WO2012014953A1 - 光学活性スクシンイミド誘導体の製造方法 - Google Patents

光学活性スクシンイミド誘導体の製造方法 Download PDF

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WO2012014953A1
WO2012014953A1 PCT/JP2011/067192 JP2011067192W WO2012014953A1 WO 2012014953 A1 WO2012014953 A1 WO 2012014953A1 JP 2011067192 W JP2011067192 W JP 2011067192W WO 2012014953 A1 WO2012014953 A1 WO 2012014953A1
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amino acid
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acid sequence
esterase
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PCT/JP2011/067192
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伸二 北
和也 津崎
栄虎 山村
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大日本住友製薬株式会社
協和発酵バイオ株式会社
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    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07D487/20—Spiro-condensed systems
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    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
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    • C12P41/003—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions
    • C12P41/005—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions by esterification of carboxylic acid groups in the enantiomers or the inverse reaction
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    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid

Definitions

  • the present invention is (3R) -2 '-(4-bromo-2-fluorobenzyl) spiro [pyrrolidine-3,4'(1'H) represented by the following formula expected as a therapeutic agent for diabetic complications -Pyrrolo [1,2-a] pyrazine] -1 ′, 2,3 ′, 5 (2′H) -tetraone (hereinafter referred to as “Compound A”):
  • the present invention relates to a method for producing an optically active succinimide derivative that is a key intermediate.
  • the present invention also provides a method for producing an optically active carboxylic acid derivative that is a useful intermediate of the above compound A, a method for producing compound A using the optically active carboxylic acid derivative, and an activity for producing the optically active carboxylic acid derivative. And an enzyme-encoding DNA.
  • an optical resolution method As a method for separating a racemate into an optically active form (an optical resolution method), a method using an enzyme, a method in which an optically active form is reacted to convert it into a salt and split, and a diastereomeric mixture obtained by reacting with an optically active form There are methods such as purification and separation later. Especially, since the method using an enzyme does not require an optically active substance, there is an advantage that the reaction can be carried out at a low cost. However, there is a problem that it is generally difficult to hydrolyze a specific alkoxycarbonyl such as a triester having a plurality of alkoxycarbonyls in the molecule in a regioselective or stereoselective manner.
  • a specific alkoxycarbonyl such as a triester having a plurality of alkoxycarbonyls in the molecule in a regioselective or stereoselective manner.
  • Patent Document 1 and Non-Patent Documents 1 and 2 describe ⁇ -lower alkyl- ⁇ -protected amino malonate diester derivatives. Has been reported to produce an optically active ⁇ -lower alkyl- ⁇ -protected amino malonate monoester derivative by asymmetric hydrolysis using a porcine liver-derived esterase. (Wherein R 4 represents benzyloxycarbonyl, tert-butoxycarbonyl or the like, and R 5 represents lower alkyl or the like)
  • Patent Document 2 describes a method of producing (R) -2-amino-2-ethoxycarbonylsuccinimide (hereinafter referred to as Compound B), which is a key intermediate of Compound A, using an esterase.
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently producing an optically active succinimide derivative which is a key intermediate of compound A. More specifically, the object of the present invention is to efficiently produce an optically active succinimide derivative that is a key intermediate of compound A, and an optically active carboxylic acid derivative from an ester derivative that is a useful intermediate of compound A. The object is to provide a method for efficient production.
  • the present invention relates to the following (1) to (12).
  • a step of converting to an ester derivative represented by: (B) acts on an ester derivative represented by the formula (IV) or a salt thereof with
  • a step of converting to an optically active amide derivative represented by the formula: (D) A base is allowed to act on the optically active amide derivative represented by the formula (VI) or a salt thereof, and the formula (I) or the formula (VII): [In the formula (VII), R 1A represents an amino protected with a protecting group, and R 3 has the same meaning as described above.]
  • a step of converting to an optically active succinimide derivative represented by (E) The protecting group on R 1A of the optically active succinimide derivative represented by the formula (VII) or a salt thereof is deprotected and converted to the optically active succinimide derivative represented by the above formula (I) or a salt thereof. Process.
  • a method for producing Compound A which comprises the following steps (a) to (e): (A) A step of producing compound (I) by the production method according to (1); (B) a step of reacting the compound (I) obtained in the step (a) with 2,5-dimethoxytetrahydrofuran in the presence of an acid (for example, acetic acid and the like); (C) reacting the product obtained in the step (b) with a trichloroacetylating reagent (for example, trichloroacetyl chloride, trichloroacetyl bromide, trichloroacetic anhydride, etc.); (D) a step of reacting the product obtained in the step (c) with 4-bromo-2-fluorobenzylamine; and (e) a step of isolating the compound A obtained in the step (d). (10) The production method according to (8) or (9), wherein R 3 is ethyl.
  • an optically active carboxylic acid derivative can be efficiently produced from an ester derivative that is a useful intermediate of compound A.
  • compound (I) and compound A with high optical purity can be produced in high yield, which is advantageous from an industrial viewpoint.
  • each group of formulas (I) to (VII) examples include linear or branched alkyl having 1 to 6 carbon atoms, and more specifically, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, Examples include isopentyl, neopentyl, hexyl and the like.
  • Halogen means fluorine, chlorine, bromine or iodine.
  • the protecting group in “amino protected with a protecting group” means, for example, an amino protecting group commonly used in organic synthetic chemistry [for example, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd edition (Protective Groups In Organic Synthesis). , Third edition), written by TW Greene, John Wiley & Sons Inc. (1999), etc., more preferably, the action of thiol or acid, hydrogenolysis, etc. Protecting groups that are deprotected by.
  • Examples of the protecting group to be deprotected by the action of thiol include 2-nitrobenzenesulfonyl, 4-nitrobenzenesulfonyl, 2,4-dinitrobenzenesulfonyl and the like.
  • Examples of the protecting group to be deprotected by the action of an acid include acetyl, trityl, tert-butoxycarbonyl and the like, more preferably tert-butoxycarbonyl.
  • Examples of the protecting group to be deprotected by hydrogenolysis include, for example, benzyl optionally having 1 to 3 substituents selected from the group consisting of a halogen atom, lower alkyl, lower alkoxy and nitro on the benzene ring. And oxycarbonyl, benzyl and the like. More preferably, benzyloxycarbonyl, 4-nitrobenzyloxycarbonyl, 4-chlorobenzyloxycarbonyl, 4-methylbenzyloxycarbonyl, 2-methoxybenzyloxycarbonyl, benzyl, 4-nitrobenzyl, 4-chlorobenzyl, 4- Examples include methylbenzyl, 2-methoxybenzyl, 4-methoxybenzyl and the like.
  • amino protected with a protecting group may be converted to amino during the reaction.
  • R 1 and R 1A in the formula include amino protected by a protecting group that can be eliminated by the action of thiol or acid, hydrogenolysis, etc., preferably benzyloxycarbonylamino, or tert -Butoxycarbonylamino is mentioned.
  • R 2 and R 3 in the formula include ethyl and the like.
  • a preferable combination of R 1 , R 2 , and R 3 includes, for example, a case where R 1 is benzyloxycarbonylamino and R 2 and R 3 are ethyl.
  • a preferred combination of R 1A and R 3 includes a case where R 1A is benzyloxycarbonylamino and R 3 is ethyl.
  • Y includes halogen, and preferably iodine, bromine, chlorine and the like. More preferably, bromine or chlorine is used.
  • ammonia source examples include ammonia or an ammonia equivalent, and preferably ammonia.
  • ammonia a gas or an aqueous solution can be mentioned, and an aqueous solution is preferable.
  • ammonia equivalent examples include salts of ammonia and acid, preferably ammonium acetate, ammonium formate, ammonium carbonate and the like, and more preferably ammonium acetate.
  • condensing agent examples include dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, N, N′-carbonyldiimidazole (CDI), N-hydroxybenzotriazole (HOBT).
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • CDI 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • CDI N, N′-carbonyldiimidazole
  • HOBT N-hydroxybenzotriazole
  • Diphenyl phosphate azide DPPA
  • N-hydroxysuccinimide N-hydroxyphthalimide
  • benzotriazol-1-yloxy-trisdimethylaminophosphonium hexafluorophosphate BOP
  • 4- (4,6-dimethoxy-1,3, 5-triazin-2-yl) -4-methylmorpholinium chloride DTMM
  • O- (benzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate HBTU
  • 2-chloro-1-methylpyridinium iodide 2-chloro-1-methylpyridinium iodide and the like.
  • Examples of the activation reagent include methyl chloroformate, ethyl chloroformate, isopropyl chloroformate, isobutyl chloroformate, pivaloyl chloride, phosgene, triphosgene, phosphorus oxychloride, phosphorus pentachloride, thionyl chloride, and preferably chloroformate.
  • Examples include isobutyl acid.
  • Examples of the salt of compound (I), (IV), (V), (VI), or (VII) include acid addition salts, metal salts, ammonium salts, organic amine addition salts, amino acid addition salts, and the like.
  • Examples of the acid addition salt include inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, nitrate, sulfate, and phosphate, acetate, oxalate, maleate, fumarate, citrate, Examples include organic acid salts such as benzoate and methanesulfonate.
  • Examples of the metal salt include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as magnesium salt and calcium salt, aluminum salt, zinc salt and the like.
  • ammonium salt examples include salts such as ammonium and tetramethylammonium.
  • organic amine addition salt examples include addition salts such as morpholine and piperidine.
  • amino acid addition salts include addition salts of lysine, glycine, phenylalanine, aspartic acid, glutamic acid and the like.
  • the production method of the present invention uses an esterase derived from a non-animal, preferably from a microorganism, more preferably from a microorganism belonging to the genus Bacillus, particularly preferably from Bacillus thuringiensis as an enzyme in “Step 2” in the following steps. It is characterized by.
  • reaction conditions such as reaction temperature, reagent type, reagent amount, and reaction time are mentioned for illustrative purposes and should be interpreted in a limited manner in any sense. Must not.
  • R 1 represents amino or amino protected with a protecting group
  • R 1A represents amino protected with a protecting group
  • R 2 and R 3 are the same or different and represent lower alkyl
  • Any solvent may be used as long as it does not participate in the reaction, but cyclohexane, benzene, toluene, xylene, diethyl ether, diisopropyl ether, tert-butyl methyl ether, tetrahydrofuran (THF), dioxane, pyridine, methanol, Examples include ethanol, isopropyl alcohol, dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO), acetonitrile, and the like, preferably DMF. These can be used alone or as a mixture.
  • the base examples include organic bases or inorganic bases, preferably inorganic bases, and more preferably sodium hydride, sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, potassium carbonate, potassium hydrogen carbonate. , Cesium carbonate, sodium methoxide, sodium ethoxide, potassium tert-butoxide and the like, more preferably sodium hydride, sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium carbonate, potassium bicarbonate, cesium carbonate and the like, Most preferably, sodium hydride or potassium carbonate is used.
  • alkali halide examples include alkali bromide and alkali iodide, preferably alkali iodide, more preferably lithium iodide, sodium iodide, potassium iodide, or cesium iodide. Most preferably, potassium iodide is used.
  • alkali bromide and alkali iodide preferably alkali iodide, more preferably lithium iodide, sodium iodide, potassium iodide, or cesium iodide. Most preferably, potassium iodide is used.
  • compound (III) examples include ethyl 2-chloroacetate and ethyl 2-bromoacetate. Compound (II) and compound (III) can also be obtained as commercial products.
  • the substrate concentration is 0.1% to 50%, preferably 1% to 30%, in water or a mixed solvent of water and a solvent, at a temperature between 0-60 ° C., preferably 10-40 ° C.
  • the reaction pH is 3 to 10, preferably pH 4 to 9, and 1 to 100,000 times, preferably 1 to 10,000 times the amount of the enzyme is allowed to act on the substrate for 1 to 200 hours, preferably 1 to 200 hours. Can be obtained by reacting for 5 to 150 hours.
  • the reaction can be performed by adding a buffer solution or a metal salt.
  • Solvents include cyclohexane, benzene, toluene, xylene, diethyl ether, diisopropyl ether, tert-butyl methyl ether, THF, dioxane, methyl acetate, ethyl acetate, butyl acetate, methyl isobutyl ketone, acetone, dichloromethane, chloroform, dichloroethane, four Examples include carbon chloride, methanol, ethanol, isopropyl alcohol, tert-butyl alcohol, DMF, DMSO, acetonitrile, and the like, and preferably ethanol or acetonitrile. When used in a mixed solvent, water and the solvent may form either a homogeneous system or a heterogeneous system, but it is preferable to form a homogeneous system.
  • Examples of the enzyme include esterases derived from non-animals, preferably from microorganisms.
  • a microorganism belonging to the genus Bacillus is preferable.
  • microorganisms belonging to the genus Bacillus include, for example, Bacillus thuringiensis, Bacillus subtilis, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus ⁇ ⁇ coulans (Bacillus coulans).
