CN102046788B

CN102046788B - 胞内分枝杆菌检测用引物和探针、以及使用该引物和探针检测胞内分枝杆菌的方法

Info

Publication number: CN102046788B
Application number: CN2009801194533A
Authority: CN
Inventors: 石川友一
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 2008-05-28
Filing date: 2009-05-26
Publication date: 2013-07-10
Anticipated expiration: 2029-05-26
Also published as: US20110079512A1; JPWO2009145181A1; WO2009145181A1; EP2284262A4; EP2284262A1; HK1157395A1; ES2650066T3; EP2853594A1; US10359424B2; EP2853594B1; JP2014195461A; CN103224932A; CN102046788A; JP5958498B2

Abstract

本发明涉及：含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的一部分或全部、或者含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的互补序列的一部分或全部、且与胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)基因的碱基序列杂交的寡核苷酸；含有该寡核苷酸的胞内分枝杆菌检测用引物以及探针；使用该引物和/或探针检测胞内分枝杆菌的方法。

Description

胞内分枝杆菌检测用引物和探针、以及使用该引物和探针检测胞内分枝杆菌的方法

技术领域

本发明涉及利用核酸的扩增及其检测体系来检测或/和鉴定胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare，以下有时简称为“M.intracellulare”)的方法。

背景技术

在以下的本说明书的记载中，在表示核酸碱基时A表示腺嘌呤，C表示胞嘧啶，G表示鸟嘌呤、T表示胸腺嘧啶、U表示尿嘧啶。另外，称作“寡核苷酸”的情况有时也包括“多核苷酸”。

非结核性抗酸菌(nontuberculous mycobacterium)是被分类在分枝杆菌(Mycobacterium，以下有时单独简写为M.)属的具有抗酸性的性质的革兰氏阳性杆菌，是除结核菌群和麻疯分枝杆菌(Mycobacterium leprae)以外的一种抗酸菌。喀痰的抗酸菌涂片检查中呈现阳性的病例的15～20％在其后的菌种鉴定检查中被诊断为非结核性抗酸菌。

在非结核性抗酸菌中，临床上成为问题的菌种已知有胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)、海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、戈氏分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)、苏尔加分枝杆菌(Mycobacterium szulgai)、鸟分枝杆菌(Mycobacteriumavium)、蟾分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)、偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)、龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonei)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)等。

这其中最常见的是胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌。由于胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌非常相似、难以区分，因而将胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌合起来称作鸟分枝杆菌复合群(Mycobacterium avium complex，MAC)。非结核性抗酸菌症患者中约70％为MAC感染症，其次多的是堪萨斯分枝杆菌症，占20％。而其余的10％是由其它菌株引起的感染症。

非结核性抗酸菌一般毒力弱，可以说对健常人无害。但是，偶尔对人也表现出感染性。其中，已知MAC引起结核后遗症(肺感染症)，对于AIDS等易感染患者引起机会性感染。因此，迅速且正确地检测非结核性抗酸菌在治疗上特别重要。

而且，由于非结核性抗酸菌症近年有增加倾向，因此强烈希望开发出能在短时间内鉴别结核菌和非结核性抗酸菌的方法。并且，用核酸扩增法检测和/或诊断胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌的方法已应用于健康保险，即使从这方面出发，其诊断上的意义也较大。

另外，非结核性抗酸菌大多数对抗结核药表现出抗性。因此，当患者疑似为抗酸菌感染症时，结核症还是非结核性抗酸菌症的鉴别诊断在确定治疗方针上很重要。并且，由非结核性抗酸菌引起的疾病因其菌的种类不同治疗法也各异，所以确定其菌种也非常重要。然而，非结核性抗酸菌症没有特异性的临床症状。因此，根据临床观察、病理组织学观察来鉴别结核症与非结核性抗酸菌症，以及进一步确定非结核性抗酸菌的种类极其困难。因此，结核症还是非结核性抗酸菌症的诊断必须通过菌的鉴定来进行。

用于诊断非结核性抗酸菌症的一般的菌的鉴定法是喀痰涂片检查。但是，该检查仅能判断其病原菌是否是“抗酸菌阳性”，而无法鉴别该病原菌是结核菌还是非结核性抗酸菌。因此，通常，在喀痰涂抹检查中为阳性时，通过将菌在小川培养基等培养基上分离培养，进行菌的培养检查，鉴别是结核菌还是非结核性抗酸菌。然后再进行生物化学试验来鉴定菌种。然而，分枝杆菌属一般发育比较慢，例如，只进行菌的分离培养就需要3～4周。而且，要获得用于鉴定菌种的各种生物化学试验的结果，还需要2～3周。因此，进行以往的基本方法即如上的涂片检查和/或培养检查，获得是否是结核症的诊断结果的方法是需要相当长时间的方法。

另一方面，近年来，已经开发了在基因水平上检测菌的技术。例如，作为用于检测菌的有用方法，研究了利用聚合酶链反应(Polymerase ChainReaction，PCR)等核酸扩增技术的诊断技术。该方法由于灵敏度高，因此只要样品中有几个菌，就可以检测到菌。而且，有能够在短时间(最长4天)内检测到(能够鉴定菌种)的优点。但是，用通常的PCR法无法判断菌数。而且，无论是活菌还是死菌都同样地检测出来。而且，只要样品中有菌，则无论菌数多少都被判定为阳性。因此，用PCR法对患者所携带的细菌是否存在感染性的诊断是不确实的。并且，PCR法还存在由于灵敏度过高而容易出现假阳性的判定等问题。

作为利用PCR法检测胞内分枝杆菌的方法，例如有：使用特异于MacSequevar基因区域、鸟分枝杆菌19千道尔顿蛋白质(MAV19k)基因区域和胞内分枝杆菌核糖体蛋白质s1基因区域的二个以上区域的寡核苷酸引物的多重引物组，检测是否存在MAC核酸的方法(专利文献1)。但是，该检测方法无法判别胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌。另外，在所使用的利用rps1引物(根据胞内分枝杆菌核糖体蛋白质s1基因区域设计的引物)的PCR中，在样品是鸟分枝杆菌分离株时也会检测到扩增产物，在对胞内分枝杆菌的特异性方面存在问题。

而且，已知使用扩增夹着基因插入序列IS901的插入部位的DNA碱基序列的引物进行PCR，根据获得的引物延伸产物的链长，判定是鸟结核菌(鸟分枝杆菌)还是胞内分枝杆菌的方法(专利文献2)。但是，在使用该引物的PCR中，不论样品是鸟结核菌(鸟分枝杆菌)还是胞内分枝杆菌都能获得引物延伸产物，因此该判别方法不能说是特异于胞内分枝杆菌的方法。而且，根据引物延伸产物的链长判别这二者这样的方法复杂，并且还存在根据判断者不同而其判定结果不同的情况，不能说是准确的判定方法。

除PCR法之外，还有利用链置换扩增法(SDA法，Strand DisplacementAmplification Method)的检测方法。例如，特开平10-4984号公报(专利文献3)中公开了以编码分枝杆菌α抗原的一部分的BCG85-B基因的63个核苷酸的片段为目标的方法。该方法是使用扩增胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌这两种菌所具有的BCG85-B基因的目标序列的引物，用SDA法进行核酸扩增反应，然后基于该结果检测MAC的方法。即，在该方法中使用的引物是使胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌这两者扩增的引物。但是，该方法理所当然地在样品中存在胞内分枝杆菌时和存在鸟分枝杆菌时这两种情况下都能获得引物延伸产物。因此，通过该方法可以检测MAC，但无法特异性地检测胞内分枝杆菌。另外，即使在检测MAC时，也存在出现假阳性的情况。

特开2001-103986号公报(专利文献4)中公开了用于检测MAC的引物，作为捕捉探针和检测用探针使用的寡核苷酸。然而，该引物扩增来自胞内分枝杆菌和鸟型结核菌(鸟分枝杆菌)这两种菌所具有的dnaJ基因的48bp目标序列。即，在样品中存在胞内分枝杆菌的情况、存在鸟分枝杆菌的情况下都会发生扩增反应。因此，使用该引物进行SDA法，使用捕捉探针和检测用探针检测引物延伸产物，基于其结果能够进行MAC的检测。但是，该方法不能不检测到鸟分枝杆菌而特异性地仅检测胞内分枝杆菌。

此外，还有利用LAMP(环介导等温扩增，Loop-Mediated IsothermalAmplification)法来扩增胞内分枝杆菌的核酸的方法(专利文献5)等。但是，LAMP法存在无法确定所扩增的DNA的碱基序列、能够有效扩增的DNA的长度有限、出现假阳性等问题。

为了解决这些问题，本发明者已经提出了PCT/JP2007/059251号专利申请(专利文献6)。该申请中公开了主要以能够与鸟分枝杆菌相区别地识别、检测胞内分枝杆菌为目的而开发的引物和探针。另外，通过该发明，与现有方法相比，能够区别于其它分枝杆菌属细菌、特异性且迅速地检测胞内分枝杆菌。

专利文献1：特开平11-69999号公报

专利文献2：日本专利第3111213号公报

专利文献3：特开平10-4984号公报

专利文献4：特开2001-103986号公报

专利文献5：特开2005-204582号公报

专利文献6：国际公开第2007/129628号小册子

非专利文献1：F.Poly et al.，J.Bacteriology，2004，186(14)，p.4781-4795

发明内容

发明要解决的课题

本发明的课题是提供排除了诊断上的假阳性的新的胞内分枝杆菌检测用引物，以及使用该引物简便、迅速且高精度地检测胞内分枝杆菌的方法。

用于解决课题的方法

本发明是为了解决上述课题而完成的发明，其构成如下。

(1)一种寡核苷酸，其含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的一部分或全部、或者含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与胞内分枝杆菌基因的碱基序列杂交。

(2)一种胞内分枝杆菌检测用引物，其含有下述寡核苷酸，所述寡核苷酸含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的一部分或全部、或者含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与胞内分枝杆菌基因的碱基序列杂交。

(3)一种胞内分枝杆菌检测用探针，其含有下述寡核苷酸，所述寡核苷酸含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的一部分或全部、或者含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与胞内分枝杆菌基因的碱基序列杂交。

(4)一种胞内分枝杆菌的检测方法，其特征在于，使用下述寡核苷酸作为引物或/和探针，所述寡核苷酸含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的一部分或全部、或者含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与胞内分枝杆菌基因的碱基序列杂交。

(5)一种胞内分枝杆菌检测用试剂盒，其包含下述寡核苷酸作为引物或/和探针，所述寡核苷酸含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的一部分或全部、或者含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与胞内分枝杆菌基因的碱基序列杂交。

已知在包括胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌的鸟分枝杆菌复合群(Mycobacterium avium complex，MAC)中，存在28种血清型。因此，特定下述DNA区域在技术上是非常困难的，所述DNA区域(1)是在胞内分枝杆菌的菌株(strain)之间高度保守的共有序列，并且(2)能作为用于从包括鸟分枝杆菌的其它近缘种中仅识别、鉴定出胞内分枝杆菌的标记(靶)序列使用。

因此，在现在已知的追求特异性(回避假阳性)的引物组中，找不到多样的胞内分枝杆菌菌株之间的共有序列。即，从包括鸟分枝杆菌的其它近缘种中仅识别、鉴定出某特定菌株的胞内分枝杆菌是可能的。但是，在使用该引物组进行胞内分枝杆菌的判定时，仅能判定感染了能用该引物组检测的某特定胞内分枝杆菌菌株的情况，而不能判定感染了其它胞内分枝杆菌菌株的情况。

另一方面，以作为共有序列(回避假阴性)为重点的引物组相反地对胞内分枝杆菌的特异性低。

因此，现在，在判定是否感染了多种血清型或菌株的胞内分枝杆菌的任一种时，必须进行如下的两步操作：使用扩增所有抗酸菌的引物组进行PCR；然后，使所得的扩增DNA片段与胞内分枝杆菌的特异性探针序列杂交。因此非常繁琐。

本发明者鉴于这种状况，以上述专利申请的发明为基础，为了确立更加优异的胞内分枝杆菌的检测方法而进行了深入研究。

其结果是，开发出了不仅能够与其它分枝杆菌属相区别地特异性地检测胞内分枝杆菌、而且能够检测在胞内分枝杆菌的多种菌株之间高度保守的序列区域的引物和探针。然后发现，仅使用选自该开发出的引物中的一组引物组进行PCR(不需要如上所述的二步检测操作)，就能够检测存在多种血清型或菌株(strain)的胞内分枝杆菌中的任何种的情况，从而完成了本发明。

发明的效果

根据使用本发明的引物或/和探针的胞内分枝杆菌的检测方法，可以远比现有的通过菌的培养检查等鉴定菌种的方法更加迅速且高精确度地进行胞内分枝杆菌的检测。另外，通过用本发明的检测方法进行胞内分枝杆菌的检测，与现有的通过使用引物或/和探针的PCR法进行的诊断方法相比，可以排出诊断上的假阳性，能够更高精度、正确且特异性地进行胞内分枝杆菌的检测和诊断。并且，通过使用本发明的检测方法，还可以进行胞内分枝杆菌菌体的定量。

另外，根据使用本发明的引物的胞内分枝杆菌的检测方法，无需使用多种引物组，仅通过一次操作就可以检测存在多种血清型或菌株(strain)的胞内分枝杆菌的任一者的情况。而且，由此还获得了检测操作变得简单、诊断所需时间也缩短这样的效果。

附图说明

图1是实施例2获得的熔解曲线分析的结果，该结果是以使用Mint02_T7pa Fw1和引物Mint 02_T7pa Rv1、使用来源于各胞内分枝杆菌菌株的各DNA样品或来源于鸟分枝杆菌的DNA样品作为模板、通过嵌入剂法进行的实时PCR的结果为基础获得的。

图2是实施例4获得的熔解曲线分析的结果，该结果是以使用Mint02_T7pa Fw1和引物Mint 02_T7pa Rv1，使用来源于18种分枝杆菌属细菌的DNA样品和来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的DNA样品作为模板、通过嵌入剂法进行的实时PCR的结果为基础获得的熔解曲线分析的结果。

图3是实施例6获得的扩增曲线，该扩增曲线是通过使用Mint02_T7pa Fw1和引物Mint 02_T7pa Rv1、使用来源于胞内分枝杆菌的DNA样品作为模板的实时PCR获得的。

图4显示实施例4所进行的实时PCR检测结果，是将Ct值(y轴)相对于各PCR用DNA样品的基因组的拷贝数(x轴，对数值)作图而得的标准曲线。

具体实施方式

在本发明中，所谓胞内分枝杆菌基因，是指胞内分枝杆菌所具有的全基因组序列中的任意碱基序列单元(区域)。胞内分枝杆菌的全基因组序列尚未解读出。

作为本发明的寡核苷酸，可列举下述寡核苷酸，所述寡核苷酸含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的一部分或全部、或者含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与胞内分枝杆菌基因的碱基序列杂交(以下，有时简称为“本发明的寡核苷酸”)。

作为本发明的含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸的例子，可列举例如：(1)含有与序列号1～15的任一者所示碱基序列具有约70％以上、优选为约80％以上、更优选为约90％以上、进一步优选为约95％以上的同源性的碱基序列的寡核苷酸；或(2)以含有序列号1～15的任一者所示碱基序列中的连续10个以上碱基、优选为15个以上碱基、更优选为18个以上碱基为特征的寡核苷酸等。

