CN105073195A - 使用Wnt途径抑制剂进行治疗的方法及对该治疗的监测 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及治疗疾病例如癌的方法，其包含单独投予Wnt途径抑制剂或与其他抗癌剂组合投予，及监测骨骼相关不良反应及/或毒性。

Description

使用Wnt途径抑制剂进行治疗的方法及对该治疗的监测
相关申请案的交互引用
本申请案主张美国临时专利申请案61/760,523(2013年2月4日提出)的优先权权益，其以引用方式整体纳入本文。
技术领域
本发明关于使用Wnt途径抑制剂治疗疾病的领域。更特别地，本发明提供治疗癌的方法，该方法包含单独投予Wnt途径抑制剂或与其他抗癌剂组合投予，及监测不良反应及/或毒性的方法。
背景技术
癌症是已开发国家的主要死因之一，光是在美国每年就有超过一百万人被诊断出癌症而且有500,000例死亡。整体来说，预期每3人中超过1人会在有生之年发展出某些形式的癌。癌症有超过200种不同的种类，其中四种：乳癌、肺癌、结直肠癌及前列腺癌，占所有新病例的几乎一半(Siegeletal.,2011,CA:ACancerJ.Clin.61:212-236)。
信号传导途径通常连接细胞外信号至细胞核，导致表达直接或间接控制细胞生长、分化、存活、及死亡的基因。在许多种类的癌中，信号传导途径失调且可能与肿瘤起始及/或进展有关。与人癌症发生有关的信号传导途径包括但不限于Wnt途径、Ras-Raf-MEK-ERK或MAPK途径、PI3K-AKT途径、CDKN2A/CDK4途径、Bcl-2/TP53途径、及缺口(Notch)途径。
Wnt信号传导途径已被认为是有效的癌治疗标靶。Wnt信号传导途径是胚胎模式形成、后胚胎组织维持及干细胞生物学的重要调节因子之一。更特别地，Wnt信号传导在细胞极性的产生和细胞命运决定包括干细胞族群自我更新扮演重要角色。未受调节的Wnt途径活化与许多人癌症有关，一般相信该活化可改变细胞的发育命运。活化Wnt途径可能使肿瘤细胞维持在未分化状态及/或导致不受控制的增殖。因此癌的发生可藉由超越控制正常发育及组织修复的恒定机制进行(于Reya&Clevers,2005,Nature,434:843-50；Beachyetal.,2004,Nature,432:324-31中回顾)。
Wnt信号传导途径首先在果蝇发育突变无翅(wg)以及小鼠原致癌基因int-1(现称Wnt1)中阐述(Nusse&Varmus,1982,Cell,31:99-109；VanOoyen&Nusse,1984,Cell,39:233-40；Cabreraetal.,1987,Cell,50:659-63；Rijsewijketal.,1987,Cell,50:649-57)。Wnt基因编码分泌型脂肪修饰糖蛋白，其中19种已在哺乳动物中识别。这些分泌型配体活化由卷曲(FZD)受体家族成员及低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白5或6(LRP5/6)组成的受体复合体。该等FZD受体为G蛋白偶合受体(GPCR)超家族的七个跨膜结构域蛋白，且包含具有10个保守性半胱氨酸的大型胞外N端配体结合结构域，称为多半胱氨酸区(CRD)或Fri结构域。有十种人FZD受体，FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9及FZD10。不同的FZDCRD对特定Wnt蛋白有不同的结合亲和性(Wu&Nusse,2002,J.Biol.Chem.,277:41762-9)，FZD受体已被分成活化典型β-连环蛋白途径者及活化非典型途径者(Milleretal.,1999,Oncogene,18:7860-72)。
Wnt信号传导于癌症的角色，首先是因为识别Wnt1(原名int1)为藉由邻近插入小鼠病毒而转化的乳房肿瘤的致癌基因而被发现(Nusse&Varmus,1982,Cell,31:99-109)。其他Wnt信号传导在乳癌角色的证据自此开始累积。举例来说，基因转殖β-连环蛋白于乳腺中的过度表达导致增殖及腺癌(Imbertetal.,2001,J.CellBiol.,153:555-68；Michaelson&Leder,2001,Oncogene,20:5093-9)，然而丧失Wnt信号传导扰乱正常乳腺发育(Teperaetal.,2003,J.CellSci.,116:1137-49；Hatselletal.,2003,J.MammaryGlandBiol.Neoplasia,8:145-58)。在人乳癌中，β-连环蛋白累积表示超过50％的癌中有经活化的Wnt信号传导，虽然特定突变尚未被识别，但已观察到卷曲受体表达上调(Brennan&Brown,2004,J.MammaryGlandBiol.Neoplasia,9:119-31；Malovanovicetal.,2004,Int.J.Oncol.,25:1337-42)。
Wnt途径的活化也和结直肠癌有关。大约5至10％的所有结直肠癌为遗传性，其中一种主要形式为家族性腺瘤息肉症(FAP)，这是一种体染色体显性疾病，其中大约80％的患者包含大肠腺瘤息肉(APC)基因的种系突变。另外也在其他Wnt途径成分包括Axin及β-连环蛋白发现突变。个别腺瘤为包含第二失活等位基因的上皮细胞的种系过度生长，大量FAP腺瘤无可避免地导致腺癌经由致癌基因及/或抑瘤基因的额外突变发生。另外，Wnt信号传导途径的活化，包括APC的功能丧失突变及β-连环蛋白的稳定突变，可诱导小鼠模型中的增殖发育及肿瘤生长(Oshimaetal.,1997,CancerRes.,57:1644-9；Haradaetal.,1999,EMBOJ.,18:5931-42)。
黑色素瘤和乳癌及结肠癌类似，通常具有Wnt途径的组成性活化，如细胞核累积β-连环蛋白所示。一些黑色素瘤及细胞系中的Wnt/β-连环蛋白途径活化是因为途径成分的修饰所致，如APC、ICAT、LEF1及β-连环蛋白(见例如Larueetal.,2006,FrontiersBiosci.,11:733-742)。然而，文献中关于Wnt/β-连环蛋白信号传导于黑色素瘤的确切角色有所冲突。举例来说，一项研究发现细胞核β-连环蛋白浓度上升和黑色素瘤存活改善有关，而经活化的Wnt/β-连环蛋白信号传导却与细胞增殖减少有关(Chienetal.,2009,PNAS,106:1193-1198)。
化学治疗是发展成熟的治疗许多癌症的手段，但其疗效可受限于不良反应及/或毒性。此外，标靶疗法例如抗ErbB2受体(HER2)抗体曲妥珠单抗(trastuzumab)(HERCEPTIN)、酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(imatinib)(GLEEVEC)、达沙替尼(dasatinib)(SPRYCEL)、尼罗替尼(nilotibib)(TASIGNA)、舒尼替尼(sunitinib)(SUTENT)、索拉非尼(sorafenib)(NEXAVAR)、抗VEGF抗体贝伐珠单抗(bevacizumab)(AVASTIN)、及抗血管新生药物舒尼替尼(sunitinib)(SUTENT)及索拉非尼(sorafenib)(NEXAVAR)，已知会造成或可能造成用药受试者的不良反应及/或毒性。因此，能识别药物引发的不良反应、监测该等不良反应、及/或减轻该等不良反应，以使有效的癌症疗法得以继续的新颖方法仍有需要。
发明内容
本发明提供治疗疾病的改良方法，该方法包含对受试者投予治疗有效量的Wnt途径抑制剂。例如，在一方面中，本发明提供筛选、检测、识别、监测、减少、预防、减弱、及/或减轻与Wnt途径抑制剂治疗有关的骨骼相关不良反应及/或毒性的方法。在一些实施方式中，该等方法包含测定来自病患的样本中骨转换标志的量，该病患已接受、正在接受、将要接受、或考虑接受Wnt途径抑制剂的初次或进一步治疗，该Wnt途径抑制剂包括但不限于抗卷曲(FZD)抗体或可溶性FZD受体。
在另一方面中，本发明提供识别受试者为适合使用Wnt途径抑制剂进行治疗的方法，其包含：自该受试者获得生物样本、测定该样本中生物标志的量、及若该生物标志的量系低于预设量，则识别该受试者为适合使用该Wnt途径抑制剂进行治疗。在一些实施方式中，该生物标志系骨转换标志。在一些实施方式中，该生物标志系骨吸收生物标志。在一些实施方式中，该识别受试者为适合使用Wnt途径抑制剂进行治疗的方法包含：自该受试者获得生物样本、测定该样本中骨吸收生物标志的量、及若该骨吸收生物标志的量系低于预设量，则识别该受试者为适合使用该Wnt途径抑制剂进行治疗。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系第1型胶原蛋白交联的C-端肽(β-CTX)。
在一方面中，本发明提供监测接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者是否发展骨骼相关不良反应及/或毒性的方法，其包含：自该接受治疗的受试者获得生物样本、测定该样本中生物标志的量、及比较该样本中生物标志的量与该生物标志的预设量，其中该生物标志的量增加显示发展骨骼相关不良反应及/或毒性。在一些实施方式中，该生物标志系骨转换标志。在一些实施方式中，该生物标志系骨吸收生物标志。在一些实施方式中，该监测接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者是否发展骨骼相关不良反应及/或毒性的方法包含：自该接受治疗的受试者获得生物样本、测定该样本中骨吸收生物标志的量、及比较该样本中骨吸收生物标志的量与该骨吸收生物标志的预设量，其中该骨吸收生物标志的量增加显示发展骨骼相关不良反应及/或毒性。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系β-CTX。
在另一方面中，本发明提供对接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者检测骨骼相关不良反应及/或毒性发展的方法，其包含：自该接受治疗的受试者获得生物样本、测定该样本中生物标志的量、及比较该样本中生物标志的量与该生物标志的预设量，其中该生物标志的量增加显示发展骨骼相关不良反应及/或毒性。在一些实施方式中，该生物标志系骨转换标志。在一些实施方式中，该生物标志系骨吸收生物标志。在一些实施方式中，该对接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者检测骨骼相关不良反应及/或毒性发展的方法包含：自该接受治疗的受试者获得生物样本、测定该样本中骨吸收生物标志的量、及比较该样本中骨吸收生物标志的量与该骨吸收生物标志的预设量，其中该骨吸收生物标志的量增加显示发展骨骼相关不良反应及/或毒性。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系β-CTX。
在另一方面中，本发明提供对接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者识别骨骼相关不良反应及/或毒性发展的方法，其包含：自该接受治疗的受试者获得生物样本、测定该样本中生物标志的量、及比较该样本中生物标志的量与该生物标志的预设量，其中若该样本中生物标志的量系高于该生物标志的预设量，则显示骨骼相关不良反应及/或毒性。在一些实施方式中，该生物标志系骨转换标志。在一些实施方式中，该生物标志系骨吸收生物标志。在一些实施方式中，该对接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者识别骨骼相关不良反应及/或毒性发展的方法包含：自该接受治疗的受试者获得生物样本、测定该样本中骨吸收生物标志的量、及比较该样本中骨吸收生物标志的量与该骨吸收生物标志的预设量，其中若该样本中骨吸收生物标志的量系高于该骨吸收生物标志的预设量，则显示骨骼相关不良反应及/或毒性。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系β-CTX。
在另一态样中，本发明提供对接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者监测骨骼相关不良反应及/或毒性发展的方法，其包含：自该接受治疗的受试者获得生物样本、测定该样本中生物标志的量、及比较该样本中生物标志的量与该生物标志的预设量，其中若该样本中生物标志的量系高于该生物标志的预设量，则显示骨骼相关不良反应及/或毒性。在一些实施方式中，该生物标志系骨转换标志。在一些实施方式中，该生物标志系骨吸收生物标志。在一些实施方式中，该对接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者监测骨骼相关不良反应及/或毒性发展的方法包含：自该接受治疗的受试者获得生物样本、测定该样本中骨吸收生物标志的量、及比较该样本中骨吸收生物标志的量与该骨吸收生物标志的预设量，其中若该样本中骨吸收生物标志的量系高于该骨吸收生物标志的预设量，则显示骨骼相关不良反应及/或毒性。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系β-CTX。
在本文中所描述的方法的一些方面及/或实施方式中，其中若样本中该骨吸收生物标志的量(例如β-CTX)相较于预设量增加2倍或更高，则对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系β-CTX且该预设量系小于约1000pg/ml。在一些实施方式中，该抗吸收药物剂系双膦酸盐。
在另一方面中，本发明提供使接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者减少骨骼相关不良反应及/或毒性的方法，其包含：自该接受治疗的受试者获得生物样本、测定该样本中骨吸收生物标志的量、比较该样本中骨吸收生物标志的量与该骨吸收生物标志的预设量、及若该样本中骨吸收生物标志的量系高于该骨吸收生物标志的预设量，则对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物。在一些实施方式中，该吸收生物标志增加为该骨吸收生物标志的预设量的约1.5倍或更高、约2倍或更高、约2.5倍或更高、或约3倍或更高。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系β-CTX。在一些实施方式中，该抗吸收药物剂系双膦酸盐。
在另一方面中，本发明提供使接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者预防或减弱骨骼相关不良反应及/或毒性发展的方法，其包含：在使用Wnt途径抑制剂治疗之前，自该接受治疗的受试者获得生物样本、测定该样本中骨吸收生物标志的量、比较该样本中骨吸收生物标志的量与该骨吸收生物标志的预设量、对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物、及对该受试者投予该Wnt途径抑制剂。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系β-CTX。在一些实施方式中，该抗吸收药物剂系双膦酸盐。
在另一方面中，本发明提供对投予Wnt途径抑制剂的受试者改善骨骼相关不良反应及/或毒性的方法，其包含：测定样本中骨吸收生物标志的量、及对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系β-CTX。在一些实施方式中，该抗吸收药物剂系双膦酸盐。
在另一方面中，本发明提供筛选受试者因Wnt途径抑制剂治疗所致的骨骼相关不良反应及/或毒性的风险的方法，其包含：在使用Wnt途径抑制剂治疗之前，自该受试者获得生物样本、测定该样本中骨吸收生物标志的量、及比较该样本中骨吸收生物标志的量与该骨吸收生物标志的预设量，其中若该样本中骨吸收生物标志的量系高于该预设量，则该受试者具有骨骼相关不良反应及/或毒性的风险。在一些实施方式中，若该受试者具有骨骼相关不良反应及/或毒性的风险，则在使用该Wnt途径抑制剂治疗之前，对该受试者投予治疗有效量的针对该骨骼相关不良反应及/或毒性的治疗剂。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系β-CTX。在一些实施方式中，该针对骨骼相关不良反应的治疗剂系双膦酸盐。
在另一方面中，本发明提供对受试者治疗癌症的方法，其包含：对该受试者投予治疗有效量的Wnt途径抑制剂、及测定来自该受试者的样本中骨吸收生物标志的量。在一些实施方式中，该治疗癌症的方法另包含比较该样本中骨吸收生物标志的量与骨吸收生物标志的预设量。在一些实施方式中，该治疗癌症的方法另包含比较该样本中骨吸收生物标志的量与该骨吸收生物标志的预设量，其中若该骨吸收生物标志的量系高于该骨吸收生物标志的预设量，则该受试者具有骨骼相关不良反应及/或毒性的风险。在一些实施方式中，该治疗癌症的方法另包含比较该样本中骨吸收生物标志的量与该骨吸收生物标志的预设量，其中若该骨吸收生物标志的量系高于该骨吸收生物标志的预设量，则对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系β-CTX。在一些实施方式中，该抗吸收药物剂系双膦酸盐。
在另一方面中，本发明提供抑制受试者的肿瘤生长的方法，其包含：对该受试者投予治疗有效量的Wnt途径抑制剂、及测定来自该受试者的样本中骨吸收生物标志的量。在一些实施方式中，该抑制肿瘤生长的方法另包含比较该样本中骨吸收生物标志的量与骨吸收生物标志的预设量。在一些实施方式中，该抑制肿瘤生长的方法另包含比较该样本中骨吸收生物标志的量与该骨吸收生物标志的预设量，其中若该骨吸收生物标志的量系高于该骨吸收生物标志的预设量，则该受试者具有骨骼相关不良反应及/或毒性的风险。在一些实施方式中，该抑制肿瘤生长的方法另包含比较该样本中骨吸收生物标志的量与该骨吸收生物标志的预设量，其中若该骨吸收生物标志的量系高于该骨吸收生物标志的预设量，则对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系β-CTX。在一些实施方式中，该抗吸收药物剂系双膦酸盐。
在本文所述的方法的一些方面及/或实施方式中，该生物样本系血液、血清或血浆。在一些实施方式中，该生物样本系“空腹样本”。如本文所使用，“空腹样本”系指自尚未进食且尚未饮用任何饮料至少9至12个小时的受试者所采集的样本。在一些实施方式中，该预设量系在血液、血清、或血浆样本中约1500pg/ml或更低。在一些实施方式中，该预设量系在血液、血清、或血浆样本中约1200pg/ml或更低。在一些实施方式中，该预设量系在血液、血清、或血浆样本中约1000pg/ml或更低。在一些实施方式中，该预设量系在血液、血清、或血浆样本中约800pg/ml或更低。在一些实施方式中，该预设量系在血液、血清、或血浆样本中约600pg/ml或更低。在一些实施方式中，该预设量系在血液、血清、或血浆样本中约400pg/ml或更低。在一些实施方式中，该生物标志(例如骨转换标志)的预设量系该生物标志于稍早日期所获得的样本中的量。在一些实施方式中，该生物标志(例如骨转换标志)的预设量系该生物标志于治疗前所获得的样本中的量。在一些实施方式中，该生物标志(例如骨转换标志)的预设量系该生物标志于最初筛选时所获得的样本中的量。在一些实施方式中，该生物标志(例如骨转换标志)的预设量系正常参考量。在一些实施方式中，该生物标志的预设量系基准量。在一些实施方式中，该基准量系在最初筛选时(例如治疗前)所测定的该生物标志的量。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系β-CTX。在一些实施方式中，该β-CTX的预设量系在血液、血清、或血浆中约1000pg/ml或更低。
在本文所述的方法的一些方面及/或实施方式中，生物样本系于约每周、每2周、每3周、每4周、每5周、或每6周获得。
在前述各种方面的某些实施方式，以及本文他处所述的其他方面及实施方式中，该Wnt途径抑制剂系与至少一种人Wnt蛋白特异性结合的抗体。抗Wnt抗体的非限制性实例已于例如美国专利公开号2012/0027778及国际专利公开号WO2011/088127中描述。在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系与至少一种人FZD蛋白特异性结合的抗体。抗FZD抗体的非限制性实例已于例如美国专利第7,982,013号中描述。在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系可溶性FZD受体。可溶性FZD受体的非限制性实例已于例如美国专利第7,723,477及8,324,361号及美国专利公开号2011/0305695中描述。
在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系包含下列的抗体：(a)包含GFTFSHYTLS(SEQIDNO:1)的重链CDR1、包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQIDNO:2)的重链CDR2、及包含NFIKYVFAN(SEQIDNO:3)的重链CDR3，及/或(b)包含SGDNIGSFYVH(SEQIDNO:4)的轻链CDR1、包含DKSNRPSG(SEQIDNO:5)的轻链CDR2、及包含QSYANTLSL(SEQIDNO:6)的轻链CDR3。
在前述各种方面的某些实施方式，以及本文他处所述的其他方面及实施方式中，该Wnt途径抑制剂系包含下列的抗体：(a)与SEQIDNO:7具有至少约90％、至少约95％、或100％序列一致性的重链可变区；及/或(b)与SEQIDNO:8具有至少约90％、至少约95％、或100％序列一致性的轻链可变区。在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系抗体OMP-18R5。
在前述各种方面的某些实施方式，以及本文他处所述的其他方面及/或实施方式中，该Wnt途径抑制剂系重组抗体。在一些实施方式中，该抗体系单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或人抗体。在一些实施方式中，该抗体系包含抗原结合部位的抗体片段。在某些实施方式中，该抗体或抗体片段系单价、单特异性、或双价。在一些实施方式中，该抗体系双特异性抗体或多特异性抗体。在一些实施方式中，该抗体系IgG1抗体。在一些实施方式中，该抗体系IgG2抗体。在某些实施方式中，该抗体系经分离。在其他实施方式中，该抗体系实质上纯的。
在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系以约10nM至约0.1nM的解离常数(KD)与至少一种人FZD结合的抗体。
在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂包含与保藏于美国菌种保存中心(ATCC)的编号PTA-9541的质粒所编码的抗体相同的重链及轻链氨基酸序列。在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂包含与保藏于美国菌种保存中心(ATCC)的编号PTA-9541的质粒所编码的抗体相同的重链可变区及轻链可变区氨基酸序列。在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系由具有ATCC保藏编号PTA-9541的质粒所编码，该质粒依据布达佩斯条约的规定于2008年9月29日保藏于美国菌种保存中心(ATCC)(地址：10801UniversityBoulevard,Manassas,VA,20110)。在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂与保藏于美国菌种保存中心(ATCC)的编号PTA-9541的质粒所编码的抗体，竞争与人FZD的特异性结合。
在本文所述的方法的任何方面及/或实施方式中，该受试者罹患癌症。在一些实施方式中，该癌症系选自：肺癌、胰癌、乳癌、结肠癌、结直肠癌、黑色素瘤、胰癌、胃肠癌、肾癌(renalcancer)、卵巢癌、肝癌、子宫内膜癌、肾癌(kidneycancer)、前列腺癌、甲状腺癌、神经胚细胞瘤、神经胶瘤、多形性神经胶质母细胞瘤、子宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝肿瘤、肝细胞癌(HCC)、神经内分泌癌、甲状腺癌、腺癌、及头颈癌。在一些实施方式中，该癌系乳癌。在一些实施方式中，该癌系胰癌。在一些实施方式中，该癌系肺癌。在一些实施方式中，该癌系非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施方式中，该癌系卵巢癌。在一些实施方式中，该癌系肝癌。在一些实施方式中，该癌系HCC。
在本文所述的方法的任何方面及/或实施方式中，该受试者系经Wnt途径抑制剂与一或多种额外抗癌剂的组合治疗。在一些实施方式中，该一或多种额外抗癌剂系化学治疗剂。在一些实施方式中，该额外抗癌剂系太平洋紫杉醇(paclitaxel)或与白蛋白结合的太平洋紫杉醇。在一些实施方式中，该额外抗癌剂系吉西他滨(gemcitabine)。在一些实施方式中，该额外抗癌剂系吉西他滨及与白蛋白结合的太平洋紫杉醇。在一些实施方式中，该额外抗癌剂系多西紫杉醇(docetaxel)。在一些实施方式中，该额外抗癌剂系卡铂(carboplatin)。在一些实施方式中，该额外抗癌剂系卡铂及太平洋紫杉醇或与白蛋白结合的太平洋紫杉醇。在一些实施方式中，该额外抗癌剂系索拉非尼(sorafenib)。
本发明的方面或实施方式系以马库什群组或其他选择性形式的群组描述，本发明不仅包含被标示为整体的整个群组，但亦包含该群组的个别成员及该主要群组中所有可能的亚群，且亦包含不含其中一或多个群组成员的主要群组。本发明亦设想明确排除该申请专利的发明中任何群组成员之一或多者。
附图简要说明
图1：间歇性投予Wnt途径抑制剂对活体内乳房肿瘤生长的抑制。使用下列治疗小鼠：太平洋紫杉醇(-●-)、5mg/kgOMP-18R5与太平洋紫杉醇的组合(-■-)、10mg/kgOMP-18R5与太平洋紫杉醇的组合(-▲-)、25mg/kgOMP-18R5与太平洋紫杉醇的组合(-▼-)、或45mg/kgOMP-18R5与太平洋紫杉醇的组合(-◆-)。数据以治疗后天数的肿瘤体积(mm3)显示。OMP-18R5系经腹膜内投予，每三周一次(如箭头所示)，太平洋紫杉醇系以10mg/kg的剂量每周投予一次。
图2：间歇性投予Wnt途径抑制剂对活体内乳房肿瘤生长的抑制。使用下列治疗小鼠：太平洋紫杉醇(-■-)、25mg/kgOMP-18R5与太平洋紫杉醇(每4周一次)的组合(-▼-)、25mg/kgOMP-18R5与太平洋紫杉醇(每2周一次)的组合(-▲-)、或25mg/kgOMP-18R5与太平洋紫杉醇(每周一次)的组合(-●-)。数据以治疗后天数的肿瘤体积(mm3)显示。OMP-18R5系经腹膜内投予，太平洋紫杉醇系以15mg/kg的剂量每周投予一次。
图3：OMP-18R5对小鼠骨形成的影响。
图4：唑来膦酸(zoledronicacid)对OMP-18R5治疗小鼠的骨形成的影响。
具体实施方式
本发明的详细说明
本发明关于使用Wnt途径抑制剂治疗疾病。更特别地，本发明提供治疗癌的方法，该方法包含单独投予Wnt途径抑制剂或与其他抗癌剂组合投予，及监测骨骼相关不良反应及/或毒性(包括与Wnt途径抑制剂有关者)的方法。
抗FZD抗体OMP-18R5系于第1a期单剂药物增量临床试验中投予给受试者。此早期试验的数据以及动物试验的结果显示，投予Wnt途径抑制剂如抗FZD抗体或FZD8-Fc可溶性受体，可能在某些病患导致骨骼相关不良反应及/或毒性。另外，该第1a期试验显示β-CTX的量增加，可能是接受Wnt途径抑制剂治疗的病患，可能发生骨骼相关不良反应及/或毒性的早期指标，因此允许适当药物的介入治疗。
这些结果使吾等想针对如本文所述的骨骼相关不良反应及/或毒性发展风险降低及监测策略，以用于接受Wnt途径抑制剂(例如抗FZD抗体或可溶性FZD受体)作为单一剂治疗或与额外抗癌剂组合治疗的受试者。
I.定义
为了促进对本发明的了解，以下定义一些用语及用词。
本文所使用的用语“拮抗剂”及“拮抗性”，系指部分或完全阻断、抑制、减少、或中和标靶及/或信号传导途径(例如Wnt途径)的生物活性的任何分子。本文所使用的用语“拮抗剂”包括部分或完全阻断、抑制、减少、或中和蛋白(例如FZD蛋白或Wnt蛋白)的活性的任何分子。适当的拮抗剂分子特别包括但不限于拮抗剂抗体、抗体片段、可溶性受体、或小分子。
本文所使用的用语“调节”系指生物活性的改变或变化。调节包括但不限于刺激或抑制活性。调节可为增加或减少活性(例如减少Wnt途径信号传导)、改变结合特性，或任何其他与蛋白、途径、或其他生物关注点的活性有关的生物性、功能性、或免疫性性质的改变。
本文所使用的用语“抗体”系指免疫球蛋白分子，该免疫球蛋白分子藉由其可变区内的至少一个抗原识别部位，识别标靶(例如蛋白、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质、或前述的组合)且与的特异性结合。如本文所使用，该用语包含完整多克隆抗体、完整单克隆抗体、单链抗体、抗体片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')2、及Fv片段)、单链Fv(scFv)抗体、多特异性抗体诸如双特异性抗体、单特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原结合部位的融合蛋白，及任何其他包含抗原识别部位(例如抗原结合部位)的经修饰的免疫球蛋白分子，只要该抗体展现所欲的生物活性。抗体可为下列五种主要免疫球蛋白类型中的任一者：IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM或其亚型(同型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)，此系根据彼等分别被称为α、δ、ε、γ、及μ的重链恒定结构域命名。不同类型的免疫球蛋白具有不同且广为周知的亚单位结构及三维构型。抗体可为未经修饰(naked)或与其他分子缀合(conjugated)，该等其他分子包括但不限于毒素及放射性同位素。
用语“抗体片段”系指完整抗体的部分且系指完整抗体的抗原性决定可变区。抗原片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段、线性抗体、单链抗体及自抗体片段形成的多特异性抗体。本文所使用的“抗体片段”包含抗原结合部位或表位结合部位。
抗体的“可变区”用语系指抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区(不论单独或组合指称)。重链及轻链的可变区各由四个框架区(FR)及连接该四个框架区的三个互补决定区(CDR)组成，该三个CDR又名“超变异区”。各链中的CDR被框架区拉近，并与来自其他链中的CDR一起形成该抗体的抗原结合部位。至少有两种技术用于测定CDR：(1)基于跨种序列变异性的方法(即Kabatetal.,1991,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEdition,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD)；及(2)基于抗原-抗体复合物的结晶学研究的方法(Al-Lazikanietal.,1997,J.Mol.Biol.,273:927-948)。此外，有时该领域组合使用这两种技术以测定CDR。
本文所使用的用语“单克隆抗体”系指同源性抗体群，其高度特异性识别及结合单一抗原性决定簇或表位。此与多克隆抗体相反，多克隆抗体通常包括多种以不同抗原决定簇为目标的不同抗体的混合物。用语“单克隆抗体”包含完整及全长单克隆抗体，也包含抗体片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)抗体、包含抗体部分的融合蛋白质、及任何其他包含抗原识别部位(抗原结合部位)的经修饰的免疫球蛋白分子。另外，“单克隆抗体”系指由多种技术包括但不限于杂交瘤产制、噬菌体选择、重组表达及基因转殖动物制备的该等抗体。
本文所使用的用语“人源化抗体”系指非人(例如小鼠)抗体的形式，该形式系包含最少非人序列的特定免疫球蛋白链、嵌合性免疫球蛋白或其片段。通常，人源化抗体系其中CDR的残基经非人物种(例如小鼠、大鼠、兔或仓鼠)的CDR残基置换的人免疫球蛋白，其具有所欲的特异性、亲和性及/或结合能力(Jonesetal.,1986,Nature,321:522-525；Riechmannetal.,1988,Nature,332:323-327；Verhoeyenetal.,1988,Science,239:1534-1536)。在一些情况中，人免疫球蛋白的Fv框架区残基系由具有所欲特异性、亲和性及/或结合能力的非人物种的抗体的对应残基置换。该人源化抗体可进一步藉由替换Fv框架区及/或该经置换的非人残基内的额外残基加以修饰，以精进优化抗体特异性、亲和性及/或结合能力。通常，该人源化抗体将包含实质上所有的至少一个且通常两或三个可变结构域，该可变结构域包含所有或实质上所有的对应该非人免疫球蛋白的CDR，然而所有或实质上所有的框架区系具有人免疫球蛋白共同序列的框架区。该人源化抗体亦可包含至少部分的免疫球蛋白恒定区或恒定结构域(Fc)，通常为人免疫球蛋白的该部分。
如本文所使用的用语“人抗体”系指由人体产制的抗体或具有对应由人体产制的抗体的氨基酸序列的抗体。人抗体可利用任何该领域已知的技术制备。此人抗体的定义特别排除包含非人CDR的人源化抗体。
本文所使用的用语“嵌合抗体”系指其中该免疫球蛋白分子的氨基酸序列系源自二或多个物种的抗体。通常，轻链及重链的可变区皆对应源自一哺乳动物物种(例如小鼠、大鼠、兔等)的具有所欲特异性、亲和性及/或结合能力的抗体的可变区，然而该恒定区对应源自另一物种(通常是人)的抗体中的序列。
本文所使用的用词「亲和性成熟抗体」系指在其一或多个CDR中具有一或多个改变的抗体，该等改变导致该抗体对抗原的亲和性增加，相较于不具有该等改变的母体抗体。该定义亦包括与CDR残基改变一起发生的非CDR残基的改变。较佳的亲和性成熟抗体将具有纳摩尔或甚至皮摩尔程度的对标靶抗原的亲和性。亲和性成熟抗体系藉由该领域已知的方法产制。举例来说，Marksetal.,1992,Bio/Technology10:779-783描述藉由VH及VL结构域替换产生的亲和性成熟。CDR及/或框架残基的随机突变形成系由Barbasetal.,1994,PNAS,91:3809-3813；Schieretal.,1995,Gene,169:147-155；Yeltonetal.,1995,J.Immunol.155:1994-2004；Jacksonetal.,1995,J.Immunol.,154:3310-9；及Hawkinsetal.,1992,J.Mol.Biol.,226:889-896所述。定点突变形成亦可被用来获得亲和性成熟抗体。
用语“表位”及“抗原决定簇”在本文可交换使用，系指可被特定抗体识别且特异性结合的抗原部分。当抗原系多肽时，表位可自连续氨基酸或藉由蛋白质的三级折迭并列的非连续氨基酸形成。自连续氨基酸形成的表位(又称为线性表位)通常在蛋白质变性时仍被保留，然而藉由三级折迭形成的表位(又称为构型表位)通常在蛋白质变性时丧失。表位通常包括至少3个及更常地至少5或8至10个呈独特空间构型的氨基酸。