  • Bacillus licheniformis Bacillus megaterium, Bacillus earearothermophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pumilus
  • esterase derived from Bacillus thuringiensis is preferable, but is not limited to the specific esterase described above.
  • an esterase comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • the method of the present invention comprises, in addition to the above-mentioned specific esterase, an amino acid sequence having 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 99% or more identity with the amino acid sequence
  • a protein having an esterase action can also be used. Further, it comprises a protein encoded by a DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a base sequence having 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 99% or more identity with the base sequence. Examples include a protein encoded by DNA and having the same esterase action as the esterase described in SEQ ID NO: 2.
  • an esterase derived from a microorganism as an esterase
  • the microorganism culture, or the separated microorganism cells or microorganism culture is subjected to appropriate treatment.
  • a treated product of the microbial cells or a treated product of the culture may be used.
  • an embodiment using a cell body, a culture, or a treated product of a cell or culture containing an esterase is also encompassed by a use embodiment of an esterase derived from a microorganism.
  • treated cells or cultures include, for example, lyophilized products of cells or cultures, treated cells obtained by treatment with toluene, acetone, and the like, as well as known immobilization methods.
  • immobilization methods examples thereof include an immobilized product immobilized by a comprehensive method, a carrier binding method, a crosslinking method, or the like.
  • a comprehensive method a method using a natural polymer such as carrageenan or alginic acid or a synthetic polymer using a monomer or a prepolymer, a method for adsorbing to chitosan or the like as a carrier binding method, a method using glutaraldehyde or the like as a crosslinking method Is mentioned.
  • a crushed product or an extract of microbial cells may be used as the processed microbial product.
  • the disrupted cells can be obtained by a known disruption method such as an ultrasonic disruption method, a French press disruption method, a glass bead disruption method, or a dynomill disruption method.
  • the microbial cell extract can be obtained by removing the microbial cells from the crushed microbial cells by centrifugation or the like.
  • the bacterial cell extract can be used as a crude enzyme solution.
  • the crude enzyme solution can be used, for example, a salting-out method using ammonium sulfate precipitation, a concentration method using an ultrafiltration membrane, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, or gel filtration. It can also be purified and used as a purified enzyme by a combination such as chromatographic separation.
  • the term cell-treated product includes the crushed cell material, extract, crude enzyme solution, purified enzyme and the like as described above.
  • the immobilized cell body or immobilized enzyme By immobilizing a crushed cell product or extract (crude enzyme or purified enzyme) on a carrier as a treated cell product, the immobilized cell body or immobilized enzyme can be used repeatedly.
  • the target product When used as an immobilized microbial cell or an immobilized enzyme, the target product can be produced by a continuous method. For example, they can be packed in a column and used as a bioreactor. Any carrier can be used as long as it is generally used.
  • cellulose agarose, dextran, ⁇ -carrageenan, alginic acid, gelatin, natural polymers such as cellulose acetate, natural polymers such as gluten, activated carbon, glass, clay, kaolinite, alumina, silica gel, bentonite, hydroxyapatite, calcium phosphate, etc.
  • synthetic adsorbents such as polyacrylamide, polyvinyl acetate, polypropylene glycol, and urethane.
  • the immobilization method for example, a cross-linking method, a physical adsorption method, or a comprehensive method can be used.
  • Microorganism culture conditions are not particularly limited, and can be performed by a commonly used method. Any medium can be used as long as it is usually used, and any medium can be used as long as it is capable of growing microorganisms and appropriately contains an assimitable carbon source, nitrogen source, inorganic substance, and necessary growth promoting substances. Can be used. As the medium, either a synthetic medium or a natural medium can be used.
  • Any carbon source can be used as long as it is a carbon compound that can be assimilated and grown by cells.
  • Nitrogen sources include ammonium salts of inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid and phosphoric acid, ammonium salts of organic acids such as fumaric acid and citric acid, nitrates such as sodium nitrate and potassium nitrate, yeast extract, peptone, meat extract, Organic nitrogen sources such as corn steep liquor, processed soybean products and urea can be used alone or in combination.
  • inorganic salts sulfates such as potassium, sodium, calcium, magnesium, manganese and iron, hydrochlorides, carbonates, nitrates, phosphates and the like can be used alone or in combination.
  • Cultivation can be performed either under aeration conditions using shake culture or jar fermenter, or under anaerobic conditions, depending on the type of microorganism.
  • the pH of the medium is preferably in the range of 3 to 10
  • the temperature is preferably in the range of 10 to 50 ° C.
  • the culture time is preferably 10 to 500 hours.
  • the culture conditions are appropriately selected according to the type of microorganism.
  • the present invention is not limited to the above specific conditions.
  • DNA comprising the base sequence specified by SEQ ID NO: 1 or consisting of a base sequence having 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 99% or more identity with the base sequence
  • a recombinant vector containing DNA that encodes a protein having the same esterase activity as the esterase described in SEQ ID NO: 2 is prepared, and this vector is introduced into an appropriate host cell to prepare a transformant.
  • a protein encoded by the DNA can be obtained and used as an esterase.
  • the transformant is a microorganism, as described above, in addition to the microbial cell, a microbial culture or a microbial cell product obtained by subjecting the isolated microbial cell to appropriate treatment It may be used as such.
  • hybridize is a step in which DNA hybridizes to DNA having a specific base sequence or a part of the DNA. Accordingly, the DNA having the specific base sequence or a part of the base sequence of the DNA is useful as a probe for Northern or Southern blot analysis, or is a length of DNA that can be used as an oligonucleotide primer for PCR analysis. May be.
  • DNA used as a probe include DNA of at least 100 bases, preferably 200 bases or more, more preferably 500 bases or more, but may be DNA of at least 10 bases, preferably 15 bases or more. .
  • the above stringent conditions include, for example, a filter on which DNA is immobilized and a probe DNA, 50% formamide, 5 ⁇ SSC (750 mM sodium chloride, 75 mM sodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6). ), Incubated in a solution containing 5 ⁇ Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 ⁇ g / l denatured salmon sperm DNA overnight at 42 ° C., for example in a 0.2 ⁇ SSC solution at about 65 ° C. Conditions for washing the filter can be raised, but lower stringent conditions can also be used.
  • Stringent conditions can be changed by adjusting the formamide concentration (lower stringent concentration reduces the stringency), and changing the salt concentration and temperature conditions.
  • low stringent conditions for example, 6 ⁇ SSCE (20 ⁇ SSCE is 3 mol / l sodium chloride, 0.2 mol / l sodium dihydrogen phosphate, 0.02 mol / l EDTA, pH 7.4), 0.5% Incubate overnight at 37 ° C in a solution containing SDS, 30% formamide, 100 ⁇ g / l denatured salmon sperm DNA, then wash with 50 ° C 1x SSC, 0.1% SDS solution. I can give you.
  • examples of lower stringent conditions include conditions in which hybridization is performed using a solution having a high salt concentration (for example, 5 ⁇ SSC) under the above-described low stringency conditions and then washed.
  • the various conditions described above can also be set by adding or changing a blocking reagent used to suppress the background of the hybridization experiment.
  • the addition of the blocking reagent described above may be accompanied by a change in hybridization conditions in order to adapt the conditions.
  • the DNA capable of hybridizing under the above stringent conditions is 95% or more, preferably 97% or more, with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, when calculated using a program such as BLAST and FASTA. More preferably, DNA comprising a nucleotide sequence having 99% or more identity can be mentioned.
  • the DNA that hybridizes with the above-described DNA under stringent conditions is a DNA that encodes a protein having an esterase action similar to that of the esterase described in SEQ ID NO: 2. And culturing a microorganism obtained by introducing the recombinant DNA into a main cell, preparing a crude enzyme extract from the obtained culture and reacting with compound (IV), This can be confirmed by the presence or absence of generation.
  • DNA encoding a protein consisting of a sequence and having the same action as an esterase having the amino acid sequence specified in SEQ ID NO: 2 is based on the information on the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, based on chemical synthesis and genetic engineering. It can be made by any method known to those skilled in the art such as techniques or mutagenesis.
  • a DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing for example, a DNA having a base sequence described in SEQ ID NO: 1, to contact with a drug that becomes a mutagen Desired DNA can be prepared by a method of irradiating ultraviolet rays, a genetic engineering technique, or the like.
  • Site-directed mutagenesis which is one of genetic engineering techniques, is a technique that can introduce a specific mutation at a specific position. For example, Molecular Cloning 2nd edition, “Current Protocols in Molecular Biology” ”,“ John Wiley ”&“ Sons ”(1987-1997).
  • an esterase comprising an amino acid sequence having 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 99% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and having the amino acid sequence specified in SEQ ID NO: 2
  • a protein having the same action as that described above is obtained by using the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in a query and searching a database of various proteins to obtain an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence.
  • An enzyme having the amino acid sequence thus prepared can be prepared by expressing the enzyme using recombinant DNA and confirming its activity as described above.
  • the DNA can be obtained by preparing appropriate probes and primers based on the amino acid sequence information described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and screening microorganism chromosomes using them.
  • a desired DNA can be isolated by PCR using a chromosomal DNA library or cDNA library derived from various microorganisms as a template.
  • Preparation of the above-mentioned probe or primer, construction of a cDNA library, Techniques such as screening and cloning of the target DNA are well known and commonly used by those skilled in the art, and can be carried out, for example, according to the methods described in Current Protocols in Molecular Biology and the like described above.
  • DNA comprising the nucleotide sequence specified by SEQ ID NO: 1, or DNA comprising a nucleotide sequence having 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 99% or more identity with the nucleotide sequence DNA encoding a protein having an esterase action similar to the esterase described in 2 can be used by inserting it into an appropriate vector.
  • the type of vector used in the present invention is not particularly limited.
  • a vector such as a plasmid that replicates autonomously, a vector that is integrated into the host cell genome and replicated together with the chromosome when introduced into the host cell, and the like are used. can do.
  • an expression vector is preferably used.
  • it is desirable that the DNA is functionally linked to a promoter necessary for transcription.
  • a promoter is a DNA sequence that exhibits transcriptional activity in a host cell, and can be appropriately selected depending on the type of host.
  • promoters operable in bacterial cells include the Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene, the Bacillus licheniformis alpha-amylase gene, and the Bacillus amylo gene.
  • promoters that can operate in insect cells include polyhedrin promoter, P10 promoter, autographa calicornica polyhedrosis basic protein promoter, baculovirus immediate early gene 1 promoter, or baculovirus 39K delayed early gene.
  • promoters operable in yeast host cells include promoters derived from yeast glycolytic genes, alcohol dehydrogenase gene promoters, TPI1 promoters, ADH2-4c promoters, and the like.
  • promoters that can operate in filamentous fungal cells include the ADH3 promoter or the tpiA promoter.
  • the recombinant vector may further contain a selection marker.
  • selectable markers include drug resistance genes such as ampicillin, kanamycin, tetracycline, chloramphenicol, neomycin, or hygromycin.
  • the type of host cell for introducing the recombinant vector is not particularly limited as long as the above DNA can be expressed.
  • Examples include bacteria, yeasts, fungi, and higher eukaryotic cells, but bacteria and yeasts are preferred.
  • the bacterium include Gram-positive bacteria belonging to the genus Bacillus, Streptomyces, etc., or Gram-negative bacteria such as Escherichia coli, with E. coli being preferred. Transformation of these bacteria can be performed by an appropriate means depending on the type of cell. By culturing the transformant under appropriate conditions, the esterase can be expressed from the introduced DNA, and then the esterase can be isolated and purified by an appropriate means and used in the method of the present invention. .
  • the microbial cell itself or a processed microbial cell product can be used as a transformant.
  • the above-mentioned DNA can be introduced into a plasmid to prepare a recombinant vector, the recombinant vector can be introduced into E. coli and transformed, and then the desired esterase can be obtained by culturing E. coli.
  • the mode of use of the converter is not limited to this specific mode.
  • Examples of the buffer solution used for the reaction in Step 2 include a phosphate buffer solution, an acetate buffer solution, a citrate buffer solution, a borate buffer solution, and a Tris buffer solution, and preferably a phosphate buffer solution.
  • the concentration of the buffer is 0.1 mmol / L to 1 mol / L, preferably 1 mmol / L to 100 mmol / L.
  • Examples of the metal salt include NaCl, FeCl 3 , KCl, CaCl 2 , MgSO 4 , MnSO 4 , ZnCl 2 , CoCl 2 and the like.
  • the concentration of the metal salt is preferably 0.01 to 10%.
  • the optically active carboxylic acid derivative of the formula (V) obtained by the above reaction is filtered to remove insolubles, and an acid is added to adjust the pH to about 1 to 3, preferably about pH 2 Then, the reaction product can be separated by extracting with a suitable solvent.
  • any solvent can be used as long as it does not participate in the reaction.
