El residuo se recristalizó en la cantidad mínima de CH2Cl2 en hexanos con 1-2 gotas de MeOH para producir 2,49 g (41 %) de ciclopentilsulfonamida en forma de unsólido de color blanco. 1H RMN (CDCl3) 5 1,58-1,72 (m, 2H), 1,74-1,88 (m, 2H), 1,94-2,14 (m, 4H), 3,48-3,59 (m, 1H), 4,80 (s a, 2H); 13C RMN (CDCl3) 5 25,90, 28,33, 63,54; EM m/e 148 (M-H)-.
Preparación de ciclohexil sulfonamida
Una solución de 18,5 ml (37,0 mmol) de cloruro de ciclohexilmagnesio 2 M (TCI Americas) en éter se añadió gota agota a una solución de 3,0 ml (37,0 mmol) de cloruro de sulfurilo recién destilado en 100 ml de hexanos enfriados a 78 ºC. La mezcla se calentó a 0 ºC durante 1 h y después se concentró cuidadosamente al vacío. Esta mezcla sedisolvió de nuevo en Et2O (200 ml), se lavó una vez con un poco de agua enfriada con hielo (200 ml), se secó (MgSO4) y se concentró cuidadosamente. Esta mezcla se disolvió de nuevo en 35 ml de THF, se añadió gota a gota a 500 ml de NH3 saturado en THF y se dejó en agitación durante una noche. La mezcla se concentró al vacío paradar un sólido de color amarillo en bruto, el residuo se filtró a través de 50 g de gel de sílice usando EtOAc al 70 %hexanos como eluyente y se concentró. El residuo se recristalizó en la cantidad mínima de CH2Cl2 en hexanos con 1-2 gotas de MeOH para producir 1,66 g (30 %) de ciclohexil-sulfonamida en forma de un sólido de color blanco: 1H RMN (CDCl3) 5 1,11-1,37 (m, 3H), 1,43-1,56 (m, 2H), 1,67-1,76 (m, 1H), 1,86-1,96 (m, 2H), 2,18-2,28 (m, 2H), 2,91 (tt, J = 12, 3,5 Hz, 1H), 4,70 (s a, 2H); 13CH RMN (CDCl3) 5 25,04, 25,04, 26,56, 62,74; EM m/e 162 (M-1)-.
Ejemplo 5. Preparación del Compuesto 2, éster terc-butílico del ácido [18-(isoquinolin-1-iloxi)-4metanosulfonilaminocarbonil-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico
Se preparó a partir de ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]-nonadec-7-eno-4-carboxílico (50 mg, 0,075 mmol) y metanosulfonamida (9,3 mg, 0,098 mmol)como se ha descrito en el procedimiento general anterior para dar éster terc-butílico del ácido [18-(isoquinolin-1iloxi)-4-metanosulfonilaminocarbonil-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico en forma de un polvo de color blanco: 1H RMN (300 MHz, CD3Cl3) 5 1,18 (s, 9 H), 1,25-1,96 (m, 11 H), 2,26 (m, 1 H),2,54 (m, 1 H), 2,71 (m, 2 H), 3,18 (s, 3 H), 4,08 (m, 1 H), 4,26 (m, 1 H), 4,64 (m, 2 H), 5,00 (m, 2 H), 5,73 (m, 1 H), 6,01 (s, 1 H), 6,73 (s, 1 H), 7,28 (d, J = 5,5 Hz, 1 H), 7,50 (t, J = 7,3 Hz, 1 H), 7,65-7,76 (m, 2 H), 7,98 (d, J = 5,9 Hz, 1 H), 8,19 (d, J = 7,7 Hz, 1 H), 10,28 (s, 1 H). CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 3,57 min), EM m/z 670 (M++1).
Ejemplo 6. Preparación del Compuesto 3, éster terc-butílico del ácido [18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-4(propano-2-sulfonilaminocarbonil)-3,16-diaza-triciclo-[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico
Se disolvió ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico (67 mg, 0,10 mmol) en 5 ml de THF y se trató con CDI (21 mg, 0,13 mmol). (Debe tenerse cuidado para evitar la humedad usando cristalería secada con una estufa y manteniendo una atmósfera deN2 seca.) Después de calentar a reflujo la mezcla de reacción durante una hora, se enfrió a ta y se trató secuencialmente con isopropilsulfonamida (16 mg, 0,13 mmol) y DBU (20 mg, 0,13 mmol). Después de agitardurante 24 h a ta, el THF se retiró por evaporación rotatoria. El residuo se repartió entre acetato de etilo y tampón apH 4. La fase orgánica se secó (MgSO4) y se concentró al vacío para dar el producto en bruto. La cromatografía ultrarrápida (MeOH al 1-5 %/cloruro de metileno) dio 50 mg (71 %) del producto deseado. La purificación adicionalpor HPLC preparativa (YMC ODS-A, S5, 20 x 100 mm, gradiente: B del 60 % al 100 %) dio 30 mg (43 %) de ésterterc-butílico del ácido [18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-4-(propano-2-sulfonilaminocarbonil)-3,16diazatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico en forma de un polvo de color blanco: 1H RMN (300 MHz, CD3Cl3) 5 1,22 (S, 9 H), 1,31 (d. J = 6,6 Hz, 3 H), 1,41 (d, J = 6,9 Hz, 3 H), 1,20-1,96 (m, 11 H), 2,30 (c, J = 8,4 Hz, 1 H), 2,56 (m, 1 H), 2,69 (m, 2 H), 3,69 (m, 1 H), 4,03 (m, 1 H), 4,29 (m, 1 H), 4,62 (m, 2 H), 4,97-5,06 (m, 2 H), 5,68 (c,J = 9,5 Hz, 1 H), 5,91 (s, 1 H), 6,76 (s, 1 H), 7,23 (m, 1 H), 7,45 (t, J = 7,7 Hz, 1 H), 7,63 (t, J = 8,1 Hz, 1 H), 7,71 (d, J = 8,1 Hz, 1 H), 7,97 (d, J = 5,9 Hz, 1 H), 8,17 (d, J = 8,1 Hz, 1 H), 9,89 (s, 1 H). CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 3,79 min), EM m/z 670 (M++1).
Ejemplo 7. Preparación del Compuesto 4, éster terc-butílico del ácido [4-ciclopropanosulfonilaminocarbonil18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico
Se preparó a partir de eterato del ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]-nonadec-7-eno-4-carboxílico (100 mg, 0,15 mmol) y ciclopropilsulfonamida (24 mg, 0,20 mmol)como se ha descrito en el procedimiento general anterior. La cromatografía ultrarrápida (metanol al 2 %/cloruro de metileno) dio 55 mg (53 %) de éster terc-butílico del ácido [4-ciclopropanosulfonilaminocarbonil-18-(isoquinolin-1iloxi)-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo-[14,3,0,04,6]-nonadec-7-en-14-il]-carbámico en forma de un polvo de color blanco: 1H RMN (500 MHz, CD3Cl3) 5 0,89-0,95 (m, 1 H), 1,03-1,16 (m, 3 H),1,22 (s, 9 H), 1,18-1,48 (m, 8 H), 1,78 (m, 1 H),1,87 (m, 1 H), 1,94 (m, 1 H), 2,29 (c, J = 9,0 Hz, 1 H), 2,56 (m, 1 H), 2,67 (dd, J = 7,9 Hz, 2,7 Hz, 2 H), 2,90 (m, 1 H), 4,04 (dd, J = 11,3 Hz, 4,0 Hz, 1 H), 4,29 (m, 1 H), 4,61 (m, 2 H), 4,97-5,03 (m, 2 H), 5,70 (m, 1 H), 5,94 (s, 1 H), 6,67 (s, H), 7,25 (m, 1 H), 7,47 (1, J = 7,3 Hz, 1 H), 7,64 (t, J = 7,3 Hz, 1 H), 7,72 (d, J = 7,9 Hz, 1 H), 7,97 (d, J = 5,8 Hz, 1 H), 8,17 (d, J = 8,5 Hz, 1 H), 10,20 (s, 1 H). CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 3,67 min), EM m/z 696 (M++1).
Ejemplo 8, éster terc-butílico del ácido [4-(1-bencil-ciclopropanosulfonilaminocarbonil)-18-(isoquinolin-1iloxi)-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico
Se preparó a partir de ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-3,16-diaza
5 triciclo[14,3,0,04,6]-nonadec-7-eno-4-carboxílico (50 mg, 0,075 mmol) y amida del ácido 1-bencilciclopropanosulfónico (21 mg, 0,098 mmol, preparada como se ha descrito anteriormente) para dar éster terc-butílicodel ácido [4-(1-bencil-ciclopropanosulfonilaminocarbonil)-18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico en forma de un polvo de color blanco: 1H RMN (500 MHz, CD3Cl3) 5 1,23 (s, 9 H), 1,04-1,92 (m, 14 H), 1,96 (m, 1 H), 2,32 (dd, J = 17,7 Hz, 9,5 Hz, 1 H), 2,59 (m, 1 H), 2,70 (m, 2 H),
10 3,20 (d, J = 13,4 Hz, 1 H), 3,41 (d, J = 13,7 Hz, 1 H), 4,02 (m, 1 H), 4,29(m, 1 H), 4,61 (m, 2 H), 5,01 (d, J = 7,6 Hz, 1 H), 5,15 (m, 1 H), 5,78 (m, 1 H), 5,92 (s, 1 H), 6,65 (s, 1 H), 7,08 (d, J = 8,2 Hz, 2 H), 7,26 (m, 4 H), 7,46 (t, J = 7,3 Hz, 1 H), 7,64 (t, J = 7,3 Hz, 1 H), 7,72 (d, J = 8,2 Hz, 1 H), 7,97 (d, J = 5,8 Hz, 1 H), 8,17 (d, J = 8,9 Hz, 1 H), 10,05 (s, 1 H). CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 3,87 min), EM m/z 786 (M++1).
Ejemplo 9. Preparación del Compuesto 6, éster terc-butílico del ácido [18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-4-(115 propil-ciclopropanosulfonilamino-carbonil)-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico
Se preparó a partir de ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]-nonadec-7-eno-4-carboxílico (50 mg, 0,075 mmol) y amida del ácido 1-propilciclopropanosulfónico (16 mg,0,098 mmol, preparada como se ha descrito anteriormente) para dar éster terc-butílico20 del ácido [18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-4-(1-propil-ciclopropanosulfonilaminocarbonil)-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico en forma de un polvo de color blanco: 1H RMN (300 MHz, CD3Cl3) 5 0,82-0,93 (m, 5 H), 1,23 (s, 9 H), 1,30-1,94 (m, 17 H), 2,28 (m, 1 H ), 2,54 (m, 1 H), 2,68 (dd, J = 8,1 Hz, 3,2 Hz, 2 H), 4,05 (m, 1 H), 4,30 (m, 1 H), 4,63-4,66 (m, 2 H), 4,96-5,09 (m, 2 H), 5,70 (m, 1 H), 5,92 (s, 1 H), 6,69 (s, 1 H), 7,23(m, 1 H), 7,46 (t, J = 8,1 Hz, 1 H), 7,63 (t, J = 8, Hz, 1 H), 7,72 (d, J = 8,1 Hz, 1 H), 7,97 (d, J = 5,9 Hz, 1 H), 8,17 (d,
25 J = 8,4 Hz, 1 H), 10,12 (s, 1 H). CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 3,77 min), EM m/z 738 (M++1).
Ejemplo 10. Preparación del Compuesto 7, éster terc-butílico del ácido [18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-4(1-propil-ciclopropanosulfonilaminocarbonil)-3,16-diaza-triciclo[4,3,0,04,6]nonadec-14-il]-carbámico
A una mezcla de 73 mg (0,1 mmol) de éster terc-butílico del ácido [18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-4-(1propilciclopropanosulfonilamino-carbonil)-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico en 3 ml de metanol se le añadieron 332 mg (2 mmol) de azodicarboxilato dipotásico. Se añadió lentamente ácido acético glacial5 (240 mg, 4 mmol) en 2 ml de metanol mediante una bomba de jeringa durante 5 h. La mezcla se agitó a ta. Después de 5 h, se añadieron 332 mg (2 mmol) de azodicarboxilato dipotásico y 240 mg (4 mmol) de ácido acético glacialdurante el transcurso de 5 h y la agitación se continuó durante una noche. Este ciclo se repitió dos veces. La CL-EMmostró que aún quedaba aproximadamente un 40 % de material de partida restante. Después, el disolvente se retiróen un evaporador rotatorio. Al residuo se le añadió agua y la mezcla se extrajo tres veces con acetato de etilo.10 Después, se secó con sulfato de magnesio, se filtró y se concentró al vacío. El aceite resultante se disolvió en metanol y se purificó por HPLC preparativa (YMC ODS-A, S5, 20 x 100 mm, gradiente: de 80 % de B a 85 % de B,15 min, mantenido 2 min, caudal 25 ml/min) para aislar el producto en forma de un polvo de color blanco (25 mg, 34%). 1H RMN (500 MHz, CD3Cl3) 5 0,91 (m, 5 H), 1,30 (s, 9 H), 1,20-1,80 (m, 21 H), 1,86-1,93 (m, 2 H), 2,57 (m, 1 H),2,67 (m, 1 H), 4,10 (m, 1 H), 4,36 (d, J = 12,2 Hz, 1 H), 4,44 (t, J = 8,2 Hz, 1 H), 4,61 (t, J = 7,9 Hz, 1 H), 5,16 (d, J =
15 8,2 Hz, 1 H), 5,92 (s a, 1 H), 6,58 (s a, 1 H), 7,25 (m, 1 H), 7,49 (t, J = 7,3 Hz, 1 H), 7,65 (t, J = 7,3 Hz, 1 H), 7,73 (d, J = 8,2 Hz, 1 H), 7,97 (d, J = 5,8 Hz, 1 H), 8,15 (d, J = 8,2 Hz, 1 H), 10,09 (s, 1 H). CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 3,83 min), EM m/z 740(M++1).
Ejemplo 11. Preparación del Compuesto 8, éster terc-butílico del ácido [18-(isoquinolin-1-iloxi)-4-(1-metilciclopropanosulfonilaminocarbonil)-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico
20 Se preparó a partir de eterato del ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]-nonadec-7-eno-4-carboxílico (105 mg, 0,177 mmol) y amida del ácido 1-metilciclopropanosulfónico (31 mg, 0,23 mmol, preparada como se ha descrito anteriormente). La cromatografía ultrarrápida (metanol al 2 %/cloruro de metileno) dio 73 mg (58 %) de éster terc-butílico del ácido [18-(isoquinolin-1
25 iloxi)-4-(1-metil-ciclopropanosulfonilaminocarbonil)-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il]carbámico en forma de un polvo de color blanco: CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 3,50 min), EM m/z 710 (M++1).
Ejemplo 12. Preparación de Compuesto 9, éster terc-butílico del ácido [4-ciclobutanosulfonilaminocarbonil18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico
Se preparó a partir de eterato del ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]-nonadec-7-eno-4-carboxílico (114 mg, 0,192 mmol) y amida del ácido ciclobutanosulfónico (34mg, 0,25 mmol) como se ha descrito en el procedimiento general anterior. La cromatografía ultrarrápida (metanol al 2
5 %/cloruro de metileno) dio 73 mg (58 %) de éster terc-butílico del ácido [18-(isoquinolin-1-iloxi)-4-(1-metilciclopropanosulfonilaminocarbonil)-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico en formade un polvo de color blanco: CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 3,55 min), EM m/z 710 (M++1).
Ejemplo 13. Preparación del Compuesto 10, éster terc-butílico del ácido [4ciclopropanosulfonilaminocarbonil-18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-di-oxo-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec
10 14-il]-carbámico
A una mezcla de 140 mg (0,2 mmol) de éster terc-butílico del ácido [4-ciclopropanosulfonilaminocarbonil-18(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico en 3 ml de metanol se leañadieron 656 mg (4 mmol) de azodicarboxilato dipotásico. Se añadió lentamente ácido acético glacial (480 mg, 815 mmol) en 2 ml de metanol mediante una bomba de jeringa durante 5 h. La mezcla se agitó a ta. Después de 5 h, se añadieron 656 mg más (4 mmol) de azodicarboxilato dipotásico y 480 mg (8 mmol) de ácido acético glacial duranteel transcurso de 5 h y la agitación se continuó durante una noche. Este ciclo se repitió dos veces. La CL-EM mostróque aún quedaba aproximadamente un 40 % de material de partida restante. Después, el disolvente se retiró en unevaporador rotatorio. Al residuo se le añadió agua y la mezcla se extrajo tres veces con acetato de etilo. Después,
20 se secó con sulfato de magnesio, se filtró y se concentró al vacío. El aceite resultante se disolvió en metanol y se purificó por HPLC preparativa (YMC TERRA, S5, 30 x 50 mm, gradiente: de 72 % de B a 78 % de B, 15 min,mantenido 2 min, caudal 40 ml/min) para aislar el producto en forma de un polvo de color blanco (80 mg, 57 %). CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 3,59 min), EM m/z 698 (M++1).
Ejemplo 14. Preparación del Compuesto 11, bis clorhidrato de [14-amino-18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo25 3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carbonil]-amida del ácido ciclopropanosulfónico
Una suspensión agitada de éster terc-butílico del ácido [4-ciclopropano-sulfonilaminocarbonil-18-(isoquinolin-1-iloxi)2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico (1,20 g, 1,7 mmol) se trató con HCl 4 N/dioxano (Aldrich) (10 ml) durante 4 h. La mezcla de reacción se concentró al vacío para dar 1,10 g (92 %) de bis
5 clorhidrato de [14-amino-18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carbonil]amida del ácido ciclopropanosulfónico en forma de un sólido de color blanco: CL-EM (Procedimiento B, tiempo deretención: 1,39 min), EM m/z 596 (M++1-2 HCl).
Ejemplo 15. Preparación del compuesto 12, éster metílico del ácido [4-ciclopropanosulfonilaminocarbonil-18(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-3,16--diaza-triciclo[14,3,0,4,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico
A una mezcla de bis clorhidrato de [14-amino-18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carbonil]-amida del ácido ciclopropanosulfónico (50 mg, 0,075 mmol) en 2 ml deDCM se le añadieron 44 ml (0,25 mmol) de DIPEA y 9 mg (0,10 mmol) de cloroformiato de metilo. La mezcla se agitóa ta durante 2 h. Después, se diluyó con EtOAc y se lavó con tampón a pH 4 (2 x) y salmuera (1 x). La fase orgánica
15 se secó (MgSO4) y se concentró al vacío para dar el producto en bruto. La cromatografía ultrarrápida (MeOH al 2 %/DCM) dio 40 mg (82 %) del producto deseado en forma de un sólido de color blanco: CL-EM (Procedimiento A,tiempo de retención: 3,05 min), EM m/z 654 (M++1).
Ejemplo 16. Preparación del Compuesto 13, del 2,2-dimetil-propil éster ácido [4ciclopropanosulfonilaminocarbonil-18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-di-oxo-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec
20 7-en-14-il]-carbámico
A una mezcla de bis clorhidrato de [14-amino-18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carbonil]-amida del ácido ciclopropanosulfónico (50 mg, 0,075 mmol) en 2 ml deDCM se le añadieron 44 ml (0,25 mmol) de DIPEA y 15 mg (0,1 mmol) de cloroformiato de neopentilo. La mezcla se
5 agitó a ta durante 2 h. Después, se diluyó con EtOAc y se lavó con tampón a pH 4 (2 x) y salmuera (1x). La fase orgánica se secó (MgSO4) y se concentró al vacío para dar el producto en bruto. El aceite resultante se disolvió enmetanol y se purificó por HPLC preparativa (YMC XTERRA, S5, 30 x 50 mm, gradiente: de 65 % de B a 100 % de B,15 min, mantenido 2 min, caudal 40 ml/min) para aislar el producto en forma de un polvo de color blanco (42 mg, 79%): CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 3,58 min), EM m/z 710 (M++1).
10 Procedimiento General para la Preparación de cloroformiatos
Este procedimiento se usó para la preparación de cloroformiatos no disponibles en el mercado. A una solución de5,96 g (67,6 mmol) de los reactivos disponibles en el mercado (S)-3-hidroxitetrahidrofurano y piridina (5,8 ml; 72mmol) en THF (150 ml) enfriada a 0 ºC se le añadió una solución 1,93 M de fosgeno en tolueno (48 ml, 92,6 mmol
15 durante 10 min en atmósfera de argón. La solución resultante se dejó calentar a ta durante 2 h, el sólido resultante se filtró y las aguas madre se concentraron cuidadosamente al vacío a temperatura ambiente hasta que se obtuvo lamasa teórica. El residuo resultante se disolvió en 100 ml de THF para preparar una solución madre 0,68 M de cloroformiato de 3(S)-oxo-tetrahidrofurano que puede almacenarse en el congelador hasta el uso. De una maneraanáloga, otros alcoholes disponibles en el mercado pueden convertirse en soluciones madre 0,68 M de los
20 cloroformiatos correspondientes.
Ejemplo 17. Preparación del Compuesto 14, tetrahidro-piran-4-il éster del ácido [4ciclopropanosulfonilaminocarbonil-18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-di-oxo-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec7-en-14-il]-carbámico
Se preparó a partir de bis clorhidrato de [14-amino-18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carbonil]-amida del ácido ciclopropanosulfónico (50 mg, 0,075 mmol), 44 µl (0,25mmol) de DIPEA y 0,17 ml (0,1 mmol) de cloroformiato de tetrahidropirano (preparado por tratamiento de tetrahidro
5 piran-4-ol con fosgeno) en DCM como se ha descrito en el procedimiento anterior para dar 28 mg (52 %) de un sólido de color blanco. Condición de HPLC preparativa: YMC XTERRA, S5, 19 x 100 mm, gradiente: de 50 % de B a100 % de B, 10 min, mantenido 2 min, caudal 25 ml/min. CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 3,13 min),EM m/z 724 (M++1).
Ejemplo 18. Preparación del Compuesto 15, tetrahidro-furan-3-il éster del ácido [4
10 ciclopropanosulfonilaminocarbonil-18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-di-oxo-3,16-diaza-triciclo[4,3,0, 04,6]nonadec7-en-14-il]-carbámico
Se preparó a partir de bis clorhidrato de [14-amino-18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carbonil]-amida del ácido ciclopropanosulfónico (50 mg, 0,075 mmol), 44 µl (0,25
15 mmol) de DIPEA y 0,10 ml (0,1 mmol) de cloroformiato de tetrahidro-furan-3-ilo (preparado por tratamiento de tetrahidrofurano-3-ol con fosgeno) en DCM como se ha descrito en el procedimiento anterior para dar 28 mg (52 %)de un sólido de color blanco. Condición de HPLC preparativa: YMC ODS-A, S5, 30 x 50 mm, gradiente: de 50 % deB a 85 % de B, 8 min, mantenido 2 min, caudal 45 ml/min. CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 3,05 min),EM m/z 710 (M++1).
20 Ejemplo 19. Preparación del Compuesto 16, isopropil éster del ácido [4-ciclopropanosulfonilaminocarbonil18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-di-oxo-3,16-diaza-triciclo[14,3,0, 04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico
Se preparó a partir de bis clorhidrato de [14-amino-18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carbonil]-amida del ácido ciclopropanosulfónico (50 mg, 0,075 mmol), 44 µl (0,25mmol) de DIPEA y 0,10 ml (0,1 mmol) de cloroformiato de isopropilo 1 M en tolueno (Aldrich) como se ha descrito en
5 el procedimiento anterior para dar 40 mg (78 %) de un sólido de color blanco. Condición de HPLC preparativa: YMC XTERRA, S5, 30 x 50 mm, gradiente: de 50 % de B a 100 % de B, 15 min, mantenido 2 min, caudal 40 ml/min) RMN(300 MHz, CD3OD) 5. CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 3,32 min), EM m/z 682 (M++1).
Ejemplo 20. Preparación de ácido (1S,4R,6S,14S,18R)-7-cis-14-terc-butoxcycarbonilamino-18-hidroxi-2,15dioxo-3,16-di-azatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico para uso en la preparación del Compuesto
10 17 del Ejemplo 21
15 Una solución de ácido 2(S)-terc-butoxicarbonilamino-8-nonenoico (adquirido en RSP Amino Acids) (3,5 g, 12,9 mmol) en 200 ml de DCM se trató secuencialmente con clorhidrato de éster metílico del ácido 4(R)-hidroxipirrolidina2(S)-carboxílico (2,15 g, 11,8 mmol), N-metil morfolina (4,25 ml, 38,6 mmol) y HATU (5,37 g, 14,1 mmol). La mezclade reacción se agitó a ta en una atmósfera de N2 durante 3 días y después se concentró al vacío. El residuo serepartió entre acetato de etilo y tampón a pH 4 (biftalato). La fase orgánica se lavó con NaHCO3 ac. sat., se secó
20 (MgSO4) y se concentró al vacío para dar el producto en bruto. La cromatografía ultrarrápida (de acetato de etilo al 50 %/hexano a acetato de etilo al 100 %) dio 4,7 g (~100 %) de éster metílico del ácido 1-(2(S)-tercbutoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4(R)-hidroxi-pirrolidina-2(S)-carboxílico en forma de un aceite incoloro: 1H RMN (500 MHz, CD3OD) 5 1,33-1,50 (m, 8 H), 1,46 (s, 9 H), 1,57 (m, 1 H), 1,72 (m, 1 H) 2,08 (m, 2 H), 2,28 (m, 1 H), 3,72(s, 3 H,) 3,75-3,87 (m, 2 H), 4,36 (m, 1 H), 4,51 (s a, 1 H), 4,57 (t, J = 8,2 Hz, 1 H), 4,95 (d, J = 10,4 Hz, 1 H), 5,01
25 (m, 1 H), 5,83 (m, 1 H). CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 3,01 min), EM m/z 399 (M++1).
