JP2011504461A

JP2011504461A - Ｗｎｔ活性を測定するためのおよびｗｎｔ関連がんを処置するための方法および組成物

Info

Publication number: JP2011504461A
Application number: JP2010532575A
Authority: JP
Inventors: アトウッド・チェウン; コン・フェン; フアン・シー−ミン
Original assignee: ノバルティスアーゲー
Priority date: 2007-11-05
Filing date: 2008-11-05
Publication date: 2011-02-10
Also published as: BRPI0820504A2; CA2704648A1; EA201000673A1; WO2009059994A2; AU2008324203A1; KR20100089869A; WO2009059994A3; US20100267626A1; MX2010004982A; EP2217223A2; CN101854924A

Abstract

本願は、Ａｘｉｎ安定化剤を投与することによって、Ｗｎｔシグナル伝達を制御または調節（例えばアンタゴナイズまたは阻害）する方法を開示する。本願はまた、Ｗｎｔシグナル伝達関連障害の処置、診断、予防および／改善のための、本明細書に記載のＡｘｉｎ安定化剤を用いる方法を開示する。

Description

発明の背景
Ｗｎｔ遺伝子ファミリーはＩｎｔ１／Ｗｎｔ１がん原遺伝子およびショウジョウバエＷｎｔ１ホモログである無翅（Ｗｇ）ショウジョウバエに関連した分泌タンパク質の大きなクラスをコードする（Cadigan et al. （1997） Genes & Development 11:3286-3305）。Ｗｎｔは多様な組織および臓器で発現され、ショウジョウバエの分節；C. elegansにおける内胚葉の発生；および哺乳類の肢極性の確立、神経堤分化、腎形態形成、性別決定および脳発生を含む多くの発生プロセスに必要である（Parr, et al. （1994） Curr. Opinion Genetics & Devel. 4:523-528）。Ｗｎｔ経路は胚形成期および成熟生物の両方において、動物発生の主なレギュレーターである（Eastman, et al. （1999） Curr Opin Cell Biol 11: 233-240; Peifer, et al. （2000） Science 287: 1606-1609）。

Ｗｎｔシグナルは７種の膜貫通ドメイン受容体のFrizzled（Ｆｚ）ファミリーによって伝達される（Bhanot et al. （1996） Nature 382:225-230）。ＷｎｔリガンドはＦｚｄと結合し、そうすることで細胞質タンパク質Dishevelled（ヒトおよびマウスのＤｖｌ−１、２および３）を活性化し（Boutros, et al. （1999） Mech Dev 83: 27-37）、ＬＲＰ５／６をリン酸化する。それによってシグナルが生じ、Armadillo／β−カテニンのリン酸化および分解を防止し、そしてβ−カテニンの安定化を導く（Perrimon （1994） Cell 76:781-784）。この安定化は、ＧＳＫ３、ＡＰＣ、ＣＫ１およびβ−カテニンを含む多様なタンパク質と一体となってβ−カテニン破壊複合体を形成する骨格タンパク質であるＡｘｉｎとのＤｖｌの結合によってもたらされる（Zeng et al. （1997） Cell 90:181-192）。

グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３、ショウジョウバエにおいてshaggyとして知られている）、腫瘍抑制遺伝子産物ＡＰＣ（大腸腺腫様ポリポーシス）（Gumbiner （1997） Curr. Biol. 7:R443-436）およびＡｘｉｎは全て、Ｗｎｔ経路の負のレギュレーターである。Ｗｎｔリガンドの非存在下では、これらのタンパク質は複合体を形成して、β−カテニンのリン酸化および分解を促進するが、Ｗｎｔシグナル伝達はこの複合体を不活性化し、β−カテニン分解を防止する。結果として安定化されたβ−カテニンは核へ移行し、そこでこれはＴＣＦ（Ｔ細胞因子）転写因子（リンパ球エンハンサー結合因子−１（ＬＥＦ１）としても知られる）と結合して、ＴＣＦ／ＬＥＦ誘導性転写の共アクチベーターとして働く（Bienz, et al. （2000） Cell 103: 311-320; Polakis, et al. （2000） Genes Dev 14: 1837-1851）。

β−カテニンの安定化による異常なＷｎｔ経路活性化は、多くの結直腸癌腫の腫瘍形成に中心的な役割を有する。結直腸癌腫（ＣＲＣ）の８０％が、連続したＷｎｔシグナル伝達を可能とする腫瘍リプレッサーＡＰＣの不活性化変異を有する。さらにまた、Ｗｎｔ経路活性化が黒色腫、乳癌、肝臓癌、肺癌および胃癌に関与し得ることを示唆する証拠が増えつつある。Ｗｎｔ、正常な発生およびがんの間の関係が長らく認識されているが、Ｗｎｔシグナル伝達の標的としてのｃ−Ｍｙｃがん原遺伝子の同定との関連性がさらに確立された（He et al. （1998） Science 281:1509-3512）。

さらにまた、骨粗鬆症、骨関節炎、多発性嚢胞腎疾患、糖尿病、統合失調症、血管疾患、心臓疾患、非がん原性増殖性疾患およびアルツハイマー病のような神経変性疾患を含むがこれらに限定されない他の障害が、異常なＷｎｔシグナル伝達と関連している。

結直腸癌のようなＷｎｔシグナル伝達関連障害の治療法開発のための現在のパラダイムは、β−ｃａｔまたはβ−ｃａｔの下流のＷｎｔ経路の成分を標的とすることに頼っている。しかし近年の研究では、Ｗｎｔ受容体のFrizzledおよびＬＲＰ５／６によって介在される自己分泌Ｗｎｔシグナル伝達が腫瘍増殖および生存の制御に重要な役割を有し得ることが示唆されている。Ｗｎｔ経路と他の重大な岐路の活性を調節してＷｎｔシグナル伝達活性を阻害し、それによってＷｎｔシグナル伝達関連障害を処置し、診断し、予防しおよび／または改善する薬物および方法が必要とされている。

発明の概要
本発明は、例えばＡｘｉｎのタンパク質安定性および／またはレベルを調節する薬物（例えば低分子、例えば本発明の化合物、阻害核酸、融合タンパク質等）を使用して、Ｗｎｔシグナル伝達関連障害（例えば結直腸癌）を診断し、その症状を改善し、保護し、処置する方法を提供する。ある態様において、当該薬物は例えばＴＮＫＳ触媒活性を調節することによって、タンキラーゼ（ＴＮＫＳ）を調節する。

かかる方法は、それを必要とする対象に有効量のＷｎｔ経路シグナル伝達の調節剤、例えばＡｘｉｎ安定化剤および／またはＴＮＫＳ調節剤（例えば低分子、例えば本発明の化合物、阻害核酸、融合タンパク質またはそれらの何れかの組合せ）と薬学的に許容される担体を投与することを含んでいてもよい。

かかる方法は、例えばＷｎｔ受容体を有する上皮細胞を処置するために、細胞レベルで使用することができる。例えば、対象方法は基底細胞癌腫または他のＷｎｔシグナル伝達関連障害（例えば異常な細胞増殖によって特徴付けられるもの）の処置または予防に使用することができる。対象方法はまた、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害し、またはその阻害をアゴナイズすることによって、細胞増殖、異常またはその他のものを予防するために使用してもよい。

本発明はまた、例えばＡｘｉｎ安定化剤の使用によって、例えばＴＮＫ調節剤（例えば低分子、阻害核酸、融合タンパク質等）の使用によって、Ｗｎｔ経路シグナル伝達を調節する方法を提供する。一つの態様において、本発明の方法は、例えばＡｘｉｎ安定化剤の使用によって、例えばＴＮＫ調節剤（例えば低分子、阻害核酸、融合タンパク質等）の使用によって、Ｗｎｔ経路シグナル伝達を阻害し、またはその阻害をアゴナイズすることを含む。

Ｗｎｔ経路シグナル伝達を阻害し、またはその阻害をアゴナイズするかかる方法は、例えば正常な細胞、組織および臓器を含む多様な細胞、組織および臓器の修復および／または機能実行の制御において、使用してもよい。例えば、神経組織、骨および軟骨形成および修復の制御、精子形成の制御、平滑筋の制御、肺、肝臓および原腸から生じる他の臓器の制御、造血機能の制御、皮膚および毛髪増殖の制御等を含むが、これらに限定されない。本発明の方法はインビトロまたはインビボで実施することができる。

本発明はまた、Ｗｎｔ経路シグナル伝達のアゴニストおよびアンタゴニストを同定し、試験する方法ならびにＷｎｔ経路のメンバー（例えばＡｘｉｎ、ＴＮＫＳ）を同定し、試験する方法を提供する。Ａｘｉｎタンパク質レベルの安定化および上昇ならびにＴＮＫＳの阻害によってＷｎｔ経路シグナル伝達を阻害するという本発見は、この安定化を促進し、またはそれに干渉し、それによってインビトロまたはインビボでＷｎｔ経路シグナル伝達に干渉する薬物を同定するために有用である。したがって本発見はまた、ＴＮＫＳ触媒活性を阻害することができる薬物を発見するために有用であり、それによって、例えばＡｘｉｎの安定化およびそのβ−カテニン破壊複合体の形成の不全（そして得られるＷｎｔ経路シグナル伝達の調節）によってもたらされ得る異常な病的Ｗｎｔシグナル伝達に関連した障害を処置するために使用することができる。

一つの態様において、Ｗｎｔ経路シグナル伝達を調節することができる薬物を同定する方法は、a）試験薬物の存在下および非存在下、Ｗｎｔシグナル伝達を許容する条件下で、Ｗｎｔシグナル伝達経路が活性であり、ＴＮＫＳタンパク質レベルを測定することができる生物学的サンプルを接触させ；そしてb）前記試験薬物の存在下および非存在下の両方で、ＴＮＫＳタンパク質レベルを測定することを含み、ここで（i）試験薬物の非存在下と比較して、試験薬物の存在下でのＴＮＫＳタンパク質レベルまたは安定性の低下が、該試験薬物をＷｎｔ経路シグナル伝達のアンタゴニストとして同定し、そして（ii）試験薬物の非存在下と比較して、試験薬物の存在下でのＴＮＫＳタンパク質レベルまたは安定性の上昇が、該試験薬物をＷｎｔ経路シグナル伝達のアゴニストとして同定する。

一つの態様において、薬物は低分子である。他の態様において、薬物は阻害核酸（例えば抗−ＴＮＫＳ１または−ＴＮＫＳ２ｓｉＲＮＡ）である。他の態様において、薬物は融合タンパク質（例えばＴＮＫＳに対する阻害的融合タンパク質）であってもよい。

本発明は、Ｗｎｔシグナル伝達関連障害（例えば結直腸癌）の処置に有用な化合物をスクリーニングする方法であって、Ｗｎｔシグナル伝達を示す細胞を試験薬物と接触させ、ＴＮＫＳタンパク質レベルまたはＡｘｉｎタンパク質レベルおよび／またはＡｘｉｎ安定化の変化を検出することを含む方法を含む。

一つの態様において、Ｗｎｔシグナル伝達関連障害の処置に有用な薬物を同定する方法は、a）試験薬物の存在下および非存在下、Ｗｎｔシグナル伝達を許容する条件下で、Ｗｎｔシグナル伝達経路が活性であり、ＴＮＫＳタンパク質または安定性レベルを測定することができる生物学的サンプルを接触させ；そしてb）前記試験薬物の存在下および非存在下の両方で、ＴＮＫＳタンパク質レベルを測定することを含み、ここで（i）試験薬物の非存在下と比較して、試験薬物の存在下でのＴＮＫＳタンパク質レベルまたは安定性の低下が、該試験薬物をＷｎｔシグナル伝達の異常なアップレギュレーションに関連した障害の処置に有用として同定し、そして（ii）試験薬物の非存在下と比較して、試験薬物の存在下でのＴＮＫＳタンパク質レベルまたは安定性の上昇が、該試験薬物をＷｎｔシグナル伝達の異常なダウンレギュレーションに関連した障害の処置に有用として同定する。

一つの態様において、Ｗｎｔシグナル伝達関連障害の処置に有用な薬物を同定するための方法は、Ｗｎｔシグナル伝達経路が活性である細胞を試験薬物と接触させ、ＴＮＫＳタンパク質レベルまたは安定性の変化を検出することを含む方法を含む。

本発明のスクリーニング法において、Ａｘｉｎタンパク質レベルまたは安定性の上昇は、総β−カテニンレベルの低下、ホスホ−β−カテニンレベルの上昇、Ａｘｉｎタンパク質レベルの上昇または増加したＡｘｉｎ−ＧＳＫ３複合体の形成によって測定される。Ａｘｉｎタンパク質レベルまたは安定性の低下は、総β−カテニンレベルの上昇、ホスホ−β−カテニンレベルの低下、Ａｘｉｎタンパク質レベルの低下または減少したＡｘｉｎ−ＧＳＫ３複合体の形成によって測定される。

本発明の他のスクリーニング方法は、Ｗｎｔ経路シグナル伝達を調節することができる薬物を同定する方法およびタンキラーゼ（ＴＮＫＳ）の触媒活性を阻害することができる薬物を同定する方法を含む。かかる薬物は少なくとも低分子、阻害核酸（例えば抗−ＴＮＫＳ１または−ＴＮＫＳ２ｓｉＲＮＡ）または融合タンパク質（例えばＴＮＫＳに対する阻害的融合タンパク質）であってもよい。

本発明は、有効成分として、本明細書に記載されているようなＷｎｔアンタゴニスト（例えばＡｘｉｎ安定化剤および／またはＴＮＫＳアンタゴニスト）を含む医薬組成物であって、（i）インビボで細胞増殖または他のＷｎｔ異常発現の生物学的帰結（例えば構成的Ｗｎｔシグナル伝達によって特徴付けられるがん）の阻害；および（ii）Ｗｎｔシグナル伝達関連障害の診断、その症状の改善、それからの保護または処置に十分な量で製剤された医薬組成物を含む。かかる組成物は例えば、薬学的に許容される担体中に、本発明の何れかの態様による化合物、阻害核酸または融合タンパク質またはそれらの何れかの組合せを含んでいてもよい。

他の態様において、腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、それを必要とする対象に有効量のＷｎｔ経路シグナル伝達調節剤、例えばＡｘｉｎ安定化剤および／またはＴＮＫＳアンタゴニスト（例えば低分子、例えば本発明の化合物、阻害核酸、融合タンパク質等、またはそれらの何れかの組合せ）と薬学的に許容される担体を投与することを含む方法を提供する。

さらに、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、それを必要とする対象に有効量のＷｎｔ経路シグナル伝達調節剤、例えばＡｘｉｎ安定化剤および／またはＴＮＫＳアンタゴニスト（例えば低分子、例えば本発明の化合物、阻害核酸、融合タンパク質等、またはそれらの何れかの組合せ）と薬学的に許容される担体を投与することを含む方法を提供する。

本発明は、Ｗｎｔシグナル伝達関連障害（例えば結直腸癌）に罹患している対象の、「ＴＮＫＳ阻害剤」、「Ａｘｉｎ安定化剤」等（例えば、本発明の化合物またはＴＮＫＳの触媒活性を阻害することができる融合タンパク質もしくは阻害ヌクレオチド）を含む処置レジメンから利益を受ける素因または可能性を同定または予測する方法を含む。

図１：ＸＡＶ９３９はＡｘｉｎタンパク質レベルを上昇させることによってＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を阻害する。ＸＡＶ９３９はＨＥＫ２９３細胞のＳＴＦ活性を特異的に阻害する。ＨＥＫ２９３ＳＴＦ、ＣＲＥ、ＮＦκＢおよびＣＡＧＡ１２レポーター細胞系はＷｎｔ３Ａ調節培地、Forskolin、ＴＮＦαおよびＴＧＦβでそれぞれ活性化され、ＸＡＶ９３９またはＬＤＷ６４３（ＸＡＶ９３９に対する化合物の不活性アナログ、ネガティブコントロール）の１２点希釈で処理した。各希釈化合物に対応するレポーター活性は、ＤＭＳＯに正規化し、ＤＭＳＯのレポーター活性のパーセンテージとして表した。ＸＡＶ９３９はＷｎｔ３Ａ安定化β−カテニンレベルを低下する。ＨＥＫ２９３細胞をＷｎｔ３Ａ調節培地で記載した時間、ＤＭＳＯまたは１μＭのＸＡＶ９３９の存在下で刺激した。細胞溶解物を分画し、細胞質β−カテニンについてイムノブロットした。ＸＡＶ９３９はＡＰＣ欠損ＳＷ４８０細胞でＳＴＦ活性を阻害する。ＳＷ４８０−ＳＴＦおよびＳＷ４８０−ＳＴＦ−ＴＣＦ３ＶＰ１６細胞をＸＡＶ９３９またはＬＤＷ６４３の１２点希釈で処理し、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。ＴＣＦ３ＶＰ１６融合タンパク質の過剰発現は、ＳＴＦ活性におけるβ−カテニンの要求を大部分迂回した（データは示さず）。ｂと同様に、各化合物の希釈点に対応するレポーター活性をＤＭＳＯ中のレポーター活性に正規化し、パーセンテージとして表した。ＸＡＶ９３９はβ−カテニンの存在量を減少させ、Ａｘｉｎおよびホスホ−β−カテニンの存在量を増加させる。ＳＷ４８０細胞を１μＭのＸＡＶ９３９またはＬＤＷ６４３で一夜処理し、細胞質タンパク質について分画し、記載の抗体でイムノブロットした。 β−カテニンに対するＸＡＶ９３９の効果はＡｘｉｎ依存的である。Ａｘｉｎ１およびＡｘｉｎ２ｓｉＲＮＡの両方または対照ｐＧＬ２ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＳＷ４８０細胞を、３μＭのＸＡＶ９３９の存在下または非存在下で処理した。次いで細胞質溶解物を単離し、記載の抗体でイムノブロットした。図２：細胞効果標的の同定。１ｎＭ〜１００μＭの範囲で１０倍増加段階の漸増用量の化合物ＸＡＶ９３９およびその不活性アナログＬＤＷ６４３での用量応答化合物競合実験からの、溶解物におけるＴＮＫＳ１／２、ＰＡＲＰ１、ＰＡＲＰ２についてのイムノブロット分析。ＸＡＶ９３９はＴＮＫＳ１およびＴＮＫＳ２のＰＡＲＰドメインと高い親和性で直接結合する。ＧＳＴ−ＴＮＫＳ１およびＴＮＫＳ２を、Ｃｙ５と結合したＸＡＶ９３９とインキュベートした。生ｍＰ[1000 x （S-G*P/S+G*P）]データを保存し、一部合計結合飽和（one-site total binding saturation）アルゴリズムで分析した。図３：タンキラーゼはＡｘｉｎタンパク質レベルを調節する。ＴＮＫＳ１およびＴＮＫＳ２の同時欠損は、Ａｘｉｎタンパク質レベルの上昇およびβ−カテニンタンパク質レベルの低下によって、ＸＡＶ９３９を表現型模写する。ＳＷ４８０細胞をＰＡＲＰ１、ＰＡＲＰ２、ＴＮＫＳ１およびＴＮＫＳ２に対するｓｉＲＮＡシングルトンで、記載した組合せでトランスフェクトした。ＴＮＫＳ１およびＴＮＫＳ２の両方について、ＡおよびＢとラベルした固有の標的配列から生じた２つの独立ｓｉＲＮＡを実験に用いた。細胞質タンパク質をトランスフェクションの４８時間後に採取し、記載の抗体で分析した。ＴＮＫＳ１およびＴＮＫＳ２の欠損は、Ａｘｉｎ１のタンパク質レベルを上昇させ、Ｗｎｔ３ａ誘導性β−カテニン蓄積を阻止する。ＨＥＫ２９３細胞をＴＮＫＳ１またはＴＮＫＳ２に対する個々のｓｉＲＮＡで、記載の組合せでトランスフェクトした。上の図はＡｘｉｎ１の発現をトランスフェクションの４８時間後にイムノブロットで分析した。下の図は、トランスフェクションの４８時間後に細胞をＷｎｔ３Ａ調節培地で処理した。次いで細胞質β−カテニンを単離し、イムノブロットで測定した。ＴＮＫＳ１およびＴＮＫＳ２の欠損はＷｎｔレポーターを特異的に阻害する。ＨＥＫ２９３ＣＲＥおよびＳＴＦレポーター細胞系を記載のｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、ForskolinおよびＷｎｔ３Ａ調節培地でそれぞれ刺激し、ルシフェラーゼ活性を測定した。データはｐＧＬ２対照ｓｉＲＮＡに対して正規化し、阻害のパーセンテージとして表す。ＴＮＫＳのノックダウンによってショウジョウバエＳ２細胞のＡｘｉｎタンパク質レベルが上昇する。ＤＡｘｉｎ−３ｘＨＡを安定的に発現するＳ２細胞を対照ｄｓＲＮＡ（白）またはショウジョウバエＴＮＫＳに対するｄｓＲＮＡとインキュベートした。ＤＡｘｉｎ−３ｘＨＡのタンパク質およびｍＲＮＡレベルをイムノブロット（左図）およびｑＰＣＲ（右図）で検出した。ＴＮＫＳノックダウンはショウジョウバエＳ２細胞のＷｎｔレポーターを特異的に阻害する。Ｓ２を記載のｄｓＲＮＡで処理し、一時的にＷｎｔ（ＬＥＦ−Ｌｕｃ）、ＢＭＰ（ＢＲＥ−Ｌｕｃ）およびＪＡＫ／ＳＡＴ（Ｄｒａｆ−Ｌｕｃ）レポーターでトランスフェクトし、適切なリガンド（無翅調節培地、ＢＭＰ２およびＵＰＤ調節培地）で刺激して、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。触媒的に不活性ではないが野生型のＴＮＫＳ２は、Ａｘｉｎ１のＴＮＫＳ１／２ｓｉＲＮＡ誘導性蓄積を救う。安定的に誘導可能なｓｉＲＮＡを発現し、耐性およびＦｌａｇタグ化野生型（ＷＴ）または触媒的に不活性（Ｍ１０５４Ｖ）なＨＥＫ２９３細胞を、ＴＮＳＫ１およびＴＮＫＳ２に対するｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。外因的ＴＮＫＳ２のドキシサイクリン（ＤＯＸ）誘導性発現の後、細胞融解物を採取し、イムノブロットで分析した。ＸＡＶ９３９はＴＮＫＳの自己ＰＡＲシレーション（autoparsylation）を阻害する。１μＭのタンパク質（ＧＳＴ−ＴＮＫＳ２−ＳＡＭ−ＰＡＲＰ１）を３０℃で、ＤＭＳＯ中５μＭのビオチン−ＮＡＤまたは２μＭのＸＡＶ９３９もしくはＬＤＷ６４３と混合した。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットで分析した。図４：タンキラーゼはＡｘｉｎと物理的および機能的に相互作用する。内因性Ａｘｉｎ２とＴｎｋｓの免疫共沈降。ＳＷ４８０細胞を対照ｓｉＲＮＡまたはＡｘｉｎ２ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、細胞溶解物を抗Ａｘｉｎ２抗体またはＩｇＧで免疫沈降した。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、記載の抗体でブロットした。酵母２ハイブリッドアッセイを用いたＡｘｉｎ１のＴＮＫＳ結合ドメインのマッピング。左図は、酵母２ハイブリッドアッセイでＴｎｋｓとの結合に使用されたＡｘｉｎ１タンパク質フラグメントのスキームを図示している。右図は酵母２ハイブリッドアッセイにおけるＴＮＫＳとＡｘｉｎ１のタンパク質フラグメント結合強度の概略を表にしている（＋強い結合、＋／−弱い結合、−結合せず）。既知のＡｘｉｎ１結合分子であるＧＳＫ３βを対照として用いた。Ｎ８８フラグメントは部分的自己活性化活性を保持することに注意されたい。Ｆｌａｇ−ＴＮＫＳ１を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞の細胞溶解物を、記載のＧＳＴ融合タンパク質とインキュベートして沈殿させた後、記載の抗体でイムノブロットして分析した。ＧＳＴ−ＡｘｉｎＮはＧＳＴと融合したＡｘｉｎ１のアミノ末端８７アミノ酸残基から成る。Ａｘｉｎ１タンパク質とＴＮＫＳ１の免疫共沈降。記載の構築物でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の細胞溶解物を、抗Ｆｌａｇ抗体で免疫沈降し、イムノブロットで分析した。ＴＮＫＳ結合ドメインはＸＡＶ９３９誘導性Ａｘｉｎ１タンパク質蓄積に必要である。記載のＧＦＰ−Ａｘｉｎ融合構築物を発現するＳＷ４８０細胞系を、レトロウイルス感染によって確立し、ＸＡＶ９３９で一夜処理した。全細胞溶解物を収穫し、イムノブロットで分析した。Ａｘｉｎ１のアミノ末端フラグメントの過剰発現は、内因性Ａｘｉｎ１の蓄積を導く。誘導性ＧＦＰ−Ａｘｉｎ１Ｎ（a.a 1-87）を発現するＨＥＫ２９３細胞系を作成した。ＧＦＰ−Ａｘｉｎ１Ｎの発現は、細胞をドキソサイクリン（ＤＯＸ）で２４時間処理して誘導した。全細胞溶解物を収穫し、イムノブロットで分析した。酵母２ハイブリッドアッセイにおいてＡｘｉｎ１との結合について、およびＨＥＫ２９３細胞で過剰発現したときのＳＴＦレポーターに対する効果について、多様なＴＮＫＳ１フラグメントを試験した。左図はＴＮＫＳ１構造のスキームおよびそれらのＡｘｉｎ１との結合能の要約である。これらの構築物のＡｘｉｎ１とのＡｘｉｎ１結合活性は、「β−Ｇａｌアッセイ」の下の真ん中の列に示す。右図はＳＴＦレポーターに対するＴＮＫＳ１構築物の効果である。ＴＮＫＳ１構築物を一時的にＨＥＫ２９３ＳＴＦレポーター細胞にトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後にルシフェラーゼ活性についてアッセイした。（ＩＰ：免疫沈降、ＴＣＬ：総細胞溶解物）図５：ＸＡＶ９３９はＡｘｉｎタンパク質レベルを安定化し、Ａｘｉｎユビキチン化を阻害する。ＡｘｉｎはＸＡＶ９３９で安定化される。ＳＷ４８０細胞をＤＭＳＯまたは１μＭのＸＡＶ９３９で２時間処理した後、材料および方法に記載のとおり、パルスチェイス分析を行った。細胞溶解物はＲＩＰＡバッファーで調製し、抗Ａｘｉｎ２抗体で免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、次いでPhosphoImagerで分析した。ＴＮＫＳ２によるＡｘｉｎ１フラグメントのインビトロＰＡＲシレーション。組換えＴＮＫＳ２およびＧＳＴ−Ａｘｉｎ１（a.a. 1-280）をビオチン−ＮＡＤ^＋とインキュベートした。反応はＸＡＶ９３９の存在下または非存在下で実施し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ストレプトアビジン−AlexaFluor680でプローブした。Ａｘｉｎユビキチン化はＸＡＶ９３９で阻害される。ＳＷ４８０細胞を１μＭのＸＡＶ９３９で４時間前処理し、続いて２０μＭのＭＧ１３２でさらに２時間処理した。細胞溶解物をＲＩＰＡバッファーで収穫し、対照ＩｇＧまたは抗ユビキチン抗体で免疫沈降し、記載の抗体でイムノブロットして分析した。Ａｘｉｎ１が移動する位置は矢印で標識する。ゆっくりと移動するポリユビキチン化Ａｘｉｎ１複合体が示される。Ａｘｉｎ１のインビボＰＡＲシレーション。メタロチオネインプロモーターの制御下でＧＦＰ−Ａｘｉｎ１を安定的に発現するＳＷ４８０細胞を、Ｃｕ^２＋と共に一夜インキュベートして、ＧＦＰ−Ａｘｉｎ１の発現を誘導した。細胞をＸＡＶ９３９でさらに６時間処理した。ＰＡＲＧ阻害剤ＡＤＰ−ＨＰＤ（５μＭ）およびＰＡＲＰ１阻害剤ＰＪ３４（８０μＭ）を含むＲＩＰＡバッファーで溶解物を収穫し、ＧＦＰ抗体で免疫沈降し、イムノブロットで分析した。化合物ウォッシュオフ実験におけるＡｘｉｎ２の翻訳後修飾。ＳＷ４８０細胞を１μＭのＸＡＶ９３９で一夜処理し、新鮮な培地で洗浄してＸＡＶ９３９を除去し、次いで、記載の化合物を補った培地で１時間インキュベートした。細胞溶解物をＲＩＰＡバッファーで収穫し、抗Ａｘｉｎ２抗体で免疫沈降し、イムノブロットで分析した。Ａｘｉｎ２が移動する位置を矢印で示す。（ＩＰ：免疫沈降、ＴＣＬ：総細胞溶解物）図６：ＸＡＶ９３９はＡｘｉｎ依存的にＤＬＤ１コロニー形成を阻害する。ＸＡＶ９３９はＤＬＤ１細胞のコロニー形成を阻害するが、ＲＫＯ細胞のコロニー形成は阻害しない。６ウェルプレート中の０．５％の血清と記載の化合物を含む培地にＤＬＤ１およびＲＫＯ細胞を５００細胞／ウェルで播種し、２日ごとに新鮮な培地を補充した。コロニーはクリスタルバイオレット染色で可視化した。ＤＬＤ１コロニー形成に対するＸＡＶ９３９の効果はＡｘｉｎ依存的である。ＤＬＤ１細胞をＡｘｉｎ１およびＡｘｉｎ２に対するｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、１０００細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種した。化合物処理は６Ａに記載のとおりに実施した。図７は、ＡＰＣ変異機能の喪失を有するがん、β−カテニン活性化変異機能の獲得を有するがんおよび／またはβ−カテニン標的遺伝子Ａｘｉｎ２の高い発現レベルによって示される活性化されたＷｎｔシグナル伝達を有するがんを含む、活性化されたＷｎｔシグナル伝達によって特徴付けられる多様ながんモデルの増殖阻害についての、本発明の化合物の能力を示す。３つの代表例を図に示し、これはＡＰＣ変異を有する結直腸癌細胞系ＳＷ４０３、β−カテニン変異を有する結直腸癌細胞系ＨｕＴｕ−８０、そして定量的ＰＣＲおよび遺伝子発現マイクロアレイの両方によって示される高いレベルのＡｘｉｎ２遺伝子発現を有する胃癌細胞型ＮＣＩ−Ｎ８７を含む。クローン原性アッセイのために、１０％胎児ウシ血清を補った細胞培養培地中で細胞を培養し、密度１０００〜３０００細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種し、ＸＡＶ９３９で１２日間処理した。化合物は３日ごとに補充した。コロニーはクリスタルバイオレットで固定し、染色して可視化した。定量的ＰＣＲのために、全ＲＮＡを細胞から単離し、逆転写反応を用いてｃＤＮＡを作成した。Advanced Biosystems（ＡＢＩ）のＡｘｉｎ２特異的プローブプライマーを用いて定量的ＰＣＲを実施した。