  • cyclohexane, benzene, toluene, xylene, diethyl ether, diisopropyl ether, tert-butylmethyl examples include ether, THF, dioxane, methyl acetate, ethyl acetate, butyl acetate, methyl isobutyl ketone, acetone, pyridine, DMF, DMSO, dichloromethane, chloroform, acetonitrile, and the like, preferably THF.
  • These solvents can be used alone or as an arbitrary mixture.
  • a solvent such as water, methanol, ethanol, isopropyl alcohol or the like can be used in addition to the above solvent. Can be used as a mixture. Further, in any of the cases (A) to (C), the reaction can be carried out by adding 1 to 30 equivalents of a base.
  • Examples of the base include organic bases and inorganic bases, preferably organic bases.
  • Examples of the organic base include 1,8-diazabicyclo [5,4,0] -7-undecene (DBU), triethylamine, 4-dimethylaminopyridine, N, N-dimethylaniline, pyridine, N-methylmorpholine, and ethyldiisopropyl.
  • DBU 1,8-diazabicyclo [5,4,0] -7-undecene
  • triethylamine 4-dimethylaminopyridine, N, N-dimethylaniline, pyridine, N-methylmorpholine, and ethyldiisopropyl.
  • An amine etc. are mentioned, Preferably a triethylamine is mentioned.
  • Examples of the inorganic base include sodium hydride, sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, potassium carbonate, potassium hydrogen carbonate, cesium carbonate, sodium methoxide, sodium ethoxide, potassium tert-butoxide and the like. Can be mentioned.
  • the condensing agent the same condensing agent as described above can be used.
  • the same activation reagent and ammonia source as described above can be used.
  • Examples of the base include sodium hydride, sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium carbonate, potassium bicarbonate, cesium carbonate, sodium methoxide, sodium ethoxide, potassium tert-butoxide and the like.
  • sodium ethoxide is used.
  • R 1A of compound (VII) is an amino protected with a protecting group that is deprotected by hydrogenolysis, 1 in a solvent at a temperature of ⁇ 50 ° C. to 150 ° C., preferably 20 ° C. to 100 ° C.
  • Coexistence of hydrogen or a hydrogen donor by adding 1 to 50% by weight, preferably 1 to 10% by weight of a metal catalyst to the substrate under a pressure of ⁇ 10 atm, more preferably 1 to 5 atm
  • the compound (I) can be obtained by reacting for 5 minutes to 72 hours.
  • solvent examples include acetic acid, methyl acetate, ethyl acetate, butyl acetate, diethyl ether, diisopropyl ether, tert-butyl methyl ether, THF, dioxane, water, methanol, ethanol, isopropyl alcohol, DMF, and the like, preferably ethanol. Can be mentioned. These solvents can be used alone or in any mixture.
  • Metal catalysts include platinum (IV) oxide, platinum-carbon, palladium hydroxide (II), palladium hydroxide (II) -carbon, palladium-carbon, palladium-alumina, ruthenium-carbon, rhodium-carbon, rhodium-alumina. , Wilkinson's catalyst, Raney nickel and the like, preferably palladium-carbon.
  • the palladium content in palladium-carbon is not particularly limited, but preferably 5 to 10%.
  • the hydrogen donor include ammonium formate, cyclohexene, cyclohexa-1,3-diene, cyclohexa-1,4-diene and the like.
  • R 1A of compound (VII) is amino protected with a protecting group that can be deprotected by the action of an acid, it is -50 ° C to 150 ° C, preferably 20 ° C to 100 ° C, without solvent or in a solvent.
  • Compound (I) can be obtained by reacting an acid at a temperature.
  • Solvents include cyclohexane, benzene, toluene, xylene, diethyl ether, diisopropyl ether, tert-butyl methyl ether, THF, dioxane, methyl acetate, ethyl acetate, butyl acetate, water, isopropyl alcohol, methanol, ethanol, DMF, dichloromethane, Chloroform etc. are mentioned, The solvent of these can be used individually or as arbitrary mixtures.
  • acids include inorganic acids and organic acids.
  • inorganic acids include hydrochloric acid, sulfuric acid, and nitric acid.
  • organic acids include acetic acid, trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid, and p-toluenesulfonic acid. Etc. Preferably, trifluoroacetic acid is used.
  • R 1A of compound (VII) is amino protected with a protecting group that is deprotected by the action of thiol, 1 in a solvent at a temperature of ⁇ 50 ° C. to 150 ° C., preferably 20 ° C. to 100 ° C.
  • Compound (I) can be obtained by allowing an equivalent to a large excess of thiol to act in the presence of 1 equivalent to a large excess of base for 5 minutes to 72 hours.
  • solvent examples include cyclohexane, benzene, toluene, xylene, pyridine, diethyl ether, THF, dioxane, methyl acetate, ethyl acetate, butyl acetate, water, acetone, isopropyl alcohol, methanol, ethanol, DMF, dichloromethane, chloroform, and the like. These solvents can be used alone or as an arbitrary mixture.
  • Any thiol can be used as long as it is a compound having a sulfhydryl group.
  • Preferred examples include a thiophenol optionally having a substituent and a lower alkylthiol optionally having a substituent. More preferably, thiophenol, methanethiol, ethanethiol, 1-dodecanethiol, etc. are mentioned.
  • Examples of the base include organic bases and inorganic bases.
  • Examples of the organic base include DBU, triethylamine, 4-dimethylaminopyridine, N, N-dimethylaniline, pyridine, N-methylmorpholine, ethyldiisopropylamine, and the inorganic base includes, for example, sodium hydride, water
  • Examples include sodium oxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, potassium carbonate, potassium hydrogen carbonate, sodium methoxide, sodium ethoxide, potassium tert-butoxide, and the like, preferably potassium carbonate or triethylamine.
  • step (b) for example, a mixture of compound B, about 1.5 equivalents of 2,5-dimethoxytetrahydrofuran and excess acetic acid is stirred at about 70 ° C. for about 1.5 hours.
  • a crude reaction product is isolated according to a conventional method and can be used in the next step.
  • step (c) for example, a mixture of the product obtained in step (b), about 3 equivalents of trichloroacetyl chloride, and an appropriate amount of chloroform is heated to reflux for about 16 hours.
  • Other inert solvents for example, dichloromethane, THF, etc.
  • a crude reaction product is isolated according to a conventional method and can be used in the next step.
  • step (d) for example, the product obtained in step (c), about 1.2 equivalents of 4-bromo-2-fluorobenzylamine hydrochloride, and about 2.5 equivalents of triethylamine in an appropriate amount of dry DMF solvent, Stir at room temperature for about 16 hours.
  • a crude reaction product (compound A) can be isolated according to a conventional method and used in the next step.
  • the compound A obtained in the step (d) is recrystallized from an appropriate amount of a mixed solvent of ethyl acetate and hexane.
  • alcohols such as ethanol can also be used.
  • optical purity analysis was performed under the following conditions using HPLC.
  • CHIRALCEL® OJ-RH® ⁇ 4.6 ⁇ 150 mm
  • the detection wavelength was 254 nm.
  • the intermediates and target compounds in each of the above production methods are isolated and purified by separation and purification methods commonly used in organic synthetic chemistry, such as filtration, extraction, washing, drying, concentration, recrystallization, and various chromatography. be able to.
  • the intermediate can be subjected to the next reaction without any particular purification.
  • compound (I), (IV), (V), (VI), or (VII) When it is desired to obtain a salt of compound (I), (IV), (V), (VI), or (VII), compound (I), (IV), (V), (VI), or (VII) When it is obtained in the form of a salt, it may be purified as it is, and when it is obtained in a free form, the compound (I), (IV), (V), (VI) or (VII) is added to an appropriate solvent. It may be dissolved or suspended in the solution, and then isolated or purified by adding an acid or a base. In addition, compound (I), (IV), (V), (VI), or (VII) and salts thereof may exist in the form of adducts with water or various solvents. Products are also encompassed by the present invention.
  • the cells were cultured aerobically at 16 ° C for 16 hours. From the obtained culture broth, wet cells were collected by centrifugation (12,000 ⁇ g, 10 minutes) and suspended in 0.01 M Tris-HCl buffer (pH 8.0).
  • the suspension was crushed with an ultrasonic homogenizer (Nippon Seiki US-300T) under ice cooling, and then separated into a supernatant and a residue by centrifugation (12,000 ⁇ g, 10 minutes). Under ice-cooling, ammonium sulfate was added to the supernatant to a 20% saturation concentration, and after stirring, centrifuged (12,000 ⁇ g, 10 minutes) to remove the supernatant. The precipitate was suspended in 0.01 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 1 mM Dithiothreitol (DTT) and dialyzed against the same buffer. DEAE Sepharose Fast Flow (manufactured by GE Healthcare) was added to this solution, mixed and then filtered to recover the active solution.
  • an ultrasonic homogenizer Nippon Seiki US-300T
  • Ammonium sulfate was added to the supernatant to a 20% saturation concentration, and after stirring, centrifuged (12,000 ⁇
  • Dialyze the active fraction remove CHAPS, add polyoxyethylene lauryl ether (Brij 35) to a final concentration of 0.05%, 0.01 M Tris containing 0.05% Brij 35, 1 mM1DTT, 0.3M sodium chloride. It is applied to Phenyl Sepharose High Performance (produced by GE Healthcare Co.) equilibrated with hydrochloric acid buffer (pH 8.0) (hereinafter Buffer B), washed with buffer B, and a 0.3 to 0 M sodium chloride gradient To elute the protein. The active fraction is dialyzed with buffer A, concentrated by ultrafiltration, and then applied to Mono Q (equipped with GE Healthcare Co., Ltd.) equilibrated with buffer A.
  • Buffer B hydrochloric acid buffer
  • Activity measurement was performed as follows. Add 0.1 mL of purified solution to 0.1 mL of the enzyme-containing solution, 0.05 mL of 1 M phosphate buffer (pH7), 0.05 mL of acetonitrile containing 1% diethyl-2-benzyloxycarbonylamino-2-ethoxycarbonyl succinate. After mixing, the mixture was shaken at 30 ° C. for 4 hours.
  • the base sequence of the insert DNA was decoded by the primer walking method using pBTEST7 as a template.
  • ABI ⁇ ⁇ PRISM 310NT Genetic Analyzer (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.) and BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.) were used for decoding the base sequence.
  • the gene consisted of 1380 bp (SEQ ID NO: 1).
  • the gene shown in SEQ ID NO: 1 encoded an enzyme consisting of 460 amino acid residues (SEQ ID NO: 2).
  • the protein whose esterase activity has been confirmed in the above (b) is the 40 amino acids on the N-terminal side in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Was found to be a deleted protein.
  • the PCR product was digested with Sph I (Toyobo Co., Ltd.) and Bgl II (Toyobo Co., Ltd.) to construct a plasmid inserted into the Sph I and Bgl II sites of pQE-70 (Qiagen Co., Ltd.) (pBTEST12) .
  • pBTEST12 was introduced into Escherichia coli JM109 using Competent high JM109 (Toyobo Co., Ltd.) according to the attached instructions to prepare Escherichia coli JM109 / pBTEST12.
  • PCR was performed using pODTEST12 as a template, 5'-GTACAAAGCATGCAAAAGAAACCAGTCTCTTTAACGGCGAGCG (Hokkaido System Science) and 5'-CTTTTGTTGTAGATCTTTTCTTTGTCGC ATTGACCCA (Hokkaido System Science) using KOD-plus-.
  • the PCR product was digested with Sph I and Bgl II to construct a plasmid inserted into the Sph I and Bgl II sites of pQE-70 (pBTEST38).
  • pBTEST38 was introduced into Escherichia coli JM109 using Competent high JM109 according to the attached instructions to prepare Escherichia coli JM109 / pBTEST38.
  • Escherichia coli JM109 / pBTEST38 was inoculated into 5 ⁇ mL LB liquid medium containing 100 ⁇ mg / L ampicillin sodium, and cultured with shaking at 30 ° C. and 200 ⁇ rpm for 19 hours.
  • This culture solution was inoculated into 100 ⁇ mL LB liquid medium containing 0.1 ⁇ mM isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside and cultured with shaking at 25 ° C. and 200 rpm for 16 hours.
  • 3 L of this culture solution was prepared and centrifuged at 12,000 cm ⁇ g, 4 ° C. for 10 minutes to obtain bacterial cells. Suspend the cells in a small amount of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0), add 15 mL of acetonitrile solution containing 35% diethyl-2-benzyloxycarbonylamino-2-ethoxycarbonyl succinate, and add a total amount. Purified water was added to 150 mL. The solution was maintained at 25 ° C. for 18 hours with stirring. A 28% sodium hydroxide solution was added in a timely manner so that the pH of the reaction solution was maintained at 7.0.