用语“选择性结合”或“特异性结合”系指结合剂或抗体以更频繁、更快速、更长时间、更高亲和性或上述条件的某些组合与表位、蛋白质或标靶分子反应或结合，相较于可供选择的物质包括非相关或相关蛋白。在某些实施方式中，“特异性结合”系指例如抗体以大约0.1mM或更低，但通常低于大约1μM的KD与蛋白质结合。在某些实施方式中，“特异性结合”系指抗体有时以至少约0.1μM或更低，有时以至少约0.01μM或更低，且有时以至少约1nM或更低的KD与标靶结合。由于不同物种之间的同源性蛋白质具有序列一致性，因此特异性结合可包括识别超过一个物种的蛋白质的抗体(例如人FZD及小鼠FZD)。同样地，由于不同蛋白的多肽序列的某些区域内具有同源性，因此特异性结合可包括识别超过一种蛋白的抗体(或其他多肽或结合剂)。应了解的是，在某些实施方式中，与第一标靶特异性结合的抗体或结合基团可能或可能不与第二标靶特异性结合。因此，“特异性结合”不一定表示(虽然可包括)排他性结合(即与单一标靶结合)。因此，在某些实施方式中，抗体与一种以上的标靶特异性结合。在某些实施方式中，多重标靶可能由抗体上的相同的抗原结合部位结合。举例来说，在某些情况下，抗体可能包含二个完全相同的抗原结合部位，该二个抗原结合部位各自与二或多个蛋白上的相同表位特异性结合。在一些实施方式中，抗体可能为多特异性且包含至少二个具有不同特异性的抗原结合部位。以非限制性实例而言，双特异性抗体可包含识别一蛋白上的表位的一抗原结合部位，另包含识别第二蛋白上的不同表位的第二、不同抗原结合部位。一般来说(但不必然)，所谓的结合系指特异性结合。
本文使用的用语“可溶性受体”系指受体蛋白在该受体的第一跨膜结构域之前的N端胞外片段(或它的部分)，其可以可溶形式自细胞分泌。
本文使用的用语“FZD可溶性受体”或“可溶性FZD受体”系指FZD受体蛋白在该受体的第一跨膜结构域之前的N端胞外片段，其可以可溶形式自细胞分泌。包含整个N端胞外域(ECD)的FZD可溶性受体以及较小片段系由该用语涵盖。因此，包含Fri结构域的FZD可溶性受体亦包括于此用语中。
用语“多肽”和“肽”以及“蛋白”在本文可交换使用，这些用语系指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可为线性或分支，其可能包含经修饰的氨基酸，且其可能被非氨基酸中断。该等用语亦包含经天然或人为干预修饰的氨基酸聚合物；例如双硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，诸如与标记成份缀合。该定义亦包括例如包含一或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸)的多肽，以及包含该领域已知的其他修饰的多肽。应了解的是，由于本发明的多肽可能以抗体为主，因此在某些实施方式中，该多肽可能为单链或相连的链(例如二聚体)。
用语“多核苷酸”及“核酸”在本文可交换使用，系指任何长度的核苷酸的聚合物，包括DNA及RNA。该核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基及/或其类似物，或任何可藉由DNA或RNA聚合酶被纳入聚合物中的底物。
在提及二或多个核酸或多肽时，用语“一致”或百分比“一致性”系指当二或多个序列或子序列经比较及比对(需要时导入间格)以达最高对应性且不把任何保守性氨基酸置换当作序列一致性的部分时，该二或多个序列或子序列系相同或具有相同的特定百分比的核苷酸或氨基酸残基。该百分比一致性可利用序列比较软件或算法测量，或藉由目视检查测量。多种可被用于取得氨基酸或核苷酸序列比对的算法及软件系该领域所广为周知。该等算法及软件包括但不限于BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCGWisconsin软件包及其变化性产品。在一些实施方式中，本发明的二个核酸或多肽系实质上一致，表示当彼等经比较或比对以达最高对应性时，利用序列比较算法或目视检查得知彼等具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％且在一些实施方式中至少95％、96％、97％、98％、99％的核苷酸或氨基酸残基一致性。在一些实施方式中，一致性存在于至少约10、至少约20、至少约40至60残基、至少约60至80残基长度或介于之间的任何整数长度的序列区域。在一些实施方式中，一致性存在于60至80残基以上的更长区域，诸如至少约80至100残基，且在一些实施方式中该等序列系与经比较的全长序列诸如核苷酸序列的编码区域实质上一致。
“保守性氨基酸置换”系指其中一个氨基酸残基被另一个具有类似侧链的氨基酸残基替代的置换。具有类似侧链的氨基酸残基群系于该领域中定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。举例来说，以苯丙氨酸替代酪氨酸系保守性置换。较佳地，本发明的多肽及抗体的序列中的保守性置换不废除含有该氨基酸序列的多肽或抗体与该多肽或抗体原本所结合的抗原(即该一或多种RSPO蛋白)的结合。识别不消除抗原结合性的核苷酸及氨基酸保守性置换的方法系该领域所广为周知。
本文所使用的用语“载体”系指建构物，该建构物能在宿主细胞中递送及通常表达一或多种感兴趣的基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒性载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体、与阳离子缩合剂有关的DNA或RNA表达载体，及包封于脂质体中的DNA或RNA表达载体。
经“分离”的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物系呈现未见于天然中的形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。经分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括该些经纯化至一定程度而使彼等不再以见于天然中的形式存在者。在一些实施方式中，经纯化的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物系实质上纯的。
本文所使用的用语“实质上纯的”系指其为至少50％纯的(即不含污染物)、至少90％纯的、至少95％纯的、至少98％纯的或至少99％纯的物质。
本文所使用的用语“癌”及“癌性”系指称或描述哺乳动物的生理状况，其中细胞群具有未受调节的细胞生长的特征。癌的实例包括但不限于癌(carcinoma)、胚细胞瘤、肉瘤及血液性癌诸如淋巴瘤及白血病。
本文所使用的用语“肿瘤”及“瘤(neoplasm)”系指任何由过度细胞生长或增殖所导致的组织团块，不论是良性(非癌性)或包括癌前性病灶的恶性(癌性)。
本文所使用的用语“转移”系指癌藉以自原发部位扩散或转移至身体其他区域且在新位置发展类似癌性病灶的过程。“转移”或“转移性”细胞系指与邻近细胞丧失黏着接触且(例如经由血流或淋巴)自疾病的原发部位移动以入侵邻近身体结构的细胞。
用语“癌干细胞”、“CSC”、“肿瘤干细胞”及“肿瘤起始细胞”在本文可交换使用，系指源自癌或肿瘤且具有下列特性的细胞：(1)具有广泛增殖能力，(2)能进行不对称细胞分裂以产生一或多种类型的经分化的细胞后代，其中该经分化的细胞具有减少的增殖或发育能力，及(3)能进行对称细胞分裂以自我更新或自我维持。这些特性授予癌干细胞在连续移植至免疫不全宿主(例如小鼠)时能形成或建立肿瘤或癌的能力，大部分肿瘤细胞无法形成肿瘤。癌干细胞以混乱方式进行自我更新及分化，以形成具有异常细胞类型的肿瘤，该细胞类型可在将来突变发生时改变。
用语“癌细胞”及“肿瘤细胞”系指源自癌或肿瘤或癌前病灶的整体细胞族群，包括非肿瘤发生性细胞(其包含大部分的肿瘤细胞族群)及肿瘤发生性干细胞(癌干细胞)。本文使用的用语“癌细胞”或“肿瘤细胞”当仅用于指称该些缺乏更新及分化能力的细胞时，将由用语“非肿瘤发生性”修饰以区别该些肿瘤细胞与癌干细胞。
本文所使用的用语“肿瘤发生性”系指癌干细胞的功能特性，包括自我更新(导致额外的肿瘤发生性癌干细胞)及增殖以产生所有其他肿瘤细胞(导致经分化及因此非肿瘤发生性肿瘤细胞)的特性。
本文所使用的用语“肿瘤发生性”系指源自肿瘤的随机细胞样本在连续移植至免疫不全宿主(例如小鼠)时形成明显肿瘤的能力。此定义亦包括当连续移植至免疫不全宿主(例如小鼠)时形成明显肿瘤的经富集及/或经分离的癌干细胞族群。
用语“受试者”系指任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长动物、犬、猫、啮齿动物及该类似动物，该动物将成为特定治疗的接受者。通常，关于人受试者的用语“受试者”及“病患”在本文可交换使用。
用语“医药上可接受”系指经美国联邦政府的管理机关或州政府核准(或可核准)或经明列于美国药典或其他普遍公认的药典中以用于动物(包括人)的产品或化合物。
用语“医药上可接受的赋形剂、载剂或佐剂”或“可接受的医药载剂”系指可与本发明的至少一种结合剂(例如抗体)一起投予至受试者的赋形剂、载剂或佐剂，且该赋形剂、载剂或佐剂不破坏该结合剂的活性。该赋形剂、载剂或佐剂当与足以达到治疗效应的剂量的结合剂一起投予时应不具毒性。
用语“有效量”或“治疗有效量”或“治疗效应”系指有效“治疗”受试者或哺乳动物的疾病或疾患的结合剂、抗体、多肽、多核苷酸、小型有机分子或其他药物的量。以癌为例，药物(例如抗体)的治疗有效量具有治疗效应且因此可减少癌细胞的数量；降低肿瘤发生性、肿瘤发生频率、或肿瘤发生能力；减少癌干细胞的数量或频率；减少肿瘤大小；减少癌细胞群；抑制及/或停止癌细胞浸润至外围器官包括例如癌扩散至软组织及骨；抑制及/或停止肿瘤或癌细胞转移；抑制及/或停止肿瘤或癌细胞生长；缓解一或多种与癌相关的症状的严重程度；减少发病率及死亡率；促进生活质量；或该等效应的组合。以该剂举例来说抗体预防现存癌细胞生长及/或杀死现存癌细胞的方面而言，其可被称为细胞静止性及/或细胞毒性。
用语“治疗”或“缓和”系指1)治疗性措施，该措施治愈、减缓、减轻经诊断的病理状况或疾患的症状及/或停止该经诊断的病理状况或疾患的进展及2)预防性或防范性措施，该措施预防或减缓标靶病理状况或疾患的发展。因此该些需要治疗者包括该些已罹患该疾患者、该些易于罹患该疾患者，以及该些欲预防该疾患者。在一些实施方式中，受试者系经本发明的方法成功“治疗”，若该病患显示下列一或多项：癌细胞的数量减少或完全消失；肿瘤大小减少；抑制或缺乏癌细胞浸润至外围器官包括癌细胞扩散至软组织及骨；抑制或缺乏肿瘤或癌细胞转移；抑制或缺乏癌生长；缓解一或多种与该特定癌相关的症状；减少发病率及死亡率；改善生活质量；减少肿瘤发生性；减少癌干细胞的数量或频率；或一些效应的组合。
如本揭示内容及权利要求书中所使用者，单数形式的“一”(a,an)及“该”(the)包含复数形式除非上下文另外清楚地说明。
应了解的是，只要本文的实施方式系以用语“包含”描述，其亦提供其他以“由...组成”及/或“实质上由...组成”的用语所描述的类似实施方式。也应了解的是，只要本文的实施方式系以用语“实质上由...组成”描述，其亦提供其他以“由...组成”的用语所描述的类似实施方式。
如本文所使用，提及“约”或“大约”某数值或参数时，其包括(且描述)与该数值或参数相关的实施方式。举例来说，“约X”的叙述包括“X”的叙述。
当使用于本文诸如“A及/或B”的词组中，用语“及/或”系意图包括A及B两者、A或B、A(单独)及B(单独)。同样地，使用于词组诸如“A、B及/或C”中的用语“及/或”系意图包含下列实施方式中的各者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A(单独)；B(单独)；及C(单独)。
II.Wnt途径抑制剂
本发明提供用于抑制肿瘤生长的方法及/或用于治疗癌症的方法中的Wnt途径抑制剂。
在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系与一或多种人卷曲蛋白(FZD)结合的剂。该等剂在本文中被称为“FZD结合剂”。在一些实施方式中，该FZD结合剂与一、二、三、四、五、六、七、八、九、或十种FZD蛋白特异性结合。在一些实施方式中，该FZD结合剂与一或多种选自下列的FZD蛋白结合：FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、及FZD10。在一些实施方式中，FZD结合剂与一或多种FZD蛋白结合，该一或多种FZD蛋白包含FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、及/或FZD8。在某些实施方式中，FZD结合剂与FZD7结合。在某些实施方式中，FZD结合剂与FZD5及/或FZD8结合。在某些实施方式中，该FZD结合剂与FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、及FZD8特异性结合。FZD结合剂的非限制性实例可见于美国专利第7,982,013号。
在某些实施方式中，该FZD结合剂系FZD拮抗剂。在某些实施方式中，该FZD结合剂系Wnt途径拮抗剂。在某些实施方式中，该FZD结合剂抑制Wnt信号传导。在一些实施方式中，该FZD结合剂抑制典型Wnt信号传导。
在一些实施方式中，该FZD结合剂系抗体。在一些实施方式中，该FZD结合剂系多肽。在某些实施方式中，该FZD结合剂系包含抗原结合部位的抗体或多肽。在某些实施方式中，本文所述的FZD结合抗体或多肽的抗原结合部位能与一、二、三、四、五、或更多种人FZD蛋白结合。在某些实施方式中，该FZD结合抗体或多肽的抗原结合部位能与选自FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9及FZD10的一、二、三、四、或五种人FZD蛋白特异性结合。在一些实施方式中，当该FZD结合剂系与超过一种FZD蛋白结合的抗体时，其可能被称为“泛FZD抗体”。
在某些实施方式中，该FZD结合剂(例如抗体)与其所结合的一或多种人FZD蛋白内的胞外域(ECD)特异性结合。在某些实施方式中，该FZD结合剂在其所结合的人FZD蛋白的Fri结构域(亦称为多半胱氨酸区(CRD))内特异性结合。各种人FZD蛋白的Fri结构域的序列系该领域已知，且提供于本文为SEQIDNO:13(FZD1)、SEQIDNO:14(FZD2)、SEQIDNO:15(FZD3)、SEQIDNO:16(FZD4)、SEQIDNO:17(FZD5)、SEQIDNO:18(FZD6)、SEQIDNO:19(FZD7)、SEQIDNO:20(FZD)、SEQIDNO:21(FZD9)、及SEQIDNO:22(FZD10)。
在某些实施方式中，该FZD结合剂与一、二、三、四、五、或多种FZD蛋白结合。在一些实施方式中，该FZD结合剂与选自FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、及FZD8中的一、二、三、四、或五种FZD蛋白特异性结合。在一些实施方式中，该FZD结合剂与至少FZD5及FZD8特异性结合。
在一些实施方式中，该FZD结合剂以大约1μM或更低、大约100nM或更低、大约40nM或更低、大约20nM或更低、大约10nM或更低、大约1nM或更低、或大约0.1nM或更低的解离常数(KD)与至少一种人FZD蛋白结合。在一些实施方式中，FZD结合剂以大约10nM或更低的KD与至少一种FZD蛋白结合。在一些实施方式中，FZD结合剂以大约1nM或更低的KD与至少一种FZD蛋白结合。在一些实施方式中，FZD结合剂以大约0.1nM或更低的KD与至少一种FZD蛋白结合。在某些实施方式中，FZD结合剂以约40nM或更低的KD与一或多种(例如1、2、3、4、或5种)FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、及FZD8的各者结合。在某些实施方式中，该FZD结合剂以约10nM或更低的KD与一或多种FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、及FZD8的各者结合。在某些实施方式中，该FZD结合剂以约10nM的KD与FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、及FZD8的各者结合。在一些实施方式中，该结合剂(例如抗体)与FZD蛋白的KD系利用固定于Biacore芯片上的FZD-Fc融合蛋白测得的KD，该FZD-Fc融合蛋白包含至少部分的FZD胞外域或FZD-Fri结构域。
在某些实施方式中，该FZD结合剂以约1μM或更低、约100nM或更低、约40nM或更低、约20nM或更低、约10nM或更低、或约1nM或更低的EC50与一或多种(例如二或多种、三或多种、或四或多种)人FZD蛋白结合。在某些实施方式中，FZD结合剂以约40nM或更低、约20nM或更低、或约10nM或更低的EC50与超过一种FZD蛋白结合。在某些实施方式中，该FZD结合剂对下列一或多种(例如1、2、3、4、或5种)FZD蛋白具有约20nM或更低的EC50：FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、及FZD8。在某些实施方式中，该FZD结合剂对下列一或多种(例如1、2、3、4、或5种)FZD蛋白具有约10nM或更低的EC50：FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、及FZD8。在某些实施方式中，该FZD结合剂在与FZD5及/或FZD8结合方面具有约40nM或更低或20nM或更低的EC50。
在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系FZD结合剂，且该FZD结合剂系抗体。在一些实施方式中，该抗体系重组抗体。在一些实施方式中，该抗体系单克隆抗体。在一些实施方式中，该抗体系嵌合抗体。在一些实施方式中，该抗体系人源化抗体。在一些实施方式中，该抗体系人抗体。在某些实施方式中，该抗体系IgG1抗体。在某些实施方式中，该抗体系IgG2抗体。在某些实施方式中，该抗体系包含抗原结合部位的抗体片段。在一些实施方式中，该抗体系单价、单特异性、或双价。在一些实施方式中，该抗体系双特异性抗体或多特异性抗体。在一些实施方式中，该抗体系与细胞毒性部分缀合。在一些实施方式中，该抗体系经分离。在一些实施方式中，该抗体系实质上纯的。
本发明的FZD结合剂(例如抗体)的特异性结合可使用该领域已知的任何方法检测。可使用的免疫检测包括但不限于竞争性及非竞争性检测系统，该等系统利用诸如Biacore分析、FACS分析、免疫荧光、免疫细胞化学、Western印迹分析、放射性免疫测定、ELISA、“三明治式”免疫测定、免疫沉淀分析、沉淀反应、胶体扩散沉淀反应、免疫扩散分析、凝集测定、补体固定测定、免疫放射分析、荧光免疫分析及蛋白质A免疫分析的技术。该等检测系例行性检测且为该领域中广为周知(见例如Ausubeletal.,Editors,1994-present,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,NY)。
举例来说，抗体与人FZD蛋白的特异性结合可利用ELISA测定。ELISA测定包含准备抗原，以抗原包覆96孔微量板的孔槽，添加与可检测的化合物诸如酶底物(例如辣根过氧化酶或碱性磷酸酶)缀合的FZD结合剂(例如抗体)至孔槽，培养一段时间后，检测与该抗原结合的FZD结合剂的存在。在一些实施方式中，该FZD结合抗体或剂不与可检测的化合物缀合，而是将识别该FZD结合抗体或剂或抗体的第二缀合抗体(例如抗Fc抗体)加入孔槽中。在一些实施方式中，不以抗原包覆孔槽，反而是以FZD结合抗体或剂包覆孔槽，并于添加抗原至该经包覆的孔槽后加入与可检测的化合物缀合的第二抗体。该领域技术人员将知道可经修改以增加及/或优化检测信号的参数以及可使用的ELISA的其他变量。
在另一实例中，抗体与人FZD蛋白的特异性结合可利用FACS测定。FACS筛选测定可包含产制cDNA建构物以表达抗原为融合蛋白，将该建构物转染至细胞中，使该抗原表达在细胞表面，使该FZD结合抗体或其他FZD结合剂与该经转染的细胞混合，并培养一段时间。被FZD结合抗体或其他FZD结合剂结合的细胞，可利用与可检测的化合物缀合的二级抗体(例如PE缀合抗Fc抗体)及流式细胞分析识别。该领域技术人员将知道可经修改以优化经检测的信号的参数以及其他可增进筛选(例如筛选阻断抗体)的FACS变数。
抗体或其他结合剂与抗原(例如FZD蛋白)的结合亲和性，及抗体-抗原交互反应的解离速率，可藉由竞争性结合测定决定。竞争性结合测定的一实例系放射性免疫测定，其包含在渐增量的未经标记的抗原存在下，培养经标记的抗原(例如3H或125I)或其片段或变异体与感兴趣的抗体，之后检测与该经标记的抗原结合的抗体。该抗体对抗原(例如FZD蛋白)的亲和性及结合解离速率可由斯卡查德(Scatchard)图分析的数据决定。在一些实施方式中，Biacore动力学分析系用于测定与抗原(例如FZD蛋白)结合的抗体或剂的结合及解离速率。Biacore动力学分析包含分析抗体与芯片表面上经固定的抗原(例如FZD蛋白)的结合及解离。
在某些实施方式中，本发明提供Wnt途径抑制剂，其系包含重链CDR1、重链CDR2、及重链CDR3的FZD结合剂(例如抗体)，该重链CDR1包含GFTFSHYTLS(SEQIDNO:1)，该重链CDR2包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQIDNO:2)，且该重链CDR3包含NFIKYVFAN(SEQIDNO:3)。在一些实施方式中，该FZD结合剂另包含轻链CDR1、轻链CDR2、及轻链CDR3，该轻链CDR1包含SGDNIGSFYVH(SEQIDNO:4)，该轻链CDR2包含DKSNRPSG(SEQIDNO:5)，且该轻链CDR3包含QSYANTLSL(SEQIDNO:6)。在一些实施方式中，该FZD结合剂包含：包含SGDNIGSFYVH(SEQIDNO:4)的轻链CDR1、包含DKSNRPSG(SEQIDNO:5)的轻链CDR2、及包含QSYANTLSL(SEQIDNO:6)的轻链CDR3。在某些实施方式中，该FZD结合剂包含：(a)包含GFTFSHYTLS(SEQIDNO:1)的重链CDR1、包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQIDNO:2)的重链CDR2、及包含NFIKYVFAN(SEQIDNO:3)的重链CDR3，及(b)包含SGDNIGSFYVH(SEQIDNO:4)的轻链CDR1、包含DKSNRPSG(SEQIDNO:5)的轻链CDR2、及包含QSYANTLSL(SEQIDNO:6)的轻链CDR3。
在某些实施方式中，本发明提供包含下列的FZD结合剂(例如抗体)：(a)包含GFTFSHYTLS(SEQIDNO:1)的重链CDR1，或其包含1、2、3、或4个氨基酸置换的变异体；(b)包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQIDNO:2)的重链CDR2，或其包含1、2、3、或4个氨基酸置换的变异体；(c)包含NFIKYVFAN(SEQIDNO:3)的重链CDR3，或其包含1、2、3、或4个氨基酸置换的变异体；(d)包含SGDNIGSFYVH(SEQIDNO:4)的轻链CDR1，或其包含1、2、3、或4个氨基酸置换的变异体；(e)包含DKSNRPSG(SEQIDNO:5)的轻链CDR2，或其包含1、2、3、或4个氨基酸置换的变异体；及(f)包含QSYANTLSL(SEQIDNO:6)的轻链CDR3，或其包含1、2、3、或4个氨基酸置换的变异体。在某些实施方式中，该氨基酸置换系保守性置换。
在某些实施方式中，本发明提供包含重链可变区及/或轻链可变区的FZD结合剂(例如抗体)，该重链可变区与SEQIDNO:7具有至少约80％序列一致性，该轻链可变区与SEQIDNO:8具有至少80％序列一致性。在某些实施方式中，该FZD结合剂包含与SEQIDNO:7具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、或至少约99％序列一致性的重链可变区。在某些实施方式中，该FZD结合剂包含与SEQIDNO:8具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、或至少约99％序列一致性的轻链可变区。在某些实施方式中，该FZD结合剂包含与SEQIDNO:7具有至少约95％序列一致性的重链可变区，及/或与SEQIDNO:8具有至少约95％序列一致性的轻链可变区。在某些实施方式中，该FZD结合剂包含：包含SEQIDNO:7的重链可变区，及/或包含SEQIDNO:8的轻链可变区。在某些实施方式中，该FZD结合剂包含：包含SEQIDNO:7的重链可变区及包含SEQIDNO:8的轻链可变区。在某些实施方式中，该FZD结合剂包含：实质上由SEQIDNO:7组成的重链可变区及实质上由SEQIDNO:8组成的轻链可变区。
在某些实施方式中，本发明提供包含下列的FZD结合剂(例如抗体)：(a)与SEQIDNO:9(有或无信号序列)或SEQIDNO:11具有至少90％序列一致性的重链；及/或(b)与SEQIDNO:10(有或无信号序列)或SEQIDNO:12具有至少90％序列一致性的轻链。在一些实施方式中，该FZD结合剂包含：(a)与SEQIDNO:9(有或无信号序列)或SEQIDNO:11具有至少95％序列一致性的重链；及/或(b)与SEQIDNO:10(有或无信号序列)或SEQIDNO:12具有至少95％序列一致性的轻链。在一些实施方式中，该FZD结合剂包含：包含SEQIDNO:9(有或无信号序列)或SEQIDNO:11的重链，及/或包含SEQIDNO:10(有或无信号序列)或SEQIDNO:12的轻链。在一些实施方式中，该FZD结合剂包含：包含SEQIDNO:11的重链及包含SEQIDNO:12的轻链。在一些实施方式中，该FZD结合剂包含：实质上由SEQIDNO:9的氨基酸20至463所组成的重链及实质上由SEQIDNO:10的氨基酸20至232所组成的轻链。在一些实施方式中，该FZD结合剂包含：实质上由SEQIDNO:11组成的重链及实质上由SEQIDNO:12组成的轻链。
在某些实施方式中，本发明提供Wnt途径抑制剂，其系与FZD1、FZD2、FZD5、FZD7及/或FZD8中的至少一者特异性结合的FZD结合剂(例如抗体)，其中该FZD结合剂(例如抗体)包含抗体OMP-18R5的一、二、三、四、五、及/或六个CDR。抗体OMP-18R5(亦称为18R5及凡地吐单抗(vantictumab))，以及其他FZD结合剂，已于美国专利第7,982,013号中先行描述。编码该OMP-18R5IgG2抗体的重链及轻链的DNA，依照布达佩斯条约的规定，于2008年9月29日以ATCC编号PTA-9541保藏于美国菌种保存中心。在一些实施方式中，该FZD结合剂包含OMP-18R5的1或多个CDR、OMP-18R5的2或多个CDR、OMP-18R5的3或多个CDR、OMP-18R5的4或多个CDR、OMP-18R5的5或多个CDR、或OMP-18R5的所有6个CDR。
本发明提供其系Wnt途径抑制剂的多肽。该等多肽包括但不限于与人FZD蛋白特异性结合的抗体。在一些实施方式中，多肽与一或多种选自下列的FZD蛋白结合：FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、及FZD10。在一些实施方式中，多肽与FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、及/或FZD8结合。在一些实施方式中，多肽与FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、及FZD8结合。
在某些实施方式中，多肽包含抗体OMP-18R5的一、二、三、四、五、及/或六个CDR。在一些实施方式中，多肽包含其中每个CDR有最多有四个(即0、1、2、3、或4个)氨基酸置换的CDR。在某些实施方式中，该重链CDR被包含于重链可变区之内。在某些实施方式中，该轻链CDR被包含于轻链可变区之内。
在一些实施方式中，本发明提供与一或多种人FZD蛋白特异性结合的多肽，其中该多肽包含与SEQIDNO:7具有至少约80％序列一致性的氨基酸序列，及/或与SEQIDNO:8具有至少约80％序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含与SEQIDNO:7具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含与SEQIDNO:8具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含与SEQIDNO:7具有至少约95％序列一致性的氨基酸序列，及/或与SEQIDNO:8具有至少约95％序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQIDNO:7的氨基酸序列，及/或包含SEQIDNO:8的氨基酸序列。
在一些实施方式中，FZD结合剂包含多肽，该多肽包含选自下列的序列：SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、及SEQIDNO:12。
在某些实施方式中，FZD结合剂包含OMP-18R5抗体的重链可变区及轻链可变区。在某些实施方式中，FZD结合剂包含(有或无前导序列的)OMP-18R5抗体的重链及轻链。
在某些实施方式中，FZD结合剂包含抗体OMP-18R5、实质上由抗体OMP-18R5组成、或由抗体OMP-18R5组成。
在某些实施方式中，FZD结合剂(例如抗体)与包含下列的抗体竞争与一或多种人FZD蛋白的特异性结合：包含SEQIDNO:7的重链可变区及包含SEQIDNO:8的轻链可变区。在某些实施方式中，FZD结合剂(例如抗体)与包含下列的抗体竞争与一或多种人FZD蛋白的特异性结合：包含SEQIDNO:9(有或无信号序列)的重链及包含SEQIDNO:10(有或无信号序列)的轻链。在某些实施方式中，FZD结合剂(例如抗体)与包含下列的抗体竞争与一或多种人FZD蛋白的特异性结合：包含SEQIDNO:11的重链及包含SEQIDNO:12的轻链。在某些实施方式中，FZD结合剂(例如抗体)与包含下列的抗体竞争与一或多种人FZD蛋白的特异性结合：由保藏于ATCC的编号PTA-9541的质粒所编码的重链可变区及轻链可变区。在某些实施方式中，FZD结合剂与抗体OMP-18R5竞争与一或多种人FZD蛋白的特异性结合。在一些实施方式中，FZD结合剂或抗体于活体外(invitro)竞争性结合测定中竞争与一或多种人FZD蛋白的特异性结合。
在某些实施方式中，FZD结合剂(例如抗体)与一或多种人FZD蛋白上由本发明的抗体所结合的相同表位或实质上相同的表位结合。在另一实施方式中，FZD结合剂系与一或多种人FZD蛋白上的表位结合的抗体，该表位与由本发明的抗体所结合的FZD蛋白上的表位重迭。在某些实施方式中，FZD结合剂(例如抗体)与一或多种FZD蛋白上由抗体OMP-18R5所结合的相同表位或实质上相同的表位结合。在另一实施方式中，该FZD结合剂系与一或多种人FZD蛋白上的表位结合的抗体，该表位与由抗体OMP-18R5所结合的FZD蛋白上的表位重迭。
在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系与一或多种人Wnt蛋白结合的剂。该等剂在本文被称为“Wnt结合剂”。在某些实施方式中，该等剂与一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、或更多种Wnt蛋白特异性结合。在一些实施方式中，该Wnt结合剂与一或多种选自下列的人Wnt蛋白结合：Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、及Wnt16。在某些实施方式中，Wnt结合剂与一或多种(或二或更多种、三或更多种、四或更多种、五或更多种、等)选自下列的Wnt蛋白结合：Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、及Wnt10b。在某些实施方式中，该一或多种(或二或更多种、三或更多种、四或更多种、五或更多种、等)Wnt蛋白系选自下列：Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、及Wnt10b。
在某些实施方式中，该Wnt结合剂系Wnt拮抗剂。在某些实施方式中，该Wnt结合剂系Wnt途径拮抗剂。在某些实施方式中，该Wnt结合剂抑制Wnt信号传导。在一些实施方式中，该Wnt结合剂抑制典型Wnt信号传导。
在一些实施方式中，该Wnt结合剂系抗体。在一些实施方式中，该Wnt结合剂系多肽。在某些实施方式中，该Wnt结合剂系包含抗原结合部位的抗体或多肽。在某些实施方式中，本文所述的Wnt结合抗体或多肽的抗原结合部位能与一、二、三、四、五、或更多种人Wnt蛋白结合。在某些实施方式中，该Wnt结合抗体或多肽的抗原结合部位能与一、二、三、四、或五种选自Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、及Wnt10b的人Wnt蛋白特异性结合。Wnt结合剂的非限制性实例可见于国际公开号WO2011/088127。
在某些实施方式中，Wnt结合剂与一或多种人Wnt蛋白的C端多半胱氨酸区结合。在某些实施方式中，该Wnt结合剂与位于该剂或抗体所结合的一或多种Wnt蛋白内的结构域结合，该一或多种Wnt蛋白系选自下列：SEQIDNO:46(Wnt1)、SEQIDNO:47(Wnt2)、SEQIDNO:48(Wnt2b)、SEQIDNO:49(Wnt3)、SEQIDNO:50(Wnt3a)、SEQIDNO:51(Wnt7a)、SEQIDNO:52(Wnt7b)、SEQIDNO:53(Wnt8a)、SEQIDNO:54(Wnt8b)、SEQIDNO:55(Wnt10a)、及SEQIDNO:56(Wnt10b)。
在某些实施方式中，该Wnt结合剂以约1μM或更低、约100nM或更低、约40nM或更低、约20nM或更低、或约10nM或更低的KD与一或多种(例如二或多种、三或多种、或四或多种)Wnt蛋白结合。举例来说，在某些实施方式中，本文所述的与超过一种Wnt蛋白结合的Wnt结合剂，以约100nM或更低、约20nM或更低、或约10nM或更低的KD与该些Wnt蛋白结合。在某些实施方式中，该Wnt结合剂以约40nM或更低的KD与一或多种(例如1、2、3、4、或5种)Wnt蛋白中的各者结合，其中该等Wnt蛋白系选自下列：Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a及Wnt10b。在一些实施方式中，该结合剂(例如抗体)与Wnt蛋白的KD系利用固定于Biacore芯片上的包含至少部分的WntC端多半胱氨酸区的Wnt融合蛋白测得的KD。
在某些实施方式中，该Wnt结合剂以约1μM或更低、约100nM或更低、约40nM或更低、约20nM或更低、约10nM或更低、或约1nM或更低的EC50与一或多种(例如二或多种、三或多种、或四或多种)人Wnt蛋白结合。在某些实施方式中，Wnt结合剂以约40nM或更低、约20nM或更低、或约10nM或更低的EC50与超过一种Wnt结合。在某些实施方式中，该Wnt结合剂相对于一或多种(例如1、2、3、4、或5种)Wnt蛋白Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、及/或Wnt16具有约20nM或更低的EC50。在某些实施方式中，该Wnt结合剂相对于一或多种(例如1、2、3、4、或5种)下列Wnt蛋白具有约10nM或更低的EC50：Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、及/或Wnt10b。