Etapa 20 B: Preparación de éster etílico del ácido 1-{[-(2(S)-terc-butoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4(R)hidroxi-pirrolidina-2(S)carbonil]-(1R)-amino}-2(S)-vinil-ciclopropanocarboxílico
Se disolvió éster metílico del ácido 1-(2(S)-terc-butoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4(R)-hidroxi-pirrolidina-2(S)carboxílico (4,7 g, 11,8 mmol) en THF (80 ml), metanol (20 ml) y agua (40 ml). Se añadió hidróxido de litio en polvo (5,6 g, 233 mmol). La suspensión de color amarillo claro se agitó a ta en una atmósfera de N2 durante 16 h ydespués se concentró al vacío. El residuo se repartió entre éter y agua. La fase de éter se desechó y la fase acuosase trató con HCl 1 N hasta que el pH fue de 4. Esta solución ácida se extrajo con EtOAc (3 x). Los extractos deEtOAc combinados se secaron (MgSO4) y se concentraron al vacío para dar 4,36 g (96 %) de ácido 1-(2(S)-tercbutoxicarbonilamino-8-nonenoil)-4(R)-hidroxi-pirrolidina-2(S)-carboxílico en forma de un sólido de color blanco. Después, este ácido se disolvió en 150 ml de DMF y se añadieron clorhidrato de éster etílico del ácido (1R, 2S)-1amino-2-vinilciclopropanocarboxílico (2,61 g, 13,6 mmol), N-metil morfolina (2,5 ml, 22,6 mmol) y HATU (5,2 g, 13,7mmol). La mezcla de reacción se agitó a ta en una atmósfera de N2 durante 16 h y después se concentró al vacío. Elresiduo se repartió entre acetato de etilo y tampón a pH 4 (biftalato). La fase orgánica se lavó con NaHCO3 ac. sat., se secó (MgSO4) y se concentró al vacío para dar el producto en bruto. La cromatografía ultrarrápida (acetato de etilo al 60 %-80 %/hexano) dio 6,0 g (98 %) de éster etílico del ácido 1-{[1-(2(S)-terc-butoxicarbonilamino-non-8enoil)-4(R)-hidroxi-pirrolidina-2(S)carbonil]-(1R)-amino}-2(S)-vinil-ciclopropanocarboxílico en forma de un sólido de color blanco: 1H RMN (500 MHz, CD3OD) 5 1,25 (t, J = 7,2 Hz, 3 H), 1,33-1,80 (m, 10 H), 1,46 (s, 9 H), 2,09 (m, 3 H), 2,25 (m, 2 H), 3,76 (m, 2 H), 4,14 (m, 2 H), 4,27 (dd, J = 8,5, 5,2 Hz, 1 H), 4,50 (m, 2 H), 4,94 (d, J = 10,1 Hz, 1 H), 5,01 (dd, J = 17,1, 1,8 Hz, 1 H), 5,11 (dd, J = 10,4, 1,8 Hz, 1 H), 5,30 (d, J = 15,6 Hz, 1 H), 5,80 (m, 2 H), 8,57 (s, 1 H). CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 3,21 min), EM m/z 522 (M++1).
Etapa 20C: Preparación de éster etílico del ácido (1S,4R,6S,14S,18R)-7-cis-14-terc-butoxicarbonilamino-18hidroxi-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico
Una solución de éster etílico del ácido 1-{[1-(2(S)-terc-butoxicarbonil-amino-non-8-enoil)-4(R)-hidroxi-pirrolidina2(S)carbonil]-(1R)-amino}-2(S)-vinilciclopropano-carboxílico (800 mg, 1,53 mmol) en 2 l de cloruro de metileno se lavó abundantemente con N2 durante 0,5 h. Después, se añadió dicloruro de triciclohexilfosfina[1,3-bis(2,4,6-trimetilfenil)-4,5-dihidroimidazol-2-ilideno][bencilideno]-rutenio (IV) (Strem) (64 mg, 0,075 mmol) y la mezcla se lavó abundantemente con N2 durante 10 min más. La solución homogénea de color naranja claro se calentó a reflujodurante 2 h para dar una solución de color naranja oscuro. La mezcla de reacción se enfrió a ta y se concentró al vacío para dar un aceite de color naranja. La cromatografía ultrarrápida (acetato de etilo) dio 460 mg (61 %) de ésteretílico del ácido (1S,4R,6S,14S,18R)-7-cis-14-terc-butoxicarbonilamino-18-hidroxi-2,15-dioxo-3,16diazatriciclo[14,3,0,04,6]-nonadec-7-eno-4-carboxílico en forma de un sólido de color gris. 1H RMN (500 MHz, CDCl3)5 1,19 (t, J = 7,2 Hz, 3 H), 1,42 (s, 9 H), 1,22-1,8 (m, 8 H), 1,87 (m, 2 H), 2,03-2,22 (m, 4 H), 2,63 (m, 1 H), 3,65 (m, 1H), 4,09 (m, 3 H), 4,45 (m, 1 H), 4,56 (s, 1 H), 4,82 (m, 1 H), 5,23 (m, 1 H), 5,51 (s, 1 H), 7,16 (s, 1 H). CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 2,97 min), EM m/z 494 (M++1).
Etapa 20 D: ácido (1S,4R,6S,14S,18R)-7-cis-14-terc-butoxicarbonilamino-18-hidroxi-2,15-dioxo-3,16diazatriciclo[14,3,0,04,6]-nonadec-7-eno-4-carboxílico
A una solución de éster etílico del ácido (1S,4R,6S,14S,18R)-7-cis-14-terc-butoxicarbonilamino-18-hidroxi-2,15dioxo-3,16-diazatri-ciclo[14,3,0,04,6]-nonadec-7-eno-4-carboxílico (493 mg, 1,0 mmol) en THF (4 ml), metanol (1 ml) yagua (2 ml) se le añadió hidróxido de litio en polvo (480 mg, 20 mmol) y la suspensión de color amarillo claro se agitó 5 a ta en una atmósfera de N2 durante 16 h. Después, la mezcla se concentró al vacío y el residuo se repartió entre éter y agua. La fase de éter se desechó y la fase acuosa se trató con HCl 1 N hasta pH 4. Esta solución ácida seextrajo tres veces con EtOAc. Los extractos de EtOAc combinados se secaron (MgSO4) y se concentraron al vacío para dar 460 mg (98 %) del Ejemplo 26, ácido (1S,4R,6S,14S,18R)-7-cis-14-terc-butoxicarbonilamino-18-hidroxi2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]-nonadec-7-eno-4-carboxílico en forma de un sólido de color gris. 1H RMN 10 (500 MHz, CD3OD) 5 ppm 1,26 (t, J = 7,2 Hz, 3 H), 1,35-1,52 (m, 15 H), 1,57-1,68 (m, 3 H), 1,79 (m, 1 H), 2,04 (m, 1 H), 2,16-2,41 (m, 3 H), 3,80 (dd, J = 10,7, 4,3 Hz, 1 H), 3,88 (m, 1 H), 4,38 (dd, J = 8,9, 3,1 Hz, 1 H), 4,55 (m, 2 H), 5,39 (t, J = 9,8 Hz, 1 H), 5,58 (m, 1 H). CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 2,64 min), EM m/z 466 (M++1).
Ejemplo 21. Preparación del Compuesto 17B, éster terc-butílico del ácido [4ciclopropanosulfonilaminocarbonil-18-(6-metoxi-isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-3,16-diaza
15 triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico
A una mezcla de ácido 4-terc-butoxicarbonilamino-18-hidroxi-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7eno-4-carboxílico (215 mg, 0,46 mmol) en DMSO (5 ml) se le añadieron t-BuOK (125 mg, 1,11 mmol) y 1-cloro-6metoxi-isoquinolina (110 mg, 0,56 mmol). La reacción se agitó durante 16 h a ta. Después, la mezcla de reacción se20 repartió entre éter (10 ml) y agua (10 ml). La fase acuosa se acidificó a pH 4 usando HCl 1 N. La solución resultante se extrajo con EtOAc (3 x 20 ml). Los extractos de EtOAc combinados se secaron (MgSO4), se filtraron y seconcentraron al vacío para dar un sólido de color blanco. La cromatografía ultrarrápida (MeOH al 2 %/CH2Cl2) dio140 mg (49 %) del derivado de ácido carboxílico en forma de un sólido de color blanco. CL-EM (Procedimiento B,tiempo de retención: 1,80 min), EM m/z 543 (M++1). El sólido anterior (140 mg, 0,22 mmol) se trató con
25 ciclopropilsulfonamida (35 mg, 0,28 mmol) como se ha descrito en el procedimiento general anterior para dar el producto en bruto. La cromatografía ultrarrápida (MeOH al 2 %/DCM) dio 90 mg del producto deseado. Lapurificación adicional por HPLC preparativa (YMC Xterra, S5, 30 x 50 mm, del 50 % al 100 % de B, gradiente 9 min,mantenido 1 min, caudal 40 ml/min) dio 30 mg (19 %) del producto en forma de un polvo de color blanco: CL-EM(Procedimiento B, tiempo de retención: 1,86 min), EM m/z 726 (M++1).
30 Ejemplo 22. Preparación de éster etílico del ácido 1-{[4-(6-metoxi-isoquinolin-1-iloxi)-pirrolidina-2-carbonil]amino}-2-vinil-ciclopropanocarboxílico (en forma de la sal bis HCl) para uso en el Ejemplo 24
Se preparó usando la misma secuencia sintética empleada para la preparación del producto de la Etapa 2B delEjemplo 3 con la excepción de que se usó 6-Metoxi-1-cloroquinolina (descrita en el Ejemplo 1, p. ej. Etapa 1a yEtapa 1b) en lugar de 1-cloroquinolina.
Ejemplo 23. Preparación de Ejemplo 23, ácido 2(S)-terc-butoxicarbonilamino-3-pent-4-enilsulfanilpropiónico para uso en el Ejemplo 24.
Etapa 1: A una solución de éster metílico de N-Boc-cisteína (3,36 g, 0,014 mol) en metanol (166 ml) a TA se leañadieron trietilamina (10,8 ml) y 1-bromopent-4-eno (3,19 g, 21 mmol, 1,5 equivalentes) y la solución resultante se
10 agitó a temperatura ambiente durante una noche. Después, la mezcla se concentró al vacío y la mezcla residual resultante se purificó usando cromatografía ultrarrápida (gradiente de hexano, acetato de etilo) para proporcionar1,76 g (41 %) del tioéter deseado. 1H RMN (500 MHz, CDCl3) 51,43 (s, 9H), 1,64 (m, 2H), 2,11 (m, 2H), 2,51 (m, 2H),2,95 (m, 2H), 3,75 (s, 3H), 4,51 (m, 1H), 4,95-5,03 (m, 2H), 5,34 (m, 1H), 5,80 (1H, m). CL-EM (Procedimiento B, conla excepción de que el tiempo de gradiente fue de 3 min, y el caudal fue de 4 ml/min, tiempo de retención: 2,29 min),
15 EM m/z 304 (M++1).
Etapa 2: El producto de tioéter de la etapa 1 (9,51 g, 31,4 mmol) se añadió a una mezcla de LiOH 1 M en agua (200ml) y THF (200 ml) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante una noche. Después, la mezclade reacción se acidificó usando ácido clorhídrico 1 N y la mezcla resultante se extrajo varias veces con acetato deetilo. Los extractos se combinaron, se secaron sobre sulfato de magnesio y se concentraron al vacío para
20 proporcionar el ácido deseado que se usó tal cual en la siguiente reacción.
Ejemplo 24. Preparación del Compuesto 18B, éster terc-butílico del ácido [4ciclopropanosulfonilaminocarbonil-18-(6-metoxi-isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-12-tia-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]Inonadec-7-en-14-il]-carbámico
5 A una solución del ácido carboxílico del Ejemplo 23 (289 mg, 1,00 mmol, 1 equiv.) en DMF (9 ml) se le añadieron secuencialmente el producto de dipéptido del Ejemplo 22 (498 mg, 1,00 mmol, 1 equiv.), HATU (456 mg, 1,20 mmol,1,2 equiv.) y N-metil morfolina (385 µl, 3,50 mmol, 3,5 equiv.). La solución se dejó en agitación a temperaturaambiente durante una noche, momento en el que la CL/EM indicó la formación del producto y la desaparición del material de partida 2. Se añadió una solución de tampón a pH 4 y la mezcla se extrajo tres veces con acetato de
10 etilo. Las fases orgánicas se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de magnesio y se concentraron al vacío. Se realizó cromatografía (gel de sílice, gradiente de Acetato de etilo/Hexano) para obtener el tripéptido puro 3con rendimiento cuantitativo.
1H RMN (400 MHz, CDCl3) 5 8,03 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 7,89 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 7,56 (s a, 1H), 7,15-7,09 (m, 2H), 7,01 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 5,86-5,68 (m, 3H), 5,39-5,22 (m, 2H), 5,12-4,82 (m, 4H), 4,61 (c ap., J = 6,8 Hz, 1H), 4,24
15 4,04 (m, 3H), 3,91 (s, 3H), 3,02-2,90 (m, 1H), 2,84-2,69 (m, 2H), 2,66 (m, 3H), 2,24-2,08 (m, 2H), 1,88 (dd, J = 5,5, 8,0 Hz, 1H), 1,68 (quint. ap., J = 7,5 Hz, 2H), 1,56 (dd, J = 5,4, 9,5 Hz, 1H), 1,42 (m, 1H), 1,31 (s, 9H), 1,27-1,20 (m,4H). [m/z] + H 697, TERRA 3,0 X 50 mm S7 tiempo de retención = 1,937 min, HPLC procedimiento 2 min, gradientede 0 % de B a 100 % de B, después 1 min a 100 % de B (tiempo de realización total 3 min)
Etapa 24 B. Preparación de éster etílico del ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(6-metoxi-isoquinolin-120 iloxi)-2,15-dioxo-12-tia-3,16-di-aza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico
A una solución del producto de tripéptido de la Etapa 24A (384,6 mg, 553 µmol, 1 equiv.) en dicloroetano (159 ml) sele añadió dicloruro de triciclohexilfosfina[1,3-bis(2,4,6-trimetilfenil)-4,5-dihidroimidazol-2-ilideno[bencilidino]rutenio
(IV) (48,5 mg, 57 µmol, 0,10 equiv.) y se calentó a reflujo durante 16 h. La reacción se concentró al vacío. Se realizócromatografía (gel de sílice, gradiente de Acetato de etilo/Hexano) para obtener el macrociclo puro, con un rendimiento del 73 %. 1H RMN (500 MHz, CDCl3) 5 8,04 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,86 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 7,59 (s a, 1H), 7,16-7,09 (m, 2H), 7,00 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,78-5,71 (m, 1H), 5,64 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 5,58-5,50 (m, 1H), 5,36 (m, 1H), 5,03 (dd, J = 4,2, 8,3 Hz, 1H), 4,81-4,75 (m, 1H), 4,27-4,14 (m, 2H), 3,98-3,93 (m, 1H), 3,91 (s, 3H), 3,13-3,02(m, 2H), 3,00-2,94 (m, 1H), 2,69 (dt, J = 3,9, 11,2 Hz, 1H), 2,52-2,42 (m, 2H), 2,36-2,26 (m, 2H), 2,16-2,08 (m, 1H), 1,96 (dd, J = 5,5, 8,2 Hz, 1H), 1,86-1,76 (m, 1H), 1,68-1,58 (m, 2H), 1,37 (s, 9H), 1,29 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 1,27-1,21 (m, 1H).
[m/z] + H 669
XTERRA 3,0 X 50 mm S7 tiempo de retención = 1,797, HPLC procedimiento 2 min gradiente de 0 % de B a 100 %de B, después 1 min a 100 % de B (tiempo de realización total de 3 min)
Etapa 24 C. Preparación de ácido 18A, 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(6-metoxi-isoquinolin-1-iloxi)-2,15dioxo-12-tia-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico
A una solución del producto de éster de macrociclo de la Etapa 24B (271 mg, 406 µmol, 1 equiv.) en THF (4,1 ml) sele añadieron LiOH (97 mg, 4,04 mmol, 10 equiv.), agua (0,45 ml) y MeOH (1,9 ml). La reacción se dejó en agitacióndurante 16 h, momento en el que la CL/EM indicó que la hidrólisis se había completado. Se añadió una solución 1 M de HCl en agua y la mezcla resultante se extrajo 3 veces en acetato de etilo. Los extractos orgánicos se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de magnesio y se concentraron al vacío para proporcionar el ácido carboxílicopuro con rendimiento cuantitativo.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 12,50 (s a, 1H), 8,59 (s a, 1H), 8,22 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 8,14-8,07 (m, 1H), 7,46 (sa, 2H), 7,33-7,25 (m, 2H), 5,95 (s a, 1H), 5,79-5,56 (m, 2H), 4,66-4,57 (m, 1H), 4,50-4,37 (m, 2H), 4,24-4,11 (m, 2H), 4,05 (s, 3H), 3,60-3,40 (m, 2H), 3,09-2,97 (m, 1H), 2,91-2,81 (m, 1H), 2,65-2,58 (m, 1H), 2,56-2,44 (m, 2H), 2,44-2,33(m, 1H), 1,84-1,73 (m, 1H), 1,72-1,57 (m, 2H), 1,34 (s, 9H), 1,08-0,95 (m, 1H).
[m/z] + H 641 TERRA 3,0 X 50 mm S7 tiempo de retención = 1,673, HPLC procedimiento 2 min gradiente de 0 % deB a 100 % de B, después 1 min a 100 % de B (tiempo de realización total de 3 min)
Etapa 24D. Preparación del Compuesto 18B, éster terc-butílico del ácido [4ciclopropanosulfonilaminocarbonil-18-(6-metoxi-isoquinolin-1-iloxi)-3,15-dioxo-12-tia-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico
A una solución del producto de ácido carboxílico de la Etapa 24 C(236,3 mg, 369 µmol, 1 equiv.) en THF (5,2 ml) sele añadió carbonil diimidazol (143 mg, 738 µmol, 2 equiv.) y se calentó a reflujo durante 2,5 h. La solución se enfrió atemperatura ambiente, momento en el que se añadieron ciclopropil sulfonamida (158 mg, 1,1 mmol, 3 equiv.) y DBU
5 (127 µl, 849 µmol, 2,3 equiv.). La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 16 h. Se añadió una solución 1 M de HCl en agua y el producto se extrajo tres veces en cloruro de metileno. Las fases orgánicas selavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de magnesio y se concentraron al vacío. Se realizó cromatografía(Gel de sílice, gradiente de Acetato de etilo/Hexano) para obtener el Compuesto de sulfonamida puro 18, con unrendimiento del 78 %.
10 1H RMN (400 MHz, CD3OD) 5 8,10 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 7,89-7,83 (m, 2H), 7,21 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 7,13 (s a, 1H), 7,05 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 5,81 (s a, 1H), 5,68 (c ap., J = 8,9 Hz, 1H), 5,16 (t ap., J = 9,7 Hz, 1H), 4,59-4,52 (m, 2H),4,40-4,32 (m, 1H), 4,12-4,04 (m, 1H), 3,89 (s, 3H), 2,98-2,78 (m, 3H), 2,73-2,41 (m, 6H), 2,02-1,98 (m, 1H), 1,75 (dd,J = 5,5, 8,2 Hz, 1H), 1,71-1,53 (m, 3H), 1,32-1,20 (m, 1H), 1,16 (s, 9H), 1,14-0,95 (m, 2H). [m/z] + H 744
XTERRA 3,0 X 50 mm, S7 tiempo de retención = 1,700, HPLC procedimiento 2 min gradiente de 0 % de B a 100 %15 de B, después 1 min a 100 % de B (tiempo de realización total de 3 min)
Ejemplo 25. Preparación del Compuesto 19, éster terc-butílico del ácido 4ciclopropanosulfonilaminocarbonil-18-(6-metoxi-isoquinolin-1-iloxi)-2,12,12,15-tetraoxo-12-tia-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico
20 A una solución del Compuesto 18 (84,7 mg, 114 µmol) en MeOH (1,4 ml) y agua (460 µl) a 0 ºC se le añadió oxone (210,6 mg, 343 µmol, 3,0 equiv.). La mezcla se agitó durante 20 min a 0 ºC y después se dejó en agitación durante 3h a temperatura ambiente. Después, se añadieron agua y cloruro de metileno y las fases se separaron. La faseacuosa se extrajo dos veces más con cloruro de metileno. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfatode magnesio y se concentraron al vacío. El producto se purificó por TLC prep. (acetato de etilo) para producir la
25 sulfona (37,2 mg, 42 % de rendimiento).
1H RMN (CD3OD) 5 8,11 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 7,88 (d, J = 6,1 Hz, 1H), 7,23 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 7,20-7,15 (m, 1H), 7,11 (dd, J = 1,8, 8,9 Hz, 1H), 5,87-5,81 (m, 1H), 5,61-5,47 (m, 2H), 4,96-4,90 (m, 1H), 4,67 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 4,464,39 (m, 1H), 4,27-4,20 (m, 1H), 3,92 (s, 3H), 3,84-3,72 (m, 1H), 2,94-2,84 (m, 2H), 2,67-2,58 (m, 2H), 2,47-2,37 (m,1H), 2,37-2,25 (m, 2H), 1,85-1,73 (m, 2H), 1,72-1,64 (m, 1H), 1,49-1,38 (m, 1H), 1,20 (s, 9H), 1,16-1,02 (m, 3H),
30 1,00-0,82 (m, 3H).
Etapa 26A: Preparación de pirrolidin-5-ona-2(S)-carboxilato de isopropilo
5 Una solución de ácido L-piroglutámico (Aldrich, 25,0 g, 195 mmol) y ácido paratoluenosulfónico monohidrato (3,71 g, 19,5 mmol) se calentó a reflujo en isopropanol (40 ml) en atmósfera de nitrógeno durante 6 horas usando unavariación del purgador Dean-Stark (condensado devuelto a través de un extractor Soxhlet cargado con tamicesmoleculares de 4 Å). Después de enfriar a temperatura ambiente, la reacción se diluyó con éter, se lavó conbicarbonato sódico acuoso saturado y después NaCl acuoso saturado, se secó (MgSO4) y se evaporó para dar un
10 jarabe incoloro. Cristalizó después de un periodo de reposo. La trituración del residuo cristalino en hexano proporcionó 31,9 g (96 %) de pirrolidin-5-ona-2(S)-carboxilato de isopropilo en forma de prismas de color blanco: 1H RMN (300 MHz, Cloroformo-D) 5 6,35 (s a, 1 H), 5,04 (sept., 1 H, J = 6,2 Hz), 4,18 (dd, 1 H, J = 8,4, 5,3 Hz), 2,512,28 (m, 3 H), 2,27-2,12 (m, 1 H), 1,24 (d, 6 H, J = 6,2 Hz). CLEM m/z 172 (M+H)+.
Etapa 26B: Preparación de 1-(terc-butoxicarbonil)-pirrolidin-5-ona-2(S)-carboxilato de isopropilo
15 Una solución de pirrolidin-5-ona-2(S)-carboxilato de isopropilo (producto de la etapa 26A, 31,9 g, 188 mmol),dicarbonato de di-terc-butilo (48,6 g, 225 mmol) y DMAP (2,30 g, 8,8 mmol) en acetonitrilo (300 ml) se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera de N2 durante 30 minutos. La reacción se evaporó a aproximadamente 100ml, se diluyó con éter, se lavó con HCl 1 N y después NaCl acuoso saturado, se secó (MgSO4) y se evaporó para
20 dar 1-(terc-butoxicarbonil)pirrolidin-5-ona-2(S)carboxilato de isopropilo en forma de un aceite de color amarillo claro, 50,1 g (99 %): 1H RMN (300 MHz, Cloroformo-D) 5 5,06 (sept., 1 H, J = 6,2 Hz), 4,53 (dd, 1 H, J = 9,5, 2,9 Hz), 2,662,40 (m, 2H), 2,36-2,22 (m, 1 H), 2,03-1,93 (m, 1 H), 1,47 (s, 9 H), 1,26 (d, 3 H, J = 6,2 Hz), 1,24 (d, 3 H, J = 6,2 Hz). CLEM m/z 272 (M+H)+.
