NO337510B1

NO337510B1 - Fremgangsmåte for spaltning av en blanding av alkylesterenantiomerer

Info

Publication number: NO337510B1
Application number: NO20110945A
Authority: NO
Inventors: Zhizhen Barbara Zheng; Andrew Charles Good; Fiona Mcphee; Jeffrey Allen Campbell; Paul Michael Scola; Wenying Li; Stanley V D'andrea; Barry L Johnson; David J Carini
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2003-04-16
Filing date: 2011-06-30
Publication date: 2016-05-02
Also published as: WO2004094452A2; EP2033654A1; EP1629000A2; US20060257980A1; JP2006523714A; ES2320771T3; JP2010263896A; NO333049B1; IS8073A; EP1629000A4; US20050090432A1; ES2386161T3; NO20054841D0; DE602004019518D1; NO20110945L; EP1629000B1; JP4733023B2; NO20054841L; ATE422895T1; WO2004094452A3

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåte for spaltning av en blanding av alkylester-enantiomerer.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

HCV er et viktig humant patogen, beregnet å infisere 170 millioner personer verden over - omtrent fem ganger antallet infisert av humant immunsvikt-virus type 1. En stor del av disse HCV-infiserte individer utvikler alvorlig progressiv leversykdom, omfattende cirrhose og hepatocellulært karsinom (Lauer, G. M.; Walker, B. D. N. Engl. J. Med. (2001), 345, 41-52).

For tiden anvender den mest effektive HCV-terapi en kombinasjon av alfa-interferon og ribavirin, hvilket fører til langvarig effektivitet hos 40% av pasientene (Poynard, T. et al. Lancet (1998), 352, 1426-1432). Nyere kliniske resultater demonstrerer at pegylert alfa-interferon er bedre enn umodifisert alfa-interferon som monoterapi (Zeuzem, S. et al. N. Engl. J. Med. (2000), 343. 1666-1672). Imidlertid, selv med eksperimentelle terapeutiske regimer som involverer kombinasjoner av pegylert alfa-interferon og ribavirin, oppnår en vesentlig del av pasientene ikke langvarig reduksjon i vi ral belastning. Således er det et klart og umettet medisinsk behov for å utvikle effektive terapeutiske midler for behandling av HCV-infeksjon.

HCV er et positiv-trådet RNA-virus. Basert på en sammenligning av den utledede aminosyresekvens og den omfattende similaritet i den 5' utranslaterte region er HCV klassifisert som en separat slekt i Flaviviridae-familien. Alle medlemmer av Flaviviridae-familien har innkappede virioner som inneholder et positiv tråd RNA-genom som koder for alle kjente virus-spesifikke proteiner via translasjon av en enkel, uavbrutt, åpen leseramme.

Betraktelig heterogenitet er funnet innen nukleotidet og den kodede aminosyresekvens gjennom hele HCV-genomet. Minst seks viktige genotyper erkarakterisertog mer enn 50 undertyper er beskrevet. Hoved-genotyper av HCV avviker i deres distribusjon verden over og den kliniske betydning av den genetiske heterogenitet av HCV er fortsatt uklar til tross for en rekke undersøkelser av den mulige effekt av genotyper på patogenese og terapi.

Enkeltrådet HCV RNA-genom er omtrent 9500 nukleotider i lengde og har en enkel åpen leseramme (ORF) som koder for et enkelt stort polyprotein med ca. 3000 aminosyrer. I infiserte celler er dette polyprotein spaltet ved multiple seter av cellulære og virale proteaserfor å produsere strukturelle og ikke-strukturelle (NS) proteiner. I tilfellet av HCV blir dannelsen av modne ikke-strukturelle proteiner (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A og NS5B) utført av to virale proteaser. Den første spalter ved NS2-NS3-forbindelsen; den andre er en serinprotease inneholdt i den N-terminale region av NS3 og medierer alle de påfølgende spaltninger nedstrøms for NS3, både i cis, ved NS3-NS4A spaltningssetet og i trans, for de resterende NS4A-NS4B, NS4B-NS5A, NS5A-NS5B-seter. NS4A-proteinet synes å tjene multiple funksjoner, ved å virke som en kofaktorfor NS3-protease og muligens assistere i membranlokalisering av NS3 og andre virale replikase-komponenter. Kompleksdannelse mellom NS3 protease-domenet og dets kofaktor, NS4A, er essensiell for effektiv proteolytisk spaltning av de fire respektive seter. NS3-proteinet oppviser også nukleosid trifosfatase og RNA helikase-aktiviteter. NS5B er en RNA-avhengig RNA-polymerase som er involvert i replikasjon av HCV.