作为本发明的含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的全部的寡核苷酸的具体例，可列举例如，由序列号1～15的任一者所示碱基序列构成的寡核苷酸、或含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的寡核苷酸。

作为含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例，可列举例如，含有序列号16～129的任一者所示碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸。优选列举含有序列号16～129的任一者所示碱基序列中的连续的10个以上碱基、优选为15个以上碱基、更优选为18个以上碱基的寡核苷酸。

作为含有序列号16～129的任一者所示碱基序列的全部的寡核苷酸的具体例，可列举由序列号16～129的任一者所示碱基序列构成的寡核苷酸、或含有序列号16～129的任一者所示碱基序列的寡核苷酸。

作为含有序列号1所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例，可列举例如，含有序列号16～23或序列号92～95的任一者所示碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸。

作为含有序列号2所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例，可列举例如，含有序列号24～27或序列号96～97的任一者所示碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸。

作为含有序列号3所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例，可列举例如，含有序列号28～33或序列号98～100的任一者所示碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸。

作为含有序列号4所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例，可列举例如，含有序列号34～35或序列号101的任一者所示碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸。

作为含有序列号5所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例，可列举例如，含有序列号36～39或序列号102～103的任一者所示碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸。

作为含有序列号6所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例，可列举例如，含有序列号40～47或序列号104～107的任一者所示碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸。

作为含有序列号7所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例，可列举例如，含有序列号48～53或序列号108～110的任一者所示碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸。

作为含有序列号8所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例，可列举例如，含有序列号54～57或序列号111～112的任一者所示碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸。

作为含有序列号9所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例，可列举例如，含有序列号58～63或序列号113～115的任一者所示碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸。

作为含有序列号10所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例，可列举例如，含有序列号64～69或序列号116～118的任一者所示碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸。

作为含有序列号11所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例，可列举例如，含有序列号70～73或序列号119～120的任一者所示碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸。

作为含有序列号12所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例，可列举例如，含有序列号74～77或序列号121～122的任一者所示碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸。

作为含有序列号13所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例，可列举例如，含有序列号78～81或序列号123～124的任一者所示碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸。

作为含有序列号14所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例，可列举例如，含有序列号82～87或序列号125～127的任一者所示碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸。

作为含有序列号15所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例，可列举例如，含有序列号88～91或序列号128～129的任一者所示碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸。

作为本发明的含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的互补序列的一部分或全部的寡核苷酸，可列举例如，含有与本发明的由序列号1～15的任一者所示碱基序列构成的寡核苷酸杂交的碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸等。

作为上述的含有与本发明的由序列号1～15的任一者所示碱基序列构成的寡核苷酸杂交的碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸，具体可列举具有与本发明的由序列号1～15的任一者所示碱基序列构成的寡核苷酸在高严格条件或严格条件下杂交的碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸等。

此外，这里所谓“高严格条件”，具体是例如“在50％甲酰胺中在42～70℃、优选为60～70℃进行杂交，然后在0.2～2×SSC、0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)中、在25～70℃进行洗涤”这样的条件。

另外，所谓“严格条件”，具体是例如“在6×SSC或盐浓度与其同等的杂交溶液中、在50～70℃的温度条件下杂交16小时，根据需要在6×SSC或盐浓度与其同等的溶液等中进行预洗涤，然后在1×SSC或盐浓度与其同等溶液等中进行洗涤”这样的条件。

作为本发明的含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的互补序列的一部分或全部的寡核苷酸的例子，可列举例如，(1)含有与序列号1～15的任一者所示碱基序列的互补序列具有约70％以上、优选为约80％以上、更优选为约90％以上、进一步优选为约95％以上的同源性的碱基序列的寡核苷酸；或(2)以含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的互补序列中的连续10个以上碱基、优选为15个以上碱基、更优选为20个以上碱基为特征的寡核苷酸等。

作为本发明的含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的互补序列的全部的寡核苷酸的具体例，可列举例如，由序列号1～15的任一者所示碱基序列的互补序列构成的寡核苷酸、或含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的互补序列的寡核苷酸。

作为含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的互补序列的一部分的寡核苷酸的具体例，可列举例如，含有序列号16～129的任一者所示碱基序列的互补序列的一部分或全部的寡核苷酸。优选列举含有序列号16～129的任一者所示碱基序列的互补序列中的连续10个以上碱基、优选为15个以上碱基、进一步优选为18个以上碱基的寡核苷酸。

作为含有序列号16～序列号129的任一者所示碱基序列的互补序列的全部的寡核苷酸的具体例，可列举例如，由序列号16～129的任一者所示碱基序列的互补序列构成的寡核苷酸、或含有序列号16～129的任一者所示碱基序列的互补序列的寡核苷酸。

本发明中所谓与胞内分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸，可列举上述的具有与胞内分枝杆菌基因的碱基序列在高严格条件或严格条件下杂交的碱基序列的寡核苷酸等。该高严格条件和严格条件如上所述。

此外，本发明的寡核苷酸既可以是脱氧核糖核酸(DNA)也可以是核糖核酸(RNA)。当然在为核糖核酸时要将胸腺嘧啶残基(T)替换为尿嘧啶残基(U)。还可以是在合成时将任意位置的T变换成U而进行合成所得的、含有尿嘧啶残基的DNA。同样可以是将任意位置的U变换成T而得的含有胸腺嘧啶残基的RNA。另外，还可以缺失、插入或置换一个或多个核苷酸。一个或多个核苷酸可以是肌苷酸(I)等修饰核苷酸。

作为获得本发明的寡核苷酸的方法，不特别限制，可列举例如，通过本身公知的化学合成法来制备的方法。该方法与通过使用载体等的基因操作法来获得寡核苷酸或多核苷酸的方法(克隆法)相比，能够容易、大量且廉价地获得一定品质的寡核苷酸。

例如，只要如在DNA合成中通常进行的那样，使用DNA合成仪，用通常的亚磷酰胺法合成寡核苷酸，通过使用阴离子交换柱层析的常规方法进行纯化，就可以获得作为目标的本发明的寡核苷酸。

另外，还可以将寡核苷酸的合成委托商家，从商家购买。

作为寻找(筛选)能够实现本发明的目的的寡核苷酸的方法，有FEMSMicrobiology Letters 166：63-70，1998或Systematic and AppliedMicrobiology 24：109-112，2001等中所示的扣除法。本法是从来源于目标基因组DNA的片段群中除去与来源于想要区别的生物种的基因组DNA的片段群反应的片段，从而浓缩候选序列的方法。

另外，还有制成来源于目标基因组DNA和想要区别的生物种的基因组DNA的扩增产物的差异显示这样的方法。即利用随机引物的聚合酶链反应(AP-PCR)的方法等(特开平11-155589号公报)。

此外，通过使用被称为微阵列法的方法，也可以寻找能实现本发明的目标的寡核苷酸，从而能够得到本发明的寡核苷酸。该方法的概略如下。

即，例如制成来源于胞内分枝杆菌的基因组DNA的鸟枪法克隆，从得到的鸟枪法克隆中纯化DNA。接着，通过PCR等扩增来源于该鸟枪法克隆的纯化DNA，然后配置在载玻片上，并通过常规方法制成微阵列。另外，制作将来源于作为检测对象的胞内分枝杆菌的基因组DNA进行荧光标记(标记1)而得的DNA片段群。另一方面，另外制作将来源于想要区别的生物种的基因组DNA进行荧光标记(标记2)而得的DNA片段群。然后，在同一反应体系分别使用标记1和标记2进行竞争杂交法，从而检测微阵列上的纯化DNA与标记1和标记2的反应性(结合性)。通过该检测，能够选定与来源于作为目标的胞内分枝杆菌的基因组DNA的片段群(标记1)更特异性地反应的序列候选群(例如，非专利文献1等)。

通过以上方法，可以选择出与作为目标的胞内分枝杆菌基因的碱基序列特异性地杂交的寡核苷酸。

以下，对于使用微阵列法来选定本发明的寡核苷酸的方法的一例进行详细说明。

(1)来源于胞内分枝杆菌的纯化基因组DNA的制备

首先，将胞内分枝杆菌菌株通过常规方法(例如，高压釜处理和使用玻璃珠等的菌体粉碎处理)进行破碎处理，然后按照常规方法进行DNA的提取、纯化。

(2)全基因组鸟枪法文库的制作

作为制作胞内分枝杆菌的全基因组鸟枪法文库(Whole GenomeShotgun library)的方法的一例，以下说明将Venter et al.，Science.2001 Feb16；291(5507)：1304-1351所记载的全基因组鸟枪法进行了改变而得的方法。

首先，将上述(1)所获得的来源于胞内分枝杆菌的纯化基因组DNA用适当的缓冲液等稀释，然后例如在终浓度20％的甘油存在下，在5kPa～9kPa的压力下，使用雾化器处理约1～15分钟，从而进行DNA的片段化处理。将所得的组分使用市售的提取柱进行纯化。

然后将得到的组分(DNA片段，含有目的DNA片段)按照常规方法通过连接整合到载体DNA中，得到重组DNA(胞内分枝杆菌的全基因组鸟枪法文库)。

作为用于上述操作的载体DNA，当之后转化的宿主细胞为大肠杆菌时，例如为pBS[例如pBSII sk+载体(Stratagene社)]、pQE-TRI质粒(Qiagen社制)、pBluescript、pET、pGEM-3Z、pGEX等载体。根据所使用的载体种类不同，可以在连接之前，预先将DNA片段用DNA聚合酶处理，并将DNA片段的末端进行平端化处理。

然后，用得到的重组DNA转化适当的宿主细胞，得到转化体。

作为用于上述操作的宿主细胞，可列举例如，大肠杆菌(E.coli)，优选列举JM109、DH5α、TOP10等。此外，还可使用质粒和/或噬菌体DNA的导入效率更高的感受态细胞(Competent Cell)。可列举例如，大肠杆菌JM109感受态细胞(タカラバイオ社制)等。

宿主细胞的转化可以通过常规方法[例如，D.M.Morrison的方法(Method in Enzymology，68，326-331，1979)等]进行。另外，在使用市售的感受态细胞的情况下，只要根据该制品的说明书进行转化即可。

作为选择导入了“整合了目的DNA片段的重组DNA”的转化体的方法，例如，有利用用于转化的载体的性质的方法。例如，在使用含有氨苄青霉素抗性基因的载体的情况下，通过在含有氨苄青霉素的培养基上培养转化体，并对得到的克隆进行选择，可以容易地获得导入了“整合了目标DNA片段的重组DNA”的转化体的文库(来源于胞内分枝杆菌的基因组DNA的全基因组鸟枪法克隆文库)。

(3)微阵列制作

接下来用下述方法制作微阵列。

即，按照常规方法从上述(2)所得的转化体的文库(来源于胞内分枝杆菌的基因组DNA的全基因组鸟枪法克隆文库)中纯化DNA。

使用纯化的DNA作为模板，使用适当的引物[也可以是市售的引物，例如M13Primer M1(タカラバイオ社制)、M13Primer RV(タカラバイオ社制)等]，按照常规方法进行PCR，然后纯化获得的PCR扩增产物。接着，按照常规方法将纯化的PCR扩增产物点样在微阵列用载玻片上。对该载玻片进行UV照射(60mJ～300mJ/cm²，通常为150mJ/cm²)，使PCR扩增产物(具有由来源于作为目标的胞内分枝杆菌的基因组DNA进行片段化而得的碱基序列)固定在载玻片上，从而制作微阵列。

(4)目标基因组DNA的荧光色素标记

(i)目标基因组DNA的荧光色素标记

例如，通过使用己氨基-UTP的间接标记法等常规方法，用标记物质标记例如用上述(1)的方法获得的来源于胞内分枝杆菌的纯化基因组DNA。另外，用与标记上述来源于胞内分枝杆菌的纯化基因组DNA的标记物质不同的标记物质标记对照用基因组DNA(来源于想要与胞内分枝杆菌区别的生物种的基因组DNA)。

作为上述DNA的标记中所使用的标记物质，可以例举通常在该领域中使用的标记物质，作为广泛使用的标记物质，可以例举Alexa555(インビトロジエン社商品名)、Alexa647(インビトロジエン社商品名)、Cy3(アマシヤムバイオサイエンス株式会社商品名)、Cy5(アマシヤムバイオサイエンス株式会社商品名)等。

作为使用如上所述的标记物质来标记上述DNA的方法，可列举例如，将DeRisi研究室(www.microarrays.org)所发表的方案进行改变而得的间接标记法。该方法如下：首先进行酶延伸反应，制成分子内掺入了带有氨基的αUTP的DNA链；然后通过使荧光色素(琥珀酰亚胺体)化学键合在该DNA链的氨基上来标记DNA。该方法中直到标记DNA之前的DNA链(掺入了αUTP)的制备可以使用BioPrime DNA labeling system(Invitrogen社制)等市售试剂盒。

以下，显示使用Alexa647和/或Alexa555、通过上述方法来标记DNA的方法的一例。

即，首先，按照常规方法将起始材料(来源于胞内分枝杆菌的纯化基因组DNA、或对照用基因组DNA)进行热变性处理。接着，在热变性处理物中添加DTT 2μl、dATP/dCTP/dGTP的混合液、dTTP、Ha-dUTP、克列诺酶，于37℃进行3小时左右的延伸反应。将得到的反应产物装到超滤柱中，以14000转/分钟离心4分钟左右，然后将浓缩液回收到微管中，用真空干燥离心机等使其干燥。然后向干燥的上述反应产物中加入NaHCO₃并混合，在常温静置2～3分钟。

另外制备将Alexa555(或Alexa647)溶于DMSO而得的溶液(染色溶液Alexa555、染色溶液Alexa647)。将该染色溶液Alexa555加入到使用对照用基因组DNA获得的上述反应产物中。另外，将染色溶液Alexa647加入到使用来源于胞内分枝杆菌的基因组DNA获得的上述反应产物中。将各个反应产物在40℃、避光下温育60分钟左右。再向各个反应产物中加入4M NH₂OH，搅拌之后在避光下温育15分钟左右，获得各个基因组DNA的标记产物。然后，将所得的标记产物上样至超滤柱，以14000转/分钟离心4分钟左右，然后将浓缩液回收到微管中，用真空干燥离心机使其干燥。

(ii)标记产物的片段化工序

制备终浓度为0.04M Tris-乙酸(pH8.1)、0.1M乙酸钾、0.03M乙酸镁四水合物的组成的溶液，将其加入到上述(4)(i)所得的干燥状态的各基因组DNA的标记产物中，使其悬浮混合。在94℃加热处理15分钟左右，获得100个碱基～300个碱基的将各基因组DNA的标记产物片段化而得的片段化物(分别为Alexa555标记产物、Alexa647标记产物)。

将所得的Alexa555标记产物和Alexa647标记产物分别上样至超滤柱，以14000转/分钟离心4分钟左右，然后将各浓缩液回收到同一个微管中，用真空干燥离心机等使其完全干燥。

接着，加入鲑鱼精DNA和ArrayHyb杂交缓冲液而制备试剂溶液，将其加入到上述微管中，使上述所得的干燥物悬浮混合，然后在95℃温育5分钟左右，制备Alexa555-Alexa647标记产物混合溶液。

(5)微阵列杂交

在上述(3)的工序获得的、来源于胞内分枝杆菌的基因组DNA的全基因组鸟枪法克隆的微阵列上，上样上述(4)(ii)所制备的Alexa555-Alexa647标记产物混合溶液，在约65℃、避光下反应8小时以上，进行杂交。杂交之后，洗涤微阵列，以800转/分钟离心约5分钟，使其干燥。