Etapa 26C: Preparación de 2(S)-(terc-butoxicarbonilamino)-5-hidroxipentanoato de isopropilo
A una solución de 1-(terc-butoxicarbonil)pirrolidin-5-ona-2(S)-carboxilato de isopropilo (producto de la etapa 26B, 49,5 g, 183 mmol) en metanol (300 ml) se le añadió borohidruro sódico (10,0 g, 263 mmol) en porciones de ~1 gdurante 1,5 horas. La reacción se agitó en atmósfera de nitrógeno durante 10 minutos más. Se diluyó con agua, seextrajo con éter y las fracciones orgánicas combinadas se lavaron con NaCl acuoso saturado, se secaron (MgSO4) yse evaporaron para dar un aceite de color amarillo claro. La cromatografía ultrarrápida (gel de sílice, acetato de etilo al 20-30 %/hexano) dio 31,8 g (64 %) de 2(S)-(terc-butoxicarbonilamino)-5-hidroxipentanoato de isopropilo en forma de un jarabe incoloro: 1H RMN (300 MHz, Cloroformo-D) 5 5,16 (d a, 1 H, J = 7,3 Hz), 5,03 (sept., 1 H, J = 6,2 Hz), 4,28 (d a, 1 H, J = 6,2 Hz), 3,67 (dd a, J = 10,2, 5,5 Hz), 1,94-1,79 (m, 2 H), 1,76-1,67 (m, 1 H), 1,66-1,56 (m, 2 H), 1,43 (s, 9 H), 1,25 (d, 3 H, J = 6,2 Hz), 1,23 (d, 3 H, J = 6,2 Hz). CLEM m/z 276 (M+H)+.
Etapa 26D: Preparación de 5-aliloxi-2(S)-(terc-butoxicarbonilamino)pentanoato de isopropilo
Una mezcla desgasificada de 2(S)-(terc-butoxicarbonilamino)-5-hidroxipentanoato de isopropilo (producto de laetapa 26C, 17,6 g, 63,9 mmol), carbonato de alil metilo (24,0 ml, 213 mmol), Pd2(dba)3 (1,62 g, 1,78 mmol) y BINAP (4,42 g, 7,10 mmol) en THF (150 ml) se calentó a reflujo en atmósfera de nitrógeno durante 3 horas. Después de enfriar a temperatura ambiente, la reacción se diluyó con éter, se filtró a través de celite y se evaporó, dando unjarabe de color pardo oscuro. La cromatografía ultrarrápida del residuo (gel de sílice, éter al 30 %/hexano) dio 5aliloxi-2(S)-(terc-butoxicarbonilamino)pentanoato de isopropilo en forma de un aceite incoloro viscoso, 16,3 g (81 %):1H RMN (300 MHz, Cloroformo-D) 5 5,88 (ddt, 1 H, 17,4, 10,4, 5,5), 5,28 (m, 1 H), 5,22-5,11 (m, 1 H), 5,02 (sept., 1 H, J = 6,2 Hz), 4,21 (t a, 1 H, J = 6,7 Hz), 3,94 (dt, 2 H, J = 5,9, 1,5 Hz), 3,42 (t, 2 H, J = 5,9 Hz), 1,90-1,82(m,1H), 1,75-1,57 (m,3H),1,42 (s,9H),1,21(d,3H, J = 6,2 Hz), 1,19(d, 3H, J = 6,2 Hz).CLEM m/z 316(M+H)+.
Etapa 26E: Preparación de ácido 5-aliloxi-2(S)-(terc-butoxicarbonilamino)pentanoico
Una mezcla de 5-aliloxi-2(S)-(terc-butoxicarbonilamino)pentanoato de isopropilo (producto de la etapa 26D, 16,1 g,51,1 mmol) e hidróxido de litio hidrato (4,19 g, 102 mmol) en THF/agua (100 ml/20 ml) se agitó a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno durante 16 horas. La reacción se diluyó con agua, se lavó con éter, el pH de lafracción acuosa se ajustó a ~4, se extrajo con éter y las fracciones orgánicas combinadas se lavaron con NaClsaturado, se secaron (MgSO4) y se evaporaron, dando ácido 5-aliloxi-2(S)-(terc-butoxicarbonilamino)pentanoico enforma de un jarabe de color amarillo claro: 1H RMN (300 MHz, Cloroformo-D) δ 5,89 (ddt, 1 H, J = 17,4, 10,4, 5,5), 5,25 (dd, 1 H, J = 17,4, 1,6 Hz), 5,17 (dd, 1 H, J = 10,4, 1,6 Hz), 4,30 (d a, 1 H, J = 6,2), 3,96 (dt, 2 H, J = 5,9, 1,5 Hz), 3,46 (t, 2 H, J = 5,9 Hz), 1,96-1,86 (m, 1 H), 1,85-1,77 (m, 1 H), 1,75-1,64 (m, 2 H), 1,43 (s, 9 H). CLEM m/z 274 (M+H)+.
Etapa 26F Preparación de éster etílico del ácido 1-{[1-(5-aliloxi-2-terc-butoxicarbonilamino-pentanoil)-4-(6metoxi-isoquinolin-1-iloxi)-pirrolidina-2-carbonil]-amino}-2-vinilciclopropanocarboxílico
Una solución de diclorhidrato de éster etílico del ácido 1-{[4-(6-metoxi-isoquinolin-1-iloxi)-pirrolidina-2-carbonil]amino}-2-vinil-ciclopropanocarboxílico (Ejemplo 22) (3,60 g, 7,25 mmol) y ácido 5-aliloxi-2-terc-butoxicarbonilaminopentanoico (el producto de la etapa 26E, 1,98 g, 7,25 mmol) en 75 ml de DMF se trató con HATU (3,31 g, 8,7 mmol)y N-metilmorfolina (2,79 ml, 25,4 mmol). La mezcla de reacción se agitó a ta en una atmósfera de N2 durante 4 h y después se inactivó con tampón a pH 4 (biftalato). La mezcla resultante se extrajo con EtOAc. La fase orgánica selavó con NaCl ac. sat., se secó (MgSO4) y se concentró al vacío para dar el producto en bruto. La cromatografíaultrarrápida (gel de sílice, acetato de etilo al 10-60 %/hexano) dio 3,91 g (~79 %) de éster etílico del ácido 1-{[1-(5aliloxi-2-terc-butoxicarbonilamino-pentanoil)-4-(6-metoxi-isoquinolin-1-iloxi)-pirrolidina-2-carbonil]-amino}-2-vinilciclopropanocarboxílico en forma de una espuma colapsada de color amarillo: 1H RMN (500 MHz, METANOL-D4) 5 1,05-1,16 (m, 1 H), 1,32 (s, 9 H), 1,37-1,50 (m, 3 H), 1,51-1,67 (m, 3 H), 1,68-1,84 (m, 2 H), 2,17-2,30 (m, 1 H), 2,322,50 (m, 1 H), 2,58-2,73 (m, 1 H), 2,80 (s, 1 H), 3,33-3,52 (m, 2 H), 3,86-3,95 (m, 5 H), 4,00-4,06 (m, 1 H), 4,07-4,22(m, 3 H), 4,23-4,38 (m, 1 H), 4,58-4,67 (m, 1 H), 5,04-5,17 (m, 2 H), 5,18-5,34 (m, 2 H), 5,65-5,94 (m, 3 H), 7,07-7,28(m, 3 H), 7,82-7,92 (m, 1 H), 7,96-8,13 (m, 1 H). CL-EM (Procedimiento B, tiempo de retención: 1,75 min), EM m/z 681 (M++1).
Etapa 26G: Preparación de éster etílico del ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(6-metoxi-isoquinolin-1iloxi)-2,15-dioxo-10-oxa-3,16-di-aza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4 carboxílico
Una solución de éster etílico del ácido 1-{[1-(5-aliloxi-2-terc-butoxicarbonilamino-pentanoil)-4-(6-metoxi-isoquinolin-1iloxi)-pirrolidina-2-carbonil]-amino}-2-vinilciclopropanocarboxílico (el producto de la etapa 26F, 2,0 g, 2,94 mmol) en 800 ml de benceno se trató con catalizador de Grubb de segunda generación (375 mg, 0,44 mmol). La mezcla dereacción se calentó a 50 ºC, se agitó en una atmósfera de N2 durante 2 h y después se concentró al vacío. Lacromatografía ultrarrápida (gel de sílice, acetato de etilo al 25-100 %/hexano) y el tratamiento con carbono activadodieron 677,6 mg (~35 %) de éster etílico del ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(6-metoxi-isoquinolin-1-iloxi)-2,15dioxo-10-oxa-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico en forma de una espuma colapsada de color pardo: 1H RMN (500 MHz, METANOL-D4) 5 1,06-1,30 (m, 12 H), 1,51-2,03 (m, 6 H), 2,41-2,70 (m, 3 H), 3,39-3,50(m, 1 H), 3,51-3,61 (m, 1 H), 3,77-3,87 (m, 1 H), 3,92 (s, 3 H), 4,02-4,18 (m, 3 H), 4,24 (d, J = 6,41 Hz, 1 H), 4,364,48 (m, 1 H), 4,55 (d, J = 11,29 Hz, 1 H), 4,65 (t, J = 8,39 Hz, 1 H), 5,55-5,72 (m, 2 H), 5,85 (s, 1 H), 7,08 (d, J = 8,85 Hz, 1 H), 7,17 (s, 1 H), 7,24 (d, J = 5,80 Hz, 1 H), 7,89 (d, J = 5,80 Hz, 1 H), 8,16 (d, J = 9,16 Hz, 1 H). CL-EM (Procedimiento B, tiempo de retención: 1,58 min), EM m/z 653 (M++1).
Etapa 26H. Preparación del Compuesto 27, ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(6-metoxi-isoquinolin-1iloxi)-2,15-dioxo-10-oxa-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico
A una solución de éster etílico del ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(6-metoxi-isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-10oxa-3,16-di-aza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico (el producto de la etapa 26G, 667 mg, 1,02 mmol) en25,7 ml de THF se le añadieron 2,9 ml de agua, 11,4 ml de metanol e hidróxido de litio en polvo (489 mg, 20,4
5 mmol). La mezcla de reacción se agitó a ta durante 6 h y después se concentró al vacío. El residuo se repartió entre acetato de etilo y 20,4 ml de HCl ac. 1 N. A la solución resultante se le añadió tampón a pH 4 (biftalato). La faseorgánica se lavó con agua y NaCl ac. sat., se secó (MgSO4) y se concentró al vacío para dar el producto en bruto. Lacromatografía ultrarrápida (gel de sílice, metanol al 0-10 %/cloroformo) dio 446 mg (~70 %) de ácido 14-tercbutoxicarbonilamino-18-(6-metoxi-isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-10-oxa-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno
10 4-carboxílico en forma de una espuma colapsada de color ligeramente rosa: 1H RMN (500 MHz, METANOL-D4) 5 0,99-1,16 (m, 1 H), 1,22 (s, 9 H), 1,50-2,04 (m, 6 H), 2,40-2,73 (m, 3 H), 3,41-3,50 (m, 1 H), 3,51-3,62 (m, 1 H), 3,733,86 (m, 1 H), 3,90 (s, 3 H), 4,03 (d, J = 10,52 Hz, 1 H), 4,21 (d, J = 8,31 Hz, 1 H), 4,42-4,72 (m, 3 H), 5,65 (s, 2 H), 5,82 (s, 1 H), 7,06 (d, J = 9,05 Hz, 1 H), 7,15 (s, 1 H), 7,22 (d, J = 5,87 Hz, 1 H), 7,87 (m, J = 9,29 Hz, 2 H), 8:14 (d, J = 8,56 Hz, 1 H). CL-EM (Procedimiento B, tiempo de retención: 1,46 min), EM m/z 625 (M++1).
15 Etapa 26I. Preparación del Compuesto 28, éster terc-butílico del ácido [4-ciclopropanosulfonilaminocarbonil18-(6-metoxi-isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-10-oxa-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il]carbámico
Una solución de ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(6-metoxi-isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-10-oxa-3,16-diaza
20 triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico (el producto de la etapa 26H, 146,5 mg, 0,235 mmol) ycarbonildiimidazol (76 mg, 0,47 mmol) en 5 ml de THF se agitó a la temperatura de reflujo en una atmósfera de N2 durante 2 h y después se dejó volver a la ta. A la mezcla de reacción se le añadieron amida del ácido ciclopropanosulfónico (86 mg, 0,71 mmol) y 1,8-diazabiciclo[5,4,0]undec
7-eno (81 µl, 0,54 mmol). La mezcla de reacción se agitó a ta en una atmósfera de N2 durante 4 h y después se
25 inactivó con tampón a pH 4 (biftalato). La mezcla resultante se extrajo con EtOAc. La fase orgánica se lavó con NaCl ac. sat., se secó (MgSO4) y se concentró al vacío para dar el producto en bruto. La cromatografía ultrarrápida (gel de sílice, metanol al 0-8 %/cloroformo) dio 111,7 mg (~65 %) de éster terc-butílico del ácido [4ciclopropanosulfonilaminocarbonil-18-(6-metoxi-isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-10-oxa-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico (compuesto 27) en forma de un polvo de color blanco: 1H RMN
30 (500 MHz, METANOL-D4) 5 0,96-1,17 (m, 6 H), 1,20 (s, 9 H), 1,24-1,32 (m, 1 H), 1,49-1,64 (m, 2 H), 1,65-1,79 (m, 2 H), 1,79-2,06 (m, 2 H), 2,45-2,60 (m, 1 H), 2,62-2,76 (m, 2 H), 2,86-2,98 (m, 1 H), 3,47-3,61 (m, 2 H), 3,62-3,73 (m, 1 H), 3,92 (s, 3 H), 4,00 (d, J = 10,38 Hz, 1 H), 4,18 (d, J = 10,99 Hz, 1 H), 4,55-4,72 (m, 3 H), 5,44 (t, J = 9,92 Hz, 1 H), 5,69-5,78 (m, 1 H), 5,86 (s, 1 H), 7,07 (d, J = 7,02 Hz, 1 H), 7,17 (s, 1 H), 7,24 (d, J = 5,80 Hz, 1 H), 7,85-7,95 (m, 2 H), 8,18 (d, J = 8,85 Hz, 1 H). CL-EM (Procedimiento B, tiempo de retención: 1,52 min), EM m/z 728 (M++1).
Preparación del Compuesto 61
La preparación del Compuesto 61 se realizó como se ha mostrado en el esquema anterior y usando los procedimientos que se indican a continuación:
Preparación de Ejemplo 28:
El Ejemplo 28 se preparó añadiendo una solución en DMF de treonina protegida con N-tritilo a una solución en DMF
10 de hidruro sódico enfriada a -15 ºC. La mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos a -15 ºC, después de lo cual se añadió 5-bromo-1-penteno y la mezcla resultante se calentó a -5 ºC. La mezcla de reacción se mantuvo a -5 Cdurante 3 días, tiempo después del cual la reacción se interrumpió mediante la adición de HCl acuoso 1 N y se trató usando procedimientos de extracción convencionales como se ha descrito anteriormente. El Ejemplo 28 se obtuvoen forma pura por procedimientos de cromatografía convencionales.
15 Preparación de Ejemplo 29
El Ejemplo 29 se preparó por acoplamiento del Ejemplo 28 con el Ejemplo 22 como se muestra en el esquemausando el procedimiento general descrito anteriormente para la preparación de Compuestos y Ejemplos relacionados estructuralmente.
Preparación de Ejemplo 30
El Ejemplo 30 se preparó a partir del Ejemplo 29 como se muestra en el esquema usando procedimientos descritosanteriormente para la preparación de Compuestos y Ejemplos relacionados estructuralmente.
5 Preparación de Ejemplo 31
El Ejemplo 31 se preparó a partir del Ejemplo 30 como se muestra en el esquema. En este caso, se disolvieron 100mg del Ejemplo 30 se en 2 ml de DCM y la solución resultante se trató con 82 microlitros de una solución 4:1 deagua y ácido trifluoroacético. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante varias horas, despuésde lo cual la mezcla de reacción se concentró y la mezcla del producto en bruto resultante se purificó por
10 cromatografía para proporcionar el Ejemplo 31.
Preparación del Compuesto 61
El Compuesto 61 se preparó a partir del Ejemplo 31 como se muestra en el esquema y usando procedimientos descritos anteriormente para la preparación de Compuestos y Ejemplos relacionados.
Preparación del Compuesto 62, el Compuesto 66 y el Compuesto 70
El Compuesto 62 se preparó a partir del Compuesto 61 como se muestra en el esquema, y usando los procedimientos descritos anteriormente para la preparación de Compuestos y Ejemplos relacionados.
Preparación de Compuestos 63, 64, 65, Compuestos 67, 68, 69, Compuestos 71, 72, 73
Los compuestos 63, 64, 65, 67, 68, 69, 71, 72 y 73 se prepararon como se ha mostrado en el esquema de Síntesisanterior, y usando procedimientos descritos en este documento para la síntesis de Ejemplos y Compuestos relacionados.
Etapa 36A: Preparación de N-t-butoxicarbonil-3-(4-penteniltio)-L-valina, éster metílico
A una solución de 7,12 g (48 mmol, 1,0 equiv.) de L-penicilamina en 100 ml de 1,4-dioxano y 25 ml de agua a temperatura ambiente se le añadieron 9,60 ml (96 mmol, 2,0 equiv.) de una solución acuosa 10 N de hidróxidosódico, seguido de la adición gota a gota de 12,00 ml (101 mmol, 2,1 equiv.) de 5-bromo-1-penteno durante unosminutos. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 68 horas. En este punto, se añadieron 12,50 g (57 mmol, 1,2 equiv.) de dicarbonato de di-terc-butilo y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 6 horasmás. La mezcla se concentró al vacío y el residuo se disolvió en agua. La mezcla acuosa se lavó con éter dietílico,se ajustó a pH 3 empleando ácido clorhídrico 1 N y después se extrajo con acetato de etilo. Los extractos combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtraron y se concentraronal vacío.
El producto en bruto (12,20 g) se disolvió en 120 ml de dimetilsulfóxido anhidro. A esta solución se le añadieron10,50 g (76 mmol) de carbonato potásico y 4,70 ml (76 mmol) de yodometano y la mezcla resultante se agitó atemperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla de reacción se diluyó con agua y se extrajo con acetato de etilo.Los extractos combinados se lavaron con agua (2 x) y salmuera, se secaron sobre sulfato sódico anhidro, se filtrarony se concentraron al vacío. La cromatografía en columna sobre gel de sílice (elución: acetato de etilo al 2-10 %/hexano) proporcionó 8,54 g de N-terc-butoxicarbonil-3-(4-penteniltio)-L-valina, éster metílico en forma de un aceiteincoloro. RMN (300 MHz, CDCl3): 5 5,76 (d de d de t, 1 H, J = 17,2, 10,3, 6,6 Hz), 5,35 (d a, 1 H, J = 9,0 Hz), 5,054,94 (m, 2 H), 4,27 (d a, 1 H, J = 9,0 Hz), 3,73 (s, 3 H), 2,52 (m, 2 H), 2,13 (cuadr., 2 H, J = 7,3 Hz), 1,61 (quint., 2 H, J = 7,3 Hz), 1,43 (s, 9 H), 1,35 (s, 3 H), 1,33 (s, 3 H).
Etapa 36B: Preparación de N-terc-butoxicarbonil-3-(4-penteniltio)-L-valina
A una solución de 8,52 g (25,7 mmol) de N-terc-butoxicarbonil-3-(4-penteniltio)-L-valina, éster metílico en 200 ml detetrahidrofurano a temperatura ambiente se le añadió una solución de 1,10 g (26,2 mmol) de hidróxido de litiomonohidrato en 50 ml de agua. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 65 horas. Después, ala mezcla de reacción se le añadieron 28 ml de ácido clorhídrico 1,00 N. La mezcla se diluyó con éter dietílico, se lavó con agua (3 x) y salmuera, se secó sobre sulfato sódico anhidro, se filtró y se concentró al vacío para producir8,10 g de N-terc-butoxicarbonil-3-(4-penteniltio)-L-valina en forma de un aceite incoloro. RMN (300 MHz, CDCl3): 5 5,75 (d de d de t, 1 H, J = 17,2, 10,3, 6,6 Hz), 5,40 (s a, 1 H), 5,05-4,94 (m, 2 H), 4,28 (s a, 1 H), 2,56 (m, 2 H), 2,13 (cuadr., 2 H, J = 7,3 Hz), 1,63 (quint., 2 H, J = 7,3 Hz), 1,44 (s, 9 H), 1,39 (s, 3 H), 1,37 (s, 3 H).
Etapa 36C: Preparación de ácido (1S, 4R, 6S, 14R, 18R)-7-cis-14-terc-butoxicarbonilamino-13,13-dimetil-18-(6metoxi-isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-12-tia-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico (Compuesto 79)
Este compuesto se preparó a partir de N-terc-butoxicarbonil-3-(4-penteniltio)-L-valina empleando los procedimientosdescritos en el ejemplo 24. ESI-espectro de masas: m/e: 669 (M+H)+, 667 (M-H)-; espectro de masas de alta resolución: calc. para C34H45N4O8S: 669,2958, encontrado: 669,2975; RMN (500 MHz, CD3OD 5 8,06 (d, 1 H, J = 8,8 Hz), 7,90 (d, 1 H, J = 5,8 Hz), 7,24 (d, 1 H, J = 5,8 Hz), 7,16 (s, 1 H), 7,09 (d, 1 H, J = 8,8 Hz), 6,69 (d, 1 H, J = 8,5
5 Hz), 5,80 (s, 1 H), 5,72 (cuadr., 1 H, J = 8,5 Hz), 5,46 (t, 1 H, J = 8,5 Hz), 4,71 (t, 1 H, J = 8,5 Hz), 4,64 (d, 1 H, J = 9,1 Hz), 4,45 (d, 1 H, J = 11,6 Hz), 4,22 (m, 1 H), 3,91 (s, 3 H), 2,78 (m, 1 H), 2,74-2,68 (m, 2 H), 2,56 (m, 1 H), 2,362,28 (m, 2 H), 2,21 (m, 1 H), 1,75 (m, 1 H), 1,72-1,64 (m, 2 H), 1,60 (m, 1 H), 1,45 (s, 3 H), 1,39 (s, 3 H), 1,21 (s, 9H).
Etapa 36D: Preparación de ácido (1S, 4R, 6S, 14R, 18R)- [7-cis-4-ciclopropanosulfonilaminocarbonil-13,13
10 dimetil-18-(6-metoxiisoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-12-tia-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14il]carbámico, éster terc-butílico (Compuesto 80)
Este compuesto se preparó a partir del compuesto 79 empleando el procedimiento descrito en el ejemplo 24D. ESIespectro de masas: m/e: 772 (M+H)+, 770 (M-H)-; espectro de masas de alta resolución: calc. para C37H50N5O6S2:
15 772,3050, encontrado: 772,3060; RMN (500 MHz, CD3OD) 5 8,06 (d, 1 H, J = 8,8 Hz), 7,90 (d, 1 H, J = 5,8 Hz), 7,24 (d, 1 H, J = 5,8 Hz), 7,17 (s 1 H), 7,08 (d, 1 H, J = 8,8 Hz), 6,62 (d, 1 H, J = 8,5 Hz), 5,83 (s, 1 H), 5,74 (cuadr., 1 H, J = 8,5 Hz), 5,26 (t, 1 H, J = 8,5 Hz), 4,67 (m, 1 H), 4,46 (m, 2H), 4,19 (m, 1 H), 3,92 (s, 3 H), 2,93 (m, 1 H), 2,74-2,67(m, 3 H), 2,58-2,48 (m, 3 H), 2,11 (m, 1 H), 1,82-1,75 (m, 2 H), 1,61 (m, 1 H), 1,54 (m, 1 H), 1,45 (s, 3 H), 1,37 (s, 3H), 1,27 (m, 1 H), 1,18 (s, 9 H), 1,09 (m, 1 H), 1,07-0,99 (m, 2 H).
20 Ejemplo 37: Preparación del Compuesto 84 y Compuesto 85
Etapa 37A: Preparación de N-terc-butoxicarbonil-O-(4-pentenil)-L-serina, éster metílico
A una solución de 10,26 g (50 mmol, 1,0 equiv.) de N-terc-butoxicarbonil-L-serina en 500 ml de dimetilsulfóxidoanhidro a temperatura ambiente se le añadieron 2,00 g (50 mmol, 1,0 equiv.) de hidruro sódico al 60 % en aceitemineral. Esta mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 0,5 horas hasta que cesó el desprendimiento de gas.A la solución resultante se le añadieron 6,00 ml (50 mmol, 1,0 equiv.) de 5-bromo-1-penteno seguido inmediatamente de 2,00 g más (50 mmol, 1,0 equiv.) de hidruro sódico al 60 % en aceite mineral. Después, lamezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla se diluyó con 2000 ml de agua, seajustó a pH 3-4 mediante la adición de 50 ml de ácido clorhídrico 1,00 N y se extrajo con acetato de etilo. La faseorgánica se lavó con agua (2 x) y salmuera, se secó sobre sulfato sódico anhidro, se filtró y se concentró al vacío.Para retirar el aceite mineral residual, el material de partida se disolvió en una solución acuosa diluida de hidróxido sódico. Esta solución acuosa se lavó con hexano y después se ajustó a pH 4 empleando ácido clorhídrico y se extrajo con acetato de etilo. El extracto se lavó con agua (2 x) y salmuera, se secó sobre sulfato sódico anhidro, sefiltró y se concentró al vacío.
