ES2356273T3 - Péptidos macrocíclicos como inhibidores del virus de la hepatitis c. - Google Patents

Abstract

Un compuesto de fórmula (I) o un enantiómero, diastereómero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que R1 se selecciona entre alcoxi, hidroxi y -NHSO2R7; R2a y R2b se seleccionan independientemente entre hidrógeno y metilo; R3 se selecciona entre alquenilo, alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, heterociclilo y heterociclilalquilo; R4 es hidroxi; R5 se selecciona entre hidrógeno, alquilo y cicloalquilo; R6 se selecciona entre hidrógeno, alquilo, alcoxicarbonilo, alquilaminocarbonilo, alquilcarbonilo, aminocarbonilo, ariloxicarbonilo, cicloalquiloxicarbonilo, dialquilaminocarbonilo, haloalcoxicarbonilo, haloalquilo, haloalquilcarbonilo, heterocicliloxicarbonilo y (NRaRb)sulfonilo; R7 se selecciona entre alquilo, arilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, heterociclilo y -NRaRb; en el que el cicloalquilo y la parte cicloalquilo del (cicloalquil)alquilo están opcionalmente sustituidos con uno, dos o tres grupos seleccionados independientemente entre alquenilo, alcoxi, alcoxialquilo, alquilo, arilalquilo, arilcarbonilo, ciano, cicloalquenilo, (cicloalquil)alquilo, halo, haloalcoxi, haloalquilo y (NReRf)carbonilo; y en el que Ra y Rb se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alcoxi, alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, haloalquilo, heterociclilo y heterociclilalquilo; y en el que Re y Rf se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo, arilo, arilalquilo y heterociclilo; en el que el arilo, la parte arilo del arilalquilo y el heterociclilo están opcionalmente sustituidos con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre alcoxi, alquilo y halo; y Q es una cadena C3-9 saturada o insaturada, que contiene opcionalmente de uno a tres heteroátomos seleccionados independientemente entre O, S(O)m y NR9, en el que m es 0, 1 ó 2, y R9 se selecciona entre hidrógeno, alcoxi, alcoxicarbonilo, alquilo, alquilcarbonilo, alquilsulfonilo, aminocarbonilo, arilsulfonilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, cicloalquiloxi, dialquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilalquilo, haloalquilo y heterociclilcarbonilo. Q es una cadena C3-9 saturada o insaturada, que contiene opcionalmente de uno a tres heteroátomos seleccionados independientemente entre O, S(O)m y NR9, en el que m es 0, 1 ó 2, y R9 se selecciona entre hidrógeno, alcoxi, alcoxicarbonilo, alquilo, alquilcarbonilo, alquilsulfonilo, aminocarbonilo, arilsulfonilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, cicloalquiloxi, dialquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilalquilo, haloalquilo y heterociclilcarbonilo.

Description

La presente divulgación se refiere en general a compuestos antivirales y más específicamente se refiere a compuestos que inhiben la función de la proteasa NS3 (también denominada en el presente documento "serina proteasa") codificada por el virus de la Hepatitis C (VHC), composiciones que comprenden tales compuestos y procedimientos para inhibir la función de la proteasa NS3. 5

El VHC es un patógeno humano importante, que infecta a aproximadamente 170 millones de personas en todo el mundo - aproximadamente cinco veces el número de infectados por el virus de inmunodeficiencia humana de tipo 1. Una parte considerable de estos individuos infectados con VHC desarrollan enfermedad hepática progresiva grave, incluyendo cirrosis y carcinoma hepatocelular.

Actualmente, la terapia más eficaz contra VHC emplea una combinación de interferón-alfa y ribavirina, que 10 conduce a una eficacia sostenida en el 40% de los pacientes. Resultados clínicos recientes demuestran que el interferón-alfa pegilado es mejor que el interferón-alfa no modificado como monoterapia. Sin embargo, incluso con regímenes terapéuticos experimentales que implican combinaciones de interferón-alfa pegilado y ribavirina, una parte considerable de los pacientes no tiene una reducción sostenida de la carga viral. Por tanto, existe una necesidad clara y no satisfecha de desarrollar medicamentos eficaces para el tratamiento de Infección por VHC. 15

VHC es un virus ARN de cadena positiva. En base a una comparación de la secuencia de aminoácidos deducida y la extensa similitud en la región no traducida 5’, VHC se ha clasificado como un género separado en la familia Flaviviridae. Todos los miembros de la familia Flaviviridae tienen viriones envueltos que contienen un genoma de ARN de cadena positiva que codifica todas las proteínas específicas de virus conocidas a través de la traducción de una fase de lectura abierta única e ininterrumpida. 20

Se encuentra heterogeneidad considerable dentro de la secuencia de nucleótidos y aminoácidos codificada por todo el genoma de VHC. Se han caracterizado seis genotipos principales y se han descrito más de 50 subtipos. Los genotipos principales de VHC difieren en su distribución en todo el mundo y la significancia clínica de la heterogeneidad genética de VHC permanece elusiva a pesar de los numerosos estudios del posible efecto de los genotipos sobre la patogénesis y terapia. 25

El genoma de ARN de VHC monocatenario tiene aproximadamente 9500 nucleótidos de longitud y tiene una fase de lectura abierta (ORF) única que codifica una poliproteína grande única de aproximadamente 3000 aminoácidos. En células infectadas, esta poliproteína se escinde en sitios múltiples mediante proteasas celulares y virales para producir las proteínas estructurales y no estructurales (NS). En el caso de VHC, la generación de proteínas no estructurales maduras (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B) se realiza mediante dos proteasas 30 virales. La primera escinde en el punto de unión NS2-NS3; la segunda es una serina proteasa contenida dentro de la región N-terminal de NS3 y media todas las escisiones posteriores cadena debajo de NS3, tanto en cis, en el sitio de escisión NS3-NS4A, como en trans, para los sitios restantes NS4A- NS4B, NS4B-NS5A, NS5A-NS5B. La proteína NS4A parece tener múltiples funciones, actuando como un co-factor para la proteasa NS3 y posiblemente ayudando en la localización de membrana de NS3 y otros componentes de replicasa viral. La formación de complejo de la 35 proteína NS3 con NS4A es esencial para el procesamiento eficaz de poliproteína, potenciando la escisión proteolítica en todos los sitios. La proteína NS3 también muestra actividades nucleósido trifosfatasa y ARN helicasa. NS5B es una ARN polimerasa dependiente de ARN que está implicada en la replicación de VHC. El documento US 2005/153877 describe compuestos macrocíclicos que son útiles como inhibidores de proteasa del virus de la hepatitis C. 40

La presente divulgación proporciona compuestos peptídicos que pueden inhibir el funcionamiento de la proteasa NS3, por ejemplo, en combinación con la proteasa NS4A. Además, la presente divulgación describe la administración de terapia de combinación a un paciente mediante la cual se puede administrar un compuesto de acuerdo con la presente divulgación, que es eficaz para inhibir la proteasa NS3 de VHC, con uno o dos compuestos adicionales que tienen actividad anti-VHC. 45

En un primer aspecto, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula (I)

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que

R1 se selecciona entre alcoxi, hidroxi y -NHSO2R7;

R2a y R2b se seleccionan independientemente entre hidrógeno y metilo;

R3 se selecciona entre alquenilo, alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, heterociclilo y 5 heterociclilalquilo;

R4 es hidroxi;

R5 se selecciona entre hidrógeno, alquilo y cicloalquilo;

R6 se selecciona entre hidrógeno, alquilo, alcoxicarbonilo, alquilaminocarbonilo, alquilcarbonilo, aminocarbonilo, ariloxicarbonilo, cicloalquiloxicarbonilo, dialquilaminocarbonilo, haloalcoxicarbonilo, 10 haloalquilo, haloalquilcarbonilo, heterocicliloxicarbonilo y (NRaRb)sulfonilo;

R7 se selecciona entre alquilo, arilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, heterociclilo y -NRaRb; en el que el cicloalquilo y la parte cicloalquilo del (cicloalquil)alquilo están opcionalmente sustituidos con uno, dos o tres grupos seleccionados independientemente entre alquenilo, alcoxi, alcoxialquilo, alquilo, arilalquilo, arilcarbonilo, ciano, cicloalquenilo, (cicloalquil)alquilo, halo, haloalcoxi, haloalquilo y (NReRf)carbonilo; y en 15 el que Ra y Rb se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alcoxi, alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, haloalquilo, heterociclilo y heterociclilalquilo; y en el que Re y Rf se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo, arilo, arilalquilo y heterociclilo; en el que el arilo, la parte arilo del arilalquilo y el heterociclilo están opcionalmente sustituidos con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre alcoxi, alquilo y halo; y 20

Q es una cadena C3-9 saturada o insaturada, que contiene opcionalmente de uno a tres heteroátomos seleccionados independientemente entre O, S(O)m y NR9, en el que m es 0, 1 ó 2, y R9 se selecciona entre hidrógeno, alcoxi, alcoxicarbonilo, alquilo, alquilcarbonilo, alquilsulfonilo, aminocarbonilo, arilsulfonilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, cicloalquiloxi, dialquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilalquilo, haloalquilo y heterociclilcarbonilo. 25

En una primera realización del primer aspecto, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que R1 es -NHSO2R7.

En una segunda realización del primer aspecto, R7 es cicloalquilo.

En una tercera realización del primer aspecto, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que R2a y R2b son hidrógeno. 30

En una cuarta realización del primer aspecto, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que Q es una cadena C5-7 insaturada que contiene cero heteroátomos.

En una quinta realización del primer aspecto, Q es una cadena C6 insaturada que contiene cero heteroátomos. 35

En un segundo aspecto, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula (II)

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que

R1 es -NHSO2R7;

R2a y R2b son hidrógeno;

R3 se selecciona entre alquenilo, alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, heterociclilo y 5 heterociclilalquilo;

R4 es hidroxi;

R5 es hidrógeno; R6 es alcoxicarbonilo;

R7 se selecciona entre alquilo, arilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, heterociclilo y -NRaRb; en el que Ra y Rb se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alcoxi, alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, 10 (cicloalquil)alquilo, haloalquilo, heterociclilo y heterociclilalquilo; y Q es una cadena C3-9 saturada o insaturada, que contiene opcionalmente de uno a tres heteroátomos seleccionados independientemente entre O, S(O)m y NR9, en el que m es 0, 1 ó 2, y R9 se selecciona entre hidrógeno, alcoxi, alcoxicarbonilo, alquilo, alquilcarbonilo, alquilsulfonilo, aminocarbonilo, arilsulfonilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, cicloalquiloxi, dialquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilalquilo, haloalquilo y heterociclilcarbonilo. 15

En una primera realización del segundo aspecto, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula (II), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que R4 es hidroxi.

En una segunda realización del segundo aspecto, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula (II), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que R7 es cicloalquilo.

En una tercera realización del segundo aspecto, la presente divulgación proporciona un compuesto de 20 fórmula (II), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que Q es una cadena C6 insaturada que contiene cero heteroátomos.

En un tercer aspecto, la presente divulgación proporciona un compuesto seleccionado entre

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 25

En un cuarto aspecto la presente divulgación proporciona una composición que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una primera realización de un cuarto aspecto una composición comprende además al menos un compuesto adicional

que tiene actividad anti-VHC. En una segunda realización de un cuarto aspecto al menos uno de los compuestos adicionales es un interferón o una ribavirina. En una tercera realización de un cuarto aspecto el interferón se selecciona entre interferón alfa 2B, interferón alfa pegilado, interferón de consenso, interferón alfa 2A e interferón tau linfoblastoide.

En una cuarta realización de un cuarto aspecto la presente divulgación proporciona una composición que 5 comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, un vehículo farmacéuticamente aceptable y al menos un compuesto adicional que tiene actividad anti-VHC, en el que al menos uno de los compuestos adicionales se selecciona entre interleuquina 2, interleuquina 6, interleuquina 12, un compuesto que potencia el desarrollo de una respuesta de células T auxiliares de tipo 1, ARN de interferencia, ARN antisentido, Imiquimod, ribavirina, un inhibidor de inosina 5’-monofosfato deshidrogenasa, amantadina y rimantadina. 10

En una quinta realización de un cuarto aspecto la presente divulgación proporciona una composición que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, un vehículo farmacéuticamente aceptable y al menos un compuesto adicional que tiene actividad anti-VHC, en el que al menos uno de los compuestos adicionales es eficaz para inhibir la función de una diana seleccionada entre metaloproteasa de VHC, serina proteasa de VHC, polimerasa de VHC, helicasa de VHC, proteína NS4B de VHC, entrada de VHC, 15 ensamblaje de VHC, salida de VHC, proteína NS5A de VHC e IMPDH para el tratamiento de una infección por VHC.

En un quinto aspecto la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en un procedimiento de tratamiento de una infección por VHC en un paciente. Un procedimiento de este tipo comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En una primera realización 20 de un quinto aspecto un procedimiento comprende además administrar al menos un compuesto adicional que tiene actividad anti-VHC antes, después o de forma simultánea con un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En una segunda realización al menos uno de los compuestos adicionales es un interferón o una ribavirina. En una tercera realización el interferón se selecciona entre interferón alfa 2B, interferón alfa pegilado, interferón de consenso, interferón alfa 2A e interferón tau linfoblastoide. 25

En una cuarta realización de un quinto aspecto la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en un procedimiento de tratamiento de una infección por VHC en un paciente. Un procedimiento de este tipo comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y al menos un compuesto adicional que tiene actividad anti-VHC antes, después o de forma simultánea con un 30 compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que al menos uno de los compuestos adicionales se selecciona entre interleuquina 2, interleuquina 6, interleuquina 12, un compuesto que potencia el desarrollo de una respuesta de células T auxiliares de tipo 1, ARN de interferencia, ARN antisentido, Imiquimod, ribavirina, un inhibidor de inosina 5’-monofosfato deshidrogenasa, amantadina y rimantadina.

En una quinta realización de un quinto aspecto la presente divulgación proporciona un compuesto de 35 fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en un procedimiento de tratamiento de una infección por VHC en un paciente. Un procedimiento de este tipo comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y al menos un compuesto adicional que tiene actividad anti-VHC antes, después o de forma simultánea con un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que al menos uno de los 40 compuestos adicionales es eficaz para inhibir la función de una diana seleccionada entre metaloproteasa de VHC, serina proteasa de VHC, polimerasa de VHC, helicasa de VHC, proteína NS4B de VHC, entrada de VHC, ensamblaje de VHC, salida de VHC, proteína NS5A de VHC e IMPDH para el tratamiento de una infección por VHC.

En un sexto aspecto la presente divulgación proporciona una composición que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, uno, dos, tres, cuatro o cinco compuestos 45 adicionales que tienen actividad anti-VHC y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una primera realización de un sexto aspecto una composición comprende tres o cuatro compuestos adicionales que tienen actividad anti-VHC. En una segunda realización de un sexto aspecto una composición comprende uno o dos compuestos adicionales que tienen actividad anti-VHC.

En un séptimo aspecto la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula (I) o una sal 50 farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en un procedimiento de tratamiento de una infección por VHC en un paciente. Un procedimiento de este tipo comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y uno, dos, tres, cuatro o cinco compuestos adicionales que tienen actividad anti-VHC antes, después o de forma simultánea con un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En una primera realización de un 55 séptimo aspecto un procedimiento comprende administrar tres o cuatro compuestos adicionales que tienen actividad anti-VHC. En una segunda realización de un séptimo aspecto un procedimiento comprende administrar uno o dos compuestos adicionales que tienen actividad anti-VHC.

Otros aspectos de la presente divulgación pueden incluir combinaciones adecuadas de realizaciones desveladas en el presente documento. 60

Otros aspectos y realizaciones adicionales se pueden encontrar en la descripción proporcionada en el presente documento.

La descripción de la presente divulgación en el presente documento se debe interpretar en congruencia con las leyes y principios de enlaces químicos. En algunos casos puede ser necesario retirar un átomo de hidrógeno a fin de alojar un sustituyente en cualquier emplazamiento dado. 5

Se ha de apreciar que los compuestos incluidos en la presente divulgación son aquellos que son estables de forma adecuada para su uso como agente farmacéutico.

Como se usa en el presente documento descriptiva, los siguientes términos tienen los significados indicados:

El término "alquenilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo de cadena lineal o 10 ramificada de dos a seis átomos de carbono que contiene al menos un doble enlace carbono-carbono.

El término "alcoxi", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo unido al resto molecular parental a través de un átomo de oxígeno.

El término "alcoxialquilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con uno, dos o tres grupos alcoxi. 15

El término "alcoxicarbonilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alcoxi unido al resto molecular parental a través de un grupo carbonilo.

El término "alquilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo obtenido a partir de un hidrocarburo saturado de cadena lineal o ramificada que contiene de uno a seis átomos de carbono.

El término "alquilamino", como se usa en el presente documento, se refiere a -NHR, en el que R es un 20 grupo alquilo.

El término "alquilaminocarbonilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilamino unido al resto molecular parental a través de un grupo carbonilo.

El término "alquilcarbonilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo unido al resto molecular parental a través de un grupo carbonilo. 25

El término "alquilsulfonilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo unido al resto molecular parental a través de un grupo sulfonilo.

El término "amino", como se usa en el presente documento, se refiere a -NH2.

El término "aminocarbonilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo amino unido al resto molecular parental a través de un grupo carbonilo. 30

El término "arilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo fenilo, o a un sistema de anillo condensado bicíclico en el que uno o los dos anillos es un grupo fenilo. Los sistemas de anillos bicíclicos condensados consiste en un grupo fenilo condensado con un anillo carbocíclico, aromático o no aromático, de cuatro a seis miembros. Los grupos arilo de la presente divulgación pueden estar unidos al resto molecular parental a través de cualquier átomo de carbono sustituible en el grupo. Los ejemplos representativos de grupos arilo incluyen, 35 pero sin limitación, indanilo, indenilo, naftilo, fenilo y tetrahidronaftilo. Los grupos arilo de la presente divulgación pueden estar opcionalmente sustituidos con uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituyentes seleccionados independientemente entre alquenilo, alcoxi, alcoxicarbonilo, alquilo, un segundo grupo arilo, arilalquilo, ariloxi, ciano, cianoalquilo, halo, haloalcoxi, haloalquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo, nitro y oxo; en el que el segundo grupo arilo, la parte arilo del arilalquilo y el ariloxi, el heterociclilo y la parte heterociclilo del heterociclilalquilo pueden estar 40 opcionalmente sustituidos con uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituyentes seleccionados independientemente entre alquenilo, alcoxi, alquilo, ciano, halo, haloalcoxi, haloalquilo, nitro y oxo.

El término "arilalquilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con uno, dos o tres grupos arilo.

El término "arilcarbonilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo arilo unido al resto 45 molecular parental a través de un grupo carbonilo.

El término "ariloxi", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo arilo unido al resto molecular parental a través de un átomo de oxígeno.

El término "ariloxicarbonilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo ariloxi unido al resto molecular parental a través de un grupo carbonilo. 50

El término "arilsulfonilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo arilo unido al resto molecular parental a través de un grupo sulfonilo.

El término "carbonilo", como se usa en el presente documento, se refiere a -C(O)-.

El término "ciano", como se usa en el presente documento, se refiere a -CN.

El término "cianoalquilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con uno, dos o tres ciano groups.

El término "cicloalquenilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un sistema de anillos 5 monocíclico, bicíclico o tricíclico, parcialmente insaturado, no aromático, que tiene de tres a catorce átomos de carbono y cero heteroátomos. Los ejemplos representativos de grupos cicloalquenilo incluyen, pero sin limitación, ciclohexenilo, octahidronaftalenilo y norbornilenilo.

El término "cicloalquilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un sistema de anillos hidrocarburo monocíclico, bicíclico o tricíclico, saturado, que tiene de tres a catorce átomos de carbono y cero 10 heteroátomos. Los ejemplos representativos de grupos cicloalquilo incluyen, pero sin limitación, ciclopropilo, ciclopentilo, biciclo[3.1.1]heptilo y adamantilo.

El término "cicloalquiloxi", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo cicloalquilo unido al resto molecular parental a través de un átomo de oxígeno.

El término "cicloalquiloxicarbonilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo 15 cicloalquiloxi unido al resto molecular parental a través de un grupo carbonilo.

El término "(cicloalquil)alquilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con uno, dos o tres grupos cicloalquilo.

El término "dialquilamino", como se usa en el presente documento, se refiere a -NR2, donde cada grupo R es un grupo alquilo. Los dos grupos R pueden ser iguales o diferentes. 20

El término "dialquilaminocarbonilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo dialquilamino unido al resto molecular parental a través de un grupo carbonilo.

El término "dialquilaminocarbonilalquilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con uno, dos o tres grupos dialquilaminocarbonilo.

Los términos "halo" y "halógeno", como se usa en el presente documento, se refieren a F, Cl, Br o I. 25

El término "haloalcoxi", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo haloalquilo unido al resto molecular parental a través de un átomo de oxígeno.

El término "haloalcoxialquilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con uno, dos o tres grupos haloalcoxi.

El término "haloalcoxicarbonilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo haloalcoxi 30 unido al resto molecular parental a través de un grupo carbonilo.

El término "haloalquilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con uno, dos, tres o cuatro átomos de halógeno.

El término "haloalquilcarbonilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo haloalquilo unido al resto molecular parental a través de un grupo carbonilo. 35

El término "heterociclilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un anillo de cinco, seis o siete miembros que contiene uno, dos o tres heteroátomos seleccionados independientemente entre nitrógeno, oxígeno y azufre. El anillo de cinco miembros tiene de cero a dos dobles enlaces y el anillo de seis y siete miembros tiene de cero a tres dobles enlaces. El término "heterociclilo" también incluye grupos bicíclicos en los que el anillo de heterociclilo está condensado con un anillo carbocíclico, aromático o no aromático, de cuatro a siete miembros, 40 preferentemente de cuatro a seis miembros, u otro grupo heterociclilo monocíclico. Los grupos heterociclilo de la presente divulgación pueden estar unidos al resto molecular parental a través de un átomo de carbono o un átomo de nitrógeno en el grupo. Los ejemplos de grupos heterociclilo incluyen, pero sin limitación, benzotienilo, furilo, imidazolilo, indolinilo, indolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, morfolinilo, oxazolilo, piperazinilo, piperidinilo, pirazolilo, piridinilo, pirrolidinilo, pirrolopiridinilo, pirrolilo, tiazolilo, tienilo y tiomorfolinilo. Los grupos heterociclilo de la presente 45 divulgación puede estar opcionalmente sustituido con uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituyentes seleccionados independientemente entre alquenilo, alcoxi, alcoxicarbonilo, alquilo, arilo, arilalquilo, ariloxi, ciano, cianoalquilo, halo, haloalcoxi, haloalquilo, un segundo grupo heterociclilo, heterociclilalquilo, nitro y oxo; en el que el arilo, la parte arilo del arilalquilo y el ariloxi, el segundo heterociclilo, y la parte heterociclilo del heterociclilalquilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituyentes seleccionados independientemente entre 50 alquenilo, alcoxi, alquilo, ciano, halo, haloalcoxi, haloalquilo, nitro y oxo.

El término "heterociclilalquilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con uno, dos o tres grupos heterociclilo.

El término "heterociclilcarbonilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo heterociclilo unido al resto molecular parental a través de un grupo carbonilo.

El término "heterocicliloxi", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo heterociclilo unido al resto molecular parental a través de un átomo de oxígeno.

El término "heterocicliloxicarbonilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo 5 heterocicliloxi unido al resto molecular parental a través de un grupo carbonilo.

El término "hidroxi", como se usa en el presente documento, se refiere a -OH.

El término "nitro", como se usa en el presente documento, se refiere a -NO2.

El término "-NR3Rb", como se usa en el presente documento, se refiere a dos grupos, Ra y Rb, que están unidos al resto molecular parental a través de un átomo de nitrógeno. Ra y Rb se seleccionan independientemente 10 entre hidrógeno, alcoxi, alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, haloalquilo, heterociclilo y heterociclilalquilo.

El término "(NRaRb)sulfunilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo -NRaRb unido al resto molecular parental a través de un grupo sulfonilo.

El término "-NReRf", como se usa en el presente documento, se refiere a dos grupos, Re y Rf, que están 15 unidos al resto molecular parental a través de un átomo de nitrógeno. Re y Rf se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo, arilo, arilalquilo y heterociclilo; en el que el arilo, la parte arilo del arilalquilo y el heterociclilo están opcionalmente sustituidos con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre alcoxi, alquilo y halo.

El término "(NReRf)carbonilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo -NReRf unido al 20 resto molecular parental a través de un grupo carbonilo.

El término "oxo", como se usa en el presente documento, se refiere a =O.

El término "sulfonilo", como se usa en el presente documento, se refiere a SO2.

Los compuestos de la presente divulgación pueden existir como profármacos. El término "profármaco", como se usa en el presente documento, representa compuestos que se transforman rápidamente in vivo en los 25 compuestos parentales por hidrólisis en sangre. Los profármacos de la presente divulgación incluyen ésteres de grupos hidroxi en la molécula parental, ésteres de grupos carboxi en la molécula parental y amidas de aminas en la molécula parental.

Los compuestos de la presente divulgación pueden existir como sales farmacéuticamente aceptables. El término "sal farmacéuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, representa sales o formas 30 zwiteriónicas de los compuestos de la presente divulgación que son solubles o dispersables en agua o aceite, y que son, dentro del alcance del juicio médico, adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de pacientes sin una toxicidad, irritación o respuesta alérgica excesivas u otro problema o complicación en proporción a una relación beneficio/riesgo razonable, y son eficaces para su uso deseado. Las sales pueden prepararse durante el aislamiento y purificación finales de los compuestos o por separado haciendo reaccionar una funcionalidad básica adecuada con 35 un ácido adecuado. Las sales de adición de ácidos representativas incluyen acetato, adipato, alginato, citrato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, canforato, canforsulfonato; digluconato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, formiato, fumarato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, 2-hidroxietanosulfonato, lactato, maleato, mesitilenesulfonato, metanosulfonato, naftilenosulfonato, nicotinato, 2-naftalenosulfonato, oxalato, palmoato, pectinato, persulfato, 3-fenilproprionato, picrato, pivalato, propionato, 40 succinato, tartrato, tricloroacetato, trifluoroacetato, fosfato, glutamato, bicarbonato, paratoluenosulfonato y undecanoato. Los ejemplos de ácidos que pueden emplearse para formar sales de adición farmacéuticamente aceptables incluyen ácidos inorgánicos, tales como clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico y fosfórico, y ácidos orgánicos, tales como oxálico, maleico, succínico y cítrico.

Pueden prepararse sales de adición de bases durante el aislamiento y purificación finales de los 45 compuestos haciendo reaccionar un grupo ácido con una base adecuada tal como el hidróxido, carbonato o bicarbonato de un catión metálico o con amoniaco o una amina orgánica primaria secundaria o terciaria. Los cationes de sales farmacéuticamente aceptables incluyen litio, sodio, potasio, calcio, magnesio y aluminio, así como cationes de amina cuaternarios no tóxicos tales como amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, dietilamina, etilamina, tributilamina, piridina, N,N-dimetilanilina, N-50 metilpiperidina, N-metilmorfolina, diciclohexilamina, procaína, dibencilamina, N,N-dibencilfenetilamina y N,N’-dibenciletilendiamina. Otras aminas orgánicas representativas útiles para la formación de sales de adición de bases incluyen etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperidina y piperazina.

Como se usa en el presente documento, la expresión "actividad anti-VHC" significa que el compuesto es eficaz para tratar el virus de VHC. 55

La expresión "compuestos de la divulgación" y expresiones equivalentes, tienen por objeto abarcar compuestos de fórmula (I) y enantiómeros, diasterómeros y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. De forma similar, las referencias a intermedios, tienen por objeto abarcar sus sales donde el contexto lo permita.

La expresión "paciente" incluye tanto seres humanos como otros mamíferos.

La expresión "composición farmacéutica" significa una composición que comprende un compuesto de la 5 divulgación en combinación con al menos un vehículo farmacéutico adicional, es decir, adyuvante, excipiente o vehículo, tales como diluyentes, agentes conservantes, cargas, agentes reguladores de flujo, agentes disgregantes, agentes humectantes, agentes emulsificantes, agentes de suspensión, agentes edulcorantes, agentes saporíferos, agentes de fragancia, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, agentes lubricantes y agentes de reparto, dependiendo de la naturaleza del modo de administración y formas de dosificación. Se pueden usar, por ejemplo, 10 ingredientes enumerados en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18ª ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1999).

La expresión "farmacéuticamente aceptables" se emplea en el presente documento para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones, y/o formas de dosificación que son, dentro del alcance del criterio médico sensato, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de los pacientes sin toxicidad, irritación, 15 respuesta alérgica excesiva u otro problema o complicación conmensurable con una proporción riesgo/beneficio razonable.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la cantidad total de cada componente activo que es suficiente para mostrar un beneficio significativo para el paciente, por ejemplo, una reducción sostenida en carga viral. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual, administrado en solitario, la expresión se refiere a ese 20 ingrediente solamente. Cuando se aplica a una combinación, la expresión se refiere a cantidades combinadas de los ingredientes activos que dan como resultado el efecto terapéutico, bien sea administrados en combinación, en serie o de forma simultánea.

Los términos "trata" y "tratar" se refieren a: (i) prevenir la aparición de una enfermedad, trastorno o afección en un paciente que pueda estar predispuesto a la enfermedad, trastorno y/o afección pero que aún no se ha 25 diagnosticado que la tiene; (ii) inhibir una enfermedad, trastorno o afección, es decir, detener su desarrollo; y/o (iii) aliviar una enfermedad, trastorno o afección, es decir, provocar la regresión de la enfermedad, trastorno y/o afección.