(6)荧光强度的测定：从信号检测到数量化

使用荧光解读扫描仪，测定上述(5)所得的经微阵列杂交处理的微阵列上的荧光强度。这时，测定在Alexa555和Alexa647的2信道的荧光强度，得到荧光检测数据。

荧光信号的数量化只要使用市售的DNA芯片表达图像分析软件等来进行即可。然后，按照软件的操作步骤进行斑点自动识别、背景计算、荧光强度比的归一化即可。

杂交中所用的Alexa647标记产物是将来源于胞内分枝杆菌的基因组DNA进行标记而得DNA的片段(fragment)群，Alexa555标记产物是将对照用基因组DNA进行标记而得的DNA的片段(fragment)群。因此，在测定微阵列上的某个斑点的Alexa555和Alexa647各自的荧光强度的结果是Alexa647与Alexa555的荧光强度比高的情况下，表示该斑点的DNA片段(PCR产物)与Alexa647标记产物、即来源于胞内分枝杆菌的基因组DNA更强地杂交。从而，判断该DNA片段(PCR产物)对胞内分枝杆菌的特异性高。

另一方面，在测定某个斑点的Alexa555和Alexa647各自的荧光强度的结果是Alexa647与Alexa555的荧光强度比低的情况下，表示该斑点的DNA片段(PCR产物)对来源于胞内分枝杆菌的基因组DNA的特异性低，因而观察到了与Alexa555标记产物、即对照用基因组DNA的交叉反应。在这种情况、以及Alexa555与Alexa647的荧光强度同程度的情况、未检测到Alexa555和Alexa647任一者的荧光的情况下，判断该斑点的DNA片段(PCR扩增产物)对胞内分枝杆菌的特异性低。

因此，例如，基于微阵列上检测到的Alexa555/Alexa647的荧光强度比(Ratio)，制成散点图(Scatter plot)等，从而分析结果。然后，筛选对胞内分枝杆菌特异性的序列。

筛选的结果是选择出获得了胞内分枝杆菌特异性信号的(Alexa647的荧光强度较强的情况)斑点，作为候选。

此外，为了从选择出的斑点的中进一步选择用于胞内分枝杆菌特异性检测的候选序列，还可以进行二次筛选。

例如，(a)将来源于多种胞内分枝杆菌菌株的基因组DNA通过与上述同样的方法用标记物质进行标记，并进行片段化。

(b)同样地，作为对照将来源于想要区别的生物种的基因组DNA用与胞内分枝杆菌菌株不同的标记物质进行标记，并进行片段化。

对于各个胞内分枝杆菌菌株，分别获得该(a)与(b)的混合溶液，即，来源于该胞内分枝杆菌菌株的基因组DNA的标记产物的片段化物与来源于对照菌株的基因组DNA的标记产物的片段化物的混合物。

使用各个标记片段的混合物，相对于点样有一次筛选所选择出的候选斑点的微阵列进行竞争杂交。然后，选择出与来源于多种胞内分枝杆菌菌株的基因组DNA的标记片段重复反应的斑点。将该斑点的DNA片段确定为最终的候选克隆。

接着，利用本领域中通常使用的测序仪、例如ABI PRISM310毛细管测序仪(アプライドバイオ社)等仪器，按照常规方法确定所得的候选克隆的碱基序列。

作为本发明的胞内分枝杆菌检测用引物，可列举含有下述寡核苷酸的引物，所述寡核苷酸含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的一部分或全部、或者含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与胞内分枝杆菌基因的碱基序列杂交(以下，有时记为本发明的引物)。

另外，本发明的引物可以根据PCR(包括实时PCR)等核酸扩增反应、核酸杂交等的条件，从含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸、或含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的互补序列的一部分或全部的寡核苷酸中，考虑解离温度(Tm值)等而选择出适当区域的适当长度，从而设计出。

考虑到为了维持作为引物序列的特异性所需的碱基数，优选列举具有10～50碱基、更优选为10～35碱基、进一步优选为18～25碱基、特别优选为18～22碱基的长度的寡核苷酸。

设计引物时只要使用一般用于引物设计的软件，例如，引物设计用的Web工具Primer3(Whitehead Institute for Biomedical Research.)等即可。

本发明的引物中所用的含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的一部分或全部、或者含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的互补序列的一部分或全部、且与胞内分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸(本发明的寡核苷酸)的具体例与上述本发明的寡核苷酸的说明中所记载的相同。

作为本发明的引物的具体例，可列举例如，含有序列号16～129的任一者所示碱基序列的一部分或全部、且与胞内分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸，或含有序列号16～129的任一者所示碱基序列的互补序列的一部分或全部、且与胞内分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸。

作为本发明的引物的优选具体例，可列举例如，含有序列号16～91的任一者所示碱基序列的一部分或全部、且与胞内分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸，或含有序列号16～91的任一者所示碱基序列的互补序列的一部分或全部、且与胞内分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸。

作为本发明的引物的更优选具体例，可列举例如，含有序列号16～19、24、25、28、29、34～37、40～43、48、49、54～59、64、65、70、71、74、75、78、79、82、83、88、89的任一者所示碱基序列的一部分或全部、且与胞内分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸，或含有序列号16～19、24、25、28、29、34～37、40～43、48、49、54～59、64、65、70、71、74、75、78、79、82、83、88、89的任一者所示碱基序列的互补序列的一部分或全部、且与胞内分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸。

作为本发明的引物的进一步优选具体例，可列举例如，由序列号16～19、24、25、28、29、34～37、40～43、48、49、58、59、64、65、70、71、74、75、78、79、82、83、88、89的任一者所示碱基序列构成、且与胞内分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸，或由序列号16～19、24、25、28、29、34～37、40～43、48、49、58、59、64、65、70、71、74、75、78、79、82、83、88、89的任一者所示碱基序列的互补序列构成、且与胞内分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸。

此外，含有序列号16～23所示碱基序列的引物，是以序列号1所示碱基序列为基础设计出的。

含有序列号24～27所示碱基序列的引物，是以序列号2所示碱基序列为基础设计出的。

含有序列号28～33所示碱基序列的引物，是以序列号3所示碱基序列为基础设计出的。

含有序列号34～35所示碱基序列的引物，是以序列号4所示碱基序列为基础设计出的。

含有序列号36～39所示碱基序列的引物，是以序列号5所示碱基序列为基础设计出的。

含有序列号40～47所示碱基序列的引物，是以序列号6所示碱基序列为基础设计出的。

含有序列号48～53所示碱基序列的引物，是以序列号7所示碱基序列为基础设计出的。

含有序列号54～57所示碱基序列的引物，是以序列号8所示碱基序列为基础设计出的。

含有序列号58～63所示碱基序列的引物，是以序列号9所示碱基序列为基础设计出的。

含有序列号64～69所示碱基序列的引物，是以序列号10所示碱基序列为基础设计出的。

含有序列号70～73所示碱基序列的引物，是以序列号11所示碱基序列为基础设计出的。

含有序列号74～77所示碱基序列的引物，是以序列号12所示碱基序列为基础设计出的。

含有序列号78～81所示碱基序列的引物，是以序列号13所示碱基序列为基础设计出的。

含有序列号82～87所示碱基序列的引物，是以序列号14所示碱基序列为基础设计出的。

含有序列号88～91所示碱基序列的引物，是以序列号15所示碱基序列为基础设计出的。

序列号1所示碱基序列上的、设计为引物的序列号16～23所示碱基序列的存在位置分别如下。

序列号16(Mint 02_T7pa Fw1)：266位～287位、

序列号17(Mint 02_T7pa Rv1)：361位～381位、

序列号18(Mint 02_T3pa Fw1)：173位～190位、

序列号19(Mint 02_T3pa Rv1)：324位～341位、

序列号20(Mint 02_con Fw1)：425位～443位、

序列号21(Mint 02_con Rv1)：570位～589位、

序列号22(Mint 02_con Fw2)：63位～80位、

序列号23(Mint 02_con Rv2)：245位～262位。

序列号2所示碱基序列上的、设计为引物的序列号24～27所示碱基序列的存在位置分别如下。

序列号24(Mint 04_con Fw1)：40位～59位、

序列号25(Mint 04_con Rv1)：187～205位、

序列号26(Mint 04_T3pa Fw1)：394位～412位、

序列号27(Mint 04_T3pa Rv1)：519位～538位。

序列号3所示碱基序列上的、设计为引物的序列号28～33所示碱基序列的存在位置分别如下。

序列号28(Mint 06_T3pa Fw1)：458位～475位、

序列号29(Mint 06_T3pa Rv1)：608位～627位、

序列号30(Mint 06_con Fw1)：260位～278位、

序列号31(Mint 06_con Rv1)：389位～408位、

序列号32(Mint 06_con Fw3)：153位～170位、

序列号33(Mint 06_conRv3)：301位～318位。

序列号4所示碱基序列上的、设计为引物的序列号34～35所示碱基序列的存在位置分别如下。

序列号34(Mint 17_T3pa Fw1)：118位～137位、

序列号35(Mint 17_T3pa Rv1)：282位～299位。

另外，序列号5所示碱基序列上的、设计为引物的序列号36～39所示碱基序列的存在位置分别如下。

序列号36(Mint 07_FWpa Fw1)：106位～123位、

序列号37(Mint 07_FWpa Rv1)：202位～220位、

序列号38(Mint 07_con Fw1)：362位～381位、

序列号39(Mint 07_con Rv1)：500位～518位。

序列号6所示碱基序列上的、设计为引物的序列号40～47所示碱基序列的存在位置分别如下。

序列号40(Mint 10_FWpa Fw1)：496位～513位、

序列号41(Mint 10_FWpa Rv1)：613位～632位、

序列号42(Mint 10_con Fw2)：750位～769位、

序列号43(Mint 10_con Rv2)：858位～877位、

序列号44(Mint 10_RVpa Fw1)：184位～201位、

序列号45(Mint 10_RVpa Rv1)：336位～353位、

序列号46(Mint 10_con Fw1)：141位～159位、

序列号47(Mint 10_con Rv1)：312位～329位。

序列号7所示碱基序列上的、设计为引物的序列号48～53所示碱基序列的存在位置分别如下。

序列号48(Mint 14_T3pa Fw1)：141位～160位、

序列号49(Mint 14_T3pa Rv1)：249位～266位、

序列号50(Mint 14_FWpa Fw1)：174位～192位、

序列号51(Mint 14_FWpa Rv1)：304位～323位、

序列号52(Mint 14_con Fw1)：401位～421位、

序列号53(Mint 14_con Rv1)：513位～530位。

序列号8所示碱基序列上的、设计为引物的序列号54～57所示碱基序列的存在位置分别如下。

序列号54(Mint 15_RVpa Fw1)：174位～193位、

序列号55(Mint 15_RVpa Rv1)：294位～312位、

序列号56(Mint 15_con Fw1)：374位～391位、

序列号57(Mint 15_con Rv1)：522位～541位。

序列号9所示碱基序列上的、设计为引物的序列号58～63所示碱基序列的存在位置分别如下。

序列号58(Mint 19_T3pa Fw1)：853位～872位。

序列号59(Mint 19_T3pa Rv1)：972位～990位、

序列号60(Mint 19_FWpa Fw1)：183位～200位、

序列号61(Mint 19_FWpa Rv1)：336位～354位、

序列号62(Mint 19_con Fw1)：512位～530位、

序列号63(Mint 19_con Rv1)：642位～659位。

序列号10所示碱基序列上的、设计为引物的序列号64～69所示碱基序列的存在位置分别如下。

序列号64(Mint 21_FWpa Fw1)：902位～921位、

序列号65(Mint 21_FWpa Rv1)：1015位～1032位、

序列号66(Mint 21_T3pa Fw1)：178位～197位、

序列号67(Mint 21_T3pa Rv1)：271位～290位、

序列号68(Mint 21_con Fw1)：425位～443位、

序列号69(Mint 21_con Rv1)：589位～608位。

序列号11所示碱基序列上的、设计为引物的序列号70～73所示碱基序列的存在位置分别如下。

序列号70(Mint 23_con Fw1)：360位～379位、

序列号71(Mint 23_con Rv1)：509位～528位、

序列号72(Mint 23_FWpaFw1)：707位～724位、

序列号73(Mint 23_FWpa Rv1)：844位～862位。

序列号12所示碱基序列上的、设计为引物的序列号74～77所示碱基序列的存在位置分别如下。

序列号74(Mint 01con Fw1)：129位～147位、

序列号75(Mint 01con Rv1)：291位～313位、

序列号76(Mint 01_T7pa Fw1)：6位～23位、

序列号77(Mint 01_T7pa Rv1)：170位～189位。

另外，序列号13所示碱基序列上的、设计为引物的序列号78～81所示碱基序列的存在位置分别如下。

序列号78(Mint 03_con Fw1)：405位～424位、

序列号79(Mint 03_con Rv1)：523位～540位、

序列号80(Mint 03_con Fw2)：142位～161位、

序列号81(Mint 03_con Rv2)：270位～288位。

序列号14所示碱基序列上的、设计为引物的序列号82～87所示碱基序列的存在位置分别如下。

序列号82(Mint 12_FWpa Fw1)：189位～207位、

序列号83(Mint 12_FWpa Rv1)：343位～362位、

序列号84(Mint 12_RVpa Fw1)：634位～652位、

序列号85(Mint 12_RVpa Rv1)：716位～734位、

序列号86(Mint 12_con Fw1)：296位～315位、

序列号87(Mint 12_con Rv1)：468位～485位。

序列号15所示碱基序列上的、设计为引物的序列号88～91所示碱基序列的存在位置分别如下。

序列号88(Mint 18con Fw1)：69位～89位、

序列号89(Mint 18con Rv1)：225位～242位、

序列号90(Mint 18con Fw2)：354位～373位、

序列号91(Mint 18con Rv2)：440位～457位。

此外，上述各序列号后的()内表示本发明中命名的引物的名称。

获得本发明的引物的方法如上述获得本发明的核苷酸的方法中所记载。

另外，本发明的引物可以经标记物质标记。

作为用于将本发明的引物用标记物质进行标记的标记物质，只要是放射性同位素和/或酶、荧光物质、发光物质、生物素等公知的标记物质，就可以任意使用。

例如，作为放射性同位素，可列举³²P，³³P，³⁵S等；作为酶，可列举碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等；作为荧光物质，可列举Alexa555、Alexa647(インビトロジエン社)、花菁染料(Cyanine Dye)系的Cy3、Cy5(アマシヤムバイオサイエンス株式会社)、荧光素等；作为发光物质，可列举包含吖啶酯(Acridinium Ester)的化学发光试剂等。

作为用放射性同位素标记本发明的引物的方法，可以列举通过在合成引物时掺入用放射性同位素标记了的核苷酸来标记引物的方法、和/或在合成了引物之后用放射性同位素进行标记的方法等。具体地说，可以列举：一般常用的随机引物法、缺口平移法、利用T4多核苷酸激酶的5’-末端标记法、使用末端脱氧核苷酸转移酶的3’-末端标记法、RNA标记法等。

作为用标记物质标记本发明的引物的方法，可列举本领域通常进行寡核苷酸的标记方法，只要根据标记物质不同来选择适当方法即可。

例如，作为用酶标记本发明的引物的方法，可列举使碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等酶分子与想要进行标记的引物直接共价结合等作为该领域的常规方法的直接标记法。