発明の詳細な説明
本発明は、例えばＷｎｔ経路シグナル伝達の調節剤、例えばＡｘｉｎ安定化剤または脱安定化剤および／またはＴＮＫＳ調節剤（例えば低分子、例えば本発明の化合物、阻害核酸、融合タンパク質等）の使用によって、Ｗｎｔシグナル伝達関連障害（例えば結直腸癌）を診断し、その症状を改善し、それから保護し、処置する方法を提供する。

本発明の目的のため、そして本発明により詳細に説明されるとおり、「本発明の化合物」および同様の用語は、Ａｘｉｎ安定化を介してＷｎｔ経路シグナル伝達を阻害し、アンタゴナイズし、軽減しまたは弱める化合物を記載するために使用する。当該化合物はＸＡＶ９３９を含むがこれに限定されない。該化合物は他の低分子量ＰＡＲＰ阻害剤を含んでいてもよく、これは他のＰＡＲＰのものと比較して、ＴＮＫＳ１および／またはＴＮＫＳ２の触媒活性を優先的に阻害する。

一つの態様において、本発明のＡｘｉｎ安定化剤（例えば本発明の化合物、例えばＸＡＶ９３９）を用いて、Ｗｎｔシグナル伝達の異常なアップレギュレーションに関連したＷｎｔシグナル伝達障害（例えばがん、骨関節炎および多発性嚢胞腎疾患）を処置してもよい。

他の態様において、Ａｘｉｎ安定化は、Ｗｎｔシグナル伝達の異常なダウンレギュレーションに関連したＷｎｔシグナル伝達障害（例えば骨粗鬆症、肥満、糖尿病および神経変性疾患）が改善され得るように調節され得る。例えば、Ａｘｉｎの安定化を防止することができる低分子、融合タンパク質または抗体の投与は、β−カテニンの安定化を促進する（したがってＷｎｔ経路シグナル伝達をもたらす）。

かかる方法は、例えばＷｎｔ受容体を有する上皮細胞を処置するために、細胞レベルで使用することができる。例えば、対象方法は基底細胞癌腫または他のＷｎｔシグナル伝達関連障害（例えば異常な細胞増殖によって特徴付けられるもの）の処置または予防に使用することができる。対象方法はまた、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害し、またはその阻害をアゴナイズすることによって、細胞増殖、異常またはその他のものを予防するために使用してもよい。かかる方法はインビトロまたはインビボで使用してもよい。

本発明はまた、例えばＡｘｉｎ安定化剤および／またはＴＮＫＳ調節剤（例えば低分子、阻害核酸、融合タンパク質等）の使用によって、Ｗｎｔ経路シグナル伝達を調節する方法を提供する。一つの態様において、本発明の方法は、例えばＡｘｉｎ安定化剤および／またはＴＮＫ調節剤（例えば低分子、阻害核酸、融合タンパク質等）の使用によって、Ｗｎｔ経路シグナル伝達を阻害し、またはその阻害をアゴナイズすることを含む。Ａｘｉｎ安定化に寄与する（それによって、β−カテニンリン酸化および分解に寄与する）薬物は、Ｗｎｔ経路シグナル伝達の阻害を導き；逆に、Ａｘｉｎ安定化を低減する（それによって、β−カテニンを安定化する）薬物は、Ｗｎｔ経路シグナル伝達の増加を導く。

本発明はまた、Ｗｎｔ経路シグナル伝達のアゴニストおよびアンタゴニストを同定し、試験する方法、ならびにＷｎｔ経路のメンバー（例えばＡｘｉｎ、ＴＮＫＳ）のアゴニストおよびアンタゴニストを同定し、試験する方法を提供する。Ａｘｉｎタンパク質レベルの安定化および上昇によってＷｎｔ経路シグナル伝達が阻害されならびにＴＮＫＳの阻害によってＷｎｔ経路シグナル伝達が阻害されるという本発見は、この安定化を促進し、またはそれに干渉し、それによってインビトロまたはインビボでＷｎｔ経路シグナル伝達に干渉する薬物を同定するために有用である。したがって本発見はまた、Ａｘｉｎ安定化剤の非存在および存在（そして得られるＷｎｔ経路シグナル伝達の調節）に関連した障害を処置するために使用することができる薬物を発見するために有用である。

一つの態様において、Ｗｎｔ経路シグナル伝達を調節することができる薬物を同定する方法は、a）試験薬物の存在下および非存在下、Ｗｎｔシグナル伝達を許容する条件下で、Ｗｎｔシグナル伝達経路が活性であり、Ａｘｉｎタンパク質または安定性レベルを測定することができる生物学的サンプルを接触させ；そしてb）前記試験薬物の存在下および非存在下の両方で、Ａｘｉｎタンパク質レベルまたは安定性を測定することを含み、ここで（i）試験薬物の非存在下と比較して、試験薬物の存在下でのＡｘｉｎタンパク質レベルまたは安定性の低下が、該試験薬物をＷｎｔ経路シグナル伝達のアゴニストとして同定し、そして（ii）試験薬物の非存在下と比較して、試験薬物の存在下でのＡｘｉｎタンパク質レベルまたは安定性の上昇が、該試験薬物をＷｎｔ経路シグナル伝達のアンタゴニストとして同定する。

一つの態様において、薬物は低分子であり得る。他の態様において、薬物は阻害核酸であり得る。他の態様において、薬物は融合タンパク質であってもよい。一つの態様において、当該低分子、阻害核酸または融合タンパク質は、Ａｘｉｎと直接作用し得る。他の態様において、かかる低分子、阻害核酸または融合タンパク質は、Ａｘｉｎと間接的に作用し得る（例えば、Ａｘｉｎの結合パートナーまたはＡｘｉｎ結合タンパク質、例えばＧＳＫ３、β−カテニン、ＡＰＣおよびDishevelled、ＰＰ１、ＰＰ２Ａ、カゼインキナーゼ１、ＬＲＰ５／６に対して作用し得る）。

一つの態様において、Ｗｎｔシグナル伝達関連障害の処置に有用な薬物を同定する方法は、a）試験薬物の存在下および非存在下、Ｗｎｔシグナル伝達を許容する条件下で、Ｗｎｔシグナル伝達経路が活性であり、Ａｘｉｎタンパク質レベルを測定することができる生物学的サンプルを接触させ；そしてb）前記試験薬物の存在下および非存在下の両方で、Ａｘｉｎタンパク質レベルを測定することを含み、ここで（i）試験薬物の非存在下と比較して、試験薬物の存在下でのＡｘｉｎタンパク質レベルの低下が、該試験薬物をＷｎｔシグナル伝達の異常なダウンレギュレーションに関連した障害の処置に有用として同定し、そして（ii）試験薬物の非存在下と比較して、試験薬物の存在下でのＡｘｉｎタンパク質レベルの上昇が、該試験薬物をＷｎｔシグナル伝達の異常なアップレギュレーションに関連した障害の処置に有用として同定する。

一つの態様において、Ｗｎｔシグナル伝達関連障害の処置に有用な薬物を同定するための方法は、Ｗｎｔシグナル伝達経路が活性である細胞を試験薬物と接触させ、Ａｘｉｎタンパク質レベルまたは安定性の変化を検出することを含む方法を含む。

本発明は、有効成分として、本明細書に記載されているようなＷｎｔアンタゴニスト（例えばＡｘｉｎ安定化剤および／またはＴＮＫＳアンタゴニスト）を含む医薬組成物であって、（i）インビボで細胞増殖または他のＷｎｔ異常発現の生物学的帰結の阻害；および（ii）Ｗｎｔシグナル伝達関連障害の診断、その症状の改善、それからの保護または処置に十分な量で製剤された医薬組成物を含む。かかる組成物は例えば、薬学的に許容される担体中に、本発明の何れかの態様による化合物、阻害核酸または融合タンパク質またはそれらの何れかの組合せを含んでいてもよい。

他の態様において、腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、それを必要とする対象に有効量のＷｎｔ経路シグナル伝達調節剤、例えばＡｘｉｎ安定化剤および／またはＴＮＫＳアンタゴニスト（例えば低分子、例えば本発明の化合物、阻害核酸、融合タンパク質等、またはそれらの何れかの組合せ）と薬学的に許容される担体を投与することを含む方法を提供する。非限定的な例として、本明細書においてさらに説明されるとおり、本発明の化合物（例えば化合物Ｉ）は、ＡＰＣ欠損を有する結腸癌細胞およびインタクトなＷｎｔシグナル伝達経路を有する細胞系の両方においてＷｎｔシグナル伝達を阻害することができる。また非限定的な例として、本明細書においてさらに説明されるとおり、本発明の化合物（例えば化合物Ｉ）は、インビトロ細胞培養アッセイにおいて、結腸癌細胞の増殖を阻害することができる。

本発明の方法の一つの態様において、本発明の化合物のようなＡｘｉｎ安定化剤が投与される。かかる態様において、Ａｘｉｎ安定化剤はそれが投与される細胞または系におけるＡｘｉｎタンパク質レベルの上昇を導く。結果として、β−カテニンはＧＳＫ３メカニズムを介した同時的リン酸化および分解を起こす。Ａｘｉｎ安定化とβ−カテニン分解の組合せは、Ｗｎｔ経路シグナル伝達の阻害をもたらす。かかる態様の少なくとも一つの有用性は、Ｗｎｔシグナル伝達レベルが異常に高い障害（例えば結腸癌）の処置である。別の有用性は、腫瘍細胞の増殖阻害および／または腫瘍細胞のアポトーシス誘導である。

本発明の方法の一つの態様において、Ａｘｉｎ安定化剤が投与されると、ＧＳＫ３によるＡｘｉｎリン酸化の上昇によって作用する。一つの態様において、ＸＡＶ９３９はＧＳＫ３によるＡｘｉｎリン酸化の上昇を誘導し、それによってＡｘｉｎを安定化し、Ａｘｉｎタンパク質レベルを上昇させ、そしてそれによってＷｎｔシグナル伝達を阻害することができる。

本明細書においてさらに説明するとおり、かかる方法は、まずＷｎｔシグナル伝達関連障害（例えば結直腸癌）に罹患している対象を診断し、次に該対象が異常なＡｘｉｎ安定化および／またはβ−カテニン分解に関連した障害の１種以上のバイオマーカーの存在を示すか否かを検出することを含む。かかるバイオマーカーの存在は、当該対象が「ＴＮＫＳ阻害剤」、「Ａｘｉｎ安定化剤」等を含む処置レジメンから利益を受けるかもしれないことを示す。かかるバイオマーカーの非限定的な例は、（i）腫瘍サプレッサーＡＰＣの切断型変異；（ii）Ａｘｉｎ１およびＡｘｉｎ２変異；（iii）β−カテニン過剰発現；および上昇したＡｘｉｎ−ＧＳＫ３複合体の形成を含む。

定義
用語「処置する」、「処置され」、「処置し」または「処置」は、処置する状態、障害または疾患に関連し、またはそれによって引き起こされる少なくとも１つの症状の消失または軽減を含む。ある態様において、処置は、Ｗｎｔシグナル伝達関連障害の誘導、次いで本発明の化合物の活性化を含み、これは次いで、処置するＷｎｔシグナル伝達関連障害に関連し、またはそれによって引き起こされる少なくとも１つの症状を消失させまたは緩解する。例えば、処置は障害の１つ異常の症状の消失または障害の完全な根絶であり得る。

用語「使用」は、適切であり、便宜であるとき、特に定めの無い限り、次の本発明の態様の何れか１個以上をそれぞれ含む：Ｗｎｔシグナル伝達関連障害の処置における使用；これらの疾患の処置に使用する医薬組成物の製造のための、例えば医薬の製造における、使用；これらの疾患の処置における本発明の化合風ｔの使用方法；これらの疾患の処置のための、本発明の化合物を有する医薬組成物；およびこれらの疾患の処置に使用するための本発明の化合物。特に、処置する疾患、したがって本発明の化合物の使用に好ましい疾患は、がん（例えば結腸癌）および他の増殖性疾患、骨粗鬆症および統合失調症、ならびにＷｎｔシグナル伝達の活性に依存する疾患から選択される。

用語「Ｗｎｔシグナル伝達関連障害」は、異常なＷｎｔシグナル伝達に関連した疾患および状態を意味し、がん（例えば結直腸癌腫（ＣＲＣ）、黒色腫、乳癌、肝臓癌、肺癌および胃癌；他の非がん原性増殖性疾患、例えば増殖性皮膚障害（例えば乾癬、皮膚炎）；骨粗鬆症；骨関節炎；線維症；統合失調症；血管疾患；心臓疾患；および神経変性疾患、例えばアルツハイマー病を含むが、これらに限定されない。Ｗｎｔシグナル伝達の異常なアップレギュレーションは、がん、骨関節炎および多発性嚢胞腎疾患に関連しており、Ｗｎｔシグナル伝達の異常なダウンレギュレーションは骨粗鬆症、肥満、糖尿病および神経変性疾患に関連している。

本明細書において使用するとき、「Ｗｎｔシグナル伝達関連がん」は、結直腸癌腫（ＣＲＣ）、黒色腫、乳癌、肝臓癌、肺癌および胃癌を含むが、これらに限定されない。用語「Ｗｎｔ関連がん」は、本明細書において使用するとき、悪性髄芽腫および他の原発性ＣＮＳ悪性神経外胚葉性腫瘍、横紋筋肉腫、肺癌、特に小細胞肺癌、食道癌、胃癌、膵臓癌および胆管系癌を含むがこれらに限定されない腸由来腫瘍；前立腺癌および膀胱癌、結腸癌および肝臓癌を含む。

用語「Ｗｎｔアンタゴニスト」は、本明細書において使用するとき、本明細書に記載のとおり、Ｗｎｔシグナルの阻害剤またはその阻害のアゴナイザーを含む。一つ以上の態様において、かかるＷｎｔアンタゴニストは、Ａｘｉｎ安定化を介して作用する。一つ以上の態様において、かかるＷｎｔアンタゴニストはＴＮＫＳ拮抗作用を介して（例えばＴＮＫＳの触媒活性を阻害し、それによってＡｘｉｎを安定化して）作用する。Ｗｎｔアンタゴニストは低分子（例えば本発明の化合物）、阻害核酸および融合タンパク質を含むが、これらに限定されない。

用語「ＴＮＫＳアンタゴニスト」、「ＴＮＫＳ阻害剤」等は、本明細書において使用するとき、Ａｘｉｎの安定性を上昇させることができる薬物を意味する。「ＴＮＫＳアンタゴニスト」、「ＴＮＫＳ阻害剤」等は、本発明の化合物のようなＡｘｉｎ安定化剤を含んでいてもよい。ＴＮＫＳアンタゴニストは好ましくは、ＴＮＫＳタンパク質の触媒活性（例えばＡｘｉｎのような標的タンパク質のＰＡＲシレーション能ならびに自己ＰＡＲシレーション能）を低下または阻害して、ＴＮＫＳタンパク質または転写レベルを低下させずに、作用する。ＴＮＫＳアンタゴニストはまた、ＡｘｉｎがＷｎｔの負のレギュレーターであり、ＴＮＫＳがＡｘｉｎと相互作用する（例えばＴＮＫＳノックダウンはＡｘｉｎタンパク質レベルを安定化し、上昇させる）という理由から、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害するとも考えられる。ＴＮＫＳアンタゴニストは、ホスホ−β−カテニンを増加させ、細胞質β−カテニンを減少させ、そしてβ−カテニンｓｉＲＮＡと同様に、β−カテニン標的遺伝子に影響を与える。

用語「Ａｘｉｎ安定化剤」は、本明細書において使用するとき、Ａｘｉｎの安定性を上昇させることができる薬物を意味する。これはβ−カテニンの加速したリン酸化および分解を導く。Ａｘｉｎ安定化剤はまた、ＡｘｉｎがＷｎｔシグナル伝達の負のレギュレーターであるとの理由から、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害するとも考えられる。Ａｘｉｎ安定化剤（例えば本発明の化合物、例えばＸＡＶ９３９）は、細胞において、総β−カテニンの減少およびホスホ−β−カテニンの増加に寄与する。本発明の目的のため、用語「Ａｘｉｎ」はＡｘｉｎ１Ａｘｉｎ２と相互に交換可能なように使用され本発明のＡｘｉｎ安定化剤は、Ａｘｉｎ１およびＡｘｉｎ２両方を安定化し、そのタンパク質レベルを上昇させることができる。さらにまた、「Ａｘｉｎ」は、本明細書において使用するとき、ヒト、マウス、ラットまたは他の種由来のＡｘｉｎ１および／またはＡｘｉｎ２に適用することができる。

用語「Ａｘｉｎ結合タンパク質」は、本明細書において使用するとき、正常な条件下でＡｘｉｎが結合する（例えば直接または間接的に結合し、その標的であり、それとタンパク質複合体を形成し、そして／または影響を示す）Ｗｎｔシグナル伝達経路のタンパク質メンバーを意味する。かかるＡｘｉｎ結合タンパク質は、ＧＳＫ３、β−カテニン、ＡＰＣおよびDishevelled、ＰＰ１、ＰＰ２Ａ、カゼインキナーゼ１、ＬＲＰ５／６を含むが、これらに限定されない。

用語「本発明の化合物」および同様の用語は、さらに本明細書において定義するとおり、例えばＡｘｉｎを安定化する（それによってＷｎｔ経路シグナル伝達を阻害する）ために使用され得る化合物を記載するため、本明細書に置いて使用される。該化合物は、ＸＡＶ９３９を含むが、これに限定されない。該化合物は他の低分子量ＰＡＲＰ阻害剤を含んでいてもよく、これは他のＰＡＲＰのものと比較して、ＴＮＫＳ１および／またはＴＮＫＳ２の触媒活性を優先的に阻害する。

「治癒」は、本明細書において使用するとき、処置によって障害、例えばＷｎｔシグナル伝達関連障害、例えば骨粗鬆症、統合失調症、血管疾患、心臓疾患または神経変性疾患の回復を導くことを意味する。

用語「予防的」または「予防」は、障害、例えばＷｎｔシグナル伝達関連障害の発症または再発を防止することを意味する。

本明細書において使用するとき、用語「病状」は、処置が望まれる１種以上の身体的および／または精神的症状として明らかとなる何れかの状態または疾患を含むが、これらに限定されず、既におよび新たに同定された疾患および他の障害を含む。

本明細書において使用するとき、対象または患者への薬剤または薬物の投与は、自己投与および他人による投与を含む。記載の病状の多様な処置または予防形態は、「実質的」を意味し、これは全体および何らかの生物学的または医学的に関連した結果が得られる全体未満の処置または予防を含むことも理解される。

本明細書において使用するとき、「調節」は、直接または間接的に制御または影響する能力を意味し、非限定的な例として、あるいは刺激し、アゴナイズもしくはアンタゴナイズし、阻止または促進し、そして強化または弱化することを意味し得る。

本明細書において使用するとき、「有機低分子」または「低分子」は、分子量３キロダルトン未満、好ましくは１．５キロダルトン未満を有する有機化合物（または無機化合物、例えば金属と複合体を形成している有機化合物）である。

本明細書において使用するとき、化合物の「有効量」なる用語は、所望の治療および／または予防効果を得るのに十分な量であり、例えば処置する疾患、例えば異常なＷｎｔシグナル伝達に関連した障害に関連した症状の予防または低減をもたらす量である。対象に投与する化合物の量は、疾患のタイプおよび重症度ならびに個体の特徴、例えば一般的な健康、年齢、性別、体重および薬物の耐容性に依存する。それは疾患の程度、重症度およびタイプにも依存する。当業者はこれらおよび他の要因に従って、適切な投与量を決定することができる。典型的には、治療または予防的効果を得るために十分な本発明の化合物の有効量は、約０．０００００１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜約１０，０００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲である。好ましくは、投与量範囲は約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日である。本発明の化合物はまた、互いにまたは１種以上のさらなる治療化合物との組合せで投与してもよい。

用語「対象」は、異常なＷｎｔシグナル伝達に関連した疾患、障害または状態を有し、または罹患し得る生物、例えば原核生物および真核生物を含むことを意図する。対象の例は、哺乳類、例えばイヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラットおよびトランスジェニック非ヒト動物を含む。ある態様において、対象はヒト、例えばがん（例えば結腸癌）および他の増殖性疾患、骨粗鬆症および統合失調症ならびに本明細書に記載の他の疾患または状態（例えばＷｎｔシグナル伝達関連障害）を有する、有する危険がある、または潜在的に有し得るヒトである。他の態様において、対象は細胞である。

本明細書において使用するとき、用語「アリール」は、６〜１４個の環炭素原子を有し、環ヘテロ原子を有さない芳香族性基として定義される。アリール基は単環式または縮合二環式もしくは三環式であってよい。これは非置換であるか、あるいは１個以上、好ましくは１または２個の置換基で置換されていてもよく、ここで該置換基は本明細書に記載のとおりである。本明細書に定義するとおり、アリール基は、これが単環式または二環式であるかに拘わらず、完全に芳香族性であってよい。しかし、本明細書に定義のとおり、それが１個以上の環を含むとき、用語アリールは、少なくとも１個の環が完全に芳香族性であるが、他の環（複数であってもよい）が部分不飽和もしくは飽和または完全に芳香族性でる基を含む。

「Ｈｅｔ」は、本明細書において使用するとき、少なくとも１個のＳ、ＯまたはＮ環ヘテロ原子を含むヘテロアリールおよびヘテロ環式化合物を意味する。より具体的には、「Ｈｅｔ」はＮ、ＯおよびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を含む５〜７員ヘテロ環式環またはＮ、ＯおよびＳから選択される１、２または３個のヘテロ原子を含む少なくとも１個の５〜７員ヘテロ環式環を含む８〜１２員縮合環系である。Ｈｅｔの例は、本明細書において使用するとき、非置換および置換ピロリジル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロチオフリル、ピペリジル、ピペラジル、プリニル、テトラヒドロピラニル、モルホリノ、１，３−ジアザパニル、１，４−ジアザパニル、１，４−オキサゼパニル、１，４−オキサチアパニル、フリル、チエニル、ピリル、ピロリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、インダゾリル、オキサジアゾリル、イミダゾリル、ピロリジル、ピロリジニル、チアゾリル、オキサゾリル、ピリジル、ピラゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、イソオキサゾリル、ピラジニル、キノリル、イソキノリル、ピリドピラジニル、ピロロピリジル、フロピリジル、インドリル、ベンゾフリル、ベンゾチオフリル、ベンゾインドリル、ベンゾチエニル、ピラゾリル、ピペリジル、ピペラジニル、インドリニル、モルホリニル、ベンゾオキサゾリル、ピロロキノリル、ピロロ［２，３−ｂ］ピリジニル、ベンゾトリアゾリル、オキソベンゾ−オキサゾリル、ベンゾ［１，３］ジオキソリル、ベンゾイミダゾリル、キノリニル、インダニル等を含むが、これらに限定されない。ヘテロアリールはＨｅｔの定義に範囲に含まれる。ヘテロアリールの例は、ピリジル、ピリミジニル、キノリル、チアゾリルおよびベンゾチアゾリルである。最も好ましいＨｅｔは、ピリジル、ピリミジニルおよびチアゾリルである。Ｈｅｔは非置換であるか、あるいは本明細書に記載のとおりに置換されていてもよい。非置換であるか、または置換されているとき、これは炭素原子上でハロゲン、特にフッ素または塩素、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、例えばメチルおよびエチル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、特にメトキシおよびエトキシ、ニトロ、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４アルキルまたは−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｃ１−Ｃ４アルキル、ＳＣＮまたはニトロで、あるいは窒素原子上でＣ１−Ｃ４アルキル、特にメチルまたはエチル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４アルキルまたは−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｃ１−Ｃ４アルキル、例えばカルボメトキシまたはカルボエトキシで置換されていることが好ましい。

２個の置換基が共通して結合している窒素と一体となってＨｅｔであるとき、得られるヘテロ環式環は窒素含有環、例えばアジリジン、アゼチジン、アゾール、ピペリジン、ピペラジン、モルフィリン、ピロール、ピラゾール、チアゾール、オキサゾール、ピリジン、ピリミジン、イソキサゾール等であると理解され、ここで該Ｈｅｔは非置換であるか、あるいは上記定義のとおり置換されていてもよい。

ハロはハロゲンであり、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素、特にフッ素および塩素であってよい

特に定めのない限り、用語「アルキル」は、飽和脂肪族基、例えば直鎖アルキル基（）例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル等）、分枝鎖アルキル基（イソプロピル、tert-ブチル、イソブチル等）、シクロアルキル（脂環式）基（シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル）、アルキル置換シクロアルキル基およびシクロアルキル置換アルキル基を含む。用語「アルキル」はまた、アルケニル基およびアルキニル基を含む。さらに、「Ｃｘ−Ｃｙ−アルキル」なる表現（ここで、ｘは１〜５であり、ｙは２〜１０である）は、特定の範囲の炭素の特定のアルキル基（直鎖または分枝鎖）を意味する。例えば、Ｃ１−Ｃ４−アルキルなる表現は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、tert-ブチルおよびイソブチルおよびsec-ブチルを含むが、これらに限定されない。さらに、用語Ｃ３−７−シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシルおよびシクロヘプチルを含むが、これらに限定されない。次に記載のとおり、これらのアルキル基およびシクロアルキル基はさらに置換されていてもよい。

さらに、用語アルキルは、炭化水素主鎖の１個以上の炭素に代えて、酸素、窒素、硫黄およびリン原子をさらに含んでいてもよいアルキル基を含む。ある態様において、直鎖または分枝鎖アルキルは、その主鎖に１０個以下の炭素原子を有し（例えば直鎖についてＣ１−Ｃ１０、分枝鎖についてＣ３−Ｃ１０）、より好ましくは６個以下の炭素を有する。同様に、好ましいシクロアルキルは、その環構造に４〜７個の炭素原子を有し、より好ましくは環構造に５または６個の炭素原子を有する。

さらにまた、アルキル（例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル等）は、「非置換アルキル」および「置換アルキル」の両方を含み、後者は炭化水素主鎖の１個以上の炭素上の水素を置換する置換基を有するアルキル基を意味し、これは該分子がその意図した機能を発揮することを許容する。

「シクロアルキル」基は、３〜１０個の環炭素原子を有するＣ３−Ｃ１０シクロアルキルを意味し、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルまたはシクロオクチル、シクロノニル等であってよい。該シクロアルキル基は、単環式または縮合二環式であってよい。さらに、好ましいシクロアルキル基は、シクロペンチルまたはシクロヘキシルである。最も好ましくは、シクロアルキルはシクロヘキシルである。シクロアルキル基は完全飽和または部分不飽和であってよいが、それが完全飽和であることが好ましい。本明細書に定義のとおり、これはアリール基を含まない。シクロアルキル基は非置換であるか、あるいは次に定義の何れかの置換基、好ましくはハロ、ヒドロキシまたはＣ１−Ｃ６アルキル、例えばメチルで置換されていてもよい。