Cuando se usan para denominar compuestos de la presente divulgación, las denominaciones P1’, P1, P2, P2*, P3 y P4, como se usan en el presente documento, cartografían las posiciones relativas de los restos 30 aminoacídicos de una unión de un inhibidor de proteasa en relación con la unión del sustrato de escisión peptídico natural. La escisión se produce en el sustrato natural entre P1 y P I’ donde las posiciones no cebadoras indican aminoácidos comenzando desde el extremo C-terminal del sitio de escisión natural peptídico extendiéndose hacia el extremo N; mientras que, las posiciones cebadoras emanan del extremo N-terminal de la denominación del sitio de escisión y se extienden hacia el extremo C. Por ejemplo, P1’ se refiere a la primera posición alejada del extremo 35 derecho del C-terminal del sitio de escisión (es decir, primera posición del extremo N); mientras que P1 comienza la numeración desde el lado izquierdo del sitio de escisión del extremo C, P2: segunda posición desde el extremo C, etc.). (véase Berger A. & Schechter I., Transactions of the Royal Society London series (1970), B257, 249-264].

En los compuestos de la presente divulgación existen centros asimétricos. Por ejemplo, los compuestos pueden incluir elemento ciclopropilo P1 de fórmula 40

en la que cada uno de C1 y C2 representa un átomo de carbono asimétrico en las posiciones 1 y 2 del anillo de ciclopropilo.

(1R, 2S) R2 es sin con respecto al carbonilo

(1S, 2R) R2 es sin con respecto al carbonilo

(1R, 2R) R2 es sin con respecto a la amida

(1S, 2S) R2 es sin con respecto a la amida

Se ha de apreciar que la divulgación incluye todas las formas estereoquímicas o mezclas de las mismas, que poseen la capacidad de inhibir la proteasa de VHC.

Determinados compuestos de la presente divulgación también pueden existir en formas conformacionales estables diferentes que se pueden separar. La asimetría torsional debida a la rotación limitada alrededor de un 5 enlace único asimétrico, por ejemplo por impedimento estérico o tensión anular, puede permitir la separación de diferentes confórmeros. La presente divulgación incluye cada isómero conformacional de estos compuestos y mezclas de los mismos.

Determinados compuestos de la presente divulgación pueden existir en forma zwitteriónica y la presente divulgación incluye cada forma zwitteriónica de estos compuestos y mezclas de las mismas. 10

Cuando sea posible que, para su uso en terapia, se puedan administrar cantidades terapéuticamente eficaces de un compuesto de fórmula (I), así como sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, como la sustancia química sin procesar, es posible presentar el ingrediente activo como una composición farmacéutica. Por consiguiente, la divulgación proporciona además composiciones farmacéuticas, que incluyen cantidades terapéuticamente eficaces de compuestos de fórmula (I) o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y uno 15 o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables. Los compuestos de fórmula (I) y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, son como se ha descrito anteriormente. El o los vehículos, diluyentes o excipientes tienen que ser aceptables en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no dañinos para el destinatario de los mismos. De acuerdo con otro aspecto de la divulgación se proporciona también un procedimiento para la preparación de una formulación farmacéutica que incluye mezclar un compuesto 20 de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Las formulaciones farmacéuticas se pueden presentar en formas de dosificación unitarias que contienen una cantidad predeterminada de ingrediente activo por dosis unitaria. Los niveles de dosis de entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 250 miligramos por kilogramo ("mg/kg") de peso corporal por día, de 25 preferencia entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por día de los compuestos de la divulgación son típicos en una monoterapia para la prevención y tratamiento de enfermedad mediada por VHC. Típicamente, la composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se administrarán desde aproximadamente 1 a aproximadamente 5 veces por día o como alternativa, como infusión continua. Tal administración se puede usar como una terapia crónica o aguda. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con los materiales de 30 vehículo para producir una forma de dosificación única variará dependiendo de la afección que se esté tratando, la gravedad de la afección, el tiempo de administración, la vía de administración, la tasa de excreción de un compuesto empleado, la duración de tratamiento y la edad, género, peso y estado de un paciente. Las formulaciones de

dosificación unitaria preferidas son aquellas que contienen una dosis o sub-dosis diaria, como se ha indicado anteriormente en el presente documento o una fracción apropiada de la misma, de un ingrediente activo. En general, el tratamiento se inicia con dosis pequeñas considerablemente menores que la dosis óptima de un compuesto. A partir de entonces, la dosis se aumenta mediante pequeños aumentos hasta que se alcanza el efecto óptimo en dichas circunstancias. En general, un compuesto se administra de forma más deseable en un nivel de concentración 5 que producirá, en general, resultados eficaces antivirales sin causar ningún efecto secundario dañino o nocivo.

Cuando las composiciones de la presente divulgación comprenden una combinación de un compuesto de la divulgación y uno o más agentes terapéuticos o profilácticos, habitualmente están presentes tanto un compuesto como el agente adicional en los niveles de dosis de entre aproximadamente el 10 al 150% y más preferentemente entre aproximadamente el 10 y el 80% de la dosis administrada normalmente en un régimen de monoterapia. 10

Se pueden adaptar formulaciones farmacéuticas para administración mediante cualquier vía apropiada, por ejemplo mediante la vía oral (incluyendo bucal o sublingual), rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal, sublingual o transdérmica), vaginal o parenteral (incluyendo inyecciones o infusiones subcutánea, intracutánea, intramuscular, intra-articular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intralesional, intravenosa o intradérmica). Tales formulaciones se pueden preparar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica de farmacia, por ejemplo, asociando el 15 ingrediente activo con el o los vehículos o excipientes.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración oral se pueden presentar como unidades separadas tales como cápsulas o comprimidos; polvos o gránulos; soluciones o suspensiones en líquidos acuosos o no acuosos; batidos o espumas comestibles; o emulsiones líquidas de aceite-en-agua o emulsiones de agua-en-aceite. 20

Por ejemplo, para administración oral en la forma de un comprimido o cápsula, el componente de fármaco activo se puede combinar con un vehículo inerte oral no tóxico farmacéuticamente aceptable tal como etanol, glicerol, agua y similares. Los polvos se preparan triturando el compuesto hasta un tamaño fino adecuado y mezclándolo con un vehículo farmacéutico triturado de forma similar tal como un carbohidrato comestible, como, por ejemplo, almidón o manitol. También pueden estar presentes un agente saporífero, conservante, de dispersión y 25 colorante.

Las cápsulas se fabrican preparando una mezcla en polvo, como se ha descrito anteriormente y llenando envueltas de gelatina formadas. Se pueden añadir emolientes y lubricantes tales como sílice coloidal, talco, estearato de magnesio, estearato de calcio o polietilen glicol sólido a una mezcla en polvo antes de la operación de llenado. También se puede añadir un agente disgregante o solubilizante tal como agar-agar, carbonato de calcio o 30 carbonato de sodio para mejorar la disponibilidad del medicamento cuando la cápsula se ingiere.

Además, cuando se desee o sea necesario, también se pueden incorporar en la mezcla aglutinantes, lubricantes, agentes disgregantes y agentes colorantes adecuados. Los aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales tales como glucosa o betalactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas tales como goma arábiga, tragacanto o alginato de sodio, carboximetil celulosa, polietilen glicol y similares. Los 35 lubricantes usados en estas formas de dosificación incluyen oleato de sodio, cloruro de sodio y similares. Los disgregantes incluyen, sin limitación, almidón, metil celulosa, agar, betonita, goma de xantano y similares. Los comprimidos se formulan, por ejemplo, preparando una mezcla en polvo, sometiéndola a granulación o doble compresión, añadiendo un lubricante y disgregante y comprimiéndola en comprimidos. Una mezcla en polvo se prepara mezclando el compuesto, triturado de forma adecuada, con un diluyente o base como se ha descrito 40 anteriormente y opcionalmente, con un aglutinante tal como carboximetil celulosa, un alginato, gelatina o polivinil pirrolidona, un retardante de solución tal como parafina, un acelerador de reabsorción tal como una sal cuaternaria y/o un agente de absorción tal como betonita, caolín o fosfato dicálcico. Una mezcla en polvo se puede granular humedeciéndola con un aglutinante tal como jarabe, pasta de almidón, mucílago de goma arábiga o soluciones de materiales celulósicos o poliméricos y haciéndola pasar a través de un tamiz. Como una alternativa a la granulación, 45 una mezcla en polvo se puede pasar a través de la máquina de preparación de comprimidos y el resultado son cápsulas formadas de forma imperfecta degradadas en gránulos. Los gránulos se pueden lubricar para evitar que se peguen a los troqueles de formación de comprimidos por medio de la adición de ácido esteárico, una sal de estearato, talco o aceite mineral. Después la mezcla lubricada se comprime para formar comprimidos. Los compuestos de la presente divulgación también se pueden combinar con un vehículo inerte fluido y comprimirse 50 para formar comprimidos directamente sin pasar por las etapas de granulación o trituración. Se puede proporcionar un revestimiento protector transparente u opaco que consiste en un revestimiento de sellado de goma laca, un revestimiento de azúcar o material polimérico y un revestimiento pulido de cera. Se pueden añadir colorantes a estos revestimientos para distinguir dosis unitarias diferentes.

Se pueden preparar líquidos orales tales como solución, jarabes y elíxires en forma de dosis unitaria de 55 manera que una cantidad contenga una cantidad predeterminada de un compuesto. Se pueden preparar jarabes disolviendo un compuesto en una solución acuosa saborizada de manera adecuada, mientras que los elíxires se preparan a través del uso de un vehículo no tóxico. También se pueden añadir solubilizantes y emulsificantes tales como alocholes isostearílicos etoxilados y éteres de polioxietilen sorbitol, conservantes, aditivos de sabor tales como aceite de menta o edulcorantes naturales o sacarina u otros edulcorantes artificiales y similares. 60

Cuando sea apropiado, las formulaciones de dosis unitaria para administración oral se pueden microencapsular. La formulación también se puede preparar para prolongar o mantener la liberación como, por ejemplo, revistiendo o impregnando material particulado en polímeros, cera o similares.

Los compuestos de fórmula (I) y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, también se pueden administrar en la forma de sistemas de administración por liposomas, tales como vesículas unilamelares pequeñas, 5 vesículas unilamelares grandes y vesículas multilamelares. Los liposomas se pueden formar a partir de una diversidad de fosfolípidos, tales como colesterol, estearilamina o fosfatidil colinas.

Los compuestos de fórmula (I) y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos también se pueden administrar mediante el uso de anticuerpos monoclonales como vehículos individuales a los que se unen las moléculas de compuesto. Los compuestos también se pueden unir a polímeros solubles como vehículos de fármaco 10 dirigibles. Tales polímeros pueden incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, polihidroxipropilmetacrilamidafenol, polihidroxietilaspartamidafenol o polietilenoxidopolilisina sustituido con restos palitoilo. Adicionalmente, los compuestos se pueden unir a una clase de polímeros biodegradables útiles para conseguir la liberación controlada de un fármaco, por ejemplo, ácido poliláctico, poliepsilon caprolactona, ácido polihidroxi butírico, poliortoésteres, poliacetales, polidihidropiranos, policianoacrilatos y copolímeros de bloque 15 reticulados o anfipáticos de hidrogeles.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración transdérmica se pueden presentar como parches separados que tienen por objeto permanecer en contacto íntimo con la epidermis del destinatario durante un periodo de tiempo prolongado. Por ejemplo, el ingrediente activo se puede administrar a partir del parche mediante iontoforesis como se ha descrito de forma general en Pharmaceutical Research, 3(6), 318 (1986). 20

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración tópica se pueden formular como ungüentos, cremas, suspensiones, lociones, polvos, soluciones, pastas, geles, pulverizaciones, aerosoles o aceites.

Para tratamientos del ojo u otros tejidos externos, por ejemplo boca y piel, las formulaciones se aplican preferentemente como un ungüento o crema tópico. Cuando se formula en un ungüento, el ingrediente activo se puede emplear con una base de ungüento parafínica o miscible en agua. Como alternativa, el ingrediente activo se 25 puede formular en una crema con una base de crema de aceite-en-agua o una base de agua-en-aceite.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administraciones tópicas al ojo incluyen colirios en los que el ingrediente activo se disuelve o suspende en un vehículo adecuado, especialmente un disolvente acuoso.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración tópica en la boca incluyen grageas, pastillas y enjuagues bucales. 30

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración rectal se pueden presentar como supositorios o como enemas.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración nasal en las que el vehículo es un sólido incluyen un polvo grueso que tiene un tamaño de partícula, por ejemplo, en el intervalo de 20 a 500 micrómetros que se administra en la manera en la que se toma una inhalación, es decir, mediante inhalación rápida a través del 35 conducto nasal de un recipiente del polvo sujetado muy cerca de la nariz. Las formulaciones adecuadas en las que el vehículo es un líquido, para administración como una pulverización nasal o gotas nasales, incluyen soluciones acuosas u oleosas del ingrediente activo.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración por inhalación incluyen polvos o nieblas de partícula fina, que se pueden generar por medios de diversos tipos de aerosoles, nebulizadores o insufladores 40 presurizados de dosis medida.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración vaginal se pueden presentar como formulaciones de pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o pulverización.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración parenteral incluyen soluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos 45 que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor para el que están destinadas; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones se pueden presentar en recipientes de dosis unitaria o multi-dosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados y se pueden almacenar en una condición de secado por congelación (liofilizado) que requiere únicamente la adición del vehículo estéril líquido, por ejemplo agua para inyecciones, inmediatamente antes del uso. Se pueden preparar 50 soluciones y suspensiones de inyección improvisadas a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles.

Se ha de apreciar que adicionalmente a los ingredientes mencionados anteriormente particularmente, las formulaciones pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica considerando el tipo de formulación en cuestión, por ejemplo aquellos adecuados para administración oral pueden incluir agentes saporíferos.

La Tabla I más adelante enumera algunos ejemplos ilustrativos de compuestos que se pueden administrar 55 con los compuestos de la presente divulgación. Los compuestos de la divulgación se pueden administrar con otros

compuestos con actividad anti-VHC en terapia de combinación, de forma conjunta o por separado o combinando los compuestos en una composición.

Tabla 1

Nombre de Marca

Clase Fisiológica Tipo de Inhibidor o Diana Compañía de Origen

NIM811

Inhibidor de Ciclofilina Novartis

Zadaxin

Inmunomodulador Sciclone

Suvus

Azul de metileno Bioenvision

Actilon (CPG10101)

agonista de TLR9 Coley

Batabulin (T67)

Anti cáncer inhibidor de -tubulina Tularik Inc., South San Francisco, CA

ISIS 14803

Antiviral antisentido ISIS Pharmaceuticals Inc, Carlsbad, CA/Elan Phamaceuticals Inc., New York, NY

Summetrel

Antiviral antiviral Endo Pharmaceuticals Holdings Inc., Chadds Ford, PA

GS-9132 (ACH-806)

Antiviral Inhibidor de VHC Achillion / Gilead

compuestos y sales de Pirazolopirimidina del documento WO-2005047288 26 de Mayo de 2005

Antiviral Inhibidores de VHC Arrow Therapeutics Ltd.

Levovirina

Antiviral inhibidor de IMPDH Ribapharm Inc., Costa Mesa, CA

Merimepodib (VX-497)

Antiviral inhibidor de IMPDH Vertex Pharmaceuticals Inc., Cambridge, MA

XTL-6865(XTL-002)

Antiviral anticuerpo monoclonal XTL Biopharmaceuticals Ltd., Rehovom, Isreal

Telaprevir (VX-950, LY-570310)

Antiviral NS3 inhibidor de serina proteasa Vertex Pharmaceuticals Inc., Cambridge, MA/ Eli Lilly y Co. Inc., Indianápolis, IN

VHC-796

Antiviral Inhibidor de Replicasa NS5B Wyeth / Viropharma

(cont.)

Nombre de Marca

Clase Fisiológica Tipo de Inhibidor o Diana Compañía de Origen

NM-283

Antiviral Inhibidor de Replicasa NS5B Idenix / Novartis

GL-59728

Antiviral Inhibidor de Replicasa NS5B Gene Labs / Novartis

GL-60667

Antiviral Inhibidor de Replicasa NS5B Gene Labs / Novartis

2’C MeA

Antiviral Inhibidor de Replicasa NS5B Gilead

PSI 6130

Antiviral Inhibidor de Replicasa NS5B Roche

R1626

Antiviral Inhibidor de Replicasa NS5B Roche

2’C Metil adenosina

Antiviral Inhibidor de Replicasa NS5B Merck

JTK-003

Antiviral inhibidor de RdRp Japan Tobacco Inc., Tokyo, Japón

Levovirina

Antiviral ribavirina ICN Pharmaceuticals s, Costa Mesa, CA

Ribavirina

Antiviral ribavirina Schering-Plough Corporation, Kenilworth, NJ

Viramidina

Antiviral Profármaco de Ribavirina Ribapharm Inc., Costa Mesa, CA

Heptazima

Antiviral ribozima Ribozyme Pharmaceuticals Inc., Boulder, CO

BILN-2061

Antiviral inhibidor de serina proteasa Boehringer Ingetheim Pharma KG, Ingelheim, Alemania

SCH 503034

Antiviral inhibidor de serina proteasa Schering Plough

Zadazim

Modulador inmune Modulador inmune SciClone Pharmaceuticals Inc., San Mateo, CA

Ceplene

Inmunomodulador modulador inmune Maxim Pharmaceuticals Inc., San Diego, CA

CellCept

Inmunosupresor inmunosupresor de IgG de VHC F. Hoffmann-La Roche LTD, Basel, Suiza

Civacir

Inmunosupresor inmunosupresor de IgG de VHC Nabi Biopharmaceuticals Inc., Boca Ratón, FL

Albuferon - α

Interferón Albúmina de IFN-2b Human Genome Sciences Inc., Rockville, MD

Infergen A

Interferón IFN alfacon-1 InterMune Pharmaceutical Inc., Brisbane, CA

Omega IFN

Interferón IFN- Intarcia Therapeutics

IFN-β y EMZ701

Interferón IFN- y EMZ701 Transition Therapeutics Inc., Ontario, Canadá

Rebif

Interferón IFN-1a Serono, Geneva, Suiza

Roferon A

Interferón IFN-2a F. Hoffmann-La Roche LTD, Basel, Suiza

(cont.)

Nombre de Marca

Clase Fisiológica Tipo de Inhibidor o Diana Compañía de Origen

Intron A

Interferón IFN-2b Schering-Plough Corporation, Kenilworth, NJ

Intron A y Zadaxin

Interferón IFN-α2b/α1-timosina RegeneRx Biopharmiceuticals Inc., Bethesda, MD/ SciClone Pharmaceuticals Inc, San Matey, CA

Rebetron

Interferón IFN-α2b/ribavirina Schering-Plough Corporation, Kenilworth, NJ

Actimmune

Interferón INF-Y InterMune Inc., Brisbane, CA

Interferón-β

Interferón Interferón-β-1a Serono

Multiferon

Interferón IFN de Larga Duración Viragen/Valentis

Wellferon

Interferón IFN-αn1 linfoblastoide GlaxoSmithKline plc, Uxbridge, RU

Omniferon

Interferón IFN-α natural Viragen Inc., Plantation, FL

Pegasys

Interferón IFN-α2a PEGilado F. Hoffmann-La Roche LTD, Basel, Suiza

Pegasys y Ceplene

Interferón IFN-α2a PEGilado/ modulador inmune Maxim Pharmaceuticals Inc., San Diego, CA

Pegasys y Ribavirina

Interferón IFN-α2a PEGilado /ribavirina F. Hoffmann-La Roche LTD, Basel, Suiza

PEG-Intron

Interferón IFN-α2b PEGilado Schering-Plough Corporation, Kenilworth, NJ

PEG-Intron / Ribavirina

Interferón IFN-α2b PEGilado /ribavirina Schering-Plough Corporation, Kenilworth, NJ

IP-501

Protección hepática antifibrótico Indevus Pharmaceuticals Inc., Lexington, MA

IDN-6556

Protección hepática inhibidor de caspasa Idun Pharmaceuticals Inc., San Diego, CA

ITMN-191 (R-7227)

Antiviral inhibidor de serina proteasa InterMune Pharmaceuticals Inc., Brisbane, CA

GL-59728

Antiviral Inhibidor de Replicasa NS5B Genelabs

ANA-971

Antiviral agonista de TLR-7 Anadys

TMC-465350

Antiviral inhibidor de serina proteasa Medivir/ Tibotec

Los compuestos de la divulgación también se pueden usar como reactivos de laboratorio. Los compuestos pueden contribuir decisivamente para proporcionar herramientas de investigación para el diseño de ensayos de replicación viral, validación de sistemas de ensayo animal y estudios de biología estructural para mejorar adicionalmente el conocimiento de los mecanismos de la enfermedad por VHC. Además, los compuestos de la 5 presente divulgación son útiles para establecer o determinar el sitio de unión de otros compuestos antivirales, por ejemplo, mediante inhibición competitiva.

Los compuestos de la presente divulgación también se pueden usar para tratar o prevenir la contaminación viral de materiales y de ese modo reducir el riesgo infección viral de personal de laboratorio o médico o pacientes que entran en contacto con tales materiales, por ejemplo, sangre, tejido, instrumentos y prendas quirúrgicas, 10

instrumentos y prendas de laboratorio y aparatos y materiales de recolección o transfusión de sangre.

La presente divulgación tiene por objeto abarcar compuestos que tienen la fórmula (I) cuando se preparan mediante procedimientos sintéticos o mediante procesos metabólicos incluyendo aquellos que se producen en el cuerpo humano o animal (in vivo) o procesos que se producen in vitro.

Las abreviaturas químicas usadas habitualmente para identificar compuestos químicos desvelados en el 5 presente documento incluyen Bn: bencilo; Boc: terc-butiloxicarbonilo {Me3COC(O)}; BSA: albúmina de suero bovino; CDI: carbonildiimidazol; DBU: 1,8-diazabiciclo[5.4.0]-undec-7-eno; CH2Cl2 = DCM: cloruro de metileno; TBME: terc-butil metil éter; DEAD: azodicarboxilato de dietilo; DIAD: azodicarboxilato de diisopropilo; DIEA: diisopropiletilamina; DIPEA: diisopropiletilamina; 4-DMAP: 4-dimetilaminopiridina; DCC: 1,3-diciclohexilcarbodiimida; DMF: dimetilformamida; DMSO: dimetilsulfóxido; DP-PA: difenilfosforil azida; Et: etilo; EtOH: etanol; EtOAc: acetato de 10 etilo; Et2O: éter dietílico; Catalizador de Grubb: dicloruro de bis(triciclohexilfosfina)bencilideno rutenio (IV); Catalizador de Grubb de 2ª Generación: dicloruro de triciclohexilfosfina[1,3-bis(2,4,6-trimetilfenil)-4,5-dihidroimidazol-2-ilideno][bencilideno]rutenio (IV); HATU: hexafluorofosfato de [O-(7-aza-benzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametiluronio; HBTU: hexafluorofosfato de [O-(1H-benzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-te-trametiluronio; HOBT, 1-hidroxibenzotriazol; HOAT, 1-hidroxi-7-azabenzotriazol; HPLC: cromatografía líquida de alta resolución; EM: espectrometría de masas; 15 Me: metilo; MeOH: metanol; NMM: N-metilmorfolina; NMP: N-metilpirrolidina; Pr: propilo; PPA: ácido polifosfórico; TBAF: fluoruro de tetra-n-butilamonio; 1,2-DCE o DCE: 1,2-dicloroetano; TFA: ácido trifluoroacético; THF: tetrahidrofurano.

Los materiales de partida útiles para sintetizar los compuestos de la presente divulgación son conocidos por los expertos en la materia y pueden fabricarse fácilmente o están disponibles en el mercado. 20

Los siguientes procedimientos expuestos a continuación se proporcionan con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de las reivindicaciones. Se apreciará que puede ser necesario preparar un compuesto tal en el que un grupo funcional esté protegido usando un grupo protector convencional y después retirando el grupo protector para proporcionar un compuesto de la presente divulgación. Los detalles con respecto al uso de grupos protectores de acuerdo con la presente divulgación son conocidos para los expertos en la materia. 25

Como se muestra en el Esquema 1, los intermedios de la presente divulgación, tales como el dipéptido (1), pueden usarse para la preparación de compuestos de fórmula (I). En la primera etapa de este proceso, el nitrógeno protegido con Boc de (1) se desprotege usando un ácido tal como HCl en un disolvente tal como éter, para proporcionar la amina libre correspondiente 2. La amina (2) puede acoplarse posteriormente con el aminoácido (3) usando un agente de acoplamiento tal como HATU en un disolvente tal como diclorometano para proporcionar el 30 intermedio de tripéptido (4). Debe apreciarse que, en algunos casos, los intermedios de tipo (3) están disponibles en el mercado, y como alternativa dichos compuestos pueden prepararse fácilmente en forma racémica o quiral por procedimientos conocidos en la técnica. Una transformación clave en la construcción de compuestos de fórmula (I) es el procedimiento de macrolización en el que los intermedios de estructura general (4) se convierten en intermedios de estructura general (5). En el ejemplo general citado, la conversión del intermedio (4) en (5) puede 35 verse influenciada por una reacción de metátesis de olefina intramolecular. Esta clase de reacciones está bien arraigada en la técnica y, por lo tanto, se han desarrollado varias catálisis de metátesis de olefina y están disponibles en el mercado. Por ejemplo, la conversión del dieno (4) en el macrólido (5) podría verse influenciada por el tratamiento de (4) con una cantidad suficiente de catalizador de metátesis de olefina de Grubb de primera generación, en un disolvente tal como diclorometano o dicloroetano. En algunos ejemplos para la conversión de (4) 40 en (5), puede ser necesario calentar la mezcla de reacción con el fin de influir en este procedimiento de ciclación. Después, el intermedio (5) se convierte en compuestos de fórmula (I) tales como (7) por un procedimiento en dos etapas. En la primera etapa de este procedimiento, la funcionalidad éster del intermedio (5) se hidroliza para dar el ácido carboxílico correspondiente (6). Esta transformación puede realizarse por una reacción de saponificación en la que (5) se trata con una base tal como hidróxido de litio en una mezcla de THF, metanol y agua. El ácido resultante 45 (6) puede convertirse en un compuesto de fórmula (I) por una reacción de acoplamiento sencilla con un derivado de sulfonamida tal como se muestra. Por ejemplo, está bien arraigado en la técnica que el tratamiento de un ácido carboxílico tal como (6), con CDI en un disolvente tal como cloruro de metileno, genera in situ un intermedio reactivo que, cuando se trata con una sulfonamida, proporciona (7), un compuesto de fórmula (I).

Si, en el procedimiento de acoplamiento final anterior, es decir, en la conversión de (6) en (7), la entidad R7SO2NH2 es un derivado de sulfamida, tal como, por ejemplo, RaRbNSO2NH2, entonces puede usarse un procedimiento de acoplamiento alternativo. En él, el intermedio de sulfamida (1) (Esquema 2) se desprotona primero usando una base tal como bishexametildisilano de litio en un disolvente tal como THF. La solución en THF resultante 5 de anión de sulfamida (2) se añade después a la mezcla de reacción mencionada anteriormente que contiene el ácido carboxílico activado. Después, esta mezcla de reacción se agita durante varias horas para proporcionar la acilsulfamida requerida (7).

Los compuestos de fórmula (1) también pueden convertirse en otros compuestos de fórmula I como se describe en el presente documento. Un ejemplo de dicho procedimiento se muestra en el Esquema 3, en el que un compuesto de fórmula I (1) que porta un grupo Boc en la posición P4 se convierte en un compuesto de fórmula I (3) en el que dicho compuesto porta un grupo urea en la posición P4. La conversión de (1) en (3) puede realizarse en un 5 procedimiento en dos etapas, la primera de las cuales es la conversión de (1) en la amina (2) por tratamiento de (1) con un ácido, tal como TFA, en un disolvente, tal como cloruro de metileno. La sal TFA de amina resultante puede tratarse con un isocianato en presencia de un equivalente de base para proporcionar un compuesto de fórmula I (3) en el que el resto P3 está tapado con una urea. Como se ha indicado previamente, un experto en la materia reconocerá que el intermedio (2) puede usarse como material de partida para la preparación de compuestos de 10 fórmula (1) en la que el grupo P3 está tapado con una amida o un carbamato. La construcción de dichos compuestos de fórmula (I) puede conseguirse usando condiciones convencionales para la formación de dichas funcionalidades P4 a partir de aminas.

Los procedimientos ejemplares para fabricar intermedios P2 y compuestos de fórmula (I) se muestran en 15 los siguientes Esquemas. Dichos intermedios, condiciones de reacción y procedimientos dados en los ejemplos específicos son ampliamente aplicables a compuestos con otros patrones de sustitución. Por ejemplo, la síntesis de

los elementos P2 que se encuentran en los compuestos de fórmula (I) del Esquema 4 puede prepararse siguiendo la ruta sintética definida. En ella, se trata N-Boc-4-oxo-L-prolina disponible en el mercado con un agente organometálico, tal como un reactivo de Grignard (o, como alternativa, una especie de alquil o aril litio, o como alternativa un alquilo, o una especie de aril cinc) para proporcionar el intermedio (2) en el que la posición C4 de la prolina porta un sustituyente R3 y un grupo hidroxi terciario libre. Después, el intermedio (2) puede convertirse en 5 compuestos de fórmula (I).