作为用荧光物质标记本发明的引物的方法，可列举例如，用本领域常规方法的标记方法使经荧光素标记的核苷酸掺入引物的方法。另外，利用使具有连接臂(linker arm)的核苷酸与序列中的寡核苷酸置换的方法(例如，参考Mucleic Acids Res.，1986年，第14卷，第6115页)，也可以将核苷酸用荧光物质标记。这种情况下，还有利用特开昭60-500717号公报所公开的合成方法，从脱氧尿苷化学合成第5位具有连接臂的尿苷，然后将荧光物质导入上述寡核苷酸链的方法。

作为用发光物质标记本发明的引物的方法以及用生物素标记本发明的引物的方法，可以例举通常在本领域进行的对核苷酸进行发光标记或生物素标记的常规方法。

作为本发明的胞内分枝杆菌检测用探针，可列举含有下述寡核苷酸的探针，所述寡核苷酸含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的一部分或全部、或者含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与胞内分枝杆菌基因的碱基序列杂交(以下，有时记为本发明的探针)。

本发明的探针可以根据PCR(包含实时PCR)等核酸扩增反应、核酸杂交等的条件，由含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸、或含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的互补序列的一部分或全部的寡核苷酸，考虑解离温度(Tm值)等而选择适当区域的适当长度，从而设计出。但是，如果要使探针具有充分的特异性，则优选考虑到为了维持作为探针序列的特异性所需的碱基数来进行设计。

例如，作为在核酸杂交法(例如，DNA杂交(southern杂交)等)等中使用的探针，可列举具有10～700碱基、优选为100～600碱基、更优选为100～500碱基、进一步优选为200～500碱基的长度的探针。

另外，例如，作为在实时PCR扩增体系(例如，TaqMan^TM法、分子信标(Molecular Beacon)法等)等中使用的探针，可列举具有10～50碱基、优选为15～40碱基、进一步优选为20～30碱基的长度的探针。

本发明的探针中所使用的、含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的一部分或全部、或者含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的互补序列的一部分或全部、且与胞内分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸(本发明的寡核苷酸)的具体例与上述本发明的寡核苷酸的说明中所记载的相同。

作为本发明的探针的具体例，可列举例如，含有序列号16～129的任一者所示碱基序列的一部分或全部、或者含有序列号16～129的任一者所示碱基序列的互补序列的一部分或全部、且与胞内分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸。

作为本发明的探针的优选具体例，可列举例如，含有序列号16～19、24、25、28、29、34～37、40～43、48、49、54～59、64、65、70、71、74、75、78、79、82、83、88、89、92、93、96、98、101、102、104、105、108、111、112、113、116、119、121、123、125、128的任一者所示碱基序列的一部分或全部、且与胞内分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸，或含有序列号16～19、24、25、28、29、34～37、40～43、48、49、54～59、64、65、70、71、74、75、78、79、82、83、88、89、92、93、96、98、101、102、104、105、108、111、112、113、116、119、121、123、125、128的任一者所示碱基序列的互补序列的一部分或全部、且与胞内分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸。

作为本发明的探针的更优选具体例，可列举例如，含有序列号16～19、24、25、28、29、34～37、40～43、48、49、58～59、64、65、70、71、74、75、78、79、82、83、88、89、92、93、96、98、101、102、104、105、108、113、116、119、121、123、125、128的任一者所示碱基序列的一部分或全部、且与胞内分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸，或含有序列号16～19、24、25、28、29、34～37、40～43、48、49、58～59、64、65、70、71、74、75、78、79、82、83、88、89、92、93、96、98、101、102、104、105、108、113、116、119、121、123、125、128的任一者所示碱基序列的互补序列的一部分或全部、且与胞内分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸。

此外，序列号92～129所示碱基序列或序列号92～129所示碱基序列的互补序列，是通过使用本发明的引物的PCR扩增出的寡核苷酸或该寡核苷酸的互补寡核苷酸的碱基序列。表1一并显示出了正向引物与反向引物的组合、以及通过使用这些引物组合的PCR扩增出的碱基序列的序列号。例如显示出，序列号92所示碱基序列，是通过使用由序列号16所示碱基序列构成的寡核苷酸作为正向引物、使用由序列号17所示碱基序列构成的寡核苷酸作为反向引物的PCR扩增出的寡核苷酸的碱基序列。

表1

编号	正向引物	反向引物	扩增的序列	编号	正向引物	反向引物	扩增的序列
								1	序列号16	序列号17	序列号92	20	序列号54	序列号55	序列号111
2	18	19	93	21	56	57	112
								3	20	21	94	22	58	59	113
4	22	23	95	23	60	61	114
								5	24	25	96	24	62	63	115
6	26	27	97	25	64	65	116
								7	28	29	98	26	66	67	117
8	30	31	99	27	68	69	118
								9	32	33	100	28	70	71	119
10	34	35	101	29	72	73	120
								11	36	37	102	30	74	75	121
12	38	39	103	31	76	77	122
								13	40	41	104	32	78	79	123
14	42	43	105	33	80	81	124
								15	44	45	106	34	82	83	125
16	46	47	107	35	84	85	126
								17	48	49	108	36	86	87	127
18	50	51	109	37	88	89	128
								19	52	53	110	38	90	91	129

获得本发明的探针的方法如上述获得本发明的核苷酸的方法中所记载。

本发明的探针可以经标记物质标记。

作为用于将本发明的探针用标记物质进行标记的标记物质，只要是放射性同位素和/或酶、荧光物质、发光物质、生物素等公知的标记物质，就可以任意使用。

用于将本发明的探针进行标记的标记物质的具体例和标记方法，如本发明的引物的标记方法的说明中所记载。

另外，作为在后述的利用实时PCR的检测法中使用的标记探针，可以列举用在实时PCR法中通常使用的标记物质标记本发明的探针而得的标记探针。可列举例如，5’末端被报告荧光物质[羧基荧光素(FAM)、六氯荧光素(HEX)、四氯荧光素(TET)等]标记、3’末端被猝灭色素[例如羧基四甲基罗丹明(TAMRA)等荧光物质，Black Hole Quencher色素(BHQ)、4-((4-(二甲基氨基)苯基)偶氮)苯甲酸(DABCYL)等非荧光物质]标记的本发明的探针。

在后述的利用TaqMan^TM实时PCR的检测法中，也可以使用上述的标记探针。

作为本发明的胞内分枝杆菌的检测中所用的样品(被检样品)，可以列举喀痰、血液、咽部粘液、胃液、支气管灌洗液、经支气管采集物、胸水等的穿刺液、尿、脓等各种临床材料。另外，还可以是从样本中分离、培养的培养菌体，以及从这些培养菌体中分离、纯化出的核酸，或者用核酸扩增检测体系等扩增出的核酸。

为了从上述样品中提取、纯化DNA，可以按照从样本提取抗酸菌(结核菌)的DNA时所使用的常规方法来进行。

首先，需要破坏样品中的菌体的细胞壁。作为其方法，例如在以菌体为样品时，可使用例如：用SDS等表面活性剂、和/或硫氰酸胍(GTC)等蛋白变性剂处理菌体从而破坏结核菌等抗酸菌的膜结构的方法；或用玻璃珠等物理性地破坏菌体的方法等。

在使用痰作为样本的情况下，优选首先作为前处理，通过美国疾病管理预防中心(Centers for Disease Control and Prevention，简称CDC)所推荐的NALC(N-乙酰-L-半胱氨酸)-NaOH法(Kent PT，Kubica GP，PubricHealth Mycobacteriology，A Guide for the Level III Laboratory，U.S.Department of Health and Human Services，Public Health Service，Center for Disease Control，Atlanta，U.S.A.，1985年，第31-55页)来进行样本的均匀化。

在破坏了菌体的细胞壁之后，通过本领域一般的DNA制备法[酚/氯仿提取、乙醇沉淀法、使用异丙醇使其沉淀的方法等R.Boom，C.J.A.SOL，M.M.M.SALIMANS，C L.JANSEN，P.M.E.WERTHEIM-vanDILLEN，J.VAN DER NOORDAA，Rapid and Simple Method forPurification of Nucleic Acids，J.Clin.Microbiol.，1990，Mar；28(3)，pp.495-503)]来进行DNA的提取和纯化即可。

对于DNA的提取、纯化，因为这种用途的各种试剂盒已有市售，所以可使用这些试剂盒，按照本领域的常规方法(例如，酚/氯仿提取、使用乙醇和/或异丙醇等使其沉淀的方法等)来进行。例如，可以使用(株)キアゲン制的离子交换树脂型DNA提取纯化试剂盒Genomic-tip等进行DNA的提取、纯化。

如果以使用从样本中分离、培养的培养菌体作为样品的情况为例来显示，则如下。

例如，挑取小川培养基上的菌落，悬浮在灭菌蒸馏水中，离心分离而收集菌体，然后再次悬浮在蒸馏水中。接着将菌体悬浮液进行高压釜处理之后，经过菌体的粉碎处理(利用玻璃珠的物理性破碎等)，再离心分离回收上清。通过上述方法从所得的上清中提取、纯化DNA即可。

作为本发明的胞内分枝杆菌的检测方法，可列举使用含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的一部分或全部、或者含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的互补序列的一部分或全部、且与胞内分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸作为引物或/和探针的方法(使用本发明的寡核苷酸作为引物或/和探针的方法)。

可列举例如，

(A)使用本发明的寡核苷酸作为引物进行核酸扩增反应，检测获得的引物延伸产物的方法；

(B)使用经标记物质标记的本发明寡核苷酸作为标记探针的方法；

等等。以下，对于各个方法进行说明。

(A)使用本发明的寡核苷酸作为引物、使用样品中的核酸作为模板进行核酸扩增反应，检测获得的引物延伸产物的方法

对于方法(A)，作为使用本发明的寡核苷酸作为引物、使用样品中的核酸作为模板来进行核酸扩增反应的方法，可列举例如，使用本发明的引物，使用样品中的核酸作为模板，通过DNA聚合酶等来进行核酸扩增反应[例如，聚合酶链反应(PCR)法、LAMP(环介导等温扩增，Loop-MediatedIsothermal Amplification)法(Tsugunori Notomi等，Nucleic Acid Res.，第28卷，e63，2000年)、ICAN^TM(嵌合引物引发的核酸等温扩增，Isothermaland Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)法(临床病理，51卷(11)，第1061-1067页，2003年11月)、LCR(连接酶链反应)法(特开平4-211399号)、SDA(链置换扩增)法(特开平8-19394号)]，从而使引物延伸的方法。因为由此可以扩增胞内分枝杆菌的碱基序列的特定区域的序列，所以通过测定得到的引物延伸产物，可以检测胞内分枝杆菌。

在上述的进行核酸扩增反应的方法中，可以列举PCR法作为最一般的方法，作为PCR法的例子，可以使用例如实时扩增检测法(例如，参考美国专利第5210015号、美国专利第5538848号的记载)。此外，作为通过实时扩增检测法进行的检测法的例子，可以列举例如实时PCR检测法。

作为实时PCR检测法的例子，可列举TaqMan^TM实时PCR法(例如，参考美国专利第5538848号的记载)、MGB遮蔽探针系统(MGB EclipseProbe System)法(例如，参考美国专利第5,801,155号的记载)、分子信标探针技术(Molecular Beacons Probe Technology)法(例如，参考美国专利第5925517号的记载)、LUX荧光引物(LUX Fluorogenic Primer)法(InvitrogenCorporation)、猝灭探针-PCR(Quenching probe-PCR，QP)法(例如，参考美国专利第6,492,121号的记载)等。

在PCR等核酸扩增反应中使用的本发明的引物的具体例如上所述。

另外，作为在核酸扩增反应中使用的优选的正向引物与反向引物的组合，可列举上述表1所示组合。

例如，在表1中，例如编号1的组合表示“正向引物是含有序列号16所示碱基序列的寡核苷酸、反向引物是含有序列号17所示碱基序列的寡核苷酸的组合”或“正向引物是含有序列号16所示碱基序列的互补序列的寡核苷酸、反向引物是含有序列号17所示碱基序列的互补序列的寡核苷酸的组合”。

其中，作为优选的正向引物与反向引物的组合，可列举例如下述表2所记载的组合。

表2

编号	正向引物	反向引物
			1	序列号16	序列号17
2	18	19
			3	24	25
4	28	29
			5	34	35
6	36	37
			7	40	41
8	42	43
			9	48	49
10	54	55
			11	56	57
12	58	59
			13	64	65
14	70	71
			15	74	75
16	78	79
			17	82	83
18	88	89

其中，作为特别优选的组合，可列举编号1～9号、12～18的组合。

在使用上述引物的实时PCR等核酸扩增反应中所使用的其它脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、DNA聚合酶等试剂只要使用通常在本领域中使用的试剂即可，其条件、方法等除了使用本发明的引物和探针以外，只要按照PCR法的一般方案进行即可。

检测核酸扩增反应中获得的引物延伸产物的方法只要是通常在本领域中进行的常规方法即可，没有限定。

可以列举如下各种检测方法，例如：嵌入剂法；TaqMan^TM实时PCR法(例如，参考美国专利第5538848号的记载)；MGB遮蔽探针系统(MGBEclipse Probe System)法(例如，参考美国专利第5,801,155号的记载)；分子信标探针技术(Molecular Beacons Probe Technology)法(例如，参考美国专利第5925517号的记载)；LUX荧光引物(LUXFluorogenic Primer)法(Invitrogen Corporation)；猝灭探针-PCR(Quenching probe-PCR，QP)法(例如，参考美国专利第6,492,121号的记载)；和/或在进行核酸扩增反应之后，对得到的引物延伸产物进行电泳，基于其结果而进行的方法；以及使用标记引物进行核酸扩增反应，测定所得的引物延伸产物的标记的方法；等等。

其中，作为一般常用的方法，可列举例如以下方法。

(A-1)嵌入剂法；

(A-2)TaqMan^TM实时PCR法；

(A-3)在进行核酸扩增反应之后，对得到的引物延伸产物进行电泳，基于其结果进行判定的方法；

(A-4)使用标记引物进行核酸扩增反应，测定所得到的引物延伸产物的标记的方法。

以下，对于各个方法进行说明。

(A-1)嵌入剂法

可以利用使用公知的嵌入剂进行实时PCR的通常的嵌入剂法。

可列举例如，使用本发明的引物和嵌入剂，并利用通常的嵌入剂法来进行实时PCR的方法。

即，嵌入剂是与双链DNA特异性地结合而发出荧光的试剂，一照射激发光就发出荧光。因为如果用PCR来反复扩增而使DNA增加，嵌入剂就插入该DNA中，所以嵌入剂与引物延伸产物的生成量成比例地掺入DNA，因此通过检测来自嵌入剂的荧光强度，可以得知引物延伸产物的量。

其中，因为嵌入剂与所有的双链DNA结合，所以以得到的荧光强度的测定结果为基础，根据需要进行熔解曲线分析。即，在PCR反应之后，一边缓缓提高PCR反应液的温度，一边测定来自嵌入剂的荧光强度。最开始因为PCR扩增产物形成双链，所以发出荧光，但因为一旦PCR反应液的温度达到某一定温度，PCR扩增产物就解离成单链，所以来自嵌入剂的荧光急剧下降。这时的温度为熔解温度(Tm值)，是引物延伸产物的序列固有的值。对于熔解曲线的峰是作为目标的特异产物的峰还是非特异产物的峰，可以从该Tm值判定。