El producto en bruto (7,70 g) se disolvió en 100 ml de dimetilsulfóxido anhidro. A esta solución se le añadieron 7,80g (56 mmol) de carbonato potásico y 3,50 ml (56 mmol) de yodometano y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla de reacción se diluyó con agua y se extrajo con acetato de etilo. Losextractos combinados se lavaron con agua (2 x) y salmuera, se secaron sobre sulfato sódico anhidro, se filtraron yse concentraron al vacío. La cromatografía en columna sobre gel de sílice (elución: acetato de etilo al 2-10%/hexano) proporcionó 6,70 g de N-terc-butoxicarbonil-O-(4-pentenil)-L-serina, éster metílico en forma de un aceiteincoloro. RMN (300 MHz, CDCl3): 5 5,78 (d de d de t, 1 H, J = 17,2, 10,2, 6,6 Hz), 5,34 (d a, 1 H, J = 8,0 Hz), 5,034,92 (m, 2 H), 4,40 (m, 1 H), 3,81 (d de d, 1 H, J = 9,5, 2,9 Hz), 3,74 (s, 3 H), 3,61 (d de d, 1 H, J = 9,5, 3,5 Hz), 3,42 (m, 2 H), 2,06 (cuadr., 2 H, J = 7,3 Hz), 1,61 (quint., 2 H, J = 7,3 Hz), 1,44 (s, 9 H).
Etapa 37B: Preparación de N-terc-butoxicarbonil-O-(4-pentenil)-L-serina
A una solución de 6,65 g (23 mmol) de N-terc-butoxicarbonil-O-(4-pentenil)-L-serina, éster metílico en 500 ml de tetrahidrofurano a temperatura ambiente se le añadió una solución de 1,95 g (46 mmol) de hidróxido de litiomonohidrato en 100 ml de agua. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 40 horas. Después,a la mezcla de reacción se le añadieron 46 ml de ácido clorhídrico 1,00 N. La mezcla se diluyó con acetato de etilo,se lavó con agua (3 x) y salmuera, se secó sobre sulfato sódico anhidro, se filtró y se concentró al vacío paraproducir 6,30 g de N-terc-butoxicarbonil-O-(4-pentenil)-L-serina en forma de un aceite incoloro. RMN (300 MHz, CDCl3): 5 5,77 (d de d de t, 1H, J = 17,2, 10,2, 6,6 Hz), 5,37 (d a, 1 H, J = 8,0 Hz), 5,03-4,92 (m, 2 H), 4,42 (m, 1 H), 3,87 (d de d, 1 H, J = 9,5, 2,6 Hz), 3,63 (d de d, 1 H, J = 9,5, 4,0 Hz), 3,45 (t, 2 H, J = 6,6 Hz), 2,07 (cuadr., 2 H, J = 7,3 Hz), 1,64 (quint., 2 H, J = 7,3 Hz), 1,44 (s, 9 H).
Etapa 37C: Preparación de ácido (1S, 4R, 6S, 14S, 18R)-7-cis-14-terc-butoxicarbonilamino-18-(6metoxiisoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-12-oxa-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]-nonadec-7-eno-4-carboxílico (Compuesto 84)
Este compuesto se preparó a partir de N-terc-butoxicarbonil-3-(4-penteniltio)-L-valina empleando los procedimientosdescritos en el ejemplo 26. ESI-espectro de masas: m/e: 625 (M+H)+, 623 (M-H)-; espectro de masas de alta resolución: calc. para C32H41N4O9: 625,2874, encontrado: 625,2871; RMN (500 MHz, CD3OD) 5 8,12 (d, 1 H, J = 9,0
5 Hz), 7,89 (d, 1 H, J = 5,8 Hz), 7,24 (d, 1 H, J = 5,8 Hz), 7,17 (s, 1 H), 7,12 (d, 1 H, J = 9,0 Hz), 5,83 (s, 1 H), 5,63 (cuadr., 1 H, J = 8,8 Hz), 5,45 (t, 1 H, J = 8,8 Hz), 4,74 (m, 1 H), 4,60 (s a, 1 H), 4,36 (d, 1 H, J = 11,0 Hz), 4,16 (d, 1 H, J = 8,0 Hz), 3,91 (s, 3 H), 3,74 (m, 2 H), 3,62 (m, 1 H), 3,49 (m, 1 H), 2,66 (m, 1 H), 2,57 (m, 1 H), 2,47-2,33 (m, 2H), 2,19 (m, 1 H), 1,78 (m, 2 H), 1,69 (m, 1 H), 1,48 (m, 1 H), 1,30 (s, 9 H).
Etapa 37D: Preparación de ácido (1S, 4R, 6S, 14S, 18R)- [7-cis-4-ciclopropanosulfonilaminocarbonil-18-(6
10 metoxi-isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-12-oxa-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico, éster terc-butílico (Compuesto 85)
Este compuesto se preparó a partir del compuesto 84 empleando el procedimiento descrito en el ejemplo 26I. ESIespectro de masas: m/e: 728 (M+H)+, 726 (M-H)-; espectro de masas de alta resolución: calc. para C35H46N5O10S:
15 728,2966, encontrado: 728,2972; RMN (500 MHz, CD3OD) 5 8,12 (m, 1 H), 7,89 (d, 1 H, J = 5,8 Hz), 7,25 (d, 1 H, J = 5,8 Hz), 7,18 (s, 1 H), 7,12 (d, 1 H, J = 8,0 Hz), 5,89 (s, 1 H), 5,66 (cuadr., 1 H, J = 8,8 Hz), 5,19 (t, 1 H, J = 8,8 Hz), 4,71 (m, 1 H), 4,52 (s a, 1 H), 4,36 (d, 1 H, J = 10,0 Hz), 4,12 (m, 1 H), 3,92 (s, 3 H), 3,65 (m, 2 H), 3,47 (m, 2 H),2,92 (m, 1 H), 2,64 (m, 1 H), 2,56 (m, 1 H), 2,45 (m, 2 H), 2,19 (m, 1 H), 1,77 (m, 1 H), 1,70-1,60 (m, 2 H), 1,54 (m, 1H), 1,28 (s, 9 H), 1,15-0,98 (m, 4 H).
20 Ejemplo 38: Preparación del Compuesto 58: Etapa 38a: Preparación de éster etílico del ácido 1-{[1-(2-terc-butoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4-(terc-butildimetil-silaniloxi)-pirrolidina-2-carbonil]-amino}-2-vinilciclopropanocarboxílico
A una mezcla de éster etílico del ácido 1-{[1-(2(S)-terc-butoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4(R)-hidroxipirrolidina2(S)carbonil]-(1R)-amino}-2(S)-vinil-ciclopropanocarboxílico (1,5 g, 2,87 mmol) en 10 ml de DMF se le añadieronimidazol (0,25 g, 3,67 mmol) y cloruro de terc-butil-dimetilsililo (516 mg, 3,44 mmol). La mezcla se agitó a ta durante
5 dos días. Después, la mezcla de reacción se concentró al vacío y el residuo se disolvió en acetato de etilo. Esta solución se lavó con agua, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró al vacío para obtener un sólido enbruto. La purificación por cromatografía ultrarrápida (eluyendo con acetato de etilo al 20 % en hexano) dio 1,43 g (78%) de éster etílico del ácido 1-{[1-(2-terc-butoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4-(terc-butildimetil-silaniloxi)-pirrolidina-2carbonil]-amino}-2-vinilciclopropanocarboxílico en forma de un sólido de color blanco.
10 1H RMN (300 MHz, CD3OD) 5 0,10 (s,6 H), 0,89 (s, 9 H), 1,22 (m, 3 H), 1,31-1,48 (m, 16 H), 1,50-1,75 (m, 3 H), 2,06 (m, 3 H), 2,11-2,33 (m, 2 H), 3,70 (m, 2 H), 4,03-4,19 (m, 2 H), 4,21 (m, 1 H), 4,45 (t, J = 7,87 Hz, 1 H), 4,59 (m, 1 H), 4,91 (d, J = 9,15 Hz, 1 H), 4,98 (d, J = 17,20 Hz, 1 H), 5,08 (dd, J = 10,25, 1,83 Hz, 1 H), 5,27 (dd, J = 17,38, 1,65 Hz, 1 H), 5,65-5,87 (m, 2 H). CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 4,00 min), EM m/z 636 (M++1).
Etapa 38b: Preparación de ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-2,15-dioxo-3,1615 diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico, éster etílico
A una solución de éster etílico del ácido 1-{[1-(2-terc-butoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4-(terc-butildimetil-silaniloxi)pirrolidina-2-carbonil]-amino}-2-vinilciclopropanocarboxílico (1,63 g, 2,56 mmol) en 640 ml de cloruro de metileno sele añadieron 215 mg (0,26 mmol) de dicloruro de triciclohexilfosfina[1,3-bis(2,4,6-tri[bencilideno]rutenio (IV). La20 mezcla se calentó a reflujo durante 15 min. El residuo se concentró al vacío y después se purificó por cromatografía ultrarrápida eluyendo con acetato de etilo al 30 %/hexano. Para decolorar adicionalmente la muestra, el producto enbruto se cromatografió una segunda vez eluyendo con éter al 50 % en hexano para dar 1,5 g (96 %) de éster etílico del ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(terc-butildimetil-silaniloxi)-2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico en forma de un sólido de color blanco. 1H RMN (500 MHz, CD3Cl) 5
25 0,06 (s, 3 H), 0,07 (s, 3 H), 0,86 (s, 9 H), 1,18-1,24 (m, 6 H), 1,34-1,64 (m, 14 H), 1,86-1,96 (m, 3 H), 2,02-2,09 (m, 1 H), 2,11-2,17 (m, 1 H), 2,19-2,28 (m, 1 H), 2,57-2,63 (m, 1 H), 3,50-3,54 (m, 1 H), 3,71 (dd, J = 10,22, 6,26 Hz, 1 H), 4,06-4,17 (m, 2 H), 4,52-4,58 (m, 2 H), 4,75 (d, J = 8,55 Hz, 1 H), 5,21 (t, J = 9,92 Hz, 1 H), 5,35 (d, J = 7,63 Hz, 1 H), 5,45-5,50 (m, 1 H), 6,94 (s,1 H). CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 3,88 min), EM m/z 608 (M++1).
Etapa 38c: Preparación de ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-2,15-dioxo-3,1630 diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico
A una solución de éster etílico del ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-2,15-dioxo-3,16diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico (1,5 g, 2,47 mmol) en un sistema disolvente mixto de THF (4ml), metanol (1 ml) y agua (2 ml), se le añadió hidróxido de litio monohidrato en polvo (1,0 g, 50 mmol). La suspensión de color amarillo claro se agitó a ta en una atmósfera de N2 durante 4 h. Después, la mezcla se concentró al vacío y el residuo se repartió entre éter y agua. La fase de éter se desechó y la fase acuosa se trató con HCl 1 N hasta que alcanzó pH 4. Esta solución ácida se extrajo con EtOAc (3 x). Los extractos de EtOAccombinados se secaron (MgSO4) y se concentraron al vacío para dar 1,2 g (84 %) de ácido 14-tercbutoxicarbonilamino-18-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4carboxílico en forma de un sólido de color blanquecino. 1H RMN (300 MHz, CD3OD) 0,12 (s, 6 H), 0,89 (s, 9 H), 1,231,64 (m, 17 H), 1,70-1,87 (m, 1 H), 1,90-2,49 (m, 6 H), 3,70-3,80 (m,1 H), 3,83-3,90 (m, 1 H), 4,28-4,36 (m, 1 H),4,47-4,55 (m, 1 H), 4,65 (s, 1 H), 5,30-5,39 (m, 1 H), 5,53-5,62 (m, 1 H). CL-EM (Procedimiento A, tiempo deretención: 3,69 min), EM m/z 580 (M++1).
Etapa 38d: Preparación de éster terc-butílico del ácido [18-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-4ciclopropanosulfonilaminocarbonil-2,15-dioxo-3,16-di-azatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico
Se disolvió ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico (500 mg, 0,86 mmol) en 25 ml de THF y se trató con CDI (180 mg,1,12 mmol). (Debe tenerse cuidado para evitar la humedad usando cristalería secada al horno y manteniendo unaatmósfera de N2 seca). Después de calentar a reflujo la mezcla de reacción durante 2 h, se enfrió a ta y se trató secuencialmente con ciclopropilsulfonamida (135 mg, 1,12 mmol) y DBU (170 mg, 1,12 mmol). La mezcla dereacción se agitó durante 4 h a ta y el THF se retiró por evaporación rotatoria. El residuo se repartió entre acetato deetilo y tampón a pH 4. La fase orgánica se secó (MgSO4) y se concentró al vacío para dar el producto en bruto.Después, se purificó por cromatografía ultrarrápida (eluyendo con acetato de etilo al 33 % en hexano) para dar 300 mg (5 1 %) de éster terc-butílico del ácido [18-(terc-butildimetil-silaniloxi)-4-ciclopropanosulfonilaminocarbonil-2,15dioxo-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico en forma de un sólido de color blanco. 1H RMN (300 MHz, CD3OD) 5 1H 0,07 (s, 3 H), 0,08 (s, 3 H), 0,85 (s, 9 H), 0,87-1,49 (m, 21 H), 1,73-1,95 (m, 3 H), 2,08-2,16(m, 1 H), 2,25-2,36 (m, 2 H), 2,42-2,56 (m, 1 H), 2,85-2,93 (m, 1 H), 3,65-3,74(dd, J = 10,61, 3,66 Hz, 1 H), 3,89 (d, J = 10,25 Hz, 1 H), 4,34 (m, J = 9,70, 9,70 Hz, 1 H), 4,43 (t, J = 7,87 Hz, 1 H), 4,57 (s, 1 H), 4,94-5,01 (m, 1 H), 5,10 (d, J = 8,78 Hz, 1 H), 5,66-5,75 (m, 1 H), 6,55 (s, 1 H), 10,13 (s, 1 H). CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 3,81 min), EM m/z 683 (M++1).
Etapa 38e: éster terc-butílico del ácido (4-ciclopropanosulfonilaminocarbonil-18-hidroxi-2,15-dioxo-3,16diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il)-carbámico
A una mezcla de éster terc-butílico del ácido [18-(terc-butil-dimetilsilaniloxi)-4-ciclopropanosulfonilaminocarbonil2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico (330 mg, 0,48 mmol) en 25 ml de THF se leañadió fluoruro de tetrabutilamonio (150 mg, 0,54 mmol). La mezcla de reacción se agitó a ta durante 18 h y5 después the THF se retiró por evaporación rotatoria. El residuo se repartió entre acetato de etilo y agua. La fase orgánica se secó (MgSO4) y se concentró al vacío para dar el producto en bruto. Después, se purificó por trituracióncon hexano para producir 200 mg (73 %) de éster terc-butílico del ácido (4-ciclopropanosulfonilaminocarbonil-18hidroxi-2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il)-carbámico en forma de un sólido de color blanco. 1H RMN (500 MHz, CD3Cl) 5 1,87-1,64 (m, 21 H), 1,70-1,98 (m, 3 H), 2,15-2,56 (m, 5 H), 2,85-2,94 (m, 1 H), 3,71 (d,
10 J = 13,91 Hz, 1 H), 4,10-4,26 (m, 2 H), 4,51 (t, J = 7,87 Hz, 1 H), 4,62 (s, 1 H), 4,98 (m, 1 H), 5,06 (d, J = 8,78 Hz, 1 H), 5,64-5,71 (m, 1 H), 6,72 (s, 1 H), 10,24 (s, 1 H). CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 2,85 min), EMm/z 569 (M++1).
Etapa 38f: Preparación del Compuesto 58: éster terc-butílico del ácido [(Z)-(1S,4R,14S,18R)-4ciclopropanosulfonilaminocarbonil-2,15-dioxo-18-(3-fenil-isoquinolin-1-iloxi) 3,16-diaza
15 triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico
A una mezcla de éster terc-butílico del ácido (4-ciclopropanosulfonilaminocarbonil-18-hidroxi-2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il)-carbámico (20 mg, 0,035 mmol) en 1 ml de DMF se le añadió t-butóxido potásico (22 mg, 0,196 mmol). La mezcla se agitó a ta durante 5 min y después se añadió 1-cloro-3-fenilisoquinolina
20 (15 mg, 0,062 mmol). La mezcla de reacción se agitó a ta durante 15 h y después se concentró al vacío. Este producto en bruto se trituró con éter. El residuo se disolvió en MeOH y después se purificó por HPLC preparativa.(YMC XTERRA, S5, 19 x 100 mm, gradiente: de 60 % de B a 100 % de B, 15 min, mantenido 2 min, caudal 25ml/min) para dar 10 mg (39 %) del Compuesto 58, éster terc-butílico del ácido [(Z)-(1S,4R,14S,18R)-4ciclopropanosulfonilaminocarbonil-2,15-dioxo-18-(3-fenilisoquinolin-1-iloxi)-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7
25 en-14-il]-carbámico, en forma de un sólido de color blanco. 1H RMN (500 MHz, CD3Cl) 5 0,90-1,64 (m, 21 H), 1,761,97 (m, 3 H), 2,26-2,31 (m, 1 H), 2,52-2,63 (s a, 1 H), 2,69-2,81 (m, 2 H), 2,88-2,93 (m, 1 H), 4,11 (d, J = 11,60 Hz, 1 H), 4,33 (m, 1 H), 4,61 (d, J = 7,94 Hz, 2 H), 4,99 (t, J = 9,31 Hz, 1 H), 5,05 (d, J = 7,93 Hz, 1 H), 5,69-5,74 (m, 1 H), 6,08 (s, 1 H), 6,60 (s, 1 H), 7,38-7,47(m, 2 H), 7,50 (t, J = 7,63 Hz, 2 H), 7,63 (t, J = 7,32 Hz, 1 H), 7,71 (s, 1 H), 7,77 (d, J = 8,24 Hz, 1 H), 8,10 (d, J = 7,32 Hz, 2 H), 8,18 (d, J = 7,93 Hz, 1 H), 10,27 (s, 1 H). CL-EM
30 (Procedimiento A, tiempo de retención: 3,72 min), EM m/z 772 (M++1).
Ejemplo 39: Preparación de los Compuestos 144 y 145 Etapa 39a: Preparación de ácido (S)-2-(terc-butoxicarbonil)-3-(2-nitro-N-(pent-4enil)fenilsulfonamido)propanoico v
5 Preparación de 3-amino-2-(terc-butoxicarbonil)propanoato de (S)-metilo ii:
A una mezcla de i (Boc-DAP-OH)(3,0 g 14,7 mmol) en 50 ml de cloruro de metileno se le añadieron 5 ml de metanol.A esta solución se le añadió lentamente (trimetilsilil)diazometano (2 M en éter, 7,9 ml, 15,8 mmol). La mezcla se agitó a ta durante 2 h hasta que se disolvió todo el sólido y la solución se volvió de color amarillo claro. Después, seconcentró para producir 3,2 g (99 %) de 3-amino-2-(terc-butoxicarbonil)propanoato de (S)-metilo ii en forma de un
10 aceite incoloro. 1H RMN (CD3OD, 300 MHz) 5 1,46 (s, 9 H), 2,82-3,00 (m, 2 H), 3,71 (s, 3 H), 4,14 (s a, 1 H).
Preparación de 2-(terc-butoxicarbonil)-3-(2-nitrofenilsulfonamido)propanoato de (S)-metilo iii:
A una mezcla de 3-amino-2-(terc-butoxicarbonil)propanoato de (S)-metilo ii (1,6 g, 7,3 mmol) en DCM (50 ml) se leañadieron DIPEA (1,64 ml, 9,4 mmol) y cloruro de 2-nitrobenceno sulfonilo (1,62 g, 7,3 mmol). La mezcla se agitó ata durante 2 h. Después, se concentró, se disolvió en acetato de etilo, que se lavó después con bicarbonato sódico
15 sat. y salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después, se filtró y se concentró para producir 2,9 g (98 %) de 2-(terc-butoxicarbonil)-3-(2-nitrofenilsulfonamido)propanoato de (S)-metilo iii en forma de una espuma de color amarillo. 1H RMN (CD3OD, 300 MHz) 5 1,41 (s, 9 H), 3,36-3,51 (m, 2 H), 3,71 (s, 3 H), 4,22 (m, 1 H), 7,80-7,90 (m, 3 H), 8,07-8,10 (m, 1 H).
Preparación de 2-(terc-butoxicarbonil)-3-(2-nitro-N-(pent-4-enil)fenilsulfonamido)propanoato de (S)-metilo iv:
20 A una mezcla de 2-(terc-butoxicarbonil)-3-(2-nitrofenilsulfonamido)-propanoato de (S)-metilo iii (150 mg, 0,37 mmol) en 3 ml de DMF se le añadió carbonato potásico (102 mg, 0,74 mmol). Esta mezcla se agitó a ta durante 20 minseguido de la adición de 5-bromo-1-penteno (65 µl, 0,55 mmol). La mezcla de reacción se agitó a ta durante 2 días.Después, se filtró, se concentró y se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (eluyendo con 25 % acetato deetilo en hexano) para dar 75 mg (43 %) de 2-(terc-butoxicarbonil)-3-(2-nitro-N-(pent-4
25 enil)fenilsulfonamido)propanoato de (S)-metilo iv en forma de un sólido de color amarillo. 1H RMN (CD3OD, 300
MHz) 5 1,42 (s, 9 H), 1,54-1,64 (m, 2 H), 1,97 (c, J = 7,20 Hz, 2 H), 3,37 (m, 2 H), 3,57-3,80 (m, 2 H), 3,72 (s, 3 H), 4,42 (dd, J = 8,60, 5,31 Hz, 1 H), 4,91-5,01 (m, 2 H), 5,69-5,79 (m, 1 H), 7,75-7,85 (m, 3 H), 8,04 (m, 1 H). CL-EM(Procedimiento D, tiempo de retención: 2,68 min), EM m/z 372 (M++1-Boc).
Preparación de ácido (S)-2-(terc-butoxicarbonil)-3-(2-nitro-N-(pent-4-enil)fenilsulfonamido)propanoico v:
Se disolvió 2-(terc-butoxicarbonil)-3-(2-nitro-N-(pent-4-enil)fenilsulfonamido)-propanoato de (S)-metilo iv (500 mg, 1,06 mmol) en el sistema disolvente mixto: THF (4 ml), metanol (1 ml) y agua (2 ml). Se añadió hidróxido de litio enpolvo (250 mg, 10,4 mmol). La suspensión de color amarillo claro se agitó a ta durante 15 h y después se concentróal vacío. El residuo se repartió entre éter y agua. La fase de éter se desechó y la fase acuosa se trató con HCl 1 Nhasta que el pH fue de 4. Esta solución ácida se extrajo cuatro veces con acetato de etilo. Los extractos de acetatode etilo combinados se secaron (MgSO4) y se concentraron al vacío para dar 430 mg (89 %) de ácido (S)-2-(tercbutoxicarbonil)-3-(2-nitro-N-(pent-4-enil)fenilsulfonamido)propanoico v en forma de un aceite de color amarillo. 1H RMN (CD3OD, 300 MHz) 5 1,38 (s, 9 H), 1,51-1,60 (m, 2 H), 1,89-1,98 (m, 2 H), 3,28-3,32 (m, 2 H), 3,59-3,64 (dd, J = 14,95, 9,46 Hz, 1 H), 3,71-3,74 (m, 1 H), 4,33 (dd, J = 9,61, 4,43 Hz, 1 H), 4,87-4,94 (m, 2 H), 5,63-5,72 (m, 1 H), 7,71-7,77 (m, 3 H), 8,01 (dd, J = 7,48, 1,37 Hz, 1 H). CL-EM (Procedimiento D, tiempo de retención: 2,04 min), EM m/z 358 (M++1-Boc).