Blant forbindelsene som har demonstrert effektivitet i hemning av HCV-replikasjon, som selektive HCV-serinproteaseinhibitorer, er de makrocykliske peptid-forbindelser beskrevet i internasjonal søknad PCT/CA00/00353 (publikasjon nf. WO 00/59929).

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåte for spaltning av en blanding av alkylester-enantiomerer kjennetegent ved at den omfatter å bringe blandingen i kontakt med et enzym effektivt til preferensielt å fremme hydrolyse av én av enantiomerene;karakterisert vedat kontakten blir utført i nærvær av en buffer, hvor alkylesteren har den følgende formel:

og hvor:

R25er en amino-beskyttelsesgruppe; og

R26er valgt fra gruppen bestående av C1-10alkyl, C6-u aryl, C7-16alkylaryl,

C3-7cykloalkyl eller C3-10alkyl cykloalkyl.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Stereokjemiske definisjoner og konvensjoner anvendt her følger generelt McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms, S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Book Company, New York (1984) og Stereochemistry of Organic Compounds, Eliel, E. og Wilen, S., John Wiley & Sons, Inc., New York (1994). Mange organiske forbindelser eksisterer i optisk aktive former, dvs. de har evnen til å rotere planet av plan-polarisert lys. Ved beskrivelse av en optisk aktiv forbindelse blir prefiksene D og L eller R og S anvendt for å angi den absolutte konfigurasjon av molekylet omkring dets chirale senter(e). Prefiksene d og I eller (+) og (-) blir anvendt for å angi rotasjonen av plan-polarisert lys av forbindelsen, med (-) eller I som betyr at forbindelsen er venstredreiende og (+) eller d, som betyr at forbindelsen er høyredreiende. For en gitt kjemisk struktur er disse forbindelser, betegnet stereoisomerer, identiske bortsett fra at de er speilbilder av hverandre. En spesifikk stereoisomer av et speilbilde-par kan også refereres til som en enantiomer og en blanding av slike isomerer er ofte betegnet en enantiomer blanding. Med referanse til tilfellene hvor (R) eller (S) blir anvendt, er det for å angi den absolutte konfigurasjon av en substituent i sammenheng med hele forbindelsen og ikke i sammenheng med substituenten alene.

Oppfinnelsen angår fremgangsmåte for spaltning av en blanding av alkylester-enantiomerer kjennetegnet ved at den omfatter å bringe blandingen i kontakt med et enzym effektivt til preferensielt å fremme hydrolyse av én av enantiomerene;karakterisert vedat kontakten blir utført i nærvær av en buffer, hvor alkylesteren har den følgende formel:

og hvor:

R25er en amino-beskyttelsesgruppe; og

R26er valgt fra gruppen bestående av C1-10alkyl, C6-u aryl, C7-16alkylaryl,

C3-7cykloalkyl eller C3-10alkyl cykloalkyl.

Foretrukket er fremgangsmåte som definert over hvor bufferen er valgt fra gruppen bestående av fosfater, borater og karbonater.

Også foretrukket er fremgangsmåte som definert over hvor enzymet er en protease.

Også foretrukket er fremgangsmåte definert over hvor enzymet er fremstilt fra en substans valgt fra gruppen bestående av Bacillus globigii, Bacillus licheniformis, Bacillus halodurans, Bacillus clausii, Aspergillus oryzase og blandinger derav.