Los compuestos de fórmula (I) en la que R4 es un hidrógeno pueden sintetizarse a partir del compuesto correspondiente de fórmula (I) en la que R4 es un grupo hidroxi. Como alternativa, un compuesto de fórmula (I) en la que R4 es un hidrógeno puede sintetizarse a partir de cualquiera de los intermedios usados para la preparación de 10 compuestos de fórmula (I) en la que R4 es un grupo hidroxi. Por ejemplo, pueden prepararse los compuestos de fórmula (I) en la que R4 es un hidrógeno como se muestra en el Esquema 5. Dichos compuestos (3) pueden prepararse a partir de los análogos de hidroxi correspondientes (1). El procedimiento para la formación de compuestos de tipo (3) a partir de compuestos de tipo (1) requiere una reducción, o desoxigenación del grupo hidroxi C4 de la prolina. Existe una técnica considerable arraigada para la reducción y/o desoxigenación de alcoholes y 15 particularmente alcoholes terciarios que podría proporcionar la formación de compuestos de tipo (3) a partir de compuestos de tipo (1). Por ejemplo, la reducción directa de alcoholes para dar el alcano correspondiente (Procedimiento 1 del Esquema 5) se ha informado en la siguiente referencia: J. Org. Chem. 2001, 66, 7741. En ella, se describe la reducción de alcoholes para dar alcanos, en la que dicho alcohol se trata con clorodifenilsilano y una cantidad catalítica de tricloruro de indio en un disolvente, tal como dicloroetano para proporcionar el alcano 20 correspondiente. Dicha reacción puede realizarse a temperatura ambiente, pero en algunos casos puede requerirse calentamiento. Un procedimiento alternativo para la formación de compuestos de fórmula (I), en la que R4 es un hidrógeno, a partir de compuestos de fórmula (I) en la que R4 es un grupo hidroxi, se muestra como Procedimiento 2 en el Esquema 5. En él, los compuestos de tipo (1) se convierten primero en alcoholes activados (2) y estos intermedios se reducen para dar el alcano correspondiente (por ejemplo, usando un procedimiento de 25 desoxigenación de Barton). Como alternativa, los alcoholes activados como los que se muestran en (2) pueden reducirse para dar los alcanos correspondientes tal como, por ejemplo, usando agentes reductores. Estos procedimientos para la conversión de (1) en (3) en el Esquema 5 son bien conocidos para los expertos en la materia.

Debe apreciarse que la adición de agentes organometálicos al resto cetona del derivado de prolina I 30 (Esquema 6) está bien arraigada en la técnica. Por ejemplo, Hruby y colaboradores (J. Org. Chem. 2001, 66, 3593) han descrito la adición de bromuro de fenilmagnesio a intermedios de estructura general (1) del Esquema 6. Estos descubrimientos proporcionan pruebas de que se obtienen rendimientos óptimos de los productos de adición 1,2

deseados ((2), del Esquema 6) cuando se emplea un grupo éster terc-butílico como grupo protector del resto carboxilo C2. Además, este trabajo proporcionó pruebas claras en forma de cristalografía de rayos X para el resultado estereoquímico de esta reacción de adición. Específicamente, como resultado de la adición de Grignard mencionada anteriormente a la cetona (1), se obtuvo un producto individual en el que el grupo hidroxilo C4 y el grupo carboxilo C2 asumen una orientación relativa sin alrededor del anillo de cinco miembros. A partir de esta 5 determinación de estructura, se dedujo que la selectividad de las caras en la adición de R3M a la cetona de (1) era alfa en el contexto de la estructura (1) del Esquema 6. Es decir, la selectividad organometálica se suma a la redisposición de las caras (cara inferior) del carbonilo en (1) para proporcionar el alcohol terciario correspondiente (2) con la estereoquímica mostrada.

10

El trabajo mencionado anteriormente de Hruby describe la adición de un reactivo de Grignard específico a derivados de (1) (Esquema 6). Sin embargo, la adición de una diversidad de reactivos de Grignard a la prolina (1) se incluye en la presente divulgación. El conjunto de la bibliografía que describe la adición de agentes organometálicos, incluyendo reactivos de Grignard, a cetonas es considerable y se resume en visiones globales generales en la técnica, tales como: Comprehensive Organic Functional Group Transformations. Volumen 2: Synthesis: Carbon with 15

one heteroatom attached by a single bond. Editor in Chief Alan. R. Katritzky, y col. 1995, Capítulo 2.02, página 37. Esta clase de reacciones también se describe en Comprehensive Organic Synthesis. Editor in Chief Barry M Trost, Volumen 1: Additions to C-X pi-bonds (parte 1). 1991.

La investigación reciente en la técnica proporciona condiciones para la optimización adicional de reactivos de Grignard en reacciones de adición a cetonas y estos trabajos pueden ser útiles en la presente divulgación. Por 5 ejemplo, Ishihara y colaboradores (Org. Lett. 2005, Vol. 7, Nº 4, 573) describieron recientemente la formación y utilidad de complejos de átomos de magnesio. Los complejos de átomos de magnesio, R3MgLi, se obtienen a partir de reactivos de Grignard y alquil litios. Como se describe por Ishihara, estos complejos proporcionan excelentes rendimientos de productos de adición 1,2 en reacciones con cetonas. En un estudio separado, Knochel y colaboradores (Angew. Chem Int. Ed. 2006, 45, 497) han descrito el uso de sales de lantánidos solubles tales como 10 LnCl3 junto con reactivos de organomagnesio. La presencia de estas sales de lantánidos da como resultado una mejora en la eficacia de la reacción de adición 1,2 a compuestos de carbonilo. Estos trabajos, y referencias citadas en ese documento, establecen el estado de la técnica con respecto a la optimización de la reacción de Grignard en adiciones sencillas a compuestos de carbonilo y sirven como una fuente importante de información en la presente divulgación. 15

También debe apreciarse que una gama de reactivos organometálicos participan en reacciones de adición a cetonas. En este conjunto de trabajos se incluyen reactivos tales como reactivos de aril litio, alquil litio y heteroaril litio, que son bien conocidos para su adición de forma 1,2 a restos carbonilo. Por ejemplo, en un estudio reciente realizado por Dondoni y colaboradores (J. Org. Chem. 2005, 70, 9257) el benzotioazol se litia usando BuLi y la especie de litio C2 resultante se añade de forma 1,2 a una lactona. A modo de analogía, podría esperarse que el 20 benzotiazol litiado se añadiera de forma 1,2 a la cetona (1) del Esquema 6 para proporcionar un intermedio de tipo (2a).

Un experto en la materia reconocerá que los reactivos organometálicos obtenidos a partir de heterociclos, tales como oxazoles y tiazoles e imidazoles también pueden participar en reacciones de adición 1,2 a la cetona (1). Existe un conjunto de bibliografía considerable que define las condiciones únicas empleadas para cada uno de estos 25 sistemas de heterociclos y esta información está fácilmente disponible para un experto en la materia. Por ejemplo, el uso de reactivos organometálicos obtenidos a partir de benzoxazol u oxazol, en reacciones de adición a cetonas, requiere el uso de magnesatos de litio. Los detalles específicos de este estudio reciente realizado por Bayh y colaboradores se describen en J. Org. Chem., 2005, 70, 5190. La adición de benzoxazol a la cetona (1) del Esquema 6 proporcionaría acceso a intermedios de tipo (2b). 30

Existen precedentes bibliográficos significativos para la adición a cetonas usando una gran diversidad de reactivos organometálicos obtenidos a partir de heterociclos. Por ejemplo, el trabajo de Behinda y colaboradores (Tet. Lett. 42, 2001, 647) describe la formación de un benzoimidazol litiado y su adición a una lactona simple. Por analogía, el uso de este benzoimidazol litiado en reacciones de adición a la cetona (1) del Esquema 6 proporcionaría acceso a intermedios de tipo (2c). Además, un estudio reciente realizado por Kawasaki y colaboradores (Bioorganic 35 and Medicinal Chem. Lett. 13, 2003, 87) describe la formación de una serie de compuestos heteroaromáticos litiados y sus reacciones de adición a amidas activadas. Por analogía, el uso de estos intermedios heteroaromáticos litiados en reacciones de adición a la cetona (1) del Esquema 6 proporcionaría acceso a intermedios (2d-2k).

El empleo de organometálicos obtenidos a partir de biarilo, o sistemas de heteroaril-arilo en reacciones de adición 1,2 a la cetona (1) también es pertinente en la presente divulgación. La adición de esta clase de reactivos 40 organometálicos a la cetona (1) proporcionaría acceso a intermedios de tipo (21) y (2m). Debe apreciarse que en la ejemplificación de la presente divulgación, puede ser necesario sintetizar organometálicos de biarilo o hetero-arilo para su uso posterior en reacciones de adición a la cetona (1) del Esquema 6. Un experto en la materia reconocerá el conjunto significativo de bibliografía que describe la preparación de organometálicos de este tipo y precursores de los mismos. Por ejemplo, una revisión reciente por Chinchilla y colaboradores (Chem. Rev. 2004, 104, 2667) 45 describe la preparación de heterociclos metalados y su utilidad. La química básica para la preparación de biarilo o sistemas de heteroaril-arilo normalmente emplea reacciones de acoplamiento de tipo Suzuki. A continuación se indica un conjunto de bibliografía proporcionada por Gregory Fu describe el estado de la técnica en dichas reacciones de acoplamiento y un subconjunto de estas referencias: JACS 2004, 126, 1340; JACS, 2002, 124, 13662; Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, Nº 11, 1945; Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, Nº 20, 3910; JACS 2002, 122, 4020; 50 JACS 2001, 123, 10099; Org. Lett. 2001, Vol. 3, Nº 26, 4295; Angew. Chem. Int. Ed. 1998, 37, Nº 24, 3387. Además de este trabajo, están disponibles fácilmente revisiones críticas en el área, tales como las realizadas por Rossi en Synthesis 2004, Nº 15, 2419.

EJEMPLOS

La presente divulgación se describirá ahora con respecto a ciertas realizaciones que no pretenden limitar su 55 alcance. Por lo tanto, los siguientes ejemplos, que incluyen realizaciones específicas, ilustrarán una práctica de la presente divulgación, entendiéndose que los ejemplos sólo tienen fines de ilustración de ciertas realizaciones y se presentan para proporcionar lo que se cree que es la descripción más útil y fácilmente entendible de sus procedimientos y aspectos conceptuales.

Los siguientes ejemplos 1 a 37, 86 y 87 son ejemplos de referencia. Los ejemplos 88 y 89 se refieren a 60

realizaciones de la invención.

Los porcentajes de solución expresan una relación de peso a volumen, y las relaciones de solución expresan una relación de volumen a volumen, a menos que se indique otra cosa. Los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) se registraron en un espectrómetro Bruker de 300, 400 ó 500 MHz; los desplazamientos químicos () se indican en partes por millón. La cromatografía ultrarrápida se realizó sobre gel de sílice (SiO2) de 5 acuerdo con la técnica de cromatografía ultrarrápida de Still (J. Org. Chem. 1978, 43, 2923).

EJEMPLO 1

Preparación de Sulfamidas

El cloruro de sulfamoílo intermedio se preparó mediante la adición de agua (1 equiv.) en THF a una solución 10 enfriada (-20ºC) y agitada de isocianato de clorosulfonilo (1 equiv.) en THF y la solución resultante se dejó calentar a 0ºC. A esta solución se le añadió Et3N anhidro (1 equiv.) seguido de la amina secundaria requerida (1 equiv.). La mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente, después se filtró y el filtrado se sometió a evaporación rotatoria, proporcionando las sulfamidas deseadas. Después, dicha sulfamida se acopló con un ácido carboxílico, proporcionando la acilsulfamida deseada. 15

EJEMPLO 2

Procedimiento específico para la preparación de un intermedio de acilsulfamida

A una solución de ácido (1R,2S)-1-terc-butoxicarbonilamino-2-vinilciclopropanocarboxílico (217 mg, 1,194 mmol) en THF (5 ml) se le añadió CDI (290 mg, 1,791 mmol) y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 45 20 min. En otro matraz de fondo redondo, se añadió LiHMDS (solución 1,0 M en hexanos, 2,4 ml, 2,4 mmol) a una solución de N-etilmetilsulfamida (330 mg, 2,388 mmol) en THF (5 ml) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Las dos mezclas de reacción se añadieron juntas y se agitaron a temperatura ambiente durante 2 h. Se añadió agua para interrumpir la reacción y la solución de reacción se extrajo con EtOAc. La fase orgánica se separó y se secó sobre MgSO4. La evaporación del disolvente dio el producto en bruto que se purificó 25 por HPLC Prep., proporcionando la N-acilsulfamida deseada. Después, la N-acilsulfamida se disolvió en una solución 4 N de HCl en dioxano (2 ml) y se agitó a ta durante 4 h. La evaporación de la solución dio un aceite de color parduzco en forma de la sal HCl. (112 mg, rendimiento del 33%). RMN 1H (400 MHz, CD3OD)  1,16 (t, J = 7,21 Hz, 3 H), 1,68 (dd, J = 10,03, 7,83 Hz, 1 H), 2,15 (m, 1 H), 2,37 (m, 1 H), 2,89 (s, 3 H), 3,30 (m, 2 H), 5,31 (d, J = 10,27 Hz, 1 H), 5,42 (d, J = 17,12 Hz, 3 H), 5,68 (m, 1 H). CL-EM (tiempo de retención: 0,883 min.), EM m/z 270 30 (M+Na+).

EJEMPLO 3:

Preparación de clorhidrato de éster etílico del ácido (1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico racémico (Procedimiento A y Procedimiento B)

El compuesto nombrado se hizo racémico por cada uno de los siguientes procedimientos A y B.

PROCEDIMIENTO A

Preparación de N-Bencil Imina de Éster Etílico de Glicina

5

Se suspendió clorhidrato de éster etílico de glicina (303,8 g, 2,16 mol) en terc-butil metil éter (1,6 l). Se añadieron benzaldehído (231 g, 2,16 mol) y sulfato sódico anhidro (154,6 g, 1,09 mol) y la mezcla se enfrió a 0ºC usando un baño de agua enfriada con hielo. Se añadió gota a gota trietilamina (455 ml, 3,26 mol) durante 30 min y la mezcla se agitó durante 48 h a ta. Después, la reacción se interrumpió mediante la adición de agua enfriada con hielo (1 l) y la fase orgánica se separó. La fase acuosa se extrajo con terc-butil metil éter (0,5 l) y la fase orgánica 10 combinada se lavó con una mezcla de NaHCO3 acuoso saturado (1 l) y salmuera (1 l). La solución se secó sobre MgSO4 y se concentró al vacío, proporcionando 392,4 g del producto de N-bencilimina en forma de un aceite espeso de color amarillo que se usó directamente en la siguiente etapa. RMN 1H (CDCl3, 300 MHz)  1,32 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 4,24 (c, J = 7,1 Hz, 2H), 4,41 (d, J = 1,1 Hz, 2H), 7,39-7,47 (m, 3H), 7,78-7,81 (m, 2H), 8,31 (s, 1H).

Preparación de éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico racémico 15

A una suspensión de terc-butóxido de litio (84,06 g, 1,05 mol) en tolueno seco (1,2 l) se le añadió gota a gota una mezcla de la N-bencil imina de éster etílico de glicina (100,4 g, 0,526 mol) y trans-1,4-dibromo-2-buteno (107,0 g, 0,500 mol) en tolueno seco (0,6 l) durante 60 min. Después de que se completara la adición, la mezcla de color rojo oscuro se inactivó mediante la adición de agua (1 l) y terc-butil metil éter (TBME, 1 l). La fase acuosa se 20 separó y se extrajo una segunda vez con TBME (1 l). Las fases orgánicas se combinaron, se añadió HCl 1 N (1 l) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. La fase orgánica se separó y se extrajo con agua (0,8 l). Después, las fases acuosas se combinaron, se saturaron con sal (700 g), se añadió TBME (1 l) y la mezcla se enfrió a 0ºC. Después, la mezcla agitada se basificó a pH 14 mediante la adición gota a gota de NaOH 10 N, la fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con TBME (2 x 500 ml). Los extractos orgánicos combinados se 25 secaron (MgSO4) y se concentraron hasta un volumen de 1 l. A esta solución de amina libre se le añadió BOC2O o dicarbonato de di-terc-butilo (131,0 g, 0,6 mol) y la mezcla se agitó durante 4 días a ta. A la reacción se le añadió más cantidad de dicarbonato de di-terc-butilo (50 g, 0,23 mol), la mezcla se calentó a reflujo durante 3 h y después se dejó enfriar a temperatura ambiente durante una noche. La mezcla de reacción se secó sobre MgSO4 y se concentró al vacío, proporcionando 80 g de material en bruto. Este residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida 30 (2,5 kg de SiO2. eluyendo con MeOH del 1% al 2%/CH2Cl2), proporcionando 57 g (53%) de éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico racémico en forma de un aceite de color amarillo que solidificó mientras permanecía en reposo en el frigorífico: RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 1,26 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 1,46 (s, 9H), 1,43-1,49 (m, 1H), 1,76-1,82 (m a, 1H), 2,14 (c, J = 8,6 Hz, 1H), 4,18 (c, J = 7,2 Hz, 2H), 5,12 (dd J = 10,3, 1,7 Hz, 1H), 5,25 (s a, 1H), 5,29 (dd, J = 17,6, 1,7 Hz, 1H), 5,77 (ddd, J = 17,6, 10,3, 8,9 Hz, 1H); EM m/z 254,16 (M-35 1).

Preparación de clorhidrato de éster etílico del ácido (1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico racémico

Se disolvió éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico (9,39 g, 36,8 mmol) en HCl 4 N/dioxano (90 ml, 360 mmol) y se agitó durante 2 h a ta. La mezcla de reacción se concentró para suministrar clorhidrato de éster etílico del ácido (1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico con rendimiento cuantitativo (7 g, 100%). RMN 1H (metanol-d4)  1,32 (t, J = 7,1, 3H), 1,72 (dd, J = 10,2, 6,6 Hz, 1H), 5 1,81 (dd, J = 8,3, 6,6 Hz, 1H), 2,38 (c, J = 8,3 Hz, 1H), 4,26-4,34 (m, 2H), 5,24 (dd, 10,3, 1,3 Hz, 1H) 5,40 (d, J = 17,2, 1H), 5,69-5,81 (m, 1H).

PROCEDIMIENTO B

Preparación de clorhidrato de éster etílico del ácido N-Boc-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico racémico

10

A una solución de terc-butóxido potásico (11,55 g, 102,9 mmol) en THF (450 ml) a -78ºC se le añadió la N,N-dibencil imina de éster etílico de glicina disponible en el mercado (25,0 g, 93,53 mmol) en THF (112 ml). La mezcla de reacción se calentó a 0ºC, se agitó durante 40 min y después se enfrió de nuevo a -78ºC. A esta solución se le añadió trans-1,4-dibromo-2-buteno (20,0 g, 93,50 mmol), la mezcla se agitó durante 1 h a 0ºC y se enfrió de nuevo a -78ºC. Se añadió terc-butóxido potásico (11,55 g, 102,9 mmol), la mezcla se calentó inmediatamente a 0ºC 15 y se agitó una hora más antes de concentrarse al vacío. El producto en bruto se recogió en Et2O (530 ml), se añadió una solución ac. 1 N de HCl (106 ml, 106 mmol) y la mezcla bifásica resultante se agitó durante 3,5 h a ta. Las fases se separaron y la fase acuosa se lavó con Et2O (2 x) y se basificó con una solución ac. saturada de NaHCO3. La amina deseada se extrajo con Et2O (3 x) y el extracto orgánico combinado se lavó con salmuera, se secó (MgSO4) y se concentró al vacío, obteniendo la amina libre. Este material se trató con una solución 4 N de HCl en dioxano (100 20 ml, 400 mmol) y se concentró, proporcionando clorhidrato de éster etílico del ácido (1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico en forma de un semisólido de color parduzco (5,3 g, rendimiento del 34%) idéntico al material obtenido del procedimiento A, con la excepción de la presencia de una pequeña impureza aromática no identificada (8%).

EJEMPLO 4 25

Resolución de éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico

Resolución A

A una solución acuosa de tampón fosfato sódico (0,1 M, 4,25 litros ("l"), pH 8) alojada en un reactor con camisa de 12 litros, mantenido a 39ºC, y agitado a 300 rpm, se le añadieron 511 gramos de Alcalase 2.4L (aproximadamente 425 ml) (Novozymes North America Inc.). Cuando la temperatura de la mezcla alcanzó 39ºC, el 5 pH se ajustó a 8,0 mediante la adición de NaOH al 50% en agua. Después, se añadió una solución del éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico racémico (85 g) en 850 ml de DMSO durante un periodo de 40 min. Después, la temperatura de la reacción se mantuvo a 40ºC durante 24,5 h, tiempo durante el cual el pH de la mezcla se ajustó a 8,0 en los puntos de tiempo 1,5 h y 19,5 h usando NaOH al 50% en agua. Después de 24,5 h, se determinó que el exceso enantiomérico del éster era del 97,2 y la reacción se enfrió a 10 temperatura ambiente (26ºC) y se agitó durante una noche (16 h), después de lo cual se determinó que el exceso enantiomérico del éster era del 100%. Después, el pH de la mezcla de reacción se ajustó a 8,5 con NaOH al 50% y la mezcla resultante se extrajo con MTBE (2 x 2 l). Después, el extracto de MTBE combinado se lavó con NaHCO3 al 5% (3 x 100 ml) y agua (3 x 100 ml) y se evaporó al vacío, dando el éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico enantioméricamente puro en forma de un sólido de color amarillo claro (42,55 g; pureza: 15 97% @ 210 nanomolar ("nM"), que no contenía ácido; exceso enantiomérico del 100% ("ee").

Después, la fase acuosa del procedimiento de extracción se acidificó a pH 2 con H2SO4 al 50% y se extrajo con MTBE (2 x 2 l). El extracto de MTBE se lavó con agua (3 x 100 ml) y se evaporó, dando el ácido en forma de un sólido de color amarillo claro (42,74 g; pureza: 99% @ 210 nM, que no contenía éster).

1R,2S-éster

1S,2R-ácido

20

éster ácido

Espec. de Masas de Alta Resolución

(+) IEN, C13H22NO4, [M+H]+, cal. 256,1549, encontrado 256,1542 (-) IEN, C11H16NO4, [M-H]-, cal. 226,1079, encontrado 226,1089

Desplazamiento químico observado por RMN, Disolvente: CDCl3 (protón  7,24 ppm, C-13  77,0 ppm) Bruker DRX-500C: protón 500,032 MHz, carbono 125,746 MHz

Posición

Protón (patrón) ppm C-13 ppm Protón (patrón) ppm C-13 ppm

1

--- 40,9 ---- 40,7

2

2,10 (c, J = 9,0 Hz) 34,1 2,17 (c, J = 9,0 Hz) 35,0

3a

1,76 (a) 23,2 1,79 (a) 23,4

3b

1,46 (a) 1,51, (a)

4

--- 170,8 ---- 175,8

5

5,74 (ddd, J = 9,0, 10,0, 17,0 Hz) 133,7 5,75 m) 133,4

6a

5,25 (d, J = 17,0 Hz) 117,6 5,28 (d, J = 17,0 Hz) 118,1

6b

5,08 (dd, J = 10,0, 1,5 Hz) 5,12 (d, J = 10,5 Hz)

7

---- 155,8 ---- 156,2

8

--- 80,0 ---- 80,6

9

1,43 (s) 28,3 1,43 (s) 28,3

10

4,16 (m) 61,3 ---- ----

11

1,23 (t, J = 7,5 Hz) 14,2 ---- ----

Resolución B

A 0,5 ml de tampón Heps·Na 100 milimolar ("mM") (pH 8,5) en un pocillo de una placa de 24 pocillos (capacidad: 10 ml/pocillo) se le añadieron 0,1 ml de Savinase 16.0L (proteasa de Bacillus clausii) (Novozymes North America Inc.) y una solución del éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico 5 racémico (10 mg) en 0,1 ml de DMSO. La placa se cerró herméticamente y se incubó a 250 rpm a 40ºC. Después de 18 h, se determinó que el exceso enantiomérico del éster era del 44,3% como se indica a continuación: se retiraron 0,1 ml de la mezcla de reacción y se mezclaron bien con 1 ml de etanol; después de la centrifugación, se analizaron 10 microlitros ("l") del sobrenadante con la HPLC quiral. A la mezcla de reacción restante se le añadieron 0,1 ml de DMSO y la placa se incubó durante 3 días más a 250 rpm a 40ºC, después de lo cual se añadieron cuatro ml de 10 etanol al pocillo. Después de la centrifugación, se analizaron 10 l del sobrenadante con la HPLC quiral y se determinó que el exceso enantiomérico del éster era del 100%.

Resolución C

A 0,5 ml de tampón Heps·Na 100 mM (pH 8,5) en un pocillo de una placa de 24 pocillos (capacidad: 10 ml/pocillo) se le añadieron 0,1 ml de Esperas 8.0L, (proteasa de Bacillus halodurans) (Novozymes North America 15 Inc.) y una solución del éster etílico del ácido N-Boc-(1R, 2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico racémico (10 mg) en 0,1 ml de DMSO. La placa se cerró herméticamente y se incubó a 250 rpm a 40ºC. Después de 18 horas, se determinó que el exceso enantiomérico del éster era del 39,6% como se indica a continuación: se retiraron 0,1 ml de la mezcla de reacción y se mezclaron bien con 1 ml de etanol; después de la centrifugación, se analizaron 10 l del sobrenadante con la HPLC quiral. A la mezcla de reacción restante se le añadieron 0,1 ml de 20 DMSO y la placa se incubó durante 3 días más a 250 rpm a 40ºC, después de lo cual se añadieron cuatro ml de etanol al pocillo. Después de la centrifugación, se analizaron 10 l del sobrenadante con la HPLC quiral y se determinó que el exceso enantiomérico del éster era del 100%.

El análisis de las muestras se realizó de la siguiente manera:

1) Preparación de la muestra: Se mezclaron bien aproximadamente 0,5 ml de la mezcla de reacción con 10 25 volúmenes de EtOH. Después de la centrifugación, se inyectaron 10 l del sobrenadante en la columna de HPLC.

2) Determinación de la conversión:

Columna: YMC ODS A, 4,6 x 50 milímetros ("mm"), S-5 m

Disolvente: A, I mM HCl en agua; B, MeCN 30

Gradiente: 30% de B durante 1 min; del 30% al 45% de B durante 0,5 min; 45% de B durante 1,5 min; del 45% al 30% de B durante 0,5 min.

Caudal: 2 ml/min

Detección UV: 210 nM

Tiempo de retención: ácido, 1,2 min; éster, 2,8 min. 35

3) Determinación del exceso enantiomérico para el éster:

Columna: CHIRACEL OD-RH, 4,6 x 150 mm, S-5 m

Fase móvil: MeCN/HClO4 50 mM en agua (67/33)

Caudal: 0,75 ml/min.

Detección UV: 210 nM.

Tiempo de retención: 5

ácido (1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico 5,2 min;

Racemato éster etílico del ácido (1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico 18,5 min y 20,0 min;

éster etílico del ácido (1R,2S)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico 18,5 min.

Resolución D 10

Se mantuvieron 5 l de tampón fosfato sódico 0,3 M (pH 8) a 38ºC en un reactor con camisa de 20 litros, agitado a 130 rpm. Al reactor se le añadieron 4 litros de Alcalase 2.4L (Novozymes North America Inc.) y 1 litro de agua DI. Cuando la temperatura de la mezcla alcanzó 38ºC, el pH se ajustó a 7,8 con NaOH 10 N. Al reactor se le añadió una solución del éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico racémico (500 gramos) en 5 litros de DMSO durante un periodo de 1 hora mediante un embudo de adición. 15 Después, la temperatura de la reacción se ajustó a 48ºC. Después de 21 horas, el exceso enantiomérico del éster alcanzó el 99,3%. El calentamiento se interrumpió a las 24 horas y la reacción se enfrió lentamente a temperatura ambiente (aproximadamente 25ºC) y se agitó durante una noche. El pH de la mezcla de reacción se ajustó a 8,5 con NaOH 10 N y la mezcla se extrajo con MTBE (2 x 4 l). El extracto de MTBE combinado se lavó con NaHCO3 al 5% (3 x 400 ml) y agua (3 x 400 ml) y se evaporó para dar éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/-1-amino-2-20 vinilciclopropanocarboxílico enantioméricamente puro en forma de un cristal de color amarillo claro (259 g; pureza: 96,9% @ 210 nM, que no contenía ácido; ee del 100%).

Resolución E

Se mantuvieron 10 l de tampón fosfato sódico 0,1 M (pH 8) a 40ºC en un reactor con camisa de 20 litros, agitado a 360 rpm. Al reactor se le añadieron 1,5 litros de Alcalase 2.4 l (Novozymes North America Inc.). Cuando la 25 temperatura de la mezcla alcanzó 38ºC. El pH se ajustó a 8,0 con NaOH 10 N. Al reactor se le añadió una solución del éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico racémico (200 gramos) en 2 litros DMSO durante un periodo de 1 hora mediante un embudo de adición. Después, la temperatura de la reacción se ajustó a 40ºC. Después de 3 horas, el pH se ajustó a 8,0 con NaOH 10 N. Después de 21 horas, la reacción se enfrió a 25ºC. El pH de la mezcla de reacción se ajustó a 8,5 con NaOH 10 N y la mezcla se extrajo con MTBE (2 x 5 30 l). El extracto de MTBE combinado se lavó con NaHCO3 al 5% (3 x 500 ml) y agua (3 x 200 ml) y se evaporó, dando 110 gramos de aceite de color amarillo. El aceite se ajustó a la temperatura ambiente al vacío doméstico y dio éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico enantioméricamente puro como un cristal con forma de una varilla incoloro (101 g; pureza: 97,9% @ 210 nM, que no contenía ácido; ee del 100%).

La estructura cristalina de éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico 35 enantioméricamente puro se ha caracterizado por un análisis de cristal único (rayos X NB#: 52795-093, código de ref.: 634592N1). La configuración absoluta no se establece por la falta de un centro quiral conocido o átomos más pesados. Se forma una estructura de cadena a lo largo del eje a cristalográfico mediante la unión de hidrógeno intermolecular entre el grupo amida y el átomo de oxígeno carbonilo (N...O 3,159 Å).

