KR20100089869A - Ｗｎｔ 활성화의 측정 및 ｗｎｔ-관련 암의 치료를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

Abstract

본 출원은 악신 안정화제를 투여하여 Wnt 신호전달을 조절 또는 조정하는 (예컨대 길항 또는 억제하는) 방법에 대해 기술한다. 본 출원은 또한 본원에서 기술되는 악신 안정화제를 사용하여 Wnt 신호전달-관련 장애를 치료, 진단, 예방 및/또는 개선하는 방법에 대해 기술한다.

Description

ＷＮＴ 활성화의 측정 및 ＷＮＴ-관련 암의 치료를 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR MEASURING WNT ACTIVATION AND FOR TREATING WNT-RELATED CANCERS}

Wnt 유전자 족은 Int1/Wnt1 원형-종양유전자, 및 초파리 Wnt1 동족인 초파리 윙리스(wingless) ("Wg")와 관련된 대형 군의 분비 단백질들을 코딩하고 있다 (문헌 [Cadigan et al. (1997) Genes & Development 11: 3286-3305]). Wnt는 다양한 조직 및 장기에서 발현되며, 초파리에서의 분할; C. 엘레강스(C. elegans)에서의 내배엽 발달; 및 포유류에서의 사지 극성의 확립, 신경 능선 분화, 신장 형태형성, 성 결정, 및 뇌 발달을 포함한 많은 발생 과정들에 필요하다 (문헌 [Parr, et al. (1994) Curr. Opinion Genetics & Devel. 4: 523-528]). Wnt 경로는 배아형성 동안 및 성숙 생물체 모두에 있어서 동물 발생의 주요 조절인자이다 (문헌 [Eastman, et al. (1999) Curr Opin Cell Biol 11: 233-240]; [Peifer, et al. (2000) Science 287: 1606-1609]).

Wnt 신호는 프리즐드(Frizzled) ("Fz") 족의 7개 막횡단 도메인 수용체에 의해 전달된다 (문헌 [Bhanot et al. (1996) Nature 382: 225-230]). Wnt 리간드는 Fzd에 결합하며, 그렇게 함으로써 세포질 단백질인 디셰블드(Dishevelled) (인간 및 마우스의 Dvl-1, 2 및 3) (문헌 [Boutros, et al. (1999) Mech Dev 83: 27-37])를 활성화하고, LRP5/6을 인산화한다. 그에 의해 아르마딜로(Armadillo)/β(베타)-카테닌의 인산화 및 분해를 방지하는 신호가 발생되고, 다시 β-카테닌의 안정화로 이어진다 (문헌 [Perrimon (1994) Cell 76: 781-784]). 이와 같은 안정화는 GSK3, APC, CK1, 및 β-카테닌을 포함한 다양한 단백질들을 모아 β-카테닌 파괴 복합체를 형성하는 골격 단백질인 악신(axin) (문헌 [Zeng et al. (1997) Cell 90: 181-192])과의 Dvl의 회합에 의해 야기된다.

글리코겐 신타제 키나제3 (GSK3, 초파리에서 샤기(shaggy)로 알려져 있음), 종양 억제인자 유전자 생성물 APC (선종성 결장 폴립증) (문헌 [Gumbiner (1997) Curr. Biol. 7: R443-436]), 및 악신은 모두 Wnt 경로의 음성 조절인자이다. Wnt 리간드의 부재시에는, 이들 단백질이 복합체를 형성하여 β-카테닌의 인산화 및 분해를 촉진하는 반면, Wnt 신호전달은 상기 복합체를 불활성화하여 β-카테닌 분해를 방지한다. 안정화된 β-카테닌은 결과적으로 핵으로 이동하며, 거기에서 TCF (T 세포 인자) 전사 인자 (림프구 인핸서-결합 인자-1 (LEF1)로도 알려져 있음)에 결합하여, TCF/LEF-유도 전사의 공동활성화인자로서 기능한다 (문헌 [Bienz, et al. (2000) Cell 103: 311-320]; [Polakis, et al. (2000) Genes Dev 14: 1837-1851]).

비정상적인 Wnt 경로 활성화는 β-카테닌의 안정화를 통하여 많은 결장직장 암종에 있어서의 종양형성에 중심적인 역할을 한다. 결장직장 암종 (CRC)의 80 ％가 중단없는 Wnt 신호전달을 가능케 하는 종양 억제인자 APC에서의 불활성화 돌연변이에 근거하는 것으로 추정되고 있다. 또한, Wnt-경로 활성화가 흑색종, 유방암, 간암, 폐암, 및 위암에 관련되어 있을 수 있다는 것을 암시하는 증거들이 점점 더 늘어나고 있다. Wnt, 정상적인 발생, 및 암 사이에는 오래전부터 연관성이 인식되어 왔으며, Wnt 신호전달 표적으로서의 c-Myc 원형-종양유전자의 확인으로 연관성은 추가 확립되었다 (문헌 [He et al. (1998) Science 281: 1509-3512]).

또한, 비제한적으로 골다공증, 골관절염, 다낭성 신장병, 당뇨병, 정신분열증, 혈관 질환, 심장 질환, 비-종양발생 증식성 질병, 및 신경변성 질병 예컨대 알츠하이머병을 포함한 기타 장애들이 비정상적인 Wnt 신호전달과 관련되어 있다.

결장직장암과 같은 Wnt 신호전달-관련 장애용 요법의 개발을 위한 현재의 패러다임은 β-cat 또는 β-cat 하류의 Wnt 경로 구성요소를 표적으로 하는 것에 의존하고 있다. 그러나, 최근의 연구들은 Wnt 수용체 프리즐드 및 LRP5/6에 의해 매개되는 자가분비 Wnt 신호전달이 종양의 성장 및 생존을 조절함에 있어 핵심적인 역할을 할 수 있다는 것을 암시하고 있다. 다른 중요한 연결부를 따라서 Wnt 경로의 활성화를 조정하는 것에 의해 Wnt 신호 전달 활성을 억제함으로써, Wnt 신호전달-관련 장애를 치료, 진단, 예방, 및/또는 개선하는 제제 및 방법에 대한 필요성이 존재한다.

본 발명은 예를 들면 악신의 단백질 안정성 및/또는 수준을 조정하는 제제 (예, 소형 분자 (예컨대 본 발명의 화합물 포함), 억제성 핵산, 융합 단백질 등)의 사용을 통하여 Wnt 신호전달-관련 장애 (예, 결장직장암)를 진단하고, 그의 증상을 개선하며, 그를 예방하고, 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 예를 들면 TNKS 촉매 활성을 조정하는 것에 의해 탄키라제(Tankyrase) (TNKS)를 조정한다.

상기 방법은 그를 필요로 하는 대상에게 유효량의 Wnt 경로 신호 전달 조정제, 예를 들면 악신 안정화제 및/또는 TNKS 조정제 (예, 소형 분자 (예컨대 본 발명의 화합물 포함), 억제성 핵산, 융합 단백질, 또는 이들의 소정의 조합), 및 제약상 허용되는 담체를 투여하는 것을 포함할 수 있다.

상기 방법은 예를 들면 Wnt 수용체를 가지는 상피 세포를 치료하기 위하여, 세포 수준에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 방법은 기저 세포 암종 또는 기타 Wnt 신호전달-관련 장애 (예, 비정상적인 세포 증식을 특징으로 하는 것들)를 치료 또는 예방하는 데에 사용될 수 있다. 본 방법은 또한 Wnt 신호 전달을 억제하거나 또는 그의 억제를 작동시킴으로써, 비정상적인 또는 기타 세포 증식을 예방하는 데에 사용될 수 있다. 상기 방법은 또한 인간 및 동물 대상 모두를 위하여 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 예를 들면 악신 안정화제의 사용을 통하여, 예를 들면 TNKS 조정제 (예, 소형 분자, 억제성 핵산, 융합 단백질 등)의 사용을 통하여, Wnt 경로 신호 전달을 조정하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명의 방법은 예를 들면 악신 안정화제의 사용을 통하여, 예를 들면 TNKS 조정제 (예, 소형 분자, 억제성 핵산, 융합 단백질 등)의 사용을 통하여, Wnt 경로 신호 전달을 억제하거나 또는 그의 억제를 작동시키는 것을 포함한다.

Wnt 경로 신호 전달을 억제하거나 또는 그의 억제를 작동시키는 상기 방법은 예를 들면 정상 세포, 조직 및 장기를 포함한 광범위한 세포, 조직 및 장기의 복구 및/또는 기능적 성능을 조절하는 데에 사용될 수 있다. 비제한적인 예에는 신경 조직의 조절, 뼈 및 연골의 형성 및 복구, 정자형성의 조절, 평활근의 조절, 원시 장관으로부터 발생하는 폐, 간 및 기타 장기의 조절, 조혈 기능의 조절, 피부 및 모발 성장의 조절 등이 포함된다. 본 발명의 상기 방법은 생체외 또는 생체내에서 수행될 수 있다.

본 발명은 또한 Wnt 경로 신호 전달의 효능제 및 길항제를 확인 및 시험하는 방법, 및 Wnt 경로 구성원 (예, 악신, TNKS)의 효능제 및 길항제를 확인 및 시험하는 방법을 제공한다. 악신 단백질 수준의 안정화 및 상승을 통하여, 그리고 TNKS의 억제를 통하여 Wnt 경로 신호 전달을 억제하는 본 발명의 발견은 생체외 또는 생체내에서 상기 안정화, 및 그에 따른 Wnt 경로 신호전달을 촉진 또는 방해하게 될 제제를 확인하는 데에 유용하다. 따라서, 상기 본 발명의 발견은 TNKS 촉매 활성을 억제할 수 있으며, 그에 따라 예를 들면 안정화되어 그의 β-카테닌 파괴 복합체를 형성하는 데 (그리고 결과적인 Wnt 경로 신호 전달의 조정)에 있어서의 악신의 실패로부터 기인할 수 있는 비정상적 및 병리학적 Wnt 신호전달과 관련된 장애를 치료하는 데에 사용될 수 있는 제제를 발견하는 데에도 유용하다.

일 구현예에서, Wnt 경로 신호 전달을 조정할 수 있는 제제를 확인하는 방법은 a) Wnt 신호전달 경로가 활성인 생물학적 샘플을, Wnt 신호전달을 허용하며 TNKS 단백질 수준이 측정될 수 있는 조건하에서, 시험 제제의 존재 및 부재하에 접촉시키는 것; 및 b) 상기 시험 제제의 존재 및 부재 모두에서 TNKS 단백질 수준을 측정하는 것을 포함하며, 여기에서 (i) 시험 제제의 부재시와 비교할 때 시험 제제의 존재시의 TNKS 단백질 수준 또는 안정성의 감소는 시험 제제가 Wnt 경로 신호 전달의 길항제임을 확인해주고, (ii) 시험 제제의 부재시와 비교할 때 시험 제제의 존재시의 TNKS 단백질 수준 또는 안정성의 증가는 시험 제제가 Wnt 경로 신호 전달의 효능제임을 확인해준다.

일 구현예에서, 상기 제제는 소형 분자일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 제제는 억제성 핵산 (예, 항-TNKS1 또는 -TNKS2 siRNA)일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 제제는 융합 단백질 (예, TNKS에 대한 억제성 융합 단백질)일 수 있다.

본 발명은 Wnt 경로 신호 전달을 나타내는 세포를 시험 제제와 접촉시키는 것, 및 TNKS 단백질 수준, 또는 악신 단백질 수준 및/또는 악신 안정화에서의 변화를 검출하는 것을 포함하는, Wnt 신호전달-관련 장애 (예, 결장직장암)의 치료에 유용한 화합물의 스크리닝 방법을 포함한다.

일 구현예에서, Wnt 신호전달-관련 장애의 치료에 유용한 제제의 확인 방법은 a) Wnt 신호전달 경로가 활성인 생물학적 샘플을, Wnt 신호전달을 허용하며 TNKS 단백질 수준 또는 안정성이 측정될 수 있는 조건하에서, 시험 제제의 존재 및 부재하에 접촉시키는 것; 및 b) 상기 시험 제제의 존재 및 부재 모두에서 TNKS 단백질 수준을 측정하는 것을 포함하며, 여기에서 (i) 시험 제제의 부재시와 비교할 때 시험 제제의 존재시의 TNKS 단백질 수준 또는 안정성의 감소는 시험 제제가 Wnt 신호전달의 비정상적인 상향조절과 관련된 장애를 치료하는 데에 유용함을 확인해주고, (ii) 시험 제제의 부재시와 비교할 때 시험 제제의 존재시의 TNKS 단백질 수준 또는 안정성의 증가는 시험 제제가 Wnt 신호전달의 비정상적인 하향조절과 관련된 장애를 치료하는 데에 유용함을 확인해준다.

일 구현예에서, 상기 제제는 소형 분자일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 제제는 억제성 핵산 (예, 항-TNKS1 또는 -TNKS2 siRNA)일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 제제는 융합 단백질 (예, TNKS에 대한 억제성 융합 단백질)일 수 있다.

일 구현예에서, Wnt 신호전달-관련 장애의 치료에 유용한 제제의 확인 방법은 Wnt 신호전달 경로가 활성인 세포를 시험 제제와 접촉시키는 것 및 TNKS 단백질 수준 또는 안정성에서의 변화를 검출하는 것을 포함한다.

본 발명의 스크리닝 방법에서, 악신 단백질 수준 또는 안정성의 증가는 총 β-카테닌 수준의 감소, 포스포-β-카테닌 수준의 증가, 악신 단백질 수준의 증가 또는 악신-GSK3 복합체 형성의 증가에 의해 측정된다. 악신 단백질 수준 또는 안정성의 감소는 총 β-카테닌 수준의 증가, 포스포-β-카테닌 수준의 감소, 악신 단백질 수준의 감소 또는 악신-GSK3 복합체 형성의 감소에 의해 측정된다.

본 발명의 기타 스크리닝 방법에는 Wnt 경로 신호 전달을 조정할 수 있는 제제를 확인하는 방법, 및 탄키라제 (TNKS)의 촉매 활성을 억제할 수 있는 제제를 확인하는 방법이 포함된다. 상기 제제는 적어도 소형 분자, 억제성 핵산 (예, 항-TNKS1 또는 -TNKS2 siRNA), 또는 융합 단백질 (예, TNKS에 대한 억제성 융합 단백질)일 수 있다.

본 발명에는 (i) 생체내에서 세포 증식 또는 Wnt 비정상적인 발현의 기타 생물학적 결과를 억제하고 (예컨대 구성적인(constitutive) Wnt 신호전달을 특징으로 하는 암에서); (ii) Wnt 신호전달-관련 장애를 진단하거나, 그의 증상을 개선하거나, 그를 예방하거나, 또는 치료하기에 충분한 양으로 제제화된 본원에서 기술되는 것과 같은 Wnt 길항제 (예, 악신 안정화제 및/또는 TNKS 길항제)를 활성 성분으로서 포함하는 제약 제제가 포함된다. 상기 제제는 예를 들면 제약상 허용되는 담체 내에, 본 발명의 임의의 구현예에 따른 화합물, 억제성 핵산, 또는 융합 단백질, 또는 이들의 소정의 조합을 포함할 수 있다.

또 다른 구현예에서는, 종양 세포의 성장을 억제하는 방법이 제공되며, 그것은 그를 필요로 하는 대상에게 유효량의 Wnt 경로 신호 전달 조정제, 예를 들면 악신 안정화제 및/또는 TNKS 길항제 (예, 소형 분자 (예컨대 본 발명의 화합물 포함), 억제성 핵산, 융합 단백질 등, 또는 이들의 소정의 조합), 및 제약상 허용되는 담체를 투여하는 것을 포함한다.

추가적으로 제공되는 것은 종양 세포에서 세포자멸을 유도하는 방법으로서, 그것은 그를 필요로 하는 대상에게 유효량의 Wnt 경로 신호 전달 조정제, 예를 들면 악신 안정화제 및/또는 TNKS 길항제 (예, 소형 분자 (예컨대 본 발명의 화합물 포함), 억제성 핵산, 융합 단백질 등, 또는 이들의 소정의 조합), 및 제약상 허용되는 담체를 투여하는 것을 포함한다.