用語「置換」は、分子の１個以上の原子、例えばＣ、ＯまたはＮ上の水素を置換する置換基を有する基を説明することを意図する。かかる置換基は、電子求引基または電子求引原子を含んでいてもよい。かかる置換基は、例えばオキソ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルホヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロ環式、アルキルアリール、モルホリノ、フェノール、ベンジル、フェニル、ピペリジン、シクロペンタン、シクロヘキサン、ピリジン、５Ｈ−テトラゾール、トリアゾール、ピペリジンまたは芳香族性もしくはヘテロ芳香族性基およびそれらの何れかの組合せを含んでいてもよい。

非置換は、置換基が水素のみであることを意図する。

本明細書に記載されているものを除いて、上記定義のアリール、Ｈｅｔ、アルキル、アルケニル、アルキニルまたはシクロアルキルの何れかは、非置換であるか、あるいは独立して４個まで、好ましくは１、２または３個の置換基で置換されていてもよく、該置換基は次の群：ハロ（例えばＣｌまたはＢｒ）；ヒドロキシ；低級アルキル（例えばＣ１−Ｃ３アルキル）；本明細書に定義の何れかの置換基で置換されていてもよい低級アルキル；低級アルケニル；低級アルキニル；低級アルカノイル；低級アルコキシ（例えばメトキシ）；アリール（例えばフェニルまたはナフチル）；置換アリール（例えばフルオロフェニルまたはメトキシフェニル）；アリール低級アルキル、例えばベンジル、アミノ、モノもしくはジ低級アルキル（例えばジメチルアミノ）；低級アルカノイルアミノアセチルアミノ；アミノ低級アルコキシ（例えばエトキシアミン）；ニトロ；シアノ；シアノ低級アルキル；カルボキシ；低級カルボアルコキシ（例えばメトキシカルボニル；ｎ−プロポキシカルボニルまたはイソプロポキシカルボニル）、低級アリーロイル、例えばベンゾイル；カルバモイル；Ｎ−モノ−もしくはＮ，Ｎジ−低級アルキルカルバモイル；低級アルキルカルバミン酸エステル；アミジノ；グアニジン；ウレイド；メルカプト；スルホ；低級アルキルチオ；スルホアミノ；スルホンアミド；ベンゾスルホンアミド；スルホネート；スルファニル低級アルキル（例えばメチルスルファニル）；スルホアミノ；アリールスルホンアミド；ハロゲン置換または非置換アリールスルホネート（例えばクロロ−フェニルスルホネート）；低級アルキルスルフィニル；アリールスルフィニル；アリール−低級アルキルスルフィニル；低級アルキルアリールスルフィニル；低級アルカンスルホニル；アリールスルホニル；アリール−低級アルキルスルホニル；低級アリールアルキル；低級アルキルアリールスルホニル；ハロゲン−低級アルキルメルカプト；ハロゲン−低級アルキルスルホニル；例えばトリフルオロメタンスルホニル；ホスホノ（−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２）；ヒドロキシ−低級アルコキシホスホリルまたはジ−低級アルコキシホスホリル；ウレアおよび置換ウレア；アルキルカルバミン酸エステルもしくはカルバメート（例えばエチル−Ｎ−フェニル−カルバメート）；または低級アルキル（例えばメチル、エチルまたはプロピル）から選択される。

ある態様において、上記アルキル、シクロアルキルおよびアリール基は、独立して非置換であるか、あるいは低級アルキル、アリール、アリール低級アルキル、カルボキシ、低級カルボアルコキシ、特にハロゲン、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＯＣＨ３、−ＳＣＨ３、−ＣＮ、−ＳＣＮまたはニトロで置換されている。

本明細書で定義する用語「低級アルキル」は、単独または組み合わせて使用するとき、１〜６個の炭素原子を含むアルキルを意味する。アルキル基は分枝鎖または直鎖状であってよく、上記定義のとおりである。

用語「アルケニル」は、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含む炭化水素基を意味し、上記アルキルと同様の長さおよび可能な置換基を有する不飽和脂肪族基を意味する。本明細書に定義のとおり、これは非置換であるか、あるいは本明細書に記載の置換基で置換されていてもよい。炭素−炭素二重結合は、アルケニル基の何れかの２個の炭素原子間に存在し得る。好ましくは、これは１または２個の炭素−炭素二重結合、より好ましくは１個の炭素−炭素二重結合を含む。アルケニル基は直鎖または分枝鎖状であってよい。例えば、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、２−メチル−１−プロペニル、１，３−ブタジエニル等を含むが、これらに限定されない。用語「低級アルケニル」は、２〜６個の炭素原子を含むアルケニル基を意味する。

例えば、用語「アルケニル」は、直鎖アルケニル基（例えばエテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル等）、分枝鎖アルケニル基、シクロアルケニル（脂環式）基（シクロプロペニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニル）、アルキルまたはアルケニル置換シクロアルケニル基およびシクロアルキルまたはシクロアルケニル置換アルケニル基を含む。用語アルケニルはさらに、炭化水素主鎖の１個以上の炭素に代えて、酸素、窒素、硫黄またはリン原子を含むアルケニル基を含む。ある態様において、直鎖または分枝鎖アルケニル基はその主鎖に６個以下の炭素原子を有する（例えば直鎖についてＣ２−Ｃ６、分枝鎖についてＣ３−Ｃ６）。同様に、シクロアルケニル基はその環構造に３〜８個の炭素原子を有し、より好ましくはその環構造に５または６個の炭素を有する。用語Ｃ２−Ｃ６は、２〜６個の炭素原子を含むアルケニル基を含む。

さらに、用語アルケニルは、「非置換アルケニル」および「置換アルケニル」の両方を含み、後者は炭化水素主鎖の１個以上の炭素上の水素に代えて置換基を有するアルケニル基を意味する。かかる置換基は、例えばアルキル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレートアルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルホヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは芳香族性もしくはヘテロ芳香族性基を含み得る。

本明細書において使用するとき、用語「アリールアルキル」は、架橋アルキレン基で主鎖と結合しているアリール基を意味する。例えば、ベンジル、フェネチル、ナフチルメチル等を含むが、これらに限定されない。同様に、シアノアルキル基は架橋アルキレン基で主鎖と結合しているシアノ基を意味する。

他方、用語「アルキルアリール」は、フェニレン基を介して主鎖と結合しているアルキル基を意味する。例えばメチルフェニル、エチルフェニル等を含むが、これらに限定されない。

本明細書において使用するとき、用語「アルカノイル」は、１個以上の炭素原子がＣ＝Ｏ基で置換されているアルキル鎖を意味する。Ｃ＝Ｏ基は置換基の末端の一方でまたは基の中にに存在していてよい。例えば、ホルミル、アセチル、２−プロパノイル、１−プロパノイル等を含むが、これらに限定されない。

用語「低級チオアルキル」は、硫黄原子で主鎖と結合している、本明細書に定義するアルキル基を意味する。例えば、チオメチル（またはメルカプトメチル）、チオエチル（メルカプトエチル）等を含むが、これらに限定されない。

用語「低級カルボアルコキシ」またはそれと同様の表現は、主鎖との結合がアリール基（Ｃ（Ｏ））を介しているアルコキシカルボニル基を意味する。例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル等を含むが、これらに限定されない。

用語Ｃ（Ｏ）は、ケトン、アルデヒド、または酸もしくは酸誘導体であれ、−Ｃ＝Ｏ基を意味することが理解される。同様に、Ｓ（Ｏ）は−Ｓ＝Ｏ基を意味する。

用語「アルキニル」は、上記アルキルと長さおよび可能な置換基が類似した不飽和脂肪族基であって、少なくとも１個の三重結合を有する基を含む。

例えば、用語「アルキニル」は、直鎖アルキニル基（例えばエチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニル等）、分枝鎖アルキニル基およびシクロアルキルまたはシクロアルケニル置換アルキニル基を含む。用語アルキニルはさらに、炭化水素主鎖の１個以上の炭素に代えて、酸素、窒素、硫黄またはリン原子を含むアルキニル基を含む。ある態様において、直鎖または分枝鎖アルキニル基はその主鎖に６個以下の炭素原子を有する（例えば、直鎖についてＣ２−Ｃ６、分枝鎖についてＣ３−Ｃ６）。用語Ｃ２−Ｃ６は、２〜６個の炭素原子を含むアルキニル基を含む。

さらに、用語アルキニルは、「非置換アルキニル」および「置換アルキニル」の両方を含み、後者は、炭化水素主鎖の１個以上の炭素上の水素に代えて置換基を有するアルキニル基を意味する。かかる置換基は、例えばアルキル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルホヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは芳香族性もしくはヘテロ芳香族性基を含み得る。

用語「アミン」または「アミノ」は、当該技術分野において一般に理解されるとおり、分子または基もしくは官能基の両方に広く適用されると理解され、１級、２級または３級であってよい。用語「アミン」または「アミノ」は、窒素原子が少なくとも１個の炭素、水素またはヘテロ原子と共有結合している化合物を含む。該用語は、例えば、「アルキルアミノ」、「アリールアミノ」、「ジアリールアミノ」、「アルキルアリールアミノ」、「アルキルアミノアリール」、「アリールアミノアルキル」、「アルコアミノアルキル」、「アミド」、「アミド」および「アミノカルボニル」を含むが、これらに限定されない。用語「アルキルアミノ」は、窒素が少なくとも１個のさらなるアルキル基と結合している基および化合物を含む。用語「ジアルキルアミノ」は、窒素原子が少なくとも２個のさらなるアルキル基と結合している基を含む。用語「アリールアミノ」および「ジアリールアミノ」は、窒素が少なくとも１または２個のアリール基と結合している基をそれぞれ含む。用語「アルキルアリールアミノ」、「アルキルアミノアリール」または「アリールアミノアルキル」は、少なくとも１個のアルキル基および少なくとも１個のアリール基と結合しているアミノ基を意味する。用語「アルコアミノアルキル」は、アルキル基と結合している窒素原子と結合した、アルキル、アルケニルまたはアルキニルを意味する。

用語「アミド」、「アミド」または「アミノカルボニル」は、カルボニルまたはチオカルボニル基の炭素と結合している窒素原子を含む化合物または基を含む。該用語は、「アルコアミノカルボニル」または「アルキルアミノカルボニル」基を含み、これらはカルボニル基と結合したアミノ基と結合している、アルキル、アルケニル、アリールまたはアルキニル基を含む。それはアリールアミノカルボニルおよびアリールカルボニルアミノ基を含み、これらはカルボニルまたはチオカルボニル基の炭素と結合しているアミノ基と結合した、アリールまたはヘテロアリール基を含む基を含む。用語「アルキルアミノカルボニル」、「アルケニルアミノカルボニル」、「アルキニルアミノカルボニル」、「アリールアミノカルボニル」、「アルキルカルボニルアミノ」、「アルケニルカルボニルアミノ」、「アルキニルカルボニルアミノ」および「アリールカルボニルアミノ」は、用語「アミド」に含まれる。アミドはウレア基（アミノカルボニルアミノ）およびカルバメート（オキシカルボニルアミノ）も含む。

用語「アリール」は、０〜４個のヘテロ原子を含み得る５および６員単環芳香族性基を含む基を含み、例えばフェニル、ピロール、フラン、チオフェン、チアゾール、イソチアゾール、イミダゾール、トリアゾール、テトラゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジンおよびピリミジン等を含む。さらにまた、用語「アリール」は、多環式アリール基、例えば三環式、二環式基を含み、例えばナフタレン、ベンゾオキサゾール、ベンゾジオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾイミダゾール、ベンゾチオフェン、メチレンジオキシフェニル、キノリン、イソキノリン、アントリル、フェナントリル、ナフトリジン、インドール、ベンゾフラン、プリン、ベンゾフラン、デアザプリンまたはインドリジンを含む。

環構造にヘテロ原子を有するアリール基はまた、「アリールヘテロ環」、「ヘテロ環」、「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香族性」とも称される。芳香環は１個以上の環の位置で、上記置換基、例えばアルキル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アラルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルホヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは芳香族性もしくはヘテロ芳香族性基で置換されていてもよい。アリール基はまた、芳香族性でない脂環式またはヘテロ環式環と縮合または架橋されて、多環（例えばテトラリン）を形成してもよい。

用語「ヘテロアリール」は、本明細書において使用するとき、各環に７個までの原子を有し、少なくとも１個の環が芳香族性であり、Ｏ、ＮおよびＳから成る群から選択される１〜４個のヘテロ原子を含む、安定な単環式または二環式環を意味する。この定義の範囲内のヘテロアリール基は、アクリジニル、カルバゾリル、シノリニル、キノキサリニル、ピラゾリル、インドリル、ベンゾトリアゾリル、フラニル、チエニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、キノリニル、イソキノリニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、インドリル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリル、テトラヒドロキノリンを含むが、これらに限定されない。下記ヘテロ環の定義のとおり、「ヘテロアリール」はまた、何れかの窒素含有ヘテロアリールのＮ−オキシド誘導体を含むと理解される。ヘテロアリール置換基が二環式であり、一方の環が非芳香族性であるかまたはヘテロ原子を含まないとき、結合は芳香環またはヘテロ原子含有環をそれぞれ介すると理解される。

用語「ヘテロ環」または「ヘテロシクリル」は、本明細書において使用するとき、Ｏ、ＮおよびＳから成る群から選択される１〜４個のヘテロ原子を含む、５〜１０員芳香族性または非芳香族性ヘテロ環を意味し、二環式基を含む。「ヘテロシクリル」は、したがって、上記ヘテロアリールならびにそのジヒドロおよびテトラヒドロアナログを含む。さらなる「ヘテロシクリル」の例は、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾフラザニル、ベンゾピラゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、カルバゾリル、カルボリニル、シノリニル、フラニル、イミダゾリル、インドリニル、インドリル、インドラジニル、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ナフトピリジニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、オキサゾリン、イソキサゾリン、オキセタニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドピリジニル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、テトラヒドロピラニル、テトラゾリル、テトラゾロピリジル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、アゼチジニル、１，４−ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピリジン−２−オニル、ピロリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジヒドロベンゾイミダゾリル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンゾオキサゾリル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジアゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、ジヒドロアゼチジニル、メチレンジオキシベンゾイル、テトラヒドロフラニルおよびテトラヒドロチエニル、ならびにそれらのＮ−オキシドを含むが、これらに限定されない。ヘテロシクリル置換基の結合は、炭素原子またはヘテロ原子を介して生じ得る。

用語「アシル」は、アシル基（ＣＨ_３ＣＯ−）またはカルボニル基を含む化合物および基を含む。用語「置換アシル」は、１個以上の水素原子が例えば、アルキル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルホヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは芳香族性もしくはヘテロ芳香族性基で置換されたアシル基を含む。

用語「アシルアミノ」は、アシル基がアミノ基と結合している基を含む。例えば、該用語は、アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイド基を含む。

用語「アルコキシ」は、酸素原子と共有結合している、置換および非置換アルキル、アルケニルおよびアルキニル基を含む。アルコキシ基の例は、メトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、プロポキシ、ブトキシおよびペントキシ基を含み、シクロペントキシのような環式基を含んでいてもよい。置換アルコキシ基の例は、ハロゲン化アルコキシ基を含む。該アルコキシ基は、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルホヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは芳香族性もしくはヘテロ芳香族性基のような基で置換されていてよい。ハロゲン置換アルコキシ基の例は、フルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、クロロメトキシ、ジクロロメトキシ、トリクロロメトキシ等を含むが、これらに限定されない。

用語「カルボニル」または「カルボキシ」は、酸素原子と二重結合で結合した炭素を含む化合物および基、ならびにその互変異性体を含む。カルボイルを含む基の例は、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、アミド、エステル、無水物等を含む。用語「カルボキシ基」または「カルボニル基」は、アルキル基がカルボニル基と共有結合している「アルキルカルボニル」基、アルケニル基がカルボニル基と共有結合している「アルケニルカルボニル」基、アルキニル基がカルボニル基と共有結合している「アルキニルカルボニル」基、アリール基がカルボニル基と共有結合している「アリールカルボニル」基のような基を意味する。例えば、該用語は、例えばアミノカルボニル基（ここで、窒素原子はカルボニル基の炭素と結合している、例えばアミド）、アミノカルボニルオキシ基（ここで、酸素および窒素原子はいずれもカルボニル基の炭素と結合している、例えばカルバメートとも称するのような基を含む。さらにまた、アミノカルボニルアミノ基（例えばウレア）はまた、ヘテロ原子（窒素、酸素、硫黄等、ならびに炭素原子）と結合したカルボニル基の他の組合せも含む。さらにまた、ヘテロ原子がさらに、１個以上のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、アシル等の基で置換されていてもよい。

用語「チオカルボニル」または「チオカルボキシ」は、二重結合で硫黄原子と結合した炭素を含む化合物および基を含む。用語「チオカルボニル基」は、カルボニル基と同様の基を含む。例えば、「チオカルボニル」基はアミノ基がチオカルボニル基の炭素原子と結合しているアミノチオカルボニルを含み、さらにまた、他のチオカルボニル基はオキシチオカルボニル（炭素原子と結合した酸素）、アミノチオカルボニルアミノ基等を含む。

用語「エーテル」は、２個の異なる炭素原子またはヘテロ原子と結合した酸素を含む化合物または基を含む。例えば、該用語は「アルコキシアルキル」を含み、これは別のアルキル基と共有結合している酸素原子と共有結合したアルキル、アルケニルまたはアルキニル基を意味する。

用語「エステル」は、カルボニル基の炭素と結合している酸素原子と結合した炭素またはヘテロ原子を含む化合物および基を含む。用語「エステル」は、アルコキシカルボキシ基、例えばメトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、ペントキシカルボニル等を含む。アルキル、アルケニルまたはアルキニル基は上記定義のとおりである。

用語「チオエーテル」は、２個の異なる炭素またはヘテロ原子と結合した硫黄原子を含む化合物および基を含む。チオエーテルの例は、アルコチオアルキル、アルコチオアルケニルおよびアルコチオアルキニルを含むが、これらに限定されない。用語「アルコチオアルキル」は、アルキル基と結合している硫黄原子と結合したアルキル、アルケニルまたはアルキニルを有する化合物を含む。同様に、用語「アルコチオアルケニル」および「アルコチオアルキニル」は、アルキル、アルケニルまたはアルキニル基がアルキニル基と共有結合している硫黄原子と結合している化合物または基を意味する。

用語「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」は、−ＯＨまたは−Ｏ−を有する基を含む。

用語「ハロゲン」はフッ素、臭素、塩素、ヨウ素等を含む。用語「過ハロゲン化」は一般に、全ての水素がハロゲン原子で置換されている基を意味する。

用語「多環」または「多環式基」は、２個以上の環（例えばシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリールおよび／またはヘテロシクリル）を有する基であって、２個以上の炭素が２個の隣接する環で共通している基を意味し、例えばかかる環は「縮合環である」。非隣接原子を介して結合している環は「架橋」環と称される。多環のそれぞれの環は、上記の置換基、例えばハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アラルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルホヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキル、アルキルアリールまたは芳香族性もしくはヘテロ芳香族性基で置換されていてもよい。

用語「ヘテロ原子」は、炭素または水素以外の何れかの元素の原子を含む。好ましいヘテロ原子は、窒素、酸素、硫黄およびリンである。

用語「電子求引基」または「電子求引原子」は、当該技術分野で理解され、隣接する原子から価電子を誘引する、すなわち置換基が隣接する原子に対して電気的に陰性である置換基の傾向を意味する。電子求引能レベルの定量は、Hammett sigma（Σ）定数によって与えられる。この周知の定数は、多くの文献、例えばJ. March, Advanced Organic Chemistry, McGraw Hill Book Company, New York, (1977 edition) pp. 251-259に記載されている。Hammett定数値は一般に、電子供与基で負であり（ＮＨ２について、Σ［Ｐ］＝−０．６６）、電子求引基は正である（ニトロ基について、Σ［Ｐ］＝０．７８）。ここでΣ［Ｐ］は、パラ置換を示す。電子求引基の例は、ニトロ、アシル、ホルミル、スルホニル、トリフルオロメチル、シアノ、クロライド、カルボニル、チオカルボニル、エステル、イミノ、アミド、カルボン酸、スルホン酸、スルフィン酸、スルファミン酸、ホスホン酸、ボロン酸、硫酸エステル、ヒドロキシル、メルカプト、シアノ、シアネート、チオシアネート、イソシアネート、イソチオシアネート、カルボネート、ニトレートおよびニトロ基等を含むが、これらに限定されない。電子求引原子の例は、酸素原子、窒素原子、硫黄原子またはハロゲン原子、例えばフッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子を含むが、これらに限定されない。特に定めのない限り、本明細書における酸性官能基についての記載は、好適なカチオンとの組合せにおける当該官能基の塩も含むことが理解される。

さらに、用語「その何れかの組合せ」は、列挙した官能基および分子の何れかのメンバーを組み合わせて、より大きな分子構造を創出し得ることを意味している。例えば、用語「フェニル」、「カルボニル」（または「＝Ｏ」）、「−Ｏ−」、「−ＯＨ」およびＣ１−６（すなわち、−ＣＨ３および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）を組み合わせて、３−メトキシ−４−プロポキシ安息香酸置換基を形成してよい。官能基および分子を組み合わせてより大きな分子構造を創出するとき、各原子の価数を満足するために必要なとおりに、水素を除去または添加してもよいことが理解される。

本明細書の説明は、化学結合の法則および原理と一致して構成されるべきである。例えば、ある位置で置換基を適合させるために、水素原子を除く必要があり得る。さらにまた、可変部（すなわちＲ基）の定義ならびに本発明の一般式（例えば式ＩまたはＩＩ）の結合位置は、当該技術分野において既知の化学結合の法則に合致すると理解される。全ての上記本発明の化合物はまた、さらに、各原子の原子価を満足するために必要な、隣接する原子および／または水素間の結合が含まれると理解される。すなわち、結合および／または水素原子を加えて、次のタイプの原子のそれぞれに次の合計結合数を与える：炭素：４結合；窒素：３結合；酸素：２結合；硫黄：２〜６結合。

本発明の化合物のいくつかの構造は、不斉炭素原子を含むことに注意されたい。したがって、かかる不斉性から生じる異性体（例えば全てのエナンチオマー、立体異性体、回転異性体、互変異性体、ジアステレオマーまたはラセミ体）が本発明の範囲に含まれると理解される。かかる異性体は、分級分離技術および立体的に制御された合成によって実質的に純粋な形態で得られる。さらにまた、かかる構造ならびに本明細書に記載の他の化合物および基は、その全ての互変異性体も含む。本明細書に記載の化合物は、当該技術分野において理解される合成戦略によって得ることができる。

いくつかの本発明の化合物の置換基は異性環式構造を含むことにも注意されたい。したがって、特に定めのない限り、特定の置換基の構造異性体が本発明の範囲に含まれると理解される。例えば、用語「テトラゾール」はテトラゾール、２Ｈ−テトラゾール、３Ｈ−テトラゾール、４Ｈ−テトラゾールおよび５Ｈ−テトラゾールを含む。

本明細書で使用するある用語の定義は、以下に提供される。他の用語の定義は、U.S. Department of Energy, Office of Science, Human Genome Projectから得られる用語集に見ることができる。本発明の実施において、分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡにおける多くの常套技術が使用される。これらの技術は周知であり、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, Vols. I III, Ausubel, ed. (1997); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I and II, Glover D, ed. (1985); Oligonucleotide Synthesis, Gait, ed. (1984); Nucreic Acid Hybridization, Hames & Higgins, Eds. (1985); Transcription and Translation, Hames & Higgins, eds. (1984); Animal Cell Culture, Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymol. (Academic Press, Inc., 1984); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Miller and Calos, Eds. (Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1987);およびMethods in Enzymology, Vols. 154 and 155, Wu and Grossman, and Wu, Eds.にそれぞれ記載されている。

本明細書において使用するとき、「レポーター」遺伝子は、用語「マーカー遺伝子」と相互に交換可能なように使用されており、容易に検出可能な核酸および／またはルシフェラーゼのような容易に検出可能な遺伝子産物をコードする核酸である。

転写および翻訳制御配列はＤＮＡ制御配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等であり、これは宿主細胞のコーディング配列の発現のために提供する。真核細胞において、ポリアデニル化シグナルが制御配列である。

「プロモーター配列」は、細胞においてＲＮＡポリメラーゼと結合し、下流（３’方向）コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ制御領域である。本発明を定義するため、該プロモーター配列はその３’末端で転写開始部位に結合されており、バックグラウンド以上の検出可能なレベルで転写を開始するために必要な最低塩基または要素数を含むために上流（５’方向）に伸長する。プロモーター配列内で、転写開始部位（簡便には、例えばヌクレアーゼＳ１でのマッピングによって定義される）ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。

コーディング配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、次いでtrans-ＲＮＡスプライシングされてコーディング配列によってコードされるタンパク質に翻訳されるとき、細胞内で転写および翻訳制御配列の「制御下」にある。

用語「薬学的に許容される」は、ヒトに投与したとき、生理的に耐容性であり、典型的にはアレルギーまたは同様の有害な反応、例えば胃の不調、目眩等を生じない分子および組成物を意味する。好ましくは、本明細書において使用するとき、用語「薬学的に許容される」は、米国政府または州政府当局に認められているか、あるいは米国薬局方または動物、特にヒトに使用するために一般に理解されている他の局方に記載されていることを意味する。

用語「担体」は、本化合物と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビークルを意味する。かかる医薬担体は、滅菌液体、例えば水および石油、動物、植物または合成起源のものを含む油、例えばピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等であってよい。水または水溶液、水性生理食塩水および水性デキストロース溶液および水性グリセロール溶液が、好ましくは担体として、特に注射液として使用される。好適な医薬担体は、Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martinに記載されている。

用語「治療上有効量」および「有効量」は、本明細書において、宿主の活性、機能および応答における臨床的に顕著な欠乏を、少なくとも約１５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは９０％低下させ、最も好ましくは防止するのに十分な量を意味するものとして使用される。あるいは、治療上有効量は、宿主の臨床的に顕著な状態／症状の改善を引き起こすのに十分である。

「薬物」は、全て本発明にしたがって、医薬組成物および診断組成物を製造するために使用することができるか、あるいはかかる目的のために独立して使用され得る化合物、核酸（阻害核酸、例えばｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ等を含む）、低分子、ポリペプチド、フラグメント、アイソフォーム、変異体または他の物質であり得る全ての物質を意味する。

「調節剤」は、本明細書において使用するとき、Ａｘｉｎ安定化を促進または消失させることができ、それによってＷｎｔシグナル伝達に作用し得る薬物、化合物、タンパク質またはペプチドを含むが、これらに限定されない物質であり得る。調節剤は、Ｗｎｔシグナル伝達を促進または阻害し得るように、Ａｘｉｎと直接または間接的に相互作用することができる。

「誘導体」は、親タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基置換、欠失または付加の導入によって改変されている化合物、タンパク質またはポリペプチド、あるいはヌクレオチド置換または欠失、付加または変異の導入によって修飾された核酸またはヌクレオチドを意味する。誘導体核酸、ヌクレオチド、タンパク質またはポリペプチドは、親ポリペプチドと同様または同一の機能を有する。

用語「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」は、本明細書において使用するとき、２本のアンチパラレルおよび実質的に相補的な、上記核酸鎖を含む二本鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を意味する。二本鎖構造を形成する２本の鎖は、１つのより大きなＲＮＡ分子の別の部分であってよく、あるいはそれらは別のＲＮＡ分子であってもよい。別のＲＮＡ分子、例えばｓｉＲＮＡは、しばしば文献において、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）と称される。２本の鎖が１つのより大きな分子の部分であり、したがって二本鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端とそれぞれの他の鎖の５’末端間でヌクレオチドの中断されていない鎖によって結合されているとき、結合ＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」、「低分子ヘアピンＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」と称される。２本の鎖が二本鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端とそれぞれの他の鎖の５’末端間でヌクレオチドの中断されていない鎖以外の手段で共有結合されているとき、該結合構造は「リンカー」と称される。ＲＮＡ鎖は同一または異なるヌクレオチド数を有していてもよい。塩基対の最大数は、ｓｉＲＮＡの最も短い鎖のヌクレオチド数引く二本鎖に存在する何れかのオーバーハングである。二本鎖構造に加えて、ｓｉＲＮＡは１個以上のヌクレオチドオーバーハングを含んでいてもよい。さらに、本明細書で使用するとき、「ｓｉＲＮＡ」は、複数のヌクレオチドでの実質的な修飾および本明細書に開示されているかあるいは当該技術分野において既知のあらゆるタイプの修飾を含む、リボヌクレオチドの化学修飾を含んでいてもよい。何れかのかかる修飾は、ｓｉＲＮＡタイプ分子において使用するとき、本明細書および特許請求の範囲において、「ｓｉＲＮＡ」に含まれる。