因为该嵌入剂法不需要在实时PCR之后进行电泳，所以在临床检查领域等中需要迅速进行判定的情况下是有效的方法。

作为在本发明中使用的嵌入剂，只要是通常在该领域中使用的嵌入剂，就可以任意使用，例如有：SYBR^TM Green I(Molecular Probe社商品名)、溴化乙锭、芴等。

本发明的“使用嵌入剂法的胞内分枝杆菌的检测方法”的例子说明如下。

使用本发明的引物和嵌入剂(例如SYBR^TM Green I)，使用从被检样品中纯化出的纯化DNA样品作为模板，使用Taq DNA聚合酶等聚合酶来进行实时PCR。然后用上述的提高温度的方法，测定与引物延伸产物的扩增量相关地嵌入的嵌入剂(SYBR^TM Green I)的荧光强度。

接着，以引物延伸产物(双链DNA)的解离温度作为横轴，以荧光强度的1次微分(变化量)作为纵轴，制成熔解曲线。使用该熔解曲线，通过进行引物延伸产物的熔解曲线分析来进行峰的检测。然后，在得到单一峰的情况下，判断被检样品为胞内分枝杆菌阳性(即，存在胞内分枝杆菌或其基因，以下相同)。

另外，为了更准确地进行胞内分枝杆菌的判定，优选以下方法。

即，使用被检样品进行上述测定，制成熔解曲线并检测峰。另外，使用胞内分枝杆菌的典型菌株(type strain)进行与上述同样的测定，进行熔解曲线分析并检测峰。然后，在使用被检样品获得的结果得到了单一峰、且该峰的位置与使用胞内分枝杆菌的典型菌株获得的峰的位置相同或者出现在相近的位置情况下，判定被检样品为胞内分枝杆菌阳性。

此外，如果使用胞内分枝杆菌的典型菌株预先进行测定而确认了峰的位置，则不需要在每次测定被检样品时都对典型菌株同样地进行测定而确认峰的位置。

另外，因为也可以基于利用嵌入剂法的方法获得的测定值，按照在实时PCR中进行的常规方法制成标准曲线，所以可以使用该标准曲线获得存在于样品中的胞内分枝杆菌的基因组DNA量(拷贝数)。

标准曲线的制作方法以及使用该标准曲线的胞内分枝杆菌的定量方法在后面叙述。

作为本发明的使用嵌入剂通过实时PCR检测法来检测胞内分枝杆菌的方法的一例，以使用上述的“引物Mint 02_T7pa Fw1”和“引物Mint02_T7pa Rv1”检测胞内分枝杆菌的情况为例，说明如下。

首先，通过公知的方法，从被检样品中获得纯化DNA样品。

另外，例如，使用DNA合成仪，通过亚磷酰胺法合成由序列号16所示碱基序列构成的寡核苷酸(Mint 02_T7pa Fw1)、和由序列号17所示碱基序列构成的寡核苷酸(Mint 02_T7pa Rv1)。

使用上述合成的Mint 02_T7pa Fw1作为正向引物，02_Rv1作为反向引物，例如，如下进行实时PCR。

即，制备含有各50～2000nM的引物Mint 02_T7pa Fw1和引物Mint02_T7pa Rv1、由原液约5000～100000倍稀释的嵌入剂[例如，SYBR^TMGreen I(Molecular Probe社商品名)]、1.0～4.0mM MgCl₂、KCl、BSA、胆酸钠、0.005～0.2％TritonX-100、各0.2mM左右的dATP、dCTP、dGTP、dTTP、10～80单位/mL的聚合酶(例如，Taq DNA聚合酶)的10mMTris-HCl缓冲液(pH8.9)，作为PCR用反应液。在该PCR用反应液中加入纯化DNA样品，作为PCR用样品。使用该PCR用样品，利用适当的实时PCR检测装置等进行实时PCR。反应重复30～50个循环，测定每1循环中来源于与引物延伸产物的扩增量相关地嵌入的嵌入剂(例如，SYBR^TMGreen I)荧光强度。

接着，以引物延伸产物(双链DNA)的解离温度作为横轴，以荧光强度的1次微分(变化量)作为纵轴，制成熔解曲线。用该曲线进行引物延伸产物的熔解曲线分析并检测峰。然后，在获得单一峰的情况下，判定被检样品为胞内分枝杆菌阳性。

更优选在使用被检样品进行测定、熔解曲线分析所获得的峰的位置，与使用胞内分枝杆菌的典型菌株进行与上述同样的测定、熔解曲线分析所获得的峰的位置相同或者出现在相近的位置的情况下，判定被检样品为胞内分枝杆菌阳性。

另外，作为对照，可以利用常规方法提取、纯化来源于除胞内分枝杆菌以外的分枝杆菌属菌的DNA，使用该DNA作为模板，除此之外，通过与上述同样的方法进行实时PCR，同样地测定SYBR^TM Green I的荧光强度，进行熔解曲线分析。此时，因为样品中没有具有来源于胞内分枝杆菌的碱基序列的多核苷酸，所以在熔解曲线分析中应该不出现峰。为了更准确地判断有无胞内分枝杆菌，可以同时进行上述对照实验。

而且，通过制成标准曲线，可以获得样品中的胞内分枝杆菌的基因组DNA的数量(拷贝数)。另外，因为该数量与胞内分枝杆菌的数量成比例，所以还能得知样品(被检样品)中的胞内分枝杆菌的数量。

(A-2)TaqMan^TM实时PCR法(TaqMan^TM探针法)

TaqMan^TM实时PCR法是使用了将5’末端用例如FAM等荧光色素(报告分子)标记、将3’末端用例如TAMRA等猝灭色素标记得到的标记探针的实时PCR法，是能够高灵敏度且定量地检测作为目标的微量DNA的方法(例如，参考美国专利第5,538,848号的记载)。

即，本法是使用本发明的引物，以及将本发明的探针的5’末端用报告荧光色素标记、3’末端用猝灭色素标记的标记探针，以样品中的核酸为模板进行PCR，检测从该标记探针游离出来的标记物质的标记的方法。

TaqMan^TM实时PCR法的原理如下。

该方法使用5’末端用荧光色素(报告分子)进行了标记、3’末端用猝灭色素进行了标记的与目标基因的特定区域杂交的寡核苷酸探针。该探针在通常状态下报告色素的荧光被猝灭色素所抑制。在使该荧光标记探针与目标基因完全杂交的状态下，使用DNA聚合酶自其外侧起进行PCR。依赖DNA聚合酶的延伸反应一旦进行，则由于DNA聚合酶的外切核酸酶活性，荧光标记探针被从5’端水解，报告色素游离，从而发出荧光。实时PCR法是实时地监测该荧光强度的方法，由此可以正确地定量模板DNA的初始量。

在本发明所涉及的TaqMan^TM实时PCR检测法中使用的正向引物和反向引物可以使用本发明的引物。作为优选的引物，可以列举在上述的PCR法等核酸扩增反应的中使用的引物，其优选的具体例和优选的组合也如上所述。

作为在本发明所涉及的TaqMan^TM实时PCR检测法中使用的、5’末端用荧光色素(报告分子)进行了标记、3’末端用猝灭色素进行了标记的探针中使用的探针，可以是上述的本发明的探针。实际上，可使用含有预计可以在用所选择的正向引物与反向引物的组合进行实时PCR的情况下得到的引物延伸产物的碱基序列的探针，或者进一步含有从该序列设计出的碱基序列的探针。

例如，在使用上述本发明的Mint 02_T7pa Fw1与Mint 02_T7pa Rv1的引物的组合进行实时PCR时所用的探针，可列举含有预计在该实时PCR中被扩增的序列号92所示碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸

作为用于将标记探针的5’端进行标记的报告荧光物质，可列举羧基荧光素(FAM)、六氯荧光素(HEX)、四氯荧光素(TET)、Cy5、VIC等，其中经常使用FAM。

作为用于标记3’末端的猝灭色素，可列举羧基四甲基罗丹明(TAMRA)等荧光物质，Black Hole Quencher色素(例如BHQ2)、4-((4-(二甲基氨基)苯基)偶氮)苯甲酸(DABCYL)等非荧光物质，其中经常使用TAMRA。

在实时PCR检测体系中使用的其它脱氧核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、DNA聚合酶等试剂，只要使用通常在实时PCR中使用的试剂即可，实时PCR的方法除了使用本方法的引物和探针之外，可以按照实时PCR的一般方案进行。

作为本发明的利用TaqMan^TM实时PCR检测法的胞内分枝杆菌的检测方法的一例，以使用上述本发明的“引物Mint 02_T7pa Fw1”和“引物Mint 02_T7pa Rv1”检测胞内分枝杆菌的情况为例，说明如下。

首先，通过公知的方法，从被检样品中获得纯化DNA样品。

另外，从预计在使用Mint 02_T7pa Fw1与Mint 02_T7pa Rv1的引物对的PCR中被扩增的序列号92的碱基序列设计用作探针的序列，合成该碱基序列的寡核苷酸。用常规方法在该寡核苷酸的5’末端结合报告色素FAM，在3’末端结合报告猝灭色素TAMRA，从而得到荧光标记探针。

使用上述合成的Mint 02_T7pa Fw1作为正向引物，Mint 02_T7pa Rv1作为反向引物，例如，如下进行实时PCR。

即，制备含有各0.1～2μM并优选为各1μM的引物Mint 02_T7pa Fw1和引物Mint 02_T7pa Rv1、100～1000nM的荧光标记探针、1.0～4.0mMMgCl₂、KCl、BSA、胆酸钠、0.005～0.2％TritonX-100、各0.2mM左右的dATP、dCTP、dGTP、dTTP、10～80单位/mL的Taq DNA聚合酶等聚合酶的10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.9)，作为PCR用反应液。在该PCR用反应液中加入纯化DNA样品，从而获得PCR用样品。

使用该PCR用样品，利用适当的实时PCR检测装置等进行实时PCR。反应重复30～50个循环，在每1个循环中测定来源于报告色素的荧光。

作为这时的胞内分枝杆菌检测方法，在报告色素的荧光被测定的情况下，判定被检样品为胞内分枝杆菌阳性。

另外，因为在实时PCR法中能够制成标准曲线，所以可以获得样品中的胞内分枝杆菌的基因组DNA的数量(拷贝数)。另外，因为该数量与胞内分枝杆菌的数量成比例，所以还可以获知样品(被检样品)中的胞内分枝杆菌的数量。

标准曲线的制作方法只要按照在实时PCR法中通常进行的常规方法来进行即可。例如，使用拷贝数已知的鸟分枝杆菌的基因组DNA样品作为标准，调制稀释系列的浓度(拷贝数)的PCR用DNA样品。接着使用各稀释系列的PCR用DNA样品按照上述方法进行实时PCR，从而测定报告色素的荧光强度。对于每个各稀释系列的PCR用DNA样品，分别制成扩增曲线，该扩增曲线是将测定的荧光强度的测定值(Rn、y轴)相对于PCR的各循环数(x轴)作图而获得的。接着，选择荧光强度以指数函数扩增的Rn部分，划出阈值线(Threshold line，Th)。将Th与各PCR用DNA样品的扩增曲线交叉的点作为循环阈值(Threshold cycle，Ct)。接着将Ct值(y轴)相对于所使用的各PCR用DNA样品的拷贝数的对数值(x轴)作图，可以以对各Ct所得到的近似曲线作为标准曲线。

即使在上文所述的通过嵌入剂法来进行实时PCR的情形下，也可以同样地以所得到的测定值为基础制成标准曲线。例如，制成将来自嵌入剂的荧光量的测定值(Rn，y轴)相对于PCR的各循环数(x轴)作图而得的扩增曲线。接着，用与上述相同的方法得到Ct值，将Ct值(y轴)相对于在实时PCR中使用的各PCR用DNA样品的拷贝数的对数值(x轴)作图，以对各Ct得到的近似曲线作为标准曲线即可。

为了定量样品中的胞内分枝杆菌的基因组DNA的数量(拷贝数)，首先从被检样品中分离纯化DNA，然后对于所得到的DNA样品进行实时PCR，同样地制成扩增曲线。获得制成标准曲线时的Th与得到的扩增曲线交叉的Ct值。通过将该Ct值代入标准曲线，可以得到样品中的胞内分枝杆菌的基因组DNA量(拷贝数)。

(A-3)在进行核酸扩增反应之后，对得到的引物延伸产物进行电泳，基于其结果而进行判定的方法

作为该方法可列举例如：

“一种胞内分枝杆菌的检测方法，其特征在于，包含下述工序：

(i)使用下述寡核苷酸作为引物(本发明的引物)，以样品中的核酸为模板进行核酸扩增反应，所述寡核苷酸含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的一部分或全部、或者含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与胞内分枝杆菌基因的碱基序列杂交；

(ii)对上述(i)所得的引物延伸产物进行电泳，基于其结果判定有无胞内分枝杆菌。”

核酸扩增反应的具体例如上所述。

作为进行电泳，基于其结果来判定有无胞内分枝杆菌的方法，可以列举例如：

(A-3-1)通过确认目标大小(碱基对数)的引物延伸产物组分来判定的方法；

(A-3-2)通过使用标记探针的杂交来判定的方法；

等等。

关于电泳法的条件、操作方法等，只要按照本领域通常进行的常规方法来进行即可。

以下，对(A-3-1)和(A-3-2)的方法进行说明。

(A-3-1)通过确认目标大小(碱基对数)的引物延伸产物组分来判定的方法

例如，首先从本发明的引物中，选择适当的正向引物与反向引物的组合，使用该组合进行PCR等核酸扩增反应。

接着，对得到的引物延伸产物进行电泳。预先预测会被在核酸扩增反应中使用的正向引物与反向引物的组合扩增的引物延伸产物的大小(碱基对数)，然后用常规方法确认所得到的电泳组分是否相当于所预测的大小的引物延伸产物。可列举例如，使用将得到的电泳组分用溴化乙锭等染色来将核酸种可视化这样的方法，来将该组分染色，从而确认该引物延伸产物的大小(碱基对数)等方法。而且，在确认了目标碱基对数的引物延伸产物的情况下，判定被检样品为胞内分枝杆菌阳性。

作为利用(A-3-1)的方法的具体判定方法，可列举下述方法：例如，使用上述表1所记载的正向引物与反向引物的组合来进行PCR，然后对得到的引物延伸产物进行电泳，在其结果是确认了预计会被所用的引物组合扩增的碱基序列的寡核苷酸，或者确认了该碱基对数大小的组分的情况下，判定被检样品为胞内分枝杆菌阳性。

(A-3-1)方法的具体例汇总示于下表3中。

即，例如作为下述表3中编号1的方法，是“使用含有序列号16所示碱基序列的寡核苷酸作为正向引物、使用含有序列号17所示碱基序列的寡核苷酸作为反向引物进行PCR，然后对所得的引物延伸产物进行电泳，将确认了116碱基对的组分或具有序列号92所示碱基序列的寡核苷酸组分的被检样品判定为阳性的方法”或者“使用含有序列号16所示碱基序列的互补序列的寡核苷酸作为正向引物、使用含有序列号17所示碱基序列的互补序列的寡核苷酸作为反向引物进行PCR，然后对所得的引物延伸产物进行电泳，将确认了116碱基对的组分或含有序列号92所示碱基序列的互补序列的寡核苷酸组分的被检样品判定为阳性的方法”。