본 발명에는 Wnt 신호전달-관련 장애 (예, 결장직장암)에 걸린 대상이 "TNKS 억제제", "악신 안정화제" 등 (예를 들면 본 발명의 화합물, 또는 TNKS의 촉매 활성을 억제할 수 있는 융합 단백질 또는 억제 뉴클레오티드 포함)을 포함하는 치료 처방계획으로부터 이익을 얻게 될 성향 또는 가능성을 확인 또는 예측하는 방법이 포함된다.

도 1. XAV939는 악신 단백질 수준을 증가시킴으로써 Wnt/β-카테닌 신호전달을 억제한다.
도 1a. XAV939는 HEK293 세포에서 STF 활성을 특이적으로 억제한다. HEK293 STF, CRE, NF_KB, 및 CAGA12 리포터 세포주들을 각각 Wnt3A 조건화 배지, 포르스콜린(Forskolin), TNFα, 및 TGFβ를 사용하여 활성화시키고, XAV939 또는 LDW643 (XAV939용 화합물의 비활성 유사체, 및 음성 대조)의 12-단계 희석액으로 처리하였다. 각 화합물 희석액에 있어서의 상응 리포터 활성을 DMSO로 표준화하여, DMSO에서의 리포터 활성의 백분율로서 나타내었다.
도 1b. XAV939는 Wnt3A 안정화 β-카테닌 수준을 감소시킨다. DMSO 또는 1 μM XAV939의 존재하에, Wnt3A 조건화 배지를 사용하여 표시된 길이의 시간 동안 HEK293 세포를 자극하였다. 세포 용해질을 분별하고, 세포질 β-카테닌에 대하여 면역블롯팅하였다.
도 1c. XAV939는 APC-결핍 SW480 세포에서 STF 활성을 억제한다. SW480-STF 및 SW480-STF-TCF3VP16 세포를 XAV939 또는 LDW643의 12-단계 희석액으로 처리하고, 루시퍼라제 활성에 대하여 분석하였다. TCF3VP16 융합 단백질의 과발현은 STF 활성 (데이터 미도시)에 있어서의 β-카테닌 요구도를 크게 뛰어넘었다. b와 유사하게, 각 화합물 희석 단계에 있어서의 상응 리포터 활성을 DMSO에서의 리포터 활성으로 표준화하여, 백분율로 나타내었다.
도 1d. XAV939는 β-카테닌의 풍부도를 감소시키고, 악신 및 포스포-β-카테닌의 풍부도를 증가시킨다. SW480 세포를 1 μM의 XAV939 또는 LDW643으로 밤새 처리하고, 세포질 단백질에 대하여 분별한 후, 표시된 항체를 사용하여 면역블롯팅하였다.
도 1e. β-카테닌에 대한 XAV939의 효과는 악신 의존성이다. 악신1 및 악신2 siRNA 모두 또는 대조 pGL2 siRNA로 핵산전달감염된 SW480 세포를 3 μM XAV939의 존재 또는 부재로 처리하였다. 다음에, 세포질 용해질을 분리하여, 표시된 항체로 면역블롯팅하였다.
도 2. 세포 효능 표적의 확인
도 2a. 활성 화합물 XAV939 및 비활성 유사체 LDW643의, 10-배 증가분 단계로 1 nM에서 100 μM까지 범위인 점증 투여량을 사용한 투여량 응답 화합물 경쟁 실험으로부터의, 용해질 상에서의 TNKS1/2, PARP1, PARP2에 대한 면역블롯팅 분석.
도 2b. XAV939는 더 높은 친화성을 가지는 TNKS1 및 TNKS2의 PARP 도메인에 직접적으로 결합한다. Cy5에 접합된 XAV939를 사용하여 GST-TNKS1 및 TNKS2를 배양하였다. 미가공 mP [1000 × (S-G*P/S+G*P)] 데이터를 익스포팅하고, 1-부위 총 결합 포화 알고리듬을 사용하여 분석하였다.
도 3. 탄키라제는 악신 단백질 수준을 조정한다.
도 3a, b. TNKS1과 TNKS2의 동시 고갈은 악신 단백질 수준을 증가시키고 β-카테닌 단백질 수준을 감소시킴으로써 XAV939를 비유전성표현변이화한다. SW480 세포를 표시된 조합의 PARP1, PARP2, TNKS1, 및 TNKS2에 대한 siRNA 싱글톤(singleton)을 사용하여 핵산전달감염시켰다. TNKS 1 및 2 모두에 있어서, 고유의 표적 서열로부터 생성되며, A 및 B로 표지화된 2종의 독립적인 siRNA가 실험에 이용되었다. 핵산전달감염 48시간 후 세포질 단백질을 수확하여, 표시된 항체에 의해 분석하였다.
도 3c. TNKS1 및 TNKS2의 고갈은 악신1의 단백질 수준을 증가시키고, Wnt3a-유도 β-카테닌 축적을 차단한다. HEK293 세포를 표시된 조합의 TNKS1 또는 TNKS2에 대한 개별 siRNA로 핵산전달감염시켰다. 상단부에서는, 핵산전달감염 48시간 후 면역블롯팅에 의해 악신1의 발현을 분석하였다. 하단부에서는, 핵산전달감염 48시간 후 Wnt3A 조건화 배지를 사용하여 6시간 동안 세포를 자극하였다. 다음에, 세포질 β-카테닌을 분리하여, 면역블롯팅에 의해 측정하였다.
도 3d. TNKS1 및 TNKS2의 고갈은 Wnt 리포터를 특이적으로 억제한다. HEK293 CRE 및 STF 리포터 세포주를 표시된 siRNA로 핵산전달감염시킨 후, 각각 포르스콜린(Forskolin) 및 Wnt3A 조건화 배지로 자극하고, 루시퍼라제 활성에 대하여 측정하였다. 데이터를 pGL2 대조 siRNA에 대하여 표준화하고, 억제 ％로서 나타내었다.
도 3e. 초파리 S2 세포에서, TNKS의 녹다운은 악신의 단백질 수준을 증가시킨다. DAxin-3xHA를 안정적으로 발현하는 S2 세포를 대조 dsRNA (백색) 또는 초파리 TNKS에 대한 dsRNA와 함께 배양하였다. 면역블롯팅 (좌측 단) 및 qPCR (우측 단)에 의해 DAxin-3xHA의 단백질 및 mRNA 수준을 검출하였다.
도 3f. 초파리 S2 세포에서, 녹-다운 TNKS는 Wnt 리포터를 특이적으로 억제한다. S2를 표시된 dsRNA로 처리하고, Wnt (LEF-Luc), BMP (BRE-Luc) 및 JAK/SAT (Draf-Luc) 리포터를 사용하여 일시적으로 핵산전달감염시킨 후, 적절한 리간드 (윙리스 조건화 배지, BMP2, 및 UPD 조건화 배지)로 자극하고, 루시퍼라제 활성에 대하여 분석하였다.
도 3g. 야생형이나 촉매적으로 비활성은 아닌 TNKS2는 TNKS1/2 siRNA 유도 악신1 축적을 구조한다. 유도가능 siRNA 내성을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포 및 Flag-표지된 야생형 (WT) 또는 촉매적으로 비활성인 것 (M1054V)을 TNKS1 및 TNKS2에 대한 siRNA로 핵산전달감염시켰다. 외인성 TNKS2의 독시시클린 (DOX) 유도 발현 후, 세포 용해질을 수확하여 면역블롯팅에 의해 분석하였다.
도 3h. XAV939는 TNKS의 자가파실레이팅을 억제한다. 1 μM의 단백질 (GST-TNKS2-SAM-PARP1)을 30 ℃에서 DMSO 중 5 μM의 바이오틴-NAD, 또는 2 μM의 XAV939 또는 LDW643과 혼합하였다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅에 의해 샘플을 분석하였다.
도 4. 탄키라제는 물리적으로 및 기능적으로 악신과 상호작용한다.
도 4a. 외인성 악신2와 TNKS의 공동-면역침전. SW480 세포를 대조 siRNA 또는 악신2 siRNA로 핵산전달감염시키고, 세포 용해질을 항-악신2 항체 또는 IgG로 면역침전시켰다. 면역침전물을 SDS-PAGE에 의해 용해시키고, 표시된 항체로 블롯팅하였다.
도 4b. 효모 2종-하이브리드 분석을 사용한 악신1의 TNKS 결합 도메인의 매핑(mapping). 좌단은 효모 2종-하이브리드 분석에서 TNKS에 결합하는 데에 사용되는 악신1 단백질 단편을 묘사하는 개략도. 우단은 효모 2종-하이브리드 분석에서 TNKS에 대한 악신1 단백질 단편 결합력의 요약표 (+ 강한 결합, +/- 약한 결합, - 결합 없음). 공지의 악신1 바인더인 GSK3β를 대조로서 사용하였다. N88 단편은 부분적인 자가-활성화 활성을 보유하고 있다는 것에 유의하라.
도 4c. Flag-TNKS1을 과발현하는 HEK293 세포의 세포 용해질을 표시된 GST 융합 단백질과 함께 배양하여, 침전시킨 후, 표시된 항체를 사용하여 면역블롯팅 및 분석하였다. GST-악신N은 GST에 융합된 악신1의 아미노-말단 87 아미노산 잔기로 구성된다.
도 4d. 악신1 단백질과 TNKS1의 공동-면역침전. 표시된 구축물로 핵산전달감염된 HEK293 세포의 세포 용해질을 항-Flag 항체를 사용하여 면역침전시키고, 면역블롯팅에 의해 분석하였다.
도 4e. XAV939-유도 악신1 단백질 축적을 위해서는, TNKS 결합 도메인을 필요로 한다. 레트로바이러스 감염에 의해 표시된 GFP-악신 융합 구축물을 안정적으로 발현하는 SW480 세포주를 확립하고, XAV939로 밤새 처리하였다. 전체 세포 용해질을 수확하여, 면역블롯팅에 의해 분석하였다.
도 4f. 악신1 아미노 말단 단편의 과발현은 내인성 악신1의 축적으로 이어진다. 유도가능 GFP-악신1N (아미노산 1-87)을 발현하는 HEK293 세포주를 생성시켰다. 독소시클린 (DOX)으로 24 시간 동안 세포를 처리함으로써, GFP-악신1N의 발현을 유도하였다. 전체 세포 용해질을 수확하여, 면역블롯팅에 의해 분석하였다.
도 4g. 다양한 TNKS1 단편들을 효모 2종 하이브리드 분석에서의 악신1에 대한 그의 결합에 대하여, 그리고 HEK293 세포에서 과발현되었을 때의 STF 리포터에 대한 그의 효과에 대하여 시험하였다. 좌단은 TNKS1 구축물의 개략도 및 악신1에 결합하는 그의 능력의 요약. 악신1에 대한 이러한 구축물의 악신1 결합 활성은 중앙 컬럼의 "β-Gal 분석" 하단에 표시되어 있다. 우단은 STF 리포터에 대한 TNKS1 구축물의 효과. TNKS1 구축물을 HEK293 STF 리포터 세포에 일시적으로 핵산전달감염시키고, 핵산전달감염 48시간 후 루시퍼라제 활성에 대하여 분석하였다. (IP: 면역침전, TCL: 총 세포 용해질)
도 5. XAV939는 악신 단백질 수준을 안정화하고, 악신 유비퀴틴화를 억제한다.
도 5a. 악신은 XAV939에 의해 안정화된다. 재료 및 방법에 기술되어 있는 바와 같이, 펄스-추적(pulse-chase) 분석 전에 SW480 세포를 DMSO 또는 1 μM XAV939 중 어느 것으로 2시간 동안 처리하였다. RIPA 버퍼를 사용하여 세포 용해질을 제조하여, 항-악신2 항체로 면역침전시키고, SDS-PAGE에 의해 용해시킨 다음, 포스포화상화기로 분석하였다.
도 5b. TNKS2에 의한 악신1 단편의 생체외 파실레이팅(PARsylating). 재조합 TNKS2 및 GST-악신1 (아미노산 1-280)을 바이오틴-NAD⁺와 함께 배양하였다. XAV939의 존재하에 또는 부재하에 반응을 수행하고, SDS-PAGE에 의해 용해시킨 후, 스트렙타비딘-알렉사플루오르(AlexaFluor)680으로 표지화하였다.
도 5c. 악신 유비퀴틴화는 XAV939에 의해 억제된다. SW480 세포를 1 μM의 XAV939로 4시간 동안 예비-처리하고, 이어서 20 μM 의 MG132를 사용하여 추가 2시간 동안 처리하였다. RIPA 버퍼를 사용하여 세포 용해질을 수확하여, 대조 IgG 또는 항-유비퀴틴 항체로 면역침전시킨 후, 표시된 항체로 면역블롯팅 및 분석하였다. 악신1이 이동하는 위치는 화살표로 표시하였다. 저속 이동 폴리-유비퀴틴화-악신1 접합물이 표시되어 있다.
도 5d. 악신1의 생체내 파실레이팅. 메탈로티오네인 프로모터의 조절하에서 GFP-악신1을 안정하게 발현하는 SW480 세포를 Cu^{2 +}와 함께 밤새 배양하여 GFP-악신1의 발현을 유도하였다. XAV939를 사용하여 추가 6시간 동안 세포를 처리하였다. PARG 억제제 ADP-HPD (5 μM) 및 PARP1 억제제 PJ34 (80 μM)를 함유하는 RIPA 버퍼를 사용하여 용해질을 수확하고, GFP 항체로 면역침전시킨 후, 면역블롯팅에 의해 분석하였다.
도 5e. 화합물 세척 제거 실험에서의 악신2의 해독-후 변형. SW480 세포를 1μM의 XAV939로 밤새 처리하고, 새로운 배지로 세척하여 XAV939를 제거한 다음, 표시된 화합물이 보충된 배지를 사용하여 1시간 동안 배양하였다. RIPA 버퍼를 사용하여 세포 용해질을 수확하고, 항-악신2 항체로 면역침전시킨 후, 면역블롯팅에 의해 분석하였다. 악신2가 이동하는 위치는 화살표로 표시되어 있다. (IP: 면역침전, TCL: 총 세포 용해질).
도 6. XAV939는 악신-의존 방식으로 DLD1 콜로니 형성을 억제한다.
도 6a. XAV939는 DLD1 세포의 콜로니 형성은 억제하나, RKO 세포에서는 그렇지 않다. DLD1 및 RKO 세포를 0.5 ％ 혈청 및 표시된 화합물을 함유하는 배지의 6-웰 플레이트에 500 세포/웰로 접종하고, 매 2일마다 새로운 배지를 보충하였다. 콜로니는 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 가시화하였다.
도 6b. DLD1 콜로니 형성에 대한 XAV939의 효과는 악신-의존성이다. DLD1 세포를 악신1 및 악신2에 대한 siRNA로 핵산전달감염시킨 후, 6-웰 플레이트에 1000 세포/웰로 접종하였다. 화합물 처리는 6A에 기술되어 있는 바와 같이 수행하였다.
도 7은 기능상실 APC 돌연변이를 가지는 암, 기능강화 β-카테닌 활성화 돌연변이를 가지는 암, 및/또는 β-카테닌 표적 유전자 악신2의 높은 발현 수준에 의해 입증되는 활성화된 Wnt 신호전달을 가지는 암을 포함하여, 활성화된 Wnt 신호전달을 특징으로 하는 다발성 암 모델의 성장을 억제하는 본 발명 화합물의 능력을 도시한다. APC 돌연변이를 가지는 결장직장암 세포주 SW403, β-카테닌 돌연변이를 가지는 결장직장암 세포주 HuTu-80, 그리고 정량 PCR 및 유전자 발현 마이크로어레이(microarray) 양자에 의해 입증되는 높은 수준의 악신2 유전자 발현을 가지는 위암 세포주 NCI-N87을 포함한 세 가지 대표적인 예가 도면에 제시되어 있다.
클론원성 분석을 위하여, 10 ％ 소 태아 혈청이 보충된 세포 배양 배지에서 세포를 배양하여, 1000-3000 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 플레이팅한 후, XAV939로 12시간 동안 처리하였다. 매 3일마다 화합물을 보충하였다. 크리스탈 바이올렛에서의 고정 및 염색에 의해 콜로니를 가시화하였다. 정량 PCR을 위하여, 세포로부터 총 RNA를 분리하고, 역전사 반응을 사용하여 cDNA를 제조하였다. 어드밴스드 바이오시스템즈(Advanced Biosystems) (ABI) 사의 악신2 특이적 프로브-프라이머를 사용하여 정량 PCR을 수행하였다.