  • 0.1 M phosphate buffer pH 7.0
  • Example 6 Preparation of (R) -2-amino-2-ethoxycarbonylsuccinimide 80 mg of (R) -2-benzyloxycarbonylamino-2-ethoxycarbonylsuccinimide was dissolved in 10 mL of ethanol and 5% palladium-carbon 4 mg was added, and catalytic hydrogenation was performed at room temperature under a hydrogen atmosphere. After removing the catalyst by filtration, the filtrate was concentrated under reduced pressure. The residue was recrystallized from ethanol to obtain 43 mg (yield 93%) of the title compound as colorless crystals. The optical rotation was [ ⁇ ] D 24 -35.9 ° (c 0.22, ethanol). The optical purity was 99.9% ee or higher.
  • an optically active carboxylic acid having high optical purity from the ester derivative that is the useful intermediate A method for producing the derivative with high yield is provided.

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Abstract

　(3R)-2'-(4-ブロモ-2-フルオロベンジル)スピロ[ピロリジン-3,4'(1'H)-ピロロ[1,2-ａ]ピラジン]-1',2,3',5(2'H)-テトラオンの鍵中間体である光学活性スクシンイミド誘導体の効率的製造方法であって、以下の反応工程を含み、工程２を非動物由来の酵素を用いて行う製造方法。

Description

光学活性スクシンイミド誘導体の製造方法
　本発明は、糖尿病合併症治療薬として期待される下記の式で表される(3R)-2'-(4-ブロモ-2-フルオロベンジル)スピロ[ピロリジン-3,4'(1'H)-ピロロ[1,2-ａ]ピラジン]-1',2,3',5(2'H)-テトラオン（以下、本明細書において「化合物A」と称する）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 の鍵中間体である光学活性スクシンイミド誘導体の製造方法に関するものである。
　また、本発明は、上記化合物Aの有用中間体である光学活性カルボン酸誘導体の製造方法、該光学活性カルボン酸誘導体を用いた化合物Aの製造方法、並びに該光学活性カルボン酸誘導体を生成する活性を有する酵素及び該酵素をコードするDNAに関する。
　ラセミ体を光学活性体に分ける方法（光学分割方法）としては、酵素を用いる方法、光学活性体を作用させて塩に変換し分割する方法、光学活性体と反応させてジアステレオマー混合物とした後に精製して分ける等の方法がある。なかでも、酵素を用いる方法は光学活性体を必要としないため、低コストで反応が行える等のメリットがある。しかしながら、分子内に複数のアルコキシカルボニルを有するトリエステル等の特定のアルコキシカルボニルを、位置選択的、立体選択的に加水分解することは一般には困難であるという問題もある。
　エステラーゼを用いた位置選択的、立体選択的な加水分解による光学活性カルボン酸誘導体の製造方法として、特許文献1及び非特許文献1～2にはα-低級アルキル-α-保護アミノマロナートジエステル誘導体をブタ肝臓由来エステラーゼを用いて不斉加水分解し、光学活性なα-低級アルキル-α-保護アミノマロナートモノエステル誘導体を製造する方法が報告されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （式中R4は、ベンジルオキシカルボニル又はtert-ブトキシカルボニル等を表し、R5は低級アルキル等を表す）
　また、特許文献2には、化合物Aの鍵中間体である (R)-2-アミノ-2-エトキシカルボニルスクシンイミド（以下、化合物Bと称する）のエステラーゼを用いた製造方法が記載されている。
　化合物Bから化合物Aを製造する方法は特許文献3及び非特許文献3等に記載されており、特許文献4の参考例1には、ジエチル=2-ベンジルオキシカルボニルアミノマロナートと2-ブロモ酢酸tert-ブチルを反応させる4-tert-ブチル=1-エチル=2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-2-エトキシカルボニルスクシナートの製造方法が記載されている。
特開平10-245369号公報 国際公開第2008-035735号パンフレット 特開平05-186472号公報 特開平06-192222号公報
テトラヘドロン・レターズ (Tetrahedron. Lett.), 1998, 39(31), p5571-5574 テトラヘドロン・レターズ (Tetrahedron. Lett.), 2000, 41(26), p5013-5016 ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー (J. Med. Chem.), 1998, 41, p4118-4129
　本発明の課題は、化合物Aの鍵中間体である光学活性スクシンイミド誘導体を効率的に製造する方法を提供することにある。
　より具体的には、本発明の課題は、化合物Aの鍵中間体である光学活性スクシンイミド誘導体を効率的に製造する方法、及び化合物Aの有用中間体であるエステル誘導体から光学活性カルボン酸誘導体を効率的に製造する方法を提供することにある。
　本発明は、以下の（１）～（１２）に関する。
（１）式(I)：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 [式(I)中、R3は低級アルキルを表す]
で表される光学活性スクシンイミド誘導体又はその塩の製造方法であって、以下の工程(A)～(D)、さらに必要により工程 (E)を含む製造方法：
(A) 式(II)：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
  [式(II)中、R1はアミノ、又は保護基で保護されたアミノを表し、2つのR3は、前記と同義の同一の低級アルキルを表す]で表されるアミノマロナート誘導体と式(III)：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 [式(III)中、R2は低級アルキルを表し、Yはハロゲンを表す]
で表されるハロゲン化酢酸エステル誘導体を塩基の存在下で反応させて式(IV)：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 [式(IV)中、R1、R2及びR3はそれぞれ前記と同義である]
で表されるエステル誘導体又はその塩に変換する工程、
（B）式(IV)で表されるエステル誘導体又はその塩に非動物由来の酵素、該酵素を生産する細胞、該細胞の培養物、又は該細胞若しくは該細胞の培養物の処理物を作用させ、式(V)：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 [式(V)中、R1、R2及びR3はそれぞれ前記と同義である]
で表される光学活性カルボン酸誘導体又はその塩に変換する工程、
（C）式(V)で表される光学活性カルボン酸誘導体又はその塩を縮合剤の存在下、アンモニア源と反応させるか、又は活性化試薬と反応させた後に、さらにアンモニア源と反応させて、式(VI)：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 [式(VI)中、R1、R2及びR3はそれぞれ前記と同義である]
で表される光学活性アミド誘導体又はその塩に変換する工程、
（D）式(VI)で表される光学活性アミド誘導体又はその塩に塩基を作用させて、式(I)又は式(VII)：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 ［式(VII)中、R1Aは保護基で保護されたアミノを表し、R3は前記と同義である］
で表される光学活性スクシンイミド誘導体又はその塩に変換する工程、
（E）式(VII)で表される光学活性スクシンイミド誘導体又はその塩のR1A上の保護基を脱保護して、上記式(I)で表される光学活性スクシンイミド誘導体又はその塩に変換する工程。
（２）式(IV)で表されるエステル誘導体又はその塩に非動物由来の酵素、該酵素を生産する細胞、該細胞の培養物、又は該細胞若しくは該細胞の培養物の処理物を作用させる工程を含む、式(V)で表される光学活性カルボン酸誘導体又はその塩の製造方法。
（３）酵素が微生物由来エステラーゼである（１）又は（２）に記載の製造方法。
（４）酵素がバチルス属に属する微生物由来エステラーゼである（１）又は（２）に記載の製造方法。
（５）酵素がバチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)由来のエステラーゼである（１）又は（２）に記載の製造方法。
（６）酵素が以下の（ａ）～（ｄ）より選ばれる蛋白質である（１）又は（２）に記載の製造方法。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列により特定される蛋白質
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が置換及び／又は欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、Ｎ末端から１～４０個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を有する蛋白質
（７）R1及びR1Aがベンジルオキシカルボニルアミノであり、R2がエチルであり、R3がエチルである（１）ないし（６）のいずれかに記載の製造方法。
（８）（１）に記載の製造方法により、式(I)で表される光学活性スクシンイミド誘導体｛以下、化合物(I)と称する｝を製造する工程、及び該工程で得られた化合物(I)を化合物Aに変換する工程を含む化合物Aの製造方法。
（９）化合物Aの製造方法であって、下記（ａ）～（ｅ）の工程を含む製造方法：
（ａ）化合物(I)を（１）に記載の製造方法で製造する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）で得られた化合物(I)を酸（例えば、酢酸など）の存在下に2,5-ジメトキシテトラヒドロフランと反応させる工程；
（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた生成物をトリクロロアセチル化試薬（例えば、トリクロロアセチルクロリド、トリクロロアセチルブロミド、無水トリクロロ酢酸など）と反応させる工程；
（ｄ）前記工程（ｃ）で得られた生成物を4-ブロモ-2-フルオロベンジルアミンと反応させる工程；及び
（ｅ）前記工程（ｄ）で得られた化合物Aを単離する工程。
（１０）R3がエチルである（８）又は（９）に記載の製造方法。
（１１）以下の（ａ）～（ｄ）より選ばれる蛋白質。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列により特定される蛋白質
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が置換及び／又は欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、Ｎ末端から１～４０個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を有する蛋白質
（１２）以下の（ａ）～（ｄ）より選ばれるＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列により特定されるＤＮＡ
（ｂ）請求項１１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列において１つ又は複数の塩基が置換及び／又は欠失及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ配列番号２に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつ配列番号２に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
　本発明の製造方法によれば、化合物Aの有用中間体であるエステル誘導体から光学活性カルボン酸誘導体を効率的に製造することができる。特に、本発明の方法によれば、高い光学純度の化合物(I)及び化合物Aを高収率で製造することができるので、工業的な観点などから有利である。
　式(I)で表される化合物を化合物(I)と前記で定義したが、他の式番号の化合物についても以下同様である。
　式(I)～(VII)の各基の定義において、
　低級アルキルとしては、例えば直鎖又は分岐状の炭素数１～６のアルキルが挙げられ、より具体的にはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等が挙げられる。ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を意味する。
　「保護基で保護されたアミノ」における保護基とは、例えば、有機合成化学で常用されるアミノの保護基［例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第3版 (Protective Groups in Organic Synthesis, third edition)、グリーン(T.W. Greene)著、John Wiley & Sons Inc. (1999年) 等に記載されているもの］等が挙げられ、より好ましくは、チオール若しくは酸の作用、又は加水素分解等により脱保護される保護基が挙げられる。
　チオールの作用により脱保護される保護基としては、例えば、2-ニトロベンゼンスルホニル、4-ニトロベンゼンスルホニル、2,4-ジニトロベンゼンスルホニル等が挙げられる。
　酸の作用により脱保護される保護基としては、例えば、アセチル、トリチル、tert-ブトキシカルボニル等が挙げられ、より好ましくはtert-ブトキシカルボニルが挙げられる。
　加水素分解により脱保護される保護基としては、例えば、ベンゼン環上にハロゲン原子、低級アルキル、低級アルコキシ及びニトロからなる群から選ばれる1～3個の置換基を有していてもよいベンジルオキシカルボニル、ベンジル等が挙げられる。より好ましくは、ベンジルオキシカルボニル、4-ニトロベンジルオキシカルボニル、4-クロロベンジルオキシカルボニル、4-メチルベンジルオキシカルボニル、2-メトキシベンジルオキシカルボニル、ベンジル、4-ニトロベンジル、4-クロロベンジル、4-メチルベンジル、2-メトキシベンジル、4-メトキシベンジル等が挙げられる。
　本発明において、保護基で保護されたアミノは、反応中にアミノに変換されてもよい。
　式中のR1及びR1Aとしては、例えば、チオール若しくは酸の作用、又は加水素分解等により脱離しうる保護基で保護されたアミノ等が挙げられ、好ましくは、ベンジルオキシカルボニルアミノ、又はtert-ブトキシカルボニルアミノが挙げられる。
　式中のR2及びR3としては、例えば、エチル等が挙げられる。
　R1、R2、及びR3の好ましい組み合わせとしては、例えば、R1がベンジルオキシカルボニルアミノであり、かつR2及びR3がエチルである場合が挙げられる。R1A とR3 との好ましい組み合わせとしては、R1Aがベンジルオキシカルボニルアミノであり、かつR3がエチルである場合が挙げられる。
　Yとしては、ハロゲンが挙げられ、好ましくはヨウ素、臭素、塩素等が挙げられる。より好ましくは、臭素、又は塩素が挙げられる。
　アンモニア源としては、アンモニア若しくはアンモニア等価体が挙げられ、好ましくは、アンモニアが挙げられる。アンモニアの形態としては気体又は水溶液が挙げられ、好ましくは水溶液が挙げられる。
　アンモニア等価体としては、例えば、アンモニアと酸との塩が挙げられ、好ましくは、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、炭酸アンモニウム等が挙げられ、さらに好ましくは酢酸アンモニウムが挙げられる。