表3

在上述表3所记载的方法中，作为更优选方法，可列举表3的编号1、2、5、7、10、11、13、14、17、20～22、25、28、30、32、34、37的方法。

另外，在上述表3所述的方法中，作为更加特别优选方法，可列举表3的编号1、2、5、7、10、11、13、14、17、22、25、28、30、32、34、37的方法。

(A-3-2)通过使用标记探针的杂交来判定的方法

可列举例如以下方法：进行核酸扩增反应并对所得的引物延伸产物进行电泳；对于所得的电泳组分，针对将本发明的探针(具有预计被在核酸扩增反应中所用的正向引物与反向引物的组合扩增的碱基序列)用标记物质进行标记而得的标记探针进行杂交；在通过检测该标记探针的标记，确认了存在与该标记探针杂交的组分的情况下，判定该被检样品为胞内分枝杆菌阳性。

使用的探针和用于将探针进行标记的标记物质的具体例、以及探针的标记方法如上所述。

这些方法的优选具体例汇总示于下述表4中。

例如，在表4中，作为编号1的方法，是“使用含有序列号16所示碱基序列的寡核苷酸作为正向引物、使用含有序列号17所示碱基序列的寡核苷酸作为反向引物进行PCR，然后对所得的引物延伸产物进行电泳；接着，对于所得的组分，针对将含有包含序列号92所示碱基序列的一部分或全部的碱基序列的寡核苷酸用标记物质进行标记而得的标记探针进行杂交，通过检测该标记探针的标记，将确认了与该标记探针杂交的组分的被检样品判定为阳性的方法”或者“使用含有序列号16所示碱基序列的互补序列的寡核苷酸作为正向引物、使用含有序列号17所示碱基序列的互补序列的寡核苷酸作为反向引物进行PCR，然后对所得的引物延伸产物进行电泳；接着，对于所得的组分，针对将含有包含序列号92所示碱基序列的一部分或全部的碱基序列的寡核苷酸用标记物质进行标记而得的标记探针进行杂交，通过检测该标记探针的标记，将确认了与该标记探针杂交的组分的被检样品判定为阳性的方法”。

表4

在上述表4所述的方法中，作为更优选方法，可列举表3的编号1、2、5、7、10、11、13、14、17、20～22、25、28、30、32、34、37的方法。

另外，上述表4所述的方法中，作为更加特别优选方法，可列举表3的编号1、2、5、7、10、11、13、14、17、22、25、28、30、32、34、37的方法。

通过(A-3)的方法进行本发明的胞内分枝杆菌的检测方法的详细方法，例如，可列举下述情况为例进行说明：通过使用Mint 02_T7pa Fw1作为正向引物、使用Mint 02_T7pa Rv1作为反向引物进行PCR，并进行电泳，然后确认目标碱基对数的引物延伸产物组分的方法来进行检测(上述(A-3-1)的、表3的编号1的方法)。说明如下。

首先，通过公知的方法从被检样品中获得纯化DNA样品。

另外，例如，使用DNA合成仪，通过亚磷酰胺法来合成Mint 02_T7paFw1(由序列号16所示序列构成的寡核苷酸)和Mint 02_T7pa Rv1(由序列号17所示碱基序列构成的寡核苷酸)。

使用本发明的引物Mint 02_T7pa Fw1和引物Mint 02_T7pa Rv1进行PCR。

将所得的PCR后的反应液进行琼脂糖凝胶电泳。接着进行溴化乙锭染色，然后检测紫外线下的荧光。另外，分子量标记也与反应液同时进行电泳，通过比较相对迁移率来计算出被检测的DNA片段的长度。预计在使用Mint 02_T7pa Fw1作为正向引物、并使用Mint 02_T7pa Rv1作为反向引物PCR中，胞内分枝杆菌的碱基序列中的116碱基对的DNA片段(具有序列号92所示碱基序列)被复制(参考表3的编号1)。因此，在确认了116碱基对大小的荧光条带的情况下，即可判定被检样品为胞内分枝杆菌阳性。

另外，本发明在核酸扩增工序中，还可以应用使用RNA转录产物的检测方法。可以列举例如，NASBA(基于核酸序列的扩增，nucleic acidsequence based amplification)法(日本专利第2650159号)、3SR(自主序列复制，self-sustained sequence replication)法(特公平7-114718号)、TAS(基于转录的扩增系统，transcription based amplification system)法(特表平2-500565号：国际公开WO88/10315号)、TMA(转录介导的扩增，transcription mediated amplification)法(特开平11-46778号)等。其中利用逆转录酶与RNA聚合酶的协同作用(在逆转录酶与RNA聚合酶协同作用那样的条件下进行反应)的恒温核酸扩增法是适应使测定体系自动化的方法。

(A-4)使用标记引物进行核酸扩增反应，测定得到的引物延伸产物的标记的方法

可列举以下方法：使用将本发明的引物用上述的方法进行标记而得的标记引物，使用被检样品中的核酸作为模板进行PCR等核酸扩增反应，检测、测定得到的引物延伸产物的标记，在能够检测出标记的情况下，判定该被检样品为胞内分枝杆菌阳性。

作为在该方法中使用的正向引物和反向引物，可以列举在上述的PCR法中使用的引物，其优选的具体例和优选的组合也如上所述。

在上述方法的情况下，在进行了核酸扩增反应之后，除去游离的标记引物，测定引物延伸产物的标记，在能够检测出标记的情况下，可以判断被检样品为胞内分枝杆菌阳性。

作为除去游离的标记引物的方法，可以列举用使核酸沉淀的常规方法(乙醇沉淀法、使用了异丙醇的沉淀法等)使进行核酸扩增反应而得到的反应物中的引物延伸产物沉淀，然后除去含有未沉淀的游离标记引物的上清的方法等。

另外，还可以列举以下方法：将进行核酸扩增反应而得到的反应物在适当的条件下用凝胶层析进行处理，从而分离引物延伸产物与游离的标记引物的方法；利用电泳法进行分离的方法等。

(B)使用经标记物质标记的本发明的寡核苷酸作为标记探针的方法

另外，作为本发明的胞内分枝杆菌的检测方法，可列举以下方法：使用经标记物质标记的本发明的寡核苷酸作为标记探针，使该标记探针与样品中的核酸杂交，除去游离的标记探针，然后检测杂交的复合体的标记。

具体地，可例举如下所述的方法。

(B-1)使本发明的寡核苷酸与固相载体结合，使用该结合体作为捕获探针，使其与被检样品中的核酸杂交，从而使样品中的来源于胞内分枝杆菌的核酸固定化在固相上的检测方法(例如，参考特开昭62-265999号的记载)。

在这种方法的情况下，本发明的寡核苷酸或者固相载体可以经标记物质标记。

(B-2)使用未经标记的(B-1)的捕获探针、和将本发明的探针进行标记而得的标记探针，使其与被检样品中的核酸杂交，从而进行使固相载体上形成捕获探针、来源于胞内分枝杆菌的核酸和标记探针的复合体，测定标记探针的标记的夹心法的方法(例如，参考特开昭58-40099号的记载)。

(B-3)使用经生物素标记的本发明的探针，与被检样品中的核酸杂交，然后用亲和素结合载体来捕获被检样品中的来源于胞内分枝杆菌的核酸的方法。

此外，在本发明的胞内分枝杆菌的检测方法所用的试剂中，可以使用通常在本领域使用的试剂类，例如缓冲剂、稳定剂、防腐剂等不抑制共存试剂等的稳定性、且不抑制PCR等核酸扩增反应和/或杂交反应的试剂。另外，其浓度也可以在通常在本领域常用的浓度范围内适当选择。

如果列举缓冲液的具体例，则可列举例如，Tris缓冲液、磷酸缓冲液、佛罗那(Veronal)缓冲液、硼酸缓冲液、Good’s缓冲液等通常在进行PCR等核酸扩增反应和/或杂交反应时使用的所有缓冲液，对其pH值也没有特别限制，通常优选5～9的范围。

另外，根据需要可以使用核酸合成酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶等)、与酶相应的底物(dNTP、rNTP等)、以及双链嵌入剂(溴化乙锭、SYBR^TM Green等)或FAM、TAMRA等的标记检测物质等。

作为本发明的胞内分枝杆菌检测用试剂盒，可列举“含有下述寡核苷酸作为引物(本发明的引物)或/和探针(本发明的探针)的胞内分枝杆菌检测用试剂盒，所述寡核苷酸含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的一部分或全部、或者含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与胞内分枝杆菌基因的碱基序列杂交”。引物可以是经标记物质标记的引物。该标记物质的具体例如上所述。

对构成上述试剂盒的本发明的引物和本发明的探针的具体例，如上述对于“本发明的引物”、“本发明的探针”的说明中所述。

本发明的引物可以是经标记物质标记的引物。该标记物质的具体例如上所述。

在含有本发明的引物的试剂盒中，还可包括含有正向引物与反向引物的一组引物对的组成。该引物对的优选组合如上所述。

另外，上述试剂盒还可以含有经标记物质标记的本发明的寡核苷酸作为标记探针。

而且，作为本发明的试剂盒，可列举“含有下述寡核苷酸作为引物(本发明的引物)或/和探针(本发明的探针)的胞内分枝杆菌检测用试剂盒，所述寡核苷酸含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的一部分或全部、或者含有序列号1～15的任一者所示碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与胞内分枝杆菌基因的碱基序列杂交”。该探针可以是经标记物质标记的探针。

构成这些试剂盒的构成试剂的优选方式和具体例如上所述。

此外，本发明的胞内分枝杆菌检测用试剂盒中也可以含有例如缓冲剂、稳定剂、防腐剂等不抑制共存试剂等的稳定性、不抑制PCR等核酸扩增反应和/或杂交反应的试剂。另外，其浓度也可以在通常本领域常用的浓度范围中适当选择。

如果列举缓冲液的具体例，则可列举例如，Tris缓冲液、磷酸缓冲液、佛罗那(VeronaD缓冲液、硼酸缓冲液、Good’s缓冲液等通常在进行PCR和/或杂交反应时使用的所有缓冲液，对其pH值也没有特别限制，通常优选5～9的范围。

另外，根据需要也可以含有核酸合成酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶等)、与酶相应的底物(dNTP、rNTP等)、以及双链嵌入剂(SYBR^TMGreen、溴化乙锭等)或FAM、TAMRA等标记检测物质等。

以下列举实施例，更加具体地说明本发明，但本发明并不受这些实施例任何限制。

此外，在实施例中使用的细菌均是临床分离菌株，全部可以在培养之后，根据菌落的形状和/或现有的各种生物化学试验等来鉴别菌种。

实施例

实施例1来源于胞内分枝杆菌的克隆的选择

(1)来源于胞内分枝杆菌的DNA样品的制备

首先，将作为胞内分枝杆菌的典型菌株的胞内分枝杆菌JCM6384(由理化学研究所分售)悬浮在纯化水中，进行高压釜处理(120℃、2大气压、20分钟)。接着，将菌体进行粉碎处理(通过直径2mm的玻璃珠进行物理破碎)，然后进行离心分离，得到上清。使用(株)キアゲン制的离子交换树脂型DNA提取纯化试剂盒Genomic-tip从所得的上清中提取、纯化DNA，获得来源于胞内分枝杆菌(胞内分枝杆菌JCM6384)的纯化基因组DNA。

将所得的来源于胞内分枝杆菌的纯化基因组DNA制成终浓度为400ng/μl(10mM Tris-HCl缓冲液、pH8.9)的溶液，使用该溶液作为“来源于胞内分枝杆菌的DNA样品”。

(2)全基因组鸟枪法文库的制作

使用上述(1)所得的来源于胞内分枝杆菌的DNA样品24μg作为材料，通过以下方法(将Science.2001 Feb 16；291(5507)：1304-1351 Venter et al.所记载的全基因组鸟枪法进行了改变)制作全基因组鸟枪法文库。

首先，对于上述(1)获得的来源于胞内分枝杆菌的DNA样品，利用雾化器(インビトロジエン社制)，在终浓度20％的甘油存在下，于5kPa～9kPa压力下进行约10分钟处理，使来源于胞内分枝杆菌的DNA样品片段化。通过该处理，可以有效回收500～1000bp大小的组分(DNA片段)。将得到的组分利用(株)キアゲン社制的提取柱进行纯化。

接下来，使用DNA平端化试剂盒(DNA Blunting Kit，タカラバイオ(株)制)，利用T4 DNA聚合酶的5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切核酸酶活性，使得到的DNA片段的末端平端化。然后将该DNA片段与经平端化处理后的pBSII sk+载体(Stratagene社)进行连接反应，制作在pBSII sk+载体(amp^r)中整合了DNA片段的重组DNA。

使用大肠杆菌JM109感受态细胞(タカラバイオ(株)制)，按照该制品说明书，用上述得到的重组DNA转化大肠杆菌JM109感受态细胞。

将得到的转化体于含有100μg/ml的氨苄青霉素、0.2mM IPTG、40μg/ml X-Gal的LB-琼脂培养基中进行培养。挑出白色菌落，获得导入了“整合了目的DNA片段的重组DNA”的转化体的文库(来源于胞内分枝杆菌的基因组DNA的全基因组鸟枪法克隆文库)。

(3)微阵列制作

通过使用上述(2)得到的转化体的文库(来源于胞内分枝杆菌的基因组DNA的全基因组鸟枪法克隆文库)，用下述方法进行PCR，制备固定于载玻片上的探针材料。

首先，制备含有各1μM的引物M13Primer M1(タカラバイオ(株)制)和引物M13Primer RV(タカラバイオ(株)制)、1.5mM MgCl₂、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1％胆酸钠、0.1％Triton X-100(聚氧乙烯辛基苯基醚，ロ一ムアンドハ一ス社商品名)、各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP、以及40单元/ml的Taq DNA聚合酶((株)ニツポン·ジ一ン制)的10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.9)，作为PCR用反应液。

按照常规方法从上述(2)中得到的各转化体(来源于胞内分枝杆菌的基因组DNA的全基因组鸟枪法克隆)中纯化DNA。调制将该纯化的DNA(在以后进行的PCR中作为模板使用)悬浮添加到20μl PCR用反应液中而得的溶液，将所得溶液作为PCR用样品。使用该PCR样品，使用DNA热循环仪(DNA Engine PTC200、MJ Research Inc.制)，在下述反应条件下进行30个循环的PCR。

PCR反应条件：

热变性：94℃、0.5分钟

退火：55℃、1分钟

聚合反应：75℃、0.5分钟。

将得到的PCR扩增产物进行纯化，然后与固定缓冲液(终浓度3×SSC)混合。

调整使得点样的PCR扩增产物的终浓度为300ng/μL，使用将装置内的湿度设定为55％的点样用装置(GTMAS Stamp II：日本レ一ザ电子社制造)，将上述得到的PCR产物点样(斑点直径150～250μm)在载玻片(CMTGAPS-II，Corning社制)上。将点样结束后的载玻片移入紫外交联仪(UVStratalinker1800，Stratagene社制)，进行150mJ/cm²的UV照射，将PCR扩增产物(具有作为目标的来源于胞内分枝杆菌的基因组DNA的碱基序列)固定化在载玻片上，从而制成微阵列(以来源于胞内分枝杆菌的基因组DNA的全基因组鸟枪法克隆文库为材料的微阵列，积累有合计2000个克隆)。