本明細書において使用するとき、「ヌクレオチドオーバーハング」は、ｓｉＲＮＡの一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を超えて伸長するか、あるいはその逆であるとき、ｓｉＲＮＡの二本鎖構造から突出する、対にならないヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドを意味する。「平滑」または「平滑末端」は、ｓｉＲＮＡの末端で対にならないヌクレオチドが存在しないこと、すなわちヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。「平滑末端化」ｓｉＲＮＡは、その全長にわたって二本鎖であり、すなわち該分子のいずれの末端でもヌクレオチドオーバーハングが存在しない。明確にするため、ｓｉＲＮＡの３’末端または５’末端に結合した化学キャップまたは非ヌクレオチド化学分子は、ｓｉＲＮＡがオーバーハングを有するか平滑末端であるかを決定する際に考慮されない。

用語「アンチセンス鎖」は、標的配列と実質的に相補的である領域を含むｓｉＲＮＡの鎖を意味する。本明細書において使用するとき、用語「相補性の領域」は、本明細書に定義のある配列、例えば標的配列と実質的に相補的であるアンチセンス鎖の領域を意味する。相補性の領域が標的配列に対して完全に相補的でないとき、ミスマッチは末端領域で最も耐容性であり、そして存在するとき、一般に、例えば５’および／または３’末端の６、５、４、３または２ヌクレオチド内の末端領域または複数の領域で存在する。

用語「センス鎖」は、本明細書において使用するとき、アンチセンス鎖の領域と実質的に相補的である領域を含むｓｉＲＮＡの鎖を意味する。

ｓｉＲＮＡについて記載するとき、「細胞への導入」は、当業者に理解されるように、細胞への取り込みまたは吸収を促進することを意味する。ｓｉＲＮＡの吸収または取り込みは、援助のない拡散または積極的な細胞プロセスを介して、または助剤もしくはデバイスによって生じ得る。この用語の意味は、インビトロでの細胞へのものに限られない；ｓｉＲＮＡは、細胞が生きている生物の一部である、「細胞への導入」であってもよい。そのような場合、細胞への導入は、生物への送達を含む。例えば、インビボ送達のために、ｓｉＲＮＡを組織部位に注射するか、あるいは全身的に投与してよい。細胞へのインビトロでの導入は、エレクトロポレーションおよびリポフェクションのような当該技術分野において既知の方法を含む。

用語「結合」は、ある成分（例えばＡｘｉｎタンパク質）と他の成分（例えばＡｘｉｎ結合タンパク質）の物理的結合を意味する。結合の測定によって、解離定数、会合定数、結合速度（on-rate）または解離速度（off-rate）のような値を導くことができる。

本明細書において使用するとき、用語「結合を許容する条件」は、例えば結合が生じる温度、塩濃度、ｐＨおよびタンパク質濃度の条件を意味する。正確な結合条件は、アッセイの性質、例えば該アッセイが純粋なタンパク質を用いるかあるいは部分的にのみ純粋なタンパク質を用いるかによって変化する。結合のための温度は、１５℃〜３７℃で変化するが、好ましくは室温〜約３０℃である。結合反応におけるＡｘｉｎの濃度も変化するが、好ましくは（例えば、放射線標識成分を用いる反応において）約１０ｐＭ〜１０ｎＭである。

結合が１ｍＭ以下のＫｄ、一般に１００ｎＭ〜１０ｐＭの範囲で生じるとき、該用語を本明細書において使用するとき結合は「特異的」である。例えば、Ｋｄが１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、９５０ｐＭ、９００ｐＭ、８５０ｐＭ、８００ｐＭ、７５０ｐＭ、７００ｐＭ、６５０ｐＭ、６００ｐＭ、５５０ｐＭ、５００ｐＭ、４５０ｐＭ、３５０ｐＭ、３００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１００ｐＭ、７５ｐＭ、５０ｐＭ、２５ｐＭ、１０ｐＭまたはそれ未満であるとき、結合は特異的である。

本明細書において使用するとき、「発現」は、次のものの１つ以上を含むが、それらに限定されない：遺伝子の前駆ｍＲＮＡへの転写；前駆ｍＲＮＡのスプライシングまたは他のプロセッシングによる成熟ｍＲＮＡの生産；ｍＲＮＡ安定性；成熟ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳（コドン使用およびｔＲＮＡ利用能を含む）；および適切な発現および機能に必要であるとき、翻訳生成物の糖鎖修飾および／または他の修飾。

本明細書において使用するとき、用語「成熟」は、変異の結果である、野生型からの何れかの遺伝的変異、例えば一塩基多形（ＳＮＰ）を意味する。用語「変異」は、本明細書を通じて、用語「マーカー」、「バイオマーカー」および「標的」と相互に交換可能なように使用される。

Ｗｎｔシグナル伝達経路
Ｗｎｔ遺伝子ファミリーはＩｎｔ１／Ｗｎｔ１がん原遺伝子およびショウジョウバエＷｎｔ１ホモログである無翅（Ｗｇ）ショウジョウバエに関連した分泌タンパク質の大きなクラスをコードする（Cadigan et al. （1997） Genes & Development 11:3286-3305）。Ｗｎｔは多様な組織および臓器で発現され、ショウジョウバエの分節；C. elegansにおける内胚葉の発生；および哺乳類の肢極性の確立、神経堤分化、腎形態形成、性別決定および脳発生を含む多くの発生プロセスに必要である（Parr, et al. （1994） Curr. Opinion Genetics & Devel. 4:523-528）。Ｗｎｔ経路は胚形成期および成熟生物の両方において、動物発生の主なレギュレーターである（Eastman, et al. （1999） Curr Opin Cell Biol 11: 233-240; Peifer, et al. （2000） Science 287: 1606-1609）。

Ｗｎｔシグナルは７種の膜貫通ドメイン受容体のFrizzled（Ｆｚ）ファミリーによって伝達される（Bhanot et al. （1996） Nature 382:225-230）。ＷｎｔリガンドはＦｚｄと結合し、そうすることで細胞質タンパク質Dishevelled（ヒトおよびマウスのＤｖｌ−１、２および３）を活性化し（Boutros, et al. （1999） Mech Dev 83: 27-37）、ＬＲＰ５／６をリン酸化する。それによってシグナルが生じ、Armadillo／β−カテニンのリン酸化および分解を防止し、そしてβ−カテニンの安定化を導く（Perrimon （1994） Cell 76:781-784）。この安定化は、ＧＳＫ３、ＡＰＣ、ＣＫ１およびβ−カテニンを含む多様なタンパク質と一体となってβ−カテニン破壊複合体を形成する骨格タンパク質であるＡｘｉｎとのＤｖｌの結合によってもたらされる（Zeng et al. （1997） Cell 90:181-192）。進化的に保存されている標準Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達カスケードは、後生動物の発生の多様な局面を制御する。該経路の状況依存的活性化は、胚細胞運命決定、幹細胞制御および組織ホメオスタシスに関与する。Ｗｎｔ／β−カテニン経路の重要な特徴は、β−カテニン破壊複合体によって制御された、下流エフェクターβ−カテニンのタンパク質分解である。β−カテニン破壊複合体の主な構成要素は、大腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ）、ＡｘｉｎおよびＧＳＫ３α／βである。Ｗｎｔ経路活性化の非存在下で、細胞質β−カテニンは構成的にリン酸化され、分解の標的にされる。Ｗｎｔ刺激によって、β−カテニン破壊複合体が解離して、核β−カテニンの蓄積およびＷｎｔ経路応答遺伝子の転写を導く。

β−カテニン破壊複合体の成分に作用するＷｎｔタンパク質の過剰発現または変異によって仲介される該経路の不適切な活性化は、多くのがんで観察されている（Polakis, P. (2007) Curr Opin Genet Dev 17, 45-51）。特に、腫瘍リプレッサーＡＰＣの切断変異は、結直腸癌腫において最も一般的な遺伝的変化である。さらに、肝臓癌腫および結直腸癌を有する患者において、それぞれＡｘｉｎ１およびＡｘｉｎ２変異が同定されている（Taniguchi, K. et al. (2002) Oncogene 21, 4863-71; Liu, W. et al. (2000) Nat Genet 26, 146-7; Lammi, L. et al. (2004) Am J Hum Genet 74）。これらの体細胞変異は、β−カテニンのＷｎｔ非依存的安定化およびβ−カテニン介在転写の構成的活性化をもたらす。

β−カテニンの安定化による異常なＷｎｔ経路活性化は、多くの結直腸癌腫の腫瘍形成において中心的な役割を有する。結直腸癌腫（ＣＲＣ）の８０％が、連続したＷｎｔシグナル伝達を可能とする腫瘍リプレッサーＡＰＣの不活性化変異を有する。さらにまた、Ｗｎｔ経路活性化が黒色腫、乳癌、肝臓癌、肺癌および胃癌に関与し得ることを示唆する証拠が増えつつある。Ｗｎｔ、正常な発生およびがんの間の関係が長らく認識されているが、Ｗｎｔシグナル伝達の標的としてのｃ−Ｍｙｃがん原遺伝子の同定との関連性がさらに確立された（He et al. （1998） Science 281:1509-3512）。

さらにまた、骨粗鬆症、骨関節炎、多発性嚢胞腎疾患、糖尿病、統合失調症、血管疾患、心臓疾患、非がん原性増殖性疾患およびアルツハイマー病のような神経変性疾患を含むが、これらに限定されない他の障害が、異常なＷｎｔシグナル伝達に関連している。

Ａｘｉｎ
Ａｘｉｎは、β−カテニンは回復交代のタンパク質成分（ＧＳＫ３、ＡＰＣ、ＣＫ１およびβ−カテニン）と一体となって並ぶ、Ｗｎｔシグナル伝達の重要なレギュレーターである。グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３、ショウジョウバエにおいてshaggyとして知られている）、腫瘍抑制遺伝子産物ＡＰＣ（大腸腺腫様ポリポーシス）（Gumbiner （1997） Curr. Biol. 7:R443-436）およびＡｘｉｎは全て、Ｗｎｔ経路の負のレギュレーターである。Ｗｎｔリガンドの非存在下では、これらのタンパク質は複合体を形成して、β−カテニンのリン酸化および分解を促進するが、Ｗｎｔシグナル伝達はこの複合体を不活性化し、β−カテニン分解を防止する。結果として安定化されたβ−カテニンは核へ移行し、そこでこれはＴＣＦ（Ｔ細胞因子）転写因子（リンパ球エンハンサー結合因子−１（ＬＥＦ１）としても知られる）と結合して、ＴＣＦ／ＬＥＦ誘導性転写の共アクチベーターとして働く（Bienz, et al. （2000） Cell 103: 311-320; Polakis, et al. （2000） Genes Dev 14: 1837-1851）。

多タンパク質破壊複合体の効果的な集合は、その主成分の安定状態レベルに依存する。Ａｘｉｎはβ−カテニン破壊複合体の効率を制御する濃度限定的因子であると報告されており、上昇したＡｘｉｎの発現は切断ＡＰＣを発現する細胞系におけるβ−カテニン分解を促進することができる（Salic, A., et al. (2000) Mol Cell 5, 523-32 ; Lee, E., et al. (2003) PLoS Biol 1, E10; Behrens, J., et al. (1998) Science 280, 596-9 ; Kishida, M., et al. (1999) Oncogene 18, 979-85）。したがって、Ａｘｉｎタンパク質レベルを緊密に制御し、適切なＷｎｔシグナル伝達を確実にする必要がある可能性がある。この理由から、ＸＡＶ９３９のようなタンキラーゼ阻害剤は、Ｗｎｔ経路シグナル伝達の有効な調節剤である。

本明細書に記載したとおり、遺伝生化学およびプロテオミクス手法を使用して、Ｗｎｔシグナル伝達経路の新規調節剤を探索した。本明細書において説明し、図に示し、そして実験的に説明するように、Ａｘｉｎ安定化はＷｎｔシグナル伝達を調節する強いメカニズムである。タンキラーゼ（ＴＮＫＳ）を阻害してＡｘｉｎの半減期を延長し、β−カテニン分解を促進することができる低分子量化合物を同定した。さらにまた、Ａｘｉｎタンパク質安定性を制御する新たなメカニズムが明らかとなったが、その治療的探索はＷｎｔ経路依存的がんを処置するために期待できる。

ヒトＡｘｉｎ遺伝子は９００アミノ酸ポリペプチドをコードし、これはマウスタンパク質と８７％の同一性を有する（「融合」（fu）として知られ、ホモ接合性マウス胚に軸重複（axis duplication）を生じることが示されている）。該配列はまた、Ｇタンパクシグナル伝達ドメインのレギュレーター（ＲＧＳドメイン、ＡＰＣと結合する）、ＧＳＫ３結合ドメイン、β−カテニン結合ドメイン、ＤＩＸドメイン（自己オリゴマー形成に関与する）およびショウジョウバエおよび脊椎動物dishevelledタンパク質のＮ末端付近の保存配列と相同性を有するＣ末端領域を含む。該配列は二分核定位シグナルを含むが、Ａｘｉｎは核に局在化することが知られている（Zeng, et al. (1997) Cell 90: 181）。

Ａｘｉｎ内で最も保存されたアミノ酸伸長を含む、Ａｘｉｎ１の小さなＮ末端領域（アミノ酸１９〜３０）が、本明細書に記載のとおり、タンキラーゼとの相互作用に必要かつ十分であることを見出した。このＮ末端ドメインを介するＡｘｉｎ１とＴＮＫＳ１の特異的相互作用は、本明細書において、ＴＢＤ（タンキラーゼ結合ドメイン）と称し、ＧＳＴ−プルダウンおよび免疫共沈降アッセイによってさらに実証された。

Ａｘｉｎは少なくとも２種の形態、Ａｘｉｎ１およびＡｘｉｎ２の一方として存在する（非ヒト種においてＡｘｉｌまたはconductinとも称される）。Ａｘｉｎ１とＡｘｉｎ２タンパク質は、約４５％のアミノ酸同一性を有し、β−カテニンレベルの制御において本質的に同一の機能を有する。しかしＡｘｉｎ２とは異なり、Ａｘｉｎ１はβ−カテニン−ＴＣＦ制御遺伝子であるとは考えられない。さらにまた、Ｗｎｔシグナル伝達を制御するフィードバックリプレッサー経路において、Ａｘｉｎ２の機能は、Ａｘｉｎ１とＡｘｉｎ２のＷｎｔ経路活性化に対する効果の間で潜在的に機能的差が存在し得ると考えられていることに貢献する。

本発明の化合物は、本明細書において実験的に示されるとおり、Ａｘｉｎ安定化剤として作用する。かかる化合物はＡｘｉｎのタンパク質レベルを上昇させる。多様なアッセイによってＷｎｔアンタゴニストとして同定された化合物は、Ａｘｉｎ安定化を介して作用することが見出された。このメカニズムの発見および確認によって、本発明の方法が得られた。

本発明の化合物は、多数の低分子ブラックボックススクリーニングにおいてＷｎｔシグナル伝達を阻害することが見出された。あるスクリーニングは、ＴＣＦルシフェラーゼレポーターであるSuperTopflashで安定的にトランスフェクトしたＳＷ４８０細胞（ＡＰＣ切断を有する結腸癌細胞系）を用いて実施した。ＳＷ４８０はＡＰＣ欠損であり、構成的リガンド非依存的Ｗｎｔシグナル伝達によって特徴付けられるヒト結腸癌腫系である。β−カテニンがリン酸化されず、正常細胞におけるようにβ−カテニン破壊複合体によって分解されるため、シグナル伝達は、核における安定なβ−カテニンの異常な蓄積から生じる。

さらに、本発明の化合物は、インタクトなＷｎｔシグナル伝達経路を有する細胞系（例えば２９３Ｔ細胞）においてＷｎｔシグナル伝達を阻害することを見出した。別のスクリーニングは、Ｗｎｔ３ａ調節培地で処理した２９３Ｔ−ＳＴＦ細胞を用いて実施した。これおよび阻害薬物（例えばＲＮＡｉおよびＷｎｔ阻害剤タンパク質）の使用は、同時的Ａｘｉｎ安定化なしで多様なレベルでＷｎｔシグナル伝達を阻止することが見出され、本発明のＡｘｉｎ安定化の作用はＷｎｔ阻害それ自体の結果ではないと考えられる。

本明細書に記載のとおり、本発明のＡｘｉｎ安定化剤（例えば本発明の化合物）は、ＧＳＫ３依存的メカニズムを介して、結腸癌細胞（例えばＳＷ４８０細胞）におけるβ−カテニンのリン酸化および分解を誘導する。かかる安定化剤は、インビトロ細胞培養アッセイにおいて結腸癌細胞の増殖を阻害する。本発明の一つの態様において、かかる安定化剤は、ＧＳＫ３によるＡｘｉｎのリン酸化を増加させ、Ａｘｉｎを安定化し、Ａｘｉｎとβ−カテニン間の相互作用を上昇させる。これはβ−カテニンのリン酸化および分解を加速させる。

ＴＮＫＳの触媒活性は、Ａｘｉｎの安定性と関連しており、ＡｘｉｎとＴＮＫＳは、免疫共沈降実験および酵母２ハイブリッドアッセイにおいて示された。

タンキラーゼ（ＴＮＫＳ）
「タンキラーゼ」は、ＴＲＦ１−相互作用アンキリン結合ＡＤＰ−リボースポリメラーゼを短縮したものであり、ＰＡＲシレーション活性を有する分子足場タンパク質である。非分極細胞のゴルジ体へのその局在化に基づいて、小胞輸送（例えば新たに合成されたタンパク質の標的送達）を制御することが知られている（Yeh, et al. (2006) Biochem. J. 399:415）。ＴＮＫＳは、テロメア、セントロソームおよび核孔でも見られる。ＴＮＫＳは有糸分列分節において必須の制御的役割を有し、テロメア長の負のレギュレーターであるＴＲＦ１を調節して、テロメアのホメオスタシスを制御する（Smith, et al. (1998) Science 282:1484)(Dynek, et al. (2004) Science 304:97）。

ＴＮＫＳ１および２は、それぞれ１，３２７および１，１６６残基を含むタンパク質である。タンパク質は約８３％の配列同一性を有し、主としてＴＮＫＳ１にのみ存在するヒスチジン／プロリン（praline）／セリンリッチ（ＨＰＳ）ドメインの非存在において異なる。両タンパク質は、自己オリゴマー形成に関与する、基質結合のための２４個のアンキリンタイプリピート、ステライルアルファモチーフ（ＳＡＭ）ドメインおよび触媒活性のための、Ｃ末端ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）相同性ドメインを有する。ＮＡＤ＋結合および触媒作用に必要な決定的残基は、２つのタンパク質間で完全に保存されている。結合パートナーはＩＲＡＰ（インスリンシグナル伝達に関与する）、Ｇｒｂ１４（インスリンシグナル伝達に関与する）、ＮｕＭＡ（細胞サイクルに関与する）およびＭｃｌ−１（アポトーシスに関与する）を含む。

本明細書に記載の酵母２ハイブリッドアッセイによって、reveal that the region spanning ＴＮＫＳ１のＩＩＩ、ＩＶおよびＶアンキリンリピートドメインにわたる領域が、Ａｘｉｎ１との相互作用に必要かつ十分であることが明らかとなる。さらにまた、β−カテニン安定化は、Ａｘｉｎ結合ドメインおよびＳＡＭドメインを必要とするが、ＴＮＫＳ１のＰＡＲＰドメインを必要としないことが見出された。

ＴＮＫＳ１およびＴＮＫＳ２は、Ａｘｉｎタンパク質レベルの制御において重複して機能する。少なくとも（本明細書に記載の）ＳＷ４８０細胞、ＨＥＫ２９３細胞およびＤＬＤ−１細胞において示されるように、ＴＮＫＳ１およびＴＮＫＳ２は、β−カテニンリン酸化の上昇、β−カテニン存在量の減少およびβ−カテニン標的遺伝子の転写の阻害のために、共に減少される必要がある。ＴＮＫＳ１またはＴＮＫＳ２単独の減少は、上昇したＡｘｉｎ１／２タンパク質レベルを導かない。

ＴＮＫＳ１および２は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼまたはＰＡＲＰと称される、ＮＡＤ＋依存酵素群に属し、それら自身または他の基質タンパク質をＡＤＰ−リボースポリマーで修飾する（Schreiber, et al. (2006) Nature Reviews Molecular Cell Biology; 7 (7):517）。ＡＤＰ−リボースポリマーの付加（PARシレーションまたはポリ（ＡＤＰ−リボース）化とも知られている）は、細胞分裂、エネルギー代謝および細胞間輸送において、細胞生存および細胞死機能、転写制御、テロメア結合および紡錘体形成を制御する、翻訳後修飾である。

いくつかの場合において、標的タンパク質のＰＡＲシレーションは、ユビキチン依存的分解に関連している。例えば、ＴＮＫＳ１によるＴＲＦ１のＰＡＲシレーションは、テロメアからＴＲＦ１を解離させ、その分解を促進する（Smith S, et al. (1998) Science; 282(5393):1484）。また、ＴＮＫＳの自己ＰＡＲシレーションは、ＴＮＫＳの分解を促進する（Yeh TYJ, et al. (2006) Biochemical Journal; 399:415）。

本明細書に記載のｓｉＲＮＡレスキューアプローチによって実験的に示されるように、タンキラーゼの触媒（ＰＡＲシレーション）活性は、Ａｘｉｎタンパク質レベルおよびＷｎｔ経路シグナル伝達の制御に必要である。ＸＡＶ９３９のようなタンキラーゼ阻害剤による該触媒活性の阻害は、Ａｘｉｎ安定化ならびに続くβ−カテニン分解およびＷｎｔシグナル伝達の停止をもたらす。ＸＡＶ９３９のようなタンキラーゼ阻害剤は、実際、それらのＰＡＲＰドメインでＴＮＫＳ１／２と固く結合する。ＸＡＶ９３９のようなタンキラーゼ阻害剤はまた、ＴＮＫＳ１／２の自己ＰＡＲシレーション能を阻害し、そして実際に、ＴＮＫＳタンパク質レベルを上昇させ、同時にそれらの触媒機能を抑制する。

タンキラーゼ（ＴＮＫＳ）阻害およびＷｎｔシグナル伝達阻害
本明細書に記載の免疫共沈降実験によって、ＴＮＫＳ１／２がＳＷ４８０細胞においてＡｘｉｎ２と結合し、そして本明細書に記載の酵母２ハイブリッドアッセイ実験によって、Ａｘｉｎ１／２とＴＮＫＳ１／２間の強い結合が示されることが見出された。ＡｘｉｎとＴＮＫＳの間の物理的相互作用は、Ａｘｉｎにおける進化的に保存された「タンキラーゼ結合ドメイン」（ＴＢＤ）によって介在されるように、インビボでのＡｘｉｎタンパク質レベルの制御に重要である。本明細書において示されるとおり（例えばｓｉＲＮＡ実験によって）、ＴＮＫＳ１／２はＡｘｉｎ安定性に作用する唯一のＰＡＲＰファミリーメンバーである。

本明細書に記載のとおり、タンキラーゼ阻害剤（例えばＸＡＶ９３９）はＧＳＫ３β−Ａｘｉｎ複合体形成を増加させ、それによってβ−カテニンのＧＳＫ３β依存的リン酸化およびプロテアソーム分解を促進する。タンキラーゼ阻害剤（例えばＸＡＶ９３９）が細胞のβ−カテニンを分解する他の欠損能力を助けるため、これは細胞においてさえも、正常でないＡＰＣ機能を共に生じる（例えば、切断ＡＰＣアレルを有するＳＷ４８０結直腸細胞系）。ＸＡＶ９３９のようなタンキラーゼ阻害剤は、ＴＮＫＳ１／２と物理的に相互作用し（本明細書に、例えば蛍光偏光アッセイにおいて示すとおり）、上流およびβ−カテニン破壊複合体レベルの両方で機能することができ；それらはＡｘｉｎ転写レベルの対応する増加なしに、Ａｘｉｎタンパク質レベルの上昇を生じる。

本明細書においてより詳細に記載し、図面に示し、そして実験的に示されるように、ＴＮＫＳ１／２はＡｘｉｎ安定化剤（例えば、Ａｘｉｎ安定化低分子、阻害核酸および融合タンパク質を含む）の効果的な標的であることが示される。ＴＮＫＳ１／２と結合し、その触媒活性を阻害する化合物およびＴＮＫＳ１／２に対するｓｉＲＮＡは、Ａｘｉｎを安定化し、同時にβ−カテニンのリン酸化および分解を促進する。

ＴＮＫＳアンタゴニストは好ましくは、ＴＮＫＳタンパク質の触媒活性（例えば、Ａｘｉｎのような標的タンパク質をＲＰＡシレーションする能力および自己ＰＡＲシレーション能）を低下または阻害して、ＴＮＫＳタンパク質または転写レベルを低下しないことによって作用する。本明細書において実験的に記載するとおり、ＴＮＫＳはＡｘｉｎと物理的に結合し、Ａｘｉｎタンパク質レベルの制御にそのＰＡＲシレーション活性が必要とされる。ＴＮＫＳはＡｘｉｎのユビキチン化および分解を促進し、これは少なくとも部分的には、Ａｘｉｎまたはユビキチン−プロテオソーム経路の成分の直接ＰＡＲシレーションを介して仲介され得る。

簡単には、ＸＡＶ９３９のようなタンキラーゼ阻害剤はＡｘｉｎタンパク質レベルを上昇させ、ホスホ−β−カテニンを増加させ、細胞質β−カテニンを減少させ、β−カテニンｓｉＲＮＡと同様にβ−カテニン標的遺伝子に作用する。

スクリーニングアッセイ
本発明は、例えばＡｘｉｎ安定化および／またはＴＮＫＳ触媒活性の抑止によって、Ｗｎｔシグナル伝達を調節する調節剤、すなわち候補または試験化合物または薬物（例えばペプチド、ペプチド模倣物、低分子または他の薬物）を同定するための方法（本明細書において「スクリーニングアッセイ」とも称する）を提供する。一つの態様において、該スクリーニング方法は、Ａｘｉｎ安定化および／またはＴＮＫＳ触媒活性を調節することができ、したがってＷｎｔ経路シグナル伝達を調節することができる薬物を同定する。逆に、本発明の方法によって発見されるＡｘｉｎ脱安定化剤は、Ｗｎｔシグナル伝達を伝播し、促進し、またはそうでなければアゴナイズするために使用することができる。

Ｗｎｔの調節剤（例えばＡｘｉｎ安定化の調節剤、ＴＮＫＳの調節剤）は、例えばアゴニストおよび／またはアンタゴニストを含んでいてもよく、低分子（例えば本発明の化合物）、阻害核酸および融合タンパク質を含んでいてもよい。本発明の方法を用いる例は、本発明の実施例の項に詳細に記載されている。

用語Ｗｎｔシグナル伝達の「アゴニスト」または「模倣物」は、本明細書において使用するとき、ＴＮＫＳに対する刺激効果を有する（例えばＴＮＫＳの触媒特性を向上させる）および／またはＡｘｉｎに対する脱安定化効果を有し、したがってＷｎｔシグナル伝達を模倣またはアップレギュレーション（例えば増強または補助）する薬物を意味する。かかるＷｎｔアゴニストは、Ａｘｉｎの生物学的活性（例えばβ−カテニンをユビキチン化し、分解する能力）を阻害し、低下させまたは抑制し、そして／またはＴＮＫＳ活性（例えばそのＰＡＲシレーション能）をアゴナイズし、そして／またはそうでなければＡｘｉｎ脱安定化を導く。「模倣物」および「アゴニスト」は、ポリペプチド、ペプチド、脂質、炭化水素、ヌクレオチドおよび有機低分子を含むが、これらに限定されない。候補模倣物は、例えば合成低分子、動物、植物または真菌細胞の抽出物に含まれる化合物、ならびにかかる細胞から調節した培地を含む、天然または合成化合物であってよい。

Ｗｎｔアゴニストは、Ａｘｉｎタンパク質とそれが通常結合する他のＷｎｔシグナル伝達タンパク質（例えばＧＳＫ３、ＡＰＣ、Ｄｖｌ）間の結合事象または複合体形成を阻止することができる（すなわち、Ｗｎｔアゴニストがβ−カテニン破壊複合体を破壊する）。かかるアゴニストは、β−カテニン安定化および伝播またはＷｎｔシグナル伝達の促進に寄与することができる。あるいは、ＷｎｔアゴニストはＴＮＫＳ触媒活性を促進する化合物または薬物であってもよい。