　縮合剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩、N,N'-カルボニルジイミダゾール(CDI)、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBT)、ジフェニルリン酸アジド(DPPA)、N-ヒドロキシスクシンイミド、N-ヒドロキシフタルイミド、ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ-トリスジメチルアミノホスホニウム　ヘキサフルオロホスフェート(BOP)、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド (DMTMM)、O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート(HBTU)、2-クロロ-1-メチルピリジニウムヨージド等が挙げられる。
　活性化試薬としては、例えば、クロロギ酸メチル、クロロギ酸エチル、クロロギ酸イソプロピル、クロロギ酸イソブチル、塩化ピバロイル、ホスゲン、トリホスゲン、オキシ塩化リン、五塩化リン、塩化チオニル等が挙げられ、好ましくは、クロロギ酸イソブチルが挙げられる。
　化合物(I)、(IV)、(V)、(VI)、又は(VII)の塩としては、例えば酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等が挙げられる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩などの有機酸塩などが挙げられる。金属塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等が挙げられる。アンモニウム塩としては、例えば、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられ、有機アミン付加塩としては、例えば、モルホリン、ピペリジン等の付加塩が挙げられる。アミノ酸付加塩としては、例えばリジン、グリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等の付加塩が挙げられる。
　本発明の製造方法は、下記工程中の「工程２」において酵素として非動物由来、好ましくは微生物由来、より好ましくはバチルス属に属する微生物由来、特に好ましくはバチルス・チューリンゲンシス由来のエステラーゼを用いることを特徴としている。
　次に本発明の製造方法について説明するが、反応温度、試薬の種類、試薬の量、反応時間などの反応条件は例示のために言及したものであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 （式中、R1はアミノ又は保護基で保護されたアミノを表し、R1Aは保護基で保護されたアミノを表し、R2及びR3は、それぞれ同一又は異なって低級アルキルを表し、Yはハロゲンを表す）
(工程1)
　化合物(II)に対し、溶媒中、-50℃と150℃の間の温度で、1～30当量の塩基の存在下、1当量～大過剰量の化合物(III)を、5分間～72時間反応させることにより化合物(IV)を得ることができる。また、ハロゲン化アルカリを添加して反応を行ってもよい。
　溶媒は、反応に関与しないものであればいずれも使用可能であるが、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、tert-ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン(THF)、ジオキサン、ピリジン、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルホルムアミド (DMF) 、ジメチルスルホキシド (DMSO)、アセトニトリル等が挙げられ、好ましくはDMFが挙げられる。これらは単独若しくは混合物として用いることができる。
　塩基としては、有機塩基又は無機塩基が挙げられ、好ましくは無機塩基が挙げられ、より好ましくは、水素化ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸セシウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムtert-ブトキシド等が挙げられ、さらに好ましくは、水素化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸セシウム等が挙げられ、最も好ましくは水素化ナトリウム、又は炭酸カリウムが挙げられる。
　ハロゲン化アルカリとしては、臭化アルカリ、ヨウ化アルカリ等が挙げられ、好ましくはヨウ化アルカリが挙げられ、さらに好ましくはヨウ化リチウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、又はヨウ化セシウムが挙げられる。最も好ましくは、ヨウ化カリウムが挙げられる。
　化合物(III)としては、2-クロロ酢酸エチル、2-ブロモ酢酸エチル等が挙げられる。
　化合物(II)及び化合物(III)は市販品として入手することもできる。
(工程2)
　化合物(IV)に、水中又は水及び溶媒の混合溶媒中、基質濃度は0.1％～50％、好ましくは1％～30％で0～60℃、好ましくは10～40℃の間の温度で、反応pHは3～10、好ましくはpH 4～9で、基質に対し100,000分の1から10倍量、好ましくは10,000分の1から1倍量の酵素を作用させて、1～200時間、好ましくは5～150時間反応させることにより化合物(V)を得ることができる。さらに、緩衝液、又は金属塩を加えて反応を行うこともできる。
　溶媒としては、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、tert-ブチルメチルエーテル、THF、ジオキサン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルイソブチルケトン、アセトン、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、四塩化炭素、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、tert-ブチルアルコール、DMF、DMSO、アセトニトリル等が挙げられ、好ましくは、エタノール、又はアセトニトリルが挙げられる。混合溶媒で用いる際は、水と溶媒が均一系、又は不均一系のいずれを形成してもかまわないが、均一系を形成するのが好ましい。
　酵素としては、非動物由来、好ましくは微生物由来のエステラーゼが挙げられる。微生物としては、例えば、バチルス属に属する微生物が好ましい。バチルス属に属する微生物としては、例えば、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)、バチルス・アントラシス(Bacillus anthracis)、バチルス・セレウス(Baccilus cereus)、バチルス・コアギュランス(Bacillus coagulans)、バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・マガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・ステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、バチルス・アミロリケファチエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。好ましくはバチルス・チューリンゲンシス由来のエステラーゼが好ましいが、上記の特定のエステラーゼに限定されることはない。
　例えば、バチルス・チューリンゲンシス由来のエステラーゼとして、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるエステラーゼを挙げることができる。本発明の方法には、上記の特定のエステラーゼのほか、該アミノ酸配列と95％以上、好ましくは97％以上、さらに好ましくは99％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、上記エステラーゼと同様のエステラーゼ作用を有する蛋白質を用いることもできる。また、配列番号1で表される塩基配列からなるDNAによりコードされる蛋白質、又は該塩基配列と95％以上、好ましくは97％以上、さらに好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAによりコードされ、配列番号2に記載されたエステラーゼと同様のエステラーゼ作用を有する蛋白質などが挙げられる。
　エステラーゼとして微生物由来のエステラーゼを用いる場合には、微生物の培養物から分離した微生物の菌体のほか、微生物の培養物、あるいは分離した微生物の菌体または微生物の培養物を適宜の処理に付して得られる菌体処理物または培養物の培養物の処理物を用いてもよい。このようにエステラーゼを含む菌体、培養物、または菌体若しくは培養物の処理物などを用いる態様も微生物由来のエステラーゼの使用態様に包含されることは言うまでもない。菌体または培養物の処理物としては、例えば、菌体または培養物の凍結乾燥物、トルエン、アセトンなどで処理して得られる菌体処理物のほか、さらに、菌体を公知の固定化法、例えば包括法、担体結合法、架橋法などで固定化した固定化物などを挙げることができる。包括法としては、カラギーナンやアルギン酸などの天然高分子又はモノマーやプレポリマーによる合成高分子を用いる方法、担体結合法としては、キトサンなどに吸着させる方法、架橋法としては、グルタルアルデヒドなどを用いる方法が挙げられる。
　また、菌体処理物として菌体の破砕物又は抽出物を用いてもよい。菌体の破砕物は、公知の菌体破砕法、例えば超音波破砕法、フレンチプレス破砕法、ガラスビーズ破砕法、ダイノミル破砕法などにより得ることができる。また、菌体の抽出物は、前記菌体破砕物から遠心分離などにより菌体を除いて得ることができる。菌体の抽出物は、粗酵素液として用いることができるが、粗酵素液を例えば硫安沈殿による塩析法、限外濾過膜による濃縮法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー又はゲル濾過クロマトグラフィーによる分離などの組み合わせにより精製して精製酵素として用いることもできる。本明細書において、菌体処理物の用語は、上記のような菌体の破砕物、抽出物、粗酵素液、精製酵素などを包含する。
　菌体処理物として菌体の破砕物又は抽出物（粗酵素又は精製酵素）を担体に固定化することにより、その固定化菌体又は固定化酵素を繰り返し使用することができる。固定化菌体又は固定化酵素として使用する場合、連続法によって目的物の製造を行うこともでき、例えばそれらをカラムに充填してバイオリアクターとして用いることも可能である。担体としては一般に用いられるものであればなんでもよい。例えば、セルロース、アガロース、デキストラン、κ‐カラギーナン、アルギン酸、ゼラチン、酢酸セルロース等の多糖類、グルテン等の天然高分子、活性炭、ガラス、白土、カオリナイト、アルミナ、シリカゲル、ベントナイト、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム等の無機物、ポリアクリルアミド、ポリビニルアセテート、ポリプロピレングリコール、ウレタン等の合成吸着剤等が挙げられる。固定化方法としては、例えば、架橋法、物理的吸着法、包括法が使用できる。
　微生物の培養条件は特に限定されず、通常用いられる方法で行うことができる。培地としては通常使用されるものであればよく、微生物が生育することができ、かつ資化可能な炭素源、窒素源、無機物、及び必要な生育促進物質を適当に含有する培地であれば任意の培地を用いることができる。培地としては合成培地又は天然培地のいずれも使用可能である。
　炭素源としては、菌体が資化し生育できる炭素化合物であればいずれでも使用可能である。例えば、グルコース、フルクトース、マルトース、スクロース、デキストリン、可溶性デンプン、糊化デンプン、ソルビトールなどの糖類、メタノール、エタノール、グリセロールなどのアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸類及びその塩類、パラフィンなどの炭化水素類、糖蜜、菜種油などを単独で又は混合して使用することができる。
　窒素源としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸のアンモニウム塩、フマル酸、クエン酸などの有機酸のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、大豆加工品、尿素などの有機窒素源を単独で又は混合して用いることができる。
　無機塩類としては、カリウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン、鉄などの硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、硝酸塩、リン酸塩などをそれぞれ単独で又は混合して用いることができる。さらに、ビタミン類などの通常の培養に用いられる栄養源を適宜添加してもよい。
　培養は微生物の種類に応じて、振とう培養やジャーファーメンターなどを用いた通気条件下又は嫌気的条件下のいずれかで行うことができる。培地のpHは3～10の範囲が好ましく、温度は10～50℃の範囲が好ましく、培養時間は10～500時間が好ましいが、このようは培養条件は微生物の種類に応じて適宜選択することができ、上記の特定の条件に限定されることはない。
　別の態様では、例えば、配列番号１で特定される塩基配列を含むDNA、又は該塩基配列と95％以上、好ましくは97％以上、さらに好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、配列番号２に記載されたエステラーゼと同様のエステラーゼ作用を有する蛋白質をコードするDNAを含む組み換えベクターを作成し、このベクターを適宜の宿主細胞に導入して形質転換体を調製して、該DNAによりコードされる蛋白質を取得してエステラーゼとして使用することもできる。配列番号１に記載された塩基配列により特定されるDNAに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAや、配列番号１に記載された塩基配列において１または複数個、好ましくは１から１２０個、より好ましくは１から数十個、さらに好ましくは１から数個の塩基の欠失、置換、及び／又は付加を有する塩基配列を含むDNAを用いてもよい。上記の形質転換体が微生物である場合には、すでに説明したように、菌体のほか、微生物の培養物、又は分離した微生物の菌体を適宜の処理に付して得られる菌体処理物などとして用いてもよい。
　ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するDNAまたは該DNAの一部にDNAがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するDNAまたは該DNAの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのDNAであってもよい。プローブとして用いるDNAとしては、少なくとも100塩基以上、好ましくは200塩基以上、より好ましくは500塩基以上のDNAをあげることができるが、少なくとも10塩基以上、好ましくは15塩基以上のDNAであってもよい。
　DNAのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第2版、第3版（2001年）、Methods for General and Molecular Bacteriology, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(Molecular)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
　上記のストリンジェントな条件とは、例えばDNAを固定化したフィルターとプローブDNAとを50％ホルムアミド、5×SSC（750ｍMの塩化ナトリウム、75mMのクエン酸ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20μg/lの変性させたサケ精子DNAを含む溶液中で42℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE（20×SSCEは、3mol/lの塩化ナトリウム、0.2mol/lのリン酸二水素ナトリウム、0.02mol/lのEDTA、pH7.4）、0.5％のSDS、30％のホルムアミド、100μg/lの変性させたサケ精子DNAを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベートした後、50℃の1×SSC、0.1％SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば5×SSC）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
　上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
　上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えばBLASTおよびFASTA等のプログラムを用いて計算したときに、配列番号１で表される塩基配列と95％以上、好ましくは97％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAをあげることができる。