Estructura de éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico: 40

Estructura de éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico:

Datos del Cristal:

Experimento

Fórmula Química: C13H21N1O4

Cristalización

Sistema del Cristal: Ortorrómbico

Fuente de cristal: MTBE

Grupo Espacial: P212121

Descripción del Cristal: Varilla incolora

a = 5,2902(1) Å  = 90º

Tamaño del Cristal (mm): 0,12 x 0,26 x 0,30

b = 13,8946(2) Å  = 90º

Recolección de Datos

c = 19,9768(3) Å  = 90º

Temperatura (K): 293

V = 1468,40(4) Å3

máx (º): 65,2 (Cu K)

Z = 4 dx = 1,155 g cm-3

Nº de reflejos medidos: 7518

Nº de reflejos para parámetros de red cristalina: 6817

Nº de reflejos independientes: 2390 (Rint = 0,0776)

Índice  para parámetros de red cristalina (º): 2,2-65,2

Nº de reflejos observados: (I2: 2284)

Coeficiente de absorción (mm-1): 0,700

Corrección de la absorción (Tmín-Tmáx): 0,688-1,000

Resolución F

Se mantuvieron 5 l de tampón borato sódico 0,2 M (pH 9) a 45ºC en un reactor con camisa 20 litros y se 5 agitaron a 400 rpm. Al reactor se le añadieron tres litros de agua DI y cuatro litros de Savinase 16L, tipo EX (Novozymes North America Inc.). Cuando la temperatura de la mezcla alcanzó 45ºC, el pH se ajustó a 8,5 con NaOH 10 N. Al reactor se le añadió una solución de éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico racémico (200 gramos) en 2 litros de DMSO durante un periodo de 40 min mediante un embudo de adición. Después, la temperatura de la reacción se ajustó a 48ºC. Después de 2 horas, el pH se ajustó a 10 pH 9,0 con NaOH 10 N. A las 18 horas, el exceso enantiomérico del éster alcanzó el 72% y el pH se ajustó a 9,0 con NaOH 10 N. A las 24 horas, la temperatura disminuyó a 35ºC. A las 42 horas, la temperatura se elevó a 48ºC y el pH se ajustó a 9,0 con NaOH 10 N. El calentamiento se interrumpió a las 48 horas y la reacción se enfrió lentamente a temperatura ambiente (aproximadamente 25ºC) y se agitó durante una noche. A las 66 horas, el pH de la mezcla de reacción era de 8,6. La mezcla se extrajo con MTBE (2 x 4 l). El extracto de MTBE combinado se lavó con NaHCO3 15 al 5% (6 x 300 ml) y agua (3 x 300 ml) y se evaporó, dando éster etílico del ácido N-Boc-(1R,2S)/-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico enantioméricamente puro en forma de un cristal de color amarillo claro (101A g; pureza: 95,9% @ 210 nM, que no contenía ácido; ee del 98,6%).

EJEMPLO 5

Etapa 1: Preparación de clorhidrato de 1(R)-amino-2(S)-vinilciclopropano carboxilato de etilo

Se agitó 1(R)-terc-butoxicarbonilamino-2(S)-vinilciclopropanocarboxilato de etilo (8,5 g, 33,3 mmol) en una atmósfera de N2 con 200 ml de HCl 4 N/dioxano (Aldrich) a ta durante 3 h. El disolvente se retiró a presión reducida manteniendo la temperatura por debajo de 40ºC. Esto dio 6,57 g (~100%) de clorhidrato de 1(R)-amino-2(S)-5 vinilciclopropanccarboxilato de etilo en forma de un sólido de color castaño claro. RMN 1H (300 MHz, CD3OD)  1,31 (t, J = 7,0 Hz, 3 H), 1,69-1,82 (m, 2 H), 2,38 (c, J = 8,8 Hz, 1 H), 4,29 (c, J = 7,0 Hz, 2 H), 5,22 (d, J = 10,3 Hz, 1 H), 5,40 (d, J = 17,2 Hz, 1 H), 5,69-5,81 (m, 1 H). EM m/z 156 (M++1).

Etapa 2: Preparación de 1(R)- [1-terc-butoxicarbonil-4(R) - hidroxipirrolidina-2(S) - carboxamido]-2(S)-vinilciclopropanocarboxilato de etilo 10

Una suspensión agitada de Boc-L-4-hidroxiprolina (N-Boc (2S,4R)-hidroxiprolina) (10 g, 43,3 mmol) en 400 ml de cloruro de metileno se trató secuencialmente con N-metil morfolina (9,3 ml, 84,7 mmol), HATU (19,5 g, 51,3 mmol) y clorhidrato de 1(R)-amino-2(S)-vinilciclopropanocarboxilato de etilo (9,1 g, 47,5 mmol). La solución de oro homogénea se agitó a ta en una atmósfera de N2 durante 18 h y después se concentró al vacío, dando un aceite de 15 color pardo. Éste se repartió entre acetato de etilo y NaHCO3 ac. sat. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó (MgSO4) y se concentró al vacío, dando 15 g (94%) de 1(R)-[1-terc-butoxicarbonil-4(R)-hidroxipirrolidina-2(S)-carboxamido]-2(S)-vinil-ciclopropanocarboxilato de etilo en forma de un sólido de color blanquecino: CL-EM (columna de HPLC Xterra: 3,0 x 50 mm de longitud. Gradiente: 100% de Disolvente A/0% de Disolvente B con respecto al 0% de Disolvente A/100% del Disolvente B. Tiempo de gradiente: 3 min. Tiempo de mantenimiento: 1 20 min. Caudal: 5 ml/min. Detector de Longitud de Onda: 220 nM. Disolvente A: MeOH al 10%/H2O al 90%/TFA al 0,1%. Disolvente B: H2O al 10%/MeOH al 90%/TFA al 0,1%). (Tiempo de retención: 2,09 min), EM m/z 369 (M++1).

Etapa 3: Preparación de clorhidrato de 1(R)-[4(R)-hidroxipirrolidina-2(S)-carboxamido]-2(S)-vinilciclopropanocarboxilato de etilo.

25

Un suspensión agitada de 1(R)-[1-terc-butoxicarbonil-4(R)-hidroxipirrolidina-2(S)-carboxamido]-2(S)-vinilciclopropanocarboxilato de etilo (5,0 g, 13,6 mmol) se trató con HCl 4 N/dioxano (20 ml) durante 3 h. La mezcla de reacción se concentró al vacío, dando 4,5 g (97%) de clorhidrato de 1(R)-[4(R)-hidroxipirrolidina-2(S)-carboxamido]-2(S)-vinilciclopropanocarboxilato de etilo en forma de un sólido de color blanco: RMN 1H (300 MHz, CD3OD)  1,26 (t, J = 7,14 Hz, 3 H), 1,46 (dd, J = 9,70, 5,31 Hz, 1 H), 1,80 (dd, J = 8,23, 5,31 Hz, 1 H), 2,00-2,15 (m, 30 1 H), 2,18-2,30 (m, 1 H), 2,45 (dd, J = 13,36, 7,50 Hz, 1 H), 3,36-3,48 (m, 1 H), 4,11-4,24 (m, 2 H), 4,44 (dd, J = 10,25, 7,68 Hz, 1 H), 4,58-4,65 (m, 1 H), 4,84-4,94 (m, 1 H), 5,17 (d. J = 1,83 Hz, 1 H), 5,27-5,42 (m, 1 H), 5,67-5,89 (m, 1 H).

EJEMPLO 6

Preparación de los Procedimientos A y B de Ciclopropilsulfonamida

Procedimiento A:

Una solución de 100 ml de THF enfriada a 0ºC se burbujeó en amoniaco gaseoso hasta que se alcanzó la 5 saturación. A esta solución se le añadió una solución de 5 g (28,45 mmol) de cloruro de ciclopropilsulfonilo (adquirido en Array Biopharma) en 50 ml de THF, la solución se calentó a ta durante una noche y se agitó un día más. La mezcla se concentró hasta que quedó 1-2 ml de disolvente y se aplicó sobre un lecho corto de SiO2 de 30 g (eluyendo con EtOAc del 30% al 60%/hexanos), proporcionando 3,45 g (100%) de ciclopropil sulfonamida en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (Metanol-d4)  0,94-1,07 (m, 4H), 2,52-2,60 (m, 1H); RMN 13C (metanol-d4)  10 5,92, 33,01.

PROCEDIMIENTO B:

Etapa 1: Preparación de N-terc-Butil-(3-cloro)propilsulfonamida

Se disolvió terc-butilamina (3,0 mol, 315,3 ml) en THF (2,5 l). La solución se enfrió a -20ºC. Se añadió 15 lentamente cloruro de 3-cloropropanosulfonilo (1,5 mol, 182,4 ml). La mezcla de reacción se dejó calentar a ta y se agitó durante 24 h. La mezcla se filtró y el filtrado se concentró al vacío. El residuo se disolvió en CH2Cl2 (2,0 l). La solución resultante se lavó con HCl 1 N (1,0 l), agua (1,0 l) y salmuera (1,0 l) y se secó sobre Na2SO4. Se filtró y se concentró al vacío, dando un sólido ligeramente amarillo, que se cristalizó en hexano, proporcionando el producto en forma de un sólido de color blanco (316,0 g, 99%). RMN 1H (CDCl3)  1,38 (s, 9H), 2,30-2,27 (m, 2H), 3,22 (t, J = 20 7,35 Hz, 2H), 3,68 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 4,35 (a, 1H).

Etapa 2: Preparación de terc-butilamida del ácido ciclopropanosulfónico

A una solución de N-terc-butil-(3-cloro)propilsulfonamida (2,14 g, 10,0 mmol) en THF (100 ml) se le añadió n-BuLi (2,5 M en hexano, 8,0 ml, 20,0 mmol) a -78ºC. La mezcla de reacción se dejó calentar hasta la temperatura 25 ambiente durante periodo de 1 h. Los productos volátiles se retiraron al vacío. El residuo se repartió entre EtOAC y agua (200 ml, 200 ml). La fase orgánica separada se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se recristalizó en hexano, produciendo el producto deseado en forma de un sólido de color blanco (1,0 g, 56%). RMN 1H (CDCl3)  0,98-1,00 (m, 2H), 1,18-1,19 (m, 2H), 1,39 (s, 9H), 2,48-2,51 (m, 1H), 4,19 (a, 1H). 30

Etapa 3: Preparación de ciclopropilsulfonamida

Una solución de terc-butilamida del ácido ciclopropanosulfónico (110,0 g, 0,62 mol) en TFA (500 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. El producto volátil se retiró al vacío. El residuo se recristalizó en EtOAC/hexano (60 ml/240 ml), produciendo el producto deseado en forma de un sólido de color blanco (68,5 g, 35 91%). RMN 1H (DMSO-d6)  0,84-0,88 (m, 2H), 0,95-0,98 (m, 2H), 2,41-2,58 (m, 1H), 6,56 (a, 2H).

EJEMPLO 7

Preparación de N-terc-butil-(1-metil)ciclopropilsulfonamida.

Etapa 1a Preparación de N-terc-butil-(3-cloro)propilsulfonamida.

5

Como se ha mostrado anteriormente.

Etapa 1b. Preparación de N-terc-Butil-(1-metil)ciclopropilsulfonamida.

Una solución de N-terc-butil-(3-cloro)propilsulfonamida (4,3 g, 20 mmol) se disolvió en THF seco (100 ml) y se enfrió a -78ºC. A esta solución se le añadió lentamente n-BuLi (17,6 ml, 44 mmol, 2,5 M en hexano). El baño de 10 hielo seco se retiró y la mezcla de reacción se dejó calentar a ta durante un periodo de 1,5 h. Después, esta mezcla se enfrió a -78ºC y se añadió una solución de n-BuLi (20 mmol, 8 ml, 2,5 M en hexano). La mezcla de reacción se calentó a ta, se enfrió de nuevo a -78ºC durante un periodo de 2 h y se añadió una solución pura de yoduro de metilo (5,68 g, 40 mmol). La mezcla de reacción se dejó calentar a ta durante una noche, se inactivó con NH4Cl saturado (100 ml) a ta. Se extrajo con EtOAc (100 ml). La fase orgánica se lavó con salmuera (100 ml), se secó (MgSO4) y se 15 concentró al vacío, dando un aceite de color amarillo que se cristalizó en hexano, proporcionando el producto en forma de un sólido de color ligeramente amarillo (3,1 g, 81%): RMN 1H (CDCl3)  0,79 (m, 2H), 1,36 (s, 9H), 1,52 (m, 2H), 1,62 (s, 3H), 4,10 (s a, 1H).

Etapa 1c: Preparación de 1-metilciclopropilsulfonamida

20

Una solución de N-terc-butil-(1-metil)ciclopropilsulfonamida (1,91 g, 10 mmol) se disolvió en TFA (30 ml) y la mezcla de reacción se agitó a ta durante 16 h. El disolvente se retiró al vacío, dando un aceite de color amarillo que se cristalizó en EtOAc/hexano (1:4, 40 ml), produciendo el Ejemplo 3, 1-metilciclopropilsulfonamida, en forma de un sólido de color blanco (1,25 g, 96%): RMN 1H (CDCl3)  0,84 (m, 2H), 1,41 (m, 2H), 1,58 (s, 3H), 4,65 (s a, 2H). Anal. Calc. para C4H9NO2S: C, 35,54; H, 6,71; N, 10,36. Encontrado: C, 35,67; H, 6,80; N, 10,40. 25

EJEMPLO 9

Preparación de 1-Propilciclopropilsulfonamida

Etapas 1b: Preparación de N-terc-Butil-(1-bencil)ciclopropil-sulfonamida.

Este compuesto se preparó usando el procedimiento que se ha descrito para la preparación de 1-metilciclopropilsulfonamida con la excepción de que se usó haluro de propilo en lugar de yoduro de metilo en la segunda etapa de este procedimiento. 5

EJEMPLO 10

Preparación de N-terc-Butil-(1-alil)ciclopropilsulfonamida.

Este compuesto, N-terc-butil-(1-alil)ciclopropilsulfonamida, se obtuvo con un rendimiento del 97% de acuerdo con el procedimiento descrito en la síntesis de N-terc-Butil-(1-metil)ciclopropilsulfonamida con la excepción 10 de que se usaron 1,25 equivalentes de bromuro de alilo como electrófilo. El compuesto se recogió directamente en la siguiente reacción sin purificación: RMN 1H (CDCl3)  0,83 (m, 2H), 1,34 (s, 9H), 1,37 (m, 2H), 2,64 (d, J = 7,3 Hz, 2H), 4,25 (s a, 1H), 5,07-5,10 (m, 2H), 6,70-6,85 (m, 1H).

Preparación de 1-alilciclopropilsulfonamida.

15

Este compuesto, 1-alilciclopropilsulfonamida, se obtuvo con un rendimiento del 40% a partir de N-terc-butil-(1-alil)ciclopropilsulfonamida de acuerdo con el procedimiento descrito en la síntesis de 1-metilciclopropilsulfonamida. El compuesto se purificó por cromatografía en columna sobre SiO2 usando MeOH al 2% en CH2Cl2 en forma del eluyente: RMN 1H (CDCl3)  0,88 (m, 2 H), 1,37 (m, 2 H), 2,66 (d, J = 7,0 Hz, 2 H), 4,80 (s, 2 H), 5,16 (m, 2 H), 5,82 (m, 1 H); RMN 13C (CDCl3)  11,2, 35,6, 40,7, 119,0, 133,6. 20

EJEMPLO 15

Preparación de terc-butilocarbamato de ciclopropilsulfonilamina, un intermedio clave en la preparación de ciclopropilsulfonamidas C1-sustituido

Etapa 1: Preparación de 3-cloropropilsulfonamida 25

Una solución de cloruro de 3-cloropropanosulfonilo (55 g, 310,7 mmol) se disolvió en THF (200 ml) y se añadió gota a gota durante 30 minutos a una solución de NH4OH (200 ml) enfriada a 0ºC. La mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente, se agitó durante 1 hora y la fase acuosa se repartió múltiples veces con diclorometano (4 x 500 ml). La capa de diclorometano combinada se lavó con HCl 1 N (150 ml), agua (150 ml), se 30 secó sobre MSO4, se filtró y se concentró al vacío. El sólido en bruto se recristalizó en la cantidad mínima de

diclorometano en hexanos, proporcionando 3-cloropropilsulfonamida en forma de un sólido de color blanco (45,3 g, 93%). RMN 1H (CDCl3)  2,34 (m, 2H), 3,32 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 3,70 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 4,83 (s, 2H); RMN 13C (CDCl3)  27,10, 42,63, 52,57.

Etapa 2: Preparación de terc-butilcarbamato de 3-cloropropilsulfonilamina

5

A una solución de 3-cloropropilsulfonamida (30,2 g, 191,5 mmol), trietilamina (30,2 ml, 217,0 mmol) y 4-DMAP (2,40 g, 19,6 mmol) en diclorometano (350 ml) enfriada a 0ºC se le añadió lentamente gota a gota una solución de dicarbonato de di-terc-butilo (47,2 g, 216,9 mmol) en diclorometano (250 ml) durante 30 minutos. La mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente, se agitó durante 3 horas más, se repartió con HCl 1 N (300 ml), agua (300 ml) y salmuera (300 ml), se secó sobre MSO4, se filtró y se concentró al vacío, proporcionando 10 el producto en bruto. Este material se trituró con 70 ml de diclorometano al 5% en hexanos, proporcionando terc-butilcarbamato de 3-cloropropilsulfonilamina en forma de un sólido de color blanquecino (47,2 g, 96%): RMN 1H (CDCl3)  1,51 (s, 9H), 2,33 (m, 2H), 3,60 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 3,68 (t, J = 6,21 Hz, 2H); RMN 13C (CDCl3)  26,50, 27,95, 42,37, 50,40, 84,76, 149,53.

Etapa 3: Preparación de terc-butil carbamato de ciclopropilsulfonilamina 15

Una solución de n-butil litio (74,7 ml, 119,5 mmol, 1,6 M en hexano) se disolvió en THF seco (105 ml) y se enfrió a -78ºC en una atmósfera de argón. A esta solución se le añadió gota a gota una solución de terc-butilcarbamato de 3-cloropropilsulfonilamina (14 g, 54,3 mmol) en THF seco (105 ml) durante 20-30 minutos. El baño de hielo seco se retiró y la mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente durante un periodo de 2 20 horas. La mezcla de reacción se inactivó con ácido acético glacial (3,4 ml), se concentró al vacío y se repartió entre diclorometano (100 ml) y agua (100 ml). La fase orgánica se lavó con salmuera (100 ml), se secó (MgSO4), se filtró y se concentró al vacío, proporcionando el terc-butil carbamato de ciclopropilsulfonilamina en forma de un sólido ceroso de color blanquecino (12,08 g, 100%): RMN 1H (CDCl3)  1,10 (m, 2H), 1,34 (m, 2H), 1,50 (s, 9H), 2,88 (m, 1H), 7,43 (s, 1H). RMN 13C (CDCl3)  6,21, 28,00, 31,13, 84,07, 149,82. 25

EJEMPLO 16

Preparación de 1-metoxi-metilciclopropilsulfonamida

Etapa 1: Preparación de terc-butilcarbamato de 1-metoximetilciclopropilsulfonilamina

30

A una solución de terc-butil carbamato de ciclopropilsulfonilamina (1,0 g, 4,5 mmol) disuelta en THF (30 ml) y enfriada a -78ºC se le añadió n-butil litio (6,4 ml, 10,2 mmol, 1,6 M en hexano) y la mezcla de reacción se agitó durante 1 hora. A esta solución se le añadió una solución pura de clorometil metil éter (0,40 ml, 5,24 mmol), y la mezcla se dejó calentar lentamente a temperatura ambiente durante una noche. El pH de la solución se ajustó a 3 usando HCl acuoso 1 N y después se extrajo con acetato de etilo (4 porciones x 50 ml). Los extractos combinados 35 se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron, proporcionando terc-butilcarbamato de 1-metoximetilciclopropilsulfonilamina, en forma de un sólido ceroso (1,20 g, 100%) que se recogió directamente en la siguiente reacción sin purificación adicional: RMN 1H (CDCl3)  1,03 (m, 2H), 1,52 (s, 9H), 1,66 (m, 2H), 3,38 (s, 3H),

3,68 (s, 2H), 7,54 (s, 1H); RMN 13C (CDCl3)  11,37, 28,29, 40,38, 58,94, 73,43, 83,61, 149,57.

Etapa 2: Preparación de 1-metoximetilciclopropilsulfonamida

Una solución de terc-butilcarbamato de 1-metoximetilciclopropilsulfonilamina (1,14 g, 4,30 mmol) se disolvió en una solución de TFA al 50%/diclorometano (30 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. El 5 disolvente se retiró al vacío y el residuo se sometió a cromatografía sobre 80 g de SiO2 (eluyendo con acetato de etilo del 0% al 60%/hexanos a 1-metoximetilciclopropilsulfonamida en forma de un sólido de color blanco (0,55 g, global al 77% en dos etapas): RMN 1H (CDCl3) δ 0,95 (m, 2H), 1,44 (m, 2H), 3,36 (s, 3H), 3,65 (s, 2H), 4,85 (s, 2H); RMN 13C (CDCl3)  11,17, 40,87, 59,23, 74,80; EMBR m/z 183 (M++NH4).

EJEMPLO 17 10

Preparación de 1-ciclopropilmetilciclopropilsulfonamida

Etapa 1: Preparación de terc-butilcarbamato de 1-ciclopropilmetilciclopropilsulfonilamina

Se obtuvo terc-butilcarbamato de 1-ciclopropilmetilciclopropilsulfonilamina con un rendimiento del 92% de 15 acuerdo con el procedimiento descrito en la síntesis de terc-butilcarbamato de 1-metoximetilciclopropilsulfonilamina con la excepción de que se usaron 1,10 equivalentes de bromuro de ciclopropilmetilo como electrófilo. El compuesto se recogió directamente en la siguiente reacción sin purificación: RMN 1H (CDCl3)  0,10 (m, 2H), 0,51 (m, 2H), 0,67 (m, 1H), 1,10 (m, 2H), 1,49 (s, 9H), 1,62 (m, 2H), 1,87 (d, J = 7,0 Hz, 2H).

Etapa 2: Preparación de 1-ciclopropilmetilciclopropilsulfonamida 20

Este compuesto se obtuvo con un rendimiento del 65% a partir de terc-butilcarbamato de 1-ciclopropilmetilciclopropilsulfonilamina de acuerdo con el procedimiento descrito para la síntesis de 1-metoximetilciclopropilsulfonamida. El compuesto se purificó por cromatografía en columna sobre SiO2 usando acetato de etilo del 0% al 60% en hexanos como eluyente: RMN 1H (CDCl3)  0,15 (m, 2H), 0,51 (m, 2H), 1,01 (m, 25 2H), 1,34 (m, 3H), 1,86 (d, J = 7,0 Hz, 2H), 4,83 (s, 2H); RMN 13C (CDCl3)  4,65, 7,74, 11,26, 35,62, 41,21; EMBR m/z 193 (M++NH4).

EJEMPLO 19

Preparación de 1-(3,5-dimetilisoxazol-4-il)carbamoilciclopropanosulfonamida

Etapa 1: Preparación de terc-butilcarbamato de 1-(3,5-dimetilisoxazol-4-il)carbamoilciclopropanosulfonamida

Este compuesto se obtuvo con un rendimiento en bruto al 100% de acuerdo con el procedimiento descrito para la síntesis de terc-butilcarbamato de 1-metoximetilciclopropilsulfonilamina con la excepción de que se usaron 5 1,20 equivalentes de 3,5-dimetilisoxazol-4-isocianato como el electrófilo. El compuesto se recogió directamente en la siguiente reacción sin purificación.

Etapa 2: Preparación de 1-(3,5-dimetilisoxazol-4-il)carbamoilciclopropanosulfonamida

Este compuesto se obtuvo con un rendimiento del 50% (580 mg) a partir de 1,62 g (4,52 mmol) de terc-10 butilcarbamato de 1-(3,5-dimetilisoxazol-4-il)carbamoilciclo-propanosulfonamida usando 30 ml (120 mmol) de HCl 4 N/dioxanos, en agitación durante una noche, con concentración y cromatografía sobre una columna Biotage 40 M (eluyendo con metanol del 0% al 5%/diclorometano: RMN 1H (metanol-d4)  1,57 (m, 2H), 1,61 (m 2H), 2,15 (s, 3H), 2,30 (s, 3H), 4,84 (s, 3H); RMN 13C (metanol-d4)  9,65, 10,94, 15,01, 46,11, 114,82, 159,45, 165,55, 168,15; EMBR m/z 260 (M++H). 15

EJEMPLO 20

Preparación de ciclobutilsulfonamida a partir de bromuro de ciclobutilo

A una solución de 5,0 g (37,0 mmol) de bromuro de ciclobutilo en 30 ml de éter dietílico anhidro (Et2O) enfriado a -78ºC se le añadieron 44 ml (74,8 mmol) de terc-butil litio 1,7 M en pentanos y la solución se calentó 20 lentamente a -35ºC durante 1,5 h. Esta mezcla se canuló lentamente en una solución de 5,0 g (37,0 mmol) de cloruro de sulfurilo recién destilado en 100 ml de hexanos enfriado a -40ºC, se calentó a 0ºC durante 1 h y se concentró cuidadosamente al vacío. Esta mezcla se disolvió de nuevo en Et2O, se lavó de nuevo con un poco de agua enfriada con hielo, se secó (MgSO4) y se concentró cuidadosamente. Esta mezcla se disolvió de nuevo en 20 ml de THF, se añadió gota a gota a 500 ml de NH3 saturado en THF y se dejó en agitación durante una noche. La 25 mezcla se concentró al vacío, dando un sólido de color amarillo en bruto y se recristalizó en la cantidad mínima de CH2Cl2 en hexanos con 1-2 gotas de MeOH, proporcionando 1,90 g (38%) de ciclobutilsulfonamida en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (CDCl3)  1,95-2,06 (m, 2H), 2,30-2,54 (m, 4H), 3,86 (p, J = 8 Hz, 1H), 4,75 (s a, 2H); RMN 13C (CDCl3)  16,43, 23,93, 56,29, HRMS m/z (M-H)- calc. para C4H8NSO2: 134,0276, encontrado 134,0282.

EJEMPLO 21 30

Preparación de ciclopentil sulfonamida

Una solución de 18,5 ml (37,0 mmol) de cloruro de ciclopentil-magnesio 2 M en éter se añadió gota a gota a una solución de 3,0 ml (37,0 mmol) de cloruro de sulfurilo recién destilado (obtenido en Aldrich) en 100 ml de hexanos enfriados a -78ºC. La mezcla se calentó a 0ºC durante 1 h y después se concentró cuidadosamente al vacío. Esta mezcla se disolvió de nuevo en Et2O (200 ml), se lavó una vez con un poco de agua enfriada con hielo 5 (200 ml), se secó (MgSO4) y se concentró cuidadosamente. Esta mezcla se disolvió de nuevo en 35 ml de THF, se añadió gota a gota a 500 ml de NH3 saturado en THF y se dejó en agitación durante una noche. La mezcla se concentró al vacío, dando un sólido en bruto de color amarillo, el residuo se filtró a través de 50 g de gel de sílice usando EtOAc al 70%-hexanos como eluyente y después la solución se concentró. El residuo se recristalizó en la cantidad mínima de CH2Cl2 en hexanos con 1-2 gotas de MeOH, proporcionando 2,49 g (41%) de 10 ciclopentilsulfonamida en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (CDCl3)  1,58-1,72 (m, 2H), 1,74-1,88 (m, 2H), 1,94-2,14 (m, 4H), 3,48-3,59 (m, 1H), 4,80 (s a, 2H); RMN 13C (CDCl3)  25,90, 28,33, 63,54; EM m/e 148 (M-H)-.

EJEMPLO 22

Preparación de ciclohexil sulfonamida 15

Se añadió gota a gota una solución de 18,5 ml (37,0 mmol) de cloruro de ciclohexilmagnesio 2 M (TCI Americas) en éter a una solución de 3,0 ml (37,0 mmol) de cloruro de sulfurilo recién destilado en 100 ml de hexanos enfriado a -78ºC. La mezcla se calentó a 0ºC durante 1 h y después se concentró cuidadosamente al vacío. Esta mezcla se disolvió de nuevo en Et2O (200 ml), se lavó una vez con un poco de agua enfriada con hielo (200 ml), se 20 secó (MgSO4) y se concentró cuidadosamente. Esta mezcla se disolvió de nuevo en 35 ml de THF, se añadió gota a gota a 500 ml de NH3 saturado en THF y se dejó en agitación durante una noche. La mezcla se concentró al vacío, dando un sólido en bruto de color amarillo, el residuo se filtró a través de 50 g de gel de sílice usando EtOAc al 70%-hexanos como eluyente y se concentró. El residuo se recristalizó en la cantidad mínima de CH2Cl2 en hexanos con 1-2 gotas de MeOH, proporcionando 1,66 g (30%) de ciclohexilsulfonamida en forma de un sólido de color blanco: 25 RMN 1H (CDCl3)  1,11-1,37 (m, 3H), 1,43-1,56 (m, 2H), 1,67-1,76 (m, 1H), 1,86-1,96 (m, 2H), 2,18-2,28 (m, 2H), 2,91 (tt, J = 12, 3,5 Hz, 1H), 4,70 (s a, 2H); RMN 13C (CDCl3)  25,04, 25,04, 26,56, 62,74; EM m/e 162 (M-1).

EJEMPLO 23

Preparación de Neopentilsulfonamida

30

Siguiendo el procedimiento para la preparación de ciclohexilsulfonamida, 49 ml (37 mmol) de cloruro de neopentil-magnesio (Alfa) 0,75 M en éter dietílico se convirtieron en 1,52 g (27%) de neopentilsulfonamida en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (CDCl3)  1,17 (s, 9H), 3,12 (s, 2H), 4,74 (s a, 2H); RMN 13C (CDCl3)  29,46, 31,51, 67,38; EM m/e 150 (M-1)-.