본 발명은 예를 들면 Wnt 경로 신호 전달의 조정제, 예컨대 악신 안정화제 또는 불안정화제 및/또는 TNKS 조정제 (예, 소형 분자 (예컨대 본 발명의 화합물 포함), 억제성 핵산, 융합 단백질 등)의 사용을 통하여 Wnt 신호전달-관련 장애 (예, 결장직장암)를 진단하고, 그의 증상을 개선하며, 그를 예방하고, 치료하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 그를 필요로 하는 대상에게 유효량의 Wnt 경로 신호 전달 조정제, 예를 들면 악신 안정화제 및/또는 TNKS 조정제 (예, 소형 분자 (예컨대 본 발명의 화합물 포함), 억제성 핵산, 융합 단백질 등, 또는 이들의 소정의 조합), 및 제약상 허용되는 담체를 투여하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 목적상, 그리고 본원에서 매우 상세하게 설명되는 바와 같이, "본 발명의 화합물" 및 유사 용어는 악신 안정화를 통하여 Wnt 경로 신호전달을 억제하거나, 길항하거나, 완화하거나, 또는 약화시키는 화합물을 기술하는 데에 사용된다. 상기 화합물에는 XAV939가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 화합물에는 다른 PARP의 그것에 비해 TNKS1 및/또는 TNKS2의 촉매 활성을 우선적으로 억제하는 기타 소형 분자 PARP 억제제들이 포함될 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 악신 안정화제 (예, 본 발명의 화합물 (예컨대 XAV939))는 Wnt 신호전달의 비정상적인 상향조절과 관련된 Wnt 신호전달 장애 (예, 암, 골관절염, 및 다낭성 신장병)를 치료하는 데에 사용될 수 있다.

또 다른 구현예에서는, Wnt 신호전달의 비정상적인 하향조절과 관련된 Wnt 신호전달 장애 (예, 골다공증, 비만, 당뇨병, 및 뉴런 변성 질병)가 개선될 수 있도록, 악신 안정화가 조정될 수 있다. 예를 들어, 악신의 안정화를 방지할 수 있는 소형 분자, 융합 단백질, 또는 항체의 투여는 역으로 β-카테닌의 안정화를 촉진 (그리고 그에 따라 Wnt 경로 신호전달을 야기)하게 된다.

상기 방법은 세포 수준에서, 예를 들면 Wnt 수용체를 가지는 상피 세포를 치료하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 방법은 기저 세포 암종 또는 기타 Wnt 신호전달-관련 장애 (예, 비정상적인 세포 증식을 특징으로 하는 것들)을 치료 또는 예방하는 데에 사용될 수 있다. 본 방법은 또한 Wnt 신호 전달을 억제하거나 또는 그의 억제를 작동시킴으로써, 비정상적인 또는 기타 세포 증식을 예방하는 데에 사용될 수 있다. 상기 방법은 또한 인간 및 동물 대상 모두를 위하여 사용될 수 있다. 상기 방법은 생체외 또는 생체내에서 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 예를 들면 악신 안정화제 및/또는 TNKS 조정제 (예, 소형 분자, 억제성 핵산, 융합 단백질 등)의 사용을 통하여 Wnt 경로 신호 전달을 조정하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명의 방법은 예를 들면 악신 안정화제 및/또는 TNKS 조정제 (예, 소형 분자, 억제성 핵산, 융합 단백질 등)의 사용을 통하여, Wnt 경로 신호 전달을 억제하거나 또는 그의 억제를 작동시키는 것을 포함한다. 악신 안정화 (그리고 그에 의한 β-카테닌 인산화 및 분해)에 기여하는 제제는 Wnt 경로 신호 전달의 억제를 초래하며; 역으로, 악신 안정화를 완화하는 (그리고 그에 의해 β-카테닌을 안정화하는) 제제는 Wnt 경로 신호 전달의 증가를 초래한다.

Wnt 경로 신호 전달을 억제하거나 또는 그의 억제를 작동시키는 상기 방법은 예를 들면 정상 세포, 조직 및 장기를 포함한 광범위한 세포, 조직 및 장기의 복구 및/또는 기능적 성능을 조절하는 데에 사용될 수 있다. 비제한적인 예에는 신경 조직의 조절, 뼈 및 연골의 형성 및 복구, 정자형성의 조절, 평활근의 조절, 원시 장관으로부터 발생하는 폐, 간 및 기타 장기의 조절, 조혈 기능의 조절, 피부 및 모발 성장의 조절 등이 포함된다. 본 발명의 상기 방법은 생체외 또는 생체내에서 수행될 수 있다.

본 발명은 또한 Wnt 경로 신호 전달의 효능제 및 길항제를 확인 및 시험하는 방법, 및 Wnt 경로 구성원 (예, 악신, TNKS)의 효능제 및 길항제를 확인 및 시험하는 방법을 제공한다. 악신 단백질 수준의 안정화 및 상승을 통하여 Wnt 경로 신호 전달을 억제하고, TNKS의 억제를 통하여 Wnt 경로 신호 전달을 억제하는 본 발명의 발견은 생체외 또는 생체내에서 상기 안정화, 및 그에 따른 Wnt 경로 신호전달을 촉진 또는 방해하게 될 제제를 확인하는 데에 유용하다. 따라서, 상기 본 발명의 발견은 악신 안정화 (및 결과적인 Wnt 경로 신호 전달의 조정)의 부재 또는 존재와 관련된 장애를 치료하는 데에 사용될 수 있는 제제를 발견하는 데에도 유용하다.

일 구현예에서, Wnt 경로 신호 전달을 조정할 수 있는 제제를 확인하는 방법은 a) Wnt 신호전달 경로가 활성인 생물학적 샘플을, Wnt 신호전달을 허용하며 악신 단백질 수준 또는 안정성이 측정될 수 있는 조건하에서, 시험 제제의 존재 및 부재하에 접촉시키는 것; 및 b) 상기 시험 제제의 존재 및 부재 모두에서 악신 단백질 수준 또는 안정성을 측정하는 것을 포함하며, 여기에서 (i) 시험 제제의 부재시와 비교할 때 시험 제제의 존재시의 악신 단백질 수준 또는 안정성의 감소는 시험 제제가 Wnt 경로 신호 전달의 효능제임을 확인해주고, (ii) 시험 제제의 부재시와 비교할 때 시험 제제의 존재시의 악신 단백질 수준 또는 안정성의 증가는 시험 제제가 Wnt 경로 신호 전달의 길항제임을 확인해준다.

일 구현예에서, 상기 제제는 소형 분자일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 제제는 억제성 핵산일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 제제는 융합 단백질일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 소형 분자, 억제성 핵산, 또는 융합 단백질은 악신에 직접적으로 작용할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 소형 분자, 억제성 핵산, 또는 융합 단백질은 간접적으로 악신에 작용할 수 있다 (예를 들면, 악신의 결합 상대, 또는 악신-관련 단백질, 예컨대 GSK3, β-카테닌, APC, 및 디셰블드, PP1, PP2A, 카세인 키나제1, LRP5/6에 작용할 수 있음).

본 발명은 Wnt 경로 신호 전달을 나타내는 세포를 시험 제제와 접촉시키는 것, 및 TNKS 단백질 수준, 및/또는 악신 단백질 수준 및/또는 악신 안정화에서의 변화를 검출하는 것을 포함하는, Wnt 신호전달-관련 장애 (예, 결장직장암)의 치료에 유용한 화합물의 스크리닝 방법을 포함한다.

일 구현예에서, Wnt 신호전달-관련 장애의 치료에 유용한 제제의 확인 방법은 a) Wnt 신호전달 경로가 활성인 생물학적 샘플을, Wnt 신호전달을 허용하며 악신 단백질 수준이 측정될 수 있는 조건하에서, 시험 제제의 존재 및 부재하에 접촉시키는 것; 및 b) 상기 시험 제제의 존재 및 부재 모두에서 악신 단백질의 수준을 측정하는 것을 포함하며, 여기에서 (i) 시험 제제의 부재시와 비교할 때 시험 제제의 존재시의 악신 단백질 수준의 감소는 시험 제제가 Wnt 신호전달의 비정상적인 하향조절과 관련된 장애를 치료하는 데에 유용함을 확인해주고, (ii) 시험 제제의 부재시와 비교할 때 시험 제제의 존재시의 악신 단백질 수준의 증가는 시험 제제가 Wnt 신호전달의 비정상적인 상향조절과 관련된 장애를 치료하는 데에 유용함을 확인해준다.

일 구현예에서, 상기 제제는 소형 분자일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 제제는 억제성 핵산일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 제제는 융합 단백질일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 소형 분자, 억제성 핵산, 또는 융합 단백질은 악신에 직접적으로 작용할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 소형 분자, 억제성 핵산, 또는 융합 단백질은 간접적으로 악신에 작용할 수 있다 (예를 들면, 악신의 결합 상대, 또는 악신-관련 단백질, 예컨대 GSK3, β-카테닌, APC, 및 디셰블드, PP1, PP2A, 카세인 키나제1, LRP5/6에 작용할 수 있음).

일 구현예에서, Wnt 신호전달-관련 장애의 치료에 유용한 제제의 확인 방법은 Wnt 신호전달 경로가 활성인 세포를 시험 제제와 접촉시키는 것 및 악신 단백질 수준 또는 안정성에서의 변화를 검출하는 것을 포함한다.

본 발명에는 (i) 생체내에서 증식 또는 Wnt 비정상적인 발현의 기타 생물학적 결과를 억제하고; (ii) Wnt 신호전달-관련 장애를 진단하거나, 그의 증상을 개선하거나, 그를 예방하거나, 또는 치료하기에 충분한 양으로 제제화된 본원에서 기술되는 것과 같은 Wnt 길항제 (예, 악신 안정화제, TNKS 길항제)를 활성 성분으로서 포함하는 제약 제제가 포함된다. 상기 제제는 예를 들면 제약상 허용되는 담체 내에, 본 발명의 임의의 구현예에 따른 화합물, 억제성 핵산, 또는 융합 단백질, 또는 이들의 소정의 조합을 포함할 수 있다.

또 다른 구현예에서는, 종양 세포의 성장을 억제하는 방법이 제공되며, 그것은 그를 필요로 하는 대상에게 유효량의 Wnt 경로 신호 전달 조정제, 예를 들면 악신 안정화제 및/또는 TNKS 길항제 (예, 소형 분자 (예컨대 본 발명의 화합물 포함), 억제성 핵산, 융합 단백질 등, 또는 이들의 소정의 조합), 및 제약상 허용되는 담체를 투여하는 것을 포함한다. 비제한적인 예를 들자면, 본원에서 추가 설명되는 바와 같이, 본 발명의 화합물 (예, 화합물 I)은 APC가 결핍되어 있는 결장암 세포, 및 무손상 Wnt 신호전달 경로를 가지는 세포주 모두에서 Wnt 신호전달을 억제할 수 있다. 역시 비제한적인 예를 들자면, 본원에서 추가 설명되는 바와 같이, 본 발명의 화합물 (예, 화합물 I)은 생체외 세포 배양 분석에서 결장암 세포의 성장을 억제할 수 있다.

추가적으로 제공되는 것은 종양 세포에서 세포자멸을 유도하는 방법으로서, 그것은 그를 필요로 하는 대상에게 유효량의 Wnt 경로 신호 전달 조정제, 예를 들면 악신 안정화제 및/또는 TNKS 길항제 (예, 소형 분자 (예컨대 본 발명의 화합물 포함), 억제성 핵산, 융합 단백질 등, 또는 이들의 소정의 조합), 및 제약상 허용되는 담체를 투여하는 것을 포함한다.

상기 본 발명 방법의 일 구현예에서는, 본 발명의 화합물과 같은 악신 안정화제가 투여된다. 상기 구현예에서, 악신 안정화제는 그것이 투여되는 세포 또는 시스템 내의 악신 단백질 수준 증가를 초래한다. 결과적으로, GSK3 기작을 통하여 β-카테닌이 부수적으로 인산화 및 분해된다. 악신 안정화와 β-카테닌 분해의 조합은 Wnt 경로 신호전달의 억제로 이어진다. 상기 구현예의 적어도 한 가지 효용은 Wnt 신호전달 수준이 이상적으로 높은 장애 (예, 결장암)의 치료이다. 또 다른 효용은 종양 세포 성장의 억제, 및/또는 종양 세포에서의 세포자멸의 유도이다.

상기 본 발명 방법의 일 구현예에서는, GSK3에 의한 악신 인산화를 증가시킴으로써 작용하는 악신 안정화제가 투여된다. 일 구현예에서는, XAV939가 GSK3에 의한 악신 인산화의 증가를 유도하여, 악신을 안정화하고 악신 단백질 수준을 증가시킴으로써, Wnt 신호 전달을 억제할 수 있다.

본 발명에는 Wnt 신호전달-관련 장애 (예, 결장직장암)에 걸린 대상이 "TNKS 억제제", "악신 안정화제" 등 (예를 들면 본 발명의 화합물, 또는 TNKS의 촉매 활성을 억제할 수 있는 융합 단백질 또는 억제 뉴클레오티드 포함)을 포함하는 치료 처방계획으로부터 이익을 얻게 될 성향 또는 가능성을 확인 또는 예측하는 방법이 포함된다.

본원에서 추가적으로 설명되는 바와 같이, 상기 방법은 먼저 Wnt 신호전달-관련 장애 (예, 결장직장암)에 걸린 대상을 진단한 다음, 상기 대상이 비정상적인 악신 안정화 및/또는 β-카테닌 분해와 관련된 장애의 1종 이상의 생체지표(biomarker)의 존재를 나타내는지 아닌지 여부를 검출하는 것을 포함한다. 상기 생체지표의 존재는 상기 대상이 "TNKS 억제제", "악신 안정화제" 등을 포함하는 치료 처방계획으로부터 이익을 얻게 된다는 것을 표시한다. 상기 생체지표의 비제한적인 예에는 (i) 종양 억제인자 APC의 절단 돌연변이; (ii) 악신1 및 악신2 돌연변이; (iii) β-카테닌 과발현; 및 악신-GSK3 복합체 형성의 증가가 포함된다.

정의

"치료하다", "치료된", "치료하는" 또는 "치료"라는 용어는 치료되는 상태, 장애 또는 질병과 관련되거나 그에 의해 야기되는 1종 이상의 증상의 감소 또는 경감을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 치료는 본 발명 화합물의 활성화로 이어지며, 이것은 다시 치료되는 Wnt 신호전달-관련 장애와 관련되거나 그에 의해 야기되는 1종 이상의 증상을 감소 또는 경감시키게 되는, Wnt 신호전달-관련 장애의 유도를 포함한다. 예를 들면, 치료는 1종 또는 수종의 장애 증상의 감소, 또는 장애의 완전한 근절일 수 있다.

"사용하다"라는 용어는 다르게 설명되지 않는 한, 경우에 따라 그리고 편의에 따라, 각각 하기 본 발명 구현예들 중 임의의 1종 이상을 포괄한다: Wnt 신호전달-관련 장애의 치료에서의 용도; 예컨대 약제 제조에서, 해당 질병의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물의 제조를 위한 용도; 해당 질병의 치료에서의 본 발명 화합물의 사용 방법; 해당 질병의 치료를 위한, 본 발명의 화합물을 가지는 제약 제제; 및 해당 질병의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 화합물. 구체적으로, 치료되며, 그에 따라 본 발명의 화합물을 사용하기에 바람직한 질병은 암 (예, 결장암) 및 기타 증식성 질병, 골다공증, 및 정신분열증은 물론, Wnt 신호전달의 활성에 따라 달라지는 질병들에서 선택된다.

"Wnt 신호전달-관련 장애"라는 용어는 비제한적으로 암 (예, 결장직장 암종 (CRC), 흑색종, 유방암, 간암, 폐암 및 위암); 기타 비-종양발생 증식성 질병, 예컨대 증식성 피부 장애 (예, 건선, 피부염); 골다공증; 골관절염; 섬유증; 정신분열증; 혈관 질환; 심장 질환; 및 신경변성 질병 예컨대 알츠하이머병을 포함하여, 비정상적인 Wnt 신호전달과 관련된 질병 및 이상을 의미한다. Wnt 신호전달의 비정상적인 상향조절은 암, 골관절염, 및 다낭성 신장병과 관련되는 반면, Wnt 신호전달의 비정상적인 하향조절은 골다공증, 비만, 당뇨병, 및 뉴런 변성 질병과 연관되어 있다.