　上記したDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAが、配列番号2に記載されたエステラーゼと同様のエステラーゼ作用を有する蛋白質をコードするDNAであることは、該DNAを発現する組換え体DNAを作製し、該組換え体DNAを主細胞に導入して得られる微生物を培養し、得られる培養物から粗酵素抽出液等を調製して化合物（ＩＶ）　と反応させ、化合物（Ｖ）の生成の有無により確認できる。
　配列番号２に記載のアミノ酸配列において１または複数個、好ましくは１から４０個、より好ましくは１から３０個、より好ましくは１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２において特定されるアミノ酸配列を有するエステラーゼと同様の作用を有する蛋白質をコードするDNAは、配列番号２に記載のアミノ酸配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法、又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。例えば、配列表の配列番号２に記載されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA、例えば配列番号１に記載された塩基配列を有するDNAを用いて、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、又は遺伝子工学的手法などにより所望のDNAを調製することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であり、例えば、モレキュラークローニング第2版、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」, John Wiley & Sons (1987-1997)に記載の方法に準じて行うことができる。
　また、配列番号２に記載のアミノ酸配列と95％以上、好ましくは97％以上、さらに好ましくは99％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２において特定されるアミノ酸配列を有するエステラーゼと同様の作用を有する蛋白質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列をクエリーに用い、各種蛋白質のデータベースを検索することで該アミノ酸配列と95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を取得し、取得されたアミノ酸配列を有する酵素を上記したように組換えＤＮＡを用いて該酵素を発現させ、その活性を確認することにより調製することができる。
　また、配列表の配列番号２に記載されたアミノ酸配列の情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いて微生物の染色体をスクリーニングすることにより上記DNAを取得することもできる。例えば、PCR法により各種微生物由来の染色体DNAライブラリー又はcDNAライブラリーを鋳型として所望のDNAを単離することができるが、上記のプローブ又はプライマーの調製、cDNAライブラリーの構築、cDNAライブラリーのスクリーニング、目的DNAのクローニングなどの手法は当業者に周知かつ慣用であり、例えば、上掲のカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
　配列番号１で特定される塩基配列を含むDNA、又は該塩基配列と95％以上、好ましくは97％以上、さらに好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、配列番号２に記載されたエステラーゼと同様のエステラーゼ作用を有する蛋白質をコードするDNAは適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するプラスミドなどのベクター、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれて染色体と共に複製されるベクターなどを利用することができる。上記DNAから所望の蛋白質を発現させるために発現ベクターを用いることが好ましいが、発現ベクターでは上記DNAが転写に必要なプロモーター等と機能的に連結されていることが望ましい。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すDNA配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
　例えば、細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子(Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene)、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子(Bacillus licheniformis alpha-amylase gene)、バチルス・アミロリケファチエンス・BANアミラーゼ遺伝子(Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene)、バチルス・ズブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子(Bacillus Ｓubtilis alkaline protease gene)、若しくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子(Bacillus pumilus xylosldase gene)のプロモータ、又はファージ・ラムダのPR若しくはPLプロモータ、大腸菌の lac、trp、若しくはtacプロモータなどが挙げられる。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、P10プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、又はバキュウロウイルス39K遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、TPI1プロモータ、ADH2-4cプロモータなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ADH3プロモータまたはtpiAプロモータなどがある。
　組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。上記DNA、プロモータ、所望によりターミネータ、及び／又は分泌シグナル配列などを適宜の順番でそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
　組み換えベクターを導入するための宿主細胞の種類は上記のDNAを発現できる限り特に限定されない。例えば、細菌、酵母、真菌、高等真核細胞等が挙げられるが、細菌や酵母などが好ましい。細菌としては、バチルス属、ストレプトマイセス属などに属するグラム陽性菌、あるいは大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられるが、大腸菌などが好ましい。これらの細菌の形質転換は細胞の種類に応じて適宜の手段で行うことができる。形質転換体を適宜の条件下で培養することにより、導入されたDNAからエステラーゼを発現させることができ、その後、エステラーゼを適宜の手段で単離・精製して本発明の方法に用いることができる。先に説明したように、形質転換体として微生物を用いる場合には、菌体自体や菌体処理物などを用いることも可能である。例えば、上記DNAをプラスミドに導入して組換えベクターを調製し、この組換えベクターを大腸菌に導入して形質転換した後、大腸菌を培養することにより所望のエステラーゼを取得することができるが、形質転換体の利用態様はこの特定の態様に限定されることはない。
　工程2における反応に用いる緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液等が挙げられ、好ましくはリン酸緩衝液が挙げられる。緩衝液の濃度は0.1 mmol/L ～1 mol/L、好ましくは1 mmol/L～100 mmol/Lである。金属塩としては、NaCl、FeCl3、KCl、CaCl2、MgSO4、MnSO4、ZnCl2、CoCl2等が挙げられる。金属塩の濃度は0.01～10％が好ましい。
　上記反応によって得られた式(V)の光学活性カルボン酸誘導体は、反応終了後、反応液を濾過して不溶物を除去し、酸を加えてpH 1～3、好ましくはpH 2程度に調整した後、適当な溶媒により反応物を抽出することにより分離することができる。
(工程3)
　化合物(V)に対し、（Ａ）溶媒中、-50℃～150℃、好ましくは-30℃～80℃の温度で、1当量～大過剰量の縮合剤を5分間～72時間反応させた後、-50℃～150℃、好ましくは-30℃～80℃の温度で、1当量～大過剰量のアンモニア源を添加して、5分間～72時間反応させるか、（Ｂ）溶媒中、-50℃～150℃、好ましくは-30℃～80℃の温度で、1当量～大過剰量の活性化試薬を5分間～72時間反応させた後、-50℃～150℃、好ましくは-30℃～80℃の温度で、1当量～大過剰量のアンモニア源を添加して、5分間～72時間反応させるか、又は、（Ｃ）溶媒中、-50℃～150℃、好ましくは20℃～80℃の温度で、1当量～大過剰量の縮合剤の存在下、1当量～大過剰量のアンモニア源を添加して、5分間～72時間反応させることにより、化合物(VI)を得ることができる。
　（Ａ）～（Ｃ）いずれの場合も、溶媒は反応に関与しないものであればいずれも使用可能であるが、例えば、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、tert-ブチルメチルエーテル、THF、ジオキサン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルイソブチルケトン、アセトン、ピリジン、DMF、 DMSO、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル等が挙げられ、好ましくはTHFが挙げられる。これらの溶媒は単独又は任意の混合物として用いることができる。
　また、（Ａ）～（Ｃ）いずれの場合も、アンモニア源との反応の際は、上記溶媒に加えて水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等の溶媒が使用可能であり、これらは単独又は任意の混合物として用いることができる。
　さらに、（Ａ）～（Ｃ）いずれの場合も、10分の1～30当量の塩基を加えて反応を行うこともできる。
　塩基としては、有機塩基又は無機塩基が挙げられ、好ましくは、有機塩基が挙げられる。有機塩基としては、例えば1,8-ジアザビシクロ[5,4,0]-7-ウンデセン(DBU)、トリエチルアミン、４-ジメチルアミノピリジン、N,N-ジメチルアニリン、ピリジン、N-メチルモルホリン、エチルジイソプロピルアミン等が挙げられ、好ましくは、トリエチルアミンが挙げられる。無機塩基としては、例えば、水素化ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸セシウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムtert-ブトキシド等が挙げられる。縮合剤としては前記と同様の縮合剤を用いることができる。活性化試薬及びアンモニア源も前記と同様のものを用いることができる。
(工程4)
　化合物(VI)に対し、溶媒中、-50℃～150℃、好ましくは-20℃～60℃の温度で、1当量～大過剰量の塩基を5分間～72時間作用させることにより化合物(I)又は化合物(VII)を得ることができる。
　溶媒としては、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ピリジン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、tert-ブチルメチルエーテル、THF、ジオキサン、水、イソプロピルアルコール、メタノール、エタノール、DMF、DMSO等が挙げられ、好ましくはエタノールが挙げられる。これらの溶媒は単独又は任意の混合物として用いることができる。
　塩基としては、水素化ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸セシウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムtert-ブトキシド等が挙げられ、好ましくはナトリウムエトキシドが挙げられる。
(工程5)
　化合物(VII)のR1Aが加水素分解により脱保護される保護基で保護されたアミノであるときは、溶媒中、-50℃～150℃、好ましくは20℃～100℃の温度で、1～10気圧、より好ましくは1～5気圧の圧力下で、基質に対して10分の１～50重量％、好ましくは1～10重量％の金属触媒を添加して、水素又は水素供与体共存下、5分間～72時間反応させることにより化合物(I)を得ることができる。
　溶媒としては、酢酸、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、tert-ブチルメチルエーテル、THF、ジオキサン、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、DMF等が挙げられ、好ましくはエタノールが挙げられる。これの溶媒は単独又は任意の混合物として用いることができる。
　金属触媒としては、酸化プラチナ(IV)、プラチナ-炭素、水酸化パラジウム(II)、水酸化パラジウム(II)-炭素、パラジウム-炭素、パラジウム-アルミナ、ルテニウム-炭素、ロジウム-炭素、ロジウム-アルミナ、ウィルキンソン触媒、ラネーニッケル等が挙げられ、好ましくはパラジウム-炭素が挙げられる。パラジウム-炭素におけるパラジウム含量は、特に限定されないが、好ましくは5～10%が挙げられる。
　水素供与体としては、ギ酸アンモニウム、シクロヘキセン、シクロヘキサ-1,3-ジエン、シクロヘキサ-1,4-ジエン等が挙げられる。
　化合物(VII)のR1Aが酸の作用により脱保護しうる保護基で保護されたアミノであるときは、無溶媒下又は溶媒中、-50℃～150℃、好ましくは20℃～100℃の温度で、酸を作用させることにより化合物(I)を得ることができる。
　溶媒としては、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、tert-ブチルメチルエーテル、THF、ジオキサン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、水、イソプロピルアルコール、メタノール、エタノール、DMF、ジクロロメタン、クロロホルム等が挙げられ、これの溶媒を単独又は任意の混合物として用いることができる。
　酸としては、無機酸、有機酸等が挙げられ、無機酸としては、塩酸、硫酸、硝酸等が挙げられ、有機酸としては、酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ｐ-トルエンスルホン酸等が挙げられる。好ましくは、トリフルオロ酢酸が挙げられる。
　化合物(VII)のR1Aがチオールの作用により脱保護される保護基で保護されたアミノであるときは、溶媒中、-50℃～150℃、好ましくは20℃～100℃の温度で、1当量～大過剰量のチオールを1当量～大過剰量の塩基存在下で5分間～72時間作用させることにより化合物(I)を得ることができる。
　溶媒としては、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ピリジン、ジエチルエーテル、THF、ジオキサン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、水、アセトン、イソプロピルアルコール、メタノール、エタノール、DMF、ジクロロメタン、クロロホルム等が挙げられ、これの溶媒を単独又は任意の混合物として用いることができる。
　チオールとしては、スルフヒドリル基を有する化合物であれば、いずれも用いることができるが、好ましくは、置換基を有していてもよいチオフェノール、置換基を有していてもよい低級アルキルチオールが挙げられ、さらに好ましくは、チオフェノール、メタンチオール、エタンチオール、1-ドデカンチオール等が挙げられる。
　塩基としては、有機塩基又は無機塩基が挙げられる。有機塩基としては、例えばDBU、トリエチルアミン、4-ジメチルアミノピリジン、N,N-ジメチルアニリン、ピリジン、N-メチルモルホリン、エチルジイソプロピルアミン等が挙げられ、無機塩基としては、例えば、水素化ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムtert-ブトキシド等が挙げられ、好ましくは炭酸カリウム、又はトリエチルアミンが挙げられる。