EJEMPLO 24 35

Preparación de ciclobutilcarbinilsulfonamida

Una solución de 12,3 g (83 mmol) de bromuro de ciclobutilcarbinilo (Aldrich) y 13,7 g (91 mmol) de yoduro

sódico en 150 ml de acetona se calentó a reflujo durante una noche y después se enfrió a temperatura ambiente. Los sólidos inorgánicos se retiraron por filtración y la acetona y el yoduro de ciclopropilcarbinilo (8,41 g, 46%) se retiraron por destilación a temperatura ambiente y 150 torr a 80ºC, respectivamente.

Una solución de 4,0 g (21,98 mmol) de yoduro de ciclobutil carbinilo en 30 ml de éter dietílico anhidro (éter dietílico) enfriado a -78ºC se canuló en una solución de 17 ml (21,98 mmol) de sec-butil litio 1,3 M en ciclohexanos y 5 la solución se agitó durante 5 minutos. En esta mezcla se canuló una solución de 3,0 g (21,98 mmol) de cloruro de sulfurilo recién destilado en 110 ml de hexanos enfriado a -78ºC, la mezcla se calentó a temperatura ambiente durante 1 hora y después se concentró cuidadosamente al vacío. Esta mezcla se disolvió de nuevo en éter dietílico, se lavó una vez con un poco de agua enfriada con hielo, se secó (MgSO4), se filtró y se concentró cuidadosamente. Esta mezcla se disolvió de nuevo en 30 ml de THF, se añadió gota a gota a 500 ml de NH3 saturado en THF y se 10 dejó en agitación durante una noche. La mezcla se concentró al vacío, dando un sólido en bruto de color amarillo y se recristalizó en la cantidad mínima de diclorometano en hexanos con 1-2 gotas de metanol, proporcionando 1,39 g (42%) de ciclobutil carbinilsulfonamida en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (CDCl3)  1,81-2,03 (m, 4H), 2,14-2,28 (m, 2H), 2,81-2,92 (m, 1H), 3,22 (d, J = 7 Hz, 2H), 4,74 (s a, 2H); RMN 13C (CDCl3)  19,10, 28,21, 30,04, 60,93; EM m/c 148 (M-1)-. 15

EJEMPLO 25

Preparación de ciclopropilcarbinilsulfonamida

Usando el procedimiento empleado para la preparación de ciclobutilcarbinilsulfonamida, ciclopropilcarbinilsulfonamida se preparó a partir de bromuro de ciclopropilcarbinilo (Aldrich) (véase también JACS 20 1981, pág. 442-445). RMN 1H (CDCl3)  0,39-0,44 (m, 2H), 0,67-0,76 (m, 2H), 1,13-1,27 (m, 1H), 3,03 (d, J = 7,3 Hz, 2H), 4,74 (s a, 2H); RMN 13C (CDCl3)  4,33, 5,61, 59,93; EM m/e 134 (M-1).

EJEMPLO 26

Preparación de 2-tiofenosulfonamida

25

Se preparó a partir de cloruro de 2-tiofenosulfonilo (adquirido en Aldrich) usando el método de Justus Liebigs Ann. Chem., 501, 1933, pág. 174-182.

EJEMPLO 27

Preparación de 4-bromobencenosulfonamida

30

Se preparó 4-bromofenilsulfonamida por tratamiento de cloruro de 4-bromosulfonilo disponible en el mercado con amonioaco saturado en THF.

EJEMPLO 28

Preparación de sal HCl de (1-(R)-amino-2-(S)-vinil-ciclopropanocarbonil)amida del ácido ciclopropanosulfónico

Etapa 1: Preparación de ácido 1(R)-terc-butoxicarbonilamino-2(S)-vinilciclopropanocarboxílico

A una solución de éster etílico del ácido 1(R)-terc-butoxicarbonilamino-2(S)-vinilciclopropanocarboxílico (3,28 g, 13,2 mmol) en THF (7 ml) y metanol (7 ml) se le añadió una suspensión de LiOH (1,27 g, 53,0 mmol) en 5 agua (14 ml). La mezcla se agitó durante una noche a temperatura ambiente y se inactivó con NaOH 1 N (15 ml) y agua (20 ml). La mezcla resultante se lavó con acetato de etilo (20 ml) y la fase orgánica se extrajo con 20 ml NaOH 0,5 N. Las fases acuosas combinadas se acidificaron con HCl 1 N hasta un pH 4 y se extrajo acetato de etilo (3 x 40 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron, produciendo el compuesto del título en forma de un sólido de color blanco (2,62 g, 87%). RMN 1H: 10 (DMSO-d6)  1,22-1,26 (m, 1H), 1,37 (s, 9H), 1,50-1,52 (m, 1H), 2,05 (c, J = 9 Hz, 1H), 5,04 (d, J = 10 Hz, 1H), 5,22 (d, J = 17 Hz, 1H), 5,64-5,71 (m, 1H), 7,18, 7,53 (s, NH (rotámeros), 12,4 (s a, 1H)); EM m/z 228 (M++H).

Etapa 2: Preparación de (1-(R)-terc-butoxicarbonilamino-2-(S)-vinilciclopropanocarbonil)-amida del ácido ciclopropanosulfónico

15

Una solución del producto de la Etapa 1 (2,62 g, 11,5 mmol) y CDI (2,43 g, 15,0 mmol) en THF (40 ml) se calentó a reflujo durante 50 minutos en una atmósfera de nitrógeno. La solución se enfrió a temperatura ambiente y se transfirió mediante una cánula a una solución de ciclopropilsulfonamida (1,82 g, 15,0 mmol) en THF (10 ml). A la solución resultante se le añadió DBU (2,40 ml, 16,1 mmol) y la agitación se continuó durante 20 horas. La mezcla se inactivó con HCl 1 N a pH 1 y se concentró THF al vacío. La suspensión se extrajo con acetato de etilo (2 x 50 ml) y 20 los extractos orgánicos combinados se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron. La purificación por recristalización en hexanos-acetato de etilo (1:1) proporcionó el compuesto del título (2,4 g) en forma de un sólido de color blanco. Las aguas madre se purificaron por una columna Biotage 40S (acetona eluida al 9% en diclorometano), dando un segundo lote del compuesto del título (1,1 g). Ambos lotes se combinaron (rendimiento total del 92%). RMN 1H (DMSO-d6)  0,96-1,10 (m, 4H), 1,22 (dd, J = 5,5, 9,5 Hz, 1H), 1,39 (s, 9H), 1,70 (t, J = 5,5 Hz, 1H), 2,19-25 2,24 (m, 1H), 2,90 (m, 1H), 5,08 (d, J = 10 Hz, 1H), 5,23 (d, J = 17 Hz, 1H), 5,45 (m, 1H), 6,85, 7,22 (s, NH (rotámeros); EM m/z 331 (M++H).

Etapa 3: Preparación de sal HCl de (1-(R)-amino-2-(S)-vinil-ciclopropanocarbonil)amida del ácido ciclopropanosulfónico

30

Una solución del producto de la Etapa 2 (3,5 g, 10,6 mmol) en diclorometano (35 ml) y TFA (32 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Los volátiles se retiraron al vacío, el residuo se suspendió en HCl 1 N en éter dietílico (20 ml) y se concentró al vacío. Este procedimiento se repitió una vez. La mezcla resultante se trituró a partir de pentano y se filtró, dando el compuesto del título en forma de un sólido higroscópico de color blanquecino

(2,60 g, 92%). RMN 1H: (DMSO-d6)  1,01-1,15 (m, 4H), 1,69-1,73 (m, 1H), 1,99-2,02 (m, 1H), 2,38 (c, J = 9 Hz, 1H), 2,92-2,97 (m, 1H), 5,20 (d, J = 11 Hz, 1H), 5,33 (d, J = 17 Hz, 1H), 5,52-5,59 (m, 1H), 9,17 (s a, 3H); EM m/z 231 (M++H).

EJEMPLO 29

Preparación de ácido (1S,4R,6S,14S,18R)-7-cis-14-terc-butoxicarbonilamino-18-hidroxi-2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo 5 [14.3.0.04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico, Ejemplo 29

Ejemplo 29

Etapa 1: Preparación de éster metílico del ácido 1-(2-(S)-terc-butoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4(R)-hidroxi-pirrolidina-2(S)-carboxílico 10

Una solución de ácido 2(S)-terc-butoxicarbonilamino-8-nonenoico (adquirido en RSP Amino Acids) (3,5 g, 12,9 mmol) en 200 ml de DCM se trató secuencialmente con clorhidrato de éster metílico del ácido 4(R)-hidroxipirrolidina-2(S)-carboxílico (2,15 g, 11,8 mmol), N-metil morfolina (4,25 ml, 38,6 mmol) y HATU (5,37 g, 14,1 mmol). La mezcla de reacción se agitó a ta en una atmósfera de N2 durante 3 días y después se concentró al vacío. 15 El residuo se repartió entre acetato de etilo y tampón (biftalato) a pH 4. La fase orgánica se lavó con NaHCO3 ac. sat., se secó (MgSO4) y se concentró al vacío, dando el producto en bruto. La cromatografía ultrarrápida (acetato de etilo al 50%/hexano a acetato de etilo al 100%) dio 4,7 g (~100%) de éster metílico del ácido 1-(2(S)-terc-butoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4(R)-hidroxi-pirrolidina-2(S)-carboxílico en forma de un aceite incoloro: RMN 1H (500 MHz, CD3OD)  1,33-1,50 (m, 8 H), 1,46 (s, 9 H), 1,57 (m, 1 H), 1,72 (m, 1 H) 2,08 (m, 2 H), 2,28 (m, 1 H), 3,72 20 (s, 3 H,) 3,75-3,87 (m, 2 H), 4,36 (m, 1 H), 4,51 (s a, 1 H), 4,57 (t, J = 8,2 Hz, 1 H), 4,95 (d, J = 10,4 Hz, 1 H), 5,01 (m, 1 H), 5,83 (m, 1 H); EM m/z 399 (M++1).

Etapa 2: Preparación de éster etílico del ácido 1-{[1-(2(S)-terc-butoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4(R)-hidroxi-pirrolidina-2(S)carbonil]-(1R)-amino}-2(S)-vinil-ciclopropanocarboxílico

25

Se disolvió éster metílico del ácido 1-(2(S)-terc-butoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4(R)-hidroxi-pirrolidina-2(S)-carboxílico (4,7 g, 11,8 mmol) en THF (80 ml), metanol (20 ml) y agua (40 ml). Se añadió hidróxido de litio en polvo (5,6 g, 233 mmol). La suspensión de color ligeramente amarillo se agitó a ta en una atmósfera de N2 durante 16 h y después se concentró al vacío. El residuo se repartió entre éter y agua. La fase de éter se descartó y la fase

acuosa se trató con HCl 1 N hasta que el pH fue de 4. Esta solución ácida se extrajo (3 x) con EtOAc. Los extractos de EtOAc combinados se secaron (MgSO4) y se concentraron al vacío, dando 4,36 g (96%) de ácido 1-(2(S)-terc-butoxicarbonilamino-8-nonenoil)-4(R)-hidroxi-pirrolidina-2(S)-carboxílico en forma de un sólido de color blanco. Después, este ácido se disolvió en 150 ml de DMF y se añadieron clorhidrato de éster etílico del ácido (1R,2S)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico (2,61 g, 13,6 mmol), N-metil morfolina (2,5 ml, 22,6 mmol) y HATU (5,2 g, 13,7 5 mmol). La mezcla de reacción se agitó a ta en una atmósfera de N2 durante 16 h y después se concentró al vacío. El residuo se repartió entre acetato de etilo y tampón (biftalato) a pH 4. La fase orgánica se lavó con NaHCO3 ac. sat., se secó (MgSO4) y se concentró al vacío, dando el producto en bruto. La cromatografía ultrarrápida (acetato de etilo al 60%-80%/hexano) dio 6,0 g (98%) de éster etílico del ácido 1-{[1-(2(S)-terc-butoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4(R)-hidroxi-pirrolidina-2(S)carbonil]-(1R)-amino}-2(S)-vinil-ciclopropanocarboxílico en forma de un sólido de color blanco: 10 RMN 1H (500 MHz, CD3OD)  1,25 (t, J = 7,2 Hz, 3 H), 1,33-1,80 (m, 10 H), 1,46 (s, 9 H), 2,09 (m, 3 H), 2,25 (m, 2 H), 3,76 (m, 2 H), 4,14 (m, 2 H), 4,27 (dd, J = 8,5, 5,2 Hz, 1 H), 4,50 (m, 2 H), 4,94 (d, J = 10, Hz, 1 H), 5,01 (dd, J = 17,1, 1,8 Hz, 1 H), 5,11 (dd, J = 10,4, 1,8 Hz, 1 H), 5,30 (d, J = 15,6 Hz, 1 H), 5,80 (m, 2 H), 8,57 (s, 1 H); EM m/z 522 (M++1).

Etapa 3: Preparación de éster etílico del ácido (1S,4R,6S,14S,18R)-7-cis-14-terc-butoxicarbonilamino-18-hidroxi-15 2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico

Una solución de éster etílico del ácido 1-{[1-(2(S)-terc-butoxicarbonil-amino-non-8-enoil)-4(R)-hidroxi-pirrolidina-2(S)carbonil]-(1R)-amino}-2(S)-vinilciclopropano-carboxílico (800 mg, 1,53 mmol) en 2 l de cloruro de metileno se lavó abundantemente con N2 durante 0,5 h. Después, se añadió dicloruro de triciclohexilfosfina[1,3-20 bis(2,4,6-trimetil-fenil)-4,5-dihidroimidazol-2-ilideno] [bencilideno]-rutenio (IV) (Strem) (64 mg, 0,075 mmol) y la mezcla se lavó abundantemente con N2 durante 10 min más. La solución homogénea de color naranja claro se calentó a reflujo durante 2 h, dando una solución de color naranja oscuro. La mezcla de reacción se enfrió a ta y se concentró al vacío, dando un aceite de color naranja. La cromatografía ultrarrápida (acetato de etilo) dio 460 mg (61%) de éster etílico del ácido (1S,4R,6S,14S,18R)-7-cis-14-terc-butoxicarbonilamino-18-hidroxi-2,15-dioxo-3,16-25 diazatriciclo[14.3.0.04,6]-nonadec-7-eno-4-carboxílico en forma de un sólido de color gris. RMN 1H (500 MHz, CDCl3)  1,19 (t, J = 7,2 Hz, 3 H), 1,42 (s, 9 H), 1,22-1,8 (m, 8H), 1,87 (m, 2 H), 2,03-2,22 (m, 4 H), 2,63 (m, 1 H), 3,65 (m, 1 H), 4,09 (m, 3 H), 4,45 (m, 1 H), 4,56 (s, 1 H), 4,82 (m, 1 H), 5,23 (m, 1 H), 5,51 (s, 1 H), 7,16 (s, 1 H); EM m/z 494 (M++1).

Etapa 4: Ácido (1S,4R,6S,14S,18R)-7-cis-14-terc-butoxicarbonilamino-18-hidroxi-2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo 30 [14.3.0.04,6]-nonadec-7-eno-4-carboxílico

A una solución de éster etílico del ácido (1S,4R,6S,14S,18R)-7-cis-14-terc-butoxicarbonilamino-18-hidroxi-2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo[14.3.0.04,6]-nonadec-7-eno-4-carboxílico (493 mg, 1,0 mmol) en THF (4 ml), metanol (1 ml) y agua (2 ml), se añadió hidróxido de litio en polvo (480 mg, 20 mmol) y la suspensión de color amarillo claro se 35 agitó a ta en una atmósfera de N2 durante 16 h. Después, la mezcla se concentró al vacío y el residuo se repartió entre éter y agua. La fase de éter se descartó y la fase acuosa se trató con HCl 1 N hasta un pH 4. Esta solución ácida se extrajo tres veces con EtOAc. Los extractos de EtOAc combinados se secaron (MgSO4) y se concentraron al vacío, dando 460 mg (98%) del Ejemplo 18, ácido (1S,4R,6S,14S,18R)-7-cis-14-terc-butoxicarbonilamino-18-

hidroxi-2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo[14.3.0.04,6]-nonadec-7-eno-4-carboxílico en forma de un sólido de color gris. RMN 1H (500 MHz, CD3OD)  ppm 1,26 (t, J = 7,2 Hz, 3 H), 1,35-1,52 (m, 15 H), 1,57-1,68 (m, 3 H), 1,79 (m, 1 H), 2,04 (m, 1 H), 2,16-2,41 (m, 3 H), 3,80 (dd, J = 10,7, 4,3 Hz, 1 H), 3,88 (m, 1 H), 4,38 (dd, J = 8,9, 3,1 Hz, 1 H), 4,55 (m, 2 H), 5,39 (t, J = 9,8 Hz, 1 H), 5,58 (m, 1 H); EM m/z 466 (M++1).

EJEMPLO 30 5

Preparación de éster terc-butílico del ácido (4-ciclopropanosulfonilaminocarbonil-18-hidroxi-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-en-14-il)-carbámico

Etapa 1: Preparación de éster etílico del ácido 1-{[1-(2-terc-butoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-pirrolidina-2-carbonil]amino}-2-vinilciclopropanocarboxílico 10

A una mezcla de éster etílico del ácido 1-{[1-(2(S)-terc-butoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4(R)-hidroxi-pirrolidina-2(S)carbonil]-(1R)-amino}-2(S)-vinil-ciclopropanocarboxílico (1,5 g, 2,87 mmol) en 10 ml de DMF se le añadieron imidazol (0,25 g, 3,67 mmol) y cloruro de terc-butil-dimetilsililo (516 mg, 3,44 mmol). La mezcla se agitó a ta durante dos días. Después, la mezcla de reacción se concentró al vacío y el residuo se disolvió en acetato de 15 etilo. Esta solución se lavó con agua, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró al vacío, obteniendo un sólido en bruto. La purificación por cromatografía ultrarrápida (eluyendo con acetato de etilo al 20% en hexano) dio 1,43 g (78%) de éster etílico del ácido 1-{[1-(2-terc-butoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4-(terc-butildimetil-silaniloxi)-pirrolidina-2-carbonil]-amino}-2-vinilciclopropanocarboxílico en forma de un sólido de color blanco.

RMN 1H (300 MHz, CD3OD)  0,10 (s,6 H), 0,89 (s, 9 H), 1,22 (m, 3 H), 1,31-1,48 (m, 16 H), 1,50-1,75 (m, 3 20 H), 2,06 (m, 3 H), 2,11-2,33 (m, 2 H), 3,70 (m, 2 H), 4,03-4,19 (m, 2 H), 4,21 (m, 1 H), 4,45 (t, J = 7,87 Hz, 1 H), 4,59 (m, 1 H), 4,91 (d, J = 9,15 Hz, 1 H), 4,98 (d, J = 17,20 Hz, 1 H), 5,08 (dd, J = 10,25, 1,83 Hz, 1 H), 5,27 (dd, J = 17,38, 1,65 Hz, 1 H), 5,65-5,87 (m, 2 H); EM m/z 636 (M++1).

Etapa 2: Preparación de ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico, éster etílico 25

A una solución de éster etílico del ácido 1-{[1-(2-terc-butoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4-(terc-butildimetil-silaniloxi)-pirrolidina-2-carbonil]-amino}-2-vinilciclopropanocarboxílico (1,63 g, 2,56 mmol) en 640 ml de cloruro de metileno se le añadieron 215 mg (0,26 mmol) de dicloruro de triciclohexilfosfina[1,3-bis(2,4,6-tri[bencilideno]rutenio (IV). La mezcla se calentó a reflujo durante 15 min. El residuo se concentró al vacío y después se purificó por cromatografía ultrarrápida eluyendo con acetato de etilo al 30%/hexano. Para decolorar adicionalmente la muestra, 5 el producto en bruto se cromatografió una segunda vez eluyendo con éter al 50% en hexano, dando 1,5 g (96%) de éster etílico del ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(terc-butildimetil-silaniloxi)-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (500 MHz, CD3Cl)  0,06 (s, 3 H), 0,07 (s, 3 H), 0,86 (s, 9 H), 1,18-1,24 (m, 6 H), 1,34-1,64 (m, 14 H), 1,86-1,96 (m, 3 H), 2,02-2,09 (m, 1 H), 2,11-2,17 (m, 1 H), 2,19-2,28 (m, 1 H), 2,57-2,63 (m, 1 H), 3,50-3,54 (m, 1 H), 3,71 (dd, J = 10,22, 6,26 Hz, 1 H), 10 4,06-4,17 (m, 2 H), 4,52-4,58 (m, 2 H), 4,75 (d, J = 8,55 Hz, 1 H), 5,21 (t, J = 9,92 Hz, 1 H), 5,35 (d, J = 7,63 Hz, 1 H), 5,45-5,50 (m, 1 H), 6,94 (s,1 H); EM m/z 608 (M++1).

Etapa 3: Preparación de ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico

15

A una solución de éster etílico del ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico (1,5 g, 2,47 mmol) en un sistema de disolvente mixto de THF (4 ml), metanol (1 ml) y agua (2 ml) y se le añadió hidróxido de litio monohidrato en polvo (1,0 g, 50 mmol). La suspensión de color amarillo claro se agitó a ta en una atmósfera de N2 durante 4 h. Después, la mezcla se concentró al vacío, y el residuo se repartió entre éter y agua. La fase de éter se descartó, y la fase acuosa se 20 trató con HCl 1 N hasta que alcanzó un 4. Esta solución ácida se extrajo con EtOAc (3 x). Los extractos de EtOAc combinados se secaron (MgSO4) y se concentraron al vacío, dando 1,2 g (84%) de ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico en forma de un sólido de color blanquecino. RMN 1H (300 MHz, CD3OD) 0,12 (s, 6 H), 0,89 (s, 9 H), 1,23-1,64 (m, 17 H), 1,70-1,87 (m, 1 H), 1,90-2,49 (m, 6 H), 3,70-3,80 (m, 1 H), 3,83-3,90 (m, 1 H), 4,28-4,36 (m, 1 H), 25 4,47-4,55 (m, 1 H), 4,65 (s, 1 H), 5,30-5,39 (m, 1 H), 5,53-5,62 (m, 1 H); EM m/z 580 (M++1).

Etapa 4: Preparación de éster terc-butílico del ácido [18-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-4-ciclopropanosufonilaminocarbonil-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14.3.0.04,6]nonadec-70-en-14-il]-carbámico

Se disolvió ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-2,15-dioxo-3,16-diaza-30 triciclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico (500 mg, 0,86 mmol) en 25 ml de THF y se trató con CDI (180 mg, 1,12 mmol). (Se tuvo cuidado para evitar la humedad usando cristalería secada al horno y manteniendo una atmósfera de N2 seco). Después de calentar a reflujo la mezcla de reacción durante 2 h, se enfrió a ta y se trató secuencialmente con ciclopropilsulfonamida (135 mg, 1,12 mmol) y DBU (170 mg, 1,12 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 4 h a ta y el THF se retiró por evaporación rotatoria. El residuo se repartió entre acetato de 35 etilo y tampón a pH 4. La fase orgánica se secó (MgSO4) y se concentró al vacío, dando el producto en bruto. Después, se purificó por cromatografía ultrarrápida (eluyendo con acetato de etilo al 33% en hexano), dando 300 mg (51%) de éster terc-butílico del ácido [18-(terc-butildimetil-silaniloxi)-4-ciclopropanosulfonilaminocarbonil-2,15-dioxo-

3,16-diazatriciclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (300 MHz, CD3OD)  1H 0,07 (s, 3 H), 0,08 (s, 3 H), 0,85 (s, 9 H), 0,87-1,49 (m, 21 H), 1,73-1,95 (m, 3 H), 2,08-2,16 (m, 1 H), 2,25-2,36 (m, 2 H), 2,42-2,56 (m, 1 H), 2,85-2,93 (m, 1 H), 3,65-3,74(dd, J = 10,61, 3,66 Hz, 1 H), 3,89 (d, J = 10,25 Hz, 1 H), 4,34 (m, J = 9,70, 9,70 Hz, 1 H), 4,43 (t, J = 7,87 Hz, 1 H), 4,57 (s, 1 H), 4,94-5,01 (m, 1 H), 5,10 (d, J = 8,78 Hz, 1 H), 5,66-5,75 (m, 1 H), 6,55 (s, 1 H), 10,13 (s, 1 H); EM m/z 683 (M++1). 5

Etapa 5: Preparación de Ejemplo 19, éster terc-butílico del ácido (4-ciclopropanosulfonilaminocarbonil-18-hidroxi-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo [14.3.0.04,6]nonadec-7-en-14-il)-carbámico

A una mezcla de éster terc-butílico del ácido [18-(terc-butil-dimetilsilaniloxi)-4-ciclopropanosulfonilaminocarbonil-2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico (330 mg, 10 0,48 mmol) en 25 ml de THF se le añadió fluoruro tetrabutilamonio (150 mg, 0,54 mmol). La mezcla de reacción se agitó a ta durante 18 h y después el THF se retiró por evaporación rotatoria. El residuo se repartió entre acetato de etilo y agua. La fase orgánica se secó (MgSO4) y se concentró al vacío, dando el producto en bruto. Después, se purificó triturando con hexano para producir 200 mg (73%) de éster terc-butílico del ácido (4-ciclopropanosulfonilaminocarbonil-18-hidroxi-2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-en-14-il)-carbámico, 15 Ejemplo 19, en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (500 MHz, CD3Cl)  1,87-1,64 (m, 21 H), 1,70-1,98 (m, 3 H), 2,15-2,56 (m, 5 H), 2,85-2,94 (m, 1 H), 3,71 (d, J = 13,91 Hz, 1 H), 4,10-4,26 (m, 2 H), 4,51 (t, J = 7,87 Hz, 1 H), 4,62 (s, 1 H), 4,98 (m, 1 H), 5,06 (d, J = 8,78 Hz, 1 H), 5,64-5,71 (m, 1 H), 6,72 (s, 1 H), 10,24 (s, 1 H); EM m/z 569 (M++1).

Los siguientes intermedios de alcohol macrocíclico se prepararon empleando los procedimientos que se 20 han descrito en los ejemplos 29 y 30:

Los siguientes intermedios de alcohol macrocíclico pueden prepararse empleando los procedimientos que se han descrito en los ejemplos 29 y 30:

EJEMPLO 31

Preparación de Ejemplo 31, ácido 2(S)-terc-butoxicarbonilamino-3-pent-4-enilsulfanilpropiónico

Etapa 1: A una solución de N-Boc-cisteína metil éster (3,36 g, 0,014 mol) en metanol (166 ml) a TA se le 5 añadieron trietilamina (10,8 ml) y 1-bromopent-4-eno (3,19 g, 21 mmol, 1,5 equivalentes) y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante una noche. Después, la mezcla se concentró al vacío y la mezcla residual resultante se purificó usando cromatografía ultrarrápida (gradiente de hexano, acetato de etilo), proporcionando 1,76 g (41%) del tioéter deseado. RMN 1H (500 MHz, CDCl3)  1,43 (s, 9H), 1,64 (m, 2H), 2,11 (m, 2H), 2,51 (m, 2H), 2,95 (m, 2H), 3,75 (s, 3H), 4,51 (m, 1H), 4,95-5,03 (m, 2H), 5,34 (m, 1H), 5,80 (1H, m); EM m/z 304(M++1). 10

Etapa 2: El producto de tioéter de la etapa 1 (9,51 g, 31,4 mmol) se añadió a una mezcla de LiOH 1 M en agua (200 ml) y THF (200 ml) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante una noche. Después, la mezcla de reacción se acidificó usando ácido clorhídrico 1 N y la mezcla resultante se extrajo varias veces con

acetato de etilo. Los extractos se combinaron, se secaron sobre sulfato de magnesio y se concentraron al vacío, proporcionando el ácido deseado, Ejemplo 20, que se usó como tal en la siguiente reacción.

EJEMPLO 32

Preparación de Ejemplo 32, N-terc-Butoxicarbonil-3-(4-penteniltio)-L-valina

5

Etapa 1: Preparación de N-terc-butoxicarbonil-3-(4-penteniltio)-L-valina, éster metílico

A una solución de 7,12 g (48 mmol, 1,0 equiv.) de L-penicilamina en 100 ml de 1,4-dioxano y 25 ml de agua a temperatura ambiente se le añadieron 9,60 ml (96 mmol, 2,0 equiv.) de una solución acuosa 10 N de hidróxido sódico seguido de la adición gota a gota de 12,00 ml (101 mmol, 2,1 equiv.) de 5-bromo-1-penteno durante varios 10 minutos. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 68 horas. En este punto, se añadieron 12,50 g (57 mmol, 1,2 equiv.) de dicarbonato de di-terc-butilo y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 6 horas más. La mezcla se concentró al vacío y el residuo se disolvió en agua. La mezcla acuosa se lavó con éter dietílico, se ajustó a pH 3 empleando ácido clorhídrico 1 N y después se extrajo con acetato de etilo. Los extractos combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtraron y se concentraron 15 al vacío. El producto en bruto (12,20 g) se disolvió en 120 ml de dimetilsulfóxido anhidro. A esta solución se le añadieron 10,50 g (76 mmol) de carbonato potásico y 4,70 ml (76 mmol) de yodometano y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla de reacción se diluyó con agua y se extrajo con acetato de etilo. Los extractos combinados se lavaron con agua (2 x) y salmuera, se secaron sobre sulfato sódico anhidro, se filtraron y se concentraron al vacío. La cromatografía en columna sobre gel de sílice (elución: acetato de etilo al 2-20 10%/hexano) proporcionó 8,54 g de N-terc-butoxicarbonil-3-(4-penteniltio)-L-valina, éster metílico en forma de un aceite incoloro. RMN (300 MHz, CDCl3);  5,76 (d de d de t, 1 H, J = 17,2, 10,3, 6,6 Hz), 5,35 (d a, 1 H, J = 9,0 Hz), 5,05-4,94 (m, 2 H), 4,27 (d a, 1 H, J = 9,0 Hz), 3,73 (s, 3 H), 2,52 (m, 2 H), 2,13 (cuad., 2 H, J = 7,3 Hz), 1,61 (quint., 2 H, J = 7,3 Hz), 1,43 (s, 9 H), 1,35 (s, 3 H), 1,33 (s, 3 H).