본원에서 사용될 때, "Wnt 신호전달-관련 암"에는 결장직장 암종 (CRC), 흑색종, 유방암, 간암, 폐암, 및 위암이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본원에서 사용될 때의 "Wnt-관련 암"이라는 용어에는 악성 수모세포종 및 기타 원발성 CNS 악성 신경외배엽 종양, 횡문근육종, 폐암, 특히 소세포 폐암, 비제한적으로 식도, 위, 췌장, 및 담관 시스템의 암을 포함한 장관-유래 종양; 전립선암 및 방광암, 결장암, 및 간암이 포함된다.

본원에서 사용될 때의 "Wnt 길항제"라는 용어에는 본원에서 기술되는 바와 같은, Wnt 신호 전달의 억제제, 또는 억제 효능제가 포함된다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 Wnt 길항제는 악신 안정화를 통하여 작용한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 Wnt 길항제는 TNKS 길항작용 (예컨대 TNKS의 촉매 능력을 억제하고, 그에 의해 악신을 안정화하는 것에 의한)을 통하여 작용한다. Wnt 길항제에는 소형 분자 (예컨대 본 발명의 화합물 포함), 억제성 핵산, 및 융합 단백질이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원에서 사용될 때의 "TNKS 길항제", "TNKS 억제제" 등의 용어는 악신의 안정성을 증가시킬 수 있는 제제를 의미한다. "TNKS 길항제", "TNKS 억제제" 등에는 본 발명의 화합물과 같은 악신 안정화제가 포함될 수 있다. TNKS 길항제는 바람직하게는 TNKS 단백질 또는 전사체 수준을 감소시키는 것에 의한 것이 아닌, TNKS 단백질의 촉매 활성 (예컨대 악신과 같은 표적 단백질을 파실레이팅하는(PARsylate) 그의 능력은 물론, 그의 자가파실레이팅(autoparsylate) 능력)을 감소시키거나 억제하는 것에 의해 작용한다. TNKS 길항제는 또한 Wnt 신호전달을 억제하는 것으로 생각되는데, 그 이유에는 악신이 Wnt 신호전달의 음성 조절인자이며, TNKS가 악신과 상호작용한다는 것 (예컨대, TNKS를 녹다운시키는 것은 악신 단백질 수준을 안정화하고 증가시킴)이 포함된다. TNKS 길항제는 포스포-β-카테닌을 증가시키고, 세포질 β-카테닌을 감소시키며, β-카테닌 siRNA와 유사한 방식으로 β-카테닌 표적 유전자에 충격을 준다.

본원에서 사용될 때의 "악신 안정화제"라는 용어는 악신의 안정성을 증가시킬 수 있는 제제를 의미한다. 이것은 β-카테닌의 가속화된 인산화, 및 분해로 이어진다. 악신-안정화제 역시 Wnt 신호전달을 억제하는 것으로 생각되는데, 그 이유에는 악신이 Wnt 신호전달의 음성 조절인자라는 것이 포함된다. 악신 안정화제 (예, 본 발명의 화합물 (예컨대 XAV939))는 세포 내에서 총 β-카테닌의 감소에 기여하나, 포스포-β-카테닌을 증가시키지는 않는다. 본 발명의 목적상, "악신"이라는 용어는 악신1 및 악신2에 대하여 호환가능하게 사용되며, 본 발명의 악신 안정화제는 악신1 및 악신2 모두의 단백질 수준을 안정화 및 증가시킬 수 있다. 또한, 본원에서 사용될 때의 "악신"은 인간, 마우스, 래트 또는 기타 종으로부터의 악신1 및/또는 악신2에 적용할 수 있다.

본원에서 사용될 때의 "악신-결합 단백질"이라는 용어는 정상 조건하에서 악신이 결합하는 (예를 들면, 직간접적으로 결합하거나, 그의 표적이거나, 그와 단백질 복합체를 형성하거나, 및/또는 그에 영향을 줌) Wnt 신호전달 경로의 단백질 구성원을 의미한다. 상기 악신-결합 단백질에는 GSK3, β-카테닌, APC, 및 디셰블드, PP1, PP2A, 카세인 키나제1, LRP5/6이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

"본 발명의 화합물"이라는 용어 및 유사 용어는, 본원에서 추가적으로 정의되는 바와 같이, 예컨대 악신을 안정화하기 위하여 (그리고 그에 의해 Wnt 경로 신호전달을 억제하기 위하여) 사용될 수 있는 화합물을 기술하기 위하여 본원에 사용된다. 상기 화합물에는 XAV939가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 화합물에는 다른 PARP들의 그것에 비해 TNKS1 및/또는 TNKS2의 촉매 활성을 우선적으로 억제하는 기타 소형 분자 PARP 억제제들이 포함될 수 있다.

본원에서 사용될 때의 "치유하다"는 치료를 통하여 장애, 예를 들면 Wnt 신호전달-관련 장애, 예컨대 골다공증, 정신분열증, 혈관 질환, 심장 질환, 또는 신경변성 질병의 경감을 초래하는 것을 의미한다.

"예방" 또는 "방지"라는 용어는 장애, 예컨대 Wnt 신호전달-관련 장애의 발병 또는 재발을 저지하는 것을 의미한다.

본원에서 사용될 때, "의학적 이상"이라는 용어에는 치료를 요하는 1종 이상의 신체적 및/또는 정신적 증상으로서 명시되는 소정의 이상 또는 질병이 포함되며, 이전에, 그리고 새롭게 확인된 질병 및 기타 장애들이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원에서 사용될 때, 대상 또는 환자에 대한 제제 또는 약물의 투여에는 자가-투여 및 제삼자에 의한 투여가 포함된다. 또한, 기술되는 바와 같은 의학적 이상의 치료 또는 예방의 다양한 양식들은 총체적인 것은 물론, 총체적인 것 미만의 치료 또는 예방이 포함되며, 소정의 생물학적 또는 의학적으로 의미 있는 결과가 달성되는, "실질적인" 것을 의미하고자 하는 것이라는 것을 알아야 한다.

본원에서 사용될 때, "조정하다"는 직간접적으로 조절하거나 영향을 주는 능력을 표시하며, 다르게 비제한적인 예를 들자면, 억제하거나 자극하는 것, 작용하거나 길항하는 것, 방해하거나 촉진하는 것, 및 강화시키거나 약화시키는 것을 의미할 수 있다.

본원에서 사용될 때, "소형 유기 분자" 또는 "소형 분자"는 3 킬로달톤 미만, 바람직하게는 1.5 킬로달톤 미만의 분자량을 가지는 유기 화합물 (또는 무기 화합물 (예, 금속)과 착물화된 유기 화합물)이다.

본원에서 사용될 때, 화합물의 "유효량"이라는 용어는 원하는 치료 및/또는 예방 효과를 달성하기에 충분한 양, 예를 들면 치료되는 질병, 예컨대 비정상적인 Wnt 신호전달과 관련된 장애의 예방 또는 그와 관련된 증상의 감소를 초래하는 양이다. 대상에게 투여되는 화합물의 양은 질병의 유형 및 중증도, 그리고 일반적인 건강, 연령,성, 체중 및 약물에 대한 내성과 같은 개체의 특성에 따라 달라지게 된다. 그것은 또한 질병의 정도, 중증도 및 유형에 따라 달라지게 된다. 숙련자라면, 이들 및 기타 요인에 따라 적절한 투약량을 결정할 수 있을 것이다. 통상적으로, 치료 또는 예방 효과를 달성하기에 충분한 본 발명 화합물의 유효량은 킬로그램 체중 당 하루 약 0.000001 mg 내지 킬로그램 체중 당 하루 약 10,000 mg의 범위이다. 바람직하게는, 상기 투약량 범위는 킬로그램 체중 당 하루 약 0.0001 mg 내지 킬로그램 체중 당 하루 약 100 mg이다. 본 발명의 화합물들은 또한 서로간의, 또는 1종 이상의 추가적인 치료 화합물과의 조합으로써 투여될 수 있다.

"대상"이라는 용어는 비정상적인 Wnt 신호전달과 관련된 질병, 장애 또는 이상으로 고통받거나 그에 걸릴 수 있는 생물체, 예컨대 원핵생물 및 진핵생물을 포함하고자 하는 것이다. 대상의 예에는 포유류, 예컨대 인간, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 마우스, 토끼, 래트, 및 유전자이전 비-인간 동물이 포함된다. 소정 구현예에서, 상기 대상은 인간, 예를 들면 암 (예, 결장암) 및 기타 증식성 질병, 골다공증, 및 정신분열증, 그리고 본원에서 기술되는 기타 질병 또는 이상 (예, Wnt 신호전달-관련 장애)에 걸리거나, 걸릴 위험성이 있거나, 또는 잠재적으로 걸릴 수 있는 인간이다. 또 다른 구현예에서, 상기 대상은 세포이다.

본원에서 사용될 때, "아릴"이라는 용어는 6 내지 14 고리 탄소 원자를 가지며 고리 헤테로원자는 가지지 않는 방향족 라디칼로 정의된다. 상기 아릴 기는 1고리형 또는 융합된 2고리형 또는 3고리형일 수 있다. 그것은 비치환이거나, 또는 하나 이상, 바람직하게는 하나 또는 2개의 치환체에 의해 치환될 수 있으며, 여기서 상기 치환체는 본원에서 기술되는 바와 같다. 본원에서 정의될 때, 상기 아릴 잔기는 그것이 1고리형인지 또는 2고리형인지에 관계없이 완전히 방향족일 수 있다. 그러나, 그것이 하나를 초과하는 고리를 함유하는 경우, 본원에서 정의될 때의 아릴이라는 용어에는 하나 이상의 고리는 완전히 방향족인 반면, 다른 고리(들)은 부분적으로 불포화 또는 포화이거나, 또는 완전히 방향족일 수 있는 잔기가 포함된다.

본원에서 사용될 때의 "Het"는 하나 이상의 S, O 또는 N 고리 헤테로원자를 함유하는 헤테로아릴 및 헤테로고리형 화합물을 지칭한다. 더 구체적으로, "Het"는 N, O 및 S에서 선택되는 1-4 헤테로원자를 함유하는 5-7원의 헤테로고리형 고리, 또는 N, O 및 S에서 선택되는 1, 2 또는 3 헤테로원자를 함유하는 하나 이상의 5-7원 헤테로고리형 고리를 포함하는 8-12원의 융합된 고리 시스템이다. 본원에서 사용될 때의 het의 예에는 비치환 및 치환의 피롤리딜, 테트라히드로퓨릴, 테트라히드로티오퓨릴, 피페리딜, 피레라질, 퓨리닐, 테트라히드로피라닐, 모르폴리노, 1,3-디아자파닐, 1,4-디아자파닐, 1,4-옥사제파닐, 1,4-옥사티아파닐, 퓨릴, 티에닐, 피릴, 피롤릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 인다졸릴, 옥사디아졸릴, 이미다졸릴, 피롤리딜, 피롤리디닐, 티아졸릴, 옥사졸릴, 피리딜, 피라졸릴, 피라지닐, 피리미디닐, 이속사졸릴, 피라지닐, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 피리도피라지닐, 피롤로피리딜, 퓨로피리딜, 인돌릴, 벤조퓨릴, 벤조티오퓨릴, 벤조인돌릴, 벤조티에닐, 피라졸릴, 피레리딜, 피페라지닐, 인돌리닐, 모르폴리닐, 벤즈옥사졸릴, 피롤로퀴놀릴, 피롤로[2,3-b]피리디닐, 벤조트리아졸릴, 옥소벤조-옥사졸릴, 벤코[1,3]디옥솔릴, 벤조이미다졸릴, 퀴놀리닐, 인다닐 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 헤테로아릴은 het의 정의 영역에 속한다. 헤테로아릴의 예로는 피리딜, 피리미디닐, 퀴놀릴, 티아졸릴 및 벤조티아졸릴이 있다. 가장 바람직한 het는 피리딜, 피리미디닐 및 티아졸릴이다. 상기 het는 본원에서 기술되는 바와 같이 치환되지 않거나, 또는 치환될 수 있다. 그것은 치환되지 않거나, 또는 치환되는 경우에는, 탄소 원자 상에서 할로겐, 특히 플루오르 또는 염소, 히드록시, C1-C4 알킬, 예컨대 메틸 및 에틸, C1-C4 알콕시, 특히 메톡시 및 에톡시, 니트로, -O-C(O)-C1-C4알킬 또는 -C(O)-O-C1-C4알킬, SCN 또는 니트로에 의해, 또는 질소 원자 상에서 C1-C4 알킬, 특히 메틸 또는 에틸, -O-C(O)-C1-C4알킬 또는 -C(O)-O-C1-C4알킬, 예컨대 카르보메톡시 또는 카르보에톡시에 의해 치환되는 것이 바람직하다.

2개의 치환체가 공통적으로 결합된 질소와 함께 het인 경우, 그것은 생성되는 헤테로고리형 고리가 질소-함유 고리, 예컨대 아지리딘, 아제티딘, 아졸, 피페리딘, 피페라진, 모르필린, 피롤, 피라졸, 티아졸, 옥사졸, 피리딘, 피리미딘, 이속사졸 등인 것으로 이해되며, 그와 같은 het는 치환되지 않거나, 상기 본원에서 정의된 바와 같이 치환될 수 있다.

할로는 할로겐으로서, 플루오르, 염소, 브롬 또는 요오드, 특히 플루오르 및 염소일 수 있다.

다르게 특정되지 않는 한, "알킬"이라는 용어에는 선형-사슬 알킬 기 (예, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실 등), 분지형-사슬 알킬 기 (이소프로필, tert-부틸, 이소부틸 등), 시클로알킬 (지환족) 기 (시클로프로필, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸), 알킬 치환 시클로알킬 기, 및 시클로알킬 치환 알킬 기를 포함한 포화 지방족 기가 포함된다. "알킬"이라는 용어에는 알케닐 기 및 알키닐 기도 포함된다. 또한, x는 1-5이며 y는 2-10인 경우의 "Cx-Cy-알킬"이라는 표현은 특정 탄소 범위의 특정 알킬 기 (선형- 또는 분지형-사슬)를 표시한다. 예를 들면, C1-C4-알킬이라는 표현에는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 이소프로필, tert-부틸, 그리고 이소부틸 및 sec-부틸이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, C3-7-시클로알킬이라는 용어에는 시클로프로필, 시클로펜틸, 시클로헥실 및 시클로헵틸이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 하기에 논의되는 바와 같이, 이러한 알킬 기들은 물론, 시클로알킬 기들은 추가적으로 치환될 수 있다.

알킬이라는 용어에는 추가적으로 탄화수소 골격의 하나 이상의 탄소를 대체하는 산소, 질소, 황 또는 인 원자를 추가 포함할 수 있는 알킬 기가 포함된다. 일 구현예에서, 선형 사슬 또는 분지형 사슬 알킬은 그의 골격 (예, 선형 사슬의 경우 C1-C10, 분지형 사슬의 경우 C3-C10)에 10 이하의 탄소 원자, 더욱 바람직하게는 6 이하의 탄소를 가진다. 마찬가지로, 바람직한 시클로알킬은 그의 고리 구조에 4-7 탄소 원자를 가지며, 더욱 바람직하게는 5 또는 6 탄소를 고리 구조에 가진다.

또한, 알킬 (예, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실 등)에는 "비치환 알킬" 및 "치환 알킬" 모두가 포함되며, 후자는 탄화수소 골격의 하나 이상의 탄소 상의 수소를 대체하는 치환체를 가지는 알킬 잔기를 지칭하는데, 그것은 분자가 그의 의도된 기능을 수행하도록 하여준다.

"시클로알킬" 기는 3 내지 10 고리 탄소 원자를 가지는 C3 내지 C10 시클로알킬을 의미하며, 예를 들면 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸 또는 시클로옥틸, 시클로노닐 등일 수 있다. 상기 시클로알킬 기는 1고리형 또는 융합된 2고리형일 수 있다. 또한, 바람직한 시클로알킬 기는 시클로펜틸 또는 시클로헥실이다. 가장 바람직하게는, 시클로알킬은 시클로헥실이다. 상기 시클로알킬 기는 완전히 포화이거나 부분적으로 불포화일 수 있지만, 완전히 포화인 것이 바람직하다. 본원에서 정의되는 바와 같이, 그것은 아릴 기는 배제한다. 상기 시클로알킬 기는 치환되지 않거나, 또는 하기에 정의되는 치환체, 바람직하게는 할로, 히드록시 또는 C1-C6 알킬 예컨대 메틸 중 어느 것으로 치환될 수 있다.