用語Ｗｎｔシグナル伝達の「アンタゴニスト」または「阻害剤」は、本明細書において使用するとき、Ａｘｉｎに対するその安定化効果および／またはＴＮＫＳに対するそのアンタゴナイズ効果のために、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害し、阻止し、停止させ、あるいは負の制御を行う薬物を意味する。かかるＷｎｔアンタゴニストは、ＴＮＫＳタンパク質の触媒（例えばＰＡＲシレーション）活性を抑止するか、あるいはＡｘｉｎタンパク質の生物学的活性を模倣する（例えばβ−カテニン破壊複合体を形成する）化合物または薬物であってよい。「阻害剤」および「アンタゴニスト」は、経路によるシグナル伝達（例えばＷｎｔシグナル伝達）を低下させ、阻止しまたは防止し、そして／またはタンパク質相互作用および複合体の形成を防止する薬物であってもよい。

一つの態様において、本発明は、Ａｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質またはポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性な部分と結合し、またはその活性を調節する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。例えば、本発明は、Ａｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳ安定化を調節することができる候補または試験化合物または薬物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。

他の態様において、本発明は、一次または二次（カウンタースクリーニング）アッセイとして使用することができる、Ａｘｉｎタンパク質安定性および／またはレベルスクリーニングのためのアッセイを提供する。例えば、ルシフェラーゼレポーターを一次スクリーニングの一部として使用し、次いでＡｘｉｎタンパク質安定性および／またはレベルスクリーニングをカウンタースクリーニングとして使用することができる。Ａｘｉｎ融合タンパク質、例えばＡｘｉｎＧＦＰ、Ａｘｉｎ−ルシフェラーゼ、Ａｘｉｎ−Ｒｅｎｉｌｌａ等は、細胞中で作成および発現させて、Ａｘｉｎが安定化されているかを見るために化合物で処理することができる。

他の態様において、Ａｘｉｎ融合タンパク質、例えばＡｘｉｎＧＦＰ、Ａｘｉｎ−ルシフェラーゼ、Ａｘｉｎ−Ｒｅｎｉｌｌａ等は、インビトロＡｘｉｎ分解アッセイにおいて作成し、使用してもよい。かかるアッセイは培養細胞、組織または胚からの抽出物を、Ａｘｉｎ融合タンパク質レベルが作用されているかを見るために化合物で処理して、使用することができる。

Ｗｎｔ／β−カテニン経路の低分子阻害剤のスクリーニングアッセイの具体的な例は、本明細書、例えば実施例の項に記載されている（例えば、ＨＥＫ２９３細胞におけるＷｎｔ応答性Super-Topflash （ＳＴＦ）ルシフェラーゼレポーターアッセイ）。

生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な並行固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；１ビーズ１化合物ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフ選択を用いた合成ライブラリーを含む、当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法における多様なアプローチの何れかを用いて、本発明の試験化合物を得ることができる。生物学的ライブラリーによるアプローチはペプチドライブラリーに限られるが、他の４つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である（Lam, K. S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145）。

分子ライブラリーの合成方法の例は、当該技術分野において、例えばDeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al., (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; および Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233に見ることができる。

化合物のライブラリーは、溶液中（例えばHoughten （1992） Biotechniques 13:412-421）、またはビーズ上（Lam （1991） Nature 354:82-84）、チップ（Fodor （1993） Nature 364:555-556）、細菌（Ladner U.S. Pat. No. 5,223,409）、胞子（Ladner U.S. Pat. No. '409）、プラスミド（Cull et al. （1992） Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869）またはファージ（Scott and Smith （1990） Science 249:386-390）; （Devlin （1990） Science 249:404-406）; （Cwirla et al. （1990） Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382）; （Felici （1991） J. Mol. Biol. 222:301-310）; （Ladner supra.）に存在していてもよい。

一つの態様において、アッセイは、細胞表面でＷｎｔ受容体、例えばＦｚｄを発現している細胞を試験薬物と接触させて、試験薬物のＷｎｔシグナル伝達調節能を（例えばＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質レベルの変化、あるいはＡｘｉｎ結合タンパク質とのＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳの結合を測定して）測定する、細胞利用アッセイである。他の態様において、Ｗｎｔシグナル伝達を調節する試験薬物の能力は、例えばＧＳＫ３によるＡｘｉｎリン酸化の変化を（例えばホスホ特異的抗Ａｘｉｎ抗体の使用によって）測定して決定することができる。さらに別の態様において、Ｗｎｔシグナル伝達を調節する試験薬物の能力は、例えばβ−カテニンのリン酸化および分解（および／またはその何れかの変化）を測定して、決定する。

非限定的な例として、本発明の方法の使用によって発見されるＷｎｔシグナル伝達を阻害することができる薬物は、Ａｘｉｎを安定化し、そして／またはＴＮＫＳをアンタゴナイズする能力を示す。かかる安定化は、例えば総β−カテニンレベルの低下および／またはホスホ−β−カテニンレベル（すなわちリン酸化β−カテニン）の上昇として明らかとなる。かかる安定化はまた、例えばＡｘｉｎタンパク質レベルの上昇、ＴＮＫＳ触媒活性の低下、および／またはＡｘｉｎ−ＧＳＫ３複合体の形成の増加としても明らかとなる。

細胞は例えば、哺乳類起源または酵母の細胞であってよい。試験薬物のＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質と結合する能力の測定は、例えば、Ａｘｉｎタンパク質と試験化合物の結合が複合体の標識物質を検出して測定することができるような、放射性同位体または酵素標識を有する試験薬物を結合して、実施しすることができる。例えば、試験薬物は^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃまたは^３Ｈで直接または間接的に標識することができ、放射性同位体は放射線放出の直接測定またはシンチレーションカウンティングによって検出される。あるいは、標的薬物は、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼで酵素的に標識されていてもよく、該酵素標識は適切な基質の生成物への変換の測定によって検出される。

試験薬物のＷｎｔシグナル伝達を調節する（例えばＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質と相互作用する）能力を、何ら反応体の標識をせずに、測定することも本発明の範囲に含まれる。例えば、マイクロフィジオメーター（microphysiometer）を用いて、試験薬物とＡｘｉｎまたはＴＮＫＳタンパク質の相互作用を、試験薬物またはタンパク質の標識化なしで、測定することができる（McConnell, H. M. et al. (1992) Science 257:1906-1912）。本明細書において使用するとき、マイクロフィジオメーター（例えばCytosensor（商標））は、光にアドレス可能な電位差滴定センサー（ＬＡＰＳ）を用いて、細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化速度の変化を、リガンドと受容体、ＴＮＫＳとＴＮＫＳ結合タンパク質またはＡｘｉｎとＡｘｉｎ結合タンパク質間の相互作用の指標として用いることができる。

一つの態様において、該アッセイは、Ａｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質を発現している細胞を、通常の条件下でＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳと結合することが知られているタンパク質（例えば本明細書に定義のＡｘｉｎ結合タンパク質）とまたはその生物学的活性な部分と接触させて；アッセイ混合物を形成し；該アッセイ混合物を試験薬物と接触させて；該試験薬物のＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質との相互作用能を測定することを含み、ここでかかる相互作用の測定は、試験薬物のＡｘｉｎタンパク質とＡｘｉｎ結合タンパク質またはその生物学的に活性な部分との間の結合事象の阻害能を測定することを含む。正常Ａｘｉｎ：Ａｘｉｎ結合タンパク質結合事象および／またはＴＮＫＳ：ＴＮＫＳ結合タンパク質結合事象の阻害は、正常な状態（すなわち、試験薬物が存在しないもの）と比較したβ−カテニンリン酸化の変化によって測定することができる。

他の態様において、アッセイは、Ａｘｉｎ標的分子（例えばβ−カテニン）および／またはＴＮＫＳ標的分子を発現している細胞を、試験薬物と接触させて、試験薬物のＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳ標的分子の活性を調節する（例えば刺激または阻害する）能力を測定することを含む、細胞利用アッセイである。Ａｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳ標的分子の活性を調節する試験化合物の能力の測定は、例えば試験薬物の存在下および非存在下の両方でβ−カテニンリン酸化レベルを比較することによって実施することができる。

Ａｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳ標的分子および／またはＡｘｉｎ結合タンパク質と結合または相互作用するＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質の能力の測定は、直接結合を測定するための上記方法の一つによって実施することができる。一つの態様において、Ａｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳ標的分子および／またはＡｘｉｎ結合タンパク質と結合または相互作用するＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質の能力の測定は、標的分子の活性を測定して実施することができる。例えば、標的分子の活性は、標的の細胞二次メッセンジャー（すなわち細胞内Ｃａ^２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ_３等）の誘導を検出して、標的の適切な基質に対する触媒／酵素活性を検出して、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー、例えばルシフェラーゼをコードする核酸と作動可能に結合した制御因子を含む）の誘導を検出して、あるいは細胞応答、例えば発生、分化または増殖速度を検出して、測定することができる。

さらに別の態様において、本発明のアッセイは、Ａｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させて、試験化合物のＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を測定する、無細胞アッセイである。試験化合物とＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質との結合は、上記のとおり直接または間接的に測定することができる。好ましい態様において、該アッセイは、Ａｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質またはその生物学的に活性な部分と、Ａｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳと結合する既知の化合物とを接触させてアッセイ混合物を形成し、該アッセイ混合物を試験化合物と接触させ、Ａｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質と相互作用する試験化合物の能力を測定することを含み、ここで試験化合物のＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質と相互作用する能力の測定は、既知の化合物と比較した、Ａｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質またはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する試験化合物の能力を測定することを含む。

他の態様において、該アッセイは、Ａｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させて、Ａｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節する（例えば刺激または阻害する）試験化合物の能力を測定する、無細胞アッセイである。Ａｘｉｎタンパク質の活性を調節する試験化合物の能力の測定は、例えば標的分子と結合するか、あるいはＡｘｉｎ結合および／またはＴＮＫＳ結合タンパク質と相互作用するＡｘｉｎタンパク質の能力を、直接結合を測定するための上記方法の一つによって測定して、実施することができる。標的分子と結合するＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質の能力の測定は、実時間生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）のような技術を用いて実施してもよい。Sjolander, S. and Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345 および Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705。本明細書において使用するとき、「ＢＩＡ」は、いずれの反応体も標識せずに、実時間で生体特異的相互作用を試験するための技術である（例えばBIAcore（商標））。光学現象である表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の変化は、生物学的分子間の実時間反応の指標として用いることができる。

別の態様において、試験化合物のＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質の活性を調節する能力の決定は、標的分子またはＡｘｉｎ結合および／またはＴＮＫＳ結合タンパク質の活性をさらに調節する、Ａｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質の能力を測定して、実施することができる。例えば、適切な基質に対する標的分子の触媒／酵素活性は、上記のとおりに測定することができる。

さらに別の態様において、無細胞アッセイは、Ａｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質またはその生物学的に活性な部分と、Ａｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質と結合する既知の化合物とを接触させてアッセイ混合物を形成し、該アッセイ混合物を試験化合物と接触させて、試験化合物のＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質と相互作用する能力を測定することを含み、ここで試験化合物のＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質と相互作用する能力の決定は、標的分子またはＡｘｉｎ結合および／またはＴＮＫＳ結合タンパク質と優先的に結合し、またはその活性を調節する、Ａｘｉｎタンパク質の能力を測定することを含む。

化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、ある時間内で試験する化合物数を最大化するために、ハイスループットアッセイが望まれる。細胞を含まない系で実施する、例えば精製または半精製タンパク質によって行われ得るアッセイは、速やかな開発を可能とし、試験化合物によって仲介される分子標的における変化の検出を比較的容易にすることができるため、「一次」スクリーニングとしてしばしば好まれる。さらに、試験化合物の細胞毒性および／または生物学的利用能の効果が一般にインビトロ系では無視でき、その代わりに該アッセイは、上流または下流要素との結合親和性の変化を明らかとし得るため、分子標的に対する薬物の効果に主として集中される。

したがって、本発明の典型的なスクリーニングアッセイにおいて、目的化合物を、Ａｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質または結合相手、例えばＡｘｉｎ結合および／またはＴＮＫＳ結合タンパク質と接触する。次いで、化合物とＡｘｉｎタンパク質またはＡｘｉｎ結合相手の混合物に、Ａｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳ結合相手またはＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質をそれぞれ含む組成物を加える。Ａｘｉｎタンパク質とＡｘｉｎ結合相手および／またはＴＮＫＳタンパク質とＴＮＫＳ結合相手の複合体の検出および定量は、Ａｘｉｎと結合パートナー間の複合体形成を阻害（または強化）する化合物の効果を決定するための手段を提供する。化合物の効果は、多様な濃度の試験化合物を用いて得たデータから用量応答曲線を作成して評価することができる。さらに、対照アッセイも実施して、比較のためのベースラインを得ることができる。対照アッセイにおいて、Ａｘｉｎ結合相手またはＡｘｉｎポリペプチドを含む組成物に単離および精製したＡｘｉｎポリペプチドまたは結合相手を加えて、複合体の形成を試験化合物の非存在下で定量する。あるいは、対照アッセイにおいて、ＴＮＫＳ結合相手またはＴＮＫＳポリペプチドを含む組成物に単離および精製したＴＮＫＳポリペプチドまたは結合相手を加えて、複合体の形成を試験化合物の非存在下で定量する。

本発明の無細胞アッセイは、単離タンパク質（例えばＡｘｉｎタンパク質もしくはその生物学的に活性な部分またはＡｘｉｎ標的分子、および／またはＴＮＫＳタンパク質もしくはその生物学的に活性な部分またはＴＮＫＳ標的分子）の可溶形態および／または膜結合形態両方の使用に受け入れられる。膜結合形態の単離タンパク質（例えば、Ａｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳ標的分子または受容体）を用いる場合、膜結合形態の単離タンパク質が溶液中で維持されるように、可溶化剤を用いることが望ましい場合がある。かかる可溶化剤の例は、非イオン性界面活性剤、例えばｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、Triton.RTM. X-100、Triton.RTM. X-114、Thesit.RTM.、イソトリデシポリ（エチレングリコールエーテル）.sub.n、３−［（３−コール酸アミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コール酸アミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）またはＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートを含む。

上記細胞利用または無細胞アッセイにおいて、内因性Ａｘｉｎ１および／またはＡｘｉｎ２レベルは、Ａｘｉｎ１またはＡｘｉｎ２抗体を用いて測定することができる。さらにまた、細胞または抽出物中のＡｘｉｎタンパク質レベルを測定することができるように、Ａｘｉｎをエピトープタグで評し期してもよい。

上記細胞利用または無細胞アッセイにおいて、内因性ＴＮＫＳ１および／またはＴＮＫＳ２レベルは、ＴＮＫＳ１またはＴＮＫＳ２抗体を用いて測定することができる。さらにまた、細胞または抽出物中のＴＮＫＳタンパク質レベルを測定することができるように、Ａｘｉｎをエピトープタグで評し期してもよい。

本発明の上記アッセイ方法の一つ以上の態様において、タンパク質の一方または両方の非複合化形態からの複合化形態の分離を促進し、そしてアッセイの自動化を適応させるために、Ａｘｉｎ、Ａｘｉｎ結合タンパク質または標的分子を固定化することが望まれることがある。本発明の上記アッセイ方法の一つ以上の態様において、タンパク質の一方または両方の非複合化形態からの複合化形態の分離を促進し、そしてアッセイの自動化を適応させるために、ＴＮＫＳ、ＴＮＫＳ結合タンパク質または標的分子を固定化することが望まれることがある。試験化合物とＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質の結合または候補化合物の存在下および非存在下におけるＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質と標的分子の相互作用は、反応物を含むのに好適な任意の容器内で実施することができる。かかる容器の例は、プレート、試験管および微小遠心管を含む。一つの態様において、マトリックスにタンパク質の一方または両方を結合させるドメインを加えて、融合タンパク質を得ることができる。

例えば、グルタチオン−５−トランスフェラーゼ／Ａｘｉｎ融合タンパク質またはグルタチオン−５−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical, St. Louis, Mo.）またはグルタチオン誘導化マイクロタイタープレートに吸着させて、次いでこれを試験化合物または試験化合物と非吸着標的タンパク質もしくはＡｘｉｎのいずれかと混合し、そして該混合物を、複合体形成に資する条件（例えば塩およびｐＨについて、生理的条件）下でインキュベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して非結合成分を除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定化し、例えば上記のとおりに、複合体を直接または間接的に測定する。あるいは、複合体はマトリックスから分離することができ、標準的な技術を用いて、Ａｘｉｎ結合または活性のレベルを測定することができる。

マトリックスにタンパク質を固定化するための他の技術はまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて用いてもよい。例えば、ビオチンとストレプトアビジンの結合を利用して、Ａｘｉｎタンパク質、Ａｘｉｎ結合タンパク質またはＡｘｉｎ標的分子を固定化できる。他の例として、ビオチンとストレプトアビジンの結合を利用して、ＴＮＫＳタンパク質、ＴＮＫＳ結合タンパク質またはＴＮＫＳ標的分子を固定化できる。ビオチニル化タンパク質または標的分子は、当該技術分野で周知の技術（例えばビオチニル化キット、Pierce Chemicals, Rockford, Ill.）を用いて、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から作成して、ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート（Pierce Chemical）のウェルに固定化することができる。あるいは、Ａｘｉｎ、Ａｘｉｎ結合タンパク質または標的分子と反応性であるが、該タンパク質とその標的分子との結合に干渉しない抗体は、プレートのウェルに誘導化し、非結合標的、ＡｘｉｎまたはＡｘｉｎ関連タンパク質を抗体結合によってウェル中でトラップすることができる。ＧＳＴ−固定化複合体に関する上記のものに加えて、かかる複合体を検出する方法は、Ａｘｉｎタンパク質または標的分子と反応性の抗体を用いた複合体の免疫検出ならびにＡｘｉｎタンパク質または標的分子に関連した酵素活性の検出に基づく酵素結合アッセイを含む。

他の態様において、Ａｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳ発現の調節剤は、細胞を候補化合物と接触させて、該細胞中のＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を測定する方法で同定される。候補化合物の存在下におけるｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、候補化合物の非存在下におけるｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較される。次いで、候補化合物がこの比較に基づいてＡｘｉｎ発現の調節剤として同定され得る。例えば、候補化合物の存在下におけるＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、非存在下よりも大きい（統計的に有意に大きい）とき、該候補化合物はＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳｍＲＮＡまたはタンパク質発現の刺激因子として同定される。あるいは、候補化合物の存在下におけるＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、非存在下よりも小さい（統計的に有意に小さい）とき、該候補化合物はＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害剤として同定される。細胞中のＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、Ａｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳｍＲＮＡまたはタンパク質について本明細書に記載の方法で測定することができる。

本発明のさらに別の局面において、Ａｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質は、Ａｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質と結合または相互作用してＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳ活性を調節する他のタンパク質（結合タンパク質またはｂｐ）を同定するための、２ハイブリッドアッセイまたは３ハイブリッドアッセイ（例えば米国特許第5,283,317号; Zervos et al. （1993） Cell 72:223-232; Madura et al. （1993） J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al., （1993） Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al. （1993） Oncogene 8:1693-1696; および Brent WO94/10300参照）における「ベイトタンパク質」として使用することができる。かかる結合タンパク質はまた、例えばＡｘｉｎ介在シグナル伝達経路の下流因子として、Ａｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質によるシグナルの伝播に関与する可能性もある。あるいは、かかる結合タンパク質は、非Ａｘｉｎ発現細胞と結合した細胞表面分子である可能性があり、ここで該結合タンパク質はシグナル伝達に関与している。

２ハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインから成る、ほとんどの転写因子の調節性に基づく。簡潔には、該アッセイは２個の異なるＤＮＡ構築物を利用する。一つの構成物において、Ａｘｉｎタンパク質をコードする遺伝子は、既知の転写因子（例えばＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子と融合される。他の構成物において、非同定タンパク質（プレイまたはサンプル）をコードする、ＤＮＡ配列のライブラリー由来のＤＮＡ配列は、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子と融合される。「ベイト」および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用して、Ａｘｉｎ依存複合体を形成するとき、転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、極めて近くに存在する。この近接によって、転写因子に応答する転写制御部位と作動可能に結合しているレポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写が可能となる。レポーター遺伝子の発現を検出することができ、機能的転写因子を含む細胞コロニーを単離して、Ａｘｉｎタンパク質と相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得るために用いることができる。

本発明はさらに、上記スクリーニングアッセイによって同定した新規薬物およびこれらのアッセイを用いてかかる薬物を生産する方法に関する。したがって、一つの態様において、本発明は、上記スクリーニングアッセイ（例えば細胞利用アッセイまたは無細胞アッセイ）の何れかの段階を含む方法によって得られる化合物または薬物を含む。例えば、一つの態様において、本発明は、標的分子を発現している細胞を試験化合物と接触させて、標的分子と結合し、またはその活性を調節する試験化合物の能力を測定することを含む方法によって得られる化合物または薬物を含む。他の態様において、本発明は、標的分子を発現している細胞をＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分を接触させてアッセイ混合物を形成し、該アッセイ混合物と試験化合物を接触させて、標的分子と相互作用し、またはその活性を調節する試験化合物の能力を測定することを含む方法によって得られる化合物または薬物を含む。

他の態様において、本発明は、Ａｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させて、Ａｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合し、またはその活性を調節（例えば刺激または阻害）する試験化合物の能力を測定することを含む方法によって得られる化合物または薬物を含む。さらに別の態様において、本発明は、Ａｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質またはその生物学的に活性な部分をＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質と結合する既知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成し、該アッセイ混合物と試験化合物を接触させて、Ａｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質と相互作用し、またはその活性を調節する試験化合物の能力を測定することを含む方法によって得られる化合物または薬物を含む。

したがって、適切な動物モデルにおいて本明細書に記載のとおりに同定した薬物のさらなる使用が、本発明の範囲に含まれる。例えば、本明細書に記載のとおりに同定した薬物（例えばＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳ調節薬物、アンチセンスＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳ核酸分子またはＡｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳ結合相手）は、かかる薬物による処置の効能、毒性または副作用を決定するために、動物モデルにおいて使用することができる。あるいは、本明細書に記載のとおりに同定した薬物は、かかる薬物の作用機構を決定するために、動物モデルにおいて使用することができる。

本発明はまた、本明細書に記載の診断、予測および処置のための、上記スクリーニングアッセイによって同定される新規約物の使用に関する。したがって、本明細書に記載の診断、予測または処置用薬物または医薬組成物の設計、製剤、合成、製造および／または生産における、かかる薬物の使用が、本発明の範囲に含まれる。例えば一つの態様において、本発明は、上記スクリーニングアッセイの一つによって得られる化合物の構造および／または特性を参照して、薬物または医薬組成物を合成または生産する方法を含む。

例えば、薬物または医薬組成物は、標的分子（例えばＡｘｉｎの下流タンパク質、例えばβ−カテニン）を発現している細胞を試験化合物と接触させて、該標的分子と結合し、またはその活性を調節する試験化合物の能力を測定する方法によって得られる化合物の構造および／または特性に基づいて合成することができる。別の典型的な態様において、本発明は、Ａｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させて、Ａｘｉｎおよび／またはＴＮＫＳタンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合し、またはその活性を調節（例えば刺激または阻害）する試験化合物の能力を測定する方法によって得られる化合物の構造および／または特性に基づいて、薬物または医薬組成物を合成または生産する方法を含む。

本発明の化合物
用語「本発明の化合物」および同様の用語は、本明細書においてさらに定義されるように、本明細書において、例えばＷｎｔ経路シグナル伝達を（例えばＡｘｉｎ安定化および／またはＴＮＫＳ触媒活性の阻害を介して）アンタゴナイズするために用いることができる化合物を記載するために使用される。該化合物は、ＸＡＶ９３９を含むが、これに限定されない。

本化合物はまた、本発明の化合物の薬学的に許容される塩、エナンチオマー、立体異性体、回転異性体、互変異性体、ジアステレオマーまたはラセミ体等を含む。

医薬組成物
本明細書に記載の組成物は、医薬組成物であり得る。本発明は、生理的に適合性の担体と混合されたＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストを含む医薬組成物を提供する。かかる医薬組成物は、Ｗｎｔシグナル伝達関連障害の処置、改善、診断または予防のために、温血動物、特にヒト（または温血動物、特にヒト由来の細胞または細胞系）に投与するために適している。

これらの医薬組成物は、有効成分に加えて、薬学的に使用され得る顕著な量の１種以上の無機または有機、固体または液体、薬学的に許容される担体および生理的に許容される希釈剤（例えば水、リン酸緩衝化食塩水または生理食塩水）を含んでいてもよい。

有効量は、対象のサイズおよび重量、疾患のタイプまたは具体的な本発明の化合物のような要因に従って変化し得る。例えば、本発明の化合物の選択は、何が「有効量」を構成するかに影響し得る。当業者は本明細書に含まれる要因を検討して、過度の実験を行うことなく、本発明の化合物の有効量を決定することができる。

投与レジメンは何が有効量を構成するかに影響し得る。本発明の化合物は、対象に、Ｗｎｔシグナル伝達関連障害の発症前または後に投与することができる。さらに、複数回分割用量ならびに不均一な投与量を毎日または連続的に投与するか、または、投与量を継続して注入するか、またはボーラス注射することができる。さらに、治療または予防状況の緊急性によって示されたところにしたがって、投薬量を比例的に増減させることもできる。

用語「医薬製剤」または「医薬組成物」は、哺乳類、例えばヒトへの投与に適した製剤を含む。本発明の化合物を医薬として哺乳類、例えばヒトに投与するとき、それらはそれ自体として、または薬学的に許容される担体と組み合わせた０．１〜９９．５％（より好ましくは０．５〜９０％）の有効成分を含む医薬組成物として、与えられる。

用語「薬学的に許容される担体」は、当該技術分野において理解され、哺乳類に本発明の化合物を投与するのに好適な、薬学的に許容される物質、組成物またはビークルを含む。担体は、対象薬物を体のある臓器または部位から体の別の臓器または部位へと輸送または移動させる、液体または固体増量剤、希釈剤、溶媒またはカプセル材を含む。それぞれの担体は、製剤の他の成分に適合性であり、患者に傷害性でないという意味において、「許容」されなければならない。薬学的に許容される担体として使用され得る物質の例は、糖、例えばラクトース、グルコースおよびショ糖；デンプン、例えばコーンスターチおよびポテトスターチ；セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えばココアバターおよび座薬ワックス；油、例えばピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および大豆油；グリコール、例えばプロピレングリコール；ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；寒天；緩衝化剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；アルギン酸；ピロゲンを含まない水；単離等張食塩水；リンゲル液；；エチルアルコール；リン酸バッファー液；および医薬製剤において使用される他の非毒性適合性物質を含む。好適な医薬担体は、E. W. Martin によるRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。

湿潤剤、乳化剤ならびにラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤、ならびに着色料、放出剤、コーティング剤、甘味剤、風味剤および芳香剤、保存剤および抗酸化剤も本組成物中に存在していてもよい。

薬学的に許容される抗酸化剤の例は、水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等、油溶性抗酸化剤、例えばアスコルビルパルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、プロピルガラート、α−トコフェロール等、ならびに金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等を含む。

本発明の製剤は、経口、経鼻、局所、頬側、舌下、直腸、膣および／または非経腸投与に適したものを含む。本製剤は、簡便には単位投与形態で存在していてよく、医薬分野で周知の何れかの方法で製造することができる。担体物質と組み合わせて単剤形態を作成することができる有効成分の量は、一般に、治療効果を発揮する化合物の量である。一般に、この量は、１００％に対して、有効成分約１％〜約９９％、好ましくは約５％〜約７０％、最も好ましくは約１０％〜約３０％の範囲である。

これらの製剤または組成物を製造する方法は、本発明の化合物と担体および所望により１種以上の助剤を混合する工程を含む。一般に、製剤は、本発明の化合物と液体担体または微細に分離された固体担体またはその両方を均一かつ密接に混合し、次いで所望により製品の形にすることによって製造される。

経口投与に適した本発明の製剤は、各々有効成分として所定の量の本発明の化合物を含む、カプセル剤、カセット、ピル、錠剤、トローチ（風味基剤、通常ショ糖およびアカシアまたはトラガカントを用いる）、粉末、下流の形態で、水性または非水性液体中溶液または懸濁液として、あるいは水中油型もしくは油中水型液体エマルジョンとして、あるいはエリキシル剤もしくはシロップとして、あるいはトローチ（不活性基剤、例えばゼラチンおよびグリセリン、またはショ糖およびアカシアを用いる）として、そして／またはマウスウォッシュ等として、存在していてもよい。本発明の化合物はまた、ボーラス、舐剤またはペーストとして投与してもよい。

本発明の経口投与用固体投与形態（カプセル剤、錠剤、ピル、糖衣錠、粉末、顆粒等）において、有効成分は、１種以上の薬学的に許容される担体、例えばクエン酸ナトリウムまたはリン酸２カルシウムおよび／または次のもののいずれかと混合される：増量剤または充填剤、例えばデンプン、ラクトース、ショ糖、グルコース、マンニトールおよび／またはケイ酸；結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖および／またはアカシア；保湿剤、例えばグリセロール；崩壊剤、例えば寒天−寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のシリケートおよび炭酸ナトリウム；溶解遅延剤、例えばパラフィン；吸収促進剤、例えば４級アンモニウム化合物；湿潤剤、例えばセチルアルコーおよびモノステアリン酸グリセロール；吸着剤、例えばカオリンおよびベントナイト泥；滑沢剤、例えばステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびそれらの混合物；ならびに着色料。カプセル剤、錠剤およびピルの場合、医薬組成物は緩衝化剤を含んでいてもよい。同様のタイプの固体組成物はまた、ラクトースまたは乳糖のような賦形剤および高分子量ポリエチレングリコール等を用いた軟および硬充填ゼラチンカプセル剤における増量剤として使用することもできる。