在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系Wnt结合剂，且该Wnt结合剂系抗体。在一些实施方式中，该抗体系重组抗体。在一些实施方式中，该抗体系单克隆抗体。在一些实施方式中，该抗体系嵌合抗体。在一些实施方式中，该抗体系人源化抗体。在一些实施方式中，该抗体系人抗体。在某些实施方式中，该抗体系IgG1抗体。在某些实施方式中，该抗体系IgG2抗体。在某些实施方式中，该抗体系包含抗原结合部位的抗体片段。在一些实施方式中，该抗体系单价、单特异性、或双价。在一些实施方式中，该抗体系双特异性抗体或多特异性抗体。在一些实施方式中，该抗体系与细胞毒性部分缀合。在一些实施方式中，该抗体系经分离。在一些实施方式中，该抗体系实质上纯的。
本发明的Wnt结合剂(例如抗体)的特异性结合可使用如本文所述的用于FZD结合剂的该领域已知的任何方法检测。
举例来说，抗体与人Wnt蛋白的特异性结合可利用ELISA测定。ELISA测定包含准备抗原，以抗原包覆96孔微量板的孔槽，添加与可检测的化合物诸如酶底物(例如辣根过氧化酶或碱性磷酸酶)缀合的Wnt结合剂(例如抗体)至孔槽，培养一段时间后，检测与该抗原结合的Wnt结合剂的存在。在一些实施方式中，该Wnt结合抗体或剂不与可检测的化合物缀合，而是将识别该Wnt结合抗体或剂或抗体的第二缀合抗体(例如抗Fc抗体)加入孔槽中。在一些实施方式中，不以抗原包覆孔槽，反而是以Wnt结合抗体或剂包覆孔槽，并于添加抗原至该经包覆的孔槽后加入与可检测的化合物缀合的第二抗体。该领域技术人员将知道可经修改以增加及/或优化检测信号的参数以及可使用的ELISA的其他变量。
在另一实例中，抗体与人Wnt蛋白的特异性结合可利用FACS测定。FACS筛选测定可包含产制cDNA建构物以表达抗原为融合蛋白质，将该建构物转染至细胞中，使该抗原表达在细胞表面，使该Wnt结合抗体与该经转染的细胞混合，并培养一段时间。被Wnt结合抗体结合的细胞可利用与可检测的化合物缀合的二级抗体(例如与PE缀合的抗Fc抗体)及流式细胞分析识别。该领域技术人员将了解可经修改以优化经检测的信号的参数以及其他可增进筛选(例如筛选阻断抗体)的FACS变数。
Wnt结合剂与抗原(例如Wnt蛋白)的结合亲和性，及抗体-抗原交互反应的解离速率，可藉由竞争性结合测定决定，诸如上述用于FZD结合剂者。
在某些实施方式中，该Wnt结合剂系可溶性受体。在某些实施方式中，该Wnt结合剂包含FZD受体蛋白的胞外域。在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含FZD蛋白的Fri结构域。在一些实施方式中，包含FZDFri结构域的可溶性受体相较于包含该完整FZDECD的可溶性受体可显示改变的生物活性(例如增加蛋白半衰期)。蛋白半衰期可进一步藉由聚乙二醇(PEG)或聚氧乙烯(PEO)的共价修饰延长。在某些实施方式中，该FZD蛋白系人FZD蛋白。在某些实施方式中，该人FZD蛋白系FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9或FZD10。可溶性FZD受体的非限制性实例可见于美国专利第7,723,477及7,947,277号及美国专利公开号2011/0305695中。
人FZD1至10蛋白中各者的预测Fri结构域系提供为SEQIDNO:13至22。人FZD1至10蛋白中各者的预测最小Fri结构域系提供为SEQIDNO:23至32。该领域的技艺人士对于对应各种Fri结构域的确切氨基酸的了解可能互异。因此，上述及本文所述的结构域的N端及/或C端可延长或缩短1、2、3、4、5、6、7、8、9、或甚至10个氨基酸。
在某些实施方式中，该Wnt结合剂包含与一或多种人Wnt蛋白结合的人FZD蛋白的Fri结构域，或该Fri结构域的片段或变异体。在某些实施方式中，该人FZD蛋白系FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、或FZD10。在某些实施方式中，该人FZD蛋白系FZD4。在某些实施方式中，该人FZD蛋白系FZD5。在某些实施方式中，该人FZD蛋白系FZD8。在某些实施方式中，该人FZD蛋白系FZD10。在某些实施方式中，该FZD蛋白系FZD4且该Wnt结合剂包含SEQIDNO:16。在某些实施方式中，该FZD蛋白系FZD5且该Wnt结合剂包含SEQIDNO:17。在某些实施方式中，该FZD蛋白系FZD7且该Wnt结合剂包含SEQIDNO:19。在某些实施方式中，该FZD蛋白系FZD8且该Wnt结合剂包含SEQIDNO:20。在某些实施方式中，该FZD蛋白系FZD10且该Wnt结合剂包含SEQIDNO:22。在某些实施方式中，该FZD蛋白系FZD8且该Wnt结合剂包含SEQIDNO:33。
在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含Fri结构域，该Fri结构域包含FZD1(SEQIDNO:23)的最小Fri结构域、FZD2(SEQIDNO:24)的最小Fri结构域、FZD3(SEQIDNO:25)的最小Fri结构域、FZD4(SEQIDNO:26)的最小Fri结构域、FZD5(SEQIDNO:27)的最小Fri结构域、FZD6(SEQIDNO:28)的最小Fri结构域、FZD7(SEQIDNO:29)的最小Fri结构域、FZD8(SEQIDNO:30)的最小Fri结构域、FZD9(SEQIDNO:31)的最小Fri结构域、或FZD10(SEQIDNO:32)的最小Fri结构域。在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含Fri结构域，该Fri结构域包含FZD8(SEQIDNO:30)的最小Fri结构域。
在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含Fri结构域，该Fri结构域实质上由FZD1的Fri结构域、FZD2的Fri结构域、FZD3的Fri结构域、FZD4的Fri结构域、FZD5的Fri结构域、FZD6的Fri结构域、FZD7的Fri结构域、FZD8的Fri结构域、FZD9的Fri结构域、或FZD10的Fri结构域组成。在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含实质上由FZD8的Fri结构域组成的Fri结构域。
在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含选自下列的序列：SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、及SEQIDNO:33。在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含实质上由SEQIDNO:20组成的Fri结构域。在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含实质上由SEQIDNO:33组成的Fri结构域。
在某些实施方式中，该Wnt结合剂包含前述FZDFri结构域序列的任一者的变异体，其包含一或多个(例如一、二、三、四、五、六、七、八、九、十个、等)保守性置换且能与Wnt蛋白结合。
在某些实施方式中，Wnt结合剂(例如包含人FZD受体的Fri结构域的剂)另包含非FZD多肽。在一些实施方式中，FZD可溶性受体可包括与其他非FZD功能性及结构性多肽连接的FZDECD或Fri结构域，该等非FZD功能性及结构性多肽包括但不限于人Fc区、蛋白标签(例如myc、FLAG、GST)、其他内源性蛋白或蛋白片段，或任何其他可用的蛋白序列包括在FZDECD或Fri结构域与第二多肽之间的任何连接子区。在某些实施方式中，该非FZD多肽包含人Fc区。该Fc区可自任一类型的免疫球蛋白如IgG、IgA、IgM、IgD及IgE获得。在一些实施方式中，该Fc区系人IgG1Fc区。在一些实施方式中，该Fc区系人IgG2Fc区。在一些实施方式中，该Fc区系野生型Fc区。在一些实施方式中，该Fc区系成熟型Fc区。在一些实施方式中，该Fc区的N端系经截短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸(例如在铰链结构域)。在一些实施方式中，在铰链结构域的氨基酸系经改变以阻止非所欲的双硫键形成。在一些实施方式中，半胱氨酸系经丝氨酸置换以阻碍或阻止非所欲的双硫键形成。在一些实施方式中，该Fc区的C端系经截短1、2、3、或更多个氨基酸。在一些实施方式中，该Fc区的C端系经截短1个氨基酸。在某些实施方式中，该非FZD多肽包含SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、或SEQIDNO:38。在某些实施方式中，该非FZD多肽实质上由SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、或SEQIDNO:38组成。在某些实施方式中，该非FZD多肽实质上由SEQIDNO:36或SEQIDNO:37组成。
在某些实施方式中，Wnt结合剂系包含FZD受体的至少一最小Fri结构域与一Fc区的融合蛋白。本文所使用的“融合蛋白”系由包含至少二种基因的核苷酸序列的核酸分子表达的杂合蛋白。在一些实施方式中，该第一多肽的C端系与该免疫球蛋白Fc区的N端连接。在一些实施方式中，该第一多肽(例如FZDFri结构域)系与该Fc区直接相连(即不含中介肽连接子)。在一些实施方式中，该第一多肽系与该Fc区经由连接子相连。
本文使用的用语“连接子”系指插入第一多肽(例如FZD成分)与第二多肽(例如Fc区)之间的连接子。在一些实施方式中，该连接子系肽连接子。连接子不应不良影响该多肽的表达、分泌或生物活性。连接子应不具抗原性且不应诱发免疫反应。适当的连接子系该领域技术人员所知，通常包括甘氨酸及丝氨酸残基的混合物，且通常包括无空间位阻的氨基酸。其他可被纳入于可用连接子的氨基酸包括苏氨酸及丙氨酸残基。连接子的长度范围广泛，例如1至50个氨基酸长度、1至22个氨基酸长度、1至10个氨基酸长度、1至5个氨基酸长度或1至3个氨基酸长度。连接子可能包括但不限于SerGly、GGSG、GSGS、GGGS、S(GGS)n其中n系1至7、GRA、聚(Gly)、聚(Ala)、ESGGGGVT(SEQIDNO:57)、LESGGGGVT(SEQIDNO:58)、GRAQVT(SEQIDNO:59)、WRAQVT(SEQIDNO:60)及ARGRAQVT(SEQIDNO:61)。本文所使用的连接子系不包括来自该第一多肽(例如FZDFri结构域)的C端或该第二多肽(例如Fc区)的N端的氨基酸残基的中介肽序列。
在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含FZDFri结构域、Fc区及连接该FZDFri结构域与该Fc区的连接子。在一些实施方式中，该FZDFri结构域包含SEQIDNO:20、SEQIDNO:30、或SEQIDNO:33。在一些实施方式中，该连接子包含ESGGGGVT(SEQIDNO:57)或LESGGGGVT(SEQIDNO:58)。
在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含第一多肽及第二多肽，该第一多肽包含SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、或SEQIDNO:33，该第二多肽包含SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、或SEQIDNO:38，其中该第一多肽系与该第二多肽直接连接。在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含：包含SEQIDNO:20的第一多肽及包含SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、或SEQIDNO:38的第二多肽。在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含：包含SEQIDNO:20的第一多肽及包含SEQIDNO:36或SEQIDNO:37的第二多肽。在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含：实质上由SEQIDNO:20组成的第一多肽及实质上由SEQIDNO:36或SEQIDNO:37组成的第二多肽。在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含：包含SEQIDNO:30的第一多肽及包含SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、或SEQIDNO:38的第二多肽。在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含：包含SEQIDNO:30的第一多肽及包含SEQIDNO:36或SEQIDNO:37的第二多肽。在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含：包含SEQIDNO:33的第一多肽及包含SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、或SEQIDNO:38的第二多肽。在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含：包含SEQIDNO:33的第一多肽及包含SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、或SEQIDNO:35的第二多肽。在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含：实质上由SEQIDNO:33组成的第一多肽及实质上由SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、或SEQIDNO:35组成的第二多肽。
在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含第一多肽及第二多肽，该第一多肽包含SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、或SEQIDNO:33，该第二多肽包含SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、或SEQIDNO:38，其中该第一多肽系藉由连接子与该第二多肽连接。在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含：包含SEQIDNO:20的第一多肽及包含SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、或SEQIDNO:38的第二多肽。在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含：包含SEQIDNO:20的第一多肽及包含SEQIDNO:36或SEQIDNO:37的第二多肽。在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含：实质上由SEQIDNO:20组成的第一多肽及实质上由SEQIDNO:36或SEQIDNO:37组成的第二多肽。在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含：包含SEQIDNO:30的第一多肽及包含SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、或SEQIDNO:38的第二多肽。在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含：包含SEQIDNO:33的第一多肽及包含SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、或SEQIDNO:38的第二多肽。在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含：包含SEQIDNO:33的第一多肽及包含SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、或SEQIDNO:35的第二多肽。在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含：实质上由SEQIDNO:33组成的第一多肽及实质上由SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、或SEQIDNO:35组成的第二多肽。
在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含第一多肽及第二多肽，该第一多肽与SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、或SEQIDNO:33具有至少95％一致性，该第二多肽包含SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、或SEQIDNO:38，其中该第一多肽系与该第二多肽直接连接。在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含：与SEQIDNO:20具有至少95％一致性的第一多肽及包含SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、或SEQIDNO:38的第二多肽。在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含：与SEQIDNO:30具有至少95％一致性的第一多肽及包含SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、或SEQIDNO:38的第二多肽。在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含：与SEQIDNO:33具有至少95％一致性的第一多肽及包含SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、或SEQIDNO:38的第二多肽。
在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含第一多肽及第二多肽，该第一多肽与SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、或SEQIDNO:33具有至少95％一致性，该第二多肽包含SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、或SEQIDNO:38，其中该第一多肽系经由连接子与该第二多肽连接。在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含：与SEQIDNO:20具有至少95％一致性的第一多肽及包含SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、或SEQIDNO:38的第二多肽。在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含：与SEQIDNO:30具有至少95％一致性的第一多肽及包含SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、或SEQIDNO:38的第二多肽。在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含：与SEQIDNO:33具有至少95％一致性的第一多肽及包含SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、或SEQIDNO:38的第二多肽。
FZD蛋白包含引导该蛋白运输的信号序列。信号序列(又称信号肽或前导序列)位于新生多肽的N端。它们引导该多肽至内质网且该等蛋白被分类至彼等应该去的地方，例如胞器的内部空间、细胞内部的膜、细胞的外膜或经分泌至细胞外部。大部分信号序列在蛋白被运送至内质网后，藉由信号肽酶与该蛋白切割。自该多肽切割该信号序列通常发生于氨基酸序列的特定位点，且取决于该信号序列内的氨基酸残基。虽然通常有一个特定的切割位点，但信号肽酶可能识别及/或使用一个以上的切割位点，导致该多肽不相同的N端。举例来说，使用信号序列内的不同的切割位点可导致具有不同N端氨基酸的多肽的表达。因此，在一些实施方式中，本文所述的多肽可能包含具有不同N端的多肽的混合物。在一些实施方式中，该N端的长度相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸。在一些实施方式中，该N端的长度相差1、2、3、4或5个氨基酸。在一些实施方式中，该多肽为实质上相同，即该多肽具有相同的N端。在一些实施方式中，该多肽的信号序列包含一或多个(例如一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、等等)氨基酸置换及/或删除。在一些实施方式中，该多肽的信号序列包含让一个切割位点变成主要切割位点的氨基酸置换及/或删除，藉此导致具有一种N端的实质上相同的多肽。
在一些实施方式中，该Wnt结合剂包含选自下列的氨基酸序列：SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、及SEQIDNO:45。
在某些实施方式中，该Wnt结合剂包含SEQIDNO:39的序列。在某些实施方式中，该剂包含SEQIDNO:39的序列，该序列包含一或多个(例如一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、等等)保守性置换。在某些实施方式中，该剂包含与SEQIDNO:39具有至少约90％、约95％、或约98％序列一致性的序列。在某些实施方式中，SEQIDNO:39的变异体维持其与一或多种人Wnt蛋白结合的能力。
在某些实施方式中，该Wnt结合剂包含SEQIDNO:40的序列。在一些实施方式中，该Wnt结合剂系SEQIDNO:40。在某些替代性实施方式中，该剂包含SEQIDNO:40的序列，该序列包含一或多个(例如一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、等等)保守性置换。在某些实施方式中，该剂包含与SEQIDNO:40具有至少约90％、约95％、或约98％序列一致性的序列。在某些实施方式中，SEQIDNO:40的变异体维持其与一或多种人Wnt蛋白结合的能力。
在某些实施方式中，该Wnt结合剂包含SEQIDNO:41的序列。在一些实施方式中，该Wnt结合剂系SEQIDNO:41。在某些替代性实施方式中，该剂包含SEQIDNO:41的序列，该序列包含一或多个(例如一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、等等)保守性置换。在某些实施方式中，该剂包含与SEQIDNO:41具有至少约90％、约95％、或约98％序列一致性的序列。在某些实施方式中，SEQIDNO:41的变异体维持其与一或多种人Wnt蛋白结合的能力。
在一些实施方式中，该Wnt结合剂系OMP-54F28(又称为54F28)。在一些实施方式中，该Wnt结合剂不是OMP-54F28。
在某些实施方式中，Wnt结合剂系多肽，其包含选自SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、及SEQIDNO:45的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含选自SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、及SEQIDNO:41的氨基酸序列。在一些实施方式中，多肽实质上由选自下列的氨基酸序列组成：SEQIDNO:39、SEQIDNO:40及SEQIDNO:41。在某些实施方式中，该多肽包含SEQIDNO:39的氨基酸序列。在一些实施方式中，该多肽包含SEQIDNO:40的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含SEQIDNO:41的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含SEQIDNO:42的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含SEQIDNO:43的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含SEQIDNO:44的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含SEQIDNO:45的氨基酸序列。
在一些实施方式中，该多肽系实质上经纯化的包含选自SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、及SEQIDNO:41的氨基酸序列的多肽。在一些实施方式中，该多肽系实质上经纯化的包含SEQIDNO:41的多肽。在某些实施方式中，该实质上经纯化的多肽系由至少90％的具有ASA的N端序列的多肽所组成。在一些实施方式中，该新生多肽包含导致实质上具有一N端序列的均质多肽产物的信号序列。
在某些实施方式中，Wnt结合剂包含免疫球蛋白的Fc区。该领域技术人员将了解，本发明的某些结合剂将包含融合蛋白，相较于具有大约相同免疫原性的包含天然或未经改变的恒定区的融合蛋白，其中至少部分的Fc区系经删除或以其他方式改变，以提供所欲的生化特征，例如增加癌细胞定位、增加肿瘤穿透、减少血清半衰期、或增加血清半衰期。对Fc区的修饰可能包括添加、删除或置换一或多个结构域中的一或多个氨基酸。本文所揭示的经修饰的融合蛋白可能包含对二个重链恒定结构域的一或多者(CH2或CH3)或对铰链区的改变或修饰。在其他实施方式中，整个CH2结构域可被移除(ΔCH2建构体)。在一些实施方式中，该遗漏的恒定区结构域系由短氨基酸间隔子(例如10个aa残基)置换，以提供通常由该遗漏恒定区结构域所授予的一些分子柔韧性。
在一些实施方式中，该经修饰的融合蛋白系经建构以直接连接CH3结构域与该铰链区。在其他实施方式中，肽间隔子被插入铰链区与经修饰的CH2及/或CH3结构域之间。举例来说，其中CH2结构域被删除且剩余的CH3结构域(经修饰或未经修饰)系以5至20个氨基酸间隔子与铰链区连接的建构体可被表达。该间隔子可被添加以确保恒定区的调节元件维持自由及可接近，或该铰链区维持可弯折。然而，应注意氨基酸间隔子在一些情况中可能证实具有免疫原性，且诱发拮抗该建构体的非所欲免疫反应。因此，在某些实施方式中，任何添加至建构体的间隔子将为相对非免疫原性，以维持该融合蛋白的所欲生物性质。
在一些实施方式中，该经修饰的融合蛋白可能仅具有恒定结构域的部分删除或置换少数或甚至单一个氨基酸。举例来说，在CH2结构域的选择区域中的单一氨基酸突变可能足以实质上减少Fc结合，因此增加癌细胞定位及/或肿瘤穿透。类似地，所欲的是单纯删除该一或多个恒定区结构域中控制特定效应功能(例如补体C1q结合)的部分。该恒定区的部分删除可增进该结合剂的选择特性(例如血清半衰期)，同时保留其他与该主题恒定区结构域完整有关的所欲功能。另外，如上所述，该揭示融合蛋白的恒定区可经由一或多个氨基酸的突变或置换修饰以增进该形成建构物的特性。在这方面可能扰乱由保守性结合位点所提供的活性(例如Fc结合)，同时实质上维持该经修饰的融合蛋白的构造及免疫原性特性。在某些实施方式中，该经修饰的融合蛋白包含添加一或多个氨基酸至恒定区以增进所欲特征诸如减少或增加效应功能或提供更多细胞毒素或碳水化合物连接位点。
该领域已知的是恒定区媒介数种效应功能。举例来说，补体的C1成分与(结合至抗原的)IgG或IgM抗体的Fc区结合活化该补体系统。补体活化于细胞病原体的调理作用及溶解中至为重要。补体活化亦刺激发炎反应，且亦与自体免疫超敏性有关。此外，免疫球蛋白的Fc区可与表达Fc受体(FcR)的细胞结合。有一些Fc受体对不同类型的抗体具有特异性，包括IgG(γ受体)、IgE(ε受体)、IgA(α受体)及IgM(μ受体)。抗体与细胞表面上的Fc受体结合引发多种重要且多变的生物反应，包括吞噬及破坏抗体包覆颗粒、清空免疫复合物、藉由杀手细胞溶解经抗体包覆的标靶细胞、释放发炎介质、胚胎转移及控制免疫球蛋白的产制。
在一些实施方式中，该经修饰的融合蛋白提供经改变的效应功能，因而影响该投予剂的生物特性。举例来说，在一些实施方式中，删除或不活化(经由点突变或其他方法)恒定区结构域可能减少循环中经修饰的剂与Fc受体结合，因此增加癌细胞定位及/或肿瘤穿透。在其他实施方式中，恒定区修饰增加或减少剂的血清半衰期。在一些实施方式中，恒定区系经修饰以消除双硫键或寡糖基团。
在某些实施方式中，经修饰的融合蛋白不具有一或多种通常与Fc区有关的效应功能。在一些实施方式中，该剂不具抗体依赖性细胞媒介性细胞毒性(ADCC)活性及/或不具补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。在某些实施方式中，该剂不与该Fc受体及/或补体因子结合。在某些实施方式中，该剂不具效应功能。
在一些实施方式中，本文所述的Wnt结合剂(例如可溶性受体)系经修饰以减少免疫原性。通常，当这些蛋白用来作为治疗剂时，拮抗完全正常人蛋白的免疫反应很少发生。然而，虽然许多融合蛋白包含与天然中发现的序列相同的多肽序列，数种治疗性融合蛋白已显示在哺乳动物中具有免疫原性。在一些试验中，包含连接子的融合蛋白已被发现比不包含连接子的融合蛋白更具免疫原性。因此，在一些实施方式中，本发明的多肽系藉由运算方法分析以预测免疫原性。在一些实施方式中，分析该等多肽中T细胞及/或B细胞表位的存在。若任何T细胞或B细胞表位系经识别及/或预测，可对这些区域进行修饰(例如氨基酸置换)以扰乱或破坏该等表位。各种可用于预测T细胞及/或B细胞表位的算法及软件系为该领域所知。例如，软件程序SYFPEITHI、HLABind、PEPVAC、RANKPEP、DiscoTope、ElliPro、及抗体表位预测(AntibodyEpitopePrediction)皆为公众可取得。
在一些实施方式中，本发明提供一种产生如本文中所述的任何Wnt结合剂(例如可溶性受体)或多肽的细胞。在一些实施方式中，本发明提供包含如本文中所述的任何Wnt结合剂(例如可溶性受体)或多肽的组合物。在一些实施方式中，该组合物包含多肽，其中至少80％、90％、95％、97％、98％、或99％的该多肽具有ASA的N端序列。在一些实施方式中，该组合物包含多肽，其中100％的该多肽具有ASA的N端序列。在一些实施方式中，该组合物包含多肽，其中至少80％的该多肽具有ASA的N端序列。在一些实施方式中，该组合物包含多肽，其中至少90％的该多肽具有ASA的N端序列。在一些实施方式中，该组合物包含多肽，其中至少95％的该多肽具有ASA的N端序列。
本文中所述的多肽可为重组多肽、天然多肽、或合成多肽。在本领域中咸信本发明的一些氨基酸序列可变化而不会对该蛋白的结构或功能造成显著影响。若考虑该等序列上的差异，应记住在蛋白质上将有决定活性的重要区域。因此，本发明另包括多肽的变异体，该变异体显示实质活性或包括FZD蛋白的区域，例如如本文所讨论的蛋白部分。该等突变包括删除、插入、倒位、重复、及类型置换。
当然，技术人员会采用的氨基酸置换的数量取决于许多因素，包括该些于上述者。在某些实施方式中，用于任何给定的可溶性受体多肽中的置换的数量不会超过50、40、30、25、20、15、10、5或3个。
藉由肽合成，可使用本发明的多肽的片段或部分以产制对应的全长多肽；因此，可使用该片段作为产制该全长多肽的中间体。该多肽的片段或部分亦可称为“蛋白片段”或“多肽片段”。
本发明的“蛋白片段”系能与一或多种人Wnt蛋白或一或多种人FZD蛋白结合的蛋白的部分或整体。于某些实施方式中，该片段对一或多种人Wnt蛋白具有高度亲和性。于某些实施方式中，该片段对一或多种人FZD蛋白具有高度亲和性。本文所描述的Wnt结合剂的某些片段系蛋白片段，其包含与免疫球蛋白的恒定区(例如Fc区)的至少一部分连接的FZD蛋白的胞外区的至少一部分。该蛋白片段的结合亲和性可介于约10-11至10-12M，虽然该亲和性可依片段的不同大小而广泛地变化(介于10-7至10-13M)。于某些实施方式中，该片段的长度为约100至约200氨基酸且包含与免疫球蛋白的恒定区的至少一部分连接的结合结构域。
在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系多克隆抗体。多克隆抗体可利用任何已知的方法制备。在一些实施方式中，多克隆抗体系藉由以感兴趣的抗原(例如经纯化的肽片段、全长重组蛋白或融合蛋白)利用多重皮下或腹腔内注射的方式免疫动物(例如兔、大鼠、小鼠、山羊、驴)产制。该抗原可任意选择地与载剂缀合，诸如钥孔状帽贝血蓝素(KLH)或血清白蛋白。该抗原(不论有无载剂蛋白质)系经无菌盐水稀释，且通常与佐剂(例如完全或不完全弗氏(Freund’s)佐剂)组合以形成稳定乳液。在经过足够时间后，自该经免疫的动物的血液及/或腹水回收多克隆抗体。该多克隆抗体可根据该领域的标准方法自血清或腹水纯化，该等方法包括但不限于亲和性层析、离子交换层析、胶体电泳及透析。
在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系单克隆抗体。单克隆抗体可利用该领域技术人员已知的杂交瘤方法制备(见例如KohlerandMilstein,1975,Nature,256:495-497)。在一些实施方式中，使用杂交瘤方法系将小鼠、仓鼠或其他适当的宿主动物经上述方法免疫，以诱发产制将与该免疫抗原特异性结合的抗体的淋巴细胞。在一些实施方式中，淋巴细胞可于体外(invitro)免疫。在一些实施方式中，该免疫抗原可为人蛋白质或其部分。在一些实施方式中，该免疫抗原可为小鼠蛋白质或其部分。
在免疫后，淋巴细胞系经分离并利用例如聚乙二醇与适当的骨髓瘤细胞系融合，以形成接着可与未融合的淋巴细胞及骨髓瘤细胞分离的杂交瘤细胞。产制特异性拮抗选定抗原的单克隆抗体的杂交瘤可利用多种方法识别，该等方法包括但不限于免疫沉淀、免疫印迹及体外结合试验(例如流式细胞分析、FACS、ELISA及放射性免疫测定)。该杂交瘤可利用标准方法于体外(invitro)增殖(J.W.Goding,1996,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,3rdEdition,AcademicPress,SanDiego,CA)，或于动物活体内(invivo)以腹水肿瘤方式增殖。该单克隆抗体可根据该领域的标准方法自培养基或腹水液体纯化，该等方法包括但不限于亲和性层析、离子交换层析、胶体电泳及透析。