　化合物(I)及び化合物B：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 を化合物Aの中間体として利用できることが非特許文献3に示されているので、化合物(I)及び化合物Bを化合物Aの製造原料として利用できることは当業者に自明である。この文献の記載に従えば、例えば、前記（９）の（ｂ）～（ｅ）の各工程は以下のように実施される。
　工程（ｂ）では、例えば、化合物B、約1.5当量の2,5-ジメトキシテトラヒドロフラン及び過剰量の酢酸の混合物を約70℃で約1.5時間撹拌する。通常では、常法に従って粗製の反応生成物を単離し、これを次工程に用いることができる。
　工程（ｃ）では、例えば、前記工程（ｂ）で得られた生成物、約3当量のトリクロロアセチルクロリド、及び適量のクロロホルムの混合物を約16時間加熱還流させる。クロロホルムに代えて他の不活性溶媒（例えば、ジクロロメタン、THF等）を用いることもできる。通常では、常法に従って粗製の反応生成物を単離し、これを次工程に用いることができる。
　工程（ｄ）では、例えば、前記工程（ｃ）で得られた生成物、約1.2当量の4-ブロモ-2-フルオロベンジルアミン塩酸塩、及び約2.5当量のトリエチルアミンを適量の乾燥DMF溶媒中、室温で約16時間撹拌する。通常では、常法に従って粗製の反応生成物（化合物A）を単離し、これを次工程に用いることができる。
　工程（ｅ）では、例えば、工程（ｄ）で得られた化合物Aを適量の酢酸エチルとヘキサンの混合溶媒から再結晶する。他の再結晶溶媒として、エタノールなどのアルコール類を用いることもできる。
　以下に実施例及び参考例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
　実施例及び参考例で用いられるプロトン核磁気共鳴スペクトル (1H NMR) は、300 MHzで測定されたものであり、化合物及び測定条件によって交換性プロトンが明瞭には観測されないことがある。なお、シグナルの多重度の表記としては通常用いられるものを用いるが、brとは見かけ上幅広いシグナルであることを表す。さらに、質量スペクトル(MS)により化合物の分子量の確認を行った。
　ジエチル=2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-2-エトキシカルボニルスクシナートから(R)-1-エチル=水素=3-ベンジルオキシカルボニルアミノ-3-エトキシカルボニルスクシナートへの転換反応については、含量分析を行ない、液量×含量により生成量を求め収率を算出した。含量分析は、HPLCを用いて次の条件で行った。カラムはジーエルサイエンス社製Inertsil ODS-3 (φ4.6×75 mm、3 μm)、展開溶媒はアセトニトリル/0.05 mol/L リン酸緩衝液(pH 2.5)=50/50 (容積比)、流速1.0 mL/min、オーブン温度は40℃、検出波長は254 nmで行った。含量は既知濃度の標準液による検量線から算出した。
　また、光学純度分析についてはHPLCを用いて次の条件で行った。カラムはダイセル化学工業社製CHIRALCEL OJ-RH (φ4.6×150 mm)を用いた。1-エチル=水素=3-ベンジルオキシカルボニルアミノ-3-エトキシカルボニルスクシナートの光学純度分析は、展開溶媒はアセトニトリル/過塩素酸水溶液 (pH 2.0)=30/70 (容積比)、流速1.0 mL/min、オーブン温度は20℃、検出波長は254 nmで行った。ジエチル=2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-2-カルバモイルスクシナートの光学純度分析は、展開溶媒はアセトニトリル/水=30/70 (容積比)、流速0.5 mL/min、オーブン温度は20℃、検出波長は254 nmで行った。2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-2-エトキシカルボニルスクシンイミドの光学純度分析は、展開溶媒はアセトニトリル/過塩素酸水溶液 (pH 2.0)=30/70 (容積比)、流速0.5 mL/min、オーブン温度は20℃、検出波長は254 nmで行った。(R)-2-アミノ-2-エトキシカルボニルスクシンイミドの光学純度分析は、展開溶媒は過塩素酸水溶液 (pH 1.0)、流速0.45 mL/min、オーブン温度は5℃、検出波長は196 nmで行った。
　上記各製造方法における中間体及び目的化合物は、有機合成化学で常用される分離精製法、例えば、濾過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、再結晶、各種クロマトグラフィー等に付して単離精製することができる。また、中間体においては特に精製することなく次の反応に供することも可能である。
　化合物(I)、(IV)、(V)、(VI)、又は(VII)の塩を取得したいとき、化合物(I)、(IV)、(V)、(VI)、又は(VII)が塩の形で得られるときはそのまま精製すればよく、また、遊離の形で得られるときは、化合物(I)、(IV)、(V)、(VI)、又は(VII)を適当な溶媒に溶解又は懸濁し、酸又は塩基を加えて単離、精製すればよい。
　また、化合物(I)、(IV)、(V)、(VI)、又は(VII)並びにそれらの塩は、水あるいは各種溶媒との付加物の形で存在することもあるが、これらの付加物も本発明に包含される。
例1：ジエチル=2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-2-エトキシカルボニルスクシナートの製造（クロロ酢酸エチル法）
　ジエチル=2-ベンジルオキシカルボニルアミノマロナート5.0 g、炭酸カリウム2.7ｇ、ヨウ化カリウム0.27 g及び2-クロロ酢酸エチル2.6 gのDMF 50 mL懸濁液を50℃で1時間撹拌した。冷後、反応液を希塩酸中に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣を酢酸エチル-n-ヘキサンから結晶化して表記の化合物5.5 g (収率86％)を無色結晶として得た。
1H NMR (CDCl3) δ(ppm): 7.34 (5H, m), 6.39 (1H, s), 5.10 (2H, s), 4.24 (4H, q, J= 6.9Hz), 4.10 (2H, q, J= 7.2Hz), 3.49 (2H, s), 1,21 (9H, m)
MS (FAB) : m/z 396(M+H+)
HR-MS(FAB) : calcd for C19H26NO8 396.1658, found 396.1653(M+H+)
例2：ジエチル=2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-2-エトキシカルボニルスクシナートの製造（ブロモ酢酸エチル法）
　ジエチル=2-ベンジルオキシカルボニルアミノマロナート50 gの無水DMF溶液300 mLに、氷冷撹拌下、水素化ナトリウム(60％) 6.47 gを徐々に加えた後、室温で30分間撹拌し、次いで2-ブロモ酢酸エチル22.6 gを加え一夜撹拌した。反応液を希塩酸中に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、n-ヘキサン-酢酸エチル(5：1)で溶出、精製した後、酢酸エチル-n-ヘキサンから結晶化して表記の化合物46.7 g (収率83％)を無色結晶として得た。
例3：1-エチル=水素=3-ベンジルオキシカルボニルアミノ-3-エトキシカルボニルスクシナートの製造（エステルの加水分解反応）
(a)酵素精製
　独立法人 製品評価技術基盤機構　バイオテクノロジー本部　生物遺伝資源部門より分譲を受けたBacillus thuringiensis NBRC13866 をGPY培地（1%グルコース、0.5%ペプトン、0.3%酵母エキスからなる培地）にて30℃、16時間、好気的に培養した。得られた培養液から、遠心分離（12,000 × g、10分）により、湿菌体を回収し、0.01 Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）に懸濁した。懸濁液を氷冷下、超音波ホモジナイザー（日本精機US-300T）により破砕した後、遠心分離（12,000 × g、10分間）により、上清と残渣に分離した。上清に氷冷下、硫酸アンモニウムを20%飽和濃度になるように加え、攪拌後、遠心分離（12,000 × g、10分間）を行い、上清を除いた。沈殿を1 mM Dithiothreitol (DTT) を含む0.01 Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）に懸濁し、同緩衝液により透析した。この溶液にDEAE Sepharose Fast Flow（GE Healthcare 社製）を加え、混合後、ろ過し、活性溶液を回収した。
　この溶液に3-[(3-クロルアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホネート（CHAPS）を最終濃度１％となるように加え混合し、氷冷下、30分間超音波ホモジナイザーで処理した後、1 mM DTT、１% CHAPSを含む0.01 M トリス塩酸緩衝液（pH8.0）（以下緩衝液Aとする）で平衡化したDEAE Sepharoseに付し、緩衝液Aにて洗浄後、塩化ナトリウムの0から0.3 Mのグラジエントによりタンパク質を溶出した。活性画分を透析し、CHAPSを除いた後、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（Brij 35）を最終濃度0.05％となるように加え、0.05％ Brij 35、1mM DTT、0.3M塩化ナトリウムを含む0.01 M トリス塩酸緩衝液（pH8.0）（以下緩衝液B）にて平衡化したPhenyl Sepharose High Performance (GE Healthcare 社製)に付し、緩衝液Bにて洗浄後、塩化ナトリウムの0.3から0 Mのグラジエントによりタンパク質を溶出した。活性画分を緩衝液Aにて透析、限外濾過濃縮後、緩衝液Aにて平衡化したMono Q(GE Healthcare 社製)に付し、緩衝液Aにて洗浄後、塩化ナトリウムの0から0.5Mのグラジエントによりタンパク質を溶出した。活性画分を緩衝液Aにて平衡化したBenzamidine Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare 社製)に付し、緩衝液Aにて洗浄後、塩化ナトリウムの0から0.5Mのグラジエントによりタンパク質を溶出した。その活性画分を、SDS-PAGE(0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを含む12% ポリアクリルアミドゲル)に供したところ、約50 kDaのタンパク質のみを確認し目的酵素を精製したことを確認した。
　活性測定は以下のように行った。酵素を含む溶液0.1 mLに精製水を0.3 mL、1 M リン酸緩衝液（pH7）を0.05 mL、1% ジエチル=2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-2-エトキシカルボニルスクシナートを含むアセトニトリル0.05 mLを加え、混合した後、30℃で4時間振盪した。反応液中の生成物1-エチル=水素=3-ベンジルオキシカルボニルアミノ-3-エトキシカルボニルスクシナートをHPLCにより分析した。1分間に1 μmolの基質を変換する活性を１Uとした。
(b)部分精製酵素による反応
　上記(a)のDEAE Sepharoseカラム精製の活性画分を限外ろ過膜により濃縮した。濃縮液0.08 mL（約8 mU）、35％のジエチル=2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-2-エトキシカルボニルスクシナートを含むアセトニトリル0.01 mL、1 M リン酸緩衝液（pH7）を0.01 mLを加え混合し、30℃で振盪した。反応液のpHは1N 水酸化ナトリウムを用いpH7.5に調整した。HPLC分析により、30時間後には反応収率70％で1-エチル=水素=3-ベンジルオキシカルボニルアミノ-3-エトキシカルボニルスクシナートが得られたことを確認した。生成物の光学純度をHPLCで確認したところ、R体であり、光学純度は100% eeであった。
1H NMR (CDCl3) δ(ppm): 7.35 (5H, m), 6.51 (1H, s), 5.09 (2H, m), 4.24 (2H, q, J= 7.2Hz), 4.08 (2H, q, J= 7.2Hz), 3.48 (2H, s), 1,19 (6H, m)
MS (FAB) : m/z 368(M+H+)
HR-MS(FAB) : calcd for C17H22NO8 368.1345, found 368.1314(M+H+)
(c)精製した酵素のN末端アミノ酸配列分析
　上記(a)で精製した酵素のN末端アミノ酸配列分析を行なった。分析は株式会社アプロサイエンス（〒771-0360 徳島県鳴門市瀬戸町字板屋島124番4）に依頼した。分析の結果、Glu-Lys-Lys-Pro-Val-Ser-Leu-Thr-Glu-Arg-Thr-Ser-Leu-Phe-Pheの配列が得られた。この配列をDNA Data Bank of Japan（DDBJ）で相同性検索を行なったところ、Bacillus thuringiensis IBL 200の、遺伝子配列から推定されるHydrolase（accession no.C3IAP1）と相同性があった。
(d)遺伝子取得
　このHydrolaseの遺伝子情報を基にBacillus thuringiensis NBRC13866から酵素遺伝子の取得を行なった。Bacillus thuringiensis NBRC13866を5 mL GPY培地で、30℃、200rpmで24時間、振盪培養した培養液から、Genomic DNA Buffer set（株式会社キアゲン）及びQIAGEN Genomic-tip 500/G（株式会社キアゲン）を用いて単離したゲノムDNAを鋳型とし、5'-TAAATCCATTGCTTAACGCCTCTACTCTT (北海道システム・サイエンス株式会社)及び5'-TCACGCAATGATGATTGCATGATGGCTTT(北海道システム・サイエンス株式会社)をプライマーとして、KOD-plus-(東洋紡績株式会社)を使用して添付説明書に従いPCRを行った。PCR産物をpUC18（タカラバイオ株式会社）に挿入しプラスミドを構築した（pBTEST7）。
　pBTEST7を鋳型とし、プライマーウォーキング法により、インサートDNAの塩基配列を解読した。塩基配列解読にはABI PRISM 310NT Genetic Analyzer（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）及びBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）を使用し、各々の添付説明書に従い解読した。配列を解読した結果、遺伝子は1380 bpから成っていた（配列番号1）。配列番号1に示した遺伝子は460アミノ酸残基から成る酵素をコードしていた（配列番号2）。また、配列番号2に示した配列をDDBJで相同性検索を行なったところ、上記Bacillus thuringiensis IBL 200の、遺伝子配列から推定されるHydrolaseと最も相同性が高かったが、完全には一致せず、相同性は96%であった。
　また、活性本体である酵素の全長アミノ酸配列が明らかになったことから、上記（ｂ）においてエステラーゼ活性が確認された蛋白質は、配列番号2に記載のアミノ酸配列において、そのＮ末端側の４０アミノ酸が欠失している蛋白質であることがわかった。
(e)組換え大腸菌の作製
　pBTEST7を鋳型とし、5'-AAACAGCATGCAAAAAAAGAAATTACAAAAATCAGCAC（北海道システム・サイエンス株式会社）および5'-CTTTTGTTGTAGATCTTTTCTTTGTCGCATTGACCCA（北海道システム・サイエンス株式会社）をプライマーとし、KOD-plus-を使用してPCRを行った。PCR産物をSph I（東洋紡績株式会社)、及びBgl II（東洋紡績株式会社）で消化し、pQE-70（株式会社キアゲン）のSph I及びBgl IIサイトに挿入したプラスミドを構築した（pBTEST12）。pBTEST12をCompetent high JM109（東洋紡績株式会社）を用いて添付説明書に従い大腸菌JM109に遺伝子導入し、大腸菌JM109/pBTEST12を作製した。
(f)組換え大腸菌を用いた反応
　上記(e)で作製した大腸菌JM109/pBTEST12を100 mg/Lのアンピシリンナトリウム（和光純薬工業株式会社）を含む5 mLのLB液体培地（1.0%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、1.0%塩化ナトリウム、pH 7.0）に植菌し、25℃、200 rpmで12時間振盪培養を行った。この培養液を0.1 mM イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（ナカライテスク株式会社）を含む200 mLのLB液体培地に植え継ぎ、25℃、200rpmで24時間振盪培養を行った。この培養液を1.6 L調製し、12,000 × g、4℃で10分間遠心分離し、菌体を得た。この菌体を精製水に懸濁し、35％ ジエチル=2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-2-エトキシカルボニルスクシナートを含むアセトニトリル溶液を10 mL、1.0 M リン酸緩衝液（pH7.0）を10 mL加え、さらに総量100 mLとなるよう精製水を加えた。この溶液を攪拌しながら、24時間、25℃に維持した。反応液のpHが7.0に維持されるように、適時28%水酸化ナトリウム溶液を加えた。