Ytterligere foretrukket er fremgangsmåten over hvor enzymet er valgt fra gruppen bestående av subtilisin protease, subtilisin protease, subtilisn protease, fungal protease og blandinger derav.

Også foretrukket er fremgangsmåte definert over hvor kontakten blir utført ved pH fra 7,0 til 11.

Også foretrukket er fremgangsmåte definert over hvor kontakten blir utført ved en temperatur på fra 30 til 60°C.

Også foretrukket er fremgangsmåte definert over hvor kontakten blir utført i en tid på mindre enn syv dager.

Ytterligere foretrukket er fremgangsmåten over hvor kontakten blir utført i en tid fra to timer til tre dager.

Amingruppen over kan beskyttes ved anvendelse av en Boc-gruppe for å gi den fullstendig beskyttede aminosyren. Dette mellomproduktet er et racemat som kan spaltes ved en enzymatisk prosess hvor estergruppen blir spaltet for å gi den tilsvarende karboksylsyre. Uten å være bundet til noen spesiell teori er det antatt at denne reaksjonen er selektiv ved at én av enantiomerene (1S, 2R) undergår reaksjonen med en meget større hastighet enn dens speilbilde (1 R, 2S) hvilket gir en kinetisk spaltning av mellomprodukt-racematet. I eksemplet angitt ovenfor er den mer foretrukne stereoisomer for integrering i tripepidene (1 R, 2S). I nærvær av enzymet undergår denne enantiomer ikke esterspaltning og derved blir denne enantiomer gjenvunnet fra reaksjonsblandingen. Imidlertid undergår den mindre foretrukne enantiomer (1S, 2R) esterspaltning, dvs. enzym-katalysert hydrolyse, for å gi den frie syren. Esteren kan separeres fra syreproduktet ved rutinemessige metoder så som for eksempel vandige ekstraksjonsmetoder eller kromatografi.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer prosesser for spalting av en blanding av alkylester-enantiomerer omfattende å bringe blandingen i kontakt med et enzym effektivt til preferensielt å fremme hydrolyse av én av enantiomerene;karakterisert vedat kontakten blir utført i nærvær av en buffer. En slik blanding av alkylester-enantiomerer kan være et resultat av fremstilling av kjemisk forløper, beskrevet ovenfor.

Fortrinnsvis har alkylesteren den følgende formel

hvor:

R25er en amino-beskyttelsesgruppe, så som for eksempel karbamater, f.eks.

BOC-iminer eller amider; og

R26er valgt fra gruppen bestående av C1-10alkyl, C6-14aryl, C7-16alkylaryl, C3-7cykloalkyl eller C3-10alkyl-cykloalkyl.

Den spesielle buffer anvendt i prosessene ifølge foreliggende oppfinnelse er ikke kritisk. Typisk vil bufferen ha en pKa på +1 for pH ved hvilken hydrolysen blir utført, f.eks. pH fra ca. 7,0 til 11. Således, hvis hydrolysen blir utført ved f.eks. en pH på 8,0, kan en buffer med en pKa på fra ca. 7,0 til 9,0 anvendes. Foretrukne buffere er fosfater, borater og karbonater. Eksempler på egnede buffere omfatter: 2-[(2-amino-2-oksoetyl)amino]etansulfonsyre, N-(2-acetamido)-2-iminodieddiksyre, n,n-bis(2-hydroksyetyl)glycin, 1,3-bis[tris(hydroksymetyl)metylamino]propan, o-borsyre, karbonsyre, 2- (cykloheksylamino)etansulfonsyre, dietylmalonsyre, glycylglycin, N-2-hydroksyetylpiperazin-N'-2-etan-sulfonsyre (HEPES), N-2-hydroksycthylpiperazin-N'-3-propan-sulfonsyre, imidazol, 3- (N-morfolino)propansulfonsyre, o-fosforsyre,

piperazin-N-N'-bis(2-etansulfonsyre),

piperazin-1,4-bis(2-hydroksypropansulfonsyre),

3-[tris(hydroksymetyl)metyl]amino-propansulfonsyre,

2-[tris(hydroksymetyl)metyl]amino-etansulfonsyre,

N-[tris(hydroksymetyl)metyl]glycin og tris(hydroksylmetyl)aminometan.