在某些实施方式中，单克隆抗体可利用该领域的技术人员已知的重组DNA技术制备。编码单克隆抗体的多核苷酸系自成熟B细胞或杂交瘤细胞分离，例如藉由RT-PCR使用寡核苷酸引物以特异性扩增编码该抗体的重链及轻链的基因，该等多核苷酸的序列系利用已知技术测定。该经分离的编码重链及轻链的多核苷酸接着被克隆至适当表达载体，该载体在转染至原本不产制免疫球蛋白的宿主细胞诸如大肠杆菌(E.coli)、类人猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞后产制单克隆抗体。在其他实施方式中，重组单克隆抗体或其片段可自噬菌体展示库分离(见例如McCaffertyetal.,1990,Nature,348:552-554；Clacksonetal.,1991,Nature,352:624-628；andMarksetal.,1991,J.Mol.Biol.,222:581-597)。
编码单克隆抗体的多核苷酸可进一步以多种不同方式使用重组DNA技术修饰，以产制可供选择的抗体。在一些实施方式中，例如小鼠单克隆抗体的轻链及重链的恒定结构域可被例如人抗体的该些区域替代以产制嵌合抗体，或以非免疫球蛋白多肽替代以产制融合抗体。在一些实施方式中，该等恒定区系经截短或移除以产制所欲的单克隆抗体的抗体片段。可变区的定点或高密度突变形成可被用于优化单克隆抗体的特异性、亲和性等。
在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系人源化抗体。通常，人源化抗体系其中源自CDR的残基经源自具有所欲特异性、亲和性及/或结合能力的非人物种(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠等)的CDR的残基替代的人免疫球蛋白，该替代系利用该领域的技术人员已知的方法进行。在一些实施方式中，人免疫球蛋白的Fv框架区残基系由具有所欲特异性、亲和性及/或结合能力的非人物种的抗体的对应残基替代。在一些实施方式中，该人源化抗体可进一步藉由替代Fv框架区及/或该经替代的非人残基内的额外残基加以修饰，以精进优化抗体特异性、亲和性及/或能力。通常，该人源化抗体将包含实质上所有的至少一个且通常两个可变结构域，该可变结构域包含所有或实质上所有的对应该非人免疫球蛋白的CDR，然而所有或实质上所有的框架区系具有人免疫球蛋白共同序列的框架区。在一些实施方式中，该人源化抗体亦可包含至少部分的免疫球蛋白恒定区或恒定结构域(Fc)，通常为人免疫球蛋白的该部分。在某些实施方式中，该等人源化抗体系用于治疗用途，因为当投予至人受试者时它们可能减少抗原性及HAMA(人抗小鼠抗体)反应。
在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系人抗体。人抗体可利用该领域已知的多种技术直接制备。在一些实施方式中，产制拮抗标靶抗原的抗体的永生化人B淋巴细胞可于体外免疫产制，或可自免疫受试者分离(见例如Coleetal.,1985,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,p.77；Boemeretal.,1991,J.Immunol.,147:86-95；及美国专利第5,750,373、5,567,610、及5,229,275号)。在一些实施方式中，该人抗体可选自噬菌体分子库，其中该噬菌体分子库表达人抗体(Vaughanetal.,1996,NatureBiotechnology,14:309-314；Sheetsetal.,1998,PNAS,95:6157-6162；HoogenboomandWinter,1991,J.Mol.Biol.,227:381；Marksetal.,1991,J.Mol.Biol.,222:581)。或者，噬菌体展示技术可被用来自未经免疫接种的捐赠者的免疫球蛋白可变区结构域基因库试管内(invitro)产制人抗体及抗体片段。产制及使用抗体噬菌体库的技术系描述于美国专利第5,969,108、6,172,197、5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915、6,593,081、6,300,064、6,653,068、6,706,484及7,264,963号，及Rotheetal.,2008,J.Mol.Bio.,376:1182-1200。该领域已知的亲和性成熟策略包括但不限于链洗牌(chainshuffling)(Marksetal.,1992,Bio/Technology,10:779-783)及定点突变形成可被用于产制高亲和性人抗体。
在一些实施方式中，人抗体可于包含人免疫球蛋白基因座的基因转殖小鼠中制备。经免疫后，这些小鼠可产制整套人抗体而不产制内源性免疫球蛋白。此方法系于美国专利第5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425及5,661,016号中描述。
本发明亦包含特异性识别至少一种人FZD蛋白或至少一种Wnt蛋白的双特异性抗体。双特异性抗体可特异性识别及结合至少二种不同表位。该等不同的表位可位于相同分子内(例如二个不同表位位于人FZD5上)或位于不同分子上(例如一表位位于FZD5上，一不同表位位于第二蛋白上)。在一些实施方式中，该双特异性抗体系单克隆人或人源化抗体。在一些实施方式中，该抗体可特异性识别及结合第一抗原标靶(例如FZD蛋白)及第二抗原标靶例如是在淋巴细胞上的效应分子(例如CD2、CD3、CD28、CD80、或CD86)或Fc受体(例如CD64、CD32或CD16)以使细胞性防御机制集中于表达该第一抗原标靶的细胞。在一些实施方式中，该等抗体可被用于引导细胞毒性剂至表达特定标靶抗原的细胞。这些抗体具有抗原结合臂及与细胞毒性剂或放射性核素螯合剂诸如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA结合的臂。
用于制备双特异性抗体的技术系该领域的技术人员所知，见例如Millsteinetal.,1983,Nature,305:537-539；Brennanetal.,1985,Science,229:81；Sureshetal.,1986,MethodsinEnzymol.,121:120；Trauneckeretal.,1991,EMBOJ.,10:3655-3659；Shalabyetal.,1992,J.Exp.Med.,175:217-225；Kostelnyetal.,1992,J.Immunol.,148:1547-1553；Gruberetal.,1994,J.Immunol.,152:5368；美国专利第5,731,168号及美国专利公开号2011/0123532。双特异性抗体可为完整抗体或抗体片段。本发明亦考虑超过两价的抗体。例如，可制备三特异性抗体(Tuttetal.,1991,J.Immunol.,147:60)。因此，在某些实施方式中，该等抗体系多特异性。
在某些实施方式中，本文描述的抗体(或其他多肽)可为单特异性。例如，在某些实施方式中，抗体所包含的一或多个抗原结合部位的各者系能结合不同蛋白质上的同源性表位。在某些实施方式中，本文所述的单特异性抗体的抗原结合部位能结合例如FZD5及FZD7(即在FZD5及FZD7蛋白上皆能发现的相同表位)。
在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系包含抗原结合部位的抗体片段。抗体片段可具有与完整抗体不同的功能或能力，例如抗体片段可具有增加的肿瘤穿透。已知用于产制抗体片段的各种技术包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化。在一些实施方式中，抗体片段包括由胃蛋白酶消化抗体分子所产制的F(ab')2片段。在一些实施方式中，抗体片段包括藉由减少F(ab')2片段的双硫键所产制的Fab片段。在其他实施方式中，抗体片段包括藉由以木瓜酶及还原剂处理抗体分子所产制的Fab片段。在某些实施方式中，抗体片段系经重组产制。在一些实施方式中，抗体片段包括Fv或单链Fv(scFv)片段。Fab、Fv及scFv抗体片段可在大肠杆菌或其他宿主细胞中表达及分泌，允许大量产制这些片段。在一些实施方式中，抗体片段系自如本文讨论的抗体噬菌体库分离。举例来说，可利用方法建构Fab表达库(Huseetal.,1989,Science,246:1275-1281)以允许快速有效地识别对FZD或Wnt蛋白或其衍生物、片段、类似物或同源物具有所欲特异性的单克隆Fab片段。在一些实施方式中，抗体片段系线性抗体片段。在某些实施方式中，抗体片段系单特异性或双特异性。在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系scFv。各种技术可被用于产制对一或多种人FZD蛋白或一或多种人Wnt蛋白具有特异性的单链抗体。
另外尤其以抗体片段来说所欲的是，修饰抗体以增加其血清半衰期。此可藉由例如使抗体片段中的适当区域发生突变以纳入救援受体结合表位至抗体片段中达成，或藉由将该表位纳入肽标签中然后使该肽标签与抗体片段的末端或中间融合(例如藉由DNA或肽合成)达成。在一些实施方式中，抗体系经修饰以减少其血清半衰期。
异源缀合抗体亦属于本发明的范围内。异源缀合抗体系由二个共价连接的抗体组成。该等抗体被计划用于例如使免疫细胞以非所欲的细胞为标靶(美国专利第4,676,980号)。亦考虑到该等异源缀合抗体可利用已知的合成蛋白质化学方法于体外(invitro)制备，包括该些涉及交联剂的方法。举例来说，免疫毒素可利用双硫交换反应或藉由形成硫醚键加以建构。为达此目的的适当试剂实例包括亚胺基硫醇盐及甲基-4-巯基丁亚胺酸酯。
就本发明的目的而言，应了解的是经修饰的抗体可包含任何类型的提供该抗体与标靶(即人FZD蛋白或人Wnt蛋白)连接的可变区。在这方面，该可变区可包含或衍生自任何种类的可被诱导以启动体液性反应及产制拮抗该所欲的肿瘤相关抗原的免疫球蛋白的哺乳动物。因此，该经修饰的抗体的可变区可为例如人、小鼠、非人灵长动物(例如长尾猕猴(cynomolgusmonkey)、猕猴等)或兔来源。在一些实施方式中，该经修饰的免疫球蛋白的可变区及恒定区皆为人来源。在其他实施方式中，兼容性抗体的可变区(通常源自非人来源)可经工程化或特别修饰以促进该分子的结合特性或减少免疫原性。在这方面，可用于本发明的可变区可经人源化或藉由纳入输入氨基酸序列以另行改变。
在某些实施方式中，重链及轻链的可变结构域系藉由至少部分替代一或多个CDR及(若需要的话)部分框架区替代及序列修饰及/或改变加以改变。虽然CDR可能源自与框架区来源的抗体相同类型或甚至相同亚型的抗体，一般设想CDR将较佳地源自不同物种的抗体。要转移一可变结构域的抗原结合能力至另一可变结构域不一定需要将所有CDR替代成捐赠者可变区的所有CDR。相反地，可能只需要转移该些维持抗原结合部位的活性所需的残基即可。
尽管对可变区进行改变，该领域的技术人员将了解，本发明的经修饰的抗体将包含其中至少部分的一或多个恒定结构域已被删除或以其他方式改变的抗体(例如全长抗体或其免疫反应性片段)以提供所欲的生化特征，例如相较于包含原始或未经改变的恒定区的大约相同免疫原性的抗体具有增加的肿瘤定位及/或增加的血清半衰期。在一些实施方式中，该经修饰的抗体的恒定区将包含人恒定区。与本发明兼容的恒定区修饰包含添加、删除或替代一或多个结构域中的一或多个氨基酸。本文所揭示的经修饰的抗体可能包含对三个重链恒定结构域的一或多者(CH1、CH2或CH3)及/或对轻链恒定结构域(CL)的改变或修饰。在一些实施方式中，一或多个结构域系自该经修饰的抗体的恒定区部分或全部删除。在一些实施方式中，该经修饰的抗体将包含其中整个CH2结构域被移除的结构域删除建构体或变异体(ΔCH2建构体)。在一些实施方式中，该缺少的恒定区结构域系由短氨基酸间隔子(例如10个氨基酸残基)替代，以提供通常由该缺少恒定区授予的一些分子柔韧性。
在一些实施方式中，该经修饰的抗体系经工程化以直接融合CH3结构域与该抗体的铰链区。在其他实施方式中，肽间隔子被插入铰链区与经修饰的CH2及/或CH3结构域之间。举例来说，其中CH2结构域被删除且剩余的CH3结构域(经修饰或未经修饰)系以5至20个氨基酸间隔子与铰链区连接的建构体可被表达。该间隔子可被添加以确保恒定区的调节元件维持自由及可接近，或该铰链区维持可弯折。然而，应注意氨基酸间隔子在一些情况中可能证实具有免疫原性，且诱发拮抗该建构体的非所欲免疫反应。因此，在某些实施方式中，任何添加至建构体的间隔子将为相对非免疫原性，以维持该经修饰的抗体的所欲生物性质。
在一些实施方式中，该经修饰的抗体可能仅具有恒定结构域的部分删除或替代少数或甚至单一个氨基酸。举例来说，在CH2结构域的选择区域中的单一氨基酸突变可能足以实质上减少Fc结合，因此增加癌细胞定位及/或肿瘤穿透。类似地，所欲的是单纯删除该一或多个恒定区结构域中控制特定效应功能(例如补体C1q结合)的部分。该恒定区的部分删除可增进该抗体的选择特性(血清半衰期)，同时保留其他与该主题恒定区结构域完整有关的所欲功能。另外，如上所述，该揭示抗体的恒定区可经由一或多个氨基酸的突变或替代修饰以增进该形成建构物的特性。在这方面可能扰乱由保守性结合位点所提供的活性(例如Fc结合)，然而实质上维持该经修饰的抗体的构造及免疫原性特性。在某些实施方式中，该经修饰的抗体包含添加一或多个氨基酸至恒定区以增进所欲特征诸如减少或增加效应功能或提供更多细胞毒素或碳水化合物连接位点。
该领域已知的是恒定区媒介数种效应功能。举例来说，补体的C1成分与(结合至抗原的)IgG或IgM抗体的Fc区结合活化该补体系统。补体活化于细胞病原体的调理作用及溶解中至为重要。补体活化亦刺激发炎反应，且亦与自体免疫超敏性有关。此外，抗体的Fc区可与表达Fc受体(FcR)的细胞结合。有一些Fc受体对不同类型的抗体具有特异性，包括IgG(γ受体)、IgE(ε受体)、IgA(α受体)及IgM(μ受体)。抗体与细胞表面上的Fc受体结合引发多种重要且多变的生物反应，包括吞噬及破坏抗体包覆颗粒、清空免疫复合物、藉由杀手细胞溶解经抗体包覆的标靶细胞、释放发炎介质、胚胎转移及控制免疫球蛋白的产制。
在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系提供经改变的效应功能的抗体。这些经改变的效应功能可能影响该经投予的抗体的生物特性。举例来说，在一些实施方式中，删除或不活化(经由点突变或其他方法)恒定区结构域可能减少循环中经修饰的抗体(例如抗FZD抗体)与Fc受体结合，因此增加癌细胞定位及/或肿瘤穿透。在其他实施方式中，恒定区修饰增加或减少抗体的血清半衰期。在一些实施方式中，恒定区系经修饰以消除双硫键或寡糖基团。根据本发明对恒定区的修饰可轻易利用该领域的技术人员广为周知的生化或分子工程技术进行。
在某些实施方式中，Wnt途径抑制剂系不具有一或多种效应功能的抗体。例如在一些实施方式中，该抗体不具ADCC活性及/或CDC活性。在某些实施方式中，该抗体不与Fc受体及/或补体因子结合。在某些实施方式中，该抗体不具效应功能。
本发明另包含实质上与本文前述的嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或其抗体片段同源的变异体及相等物。这些可包含例如保守性替代突变，即以类似氨基酸替代一或多个氨基酸。例如，保守性替代系指以同类型的氨基酸替代另一者，像是例如以一酸性氨基酸替代另一酸性氨基酸、以一碱性氨基酸替代另一碱性氨基酸或以一中性氨基酸替代另一中性氨基酸。保守性氨基酸替代的目的系该领域广为周知并于本文描述。
因此，本发明提供用于产制抗体的方法。在一些实施方式中，用于产制抗体的方法包含利用杂交瘤技术。在一些实施方式中，本发明提供用于产制与人FZD蛋白结合的抗体的方法。在一些实施方式中，本发明提供用于产制与人Wnt蛋白结合的抗体的方法。在一些实施方式中，用于产制抗体的方法包含筛选人噬菌体库。在一些实施方式中，该抗体系利用包含单一抗原结合部位的膜结合性异二聚体分子识别。在一些非限制性实施方式中，该抗体系利用美国专利公开号WO2011/0287979所述的方法及多肽识别。
本发明另提供识别与至少一种FZD蛋白结合的抗体的方法。在一些实施方式中，该抗体系藉由FACS筛选与FZD蛋白或其部分的结合加以识别。在一些实施方式中，该抗体系藉由利用ELISA筛选与FZD蛋白结合加以识别。在一些实施方式中，该抗体系藉由FACS筛选FZD蛋白与人Wnt蛋白结合的阻断加以识别。在一些实施方式中，该抗体系藉由筛选对Wnt途径信号传导的抑制或阻断加以识别。
本发明另提供识别与至少一种Wnt蛋白结合的抗体的方法。在一些实施方式中，该抗体系藉由FACS筛选与Wnt蛋白或其部分的结合加以识别。在一些实施方式中，该抗体系藉由利用ELISA筛选与Wnt蛋白结合加以识别。在一些实施方式中，该抗体系藉由FACS筛选Wnt蛋白与人FZD蛋白结合的阻断加以识别。在一些实施方式中，该抗体系藉由筛选对Wnt途径信号传导的抑制或阻断加以识别。
在一些实施方式中，产制抗至少一种人FZD蛋白的抗体的方法包含在抗体表达库中筛选与人FZD蛋白结合的抗体。在一些实施方式中，该抗体表达库系噬菌体库。在一些实施方式中，该抗体表达库系哺乳动物细胞库。在一些实施方式中，该筛选包含淘选(panning)。在一些实施方式中，在第一次筛选中被识别的抗体，再次利用不同的FZD蛋白筛选，藉以识别与该第一FZD蛋白及第二FZD蛋白结合的抗体。在一些实施方式中，在筛选中识别的抗体与该第一FZD蛋白及至少一种其他FZD蛋白结合。在某些实施方式中，该至少一种其他FZD蛋白系选自：FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、及FZD10。在某些实施方式中，在筛选中识别的该抗体与FZD1、FZD2、FZD5、FZD7及FZD8结合。在一些实施方式中，在筛选中被识别的抗体系FZD拮抗剂。在一些实施方式中，由本文所述的方法识别的抗体抑制Wnt途径。在一些实施方式中，在该筛选中识别的抗体抑制β-连环蛋白信号传导。
在一些实施方式中，产制抗至少一种人Wnt蛋白的抗体的方法包含在抗体表达库中筛选与人Wnt蛋白结合的抗体。在一些实施方式中，该抗体表达库系噬菌体库。在一些实施方式中，该抗体表达库系哺乳动物细胞库。在一些实施方式中，该筛选包含淘选(panning)。在一些实施方式中，在第一次筛选中被识别的抗体，再次利用不同的Wnt蛋白筛选，藉以识别与第一Wnt蛋白及第二Wnt蛋白结合的抗体。在一些实施方式中，在筛选中识别的抗体与第一Wnt蛋白及至少一种其他Wnt蛋白结合。在某些实施方式中，该至少一种其他FZD蛋白系选自Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、及Wnt10b。在一些实施方式中，在筛选中被识别的抗体系Wnt拮抗剂。在一些实施方式中，由本文所述的方法识别的抗体抑制Wnt途径。在一些实施方式中，在该筛选中识别的抗体抑制β-连环蛋白信号传导。
在某些实施方式中，本文所述的抗体系经分离。在某些实施方式中，本文所述的抗体系实质上纯的。
在本发明的一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系多肽。该多肽可为包含与至少一种人FZD蛋白或至少一种Wnt蛋白结合的抗体或其片段的重组多肽、天然多肽或合成多肽。在本领域中咸信本发明的一些氨基酸序列可变化而不会对该蛋白的结构或功能造成显著影响。因此，本发明另包括多肽的变异体，该变异体显示实质活性或包括拮抗人FZD蛋白或Wnt蛋白的抗体的区域或其片段。在一些实施方式中，FZD结合多肽或Wnt结合多肽的氨基酸序列变异体包括删除、插入、倒位、重复及/或其他类型的替代。
该多肽、类似物及其变异体可另经修饰以包含正常非该多肽的部分的额外化学基团。该等衍生化基团可增进该多肽的溶解性、生物半衰期及/或吸收。该等基团亦可减少或消除该多肽及变异体的任何非所欲的不良反应。有关化学基团的介绍可见Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,22stEdition,2012,PharmaceuticalPress,London。
本文所述的经分离的多肽可藉由该领域已知的任何适当方法产制。该等方法从直接蛋白质合成方法至建构编码多肽序列的DNA序列及在适当宿主中表达该等序列皆可。在一些实施方式中，DNA序列系利用重组技术建构，其藉由分离或合成编码感兴趣的野生型蛋白质的DNA序列。可任意选择地，该序列可藉由定点突变形成突变以提供其功能性类似物。
在一些实施方式中，编码感兴趣的多肽的DNA序列可藉由化学合成利用寡核苷酸合成器建构。寡核苷酸可根据该所欲多肽的氨基酸序列设计，并选择该些将产制感兴趣重组多肽的宿主细胞所偏好的密码子。标准方法可被用于合成编码经分离的感兴趣多肽的多核苷酸序列。举例来说，完全氨基酸序列可被用于建构反翻译基因。另外，可合成包含编码经分离的特定多肽的核苷酸序列的DNA寡聚体。例如，多个编码该所欲多肽的部分的小型寡核苷酸可被合成然后连接。个别寡核苷酸通常包含5'或3'悬端以用于互补组装。
一经组装(藉由合成、定点突变形成或其他方法)，该编码感兴趣的特定多肽的多核苷酸序列可被插入表达载体并可操作性连接适合该蛋白质于所欲宿主内表达的表达控制序列。适当组装可藉由核苷酸定序、限制酶定位及/或于适当宿主内表达生物活性多肽证实。如该领域所广为周知，为了在宿主内获得高表达量的经转染的基因，该基因必须可操作性连接在选定的表达宿主内具功能性的转录及翻译表达控制序列。
在某些实施方式中，重组表达载体被用于扩增及表达拮抗人FZD蛋白或Wnt蛋白的DNA编码结合剂(例如抗体或可溶性受体)或其片段。举例来说，重组表达载体可为可复制的DNA建构体，其具有与适当转录及/或翻译调节元件可操作性连接的编码FZD结合剂、Wnt结合剂、抗FZD抗体或其片段、抗Wnt抗体或其片段、或FZD-Fc可溶性受体的多肽链的合成性或cDNA衍生性DNA片段，该调节元件系源自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因。转录单位通常包含下列的组合：(1)于基因表达中具有调节作用的基因元件，例如转录启动子或增强子，(2)经转录成mRNA然后翻译成蛋白质的结构或编码序列，及(3)适当的转录及翻译启动及终止序列。调节元件可包括操作子序列以控制转录。通常由复制起点授予的于宿主内复制的能力及有利转化物识别的选择基因可被额外纳入。DNA区系“可操作性连接”当它们彼此之间系功能性相关。举例来说，信号肽的DNA(分泌前导序列)系可操作性连接多肽的DNA，若其被表达为参与该多肽分泌的前体；启动子系可操作性连接编码序列，若其控制该序列的转录；或核糖体结合位点系可操作性连接编码序列，若其位置系为了允许翻译。在一些实施方式中，适用于酵母菌表达系统的结构元件包括使宿主细胞得以胞外分泌经翻译的蛋白质的前导序列。在其他实施方式中，当重组蛋白质系于无前导或转运序列存在时表达，其可包括N端甲硫氨酸残基。此残基之后可任意选择地与该经表达的重组蛋白质切开以提供最终产物。
表达控制序列及表达载体的选择取决于宿主选择。多样化的表达宿主/载体组合可被采用。可用于真核宿主的表达载体包括例如包含源自SV40、牛乳头状瘤病毒、腺病毒及巨细胞病毒的表达控制序列的载体。可用于细菌宿主的表达载体包括已知的细菌质粒，例如源自大肠杆菌的质粒(包括pCR1、pBR322、pMB9及其衍生物)，及广泛宿主范围质粒例如M13及其他丝状单股DNA噬菌体。
用于表达FZD结合或Wnt结合剂(或用来作为抗原的蛋白)的适当宿主细胞包括原核生物、酵母菌细胞、昆虫细胞或在适当启动子控制下的高级真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性有机体，例如大肠杆菌(E.coli)或杆菌(Bacillus)。高级真核细胞包括如下所述的哺乳动物来源的构建的细胞系。不含细胞的翻译系统亦可被采用。用于细菌性、真菌性、酵母菌性及哺乳动物细胞性宿主的适当克隆及表达载体系描述于Pouwelsetal.(1985,CloningVectors:ALaboratoryManual,Elsevier,NewYork,NY)。有关蛋白质产制(包括抗体产制)方法的额外信息可见于例如美国专利公开号2008/0187954；美国专利第6,413,746及6,660,501号；及国际专利公开号WO2004/009823。
多种哺乳动物细胞培养系统被用于表达重组多肽。于哺乳动物细胞中表达重组蛋白可为较佳，因为这些蛋白通常经过正确折迭、适当修饰且具生物功能性。适当哺乳动物宿主细胞系的实例包括COS-7(猴肾来源)、L-929(小鼠纤维母细胞来源)、C127(小鼠乳房肿瘤来源)、3T3(小鼠纤维母细胞来源)、CHO(中国仓鼠卵巢来源)、HeLa(人子宫颈癌来源)、BHK(仓鼠肾纤维母细胞来源)、HEK-293(人胚胎肾来源)细胞系及其变异株。哺乳动物表达载体可包含非转录元件(诸如复制起点、与所欲表达的基因相连的适当启动子及增强子，及其他5'或3'侧翼非转录序列)及5'或3'非翻译序列(诸如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体位点及受体位点，及转录终止序列)。
于昆虫细胞培养系统(例如杆状病毒)中表达重组蛋白质亦提供产制正确折迭及具生物功能的蛋白质的有效方法。用于在昆虫细胞中产制异源性蛋白质的杆状病毒系统系该领域的技术人员所广为周知(见例如LuckowandSummers,1988,Bio/Technology,6:47)。
因此，本发明提供包含本文所述的FZD结合剂或Wnt结合剂的细胞。在一些实施方式中，该等细胞产制本文所述的结合剂(例如抗体或可溶性受体)。在某些实施方式中，该等细胞产制抗体。在某些实施方式中，该等细胞产制抗体OMP-18R5。在一些实施方式中，该等细胞产制可溶性受体。在一些实施方式中，该等细胞产制FZD-Fc可溶性受体。在一些实施方式中，该等细胞产制FZD8-Fc可溶性受体。在一些实施方式中，该等细胞产制FZD8-Fc可溶性受体OMP-54F28。
由经转化的宿主产制的蛋白质可根据任何适当方法纯化。标准方法包括层析(例如离子交换、亲和性及尺寸柱层析)、离心、差别溶解或藉由任何其他用于蛋白质纯化的标准技术。亲和性标签诸如六组氨酸、麦芽糖结合结构域、流感外套序列及谷胱甘肽-S-转移酶可被连接至该蛋白质以允许藉由通过适当亲和性管柱的轻易纯化。经分离的蛋白亦可经物理特征化，使用例如蛋白水解、质谱分析(MS)、核磁共振(NMR)、高效液相层析(HPLC)及x光结晶的技术。
在一些实施方式中，源自分泌重组蛋白质至培养基的表达系统的上清液可利用商用蛋白质浓缩过滤器先行浓缩，例如使用阿密康(Amicon)或密里博(Millipore)Pellicon超过滤装置浓缩。在浓缩步骤之后，该浓缩液可被加至适当纯化基材。在一些实施方式中，可采用阴离子交换树脂，例如具有二乙基氨基乙基(DEAE)悬挂基团的基材或基质。该基材可为丙烯酰胺、洋菜糖、葡聚糖、纤维素或其他常用于蛋白质纯化的基材。在一些实施方式中，可采用阳离子交换步骤。适当的阳离子交换基材包括包含磺丙基或羧甲基的各种不可溶基材。在一些实施方式中，可采用羟磷灰石基质，包括但不限于陶瓷羟磷灰石(CHT)。在某些实施方式中，一或多种应用疏水性反相HPLC基质(例如具有悬挂甲基或其他脂肪族基团的硅胶)的反相HPLC步骤可被采用以进一步纯化结合剂。上述的一些或所有纯化步骤的各种组合亦可被应用以提供均质性重组蛋白。
在一些实施方式中，于细菌培养中生产的重组蛋白质可被分离，例如藉由自细胞团块初步萃取，接着进行一或多次浓缩、盐析、水性离子交换或大小排除层析步骤。HPLC可被使用于最终纯化步骤。用于表达重组蛋白的微生物细胞可藉由任何方便方法破碎，包括冷冻解冻循环、超音波震荡、机械破碎或使用细胞溶解剂。
该领域已知的用于纯化抗体及其他蛋白质的方法亦包括例如该些于美国专利公开号2008/0312425、2008/0177048及2009/0187005所述者。
在某些实施方式中，该Wnt结合剂或该FZD结合剂系非抗体的多肽。用于识别及产制以高亲和性与蛋白质标靶结合的非抗体多肽的各种方法系该领域所知。见例如Skerra,2007,Curr.Opin.Biotechnol.,18:295-304；Hosseetal.,2006,ProteinScience,15:14-27；Gilletal.,2006,Curr.Opin.Biotechnol.,17:653-658；Nygren,2008,FEBSJ.,275:2668-76；及Skerra,2008,FEBSJ.,275:2677-83。在某些实施方式中，噬菌体展示技术可被用于生产及/或识别FZD结合或Wnt结合多肽。在某些实施方式中，该多肽包含选自蛋白A、蛋白G、脂质运载蛋白(lipocalin)、纤维粘连蛋白结构域、锚蛋白(ankyrin)共同重复结构域或硫氧还蛋白类型的蛋白质支架。
在某些实施方式中，该结合剂可以数种缀合的(即免疫缀合物或放射缀合物)或非缀合的形式的任一者被使用。在某些实施方式中，抗体可以非缀合形式被使用以驾驭受试者的天然防御机制，包括补体依赖性细胞毒性及抗体依赖性细胞毒性，以消灭该恶性或癌细胞。
在一些实施方式中，该结合剂系与细胞毒性剂缀合。在一些实施方式中，该细胞毒性剂系化学治疗剂，包括但不限于甲胺喋呤(methotrexate)、甲烯土霉素(adriamicin)、多柔比星(doxorubicin)、霉法兰(melphalan)、丝裂霉素C(mitomycinC)、氯芥苯丁酸(chlorambucil)、正定霉素(daunorubicin)或其他插入剂。在一些实施方式中，该细胞毒性剂系细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素及其片段，包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思豆毒素(abrin)A链、莫迪素(modeccin)A链、α-次黄嘌呤(sarcin)、油桐(Aleuritesfordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制剂、泻果素(curcin)、巴豆素(crotin)、肥皂草(saponariaofficinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、丝裂胶素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)及新月毒素(trichothecene)。在一些实施方式中，该细胞毒性剂系放射性同位素以产制放射缀合物或经放射缀合的抗体。多种放射性核种可用于产制经放射缀合的抗体，包括但不限于90Y、125I、131I、123I、111In、131In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re、188Re及212Bi。在一些实施方式中，本发明可产制抗体与一或多种小分子毒素的缀合物，该等毒素诸如卡利奇霉素(calicheamicin)、类美坦素(maytansinoids)、新月毒素(trichothene)、CC1065及具有毒素活性的该些毒素的衍生物。在某些实施方式中，抗体与细胞毒性剂的缀合物可利用各种双官能性蛋白偶合剂制备，例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、二亚胺环硫丁烷(IT)、亚胺酸酯的双官能基衍生物(诸如己二亚胺二甲酯HCL)、活性酯的双官能基衍生物(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺)、醛的双官能基衍生物(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如2,6-二异氰酸甲苯酯)及双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝苯)。
在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂(例如抗体或可溶性受体)系至少一种Wnt蛋白(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种Wnt蛋白)的拮抗剂。在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂抑制其所结合的Wnt蛋白的活性。在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或约100％的其所结合的人Wnt蛋白的活性。
在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂(例如抗体或可溶性受体)抑制至少一种人Wnt与适当受体的结合。在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂抑制至少一种人Wnt蛋白与一或多种人FZD蛋白的结合。在一些实施方式中，该至少一种Wnt蛋白系选自下列：Wnt1、Wnt2、Wnt2b/13、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、及Wnt16。在一些实施方式中，该一或多种人FZD蛋白系选自下列：FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9及FZD10。在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂抑制一或多种Wnt蛋白与FZD1、FZD2、FZD4、FZD5、FZD7、及/或FZD8的结合。在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂抑制一或多种Wnt蛋白与FZD8的结合。在某些实施方式中，由该Wnt途径抑制剂对特定Wnt与FZD蛋白的结合的抑制系至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或至少约95％。在某些实施方式中，抑制Wnt与FZD蛋白结合的剂亦抑制Wnt途径信号传导。在某些实施方式中，抑制人Wnt途径信号传导的Wnt途径抑制剂系抗体。在某些实施方式中，抑制人Wnt途径信号传导的Wnt途径抑制剂系FZD-Fc可溶性受体。在某些实施方式中，抑制人Wnt途径信号传导的Wnt途径抑制剂系FZD8-Fc可溶性受体。在某些实施方式中，抑制人Wnt途径信号传导的Wnt途径抑制剂系可溶性受体OMP-54F28。
在某些实施方式中，本文中所述的该Wnt途径抑制剂(例如抗体或可溶性受体)为至少一种人Wnt蛋白的抑制剂且抑制Wnt活性。在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或约100％的Wnt活性。在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂抑制一、二、三、四、五或更多种Wnt蛋白的活性。在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂抑制选自下列的至少一种人Wnt蛋白的活性：Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、及Wnt16。在一些实施方式中，该Wnt结合剂与至少一种选自下列的Wnt蛋白结合：Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、及Wnt10b。在某些实施方式中，该至少一种Wnt蛋白系选自Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、及Wnt10b。在某些实施方式中，抑制人Wnt活性的Wnt途径抑制剂系抗体。在某些实施方式中，抑制人Wnt活性的Wnt途径抑制剂系FZD-Fc可溶性受体。在某些实施方式中，抑制人Wnt活性的Wnt途径抑制剂系FZD8-Fc可溶性受体。在某些实施方式中，抑制人Wnt活性的Wnt途径抑制剂系可溶性受体OMP-54F28。