錠剤は、所望により１種以上の助剤と共に、圧縮または打錠して製造することができる。圧縮錠は、結合剤（例えばゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えばデンプングリコレートナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤または消泡剤（dispersing agent）を用いて製造することができる。打錠錠は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を、好適な機械で打錠して、製造することができる。

本発明の医薬組成物の錠剤および他の固体投与形態、例えば糖衣錠、カプセル剤、ピルおよび顆粒は、所望により、コーティングおよびシェル、例えば腸溶コーティングおよび医薬製剤分野で周知の他のコーティングを行い、あるいはそれによって製造することができる。それらはまた、例えば所望の放出プロファイルを得るための多様な割合のヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはマイクロスフェアを用いて、それらに含まれる有効成分の遅延または制御放出が得られるように、製剤してもよい。それらは、例えば細菌保持フィルターで濾過し、あるいは使用の直前に滅菌水または他の滅菌注射用媒体に溶解することができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を加えて、滅菌してもよい。これらの組成物はまた、所望により、乳白剤を含んでいてもよく、そして所望により遅延形式で、胃腸管のある部分にのみまたは優先的に、有効成分を放出する組成物であってもよい。使用できる包埋組成物の例は、ポリマー物質およびワックスを含む。有効成分はまた、適切であるとき、上記賦形剤の１種以上と共に、マイクロカプセル化形態であってもよい。

本発明の化合物の経口投与用液体投与形態は、薬学的に許容されるエマルジョン、ミクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル剤を含む。有効成分に加えて、液体投与形態は、当該技術分野において一般に使用される不活性希釈剤、例えば水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタン脂肪酸エステルならびにそれらの混合物を含んでいてもよい。

不活性希釈剤に加えて、経口組成物はまた、アジュバント、例えば湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、風味剤、着色料、芳香剤および保存剤を含んでいてもよい。

懸濁液は、活性化合物に加えて、懸濁剤、例えばエトキシル化イソステアリールアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロール、メタヒドロキシドアルミニウム、ベントナイト、寒天−寒天およびトラガカントならびにそれらの混合物を含んでいてもよい。

本発明の直腸または膣投与用医薬組成物の製剤は、座薬として存在していてもよく、これは１種以上の本発明の化合物と１種以上の好適な非刺激性賦形剤または担体、例えば室温では固体であるが、体温で液体であり、したがって直腸または膣腔で溶解して活性化合物を放出する、ココアバター、ポリエチレングリコール、座薬ワックスまたはサリチレートと混合して製造することができる。

膣投与に適した本発明の製剤はまた、適切であると当該技術分野において知られている担体を含む、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡またはスプレー製剤である。

本発明の化合物の局所または経皮投与用投与形態は、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入剤を含む。活性化合物は滅菌条件下で、薬学的に許容される担体と、そして所望により保存剤、バッファーまたはプロペラントと混合してもよい。

軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、本発明の活性化合物に加えて、賦形剤、例えば動物および植物脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはそれらの混合物を含んでいてもよい。

粉末およびスプレーは、本発明の化合物に加えて、賦形剤、例えばラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、カルシウムシリケートおよびポリアミド粉末またはこれらの物質の混合物を含んでいてもよい。スプレーは、さらに常套のプロペラント、例えばクロロフルオロ炭化水素および揮発性非置換炭化水素、例えばブタンおよびプロパンを含んでいてもよい。

経皮パッチは、本発明の化合物を体に制御送達するというさらなる利点を有する。かかる投与形態は、本化合物を適切な媒体に溶解または懸濁させて製造することができる。吸収促進剤を用いて、化合物の皮膚を通過する流入を増加させてもよい。かかる流入速度は、速度制御膜を提供するか、あるいは活性化合物をポリマーマトリックスまたはゲルに分散して、制御することができる。

眼用製剤、眼軟膏、粉末、溶液等も本発明の範囲に含まれると理解される。

非経腸投与に適した本発明の医薬組成物は、１種以上の薬学的に許容される滅菌等張水性または非水性溶液、分散剤、懸濁液またはエマルジョン、あるいは使用の直前に滅菌注射液または分散剤に再構成することができる滅菌粉末と共に、１種以上の本発明の化合物を含み、これは抗酸化剤、バッファー、抗菌剤、意図する患者の体と等張な製剤とするための溶質または懸濁剤もしくは増粘剤を含んでいてもよい。

本発明の医薬組成物に使用することができる好適な水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）およびそれらの好適な混合物、植物油、例えばオリーブ油および注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルを含む。適切な流動性は、例えば、コーティング剤、例えばレシチンの使用によって、分散剤の場合には必要な粒度を維持することによって、そして界面活性剤の使用によって、維持することができる。

これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤のようなアジュバントを含んでいてもよい。微生物の作用の予防が、多様な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等を加えることによって確保され得る。また、張性調節剤、例えば糖、塩化ナトリウム等を組成物に加えることも望まれ得る。さらに、注射医薬形態の延長された吸収が、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延する物質を加えることによってもたらされ得る。

いくつかの場合において、薬物の効果を延長するため、皮下または筋肉内注射からの薬物の吸収を遅延させることが望まれ得る。これは、水溶性の低い結晶状またはアモルファス状物質の液体懸濁液を用いて達成することができる。次いで、薬物の吸収速度は溶解速度に依存し、これは結晶サイズおよび結晶形態に依存し得る。あるいは、非経腸投与薬物形態の吸収遅延は、薬物を油性ビークルに溶解または懸濁させて達成される。

注射デポ形態は、ポリラクチド−ポリグリコライドのような生分解性ポリマー中の対象化合物のマイクロカプセル化マトリックスを形成して製造される。薬物対ポリマーの比、使用する具体的なポリマーの性質に依存して、薬物放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例は、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）を含む。デポ注射用製剤はまた、体組織に適合性であるリポソームまたはミクロエマルジョン中に薬物をトラップすることによって製造される。

本発明の製剤は、経口的、非経腸的、局所的または直腸的に投与することができる。それらは当然、それぞれの投与経路に適した形態で投与される。例えば、錠剤またはカプセル剤の形態で、注射、吸入、眼ローション、軟膏、座薬等によって投与され、注射、輸液または吸入による投与；ローションまたは軟膏による局所投与；および座薬による直腸投与が含まれる。経口および／または静脈内投与が好まれる。

用語「非経腸投与」および「非経腸的に投与」は、本明細書において使用するとき、経腸および局所投与以外の投与形態、通常は注射を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内注射および輸液を含むがこれらに限定されない。

用語「全身投与」、「全身的に投与」、「末梢投与」および「末梢的に投与」は、本明細書において使用するとき、中枢神経系に直接投与する以外の、化合物、薬物または他の物質の投与であって、それが患者の系に入り、代謝および他の同様のプロセスを受ける投与、例えば皮下投与を意味する。

これらの化合物は、経口、例えばスプレーによって経鼻、直腸、膣内、非経腸、大槽内および粉末、軟膏もしくはドロップによって頬側および舌下を含む局所を含む何れかの好適な投与経路によって、ヒトおよび他の動物に治療のために投与される。

選択した投与経路に拘わらず、好適な水和物形態で使用することができる本発明の化合物および／または本発明の医薬組成物は、当業者に既知の常套の方法によって、薬学的に許容される投与形態に製剤される。

本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与レベルは、具体的な患者、組成物および投与形態について所望の治療応答を得るために有効であり、患者に毒性でない有効成分の量を得るために、変化し得る。

選択した投与レベルは、使用する具体的な本発明の化合物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用する具体的な化合物の排出速度、処置期間、使用する具体的な化合物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または物質、処置する患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康および病歴ならびに医学分野で周知の同様の要因を含む多様な要因に依存する。

当該技術分野における通常の技術を有する医師または獣医は、必要な医薬組成物の有効量を容易に決定および予測することができる。例えば、医師または獣医は、使用する本発明の化合物の投与量を、医薬組成物において、所望の治療効果を得るために必要とされるものよりも低いレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を漸増することができる。

一般に、好適な本発明の化合物の１日用量は、治療効果を奏するために有効な最低用量である化合物の量である。かかる有効用量は、一般に、上記要因に依存する。一般に、本発明の化合物の患者への静脈内および皮下投与量は、示した鎮痛効果のために使用されるとき、約０．０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、より好ましくは約０．０１〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日、さらにより好ましくは、約１．０〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。有効量は、Ｗｎｔシグナル伝達関連障害を処置する量である。

所望により、活性化合物の有効１日用量は、その日の間の適切な間隔で、所望により単位投与形態で、２、３、４、５、６またはそれ以上の分割用量で別個に投与することができる。

本発明の化合物を単独で投与することが可能であるが、該化合物を医薬組成物として投与することが好ましい。

合成法
本発明の化合物は、下記条件のいずれか１つ以上を含むがそれらに限定されない、当業者に既知の方法を用いて、一般に入手可能な化合物から製造される。

この文脈の範囲内で、本発明の化合物の特定の所望の最終生成物の構成要素ではない、用意に除去可能な基のみが、文脈が異なることを示していない限り、「保護基」を意味する。かかる保護基による官能基の保護、保護基それ自体およびその切断反応は、例えば標準的参考書、例えばScience of Synthesis: Houben-Weyl Methods of Molecular Transformation. Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany. 2005. 41627 pp. (URL: http://www.science-of-synthesis.com (Electronic Version, 48 Volumes))； J. F. W. McOmie, “Protective Groups in Organic Chemistry”, Plenum Press, London and New York 1973； T. W. Greene and P. G. M. Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis”, Third edition, Wiley, New York 1999； “The Peptides”; Volume 3 (editors: E. Gross and J. Meienhofer), Academic Press, London and New York 1981； “Methoden der organischen Chemie”(Methods of Organic Chemistry), Houben Weyl, 4th edition, Volume 15/I, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974； H.-D. Jakubke and H. Jeschkeit, “Aminosaeuren, Peptide, Proteine” (Amino acids, Peptides, Proteins), Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach, and Basel 1982；および Jochen Lehmann, “Chemie der Kohlenhydrate: Monosaccharide und Derivate” (Chemistry of Carbohydrates: Monosaccharides and Derivatives), Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974に記載されている。保護基の特徴は、それらが容易に（すなわち望ましくない二次的反応を生じずに）、例えば加溶媒分解、還元、光分解または生理的な条件下で（例えば酵素的切断によって）除去できることである。

本発明の化合物の酸付加塩は、最も好適には、薬学的に許容される塩から形成され、これは例えば、無機酸、例えば塩酸、臭化水素、硫酸またはリン酸および有機酸、例えばコハク酸、マレイン酸、酢酸またはフマル酸と形成されるものを含む。他の薬学的に許容されない塩、例えばシュウ酸塩は、例えば本発明の化合物の単離、実験的使用または続く薬学的に許容される酸付加塩への変換のために、使用することができる。また、本発明の溶媒和物および水和物も本発明の範囲に含まれる。

所与の化合物塩の所望の化合物塩への変換は、標準的な技術を適用して達成され、ここで所与の塩の水溶液を塩基、例えば炭酸ナトリウムまたは水酸化カリウムの溶液で処理して、遊離塩基を遊離し、次いで適切な溶媒、例えばエーテルで抽出する。次いで遊離塩基を水性部から分離し、乾燥させ、必要な酸で処理して、所望の塩を得る。

インビトロでのある本発明の化合物の加水分解性エステルまたはアミドは、遊離ヒドロキシまたはアミノ官能基を有するこれらの化合物を所望のエステルの酸クロライドで、塩基の存在下、不活性溶媒、例えば塩化メチレンまたはクロロホルム中で処理して、形成することができる。好適な塩基は、トリエチルアミンまたはピリジンを含む。逆に、遊離カルボキシ基を有する本発明の化合物は、活性化、次いで好適な塩基の存在下で所望のアルコールで処理することを含んでいてもよい標準的条件を用いて、エステル化することができる。

薬学的に許容される酸付加塩の例は、非毒性無機および有機酸付加塩、例えば塩酸由来の塩酸塩、臭化水素酸由来の臭化水素炎、硝酸由来の硝酸塩、過塩素酸由来の過塩素酸塩、リン酸由来のリン酸塩、硫酸由来の硫酸塩、ギ酸由来のギ酸塩、酢酸由来の酢酸塩、アコニット酸由来のアコニット酸塩、アスコルビン酸由来のアスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸由来のベンゼンスルホン酸塩、安息香酸由来の安息香酸塩、桂皮酸由来の桂皮酸、クエン酸由来のクエン酸塩、エムボン酸由来のエムボン酸塩、エナント酸由来のエナント酸塩、フマル酸由来のフマル酸塩、グルタミン酸由来のグルタミン酸塩、グリコール酸由来のグリコール酸塩、乳酸由来の乳酸塩、マレイン酸由来のマレイン酸塩、マロン酸由来のマロン酸塩、マンデル酸由来のマンデル酸塩、メタンスルホン酸由来のメタンスルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸由来のナフタレン−２−スルホン酸塩、フタル酸由来のフタル酸塩、サリチル酸由来のサリチル酸塩、ソルビン酸由来のソルビン酸塩、ステアリン酸由来のステアリン酸塩、コハク酸由来のコハク酸塩、酒石酸由来の酒石酸塩、トルエン−ｐ−スルホン酸由来のｐ−トルエンスルホン酸塩等を含むが、これらに限定されない。特に好ましい塩は、本発明の化合物のナトリウム、リシンおよびアルギニン塩である。かかる塩は、当該技術分野において周知および記載の方法によって形成させることができる。

薬学的に許容されると考えることができないオキサル酸のような他の酸は、本発明の化合物およびその薬学的に許容される酸付加塩を得るための中間体として有用な塩の製造に有用であり得る。

本発明の化合物の金属塩は、アルカリ金属塩、例えばカルボキシ基を有する本発明の化合物のナトリウム塩を含む。

本発明に従って得られる異性体の混合物は、自体公知の方法で、個々の異性体に分離することができ；ジアステレオマーは、例えば多相溶媒混合物間での分配、再結晶および／または例えばシリカゲルによるクロマトグラフ分離、または例えば逆相カラムでの中圧液体クロマトグラフィーで分離することができ、そしてラセミ体は、例えば光学的に純粋な塩形成反応剤との塩形成およびそうして得られたジアステレオマー混合物の、例えば分画結晶化による分離、または光学的に活性なカラム材料によるクロマトグラフィーによって、分離することができる。

中間体および最終生成物は標準的方法、例えばクロマトグラフ法、分配法、（再）結晶化等に従って後処理および／または精製することができる。

一般的方法条件
次のものは、一般に、本開示を通じて記載の全方法に適用する。

本発明の化合物を合成する方法工程を、具体的に記載のものを含む自体公知の反応条件下で、溶媒または希釈剤の非存在下、または通常はそれの存在下で（例えば溶媒または希釈剤は使用される試薬に対して不活性であり、それらを溶解させる）、触媒、縮合剤または中和剤、例えばイオン交換反応薬、例えばＨ^＋形態の例えばカチオン交換反応薬の非存在下、またはそれの存在下で、反応および／または反応物の性質に依存して、低温、常温または高温で、例えば約−１００℃〜約１９０℃、例えば約−８０℃〜約１５０℃、例えば−８０〜−６０℃、室温、−２０〜４０℃、または還流温度で、大気圧または加圧が適当であるとき密封容器内で、および／または不活性雰囲気下で、例えばアルゴンまたは窒素雰囲気下で行うことができる。

反応の全ての段階で、形成された異性体の混合物を、個々の異性体、例えばジアステレオマーもしくはエナンチオマー、または異性体のいずれかの所望の混合物、例えばラセミ体またはジアステレオマーの混合物に、例えばScience of Synthesis: Houben-Weyl Methods of Molecular Transformation. Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany. 2005に記載の方法と同様にして分離することができる。

いずれかの特定の反応に適している溶媒が選択され得る溶媒には、具体的に記載のもの、または例えば、水、エステル、例えば低級アルキル−低級アルカノエート、例えば酢酸エチル、エーテル、例えば脂肪族エーテル、例えばジエチルエーテル、または環状エーテル、例えばテトラヒドロフランまたはジオキサン、液体芳香族性炭化水素、例えばベンゼンまたはトルエン、アルコール、例えばメタノール、エタノールまたは１−もしくは２−プロパノール、ニトリル、例えばアセトニトリル、ハロゲン化炭化水素、例えば塩化メチレンまたはクロロホルム、酸アミド、例えばジメチルホルムアミドまたはジメチルアセトアミド、塩基、例えばヘテロ環式窒素塩基、例えばピリジンまたはＮ−メチルピロリジン−２−オン、カルボン酸無水物、例えば低級アルカン酸無水物、例えば無水酢酸、環状、直鎖または分枝鎖炭化水素、例えばシクロヘキサン、ヘキサンまたはイソペンタン、あるいはそれらの溶媒の混合物、例えば水溶液が、方法の記載に異なることが記載されていない限り、含まれる。かかる溶媒混合物は、後処理において、例えばクロマトグラフィーまたは分配に用いることもできる。

化合物およびそれらの塩を、水和物の形態で得ることができ、またはそれらの結晶は、例えば結晶化に使用した溶媒を含んでいてもよい。異なる結晶形が存在し得る。

本発明はまた、方法のいずれかの段階で中間体として入手可能な化合物を出発物質として用いて、残りの方法工程を行うか、または出発物質を反応条件下で形成させるか、または誘導体の形態で、例えば保護形態でもしくは塩形で用いるか、あるいは本発明の方法によって入手可能な化合物を方法条件下で製造し、さらにインサイチュで処理する方法の形態に関する。

プロドラッグ
本発明はまた、本発明の化合物の薬学的に許容されるプロドラッグを含む医薬組成物、およびそれを投与することによるＷｎｔシグナル伝達関連障害を処置する方法を含む。例えば、遊離アミノ、アミド、ヒドロキシまたはカルボキシル基を有する本発明の化合物は、プロドラッグに変換することができる。プロドラッグは、アミノ酸残基、または２個以上（例えば２、３または４個）のアミノ酸残基のポリペプチドがアミド結合またはエステル結合を介して本発明の化合物の遊離アミノ、ヒドロキシまたはカルボン酸基と共有結合している化合物を含む。アミノ酸残基は、一般に３文字表記される２０種の天然に生じるアミノ酸、および４−ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン、デモシン、イソデモシン、３−メチルヒスチジン、ノルバリン、ベータアラニン、ガンマアミノ酪酸、シトルリン、ホモシステイン、ホモセリン、オルニチンおよびメチオニンスルホンを含むが、これらに限定されない。さらなるプロドラッグのタイプも含まれる。例えば、遊離カルボキシル基を、アミドまたはアルキルエステルとして誘導化することができる。Advanced Drug Delivery Reviews, 1996, 19, 115に説明されているとおり、遊離ヒドロキシ基を、ヘミコハク酸塩、リン酸エステル、ジメチルアミノアセテート、およびホスホリルオキシメチルオキシカルボニルを含むがこれらに限定されない基を用いて誘導化することができる。ヒドロキシおよびアミノ基のカルバメートプロドラッグも、ヒドロキシ基のカルボネートプロドラッグ、スルホン酸エステルおよび硫酸エステルであるのと同様に含まれる。（アシルオキシ）メチルおよび（アシルオキシ）エチルエーテル（ここで、アシル基は所望によりエーテル、アミンおよびカルボン酸官能基を含むがこれらに限定されない置換基で置換されていてもよいアルキルエステルであってよいか、またはアシル基は上記アミノ酸エステルである）のようなヒドロキシ基の誘導体化も含まれる。このタイプのプロドラッグは、J. Med. Chem. 1996, 39, 10に記載されている。遊離アミンはまた、アミド、スルホンアミドまたはホスホンアミドとして誘導体化されていてもよい。これらのプロドラッグ基は全て、エーテル、アミンおよびカルボン酸官能基を含むがこれらに限定されない基を組み込んでいてもよい。

したがって本発明の化合物についてのいずれかの記載は、適切かつ便宜であるとき、本発明の化合物の対応するプロドラッグについても言及しているものと理解される。

融合タンパク質

本発明は、キメラまたは融合タンパク質を提供する。本明細書において使用するとき、「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、異種ポリペプチド（すなわち、同じ本発明のポリペプチド以外のポリペプチド）と作動可能に連結した本発明のポリペプチドの全てまたは部分（好ましくは生物学的に活性な）を含む。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結」は、本発明のポリペプチドと異種ポリペプチドが互いにフレーム内で融合していることを意味する。異種ポリペプチドは、本発明のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端と融合していてよい。

一つの有用な融合タンパク質は、本発明のポリペプチドがＧＳＴ配列のＣ末端と融合している、ＧＳＴ融合タンパク質である。かかる融合タンパク質は、本発明の組換えポリペプチドの精製を促進し得る。

他の態様において、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含む。例えば、本発明のポリペプチドの天然シグナル配列を除去し、他のタンパク質由来のシグナル配列で置き換えることができる。例えば、バキュロウイルスエンベロープタンパク質のｇｐ６７分泌配列は異種シグナル配列として用いることができる（Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992）。真核生物異種シグナル配列の他の例は、メリチンおよびヒト胎盤アルカリホスファターゼの分泌配列を含む（Stratagene; La Jolla, California）。さらに別の例において、有用な原核生物異種シグナル配列は、ｐｈｏＡ分泌シグナル（Sambrook et al., supra）およびタンパク質Ａ分泌シグナル（Pharmacia Biotech; Piscataway, New Jersey）を含む。

さらに別の態様において、融合タンパク質は、本発明のポリペプチドの全部または一部が免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバー由来の配列と融合している、免疫グロブリン融合タンパク質である。本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、医薬組成物に組み込み、リガンドと細胞の表面上のタンパク質（受容体）間の相互作用を阻害し、それによってインビボでのシグナル伝達を阻害するために、対象に投与することができる。免疫グロブリン融合タンパク質を使用して、本発明のポリペプチドの類似リガンドの生物学的利用能に作用させることができる。リガンド／受容体相互作用の阻害は、増殖性および分化障害両方の処置および細胞生存の調節（例えば促進または阻害）に治療上有用であり得る。さらに、本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、対象において本発明のポリペプチドに対する抗体を生産するため、リガンドを精製するため、そしてスクリーニングアッセイにおいて受容体とリガンドの相互作用を阻害する分子を同定するための免疫源として使用することができる。

本発明のキメラおよび融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって作成することができる。他の態様において、自動ＤＮＡ合成装置を含む常套の技術によって、融合遺伝子を合成することができる。あるいは、２つの連続遺伝子フラグメント間の相補的オーバーハングを生じさせて、次いでアニールさせることができ、再増幅してキメラ遺伝子配列を作成することができるアンカープライマーを用いて、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を実施することができる（例えばAusubel et al., supra参照）。さらに、融合部分（例えばＧＳＴポリペプチド）を既にコードする多様な発現ベクターが商業的に入手可能である。本発明のポリペプチドをコードする核酸は、融合部分がフレーム内で本発明のポリペプチドと結合するように発現ベクターにクローン化することができる。

ＲＮＡｉ

本発明は、低分子干渉リボ核酸配列（ｓｉＲＮＡ）ならびにｓｉＲＮＡを用いてＴＮＫＳ１／２遺伝子または細胞もしくは哺乳類におけるＡｘｉｎ安定化に関与する他の遺伝子の発現粗阻害するための組成物および方法を提供する。本発明はまた、Ｗｎｔシグナル伝達関連障害、例えばＴＮＫＳ１／２遺伝子またはＡｘｉｎ安定化に関与する遺伝子の異常な発現によって、あるいは前記遺伝子が重要なメンバーである経路の異常なシグナル伝達によって引き起こされる哺乳類の病的状態および疾患を含む、Ｗｎｔシグナル伝達関連障害をｓｉＲＮＡを用いて処置するための組成物および方法を提供する。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られるプロセスによって、ｍＲＮＡの配列特異的分解を引き起こす。

本発明のｓｉＲＮＡは、３０ヌクレオチド長未満、一般には１９〜２４ヌクレオチド長であり、ＴＮＫＳ１／２遺伝子またはＡｘｉｎ安定化に関与する他の遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の少なくとも一部と実質的に相補性である領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含む。これらのｓｉＲＮＡを用いて、例えばＷｎｔシグナル伝達経路に関与する遺伝子のｍＲＮＡを標的に分解することができる。

本発明によるｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を仲介する。用語「ＲＮＡｉ」は当該技術分野において周知であり、標的遺伝子と相補的な領域を有するｓｉＲＮＡによって細胞の１つ以上の標的遺伝子を阻害することを意味すると一般に理解される。ｓｉＲＮＡをそのＲＮＡｉを仲介する能力について試験するための多様なアッセイが、当該技術分野において知られている（例えば、Elbashir et al., Methods 26 (2002), 199-213参照）。本発明のｓｉＲＮＡの遺伝子発現に対する効果は、典型的には、本発明のＲＮＡ分子で処理されない細胞と比較したとき、少なくとも１０％、３３％、５０％、９０％、９５％または９９％阻害された標的遺伝子の発現をもたらす。

本発明による「ｓｉＲＮＡ」または「低分子干渉リボ核酸」は当該技術分野において既知の意味を有し、次の局面を含む。ｓｉＲＮＡは、生理的な条件下で相補領域に沿ってハイブリダイズする２本のヌクレオチド鎖から成る。該鎖は分離するが、ある態様において、分子リンカーによって会合し得る。個々のリボヌクレオチドは天然に生じる非修飾リボヌクレオチド、天然に生じる非修飾デオキシリボヌクレオチドであり得るか、あるいはそれらは本明細書の別の箇所に記載のとおり、化学的に修飾または合成することができる。

本発明のｓｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子のｍＲＮＡの領域と実質的に同一である二本鎖領域を含む。標的遺伝子の対応する配列と１００％同一性を有する領域が好適である。この状態は、「完全相補的」と称される。しかし、該領域はまた、標的とするｍＲＮＡの領域の長さに依存して、標的遺伝子の対応する領域と比較して、１、２または３個のミスマッチを含んでいてもよく、それ自体十分に相補的でなくともよい。ある態様において、本発明のＲＮＡ分子は１つの所定の遺伝子を特異的に標的とする。望ましいｍＲＮＡのみを標的とするためには、ｓｉＲＮＡ剤が標的ｍＲＮＡに対して１００％相同性を有し、該細胞または生物に存在する他の全ての遺伝子と少なくとも２個のミスマッチヌクレオチドを有し得る。特定の標的配列の発現を有効に阻害するために十分な配列同一性を有するｓｉＲＮＡを分析および同定する方法は、当該技術分野において既知である。配列同一性は配列比較および当該技術分野において既知のアラインメントアルゴリズム（Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991およびそれに引用されている文献参照）によって最適化し、例えばＢＥＳＴＦＩＴソフトウェアプログラムに実装されているSmith-Watermanアルゴリズムによって、デフォルトパラメーター（例えばUniversity of Wisconsin Genetic Computing Group）を用いて、ヌクレオチド配列間の相違率を計算することができる。

ＲＮＡｉ剤の有効性に作用する別の要因は、標的遺伝子の標的領域である。ＲＮＡｉ剤による阻害が有効な標的遺伝子の領域は、実験によって決定することができる。好適なｍＲＮＡ標的領域は、コーディング領域である。５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲおよびスプライス部位のような非翻訳領域も好適である。例えば、Elbashir S.M. et al, 2001 EMBO J., 20, 6877-6888に記載のトランスフェクションアッセイが、この目的で実施され得る。多数の他の好適なアッセイおよび方法が当該技術分野において存在し、当業者に周知である。

本発明に従って、標的と相補的なｓｉＲＮＡの領域の長さは、１０〜１００ヌクレオチド、１２〜２５ヌクレオチド、１４〜２２ヌクレオチドまたは１５、１６、１７もしくは１８ヌクレオチドであり得る。対応する標的領域にミスマッチが存在するとき、相補領域の長さは、一般に、ある程度長い必要がある。

ｓｉＲＮＡがオーバーハング末端（標的と相補的であってもなくてもよい）またはそれ自体と相補的であるが、標的遺伝子とは相補的でないさらなるヌクレオチドを担持していてもよいため、ｓｉＲＮＡのそれぞれの鎖の合計長さは、１０〜１００ヌクレオチド、１５〜４９ヌクレオチド、１７〜３０ヌクレオチドまたは１９〜２５ヌクレオチドであってもよい。