Etapa 2: Preparación de Ejemplo 32, N-terc-Butoxicarbonil-3-(4-penteniltio)-L-valina 25

A una solución de 8,52 g (25,7 mmol) de N-terc-butoxicarbonil-3-(4-penteniltio)-L-valina, éster metílico en 200 ml de tetrahidrofurano a temperatura ambiente se le añadió una solución de 1,10 g (26,2 mmol) de hidróxido de litio monohidrato en 50 ml de agua. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 65 horas. Después, a la mezcla de reacción se le añadieron 28 ml de ácido clorhídrico 1,00 N. La mezcla se diluyó con éter 30 dietílico, se lavó con agua (3 x) y salmuera, se secó sobre sulfato sódico anhidro, se filtró y se concentró al vacío, proporcionando 8,10 g de N-terc-butoxicarbonil-3-(4-penteniltio)-L-valina en forma de un aceite incoloro. RMN (300 MHz, CDCl3):  5,75 (d de d de t, 1 H, J = 17,2, 10,3, 6,6 Hz), 5,40 (s a, 1 H), 5,05-4,94 (m, 2 H), 4,28 (s a, 1 H), 2,56 (m, 2 H), 2,13 (cuad., 2 H, J = 7,3 Hz), 1,63 (quint., 2 H, J = 7,3 Hz), 1,44 (s, 9 H), 1,39 (s, 3 H), 1,37 (s, 3 H).

EJEMPLO 33 35

Preparación de Ejemplo 33, ácido 5-aliloxi-2(S)-(terc-butiloxicarbonilamino)pentanoico

Etapa 1: Preparación de pirrolidin-5-ona-2(S)-carboxilato de isopropilo

Una solución de ácido L-piroglutámico (Aldrich, 25,0 g, 195 mmol) y ácido paratoluenosulfónico mono hidrato (3,71 g, 19,5 mmol) se calentó a reflujo en isopropanol (40 ml) en una atmósfera de nitrógeno durante 6 5 horas usando un purgador de variación Dean-Stark (el condensado regresó a través de un extracto Soxhlet con tamices moleculares de 4 Å). Después de enfriar a temperatura ambiente, la reacción se diluyó con éter, se lavó con bicarbonato sódico acuoso saturado y después NaCl acuoso saturado, se secó (MgSO4) y se evaporó, dando un jarabe incoloro. Cristalizó después de un periodo de reposo. La trituración del residuo cristalino en hexano proporcionó 31,9 g (96%) de pirrolidin-5-ona-2(S)-carboxilato de isopropilo en forma de prismas de color blanco: 10 RMN 1H (300 MHz, Cloroformo-D)  6,35 (s a, 1 H), 5,04 (sept. 1 H, J = 6,2 Hz), 4,18 (dd, 1 H, J = 8,4, 5,3 Hz), 2,51-2,28 (m, 3 H), 2,27-2,12 (m, 1 H), 1,24 (d, 6 H, J = 6,2 Hz). CLEM m/z 172 (M+H)+.

Etapa 2: Preparación de 1-(terc-butoxicarbonil)-pirrolidin-5-ona-2(S)-carboxilato de isopropilo

Una solución de pirrolidin-5-ona-2(S)-carboxilato de isopropilo (producto de la etapa 26A, 31,9 g, 188 15 mmol), dicarbonato de di-terc-butilo (48,6 g, 225 mmol) y DMAP (2,30 g, 8,8 mmol) en acetonitrilo (300 ml) se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera de N2 durante 30 minutos. La reacción se evaporó a aproximadamente 100 ml, se diluyó con éter, se lavó con HCl 1 N, después con NaCl acuoso saturado, se secó (MgSO4) y se evaporó, dando 1-(terc-butoxicarbonil)pirrolidin-5-ona-2(S)carboxilato de isopropilo en forma de un aceite de color amarillo claro, 50,1 g (99%): RMN 1H (300 MHz, Cloroformo-D)  5,06 (sept. 1 H, J = 6,2 Hz), 4,53 (dd, 1 H, J = 9,5, 2,9 Hz), 20 2,66-2,40 (m, 2H), 2,36-2,22 (m, 1 H), 2,03-1,93 (m, 1 H), 1,47 (s, 9 H), 1,26 (d, 3 H, J = 6,2 Hz), 1,24 (d, 3 H, J = 6,2 Hz). CLEM m/z 272 (M+H)+.

Etapa 3: Preparación de 2(S)-(terc-butoxicarbonilamino)-5-hidroxipentanoato de isopropilo

A una solución de 1-(terc-butoxicarbonil)pirrolidin-5-ona-2(S)-carboxilato de isopropilo (producto de la etapa 25 26B, 49,5 g, 183 mmol) en metanol (300 ml) se le añadió borohidruro sódico (10,0 g, 263 mmol) en porciones de ~1 g durante 1,5 horas. La reacción se agitó en una atmósfera de nitrógeno durante 10 minutos más. Se diluyó con agua, se extrajo con éter, las fracciones orgánicas combinadas se lavaron con NaCl acuoso saturado, se secaron (MgSO4) y se evaporaron, dando un aceite de color amarillo claro. La cromatografía ultrarrápida (gel de sílice, acetato de etilo al 20-30%/hexano) proporcionó 31,8 g (64%) de 2(S)-(terc-butoxicarbonilamino)-5-hidroxipentanoato 30

de isopropilo en forma de un jarabe incoloro: RMN 1H (300 MHz, Cloroformo-D)  5,16 (d a, 1 H, J = 7,3 Hz), 5,03 (sept., 1 H, J = 6,2 Hz), 4,28 (d a, 1 H, J = 6,2 Hz), 3,67 (br dd, J = 10,2, 5,5 Hz), 1,94-1,79 (m, 2 H), 1,76-1,67 (m, 1 H), 1,66-1,56 (m, 2 H), 1,43 (s, 9 H), 1,25 (d, 3 H, J = 6,2 Hz), 1,23 (d, 3 H, J = 6,2 Hz). CLEM m/z 276 (M+H)+.

Etapa 4: Preparación de 5-aliloxi-2(S)-(terc-butoxicarbonilamino)pentanoato de isopropilo

5

Una mezcla desgasificada de 2(S)-(terc-butoxicarbonilamino)-5-hidroxipentanoato de isopropilo (producto de la etapa 26C, 17,6 g, 63,9 mmol), metil carbonato de alilo (24,0 ml, 213 mmol), Pd2(dba)3 (1,62 g, 1,78 mmol) y BINAP (4,42 g, 7,10 mmol) en THF (150 ml) se calentó a reflujo en una atmósfera de nitrógeno durante 3 horas. Después de enfriar a temperatura ambiente, la reacción se diluyó con éter, se filtró a través de celite y se evaporó, dando un jarabe de color pardo oscuro. La cromatografía ultrarrápida del residuo (gel de sílice, éter al 30%/hexano) 10 proporcionó 5-aliloxi-2(S)-(terc-butoxicarbonilamino)pentanoato de isopropilo en forma de un aceite viscoso incoloro, 16,3 g (81%): RMN 1H (300 MHz, Cloroformo-D)  5,88 (ddt, 1 H, 17,4, 10,4, 5,5), 5,28 (m, 1 H), 5,22-5,11 (m, 1 H), 5,02 (sept., 1 H, J = 6,2 Hz), 4,21 (t a, 1 H, J = 6,7 Hz), 3,94 (dt, 2 H, J = 5,9, 1,5 Hz), 3,42 (t, 2 H, J = 5,9 Hz), 1,90-1,82 (m, 1 H), 1,75-1,57 (m, 3 H), 1,42 (s, 9 H), 1,21 (d, 3 H, J = 6,2 Hz), 1,19 (d, 3 H, J = 6,2 Hz). CLEM m/z 316 (M+H)+. 15

Etapa 5: Preparación de Ejemplo 33, ácido 5-aliloxi-2(S)-(terc-butoxicarbonilamino)pentanoico

Una mezcla de 5-aliloxi-2(S)-(terc-butoxicarbonilamino)pentanoato de isopropilo (producto de la etapa 26D, 16,1 g, 51,1 mmol) e hidróxido de litio hidrato (4,19 g, 102 mmol) en THF/agua (100 ml/20 ml) se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera de nitrógeno durante 16 horas. La reacción se diluyó con agua, se lavó con éter, el pH 20 de la fracción acuosa se ajustó a ~4, se extrajo con éter, las fracciones orgánicas combinadas se lavaron con NaCl saturado, se secaron (MgSO4) y se evaporó, dando ácido 5-aliloxi-2(S)-(terc-butoxicarbonilamino)pentanoico en forma de un jarabe de color ligeramente amarillo: RMN 1H (300 MHz, Cloroformo-D)  5,89 (ddt, 1 H, J = 17,4, 10,4, 5,5), 5,25 (dd, 1 H, J = 17,4, 1,6 Hz), 5,17 (dd, 1 H, J = 10,4, 1,6 Hz), 4,30 (d a, 1 H, J = 6,2), 3,96 (dt, 2 H, J = 5,9, 1,5 Hz), 3,46 (t, 2 H, J = 5,9 Hz), 1,96-1,86 (m, 1 H), 1,85-1,77 (m, 1 H), 1,75-1,64 (m, 2 H), 1,43 (s, 9 H). CLEM m/z 25 274 (M+H)+.

EJEMPLO 34

Procedimiento General para la Preparación de Ejemplo 34

El Ejemplo 23 se preparó añadiendo una solución de DMF de treonina protegida con N-tritilo a una solución de DMF de hidruro sódico enfriado a -15ºC. La mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos a -15ºC después de que se añadiera 5-bromo-1-penteno y la mezcla resultante se calentó a -5ºC. La mezcla de reacción se mantuvo a -5ºC durante 3 días, tiempo después del cual la reacción se interrumpió mediante la adición de HCl acuoso 1 N y tratamiento usando procedimientos de extracción convencional como se ha descrito anteriormente. El Ejemplo 23 se 5 obtuvo en forma pura mediante procedimientos de cromatografía convencional.

EJEMPLO 35:

Preparación de Ejemplo 35, N-terc-Butoxicarbonil-O-(4-pentenil)-L-serina

Etapa 1: Preparación de N-terc-Butoxicarbonil-O-(4-pentenil)-L-serina, éster metílico 10

A una solución de 10,26 g (50 mmol, 1,0 equiv.) de N-terc-butoxicarbonil-L-serina en 500 ml de dimetil-sulfóxido anhidro a temperatura ambiente se le añadieron 2,00 g (50 mmol, 1,0 equiv.) de hidruro sódico al 60% en aceite mineral. Esta mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 0,5 horas hasta que el desprendimiento de gas cesó. A la solución resultante se le añadieron 6,00 ml (50 mmol, 1,0 equiv.) de 5-bromo-1-penteno seguido 15 inmediatamente por 2,00 g más (50 mmol, 1,0 equiv.) de hidruro sódico al 60% en aceite mineral. Después, la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla se diluyó con 2000 ml de agua, se ajustó a pH 3-4 mediante la adición de 50 ml de ácido clorhídrico 1,00 N y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con agua (2 x) y salmuera, se secó sobre sulfato sódico anhidro, se filtró y se concentró al vacío. Para eliminar el aceite mineral residual, el material resultante se disolvió en una solución acuoso hidróxido sódico 20 diluido. Esta solución acuosa se lavó con hexano, después se ajustó a pH 4 empleando ácido clorhídrico y se extrajo con acetato de etilo. El extracto se lavó con agua (2 x) y salmuera, se secó sobre sulfato sódico anhidro, se filtró y se concentró al vacío.

El producto en bruto (7,70 g) se disolvió en 100 ml de dimetilsulfóxido anhidro. A esta solución se añadieron 7,80 g (56 mmol) de carbonato potásico y 3,50 ml (56 mmol) de yodometano, y la mezcla resultante se agitó a 25 temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla de reacción se diluyó con agua y se extrajo con acetato de etilo. Los extractos combinados se lavaron con agua (2 x) y salmuera, se secaron sobre sulfato sódico anhidro, se filtraron y se concentraron al vacío. La cromatografía en columna sobre gel de sílice (elución: acetato de etilo al 2-10%/hexano) proporcionó 6,70 g de N-terc-butoxicarbonil-O-(4-pentenil)-L-serina, éster metílico en forma de un aceite incoloro. RMN (300 MHz, CDCl3):  5,78 (d de d de t, 1 H, J = 17,2, 10,2, 6,6 Hz), 5,34 (d a, 1 H, J = 8,0 Hz), 30 5,03-4,92 (m, 2 H), 4,40 (m, 1 H), 3,81 (d de d, 1 H, J = 9,5, 2,9 Hz), 3,74 (s, 3 H), 3,61 (d de d, 1 H, J = 9,5, 3,5 Hz), 3,42 (m, 2 H), 2,06 (cuad., 2 H, J = 7,3 Hz), 1,61 (quint., 2 H, J = 7,3 Hz), 1,44 (s, 9 H).

Etapa 2: Preparación de Ejemplo 35, N-terc-Butoxicarbonil-O-(4-pentenil)-L-serina

A una solución de 6,65 g (23 mmol) de N-terc-butoxicarbonil-O-(4-pentenil)-L-serina, éster metílico en 500 35 ml de tetrahidrofurano a temperatura ambiente se le añadió una solución de 1,95 g (46 mmol) de hidróxido de litio monohidrato en 100 ml de agua. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 40 horas. Después, a la mezcla de reacción se le añadieron 46 ml de ácido clorhídrico 1,00 N. La mezcla se diluyó con acetato de etilo, se lavó con agua (3 x) y salmuera, se secó sobre sulfato sódico anhidro, se filtró y se concentró al vacío,

proporcionando 6,30 g de N-terc-butoxicarbonil-O-(4-pentenil)-L-serina en forma de un aceite incoloro. RMN (300 MHz, CDCl3):  5,77 (d de d de t, 1 H, J = 17,2, 10,2, 6,6 Hz), 5,37 (d a, 1 H, J = 8,0 Hz), 5,03-4,92 (m, 2 H), 4,42 (m, 1 H), 3,87 (d de d, 1 H, J = 9,5, 2,6 Hz), 3,63 (d de d, 1 H, J = 9,5, 4,0 Hz), 3,45 (t, 2 H, J = 6,6 MHz), 2,07 (cuad., 2 H, J = 7,3 Hz), 1,64 (quint., 2 H, J = 7,3 Hz), 1,44 (s, 9 H).

EJEMPLO 36 5

Preparación de Ejemplo 36, ácido (S)-4-aliloxi-2-(terc-butoxicarbonilamino)butírico

A una mezcla de hidruro sódico (913 mg, 22,8 mmol) en DMF a 0ºC se le añadió N-t-Boc-L-homoserina (2 g, 9,13 mmol). Esta mezcla de reacción se agitó a 0ºC durante 15 min y después se añadió bromuro de alilo (1,38 g, 11,4 mmol). La mezcla se calentó hasta la ta y se agitó durante 2 h. Después, se concentró al vacío. El residuo se 10 diluyó con agua y se lavó secuencialmente con hexano y éter. Las fases orgánicas se descartaron y la fase acuosa se ajustó cuidadosamente a pH 3 con HCl 1 N. Esta solución acuosa ácida se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se secó (MgSO4) y se concentró al vacío, produciendo 2,2 g (93%) de ácido (S)-4-aliloxi-2-(terc-butoxicarbonilamino)butírico en forma de un aceite incoloro. RMN 1H (300 MHz, CD3OD)  1,42 (s, 9 H), 1,80-1,90 (m, 1 H), 2,04-2,16 (m, 1 H), 3,50-3,54 (m, 2 H), 3,97 (d, J = 4,39 Hz, 2 H), 4,23 (dd, J = 8,78, 4,39 Hz, 1 H), 5,15 (d, 15 J = 10,25 Hz, 1 H), 5,26 (dd, J = 17,38, 1,65 Hz, 1 H), 5,84-5,97 (m, 1 H).

EJEMPLO 37

Preparación de Ejemplo 37, ácido (S)-2-(terc-butoxicarbonil)-3-(2-nitro-N-(pent-4-enil)fenilsulfonamido)propanoico

Etapa 1: Preparación de 3-amino-2(S)-(terc-butoxicarbonilamino)propanoato de metilo 20

A una mezcla de i (Boc-DAP-OH) (3,0 g 14,7 mmol) en 50 ml de cloruro de metileno se le añadieron 5 ml de metanol. A esta solución se le añadió lentamente (trimetilsilil)diazometano (2 M en éter, 7,9 ml, 15,8 mmol). La mezcla se agitó a ta durante 2 h hasta que todo el sólido se disolvió y la solución se volvió de color amarillo. Después, se concentró, produciendo 3,2 g (99%) de 3-amino-2(S)-(terc-butoxicarbonilamino)propanoato de metilo ii 25 en forma de un aceite incoloro. RMN 1H (CD3OD, 300 MHz)  1,46 (s, 9 H), 2,82-3,00 (m, 2 H), 3,71 (s, 3 H), 4,14 (s a, 1 H).

Preparación de 2(S)-(terc-butoxicarbonilamino)-3-(2-nitrofenilsulfonamido)propanoato de metilo iii:

A una mezcla de 3-amino-2(S)-(terc-butoxicarbonilamino)propanoato de metilo ii (1,6 g, 7,3 mmol) en DCM (50 ml) se le añadieron DIPEA (1,64 ml, 9,4 mmol) y cloruro de 2-nitrobenceno sulfonilo (1,62 g, 7,3 mmol). La mezcla se agitó a ta durante 2 h. Después, se concentró, se disolvió en acetato de etilo, que después se lavó con bicarbonato sódico sat. y salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después, se filtró y se concentró, 5 produciendo 2,9 g (98%) de 2 (S)-(terc-butoxicarbonilamino)-3-(2-nitrofenilsulfonamido)propanoato de metilo iii en forma de una espuma de color amarillo. RMN 1H (CD3OD, 300 MHz)  1,41 (s, 9 H), 3,36-3,51 (m, 2 H), 3,71 (s, 3 H), 4,22 (m, 1 H), 7,80-7,90 (m, 3 H), 8,07-8,10 (m, 1 H).

Preparación de 2(S)-(terc-butoxicarbonilamino)-3-(2-nitro-N-(pent-4-enil)fenilsulfonamido)propanoato de metilo iv:

10

A una mezcla de 2(S)-(terc-butoxicarbonilamino)-3-(2-nitrofenilsulfonamido)propanoato de metilo iii (150 mg, 0,37 mmol) en 3 ml de DMF se le añadió carbonato potásico (102 mg, 0,74 mmol). Esta mezcla se agitó a ta durante 20 min seguido de la adición de 5-bromo-1-penteno (65 l, 0,55 mmol). La mezcla de reacción se agitó a ta durante 2 días. Después, se filtró, se concentró y se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (eluyendo con acetato de etilo al 25% en hexano), dando 75 mg (43%) de 2(S)-(terc-butoxicarbonilamino)-3-(2-nitro-N-(pent-4-15 enil)fenilsulfonamido)propanoato de metilo iv en forma de un sólido de color amarillo. RMN 1H (CD3OD, 300 MHz)  1,42 (s, 9 H), 1,54-1,64 (m, 2 H), 1,97 (c, J = 7,20 Hz, 2 H), 3,37 (m, 2 H), 3,57-3,80 (m, 2 H), 3,72 (s, 3 H), 4,42 (dd, J = 8,60, 5,31 Hz, 1 H), 4,91-5,01 (m, 2 H), 5,69-5,79 (m, 1 H), 7,75-7,85 (m, 3 H), 8,04 (m, 1 H); EM m/z 372 (M+ +1-Boc).

Preparación de Ejemplo 37, ácido 2(S)-(terc-butoxicarbonilamino)-3-(2-nitro-N-(pent-4-20 enil)fenilsulfonamido)propanoico v:

Se disolvió 2-(terc-butoxicarbonil)-3-(2-nitro-N-(pent-4-enil)fenilsulfonamido)-propanoato de (S)-metilo iv (500 mg, 1,06 mmol) en el sistema de disolvente mixto: THF (4 ml), metanol (1 ml) y agua (2 ml). Se añadió hidróxido de litio en polvo (250 mg, 10,4 mmol). La suspensión de color amarillo claro se agitó a ta durante 15 h y 25 después se concentró al vacío. El residuo se repartió entre éter y agua. La fase de éter se descartó, y la fase acuosa se trató con HCl 1 N hasta el pH fue de 4. Esta solución ácida se extrajo cuatro veces con acetato de etilo. Los extractos de acetato de etilo combinados se secaron (MgSO4) y se concentraron al vacío, dando 430 mg (89%) de ácido 2-(terc-butoxicarbonilamino)-3-(2-nitro-N-(pent-4-enil)fenilsulfonamido)propanoico (Ejemplo 26) en forma de un aceite de color amarillo. RMN 1H (CD3OD, 300 MHz)  1,38 (s, 9 H), 1,51-1,60 (m, 2 H), 1,89-1,98 (m, 2 H), 3,28-30 3,32 (m, 2 H), 3,59-3,64 (dd, J = 14,95, 9,46 Hz, 1 H), 3,71-3,74 (m, 1 H), 4,33 (dd, J = 9,61, 4,43 Hz, 1 H), 4,87-4,94 (m, 2 H), 5,63-5,72 (m, 1 H), 7,71-7,77 (m, 3 H), 8,01 (dd, J = 7,48, 1,37 Hz, 1 H); EM m/z 358 (M++1-Boc).

EJEMPLO 86

Preparación de ácido (1S,4R,6S,14S,18R)-[7-cis-4-Ciclopropanosulfonilaminocarbonil-12-ciclopropil-18-hidroxi-2,15-dioxo-3,12,16-triaza-triciclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-en-14-il]carbámico, éster terc-butílico (Ejemplo 86)

Etapa 1: Síntesis de N-(pent-4-enil)ciclopropanamina.

Usando un embudo de adición, una solución de 5-bromopenteno (15,75 g, 106 mmol) en 50 ml de metanol 5 se añadió durante el transcurso de 5 min a una solución de ciclopropilamina (20,6 g, 361 mmol) en 200 ml de metanol. Esta solución se dejó en agitación a ta durante 72 h, momento en el que se calentó a reflujo durante 1 h. El metanol y el exceso de ciclopropilamina se retiraron por destilación. El residuo, sal bromhidrato del producto, se repartió entre éter y NaOH 4 N. La fase acuosa se lavó (2 x) con éter. Los extractos de éter combinados se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentró, dando 8 g (60%) de N-(pent-4-enil)ciclopropanamina en forma de un aceite de 10 color amarillo: RMN 1H (500 MHz, CDCl3)  0,31-0,36 (m, 2 H) 0,40-0,46 (m, 2 H) 1,53-1,63 (m, 2 H) 1,87 (s a, 1 H) 2,05-2,10 (m, 2 H) 2,10-2,14 (m, 1 H) 2,69 (t, J = 7,32 Hz, 2 H) 4,91-5,07 (m, 2 H) 5,72-5,88 (m, 1 H).

Etapa 2: Síntesis de ácido 2(S)-(terc-butoxicarbonilamino)-3-[N-ciclopropil-N-(pent-4-enil)amino]propanoico

Se añadió N-(pent-4-enil)ciclopropanamina (668 mg, 5,30 mmol) en 20 ml de acetonitrilo a una suspensión 15 de N-t-butoxicarbonil-L-serina -lactona (1,0 g, 5,30 mmol) en 40 ml de acetonitrilo. La mezcla se agitó en una atmósfera de N2 a ta durante 5 días y después se concentró al vacío, dando ácido 2(S)-(terc-butoxicarbonilamino)-3-[N-ciclopropil-N-(pent-4-enil)amino]propanoico en bruto. Este material se usó en Etapa 3 sin purificación. CL-EM (columna de HPLC Phenomenex 10 micromolar ("m") C18: 3,0 x 50 mm de longitud. Gradiente: 100% del Disolvente A/0% del Disolvente B a 0% del Disolvente A/100% del Disolvente B. Tiempo de gradiente: 3 min. Tiempo 20 de mantenimiento: 1 min. Caudal: 4 ml/min. Detector de Longitud de Onda: 220 nM. Disolvente A: MeOH al 10%/H2O al 90%/TFA al 0,1%. Disolvente B: H2O al 10%/MeOH al 90%/TFA al 0,1%. (Tiempo de retención: 2,50 min), EM m/z 313 (M++1).

Etapa 3: Síntesis de 1(R)-[1-[2(S)-(terc-butoxicarbonilamino)-3-[N ciclopropil-N-(pent-4-enil)amino]propanoil]-4(R)-hidroxipirrolidina-2(S)-caboxamido-2(S)-vinilcoclopropanocarboxilato de etilo. 25

Una solución de ácido 2(S)-(terc-butoxicarbonilamino)-3-[N-ciclopropil-N-(pent-4-enil)amino]propanoico (1,47 g, 4,71 mmol) en 20 ml de DCM se trató secuencialmente con clorhidrato de 1(R)-[4(R)-hidroxipirrolidina-2(S)-carboxamido]-2(S)-vinilciclopropanocarboxilato de etilo (preparado en el ejemplo 5) (1,44 g, 4,71 mmol), N-metil

morfolina (1,80 ml, 16,34 mmol) y HATU (2,14 g, 5,53 mmol). La mezcla de reacción se agitó a ta en una atmósfera de N2 durante 3 h y después se concentró al vacío. El residuo se disolvió en agua y HCl 1 N se añadió hasta pH = 5. Esta solución acuosa se extrajo con EtOAc (3 x). La fase orgánica se lavó con NaHCO3 ac. sat., se secó (MgSO4) y se concentró al vacío, dando el producto en bruto. La cromatografía ultrarrápida (acetato de etilo al 50%/hexano a acetato de etilo al 100%) dio 1,55 g (58%) de 1(R)-[1-[2(S)-(terc-butoxicarbonilamino)-3-[N-ciclopropil-N-(pent-4-5 enil)amino]propanoil]-4(R)-hidroxipirrolidina-2(S)-carboxamido]-2(S)-vinilciclopropanocarboxilato de etilo en forma de una espuma de color blanco: CL-EM (columna de HPLC Phenomenex-Luna S10: 3,0 x 50 mm de longitud. Gradiente: 100% del Disolvente A/0% del Disolvente B a 0% del Disolvente A/100% del Disolvente B. Tiempo de gradiente: 2 min. Tiempo de mantenimiento: 1 min. Caudal: 4 ml/min. Detector de Longitud de Onda: 220 nM. Disolvente A: MeOH al 10%/H2O al 90%/TFA al 0,1%. Disolvente B: H2O al 10%/MeOH al 90%/TFA al 0,1%). 10 (Tiempo de retención: 1,38 min), EM m/z 564 (M++1).

Etapa 4: Síntesis de 1(R)-[1-[2(S)-(terc-buloxicarbonilamino)-3-[N-ciclopropol-N-(pent-4-enil)amino]propanoil]-4-(R)-(terc-butildimetilsililoxi)pirrolidina-2(S)-carboxamido]-2(S)-vinilciclopropanocarboxilato de etilo.

A una mezcla de 1(R)-[1-[2(S)-(terc-butoxicarbonilamino)-3-[N-ciclopropil-N-(pent-4-enil)amino]propanoil]-15 4(R)-hidroxipirrolidina-2(S)-carboxamido]-2(S)-vinilciclopropanocarboxilato de etilo (1,55 g, 2,75 mmol) en 10 ml de DMF se le añadieron imidazol (0,47 g, 6,88 mmol) y cloruro de terc-butildimetilsililo (826 mg, 5,50 mmol). La mezcla se agitó a ta durante 18 h, se concentró al vacío y se repartió entre acetato de etilo y agua. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró al vacío, obteniendo un sólido de color blanquecino. La cromatografía ultrarrápida (eluyendo con cloruro de metileno y después con acetato de etilo) proporcionó 1(R)-[1-[2(S)-(terc-20 butoxicarbonilamino)-3-[N-ciclopropil-N-(pent-4-enil)amino]propanoil]-4(R)-(terc-butildimetilsililoxi)pirrolidina-2(S)-carboxamido]-2 (S)-vinilciclopropanocarboxilato de etilo en forma de un sólido de color blanco (1,75 g, 94%): CL-EM (columna de HPLC Phenomenex 10 m C18: 3,0 x 50 mm de longitud. Gradiente: 100% del Disolvente A/0% del Disolvente B a 0% del Disolvente A/100% del Disolvente B. Tiempo de gradiente: 2 min. Tiempo de mantenimiento: 1 min. Caudal: 5 ml/min. Detector de Longitud de Onda: 220 nM. Disolvente A: MeOH al 10%/H2O al 90%/TFA al 25 0,1%. Disolvente B: H2O al 10%/MeOH al 90%/TFA al 0,1%). (Tiempo de retención: 2,51 min), EM m/z 677 (M++1).

Etapa 5: Síntesis de ácido (1S,4R,6S,14S,18R)-7-cis-14-terc-Butoxicarbonilamino-18-(terc-butildimetilsililoxi)-2,15-di-oxo-3,12,16-triazatriciclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico, éster etiílico.