在某些实施方式中，本文所述的该Wnt途径抑制剂系至少一种人FZD蛋白的拮抗剂且抑制FZD活性。在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或约100％的FZD活性。在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂抑制一、二、三、四、五或更多种FZD蛋白的活性。在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂抑制选自下列的至少一种人FZD蛋白的活性：FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9及FZD10。在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂抑制FZD1、FZD2、FZD4、FZD5、FZD7、及/或FZD8的活性。在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂抑制FZD8的活性。在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系抗FZD抗体。在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系抗FZD抗体OMP-18R5。
在某些实施方式中，本文所述的该Wnt途径抑制剂系至少一种人Wnt蛋白的拮抗剂且抑制Wnt信号传导。在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或约100％的Wnt信号传导。在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂抑制一、二、三、四、五或更多种Wnt蛋白的信号传导。在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂抑制至少一种选自Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、及Wnt10b的Wnt蛋白的信号传导。在某些实施方式中，抑制Wnt信号传导的Wnt途径抑制剂系抗体。在某些实施方式中，抑制Wnt信号传导的Wnt途径抑制剂系可溶性受体。在某些实施方式中，抑制Wnt信号传导的Wnt途径抑制剂系FZD-Fc可溶性受体。在某些实施方式中，抑制Wnt信号传导的Wnt途径抑制剂系FZD8-Fc可溶性受体。在某些实施方式中，抑制Wnt信号传导的Wnt途径抑制剂系可溶性受体OMP-54F28。
在某些实施方式中，本文中所述的Wnt途径抑制剂系β-连环蛋白信号传导的拮抗剂。在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或约100％的β-连环蛋白信号传导。在某些实施方式中，抑制β-连环蛋白信号传导的Wnt途径抑制剂系抗体。在某些实施方式中，抑制β-连环蛋白信号传导的Wnt途径抑制剂系抗FZD抗体。在某些实施方式中，抑制β-连环蛋白信号传导的Wnt途径抑制剂系抗体OMP-18R5。在某些实施方式中，抑制β-连环蛋白信号传导的Wnt途径抑制剂系可溶性受体。在某些实施方式中，抑制β-连环蛋白信号传导的Wnt途径抑制剂系FZD-Fc可溶性受体。在某些实施方式中，抑制β-连环蛋白信号传导的Wnt途径抑制剂系FZD8-Fc可溶性受体。
在某些实施方式中，本文中所述的Wnt途径抑制剂抑制至少一种Wnt蛋白与受体的结合。在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂抑制至少一种人Wnt蛋白与一或多种其受体的结合。在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂抑制至少一种Wnt蛋白与至少一种FZD蛋白的结合。在一些实施方式中，该Wnt结合剂抑制至少一种Wnt蛋白与FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FDZ5、FDZ6、FDZ7、FDZ8、FDZ9、及/或FZD10的结合。在某些实施方式中，对至少一种Wnt与至少一种FZD蛋白的结合的抑制为至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或至少约95％。在某些实施方式中，抑制至少一种Wnt与至少一种FZD蛋白结合的Wnt途径抑制剂另抑制Wnt途径信号传导及/或β-连环蛋白信号传导。在某些实施方式中，抑制至少一种人Wnt与至少一种FZD蛋白结合的Wnt途径抑制剂系抗体。在某些实施方式中，抑制至少一种人Wnt与至少一种FZD蛋白结合的Wnt途径抑制剂系抗FZD抗体。在某些实施方式中，抑制至少一种人Wnt与至少一种FZD蛋白结合的Wnt途径抑制剂系抗体OMP-18R5。在某些实施方式中，抑制至少一种人Wnt与至少一种FZD蛋白结合的Wnt途径抑制剂系可溶性受体。在某些实施方式中，抑制至少一种人Wnt与至少一种FZD蛋白结合的Wnt途径抑制剂系FZD-Fc可溶性受体。在某些实施方式中，抑制至少一种人Wnt与至少一种FZD蛋白结合的Wnt途径抑制剂系FZD8-Fc可溶性受体。在某些实施方式中，抑制至少一种人Wnt与至少一种FZD蛋白结合的Wnt途径抑制剂系FZD8-Fc可溶性受体OMP-54F28。
在某些实施方式中，本文中所述的Wnt途径抑制剂阻断至少一种Wnt与受体的结合。在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂阻断至少一种人Wnt蛋白与一或多种其受体的结合。在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂阻断至少一种Wnt与至少一种FZD蛋白的结合。在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂阻断至少一种Wnt蛋白与FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FDZ5、FDZ6、FDZ7、FDZ8、FDZ9、及/或FZD10的结合。在某些实施方式中，至少一种Wnt与至少一种FZD蛋白的结合系经阻断至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或至少约95％。在某些实施方式中，阻断至少一种Wnt蛋白与至少一种FZD蛋白结合的Wnt途径抑制剂另抑制Wnt途径信号传导及/或β-连环蛋白信号传导。在某些实施方式中，阻断至少一种人Wnt与至少一种FZD蛋白结合的Wnt途径抑制剂系抗体。在某些实施方式中，阻断至少一种人Wnt与至少一种FZD蛋白结合的Wnt途径抑制剂系抗FZD抗体。在某些实施方式中，阻断至少一种人Wnt与至少一种FZD蛋白结合的Wnt途径抑制剂系抗体OMP-18R5。在某些实施方式中，阻断至少一种人Wnt与至少一种FZD蛋白结合的Wnt途径抑制剂系可溶性受体。在某些实施方式中，阻断至少一种人Wnt与至少一种FZD蛋白结合的Wnt途径抑制剂系FZD-Fc可溶性受体。在某些实施方式中，阻断至少一种人Wnt与至少一种FZD蛋白结合的Wnt途径抑制剂系FZD8-Fc可溶性受体。在某些实施方式中，阻断至少一种人Wnt与至少一种FZD蛋白结合的Wnt途径抑制剂系可溶性受体OMP-54F28。
在某些实施方式中，本文所述的Wnt途径抑制剂抑制Wnt途径信号传导。应了解的是，抑制Wnt途径信号传导的Wnt途径抑制剂在某些实施方式中可能抑制Wnt信号传导途径中藉由一或多种受体的信号传导，但不一定抑制藉由所有受体的信号传导。在某些选择性实施方式中，所有人受体的Wnt途径信号传导可能皆被抑制。在某些实施方式中，选自FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FDZ5、FDZ6、FDZ7、FDZ8、FDZ9、及FZD10的一或多种受体的Wnt途径信号传导系经抑制。在某些实施方式中，Wnt途径抑制剂对Wnt途径信号传导的抑制系指减少Wnt途径信号传导的量至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或至少约95％。在一些实施方式中，抑制Wnt途径信号传导的Wnt途径抑制剂系抗体。在一些实施方式中，抑制Wnt途径信号传导的Wnt途径抑制剂系抗FZD抗体。在一些实施方式中，抑制Wnt途径信号传导的Wnt途径抑制剂系抗体OMP-18R5。在一些实施方式中，抑制Wnt途径信号传导的Wnt途径抑制剂系可溶性受体。在一些实施方式中，抑制Wnt途径信号传导的Wnt途径抑制剂系FZD-Fc可溶性受体。在一些实施方式中，抑制Wnt途径信号传导的Wnt途径抑制剂系FZD8-Fc可溶性受体。在一些实施方式中，抑制Wnt途径信号传导的Wnt途径抑制剂系可溶性受体OMP-54F28。
在某些实施方式中，本文所述的Wnt途径抑制剂抑制β-连环蛋白的活化。应了解的是，抑制β-连环蛋白的活化的Wnt途径抑制剂在某些实施方式中可能抑制藉由一或多种受体的β-连环蛋白的活化，但不一定抑制藉由所有受体的β-连环蛋白的活化。在某些选择性实施方式中，藉由所有人受体的β-连环蛋白活化可能皆被抑制。在某些实施方式中，藉由选自FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FDZ5、FDZ6、FDZ7、FDZ8、FDZ9、及FZD10的一或多种受体的β-连环蛋白活化系经抑制。在某些实施方式中，该Wnt结合剂对β-连环蛋白活化的抑制系指减少β-连环蛋白活化量至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或至少约95％。在一些实施方式中，抑制β-连环蛋白的活化的Wnt途径抑制剂系抗体。在一些实施方式中，抑制β-连环蛋白的活化的Wnt途径抑制剂系抗FZD抗体。在一些实施方式中，抑制β-连环蛋白的活化的Wnt途径抑制剂系抗体OMP-18R5。在一些实施方式中，抑制β-连环蛋白的活化的Wnt途径抑制剂系可溶性受体。在一些实施方式中，抑制β-连环蛋白的活化的Wnt途径抑制剂系FZD-Fc可溶性受体。在一些实施方式中，抑制β-连环蛋白活化的Wnt途径抑制剂系FZD8-Fc可溶性受体。在一些实施方式中，抑制β-连环蛋白活化的Wnt途径抑制剂系可溶性受体OMP-54F28。
用于测定Wnt途径抑制剂是否抑制β-连环蛋白信号传导的活体内(Invivo)及活体外(invitro)测定系该领域所知。举例来说，可使用以细胞为基底的荧光素酶报告试验测量体外的β-连环蛋白信号传导量，其利用含有多份TCF结合结构域与下游萤火虫荧光素酶报告基因的TCF/Luc报告载体(Gazitetal.,1999,Oncogene,18；5959-66；TOPflash,Millipore,BillericaMA)。在一或多种Wnt蛋白(例如由转染细胞表达或由Wnt条件培养基提供的Wnt)存在下，结合剂存在时的β-连环蛋白信号传导量系与无结合剂存在时的信号传导量比较。除了TCF/Luc报告子测定之外，结合剂(或候选剂)对β-连环蛋白信号传导的影响可于体外或活体内藉由测量该剂对β-连环蛋白调节基因表达量的影响加以测定，如c-myc(Heetal.,1998,Science,281:1509-12)、细胞周期素D1(Tetsuetal.,1999,Nature,398:422-6)及/或纤维粘连蛋白(Gradletal.1999,Mol.CellBiol.,19:5576-87)。在某些实施方式中，结合剂对β-连环蛋白信号传导的影响亦可能藉由测量该剂对Dishevelled-1、Dishevelled-2、Dishevelled-3、LRP5、LRP6及/或β-连环蛋白的磷酸化状态的影响检测。
在某些实施方式中，Wnt途径抑制剂具有一或多种下列影响：抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤生长、减少癌干细胞于肿瘤中的频率、减少肿瘤的肿瘤发生性、藉由减少癌干细胞于肿瘤中的频率以减少肿瘤的肿瘤发生性、刺激肿瘤细胞的细胞死亡、诱导肿瘤中的细胞分化、使致癌细胞分化成非致癌状态、诱导肿瘤细胞分化标志的表达、防止肿瘤细胞转移、或减少肿瘤细胞的存活。
在某些实施方式中，Wnt途径抑制剂可抑制肿瘤生长。在某些实施方式中，Wnt途径抑制剂可抑制活体内(例如异种移植小鼠模型及/或于罹患癌的人)的肿瘤生长。在一些实施方式中，该肿瘤系选自结直肠肿瘤、结肠肿瘤、胰肿瘤、肺肿瘤、卵巢肿瘤、肝肿瘤、肝细胞肿瘤、甲状腺肿瘤、乳房肿瘤、肾肿瘤、前列腺肿瘤、胃肠道肿瘤、黑色素瘤、子宫颈肿瘤、神经内分泌肿瘤、膀胱肿瘤、神经胶母细胞瘤或头颈肿瘤的肿瘤。在某些实施方式中，该肿瘤系黑色素瘤。在某些实施方式中，该肿瘤系结直肠肿瘤。在某些实施方式中，该肿瘤系胰肿瘤。在某些实施方式中，该肿瘤系乳房肿瘤。在某些实施方式中，该肿瘤系肺肿瘤。在一些实施方式中，该肿瘤系卵巢肿瘤。在一些实施方式中，该肿瘤系肝肿瘤。在某些实施方式中，该肿瘤系神经内分泌肿瘤。在某些实施方式中，该肿瘤系Wnt依赖性肿瘤。
在某些实施方式中，Wnt途径抑制剂可减少肿瘤的肿瘤发生性。在某些实施方式中，Wnt途径抑制剂可于动物模型诸如小鼠异种移植模型中减少包含癌干细胞的肿瘤的肿瘤发生性。在某些实施方式中，肿瘤中癌干细胞的数量或频率系减少至少约二倍、约三倍、约五倍、约十倍、约50倍、约100倍、或约1000倍。在某些实施方式中，癌干细胞的数量或频率减少系藉由使用动物模型的限制稀释试验测定。有关使用限制稀释试验以测定肿瘤中癌干细胞的数量或频率减少的其他实例及指南可见例如国际公开号WO2008/042236、及美国专利公开号2008/0064049及2008/0178305。
在某些实施方式中，本文描述的Wnt途径抑制剂于活体内具有至少1小时、至少约2小时、至少约5小时、至少约10小时、至少约24小时、至少约2天、至少约3天、至少约1周、或至少约2周的活性。在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系IgG(例如IgG1或IgG2)抗体，其于活体内具有至少1小时、至少约2小时、至少约5小时、至少约10小时、至少约24小时、至少约2天、至少约3天、至少约1周、或至少约2周的活性。在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系融合蛋白，其于活体内具有至少1小时、至少约2小时、至少约5小时、至少约10小时、至少约24小时、至少约2天、至少约3天、至少约1周、或至少约2周的活性。
在某些实施方式中，本文描述的Wnt途径抑制剂于小鼠、长尾猕猴(cynomolgusmonkey)或人体内具有至少约5小时、至少约10小时、至少约24小时、至少约2天、至少约3天、至少约1周、或至少约2周的循环半衰期。在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系于小鼠、长尾猕猴或人体内具有至少约5小时、至少约10小时、至少约24小时、至少约2天、至少约3天、至少约1周、或至少约2周的循环半衰期的IgG(例如IgG1或IgG2)抗体。在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系融合蛋白，其于小鼠、长尾猕猴(cynomolgusmonkey)或人体内具有至少约5小时、至少约10小时、至少约24小时、至少约2天、至少约3天、至少约1周、或至少约2周的循环半衰期。增加(或减少)剂诸如多肽及抗体的半衰期的方法系该领域所知。举例来说，增加IgG抗体循环半衰期的已知方法包括导入突变至Fc区，此增加pH6.0时抗体对新生儿Fc受体(FcRn)的pH依赖性结合(见例如美国专利公开号2005/0276799、2007/0148164及2007/0122403)。增加缺乏Fc区的抗体片段的循环半衰期的已知方法包括例如PEG化的技术。
III.使用方法及医药组合物
本发明提供使用Wnt途径抑制剂治疗疾病诸如癌，同时筛选、监测、减少、预防、减弱、及/或减轻不良反应及/或毒性的方法，该等不良反应及/或毒性包括但不限于与该Wnt途径抑制剂治疗有关的骨骼相关不良反应及/或毒性。与癌症治疗有关的不良反应及/或毒性可包括但不限于疲倦、呕吐、恶心、腹泻、疼痛、掉发、嗜中性球低下、贫血、血小板低下、心血管相关并发症、骨骼相关并发症、及任何彼等的组合。如本文中所使用的“骨骼相关并发症”(例如骨骼相关不良反应及/或毒性)包括但不限于骨量减少、骨质疏松症、骨折(包括无症状骨折)、及其组合。因此，在本文所述的方法的一些态样及/或实施方式中，筛选、监测、减少、预防、减弱、及/或减轻骨骼相关不良反应及/或毒性，系筛选、监测、减少、预防、减弱、及/或减轻骨密度流失及/或骨折风险。骨密度流失通常无征状及/或骨骼相关不良反应的早期征候在例如骨密度筛选时并不明显。
骨代谢系骨形成与骨破坏的连续性双重过程。骨破坏系指骨吸收，其系由破骨细胞进行，然而骨形成系由成骨细胞进行。在成人中，骨形成与骨破坏的双重过程处于平衡状态，维持固定、恒定控制量的骨。骨代谢可藉由测量在骨形成及骨吸收期间释出的生物标志(例如酶、蛋白、及/或降解产物)评估及/或监测。这些生物标志通常被称为“骨转换标志”且包括骨形成标志及骨吸收标志。骨形成生物标志包括血清总碱性磷酸酶、血清骨骼特异性碱性磷酸酶、血清骨钙化素、血清第1型前胶原胺基端前肽(P1NP)及血清第1型前胶原羧基端前肽(P1CP)。骨吸收生物标志包括尿中羟基脯氨酸、尿中总吡啶啉(PYD)、尿中游离脱氧吡啶啉(DPD)、尿中第1型胶原蛋白交联的N-端肽(NTX)、尿中或血清第1型胶原蛋白交联的C-端肽(CTX)、骨涎蛋白(BSP)、及抗酒石酸酸性磷酸酶5b。
骨的有机基质中约90％系第1型胶原，即一种螺旋蛋白，其中该分子的N端和C端交联。于骨吸收期间，破骨细胞分泌酸性蛋白酶和中性蛋白酶的混合物，其能使胶原原纤维降解成包括C-端肽(CTX)的分子片段。当骨老化时，存在于CTX的α型天冬氨酸转化为β型(β-CTX)。于骨吸收期间，β-CTX被释出至血流且作为成熟第1型胶原的降解的特定标志。
业已使用骨代谢标志以监测停经后妇女和诊断患有骨质稀少的受试者的抗吸收治疗(例如激素取代性治疗和双磷酸盐治疗)。此外，可使用骨代谢标志以评估因使用激素药物和非激素药物进行治疗所导致的因药物引起的骨质疏松。该等药物可包括但不限于糖皮质激素、甲状腺激素、芳香酶抑制剂、卵巢抑制剂、雄激素剥夺治疗、四氢噻唑二酮、选择性血清素再摄取抑制剂、抗痉挛剂、肝素、口服抗凝血剂、环利尿剂、钙调神经磷酸酶抑制剂、抗逆转录病毒治疗及质子泵抑制剂。先前尚未使用骨代谢标志以评估Wnt途径抑制剂的功效。于是，于某些实施方式中，本发明提供使用骨代谢标志以监测经Wnt途径抑制剂治疗的受试者的骨骼相关副作用及/或毒性的方法。于某些实施方式中，该方法使用骨生成生物标志以监测及/或侦测骨生成的减少程度。于某些实施方式中，该方法使用骨吸收生物标志以监测及/或侦测骨吸收的增加程度。于某些实施方式中，监测骨生成生物标志的量给予骨生成的减少程度及/或骨折的增加风险、骨质稀少及/或骨质疏松的早期指标。于某些实施方式中，监测骨吸收生物标志的量给予骨吸收的增加程度及/或骨折的增加风险、骨质稀少及/或骨质疏松的早期指标。于某些实施方式中，于骨骼功能不良的任何事件发生之前，藉由骨密度扫描，该方法侦测骨骼相关副作用及/或毒性。
在某些实施方式中，该经检测、识别、监测、减少、预防、减弱、及/或筛选的骨骼相关不良反应及/或毒性，系由于投予Wnt途径抑制剂或使用Wnt途径抑制剂治疗所造成、所关联及/或有关。在某些实施方式中，该骨骼相关不良反应及/或毒性系关于Wnt途径抑制剂。在某些实施方式中，该骨骼相关不良反应及/或毒性系关于Wnt途径抑制剂的活性。在某些实施方式中，该骨骼相关不良反应及/或毒性系关于Wnt途径抑制剂，该Wnt途径抑制剂系抗FZD抗体。在某些实施方式中，该骨骼相关不良反应及/或毒性系关于Wnt途径抑制剂，该Wnt途径抑制剂系抗FZD抗体OMP-18R5。在某些实施方式中，该骨骼相关不良反应及/或毒性系关于Wnt途径抑制剂，该Wnt途径抑制剂系FZD可溶性受体。在某些实施方式中，该骨骼相关不良反应及/或毒性系关于Wnt途径抑制剂，该Wnt途径抑制剂系FZD8-Fc可溶性受体。在某些实施方式中，该骨骼相关不良反应及/或毒性系关于Wnt途径抑制剂，该Wnt途径抑制剂系FZD8-Fc可溶性受体OMP-54F28。
本发明提供选择受试者以使用Wnt途径抑制剂进行治疗的方法，其包含：测定样本中生物标志的量，及若该生物标志的量系低于预设量，则选择该受试者以使用该Wnt途径抑制剂进行治疗。在一些实施方式中，该选择受试者以使用Wnt途径抑制剂进行治疗的方法包含：自该受试者获得生物样本、测定该样本中生物标志的量、及若该生物标志的量系低于预设量则选择该受试者以使用该Wnt途径抑制剂进行治疗。在一些实施方式中，该生物标志系骨转换标志。在一些实施方式中，该骨转换标志系骨吸收生物标志。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系β-CTX。
在一些实施方式中，该选择受试者以使用Wnt途径抑制剂进行治疗的方法包含：自该受试者获得生物样本、测定该样本中骨转换标志的量、及若该骨转换标志的量系低于预设量则选择该受试者以使用该Wnt途径抑制剂进行治疗。在一些实施方式中，该生物样本系尿液、血液、血清、或血浆。在一些实施方式中，该骨转换标志系骨吸收生物标志。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系尿中羟基脯氨酸、尿中总吡啶啉(PYD)、尿中游离脱氧吡啶啉(DPD)、尿中第1型胶原蛋白交联的N-端肽(NTX)、尿中或血清第1型胶原蛋白交联的C-端肽(CTX)、骨涎蛋白(BSP)、或抗酒石酸酸性磷酸酶5b。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系CTX或β-CTX。因此，在一些实施方式中，该选择受试者以使用Wnt途径抑制剂进行治疗的方法包含：自该受试者获得生物样本、测定该样本中β-CTX的量、及若该β-CTX的量系低于预设量则选择该受试者以使用该Wnt途径抑制剂进行治疗。
本发明提供识别受试者为适合使用Wnt途径抑制剂进行治疗的方法，其包含：测定样本中生物标志的量，及若该生物标志的量系低于预设量，则识别该受试者为适合使用该Wnt途径抑制剂进行治疗。在一些实施方式中，识别受试者为适合使用Wnt途径抑制剂进行治疗的方法包含：自该受试者获得生物样本、测定该样本中生物标志的量、及若该生物标志的量系低于预设量，则识别该受试者为适合使用该Wnt途径抑制剂进行治疗。在一些实施方式中，该生物标志系骨转换标志。在一些实施方式中，该生物标志系骨吸收生物标志。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系尿中羟基脯氨酸、尿中总吡啶啉(PYD)、尿中游离脱氧吡啶啉(DPD)、尿中第1型胶原蛋白交联的N-端肽(NTX)、尿中或血清第1型胶原蛋白交联的C-端肽(CTX)、骨涎蛋白(BSP)、或抗酒石酸酸性磷酸酶5b。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系CTX。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系β-CTX。在一些实施方式中，识别受试者为适合使用Wnt途径抑制剂进行治疗的方法包含：自该受试者获得生物样本、测定该样本中β-CTX的量、及若该β-CTX的量系低于预设量，则识别该受试者为适合使用该Wnt途径抑制剂进行治疗。
本发明亦提供监测接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者是否发展骨骼相关不良反应及/或毒性的方法，其包含：测定样本中生物标志的量、及比较该样本中生物标志的量与该生物标志的预设量，其中该生物标志的量增加显示发展骨骼相关不良反应及/或毒性。在一些实施方式中，监测接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者是否发展骨骼相关不良反应及/或毒性的方法包含：自该接受治疗的受试者获得生物样本、测定该样本中生物标志的量、及比较该样本中生物标志的量与该生物标志的预设量，其中该生物标志的量增加显示发展骨骼相关不良反应及/或毒性。在一些实施方式中，该骨骼相关不良反应及/或毒性系增加骨折风险。在一些实施方式中，该骨骼相关不良反应及/或毒性系骨量减少或骨质疏松症。在一些实施方式中，该生物标志系骨转换标志。在一些实施方式中，该生物标志系骨吸收生物标志。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系尿中羟基脯氨酸、尿中总吡啶啉(PYD)、尿中游离脱氧吡啶啉(DPD)、尿中第1型胶原蛋白交联的N-端肽(NTX)、尿中或血清第1型胶原蛋白交联的C-端肽(CTX)、骨涎蛋白(BSP)、或抗酒石酸酸性磷酸酶5b。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系CTX。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系β-CTX。在一些实施方式中，监测接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者是否发展骨骼相关不良反应及/或毒性的方法包含：自该接受治疗的受试者获得生物样本、测定该样本中β-CTX的量、及比较该样本中β-CTX的量与该β-CTX的预设量，其中β-CTX的量增加显示发展骨骼相关不良反应及/或毒性。
本发明亦提供对接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者检测骨骼相关不良反应及/或毒性发展的方法，其包含：测定样本中生物标志的量、及比较该样本中生物标志的量与该生物标志的预设量，其中该生物标志的量增加显示发展骨骼相关不良反应及/或毒性。在一些实施方式中，对接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者检测骨骼相关不良反应及/或毒性发展的方法包含：自该接受治疗的受试者获得生物样本、测定该样本中生物标志的量、及比较该样本中生物标志的量与该生物标志的预设量，其中该生物标志的量增加显示发展骨骼相关不良反应及/或毒性。在一些实施方式中，该骨骼相关不良反应及/或毒性系增加骨折风险。在一些实施方式中，该骨骼相关不良反应及/或毒性系骨量减少或骨质疏松症。在一些实施方式中，该生物标志系骨转换标志。在一些实施方式中，该生物标志系骨吸收生物标志。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系尿中羟基脯氨酸、尿中总吡啶啉(PYD)、尿中游离脱氧吡啶啉(DPD)、尿中第1型胶原蛋白交联的N-端肽(NTX)、尿中或血清第1型胶原蛋白交联的C-端肽(CTX)、骨涎蛋白(BSP)、或抗酒石酸酸性磷酸酶5b。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系CTX。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系β-CTX。在一些实施方式中，对接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者检测骨骼相关不良反应及/或毒性发展的方法包含：自该接受治疗的受试者获得生物样本、测定该样本中β-CTX的量、及比较该样本中β-CTX的量与β-CTX的预设量，其中该β-CTX的量增加显示发展骨骼相关不良反应及/或毒性。
本发明亦提供对接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者识别骨骼相关不良反应及/或毒性发展的方法，其包含：测定样本中生物标志的量、及比较该样本中生物标志的量与该生物标志的预设量，其中若该样本中生物标志的量系高于该生物标志的预设量，则显示骨骼相关不良反应及/或毒性。在一些实施方式中，对接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者识别骨骼相关不良反应及/或毒性发展的方法包含：自该接受治疗的受试者获得生物样本、测定该样本中生物标志的量、及比较该样本中生物标志的量与该生物标志的预设量，其中若该样本中生物标志的量系高于该生物标志的预设量，则显示骨骼相关不良反应及/或毒性。在一些实施方式中，该骨骼相关不良反应及/或毒性系增加骨折风险。在一些实施方式中，该骨骼相关不良反应及/或毒性系骨量减少或骨质疏松症。在一些实施方式中，该生物标志系骨转换标志。在一些实施方式中，该生物标志系骨吸收生物标志。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系尿中羟基脯氨酸、尿中总吡啶啉(PYD)、尿中游离脱氧吡啶啉(DPD)、尿中第1型胶原蛋白交联的N-端肽(NTX)、尿中或血清第1型胶原蛋白交联的C-端肽(CTX)、骨涎蛋白(BSP)、或抗酒石酸酸性磷酸酶5b。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系CTX。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系β-CTX。在一些实施方式中，对接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者识别骨骼相关不良反应及/或毒性发展的方法包含：自该接受治疗的受试者获得生物样本、测定该样本中β-CTX的量、及比较该样本中β-CTX的量与β-CTX的预设量，其中若该样本中β-CTX的量系高于β-CTX的预设量，则显示骨骼相关不良反应及/或毒性。
本发明亦提供对接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者监测骨骼相关不良反应及/或毒性发展的方法，其包含：测定样本中生物标志的量、及比较该样本中生物标志的量与该生物标志的预设量，其中若该样本中生物标志的量系高于该生物标志的预设量，则显示骨骼相关不良反应及/或毒性。在一些实施方式中，对接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者监测骨骼相关不良反应及/或毒性发展的方法包含：自该接受治疗的受试者获得生物样本、测定该样本中生物标志的量、及比较该样本中生物标志的量与该生物标志的预设量，其中若该样本中生物标志的量系高于该生物标志的预设量，则显示骨骼相关不良反应及/或毒性。在一些实施方式中，该骨骼相关不良反应及/或毒性系增加骨折风险。在一些实施方式中，该骨骼相关不良反应及/或毒性系骨量减少或骨质疏松症。在一些实施方式中，该生物标志系骨转换标志。在一些实施方式中，该生物标志系骨吸收生物标志。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系尿中羟基脯氨酸、尿中总吡啶啉(PYD)、尿中游离脱氧吡啶啉(DPD)、尿中第1型胶原蛋白交联的N-端肽(NTX)、尿中或血清第1型胶原蛋白交联的C-端肽(CTX)、骨涎蛋白(BSP)、或抗酒石酸酸性磷酸酶5b。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系CTX。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系β-CTX。在一些实施方式中，对接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者监测心脏毒性发展的方法包含：自该接受治疗的受试者获得生物样本、测定该样本中β-CTX的量、及比较该样本中β-CTX的量与β-CTX的预设量，其中若该样本中β-CTX的量系高于β-CTX的预设量，则显示骨骼相关不良反应及/或毒性。
本发明亦提供减少接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者发生骨骼相关不良反应及/或毒性的方法，其包含：测定来自受试者的样本中生物标志的量、比较该样本中生物标志的量与该生物标志的预设量，以及若该样本中生物标志的量系高于该生物标志的预设量，则对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物诸如双膦酸盐。在一些实施方式中，减少接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者发生骨骼相关不良反应及/或毒性发展的方法包含：自该接受治疗的受试者获得生物样本、测定该样本中生物标志的量、比较该样本中生物标志的量与该生物标志的预设量，以及若该样本中生物标志的量系高于该生物标志的预设量，则对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物诸如双膦酸盐。在一些实施方式中，该骨骼相关不良反应及/或毒性系增加骨折风险。在一些实施方式中，该骨骼相关不良反应及/或毒性系骨量减少或骨质疏松症。在一些实施方式中，该生物标志系骨转换标志。在一些实施方式中，该生物标志系骨吸收生物标志。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系尿中羟基脯氨酸、尿中总吡啶啉(PYD)、尿中游离脱氧吡啶啉(DPD)、尿中第1型胶原蛋白交联的N-端肽(NTX)、尿中或血清第1型胶原蛋白交联的C-端肽(CTX)、骨涎蛋白(BSP)、或抗酒石酸酸性磷酸酶5b。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系CTX。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系β-CTX。在一些实施方式中，减少接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者发生骨骼相关不良反应及/或毒性发展的方法包含：自该接受治疗的受试者获得生物样本、测定该样本中β-CTX的量、比较该样本中β-CTX的量与β-CTX的预设量、及若该样本中β-CTX的量系高于β-CTX的预设量则对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物。在一些实施方式中，该抗吸收药物系双膦酸盐。