Hvilket som helst enzym effektivt til preferensielt å hydrolysere den ønskede alkylester-enantiomer kan anvendes i henhold til foreliggende oppfinnelse. Proteaser, lipaser og esteraser blir ofte anvendt for hydrolyse av karboksylsyreester-bindinger. Enzymene egnet for anvendelse i henhold til foreliggende oppfinnelse, uansett opprinnelse eller renhet, kan anvendes i fri tilstand, enten i flytende eller tørr form eller immobilisert på en bærer så som for eksempel ved fysisk adsorpsjon eller oppfanging. Eksempler på lipaser omfatter lipaser fra Candida rugosa, hvetekim, svin bukspyttkjertel, Rhizopus arrhizus, Candida antarctica, Mucor miehei, Aspergillus niger, Pseudomonas-arter, Candida lipolytica, Humicola langinosa og Mucor javanicus. Eksempler på esterase omfatter griselever-esterase (PLE), hestelever-esterase (HLE), acetylcholin-esterase (ACE), kolesterol-esterase, esterase fra Bacillus subtilis (karboksylesterase NP). Proteaser er generelt definert som hydrolaser som virker på peptid-bindinger som deres naturlige substrat, men de kan spalte en karboksylsyreester-binding siden en ester-binding er meget svakere enn en peptid- (amid) binding. Eksempler på proteaser omfatter a-chymotrypsin, thermolysin, papain, proteaser fra Aspergillus sp., Bacillus sp., Rhizopus sp., Penicillum sp., Streptomyces griseus.

I esteren med formel VIII er det chirale senter i syregruppen fullt substituert. Dette representerer et vanskelig mål for "hydralitic" enzymer ettersom deres naturlige substrater (så som naturlige aminosyrer) vanligvis inneholder minst ett a-hydrogen. Meget overraskende ble det ved foreliggende oppfinnelse funnet at visse proteaser var meget effektive for enantioselektiv hydrolyse av ester VIII. Foretrukne proteaser omfatter proteaser fra stammer valgt fra gruppen bestående av Bacillus globigii, Bacillus licheniformis, Bacillus halodurans, Bacillus clausii og Aspergillus oryzae. Eksempler på egnede enzymer omfatter de valgt fra gruppen bestående av Alcalase<®>(subtilisin, alkalisk protease, Novozymes North America Inc., Franklington, NC), Savinase<®>(substilisin, alkalisk protease, Novozymes), ChiroCLEC™- BL (subtilisin, alkalisk protease, Altus Biologics, Inc.,), Protease N (subtilisin, alkalisk protease, Amano) og Flavourzyme™ (fungal protease/peptidase, Novozymes). Ytterligere detaljer om slike enzymer er kjent på området. Slike enzymer er kommersielt tilgjengelige. Disse enzymer kan anvendes alene eller anvendes som blandinger derav.

Esterhydrolyse fører til frigjøring av en alkohol og en karboksylsyre, som kan nedsette pH betydelig hvis ingen buffer er til stede. I henhold til foreliggende oppfinnelse er det funnet at å inkludere buffer i reaksjonsblandingen kan stabilisere pH under hydrolyse, og således bidra til høyere enzymaktivitet og stabilitet.

Videre er det ifølge foreliggende oppfinnelse, mulig å utføre hydrolysen ved forhøyede temperaturer, fortrinnsvis ca. 30 til 60°C og i korte tidsperioder, fortrinnsvis mindre enn ca. syv dager, mer foretrukket fra ca. to timer til tre dager.