(4)目标基因组DNA的荧光色素标记

(i)目标基因组DNA的荧光色素标记

使用BioPrime DNA标记系统(インビトロジエン社制)，进行目标基因组DNA的荧光色素标记。

首先，在上述(1)所得的来源于胞内分枝杆菌的纯化基因组DNA 2μg中混合制品中的随机引物溶液20μL，然后进行热变性(95℃、5分钟)处理，获得样品溶液。另外，从鸟分枝杆菌(IID 585)中按照常规方法提取、纯化基因组DNA(对照用基因组DNA)，进行同样的处理，获得了样品溶液(对照)。

然后，向获得的各样品溶液中分别添加0.1M DTT 2μl、dATP/dCTP/dGTP(各5mM)的混合液2μl、2.5mM dTTP 0.8μl、5mM Ha-dUTP 1.6μl、克列诺酶(40U/μL)1μl，加入去离子灭菌水使得总体积为50μL，于37℃进行3小时的延伸反应。

将マイクロコンYM-30(ミリポア社制)的超滤柱安装到附带的1.5ml管上，将上述得到的反应产物上样到到柱中，以14000转/分钟离心4分钟，然后将浓缩液回收到微管中，用真空干燥离心机(CentriVap concentrator，LABCONCO社制)使其完全干燥。

向干燥的上述反应产物中加入50mM NaHCO₃ 10μl并混合，于常温下静置2～3分钟。

另外，制备将1mg的Alexa647(インビトロジエン社制)或Alexa555(インビトロジエン社制)溶于105μl的DMSO而得的溶液(染色溶液Alexa647、染色溶液Alexa555)。将该染色溶液Alexa64710μl加入到使用来源于胞内分枝杆菌的基因组DNA获得的上述反应产物中，在40℃温育(避光)60分钟。另外，将染色溶液Alexa555 10μl加入到使用对照用基因组DNA(来源于鸟分枝杆菌)获得的上述反应产物中，同样地在40℃温育(避光)60分钟。

再向温育后的上述各反应产物溶液中加入10μl的4M NH₂OH(在即将使用前制备)，搅拌后进行15分钟的温育(遮光)，得到各种标记产物，即将来源于胞内分枝杆菌的基因组DNA用Alexa647进行标记而得的标记产物、和将来源于鸟分枝杆菌的基因组DNA用Alexa555进行标记而得的标记产物。

将マイクロコンYM-30(ミリポア社制)的超滤柱安装到附带的1.5ml管上，将上述得到的各基因组DNA的标记产物上样到柱中，以14,000转/分钟离心4分钟，然后将浓缩液回收到微管中，用真空干燥离心机(CentriVap concentrator，LABCONCO社制)使其完全干燥。

(ii)标记产物的片段化工序

对上述(4)(i)所得的干燥状态的各基因组DNA的标记产物，添加制备的40μL终浓度为0.04M Tris-醋酸(pH8.1)、0.1M醋酸钾、0.03M醋酸镁四水合物组成的溶液，使其悬浮混合。接着于94℃加热处理15分钟，可得到100个碱基～300个碱基的各基因组DNA的标记产物的片段化生成物(分别记为“Alexa555标记产物”、“Alexa647标记产物”)。

此外，利用间接标记法研究了标记效率(碱基/染料分子)，关于Alexa647，确认了约100～200个碱基中掺入了1个染料分子。另外关于Alexa555，确认了约150个碱基中掺入了1个染料分子。

将所得的Alexa647标记产物和Alexa555标记产物的分别上样到マイクロコンYM-10(ミリポア社制)超滤柱中，以14000转/分钟离心4分钟，然后将浓缩液回收到同一微管中，用真空干燥离心机(CentriVapconcentrator：LABCONCO社制)使其完全干燥。接着，在该微管中加入以下试剂，使其悬浮混合，使标记产物的干燥物溶解。

ArrayHyb杂交缓冲液(SIGMA社制) ：40μL

鲑鱼精DNA(10mg/mL) ：0.5μL

甲酰胺：5μL

总计 40～50μL

通过以上操作，获得了来源于胞内分枝杆菌的基因组DNA的Alexa647标记产物的片段化生成物、和来源于鸟分枝杆菌的对照用基因组DNA的Alexa555标记产物的片段化生成物的Alexa555-Alexa647标记产物混合溶液。

将所得的Alexa555-Alexa647标记产物混合溶液在95℃温育5分钟，保持70℃直到杂交。

(5)微阵列杂交

将上述(4)(ii)所制备的Alexa555-Alexa647标记产物混合溶液全部上样到上述(3)的工序所得的来源于胞内分枝杆菌的基因组DNA的全基因组鸟枪法克隆文库的微阵列(DNA芯片)上，不带入气泡地盖上盖玻片。将它装到杂交盒中，置于在Tupper上拉伸有用蒸馏水打湿的无尘纸(Kimtowel)上并密闭，遮光下于65℃反应8小时以上，进行杂交。杂交后，于室温将微阵列连同盖玻片一起浸入到2×SSC-0.1％SDS溶液中，在溶液中轻轻地摇动微阵列，使盖玻片脱离。接着用1×SSC、0.03％SDS溶液(60℃)洗涤10分钟，用0.2×SSC溶液(42℃)洗涤10分钟，用0.05×SSC溶液(室温)洗涤10分钟，然后将微阵列迅速移到干的新管架上，立刻以800转/分钟离心5分钟使其干燥。

(6)荧光强度的测定：从信号检测到数量化

使用荧光解读扫描仪GenePix 4000B(Axon Instruments Inc.制)，测定上述(5)所得的经微阵列杂交处理的微阵列上的荧光强度。此时，为了分析Alexa555标记产物和Alexa647标记产物的竞争杂交的结果，检测2信道、即2ch(Alexa555、Alexa647)的荧光。

荧光信号的数量化使用日立ソフト社制的DNASIS^TM-Array(DNA芯片表达图像分析软件)进行。即，按照软件的操作步骤，进行斑点自动识别、背景计算、荧光强度比的归一化。另外，确定置信临界线，通过对该临界线以下区域的数据不处理，求出经归一化的可信的荧光强度比。

进一步，基于在微阵列上检测到的Alexa555/Alexa647的荧光强度比(Ratio)，按照常规方法进行散点图(Scatter plot)分析。

即，当某个微阵列上的斑点的Alexa647与Alexa555的荧光强度比高时，显示该斑点的DNA片段(PCR产物)与Alexa647标记产物、即来源于胞内分枝杆菌的基因组DNA更强地杂交。另一方面，当某个斑点的Alexa647与Alexa555的荧光强度比低时，显示该斑点的DNA片段对来源于胞内分枝杆菌的基因组DNA的特异性低，观察到了与Alexa555标记产物、即来源于鸟分枝杆菌的对照用基因组DNA的交叉反应(与来源于鸟分枝杆菌的对照用基因组DNA发生了杂交)。

在该方法中，计算出微阵列的所有斑点的荧光强度比。然后，选择出荧光强度高、且Alexa647与Alexa555的荧光强度比高的斑点。

(7)使用其它胞内分枝杆菌株(strain)的二次筛选

使用下述表5所记载的各种胞内分枝杆菌菌株(由日本细菌学会分售)，通过与上述(1)同样的方法，从各菌株制备“来源于胞内分枝杆菌的DNA样品”。

表5

菌种	菌株	来源
			M.intracellulare	GTC MY494	岐阜大学医学部
M.intracellulare	GTC MY483	岐阜大学医学部
			M.intracellulare	GTC MY482	岐阜大学医学部
M.intracellulare	GTC M91-273	岐阜大学医学部
			M.intracellulare	GTC M91-269	岐阜大学医学部
M.intracellulare	GTC M3278	岐阜大学医学部
			M.intracellulare	GTC M3274	岐阜大学医学部
M.intracellulare	GTC M3273	岐阜大学医学部
			M.intracellulare	GTC M3272	岐阜大学医学部
M.intracellulare	JCM6384	理化学研究所

接着，通过与上述(4)(i)～(ii)同样的方法，获得了将来源于各胞内分枝杆菌菌株的基因组DNA用Alexa647进行标记而得的标记产物，并获得了其片段化物。

另外，通过与上述(4)(i)～(ii)同样的方法，获得了将来源于鸟分枝杆菌的基因组DNA用Alexa555进行标记而得的标记产物，并获得了其片段化物。

然后，通过与上述(4)(i)～(ii)同样的方法，获得了来源于各胞内分枝杆菌菌株的基因组DNA的Alexa647标记产物的片段化物、和来源于鸟分枝杆菌的对照用基因组DNA Alexa555标记产物的片段化物的Alexa555-Alexa647标记产物混合溶液。

使用所得的各Alexa555-Alexa647标记产物混合溶液，通过与上述(5)～(6)同样的方法，相对于实施例1(3)所得的来源于胞内分枝杆菌的基因组的全基因组鸟枪克隆的微阵列，进行Alexa647标记产物和Alexa555标记产物的竞争杂交、以及荧光强度的测定。

进一步，通过与上述(6)同样的方法，基于微阵列上检测到的Alexa555/Alexa647的荧光强度比(Ratio)，按照常规方法进行散点图(Scatter plot)分析。

基于所得的分析结果，通过与上述(6)同样的方法，计算出所有微阵列的斑点的荧光强度比，选择出荧光强度高、且Alexa647与Alexa555的荧光强度比高的斑点。

(8)候选克隆的选择

基于以上结果，作为在选择作为共有序列的候选上的一个目标，从来源于胞内分枝杆菌的基因组的微阵列上，选择出7株以上的与胞内分枝杆菌菌株杂交、且不与鸟分枝杆菌杂交的斑点。其结果是选择出了15个斑点(候选克隆)。

(9)候选克隆的碱基序列确定

接下来，对于上述(8)所选择出的15个候选克隆，通过下述方法进行序列分析，进行各个克隆的碱基序列确定。

即，使用Big Dye Terminator试剂盒(アプライドバイオシステムズ社制)，按照制品说明书以以下步骤进行序列分析。

一次候选DNA(一次候选克隆) ：2μL(100ng)

M13Primer M1 ：1μL(5pmol)

premix ：8μL

在上述混合物中，加入去离子灭菌水使得总体积为20μL，使用DNA热循环仪(DNA Engine PTC200、MJ Research Inc.制)，在下述反应条件下进行30个循环的测序反应。

96℃2分钟→(96℃10秒→50℃5秒→60℃4分钟)×25→4℃

将所得的PCR产物用QIAGEN社制凝胶过滤柱进行纯化，然后使用测序仪(BaseStation、MJ Research Inc.制)，按照仪器附带的操作说明书，完成所有候选序列的序列解读。

将得到的结果在数据库(NCBI BLAST和CHEMICAL ABSTRACT)中进行检索，也可能因为胞内分枝杆菌是基因组序列未解读的生物种，其结果是，在数据库上可推定，候选的15个克隆的碱基序列是未登录的新序列。

确定的各候选克隆的候选序列的名称、克隆ID号和碱基序列的序列号汇总示于下述表6。此外，所谓“克隆ID号”，是本发明者所命名的克隆ID号。

表6

实施例2候选序列A的胞内分枝杆菌株间保守性评价1

(1)本发明的引物的合成

基于实施例1(9)所确定的表6记载的候选克隆中的候选克隆A(克隆ID号：R02_5h)的序列(碱基序列)的各分析结果，由该候选序列A(序列号1)，使用引物设计用Web工具Primer3(Whitehead Institute for BiomedicalResearch)，设计出用于PCR的引物的碱基序列，即“5’-CGTGGTGTAGTAGTCAGCCAGA-3’”(序列号16、以下称为“Mint 02_T7pa Fw1”)和“5’-AAAAACGGATCAGAAGGAGAC-3’”(序列号17，以下称为“Mint02_T7pa Rv1”)。

接着，使用ABI社DNA合成仪392型，通过亚磷酰胺法合成所设计的碱基序列的寡核苷酸。合成方法按照ABI社的手册进行。各种寡核苷酸的脱保护通过将寡核苷酸的氨水溶液在55℃加热过夜来进行。

接着使用フアルマシア社制FPLC进行阴离子交换柱层析，从而纯化合成寡核苷酸。

使用该合成寡核苷酸作为本发明的引物。

(2)来源于胞内分枝杆菌的DNA样品的制备

按照实施例1(1)所述的制备方法，处理上述表5记载的胞内分枝杆菌菌株(10菌株)，分别进行DNA的提取、纯化。将所得的各个纯化DNA制成终浓度1ng/μl(10mM Tris-HCl缓冲液、pH8.9)的溶液，作为各来源于胞内分枝杆菌菌株的DNA样品。

另外，从鸟分枝杆菌(IID585)中按照常规方法提取、纯化基因组DNA，同样地制成终浓度为1ng/μl(10mM Tris-HCl缓冲液、pH8.9)的溶液，作为来源于鸟分枝杆菌的DNA样品。

(3)实时PCR

(i)PCR用反应液的制备

制备含有上述(1)所合成的引物Mint 02_T7pa Fw1和引物Mint02_T7pa Rv1各300nM、终浓度为原液的30000倍稀释的SYBR^TM GreenI(Molecular Probe社商品名)、1.5mM MgCl₂、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1％胆酸钠、0.1％TritonX-100、各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP、以及40单元/ml的Taq DNA聚合酶(ニツポンジ一ン制)的10mMTris-HCl(pH8.9)，作为PCR用反应液。

(ii)实时PCR

作为用作PCR中的扩增靶标的模板DNA，使用上述(2)所制备的来源于各胞内分枝杆菌菌株的DNA样品，如下通过嵌入法进行实时PCR，进行荧光的定量监视。

首先，在上述(3)(i)所制备的PCR用反应液20μl中，添加上述(2)所制备的DNA样品1μL(1ng)，作为PCR用样品。

将该PCR用样品加入到96孔反应板(マイクロアンプ·オプチカル·96ウエル·リアクシヨン·プレ一ト、アプライドバイオシステムズジヤパン社制)的孔中，使用TaqMan^TM PCR专用热循环仪-检测器(ABI 7500、アプライドバイオシステムズジヤパン社制)进行实时PCR。

即，在95℃保温10分钟，然后将在95℃15秒、在60℃1分钟的反应重复40个循环，测定与引物延伸产物的扩增量相关地嵌入的SYBR^TMGreen I的荧光强度。

此外，预计通过使用正向引物Mint 02_T7pa Fw1和反向引物Mint02_T7pa Rv1的上述实时PCR，如果作为模板使用的各胞内分枝杆菌菌株的基因组DNA中存在候选克隆A的碱基序列，则序列号92所示序列(116个碱基)的片段被复制，从而检测到荧光。

(4)熔解曲线分析

基于通过使用来源于各胞内分枝杆菌菌株的各DNA样品作为模板的PCR获得的测定结果，分别以引物延伸产物(双链DNA)的解离温度为横轴、以荧光强度的1次微分(变化量)为纵轴制成熔解曲线，进行峰的检测。

(5)结果

将使用来源于各胞内分枝杆菌菌株的各DNA样品获得的熔解曲线分析的结果汇总于1幅图中，示于图1。

正如由图1的结果可明确的那样，使用本发明的引物Mint 02_T7paFw1和引物Mint 02_T7pa Rv1，分别使用由10种胞内分枝杆菌菌株获得的DNA样品作为模板进行实时PCR，在SYBR Green I存在下进行扩增，将扩增所得的核酸进行熔解曲线分析，结果在任一情况下，都能确认核酸扩增所产生荧光信号(图1：胞内分枝杆菌)，可以判定为胞内分枝杆菌阳性。而且，所得的信号的峰均为单一峰。并且峰的位置几乎重叠。