本发明亦提供使接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者预防或减弱骨骼相关不良反应及/或毒性发展的方法，其包含：测定来自受试者的样本中生物标志的量、比较该样本中生物标志的量与该生物标志的预设量、对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物、及对该受试者投予Wnt途径抑制剂。在一些实施方式中，使接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者预防或减弱骨骼相关不良反应及/或毒性发展的方法包含：在使用Wnt途径抑制剂治疗之前，自该接受治疗的受试者获得生物样本、测定该样本中生物标志的量、比较该样本中生物标志的量与该生物标志的预设量、对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物、及对该受试者投予该Wnt途径抑制剂。在一些实施方式中，该骨骼相关不良反应及/或毒性系增加骨折风险。在一些实施方式中，该骨骼相关不良反应及/或毒性系骨量减少或骨质疏松症。在一些实施方式中，该生物标志系骨转换标志。在一些实施方式中，该生物标志系骨吸收生物标志。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系尿中羟基脯氨酸、尿中总吡啶啉(PYD)、尿中游离脱氧吡啶啉(DPD)、尿中第1型胶原蛋白交联的N-端肽(NTX)、尿中或血清第1型胶原蛋白交联的C-端肽(CTX)、骨涎蛋白(BSP)、或抗酒石酸酸性磷酸酶5b。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系CTX。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系β-CTX。在一些实施方式中，使接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者预防或减弱骨骼相关不良反应及/或毒性发展的方法包含：在使用Wnt途径抑制剂治疗之前，自该接受治疗的受试者获得生物样本、测定该样本中β-CTX的量、比较该样本中β-CTX的量与β-CTX的预设量；若该样本中β-CTX的量系高于β-CTX的预设量则对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物；及对该受试者投予该Wnt途径抑制剂。
在本文所述的方法的一些实施方式中，该预设量系在血液、血清、或血浆样本中约1500pg/ml或更低。在一些实施方式中，该预设量系在血液、血清、或血浆样本中约1200pg/ml或更低。在一些实施方式中，该预设量系在血液、血清、或血浆样本中约1000pg/ml或更低。在一些实施方式中，该预设量系在血液、血清、或血浆样本中约800pg/ml或更低。在一些实施方式中，该预设量系在血液、血清、或血浆样本中约600pg/ml或更低。在一些实施方式中，该预设量系在血液、血清、或血浆样本中约400pg/ml或更低。在β-CTX的预设量的上下文中，用语“约”系指指称的量加或减该指称量的10％。
在一些实施方式中，该生物标志(例如骨吸收生物标志或β-CTX)的预设量系该生物标志于稍早日期所获得的样本中的量。在一些实施方式中，该生物标志(例如骨吸收生物标志或β-CTX)的预设量系该生物标志于最初筛选时所获得的样本中的量。在一些实施方式中，该生物标志(例如骨吸收生物标志或β-CTX)的预设量系该生物标志于治疗前所获得的样本中的量。在一些实施方式中，该生物标志(例如骨吸收生物标志或β-CTX)的预设量系该生物标志于最初筛选时所获得的样本中的量。在一些实施方式中，该生物标志(例如骨吸收生物标志或β-CTX)的预设量系正常参考量。在一些实施方式中，该生物标志(例如骨吸收生物标志或β-CTX)的预设量系基准量。在一些实施方式中，该基准量系在最初筛选时所测定的该生物标志的量。在一些实施方式中，该基准量系在治疗前所测定的该生物标志的量。
在一些实施方式中，若该β-CTX于该样本中的量比预设量增加2倍或更高(即变为2倍或更高)，则对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物。在一些实施方式中，若该β-CTX于该样本中的量比基准量增加2倍或更高(即变为2倍或更高)，则对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物。
在本文所述的任何方法中，生物样本系于约每周、每2周、每3周、每4周、每5周、或每6周获得。
在本文所述的任何方法的一些实施方式中，受试者系利用双能量X光吸收仪(DEXA)骨密度扫描仪评估。此技术系测量骨矿物密度(BMD)最常用的测试。DEXA输出包括T得分(比较受试者与30至35岁成人的骨密度)，以及Z得分(比较受试者的骨密度与相符年龄性别族群的平均骨密度)。T得分系用于根据标准评分决定受试者是否具有骨量减少或骨质疏松症。大于-1的T得分被认为是正常的骨密度；介于-1至-2.5之间的T得分被认为是骨量减少；小于-2.5的T得分被认为是骨质疏松症；小于-2.5的T得分且发生1次以上骨质疏松性骨折被认为是严重(已成立的)骨质疏松症。在一些实施方式中，若总股骨或脊椎L1至L4的T得分降低至小于-2.5，表示具有骨骼相关不良反应及/或毒性。在一些实施方式中，若总股骨或脊椎L1至L4的T得分降低至小于-2.0，表示具有骨骼相关不良反应及/或毒性。在一些实施方式中，若总股骨或脊椎L1至L4的T得分降低至小于-1.5，表示具有骨骼相关不良反应及/或毒性。在一些实施方式中，若总股骨或脊椎L1至L4的T得分降低至小于-1.0，表示具有骨骼相关不良反应及/或毒性。
本发明亦提供使投予Wnt途径抑制剂的受试者改善骨骼相关不良反应及/或毒性发展的方法，其包含对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物。
本发明亦提供筛选受试者因Wnt途径抑制剂治疗所致的骨骼相关不良反应及/或毒性的风险的方法，其包含：测定来自该受试者的样本中生物标志的量、及比较该样本中生物标志的量与该生物标志的预设量，其中若该样本中生物标志的量系高于该生物标志的预设量，则该受试者具有发生骨骼相关不良反应及/或毒性的风险。在一些实施方式中，筛选受试者因Wnt途径抑制剂治疗所致的骨骼相关不良反应及/或毒性的风险的方法包含：在使用Wnt途径抑制剂治疗之前，自该受试者获得生物样本、测定该样本中生物标志的量、及比较该样本中生物标志的量与该生物标志的预设量，其中若该样本中生物标志的量系高于该生物标志的预设量，则该受试者具有骨骼相关不良反应及/或毒性的风险。在一些实施方式中，该骨骼相关不良反应及/或毒性系增加骨折风险。在一些实施方式中，该骨骼相关不良反应及/或毒性系骨量减少或骨质疏松症。在一些实施方式中，该生物标志系骨转换标志。在一些实施方式中，该生物标志系骨吸收生物标志。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系尿中羟基脯氨酸、尿中总吡啶啉(PYD)、尿中游离脱氧吡啶啉(DPD)、尿中第1型胶原蛋白交联的N-端肽(NTX)、尿中或血清第1型胶原蛋白交联的C-端肽(CTX)、骨涎蛋白(BSP)、或抗酒石酸酸性磷酸酶5b。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系CTX。在一些实施方式中，该骨吸收生物标志系β-CTX。在一些实施方式中，筛选受试者因Wnt途径抑制剂治疗所致的骨骼相关不良反应及/或毒性的风险的方法包含：在使用Wnt途径抑制剂治疗之前，自该受试者获得生物样本、测定该样本中β-CTX的量、及比较该样本中β-CTX的量与β-CTX的预设量，其中若该样本中β-CTX的量系高于β-CTX的预设量，则该受试者具有骨骼相关不良反应及/或毒性的风险。在一些实施方式中，该β-CTX的预设量系在最初筛选时所测定的值。在一些实施方式中，β-CTX的预设量系约400至1200pg/ml。在一些实施方式中，若该受试者具有骨骼相关不良反应及/或毒性的风险，则在使用该Wnt途径抑制剂进行治疗之前，对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物。
在本文所述的方法的一些实施方式中，该抗吸收药物系双膦酸盐。咸信双膦酸盐藉由“诱导”破骨细胞经历细胞凋亡，从而抑制骨消化，以预防骨质流失。在一些实施方式中，该双膦酸盐系选自：羟乙膦酸盐(etidronate)、氯屈膦酸盐(clodronate)、替鲁膦酸盐(tiludronate)、帕米膦酸盐(pamidronate)、奈立膦酸盐(neridronate)、奥帕膦酸盐(olpadronate)、阿仑膦酸盐(alendronate)(FOSAMAX)、伊班膦酸盐(ibandronate)(BONIVA)、利塞膦酸盐(risedronate)(ACTONEL)及唑来膦酸(zoledronicacid)(RECLAST)。在一些实施方式中，该双膦酸盐系唑来膦酸(zoledronicacid)。在一些实施方式中，该抗吸收药物剂系抗RANKL抗体迪诺单抗(denosumab)(PROLIA)。
在本文所述的任何方法中，该Wnt途径抑制剂系抗FZD抗体。在本文所述的任何方法中，该Wnt途径抑制剂系抗Wnt抗体。在本文所述的任何方法中，该Wnt途径抑制剂系FZD可溶性受体。
在本文所述的任何方法的某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系抗体，该抗体包含：(a)包含GFTFSHYTLS(SEQIDNO:1)的重链CDR1、包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQIDNO:2)的重链CDR2、及包含NFIKYVFAN(SEQIDNO:3)的重链CDR3，及(b)包含SGDNIGSFYVH(SEQIDNO:4)的轻链CDR1、包含DKSNRPSG(SEQIDNO:5)的轻链CDR2、及包含QSYANTLSL(SEQIDNO:6)的轻链CDR3。
在本文所述的任何方法的某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系包含重链可变区及轻链可变区的抗体，该重链可变区包含SEQIDNO:7，该轻链可变区包含SEQIDNO:8。
在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂包含和OMP-18R5相同的重链可变区及相同的轻链可变区序列。在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系抗体OMP-18R5。OMP-18R5系一种与人FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、及FZD8受体结合的IgG2人单克隆抗体，先前已于美国专利第7,982,013号中描述。
在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂包含与保藏于美国菌种保存中心(ATCC)的编号PTA-9541的质粒所编码的抗体相同的重链及轻链氨基酸序列。在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系由具有ATCC保藏编号PTA-9541的质粒所编码，该质粒依据布达佩斯条约的规定于2008年9月29日保藏于美国菌种保存中心(ATCC)(地址：10801UniversityBoulevard,Manassas,VA,20110)。在某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂与保藏于美国菌种保存中心(ATCC)的编号PTA-9541的质粒所编码的抗体，竞争与人FZD的特异性结合。
在本文所述的任何方法的某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系FZD可溶性受体。在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系FZD8可溶性受体，其包含SEQIDNO:20、SEQIDNO:30、或SEQIDNO:33。在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系包含SEQIDNO:20的FZD8可溶性受体。在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系包含SEQIDNO:30的FZD8可溶性受体。在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系包含SEQIDNO:33的FZD8可溶性受体。
在本文所述的任何方法的某些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系FZD-Fc可溶性受体。在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系FZD8-Fc可溶性受体。在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系FZD8-Fc可溶性受体，其包含SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、或SEQIDNO:41。在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系包含SEQIDNO:39的FZD8-Fc可溶性受体。在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系包含SEQIDNO:40的FZD8-Fc可溶性受体。在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系包含SEQIDNO:41的FZD8-Fc可溶性受体。在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系OMP-54F28。在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂不是OMP-54F28。
在一些实施方式中，该受试者罹患癌症。在一些实施方式中，该癌症系选自：肺癌、乳癌、结肠癌、结直肠癌、黑色素瘤、胰癌、胃肠癌、肾癌(renalcancer)、卵巢癌、肝癌、肝细胞癌(HCC)、子宫内膜癌、肾癌(kidneycancer)、前列腺癌、甲状腺癌、神经内分泌癌、神经胚细胞瘤、神经胶瘤、多形性神经胶质母细胞瘤、子宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝肿瘤、及头颈癌。如本文中所使用的“肺癌”系指所有肺癌，包括非小细胞肺癌(NSCLC)及小细胞肺癌(SCLC)。在某些实施方式中，该癌系血癌诸如淋巴瘤或白血病。在一些实施方式中，该癌系乳癌。在某些实施方式中，该癌系NSCLC。在某些实施方式中，该癌系卵巢癌。在某些实施方式中，该癌系胰癌。在一些实施方式中，该癌系肝癌。在某些实施方式中，该癌不是神经内分泌癌。
因此，本发明亦提供治疗癌症的方法。在一些实施方式中，该等方法包含一种对有需要治疗的受试者治疗癌症的方法，其包含：(a)对该受试者投予治疗有效量的Wnt途径抑制剂；及(b)测定来自该受试者的样本中骨吸收生物标志的量。在一些实施方式中，治疗癌症的方法包含(a)对该受试者投予治疗有效量的Wnt途径抑制剂；(b)测定来自该受试者的样本中骨吸收生物标志的量；及(c)比较该样本中骨吸收生物标志的量与该骨吸收生物标志的预设量。在一些实施方式中，治疗癌症的方法包含(a)对该受试者投予治疗有效量的Wnt途径抑制剂；(b)测定来自该受试者的样本中骨吸收生物标志的量；及(c)比较该样本中骨吸收生物标志的量与该骨吸收生物标志的预设量；其中若该样本中骨吸收生物标志的量系高于该骨吸收生物标志的预设量，则该受试者具有骨骼相关不良反应及/或毒性的风险。在一些实施方式中，治疗癌症的方法包含(a)对该受试者投予治疗有效量的Wnt途径抑制剂；(b)测定来自该受试者的样本中骨吸收生物标志的量；及(c)比较该样本中骨吸收生物标志的量与该骨吸收生物标志的预设量；其中若该样本中骨吸收生物标志的量系高于该骨吸收生物标志的预设量，则对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物。
本发明亦提供抑制肿瘤生长的方法。在一些实施方式中，该等方法包含一种对有需要抑制肿瘤生长的受试者抑制肿瘤生长的方法，其包含：(a)对该受试者投予治疗有效量的Wnt途径抑制剂；及(b)测定来自该受试者的样本中骨吸收生物标志的量。在一些实施方式中，抑制肿瘤生长的方法包含(a)对该受试者投予治疗有效量的Wnt途径抑制剂；(b)测定来自该受试者的样本中骨吸收生物标志的量；及(c)比较该样本中骨吸收生物标志的量与该骨吸收生物标志的预设量。在一些实施方式中，抑制肿瘤生长的方法包含(a)对该受试者投予治疗有效量的Wnt途径抑制剂；(b)测定来自该受试者的样本中骨吸收生物标志的量；及(c)比较该样本中骨吸收生物标志的量与该骨吸收生物标志的预设量；其中若该样本中骨吸收生物标志的量系高于该骨吸收生物标志的预设量，则该受试者具有骨骼相关不良反应及/或毒性的风险。在一些实施方式中，抑制肿瘤生长的方法包含(a)对该受试者投予治疗有效量的Wnt途径抑制剂；(b)测定来自该受试者的样本中骨吸收生物标志的量；及(c)比较该样本中骨吸收生物标志的量与该骨吸收生物标志的预设量；其中若该样本中骨吸收生物标志的量系高于该骨吸收生物标志的预设量，则对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物。
在一些实施方式中，该生物样本系体液。在一些实施方式中，该生物样本系血液、血浆、血清、或尿液。在一些实施方式中，该生物样本系静脉全血样本。在一些实施方式中，该生物样本系使用EDTA或肝素作为抗凝剂的静脉全血样本。在一些实施方式中，该生物样本系血浆样本。在一些实施方式中，该生物样本系使用EDTA或肝素作为抗凝剂的血浆样本。体液样本可利用该领域已知的任何方法取得。在一些实施方式中，该生物样本系冷冻组织样本或新鲜组织样本。
用于测量或测定样本中骨吸收生物标志(例如β-CTX)的量的检测系为本领域技术人员所公知。例如，于某些实施方式中，使用能定量测量全血或血浆样本中β-CTX量的免疫检测。于某些实施方式中，该样本含有作为抗凝血剂的EDTA。于某些实施方式中，该样本含有作为抗凝血剂的肝素。于某些实施方式中，该免疫检测包含针对β-CTX的EKAHD-β-GGR的氨基酸序列的2种高度特异性单克隆抗体，其中天冬氨酸残基系经β异构化。为得到免疫检测的特定信号，EKAHD-β-GGR的2个链必须交联。于某些实施方式中，将样本和适当对照组置于经链霉抗生物素蛋白涂覆的微滴定孔槽中，随后加入含有针对β-CTX的EKAHD-β-GGR的氨基酸序列的生物素化单克隆抗体的溶液。经培育和冲洗后，将发色底物溶液加入至微滴定孔槽中。经培育后，令反应中止。读取该微滴定孔槽的吸亮度并测定β-CTX浓度。
在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系以约0.5mg/kg的起始剂量投予。例如，抗体OMP-18R5系以5％葡萄糖水(USP)稀释至总体积250mL。OMP-18R5系经由0.22微米滤器在30分钟内以静脉输注给予。在一些实施方式中，之后的剂量系以类似的方式投予。
在本发明的另一态样中，本文中所述的方法可进一步包含投予一或多种额外的治疗剂。额外的治疗剂可于投予该Wnt途径抑制剂之前、的同时及/或之后投予。本发明亦提供包含Wnt途径抑制剂与额外治疗剂的医药组合物。在一些实施方式中，该一或多种额外治疗剂包含1、2、3或更多种额外的治疗剂。
含有至少二种治疗剂的组合疗法通常使用具有不同作用机制的剂，虽然并非必要。使用不同作用机制的剂的组合疗法可能导致加成或协同效应。组合疗法可能允许相较于单一疗法使用较低剂量的各剂，藉以减少不良反应及/或毒性。组合疗法可能增加一或两种治疗剂的治疗指数。组合疗法可能减少抗药性癌细胞发生的可能性。在一些实施方式中，组合疗法包含主要影响(例如抑制或杀灭)非肿瘤发生性细胞的治疗剂及主要影响(例如抑制或杀灭)肿瘤发生性CSC的治疗剂。因此，在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系与至少一种额外的治疗剂组合投予。在一些实施方式中，抗FZD抗体系与至少一种额外的治疗剂组合投予。在一些实施方式中，该抗FZD抗体OMP-18R5系与至少一种额外的治疗剂组合投予。在一些实施方式中，FZD可溶性受体系与至少一种额外的治疗剂组合投予。在一些实施方式中，该FZD8-Fc可溶性受体系与至少一种额外的治疗剂组合投予。
可与该Wnt途径抑制剂组合投予的治疗剂包括化学治疗剂。因此，在一些实施方式中，该方法或治疗牵涉投予本发明的Wnt途径抑制剂与化学治疗剂或多种不同化学治疗剂的鸡尾酒组合的组合。Wnt途径抑制剂(例如抗体或可溶性受体)的治疗可发生于投予化学治疗之前、的同时或之后。组合投予可包括于单一医药调制剂中共投或利用分开的调制剂共投，或以任何顺序连续投予但通常在一段期间内以使所有活性剂可同步展现彼等的生物活性。该等化学治疗剂的准备及给药方案可根据制造商的说明使用或由经验丰富的医生凭经验决定。该等化学治疗的准备及给药方案亦描述于TheChemotherapySourceBook,4thEdition,2008,M.C.Perry,Editor,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA。
可用于本发明的化学治疗剂包括但不限于：烷化剂诸如噻替派(thiotepa)及环磷酰胺(cyclophosphamide)(CYTOXAN)；烷基磺酸盐诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶诸如苯多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、甲基优瑞多巴(meturedopa)及优瑞多巴(uredopa)；伸乙亚胺(ethylenimines)及甲基三聚氰胺(methylmelamines)包括阿草特胺(altretamine)、三亚乙基三聚氰胺(triethylenemelamine)、三乙烯磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙烯硫磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)及三羟甲基三聚氰胺(trimethylolmelamime)；氮芥子气诸如氯芥苯丁酸(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、cholophosphamide、雌二醇氮芥(estramustine)、异环磷酸胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、霉法兰(melphalan)、新氮芥(novembichin)、胆甾醇苯乙酸氮芥(phenesterine)、松龙苯芥(prednimustine)、氯乙环磷酰胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥(uracilmustard)；亚硝基脲(nitrosourea)诸如卡氮芥(carmustine)、吡葡亚硝脲(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、罗氮芥(lomustine)、尼氮芥(nimustine)、雷诺氮芥(ranimustine)；抗生素诸如阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(anthramycin)、氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡利奇霉素(calicheamicin)、卡拉比辛(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、达克霉素(dactinomycin)、正定霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-羰基-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表阿霉素(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycins)、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、波弗霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链霉黑素(streptonigrin)、链脲佐菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、鸟苯美司(ubenimex)、新制癌菌素(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢剂诸如甲胺喋呤(methotrexate)及5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物诸如二甲叶酸(denopterin)、甲胺喋呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲蝶呤(trimetrexate)；嘌呤类似物诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-硫唑脲嘧啶(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、二脱氧尿苷、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄性素诸如卡鲁睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、硫雄甾醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪内酮(testolactone)；抗肾上腺剂诸如胺鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂诸如亚叶酸；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；胺基酮戊酸(aminolevulinicacid)；安吖啶(amsacrine)；贝斯特氮芥(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatrexate)；defofamine；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elformithine；依利醋铵(elliptiniumacetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(galliumnitrate)；羟基脲；香菇糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺(2,2',2"-trichlorotriethylamine)；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(Ara-C)；类紫杉醇(taxoids)例如太平洋紫杉醇(TAXOL)及多西紫杉醇(TAXOTERE)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤(mercaptopurine)；铂类似物诸如顺铂(cisplatin)及卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂(platinum)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；丝裂霉素C；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；温诺平(navelbine)；米托蒽醌(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素(daunomycin)；胺喋呤(aminopterin)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯培拉霉素(esperamicin)；卡培他滨(capecitabine)(XELODA)及上述任一剂的医药上可接受的盐、酸或衍生物。化学治疗剂亦包括用来调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素剂包括例如它莫西芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制剂4(5)-咪唑、4-羟基它莫西芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene)(FARESTON)；及抗雄性素剂诸如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、柳普林(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；及上述任一剂的医药上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方式中，该额外治疗剂系顺铂。在某些实施方式中，该额外治疗剂系卡铂。在某些实施方式中，该额外治疗剂系太平洋紫杉醇(paclitaxel)。在某些实施方式中，当该与Wnt途径抑制剂组合投予的化学治疗剂系卡铂(carboplatin)时，该经治疗的癌或肿瘤系肺癌或肺肿瘤。
在某些实施方式中，该化学治疗剂系拓扑异构酶抑制剂。拓扑异构酶抑制剂系干扰拓扑异构酶(例如拓扑异构酶I或II)的活性的化学治疗剂。拓扑异构酶抑制剂包括但不限于盐酸多柔比星(doxorubicinHCl)、柠檬酸正定霉素(daunorubicincitrate)、盐酸米托蒽醌(mitoxantroneHCl)、放线菌素D、依托泊苷(etoposide)、盐酸拓扑替康(topotecanHCl)、替尼泊苷(teniposide)(VM-26)及伊立替康(irinotecan)，以及这些任一剂的医药上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方式中，该额外治疗剂系伊立替康(irinotecan)。
在某些实施方式中，该化学治疗剂系抗代谢剂。抗代谢剂系一化学物质，其结构类似正常生化反应所需的代谢物，但仍有足够的不同处以干扰一或多种细胞正常功能，诸如细胞分裂。抗代谢剂包括但不限于吉西他滨(gemcitabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、卡培他滨(capecitabine)、甲胺喋呤钠、雷替曲塞(ralitrexed)、培美曲塞(pemetrexed)、替加氟(tegafur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosinearabinoside)、硫鸟嘌呤、5-氮杂胞苷、6-巯基嘌呤、硫唑嘌呤、6-硫鸟嘌呤、喷司他丁(pentostatin)、磷酸氟达拉滨(fludarabinephosphate)及克拉屈滨(cladribine)，以及这些任一剂的医药上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方式中，该额外治疗剂系吉西他滨。在一些实施方式中，该额外治疗剂系培美曲塞。在某些实施方式中，当该与Wnt途径抑制剂组合投予的化学治疗剂系吉西他滨时，该经治疗的癌或肿瘤系胰癌或胰肿瘤。在某些实施方式中，当该与Wnt途径抑制剂组合投予的化学治疗剂系培美曲塞时，该经治疗的癌或肿瘤系肺癌或肺肿瘤。在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系与培美曲塞和卡铂组合投予。在一些实施方式中，抗FZD抗体或FZD可溶性受体系与吉西他滨组合投予以治疗胰癌。在一些实施方式中，该抗FZD抗体OMP-18R5或该FZD8-Fc可溶性受体OMP-54F28系与吉西他滨组合投予以治疗胰癌。在一些实施方式中，抗FZD抗体或FZD可溶性受体系与吉西他滨和经白蛋白结合的太平洋紫杉醇组合投予以治疗胰癌。在一些实施方式中，该抗FZD抗体OMP-18R5或FZD8-Fc可溶性受体OMP-54F28系与吉西他滨和经白蛋白结合的太平洋紫杉醇组合投予以治疗胰癌。在一些实施方式中，抗FZD抗体或FZD可溶性受体系与卡铂和太平洋紫杉醇或经白蛋白结合的太平洋紫杉醇组合投予以治疗卵巢癌。在一些实施方式中，该抗FZD抗体OMP-18R5或FZD8-Fc可溶性受体OMP-54F28系与卡铂和太平洋紫杉醇或经白蛋白结合的太平洋紫杉醇组合投予以治疗卵巢癌。
在某些实施方式中，该化学治疗剂系抗有丝分裂剂，包括但不限于与微管蛋白结合的剂。在一些实施方式中，该剂系紫杉烷。在某些实施方式中，该剂系太平洋紫杉醇(paclitaxel)或多西紫杉醇(docetaxel)，或太平洋紫杉醇或多西紫杉醇的医药上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方式中，该剂系太平洋紫杉醇(TAXOL)、多西紫杉醇(TAXOTERE)、白蛋白结合型太平洋紫杉醇(ABRAXANE)、DHA-太平洋紫杉醇或PG-太平洋紫杉醇。在某些替代性实施方式中，该抗有丝分裂剂包含长春花生物碱，诸如长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)或长春地辛(vindesine)或其医药上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方式中，该抗有丝分裂剂系驱动蛋白(kinesin)Eg5的抑制剂或有丝分裂激酶诸如AuroraA或Plk1的抑制剂。在某些实施方式中，当该与Wnt途径抑制剂组合投予的化学治疗剂系抗有丝分裂剂时，该经治疗的癌或肿瘤系乳癌或乳房肿瘤。在一些实施方式中，抗FZD抗体或FZD可溶性受体系与太平洋紫杉醇或经白蛋白结合的太平洋紫杉醇组合投予以治疗乳癌。在一些实施方式中，该抗FZD抗体OMP-18R5或FZD8-Fc可溶性受体OMP-54F28系与太平洋紫杉醇或经白蛋白结合的太平洋紫杉醇组合投予以治疗乳癌。在某些实施方式中，当该与Wnt途径抑制剂组合投予的化学治疗剂系抗有丝分裂剂时，该经治疗的癌或肿瘤系肺癌。在一些实施方式中，抗FZD抗体或FZD可溶性受体系与多西紫杉醇组合投予以治疗肺癌。在一些实施方式中，该抗FZD抗体OMP-18R5或FZD8-Fc可溶性受体OMP-54F28系与多西紫杉醇组合投予以治疗肺癌。
在一些实施方式中，额外治疗剂包含诸如小分子的剂。举例来说，治疗可涉及组合投予本发明的Wnt途径抑制剂(例如抗体)与作为其他肿瘤相关性蛋白质的抑制剂的小分子，其他肿瘤相关性蛋白质包括但不限于EGFR、ErbB2、HER2及/或VEGF。在某些实施方式中，该额外治疗剂系抑制蛋白激酶的小分子。在某些实施方式中，该额外治疗剂系抑制酪氨酸蛋白激酶的小分子。在一些实施方式中，抗FZD抗体或FZD可溶性受体系与蛋白激酶抑制剂(例如索拉非尼(sorafenib))组合投予以治疗肝癌(例如HCC)。在一些实施方式中，该抗FZD抗体OMP-18R5或该FZD8-Fc可溶性受体OMP-54F28系与蛋白激酶抑制剂(例如索拉非尼)组合投予以治疗肝癌(例如HCC)。在某些实施方式中，该额外治疗剂系抑制癌干细胞途径的小分子。在一些实施方式中，该额外治疗剂系缺口途径的小分子抑制剂。在一些实施方式中，该额外治疗剂系Wnt途径的小分子抑制剂。在一些实施方式中，该额外治疗剂系BMP途径的小分子抑制剂。在一些实施方式中，该额外治疗剂系抑制β-连环蛋白信号传导的小分子。