EKSEMPLER

Metode C

C. 1 Spaltning av A/- Boc-( 1R2S)/( 1S. 2f?)- 1- amino- 2- vinvlcvklopropan-karboksvlsvre- etvlester

Spaltning A

Til en vandig løsning av natriumfosfat-buffer (0,1 M, 4,25 liter ("L"), pH 8) i en 12 Liter mantlet reaktor, holdt ved 39°C og omrørt ved 300 rpm ble satt 511 gram Alcalase 2,4L (ca. 425 ml) (Novozymes North America Inc.). Da temperaturen på blandingen nådde 39°C ble pH regulert til 8,0 ved tilsetning av 50% NaOH i vann. En løsning av racemisk A/-Boc-(1f?,2S)/(1S,2f?)-1-amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester (85 g) i 850 ml DMSO ble deretter tilsatt over en periode på 40 min. Reaksjonstemperaturen ble deretter holdt ved 40°C i 24,5 timer i løpet av hvilken tid pH i blandingen ble regulert til 8,0 etter 1,5 timer og 19,5 timer ved anvendelse av 50% NaOH i vann. Etter 24,5 timer ble enantio-overskudd av esteren funnet å være 97,2% og reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur (26°C) og omrørt natten over (16 timer) hvoretter enantio-overskudd av esteren ble funnet å være 100%. pH i reaksjonsblandingen ble deretter regulert til 8,5 med 50% NaOH og den resulterende blandingen ble ekstrahert med MTBE (2x2 L). Den samlede MTBE-ekstrakt ble deretter vasket med 5% NaHC03(3 x 100 ml), vann (3 x 100 ml) og inndampet i vakuum, hvilket ga enantiomert ren A/-Boc-(1R,2S)/-1-amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester som lysegult fast stoff (42,55 g; renhet: 97% ved 210 nm, inneholdende ingen syre; 100% enantiomert overskudd ("ee").

Det vandige laget fra ekstraksjonsprosessen ble deretter surgjort til pH 2 med 50% H2SO4 og ekstrahert med MTBE (2x2 L). MTBE-ekstrakten ble vasket med vann (3 x 100 ml) og inndampet, hvilket ga syren som lysegult fast stoff (42,74 g; renhet: 99% ved 210 nm, inneholdende ingen ester).

Spaltning B

Til 0,5 ml 100 mM Heps»Na buffer (pH 8,5) i en brønn av en 24 brønn plate (kapasitet: 10 ml/brønn) ble satt 0,1 ml Savinase 16,OL (protease fra Bacillus clausii) (Novozymes North America Inc.) og en løsning av racemisk A/-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester (10 mg) i 0,1 ml DMSO. Platen ble lukket og inkubert ved 250 rpm ved 40°C. Etter 18 timer ble enantio-overskudd av esteren funnet å være 44,3% som følger: 0,1 ml av reaksjonsblandingen ble fjernet og blandet godt med 1 ml etanol; etter sentrifugering ble 10 mikroliter (VI") av supernatanten analysert ved chiral HPLC. Til den gjenværende reaksjonsblanding ble 0,1 ml DMSO tilsatt og platen ble inkubert i ytterligere 3 dager ved 250 rpm ved 40°C, hvoretter fire ml etanol ble satt til brønnen. Etter sentrifugering ble 10 ul av supernatanten analysert ved chiral HPLC og enantio-overskudd av esteren ble funnet å være 100%.

Spaltning C

Til 0,5 ml 100 mM Heps*Na buffer (pH 8,5) i en brønn av en 24 brønn plate (kapasitet: 10 ml/brønn) ble satt 0,1 ml Esperase 8,OL, (protease fra Bacillus halodurans) (Novozymes North America Inc.) og en løsning av racemisk A/-Boc-(1 R,2S)/(1 S,2R)-1 -amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester (10 mg) i 0,1 ml DMSO. Platen ble lukket og inkubert ved 250 rpm ved 40°C. Etter 18 timer ble enantio-overskudd av esteren funnet å være 39,6% som følger: 0,1 ml av reaksjonsblandingen ble fjernet og blandet godt med 1 ml etanol; etter sentrifugering ble 10 ul av supernatanten analysert ved chiral HPLC. Til den gjenværende reaksjonsblanding ble 0,1 ml DMSO tilsatt og platen ble inkubert i ytterligere 3 dager ved 250 rpm ved 40°C, hvoretter fire ml etanol ble satt til brønnen. Etter sentrifugering ble 10 ul av supernatanten analysert ved chiral HPLC og enantio-overskudd av esteren ble funnet å være 100%.