Etapa 39b: Preparación de 1-((3R,5S)-1-((S)-2-(terc-butoxicarbonil)-3-(2-nitro-N-(pent-4enil)fenilsulfonamido)propanoil)-3-(isoquinolin-1-iloxi)pirrolidina-5-carboxamido)-2vinilciclopropanocarboxilato de (1R,2S)-etilo
Se trató secuencialmente ácido (S)-2-(terc-butoxicarbonil)-3-(2-nitro-N-(pent-4-enil)fenilsulfonamido)propanoico (1,10 g, 2,40 mmol) disuelto en 20 ml de DCM secuencialmente con éster etílico del ácido 1-{[4-(isoquinolin-1-iloxi)pirrolidina-2-carbonil]-amino}-2-vinil-ciclopropanocarboxílico, bis clorhidrato (1,27 g, 2,72 mmol), N-metil morfolina (0,92 ml, 8,34 mmol) y HATU (PE biosystems) (1,28 g, 3,36 mmol). La mezcla de reacción se agitó a ta en unaatmósfera de N2 durante 15 h y después se concentró al vacío. El residuo se repartió entre acetato de etilo y tampóna pH 4 (biftalato). La fase orgánica se lavó con NaHCO3 ac. sat., se secó (MgSO4) y se concentró al vacío para dar 2,0 g del producto en bruto. La cromatografía ultrarrápida (hexano al 30 %/acetato de etilo) dio 1,4 g (70 %) de 1((3R,5S)-1-((S)-2-(terc-butoxicarbonil)-3-(2-nitro-N-(pent-4-enil)fenilsulfonamido)propanoil)-3-(isoquinolin-1iloxi)pirrolidina-5-carboxamido)-2-vinilciclopropanocarboxilato de (1R,2S)-etilo en forma de un sólido de color púrpura 1H RMN (CD3OD, 500 MHz) 5 1,23-1,31 (m, 9 H), 1,46-1,52 (m, 4 H), 1,59 (s a, 1 H), 1,66 (s a, 1 H), 1,74 (dd, J = 7,93, 5,19 Hz, 1 H), 2,00 (s a, 2 H), 2,29 (c, J = 8,95 Hz, 1 H), 2,47 (m, 1 H), 2,72 (m, 1 H), 3,38-3,51 (m, 2 H), 3,68 (m, 2 H), 4,09-4,26 (m, 3 H), 4,37 (d, J = 11,29 Hz, 1 H), 4,64 (m, 1 H), 4,72 (m, 1 H), 4,95 (d, J = 10,99 Hz, 1 H), 4,99 (dd, J = 18,92, 1,53 Hz, 1 H), 5,12 (d, J = 10,68 Hz, 1 H), 5,32 (d, J = 17,40 Hz, 1 H), 5,73-5,86 (m, 2 H), 5,92(s, 1 H), 7,36 (m,1 H), 7,58 (m,1 H), 7,73 (m, 1 H), 7,80-7,88 (m, 4 H), 7,99 (m, 1 H), 8,11 (m,1 H), 8,24 (d, J = 8,24 Hz, 1 H). CL-EM (Procedimiento D, tiempo de retención: 3,15 min), EM m/z 835 (M++1).
Etapa 39c:
Una solución de 1-((3R,5S)-1-((S)-2-(terc-butoxicarbonil)-3-(2-nitro-N-(pent-4-enil)fenilsulfonamido)propanoil)-3(isoquinolin-1-iloxi)pirrolidina-5-carboxamido)-2-vinilciclopropanocarboxilato de (1R,2S)-etilo (1,40 g, 1,67 mmol) ydicloruro de triciclohexilfosfina[1,3-bis(2,4,6-trimetilfenil)-4,5-dihidroimidazol-2-ilideno][bencilideno]rutenio (IV)5 (Aldrich), (204 mg, 0,24 mmol) en 1500 ml de cloruro de metileno se calentó a reflujo en una atmósfera de N2. Poco después de alcanzar la temperatura de reflujo, la mezcla de reacción era homogénea y de color naranja claro.Después de calentar a reflujo durante 2 h, la mezcla de reacción de color naranja oscuro se enfrió a ta y seconcentró al vacío para dar 1,7 g de un aceite de color naranja. La cromatografía ultrarrápida (hexano al 30%/acetato de etilo) dio 1,1 g (82 %) del éster mostrado anteriormente en forma de un sólido de color púrpura. 1H 10 RMN (CD3OD, 300 MHz) 5 1,11-1,31 (m, 12 H), 1,51-1,80 (m, 4 H), 1,97-2,15 (m, 2 H), 2,34-2,50 (m, 2 H), 2,62-2,69 (m, 1 H), 3,17-3,33 (m, 2 H), 3,44-3,60 (m, 2 H), 4,01-4,05 (m, 1 H), 4,12 (c, J = 7,32 Hz, 2 H), 4,37 (d, J = 13,17 Hz, 1 H); 4,58 (t, J = 8,42 Hz, 1 H), 4,71 (m, 1 H), 5,61 (m, 2 H), 5,88 (s, 1 H), 6,91 (d, J = 9,15 Hz, 1 H), 7,30 (d, J = 5,49 Hz, 1 H), 7,52 (t, J = 7,50 Hz, 1 H), 7,66-7,73 (m, 1 H), 7,76-7,80 (m, 4 H), 7,95 (d, J = 5,86 Hz, 1 H), 8,11 (d, J = 7,32 Hz, 1 H), 8,17 (d, J = 8,05 Hz, 1 H), 8,84 (s, 1 H). CL-EM (Procedimiento D, tiempo de retención: 2,91 min), EM
15 m/z 807 (M++1).
Etapa 39d: Preparación del Compuesto 144
El éster etílico preparado en la etapa 39c (1,1 g, 1,3 mmol) se disolvió en el sistema disolvente mixto: THF (16 ml),metanol (4 ml) y agua (8 ml). Se añadió hidróxido de litio hidrato en polvo (540 mg, 13,2 mmol). La suspensión de20 color amarillo claro se agitó a ta durante 15 h y después se concentró al vacío. El residuo se repartió entre éter y agua. La fase de éter se desechó y la fase acuosa se trató con HCl 1 N hasta que el pH fue de 4. Esta soluciónácida se extrajo cuatro veces con acetato de etilo. Los extractos de acetato de etilo combinados se secaron (MgSO4)y se concentraron al vacío para dar 878 mg (85 %) del compuesto 144 en forma de un sólido de color púrpura. 1H RMN (CD3OD, 300 MHz) 5 1,11, 1,31 (s, 9 H), 1,56-1,68 (m, 4 H), 2,04-2,16 (m, 2 H), 2,42-2,66 (m, 2 H), 2,68-2,75
25 (m, 1 H), 3,22-3,30 (m, 2 H), 3,48-3,63 (m, 2 H), 4,02-4,14 (m, 1 H), 4,46 (d, J = 12,44 Hz, 1 H), 4,62 (t, J = 8,42 Hz, 1 H), 4,70-4,73 (m, 1 H), 5,64 (m, 2 H), 5,90 (s, 1 H), 7,36 (d, J = 5,86 Hz, 1 H), 7,57 (t, J = 7,68 Hz, 1 H), 7,71-7,87 (m, 5 H), 7,98 (d, J = 5,86 Hz, 1 H), 8,15 (m, 1 H), 8,22 (d, J = 8,05 Hz, 1 H). CL-EM (Procedimiento D, tiempo de retención: 2,78 min), EM m/z 779 (M++1).
Etapa 39e: Preparación del Compuesto 145
El Compuesto 144 (0,878 g, 1,1 mmol) se disolvió en 15 ml de THF y se trató con CDI (255 mg, 1,58 mmol). (Debetenerse cuidado para evitar la humedad usando cristalería secada al horno y manteniendo una atmósfera de N2 5 seca.) Después de calentar a reflujo la mezcla de reacción durante una hora, se enfrió a ta y se trató secuencialmente con ciclopropilsulfonamida (194 mg, 1,6 mmol) y DBU (245 mg, 1,6 mmol). Después de agitardurante 24 h a ta, el THF se retiró por evaporación rotatoria. El residuo se repartió entre acetato de etilo y tampón apH 4. La fase orgánica se secó (MgSO4) y se concentró al vacío para dar el producto en bruto. La cromatografía ultrarrápida (MeOH al 3 %/cloruro de metileno) dio 0,68 g (70 %) del compuesto 145 en forma de un sólido de color10 blanco. 1H RMN (CD3OD, 300 MHz) 5 1,07-1,37 (m, 13 H), 1,11 (s, 9 H), 1,60-1,78 (m, 4 H), 1,97-2,02 (m, 1 H), 2,28-2,35 (m, 1 H), 2,44-2,51 (m, 1 H), 2,75-2,68 (m, 1 H), 2,75-2,80 (m, 1 H), 2,94-3,00 (m, 1 H), 3,20-3,25 (m, 1 H),3,28-3,47 (m, 2 H), 3,57-3,62 (m, 1 H), 4,05-4,08 (m, 1 H), 4,51 (d, J = 12,21 Hz, 1 H), 4,65-4,68 (m, 1 H), 4,84 (m, 1 H), 5,15-5,23 (m, 1 H), 5,70-5,75 (m, 1 H), 5,94 (s, 1 H), 7,35 (d, J = 6,10 Hz, 1 H), 7,57 (t, J = 7,32 Hz, 1 H), 7,74 (1, J = 7,78 Hz, 1 H), 7,78-7,89 (m, 4 H), 8,00 (d, J = 5,80 Hz, 1 H), 8,20-8,25 (m, 2 H). CL-EM (Procedimiento D, tiempo
15 de retención: 2,89 min), EM m/z 882 (M++1).
A una mezcla del compuesto 145 (680 mg, 0,77 mmol) en acetonitrilo (20 ml) se le añadieron carbonato potásico(319 mg, 2,31 mmol) y bencenotiol (186 mg, 1,69 mmol). La mezcla se agitó a ta durante una noche y después se
20 concentró al vacío. El residuo se diluyó con agua y esta solución acuosa se ajustó a pH 5 con HCl 1 N. Precipitó un sólido de color blanco formado en la solución. Esta mezcla heterogénea se extrajo con acetato de etilo (3 x). Losextractos combinados se secaron (MgSO4) y se concentraron para producir un sólido de color amarillo claro.Después, este sólido en bruto se trituró con hexano varias veces para producir 510 mg (95 %) del compuesto 151 enforma de un sólido de color blanquecino.
25 1H RMN (CD3OD, 300 MHz) 5 1,06-1,88 (m, 13 H), 1,23, 1,31 (s, 9 H), 1,65 (dd, J = 9,70, 5,67 Hz, 1 H), 1,80 (dd, J = 8,23, 5,67 Hz, 2 H), 2,03 (s a, 1 H), 2,18 (s a, 1 H), 2,37-2,52 (m, 3 H), 2,85-2,99 (m, 2 H), 3,09-3,15 (m, 1 H), 3,27(m, 1 H), 3,44 (m, 2 H), 4,15-4,20 (m, 1 H), 4,46 (m, 1 H), 4,74-4,85 (m, 2 H), 5,32 (t, J = 10,25 Hz, 1 H), 5,71 (m, 1 H), 5,98(s a, 1 H), 7,37 (d, J = 5,86 Hz, 1 H), 7,58 (t, J = 8,23 Hz, 1 H), 7,74 (t, J = 7,68 Hz, 1 H), 7,85 (d, J = 8,05 Hz, 1 H), 8,00 (d, J = 5,86 Hz, 1 H), 8,22 (d, J = 8,05 Hz, 1 H). CL-EM (Procedimiento D, tiempo de retención: 2,01 min), EM m/z 697 (M++1).
A una mezcla del compuesto 151 (20 mg, 0,029 mmol) en 2 ml de DCM se le añadieron trietilamina (14 mg, 0,138mmol) y anhídrido acético (8 mg, 0,078 mmol). Esta mezcla de reacción se agitó a ta durante 2 h y después seconcentró al vacío. El residuo se disolvió en metanol y se purificó por HPLC preparativa (YMC XTERRA, S5, 30 x 50 mm, gradiente: de 45 % de B a 85 % de B, 15 min, mantenido 2 min, caudal 25 ml/min) para dar 10 mg (47 %) del10 compuesto 146 en forma de un sólido de color blanco. 1H RMN (CD3OD, 300 MHz, 60 ºC) 5 1,08-1,22 (m, 13 H), 1,55-1,74 (m, 4 H), 2,09-2,21(m, 2 H), 2,13 (s, 3 H), 2,33-2,48 (m, 2 H), 2,66-2,75 (m, 1 H), 2,90-2,99 (m, 1 H), 3,123,25 (m, 2 H), 3,45-3,60 (m, 2 H), 3,75-3,84 (m, 1 H), 4,98-4,05 (m, 1 H), 4,70 (t, J = 7,68 Hz, 1 H), 4,89-4,97 (m, 1 H), 5,26 (t, J = 10,43 Hz, 1 H), 5,2-5,75 (m, 1 H), 5,92 (s, 1 H), 7,29 (d, J = 5,86 Hz, 1 H), 7,50 (t, J = 7,50 Hz, 1 H), 7,64-7,69 (m, 1 H), 7,77 (m, 1 H), 7,95 (d, J = 5,86 Hz, 1 H), 8,18 (d, J = 8,78 Hz, 1 H). CL-EM (Procedimiento D,
15 tiempo de retención: 2,64 min), EM m/z 739 (M++1).
A una mezcla del compuesto 151 (100 mg, 0,144 mmol) en 5 ml de DMF se le añadieron carbonato potásico (40 mg,0,290 mmol) y yoduro de metilo (13 µl, 0,21 mmol). Esta mezcla de reacción se agitó a ta durante 2 h. Después, se20 concentró al vacío. El residuo se disolvió en metanol y se purificó por HPLC preparativa (YMC TERRA, S5, 30 x 50 mm, gradiente: 45 % de B a 70 % de B, 15 min, mantenido 2 min, caudal 25 ml/min) para dar 75 mg (73 %) delcompuesto 147 en forma de un sólido de color blanco. 1H RMN (CD3OD, 300 MHz, 60 ºC) 5 1,02-1,28 (m, 13 H), 1,64 (dd, J = 9,70, 5,67 Hz, 1 H), 1,72-1,81 (m, 2 H), 1,91-2,10 (m, 1 H), 2,13-2,30 (m, 1 H), 2,36-2,50 (m, 2 H), 2,542,68 (m, 1 H), 2,76-2,99 (m, 2 H), 3,05 (s, 3 H), 3,11-3,46 (m, 4 H), 3,79-3,96 (m, 1 H), 4,17 (m, 1 H), 4,76 (m, 2 H),
25 5,31 (t, J = 10,06 Hz, 1 H), 5,71 (m, 1 H), 5,99 (s, 1 H), 7,33 (d, J = 5,86 Hz, 1 H), 7,55 (t, J = 7,50 Hz, 1 H), 7,70 (t, J = 7,68 Hz, 1 H), 7,81 (m, 1 H), 7,96 (d, J = 5,86 Hz, 1 H), 8,17 (d, J = 8,42 Hz, 1 H). CL-EM (Procedimiento D, tiempo de retención: 1,98 min), EM m/z 711 (M++1).
Ejemplo 43: Preparación del Compuesto 148
A una mezcla del compuesto 151 (20 mg, 0,029 mmol) en 2 ml de DCM se le añadieron diisopropilamina (15 ml,
0,086 mmol) y cloroformiato de metilo (8 mg, 0,085 mmol). Esta mezcla de reacción se agitó a ta durante 2 h y
después se concentró al vacío. El residuo se disolvió en metanol y se purificó por HPLC preparativa (YMC TERRA,
5 S5, 30 x 50 mm, gradiente: 50 % de B a 90 % de B, 15 min, mantenido 2 min, caudal 25 ml/min) para dar 15 mg (69
%) del compuesto 148 en forma de un sólido de color blanco. 1H RMN (CD3OD, 300 MHz) 5 1,09 (s, 9 H), 1,07-1,45
(m, 13 H), 1,56-1,61 (m, 1 H), 1,70-1,76 (m, 3 H), 2,95-2,10 (m, 1 H), 2,13-2,26 (m, 1 H), 2,33-2,55 (m, 2 H), 2,71
2,78 (m, 1 H), 2,93-3,02 (m, 1 H), 3,33 (m, 2 H), 3,48-3,57 (m, 2 H), 3,75 (s, 3 H), 4,04-4,12 (m,1 H), 4,64 (t, J = 8,42
Hz, 1 H), 4,90 (m, 2 H), 5,19 (t, J = 10,25 Hz, 1 H), 5,69-5,77 (m, 1 H), 5,93 (s, 1 H), 7,34 (d, J = 5,86 Hz, 1 H), 7,55 10 (t, J = 6,95 Hz, 1 H), 7,72 (t, J = 7,32 Hz, 1 H), 7,83 (d, J = 7,32 Hz, 1 H), 7,98 (d, J = 5,86 Hz, 1 H), 8,20 (d, J = 8,42
Hz, 1 H), 9,21 (s, 1 H). CL-EM (Procedimiento D, tiempo de retención: 2,75 min), EM m/z 755 (M++1).
A una mezcla del compuesto 151 (20 mg, 0,029 mmol) en 2 ml de DCM se le añadieron diisopropilamina (15 ml,
15 0,086 mmol) e isocianato de terc-butilo (8 ml, 0,058 mmol). La mezcla de reacción se agitó a ta durante 2 h y después se concentró al vacío. El residuo se disolvió en metanol y se purificó por HPLC preparativa (YMC XTERRA,S5, 30 x 50 mm, gradiente: de 55 % de B a 90 % de B, 15 min, mantenido 2 min, caudal 25 ml/min) para dar 15 mg(65 %) del compuesto 150 en forma de un sólido de color blanco (15 mg, 65 %). 1H RMN (CD3OD, 300 MHz) 5 1,061,34 (m, 13 H), 1,21 (s, 9 H), 1,40 (s, 9 H), 1,58-1,75 (m, 3 H), 1,97-2,09 (m, 1 H), 2,11-2,23 (m, 1 H), 2,37-2,50 (m, 2
20 H), 2,69-2,82 (m, 1 H), 2,94-3,04 (m, 1 H), 3,22 (m, 1 H), .36-3,46 (m, 2 H), 4,12 (d, J = 12,44 Hz, 1 H), 4,39 (d, J = 11,34 Hz, 1 H), 4,50-4,57 (m, 1 H), 4,69 (t, J = 8,23 Hz, 1 H), 5,20-5,27 (m, 1 H), 5,69-5,78 (m, 1 H), 5,90 (s, 1 H), 7,34 (d, J = 5,86 Hz, 1 H), 7,57 (t, J = 7,14 Hz, 1 H), 7,73 (m, 1 H), 7,83 (m, 1 H), 7,98 (d, J = 5,86 Hz, 1 H), 8,24 (d, J
= 8,05 Hz, 1 H). CL-EM (Procedimiento D, tiempo de retención: 3,04 min), EM m/z 796 (M++1).
A una mezcla del compuesto 151 (20 mg, 0,029 mmol) en 2 ml de DCM se le añadieron diisopropilamina (15 ml,
5 0,086 mmol) y cloruro de metanosulfonilo (5 µl 0,065 mmol). La mezcla de reacción se agitó a ta durante 2 h, y después se concentró al vacío. El residuo se disolvió en metanol y se purificó por HPLC preparativa (YMC TERRA,S5, 30 x 50 mm, gradiente: de 50 % de B a 90 % de B, 15 min, mantenido 2 min, caudal 25 ml/min) para dar 17 mg(76 %) del compuesto 153 en forma de un sólido de color blanco. 1H RMN (CD3OD, 300 MHz) 5 1,02-1,49(m, 13 H),1,59 (m, 1 H), 1,72-1,86 (m, 3 H), 1,96-2,09 (m, 1 H), 2,37-2,50 (m, 2 H), 2,63-2,80 (m, 2 H), 2,91-3,08 (m, 5 H), 2,97
10 (s, 3 H), 3,22-3,45 (m, 3 H), 4,19 (dd, J = 11,89, 3,48 Hz, 1 H), 4,52 (d, J = 11,71 Hz, 1 H), 4,62 (dd, J = 9,88, 7,32 Hz, 1 H), 4,83-4,96 (m, 1 H), 5,17 (t, J = 10,06 Hz, 1 H), 5,75 (m, 1 H), 5,94 (s, 1 H), 7,33 (d, J = 5,86 Hz, 1 H), 7,57 (d, J = 8,05 Hz, 1 H), 7,72 (t, J = 7,50 Hz, 1 H), 7,82 (m, 1 H), 7,99 (d, J = 6,22 Hz, 1 H), 8,20 (d, J = 8,42 Hz, 1 H). CL-EM (Procedimiento D, tiempo de retención: 2,59 min), EM m/z 775 (M++1).
Ejemplo 46: Preparación del Compuesto 141: éster terc-butílico del ácido [(Z)-(1S,4R,13S,17R)-4
15 ciclopropanosulfonilaminocarbonil-17-(6-metoxi-isoquinolin-1-iloxi)-2,14-dioxo-10-oxa-3,15-diazatriciclo[13,3,0,04,5]octadec-7-en-13-il]-carbámico
Etapa 46a: Preparación de ácido (S)-4-aliloxi-2-(terc-butoxicarbonilamino)butírico
A una mezcla de hidruro sódico (913 mg, 22,8 mmol) en DMF a 0 ºC se le añadió N-t-Boc-L-homoserina (2 g, 9,13mmol). Esta mezcla de reacción se agitó a 0 ºC durante 15 min y después se añadió bromuro de alilo (1,38 g, 11,4mmol). La mezcla se calentó a ta y se agitó durante 2 h. Después, se concentró al vacío. El residuo se diluyó conagua y se lavó secuencialmente con hexano y éter. Las fases orgánicas se desecharon y la fase acuosa se ajustócuidadosamente a pH 3 con HCl 1 N. Esta solución acuosa ácida se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se secó (MgSO4) y se concentró al vacío para producir 2,2 g (93 %) de ácido (S)-4-aliloxi-2-(tercbutoxicarbonilamino)butírico en forma de un aceite incoloro. 1H RMN (300 MHz, CD3OD) 5 1,42 (s, 9 H), 1,80-1,90 (m, 1 H), 2,04-2,16 (m, 1 H), 3,50-3,54 (m, 2 H), 3,97 (d, J = 4,39 Hz, 2 H), 4,23 (dd, J = 8,78, 4,39 Hz, 1 H), 5,15 (d, J = 10,25 Hz, 1 H), 5,26 (dd, J = 17,38, 1,65 Hz, 1 H), 5,84-5,97 (m, 1 H). Este material de partida se empleó en la síntesis de 1-((3R,5S)-1-((S)-4-(aliloxi)-2-(terc-butoxicarbonil)butanoil)-3-(6-metoxiisoquinolin-1-iloxi)pirrolidina-5carboxamido)-2-vinilciclopropano-carboxilato de (1R,2S)-etilo como se ha descrito en el ejemplo 2.
Etapa 46b: Preparación de éster etílico del ácido (Z)-(1S,4R,13S,7R)-13-terc-butoxicarbonilamino-17-(6metoxi-isoquinolin-1-iloxi)2,14-di-oxo-10-oxa-3,15-diaza-triciclo[13,3,0,04,6]octadec-7-eno-4-carboxílico
A una solución de 1-((3R,5S)-1-((S)-4-(aliloxi)-2-(terc-butoxicarbonil)butanoil)-3-(6-metoxiisoquinolin-1iloxi)pirrolidina-5-carboxamido)-2-vinilciclopropanocarboxilato de (1R,2S)-etilo (220 mg, 0,33 mmol) en 84 ml decloruro de metileno se le añadió dicloruro de triciclohexilfosfina[1,3-bis(2,4,6-trimetil-fenil)-4,5-dihidroimidazol-2ilideno][bencilideno]-rutenio (IV) (27 mg, 0,032 mmol). La solución homogénea de color naranja claro se calentó areflujo durante 3 h para dar una solución de color naranja oscuro. En este momento, se añadió otra porción delcatalizador de rutenio (13 mg, 0,016 mmol) y el calentamiento a reflujo se continuó durante 2 h más. La mezcla de reacción se enfrió a ta y se concentró al vacío para dar un aceite de color naranja. La cromatografía ultrarrápida(acetato de etilo y después MeOH al 10 % en acetato de etilo) dio 174 mg (80 %) de éster etílico del ácido (Z)(1S,4R,13S,17R)-13-terc-butoxicarbonilamino-17-(6-metoxi-isoquinolin-1-iloxi)-2,14-dioxo-10-oxa-3,15-diazatriciclo[13,3,0,04,6]octadec-7-eno-4-carboxílico en forma de un sólido de color blanco. CL-EM (Procedimiento A,tiempo de retención: 3,74 min), EM m/z 639 (M++1).
Etapa 46c: Preparación de los Compuestos 140 y 141:
Se hidrolizó éster etílico del ácido (Z)-(1S,4R,13S,17R)-13-terc-butoxicarbonilamino-17-(6-metoxi-isoquinolin-1-iloxi)2,14-dioxo-10-oxa-3,15-diaza-triciclo[13,3,0,04,6]octadec-7-eno-4-carboxílico de acuerdo con Ejemplo 2 (etapa 2E)para dar el Compuesto 140. El Compuesto 140 se convirtió en el Compuesto 141, éster terc-butílico del ácido [(Z)(1S,4R,13S,17R)-4-ciclopropanosulfonilaminocarbonil-17-(6-metoxi-isoquinolin-1-iloxi)-2,14-dioxo-10-oxa-3,15-diazatriciclo[13,3,0,04,6]octadec-7-en-13-il]-carbámico, de acuerdo con el Ejemplo 7, CL-EM (Procedimiento A, tiempo deretención: 3,51 min), EM m/z 714(M++1).