　この反応液を12,000 × g、4℃で10分間遠心分離し、菌体を除去した後、上清をHPLCで分析し、反応収率90％で1-エチル=水素=3-ベンジルオキシカルボニルアミノ-3-エトキシカルボニルスクシナートが得られたことを確認できた。生成物の光学純度をHPLCで確認したところ、R体であり、光学純度は100% eeであった。
(g)組換え大腸菌からの酵素精製及び酵素反応
　大腸菌JM109/pBTEST12を100mg/Lのアンピシリンナトリウムを含む5 mLのLB液体培地に植菌し、25℃、200 rpmで12時間振盪培養を行った。この培養液を0.1 mM イソプロピル-β-チオガラクトピラノシドを含む200 mLのLB液体培地に植え継ぎ、25℃、200rpmで24時間振盪培養を行った。この培養液からQIAexpress Type ATG Kit（株式会社キアゲン）を使用し、添付説明書に従い酵素精製を行った。精製した酵素溶液をSDS-PAGE(0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを含む12% ポリアクリルアミドゲル)で電気泳動を行った結果、単一のバンドであり酵素精製できたことを確認した。
　この精製酵素を用いて、3% ジエチル=2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-2-エトキシカルボニルスクシナート、0.1M リン酸緩衝液（pH7.0）、0.55 mg/mL 精製酵素 の組成となるように溶液を調製し、30℃で3時間放置した。この反応液をHPLCで分析したところ、反応収率20％で 1-エチル=水素=3-ベンジルオキシカルボニルアミノ-3-エトキシカルボニルスクシナートが得られたことを確認できた。また、生成物の光学純度をHPLCで確認したところ、R体であり、光学純度は100% eeであった。
(h)Ｎ末端欠損酵素遺伝子の発現組換え大腸菌の作製
　上記(ｄ)において、エステラーゼ活性を有する蛋白質は、配列番号2に記載のアミノ酸配列のＮ末端側のアミノ酸配列が、４０アミノ酸を欠損している蛋白質であることが分かった。このことから、Ｎ末端が欠損している蛋白質を発現する組換え大腸菌を作製した。
　pBTEST12を鋳型とし、5'-GTACAAAGCATGCAAAAGAAACCAGTCTCTTTAACGG AGCG（北海道システム・サイエンス）及び5'-CTTTTGTTGTAGATCTTTTCTTTGTCGC ATTGACCCA（北海道システム・サイエンス）をプライマーとし、ＫＯＤ-plus-を使用してPCRを行なった。PCR産物をSph I及びBgl IIで消化し、pQE-70のSph I 及び Bgl IIサイトに挿入したプラスミドを構築した(pBTEST38)。pBTEST38をCompetent high JM109を用いて添付説明書に従い大腸菌JM109に遺伝子導入し、大腸菌JM109/pBTEST38を作製した。
　大腸菌JM109/pBTEST38を100 mg/Lのアンピシリンナトリウムを含む5 mLのLB液体培地に植菌し、30℃、200 rpmで19時間振盪培養を行った。この培養液を0.1 mM イソプロピル-β-チオガラクトピラノシドを含む100 mLのLB液体培地に植え継ぎ、25℃、200rpmで16時間振盪培養を行った。
　この培養液を3L調製し、12,000 × g、4℃で10分間遠心分離し、菌体を得た。この菌体を少量の0.1 M リン酸緩衝液（pH7.0）に懸濁し、35％ ジエチル=2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-2-エトキシカルボニルスクシナートを含むアセトニトリル溶液を15 mL加え、さらに総量150 mLとなるよう精製水を加えた。この溶液を攪拌しながら、18時間、25℃に維持した。反応液のpHが7.0に維持されるように、適時28%水酸化ナトリウム溶液を加えた。
　この反応液を12,000 × g、4℃で10分間遠心分離し、菌体を除去した後、上清をHPLCで分析し、反応収率90％で1-エチル=水素=3-ベンジルオキシカルボニルアミノ-3-エトキシカルボニルスクシナートが得られたことを確認した。生成物の光学純度をHPLCで確認したところ、R体であり、光学純度は100% e.e.であった。
例4：(R)-ジエチル=2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-2-カルバモイルスクシナートの製造
　(R)-1-エチル=水素=3-ベンジルオキシカルボニルアミノ-3-エトキシカルボニルスクシナート1.8 gのTHF 20 mL溶液に-15℃撹拌下、トリエチルアミン0.96 mL、クロロギ酸イソブチル0.84 mL (0.87 g)の順で加え、5分間撹拌した。同温度にて25％アンモニア水0.47 mLを反応液に滴下した。同温度にて1時間撹拌後、反応液を希塩酸中に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、n-ヘキサン-酢酸エチル(1：1)で溶出、精製した後、酢酸エチル-n-ヘキサンから結晶化して表記の化合物1.51 g (収率84％)を無色結晶として得た。旋光度は[α]D 25 -5.7°(c 0.52、エタノール)、光学純度は96.1％ eeであった。
1H NMR (CDCl3) δ(ppm): 7.34 (5H, m), 6.51 (1H, br), 6.35 (1H, br), 5.63 (1H, br), 5.12 (2H, s), 4.26 (2H, m), 4.10 (2H, q, J= 7.2 Hz), 3.48 (2H, s), 1,23 (6H, m)
MS (FAB) : 367(M+H+)
HR-MS(FAB) : calcd for C17H23N2O7 367.1505, found 367.1509(M+H+)
例5：(R)-2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-2-エトキシカルボニルスクシンイミドの製造
　氷冷撹拌下、(R)-ジエチル=2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-2-カルバモイルスクシナート200 mgの無水エタノール10 mL溶液に、ナトリウムエトキシド 41 mgを加え、同温度で2時間撹拌した後、冷1 mol/L塩酸を注ぎ、酢酸エチルで抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒を減圧留去し残渣を酢酸エチル-n-ヘキサンから再結晶して表記の化合物149 mg (収率85％)を無色結晶として得た。旋光度は[α]D 28 -31.8°(c 0.59、エタノール)、光学純度は99.2％ eeであった。
1H NMR (CDCl3) δ(ppm): 8.39 (1H, s), 7.36 (5H, m), 6.27 (1H, s), 5.12 (2H, m), 4.32 (2H, q, J= 6.9Hz), 3.18 (2H, m), 1,29 (3H, t, J= 7.1Hz)
MS (FAB) : 321(M+H+)
HR-MS(FAB) : calcd for C15H17N2O6 321.1087, found 321.1074(M+H+)
例6：(R)-2-アミノ-2-エトキシカルボニルスクシンイミドの製造
　(R)-2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-2-エトキシカルボニルスクシンイミド80 mgをエタノール10 mLに溶解し、5％パラジウム-炭素4 mgを加え、水素雰囲気下、室温で接触水素化した。触媒を濾去した後、濾液を減圧濃縮した。残渣をエタノールから再結晶して、表記の化合物43 mg (収率93％)を無色結晶として得た。旋光度は[α]D 24-35.9°(ｃ0.22、エタノール)であった。光学純度 は 99.9％ ee 以上であった。
1H NMR (CDCl3) δ(ppm): 4.28 (2H, q, J= 7.2Hz), 3.19 (1H, d, J= 18.0Hz), 2.74 (1H, d, J= 18.0Hz), 1,30 (3H, t, J= 7.1Hz)
MS (FAB) : 187(M+H+)
HR-MS(FAB) : calcd for C7H11N2O4 187.0719, found 187.0700(M+H+)
　本発明により、糖尿病合併症治療薬として有用な化合物Aの鍵中間体である光学活性スクシンイミド誘導体の効率的な製造方法として、その有用中間体であるエステル誘導体から高い光学純度を有する光学活性カルボン酸誘導体を収率よく製造する方法が提供される。

Claims (12)

  1. 式(I) ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     [式(I)中、R3は低級アルキルを表す]
    で表される光学活性スクシンイミド誘導体又はその塩の製造方法であって、以下の工程(A)～(D)、さらに必要により工程 (E)を含む製造方法：
    (A) 式(II)：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
      [式(II)中、R1はアミノ、又は保護基で保護されたアミノを表し、2つのR3は、前記と同義の同一の低級アルキルを表す]で表されるアミノマロナート誘導体と式(III)：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     [式(III)中、R2は低級アルキルを表し、Yはハロゲンを表す]
    で表されるハロゲン化酢酸エステル誘導体を塩基の存在下で反応させて式(IV) ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     [式(IV)中、R1、R2及びR3はそれぞれ前記と同義である]
    で表されるエステル誘導体又はその塩に変換する工程、
    （B）式(IV)で表されるエステル誘導体又はその塩に非動物由来の酵素、該酵素を生産する細胞、該細胞の培養物、又は該細胞若しくは該細胞の培養物の処理物を作用させ、式(V)：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     [式(V)中、R1、R2及びR3はそれぞれ前記と同義である]
    で表される光学活性カルボン酸誘導体又はその塩に変換する工程、
    （C）式(V)で表される光学活性カルボン酸誘導体又はその塩を縮合剤の存在下、アンモニア源と反応させるか、又は活性化試薬と反応させた後に、さらにアンモニア源と反応させて、式(VI)：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     [式(VI)中、R1、R2及びR3はそれぞれ前記と同義である]
    で表される光学活性アミド誘導体又はその塩に変換する工程、
    （D）式(VI)で表される光学活性アミド誘導体又はその塩に塩基を作用させて、式(I)又は式(VII)：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     ［式(VII)中、R1Aは保護基で保護されたアミノを表し、R3は前記と同義である］
    で表される光学活性スクシンイミド誘導体又はその塩に変換する工程、
    （E）式(VII)で表される光学活性スクシンイミド誘導体又はその塩のR1A上の保護基を脱保護して、上記式(I)で表される光学活性スクシンイミド誘導体又はその塩に変換する工程。
  2. 式(IV)で表されるエステル誘導体又はその塩に非動物由来の酵素、該酵素を生産する細胞、該細胞の培養物、又は該細胞若しくは該細胞の培養物の処理物を作用させる工程を含む、式(V)で表される光学活性カルボン酸誘導体又はその塩の製造方法。
  3. 酵素が微生物由来エステラーゼである請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 酵素がバチルス属に属する微生物由来エステラーゼである請求項１又は２に記載の製造方法。
  5. 酵素がバチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)由来エステラーゼである請求項１又は２に記載の製造方法。
  6. 酵素が以下の（ａ）～（ｄ）より選ばれる蛋白質である請求項１又は２に記載の製造方法。
    （ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列により特定される蛋白質
    （ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が置換及び／又は欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質
    （ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質
    （ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、Ｎ末端から１～４０個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を有する蛋白質
  7. R1及びR1Aがベンジルオキシカルボニルアミノであり、R2がエチルであり、R3がエチルである請求項１ないし６のいずれか１項に記載の製造方法。
  8. 請求項１に記載の製造方法により、式(I)で表される光学活性スクシンイミド誘導体｛以下、化合物(I)と称する｝を製造する工程、及び該工程で得られた化合物(I)を(3R)-2'-(4-ブロモ-2-フルオロベンジル)スピロ[ピロリジン-3,4'(1'H)-ピロロ[1,2-ａ]ピラジン]-1',2,3',5(2'H)-テトラオン（以下、化合物Aと称する）に変換する工程を含む化合物Aの製造方法。
  9. 化合物Aの製造方法であって、下記（ａ）～（ｅ）の工程を含む製造方法：
    （ａ）化合物(I)を（１）に記載の製造方法で製造する工程；
    （ｂ）前記工程（ａ）で得られた化合物(I)を酸（例えば、酢酸など）の存在下に2,5-ジメトキシテトラヒドロフランと反応させる工程；
    （ｃ）前記工程（ｂ）で得られた生成物をトリクロロアセチル化試薬（例えば、トリクロロアセチルクロリド、トリクロロアセチルブロミド、無水トリクロロ酢酸など）と反応させる工程；
    （ｄ）前記工程（ｃ）で得られた生成物を4-ブロモ-2-フルオロベンジルアミンと反応させる工程；及び
    （ｅ）前記工程（ｄ）で得られた化合物Aを単離する工程。
  10. R3がエチルである請求項８又は９に記載の製造方法。
  11. 以下の（ａ）～（ｄ）より選ばれる蛋白質。
    （ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列により特定される蛋白質
    （ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が置換及び／又は欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質
    （ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質
    （ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、Ｎ末端から１～４０個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を有する蛋白質
  12. 以下の（ａ）～（ｄ）より選ばれるＤＮＡ。
    （ａ）配列番号１に記載の塩基配列により特定されるＤＮＡ
    （ｂ）請求項１１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
    （ｃ）配列番号１に記載の塩基配列において１つ又は複数の塩基が置換及び／又は欠失及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ配列番号２に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
    （ｄ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつ配列番号２に記載のアミノ酸配列により特定されるエステラーゼと同様のエステラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
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