"치환된"이라는 용어는 분자 중 하나 이상의 원자, 예컨대 C, O 또는 N 상의 수소를 대체하는 치환체를 가지는 잔기를 기술하고자 하는 것이다. 그와 같은 치환체에는 전자-흡인 기 또는 전자-흡인 원자가 포함될 수 있다. 그와 같은 치환체에는 예를 들면 옥소, 알킬, 알콕시, 알케닐, 알키닐, 할로겐, 히드록실, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 알콕시카르보닐옥시, 아릴옥시카르보닐옥시, 카르복실레이트, 알킬카르보닐, 아릴카르보닐, 알콕시카르보닐, 아미노카르보닐, 알킬아미노카르보닐, 디알킬아미노카르보닐, 알킬티오카르보닐, 알콕실, 포스페이트, 포스포네이토, 포스피네이토, 아미노 (알킬 아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노, 및 알킬아릴아미노 포함), 아실아미노 (알킬카르보닐아미노, 아릴카르보닐아미노, 카르바모일 및 우레이도 포함), 아미디노, 이미노, 술피드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카르복실레이트, 술페이트, 알킬술피닐, 술포네이토, 술파모일, 술폰아미도, 니트로, 트리플루오로메틸, 시아노, 아지도, 헤테로고리, 알킬아릴, 모르폴리노, 페놀, 벤질, 페닐, 피페리진, 시클로펜탄, 시클로헥산, 피리딘, 5H-테트라졸, 트리아졸, 피페리딘, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 잔기, 및 이들의 소정의 조합이 포함될 수 있다.

비치환은 수소가 유일한 치환체임을 의미하고자 하는 것이다.

본원에서 기술되지 않는 한, 임의의 상기 정의된 아릴, het, 알킬, 알케닐, 알키닐, 또는 시클로알킬은 치환되지 않거나, 또는 하기로 구성되는 군에서 선택되는 4개 이하, 바람직하게는 1, 2 또는 3개의 치환체에 의해 독립적으로 치환될 수 있다: 할로 (예컨대 Cl 또는 Br); 히드록시; 저급 알킬 (예컨대 C1-C3 알킬); 본원에서 정의되는 임의의 치환체로 치환될 수 있는 저급 알킬; 저급 알케닐; 저급 알키닐; 저급 알카노일; 저급 알콕시 (예컨대 메톡시); 아릴 (예컨대 페닐 또는 나프틸); 치환된 아릴 (예컨대 플루오로 페닐 또는 메톡시 페닐); 아릴 저급 알킬 예컨대 벤질, 아미노, 모노 또는 디-저급 알킬 (예컨대 디메틸아미노); 저급 알카노일 아미노 아세틸아미노; 아미노 저급 알콕시 (예컨대 에톡시아민); 니트로; 시아노; 시아노 저급 알킬; 카르복시; 저급 카르브알콕시 (예컨대 메톡시 카르보닐, n-프로폭시 카르보닐 또는 이소-프로폭시 카르보닐); 저급 아릴로일, 예컨대 벤조일; 카르바모일; N-모노- 또는 N,N 디-저급 알킬 카르바모일; 저급 알킬 카르밤산 에스테르; 아미디노; 구아니딘; 우레이도; 메르캅토; 술포; 저급 알킬티오; 술포아미노; 술폰아미드; 벤조술폰아미드; 술포네이트; 술파닐 저급 알킬 (예컨대 메틸 술파닐); 술포아미노; 아릴 술폰아미드; 할로겐 치환 또는 비치환 아릴 술포네이트 (예컨대 클로로-페닐 술포네이트); 저급 알킬술피닐: 아릴술피닐; 아릴-저급 알킬술피닐; 저급 알킬아릴술피닐; 저급 알칸술포닐; 아릴술포닐; 아릴-저급 알킬술포닐; 저급 아릴 알킬; 저급 알킬아릴술포닐; 할로겐-저급 알킬메르캅토; 할로겐-저급 알킬술포닐, 예컨대 트리플루오로메탄 술포닐; 포스포노(-P(=O)(OH)2); 히드록시-저급알콕시 포스포릴 또는 디-저급 알콕시포스포릴; 요소 및 치환된 요소; 알킬 카르밤산 에스테르 또는 카르바메이트 (예컨대 에틸-N-페닐-카르바메이트); 또는 저급 알킬 (예, 메틸, 에틸 또는 프로필).

일 구현예에서, 상기 언급된 알킬, 시클로알킬, 및 아릴 기들은 독립적으로 치환되지 않거나, 또는 저급 알킬, 아릴, 아릴 저급 알킬, 카르복시,저급 카르브알콕시, 그리고 특히 할로겐, -OH, -SH, -OCH3, -SCH3, -CN, -SCN 또는 니트로에 의해 치환된다.

본원에서 정의될 때, 단독으로 또는 조합되어 사용되는 경우의 "저급 알킬"이라는 용어는 1-6 탄소 원자를 함유하는 알킬을 지칭한다. 상기 알킬 기는 분지형 또는 선형-사슬화될 수 있으며, 상기 본원에서 정의된 바와 같다.

"알케닐"이라는 용어는 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하는 히드로카르빌 기를 표시하며, 여기에는 상기한 알킬과 길이 및 가능한 치환이 유사한 불포화 지방족 기가 포함된다. 본원에서 정의될 때, 그것은 치환되지 않거나, 또는 본원에서 기술되는 치환체로 치환될 수 있다. 상기 탄소-탄소 이중 결합은 상기 알케닐 기의 임의의 2개의 탄소 원자 사이에 존재할 수 있다. 그것은 1 또는 2개의 탄소-탄소 이중 결합, 더욱 바람직하게는 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하는 것이 바람직하다. 상기 알케닐 기는 선형 사슬화 또는 분지화될 수 있다. 예에는 에테닐, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 2-메틸-1-프로페닐, 1,3-부타디에닐 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. "저급 알케닐"이라는 용어는 2-6 탄소 원자를 함유하는 알케닐 기를 지칭한다.

예를 들면, "알케닐"이라는 용어에는 선형-사슬 알케닐 기 (예, 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 펜테닐, 헥세닐, 헵테닐, 옥테닐, 노네닐, 데세닐 등), 분지형-사슬 알케닐 기, 시클로알케닐 (지환족) 기 (시클로프로페닐, 시클로펜테닐, 시클로헥세닐, 시클로헵테닐, 시클로옥테닐), 알킬 또는 알케닐 치환 시클로알케닐 기, 및 시클로알킬 또는 시클로알케닐 치환 알케닐 기가 포함된다. 알케닐이라는 용어에는 또한 탄화수소 골격의 하나 이상의 탄소를 대체하는 산소, 질소, 황 또는 인 원자를 포함하는 알케닐 기가 포함된다. 소정 구현예에서, 선형 사슬 또는 분지형 사슬 알케닐 기는 그의 골격 (예, 선형 사슬의 경우 C2-C6, 분지형 사슬의 경우 C3-C6)에 6 이하의 탄소 원자를 가진다. 마찬가지로, 시클로알케닐 기는 그의 고리 구조에 3-8 탄소 원자를 가질 수 있으며, 더욱 바람직하게는 5 또는 6 탄소를 고리 구조에 가진다. C2-C6이라는 용어에는 2 내지 6 탄소 원자를 함유하는 알케닐 기가 포함된다.

또한, 알케닐이라는 용어에는 "비치환 알케닐" 및 "치환 알케닐" 모두가 포함되는데, 후자는 탄화수소 골격의 하나 이상의 탄소 상의 수소를 대체하는 치환체를 가지는 알케닐 잔기를 지칭한다. 그와 같은 치환체에는 예를 들면 알킬 기, 알키닐 기, 할로겐, 히드록실, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 알콕시카르보닐옥시, 아릴옥시카르보닐옥시, 카르복실레이트, 알킬카르보닐, 아릴카르보닐, 알콕시카르보닐, 아미노카르보닐, 알킬아미노카르보닐, 디알킬아미노카르보닐, 알킬티오카르보닐, 알콕실, 포스페이트, 포스포네이토, 포스피네이토, 시아노, 아미노 (알킬 아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노, 및 알킬아릴아미노 포함), 아실아미노 (알킬카르보닐아미노, 아릴카르보닐아미노, 카르바모일 및 우레이도 포함), 아미디노, 이미노, 술피드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카르복실레이트, 술페이트, 알킬술피닐, 술포네이토, 술파모일, 술폰아미도, 니트로, 트리플루오로메틸, 시아노, 아지도, 헤테로시클릴, 알킬아릴, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 잔기가 포함될 수 있다.

본원에서 사용될 때, "아릴 알킬"이라는 용어는 가교 알킬렌 기에 의해 주 사슬에 연결되는 아릴 기를 지칭한다. 예에는 벤질, 페네틸, 나프틸메틸 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 유사하게, 시아노 알킬 기는 가교 알킬렌 기에 의해 주 사슬에 연결되는 시아노 기를 지칭한다.

반면, "알킬 아릴"이라는 용어는 페닐렌 기를 통하여 주 사슬에 가교되는 알킬 기를 지칭한다. 예에는 메틸페닐, 에틸페닐 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원에서 사용될 때, "알카노일"이라는 용어는 탄소 원자들 중 하나가 C=O 기에 의해 치환된 알킬 사슬을 지칭한다. 상기 C=O 기는 치환체의 단부들 중 하나에, 또는 잔기의 중앙에 존재할 수 있다. 예에는 포르밀, 아세틸, 2-프로파노일, 1-프로파노일 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

"저급 티오알킬"이라는 용어는 황 원자에 의해 주 사슬에 연결된 본원에서 정의되는 바와 같은 알킬 기를 지칭한다. 예에는 티오메틸 (또는 메르캅토 메틸), 티오에틸 (메르캅토 에틸) 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

"저급 카르브알콕시"라는 용어 또는 그의 동의어는 주 사슬에 대한 결합이 아릴 기 (C(O))를 통하는 알콕시카르보닐 기를 지칭한다. 예에는 메톡시 카르보닐, 에톡시 카르보닐 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

C(O)라는 용어는 그것이 케톤인지, 알데히드인지, 또는 산 또는 산 유도체인지에 관계없이 -C=O 기를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 유사하게, S(O)는 -S=O 기를 지칭한다.

"알키닐"이라는 용어에는 상기한 알킬과 길이 및 가능한 치환이 유사하나, 하나 이상의 삼중 결합을 함유하는 불포화 지방족 기가 포함된다.

예를 들면, "알키닐"이라는 용어에는 선형-사슬 알키닐 기 (예, 에티닐, 프로피닐, 부티닐, 펜티닐, 헥시닐, 헵티닐, 옥티닐, 노니닐, 데시닐 등), 분지형-사슬 알키닐 기, 및 시클로알킬 또는 시클로알케닐 치환 알키닐 기가 포함된다. 알키닐이라는 용어에는 또한 탄화수소 골격의 하나 이상의 탄소를 대체하는 산소, 질소, 황 또는 인 원자를 포함하는 알키닐 기가 포함된다. 소정 구현예에서, 선형 사슬 또는 분지형 사슬 알키닐 기는 그의 골격 (예, 선형 사슬의 경우 C2-C6, 분지형 사슬의 경우 C3-C6)에 6 이하의 탄소 원자를 가진다. C2-C6이라는 용어에는 2 내지 6 탄소 원자를 함유하는 알키닐 기가 포함된다.

또한, 알키닐이라는 용어에는 "비치환 알키닐" 및 "치환 알키닐" 모두가 포함되는데, 후자는 탄화수소 골격의 하나 이상의 탄소 상의 수소를 대체하는 치환체를 가지는 알키닐 잔기를 지칭한다. 그와 같은 치환체에는 예를 들면 알킬 기, 알키닐 기, 할로겐, 히드록실, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 알콕시카르보닐옥시, 아릴옥시카르보닐옥시, 카르복실레이트, 알킬카르보닐, 아릴카르보닐, 알콕시카르보닐, 아미노카르보닐, 알킬아미노카르보닐, 디알킬아미노카르보닐, 알킬티오카르보닐, 알콕실, 포스페이트, 포스포네이토, 포스피네이토, 시아노, 아미노 (알킬 아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노, 및 알킬아릴아미노 포함), 아실아미노 (알킬카르보닐아미노, 아릴카르보닐아미노, 카르바모일 및 우레이도 포함), 아미디노, 이미노, 술피드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카르복실레이트, 술페이트, 알킬술피닐, 술포네이토, 술파모일, 술폰아미도, 니트로, 트리플루오로메틸, 시아노, 아지도, 헤테로시클릴, 알킬아릴, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 잔기가 포함될 수 있다.

"아민" 또는 "아미노"라는 용어는 업계에서 일반적으로 이해되는 바와 같은 분자, 또는 잔기 또는 관능기 모두에 광범위하게 적용되며, 1차, 2차 또는 3차일 수 있는 것으로 이해되어야 한다. "아민" 또는 "아미노"라는 용어에는 질소 원자가 하나 이상의 탄소, 수소 또는 헤테로원자에 공유 결합되어 있는 화합물이 포함된다. 상기 용어에는 예를 들면 "알킬 아미노", "아릴아미노", "디아릴아미노", "알킬아릴아미노", "알킬아미노아릴", "아릴아미노알킬", "알카미노알킬", "아미드", "아미도", 및 "아미노카르보닐"이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. "알킬 아미노"라는 용어에는 질소가 하나 이상의 추가적인 알킬 기에 결합되어 있는 기 및 화합물이 포함된다. "디알킬 아미노"라는 용어에는 질소 원자가 2개 이상의 추가적인 알킬 기에 결합되어 있는 기가 포함된다. "아릴아미노" 및 "디아릴아미노"라는 용어에는 질소가 각각 하나 이상의 또는 2개 이상의 아릴 기에 결합되어 있는 기가 포함된다. "알킬아릴아미노", "알킬아미노아릴" 또는 "아릴아미노알킬"이라는 용어는 하나 이상의 알킬 기 및 하나 이상의 아릴 기에 결합되어 있는 아미노 기를 지칭한다. "알카미노알킬"이라는 용어는 역시 알킬 기에 결합되어 있는 질소 원자에 결합된 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 기를 지칭한다.

"아미드", "아미도" 또는 "아미노카르보닐"이라는 용어에는 카르보닐 또는 티오카르보닐 기의 탄소에 결합되어 있는 질소 원자를 함유하는 화합물 또는 잔기가 포함된다. 상기 용어에는 카르보닐 기에 결합된 아미노 기에 결합되어 있는 알킬, 알케닐, 아릴 또는 알키닐 기를 포함하는 "알카미노카르보닐" 또는 "알킬아미노카르보닐" 기가 포함된다. 여기에는 카르보닐 또는 티오카르보닐 기의 탄소에 결합되어 있는 아미노 기에 결합된 아릴 또는 헤테로아릴 잔기를 포함하는 아릴아미노카르보닐 및 아릴카르보닐아미노 기가 포함된다. "알킬아미노카르보닐", "알케닐아미노카르보닐", "알키닐아미노카르보닐", "아릴아미노카르보닐", "알킬카르보닐아미노", "알케닐카르보닐아미노", "알키닐카르보닐아미노", 및 "아릴카르보닐아미노"라는 용어들은 "아미드"라는 용어 내에 포함된다. 아미드에는 또한 요소 기 (아미노카르보닐아미노) 및 카르바메이트 (옥시카르보닐아미노)가 포함된다.

"아릴"이라는 용어에는 0 내지 4개의 헤테로 원자를 포함할 수 있는 5- 및 6-원의 단일-고리 방향족 기를 포함한 기들, 예를 들면 페닐, 피롤, 퓨란, 티오펜, 티아졸, 이소티아졸, 이미다졸, 트리아졸, 테트라졸, 피라졸, 옥사졸, 이속사졸, 피리딘, 피라진, 피리다진, 및 피리미딘 등이 포함된다. 또한, "아릴"이라는 용어에는 다고리형 아릴 기, 예를 들면 3고리형, 2고리형, 예컨대 나프탈렌, 벤즈옥사졸, 벤조디옥사졸, 벤조티아졸, 벤조이미다졸, 벤조티오펜, 메틸렌디옥시페닐, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 안트릴, 페난트릴, 나프트리딘, 인돌, 벤조퓨란, 퓨린, 벤조퓨란, 데아자퓨린, 또는 인돌리진이 포함된다.