Prøveanalyse ble utført på følgende måte:

1) Prøvepreparering: Ca. 0,5 ml av reaksjonsblandingen ble blandet godt med 10 volumer av EtOH. Etter sentrifugering ble 10 ul av supernatanten injisert på HPLC-kolonne.

2) Omdannelse-bestemmelse:

Kolonne: YMC ODS A, 4,6 x 50 mm, S-5^m

Løsningsmiddel: A, 1 mM HCI i vann; B, MeCN

Gradient: 30% B i 1 min; 30% til 45% B over 0,5 min; 45% B i 1,5 min; 45% til 30% B over 0,5 min.

Strømningshastighet: 2 ml/min

UV-deteksjon: 210 nm

Retensjonstid: syre, 1,2 min; ester, 2,8 min.

3) Enantio-overskudd-bestemmelse for esteren:

Kolonne: CHIRACEL OD-RH, 4,6 x 150 mm, S-5^m

Mobil fase: MeCN/50 mM HCICmi vann (67/33)

Strømningshastighet: 0,75 ml/min.

UV-deteksjon: 210 nm.

Retensjonstid:

(1S,2R)-1-amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre 5,2 min;

Racemisk (1 f?,2S)/(1 S,2f?)-1 -amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester 18,5 min og 20,0 min;

(1 R,2S)-1 -amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester 18,5 min.

Spaltning D

5 L av 0,3 M natriumfosfat-buffer (pH 8) ble holdt ved 38°C i en 20 Liter mantlet reaktor, omrørt ved 130 rpm. Fire liter Alcalase 2,4L (Novozymes North America Inc.) og 1 liter Dl vann ble satt til reaktoren. Da temperaturen på blandingen var nær 38°C, ble pH regulert til 7,8 med 10N NaOH. En løsning av racemisk A/-Boc-(1 R,2S)/(1 S,2R)-1 -amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester (500 gram) i 5 liter DMSO ble satt til reaktoren over en periode på 1 time via en tilsetningstrakt. Reaksjonstemperaturen ble deretter regulert til 48°C. Etter 21 timer nådde enantio-overskudd av esteren 99,3%. Oppvarmning ble stanset etter 24 timer og reaksjonsblandingen ble langsomt avkjølt til romtemperatur (ca. 25°C) og omrørt natten over. pH i reaksjonsblandingen ble regulert til 8,5 med 10N NaOH og blandingen ble ekstrahert med MTBE (2x4 L). Den samlede MTBE-ekstrakt ble vasket med 5% NaHC03(3 x 400 ml) og vann (3 x 400 ml) og inndampet, hvilket ga enantiomert ren A/-Boc-(1 R,2S)/-1 -amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester som lysegule krystaller (259 g; renhet: 96,9% ved 210 nm, inneholdende ingen syre; 100% ee).

Spaltning E

10 L av 0,1 M natriumfosfat-buffer (pH 8) ble holdt ved 40°C i en 20 Liter mantlet reaktor, omrørt ved 360 rpm. 1,5 liter Alcalase 2,4L (Novozymes North America Inc.) ble satt til reaktoren. Da temperaturen på blandingen nådde 38°C, ble pH regulert til 8,0 med 10N NaOH. En løsning av racemisk N-Boc-(1 R,2S)/(1 S,2R)-1-amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester (200 gram) i 2 liter DMSO ble satt til reaktoren over en periode på 1 time via en tilsetningstrakt. Reaksjonstemperaturen ble deretter regulert til 40°C. Etter 3 timer ble pH regulert til 8,0 med 10N NaOH. Etter 21 timer ble reaksjonsblandingen avkjølt til 25°C. pH i reaksjonsblandingen ble regulert til 8,5 med 10N NaOH og blandingen ble ekstrahert med MTBE (2x5 L). Den samlede MTBE-ekstrakt ble vasket med 5% NaHC03(3 x 500 ml) og vann (3 x 200 ml) og inndampet, hvilket ga 110 gram gul olje. Oljen ble ved romtemperatur satt under husvakuum og ga enantiomert ren A/-Boc-(1R,2S)/-1-amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester som fargeløs lang stav krystall (101 g; renhet: 97,9% ved 210 nm, inneholdende ingen syre; 100% ee). Krystall-strukturen av enantiomert ren A/-Boc-(1R,2S)/-1-amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester erkarakterisert vedenkel krystall-analyse (røntgen NB#: 52795-093, refkode: 634592N1). Den absolutte konfigurasjon er ikke etablert på grunn av mangel av et kjent chiralt senter eller tungatom(er). En kjedestruktur langs den krystallografiske a-akse blir dannet via intermolekylær hydrogen-binding mellom amidgruppen og karbonyl-oksygenatomet (N... O 3,159 Å).