Ejemplo 47: Procedimiento general para preparar P4-carbamatos a partir de alcoholes terciarios. Preparación
del Compuesto 56: 1-metil-ciclobutil éster del ácido [(Z)-(1S,4R,14S,18R)-4ciclopropanosulfonilaminocarbonil-18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec7-en-14-il]-carbámico
Etapa 47a: Preparación de 1-metilciclobutanol:
A una solución de 6 ml de yoduro de metilmagnesio (3 M en éter) a -10 ºC se le añadió gota a gota ciclobutanona (1g, 14,3 mmol). La mezcla se agitó durante 2,5 h (de -10 ºC a ta). A la mezcla de reacción se le añadió HCl diluidohasta que se disolvió todo el precipitado. La mezcla de reacción homogénea se extrajo con éter (2 x). Los extractosde éter combinados se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron al vacío para dar 0,9 g (73 %) de 1metilciclobutanol en forma de un aceite de color amarillo.
Etapa 47b. Preparación de 1-metil-ciclobutil éster del ácido [(Z)-(1S,4R,14S,18R)-4ciclopropanosulfonilaminocarbonil-18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec7-en-14-il]-carbámico
A una suspensión de KH (400 mg, al 35 % en aceite, 3,5 mmol) se le añadieron 5 ml de hexano. Se agitó durante 5 min y después el hexano se retiró. Este proceso se repitió tres veces. Se añadió THF (5 ml) a este KH prelavado ydespués se añadió 1-metilciclobutanol (200 mg, 2,3 mmol) a 0 ºC. La mezcla se agitó (de 0 ºC a ta) durante 1 h ydespués se añadió dipiridin-2-il éster del ácido carbónico (753 mg, 3,5 mmol). La mezcla se agitó a ta durante 4 h yla reacción se diluyó con NH4Cl ac. sat. Después, la mezcla se extrajo con EtOAc y el disolvente se retiró al vacíopara obtener 200 mg del piridin-2-il éster de 1-metil-ciclobutil éster del ácido carbónico en bruto en forma de un sólido de color naranja. Se usó directamente en la siguiente etapa sin purificación adicional.
A una suspensión de 50 mg (0,073 mmol) del compuesto 11, sal bis clorhidrato de (1ciclopropanosulfonilaminocarbonil-2-vinil-ciclopropil)-amida del ácido [1-(2-Amino-3,3-dimetil-butiril)-4-(6-metoxiisoquinolin-1-iloxi)-pirrolidina-2-carboxílico] en CH2Cl2 se le añadieron diisopropiletilamina (29 mg, 0,22 mmol) y 70 mg (0,33 mmol) del reactivo anterior (piridin-2-il éster de 1-metil-ciclobutil éster del ácido carbónico). Esta mezcla de reacción se agitó a ta durante una noche y después se concentró al vacío. El residuo se purificó por HPLCpreparativa para dar 32 mg (62 %) del compuesto 56 en forma de un sólido de color blanco. Condición de HPLCpreparativa: YMC XTERRA, S5, 19 x 100 mm, gradiente: de 50 % de B a 90 % de B, 15 min, mantenido 2 min,caudal 25 ml/min. CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 3,47 min), EM m/z 708 (M++1).
El Compuesto 59 se preparó por el procedimiento general usado para el Compuesto 56 (ejemplo 47): se convirtió 1metilciclopropanol en el reactivo piridin-2-il éster de 1-metil-ciclopropil éster del ácido carbónico que se preparó deacuerdo con el procedimiento anterior (ejemplo 47). Se preparó 1-metil-1-ciclopropanol mediante una ligeramodificación del procedimiento descrito por Kulinkovich, O.G.; Sviridov, S.V.; y Vasilevski, D.A. Synthesis, 1991, 234:A una solución agitada de acetato de metilo (1,85 g, 25 mmol) y Ti(OPr-i)4 (744 µl, 2,5 mmol) en éter dietílico (80 ml)se le añade lentamente bromuro de etilmagnesio (solución 3 M en éter dietílico) (18 ml, 53 mmol) en éter dietílico (60 ml) durante un periodo de 1 h mientras se mantiene la temperatura de reacción a 18-20 ºC. Cuando se completa laadición, la agitación se continúa durante 10 min. La mezcla se vierte en H2SO4 ac. al 10 % enfriado (5 ºC) (250 ml) yel producto se extrae con éter dietílico (3 x 50 ml). Los extractos de éter combinados se lavan con agua (50 ml), se secan (MgSO4) y se concentran cuidadosamente por evaporación rotatoria (~2666,44 Pa, ta) para dar 1,7 g de 1metil-1-ciclopropanol (pureza de ~80 %). 1H RMN (300 MHz, CDCl3) 5 0,42-0,45 (m, 2H), 0,73-0,77 (m, 2 H), 1,44 (s, 3 H), 1,64 (s a, 1 H).
Los siguientes compuestos también se prepararon usando el procedimiento general anterior: el compuesto 50 se
5 preparó a partir de 1-metilciclopentanol; los compuestos 39 y 51 se prepararon a partir de 1,1,1-trifluoro-2metilpropan-2-ol, el compuesto 55 se preparó a partir de 1,1-difluoro-2-metilpropan-2-ol (1,1-difluoro-2-metilpropan-2ol se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito por Dickey, J. B. y Towne, E. B. US2700686), loscompuestos 40 y 52 se prepararon a partir de 1-cloro-2-metilpropan-2-ol, el compuesto 124 se preparó a partir de1,1,1-tricloro-2-metilpropan-2-ol, el compuesto 123 se preparó a partir de 3-hidroxi-3-metilbutan-2-ona, y el
10 compuesto 139 se preparó a partir de O-4-nitrofenil carbonotioato de S-terc-butilo (véase a continuación) (Este reactivo se preparó como se describe por E.M. Gordon, J.C. Barrish, G.S. Bisacchi, C-Q. Sun, J.A. Tino, G.D. Vite, y
R. Zahler en el documento US005559256A.).
A una mezcla del compuesto 11 {bis clorhidrato d [14-amino-18-(isoquinolin-1-iloxi)-2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carbonil]-amida del ácido ciclopropanosulfónico} (20 mg, 0,029 mmol) en 2 ml deDCM se le añadieron 18 µl (0,10 mmol) de DIPEA y 4 mg (0,04 mmol) de isocianato de t-butilo. La mezcla se agitó ata durante una noche. Después, se diluyó con EtOAc y se lavó con tampón a pH 4 (2 x) y salmuera (1 x). La fase20 orgánica se secó (MgSO4) y se concentró al vacío para dar el producto en bruto. El aceite resultante se disolvió en metanol y se purificó por HPLC preparativa (YMC XTERRA, S5, 19 x 100 mm, gradiente: de 50 % de B a 100 % deB, 15 min, mantenido 2 min, caudal 25 ml/min) para aislar el compuesto 126 en forma de un polvo de color blanco(17 mg, 82 %): CL-EM (Procedimiento D, tiempo de retención: 3,24 min), EM m/z 695 (M++1). 1H RMN (300 MHz, CDCl3) 5 0,86-0,96 (m, 2 H), 1,12 (s, 9 H), 1,01-1,49 (m, 18 H), 1,52-1,66 (m, 1 H), 1,70-1,78 (m, 1 H), 1,83-1,95(m,
25 2 H), 2,14-2,25 (m, 1 H), 2,49 (s a, 1 H), 2,71 (m, 2 H), 2,86-2,92 (m, 1 H), 4,07 (dd, J = 11,71, 4,03 Hz, 1 H), 4,404,44 (m, 1 H), 4,62-4,69 (m, 2 H), 4,94-5,00 (m, 1 H), 5,65-5,74 (m, 1 H), 5,97 (s a, 1 H), 7,03 (s, 1 H), 7,32 (d, J = 6,22 Hz, 1 H), 7,50-7,52 (m, 1 H), 7,68-7,78 (m, 2 H), 8,00 (d, J = 5,86 Hz, 1 H), 8,22 (d, J = 7,68 Hz, 1 H), 10,15 (s, 1 H).
Ejemplo 49: Preparación del Compuesto 58: Etapa 49a: Preparación de éster etílico del ácido 1-{[1-(2-terc-butoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4-(terc-butildimetilsilaniloxi)-pirrolidina-2-carbonil]-amino}-2-vinilciclopropanocarboxílico
A una mezcla de éster etílico del ácido 1-{[1-(2(S)-terc-butoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4(R)-hidroxi-pirrolidina2(S)carbonil]-(1R)-amino}-2(S)-vinil-ciclopropanocarboxílico (1,5 g, 2,87 mmol) en 10 ml de DMF se le añadieronimidazol (0,25 g, 3,67 mmol) y cloruro de terc-butil-dimetilsililo (516 mg, 3,44 mmol). La mezcla se agitó a ta durante
5 dos días. Después, la mezcla de reacción se concentró al vacío y el residuo se disolvió en acetato de etilo. Esta solución se lavó con agua, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró al vacío para obtener un sólido enbruto. La purificación por cromatografía ultrarrápida (eluyendo con acetato de etilo al 20 % en hexano) dio 1,43 g (78%) de éster etílico del ácido 1-{[1-(2-terc-butoxicarbonilamino- non- 8- enoil)- 4-(terc- butildimetilsilaniloxi) pirrolidina2- carbonil]-amino}- 2- vinilciclopropanocarboxílico en forma de un sólido de color blanco.
10 1H RMN (300 MHz, CD3OD) 5 0,10 (s,6 H), 0,89 (s, 9 H), 1,22 (m, 3 H), 1,31-1,48 (m, 16 H), 1,50-1,75 (m, 3 H), 2,06 (m, 3 H), 2,11-2,33 (m, 2 H), 3,70 (m, 2 H), 4,03-4,19 (m, 2 H), 4,21 (m, 1 H), 4,45 (t, J = 7,87 Hz, 1 H), 4,59 (m, 1 H), 4,91 (d, J = 9,15 Hz, 1 H), 4,98 (d, J = 17,20 Hz, 1 H), 5,08 (dd, J = 10,25, 1,83 Hz, 1 H), 5,27 (dd, J = 17,38, 1,65 Hz, 1 H), 5,65-5,87 (m, 2 H). CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 4,00 min), EM m/z 636 (M++1).
Etapa 49b: Preparación de éster etílico del ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(terc-butildimetil-silaniloxi)15 2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico
A una solución de éster etílico del ácido 1-{[1-(2-terc-butoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4-(terc-butildimetil-silaniloxi)pirrolidina-2-carbonil]-amino}-2-vinilciclopropanocarboxílico (1,63 g, 2,56 mmol) en 640 ml de cloruro de metileno sele añadieron 215 mg (0,26 mmol) de dicloruro de triciclohexilfosfina[1,3-bis(2,4,6-tri[bencilideno]rutenio (IV). La20 mezcla se calentó a reflujo durante 15 min. El residuo se concentró al vacío y después se purificó por cromatografía ultrarrápida eluyendo con acetato de etilo al 30 %/hexano. Para decolorar adicionalmente la muestra, el producto enbruto se cromatografió una segunda vez eluyendo con éter al 50 % en hexano para dar 1,5 g (96 %) de éster etílico del ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(terc-butildimetil-silaniloxi)-2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico en forma de un sólido de color blanco. 1H RMN (500 MHz, CD3Cl) 5
25 0,06 (s, 3 H), 0,07 (s, 3 H), 0,86 (s, 9 H), 1,18-1,24 (m, 6 H), 1,34-1,64 (m, 14 H), 1,86-1,96 (m, 3 H), 2,02-2,09 (m, 1 H), 2,11-2,17 (m, 1 H), 2,19-2,28 (m, 1 H), 2,57-2,63 (m, 1 H), 3,50-3,54 (m, 1 H), 3,71 (dd, J = 10,22, 6,26 Hz, 1 H), 4,06-4,17 (m, 2 H), 4,52-4,58 (m, 2 H), 4,75 (d, J = 8,55 Hz, 1 H), 5,21 (t, J = 9,92 Hz, 1 H), 5,35 (d, J = 7,63 Hz, 1 H), 5,45-5,50 (m, 1 H), 6,94 (s,1 H). CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 3,88 min), EM m/z 608 (M++1).
Etapa 49c: Preparación de ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-2,15-dioxo-3,1630 diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico
A una solución de éster etílico del ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(terc-butildimetilsilaniloxi)-2,15-dioxo-3,16diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico (1,5 g, 2,47 mmol) en un sistema disolvente mixto de THF (4ml), metanol (1 ml) y agua (2 ml) se le añadió hidróxido de litio monohidrato en polvo (1,0 g, 50 mmol). Lasuspensión de color amarillo claro se agitó a ta en una atmósfera de N2 durante 4 h. Después, la mezcla se concentró al vacío y el residuo se repartió entre éter y agua. La fase de éter se desechó y la fase acuosa se trató con HCl 1 N hasta alcanzar pH 4. Esta solución ácida se extrajo con EtOAc (3 x). Los extractos de EtOAc combinados se secaron (MgSO4) y se concentraron al vacío para dar 1,2 g (84 %) de ácido 14-tercbutoxicarbonilamino-18-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4carboxílico en forma de un sólido de color blanquecino. 1H RMN (300 MHz, CD3OD) 0,12 (s, 6 H), 0,89 (s, 9 H), 1,231,64 (m, 17 H), 1,70-1,87 (m, 1 H), 1,90-2,49 (m, 6 H), 3,70-3,80 (m,1 H), 3,83-3,90 (m, 1 H), 4,28-4,36 (m, 1 H),4,47-4,55 (m, 1 H), 4,65 (s, 1 H), 5,30-5,39 (m, 1 H), 5,53-5,62 (m, 1 H). CL-EM (Procedimiento A, tiempo deretención: 3,69 min), EM m/z 580 (M++1).
Etapa 49d: Preparación de éster terc-butílico del ácido [18-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-4ciclopropanosulfonilaminocarbonil-2,15-dioxo-3,16-di-azatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-y])-carbámico
Se disolvió ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(terc-butildimetilsilaniloxi)-2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico (500 mg, 0,86 mmol) en 25 ml de THF y se trató con CDI (180 mg,1,12 mmol). (Debe tenerse cuidado para evitar la humedad usando cristalería secada al horno y manteniendo unaatmósfera de N2 seca). Después de calentar a reflujo la mezcla de reacción durante 2 h, se enfrió a ta y se trató secuencialmente con ciclopropilsulfonamida (135 mg, 1,12 mmol) y DBU (170 mg, 1,12 mmol). La mezcla dereacción se agitó durante 4 h a ta, y el THF se retiró por evaporación rotatoria. El residuo se repartió entre acetatode etilo y tampón a pH 4. La fase orgánica se secó (MgSO4) y se concentró al vacío para dar el producto en bruto.Después, se purificó por cromatografía ultrarrápida (eluyendo con acetato de etilo al 33 % en hexano) para dar 300 mg (51 %) de éster terc-butílico del ácido [18-(terc-butildimetil-silaniloxi)-4-ciclopropanosulfonilaminocarbonil-2,15dioxo-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico en forma de un sólido de color blanco. 1H RMN (300 MHz, CD3OD) 5 1H 0,07 (s, 3 H), 0,08 (s, 3 H), 0,85 (s, 9 H), 0,87-1,49 (m, 21 H), 1,73-1,95 (m, 3 H), 2,08-2,16(m, 1 H), 2,25-2,36 (m, 2 H), 2,42-2,56 (m, 1 H), 2,85-2,93 (m, 1 H), 3,65-3,74(dd, J = 10,61, 3,66 Hz, 1 H), 3,89 (d, J = 10,25 Hz, 1 H), 4,34 (m, J = 9,70, 9,70 Hz, 1 H), 4,43 (t, J = 7,87 Hz, 1 H), 4,57 (s, 1 H), 4,94-5,01 (m, 1 H), 5,10 (d, J = 8,78 Hz, 1 H), 5,66-5,75 (m, 1 H), 6,55 (s, 1 H), 10,13 (s, 1 H). CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 3,81 min), EM m/z 683 (M++1).
Etapa 49e: éster terc-butílico del ácido (4-ciclopropanosulfonilaminocarbonil-18-hidroxi-2,15-dioxo-3,16diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il)-carbámico
A una mezcla de éster terc-butílico del ácido [18-(terc-butil-dimetilsilaniloxi)-4-ciclopropanosulfonil-aminocarbonil2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico (330 mg, 0,48 mmol) en 25 ml de THF se leañadió fluoruro de tetrabutilamonio (150 mg, 0,54 mmol). La mezcla de reacción se agitó a ta durante 18 h ydespués el THF se retiró por evaporación rotatoria. El residuo se repartió entre acetato de etilo y agua. La fase orgánica se secó (MgSO4) y se concentró al vacío para dar el producto en bruto. Después, se purificó por trituracióncon hexano para producir 200 mg (73 %) de éster terc-butílico del ácido (4-ciclopropanosulfonilaminocarbonil-18hidroxi-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il)-carbámico en forma de un sólido de color blanco. 1H RMN (500 MHz, CD3Cl) 5 1,87-1,64 (m, 21 H), 1,70-1,98 (m, 3 H), 2,15-2,56 (m, 5 H), 2,85-2,94 (m, 1 H), 3,71 (d, J = 13,91 Hz, 1 H), 4,10-4,26 (m, 2 H), 4,51 (t, J = 7,87 Hz, 1 H), 4,62 (s, 1 H), 4,98 (m, 1 H), 5,06 (d, J = 8,78 Hz, 1 H), 5,64-5,71 (m, 1 H), 6,72 (s, 1 H), 10,24 (s, 1 H). CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 2,85min), EM m/z 569 (M++1).
Etapa 49f: Preparación del Compuesto 58: éster terc-butílico del ácido [(Z)-(1S,4R,14S,18R)-4ciclopropanosulfonilaminocarbonil-2,15-dioxo-18-(3-fenil-isoquinolin-1-iloxi) 3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico
A una mezcla de éster terc-butílico del ácido (4-ciclopropanosulfonilaminocarbonil-18-hidroxi-2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7-en-14-il)-carbámico (20 mg, 0,035 mmol) en 1 ml de DMF se le añadió t-butóxido potásico (22 mg, 0,196 mmol). La mezcla se agitó a ta durante 5 min y después se añadió 1-cloro-3-fenilisoquinolina(15 mg, 0,062 mmol). La mezcla de reacción se agitó a ta durante 15 h y después se concentró al vacío. Este producto en bruto se trituró con éter. El residuo se disolvió en MeOH y después se purificó por HPLC preparativa.(YMC XTERRA, S5, 19 x 100 mm, gradiente: de 60 % de B a 100 % de B, 15 min, mantenido 2 min, caudal 25ml/min) para dar 10 mg (39 %) del compuesto 58, éster terc-butílico del ácido [(Z)-(1S,4R,14S,18R)-4ciclopropanosulfonilaminocarbonil-2,15-dioxo-18-(3-fenil-isoquinolin-1-iloxi)-3,16-di-aza-triciclo[14,3,0,04,6]nonadec-7en-14-il]-carbámico, en forma de un sólido de color blanco. 1H RMN (500 MHz, CD3Cl) 5 0,90-1,64 (m, 21 H), 1,761,97 (m, 3 H), 2,26-2,31 (m, 1 H), 2,52-2,63 (s a, 1 H), 2,69-2,81 (m, 2 H), 2,88-2,93 (m, 1 H), 4,11 (d, J = 11,60 Hz, 1 H), 4,33 (m, 1 H), 4,61 (d, J = 7,94 Hz, 2 H), 4,99 (t, J = 9,31 Hz, 1 H), 5,05 (d, J = 7,93 Hz, 1 H), 5,69-5,74 (m, 1 H), 6,08 (s, 1 H), 6,60 (s, 1 H), 7,38-7,47(m, 2 H), 7,50 (t, J = 7,63 Hz, 2 H), 7,63 (t, J = 7,32 Hz, 1 H), 7,71 (s, 1 H), 7,77 (d, J = 8,24 Hz, 1 H), 8,10 (d, J = 7,32 Hz, 2 H), 8,18 (d, J = 7,93 Hz, 1 H), 10,27 (s, 1 H). CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 3,72 min), EM m/z 772 (M++1).
Los compuestos de las tablas 2 y 3 se prepararon empleando los procedimientos descritos en los ejemplos anteriores:
Tabla 2
Los compuestos de las tablas 4 y 5 pueden prepararse empleando los procedimientos descritos en los ejemplosanteriores:
Tabla 5
EJEMPLO 50
Estudios Biológicos
Ensayo peptídico FRET de complejo de proteasa NS3/4A de VHC recombinante
El propósito de este ensayo in vitro era medir la inhibición de complejos de proteasa NS3 de VHC, obtenidos a partirde la cepa BMS, la cepa H77C o la cepa J416S, como se ha descrito más adelante, mediante compuestos de lapresente invención. Este ensayo proporciona un indicio de cuán eficaces serían los compuestos de la presenteinvención en la inhibición de la actividad proteolítica de VHC.
Se obtuvo suero a partir de un paciente infectado con VHC del Dr. T. Wright, Hospital de San Francisco. Una matrizde ADNc (ácido desoxirribonucleico complementario) de longitud completa producida por ingeniería genética delgenoma de VHC (cepa BMS) se construyó a partir de fragmentos de ADN obtenidos por transcripción inversa-PCR(RT-PCR) de ARN de suero (ácido ribonucleico) y usando cebadores seleccionados en base a la homología entrecepas 1a de otro genotipo. A partir de la determinación de la secuencia de genoma completa, se asignó un genotipo1a al aislado de VHC de acuerdo con la clasificación de Simmonds y col. (véase P Simmonds, KA Rose, S Gram.,SW Chan, F McOmish, BC Dow, EA Folleto, PL Yap y H Mariden, J. Clon. Microbiol., 31(5), 1493-1503 (1993)). Lasecuencia de aminoácidos de la región no estructural, NS2-5B, demostró ser > del 97 % idéntica al genotipo 1a deVHC (H77C) y el 87 % idéntica al genotipo 1b (J4L6S). Los clones infecciosos, H77C (genotipo 1a) y J4L6S(genotipo 1b) se obtuvieron a partir de R Purcell (NIH) y las secuencias se publican en el Genbank (AAB67036, véase Yanagi, M., Purcell, R.H., Emerson, S.U. y Bukh, J. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94(16), 8738-8743 (1997);AF054247, véase Yanagi, M., St Claire, M., Shapiro, M., Emerson, S.U., Purcell, R.H. y Bukh, J. Virology 244(1),161-172 (1998)).
Se usaron las cepas H77C y J4L6S para la producción de complejos de proteasa NS3/4A recombinantes. El ADNque codifica el complejo de proteasa NS3/4A de VHC recombinante (aminoácidos 1027 a 1711) de estas cepas semanipularon como ha descrito P. Gallinari y col. (véase Gallinari P, Paolini C, Brennan D, Nardi C, Steinkuhler C, DeFrancesco R. Biochemistry. 38(17): 5620-32, (1999)). Brevemente, se añadió un tramo final solubilizante de treslisinas al extremo 3' de la región codificante NS4A. Se cambió la cisteína en la posición P1 del sitio de escisiónNS4A-NS4B (aminoácido 1711) a una glicina para evitar la escisión proteolítica de la marca de lisina. Además, se introdujo una mutación de cisteína a serina mediante PCR en la posición de aminoácido 1454 para evitar la escisiónautolítica en el dominio de helicasa NS3. El fragmento de ADN variante se clonó en el vector de expresiónbacteriana pET21b (Novagen) y el complejo NS3/4A se expresó en la cepa de Escherichia coli BL21 (DE3)(Invitrogen) siguiendo el protocolo descrito por P. Galliari y col. (véase Galliari P, Brennan D, Nardi C, Brunetti M,Tomei L, Steinkuhler C, De Francesco R., J Virol 72(8): 6758-69 (1998)) con modificaciones. Brevemente, se indujola expresión de NS3/4A con isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 0,5 mM durante 22 h a 20 ºC. Unafermentación típica (10 l) produjo aproximadamente 80 g de pasta celular húmeda. Las células se resuspendieron entapón de lisis (10 ml/g) constituido por ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(2-etano sulfónico) (HEPES), pH 7,5,glicerol al 20 %, cloruro de sodio (NaCl) 500 mM, Triton-X100 al 0,5 %, 1 microgramo/mililitro ("μg/ml") de lisozima, cloruro de magnesio (MgCl2) 5 mM, 1 μg/ml de Dnasel, β-mercaptoetanol (βME) 5 mM, inhibidor de proteasa-ácidoetilendiamino tetracético (EDTA) libre (Roche), se homogeneizaron e incubaron durante 20 minutos a 4 ºC. Elhomogenado se sonicó y clarificó mediante ultracentrifugación a 235000 g durante 1 h a 4 ºC. Se añadió imidazol alsobrenadante hasta una concentración final de 15 mM y el pH se ajustó a 8,0. El extracto de proteína cruda se cargósobre una columna de níquel-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA) preequilibrada con tampón B (HEPES 25 mM, pH 8.0,glicerol al 20 %, NaCl 500 mM, Triton-X100 al 0,5 %, imidazol 15 mM, βME 5 mM). La muestra se cargó a un caudalde 1 ml/min. La columna se lavó con 15 volúmenes de columna de tampón C (igual que el tampón B excepto quecon Triton-X100 al 0,2 %). La proteína se eluyó con 5 volúmenes de columna de tampón D (igual que el tampón Cexcepto que con imidazol 200 mM).