고리 구조에 헤테로원자를 가지는 아릴 기는 "아릴헤테로고리", "헤테로고리", "헤테로아릴" 또는 "헤테로방향족"으로 지칭될 수도 있다. 상기 방향족 고리는 하나 이상의 고리 위치에서 상기한 바와 같은 치환체들, 예를 들자면 알킬, 할로겐, 히드록실, 알콕시, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 알콕시카르보닐옥시, 아릴옥시카르보닐옥시, 카르복실레이트, 알킬카르보닐, 알킬아미노카르보닐, 아랄킬아미노카르보닐, 알케닐아미노카르보닐, 알킬카르보닐, 아릴카르보닐, 아랄킬카르보닐, 알케닐카르보닐, 알콕시카르보닐, 아미노카르보닐, 알킬티오카르보닐, 포스페이트, 포스포네이토, 포스피네이토, 시아노, 아미노 (알킬 아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노, 및 알킬아릴아미노 포함), 아실아미노 (알킬카르보닐아미노, 아릴카르보닐아미노, 카르바모일 및 우레이도 포함), 아미디노, 이미노, 술피드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카르복실레이트, 술페이트, 알킬술피닐, 술포네이토, 술파모일, 술폰아미도, 니트로, 트리플루오로메틸, 시아노, 아지도, 헤테로시클릴, 알킬아릴, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 잔기로 치환될 수 있다. 아릴 기는 방향족이 아니어서 폴리고리 (예, 테트랄린)를 형성할 수 있는 지환족 또는 헤테로고리형 고리와 융합되거나 가교될 수도 있다.

본원에서 사용될 때의 "헤테로아릴"이라는 용어는 하나 이상의 고리가 방향족이며, O, N 및 S로 구성되는 군에서 선택되는 1 내지 4 헤테로원자를 함유하는, 각 고리 당 7 원자 이하의 안정한 1고리형 또는 2고리형 고리를 나타낸다. 본 정의의 영역에 속하는 헤테로아릴 기에는 하기가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다: 아크리디닐, 카르바졸릴, 신놀리닐, 퀴녹살리닐, 피라졸릴, 인돌릴, 벤조트리아졸릴, 퓨라닐, 티에닐, 벤조티에닐, 벤조퓨라닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 인돌릴, 피라지닐, 피리다지닐, 피리디닐, 피리미디닐, 피롤릴, 테트라히드로퀴놀린. 하기 헤테로고리의 정의에서와 같이, "헤테로아릴"은 임의의 질소-함유 헤테로아릴의 N-옥시드 유도체를 포함하는 것으로도 이해된다. 헤테로아릴 치환체가 2고리형이고, 하나의 고리가 비-방향족이거나 또는 헤테로원자를 함유하지 않는 경우에는, 결합이 각각 방향족 고리를 통하거나, 또는 헤테로원자 함유 고리를 통하는 것으로 이해된다.

본원에서 사용될 때의 "헤테로고리" 또는 "헤테로시클릴"이라는 용어는 O, N 및 S로 구성되는 군에서 선택되는 1 내지 4 헤테로원자를 함유하는 5- 내지 10-원의 방향족 또는 비방향족 헤테로고리를 의미하고자 하는 것이며, 여기에는 2고리형 기가 포함된다. 따라서, "헤테로시클릴"에는 상기 언급된 헤테로아릴은 물론, 그의 디히드로 및 테트라히드로 유사체가 포함된다. "헤테로시클릴"의 추가적인 예에는 하기가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다: 벤조이미다졸릴, 벤조퓨라닐, 벤조퓨라자닐, 벤조피라졸릴, 벤조트리아졸릴, 벤조티오페닐, 벤즈옥사졸릴, 카르바졸릴, 카르볼리닐, 신놀리닐, 퓨라닐, 이미다졸릴, 인돌리닐, 인돌릴, 인돌라지닐, 인다졸릴, 이소벤조퓨라닐, 이소인돌릴, 이소퀴놀릴, 이소티아졸릴, 이속사졸릴, 나프트피리디닐, 옥사디아졸릴, 옥사졸릴, 옥사졸린, 이속사졸린, 옥세타닐, 피라닐, 피라지닐, 피라졸릴, 피리다지닐, 피리도피리디닐, 피리다지닐, 피리딜, 피리미딜, 피롤릴, 퀴나졸리닐, 퀴놀릴, 퀴녹살리닐, 테트라히드로피라닐, 테트라졸릴, 테트라졸로피리딜, 티아디아졸릴, 티아졸릴, 티에닐, 트리아졸릴, 아제티디닐, 1,4-디옥사닐, 헥사히드로아제피닐, 피레라지닐, 피페리디닐, 피리딘-2-오닐, 피롤리디닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 디히드로벤조이미다졸릴, 디히드로벤조퓨라닐, 디히드로벤조티오페닐, 디히드로벤즈옥사졸릴, 디히드로퓨라닐, 디히드로이미다졸릴, 디히드로인돌릴, 디히드로이소옥사졸릴, 디히드로이소티아졸릴, 디히드로옥사디아졸릴, 디히드로옥사졸릴, 디히드로피라지닐, 디히드로피라졸릴, 디히드로피리디닐, 디히드로피리미디닐, 디히드로피롤릴, 디히드로퀴놀리닐, 디히드로테트라졸릴, 디히드로티아디아졸릴, 디히드로티아졸릴, 디히드로티에닐, 디히드로트리아졸릴, 디히드로아제티디닐, 메틸렌디옥시벤조일, 테트라히드로퓨라닐, 및 테트라히드로티에닐, 그리고 이들의 N-옥시드. 헤테로시클릴 치환체의 결합은 탄소 원자를 통하여, 또는 헤테로원자를 통하여 이루어질 수 있다.

"아실"이라는 용어에는 아실 라디칼 (CH3CO-) 또는 카르보닐 기를 함유하는 화합물 및 잔기가 포함된다. "치환 아실"이라는 용어에는 하나 이상의 수소 원자가 예를 들면 알킬 기, 알키닐 기, 할로겐, 히드록실, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 알콕시카르보닐옥시, 아릴옥시카르보닐옥시, 카르복실레이트, 알킬카르보닐, 아릴카르보닐, 알콕시카르보닐, 아미노카르보닐, 알킬아미노카르보닐, 디알킬아미노카르보닐, 알킬티오카르보닐, 알콕실, 포스페이트, 포스포네이토, 포스피네이토, 시아노, 아미노 (알킬 아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노, 및 알킬아릴아미노 포함), 아실아미노 (알킬카르보닐아미노, 아릴카르보닐아미노, 카르바모일 및 우레이도 포함), 아미디노, 이미노, 술피드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카르복실레이트, 술페이트, 알킬술피닐, 술포네이토, 술파모일, 술폰아미도, 니트로, 트리플루오로메틸, 시아노, 아지도, 헤테로시클릴, 알킬아릴, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 잔기에 의해 치환된 아실 기가 포함된다.

"아실아미노"라는 용어에는 아실 잔기가 아미노 기에 결합되어 있는 잔기가 포함된다. 예를 들면, 상기 용어에는 알킬카르보닐아미노, 아릴카르보닐아미노, 카르바모일 및 우레이도 기가 포함된다.

"알콕시"라는 용어에는 산소 원자에 공유 결합된 치환 및 비치환의 알킬, 알케닐, 및 알키닐 기가 포함된다. 알콕시 기의 예에는 메톡시, 에톡시, 이소프로필옥시, 프로폭시, 부톡시, 및 펜톡시 기가 포함되며, 시클로펜톡시와 같은 고리형 기가 포함될 수 있다. 치환된 알콕시 기의 예에는 할로겐화 알콕시 기가 포함된다. 상기 알콕시 기는 알케닐, 알키닐, 할로겐, 히드록실, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 알콕시카르보닐옥시, 아릴옥시카르보닐옥시, 카르복실레이트, 알킬카르보닐, 아릴카르보닐, 알콕시카르보닐, 아미노카르보닐, 알킬아미노카르보닐, 디알킬아미노카르보닐, 알킬티오카르보닐, 알콕실, 포스페이트, 포스포네이토, 포스피네이토, 시아노, 아미노 (알킬 아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노, 및 알킬아릴아미노 포함), 아실아미노 (알킬카르보닐아미노, 아릴카르보닐아미노, 카르바모일 및 우레이도 포함), 아미디노, 이미노, 술피드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카르복실레이트, 술페이트, 알킬술피닐, 술포네이토, 술파모일, 술폰아미도, 니트로, 트리플루오로메틸, 시아노, 아지도, 헤테로시클릴, 알킬아릴, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 잔기와 같은 기에 의해 치환될 수 있다. 할로겐 치환 알콕시 기의 예에는 플루오로메톡시, 디플루오로메톡시, 트리플루오로메톡시, 클로로메톡시, 디클로로메톡시, 트리클로로메톡시 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

"카르보닐" 또는 "카르복시"라는 용어에는 이중 결합에 의해 산소 원자에 연결되어 있는 탄소를 함유하는 화합물 및 잔기, 그리고 그의 호변이성질체 형태가 포함된다. 카르보닐을 함유하는 잔기의 예에는 알데히드, 케톤, 카르복실산, 아미드, 에스테르, 무수물 등이 포함된다. "카르복시 잔기" 또는 "카르보닐 잔기"라는 용어는 알킬 기가 카르보닐 기에 공유 결합되어 있는 "알킬카르보닐" 기, 알케닐 기가 카르보닐 기에 공유 결합되어 있는 "알케닐카르보닐" 기, 알키닐 기가 카르보닐 기에 공유 결합되어 있는 "알키닐카르보닐" 기, 아릴 기가 카르보닐 기에 공유 결합되어 있는 "아릴카르보닐" 기와 같은 기들을 지칭한다. 또한, 상기 용어는 하나 이상의 헤테로원자가 카르보닐 잔기에 공유 결합되어 있는 기들도 지칭한다. 예를 들면, 상기 용어에는 예컨대 아미노카르보닐 잔기 (여기에서는 질소 원자가 카르보닐 기의 탄소에 결합되어 있음, 예, 아미드), 산소 및 질소 원자가 모두 카르보닐 기의 탄소에 결합되어 있는 아미노카르보닐옥시 잔기 (예, "카르바메이트"로도 지칭됨)과 같은 잔기들이 포함된다. 또한, 아미노카르보닐아미노 기 (예, 요소) 역시 헤테로원자 (예, 질소, 산소, 황 등은 물론, 탄소 원자)에 결합된 카르보닐 기의 기타 조합들과 마찬가지로 포함된다. 또한, 상기 헤테로원자는 하나 이상의 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아랄킬, 아실 등의 잔기로 추가 치환될 수 있다.

"티오카르보닐" 또는 "티오카르복시"라는 용어에는 이중 결합에 의해 황 원자에 연결되어 있는 탄소를 함유하는 화합물 및 잔기가 포함된다. "티오카르보닐 잔기"라는 용어에는 카르보닐 잔기와 유사한 잔기가 포함된다. 예를 들면, "티오카르보닐" 잔기에는 아미노 기가 티오카르보닐 기의 탄소 원자에 결합되어 있는 아미노티오카르보닐이 포함되며, 또한 다른 티오카르보닐 잔기에는 옥시티오카르보닐 (산소가 탄소 원자에 결합됨), 아미노티오카르보닐아미노 기 등이 포함된다.

"에테르"라는 용어에는 2개의 서로 다른 탄소 원자 또는 헤테로원자에 결합되어 있는 산소를 함유하는 화합물 또는 잔기가 포함된다. 예를 들면, 상기 용어에는 또 다른 알킬 기에 공유 결합되어 있는 산소 원자에 공유 결합된 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 기를 지칭하는 "알콕시알킬"이 포함된다.

"에스테르"라는 용어에는 카르보닐 기의 탄소에 결합되어 있는 산소 원자에 결합된 탄소 또는 헤테로원자를 함유하는 화합물 및 잔기가 포함된다. "에스테르"라는 용어에는 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐, 프로폭시카르보닐, 부톡시카르보닐, 펜톡시카르보닐 등과 같은 알콕시카르복시 기가 포함된다. 상기 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 기는 상기 정의된 바와 같다.

"티오에테르"라는 용어에는 2개의 서로 다른 탄소 또는 헤테로원자에 결합되어 있는 황 원자를 함유하는 화합물 및 잔기가 포함된다. 티오에테르의 예에는 알크티오알킬, 알크티오알케닐, 및 알크티오알키닐이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. "알크티오알킬"이라는 용어에는 알킬 기에 결합되어 있는 황 원자에 결합된 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 기를 가지는 화합물이 포함된다. 유사하게, "알크티오알케닐" 및 "알크티오알키닐"이라는 용어는 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 기가 알키닐 기에 공유 결합되어 있는 황 원자에 결합되는 화합물 또는 잔기를 지칭한다.

"히드록시" 또는 "히드록실"이라는 용어에는 -OH 또는 -O-를 가지는 기가 포함된다.

"할로겐"이라는 용어에는 플루오르, 브롬, 염소, 요오드 등이 포함된다. "퍼할로겐화"라는 용어는 일반적으로 모든 수소가 할로겐 원자에 의해 치환된 잔기를 지칭한다.

"폴리시클릴" 또는 "폴리고리형 라디칼"이라는 용어에는 2 이상의 탄소가 2개의 인접한 고리에 공통되는 2개 이상의 고리를 가지는 잔기 (예, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알키닐, 아릴 및/또는 헤테로시클릴)가 포함되는데, 예를 들면 상기 고리는 "융합된 고리"이다. 비-인접 원자를 통하여 결합되는 고리들은 "가교된" 고리로 지칭된다. 폴리고리의 고리들 각각은 상기한 바와 같은 치환체들, 예를 들자면 할로겐, 히드록실, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 알콕시카르보닐옥시, 아릴옥시카르보닐옥시, 카르복실레이트, 알킬카르보닐, 알콕시카르보닐, 알킬아미노카르보닐, 아랄킬아미노카르보닐, 알케닐아미노카르보닐, 알킬카르보닐, 아릴카르보닐, 아랄킬카르보닐, 알케닐카르보닐, 아미노카르보닐, 알킬티오카르보닐, 알콕실, 포스페이트, 포스포네이토, 포스피네이토, 시아노, 아미노 (알킬 아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노, 및 알킬아릴아미노 포함), 아실아미노 (알킬카르보닐아미노, 아릴카르보닐아미노, 카르바모일 및 우레이도 포함), 아미디노, 이미노, 술피드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카르복실레이트, 술페이트, 알킬술피닐, 술포네이토, 술파모일, 술폰아미도, 니트로, 트리플루오로메틸, 시아노, 아지도, 헤테로시클릴, 알킬, 알킬아릴, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 잔기로 치환될 수 있다.

"헤테로원자"라는 용어에는 탄소 또는 수소가 아닌 다른 소정 원소의 원자가 포함된다. 바람직한 헤테로원자는 질소, 산소, 황 및 인이다.

"전자-흡인 기" 또는 "전자-흡인 원자"라는 용어는 업계에 인식되어 있으며, 이웃하는 원자로부터 원자가 전자를 끌어당기는 치환체의 경향, 즉 치환체가 이웃하는 원자와 관련하여 전기음성적이라는 것을 나타낸다. 전자-흡인 능력 수준의 정량은 하메트(Hammett) 시그마(Σ) 상수에 의해 제공된다. 잘 알려져 있는 상기 상수에 대해서는 많은 참조문헌, 예를 들면 문헌 [J. March, Advanced Organic Chemistry, McGraw Hill Book Company, New York, (1977 edition) pp. 251-259]에 기술되어 있다. 상기 하메트 상수 값은 일반적으로 전자 공여 기에 대해서는 음이고 (NH2의 경우 Σ[P]=-0.66), 전자 흡인 기에 대해서는 양이며 (니트로 기의 경우 Σ[P]=0.78), 여기서 Σ[P]는 파라 치환을 표시한다. 전자-흡인 기의 비제한적인 예에는 니트로, 아실, 포르밀, 술포닐, 트리플루오로메틸, 시아노, 염화물, 카르보닐, 티오카르보닐, 에스테르, 이미노, 아미도, 카르복실산, 술폰산, 술핀산, 술팜산, 포스폰산, 보론산, 술페이트 에스테르, 히드록실, 메르캅토, 시아노, 시아네이트, 티오시아네이트, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 카르보네이트, 니트레이트 및 니트로 기 등이 포함된다. 대표적인 전자-흡인 원자에는 산소 원자, 질소 원자, 황 원자 또는 할로겐 원자, 예컨대 플루오르, 염소, 브롬 또는 요오드 원자가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다르게 표시되지 않는 한, 산성 관능기에 대한 본원에서의 언급은 적합한 양이온과 조합된 그 관능기의 염 역시 포괄하는 것으로 이해되어야 한다.