Struktur av /V-Boc-(1 /?,2S)-1 -amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester:

Spaltning F

5 L av 0,2 M natriumborat-buffer (pH 9) ble holdt ved 45°C i en 20 liter mantlet reaktor, omrørt ved 400 rpm. Tre liter Dl-vann og fire liter Savinase 16L, type EX (Novozymes North America Inc.) ble satt til reaktoren. Da temperaturen på blandingen nådde 45°C ble pH regulert til 8,5 med 10N NaOH. En løsning av racemisk A/-Boc-(1 f?,2S)/(1 S,2f?)-1 -amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester (200 gram) i 2 liter DMSO ble satt til reaktoren over en periode på 40 min, via en tilsetningstrakt. Reaksjonstemperaturen ble deretter regulert til 48°C. Etter 2 timer ble pH regulert til pH 9,0 medl ON NaOH. Etter 18 timer nådde enantio-overskudd av esteren 72% og pH ble regulert til 9,0 med 10N NaOH. Etter 24 timer ble temperaturen senket til 35°C. Etter 42 timer ble temperaturen hevet til 48°C og pH ble regulert til 9,0 med 10N NaOH.

Oppvarmning ble stanset etter 48 timer og reaksjonen ble langsomt avkjølt til romtemperatur (ca. 25°C) og omrørt natten over. Etter 66 timer var pH i reaksjonsblandingen 8,6. Blandingen ble ekstrahert med MTBE (2x4 L). Den samlede MTBE-ekstrakt ble vasket med 5% NaHC03(6 x 300 ml) og vann (3 x 300 ml) og inndampet, hvilket ga enantiomert ren A/-Boc-(1R,2S)/-1-amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylestersom lysegul krystall (101A g; renhet: 95,9% ved 210 nm, inneholdende ingen syre; 98,6% ee).

Claims

1. Fremgangsmåte for spaltning av en blanding av alkylester-enantiomererkarakterisert vedat den omfatter å bringe blandingen i kontakt med et enzym effektivt til preferensielt å fremme hydrolyse av én av enantiomerene;karakterisert vedat kontakten blir utført i nærvær av en buffer, hvor alkylesteren har den følgende formel:

og hvor: R25er en amino-beskyttelsesgruppe; og R26er valgt fra gruppen bestående av C1-10alkyl, C6-u aryl, C7-16alkylaryl, C3-7cykloalkyl eller C3-10alkyl cykloalkyl.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat bufferen er valgt fra gruppen bestående av fosfater, borater og karbonater.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat enzymet er en protease.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat enzymet er fremstilt fra en substans valgt fra gruppen bestående av Bacillus globigii, Bacillus licheniformis, Bacillus halodurans, Bacillus clausii, Aspergillus oryzase og blandinger derav.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 5,karakterisert vedat enzymet er valgt fra gruppen bestående av subtilisin protease, subtilisin protease, subtilisn protease, fungal protease og blandinger derav.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat kontakten blir utført ved pH fra 7,0 til 11.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat kontakten blir utført ved en temperatur på fra 30 til 60°C.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat kontakten blir utført i en tid på mindre enn syv dager.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisert vedat kontakten blir utført i en tid fra to timer til tre dager.