在一些实施方式中，额外治疗剂包含生物性分子例如抗体。举例来说，治疗可涉及组合投予本发明的Wnt途径抑制剂(例如抗体)与拮抗其他肿瘤相关性蛋白质的其他抗体，包括但不限于与EGFR、ErbB2、HER2及/或VEGF结合的抗体。在某些实施方式中，该额外治疗剂系抗癌干细胞标志抗体的抗体。在一些实施方式中，该额外治疗剂系与缺口途径的成份结合的抗体。在一些实施方式中，该额外治疗剂系与Wnt途径的成份结合的抗体。在某些实施方式中，该额外治疗剂系抑制癌干细胞途径的抗体。在一些实施方式中，该额外治疗剂系缺口途径的抗体抑制剂。在一些实施方式中，该额外治疗剂系Wnt途径的抗体抑制剂。在一些实施方式中，该额外治疗剂系BMP途径的抗体抑制剂。在一些实施方式中，该额外治疗剂系抑制β-连环蛋白信号传导的抗体。在某些实施方式中，该额外治疗剂系血管生成抑制剂或调节剂的抗体(例如抗VEGF或VEGF受体抗体)。在某些实施方式中，该额外治疗剂系贝伐珠单抗(bevacizumab)(AVASTIN)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(HERCEPTIN)、帕尼单抗(panitumumab)(VECTIBIX)或西妥昔单抗(cetuximab)(ERBITUX)。组合投予可包括于单一医药调制剂中共投或利用分开的调制剂共投，或以任何顺序连续投予但通常在一段期间内以使所有活性剂可同步展现其生物活性。
另外，以本文所述的Wnt途径抑制剂治疗可包括与其他生物分子组合治疗，例如一或多种细胞介素(例如淋巴介质、介白素、肿瘤坏死因子及/或生长因子)，或可伴随手术移除肿瘤、癌细胞或任何其他医师认为必要的治疗。
将了解的是，Wnt途径抑制剂与额外治疗剂的组合可以任何顺序投予或同时投予。在一些实施方式中，该Wnt途径抑制剂系经投予至已先接受第二治疗剂治疗的受试者。在某些其他实施方式中，该Wnt途径抑制剂与第二治疗剂系经实质上同步或同时投予。举例来说，受试者可能在接受第二治疗剂(例如化学治疗)的疗程时被给予Wnt途径抑制剂(例如抗体)。在某些实施方式中，Wnt途径抑制剂系于接受第二治疗剂治疗的一年内被投予。在某些替代性实施方式中，Wnt途径抑制剂系于接受第二治疗剂的任何治疗的10、8、6、4或2个月内被投予。在某些其他实施方式中，Wnt途径抑制剂系于接受第二治疗剂的任何治疗的4、3、2、或1周内被投予。在一些实施方式中，Wnt途径抑制剂系于接受第二治疗剂的任何治疗的5、4、3、2或1天内被投予。将另外了解的是，该二(或多)种剂或治疗可在数小时或数分钟内(即实质上同步)被投予至受试者。
如该领域的技术人员所知，投予任何治疗剂可能导致不良反应及/或毒性。在一些情况中，不良反应及/或毒性非常严重以至于无法投予治疗有效剂量的特定剂。在一些情况中，药物治疗必须中断，并尝试其他剂。然而，许多相同治疗类别的剂通常展现类似的不良反应及/或毒性，表示受试者必须停止治疗，或可能的话忍受与该治疗剂有关的不适不良反应。
治疗剂的不良反应可能包括但不限于麻疹、皮肤红疹、发痒、恶心、呕吐、食欲减低、下痢、畏寒、发烧、疲倦、肌肉痛、头痛、低血压、高血压、低血钾、低血球数、出血及心脏问题。
因此，在一些实施方式中，本文所述的方法包括使用间歇性给药方案，其可能减少与投予Wnt途径抑制剂有关的不良反应及/或毒性。如本文中所使用的“间歇性投药”系指投药间隔超过每周一次的投药方案，例如每2周投药一次、每3周一次、每4周一次、等。在一些实施方式中，治疗受试者的方法包含根据间歇性投药方案对该受试者投予有效剂量的Wnt途径抑制剂(例如抗FZD抗体或FZD可溶性受体)。在一些实施方式中，该方法包含根据间歇性投药方案对该受试者投予有效剂量的Wnt途径抑制剂(例如抗FZD抗体或FZD可溶性受体)，并增加该Wnt途径抑制剂的治疗指数。在一些实施方式中，该间歇性投药方案包含对该受试者投予初始剂量的Wnt途径抑制剂，接着以大约每2周一次投予该Wnt途径抑制剂的后续剂量。在一些实施方式中，该间歇性投药方案包含对该受试者投予初始剂量的Wnt途径抑制剂，接着以大约每3周一次投予该Wnt途径抑制剂的后续剂量。在一些实施方式中，该间歇性投药方案包含对该受试者投予初始剂量的Wnt途径抑制剂，接着以大约每4周一次投予该Wnt途径抑制剂的后续剂量。
在一些实施方式中，间歇性投药方案中的后续剂量系大约与初始剂量相同或少于的量。在其他实施方式中，该后续剂量的量系高于该初始剂量。如该领域的技术人员所知，使用的剂量将视所欲达成的临床目标而异。在一些实施方式中，该初始剂量系约0.25mg/kg至约20mg/kg。在一些实施方式中，该初始剂量系约0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mg/kg。在某些实施方式中，该初始剂量系约0.5mg/kg。在某些实施方式中，该初始剂量系约1mg/kg。在某些实施方式中，该初始剂量系约2.5mg/kg。在某些实施方式中，该初始剂量系约5mg/kg。在某些实施方式中，该初始剂量系约7.5mg/kg。在某些实施方式中，该初始剂量系约10mg/kg。在某些实施方式中，该初始剂量系约12.5mg/kg。在某些实施方式中，该初始剂量系约15mg/kg。在某些实施方式中，该初始剂量系约20mg/kg。在一些实施方式中，该后续剂量系约0.25mg/kg至约20mg/kg。在某些实施方式中，该后续剂量系约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mg/kg。在某些实施方式中，该后续剂量系约0.5mg/kg。在某些实施方式中，该后续剂量系约1mg/kg。在某些实施方式中，该后续剂量系约2.5mg/kg。在某些实施方式中，该后续剂量系约5mg/kg。在一些实施方式中，该后续剂量系约7.5mg/kg。在一些实施方式中，该后续剂量系约10mg/kg。在一些实施方式中，该后续剂量系约12.5mg/kg。在一些实施方式中，该后续剂量系约15mg/kg。在一些实施方式中，该后续剂量系约20mg/kg。
在一些实施方式中，该间歇性投药方案包含：(a)对受试者投予约2.5mg/kg的Wnt途径抑制剂的初始剂量及(b)每2周投予一次约2.5mg/kg的后续剂量。在一些实施方式中，该间歇性投药方案包含：(a)对受试者投予约5mg/kg的Wnt途径抑制剂的初始剂量及(b)每2周投予一次约5mg/kg的后续剂量。在一些实施方式中，该间歇性投药方案包含：(a)对受试者投予约2.5mg/kg的Wnt途径抑制剂的初始剂量及(b)每3周投予一次约2.5mg/kg的后续剂量。在一些实施方式中，该间歇性投药方案包含：(a)对受试者投予约5mg/kg的Wnt途径抑制剂的初始剂量及(b)每3周投予一次约5mg/kg的后续剂量。在一些实施方式中，该间歇性投药方案包含：(a)对受试者投予约10mg/kg的Wnt途径抑制剂的初始剂量及(b)每3周投予一次约10mg/kg的后续剂量。在一些实施方式中，该间歇性投药方案包含：(a)对受试者投予约15mg/kg的Wnt途径抑制剂的初始剂量及(b)每3周投予一次约15mg/kg的后续剂量。在一些实施方式中，该间歇性投药方案包含：(a)对受试者投予约20mg/kg的Wnt途径抑制剂的初始剂量及(b)每3周投予一次约20mg/kg的后续剂量。在一些实施方式中，该间歇性投药方案包含：(a)对受试者投予约2.5mg/kg的Wnt途径抑制剂的初始剂量及(b)每4周投予一次约2.5mg/kg的后续剂量。在一些实施方式中，该间歇性投药方案包含：(a)对受试者投予约5mg/kg的Wnt途径抑制剂的初始剂量及(b)每4周投予一次约5mg/kg的后续剂量。在某些实施方式中，该初始剂量与维持剂量不同，例如初始剂量系约5mg/kg，后续剂量系约2.5mg/kg。在某些实施方式中，间歇性投药方案可能包含负荷剂量，例如初始剂量系约20mg/kg，后续剂量系每2周、每3周或每4周投予一次约2.5mg/kg或约5mg/kg。
在本文所述的方法的一些实施方式中，治疗癌的方法包含对需要治疗的受试者投予治疗有效量的OMP-18R5，剂量为(a)约每一至二周至少约0.5mg/kg，或(b)约每三周至少约1.0mg/kg。在一些实施方式中，治疗癌的方法包含对需要治疗的受试者投予治疗有效量的OMP-18R5，剂量为约每一至二周约0.5mg/kg至约1.0mg/kg。在一些实施方式中，治疗癌的方法包含对需要治疗的受试者投予治疗有效量的OMP-18R5，剂量为约每三周约1.0mg/kg至约10.0mg/kg。在一些实施方式中，治疗癌的方法包含对需要治疗的受试者投予治疗有效量的OMP-18R5，剂量为约每三周约10mg/kg至约20.0mg/kg。
在某些实施方式中，治疗人病患的癌症的方法包含每3周一次对该病患投予一剂量的Wnt途径抑制剂，且重复此投药总共3、4、5、6、7、8、或更多个循环。在某些实施方式中，治疗人病患的癌症的方法包含每3周一次对该病患投予一约10mg/kg剂量的Wnt途径抑制剂，且重复此投药总共3、4、5、6、7、8、或更多个循环。在某些实施方式中，治疗人病患的癌症的方法包含每3周一次对该病患投予一约15mg/kg剂量的Wnt途径抑制剂，且重复此投药总共3、4、5、6、7、8、或更多个循环。在某些实施方式中，治疗人病患的癌症的方法包含每3周一次对该病患投予一约20mg/kg剂量的Wnt途径抑制剂，且重复此投药总共3、4、5、6、7、8、或更多个循环。在一些实施方式中，该投予系重复4个循环。在一些实施方式中，该投予系重复5个循环。在一些实施方式中，该投予系重复6个循环。在一些实施方式中，该投予系重复7个循环。在一些实施方式中，该投予系重复8个循环。
本发明的另一方面关于减少Wnt途径抑制剂于人受试者的毒性的方法，该方法包含利用间歇性投药方案对该受试者投予Wnt途径抑制剂。本发明的另一方面关于减少Wnt途径抑制剂于人受试者的不良反应的方法，该方法包含利用间歇性投药方案对该受试者投予Wnt途径抑制剂。本发明的另一方面关于增加Wnt途径抑制剂于人受试者的治疗指数的方法，该方法包含利用间歇性投药方案对该受试者投予Wnt途径抑制剂。
选择初始及后续剂量的递送方法系根据受试者耐受Wnt途径抑制剂导入体内的能力而定。因此，在本文所述的任何方面/或实施方式中，Wnt途径抑制剂的投予可能藉由静脉注射或经静脉投予。在一些实施方式中，该投予系藉由静脉输注。在本文所述的任何方面/或实施方式中，Wnt途径抑制剂的投予可能藉由非静脉途径投予。
在某些实施方式中，该治疗涉及投予本发明的Wnt途径抑制剂(例如抗体)与放射治疗的组合。使用Wnt途径抑制剂治疗可发生于投予放射治疗之前、的同时或之后。该放射治疗的投予方案可由经验丰富的医生决定。
本揭示内容的实施方式可进一步参照下列非限制性实例定义，其叙述使用Wnt途径抑制剂以治疗癌症。该领域的技术人员将显而易见的是，许多在材料及方法上的调整可加以实施而不背离本发明的范围。
实施例1
于乳房异种移植模型中间歇性投予抗FZD抗体OMP-18R5及对肿瘤生长的功效
将UM-PE13乳房肿瘤细胞(20,000细胞)经皮下注射至6至8周大NOD/SCID小鼠。将动物随机分组(n＝10只/组)并经抗FZD抗体OMP-18R5与紫杉醇(Taxol)的组合处理及单独经紫杉醇处理。每周投予紫杉醇(10mg/kg)且每3周投予OMP-18R5剂量5、10、25或45mg/kg一次。该等药剂经腹膜内投予。于指定日期使用电子测径器测量肿瘤体积。
如图1所示，每3周投予OMP-18R5与紫杉醇的组合于如此低剂量5mg/kg或10mg/kg下能有效地降低PE-13肿瘤生长。该肿瘤生长抑制作用大于每周单独投予紫杉醇所观察到的肿瘤生长抑制作用。较高剂量的OMP-18R5(25mg/kg和45mg/kg)与紫杉醇的组合更能较大地抑制肿瘤生长且于后期时点观察到肿瘤消退。此等结果证实使用间歇性给药摄取方式能维持抗FZD抗体与化学治疗剂(诸如紫杉醇)组合治疗的功效。
实施例2
间歇性投予抗FZD抗体OMP-18R5对骨生成的功效
将UM-PE13乳房肿瘤细胞(20,000细胞)经皮下注射至6至8周大NOD/SCID小鼠。将动物随机分组(n＝10只/组)并经抗FZD抗体OMP-18R5与紫杉醇(Taxol)的组合处理及单独经紫杉醇处理。每周投予紫杉醇(15mg/kg)一次且每4周、每2周或每周投予OMP-18R5(25mg/kg)一次。该等药剂经腹膜内投予。于指定日期使用电子测径器测量肿瘤体积。
如图2所示，每周一次、每2周一次及每4周一次投予OMP-18R5(25mg/kg)与紫杉醇的组合能有效地降低PE-13肿瘤生长。投予OMP-18R5与紫杉醇的组合的肿瘤生长抑制作用大于单独投予紫杉醇所观察到的肿瘤生长抑制作用。
于第77天给药结束时，对经OMP-18R5处理的小鼠和经紫杉醇单独处理的对照组小鼠比较评估小梁骨生成。
自对照组小鼠和经OMP-18R5处理的小鼠的胫骨制备组织切片并经苏木素和伊红(H&E)染色。白色箭头所标记的淡粉红色染色区对应小梁骨。
如图3所示，每2周一次投予OMP-18R5(25mg/kg)比每周一次投予OMP-18R5(25mg/kg)更能减少骨流失。重要地，每4周一次投予OMP-18R5(25mg/kg)于骨生成上并未显现可观察到的功效。
实施例3
唑来膦酸(zoledronicacid)于降低OMP-18R5对骨生成的功效的效果
将NOD/SCID小鼠随机分组(n＝5只/组)并经抗FZD抗体OMP-18R5处理或经OMP-18R5与唑来膦酸的组合处理。小鼠仅于第1和15天经OMP-18R5(20mg/kg)处理或于第1和15天经OMP-18R5(20mg/kg)和于第1天经唑来膦酸(单一第IV剂量100ug/kg)组合处理。于第29天给药结束时，比较经单独OMP-18R5处理的小鼠的股骨和胫骨与经OMP-18R5与唑来膦酸组合处理的小鼠和经对照组抗体处理的小鼠的股骨和胫骨。
如实施例2所描述的方式，制备股骨和胫骨的组织切片。
如图4所示，与经对照组抗体处理的小鼠相比较，对经OMP-18R5处理的小鼠投予单一第IV剂量的唑来膦酸导致软骨下骨生成。额外的研究已证实共同投予唑来膦酸并不影响OMP-18R5的抗肿瘤功效。此等数据支持该假设：投予双磷酸盐可保护性对抗Wnt抑制作用的分解代谢作用，提供能维持骨完整性并能标靶Wnt路径的益处的途径。
实施例4
OMP-18R5对罹患实体肿瘤的病患的第1a期研究
本研究系OMP-18R5对罹患实体肿瘤的病患的开放标记性第1a期剂量累增性研究，其中不继续存在标准治愈性治疗且不存在经证实具有存活益处的治疗。本研究的主要目标系测定OMP-18R5的安全性和最大容忍剂量。第2目标系测定OMP-18R5的致免疫速率、初期功效及药效动力学。
令该试验的起初阶段的病患经OMP-18R5的给药摄取处理：每周0.5mg/kg(n＝3)和每周1.0mg/kg(n＝5)。于接受研究药物达约100天之后，接受每周一次0.5mg/kg的一位病患的前肋骨和腰椎发生骨折。因此，于此试验的现行阶段(研究持续进行且病患依然登录)中，使用较不频繁给药。特定地，剂量为每2周一次0.5mg/kg(n＝3)和每3周一次1mg/kg(n＝4)、2.5mg/kg(n＝3)、5mg/kg(n＝3)、10mg/kg(n＝3)、15mg/kg(n＝5)及20mg/kg(n＝5)(2014年1月10日)。至第28天，3个受试者的多个群经处理并评估剂量限制性毒性(DLT)。若3个受试者中无病患显现DLT，则进行累增至下一个剂量群。若3个受试者中1位病患显现DLT，则3个额外的受试者经处理。若2或多个受试者显现DLT，则无其他受试者接受该剂量且3个额外的受试者加入前一剂量群，除非6个受试者业已经该剂量处理。于第56天进行肿瘤评估且随后每隔56天进行肿瘤评估。于第56天罹患稳定疾病或产生反应的病患将被允许持续接受OMP-18R5直至疾病进展。
在一位病患历经骨骼相关(骨折)事件后，使用得自首8位病患的样本以测量4种骨代谢指标：骨特异性碱性磷酸酶、原胶原第1型N端前肽(P1NP)、骨钙化素及胶原第1型交联性C-端肽(β-CTX)。虽然于治疗期间未发现骨特异性碱性磷酸酶、P1NP及骨钙化素发生变化，但是具有至少一个随后值的所有7个受试者皆观察到β-CTX增加(表1；增加的β-CTX值系标记底线)。
表1
因此，β-CTX似乎是OMP-18R5对骨的功效的早期敏感性生物标志。
基于起初的第1a期研究结果，修改研究计划书以包括经由DEXA骨密度扫描、骨扫描及测量骨代谢生物标志骨特异性碱性磷酸酶、P1NP、骨钙化素及β-CTX以监测骨骼相关副作用及/或毒性。经修改的计划书亦包括处理骨骼相关副作用及/或毒性的策略。显现至少扫描值β-CTX值倍增或于全股骨或L1-L4DEXA扫描测量的T分数下降至低于-2.5的任何病患将被投予抗吸收药剂，特别是该双磷酸盐唑来膦酸。于该β-CTX值倍增或T分数下降的时点，经静脉内投予唑来膦酸(剂量5mg)。
表2显示26位病患的结果(2014年1月10日)，该等病患随后登录并经较低频率投予(即间歇性给药)OMP-18R5处理(至少为2倍基础值的β-CTX值系经底线标记且星号表示投予唑来膦酸时)。
表2
于2013年1月时点，首10位额外病患(病患9至18)中仅有2位显现β-CTX值倍增(病患10自基础值306至第84天的664且病患16自基础值386至第28天的805)。于2014年1月10日时点，26位额外病患(病患9至34)中有9位显现β-CTX值倍增。此等数据建议：于所研究的剂量下，较低频率投予OMP-18R5导致β-CTX值较少上升和较低的骨毒性。依据经修改的计划书，对病患10经静脉内投予唑来膦酸(剂量5mg)。经投予唑来膦酸后，该β-CTX值返回至约基础值，第112天为270且于随后的测量维持于约该值。因β-CTX值倍增，病患16亦接受唑来膦酸且经治疗后其β-CTX值亦返回至基础值。因β-CTX值倍增，病患12接受唑来膦酸且随后其β-CTX值返回至基础值的约1/3。病患16、19、23、24、26及28皆经唑来膦酸处理且随后其β-CTX值下降。此等数据建议：唑来膦酸阻断及/或抑制OMP-18R5的骨吸收性且可用于减轻此骨骼相关副作用。
于2013年1月时点，本研究所登录的所有病患于经OMP-18R5治疗时皆未显现经DEXA扫描(T分数)的骨矿物质密度(BMD)的显著变化(表3)。于2014年1月10日时点，本研究所登录的所有病患于经OMP-18R5治疗时皆未显现经DEXA扫描(T分数)的BMD的显著变化(表2)。
表3
此等数据建议：骨质疏松病患可经OMP-18R5治疗且未有发生骨矿物质密度进一步下降的显著风险。再者，证实β-CTX似乎是因使用Wnt途径抑制剂进行治疗所导致的骨骼相关副作用及/或毒性的早期敏感性生物标志。最后，本研究已显示伴随OMP-18R5治疗的骨骼相关副作用似乎是可管理且可逆转的。
实施例5
OMP-54F28对罹患实体肿瘤的病患的第1a期研究
本研究系OMP-54F28对罹患实体肿瘤的病患的开放标记性第1a期剂量累增性研究，其中不继续存在标准治愈性治疗。本研究的主要目标系测定OMP-54F28的安全性和最大容忍剂量。第2目标系测定OMP-54F28的致免疫速率、初期功效及药效动力学。
令该试验的起初阶段的病患经OMP-54F28的给药摄取处理：每3周一次0.5mg/kg(n＝3)、1.0mg/kg(n＝3)、2.5mg/kg(n＝3)、5mg/kg(n＝5)、10mg/kg(n＝3)、15mg/kg(n＝3)及20mg/kg(n＝5)。本研究持续进行且病患依然登录。至第28天，3个受试者的多个群经处理并评估剂量限制性毒性(DLT)。若3个受试者中无病患显现DLT，则进行累增至下一个剂量群。若3个受试者中1位病患显现DLT，则3个额外的受试者经处理。若2或多个受试者显现DLT，则无其他受试者接受该剂量且3个额外的受试者加入前一剂量群，除非6个受试者业已经该剂量处理。于第56天进行肿瘤评估且随后每隔56天进行肿瘤评估。于第56天罹患稳定疾病或产生反应的病患将被允许持续接受OMP-54F28直至疾病进展。
基于第1期OMP-18R5研究所获得的结果，显现至少扫描值β-CTX值倍增或于全股骨或L1-L4DEXA扫描测量的T分数下降至低于-2.5的任何病患将被投予唑来膦酸。于该β-CTX值倍增或T分数下降的时点，经静脉内投予唑来膦酸(剂量5mg)。
表4显示首6位病患的结果(2013年1月)，该等病患经登录并经每3周一次OMP-54F28处理(至少为2倍基础值的β-CTX值系经底线标记)。
表4
表5显示首25位病患的结果(2014年1月9日)，该等病患经登录并经每3周一次OMP-54F28处理(至少为2倍基础值的β-CTX值系经底线标记且星号表示投予唑来膦酸时)。
表5
于2013年1月时点，病患2显现β-CTX值倍增(自基础值538至第42天的1122。该病患的疾病进展且中止使用OMP-54F28进行治疗。于2014年1月9日时点，25位病患中有5位显现β-CTX值倍增。病患3、16、21及28经唑来膦酸处理且随后其β-CTX值降低至基础值或低于基础值。如同经OMP-18R5处理所观察到的结果，此等初期数据建议：每3周一次经剂量0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg及20mg/kg的OMP-54F28处理能导致β-CTX值较少上升和较低的骨毒性。此等经OMP-54F28处理的早期结果进一步证实：伴随使用Wnt途径抑制剂进行治疗的骨骼相关副作用似乎是可管理且为合理的缓和策略。
应了解此处所描述的实施例及实施方式仅供说明示范的目的，各种对于彼等的修饰或改变将由该领域的技术人员建议且将被纳入本申请案的精神与范围内。
本说明书所引用的所有文献、专利及专利申请案系为相同内容的所有目的全部并入本文作为参考，如同每一各别文献、专利或专利申请案被特定且个别地指明并入作为参考。
下述系本申请案所揭露的序列：
OMP-18R5重链CDR1(SEQIDNO:1)
GFTFSHYTLS
OMP-18R5重链CDR2(SEQIDNO:2)
VISGDGSYTYYADSVKG
OMP-18R5重链CDR3(SEQIDNO:3)
NFIKYVFAN
OMP-18R5轻链CDR1(SEQIDNO:4)
SGDNIGSFYVH
OMP-18R5轻链CDR2(SEQIDNO:5)
DKSNRPSG
OMP-18R5轻链CDR3(SEQIDNO:6)
QSYANTLSL
OMP-18R5重链可变区氨基酸序列(SEQIDNO:7)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYTLSWVRQAPGKGLEWVSVISGDGSYTYYADSVKGRFTISSDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNFIKYVFANWGQGTLVTVSS
OMP-18R5轻链可变区氨基酸序列(SEQIDNO:8)
DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNIGSFYVHWYQQKPGQAPVLVIYDKSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSYANTLSLVFGGGTKLTVLG
OMP-18R5具有底线划记的预测的信号序列的重链氨基酸序列(SEQIDNO:9)
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYTLSWVRQAPGKGLEWVSVISGDGSYTYYADSVKGRFTISSDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNFIKYVFANWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLeiPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
OMP-18R5具有底线划记的预测的信号序列的轻链氨基酸序列(SEQIDNO:10)
MAWALLLLTLLTQGTGSWADIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNIGSFYVHWYQQKPGQAPVLVIYDKSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSYANTLSLVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
OMP-18R5不具有预测的信号序列的重链氨基酸序列(SEQIDNO:11)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYTLSWVRQAPGKGLEWVSVISGDGSYTYYADSVKGRFTISSDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNFIKYVFANWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
OMP-18R5不具有预测的信号序列的轻链氨基酸序列(SEQIDNO:12)
DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNIGSFYVHWYQQKPGQAPVLVIYDKSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSYANTLSLVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
不具有预测的信号序列的人FZD1Fri结构域氨基酸序列(SEQIDNO:13)
QQPPPPPQQQQSGQQYNGERGISVPDHGYCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSAELKFFLCSMYAPVCTVLEQALPPCRSLCERA,RQGCEALMNKFGFQWPDTLKCEKFPVHGAGELCVGQNTSDKGT
不具有预测的信号序列的人FZD2Fri结构域氨基酸序列(SEQIDNO:14)
QFHGEKGISIPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLEQAIPPCRSICERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCEHFPRHGAEQICVGQNHSEDG
不具有预测的信号序列的人FZD3Fri结构域氨基酸序列(SEQIDNO:15)
HSLFSCEPITLRMCQDLPYNTTFMPNLLNHYDQQTAALAMEPFHPMVNLDCSRDFRPFLCALYAPICMEYGRVTLPCRRLCQRAYSECSKLMEMFGVPWPEDMECSRFPDCDEPYPRLVDL
不具有预测的信号序列的人FZD4Fri结构域氨基酸序列(SEQIDNO:16)
FGDEEERRCDPIRISMCQNLGYNVTKMPNLVGHELQTDAELQLTTFTPLIQYGCSSQLQFFLCSVYVPMCTEKINIPIGPCGGMCLSVKRRCEPVLKEFGFAWPESLNCSKFPPQNDHNHMCMEGPGDEEV
不具有预测的信号序列的人FZD5Fri结构域氨基酸序列(SEQIDNO:17)
ASKAPVCQEITVPMCRGIGYNLTHMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLRFFLCSMYTPICLPDYHKPLPPCRSVCERAKAGCSPLMRQYGFAWPERMSCDRLPVLGRDAEVLCMDYNRSEATT
不具有预测的信号序列的人FZD6Fri结构域氨基酸序列(SEQIDNO:18)
HSLFTCEPITVPRCMKMAYNMTFFPNLMGHYDQSIAAVEMEHFLPLANLECSPNIETFLCKAFVPTCIEQIHVVPPCRKLCEKVYSDCKKLIDTFGIRWPEELECDRLQYCDETVPVTFDPHTEFLG
不具有预测的信号序列的人FZD7Fri结构域氨基酸序列(SEQIDNO:19)
QPYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEICVGQNTSDGSG
不具有预测的信号序列的人FZD8Fri结构域氨基酸序列(SEQIDNO:20)
ASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDLTT
不具有预测的信号序列的人FZD9Fri结构域氨基酸序列(SEQIDNO:21)
LEIGRFDPERGRGAAPCQAVEIPMCRGIGYNLTRMPNLLGHTSQGEAAAELAEFAPLVQYGCHSHLRFFLCSLYAPMCTDQVSTPIPACRPMCEQARLRCAPIMEQFNFGWPDSLDCARLPTRNDPHALCMEAPENA
不具有预测的信号序列的人FZD10Fri结构域氨基酸序列(SEQIDNO:22)
ISSMDMERPGDGKCQPIEIPMCKDIGYNMTRMPNLMGHENQREAAIQLHEFAPLVEYGCHGHLRFFLCSLYAPMCTEQVSTPIPACRVMCEQARLKCSPIMEQFNFKWPDSLDCRKLPNKNDPNYLCMEAPNNG
人FZD1氨基酸116-227(SEQIDNO:23)
CQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSAELKFFLCSMYAPVCTVLEQALPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPDTLKCEKFPVHGAGELC
人FZD2氨基酸39-150(SEQIDNO:24)
CQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLEQAIPPCRSICERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCEHFPRHGAEQIC
人FZD3氨基酸28-133(SEQIDNO:25)
CEPITLRMCQDLPYNTTFMPNLLNHYDQQTAALAMEPFHPMVNLDCSRDFRPFLCALYAPICMEYGRVTLPCRRLCQRAYSECSKLMEMFGVPWPEDMECSRFPDC
人FZD4氨基酸48-161(SEQIDNO:26)
CDPIRISMCQNLGYNVTKMPNLVGHELQTDAELQLTTFTPLIQYGCSSQLQFFLCSVYVPMCTEKINIPIGPCGGMCLSVKRRCEPVLKEFGFAWPESLNCSKFPPQNDHNHMC
人FZD5氨基酸33-147(SEQIDNO:27)
CQEITVPMCRGIGYNLTHMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLRFFLCSMYTPICLPDYHKPLPPCRSVCERAKAGCSPLMRQYGFAWPERMSCDRLPVLGRDAEVLC
人FZD6氨基酸24-129(SEQIDNO:28)
CEPITVPRCMKMAYNMTFFPNLMGHYDQSIAAVEMEHFLPLANLECSPNIETFLCKAFVPTCIEQIHVVPPCRKLCEKVYSDCKKLIDTFGIRWPEELECDRLQYC
人FZD7氨基酸49-160(SEQIDNO:28)
CQPISIPLCTDIAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEIC
人FZD8氨基酸35-148(SEQIDNO:30)
CQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLC
人FZD9氨基酸39-152(SEQIDNO:31)
CQAVEIPMCRGIGYNLTRMPNLLGHTSQGEAAAELAEFAPLVQYGCHSHLRFFLCSLYAPMCTDQVSTPIPACRPMCEQARLRCAPIMEQFNFGWPDSLDCARLPTRNDPHALC
人FZD10氨基酸34-147(SEQIDNO:32)
CQPIEIPMCKDIGYNMTRMPNLMGHENQREAAIQLHEFAPLVEYGCHGHLRFFLCSLYAPMCTEQVSTPIPACRVMCEQARLKCSPIMEQFNFKWPDSLDCRKLPNKNDPNYLC
不具有预测的信号序列的人FZD8Fri结构域氨基酸序列(变体)(SEQIDNO:33)
ASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDL
人IgG1Fc区(SEQIDNO:34)
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQTNTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG1Fc区(变体)(SEQIDNO:35)
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG1Fc区(SEQIDNO:36)
KSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG1Fc区(SEQIDNO:37)
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG2Fc区(SEQIDNO:38)
CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
FZD8-Fc变体54F03氨基酸序列(不具有预测的信号序列)(SEQIDNO:39)
ASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDLTTGRADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
FZD8-Fc变体54F16、54F17、54F18、54F23、54F25、54F27、54F29、54F31及54F34氨基酸序列(不具有预测的信号序列)(SEQIDNO:40)
ASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDLTTKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
FZD8-Fc变体54F19、54F20、54F24、54F26、54F28、54F30、54F32、54F34及54F35氨基酸序列(不具有预测的信号序列)(SEQIDNO:41)
ASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDLTTEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
具有信号序列的FZD8-Fc变体54F03氨基酸序列(SEQIDNO:42)
MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGAAAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDLTTGRADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