Las fracciones que contenían complejo de proteasa NS3/4A se combinaron y se cargaron sobre una columna dedesalinización Superdex-S200 pre-equilibrada con tampón D (HEPES 25 mM, pH 7,5, glicerol al 20 %, NaCl 300mM, Triton-X100 al 0,2 %, βME 10 mM). La muestra se cargó a un caudal de 1 ml/min. Las fracciones que conteníancomplejo de proteasa NS3/4A se combinaron y se concentraron hasta aproximadamente 0,5 mg/ml. La pureza delos complejos de proteasa NS3/4A, obtenidos a partir de las cepas BMS, H77C y J4L6S, se calculó que fueronmayores del 90 % mediante análisis de SDS-PAGE y espectrometría de masas.
La enzima se almacenó a -80 ºC, se descongeló en hielo y se diluyó antes del uso en tampón de ensayo. El sustratousado para el ensayo de proteasa NS3/4A fue RET S1 (Resonance Energy Transfer Depsipeptide Substrate;AnaSpec, Inc. Nº de cat. 22991) (péptido FRET), descrito por Taliani y col., en Anal. Biochem. 240(2): 60-67 (1996).La secuencia de este péptido se basa ligeramente en el sitio de escisión natural NS4A/NS4B excepto en que existeun enlace éster en lugar de una unión amida en el sitio de escisión. El sustrato peptídico se incubó con uno de lostres complejos NS3/4A recombinantes, en ausencia o presencia de un compuesto de la presente invención y sesiguió la formación del producto de reacción fluorescente en tiempo real usando un Cytofluor Series 4000.
Los reactivos fueron los siguientes: Se obtuvieron HEPES y glicerol (Ultrapure) a partir de GIBCO-BRL. Se obtuvo dimetil sulfóxido (DMSO) en Sigma. Se obtuvo β-mercaptoetanol en Bio Rad.
Tampón de ensayo: HEPES 50 mM, pH 7,5; NaCl 0,15 M, Triton al 0,1 %; glicerol al 15 %; βME 10 mM. Sustrato: concentración final 2 μM (a partir de una solución madre 2 mM en DMSO almacenado a -20 ºC). NS3/4A de tipo 1a(1b) de VHC, concentración final 2-3 nM (a partir de una solución madre 5 μM en HEPES 25 mM, pH 7,5, glicerol al 20 %, NaCl 300 mM, Triton-X100 al 0,2 %, βME 10 mM). Para los compuestos con potencias que se acercaban allímite de ensayo, el ensayo se hizo más sensible mediante la adición de 50 μg/ml de Albúmina Sérica Bovina(Sigma) al tampón de ensayo y reduciendo la concentración de proteasa final hasta 300 pM.
El ensayo se realizó en una placa negra de poliestireno de 96 pocillos de Falcon. Cada pocillo contenía 25 microlitros ("μl") de complejo proteasa NS3/4A en tampón de ensayo, 50 μl de un compuesto de la presente invención en DMSO al 10 %/tampón de ensayo y 25 μl de sustrato en tampón de ensayo. También se preparó uncontrol (sin compuesto) en la misma placa de ensayo. El complejo de enzima se mezcló con compuesto o solucióncontrol durante 1 minuto antes de iniciar la reacción enzimática mediante la adición de sustrato. La placa de ensayose leyó inmediatamente usando el Cytofluor Series 4000 (Perspectiva Biosystems). El instrumento se ajustó paraleer una emisión de 340 nm y una excitación de 490 nm a 25 ºC. Las reacciones se siguieron generalmente duranteaproximadamente 15 minutos.
El porcentaje de inhibición se calculó con la siguiente ecuación:
100 - [( Finh/ Fcon)x100]
en la que δF es el cambio en la fluorescencia a lo largo del intervalo lineal de la curva. Se aplicó un ajuste de curvano lineal a los datos de inhibición-concentración y se calculó la concentración eficaz del 50 % (CI50) mediante el uso de software Excel XI-fit usando la ecuación, y=A+((B-A)/1+((C/x)^D))).
Se observó que todos los compuestos ensayados tenían CI50 de 1,2 μM o menos. Además, los compuestos de la presente invención, que se ensayaron frente a más de un tipo de complejo NS3/4A, se observó que teníanpropiedades inhibidoras similares aunque los compuestos demostraron uniformemente mayor potencia frente a lascepas 1b en comparación con las cepas 1a.
Ensayos de Especificidad
Los ensayos de especificidad se realizaron para demostrar la selectividad de los compuestos de la presenteinvención para inhibir la proteasa NS3/4A de VHC en comparación con otras serinas o cisteína proteasas.
Las especificidades de los compuestos de la presente invención se determinaron frente a una diversidad de serinaproteasas: elastasa de neutrófilos humana (HNE), elastasa pancreática porcina (PPE) y quimotripsina pancreáticahumana y una cisteína proteasa: catepsina B hepática humana. En todos los casos se usó un protocolo de formatode placa de 96 pocillos usando sustrato colorimétrico p-nitroanilina (pNA) específico para cada enzima como se hadescrito previamente (PCT Solicitud de Patente Nº WO 00/09543) con algunas modificaciones a los ensayos de serina proteasa. Todas las enzimas se obtuvieron en Sigma mientras que los sustratos se obtuvieron en Bachem.
Cada ensayo incluyó una preincubación con inhibidor de enzima de 2 horas a temperatura ambiente seguida deadición de sustrato e hidrólisis hasta ~ el 30 % de conversión medido en un lector de microplaca Spectramax Pro.Las concentraciones del compuesto variaron de 100 a 0,4 micromolar ("μM") dependiendo de su potencia.
Las condiciones finales de cada ensayo fueron las siguientes:
Tris(hidroximetil)aminometano clorhidrato (Tris-HCl) 50 milimolar ("mM") pH 8, sulfato de sodio (Na2SO4) 0,5 M, NaCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, DMSO al 3 %, Tween-20 al 0,01 % con:
succ-AAA-pNA 133 μM y HNE 20 nM o PPE 8 nM; succ-AAPF-pNA 100 μM y quimotripsina 250 pM.
NAHPO4 (fosfato de hidrógeno de sodio) 100 mM, pH 6, EDTA 0,1 mM, DMSO al 3 %, TCEP 1 mM (Tris(2carboxietil)fosfina clorhidrato), Tween-20 al 0,01 %, Z-FR-pNA 30 μM y Catepsina B 5 nM (reserva de enzima activada en tampón que contenía TCEP 20 mM antes del uso).
El porcentaje de inhibición se calculó usando la fórmula:
[1-((UVinh-UVblanco)/(UVct1-UVblanco))] x 100
Se aplicó un ajuste de curva no lineal a los datos de concentración de inhibición y se calculó la concentración eficazdel 50 % (CI50) mediante el uso de software Excel XI-fit.
En la presente invención se usaron ensayos de Replicón de VHC y se prepararon, condujeron y validaron de laforma siguiente:
Generación de Replicón de VHC
Se estableció un sistema de células enteras de Replicón de VHC como ha descrito Lohmann V, Korner F, Koch J,Herian U, Theilmann L, Bartenschlager R., Science 285(5424): 110-3 (1999). Este sistema permitió evaluar losefectos de los compuestos de Proteasa de VHC sobre la replicación del ARN de VHC. Brevemente, usando la secuencia de la cepa 1b de VHC descrita en el documento Lohmann (Número de entrada: AJ238799), se sintetizó un ADNc de VHC mediante Operon Technologies, Inc. (Alameda, CA) y después el replicón de longitud completa seensambló en un plásmido pGEM9zf(+) (promega, Madison, WI) usando técnicas de biología molecularconvencionales. El replicón está constituido por (i) el UTR 5' de VHC condensado con los primeros 12 aminoácidosde la proteína de cápside, (ii) el gen de neomicina fosfotransferasa (neo), (iii) los IRES del virus de laencefalomiocarditis (EMCV) y (iv) los genes NS3 a NS5B de VHC y el UTR 3' de VHC. Los ADN de plásmidos selinealizaron con Scal y los transcritos de ARN se sintetizaron in vitro usando el kit de transcripción T7 MegaScript(Ambion, Austin, TX) de acuerdo con las direcciones del fabricante. Para generar líneas celulares, se electroporaron4 x 106 células Huh-7 (proporcionadas gentilmente por R. Bartenschlager y disponibles en Health Science ResearchResources Bank, Japan Health Sciences Foundation) (GenePulser System, Bio-Rad) con 10 microgramos ("μg") detranscrito de ARN y se sembraron en placas en platos de 100 mm. Después de 24 horas, se añadió medio selectivoque contenía 1,0 miligramos/mililitro ("mg/ml") de G418 y se cambió el medio cada 3 a 5 días. Aproximadamente 4semanas después de la electroporación, eran visibles colonias pequeñas que se aislaron y se expandieron para análisis adicional. Estas líneas celulares se mantuvieron a 37 ºC, CO2 al 5 %, humedad relativa del 100 % en DMEM (nº de cat. 11965-084) Gibco-BRL, Rockvill, MD, con suero bovino inactivado por calor al 10 % (Sigma), 10 ml de100X penicilina/estreptomicina (nº de cat. 15140-122) Gibco-BRL, Rockville, MD, Geneticin (nº Cat. 10131-027)Gibco-BRL, Rockville, MD a 1 mg/ml. Una de las líneas celulares (depositada como Nº de Entrada de ATCC PTA4583 en la Colección Americana de Cultivos Tipo) que tenía aproximadamente 3.000 copias de replicón ARN deVHC/célula se usó para el desarrollo del ensayo (células replicón 1b-377-neo de VHC).
Ensayo FRET
Se cultivaron células Huh7, que expresan constitutivamente el replicón de VHC, el Medio Eagle Modificado deDulbecco (DMEM) que contenía suero fetal bovino (FCS) al 10 % y 1 mg/ml de G418 (Gibco-BRL). Las células sesembraron la noche anterior (1,5 x 104 células/pocillo) en placas estériles de cultivo tisular de 96 pocillos. Seprepararon controles con compuesto y sin compuesto en DMEM que contenía FCS al 4 %, penicilina/estreptomicina1:100, L-glutamina 1:100 y DMSO al 5 % en la placa de dilución (concentración final de DMSO al 0,5 % en elensayo). Las mezclas de compuesto/DMSO se añadieron a las células y se incubaron durante 4 días a 37 ºC.Después de 4 días, se evaluó en primer lugar la citotoxicidad de las células usando Azul de alamar (Trek DiagnosticSystems) para una lectura de CC50. Se determinó la toxicidad del compuesto (CC50) mediante la adición de 1/10volumen de Azul de alamar al medio en el que se incubaban las células. Después de 4 h, se leyó la señal defluorescencia de capa pocillo, con una longitud de onda de excitación a 530 nm y una longitud de onda de emisiónde 580 nm, usando el Cytofluor Series 4000 (Perspective Biosystems). Después las placas se enjuagaron abundantemente con Solución Salina Tamponada con Fosfato (PBS) (3 veces 150 μl). Las células se lisaron con 25 μl de un reactivo de ensayo de lisis que contenía sustrato de proteasa de VHC (reactivo Luciferasa de lisis de cultivocelular 5X células (Promega nº E153A) diluido hasta 1X con agua destilada, NaCl añadido hasta 150 mM final, elpéptido FRET diluido hasta 10 µM final a partir de una reserva 2 mM en DMSO al 100 %). El sustrato proteasa deVHC (péptido FRET; AnaSpec, Inc. nº de cat. 22991, descrito por Taliani y col. en Anal. Biochem. 240 (2): 60-67 (1996)) contiene un donante de fluorescencia, EDANS, cerca de un extremo del péptido y un receptor, DABCYL, cerca del otro extremo. La fluorescencia del péptido se inactiva mediante transferencia de energía de resonanciaintermolecular (RET) entre el donante y el receptor, pero a medida que la proteasa NS3 escinde el péptido losproductos se liberan a partir de la inactivación del RET y la fluorescencia del donante se vuelve aparente. Despuésla placa se puso en el instrumento Cytofluor 4000 que se había ajustado a 340 nm de excitación/490 nm de emisión,modo automático durante 21 ciclos y la placa se leyó en un modo cinético a 25 ºC. Las reacciones se siguierongeneralmente durante aproximadamente 15 minutos.
El porcentaje de inhibición tanto para la eficacia como para la citotoxicidad se calculó con la siguiente ecuación:
100 - [( Finh/ Fcon)x100]
en la que δF es el cambio en la fluorescencia a lo largo del intervalo lineal de la curva. Se aplicó un ajuste de curvano lineal a los datos de concentración de inhibición y se calculó la concentración eficaz del 50 % (CE50 y CC50) mediante el uso de software Excel Xl-fit usando la ecuación, y=A+((B-A)/(1+((C/x)^D))).
Ensayo de Luciferasa
Como un ensayo secundario, las determinaciones de CE50 a partir del ensayo FRET de replicón se confirmaron enun ensayo indicador de luciferasa. El uso de un ensayo de indicador de luciferasa de replicón se describió en primerlugar en Krieger y col. (Krieger N, Lohmann V, y Bartenschlager R, J. Virol. 75(10): 4614-4624 (2001)). Laconstrucción de replicón descrita para el ensayo FRET se modificó mediante el reemplazo del gen de resistencia a la neomicina con un casete que contenía gen de Luciferasa Renilla condensado con una secuencia que representa unsitio de escisión NS3 (sitio NS4A/B), seguido del gen de la resistencia a Blasticidina (sitios de restricción Asc1/Pmelusados para la subclonación). También se introdujo la mutación adaptativa en la posición 1179 (serina a isoleucina)(Blight KJ, Kolykhalov, AA, Rice, CM, Science 290(5498): 1972-1974). Se seleccionó una línea celular que conteníael replicón y se mantuvo en 1,25 μg/ml de Blasticidina. El ensayo del indicador de Luciferasa se preparó sembrando las células de replicón la noche anterior a una densidad de 7000 células/pocillo en placas de 96 pocillos. Un día después, el medio se cambió a DMEM fresco que contenía FBS al 4 % y se prepararon diluciones del compuesto yse añadieron a una concentración final de DMSO al 0,5 % (volumen de medio final de 150 μl). A continuación de una incubación adicional de 4 días en una incubadora a 37 ºC/CO2 al 5 %, las células se analizaron para la actividad deluciferasa Renilla usando el Sistema de Ensayo de Luciferasa Promega Dual-Glo. Se retiró medio (100 μl) de cada pocillo. A los 50 μl restantes de medio, se añadieron 50 μl de Reactivo de Luciferasa Dual-Glo y las placas seagitaron durante 10 minutos hasta 2 horas a temperatura ambiente. Después se añadió Reactivo Dual-Glo Stop &Glo (50 μl) a cada pocillo y las placas se agitaron de nuevo durante 10 minutos hasta 2 horas adicionales atemperatura ambiente. Las placas se leyeron en un Packard TopCount NXT usando un programa de luminiscencia.
El porcentaje de inhibición se calculó usando la siguiente fórmula:
Los valores se graficaron y analizaron usando XLFit para obtener el valor de CE50.
Los compuestos representativos de la invención se evaluaron en el ensayo de enzima recombinante de proteasaNS3/4A de VHC, el ensayo basado en células de replicón de VHC y/o en varios de los ensayos de especificidad descritos. Por ejemplo, se observó que el Compuesto 2 tiene una CI50 de 26 nM frente a la cepa BMS de proteasa NS3/4A en el ensayo enzimatico. Se obtuvieron valores de potencia similares con las cepas publicadas H77C (CI50 de 4,2 nM) y J4L6S (CI50 de 1,9 nM). El valor de CE50 en el ensayo de replicón fue 146 nM.
En los ensayos de especificidad, se observó que el mismo compuesto tenía la actividad siguiente: HNE > 100 μM; PPE > 100 μM; Quimotripsina > 100 μM y Catepsina B > 100 μM. Estos resultados indican que esta familia decompuestos es altamente específica para la proteasa NS3 y muchos de estos miembros inhiben la replicación del replicón de VHC.
Se observó que los compuestos ensayados tenían actividades en los siguientes intervalos:
Intervalos de Actividad de CI50 (Cepa BMS NS3/4A): A es < 50 μM; B es < 5 μM; C es < 0,5μM;
D es <0,05 μM
Intervalo de Actividad de CE50 (para los compuestos ensayados): A es < 50 μM; B es < 5 μM; C es < 0,5 μM;
D es < 0,05 μM
Tablas 6 y 7: Tablas de Actividad del Compuesto
Tabla 6
Estudios de Combinación
Ya que en las infecciones virales que siguen terapias de agente único con frecuencia se desarrolla resistencia clínicaa los fármacos, existe la necesidad de evaluar las propiedades aditivas, antagonistas o sinérgicas de las terapias decombinación. Se usó el sistema de replicón de VHC, como se ha descrito anteriormente, para evaluar el uso potencial del inhibidor macrocíclico de proteasa NS3 en terapias de combinación con Intrón A e inhibidores dirigidos a otras proteínas de VHC. Se ensayaron tres antivirales de VHC, Intrón A (Interferón alfa-2b recombinante) uninhibidor NS5A de VHC que tiene la estructura siguiente:
MS(ESI) m/z= 691,2 (MH+); HPLC tr 1,21 min; Pureza (el 99 %), y un inhibidor de replicasa NS5B (compuesto 2006; documento WO 03/010141), en combinaciones de dos fármaco con el compuesto 28 inhibidor de proteasa NS3 de VHC macrocíclico. Además, también se ensayó el compuesto 28 en combinaciones de tres fármacos con losinhibidores NS5A y NS5B.
Para los experimentos mostrados en las Tablas 8 y 9, se ensayaron inhibidores a once concentraciones cada uno.Se prepararon soluciones de reserva de 200x de cada concentración de inhibidor mediante diluciones dobles otriples en DMSO antes de la adición de células/medio. Los fármacos se ensayaron como monoterapias y en combinación con el inhibidor de proteasa NS3 a diversas proporciones de concentración. Las células se expusierona compuestos durante 4 días y después se determinó la cantidad de inhibición de VHC usando el ensayo FRET. Lascitotoxicidades potenciales de estos agentes combinados también se analizaron en paralelo mediante tinción de azulde alamar. Los valores CC50 para los compuestos presentados fueron mayores que la concentración de inhibidorensayado más alta. Se determinó el grado de antagonismo, aditividad o sinergia a lo largo de un intervalo de concentraciones de fármaco y las curvas de respuesta de combinación se ajustaron para evaluar los efectosantivirales de las combinaciones de tratamiento de fármacos. Las proporciones de concentración se analizaronusando el método de Chou (Chou, Ting-Chao, y Rideout (Editors), (1991) Synergism and Antagonism inChemotherapy, P. 61-101, Academic Press, New York). Las Tablas 8 y 9 indican los valores estimados de CE50 paralos compuestos ensayados, así como los índices de combinación (IC). Todas las estimaciones se calcularon usando SAS Proc NLIN y una logística de dos parámetros. Todos los índices de combinación se ensayaron para ladesviación de la aditividad usando procedimientos de isobolograma. También se calcularon los intervalos de confianza asintótica para cada uno de los índices de combinación. Estos intervalos se usan para ensayar ladesviación a partir de la aditividad comparando las uniones con uno - una unión inferior del intervalo mayor de 1indica antagonismo, una unión superior de menos de 1 indica sinergia y un valor de 1 contenido en el intervalo indica aditividad. Además del enfoque del índice de combinación, anteriormente, también se usó el Enfoque de Superficiede Respuesta Universal (URSA) para evaluar los efectos antivirales de combinaciones de inhibidores NS5A o NS5Bcon el inhibidor de proteasa NS3. Los experimentos se condujeron en un formato matricial con 8 concentraciones deinhibidor de proteasa NS3 cruzadas frente a 10 concentraciones de inhibidor de NS5A o NS5B en cada una de lastres placas. Se prepararon soluciones de reserva de 200x de cada concentración de inhibidor mediante dilución triple en DMSO. Los efectos sobre la replicación se evaluaron en el sistema de replicón de VHC como se ha descritoanteriormente. Los datos se analizaron usando el URSA como se ha descrito en Greco, Park y Rustum (Greco, Park,Sook, y Rustum (1990) Application of a New Approach for the Quantitation of Drug Synergism to the Combination of cis-Diam-minedicloroplatinum y 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine, Cancer Research, 50, 5318-5327). La interacciónde los dos fármacos se evaluó mediante el uso de regresión no lineal con un algoritmo de bisección. Se estimaron 7 parámetros. Los mismos incluyen la respuesta mínima o respuesta en ausencia del fármaco, la respuesta máxima orespuesta en presencia del fármaco infinito, CE50 de los dos fármacos, parámetros dependiente de los dos fármacos y el parámetro α de interacción de fármacos que proporciona la evaluación de sinergia, antagonismo o aditividad.Las Tablas 10 y 11 presentan parámetros clave estimados y errores típicos. La aditividad está implicada cuando α es igual a cero, sinergia si el parámetro de interacción es mayor que cero y antagonismo cuando el parámetro de interacción es menor que cero. También se presenta el intervalo de confianza del parámetro de interacción. Esteintervalo se usa para ensayar la desviación a partir de la aditividad comparando las uniones a cero-una unión inferiordel intervalo mayor que cero indica sinergia, una unión superior de menos de cero indica antagonismo y un valor de cero contenido de un intervalo indica aditividad.
La Tabla 8 resume los datos de las combinaciones de compuesto 28 con Intrón A. También se presentan los valoresde CE50 para cada monoterapia. En dos experimentos, la combinación de compuesto 28 con Intrón A produjoefectos o sinérgicos o de aditividad en las dosis eficaces del 75 %, 90 % y 95 %.
5 Los efectos del compuesto 28 en combinación con el inhibidor NS5A de VHC se resumen en la Tabla 9. Se observó sinergia o aditividad en dos experimentos en las dosis eficaces del 75, 90 y 95 % del compuesto 28. Más importante,no se observó antagonismo farmacológico en las dosis eficaces del 75, 90 o del 95 % cuando el compuesto 28 secombinó con el inhibidor NS5A de VHC o Interferón alfa-2b. Los experimentos de seguimiento que usaron estasmismas combinaciones de inhibidor en el formato de matriz (Tabla 10) produjeron resultados similares a los
10 experimentos de índice de combinación; aditividad para la combinación del inhibidor NS5A con el compuesto 28.
El formato de matriz también se usó para examinar la actividad de combinaciones del inhibidor NS5B de VHC, con elcompuesto 28 (Tabla 11). En dos experimentos, se observó aditividad global.
El compuesto 28 también se ensayó en experimentos de combinación de 3 fármacos con el inhibidor NS5A y el inhibidor NS5B (Tabla 12). Las concentraciones iniciales de las monoterapias estaban constituidas por una solución15 del inhibidor NS5A 0,667 μM, una solución del compuesto 28 0,3 μM y una solución del inhibidor NS5B 2,5 μM. La concentración inicial de la combinación triple contenía una mezcla de 1/3 de cada una de las concentracionesanteriores. Se obtuvieron curvas de dosis respuesta para las tres monoterapias y la terapia de combinación tripleusando diluciones triples y se realizó el análisis de los datos como se ha descrito anteriormente para los experimentos de índice de combinación. Se observaron efectos sinérgicos usando la combinación triple. No se
20 observó antagonismo farmacológico en las dosis eficaces del 75, 90 o del 95 % con la combinación de 3 fármacos. Estos resultados demuestran que el tratamiento de combinación de células de replicón con el inhibidor de proteasaNS3 de VHC, compuesto 28 e Intrón A y/o inhibidores dirigidos a NS5A de VHC y/o NS5B, produjeron efectosantivirales aditivos a sinérgicos. La capacidad de usar estos inhibidores de proteasa NS3 en terapia de combinaciónpuede proporcionar ventajas fundamentales frente a los tratamientos de fármaco único para el tratamiento de VHC.