用語「それぞれの鎖は４９ヌクレオチドまたはそれ未満」は、全ての修飾または非修飾ヌクレオチドを含むが、該鎖の３’または５’末端に加えられ得る任意の化学基を含まない、鎖の連続ヌクレオチド合計数を意味する。鎖に挿入された短い化学基は数えないが、２本の別々の鎖を結合させるために設計された化学リンカーは、連続ヌクレオチドを作るとは見なさない。

用語「５’末端または３’末端の少なくとも一方における１〜６ヌクレオチドオーバーハング」は、生理的な条件下で２本の別々の鎖から形成される相補的ｓｉＲＮＡの構造を意味する。末端ヌクレオチドがｓｉＲＮＡの二本鎖領域の一部であるとき、該ｓｉＲＮＡは平滑末端と考えられる。末端で１個以上のヌクレオチドが対になっていないとき、オーバーハングが創出される。オーバーハングの長さは、オーバーハングしているヌクレオチドの数によって測定される。オーバーハングしているヌクレオチドは、何れかの鎖の５’末端または３’末端の何れかに存在していてよい。

本発明のｓｉＲＮＡは、少なくとも一方の鎖に少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含めることによって、経口送達に好適な、高いインビボ安定性を付与される。したがって、本発明のｓｉＲＮＡは、少なくとも１個の修飾または非天然リボヌクレオチドを含む。多くの既知の化学修飾の長い説明が、公表されているＰＣＴ特許出願WO 200370918に記載されており、ここで反復することは避ける。経口送達に好適な修飾は、本明細書の実施例および説明により具体的に記載されている。好適な修飾は、糖部分（すなわち糖部分の２’位、例えば２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥ）（Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504）、すなわちアルコキシアルコキシ基）または塩基部分（すなわち、別のヌクレオチド鎖の別の特定の塩基と対を形成する能力を維持した、非天然または修飾塩基）への修飾を含むが、これらに限定されない。他の修飾にはいわゆる「バックボーン」修飾が含まれ、これはホスホエステル基（隣接リボヌクレオチドを例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートで結合する）を置換することを含むが、これに限定されない。最後に、本明細書において３’キャップまたは５’キャップと称することもある末端修飾が重要であり得る。キャップはより複雑な化学からなり得て、当業者に既知である。

一つの態様において、本発明は、ＴＮＫＳ１／２遺伝子またはＡｘｉｎ安定化に関与する他の遺伝子の発現を阻害するための、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を提供する。ｄｓＲＮＡは、互いに相補的な少なくとも２本の配列を含む。ｄｓＲＮＡは、第１配列を含むセンス鎖と、第２の配列を含むアンチセンス鎖を含む。アンチセンス鎖は、ＴＮＫＳ１／２遺伝子またはＡｘｉｎ安定化に関与する他の遺伝子をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的であり、該相補性の領域が３０ヌクレオチド長未満、一般に１９〜２４ヌクレオチド長である、ヌクレオチド配列を含む。ｄｓＲＮＡは、ＴＮＫＳ１／２遺伝子またはＡｘｉｎ安定化に関与する他の遺伝子を発現している細胞と接触させると、該遺伝子の発現を少なくとも４０％阻害する。

他の態様において、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡの一つを含む細胞を提供する。該細胞は一般に、哺乳類細胞、例えばヒト細胞である。

他の態様において、本発明は、生物、一般にヒト対象におけるＴＮＫＳ１／２遺伝子またはＡｘｉｎ安定化に関与する他の遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって、１種以上の本発明のｄｓＲＮＡと、薬学的に許容される担体または送達ビークルを含む医薬組成物を提供する。

他の態様において、本発明は、細胞においてＴＮＫＳ１／２遺伝子またはＡｘｉｎ安定化に関与する他の遺伝子の発現を阻害する方法であって、次の段階を含む方法を提供する：

（a）細胞に二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を導入し（ここで該ｄｓＲＮＡは、互いに相補的な少なくとも２本の配列を含む。該ｄｓＲＮＡは第１配列を含むセンス鎖と、第２の配列を含むアンチセンス鎖を含む。該アンチセンス鎖は、ＴＮＫＳ１／２遺伝子またはＡｘｉｎ安定化に関与する他の遺伝子をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的であり、該相補性の領域が３０ヌクレオチド長未満、一般に１９〜２４ヌクレオチド長である、相補性領域を含む。そして該ｄｓＲＮＡは、ＴＮＫＳ１／２遺伝子またはＡｘｉｎ安定化に関与する他の遺伝子を発現している細胞と接触させると、該遺伝子の発現を少なくとも４０％阻害する）；そして

（b）ＴＮＫＳ１／２遺伝子またはＡｘｉｎ安定化に関与する他の遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の分解がえられるのに十分な時間、段階（a）で作成した細胞を維持して、該細胞における前記遺伝子の発現を阻害する。

他の態様において、本発明は、細胞におけるＴＮＫＳ１／２遺伝子またはＡｘｉｎ安定化に関与する他の遺伝子の発現を阻害するためのベクターであって、本発明のｓｉＲＮＡの少なくとも一方の鎖をコードするヌクレオチド配列と作動可能に結合した制御配列を含むベクターを提供する。

本発明の阻害核酸化合物は、商業的に入手可能な自動化ＤＮＡ合成装置、例えばApplied Biosystems（Foster City, CA）モデル380B、392または394 DNA/RNA合成装置等の装置による常套の方法によって合成することができる。ホスホラミダイト化学を用いてもよい。本発明の阻害核酸化合物は修飾されていてもよく、例えば、多くの文献に記載されているヌクレアーゼ耐性バックボーン、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミダイト等を用いることができる。阻害核酸の長さは、生物学的活性が阻害されるために十分であるべきである。したがって、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合、望まれる標的ポリヌクレオチドでのみ特異的結合が生じて、他の偶然の部位では生じないために十分に大きい必要がある。長さの上限は、約３０〜４０ヌクレオチド長以上のオリゴマーを合成し、精製する不便さおよび費用、短いオリゴヌクレオチドよりも長いオリゴヌクレオチドのほうがミスマッチにより耐性であること等を含む、多様な要因によって決定される。より好ましくは、オリゴヌクレオチド部分は、約１８〜２５ヌクレオチドの長さを有する。

二本鎖ＲＮＡ、すなわちセンス−アンチセンスＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子とも称し、ＴＮＫＳ１／２遺伝子またはＡｘｉｎ安定化に関与する他の遺伝子の発現を阻害するために使用することもできる。ＲＮＡ干渉は、１本の鎖が標的ｍＲＮＡのコード領域に対応している外因性低分子ＲＮＡ二本鎖を投与する方法である（Elbashir et al.（2001） Nature 411: 494）。細胞に入ると、ｓｉＲＮＡ分子は外因性ＲＮＡ二本鎖の分解だけでなく、内因性メッセンジャーＲＮＡを含む同一の配列を有する一本鎖ＲＮＡの分解をも引き起こす。したがって、該技術が触媒的メカニズムによって作用すると考えられているため、ｓｉＲＮＡは従来のアンチセンスＲＮＡ方法論よりも強力かつ有効であり得る。好ましいｓｉＲＮＡ分子は、典型的には１９〜２５ヌクレオチド長、好ましくは約２１ヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡを標的細胞に送達するための有効な戦略は、例えば物理的または化学的トランスフェクションを用いた導入を含む。

あるいは、ｓｉＲＮＡは、例えば機能的ｓｉＲＮＡまたはその前駆体の転写を可能とする多様なＰｏｌＩＩＩプロモーター発現カセットを用いて、細胞内で発現することができる。例えば、Scherr et al. (2003) Curr. Med. Chem. 10(3):245; Turki et al. (2002) Hum. Gene Ther. 13(18):2197; Cornell et al. (2003) Nat. Struct. Biol. 10(2):91を参照されたい。本発明はまた、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が可能な他の低分子ＲＮＡ、例えばマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む。

下記実施例は、本発明の局面の実施において、本発明者らが用いた技術の代表例である。これらの技術は本発明の実施のための好ましい態様の典型例であり、当業者は、本明細書の開示に基づいて、本発明の精神および意図から離れることなく、多様な修飾を行うことができると理解されるべきである。

実施例
実施例１：低分子Ｗｎｔ阻害剤を同定するためのスクリーニングアッセイ
Ｗｎｔ／β−カテニン経路の低分子阻害剤を同定するため、１００万個の化合物にわたって、ＨＥＫ２９３細胞でＷｎｔ応答性Super-Topflash（STF）ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて、ハイスループット化合物スクリーニングを使用した。その選択性プロファイルと効力に基づいて、続く実験はＸＡＶ９３９と本明細書において称する化合物に集中させた。ＸＡＶ９３９はＷｎｔ３Ａ刺激ＳＴＦ活性をＨＥＫ２９３細胞において強力に阻害したが、ＣＲＥ、ＮＦ−κＢまたはＴＧＦβルシフェラーゼレポーターには作用しなかった。逆に、ＸＡＶ９３９の近い構造アナログであるＬＤＷ６４３は、Ｗｎｔ３Ａ誘導性ＳＴＦレポーターに対する活性を有さなかった。ＸＡＶ９３９処置は、ＨＥＫ２９３細胞において、Ｗｎｔ３Ａ誘導性β−カテニン蓄積を阻止することが見出され、これは該化合物がＷｎｔ経路活性をβ−カテニンの上流で調節することを示している。

ＸＡＶ９３９がβ−カテニン分解を促進する破壊複合体の上流できのうするのか、またはそのレベルで機能するのかを試験するため、結直腸癌細胞系ＳＷ４８０における化合物処置の効果を試験した。ＳＷ４８０細胞系は切断ＡＰＣアレルを有し、それによって破壊複合体活性が損なわれている。興味深いことに、ＸＡＶ９３９はＳＷ４８０細胞においてＳＴＦ活性を阻害するが、無傷なＷｎｔ経路カスケードを有するＨＥＫ２９３細胞におけるほどではなかった。このＳＴＦ活性の低下と一致して、ＸＡＶ９３９は、ＳＷ４８０細胞において、β−カテニン存在量を減少させたが、β−カテニンリン酸化（Ｓ３３／Ｓ３７／Ｔ４１）顕著に増加させた。これはＸＡＶ９３９がβ−カテニンのリン酸化依存的分解を促進することを示唆している。これらの発見は、ＸＡＶ９３９が欠損したＡＰＣ機能を有する細胞においてさえ、おそらく破壊複合体の活性を調節することにより、β−カテニン分解を修復し得ることを示している。

ＸＡＶ９３９がどのように破壊複合体の活性を上昇させ得るかを調べるため、既知のＷｎｔ経路成分のタンパク質レベルに対する化合物処置の効果を試験した。驚くべきことに、ＸＡＶ９３９処置後のＡｘｉｎ１およびＡｘｉｎ２のタンパク質レベルは強く上昇したが、それらの転写レベルは化合物処置によって影響されなかった。さらに、おそらく上昇したＡｘｉｎタンパク質レベルに応答してＡｘｉｎへのＧＳＫ３βの採用が促進されたため、Ａｘｉｎ−ＧＳＫ３β複合体形成における強い増加が観察された。この現象は、ＤＬＤ−１細胞、切断されたＡＰＣを有する他の結直腸癌細胞系におけるＡｘｉｎ１／２タンパク質レベル、β−カテニン分解およびβ−カテニン標的遺伝子発現に対するＸＡＶ９３９の効果が観察されることによって確認された。

重要なことに、ＳＷ４８０細胞におけるＡｘｉｎ１／２のｓｉＲＮＡ介在性欠乏は、β−カテニン分解に対するＸＡＶ９３９の効果を逆転し、ＳＴＦレポーターに対するＸＡＶ９３９の阻害効果を消失させた。これはさらに、ＸＡＶ９３９がＡｘｉｎ１／２タンパク質レベルを上昇させることによってＷｎｔシグナル伝達を阻害していることを示している。これらの発見をあわせると、ＸＡＶ９３９はＧＳＫ３β−Ａｘｉｎ複合体形成を増加し、それによってＧＳＫ３β依存的リン酸化およびβ−カテニンのプロテアソーム分解を促進することが示される。

少なくとも実施例１に記載のSuperTopFlash（STF）は、次のとおりに作成したプラスミドを使用した：SuperTopflashレポーターは、１２個のＴＣＦ結合部位をｐＴＡ−Ｌｕｃ（Clontech）に挿入して作成した。マウスＡｘｉｎ１およびその変異体をアミノ末端でＧＦＰまたはＦＬＡＧエピトープと融合させ、メタロチオネインプロモーターの制御下でレトロウイルスベクターにクローン化した。ヒトＴＮＫＳ１／２およびそれらの変異体をＦＬＡＧエピトープとアミノ末端で融合させてタグ化して、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下で哺乳類発現ベクターにクローン化した。カルボキシル末端で３個のＨＡエピトープと融合させたショウジョウバエＡｘｉｎを、メタロチオネインプロモーターの制御下でショウジョウバエ発現ベクターにクローン化した。マウスＡｘｉｎ１のアミノ末端フラグメント（a.a. １〜８７）をコードする配列をＴｅｔ制御発現ベクターpcDNA4-TO（Invitrogen）にクローン化した。Gateway技術（Invitrogen）を用いて、発現ベクターpDEST15（Invitrogen, Carlsbad, CA): TNKS1-P（1088-1327）、TNKS2-P（934-1166）、TNKS2-SP（872-1166）、PARP1-P（662-1014）およびPARP16-P（93-273）に多様なタンパク質をクローン化した。

実施例３：ＸＡＶ９３９はタンキラーゼを阻害してＡｘｉｎタンパク質レベルを制御する
実施例３ａ：ｉＴＲＡＱ定量的化学プロテオミクスアプローチ

ＸＡＶ９３９がＡｘｉｎタンパク質レベルをアップレギュレーションする細胞効果標的を同定するために、３チャンネルｉＴＲＡＱ定量化学的プロテオミクスアプローチを用いた。この戦略は、ＨＥＫ２９３細胞溶解物由来の親和性捕捉細胞タンパク質へのＸＡＶ９３９の生物活性アナログの固定化に基づく。非特異的結合と特異的結合を区別するために、過剰量（２０μＭ）の親化合物ＸＡＶ９３９、不活性アナログＬＤＷ６４３またはＤＭＳＯを細胞溶解物に加えた後、固定化化合物とインキュベーションして、競合実験を行った。固定化化合物、例えば推定効果標的および能力のない標的（potential off-target）との特異的結合は、ＸＡＶ９３９と競合するが、ＬＤＷ６４３とは競合しない。

化学的ペプチド標識技術ｉＴＲＡＱを用いて、３サンプルを多重化し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によってビークル（ＤＭＳＯ）に対する結合置換（％競合）を定量した。合計６９９タンパク質を定量した。しかし、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼＰＡＲＰ１（９３％競合）、ＰＡＲＰ２（８８％競合）、ＰＡＲＰ５ａ／ＴＮＫＳ１（７９％競合）およびＰＡＲＰ５ｂ／ＴＮＫＳ２（７４％競合）を含む１８種のタンパク質のみが、可溶性ＸＡＶ９３９により顕著かつ特異的に競合を失った（＞６５％、＞平均の２σ）。さらに、既知のＰＡＲＰ１基質を含むたようなタンパク質分子、例えばＫＵ７０複合体成分（ＸＲＣＣ５、ＸＲＣＣ６）およびＦＡＣＴ成分（ＳＵＰＴ１６Ｈ、ＳＳＲＰ１）は、おそらくＰＡＲＰ１と同時に共精製されるため、顕著に競合した。多くのタンパク質は競合せず（＜平均の２σ）、これはこれらが溶液中での自由な化合物との結合とは異なる結合形態で、親和性マトリックス上で富化された、極めて豊富な低親和性結合物質またはタンパク質のいずれかであることを示唆している。

ｉＴＲＡＱ法はBantscheff et al（2007）に記載のとおりに実施した。簡潔には、ゲルレーンを分離範囲にわたってスライスし、ゲル内トリプシン消化を行い、次いでｉＴＲＡＱ標識（Applied Biosystems）を行った。ＤＭＳＯビークル対照から抽出したペプチドをｉＴＲＡＱ試薬１１６で標識化し、ｉＴＲＡＱ試薬１１４および１１５でそれぞれ標識化した化合物処理サンプルからの抽出物と合併した。LTQ-Orbitrapマススペクトロメーター（Thermo-Finnigan）で液体クロマトグラフィータンデム質量分析によって、配列決定を行った。タンデムマススペクトルは、ｉＴＲＡＱレポーターイオンの検出が可能なように、pulsed-Q dissociationを用いて作成した、ペプチド質量およびフラグメンテーションデータを用いて、Mascot（Matrix Science）を使用するＩＰＩデータベースの社内監督版（in-house curated version）にクエリーを行った。タンパク質の同定は、デコイデータベースを用いて実証した。ｉＴＲＡＱレポーターイオン利用定量化を、社内で開発したソフトウェアで実施した。

実施例３ｂ：化合物競合

同定したＰＡＲＰタンパク質のインビボでの結合親和性を確立するために、用量応答化合物競合実験を行った。これにより、ＸＡＶ９３９はＴＮＫＳ結合を０．１μＭで阻止し、ＰＡＲＰ１／２結合を１μＭで阻止することが示された。予期したとおり、不活性な化合物ＬＤＷ６４３はこのアッセイで活性を有さなかった。Ｃｙ５−標識化ＸＡＶ９３９および組換えＰＡＲＰタンパク質を用いて、化合物の結合をさらに特徴付けた。ＸＡＶ９３９はＴＮＫＳ１およびＴＮＫＳ２の触媒的（ＰＡＲＰ）ドメインと緊密に結合することが見出された（それぞれＫｄ０．０９９μＭおよび０．０９３μＭ）。ＸＡＶ９３９は組換えＰＡＲＰ１とも結合したが、結合親和性が低かった（Ｋｄ１．２μＭ）。

ＸＡＶ９３９とＴＮＫＳ１、ＴＮＫＳ２およびＰＡＲＰ１との親和性（平衡解離定数Ｋｄ）を測定するために、ＴＮＫＳ１、ＴＮＫＳ２またはＰＡＲＰ１のＰＡＲＰドメインを含むＧＳＴ融合タンパク質の滴定を、Ｃｙ５と結合させた５０ｎＭのＸＡＶ９３９（ＸＡＶ９３９^Ｃｙ５）と共に、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０／５０ｍＭのＮａＣｌ／０．０８％のTriton X-100／１０ｍＭのＭｇＣｌ_２中で、３０℃で２時間、黒色３８４ウェルプレートでインキュベートすることにより行った。次いで、Perkin-Elmer Envision Plate ReaderのＣｙ５ＦＰに最適化された光学（最適化Cy5 FP Dual Emission Label、Perkin-Elmer）を用いて、蛍光偏光値を得た。[1000 x （S-G*P/S+G*P）]データを保存し、GraphPad Prismを用いて一部合計結合飽和（one-site total binding saturation）アルゴリズムで分析した。

実施例３ｃ：ｓｉＲＮＡ実験

どのＰＡＲＰファミリーメンバーがＸＡＶ９３９誘導性Ａｘｉｎタンパク質蓄積の実際に有効な標的であるかを決定するため、それらのｓｉＲＮＡ介在機能喪失表現型を評価した。近いファミリーメンバー間での潜在的代理機能性を回避するため、２種のタンキラーゼパラログＴＮＫＳ１およびＴＮＫＳ２ならびにＰＡＲＰ１およびＰＡＲＰ２が同時に標的にされた。特に、ＴＮＫＳ１およびＴＮＫＳ２の共欠損は、Ａｘｉｎ１およびＡｘｉｎ２両方のタンパク質レベルを上昇させてＸＡＶ９３９の効果を表現型模写したが、ＰＡＲＰ１／２ノックダウンはＡｘｉｎタンパク質レベルに影響しなかった。ＸＡＶ９３９がＰＡＲＰ１よりもＴＮＫＳ１／２に対してより高い親和性を示すということとあわせると、これらの発見は、ＴＮＫＳ１およびＴＮＫＳ２がＸＡＶ９３９の細胞効果標的であると強く示唆している。

さらなるｓｉＲＮＡを用いて、ＳＷ４８０細胞において、ＴＮＫＳ１およびＴＮＫＳ２の共欠損がβ−カテニンリン酸化を上昇し、β−カテニン存在量を減少させ、β−カテニン標的遺伝子の転写を阻害することをさらに示す。特に、ＴＮＫＳ１またはＴＮＫＳ２のいずれかのみの欠損は、Ａｘｉｎ１／２タンパク質レベルの上昇を導かなかったが、これはＡｘｉｎタンパク質レベルの制御に置いて、ＴＮＫＳ１およびＴＮＫＳ２の機能が重複していることを示している。ＴＮＫＳ１およびＴＮＫＳ２の共欠損はまた、ＨＥＫ２９３細胞およびＤＬＤ−１細胞においてもＸＡＶ９３９を表現型模写する。

多数の重要なＷｎｔ経路成分が進化的に保存されているため、Ａｘｉｎタンパク質レベルおよびＷｎｔシグナル伝達を制御するＴＮＫＳの能力を、ショウジョウバエ細胞においても試験した。ショウジョウバエＴＮＫＳを標的とする二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、Ｓ２細胞において異種的に発現されたショウジョウバエＡｘｉｎのタンパク質レベルを上昇させたが、そのｍＲＮＡレベルは上昇させなかった。さらに、ＴＮＫＳｄｓＲＮＡはＷｎｔ／無翅レポーターを特異的に阻害したが、ＢＭＰまたはＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路活性には影響しなかった。これらの結果はＡｘｉｎタンパク質レベルおよびＷｎｔシグナル伝達を制御するＴＮＫＳの進化的に保存された役割を支持する。

ＴＮＫＳ１およびＴＮＫＳ２はポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）ファミリーのメンバーであり、ポリＡＤＰリボシレーション（ＰＡＲシレーション）と称される複数のＡＤＰ−リボース単位の付加によってそれらの構造を翻訳後に修飾する。ｓｉＲＮＡ救助アプローチを用いて、ＴＮＫＳのＰＡＲシレーション活性がＡｘｉｎタンパク質レベルの制御に必須であるかを決定した。内因性ＴＮＫＳ１／ＴＮＫＳ２の欠損により、外因性ｓｉＲＮＡ抵抗性野生型ＴＮＫＳ２または触媒的に不活性なＴＮＫＳ２−Ｍ１０５４Ｖ変異体の発現が、ドキシサイクリン応答性プロモーターから誘導された（Sbodio, J. I., et al. （2002） Biochem J 361, 451-9）。野生型の発現はＴＮＫＳ１／２ｓｉＲＮＡのＡｘｉｎ１タンパク質発現に対する効果を救助するが、変異ＴＮＫＳ２はそうではなかった。これは、タンキラーゼの触媒活性がＡｘｉｎタンパク質レベルおよびＷｎｔ経路シグナル伝達に必須であることを示唆している。

この試験で使用したｓｉＲＮＡの配列を次の表Ｉに示す：

表Ｉ

実施例３ｄ：自己ＰＡＲシレーション活性アッセイ

上記発見に基づいて、タンキラーゼのＰＡＲシレーション活性阻害によってＡｘｉｎタンパク質レベルを制御するＸＡＶ９３９の能力を試験した。ＴＮＫＳ２のＣ末端ＰＡＲＰドメイン（ＧＳＴ−ＴＮＫＳ２^ＰＡＲＰ）は、インビトロでのＰＡＲシレーションアッセイを用いて、効果的に自己ＰＡＲシレーションされ、これはＸＡＶ９３９によって十分に阻害された。逆に、自己ＰＡＲシレーションは不活性な対照化合物ＤＬＷ６４３によっては作用されなかった。ＴＮＫＳの自己ＰＡＲシレーションは、ユビキチン−プロテアソーム経路を介してその分解を促進すると報告されている（Yeh, T. Y. et al. (2006) Biochem J 399, 415-25）。ＸＡＶ９３９処理はＴＮＫＳタンパク質レベルを顕著に上昇させることが見出され、これはＸＡＶ９３９がインビボでＴＮＫＳ自己ＰＡＲシレーションも阻害することを示唆している。あわせると、これらの遺伝的および生化学的分析によって、ＸＡＶ９３９がＴＮＫＳの触媒活性を阻害することでＡｘｉｎタンパク質レベルを上昇させることが示唆される。

ＴＮＫＳの自己ＰＡＲシレーションに対する化合物の効果を評価するため、インビトロ自己ＰＡＲシレーションアッセイを次のとおりに実施した：

タンキラーゼは、ＮＡＤ^＋を用いると、それ自身（自己ＰＡＲシレーション）または標的タンパク質（基質ＰＡＲシレーション）のポリ（ＡＤＰ−リボシル）作用を触媒する。それぞれの反応ターンオーバーにおいて、酵素は１単位のＮＡＤ^＋を消費し、１単位のポリマー鎖のＡＤＰ−リボースを加え、１単位のニコチンアミドを放出する。ニコチンアミド形成およびタンキラーゼ低分子阻害剤の存在下におけるニコチンアミド形成の低下をモニターするための自己ＰＡＲシレーション活性アッセイを設計する。ニコチンアミドの定量は、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）で実施する。アッセイは３８４ウェルフォーマットで設計し、ハイスループットスクリーニングに適している。

一般に、自己ＰＡＲシレーション反応は、体積４０μＬで、次のものを含む反応溶液中で実施した：５μＬの化合物（２０％ＤＭＳＯ中）、アッセイバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、０．０２％のTween-20、８％のグリセロール）中１５μＬのタンキラーゼ、２０μＬのＮＡＤ^＋。最終反応混合物は、濃度０．００８６〜１８．７５μＭの化合物（阻害剤）、２．５％のＤＭＳＯ、２０ｎＭのＧＳＴ−ＴＮＫＳ２Ｐ（または６０ｎＭのＧＳＴ−ＴＮＫＳ１Ｐ）、２５０μＭのＮＡＤ^＋を含む。全ての反応は室温で、３８４ウェルGreiner平底プレート（Costar, Cat. No. 781201）で１２０分間実施し、次いで５００ｎＭのｄ４−ニコチンアミド（CDN Isotopes, Inc. Cat. No. D3457）を含む１０μＬの２０％ギ酸を加えてクエンチした。ＬＣ／ＭＳの前に、反応混合物中のタンパク質を沈殿／遠心分離法によって除去した後アセトニトリルの２アリコートを加えた。次いで、得られた上清をＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム（Agilent 1200SL LC system、LEAP CTC HTC Autosampler and Sciex API 4000 マススペクトロメーター）に注入し、ニコチンアミドおよび重水素化内部標準をHypercarbカラム（2.1X20mm、5μMの粒子、Thermo Scientific Inc）で保持し、勾配溶出し、エレクトロスプレーイオン化のポジティブモードで操作するマススペクトロメーターで検出した。

ＬＣは、流速１ｍＬ／分、５から９５％アセトニトリルのグラジエントで０．８分間で実行した。２５ｍＭの重炭酸アンモニウムを水性移動相に加え、０．１％の水酸化アンモニウムをアセトニトリル移動相に加えた。マススペクトロメーターは、ＭＲＭモードで実行し、ニコチンアミドとｄ４−ニコチンアミドの質量遷移はそれぞれ１２３→８０および１２７→８４であった。対応するサンプルウェルの相対応答（酵素反応によって生産されたニコチンアミド対内部標準であるｄ４−ニコチンアミドの比）が、阻害剤の活性を評価し、またはＩＣ５０曲線をプロットするために報告された。註：ＩＣ_５０＜０．００８６ｎＭまたはＩＣ_５０＞１０μＭは、真のＩＣ_５０が実験範囲外であることを示している。タンキラーゼ１およびタンキラーゼ２アッセイにおいて使用したタンパク質は、それぞれ切断Ｎ−ＧＳＴ−タンキラーゼ１（１０８８−１３２７）および切断Ｎ−ＧＳＴ−タンキラーゼ２（９３４−１１６６）である。

実施例４：ＴＮＫＳとＡｘｉｎの保存Ｎ末端ドメインの結合はＡｘｉｎタンパク質レベルの制御に重要である
どのようにＴＮＫＳがＡｘｉｎタンパク質レベルを制御するか調べるために免疫共沈降実験を実施したところ、ＴＮＫＳ１およびＴＮＫＳ２がＳＷ４８０細胞においてＡｘｉｎ２と結合していることを見出した。さらに、Ａｘｉｎ１／２とＴＮＫＳ１／２の強い結合が酵母２ハイブリッドアッセイにおいて検出された。酵母２ハイブリッドアッセイは次のとおり実施した：

酵母２ハイブリッドアッセイは、Matchmaker Two-Hybrid System 3（Clontech）を用いて、製造業者の指示書に従って行った。簡潔には、マウスＡｘｉｎ１の異なるフラグメントをベイトプラスミドｐＧＢＫ−Ｔ７にクローン化し、ヒトＴＮＫＳ１の異なるフラグメントをプレイプラスミドｐＧＡＤ−Ｔ７にクローン化した。ＡＨ１０９細胞をベイトおよびプレイプラスミドで形質転換した。二重形質転換体をＴｒｐ−およびＬｅｕ−プレートで選択し、フィルターリフトの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）染色によってＬａｃＺ発現について試験した。