具有信号序列的FZD8-Fc变体54F16氨基酸序列(SEQIDNO:43)
MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGAAAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDLTTKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
具有信号序列的FZD8-Fc变体54F26(SEQIDNO:44)
MEWGYLLEVTSLLAALFLLQRSPIVHAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDLTTEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
具有信号序列的FZD8-Fc变体54F28(SEQIDNO:45)
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPFVHAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDLTTEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人Wnt1的C端富含半胱氨酸的结构域(aa288-370)(SEQIDNO:46)
DLVYFEKSPNFCTYSGRLGTAGTAGRACNSSSPALDGCELLCCGRGHRTRTQRVTERCNCTFHWCCHVSCRNCTHTRVLHECL
人Wnt2的C端富含半胱氨酸的结构域(aa267-360)(SEQIDNO:47)
DLVYFENSPDYCIRDREAGSLGTAGRVCNLTSRGMDSCEVMCCGRGYDTSHVTRMTKCGCKFHWCCAVRCQDCLEALDVHTCKAPKNADWTTAT
人Wnt2b的C端富含半胱氨酸的结构域(aa298-391)(SEQIDNO:48)
DLVYFDNSPDYCVLDKAAGSLGTAGRVCSKTSKGTDGCEIMCCGRGYDTTRVTRVTQCECKFHWCCAVRCKECRNTVDVHTCKAPKKAEWLDQT
人Wnt3的C端富含半胱氨酸的结构域(aa273-355)(SEQIDNO:49)
DLVYYENSPNFCEPNPETGSFGTRDRTCNVTSHGIDGCDLLCCGRGHNTRTEKRKEKCHCIFHWCCYVSCQECIRIYDVHTCK
人Wnt3a的C端富含半胱氨酸的结构域(aa270-352)(SEQIDNO:50)
DLVYYEASPNFCEPNPETGSFGTRDRTCNVSSHGIDGCDLLCCGRGHNARAERRREKCRCVFHWCCYVSCQECTRVYDVHTCK
人Wnt7a的C端富含半胱氨酸的结构域(aa267-359)(SEQIDNO:51)
DLVYIEKSPNYCEEDPVTGSVGTQGR4CNKTAPQASGCDLMCCGRGYNTHQYARVWQCNCKFHWCCYVKCNTCSERTEMYTCK
人Wnt7b的C端富含半胱氨酸的结构域(aa267-349)(SEQIDNO:52)
DLVYIEKSPNYCEEDAATGSVGTQGRLCNRTSPGADGCDTMCCGRGYNTHQYTKVWQCNCKFHWCCFVKCNTCSERTEVFTCK
人Wnt8a的C端富含半胱氨酸的结构域(aa248-355)(SEQIDNO:53)
ELIFLEESPDYCTCNSSLGIYGTEGRECLQNSHNTSRWERRSCGRLCTECGLQVEERKTEVISSCNCKFQWCCTVKCDQCRHVVSKYYCARSPGSAQSLGRVWFGVYI
人Wnt8b的C端富含半胱氨酸的结构域(aa245-351)(SEQIDNO:54)
ELVHLEDSPDYCLENKTLGLLGTEGRECLRRGRALGRWELRSCRRLCGDCGLAVEERRAETVSSCNCKFHWCCAVRCEQCRRRVTKYFCSRAERPRGGAAHKPGRKP
人Wnt10a的C端富含半胱氨酸的结构域(aa335-417)(SEQIDNO:55)
DLVYFEKSPDFCEREPRLDSAGTVGRLCNKSSAGSDGCGSMCCGRGHNILRQTRSERCHCRFHWCCFVVCEECRITEWVSVCK
人Wnt10b的C端富含半胱氨酸的结构域(aa307-389)(SEQIDNO:56)
ELVYFEKSPDFCERDPTMGSPGTRGRACNKTSRLLDGCGSLCCGRGHNVLRQTRVERCHCRFHWCCYVLCDECKVTEWVNVCK
连接子(SEQIDNO:57)
ESGGGGVT
连接子(SEQIDNO:58)
LESGGGGVT
连接子(SEQIDNO:59)
GRAQVT
连接子(SEQIDNO:60)
WRAQVT
连接子(SEQIDNO:61)
ARGRAQVT
PCT/RO/134表
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种选择受试者以使用Wnt途径抑制剂进行治疗的方法，其包含：
(a)测定来自该受试者的样本中骨吸收生物标志的量；及
(b)若该骨吸收生物标志的量低于预设量，则选择该受试者以使用该Wnt途径抑制剂进行治疗；
其中所述Wnt途径抑制剂是
（i）与至少一种卷曲(FZD)蛋白特异性结合的抗体，或
（ii）包含人FZD8的Fri结构域的可溶性受体。
2.一种识别受试者为适合使用Wnt途径抑制剂进行治疗的方法，其包含：
(a)测定来自该受试者的样本中骨吸收生物标志的量；及
(b)若该骨吸收生物标志的量低于预设量，则识别该受试者为适合使用该Wnt途径抑制剂进行治疗；
其中所述Wnt途径抑制剂是
（i）与至少一种卷曲(FZD)蛋白特异性结合的抗体，或
（ii）包含人FZD8的Fri结构域的可溶性受体。
3.如权利要求1或2所述的方法，如果该骨吸收生物标志的量低于所述预设量，所述方法包括对该受试者投予该Wnt途径抑制剂。
4.一种对接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者识别骨骼相关不良反应及／或毒性的方法，其包含：
(a)测定来自该受试者的样本中骨吸收生物标志的量；
(b)比较该样本中骨吸收生物标志的量与骨吸收生物标志的预设量；及
其中若该样本中骨吸收生物标志的量高于该预设量，则显示骨骼相关不良反应及／或毒性。
5.一种对接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者监测骨骼相关不良反应及／或毒性的方法，其包含：
(a)测定来自该受试者的样本中骨吸收生物标志的量；及
(b)比较该样本中骨吸收生物标志的量与骨吸收生物标志的预设量；
其中若该样本中骨吸收生物标志的量高于该预设量，则显示骨骼相关不良反应及／或毒性。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中该骨吸收生物标志是β-CTX。
7.如权利要求6所述的方法，其中该β-CTX预设量是：
（a）于稍早时间点测定的β-CTX的量；
（b）在初次筛选时测定的β-CTX的量；
（c）在治疗前测定的β-CTX的量；
（d）基准量；或
（e）约1000pg/ml或更低。
8.如权利要求4-7中任一项所述的方法，其中如果
（a）任一样本的所述骨吸收生物标记量高于预设量，或
（b）所述骨吸收生物标记量为预设量的2倍或更多，
则对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物。
9.一种使接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者减少骨骼相关不良反应及／或毒性的方法，其包含：
(a)测定来自该受试者的样本中骨吸收生物标志的量；
(b)比较该样本中骨吸收生物标志的量与骨吸收生物标志的预设量；及
(c)若该样本中骨吸收生物标志的量高于该骨吸收生物标志的预设量，则对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物。
10.一种使接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者预防或减弱骨骼相关不良反应及／或毒性发展的方法，其包含：
(a)在使用Wnt途径抑制剂进行治疗之前，测定来自该受试者的样本中骨吸收生物标志的量；
(b)比较该样本中骨吸收生物标志的量与骨吸收生物标志的预设量；
(c)对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物；及
(d)对该受试者投予该Wnt途径抑制剂。
11.一种筛选受试者因Wnt途径抑制剂治疗所致的骨骼相关不良反应及／或毒性的风险的方法，其包含：
(a)测定来自该受试者的样本中骨吸收生物标志的量；及
(b)比较该样本中骨吸收生物标志的量与该骨吸收生物标志的预设量；其中若该样本中骨吸收生物标志的量高于该骨吸收生物标志的预设量，则该受试者具有骨骼相关不良反应及／或毒性的风险。
12.一种对有需要治疗的受试者治疗癌症的方法，其包含：
(a)对该受试者投予治疗有效量的Wnt途径抑制剂；及
(b)测定来自该受试者的样本中骨吸收生物标志的量。
13.如权利要求12所述的方法，其另包含：
(c)比较该样本中骨吸收生物标志的量与该骨吸收生物标志的预设量；其中若该样本中骨吸收生物标志的量高于该骨吸收生物标志的预设量，则该受试者具有骨骼相关不良反应及／或毒性的风险；或
(c)比较该样本中骨吸收生物标志的量与该骨吸收生物标志的预设量；其中若该样本中骨吸收生物标志的量高于该骨吸收生物标志的预设量，则对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中该生物样本系血液、血清或血浆。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中该骨吸收生物标志是β-CTX。
16.如权利要求15所述的方法，其中若该β-CTX的量为预设量的2倍或更多，则对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物。
17.如权利要求11或13所述的方法，其中若该受试者具有骨骼相关不良反应及／或毒性的风险，则在使用该Wnt途径抑制剂进行治疗之前，对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物。
18.一种使接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者减少骨骼相关不良反应及／或毒性的方法，其包含对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物。
19.一种使接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者预防或减弱骨骼相关不良反应及／或毒性发展的方法，其包含对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物。
20.如权利要求4至11或13-19中任一项所述的方法，其中该骨骼相关不良反应及／或毒性是增加骨折、骨量减少或骨质疏松症的风险。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中该Wnt途径抑制剂是抗体，其包含：
(a)重链CDR1、重链CDR2及重链CDR3，该重链CDR1包含GFTFSHYTLS(SEQIDNO:1)，该重链CDR2包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQIDNO:2)且该重链CDR3包含NFIKYVFAN(SEQIDNO:3)，及
(b)轻链CDR1、轻链CDR2及轻链CDR3，该轻链CDR1包含SGDNIGSFYVH(SEQIDNO:4)，该轻链CDR2包含DKSNRPSG(SEQIDNO:5)且该轻链CDR3包含QSYANTLSL(SEQIDNO:6)。
22.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中该Wnt途径抑制剂是抗体，其包含：
包含SEQIDNO:7的重链可变区及包含SEQIDNO:8的轻链可变区。
23.如权利要求21或22所述的方法，其中该抗体是单克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、双特异性抗体、IgG1抗体、IgG2抗体或包含抗原结合部位的抗体片段。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中该Wnt途径抑制剂是抗体OMP-18R5。
25.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中该Wnt途径抑制剂是包含人FZD8蛋白的Fri结构域的可溶性受体。
26.如权利要求25所述的方法，其中该人FZD蛋白的Fri结构域包含SEQIDNO:20。
27.如权利要求25或26所述的方法，其中所述可溶性受体包含人Fc区。
28.如权利要求1-20或25-27中任一项所述的方法，其中该Wnt途径抑制剂包含SEQIDNO:41。
29.如权利要求1-20或25-28中任一项所述的方法，其中该Wnt途径抑制剂是FZD8-Fc可溶性受体OMP-54F28。
30.如权利要求8-10或13-29中任一项所述的方法，其中该抗吸收药物是双膦酸盐或迪诺单抗。
31.如权利要求30所述的方法，其中该双膦酸盐是选自：唑来膦酸、羟乙膦酸盐、氯屈膦酸盐、替鲁膦酸盐、帕米膦酸盐、奈立膦酸盐、奥帕膦酸盐、阿仑膦酸盐、伊班膦酸盐、及利塞膦酸盐。
32.如权利要求1至31中任一项的方法，其中该受试者罹患癌症。
33.如权利要求32所述的方法，其中该癌症是选自：肺癌、乳癌、结肠癌、结直肠癌、黑色素瘤、胰癌、胃肠癌、肾癌、卵巢癌、神经内分泌癌、肝癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、神经胚细胞瘤、神经胶瘤、多形性神经胶质母细胞瘤、子宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝肿瘤及头颈癌。
34.如权利要求1至33中任一项所述的方法，其中该受试者是经Wnt途径抑制剂与一或多种额外抗癌剂的组合治疗。
35.如权利要求4至11或13至34中任一项所述的方法，其中该骨骼相关不良反应及／或毒性与该Wnt途径抑制剂有关。

Claims (86)

1.一种选择受试者以使用Wnt途径抑制剂进行治疗的方法，其包含：
(a)自该受试者获得生物样本；
(b)测定该样本中骨吸收生物标志的量；及
(c)若该骨吸收生物标志的量系低于预设量，则选择该受试者以使用该Wnt途径抑制剂进行治疗。
2.一种识别受试者为适合使用Wnt途径抑制剂进行治疗的方法，其包含：
(a)自该受试者获得生物样本；
(b)测定该样本中骨吸收生物标志的量；及
(c)若该骨吸收生物标志的量系低于预设量，则识别该受试者为适合使用该Wnt途径抑制剂进行治疗。
3.一种选择受试者以使用Wnt途径抑制剂进行治疗的方法，其包含：
(a)测定来自该受试者的样本中骨吸收生物标志的量；及
(b)若该骨吸收生物标志的量系低于预设量，则选择该受试者以使用该Wnt途径抑制剂进行治疗。
4.一种识别受试者为适合使用Wnt途径抑制剂进行治疗的方法，其包含：
(a)测定来自该受试者的样本中骨吸收生物标志的量；及
(b)若该骨吸收生物标志的量系低于预设量，则识别该受试者为适合使用该Wnt途径抑制剂进行治疗。
5.如权利要求第1至4项中任一项的方法，其中该生物样本系血液、血清或血浆。
6.如权利要求第1至5项中任一项的方法，其中该骨吸收生物标志系β-CTX。
7.如权利要求第6项的方法，其中该β-CTX于血液、血清或血浆中的预设量系于稍早时间点或在初次筛选时测定的β-CTX的量。
8.如权利要求第6项的方法，其中该β-CTX于血液、血清或血浆中的预设量系约1000pg/ml或更低。
9.如权利要求第1至8项中任一项的方法，若该骨吸收生物标志的量系低于该预设量，所述方法进一步包含对该受试者投予该Wnt途径抑制剂。
10.一种监测接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者是否发展骨骼相关不良反应及／或毒性的方法，其包含：
(a)自该接受治疗的受试者获得生物样本；
(b)测定该样本中骨吸收生物标志的量；及
(c)比较该样本中骨吸收生物标志的量与骨吸收生物标志的预设量；
其中该骨吸收生物标志的量增加显示发展骨骼相关不良反应及／或毒性。
11.一种对接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者检测骨骼相关不良反应及／或毒性发展的方法，其包含：
(a)自该接受治疗的受试者获得生物样本；
(b)测定该样本中骨吸收生物标志的量；及
(c)比较该样本中骨吸收生物标志的量与骨吸收生物标志的预设量；
其中该骨吸收生物标志的量增加显示发展骨骼相关不良反应及／或毒性。
12.一种对接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者识别骨骼相关不良反应及／或毒性的方法，其包含：
(a)自该接受治疗的受试者获得生物样本；
(b)测定该样本中骨吸收生物标志的量；及
(c)比较该样本中骨吸收生物标志的量与骨吸收生物标志的预设量；
其中若该样本中骨吸收生物标志的量系高于该预设量，则显示骨骼相关不良反应及／或毒性。
13.一种对接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者监测骨骼相关不良反应及／或毒性的方法，其包含：
(a)自该接受治疗的受试者获得生物样本；
(b)测定该样本中骨吸收生物标志的量；及
(c)比较该样本中骨吸收生物标志的量与骨吸收生物标志的预设量；
其中若来自该受试者的生物样本中骨吸收生物标志的量系高于该预设量，则显示骨骼相关不良反应及／或毒性。
14.一种监测接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者是否发展骨骼相关不良反应及／或毒性的方法，其包含：
(a)测定来自该受试者的样本中骨吸收生物标志的量；及
(b)比较该样本中骨吸收生物标志的量与骨吸收生物标志的预设量；
其中该骨吸收生物标志的量增加显示发展骨骼相关不良反应及／或毒性。
15.一种对接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者检测骨骼相关不良反应及／或毒性发展的方法，其包含：
(a)测定来自该受试者的样本中骨吸收生物标志的量；及
(b)比较该样本中骨吸收生物标志的量与骨吸收生物标志的预设量；
其中该骨吸收生物标志的量增加显示发展骨骼相关不良反应及／或毒性。
16.一种对接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者识别骨骼相关不良反应及／或毒性的方法，其包含：
(a)测定来自该受试者的样本中骨吸收生物标志的量；及
(b)比较该样本中骨吸收生物标志的量与骨吸收生物标志的预设量；
其中若该样本中骨吸收生物标志的量系高于该预设量，则显示骨骼相关不良反应及／或毒性。
17.一种对接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者监测骨骼相关不良反应及／或毒性的方法，其包含：
(a)测定来自该受试者的样本中骨吸收生物标志的量；及
(b)比较该样本中骨吸收生物标志的量与骨吸收生物标志的预设量；
其中若该样本中骨吸收生物标志的量系高于该预设量，则显示骨骼相关不良反应及／或毒性。
18.如权利要求第10至17项中任一项的方法，其中该样本系血液、血清或血浆。
19.如权利要求第10至18项中任一项的方法，其中该骨骼相关不良反应及／或毒性系增加骨折、骨量减少或骨质疏松症的风险。
20.如权利要求第10至19项中任一项的方法，其中该骨吸收生物标志的预设量系在较早日期自该受试者获得的样本中骨吸收生物标志的量。
21.如权利要求第10至20项中任一项的方法，其中该骨吸收生物标志的预设量系在治疗前自该受试者获得的样本中骨吸收生物标志的量。
22.如权利要求第10至21项中任一项的方法，其中该骨吸收生物标志的预设量系基准量。
23.如权利要求第10至22项中任一项的方法，其中若任一样本的该骨吸收生物标志量系高于预设量，则对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物。
24.如权利要求第10至22项中任一项的方法，其中若该骨吸收生物标志量系为预设量的2倍或更多，则对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物。
25.如权利要求第10至24项的方法，其中该骨吸收生物标志系β-CTX。
26.一种使接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者减少骨骼相关不良反应及／或毒性的方法，其包含：
(a)自该接受治疗的受试者获得生物样本；
(b)测定该样本中骨吸收生物标志的量；
(c)比较该样本中骨吸收生物标志的量与骨吸收生物标志的预设量；及
(d)若该样本中骨吸收生物标志的量系高于该骨吸收生物标志的预设量，则对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物。
27.一种使接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者预防或减弱骨骼相关不良反应及／或毒性发展的方法，其包含：
(a)在使用Wnt途径抑制剂治疗之前，自该受试者获得生物样本；
(b)测定该样本中骨吸收生物标志的量；
(c)比较该样本中骨吸收生物标志的量与骨吸收生物标志的预设量；
(d)对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物；及
(e)对该受试者投予该Wnt途径抑制剂。
28.一种筛选受试者因Wnt途径抑制剂治疗所致的骨骼相关不良反应及／或毒性的风险的方法，其包含：
(a)在使用Wnt途径抑制剂治疗之前，自该受试者获得生物样本；
(b)测定该样本中骨吸收生物标志的量；及
(c)比较该样本中骨吸收生物标志的量与该骨吸收生物标志的预设量；其中若该样本中骨吸收生物标志的量系高于该骨吸收生物标志的预设量，则该受试者具有骨骼相关不良反应及／或毒性的风险。
29.一种使接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者减少骨骼相关不良反应及／或毒性的方法，其包含：
(a)测定来自该受试者的样本中骨吸收生物标志的量；
(b)比较该样本中骨吸收生物标志的量与骨吸收生物标志的预设量；及
(c)若该样本中骨吸收生物标志的量系高于该骨吸收生物标志的预设量，则对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物。
30.一种使接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者预防或减弱骨骼相关不良反应及／或毒性发展的方法，其包含：
(a)在使用Wnt途径抑制剂进行治疗之前，测定来自该受试者的样本中骨吸收生物标志的量；
(b)比较该样本中骨吸收生物标志的量与骨吸收生物标志的预设量；
(c)对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物；及
(d)对该受试者投予该Wnt途径抑制剂。
31.一种筛选受试者因Wnt途径抑制剂治疗所致的骨骼相关不良反应及／或毒性的风险的方法，其包含：
(a)测定来自该受试者的样本中骨吸收生物标志的量；及
(b)比较该样本中骨吸收生物标志的量与该骨吸收生物标志的预设量；其中若该样本中骨吸收生物标志的量系高于该骨吸收生物标志的预设量，则该受试者具有骨骼相关不良反应及／或毒性的风险。
32.一种对有需要治疗的受试者治疗癌症的方法，其包含：
(a)对该受试者投予治疗有效量的Wnt途径抑制剂；及
(b)测定来自该受试者的样本中骨吸收生物标志的量。
33.如权利要求第32项的方法，其另包含：
(c)比较该样本中骨吸收生物标志的量与该骨吸收生物标志的预设量；其中若该样本中骨吸收生物标志的量系高于该骨吸收生物标志的预设量，则该受试者具有骨骼相关不良反应及／或毒性的风险。
34.如权利要求第32项的方法，其另包含：
(c)比较该样本中骨吸收生物标志的量与该骨吸收生物标志的预设量；其中若该样本中骨吸收生物标志的量系高于该骨吸收生物标志的预设量，则对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物。
35.如权利要求第26至34项中任一项的方法，其中该生物样本系血液、血清或血浆。
36.如权利要求第26至35项中任一项的方法，其中该骨吸收生物标志系β-CTX。
37.如权利要求第36项的方法，其中若该β-CTX的量系为预设量的2倍或更多，则对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物。
38.如权利要求第28或31项的方法，其中若该受试者具有骨骼相关不良反应及／或毒性的风险，则在使用该Wnt途径抑制剂进行治疗之前，对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物。
39.一种使接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者减少骨骼相关不良反应及／或毒性的方法的方法，其包含对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物。
40.一种使接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者预防或减弱骨骼相关不良反应及／或毒性发展的方法，其包含对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物。
41.如权利要求第26至40项中任一项的方法，其中该骨骼相关不良反应及／或毒性系增加骨折、骨量减少或骨质疏松症的风险。
42.如权利要求第1至41项中任一项的方法，其中该Wnt途径抑制剂系与至少一种卷曲(FZD)蛋白或它的部分特异性结合的抗体。
43.如权利要求第42项的方法，其中该抗体与选自下列的至少一种FZD蛋白特异性结合：FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9及FZD10。
44.如权利要求第1至41项中任一项的方法，其中该Wnt途径抑制剂系抗体，其包含：
(a)重链CDR1、重链CDR2及重链CDR3，该重链CDR1包含GFTFSHYTLS(SEQIDNO:1)，该重链CDR2包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQIDNO:2)且该重链CDR3包含NFIKYVFAN(SEQIDNO:3)，及
(b)轻链CDR1、轻链CDR2及轻链CDR3，该轻链CDR1包含SGDNIGSFYVH(SEQIDNO:4)，该轻链CDR2包含DKSNRPSG(SEQIDNO:5)且该轻链CDR3包含QSYANTLSL(SEQIDNO:6)。
45.如权利要求第1至41项中任一项的方法，其中该Wnt途径抑制剂系抗体，其包含：
包含SEQIDNO:7的重链可变区及包含SEQIDNO:8的轻链可变区。
46.如权利要求第1至45项中任一项的方法，其中该Wnt途径抑制剂系抗体OMP-18R5。
47.如权利要求第46项的方法，其中OMP-18R5系经静脉投予至需要该剂的受试者，剂量为(a)约每一至二周至少约0.5mg/kg，或(b)约每三周至少约1.0mg/kg。
48.如权利要求第46项的方法，其中OMP-18R5系以约每一至二周约0.5mg/kg至约1.0mg/kg的剂量投予。
49.如权利要求第46项的方法，其中OMP-18R5系以约每三周约1.0mg/kg至约10.0mg/kg的剂量投予。
50.如权利要求第1至41项中任一项的方法，其中该Wnt途径抑制剂系Wnt结合剂。
51.如权利要求第50项的方法，其中该Wnt结合剂系抗体。
52.如权利要求第1至41、50或51项中任一项的方法，其中该Wnt途径抑制剂系与至少一种Wnt蛋白特异性结合的抗体。
53.如权利要求第52项的方法，其中该抗体与选自下列的至少一种Wnt蛋白特异性结合：Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a及Wnt10b。
54.如权利要求第42至45或51至53项中任一项的方法，其中该抗体系单克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或包含抗原结合部位的抗体片段。
55.如权利要求第42至54项中任一项的方法，其中该抗体系单特异性抗体或双特异性抗体。
56.如权利要求第42至45或51至55项中任一项的方法，其中该抗体系IgG1抗体或IgG2抗体。
57.如权利要求第1至41项中任一项的方法，其中该Wnt途径抑制剂系可溶性受体。
58.如权利要求第57项的方法，其中该Wnt结合剂系可溶性受体。
59.如权利要求第57或58项的方法，其中该可溶性受体包含人FZD蛋白的Fri结构域。
60.如权利要求第59项的方法，其中该人FZD蛋白的Fri结构域实质上由FZD1的Fri结构域、FZD2的Fri结构域、FZD3的Fri结构域、FZD4的Fri结构域、FZD5的Fri结构域、FZD6的Fri结构域、FZD7的Fri结构域、FZD8的Fri结构域、FZD9的Fri结构域、或FZD10的Fri结构域组成。
61.如权利要求第59项的方法，其中该人FZD蛋白的Fri结构域实质上由FZD8的Fri结构域组成。
62.如权利要求第59项的方法，其中该人FZD蛋白的Fri结构域包含选自下列的序列：SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32及SEQIDNO:33。
63.如权利要求第62项的方法，其中该人FZD蛋白的Fri结构域实质上由SEQIDNO:20或SEQIDNO:30组成。
64.如权利要求第59至63项中任一项的方法，其中该人FZD蛋白的Fri结构域系与非FZD多肽直接连接。
65.如权利要求第59至63项中任一项的方法，其中该人FZD蛋白的Fri结构域系藉由连接子与非FZD多肽连接。
66.如权利要求第64或65项的方法，其中该非FZD多肽包含人Fc区。
67.如权利要求第64至66项中任一项的方法，其中该非FZD多肽实质上由SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37或SEQIDNO:38组成。
68.如权利要求第57项的方法，其中该Wnt结合剂包含：
(a)第一多肽，其实质上由SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32或SEQIDNO:33组成；及
(b)第二多肽，其实质上由SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37或SEQIDNO:38组成；
其中该第一多肽系与该第二多肽直接连接。
69.如权利要求第57项的方法，其中该Wnt结合剂包含：
(a)第一多肽，其实质上由SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32或SEQIDNO:33组成；及
(b)第二多肽，其实质上由SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37或SEQIDNO:38组成；
其中该第一多肽系藉由连接子与该第二多肽直接连接。
70.如权利要求第68或69项的方法，其中该第一多肽实质上由SEQIDNO:20组成。
71.如权利要求第68或69的方法，其中该第一多肽实质上由SEQIDNO:20组成，且其中该第二多肽实质上由SEQIDNO:36、SEQIDNO:37或SEQIDNO:35组成。
72.如权利要求第68或69项的方法，其中该第一多肽实质上由SEQIDNO:30组成。
73.如权利要求第68或69的方法，其中该第一多肽实质上由SEQIDNO:58组成，且其中该第二多肽实质上由SEQIDNO:36、SEQIDNO:37或SEQIDNO:35组成。
74.如权利要求第57项的方法，其中该Wnt结合剂包含SEQIDNO:39、SEQIDNO:40或SEQIDNO:41。
75.如权利要求第57项的方法，其中该Wnt结合剂包含SEQIDNO:41。
76.如权利要求第57项的方法，其中该Wnt结合剂系FZD8-Fc可溶性受体OMP-54F28。
77.如权利要求第27至29、30或35至76项中任一项的方法，其中该抗吸收药物系双膦酸盐或迪诺单抗。
78.如权利要求第77项的方法，其中该双膦酸盐系选自：羟乙膦酸盐、氯屈膦酸盐、替鲁膦酸盐、帕米膦酸盐、奈立膦酸盐、奥帕膦酸盐、阿仑膦酸盐、伊班膦酸盐、利塞膦酸盐及唑来膦酸。
79.如权利要求第77或78项的方法，其中该双膦酸盐系唑来膦酸。
80.如权利要求第1至79项中任一项的方法，其中该受试者罹患癌症。
81.如权利要求第80项的方法，其中该癌症系选自：肺癌、乳癌、结肠癌、结直肠癌、黑色素瘤、胰癌、胃肠癌、肾癌、卵巢癌、神经内分泌癌、肝癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、神经胚细胞瘤、神经胶瘤、多形性神经胶质母细胞瘤、子宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝肿瘤及头颈癌。
82.如权利要求第1至81项中任一项的方法，其中该受试者系经Wnt途径抑制剂与一或多种额外抗癌剂的组合治疗。
83.如权利要求第1至81项中任一项的方法，其中该骨骼相关不良反应及／或毒性系与该Wnt途径抑制剂有关。
84.如权利要求第1至81项中任一项的方法，其中该骨骼相关不良反应及／或毒性系增加骨折、骨量减少或骨质疏松症的风险。
85.一种监测接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者发展骨骼相关不良反应及／或毒性的方法，其中该Wnt途径抑制剂系抗FZD抗体或FZD可溶性受体，该方法包含：
(a)测定自该受试者获得的样本中骨吸收生物标志的量；及
(b)比较该样本中骨吸收生物标志的量与该骨吸收生物标志的预设量，其中该预设量系于使用该Wnt途径抑制剂进行治疗之前测量的量；
其中该骨吸收生物标志的量增加显示发展骨骼相关不良反应及／或毒性。
86.一种减少接受Wnt途径抑制剂治疗的受试者的骨骼相关不良反应及／或毒性的方法，其中该Wnt途径抑制剂系抗FZD抗体或FZD可溶性受体，该方法包含：
(a)测定自该受试者获得的样本中骨吸收生物标志的量；
(b)比较该样本中骨吸收生物标志的量与该骨吸收生物标志的预设量，其中该预设量系于使用该Wnt途径抑制剂进行治疗之前测量的量；及
(c)若该样本中骨吸收生物标志的量系高于该骨吸收生物标志的预设量，则对该受试者投予治疗有效量的抗吸收药物。
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