추가적으로, "이들의 소정의 조합"이라는 구는 임의 개수의 열거된 관능기 및 분자들이 조합되어 더 큰 분자 구조를 생성시킬 수 있음을 의미한다. 예를 들면, 상기 용어 "페닐", "카르보닐" (또는 "=O"), "-O-", "-OH", 및 C1-6 (즉, -CH3 및 -CH2CH2CH2-)은 조합되어 3-메톡시-4-프로폭시벤조산 치환체를 형성할 수 있다. 더 큰 분자 구조를 생성시키기 위하여 관능기 및 분자들을 조합할 때에는, 각 원자의 원자가를 충족시키기 위하여 필요에 따라 수소가 제거되거나 첨가될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

본원 개시의 기술내용은 화학 결합의 법칙 및 원리와 일치시켜 해석되어야 한다. 예를 들어, 임의의 주어진 위치에 치환체를 수용하기 위해서는 수소 원자를 제거하는 것이 필요할 수 있다. 또한, 변수 (즉, "R 기")의 정의는 물론, 본 발명 일반 화학식 (예, 화학식 I 또는 II)의 결합 위치는 업계에 알려져 있는 화학 결합의 법칙과 일치하게 된다는 것이 이해되어야 한다. 상기한 모든 본 발명의 화합물들은 각 원자의 원자가를 충족시키기 위하여 필요에 따라 인접 원자들 및/또는 수소들 사이에 추가적으로 결합을 포함하게 된다는 것 역시 이해되어야 한다. 다시 말하면, 하기 유형의 원자 각각에 하기의 총 결합 수를 제공하도록, 결합 및/또는 수소 원자가 첨가된다: 탄소: 4 결합; 질소: 3 결합; 산소: 2 결합; 그리고 황: 2-6 결합.

본 발명 일부 화합물의 구조는 비대칭 탄소 원자를 포함한다는 것을 알게 될 것이다. 따라서, 그와 같은 비대칭성으로부터 야기되는 이성질체들 (예, 모든 거울상이성질체, 입체이성질체, 회전이성질체, 호변이성질체, 부분입체이성질체, 또는 라세미체)은 본 발명의 영역 내에 포함된다는 것이 이해되어야 한다. 그와 같은 이성질체들은 전통적인 분리 기술에 의해, 그리고 입체화학적으로 조절되는 합성에 의해 실질적으로 순수한 형태로 수득될 수 있다. 또한, 본 출원에서 논의되는 구조 및 기타 화합물 및 잔기들은 그의 모든 호변이성질체 역시 포함한다. 본원에서 기술되는 화합물들은 업계에 인식되어 있는 합성 전략을 통하여 수득될 수 있다.

본 발명 일부 화합물의 치환체가 이성질체형의 고리형 구조를 포함한다는 것 역시 알게 될 것이다. 따라서, 다르게 표시되지 않는 한, 특정 치환체의 구조 이성질체들은 본 발명의 영역 내에 포함된다는 것이 이해되어야 한다. 예를 들면, "테트라졸"이라는 용어에는 테트라졸, 2H-테트라졸, 3H-테트라졸, 4H-테트라졸 및 5H-테트라졸이 포함된다.

본 명세서에서 사용될 때의 소정 용어들의 정의가 하기에 제공된다. 기타 용어들에 대한 정의는 U.S. 에너지성 과학국 인간 게놈 프로젝트(Department of Energy, Office of Science, Human Genome Project)에서 제공되는 용어집에서 찾을 수 있다. 본 발명의 실행시에는, 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA의 많은 통상적인 기술들이 사용된다. 이러한 기술들에 대해서는 잘 알려져 있으며, 예를 들면 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology , Vols. I-III, Ausubel, ed. (1997)]; [Sambrook et al ., Molecular Cloning : A Laboratory Manual , Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)]; [DNA Cloning : A Practical Approach , Vols. I and II, Glover D, ed. (1985)]; [Oligonucleotide Synthesis , Gait, ed. (1984)]; [Nucleic Acid Hybridization , Hames & Higgins, Eds. (1985)]; [Transcription and Translation , Hames & Higgins, eds. (1984)]; [Animal Cell Culture , Freshney, ed. (1986)]; [Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986)]; [Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning; (연속 간행물), Methods in Enzymol . (Academic Press, Inc., 1984)]; [Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells , Miller and Calos, Eds. (Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1987)]; 및 [Methods in Enzymology , Vols. 154 and 155, Wu and Grossman, and Wu, Eds.]에 각각 설명되어 있다.

본원에서 사용될 때, "리포터" 유전자는 "마커 유전자"라는 용어와 호환가능하게 사용되며, 용이하게 검출가능하거나, 및/또는 루시퍼라제와 같이 용이하게 검출가능한 유전자 생성물을 코딩하고 있는 핵산이다.

전사 및 해독 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 터미네이터 등과 같은 DNA 조절 서열로서, 숙주 세포에서의 코딩 서열의 발현을 보조한다. 진핵 세포에서는, 폴리아데닐화 신호가 조절 서열이다.

"프로모터 서열"은 세포 내에서 RNA 폴리머라제에 결합하여 하류 (3' 방향) 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 본 발명을 한정하자면, 상기 프로모터 서열에는 3' 말단에 전사 개시 부위가 결합되며, 배경값을 초과하여 검출가능한 수준으로 전사를 개시하는 데에 필요한 최소 수의 염기 또는 요소를 포함하도록 상류 (5' 방향)로 연장된다. 프로모터 서열 내에서는, 전사 개시 부위는 (통상적으로는, 예를 들어 뉴클레아제 S1을 사용한 매핑(mapping)에 의해 한정됨) 물론, RNA 폴리머라제의 결합을 초래하는 단백질 결합 도메인 (공통 서열)을 찾을 수 있다.

세포 내에서, RNA 폴리머라제가 코딩 서열을 mRNA (다음에 트랜스-RNA 스플라이싱된(spliced) 후, 코딩 서열에 의해 코딩되어 있는 단백질로 해독됨)로 전사할 때, 코딩 서열은 전사 및 해독 조절 서열의 "조절하에" 있다.

"제약상 허용되는"이라는 구는 생리학적으로 허용되며, 통상적으로 인간에게 투여되었을 때 위장 전도(gastric upset), 어지럼증 등과 같은 알러지 또는 유사 부적절 반응을 일으키지 않는 분자체 및 조성물을 지칭한다. 바람직하게는, 본원에서 사용될 때, "제약상 허용되는"이라는 용어는 연방 또는 주 정부의 관리 기관에 의해 승인되었거나, 또는 U.S. 약전 또는 기타 일반적으로 인식되어 있는 약전에 동물, 더욱 구체적으로는 인간에서 사용하도록 열거되어 있다는 것을 의미한다.

"담체"라는 용어는 화합물이 그와 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 운반체를 지칭한다. 그와 같은 제약 담체는 멸균 액체, 예컨대 물, 그리고 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들을 포함한 오일, 예컨대 땅콩 오일, 대두 오일, 무기 오일, 참깨 오일 등일 수 있다. 바람직하게는, 물 또는 식염수 수용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 특히 주사가능 용액용의 담체로서 사용된다. 적합한 제약 담체에 대해서는 E.W. 마틴(Martin)의 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences"]에 기술되어 있다.

본원에서 "치료적 유효량" 및 "유효량"이라는 구는 임상적으로 유의성 있는 숙주 활성, 기능 및 응답의 결핍을, 약 15 ％ 이상, 바람직하게는 50 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상 감소시키고, 가장 바람직하게는 그것을 예방하기에 충분한 양을 의미하기 위하여 사용된다. 다르게는, 치료적 유효량은 임상적으로 유의성 있는 숙주 이상/증상의 개선을 야기하기에 충분하다.

"제제"는, 모두 본 발명에 따른, 제약 조성물 및 진단 조성물을 제조하는 데에 사용될 수 있거나, 또는 그와 같은 목적에 독립적으로 사용될 수 있는 화합물, 핵산 (shRNA, RNAi 등과 같은 억제성 핵산 포함), 소형 분자, 폴리펩티드, 단편, 동형, 변이체, 또는 기타 물질일 수 있는 모든 물질을 지칭한다.

본원에서 사용될 때의 "조정제"는 악신 안정화를 증강하거나 감소시키고, 그에 의해 Wnt 신호전달에 영향을 줄 수 있는, 비제한적으로 약물, 화합물, 단백질 또는 펩티드를 포함한 임의의 물질일 수 있다. 상기 조정제는 그것이 Wnt 신호전달을 증강 또는 억제할 수 있는 방식으로 악신과 직간접적으로 상호작용할 수 있다.

"유도체"는 아미노산 잔기 치환, 삭제 또는 첨가의 도입에 의해 변경된 모 단백질 또는 모 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 화합물, 단백질 또는 폴리펩티드 중 어느 것, 또는 뉴클레오티드 치환 또는 삭제, 첨가 또는 돌연변이 중 어느 것의 도입에 의해 변형된 핵산 또는 뉴클레오티드를 지칭한다. 유도체 핵산, 뉴클레오티드, 단백질 또는 폴리펩티드는 모 폴리펩티드와 유사하거나 동일한 기능을 보유한다.

본원에서 사용될 때의 "이중-가닥 RNA" 또는 "dsRNA"라는 용어는 2개의 반대-평행성(anti-parallel)이며 실질적으로 상보성인 상기 정의된 바와 같은 핵산 가닥을 포함하는 이중 구조를 가지는 리보핵산 분자의 복합체를 지칭한다. 이중 구조를 형성하는 상기 2개의 가닥은 하나의 더 큰 RNA 분자의 서로 다른 부분일 수 있거나, 또는 별도의 RNA 분자일 수 있다. 별도 RNA 분자의 경우, 그와 같은 siRNA는 종종 문헌에서 siRNA ("짧은 방해 RNA")로 지칭된다. 상기 2개의 가닥이 하나의 더 큰 분자의 일부이며, 그에 따라 하나의 가닥의 3'-말단과 이중 구조를 형성하는 다른 하나의 해당 가닥의 5'-말단 사이의 연속되는 뉴클레오티드 사슬에 의해 연결되는 경우, 연결 RNA 사슬은 "헤어핀 루프", "짧은 헤어핀 RNA" 또는 "shRNA"로 지칭된다. 상기 2개의 가닥이 하나의 가닥의 3'-말단과 이중 구조를 형성하는 다른 하나의 해당 가닥의 5'-말단 사이의 연속되는 뉴클레오티드 사슬이 아닌 다른 수단에 의해 공유적으로 연결되는 경우, 상기 연결구조는 "링커"로 지칭된다. 상기 RNA 가닥들은 동일하거나 상이한 수의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 최대 염기 쌍 수는 가장 짧은 siRNA 가닥의 뉴클레오티드 수 빼기 이중체에 존재하는 모든 돌출부(overhang)이다. 이중 구조 이외에도, siRNA는 하나 이상의 뉴클레오티드 돌출부를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용될 때, "siRNA"는 다수 뉴클레오티드에서의 실질적인 변형(modification)을 포함하고, 본원에서 개시되거나 업계에 알려져 있는 모든 유형의 변형을 포함하여, 리보뉴클레오티드에 대한 화학적 변형을 포함할 수 있다. siRNA 유형의 분자에 사용될 때, 그와 같은 소정의 변형은 본 명세서 및 청구항의 목적상 "siRNA"에 포괄된다.

본원에서 사용될 때, "뉴클레오티드 돌출부"는 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드, 또는 siRNA의 하나의 가닥의 3'-말단이 다른 하나의 가닥의 5'-말단을 넘어 연장되거나 그 반대의 경우에 siRNA의 이중 구조로부터 돌출되는 뉴클레오티드를 지칭한다. "블런트(blunt)" 또는 "블런트 말단"은 siRNA의 해당 말단에 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드가 존재하지 않는 것, 즉 뉴클레오티드 돌출부가 없음을 의미한다. "블런트 말단의" siRNA는 그의 전체 길이에 걸쳐 이중-가닥인, 즉 분자의 어느 말단에도 뉴클레오티드 돌출부가 없는 siRNA이다. 분명히 하자면, siRNA의 3' 말단 또는 5' 말단에 접합된 화학적 캡(cap) 또는 비-뉴클레오티드의 화학적 잔기는 siRNA가 돌출부를 가지는지 또는 블런트 말단인지를 결정하는 데에 고려되지 않는다.

"안티센스(antisense) 가닥"이라는 용어는 표적 서열에 대하여 실질적으로 상보성인 영역을 포함하는 siRNA의 가닥을 지칭한다. 본원에서 사용될 때, "상보성 영역"이라는 용어는 서열, 예를 들면 본원에서 정의되는 바와 같은 표적 서열에 대하여 실질적으로 상보성인 안티센스 가닥 상의 영역을 지칭한다. 상보성 영역이 표적 서열에 대하여 완전히 상보성이 아닌 경우, 상기 불일치는 말단 영역에서 가장 내성이므로, 존재하는 경우에는 일반적으로 말단 영역 또는 영역들, 예를 들면 5' 및/또는 3' 말단의 6, 5, 4, 3, 또는 2 뉴클레오티드 이내에 있다.

본원에서 사용될 때의 "센스(sense) 가닥"이라는 용어는 안티센스 가닥의 영역에 대하여 실질적으로 상보성인 영역을 포함하는 siRNA의 가닥을 지칭한다.

siRNA를 언급할 때, "세포에 도입하는 것"은 업계 숙련자가 이해하고 있는 바와 같은 세포로의 흡입 또는 흡수를 촉진하는 것을 의미한다. siRNA의 흡수 또는 흡입은 자체적인 확산성 또는 능동성의 세포 과정을 통하여, 또는 보조제 또는 보조 장치에 의해 이루어질 수 있다. 이와 같은 용어의 의미가 생체외의 세포로 제한되는 것은 아니어서; 해당 세포가 살아있는 생물체의 일부인 경우에 siRNA가 "세포에 도입될" 수도 있다. 그와 같은 경우, 세포로의 도입은 해당 생물체로의 전달(delivery)을 포함하게 된다. 예를 들어 생체내 전달을 위해서는, siRNA가 조직 부위로 주사되거나 전신적으로 투여될 수 있다. 세포로의 생체외 도입에는 전기영동 및 리포펙션(lipofection)과 같이 업계에 알려져 있는 방법들이 포함된다.

"결합"이라는 용어는 구성요소 (예, 악신 단백질)의 또 다른 구성요소 (예, 악신-관련 단백질)와의 물리적 회합을 지칭한다. 결합의 측정은 해리 상수, 결합 상수, 가동률(on-rate) 또는 비가동률(off-rate)과 같은 값으로 이어질 수 있다.

본원에서 사용될 때, "결합을 가능케 하는 조건"이라는 용어는 예를 들면, 결합이 발생하게 될 온도, 염 농도, pH 및 단백질 농도의 조건들을 지칭한다. 정확한 결합 조건은 분석의 특성, 예를 들면 분석이 순수한 단백질 또는 부분적으로만 정제된 단백질을 사용하였는지 여부에 따라 달라지게 된다. 결합을 위한 온도는 15 ℃ 내지 37 ℃로 변화할 수 있으나, 바람직하게는 실온 내지 약 30 ℃ 사이일 것이다. 결합 반응에서의 악신의 농도 역시 변화하게 되나, 바람직하게는 약 10 pM 내지 10 nM (예컨대 방사성 표지된 성분을 사용한 반응에서)일 것이다.