TABLA 8: Combinaciones de Dos Fármacos con Interferón alfa-2b
Experimento
CE50 de inhibidor de proteasa NS3, μM CE50 de Interferón alfa-2b, unidades por ml Proporción molar, inhibidor de proteasa NS3 a Interferón alfa-2b Índices de Combinación (intervalo de confianza) Resultado global
75 % eficaz
90 % eficaz 95 % eficaz
1
0,008 20 2:5 0,67 (0,53, 0,8) 0,59 (0,4, 0,77) 0,56 (0,33, 0,79) Sinergia
1:1
0,57 (0,48, 0,66) 0,5 (0,38, 0,62) 0,46 (0,32, 0,61) Sinergia
4:25
1,02 (0,88, 1,16) 0,64 (0,5, 0,78) 0,5 (0,36, 0,64) Aditividad al 75 %; Sinergia al90, 95 %
2
0,01 51 2:5 0,59 (0,43, 0,74) 0,38 (0,22, 0,54) 0,28 (0,13, 0,43) Sinergia
1:1
0,50 (0,44, 0,56) 0,33 (0,27, 0,39) 0,25 (0,19, 0,31) Sinergia
4:25
1,03 (0,87, 1,19) 0,65 (0,50, 0,81) 0,48 (0,33, 0,63) Aditividad al 75 %; Sinergia al90, 95 %
TABLA 9: Combinaciones de Dos Fármacos con un Inhibidor NS5A TABLA 11: Combinaciones de Dos Fármacos con un Inhibidor NS5B: Estudios de Matriz
Experimento
CE50 de inhibidor de proteasa NS3, μM CE50 de inhibidor NS5A, μM Proporción molar, inhibidor de proteasa NS3 a inhibidor NS5A Índices de Combinación (intervalo de confianza) Resultado global
75 % eficaz
90 % eficaz 95 % eficaz
1
0,009 0,043 3:100 0,66 (0,47,0,85) 0,61 (0,35,0,88) 0,59 (0,27,0,91) Sinergia
3:250
0,57 (0,41, 0,73) 0,62 (0,36, 0,89) 0,66 (0,3, 1,02) Aditividad al 95 %; Sinergia al75, 90 %
3:40
0,73 (0,55, 0,9) 0,64 (0,43, 0,85) 0,59 (0,34, 0,83) Sinergia
2
0,011 0,005 1:5 1,1 (0,91, 1,3) 1,15 (0,82, 1,47) 1,18 (0,75, 1,61) Aditividad
2:25
1,24 (1,0, 1,49) 1,19 (0,81, 1,58) 1,16 (0,67, 1,65) Aditividad
1:2
1,0 (0,88, 1,14) 0,83 (0,67, 1,0) 0,73 (0,54, 0,92) Aditividad al 75 %; Sinergia al90, 95 %

TABLA 10: Combinaciones de Dos Fármacos con un Inhibidor de NS5A: Estudios de Matriz
Error Típico
Resultado Global
CE50 Compuesto 28, μM
0,009 0,52
CE50 inhibidor NS5A, μM
0,008 0,46
Parámetro de Interacción alfa (intervalo de confianza)
0,63 (-0,09, 1,36) 0,37 Aditividad
Experimento 1
Error Típico Resultado Global Experimento 2 Error Típico Resultado Global
CE50 Compuesto 28, μM
0,015 0,53 0,020 0,87
CE50 inhibidor NS5B, μM
0,059 2,63 0,050 2,39
Parámetro de Interacción alfa (intervalo de confianza)
0,47 (-0,05, 1,0) 0,27 Aditividad 0,31 (-0,22, 0,83) 0,27 Aditividad

TABLA 12: Estudios de Combinación de Tres Fármacos
Resultado Global
Sinergia Sinergia
Índices de Combinación (intervalo de confianza)
95 % eficaz 0,65(0,37, 0,93) 5 0,52 (0,36, 0,67)
90 % eficaz
0,7(0,47, 0,93) 100,58(0,44, 0,72)
75 % eficaz
0,78(0,62, 0,94) 15 0,71(0,6, 0,81)
CE50 inhibidorNS5B, μM
0,052 0,064
Proporción molar,inhibidor de proteasa NS3a inhibidor NS5A a inhibidorNS5B
9:20:75 209:20:75
CE50 inhibidorNS5B, μM
0,052 250,064
CE50 inhibidorNS5A, μM
0,005 0,009
CE50 inhibidorNS3 Pr, μM
0,008 0,009
Experimento
1 2
Rasgos adicionales de los compuestos descritos:
1. Un compuesto de fórmula I:
en el que:
(a) R1, R2, R3, R4, R5 y R6 son cada uno independientemente H; alquilo C1-6; cicloalquilo C3-7; alcoxi C16; cicloalcoxi C3-7; halo-alcoxi C1-6; halo-alquilo C1-6; ciano; halo; hidroxilo; alcanoílo C1-6; nitro; amino; mono o di-alquil (C1-6)-amina; mono o di-cicloalquil (C3-7)-amina; mono o di-alquil C1-6-amida; mono o
10 di-cicloalquil (C3-7)-amida; carboxilo; carboxiéster (C1-6); tiol; tioalquilo C1-6; alquilsulfóxido C1-6; alquil C1-6-sulfona; alquil C1-6-sulfonamida; arilo C6-10 opcionalmente sustituido con Het; alquilarilo C7-14; ariloxi C6-10; alquilariloxi C7-14; heteroariloxi monocíclico de 4-7 miembros; o Het; dichos R1 a R6 opcionalmente unidos al grupo isoquinolina mediante un grupo enlazador alquilo C1-6;
(b) R7 es NH2 o -NR10R11; donde R10 es alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, C(O)-NR12R13, C(O)-OR14, C(O)
15 SR15 o -C(O)-R16; R11 es H, alquilo C1-6 o haloalquilo C1-6, con la condición de que si R12 o R13 es H entonces R11 es H;
R12 y R13 son cada uno independientemente H; alquilo C1-6, cicloalquilo C3-7 o alquilcicloalquilo C4-10, cada uno opcionalmente sustituido con halo, alcoxi C1-3, haloalcoxi C1-3, alquilo C1-3 o haloalquilo C1-3;
o arilo; y donde R12 y R13 junto con el nitrógeno al que están unidos pueden formar un heterociclo de
20 4-7 miembros; R14 y R15 son cada uno independientemente alquilo C1-6, cicloalquilo C3-7 o alquilcicloalquilo C4-10, cada uno opcionalmente sustituido con halo, alcoxi C1-3, haloalcoxi C1-3, alquilo C1-3 o haloalquilo C1-3; arilo o Het; R16 es H; alquilo C1-6, cicloalquilo C3-7 o alquilcicloalquilo C4-10, cada uno opcionalmente sustituido con halo, alcoxi C1-3, haloalcoxi C1-3, alquilo C1-3 o haloalquilo C1-3; arilo o Het;
25 (c) R8 y R9 son cada uno independientemente H o alquilo C1-3 opcionalmente sustituido con halo, o alcoxi C1-3, o haloalcoxi C1-3;
(d)
Q es una cadena C3-9 saturada o insaturada que contiene opcionalmente de uno a tres
heteroátomos seleccionados independientemente entre O, S(O)m; donde m es 0, 1 ó 2 o NR17, donde R17 es H; alquilo C1-6 o cicloalquilo C1-6, cada uno opcionalmente sustituido con halo, alcoxi C1-6, ciano
o haloalcoxi C1-6; -C(O)-R18, C(O)-OR19, C(O)-NR20R21 o -SO2R22; R18, R20 y R21 son cada uno independientemente H; alquilo C1-6 o cicloalquilo C1-6, cada uno opcionalmente sustituido con halo, alcoxi C1-6, ciano o haloalcoxi C1-6; R19 es alquilo C1-6 o cicloalquilo C1-6, cada uno opcionalmente sustituido con halo, alcoxi C1-6, ciano o haloalcoxi C1-6; R22 es arilo, alquilo C1-6 o cicloalquilo C1-6, cada uno opcionalmente sustituido con halo, alcoxi C1-6, ciano o haloalcoxi C1-6; y
(e)
W es OH, -NH-SOn-R23 o NH-SOn-R24; en las que n es 1 ó 2, R23 es alquilo C1-8, alquilcicloalquilo C4-10, cicloalquilo C3-7 sin sustituir, o ciclopropilo o ciclobutilo opcionalmente sustituido con alquil C7-9arilo o alquilo C1-4 opcionalmente sustituido con halo, alcoxi C1-3, ciano, amina, mono o di-alquil C1-6amina, mono o di-alquil C1-6-amida o carboxilato; y R24 es arilo C6-10 o Het;
o un enantiómero, diastereómero, sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo.
2.
El compuesto de rasgo 1 en el que R1 se une a la posición C3 y se selecciona entre H; alquilo C1-6; cicloalquilo C3-7; alcoxi C1-6; cicloalcoxi C3-7; halo-alcoxi C1-6; halo-alquilo C1-6; ciano; halo; alcanoílo C1-6; mono o di-alquil (C1-6)-amina; mono o di-alquil C1-6-amida; carboxilo; arilo C6-10 opcionalmente sustituido con Het; alquilarilo C7-14; ariloxi C6-10 o Het.
3.
El compuesto de rasgo 1 en el que R2, R3, y R4 se unen a las posiciones C4, C5 y C6, respectivamente, y cada uno se selecciona independientemente entre H; alquilo C1-6; cicloalquilo C3-7; alcoxi C1-6; cicloalcoxi C3-7; halo-alcoxi C1-6; halo-alquilo C1-6; ciano; halo; hidroxilo; alcanoílo C1-6; mono o di-alquil (C1-6)-amina; mono o di-cicloalquil (C3-7)-amina; mono o di-alquil C1-6-amida; mono o di-cicloalquil (C3-7)-amida; carboxilo; arilo C6-10 opcionalmente sustituido con Het; alquilarilo C7-14; ariloxi C6-10; o Het.
4.
El compuesto de rasgo 1 en el que R5 y R6 se unen a las posiciones C7 y C8, respectivamente, y cada uno se selecciona independientemente entre H; alquilo C1-3; cicloalquilo C3-4; alcoxi C1-3; cicloalcoxi C3-4; halo-alcoxi C1-3; halo-alquilo C1-3; ciano; halo; hidroxilo; alcanoílo C1-3; mono o di-alquil (C1-3)-amina; mono
o di-cicloalquil (C3-4)-amina; mono o di-alquil C1-3-amida; mono o di-cicloalquil (C3-4)-amida; o carboxilo.
5.
El compuesto de rasgo 1 en el que Q es una cadena C3-9 saturada o insaturada que contieneopcionalmente de uno a tres heteroátomos seleccionados independientemente entre O, S(O)m; donde m es 0, 1 ó 2 o NR17, donde R17 es H; alquilo C1-6, cicloalquilo C1-6, - C(O)-R18, C(O)-OR19, C(O)-NR20R21 o -SO2R22.
6.
El compuesto de rasgo 5 en la que R18, R20 y R21 son cada uno independientemente H; alquilo C1-6 o cicloalquilo C1-6; R19 es alquilo C1-6 o cicloalquilo C1-6; y R22 es arilo, alquilo C1-6 o cicloalquilo C1-6, cada uno opcionalmente sustituido con halo.
7.
El compuesto de rasgo 1 en el que W es OH, -NH-SOn-R23 o NH-SOn-R24 que n es 1 ó 2, R23 es cicloalquilo C3-7 sin sustituir, o ciclopropilo o ciclobutilo opcionalmente sustituido con alquil C7-9-arilo o alquilo C1-4; y R24 es arilo C6-10 o Het.
8.
Un compuesto de fórmula II:
en el que:
(a)
R1 es H; alquilo C1-6; cicloalquilo C3-7; alcoxi C1-6; cicloalcoxi C3-7; halo-alcoxi C1-6; halo-alquilo C16; ciano; halo; alcanoílo C1-6; mono o di-alquil (C1-6)-amina; mono o di-alquil C1-6-amida; carboxilo; arilo C6-10 opcionalmente sustituido con Het; alquilarilo C7-14; ariloxi C6-10 o Het; dicho R1 opcionalmente unido al grupo isoquinolina mediante un grupo enlazador alquilo C1-6; R2, R3 y R4 son cada uno independientemente H; alquilo C1-6; cicloalquilo C3-7; alcoxi C1-6; cicloalcoxi C3-7; halo-alcoxi C1-6; halo-alquilo C1-6; ciano; halo; hidroxilo; alcanoílo C1-6; mono o di-alquil (C1-6)-amina; mono o dicicloalquil (C3-7)-amina; mono o di-alquil C1-6-amida; mono o di-cicloalquil (C3-7)-amida; carboxilo; arilo C6-10 opcionalmente sustituido con Het; alquilarilo C7-14; ariloxi C6-10; o Het; dichos R2 a R4 opcionalmente unidos al grupo isoquinolina mediante un grupo enlazador alquilo C1-3; R5 y R6 son cada uno independientemente H; alquilo C1-3; cicloalquilo C3-4; alcoxi C1-3; cicloalcoxi C3-4; halo-alcoxi C1-3; halo-alquilo C1-3; ciano; halo; hidroxilo; alcanoílo C1-3; mono o di-alquil (C1-3)-amina; mono o dicicloalquil (C3-4)-amina; mono o di-alquil C1-3-amida; mono o di-cicloalquil (C3-4)-amida; o carboxilo;
(b)
R7 es NH2 o -NR10R11; donde R10 es alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, C(O)-NR12R13, C(O)-OR14 o C(O)-R16; R11 es H, alquilo C1-6 o haloalquilo C1-6, con la condición de que si R12 o R13 es H entonces R11 sea H; R12 y R13 son cada uno independientemente H; alquilo C1-6, cicloalquilo C3-7 o alquilcicloalquilo C4-10, cada uno opcionalmente sustituido con halo, alcoxi C1-3, haloalcoxi C1-3, alquilo C1-3 o haloalquilo C1-3; y donde R12 y R13 junto con el nitrógeno al que están unidos pueden formar un heterociclo de 4-7 miembros; R14 y R15 son cada uno independientemente alquilo C1-6, cicloalquilo C3-7 o alquilcicloalquilo C4-10, cada uno opcionalmente sustituido con halo, alcoxi C1-3, haloalcoxi C1-3, alquilo C1-3 o haloalquilo C1-3; R16 es H; alquilo C1-6, cicloalquilo C3-7 o alquilcicloalquilo C4-10, cada uno opcionalmente sustituido con halo, alcoxi C1-3, haloalcoxi C1-3, alquilo C1-3 o haloalquilo C1-3; arilo o Het;
(c)
R8 y R9 son cada uno independientemente H o alquilo C1-3 opcionalmente sustituido con halo, o alcoxi C1-3 o haloalcoxi C1-3,
(d)
Q es una cadena C3-9 saturada o insaturada que contiene opcionalmente de uno a tres heteroátomos seleccionados independientemente entre O, S(O)m; donde m es 0, 1 ó 2 o NR17, donde R17 es H; alquilo C1-6, cicloalquilo C1-6, -C(O)-R18, C(O)-OR19, C(O)-NR20R21 o -SO2R22; R18, R20 y R21 son cada uno independientemente H; alquilo C1-6 o cicloalquilo C1-6; R19 es alquilo C1-6 o cicloalquilo C1-6; R22 es arilo, alquilo C1-6 o cicloalquilo C1-6, cada uno opcionalmente sustituido con halo; y
(e)
W es OH, -NH-SOn-R23 o NH-SOn-R24, donde n es 1 ó 2, R23 es cicloalquilo C3-7 sin sustituir, o ciclopropilo o ciclobutilo opcionalmente sustituido con alquil C7-9-arilo o alquilo C1-4; y R24 es arilo C610 o Het;
o un enantiómero, diastereómero, sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo.
9. El compuesto de rasgo 8 en el que R1 es H; alcoxi C1-3; mono o di-alquil (C1-6)-amina; un heterociclo monocíclico de 5 ó 6 miembros; o arilo C6-10 opcionalmente sustituido con un heterociclo monocíclico de 5 ó 6 miembros.
10. El compuesto de rasgo 8 en el que R2, R3, R4 y R5 son cada uno independientemente H; alcoxi C1-6; 5 halo-alcoxi C1-6; hidroxilo; o mono o di-alquil (C1-6)-amina.
11.
El compuesto de rasgo 8 en el que R7 es NH2 o NHR10; donde R10 es C(O)-N R12R13 o C(O)-OR14; yR12 y R13 son alquilo C1-6 opcionalmente sustituido con halo; y R14 es alquilo C1-6 o cicloalquilo C3-7 opcionalmente sustituido con halo.
12.
El compuesto de rasgo 8 en el que Q es una cadena de C5-7 miembros que tiene un doble enlace que
10 contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado independientemente entre O, S(O)m; donde m es 0, 1 ó 2 o NR17, donde R17 es H; alquilo C1-6 o cicloalquilo C1-6.
13. El compuesto de rasgo 8 en el que Q tiene la siguiente estructura:
en la que P es una cadena saturada C3 que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado 15 independientemente entre O, S(O)m; donde m es 0, 1 ó 2 o NR17.
14.
El compuesto de rasgo 8 en el que W es -NH-SOn-R23, en la que n es 1 ó 2 y R23 es cicloalquilo C3-7 sin sustituir, o ciclopropilo o ciclobutilo opcionalmente sustituido con alquil C7-9-arilo o alquilo C1-4.
15.
El compuesto de rasgo 8 en el que W es NH-SOn-R24, en la que n es 1 ó 2 y R24 es Het.
16.
El compuesto de rasgo 15 en el que dicho Het se selecciona entre el grupo constituido por:
17. Un compuesto de fórmula III:
5 en el que:
(a) R1 es H; alcoxi C1-3; di-alquil (C1-6)-amina; un heterociclo monocíclico de 5 ó 6 miembros; o arilo C6-10 opcionalmente sustituido con un heterociclo monocíclico de 5 ó 6 miembros;
R2, R3, R4 y R5 son cada uno independientemente H; alcoxi C1-3; halo; o di-alquil (C1-6)-amina;
(b) R7 es -NHR10; donde R10 es C(O)-NHR13 o C(O)-OR14; R13 y R14 son alquilo C1-6; 10 (c) Q es una cadena de C5-7 miembros que tiene un doble enlace que contiene opcionalmente un
heteroátomo seleccionado independientemente entre O, S(O)m; donde m es 0, 1 ó 2 o NR17, donde R17 es H; alquilo C1-6 o cicloalquilo C1-6; y
(d) R23 es cicloalquilo C3-7 sin sustituir, o ciclopropilo o ciclobutilo opcionalmente sustituido con alquil C7-9-arilo o alquilo C1-4;
5 o un enantiómero, diastereómero, sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo.
18.
El compuesto de rasgo 17 en el que R1 se selecciona entre el grupo constituido por piridina, morfolina,piperazina, oxazol, isoxazol, tiazol, imidazol, pirrol y pirazol.
19.
El compuesto de rasgo 17 en el que R1 es fenilo opcionalmente sustituido con uno o más miembros
seleccionados entre el grupo constituido por alcoxi C1-3, halo, carboxilo, di-alquil (C1-3)-amina, haloalquilo 10 C1-3, trifluorometilo, trifluorometoxi e hidroxi.
20.
El compuesto de rasgo 17 en el que R1 es di-alquil (C1-3)-amina.
21.
El compuesto de rasgo 17 en el que R1 es piperazina sustituida con uno o más miembros seleccionados entre el grupo constituido por alquilo C1-3, cicloalquilo C5-7 o piridina.
22. El compuesto de rasgo 17 en el que R2 es cloro o fluoro. 15 23. El compuesto de rasgo17 en el que R2 es di-alquil (C1-3)-amina o metoxi.
24.
El compuesto de rasgo 17 en el que Q tiene una estructura seleccionada entre las siguientes:
25.
El compuesto de rasgo 17 en el que Q tiene una estructura seleccionada entre las siguientes:
26.
Un compuesto seleccionado entre el grupo constituido por
27.
Una composición que comprende el compuesto de rasgo 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
28.
La composición de acuerdo con el rasgo 27 que comprende adicionalmente un compuesto que tieneuna actividad anti-HCV.
29.
La composición de acuerdo con el rasgo 28 en la que el compuesto que tiene actividad anti-HCV esun interferón.
30.
La composición de acuerdo con el rasgo 29 en la que el interferón se selecciona entre el grupoconstituido por interferón alfa 2B, interferón alfa pegilado, interferón de consenso, interferón alfa 2A einterferón tau linfoblastoide.
31.
La composición de acuerdo con el rasgo 28 en la que el compuesto que tiene actividad anti-HCV seselecciona entre el grupo constituido por interleuquina 2, interleuquina 6, interleuquina 12, un compuestoque potencia el desarrollo de una respuesta de células T ayudantes tipo 1, ARN interfiriente, ARNantisentido, Imiqimod, ribavirina, un inhibidor de inosina 5'-monofosfato deshidrogenasa, amantadina yrimantadina.
32.
La composición de acuerdo con el rasgo 28 que comprende adicionalmente un interferón y ribavirina.
33.
La composición de acuerdo con el rasgo 28 en la que el compuesto que tiene actividad anti-HCV esun compuesto de moléculas pequeñas.
34.
La composición de acuerdo con el rasgo 28 en la que el compuesto que tiene actividad anti-HCV eseficaz para inhibir la función de una diana seleccionada entre el grupo constituido por metaloproteasa deHCV, serina proteasa de HCV, polimerasa de HCV, helicasa de HCV, proteína NS4B de HCV, entrada deHCV, ensamblaje de HCV, salida de HCV, proteína NS5A de HCV, IMPDH y un análogo de nucleósidopara el tratamiento de una infección por HCV.
35.
Un procedimiento para inhibir la función de la serina proteasa de HCV in vitro que comprende poneren contacto la serina proteasa de HCV con el compuesto de rasgo 1.
36.
Un procedimiento para tratar una infección por HCV en un paciente, que comprende administrar alpaciente una cantidad efectiva terapéuticamente del compuesto de rasgo 1, o un enantiómero, diastereómero, solvato, profármaco o sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
37.
El procedimiento de acuerdo con el rasgo 36 en el que el compuesto es eficaz para inhibir la función de la serina proteasa de HCV.
38.
El procedimiento de acuerdo con el rasgo 36 que comprende adicionalmente administrar otrocompuesto que tiene actividad anti-HCV antes de, después de o a la vez que el compuesto de lareivindicación 1.
39.
El procedimiento de acuerdo con el rasgo 38 en el que el otro compuesto que tiene actividad anti-HCV es un interferón.
40.
El procedimiento de acuerdo con el rasgo 39 en el que el interferón se selecciona entre el grupoconstituido por interferón alfa 2B, interferón alfa pegilado, interferón de consenso, interferón alfa 2A,interferón tau linfoblastoide.
41.
El procedimiento de acuerdo con el rasgo 38 en el que el otro compuesto que tiene actividad anti-HCV se selecciona entre el grupo constituido por interleuquina 2, interleuquina 6, interleuquina 12, uncompuesto que potencia el desarrollo de una respuesta de células T ayudantes de tipo 1, ARNinterfiriente, ARN antisentido, lmiqimod, ribavirina, un inhibidor de inosina 5'-monofosfato deshidrogenasa,amantadina y rimantadina.
42.
El procedimiento de acuerdo con el rasgo 38 en el que el compuesto que tiene actividad anti-HCV esuna molécula pequeña.
43.
El procedimiento de acuerdo con el rasgo 42 en el que el compuesto que tiene actividad anti-HCV eseficaz para inhibir la función de una diana seleccionada entre el grupo constituido por metaloproteasa de
5 HCV, serina proteasa de HCV, polimerasa de HCV, helicasa de HCV, proteína NS4B de HCV, entrada de HCV, ensamblaje de HCV, salida de HCV, proteína NS5A de HCV, IMPDH y un análogo de nucleósidopara el tratamiento de una infección por HCV.
44. El procedimiento de acuerdo con el rasgo 38 en el que el otro compuesto que tiene actividad anti-HCV
es eficaz para inhibir la función de una diana en el ciclo de vida del HCV distinta de la serina proteasa de10 HCV.
45.
Uso del compuesto de rasgo 1 para la fabricación de un medicamento para tratar una infección porHCV en un paciente
46.
Uso de la composición de rasgo 27 para la fabricación de un medicamento para tratar una infecciónpor HCV en un paciente

Claims (7)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un proceso para separar una mezcla de enantiómeros de éster alquílico que comprende poner encontacto la mezcla con una enzima eficaz para estimular preferiblemente la hidrólisis de uno de losenantiómeros; caracterizado porque el contacto se lleva a cabo en presencia de un tampón, en el que el éster alquílico tiene la siguiente fórmula:
    en la que: R25 es un grupo protector del amino; y 10 R26 se selecciona entre el grupo constituido por alquilo C1-10, arilo C6-14, alquilarilo C7-16, cicloalquilo C3-7 o cicloalquil alquilo C3-10.
  2. 2.
    El proceso de la reivindicación 1, en el que el tampón se selecciona del grupo consistente en fosfatos,boratos y carbonatos.
  3. 3.
    El proceso de la reivindicación 1, en el que la enzima es una proteasa.
    15 4. El proceso de la reivindicación 1, en el que la enzima se selecciona del grupo constituido por Bacillus globigii, Bacillus licheniformis, Bacillus halodurans, Bacillus clausii, Aspergillus oryzae y mezclas de los mismos.
  4. 5. El proceso de la reivindicación 4, en el que la enzima se selecciona del grupo constituido por
    Alcalase® (proteasa subtilisina), Savinase® ( proteasa subtilisina), Esperase® (proteasa subtilisina), 20 FlavourzymeTM (proteasa fúngica) y mezclas de los mismos.
  5. 6.
    El proceso de la reivindicación 1, en el que el contacto se lleva a cabo a un pH de aproximadamente7,0 a 11.
  6. 7.
    El proceso de la reivindicación 1, en el que el contacto se lleva a cabo a una temperatura deaproximadamente de 30 a 60 ºC
    25 8. El proceso de la reivindicación 1, en el que el contacto se lleva a cabo durante un periodo de tiempo de menos de aproximadamente siete días.
  7. 9. El proceso de la reivindicación 8, en el que el contacto se lleva a cabo durante un periodo de tiempode aproximadamente dos horas a tres días.
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