A una solución de 1(R)-[1 - [2 (S)-(terc - butoxicarbonilamino)- 3 -[N-ciclopropil-N-(pent-4-30 enil)amino]propanoil]4(R)-(terc-butildimetilsililoxi)pirrolidina-2(S)-carboxamido]-2(S)-vinilciclopropanocarboxilato de etilo (1,45 g, 2,14 mmol) en 1 l de cloruro de metileno se le añadieron 181 mg (0,21 mmol) de catalizador de Grubb de 2ª generación [(1,3-Bis-(2,4,6-trimetilfenil)-2-imidazolidinilidene)dicloro(fenilmetileno)(triciclohexilfosfina)rutenio]. La mezcla se calentó a reflujo durante 1 h. Se añadió una segunda fracción del catalizador (50 mg, 0,058 mmol) y la mezcla se agitó a ta durante una noche. El residuo se concentró al vacío y después se purificó por cromatografía 35 ultrarrápida eluyendo con éter al 50%/hexano, dando 0,84 g (62%) de ácido (1S, 4R, 6S, 14S, 18R)-7-cis-14-terc-butoxicarbonilamino-18-(terc-butildimetil-sililoxi)-2,15-dioxo-3,12,16-triazatriciclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico, éster etílico en forma de un sólido de color blanco: CL-EM (columna de HPLC Phenomenex 10 m C18: 3,0 x 50 mm de longitud. Gradiente: 100% del Disolvente A/0% del Disolvente B a 0% del Disolvente A/100% del Disolvente B. Tiempo de gradiente: 2 min. Tiempo de mantenimiento: 1 min. Caudal: 5 ml/min. Detector de Longitud 40 de Onda: 220 nM. Disolvente A: MeOH al 10%/H2O al 90%/TFA al 0,1%. Disolvente B: H2O al 10%/MeOH al 90%/TFA al 0,1%). (Tiempo de retención: 2,43 min), EM m/z 649 (M++1).

Etapa 6: Síntesis de ácido (1S,4R,6S,14S,18R)-7-cis-14-terc-butoxicarbonilamino-18-(terc-butildimetilsililoxi)-2,15-di-oxo-3,12,16-triazatriciclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico.

A una solución de ácido (1S,4R,6S,14S,18R)-7-cis-14-terc-butoxicarbonilamino-18-(terc-butildimetilsililoxi)-2,15-dioxo-3,12,16-triazatriciclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico, éster etílico (0,84 g, 1,30 mmol) en THF (30 5 ml), metanol (15 ml) y agua (4 ml) se le añadió hidróxido de litio hidrato en polvo (0,31 g, 12,90 mmol). La suspensión de color amarillo claro resultante se agitó a ta en una atmósfera de N2 durante una noche. Después, la mezcla se concentró al vacío y se repartió entre hexano/éter (1:1) y agua. La fase orgánica se descartó y la fase acuosa se trató con HCl 1 N hasta un pH 5. Esta solución ácida se extrajo (3 x) con EtOAc. Los extractos de EtOAc combinados se secaron (MgSO4) y se concentraron al vacío, dando 0,495 g (61%) de ácido (1S,4R,6S,14S,18R)-7-10 cis-14-terc-butoxicarbonilamino-18-(terc-butildimetilsililoxi)-2,15-dioxo-3,1,16-triazatriciclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico en forma de un sólido de color blanquecino: CL-EM (columna de HPLC Phenomenex 10 m C18: 3,0 x 50 mm de longitud. Gradiente: 100% del Disolvente A/0% del Disolvente B a 0% del Disolvente A/100% del Disolvente B. Tiempo de gradiente: 2 min. Tiempo de mantenimiento: I min. Caudal: 5 ml/min. Detector de Longitud de Onda: 220 nM. Disolvente A: MeOH al 10%/90% H2O/0,1% TFA. Disolvente B: H2O al 10%/MeOH al 90%/TFA al 15 0,1%). (Tiempo de retención: 2,36 min), EM m/z 621 (M++1).

Etapa 7: Síntesis de ácido (1S,4R,6S,14S,18R)-[7-cis-4-Ciclopropanosulfonilaminocarbonil- 12-ciclopropil- 18-(terc-butildimetilsililoxi)-2,15-dioxo-3,12,16-triaza-triciclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-en-14-il]carbámico, éster terc-butílico.

Se disolvió ácido (1S,4R,6S,14S,18R)-7-cis-14-terc-butoxicarbonilamino-18-(terc-butildimetilsililoxi)-2,15-20 dioxo-3,12,16-triazatriciclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico (490 mg, 0,79 mmol) en 15 ml de THF y se trató con CDI (179 mg, 1,10 mmol). (Se tuvo cuidado para evitar la humedad usando cristalería secada al horno y manteniendo una atmósfera de N2 seco). Después de calentar la mezcla de reacción durante dos horas, se enfrió a ta y se trató secuencialmente con ciclopropilsulfonamida (134 mg, 1,10 mmol) y DBU (168 mg, 1,10 mmol). Después de agitar durante una noche a ta, el THF se retiró por evaporación rotatoria. El residuo se disolvió en agua y se 25 añadió HCl 1 N hasta un pH = 5. Esta solución acuosa se extrajo (3 x) con EtOAc. Los extractos de EtOAc combinados se secaron (MgSO4) y se concentraron al vacío, dando el producto en bruto. La purificación por columna ultrarrápida, eluyendo con metanol al 3% en cloruro de metileno, proporcionó 300 mg (53%) de ácido (1S,4R,6S,14S,18R)-[7-cis-4-Ciclopropanosulfonilaminocarbonil-12-ciclopropil-18-(terc-butildimetilsililoxi)-2,15-dioxo-3,12,16-triaza-triciclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-en-14-il]carbámico, éster terc-butílico en forma de un sólido de color 30 blanco: CL-EM (columna de HPLC Phenomenex 10 m C18: 3,0 x 50 mm de longitud. Gradiente: 100% del Disolvente A/0% del Disolvente B a 0% del Disolvente A/100% del Disolvente B. Tiempo de gradiente: 2 min. Tiempo de mantenimiento: 1 min. Caudal: 5 ml/min. Detector de Longitud de Onda: 220 nM. Disolvente A: MeOH al 10%/H2O al 90%/TFA al 0,1%. Disolvente B: H2O al 10%/MeOH al 90%/TFA al 0,1%). (Tiempo de retención: 2,40 min), EM m/z 724 (M++1). 35

Etapa 8: Síntesis de ácido (1S,4R,6S,14S,18R)-[7-cis-4-Ciclopropanosulfonilaminocarbonil-12-ciclopropil-18-hidroxi-2,15-dioxo-3,12,16-triaza-triciclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-en-14-il]carbámico, éster terc-butílico

(Ejemplo 86).

A una mezcla del compuesto ácido (1S,4R,6S,14S,18R)-[7-cis-4-Ciclopropanosulfonilaminocarbonil-12-ciclopropil-18-(terc-butildimetilsililoxi)-2,15-dioxo-3,12,16-triaza-triciclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-en-14-il]carbámico, éster terc-butílico (250 mg, 0,35 mmol) en 15 ml de THF se le añadió fluoruro de tetrabutilamonio (129 mg, 0,46 mmol). La mezcla se agitó a ta durante 18 h. Se retiró el THF por evaporación rotatoria y el residuo se repartió entre 5 acetato de etilo y agua. La fase orgánica se secó (MgSO4) y se concentró al vacío, dando el producto en bruto. La purificación por trituración con hexano proporcionó 200 mg (94%) de ácido (1S,4R,6S,14S,18R)-[7-cis-4-Ciclopropanosulfonilaminocarbonil-12-ciclopropil-18-hidroxi-2,15-dioxo-3,12,16-triaza-triciclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-en-14-il]carbámico, éster terc-butílico en forma de un sólido de color blanco: CL-EM (tiempo de retención: 2,32 min), EM m/z 610 (M++1). (columna de HPLC Phenomenex 10 m C18: 3,0 x 50 mm de longitud. Gradiente: 100% del 10 Disolvente A/0% del Disolvente B a 0% del Disolvente A/100% del Disolvente B. Tiempo de gradiente: 3 min. Tiempo de mantenimiento: 1 min. Caudal: 4 ml/min. Detector de Longitud de Onda: 220 nM. Disolvente A: MeOH al 10%/H2O al 90%/TFA al 0,1%. Disolvente B: H2O al 10%/MeOH al 90%/TFA al 0,1%). (Tiempo de retención: 2,32 min), EM m/z 610 (M++1).

Ejemplo 87: Preparación del Compuesto 1

Etapa 1: Preparación de ((1R,2S)-1-(ciclopropilsulfonilcarbamoil)-2-vinilciclopropilcarbamoil)-4-fenilpirrolidina-1-carboxilato de (2S,4S)-terc-butilo

A una mezcla de ácido (2S, 4S)-Boc-4-fenilpirrolidina-2-carboxílico (0,711 g 2,44 mmol) (adquirido en 5 Chem-Impex International, Inc.), diisopropiletilamina (0,948 g, 7,33 mmol) y sal HCl de (1-(R)-amino-2-(S)-vinil-ciclopropanocarbonil)amida del ácido ciclopropanosulfónico (0,561 g, 2,44 mmol) en diclorometano (24 ml) se le añadió HATU (1,21 g, 3,18 mmol). Después de agitar la mezcla de reacción durante 14 horas, se lavó con NaHCO3 acuoso al 5% (50 ml), y ácido cítrico acuoso al 5% (50 ml). Cada capa acuosa se extrajo secuencialmente con 2 x 25 ml de diclorometano. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró. El aceite viscoso 10 de color pardo resultante se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (SiO2, 97:3, diclorometano:metanol), dando 2-((1R,2S)-1-(Ciclopropilsulfonilcarbamoil)-2-vinilciclo-propilcarbamoil)-4-fenilpirrolidina-1-carboxilato de (2S,4S)-terc-butilo en forma de un sólido espumoso de color pardo (0,973 g, rendimiento del 79%). RMN 1H (CD3OD,

500 MHz)  0,91 (s a, 1H), 1,03 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 1,16-1,23 (m, 1H), 1,31-1,38 (m, 1H), 1,44 (dd, J = 9,6, 5,6 Hz, 1H), 1,48 (s, 4H), 1,52 (s, 5H), 1,89 (t, J = 6,4 Hz), 2,09 (c, J = 8,4 Hz, 0,4H), 2,19 (c, J = 8,6 Hz, 0,6H), 2,85-2,90 (m, 0,4H), 2,92-2,97 (m, 0,6H), 3,44 (t, J = 9,6 Hz, 1H), 3,65 (p, J = 8,0 Hz, 1H), 3,93-4,01 (m, 1 H), 4,29 (dd, J = 10,1, 6,7 Hz, 1H), 5,12 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 5,30 (d, J = 18,0 Hz, 1H), 5,75-5,82 (m, 1H), 7,24 (t, J = 6,9 Hz, 1H), 7,29-7,33 (m, 5H); EM m/z 504 (M+Na). 5

Etapa 2: Preparación de (2S,4S)-N((1R,2S)-1-(ciclopropilsulfonilcarbamoil)-2-vinilciclopropil)-4-fenilpirrolidina-2-carboxamida

A una solución del producto de la Etapa 1, Ejemplo 1, (0,900 g, 1,79 mmol) en diclorometano (5 ml) se le añadió TFA (5 ml). Después de agitar a temperatura ambiente durante 30 minutos, la mezcla de reacción se concentró y se secó brevemente al vacío. El aceite viscoso de color pardo resultante se disolvió de nuevo en 10 diclorometano (10 ml) y se añadió gota a gota a una solución de HCl 1 N en éter dietílico (10 ml). Se formó un precipitado sólido de color blanco y se recogió por filtración al vacío. La torta de filtro se lavó con éter dietílico, dando 0,720 mg (rendimiento del 91%) de (2S,4S)-N-((1R,2S)-1-(ciclopropilsulfonilcarbamoil)-2-vinilciclopropil)-4-fenilpirrolidina-2-carboxamida. EM m/z 404 (MH+).

Etapa 3: Preparación de (S)-1-((2S,4S)-2-((1R,2S)-1-(ciclopropilsulfonilcarbamoil)-2-vinilciclopropilcarbamoil)-4-15 fenilpirrolidin-1-il)-1-oxonon-8-en-2-ilcarbamato de terc-butilo

A una solución de ácido (S)-2-(terc-butoxicarbonilamino)non-8-enoico (adquirido en RSP Amino Acids) (140 mg, 0,516 mmol) en 20 ml de DMF se le añadió el producto de la Etapa 2, Ejemplo 1, (227 mg, 0,516 mmol). A esta solución se le añadió HATU (236 mg, 0,620 mmol) seguido de N-metilmorfolina (182 mg, 1,80 mmol). La mezcla se agitó a ta durante 4 horas y después se concentró al vacío para retirar la DMF. El residuo se repartió entre HCl 0,1 N 20 y acetato de etilo (manteniendo la fase acuosa entre pH 3 a pH 5). La fase orgánica se secó (MgSO4), se filtró y se concentró, dando 300 mg del producto en bruto en forma de un aceite de color castaño. La cromatografía ultrarrápida eluyendo con metanol al 1-5%/CH2Cl2 proporcionó 230 mg (68%) de (S)-1-((2S.4S)-2-((1R,2S)-1-(ciclopropilsulfonilcarbamoil)-2-vinilciclopropilcarbamoil)-4-fenilpirrolidin-1-il)-1-oxonon-8-en-2-ilcarbamato de terc-butilo en forma de un aceite incoloro. EM m/z 657 (MH+). 25

Etapa 4: Preparación del Compuesto 1.

El producto de la Etapa 3 (124 mg, 0,189 mmol) se disolvió en CH2Cl2, se puso en una atmósfera de N2 y se trató con un catalizador de Grubb RCM de 2ª generación (dicloruro de triciclohexilfosfina[1,3-bis(2,4,6-trimetil-fenil)4,5-dihidroimidazol-2-ilideno][bencilideno]-rutenio (IV)) (16 mg, 0,019 mmol). Después de calentar a reflujo durante 18 horas, la solución naranja/roja se enfrió a temperatura ambiente y se concentró al vacío, dando 125 mg 30 de un aceite de color pardo. La cromatografía ultrarrápida eluyendo con metanol al 1-5%/CH2Cl2 proporcionó 60 mg del producto macrocíclico en bruto (puro ~60% como se estimó por RMN 1H y CL/EM). La HPLC Prep. proporcionó 22 mg del producto puro en forma de un sólido de color blanquecino. RMN 1H (500 MHz, CDCl3)  ppm 0,90-1,00 (m, 1H), 1,05-1,14 (m, 1H), 1,14-1,22 (m, 1H), 1,23-1,84 (m, 10H), 1,41 (s, 9H), 1,88-2,00 (m, 2H), 2,14-2,29 (m, 2H), 2,39-2,49 (m, 1H), 2,50-2,60 (m, 1H), 2,86-2,96 (m, 1H), 3,91-4,01 (m, 2H), 4,05-4,14 (m, 1H), 4,39-4,48 (m, 1H), 35 4,48-4,56 (m, 1H), 4,97-5,04 (m, 1H), 5,13 (d, J = 8,24 Hz, 1H), 5,70 (c, J = 8,95 Hz, 1H), 6,72 (s, 1H), 7,36-7,24 (m, 5H), 10,14 (s, 1H). EM m/z 629 (MH+).

Ejemplo 88: Preparación del Compuesto 2

Etapa 1: Preparación de éster metílico del ácido 1-(2(S)-terc-butoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4(R)-hidroxi-pirrolidina-2(S)-carboxílico

Una solución de ácido 2(S)-terc-butoxicarbonilamino-8-nonenoico (adquirido en RSP Amino Acids) (3,5 g, 12,9 mmol) en 200 ml de diclorometano se trató secuencialmente con clorhidrato de éster metílico del ácido 4(R)-5 hidroxipirrolidina-2(S)-carboxílico (2,15 g, 11,8 mmol), N-metil morfolina (4,25 ml, 38,6 mmol) y HATU (5,37 g, 14,1 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera de N2 durante 3 días y después se concentró al vacío. El residuo se repartió entre acetato de etilo y tampón (biftalato) a pH 4. La fase orgánica se lavó con NaHCO3 acuoso saturado, se secó (MgSO4), se filtró y se concentró al vacío, dando el producto en bruto. La cromatografía ultrarrápida (acetato de etilo al 50%/hexano a acetato de etilo al 100%) proporcionó 4,7 g (~100%) de 10 éster metílico del ácido 1-(2(S)-terc-butoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4(R)-hidroxi-pirrolidina-2(S)-carboxílico en forma de un aceite incoloro. RMN 1H (500 MHz, CD3OD)  1,33-1,50 (m, 8H), 1,46 (s, 9H), 1,57 (m, 1H), 1,72 (m, 1H) 2,08 (m, 2H), 2,28 (m, 1H), 3,72 (s, 3 H,) 3,75-3,87 (m, 2H), 4,36 (m, 1H), 4,51 (s a, 1H), 4,57 (t, J = 8,2 Hz, 1H), 4,95 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 5,01 (m, 1H), 5,83 (m, 1H); CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 3,01 min), EM m/z 399 (M++1). 15

Etapa 2: Preparación de éster etílico del ácido 1-{[1-(2(S)-terc-Butoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4(R)-hidroxi-pirrolidin-2(S)carbonil]-(1R)-amino}-2(S)-vinil-ciclopropanocarboxílico.

Se disolvió éster metílico del ácido 1-(2(S)-terc-butoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4(R)-hidroxi-pirrolidina-2(S)-carboxílico (4,7 g, 11,8 mmol) en THF (80 ml), metanol (20 ml) y agua (40 ml). Se añadió hidróxido de litio en 20 polvo (5,6 g, 233 mmol). La suspensión de color amarillo claro se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera de N2 durante 16 horas y después se concentró al vacío. El residuo se repartió entre éter y agua. La fase de éter se descartó y la fase acuosa se trató con HCl 1 N hasta que el pH fue de 4. Esta solución ácida se extrajo (3 x) con acetato de etilo. Los extractos de acetato de etilo combinados se secaron (MgSO4), se filtró y se concentró al vacío, dando 4,36 g (96%) de ácido 1-(2(S)-terc-butoxicarbonilamino-8-nonenoil)-4(R)-hidroxi-pirrolidina-2(S)-carboxílico en 25 forma de un sólido de color blanco. Después, este ácido se disolvió en 150 ml de DMF y se añadió clorhidrato de éster etílico del ácido (1R,2S)-1-amino-2-vinilciclopropanocarboxílico (2,61 g, 13,6 mmol), N-metil morfolina (2,5 ml, 22,6 mmol) y HATU (5,2 g, 13,7 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera de N2 durante 16 horas y después se concentró al vacío. El residuo se repartió entre acetato de etilo y tampón (biftalato) a pH 4. La fase orgánica se lavó con NaHCO3 acuoso saturado, se secó (MSO4), se filtró y se concentró al vacío, 30 dando el producto en bruto. La cromatografía ultrarrápida (acetato de etilo al 60%-80%/hexano) proporcionó 6,0 g (98%) de éster etílico del ácido 1-{[1-(2(S)-terc-butoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4(R)-hidroxi-pirrolidina-2(S)carbonil]-(1R)-amino}-2(S)-vinil-ciclopropanocarboxílico en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (500 MHz, CD3OD)  1,25 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 1,33-1,80 (m, 10H), 1,46 (s, 9H), 2,09 (m, 3H), 2,25 (m, 2H), 3,76 (m, 2H), 4,14 (m, 2H), 4,27 (dd, J = 8,5, 5,2 Hz, 1H), 4,50 (m, 2H), 4,94 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 5,01 (dd, J = 17,1, 1,8 Hz, 1H), 35 5,11 (dd, J = 10,4, 1,8 Hz, 1H), 5,30 (d, J = 15,6 Hz, 1H), 5,80 (m, 2H), 8,57 (s, 1H); CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 3,21 min), EM m/z 522 (M++1).

Etapa 3: Preparación de éster etílico del ácido 1-{[1-(2-terc-Butoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-pirrolidina-2-carbonil]-amino}-2-vinilciclopropanocarboxílico.

A una mezcla de éster etílico del ácido 1-{[1-(2(S)-terc-butoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4(R)-hidroxi-pirrolidina-2(S)carbonil]-(1R)-amino}-2(S)-vinil-ciclopropanocarboxílico (1,5 g, 2,87 mmol) en 10 ml de DMF se le añadieron imidazol (0,25 g, 3,67 mmol) y cloruro de terc-butil-dimetilsililo (516 mg, 3,44 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante dos días. Después, la mezcla de reacción se concentró al vacío y el residuo se 5 disolvió en acetato de etilo. Esta solución se lavó con agua, se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró al vacío, obteniendo un sólido en bruto. La purificación por cromatografía ultrarrápida (eluyendo con acetato de etilo al 20% en hexano) proporcionó 1,43 g (78%) de éster etílico del ácido 1-{[1-(2-terc-butoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-pirrolidina-2-carbonil]-amino}-2-vinilciclopropanocarboxilico en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (300 MHz, CD3OD)  0,10 (s,6H), 0,89 10 (s, 9H), 1,22 (m, 3H), 1,31-1,48 (m, 16H), 1,50-1,75 (m, 3H), 2,06 (m, 3H), 2,11-2,33 (m, 2H), 3,70 (m, 2H), 4,03-4,19 (m, 2H), 4,21 (m, 1H), 4,45 (t, J = 7,87 Hz, 1H), 4,59 (m, 1H), 4,91 (d, J = 9,15 Hz, 1H), 4,98 (d, J = 17,20 Hz, 1H), 5,08 (dd, J = 10,25, 1,83 Hz, 1H), 5,27 (dd, J = 17,38, 1,65 Hz, 1H), 5,65-5,87 (m, 2H). CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 4,00 min); EM m/z 636 (M++1).

Etapa 4: Preparación de 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo 15 [14.3.0.04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico ácido, éster etílico

A una solución de éster etílico del ácido 1-{[1-(2-terc-butoxicarbonilamino-non-8-enoil)-4-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-pirrolidina-2-carbonil]-amino}-2-vinil-ciclopropanocarboxílico (1,63 g, 2,56 mmol) en 640 ml de cloruro de metileno se le añadieron 215 mg (0,26 mmol) de dicloruro de triciclohexilfosfina[1,3-bis(2,4,6-tri[bencilideno]rutenio 20 (IV). La mezcla se calentó a reflujo durante 15 minutos. El residuo se concentró al vacío y después se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida eluyendo con acetato de etilo al 30%/hexano. Para decolorar adicionalmente la muestra, el producto en bruto se sometió a cromatografía una segunda vez eluyendo con éter al 50% en hexano, dando 1,5 g (96%) de éster etílico del ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(terc-butildimetil-silaniloxi)-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (500 MHz, 25 CD3Cl)  0,06 (s, 3H), 0,07 (s, 3H), 0,86 (s, 9H), 1,18-1,24 (m, 6H), 1,34-1,64 (m, 14H), 1,86-1,96 (m, 3H), 2,02-2,09 (m, 1H), 2,11-2,17 (m, 1H), 2,19-2,28 (m, 1H), 2,57-2,63 (m, 1H), 3,50-3,54 (m, 1H), 3,71 (dd, J = 10,22, 6,26 Hz, 1H), 4,06-4,17 (m, 2H), 4,52-4,58 (m, 2H), 4,75 (d, J = 8,55 Hz, 1H), 5,21 (t, J = 9,92 Hz, 1H), 5,35 (d, J = 7,63 Hz, 1H), 5,45-5,50 (m, 1H), 6,94 (s, 1H); CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 3,88 min), EM m/z 608 (M++1).

Etapa 5: Preparación de ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-2,15-dioxo-3,16-diaza-30 triciclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico

A una solución de éster etílico del ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo [14.3.0.04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico (1,5 g, 2,47 mmol) en un sistema de disolvente mixto de THF (4 ml), metanol (1 ml) y agua (2 ml) y se añadió hidróxido de litio monohidrato en polvo (1,0 g, 50 mmol). La suspensión de color amarillo claro se agitó a ta en una atmósfera de N2 durante 4 horas. Después, la 5 mezcla se concentró al vacío y el residuo repartió entre éter y agua. La fase de éter se descartó y la fase acuosa se trató con HCl 1 N hasta que alcanzó un pH de 4. Esta solución ácida se extrajo (3 x) con acetato de etilo. Los extractos de acetato de etilo combinados se secaron (MSO4), se filtraron y se concentraron al vacío, dando 1,2 g (84%) de ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico en forma de un sólido de color blanquecino. RMN 1H (300 MHz, 10 CD3OD) 0,12 (s, 6H), 0,89 (s, 9H), 1,23-1,64 (m, 17H), 1,70-1,87 (m, 1H), 1,90-2,49 (m, 6H), 3,70-3,80 (m,1H), 3,83-3,90 (m, 1H), 4,28-4,36 (m, 1H), 4,47-4,55 (m, 1H), 4,65 (s, 1H), 5,30-5,39 (m, 1H), 5,53-5,62 (m, 1H); CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 3,69 min), EM m/z 580 (M++1).

Etapa 6: Preparación de éster terc-butílico del ácido [18-(terc-butil - dimetil-silaniloxi)-4-ciclopropanosulfonilaminocarbonil-2, 15-dioxo-3, 16-diazatriciclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico. 15

Se disolvió ácido 14-terc-butoxicarbonilamino-18-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-eno-4-carboxílico (500 mg, 0,86 mmol) en 25 ml de THF y se trató con CDI (180 mg, 1,12 mmol) (se tuvo cuidado de evitar la humedad usando cristalería secada al horno y manteniendo una atmósfera de N2 seca). Después de calentar a reflujo la mezcla de reacción durante 2 horas, se enfrió a temperatura ambiente 20 y se trató secuencialmente con ciclopropilsulfonamida (135 mg, 1,12 mmol) y DBU (170 mg, 1,12 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 4 horas a temperatura ambiente y el THF se retiró por evaporación rotatoria. El residuo se repartió entre acetato de etilo y tampón a pH 4. La fase orgánica se secó (MSO4), se filtró y se concentró al vacío, dando el producto en bruto. Después, se purificó cromatografía ultrarrápida (eluyendo con acetato de etilo al 33% en hexano), dando 300 mg (51%) de éster terc-butílico del ácido [18-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-4-25 ciclopropanosulfonilaminocarbonil-2,15-dioxo-3,16-diazatriciclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico en forma de un sólido de color. RMN 1H (300 MHz, CD3OD)  0,07 (s, 3H), 0,08 (s, 3H), 0,85 (s, 9H), 0,87-1,49 (m, 21H), 1,73-1,95 (m, 3H), 2,08-2,16 (m, 1H), 2,25-2,36 (m, 2H), 2,42-2,56 (m, 1H), 2,85-2,93 (m, 1H), 3,65-3,74(dd, J = 10,61, 3,66 Hz, 1H), 3,89 (d, J = 10,25 Hz, 1H), 4,34 (m, J = 9,70, 9,70 Hz, 1H), 4,43 (t, J = 7,87 Hz, 1H), 4,57 (s, 1H), 4,94-5,01 (m, 1H), 5,10 (d, J = 8,78 Hz, 1H), 5,66-5,75 (m, 1H), 6,55 (s, 1H), 10,13 (s, 1H); CL-EM (Procedimiento A, 30 tiempo de retención: 3,81 min), EM m/z 683 (M++1).

Etapa 7: Preparación de éster terc-butílico del ácido (4-ciclopropanosulfonilaminocarbonil-18-hidroxi-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14.3.0.04,6]nonadec-7-en-14-il)-carbámico.

A una mezcla de éster terc-butílico del ácido [18-(terc – buti - dimetilsilaniloxi) -4-ciclopropanosulfonilaminocarbonil-2, 15-dioxo-3, 16-diazatriciclo [14.3.0.04,6]nonadec-7-en-14-il]-carbámico (330 5 mg, 0,48 mmol) en 25 ml de THF se le añadió fluoruro de tetrabutilamonio (150 mg, 0,54 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas y después el THF se retiró por evaporación rotatoria. El residuo se repartió entre acetato de etilo y agua. La fase orgánica se secó (MgSO4), se filtró y se concentró al vacío, dando el producto en bruto. Después, se purificó triturando con hexano, produciendo 200 mg (73%) de éster terc-butílico del ácido (4-ciclopropanosulfonilaminocarbonil-18-hidroxi-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclo[14.3.0.04,6]nonadec-10 7-en-14-il)-carbámico en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (500 MHz, CD3Cl)  1,87-1,64 (m, 21H), 1,70-1,98 (m, 3H), 2,15-2,56 (m, 5H), 2,85-2,94 (m, 1H), 3,71 (d, J = 13,91 Hz, 1H), 4,10-4,26 (m, 2H), 4,51 (t, J = 7,87 Hz, 1H), 4,62 (s, 1H), 4,98 (m, 1H), 5,06 (d, J = 8,78 Hz, 1H), 5,64-5,71 (m, 1H), 6,72 (s, 1H), 10,24 (s, 1H); CL-EM (Procedimiento A, tiempo de retención: 2,85 min), EM m/z 569 (M++1).

15

Etapa 8:

A una solución de éster terc-butílico del ácido (4-ciclopropanosulfonilaminocarbonil-18-hidroxi-2,15-dioxo-3,16-diaza-triciclu[14.3.0.04,6]nonadec-7-en-14-il)-carbámico (1,00 g, 1,76 mmol) en diclorometano (50 ml) se le añadió reactivo de Dess-Martin (1,64 g, 3,87 mmol) en forma de un sólido en una porción a 0ºC. Después de la eliminación del baño de hielo, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas, se inactivó con 2-propanol 20 (2 ml), se agitó durante 1 hora más y se concentró al vacío. El residuo se trituró con acetato de etilo, se filtró y el filtrado se concentró. El residuo se trituró con diclorometano y se filtró. El filtrado se concentró a sequedad. El residuo se purificó por columna ultrarrápida, eluyendo en primer lugar con 2:1, después 1:1 de hexano-acetona, produciendo el producto deseado en forma de un sólido de color blanco (670 mg, 67%). CL-EM (tiempo de retención: 2,42 min, procedimiento B), EM m/z 567 (M++H). 25

Etapa 9:

Se calentó un matraz de 2 bocas que contenía dietileterato de bromuro de magnesio (183 mg, 0,71 mmol) en un baño de aceite a 70ºC durante 4 horas a alto vacío. Después de enfriar a temperatura ambiente, se cargó con (6S,13aS,14aR,16aS,Z)-14a-(ciclopropilsulfunilcarbamoil)-2,5,16-trioxo-1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,13a,14,14a,15,16,16a-hexadecahidrociclo-propa[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazaciclopentadecin-6-ilcarbamato de terc-butilo (40 mg, 0,071 mmol). 30

El matraz se enfrió con hielo. Se añadió THF anhidro (2 ml) mediante una jeringa. La suspensión de color ligeramente amarillo formada se agitó vigorosamente a temperatura ambiente durante una noche. A este matraz enfriado con hielo seco-acetona se le añadió gota a gota fenil litio (1,8 M en THF, 0,39 ml, 0,71 mmol). La mezcla se agitó a esta temperatura durante 2 horas antes de que el baño se reemplazara por un baño de hielo y se agitó durante 1 hora más. La mezcla se inactivó con NH4Cl saturado y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica 5 separada se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró. El residuo se trituró con hexano (5 ml) y se filtró. El filtrado se concentró y se purificó por HPLC prep., proporcionando 9,5 mg (21%) del producto deseado en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (CD3OD)  1,01-1,21 (m, 4H), 1,28-1,39 (m, 2H), 1,45 (s, 9H), 1,49-1,52 (m, 4H), 1,63-1,72 (m, 2H), 1,80-1,91 (m, 2H), 1,98-2,04 (m, 1H), 2,30-2,35 (m, 1H), 2,44-2,55 (m, 2H), 2,70-2,74 (m, 1H), 2,94-2,97 (m, 1H), 4,06-4,08 (m, 1H), 4,31-4,39 (m, 2H), 4,60-4,63 (m, 1H), 5,21-5,29 (m, 10 1H), 5,65-5,71 (m, 1H), 7,31-7,34 (m, 1H), 7,38-7,42 (m, 2H), 7,63-7,65 (m, 2H); CL-EM (tiempo de retención: 2,74 min, procedimiento B), EM m/z 627 (M++H-H2O), 571 (M++H-H2O-t-Butilo).