与此相对，通过与上述(1)～(4)同样的方法，使用从作为除胞内分枝杆菌以外的分枝杆菌属菌的鸟分枝杆菌获得的DNA样品作为模板，使用相同引物、在同样条件下进行了PCR。这种情况下，不能确认核酸扩增所产生的荧光信号(图1：鸟分枝杆菌)，能够判定为胞内分枝杆菌阴性。

由以上结果判定，如果使用本发明的引物Mint 02_T7pa Fw1和引物Mint 02_T7pa Rv1进行PCR，则只要存在上述10种胞内分枝杆菌菌株中的任何种，就能够进行其检测，并且能对胞内分枝杆菌菌种进行特异性的检测。而且，由此说明，作为靶标的候选序列A是胞内分枝杆菌的共有序列的可能性高。

实施例3其它候选克隆的胞内分枝杆菌株间的碱基序列的保守性评价2

基于实施例1(9)所确定的表6记载的候选克隆A～O的各序列(碱基序列)的分析结果，由该各候选克隆的碱基序列，使用引物设计用Web工具Primer3(Whitehead Institute for Biomedical Research.)，分别设计用于检测PCR扩增的引物序列。

各候选序列的名称、该候选序列的碱基序列的序列号、以该候选克隆的碱基序列为基础设计的引物的名称(由发明者命名)及其碱基序列的序列号、以及接下来进行的PCR中使用的正向引物和反向引物的组合汇总示于表7。

表7

接着，通过与实施例2(1)同样的方法，合成、纯化所设计的碱基序列的各寡核苷酸。使用该合成寡核苷酸作为本发明的引物，用表7记载的正向引物与反向引物的组合，通过与实施例2(2)～(4)同样的方法进行DNA样品的制备、实时PCR、熔解曲线分析。

其结果是，在使用任一引物的组合进行实时PCR时，均获得与实施例2的图1同样的熔解曲线。即，使用表7记载的引物组合，分别使用由表5记载的10种胞内分枝杆菌菌株获得的DNA样品作为模板进行实时PCR，在SYBR Green I存在下对所扩增的核酸进行熔解曲线分析。其结果是，在任一情况下均能确认核酸扩增所产生的荧光信号，能够判定为胞内分枝杆菌阳性。并且，所得的信号的峰均为单一峰。而且峰的位置几乎重叠。

另外，与实施例2同样地，使用由作为除胞内分枝杆菌以外的分枝杆菌属菌的鸟分枝杆菌获得的DNA样品作为模板，使用相同引物进行PCR。这时，不能确认核酸扩增所产生的荧光信号，能够判定均为胞内分枝杆菌阴性。

由以上结果判断，如果使用表7所记载的本发明的引物进行PCR，则只要存在上述10种胞内分枝杆菌菌株中的任何种，就能够检测出，而且能够对胞内分枝杆菌菌种进行特异性检测。并且，由此说明，作为靶标的候选序列A～O均为胞内分枝杆菌的共有序列的可能性高。

实施例4候选克隆A的胞内分枝杆菌特异性评价

(1)本发明的引物的合成

使用与上述实施例2(1)所用的相同的Mint 02_T7pa Fw1和引物Mint02_T7pa Rv1，并使用与实施例2(1)相同的仪器，通过同样的方法进行合成。

使用该合成产物作为本发明的引物。

(2)来源于各细菌的DNA样品的制备

通过下述方法分别制备来源于以下所示各分枝杆菌属细菌和大肠杆菌(Escherichia coli)的DNA样品。

a：大肠杆菌(Escherichia coli)(ATCC11775)

b：结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，人型结核菌)(TMC102[H37Rv])

c：堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)(ATCC12478)

d：海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)(ATCC927)

e：猿分枝杆菌(Mycobacterium simiae)(ATCC25275)

f：瘰疬分枝杆菌(Mycobacterium scrofulaceum)(ATCC19981)

g：戈氏分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)(ATCC 14470)

h：苏尔加分枝杆菌(Mycobacterium szulgai)(ATCC35799)

i：鸟分枝杆菌(TNC16741)

j：胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)(ATCC13950)

k：胃分枝杆菌(Mycobacterium gastri)(ATCC 15754)

l：蟾分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)(ATCC19250)

m：无色分枝杆菌(Mycobacterium nonchromogenicum)(ATCC19530)

n：地分枝杆菌(Mycobacterium terrae)(ATCC 15755)

o：次要分枝杆菌(Mycobacterium triviale)(ATCC23292)

p：偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)(ATCC6841)

q：龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonei)(ATCC35752)

r：脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)(ATCC19977)

s：外来分枝杆菌(Mycobacterium peregrinum)(ATCC 14467)

首先，对于结核分枝杆菌，从Mycos Research，LLC获得的纯化基因组DNA，将其作为纯化DNA使用。

对于鸟分枝杆菌，从东京大学医科学研究所获得典型菌株(IIID 585)，对于除此以外的细菌，从American Type Culture Collection(美国典型培养物保藏中心，ATCC)获得菌株。然后，通过下述方法提取、纯化DNA。细菌均为典型菌株，是已经能在培养之后，根据菌落形状和/或现有的各种生化学的试验等鉴别菌种的菌株。

即，对于分枝杆菌(Mycobacterium)属细菌，首先，将小川培养基上的菌落悬浮于纯化水中，进行高压釜处理(120℃、2大气压、20分钟)。接着将菌体进行粉碎处理(通过直径2mm玻璃珠进行物理破碎)，然后离心分离，获得上清。使用(株)キアゲン制的离子交换树脂型DNA提取纯化试剂盒Genomic-tip从得到的上清中进行DNA的提取、纯化。

另外，对于大肠杆菌，按照大肠杆菌的DNA提取方法的常规方法，提取、纯化DNA。

将得到的各纯化DNA制成终浓度为1ng/μl(10mM Tris-HCl缓冲液、pH8.9)的溶液，作为来源于各细菌的DNA样品。

(3)实时PCR

除了使用上述(2)所制备的来源于各细菌的DNA作为模板以外，通过与实施例2(3)同样的方法进行实时PCR。

(4)熔解曲线分析

通过与实施例2(4)同样的方法，基于通过使用来源于各细菌的DNA样品作为模板的PCR获得的测定结果，分别以引物延伸产物(双链DNA)的解离温度为横轴、以荧光强度的1次微分(变化量)为纵轴制成熔解曲线，并检测峰。

(5)结果

将使用来源于各细菌的DNA样品获得的熔解曲线分析的结果汇总于1幅图中，示于图2。

正如由图2的结果明确的那样，使用本发明的引物Mint 02_T7pa Fw1和引物Mint 02_T7pa Rv1，在SYBR Green I存在下进行实时PCR，对扩增出的核酸进行熔解曲线分析，结果，仅在使用来源于胞内分枝杆菌的DNA样品作为模板进行实时PCR时，能够确认核酸扩增所产生的荧光信号(图2：胞内分枝杆菌)，能够判定为胞内分枝杆菌阳性。

与此相对，正如由图2可明确的那样，在使用来源于除胞内分枝杆菌以外的分枝杆菌属细菌和/或作为其它属细菌的大肠杆菌的DNA作为模板，使用相同的引物组合同样地进行实时PCR时，不能确认该荧光信号(图2：其它种)。能够判定均为胞内分枝杆菌阴性。

另外如由图2明确的那样，在使用来源于胞内分枝杆菌的DNA样品作为模板的情况下进行熔解曲线分析的结果是获得了单一的明确峰，由此判断，所进行检测法是对胞内分枝杆菌特异性极高的检测方法。

由以上结果判断，通过使用本发明的寡核苷酸作为引物，能够特异性地检测胞内分枝杆菌。另外判断，由于利用PCR等核酸扩增的检测可以期待高灵敏度，因而不需要分离细菌，能够将临床材料直接用于检测，因此对于如果利用现有的培养细菌然后进行检测的方法则要在培养上花费几周的胞内分枝杆菌的检测，能够在最长1天以内完成。

实施例5其它候选克隆的胞内分枝杆菌特异性评价2

(1)本发明的引物的合成

使用与实施例2(1)相同的仪器，通过同样的方法，合成、纯化上述表7所记载的、除引物Mint 02_T7pa Fw1和引物Mint 02_T7pa Rv1以外的寡核苷酸。

使用该合成寡核苷酸作为本发明的引物。

(2)来源于各细菌的DNA样品的制备

使用与实施例4所用的相同的细菌，通过与实施例4(2)同样的方法，制备来源于各细菌的DNA样品。

(3)实时PCR

将上述(1)中设计、合成的引物以上述表7的组合使用，并使用上述(2)所制备的来源于各细菌的DNA样品作为模板，除此之外，通过与实施例2(3)同样的方法进行实时PCR。

(4)熔解曲线分析

通过与实施例2(4)同样的方法，使用来源于各细菌的DNA样品作为模板进行PCR，以获得的测定结果为基础，分别以引物延伸产物(双链DNA)的解离温度为横轴、以荧光强度的1次微分(变化量)为纵轴制成熔解曲线，并检测峰。

(5)结果

与实施例4的结果同样，使用上述表7所记载的本发明的引物，在SYBR Green I存在下进行实时PCR，对扩增得到的核酸进行熔解曲线分析，其结果是，无论使用表7记载的哪种引物组合，仅在使用来源于胞内分枝杆菌的DNA样品作为模板进行实时PCR时，能够确认核酸扩增所产生的荧光信号，能够判定为胞内分枝杆菌阳性。

与此相对，在使用来源于除胞内分枝杆菌以外的分枝杆菌属细菌和/或作为其它属细菌的大肠杆菌的DNA作为模板，使用表7记载的任何相同引物组合同样地进行实时PCR的情况下，也都不能确认该荧光信号，从而能够判定均为胞内分枝杆菌阴性。

另外，使用来源于胞内分枝杆菌的DNA样品作为模板的情况下的熔解曲线分析的结果与实施例4的情况同样地获得了单一的明确峰，由此得知，所进行的检测法是对胞内分枝杆菌的特异性极高的检测方法。

由以上结果判断，通过使用本发明的寡核苷酸作为引物进行PCR，能够特异性地检测胞内分枝杆菌。另外判断，由于利用PCR等核酸扩增的检测可以期待高灵敏度，因而不需要分离细菌，能够将临床材料直接用于检测，因此对于如果利用现有的培养细菌然后进行检测的方法则要在培养上花费几周的胞内分枝杆菌的检测，能够在最长1天以内完成。

实施例6最小检测灵敏度试验

利用实时PCR检测法，检验以候选克隆J(克隆ID号：R27_4g)的碱基序列为靶标时的检测灵敏度。

(1)本发明的引物的合成

基于实施例1(9)所确定的表6记载的候选克隆中的候选克隆J(克隆ID号：R27_4g)的序列(碱基序列)的各分析结果，由该候选序列J(序列号10)，使用引物设计用Web工具Primer3(Whitehead Institute forBiomedical Research.)，设计出用于PCR的引物的碱基序列，即“5’-CAGCGACCGTGTGTTCTTAC-3’”(序列号64、以下称为“Mint21_FWpa Fw1”)、和“5’-GGAAGTGGGCGGTATCCT-3’”(序列号65，以下称为“Mint 21_FWpa Rv1”)。

接着使用フアルマシア社制FPLC进行阴离子交换柱层析，从而对合成寡核苷酸进行纯化。使用该合成寡核苷酸作为本发明的引物。

(2)PCR用DNA样品的制备

按照实施例1(1)所述的制备方法，从胞内分枝杆菌(M.intracellulareJCM6384)获得来源于胞内分枝杆菌的纯化基因组DNA，从而制备来源于胞内分枝杆菌的DNA样品。

测定所制备的来源于胞内分枝杆菌的DNA样品的吸光度，从而测定该样品中的DNA量。将所得的DNA量与以浓度已知的胞内分枝杆菌JCM6384的基因组DNA为样品同样地测定吸光度而得的测定值进行比较，从而确定样品中的基因组DNA量(基因组拷贝数)。获得了10⁸拷贝/μl的基因组DNA。

接着使用pH8.9的10mM Tris-HCl缓冲液，制备将DNA样品稀释为10⁵，10⁴，10³，10²，10，5个拷贝/μL的稀释系列，作为PCR用DNA样品。

(3)实时PCR

(i)PCR用反应液的制备

制备含有上述(1)获得的引物Mint 21_FWpa Fw1和引物Mint21_FWpa Rv1各300nM、终浓度为原液的30000倍稀释的SYBR Green I(Molecular Probe社)、1.5mM MgCl₂、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1％胆酸钠、0.1％TritonX-100、各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP、以及40单元/ml的Taq DNA聚合酶(ニツポンジ一ン制)的10mM Tris-HCl(pH8.9)，作为PCR用反应液。

(ii)实时PCR

在上述(3)(i)所制备的PCR用反应液20μl中，添加上述(2)所制备的PCR用DNA样品1μL，将所得溶液作为PCR用样品。

此外，对供给测定的每块96孔反应板，利用测定中所使用的热循环仪的将相对荧光强度比数值化的功能，求出荧光强度。

(4)结果

由所得的实验数据，按照实时PCR法中进行的常规方法，对每份各浓度的PCR用DNA样品，将来源于SYBR Green I的荧光强度(Rn、y轴)相对于PCR的循环数作图，从而制成扩增曲线。

所得的扩增曲线示于图3。

接着，由所得的扩增曲线，通过下述方法制成标准曲线。

即，选择所得的扩增曲线(图3)的荧光强度呈指数函数扩增的Rn部分，引入阈值线(Threshold line，Th)。将Th和各PCR用DNA样品的荧光强度交叉的点作为循环阈值(Threshold cycle，Ct)值。然后将Ct值(y轴)对所用的各PCR用DNA样品的基因组拷贝数(x轴，对数值)作图，将针对各Ct获得的近似曲线作为标准曲线。得到的标准曲线示于图4。

y＝-3.356x+35.57

R²＝0.999

由以上结果判断，由于首先通过实时PCR检测到荧光，因而只要使用本发明的寡核苷酸作为引物进行实时PCR，就能够检测胞内分枝杆菌。

另外，根据能够制成标准曲线判断，通过使用本发明的引物和探针的实时PCR法，能够进行胞内分枝杆菌的定量。并且由图4得知，通过使用本发明的引物和探针的实时PCR法，即使在胞内分枝杆菌的基因组DNA作为初始量存在5个拷贝的条件下，也能够进行胞内分枝杆菌的检测。

另外，本法的PCR的扩增效率在计算上为98.4％，能够确认高反应性。

并且，使用上述表7所记载的其它引物的组合进行了同样的实验，结果获得了几乎同等的成绩。由以上结果明确了，通过以候选序列A～O为目标进行实时PCR，能够进行胞内分枝杆菌的检测和定量。

产业可利用性

根据使用本发明的引物或/和探针的胞内分枝杆菌的检测方法，能够远比现有的检测方法迅速、高精度且特异性地进行胞内分枝杆菌的检测。

另外，根据使用本发明的引物的胞内分枝杆菌的检测方法，能够通过一次操作检测存在多种血清型或菌株的胞内分枝杆菌的任何种的情况。另外，由此检测操作变得简单，诊断所需时间也缩短，因此在特别要求诊断迅速性的临床检查的领域是极为有用的。