Ａｘｉｎ１のＴＮＫＳ結合ドメインを定義するために、多様なＡｘｉｎ１フラグメントをそれらのＴＮＫＳ１結合能について試験した。驚くべきことに、Ａｘｉｎ内で最も保存されたアミノ酸の広がりを含むＡｘｉｎの小さなＮ末端領域（アミノ酸１９−３０）がＴＮＫＳ１との相互作用に必要かつ十分であった。この小さなＮ末端ドメイン（本明細書においてＴＢＤ、タンキラーゼ結合ドメインと称する）によるＴＮＫＳ１とＡｘｉｎ１の特異的相互作用はさらに、ＧＳＴプルダウンおよび免疫共沈降アッセイによって立証された。

アミノ末端Ａｘｉｎ１の誘導発現は、安定的にｐｃＤＮＡ４−ＴＯ−Ａｘｉｎ１１−８７をＨＥＫ２９３−ＴＲＸ細胞（Invitrogen）にトランスフェクトすることによって達成され、細胞をは１０ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンで２４時間誘導された。Dual Luciferase アッセイキット（Promega）を用いて、製造業者の指示書に従って、ルシフェラーゼアッセイを実施した。

ＡｘｉｎとＴＮＫＳ間の物理的相互作用の阻害の機能的結果を評価した。野生型ＧＦＰ−Ａｘｉｎ１を発現する細胞は、ＸＡＶ９３９処理に応答して強く増強される低い基礎タンパク質レベルを示したが、ＧＦＰ−Ａｘｉｎ１Δ１９−３０を発現する細胞は、既に高い基礎タンパク質レベルを示し、さらに化合物処理に応答しなかった。重要なことに、ＩＲＡＰまたはＴＲＦ１の異種ＴＮＫＳ結合ドメインとＧＦＰ−Ａｘｉｎ１Δ１９−３０を融合することによるＴＮＫＳ１−Ａｘｉｎ１相互作用の回復は、そのＸＡＶ９３９への応答を十分に回復した。これらの結果は、ＡｘｉｎのＮ末端ドメインの過剰発現はＴＮＫＳの結合に関して内因性Ａｘｉｎと競合することがあり、したがって内因性Ａｘｉｎ１のタンパク質レベルを上昇させることを示している。実際、ＧＦＰ−Ａｘｉｎ１Ｎ（a.a. 1-87）の過剰発現は、実質的に内因性Ａｘｉｎ１のタンパク質レベルを上昇したが、そのｍＲＮＡ発現には作用せず、欠損ＴＢＤを有する（a.a. 19-30を欠く）変異体ではそうではなかった。あわせると、これらの発見は、進化的に保存されたＴＢＤによって仲介されるＡｘｉｎとＴＮＫＳの物理的相互作用がインビボでのＡｘｉｎタンパク質レベル制御に重要であることを示している。

タンキラーゼは、基質結合のためのアンキリン反復ドメイン、自己オリゴマー形成のためのＳＡＭドメインおよび触媒活性のためのＰＡＲＰドメインを含む。酵母２ハイブリッドアッセイを用いて、本発明者らは、ＴＮＫＳ１のIII、IVおよびＶアンキリン反復ドメインにわたる領域がＡｘｉｎ１との相互作用に必要かつ十分であることを示した。Ｗｎｔシグナル伝達に対するＴＮＫＳ過剰発現の効果を試験したところ、ＨＥＫ２９３細胞へのＴＮＫＳ１の一時的トランスフェクションによってＳＴＦレポーター活性が劇的に上昇し、β−カテニンが安定化されることが示された。この活性はＴＮＫＳ１のＡｘｉｎ結合ドメインとＳＡＭドメインを必要とするが、ＰＡＲＰドメインは必要としない。過剰発現されたＴＮＫＳはＳＡＭドメイン介在性オリゴマー形成によって大きな格子状構造を形成することが報告されている（De Rycker, M. et al. (2004) Mol Cell Biol 24, 9802-12）。我々は過剰発現されたＴＮＫＳがこの格子状構造にＡｘｉｎを捉えて、それがβ−カテニン破壊複合体においてその正常な機能の実施を妨げていると仮定する。

実施例５：イムノブロッティング、免疫沈降およびＧＳＴプルダウンアッセイ
全細胞溶解物は、ＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ−４０、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）に細胞を溶解して調製した。等量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に移し、記載の抗体で調べた。免疫共沈降実験のために、細胞をＥＢＣバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＮＰ−４０、１ｍＭのＥＤＴＡ）に溶解させ、透明な細胞溶解物を記載の抗体およびProtein G-セファロースビーズと共に、４℃で一夜インキュベートした。ビーズを溶解バッファーで５回洗浄した。結合タンパク質をＳＤＳサンプルバッファーに溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、記載の抗体でブロットした。インビボでのタンパク質ユビキチン化およびＰＡＲシレーションを検出するために、DeubiquitinaseおよびＰＡＲＧの活性を阻止するため５ｍＭのＮＥＭおよび５μＭのＡＤＰ−ＨＰＤを補ったＲＩＰＡバッファーで細胞を溶解して、次いで記載の抗体と免疫沈降させた。

ＧＳＴプルダウンアッセイのために、ＧＳＴ−Ａｘｉｎ１融合タンパク質を大腸菌で作成し、グルタチオン−アガロースビーズ（Amersham Biosciences）を用いて精製した。Ｆｌａｇ−ＴＮＫＳ１を過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞をＥＢＣバッファーに溶解させ、ＧＳＴ融合タンパク質を加えたグルタチオン−アガロースビーズと共に透明な溶解物を４℃で４時間インキュベートして、ビーズをＥＢＣバッファーで５回洗浄した。結合物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、記載の抗体でブロットした。細胞質溶解物を調製するために、細胞を低張バッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５、１０ｍＭのＫＣｌ）に入れ、細胞溶解物を４回の凍結−解凍サイクルの後に遠心分離して、不純物除去を行った。上記実験の全てで、１ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma）および１ｘホスファターゼ阻害剤カクテル（Upstate）を溶解バッファーに加えた。この試験で使用した市販の抗体は、ヤギ抗Ａｘｉｎ１抗体（R&D Systems）、ウサギ抗Ａｘｉｎ２抗体およびウサギ抗ホスホ−β−カテニン（pSer33/37/Thr41）抗体（Cell Signaling Technology）、マウス抗ＴＮＫＳ抗体（Abcam）、マウス抗ＨＡ（HA.11）抗体（Covance）、マウス抗β−カテニン抗体、ウサギ抗ポリ（ＡＤＰ−リボース）抗体およびウサギ抗ＰＡＲＰ１抗体（BD Pharmingen）、マウス抗ユビキチン抗体（MBL）、ウサギ抗ＧＦＰ抗体（Clontech）、マウス抗チューブリンおよびマウス抗Ｆｌａｇ（M2）抗体（Sigma）を含む。

実施例６：ＸＡＶ９３９はＡｘｉｎのユビキチン化およびＰＡＲシレーションを調節することによってＡｘｉｎを安定化する
ＸＡＶ９３９に応答するＡｘｉｎタンパク質レベルの上昇は、翻訳またはタンパク質安定性の調節のためであり得る。後者の可能性と一致して、ＸＡＶ９３９処置がＳＷ４８０細胞における内因性Ａｘｉｎ２の半減期を顕著に延長することを見出した。Ａｘｉｎの分解は、Ａｘｉｎ１のポリユビキチン化はプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２の添加後、顕著に増加しため、ユビキチン−プロテアソーム経路によって仲介される可能性がある。逆に、ＸＡＶ９３９とＭＧ１３２の共処置はＡｘｉｎ１およびＡｘｉｎ２のポリユビキチン化を顕著に低下し、これはＸＡＶ９３９がＡｘｉｎのポリユビキチン化を防止してＡｘｉｎを安定化し得ることを示唆している。

ＴＮＫＳの自己ＰＡＲシレーションまたはＴＮＫＳ介在性ＴＲＦ１のＰＡＲシレーションは、増加したユビキチン化およびＴＮＫＳまたはＴＲＦ１の分解をそれぞれ導く（Yeh, T. Y., et al. (2006) Biochem J 399, 415-25; Chang, W., et al. (2003) Genes Dev 17, 1328-33）。ＴＮＫＳがＡｘｉｎと物理的に結合し、Ａｘｉｎタンパク質レベルの制御にそのＰＡＲシレーション活性が必要とされるという内部での発見とあわせると、これはＡｘｉｎ分解がＴＮＫＳによる直接ＰＡＲシレーションによって促進され得ることを示唆している。実際、ＴＮＫＳ２はインビトロでＴＢＤを含むＡｘｉｎ１フラグメント（a.a. 1-280）をＰＡＲシレーションすることができ、これはＸＡＶ９３９処理によって完全に阻害された。ＰＡＲ修飾を特異的に認識する抗体を使用して、外因的に発現されたＧＦＰ−Ａｘｉｎが細胞内でＰＡＲシレーションされることを見出した。さらに、ＰＡＲシレーションシグナルがＸＡＶ９３９の存在下で強く低下し、これはＡｘｉｎのＰＡＲシレーションがインビボでＴＮＫＳによって介在されている可能性を示唆している。

細胞をＸＡＶ９３９で処理して内因性Ａｘｉｎ２レベルを上昇させて、内因性Ａｘｉｎ２ユビキチン化およびＰＡＲシレーションを検出容易にした。Ａｘｉｎ２は、ＸＡＶ９３９を洗い落とした後１時間以内に、速やかに分解された。予期したとおり、ＭＧ１３２によって細胞を処理すると、Ａｘｉｎ２分解が阻止され、そのポリユビキチン化が強く上昇された。しかし、ＸＡＶ９３９とＭＧ１３２の両方で処理すると、Ａｘｉｎ２のユビキチン化が完全に阻止された。興味深いことに、細胞をＭＧ１３２のみで処理したとき、Ａｘｉｎ２と共に移動する抗ＰＡＲ抗体応答シグナルが検出されたが、細胞をＸＡＶ９３９で処理したときには消失した。あわせると、これらの発見は、ＴＮＫＳがＡｘｉｎのユビキチン化および分解を促進し、これは少なくとも部分的に、Ａｘｉｎの直接ＰＡＲシレーションによって調節されている可能性があることを示唆している。

実施例７：ＸＡＶ９３９はＡＰＣ変異ＤＬＤ−１癌細胞のコロニー形成を阻害する
ＡＰＣ変異結直腸癌と構成的に活性なβ−カテニンシグナル伝達を結ぶ強い遺伝的証拠は、Ｗｎｔ経路阻害剤を同定するための多くの努力を刺激してきたが、脱制御Ｗｎｔ経路活性を特異的に遅延させる薬理学的阻害剤の発見は、困難であると証明されている。ＸＡＶ９３９がＡＰＣ変異細胞においてさえβ−カテニンシグナル伝達を阻害し得るとの内部の発見に基づいて、この化合物は、ＡＰＣ変異結直腸癌細胞の増殖阻害能について試験された。β−カテニンを標的とする誘導性ｓｈＲＮＡで細胞系のパネルをスクリーニングしたとき、結直腸癌細胞系ＤＬＤ−１がｓｈＲＮＡ介在β−カテニン阻害に最も感受性であることが見出された。さらに、ＸＡＶ９３９によるβ−カテニン標的遺伝子の制御は、ＳＷ４８０細胞と比較して、ＤＬＤ−１においてより強かった。Ｗｎｔ経路変異を有さず、β−カテニン欠乏に非感受性であるＲＫＯ結直腸癌細胞系をネガティブコントロールとして使用した。低血清増殖条件下で、ＸＡＶ９３９はＤＬＤ−１細胞のコロニー形成を顕著に阻害したが、不活性構造アナログＬＤＷ６４３は最も高い濃度でさえ増殖に影響しなかった。重要なことに、ＸＡＶ９３９はβ−カテニン非依存的ＲＫＯ細胞のコロニー形成には影響しなかった。

コロニー形成アッセイを次のとおりに実施した：ＤＬＤ１およびＲＫＯ細胞を低血清増殖培地（０．５％のＦＢＳ）に５００〜１０００細胞／ウェルで６ウェルプレートにそれぞれ播種した。播種から１６時間後、所定の濃度の化合物を加えた。コロニー形成が観察されるまで、培地を２日ごとに補充した。コロニーを緩衝化ホルマリン中２ｍｇ／ｍｌのクリスタルバイオレット溶液で染色して、Molecular Imager ChemiDoc XRS System（BioRad）でイメージ化した。

ＴＮＫＳ１／ＴＮＫＳ２は有糸分裂進行、テロメア維持およびＧＬＵＴ４移動を制御することが記載されている（Canudas, S., et al. (2007) Embo J 26, 4867-78 (2007); Seimiya, H., et al. (2002) J Biol Chem 277, 14116-26）。特に、ＴＮＫＳ１が姉妹テロメア結合の分離または二極性紡錘体の集合に必要であることが報告されており、そしてＴＮＫＳ１ノックダウンが強い有糸分裂停止を引き起こすことが報告されている（Chang, P., et al. (2005) NaT Cell Biol 7, 1133-9; Dynek, J. N., et al. (2004) Science 304, 97-100）。しかし、ＸＡＶ処置またはＴＮＫＳ１／ＴＮＫＳ２の個々／組合せのｓｉＲＮＡノックダウンを用いると、この試験に使用した細胞系について、高または低血清条件で、明白な有糸分裂停止表現型は全く生じなかった。これはＸＡＶ９３９が抗有糸分裂機能によってＤＬＤ１細胞の増殖を阻害しないことを示している。

ＤＬＤ１細胞に対するＸＡＶ９３９の抗増殖性効果がむしろＡｘｉｎタンパク質レベルの上昇によって仲介されているとすれば、Ａｘｉｎ１／２発現のノックダウンは化合物処置の抗増殖性効果を取り戻すと予期される。実際、ｓｉＲＮＡ介在性Ａｘｉｎ１／２欠乏は、ＸＡＶ９３９の抗増殖性効果を完全に無効にした。あわせると、これらの発見は、ＤＬＤ１細胞におけるＸＡＶ９３９の抗増殖性効果はＷｎｔ経路シグナル伝達のＡｘｉｎ依存的阻害のためであることを示唆している。

少なくとも実施例６に記載の細胞培養法は、次のとおりに実施した：ＨＥＫ２９３、ＳＷ４８０、ＤＬＤ１およびＲＫＯ細胞は１０％ＦＣＳを補ったＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ１６４０培地で、５％のＣＯ_２を含む３７℃加湿インキュベーター内で増殖した。製造業者の指示書に従って、Fugene 6（Roche）を用いてプラスミドのトランスフェクションを行い、Darmafect 1（Dhamacon）を用いてｓｉＲＮＡのトランスフェクションを行った。

実施例８：材料および方法
本明細書に記載の、詳細に説明していない実験を実施し、結果を得るために用いた材料および方法は次のとおりである：

実施例８ａ：定量的ＲＴ−ＰＣＲ

製造業者の指示書に従って、RNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いて化合物またはｓｉＲＮＡ処理細胞から全ＲＮＡを抽出し、Taqman Reverse Transcription Reagents（Applied Biosystems）で逆転写した。ABI PRISM 7900HT Sequence Detection Systemを用いて転写レベルを評価した。０．６μｌの20x Assay-on-Demand mix（各プライマーについて予め混合された濃度１８μＭおよび５μＭのプライマー）、６μｌのTaqman Universal PCR Master Mixおよび５．４μｌのｃＤＮＡテンプレートから成る反応物１２μｌ中で実時間ＰＣＲを実施した。使用した熱サイクル条件は、５０℃で２分、９５℃で１０分、次いで９５℃で１５秒と６０℃で１分の４０サイクルであった。全実験を３連で行った。遺伝子発現分析は、正規化のために、ハウスキーピング遺伝子であるＧＵＳＢをでの比較Ｃ_Ｔ法を用いて行った。

実施例８Ｂ：パルスチェイス実験

ＳＷ４８０細胞を代謝標識の前日に１０ｃｍプレートに２００万細胞／プレートで播種した。翌日、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、Ｌ−メチオニンなしのＤＭＥＭ（Mediatech）で１時間飢餓にして、次いで^３５Ｓ−メチオニン（１００μＣｉ／ｍｌ）（Amersham）で３０分間標識する。標識化の完了後、培地を除去し、１００Ｘ過剰の冷メチオニンを含む培地と交換した。細胞溶解物をＲＩＰＡで、所定の時点で収穫した。等量の放射線標識溶解物を抗Ａｘｉｎ２抗体で一夜免疫沈降させた。免疫沈降物をＲＩＰＡバッファーで徹底的に洗浄し、翌日ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、次いで移した。放射活性シグナルをPhosphoImagerで検出した。

実施例８Ｃ：化合物親和性精製

化合物の結合および親和性精製を本質的に記載のとおりに実施した（Bantscheff et al 2007）。１^ｏアミン基を有する誘導化生物活性アナログＬＤＷ６３９を合成して、ＮＨＳ活性化Sepharose 4ビーズ（Amersham）と結合させた。加圧型ホモジナイザーを用いて氷上で、２９３Ｔ細胞を溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌｐＨ７．５、５％グリセロール、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ_３ＶＯ_４、１ｍＭのＤＴＴ、５μＭのカリクリンＡ、０．８％のIgepal-CA630およびプロテアーゼ阻害剤カクテル）中でホモジナイズした。溶解物を遠心分離して予め不純物を取り除き、タンパク質濃度をBradfordアッセイで測定した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に化合物ＸおよびＹを溶解させ、最終濃度２０μＭ（またはＤＭＳＯのみ）で溶解物に、３０分間４℃で加えた。次いで１００μｌのネガティブコントロール−マトリックスを加え、４℃でさらに６０分間インキュベートを続けた。遠心分離の後、ビーズをカラム（MoBiTech）に移して洗浄した。結合物質をNuPAGE LDSサンプルバッファー（Invitrogen）で溶出させ、溶出液を濃縮し、アルキレート化し、４−１２％のＮｕＰＡＧＥゲル（Invitrogen）で分離し、コロイド状Coomassieで染色した。

実施例８Ｄ：ショウジョウバエレポーターアッセイ

Ｓ２Ｒ細胞を３８４ウェルプレートに播種し、所定のｄｓＲＮＡで３日間処理した。次いでEffectene（Qiagen）を用いて細胞を、０．５ｎｇのpPac-Renilla、Ｗｎｔレポーターアッセイについては２．５ｎｇのLef-Lucおよび２．５ｎｇのpPac-Lef1と共に、ＢＭＰレポーターアッセイについては５ｎｇのpcopHSP-BRE-Lucで、あるいはＪＡＫ／ＳＴＡＴアッセイについては１８ｎｇのDraf-Lucでトランスフェクトした。ＰＵＣ１９を担体ＤＮＡとして加えて各ウェル中ＤＮＡを２５ｎｇとした。トランスフェクションの２４時間後、１２．５％の無翅調節培地、５０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＢＭＰ−２（R&D Systems）、または５０％のＵＰＤ調節培地を加え、Duo-Gloルシフェラーゼアッセイキット（Promega）を用いてルシフェラーゼアッセイを４８時間後に行った。Ｔ７結合プライマー（Ｗｈｉｔｅについて、フォワード、5’-ACCTGTGGACGCCAAGG-3’（配列番号）;リバース、5’-AAAAGAAGTCGACGGCTTC-3’（配列番号））を用いて、Ｓ２Ｒ細胞ＲＮＡからＰＣＲフラグメントを増幅した。ＴＮＫＳについて、フォワード、5’-GATAGGATTGCGGATGAGGA-3’（配列番号）;リバース、5’-TCCAATGAAGAAGAATCGGG-3’（配列番号）を、MEGAscript 高収率転写キット（Ambion）を用いて、ｄｓＲＮＡ作成のために使用した。Ａｘｉｎに対するＴＮＫＳ欠乏の効果を試験するため、DAxin-3XHAで安定的にトランスフェクトしたＳ２Ｒ細胞を２４ウェルプレートに播種し、所定のｄｓＲＮＡで５日間処理した。

Claims

Ｗｎｔシグナル伝達関連障害を処置し、予防しまたは改善する方法であって、それを必要とする対象に有効量のタンキラーゼ（ＴＮＫＳ）の触媒活性を調節する薬物を投与することを含む方法。
薬物がタンキラーゼ（ＴＮＫＳ）の触媒活性を低下または消失させる、請求項１の方法。
薬物が阻害核酸である、請求項２の方法。
薬物が融合タンパク質である、請求項２の方法。
薬物が本発明の化合物である、請求項２の方法。
Ｗｎｔシグナル伝達関連障害がＷｎｔシグナル伝達の異常なアップレギュレーションに関連している、請求項２の方法。
Ｗｎｔシグナル伝達関連障害ががんである、請求項６の方法。
Ｗｎｔシグナル伝達関連障害が結腸癌である、請求項７の方法。
Ｗｎｔシグナル伝達関連障害が骨関節炎である、請求項６の方法。
Ｗｎｔシグナル伝達関連障害が多発性嚢胞腎疾患である、請求項６の方法。
薬物がタンキラーゼ（ＴＮＫＳ）の触媒活性を向上する、請求項１の方法。
Ｗｎｔシグナル伝達関連障害がＷｎｔシグナル伝達の異常なダウンレギュレーションに関連している、請求項１１の方法。
Ｗｎｔシグナル伝達関連障害が骨粗鬆症である、請求項１２の方法。
Ｗｎｔシグナル伝達関連障害が肥満または糖尿病である、請求項１２の方法。
Ｗｎｔシグナル伝達関連障害が神経変性疾患である、請求項１２の方法。
タンキラーゼ（ＴＮＫＳ）の触媒活性を調節することができる薬物の投与によって、Ｗｎｔ経路シグナル伝達を調節する方法。
タンキラーゼ（ＴＮＫＳ）の触媒活性を低下または消失させることによって、薬物がＷｎｔ経路シグナル伝達を阻害する、請求項１６の方法。
薬物が阻害核酸である、請求項１７の方法。
薬物が融合タンパク質である、請求項１７の方法。
薬物が本発明の化合物である、請求項１７の方法。
Ｗｎｔ経路シグナル伝達を阻害することができる薬物を同定する方法であって：
a）試験薬物の存在下および非存在下、Ｗｎｔシグナル伝達を許容する条件下で、Ｗｎｔシグナル伝達経路が活性であり、Ａｘｉｎタンパク質または安定性レベルを測定することができる生物学的サンプルを接触させ；そして
b）前記試験薬物の存在下および非存在下の両方で、Ａｘｉｎタンパク質レベルまたは安定性を測定することを含み、
ここで（i）試験薬物の非存在下と比較して、試験薬物の存在下でのＡｘｉｎタンパク質レベルまたは安定性の低下が、該試験薬物をＷｎｔ経路シグナル伝達のアゴニストとして同定し、そして（ii）試験薬物の非存在下と比較して、試験薬物の存在下でのＡｘｉｎタンパク質レベルまたは安定性の上昇が、該試験薬物をＷｎｔ経路シグナル伝達のアンタゴニストとして同定する、方法。
Ａｘｉｎタンパク質レベルまたは安定性の上昇が、総β−カテニンレベルの低下、ホスホ−β−カテニンレベルの上昇、Ａｘｉｎタンパク質レベルの上昇または増加したＡｘｉｎ−ＧＳＫ３複合体の形成によって測定される、請求項２１の方法。
Ａｘｉｎタンパク質レベルまたは安定性の低下が、総β−カテニンレベルの上昇、ホスホ−β−カテニンレベルの低下、Ａｘｉｎタンパク質レベルの低下または減少したＡｘｉｎ−ＧＳＫ３複合体の形成によって測定される、請求項２１の方法。
薬物が低分子である、請求項２１の方法。
薬物が阻害核酸である、請求項２１の方法。
薬物が融合タンパク質である、請求項２１の方法。
Ｗｎｔシグナル伝達関連障害の処置に有用な薬物を同定する方法であって：
a）試験薬物の存在下および非存在下、Ｗｎｔシグナル伝達を許容する条件下で、Ｗｎｔシグナル伝達経路が活性であり、Ａｘｉｎタンパク質レベルまたは安定性を測定することができる生物学的サンプルを接触させ；そして
b）前記試験薬物の存在下および非存在下の両方で、Ａｘｉｎタンパク質レベルまたは安定性を測定することを含み、
ここで（i）試験薬物の非存在下と比較して、試験薬物の存在下でのＡｘｉｎタンパク質レベルまたは安定性の低下が、該試験薬物をＷｎｔシグナル伝達の異常なダウンレギュレーションに関連した障害を処置するために有用として同定し、そして（ii）試験薬物の非存在下と比較して、試験薬物の存在下でのＡｘｉｎタンパク質レベルまたは安定性の上昇が、該試験薬物をＷｎｔシグナル伝達の異常なアップレギュレーションに関連した障害を処置するために有用として同定する、方法。
Ａｘｉｎタンパク質レベルまたは安定性の上昇が、総β−カテニンレベルの低下、ホスホ−β−カテニンレベルの上昇、Ａｘｉｎタンパク質レベルの上昇または増加したＡｘｉｎ−ＧＳＫ３複合体の形成によって測定される、請求項２７の方法。
Ａｘｉｎタンパク質レベルまたは安定性の低下が、総β−カテニンレベルの上昇、ホスホ−β−カテニンレベルの低下、Ａｘｉｎタンパク質レベルの低下または減少したＡｘｉｎ−ＧＳＫ３複合体の形成によって測定される、請求項２７の方法。
薬物が低分子である、請求項２７の方法。
薬物が阻害核酸である、請求項２７の方法。
薬物が融合タンパク質である、請求項２７の方法。
タンキラーゼ（ＴＮＫＳ）の触媒活性を阻害することができる薬物を同定する方法であって：
a）試験薬物の存在下および非存在下、Ｗｎｔシグナル伝達を許容する条件下で、Ｗｎｔシグナル伝達経路が活性であり、Ａｘｉｎタンパク質レベルまたは安定性を測定することができる生物学的サンプルを接触させ；そして
b）前記試験薬物の存在下および非存在下の両方で、Ａｘｉｎタンパク質レベルまたは安定性を測定することを含み、
ここで（i）試験薬物の非存在下と比較して、試験薬物の存在下でのＡｘｉｎタンパク質レベルまたは安定性の低下が、該試験薬物をＴＮＫＳアゴニストとして同定し、そして（ii）試験薬物の非存在下と比較して、試験薬物の存在下でのＡｘｉｎタンパク質レベルまたは安定性の上昇が、該試験薬物をＴＮＫＳアンタゴニストとして同定する、方法。
Ａｘｉｎタンパク質レベルまたは安定性の上昇が、総β−カテニンレベルの低下、ホスホ−β−カテニンレベルの上昇、Ａｘｉｎタンパク質レベルの上昇または増加したＡｘｉｎ−ＧＳＫ３複合体の形成によって測定される、請求項３３の方法。
Ａｘｉｎタンパク質レベルまたは安定性の低下が、総β−カテニンレベルの上昇、ホスホ−β−カテニンレベルの低下、Ａｘｉｎタンパク質レベルの低下または減少したＡｘｉｎ−ＧＳＫ３複合体の形成によって測定される、請求項３３の方法。
薬物が低分子である、請求項３３の方法。
薬物が阻害核酸である、請求項３３の方法。
薬物が融合タンパク質である、請求項３３の方法。
Ｗｎｔシグナル伝達関連障害の処置に有用な薬物を同定する方法であって、Ｗｎｔシグナル伝達経路が活性である細胞を試験薬物と接触させて、Ａｘｉｎタンパク質レベルまたは安定性の変化を検出することを含む方法。
Ａｘｉｎタンパク質レベルまたは安定性の上昇が、総β−カテニンレベルの低下、ホスホ−β−カテニンレベルの上昇、Ａｘｉｎタンパク質レベルの上昇または増加したＡｘｉｎ−ＧＳＫ３複合体の形成によって測定される、請求項３９の方法。
Ａｘｉｎタンパク質レベルまたは安定性の低下が、総β−カテニンレベルの上昇、ホスホ−β−カテニンレベルの低下、Ａｘｉｎタンパク質レベルの低下または減少したＡｘｉｎ−ＧＳＫ３複合体の形成によって測定される、請求項３９の方法。
腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、それを必要とする対象に有効量のタンキラーゼ（ＴＮＫＳ）の触媒活性を低下または消失させる薬物を投与することを含む方法。
薬物が阻害核酸である、請求項４２の方法。
薬物が融合タンパク質である、請求項４２の方法。
薬物が本発明の化合物である、請求項４２の方法。
腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、それを必要とする対象に有効量のタンキラーゼ（ＴＮＫＳ）の触媒活性を低下または消失させる薬物を投与することを含む方法。
薬物が阻害核酸である、請求項４６の方法。
薬物が融合タンパク質である、請求項４６の方法。
薬物が本発明の化合物である、請求項４６の方法。