Ejemplo 89: Preparación del Compuesto 3

Compuesto 3 15

El compuesto 3 se hizo usando el mismo procedimiento del Compuesto 2. Un matraz de 2 bocas (Matraz A) que contenía dietileterato de bromuro de magnesio (183 mg, 0,71 mmol) se calentó en un baño de aceite a 70ºC durante 4 horas a alto vacío. Después de enfriar a temperatura ambiente, se añadió (6S,13aS,14aR,16aS,Z)-14a-(ciclopropilsulfonilcarbamoil)-2,5,16-trioxo-1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,13a,14,14a,15,16,16a-hexadecahidrocicloprupa[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazaciclopentadecin-6-il-carbamato de terc-butilo (40 mg, 0,071 mmol). 20 El matraz se enfrió con hielo. Se añadió THF anhidro (2 ml) mediante una jeringa. La suspensión de color ligeramente amarillo formada se agitó vigorosamente a temperatura ambiente durante una noche.

En otro matraz de 2 bocas (Matraz B) que contenía una solución de 4-bromobifenilo (165 mg, 0,71 mmol) en THF (4 ml) a -78ºC se le añadió gota a gota n-BuLi (2,5 M en hexano, 0,28 ml, 0,71 mmol) y la solución formada se agitó a esta temperatura durante 1 hora. 25

El contenido del Matraz B a -78ºC se transfirió al Matraz A enfriado a -78ºC mediante una cánula. La solución de color amarillento formada se agitó a esta temperatura durante 2 horas antes de que el baño de hielo seco-acetona se reemplazara con un baño de hielo y se agitó durante 1 hora más. La mezcla se inactivó con NH4Cl (sat.) y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica separada se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró. El residuo se trituró con hexano (5 ml) y se filtró. El filtrado se concentró y se purificó por HPLC 30 prep., proporcionando 4,1 mg (8%) del producto deseado en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (CD3OD)  0,87-1,10 (m, 4H), 1,24-1,38 (m, 2H), 1,45 (s, 9H), 1,49-1,52 (m, 4H), 1,70-1,84 (m, 4H), 1,99-2,10 (m, 1H), 2,22-2,35 (m, 1H), 2,40-2,60 (m, 2H), 2,70-2,80 (m, 1H), 2,90-2,99 (m, 1H), 4,08-4,11 (m, 1H), 4,31-4,41 (m, 2H), 4,61-4,69 (m, 1H), 5,23-5,32 (m, 1H), 5,61-5,70 (m, 1H), 7,35-7,38 (m, 1H), 7,43-7,48 (m, 2H), 7,62-7,70 (m, 6H); CL-EM (tiempo de retención: 2,74 min, procedimiento B), EM m/z 703 (M++H-H2O), 647 (M++H-H2O-t-Butilo). 35

Estudios Biológicos

En la presente divulgación se utilizaron ensayos enzimáticos de complejo de proteasa NS3/4A de VHC y ensayos de replicón de VHC basados en células y se prepararon, condujeron y validaron de la manera siguiente:

Generación de complejo de proteasa NS3/4A de VHC recombinante

Se generaron complejos de proteasa NS3/4A de VHC; obtenidos a partir de la cepa BMS, cepa H77 o cepa 40 J4L6S, como se ha descrito más adelante. Estas proteínas recombinantes purificadas se generaron para su uso en un ensayo homogéneo (véase más adelante) para proporcionar un indicio de cuán eficaces serían los compuestos de la presente divulgación para inhibir la actividad proteolítica de NS3 de VHC.

Se obtuvo suero de un paciente infectado con VHC del Dr. T. Wright, Hospital de San Francisco. Se construyó con ingeniería genética un ADNc de longitud completa (ácido desoxirribonucleico de complemento) de 45

molde del genoma de VHC (cepa BMS) a partir de fragmentos de ADN obtenidos mediante PCR de transcripción inversa (RT-PCR) de ARN de suero (ácido ribonucleico) y usando cebadores seleccionados en base a la homología entre otras cepas de genotipo 1a. A partir de la determinación de la secuencia de genoma completa, se asignó un genotipo 1a al aislado de VHC de acuerdo con la clasificación de Simmonds y col. (Véase P Simmonds, KA Rose, S Graham, SW Chan, F McOmish, BC Dow, EA Follett, PL Yap y H Marsden, J. Clin. Microbiol., 31(6), 1493-1503 5 (1993)). La secuencia de aminoácidos de la región no estructural, NS2-5B, demostró ser >97% idéntica al genotipo Ia de VHC (H77) y 87% idéntica al genotipo 1b (J4L6S). Los clones infecciosos, H77 (genotipo 1a) y J4L6S (genotipo 1b) se obtuvieron de R. Purcell (NIH) y las secuencias están publicadas en Genbank (AAB67036, véase Yanagi, M., Purcell, R. H., Emerson, S. U. y Bukh, J. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94(16), 8738-8743 (1997); AF054247, véase Yanagi, M., St Claire, M., Shapiro, M., Emerson, S. U., Purcell, R. H. y Bukh, J, Virology 244 (1), 10 161-172. (1998)).

Las cepas H77 y J4L6S se usaron para la producción de complejos de proteasa NS3/4A recombinantes. Los ADN que codifican el complejo de proteasa NS3/4A de VHC recombinante (aminoácidos 1027 a 1711) para estas cepas se manipularon como se ha descrito por P. Gallinari y col. (véase Gallinari P, Paolini C, Brennan D, Nardi C, Steinkuhler C, De Francesco R. Biochemistry. 38(17): 5620-32, (1999)). En resumen, se añadió una cola 15 solubilizante de tres lisinas en el extremo 3’ de la región codificante NS4A. La cisteína en la posición P1 del sitio de escisión NS4A-NS4B (aminoácido 1711) se cambió a una glicina para evitar la escisión proteolítica del marcador de lisina. Adicionalmente, se introdujo una mutación de cisteína a serina mediante PCR en la posición 1454 del aminoácido para evitar la escisión autolítica en el dominio NS3 de helicasa. El fragmento de ADN variante se clonó en el vector de expresión bacteriano pET21b (Novagen) y el complejo de NS3/4A se expresó en la cepa BL21 (DE3) 20 de Escherichia coli (Invitrogen) siguiendo el protocolo descrito por P. Gallinari y col. (véase Gallinari P, Brennan D, Nardi C, Brunetti M, Tomei L, Steinkuhler C, De Francesco R., J Virol. 72(8): 6758-69 (1998)) con modificaciones. En resumen, la expresión del complejo de proteasa NS3/4A se indujo con Isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 0,5 milimolar (mM) durante 22 horas (h) a 20°C. Una fermentación típica (1 Litro (l)) produjo aproximadamente 10 gramos (g) de pasta celular húmeda. La células se resuspendieron en tampón de lisis (10 ml/g) que consiste en N-25 (2-Hidroxietil)Piperazina-N ’-( ácido 2-Etano Sulfónico) (HEPES) 25 mM, pH 7,5, glicerol al 20%, Cloruro de sodio (NaCl) 500 mM, Triton X-100 al 0,5%, 1 microgramo/mililitro (“g/ml”) de lisozima, Cloruro de magnesio 5 mM (MgCl2), 1 g/ml de Dnasel, -Mercaptoetanol 5mM (ME), Inhibidor de proteasa- ácido Etilenodiamina Tetraacético (EDTA) libre (Roche), se homogeneizaron e incubaron durante 20 minutos (min) a 4°C. El homogenado se sometió a sonicación y se clarificó mediante ultra-centrifugación a 235000 g durante 1 hora (h) a 4°C. Se añadió imidazol al 30 sobrenadante hasta una concentración final de 15 mM y el pH se ajustó a 8,0. El extracto de proteína cruda se cargó en una columna de Níquel- ácido Nitrilotriacético (Ni-NTA) pre-equilibrada con tampón B (HEPES 25 mM, pH 8,0, glicerol al 20%, NaCl 500 mM, Triton X-100 al 0,5%, imidazol 15 mM, (ME) 5 mM. La muestra se cargó a un caudal de 1 ml/min. La columna se lavó con 15 volúmenes de columna de tampón C (igual que el tampón B excepto con Triton X-100 al 0,2%). La proteína se eluyó con 5 volúmenes de columna de tampón D (igual que el tampón C 35 excepto con Imidazol 200 mM).

Las fracciones que contenían complejo de proteasa NS3/4A se combinaron y cargaron en una columna de desalación Superdex-S200 pre-equilibrada con tampón D (HEPES 25 mM, pH 7,5, glicerol al 20%, NaCl 300 mM, Triton X-100 al 0,2%, (ME) 10 mM. La muestra se cargó a un caudal de 1 ml/min. Las fracciones que contenían complejo de proteasa NS3/4A se combinaron y concentraron hasta aproximadamente 0,5 mg/ml. La pureza de 40 complejos de proteasa NS3/4A, obtenidos a partir de las cepas BMS, H77 y J4L6S, se consideró que era mayor del 90% mediante análisis de SDS-PAGE y espectrometría de masas. La enzima se almacenó a -80 °C, se descongeló en hielo y se diluyó antes del uso en tampón de ensayo.

Ensayo del péptido FRET para supervisar la actividad proteolítica de NS3/4A de VHC

El propósito de este ensayo in vitro era medir la inhibición de los complejos de proteasa NS3 del VHC, 45 obtenidos de la cepa BMS, cepa H77C o cepa J416S, como se ha descrito anteriormente, por los compuestos de la presente divulgación. Este ensayo proporciona una indicación de cuán eficaces serían los compuestos de la presente divulgación para inhibir la actividad proteolítica de NS3 del VHC.

A fin de supervisar la actividad de proteasa de NS3/4A de VHC, se usó un sustrato de péptido de NS3/4A. El sustrato fue RET S1 (Sustrato Depsipéptido de Transferencia de Energía de resonancia; AnaSpec, Inc. Nº de cat 50 22991)(péptido FRET), descrito por Taliani y col. en Anal. Biochem. 240(2): 60-67 (1996). La secuencia de este péptido se basa ligeramente en el sitio de escisión natural de NS4A/NS4B para la proteasa NS3 de VHC con la excepción de que existe un enlace éster en lugar de un puente amida en el sitio de escisión. El péptido también contiene un donador de fluorescencia, EDANS, cerca de un extremo del péptido y un aceptor, DABCYL, cerca del otro extremo. La fluorescencia del péptido se interrumpe mediante transferencia de energía de resonancia 55 intermolecular (RET) entre el donador y el aceptor, pero cuando la proteasa NS3 escinde el péptido los productos se liberan de la inactivación de RET y la fluorescencia del donador se vuelve evidente.

El sustrato peptídico se incubó con uno de los tres complejos de proteasa NS3/4A recombinantes, en ausencia o presencia de un compuesto de la presente divulgación. Los efectos inhibidores de un compuesto se determinaron supervisando la formación de producto de reacción fluorescente en tiempo real usando un Cytofluor 60 Series 4000.

Los reactivos fueron los siguientes: HEPES y Glicerol (Ultrapure) se obtuvieron en GIBCO-BRL. Dimetil Sulfóxido (DMSO) se obtuvo en Sigma. -Mercaptoetanol se obtuvo en Bio Rad.

Tampón de ensayo: HEPES 50 mM, pH 7,5; NaCl 0,15 M; Triton al 0,1%; Glicerol al 15%; ME 10 mM. Sustrato: concentración final 2 M (a partir de una solución madre 2 mM en DMSO almacenada a -20°C). Proteasa NS3/4A de VHC de tipo 1a (1b), concentración final 2-3 nM (a partir de una solución madre 5 M en HEPES 25 mM, 5 pH 7,5, glicerol al 20%, NaCl 300 mM, TritonX100 al 0,2%, ME 10 mM). Para compuestos con potencias que se aproximan al límite de ensayo, el ensayo se hizo más sensible añadiendo 50 g/ml de Albúmina Sérica Bovina (Sigma) al tampón de ensayo y reduciendo la concentración final de proteasa hasta 300 pM.

El ensayo se realizó en una placa negra de poliestireno de 96 pocillos de Falcon.

Cada pocillo contenía 25 l de complejo de proteasa NS3/4A en tampón de ensayo, 50  de un compuesto 10 de la presente divulgación en DMSO al 10%/tampón de ensayo y 25 l de sustrato en tampón de ensayo. Un control (sin compuesto) también se preparó en la misma placa de ensayo. El complejo de enzima se mezcló con compuesto o solución de control durante 1 min antes de iniciar la reacción enzimática mediante la adición de sustrato. La placa de ensayo se leyó inmediatamente usando el Cytofluor Series 4000 (Perspective Biosystems). El instrumento se ajustó para leer una emisión de 340 nm y excitación de 490 nm a 25°C. Las reacciones en general se siguieron 15 durante aproximadamente 15 min.

El porcentaje de inhibición se calculó con la siguiente ecuación:

100-[(Finh/Fcon)x100]

en la que: F es el cambio en la fluorescencia en el intervalo lineal de la curva. Se aplicó un ajuste de curva no lineal a los datos de inhibición-concentración y la concentración eficaz del 50% (CI50) se calculó mediante el uso de 20 software Excel XLfit usando la ecuación, y=A+((B-A)/(1+((C/x)^D))).

Ensayos de Especificidad

Se realizaron ensayos de especificidad para demostrar la selectividad in vitro de los compuestos de la presente divulgación en la inhibición del complejo de proteasa NS3/4A de VHC en comparación con otras serina o cisteína proteasas. 25

Las especificidades de compuestos de la presente divulgación se determinaron frente a una diversidad de serina proteasas: elastasa de neutrófilos humana (HNE), elastasa pancreática porcina (PPE) y quimotripsina pancreática humana y una cisteína proteasa: catepsina B hepática humana. En todos los casos se usó un protocolo de formato de placa de 96 pocillos usando un sustrato fluorométrico AminoMetil-Coumarin (AMC) específico para cada enzima como se ha descrito previamente (Solicitud de Patente PCT Nº WO 00/09543) con algunas 30 modificaciones a los ensayos de serina proteasa. Todas las enzimas se adquirieron en Sigma, EMDbiosciences mientras que los sustratos eran de Bachem, Sigma y EMDbiosciences.

Las concentraciones de compuesto variaron desde 100 hasta 0,4 M dependiendo de su potencia. Cada uno de los ensayos enzimáticos se inició mediante la adición de sustrato a enzima-inhibidor pre-incubado durante 10 min a temperatura ambiente e hidrólisis hasta el 15% de conversión medido en cytofluor. 35

Las condiciones finales para cada ensayo fueron las siguientes:

50 mM Tris(hidroximetil) aminometano clorhidrato (Tris-HCl) pH 8, Sulfato de Sodio 0,5 M (Na7SO4), NaCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, DMSO al 3%, Tween-20 al 0,01% con LLVY-AMC 5 M y Quimotripsina 1 nM.

Tris-HCl 50mM, pH 8,0, NaCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, DMSO al 3%, Tween-20 al 0,02%, succ-AAPV-AMC 5 M y HNE 20 nM o PPE 8 nM; 40

NaOAC 100 mM (Acetato de Sodio) pH 5,5, DMSO al 3%, TCEP 1 mM (Tris(2-carboxietil)fosfina clorhidrato), Catepsina B 5 nM (reserva de enzima activada en tampón que contiene TCEP 20 mM antes del uso) y Z-FR-AMC 2 M diluido en H2O.

El porcentaje de inhibición se calculó usando la fórmula:

[1-((UVinh-UVblanco)/(UVctl-UVblanco))] x 100 45

Se aplicó un ajuste de curva no lineal a los datos de inhibición-concentración y la concentración eficaz del 50% (CI50) se calculó mediante el uso de software Excel XLfit.

Generación de Replicón de VHC

Se estableció un sistema de células enteras de replicón de VHC como se ha descrito por Lohmann V, Korner F, Koch J, Herian U, Theilmann L, Bartemchlager R., Science 285(5424): 110-3 (1999). Este sistema permitió 50 evaluar los efectos de nuestros compuestos de Proteasa de VHC sobre la replicación del ARN de VHC. En resumen, mediante el uso de la secuencia de la cepa Ib de VHC descrita en el artículo de Lohmann (Número de acceso:

AJ238799), se sintetizó un ADNc de VHC mediante Operon Technologies, Inc. (Alameda, CA) y después el replicón de longitud completa se ensambló en el plásmido pGem9zf(+) (Promega, Madison, WI) usando técnicas de biología molecular convencionales. El replicón consiste en (i) la 5’ UTR de VHC fusionada a los primeros 12 aminoácidos de la proteína de cápside, (ii) el gen de neomicina fosfotransferasa (neo), (iii) el IRES del virus de la encefalomiocarditis (EMCV) y (iv) los genes NS3 a NS5B de VHC y la 3’ UTR de VHC. Los ADN de plásmido se linealizaron con ScaI y 5 se sintetizaron transcritos de ARN in vitro usando el kit de transcripción T7 MegaScript (Ambion, Austin, TX) de acuerdo con las direcciones del fabricante. Los transcritos in vitro del ADNc se transfectaron en una línea de células de hepatoma humano, HUH-7. La selección de células que expresan de forma constitutiva el replicón de VHC se consiguió en presencia del marcador seleccionable, neomicina (G418). Las líneas celulares resultantes se caracterizaban por producción de ARN de cadena positiva y negativa y producción de proteína a lo largo del tiempo. 10

Ensayo FRET de Replicón de VHC

El ensayo FRET de replicón de VHC se desarrolló para supervisar los efectos inhibidores de compuestos descritos en la divulgación sobre la replicación viral de VHC. Células HUH-7, que expresaban de forma constitutiva el replicón de VHC, se cultivaron en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) (Gibco-BRL) que contenía Suero fetal bovino al 10% (SFB) (Sigma) y 1 mg/ml de G418 (Gibco-BRL). Las células se sembraron la noche antes (1,5 x 15 104 células/pocillo) en placas estériles de cultivo de tejido de 96 pocillos. Se prepararon controles con compuesto y sin compuesto en DMEM que contenía SFB al 4%, 1:100 Penicilina/Estreptomicina (Gibco-BRL), 1:100 L-glutamina y DMSO al 5% en la placa de dilución (concentración final en el ensayo DMSO al 0,5%). Se añadieron mezclas de compuesto/DMSO a las células y se incubaron durante 4 días a 37°C. Después de 4 días, las células en primer lugar se evaluaron para determinar citotoxicidad usando Azul de alamar (Trek Diagnotstic Systems) para una lectura de 20 CC50. La toxicidad de compuesto (CC50) se determinó añadiendo 1/10 volumen de Azul de alamar a los medios que incuban las células. Después de 4 h, se leyó la señal de fluorescencia de cada pocillo, con una longitud de onda de excitación a 530 nm y una longitud de onda de emisión de 580 nm, usando el Cytofluor Series 4000 (Perspective Biosystems). Después las placas se enjuagaron vigorosamente con solución Salina Tamponada con Fosfato (PBS) (3 veces 150 l). La células se lisaron con 25 l de un reactivo de ensayo de lisis que contenía un sustrato de 25 proteasa de VHC (reactivo de lisis de cultivo celular de luciferasa 5X (Promega #E153A) diluido hasta 1X con agua destilada, NaCl añadido hasta 150 mM final, el sustrato de péptido FRET (como se ha descrito para el ensayo enzimático anterior) diluido hasta 10 M final a partir de una reserva 2 mM en DMSO al 100%. Después la placa se colocó en el instrumento Cytofluor 4000 que se había ajustado a 340 nm excitación/490 nm emisión, modo automático por 21 ciclos y la placa se leyó en un modo cinético. Las determinaciones de CE50 se realizaron como se 30 ha descrito para las determinaciones de CI50.

Ensayo Informador de luciferasa de Replicón de VHC

Como un ensayo secundario, las determinaciones de EC50 del ensayo FRET de replicón se confirmaron en un ensayo informador de luciferasa de replicón. La utilización de un ensayo informador de luciferasa de replicón se describió en primer lugar por Krieger y col. (Krieger N, Lohmann V y Bartcnschlagcr R, J. Virol. 75(10): 4614-4624 35 (2001)). La construcción de replicón descrita para el presente ensayo FRET se modificó insertando ADNc que codifica una forma humanizada del gen de luciferasa de Renilla y una secuencia de engarce fusionada directamente al extremo 3’ del gen de luciferasa. Este inserto se introdujo en la construcción de replicón usando un sitio de restricción Asc1 localizado en núcleo, directamente cadena arriba del gen marcador de neomicina. También se introdujo la mutación adaptativa en la posición 1179 (serina a isoleucina) (Blight KJ, Kolykhalov, AA, Rice, CM, 40 Science 290(5498): 1972-1974). Se generó una línea celular estable que expresa de forma constitutiva esta construcción de replicón de VHC como se ha descrito anteriormente. El ensayo informador de luciferasa se estableció como se ha descrito para el Ensayo FRET de replicón de VHC con las siguientes modificaciones. A continuación de 4 días en una incubadora a 37°C/CO2 al 5%, las células se analizaron para determinar la actividad de luciferasa de Renilla usando el Sistema de Ensayo de Luciferasa Promega Dual-Glo System. Los medios (100 l) 45 se retiraron de cada pocillo que contenía células. A los 50 l de medios restantes, se añadieron 50 l de Reactivo de Luciferasa Dual-Glo y las placas se agitaron durante 10 min a 2 h a temperatura ambiente. Después se añadió Reactivo Dual-Glo Stop & Glo (50 l) a cada pocillo y las placas se agitaron nuevamente durante 10 min a 2 h adicionales a temperatura ambiente. Las placas se leyeron en un Packard TopCount NXT usando un programa de luminiscencia. 50

El porcentaje de inhibición se calculó usando la fórmula más adelante:

% de Control =

señal de luciferasa promedio en pocillos experimentales (+ compuesto)

señal de luciferasa promedio en pocillos de control de DMSO (- compuesto)

Los valores se graficaron y analizaron usando XLfit para obtener el valor de CE50.

Se observa que mediante el uso del número de ejemplo de Patente y el número de compuesto de Patente 55 mostrados en la Tabla 2 se pueden encontrar las estructuras de compuestos en el presente documento.

Tabla 2

Número de Ejemplo

Número de Compuesto CI50 (nM) CE50 (nM)

87

1 18 639

88

2 9 389

89

3 2 14

Será evidente para un experto en la materia que la presente divulgación no se limita a los ejemplos ilustrativos anteriores y que se puede incluir en otras formas específicas sin alejarse de los atributos esenciales de la 5 misma. Por lo tanto se desea que los ejemplos se consideren a todos los respectos como ilustrativos y no limitantes, haciéndose referencia a las reivindicaciones adjuntas, en lugar de a los ejemplos anteriores y, por lo tanto, todos los cambios que están dentro del significado e intervalo de equivalencia de las reivindicaciones tienen por objeto incluirse en las mismas.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un compuesto de fórmula (I)

   o un enantiómero, diastereómero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que

   R1 se selecciona entre alcoxi, hidroxi y -NHSO2R7;

   R2a y R2b se seleccionan independientemente entre hidrógeno y metilo; 5

   R3 se selecciona entre alquenilo, alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, heterociclilo y heterociclilalquilo;

   R4 es hidroxi;

   R5 se selecciona entre hidrógeno, alquilo y cicloalquilo;

   R6 se selecciona entre hidrógeno, alquilo, alcoxicarbonilo, alquilaminocarbonilo, alquilcarbonilo, 10 aminocarbonilo, ariloxicarbonilo, cicloalquiloxicarbonilo, dialquilaminocarbonilo, haloalcoxicarbonilo, haloalquilo, haloalquilcarbonilo, heterocicliloxicarbonilo y (NRaRb)sulfonilo;

   R7 se selecciona entre alquilo, arilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, heterociclilo y -NRaRb; en el que el cicloalquilo y la parte cicloalquilo del (cicloalquil)alquilo están opcionalmente sustituidos con uno, dos o tres grupos seleccionados independientemente entre alquenilo, alcoxi, alcoxialquilo, alquilo, arilalquilo, 15 arilcarbonilo, ciano, cicloalquenilo, (cicloalquil)alquilo, halo, haloalcoxi, haloalquilo y (NReRf)carbonilo; y en el que Ra y Rb se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alcoxi, alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, haloalquilo, heterociclilo y heterociclilalquilo; y en el que Re y Rf se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo, arilo, arilalquilo y heterociclilo; en el que el arilo, la parte arilo del arilalquilo y el heterociclilo están opcionalmente sustituidos con uno o dos sustituyentes 20 seleccionados independientemente entre alcoxi, alquilo y halo; y

   Q es una cadena C3-9 saturada o insaturada, que contiene opcionalmente de uno a tres heteroátomos seleccionados independientemente entre O, S(O)m y NR9, en el que m es 0, 1 ó 2, y R9 se selecciona entre hidrógeno, alcoxi, alcoxicarbonilo, alquilo, alquilcarbonilo, alquilsulfonilo, aminocarbonilo, arilsulfonilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, cicloalquiloxi, dialquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilalquilo, haloalquilo y heterociclilcarbonilo. 25

   Q es una cadena C3-9 saturada o insaturada, que contiene opcionalmente de uno a tres heteroátomos seleccionados independientemente entre O, S(O)m y NR9, en el que m es 0, 1 ó 2, y R9 se selecciona entre hidrógeno, alcoxi, alcoxicarbonilo, alquilo, alquilcarbonilo, alquilsulfonilo, aminocarbonilo, arilsulfonilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, cicloalquiloxi, dialquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilalquilo, haloalquilo y heterociclilcarbonilo.
2. 2. Un compuesto de la reivindicación 1, que es un compuesto de fórmula (II) 30

   o un enantiómero, diastereómero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que

   R1 es -NHSO2R7;

   R2a y R2b son hidrógeno;

   R3 se selecciona entre alquenilo, alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, heterociclilo y 5 heterociclilalquilo;

   R4 es hidroxi;

   R5 es hidrógeno; R6 es alcoxicarbonilo;

   R7 se selecciona entre alquilo, arilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, heterociclilo y -NRaRb; en el que Ra y Rb se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alcoxi, alquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, 10 (cicloalquil)alquilo, haloalquilo, heterociclilo y heterociclilalquilo; y Q es una cadena C3-9 saturada o insaturada, que contiene opcionalmente de uno a tres heteroátomos seleccionados independientemente entre O, S(O)m y NR9, en el que m es 0, 1 ó 2, y R9 se selecciona entre hidrógeno, alcoxi, alcoxicarbonilo, alquilo, alquilcarbonilo, alquilsulfonilo, aminocarbonilo, arilsulfonilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, cicloalquiloxi, dialquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilalquilo, haloalquilo y heterociclilcarbonilo. 15
3. 3. Un compuesto de la reivindicación 1, o un enantiómero, diastereómero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que R1 es -NHSO2R7,
4. 4. Un compuesto de la reivindicación 2 ó 3, o un enantiómero, diastereómero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que R7 es cicloalquilo.
5. 5. Un compuesto de la reivindicación 1, 2, 3 ó 4, o un enantiómero, diastereómero o sal farmacéuticamente 20 aceptable del mismo, en el que Q es una cadena C6 insaturada que contiene cero heteroátomos.
6. 6. Un compuesto de la reivindicación 1 ó 2 seleccionado entre

   o un enantiómero, diastereómero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
7. 7. Una composición que comprende el compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o un 25 enantiómero, diastereómero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
8. 8. La composición de la reivindicación 7 que comprende además al menos un compuesto adicional que tiene actividad anti-VHC.
9. 9. La composición de la reivindicación 8 en la que al menos uno de los compuestos adicionales es un interferón o una ribavirina.
10. 10. La composición de la reivindicación 8 en la que al menos uno de los compuestos adicionales se selecciona 5 entre interleuquina 2, interleuquina 6, interleuquina 12, un compuesto que potencia el desarrollo de una respuesta de células T auxiliares de tipo 1, ARN de interferencia, ARN antisentido, Imiquimod, ribavirina, un inhibidor de inosina 5’-monofosfato deshidrogenasa, amantadina y rimantidina.
11. 11. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un enantiómero, diastereómero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de una infección por VHC. 10
12. 12. El compuesto para uso de la reivindicación 11, que comprende además al menos un compuesto adicional que tiene actividad anti-VHC para administrarse antes, después o de forma simultánea con un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o un enantiómero, diastereómero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
13. 13. El compuesto para uso de la reivindicación 12 en el que al menos uno de los compuestos adicionales es un 15 interferón o una ribavirina.