상기 용어가 본원에서 사용될 때, 그것이 1 mM 이하, 일반적으로는 100 nM 내지 10 pM 범위의 Kd로 이루어지는 경우라면, 결합은 "특이적"이다. 예를 들면, 상기 Kd가 100 nM, 50 nM, 10 nM, 1 nM, 950 pM, 900 pM, 850 pM, 800 pM, 750 pM, 700 pM, 650 pM, 600 pM, 550 pM, 500 pM, 450 pM, 350 pM, 300 pM, 250 pM, 200 pM, 150 pM, 100 pM, 75 pM, 50 pM, 25 pM, 10 pM 이하인 경우에, 결합은 특이적이다.

본원에서 사용될 때, "발현"은 하기 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다: 유전자의 전구체 mRNA로의 전사; 성숙한 mRNA를 생성시키기 위한 전구체 mRNA의 스플라이싱 및 기타 프로세싱; mRNA 안정성; 성숙한 mRNA의 단백질로의 해독 (코돈 용법(codon usage) 및 tRNA 가용성 포함); 및 필요에 따라 적절한 발현 및 기능을 위한 해독 생성물의 글리코실화 및/또는 기타 변형.

본원에서 사용될 때, "돌연변이(mutant)"이라는 용어는 돌연변이, 예를 들면 단일 뉴클레오티드 다형(single nucleotide polymorphism) ("SNP")의 결과인 야생형으로부터의 임의의 유전성 변이를 의미한다. "돌연변이"이라는 용어는 명세서 전체에 걸쳐 "마커", "생체지표" 및 "표적"이라는 용어와 호환가능하게 사용된다.

Wnt 신호 전달 경로

Wnt 유전자 족은 Int1/Wnt1 원형-종양유전자, 및 초파리 Wnt1 동족인 초파리 윙리스 ("Wg")와 관련된 대형 군의 분비 단백질들을 코딩하고 있다 (문헌 [Cadigan et al. (1997) Genes & Development 11: 3286-3305]). Wnt는 다양한 조직 및 장기에서 발현되며, 초파리에서의 분할; C. 엘레강스에서의 내배엽 발달; 및 포유류에서의 사지 극성의 확립, 신경 능선 분화, 신장 형태형성, 성 결정, 및 뇌 발달을 포함한 많은 발생 과정들에 필요하다 (문헌 [Parr, et al. (1994) Curr. Opinion Genetics & Devel. 4: 523-528]). Wnt 경로는 배아형성 동안 및 성숙 생물체 모두에 있어서 동물 발생의 주요 조절인자이다 (문헌 [Eastman, et al. (1999) Curr Opin Cell Biol 11: 233-240]; [Peifer, et al. (2000) Science 287: 1606-1609]).

Wnt 신호는 프리즐드 ("Fz") 족의 7개 막횡단 도메인 수용체에 의해 전달된다 (문헌 [Bhanot et al. (1996) Nature 382: 225-230]). Wnt 리간드는 Fzd에 결합하며, 그렇게 함으로써 세포질 단백질인 디셰블드 (인간 및 마우스의 Dvl-1, 2 및 3) (문헌 [Boutros, et al. (1999) Mech Dev 83: 27-37])를 활성화하고, LRP5/6을 인산화한다. 그에 의해 아르마딜로/β(베타)-카테닌의 인산화 및 분해를 방지하는 신호가 발생되고, 다시 β-카테닌의 안정화로 이어진다 (문헌 [Perrimon (1994) Cell 76: 781-784]). 이와 같은 안정화는 GSK3, APC, CK1, 및 β-카테닌을 포함한 다양한 단백질들을 모아 β-카테닌 파괴 복합체를 형성하는 골격 단백질인 악신 (문헌 [Zeng et al. (1997) Cell 90: 181-192])과의 Dvl의 회합에 의해 야기된다. 진화상 보전된 기본적인 Wnt/β-카테닌 신호 전달 연쇄단계는 많은 후생동물 발생 양상들을 조절한다. 전후관계-의존성인 경로의 활성화는 배아 세포 운명 결정, 줄기 세포 조절 및 조직 항상성1과 연관되어 있다. Wnt/β-카테닌 경로의 핵심적인 특징은 β-카테닌 파괴 복합체에 의한 하류 유효인자(effector) β-카테닌의 조절되는 단백질분해이다. β-카테닌 파괴 복합체의 주요 구성요소는 선종성 결장 폴립증 (APC), 악신, 및 GSK3α/β이다. Wnt 경로 활성화 부재시에는, 세포질 β-카테닌이 구성적으로 인산화됨으로써, 분해를 위한 표적이 된다. Wnt 자극시에는, β-카테닌 파괴 복합체가 해체되며, 이것은 핵 β-카테닌의 축적 및 Wnt 경로 담당 유전자의 전사로 이어진다.

Wnt 단백질의 과발현 또는 β-카테닌 파괴 복합체의 구성요소에 영향을 주는 돌연변이에 의해 매개되는 상기 경로의 부적절한 활성화가 많은 암에서 관찰되어 왔다 (문헌 [Polakis, P. (2007) Curr Opin Genet Dev 17, 45-51]). 특히, 종양 억제인자 APC의 절단 돌연변이는 결장직장 암종에서 가장 유력한 유전적 변경이다. 또한, 악신1 및 악신2 돌연변이가 각각 간암 및 결장직장암을 가지는 환자에서 확인된 바 있다 (문헌 [Taniguchi, K. et al. (2002) Oncogene 21, 4863-71]; [Liu, W. et al. (2000) Nat Genet 26, 146-7]; [Lammi, L. et al. (2004) Am J Hum Genet 74]). 이러한 체세포 돌연변이들은 β-카테닌의 Wnt-비의존성 안정화 및 β-카테닌-매개 전사의 구성적인 활성화를 초래한다.

β-카테닌의 안정화를 통한 비정상적인 Wnt 경로 활성화는 많은 결장직장 암종에서의 종양형성에 중심적인 역할을 한다. 결장직장 암종 (CRC)의 80 ％가 중단없는 Wnt 신호전달을 가능케 하는 종양 억제인자 APC에서의 불활성화 돌연변이에 근거하는 것으로 추정되고 있다. 또한, Wnt-경로 활성화가 흑색종, 유방암, 간암, 폐암, 및 위암에 관련되어 있을 수 있다는 것을 암시하는 증거들이 점점 더 늘어나고 있다. Wnt, 정상적인 발생, 및 암 사이에는 오래전부터 연관성이 인식되어 왔으며, Wnt 신호전달 표적으로서의 c-Myc 원형-종양유전자의 확인으로 연관성은 추가 확립되었다 (문헌 [He et al. (1998) Science 281: 1509-3512]).

또한, 비제한적으로 골다공증, 골관절염, 다낭성 신장병, 당뇨병, 정신분열증, 혈관 질환, 심장 질환, 비-종양발생 증식성 질병, 및 신경변성 질병 예컨대 알츠하이머병을 포함한 기타 장애들이 비정상적인 Wnt 신호전달과 관련되어 있다.

악신

악신은 β-카테닌 파괴 복합체의 단백질 구성요소들 (GSK3, APC, CK1, 및 β-카테닌)을 함께 집결시키는 작용을 하는 Wnt 신호전달의 핵심 조절인자이다. 글리코겐 신타제 키나제3 (GSK3, 초파리에서 샤기로 알려져 있음), 종양 억제인자 유전자 생성물 APC (선종성 결장 폴립증) (문헌 [Gumbiner (1997) Curr. Biol. 7: R443-436]), 및 악신은 모두 Wnt 경로의 음성 조절인자이다. Wnt 리간드의 부재시에는, 이들 단백질이 β-카테닌 파괴 복합체를 형성하여 β-카테닌의 인산화 및 분해를 촉진하는 반면, Wnt 신호전달은 상기 복합체를 불활성화하여 β-카테닌 분해를 방지한다. 안정화된 β-카테닌은 결과적으로 핵으로 이동하며, 거기에서 TCF (T 세포 인자) 전사 인자 (림프구 인핸서-결합 인자-1 (LEF1)로도 알려져 있음)에 결합하여, TCF/LEF-유도 전사의 공동활성화인자로서 기능한다 (문헌 [Bienz, et al. (2000) Cell 103: 311-320]; [Polakis, et al. (2000) Genes Dev 14: 1837-1851]).

다수-단백질 파괴 복합체의 효율적인 조립은 그의 주요 구성요소들의 항정 상태 농도에 의존한다. 악신은 β-카테닌 파괴 복합체의 효율을 조절함에 있어서 농도-제한 인자인 것으로 보고되어 있으며, 증가된 악신의 발현은 절단된 APC를 발현하는 세포주에서 β-카테닌 분해를 증강시킬 수 있다 (문헌 [Salic, A., et al. (2000) Mol Cell 5, 523-32]; [Lee, E., et al. (2003) PLoS Biol 1, E10]; [Behrens, J., et al. (1998) Science 280, 596-9]; [Kishida, M., et al. (1999) Oncogene 18, 979-85]). 따라서, 적정한 WNT 경로 신호전달을 보장하기 위해서는, 악신 단백질 수준이 확실하게 조절될 필요가 있을 것이다. 이와 같은 이유로, XAV939와 같은 탄키라제 억제제는 Wnt 경로 신호전달의 매우 효과적인 조정제이다.

본원에서 기술되는 바와 같이, Wnt 신호전달 경로의 신규 조정제를 탐색하는 데에는 화학적, 유전적 및 단백질체적(proteomic) 접근법들이 사용되었다. 본원에서 도면에 나타내어 기술되고 실험적으로 기술되는 바와 같이, 악신 안정화는 그를 통하여 Wnt 신호전달을 조정하는 강력한 기작이다. 악신의 반감기를 연장하고, 탄키라제 (TNKS)의 억제를 통하여 β-카테닌 분해를 촉진할 수 있는 저분자량 화합물들을 확인하였다. 또한, 악신 단백질 안정성을 조절하는 새로운 기작이 밝혀졌는데, 그의 치료적 이용은 WNT 경로 의존성 암을 치료함에 있어 유망하다.

인간 악신 유전자는 마우스 단백질 ("융합된" (fu) 것으로 알려져 있으며, 동종접합 마우스 배아에서 축 중복(axis duplication)을 야기하는 것으로 밝혀져 있음)과 87 ％의 동일성을 가지는 900-아미노산 폴리펩티드를 코딩하고 있다. 상기 서열은 또한 G 단백질 신호전달의 조절인자 도메인 (RGS 도메인, APC에 결합함), GSK3 결합 도메인, β-카테닌 결합 도메인, DIX 도메인 (자가 올리고머화에 관련됨), 그리고 초파리의 N 말단 부근의 보존 서열 및 척추동물 '디셰블드' 단백질과 상동성을 가지는 C-말단 영역을 함유한다. 또한, 상기 서열이 이분된 핵 배치 신호를 함유하기는 하나, 악신이 핵에 배치되는 것으로 알려져 있지는 않다 (문헌 [Zeng, et al. (1997) Cell 90: 181]).

악신 내 아미노산의 대부분의 보존된 부분을 포함하는 악신1의 소형 N-말단 영역 (아미노산 19-30)이 본원에서 기술되는 바와 같이 탄키라제와 상호작용하는 데에 필요하고도 충분한 것으로 밝혀졌다. 본원에서 TBD (탄키라제-결합 도메인)으로 지칭되는 상기 소형 N-말단 도메인을 통한 악신1의 TNKS1과의 특이적인 상호작용은 GST 풀-다운(pull-down) 및 공동-면역침전 분석에 의해 추가적으로 입증되었다.

악신은 악신1 및 악신2 (악실, 또는 비-인간 종에서는 콘덕틴(conductin)으로도 지칭됨)의 2종 이상 형태 중 하나로서 존재한다. 악신1 및 악신2 단백질은 대략 45 ％의 아미노산 동일성, 및 β-카테닌 수준을 조절함에 있어서의 본질적으로 동일한 기능을 가진다. 그러나, 악신2와 달리, 악신1은 β-카테닌-TCF-조절 유전자인 것으로는 여겨지지 않는다. 또한, Wnt 신호전달을 조절하는 피드백 억제인자 경로에서의 악신2의 기능은 악신1 대 악신2 상에서의 Wnt 경로 활성화의 효과 사이에 잠재적인 기능상의 차이가 존재할 수 있다는 믿음을 갖게 한다.

본 출원을 통하여 실험적으로 증명되는 바와 같이, 본 발명의 화합물은 악신 안정화제로서 작용한다. 상기 화합물은 악신의 단백질 수준을 증가시킨다. 다양한 분석들을 통하여 Wnt 길항제로서 확인된 화합물들은 악신 안정화를 통하여 작용하는 것으로 밝혀졌다. 이와 같은 기작의 발견 및 실증은 본 발명의 방법을 초래하였다.

본 발명의 화합물은 수많은 소형 분자 블랙 박스 스크리닝(black box screening)에서 Wnt 신호전달을 억제하는 것으로 밝혀졌다. TCF 루시퍼라제 리포터인 수퍼탑플래시(SuperTopflash)로 안정하게 핵산전달감염된 SW480 세포 (APC 절단을 가지는 결장암 세포주)를 사용하여 한 가지 스크리닝(screen)이 수행되었다. SW480은 APC 결핍이며, 구성적인 리간드-비의존성 Wnt 신호전달을 특징으로 하는 인간 결장 암종 주이다. 상기 신호전달은 핵에서의 안정한 β-카테닌의 비정상적인 축적에 기인하는데, β-카테닌이 정상 세포에서와 같이 β-카테닌 파괴 복합체에 의해 인산화 및 분해되지 않기 때문이다.

또한, 본 발명의 화합물은 무손상 Wnt 신호전달 경로를 가지는 세포주 (예, 293T 세포)에서의 Wnt 신호전달을 억제하는 것으로 밝혀졌다. Wnt3a 조건화 배지로 처리된 293T-STF 세포를 사용하여 또 다른 스크리닝이 수행되었다. 이와 같은 스크리닝에서, 화합물은 활성 Wnt 신호전달이 없는 세포 (293T 세포)에서 악신을 안정화하는 것으로 밝혀졌다. 이것, 및 억제제 (예, RNAi 및 Wnt 억제제 단백질)의 사용이 부수적인 악신 안정화 없이 상이한 수준으로 Wnt 신호전달을 차단하는 것으로 밝혀진 것은 본 발명 악신 안정화제의 작용이 Wnt 억제 자체의 결과는 아니라는 믿음으로 이어진다.

본원에서 기술되는 바와 같이, 본 발명의 악신 안정화제 (예, 본 발명의 화합물)는 결장암 세포 (예, SW480 세포)에서 GSK3-의존성 기작을 통하여 β-카테닌의 인산화 및 분해를 유도한다. 상기 안정화제는 생체외 세포 배양 분석에서 결장암 세포의 성장을 억제한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 안정화제는 GSK3에 의한 악신의 인산화를 증가시키며, 이것은 다시 악신을 안정화하고, 악신과 β-카테닌 사이의 상호작용을 증가시킨다. 이것은 β-카테닌의 가속화된 인산화 및 분해로 이어진다.

TNKS의 촉매 활성은 악신의 안정화와 연계되어 있는데, 악신과 TNKS는 공동면역침전 실험 및 효모 2-하이브리드 시스템에서 서로 결합하는 것으로 밝혀졌다.

탄키라제 ( TNKS )

TRF1-상호작용 안키린(ankyrin) 관련 ADP-리보스 폴리머라제를 줄인 "탄키라제"는 파실레이팅 활성을 보유하는 분자 골격 단백질이다. 그것은 비-극성화 세포에서 그의 골지(Golgi)에의 배치를 바탕으로 소포성 통행(vesicular trafficking) (예, 새롭게 합성된 단백질의 표적화된 전달)을 조절하는 것으로 알려져 있다 (문헌 [Yeh, et al. (2006) Biochem. J. 399: 415]). TNKS는 종말체(telomere), 중심체(centrosome), 및 핵공(nuclear pore)에서도 발견될 수 있다. TNKS는 유사 분열에서 필수적인 조절 역할을 하며, 종말체 길이의 음성 조절인자인 TRF1을 변형시킴으로써 종말체 항상성을 조절한다 (문헌 [Smith, et al. (1998) Science 282: 1484]) (문헌 [Dynek, et al. (2004) Science 304: 97]).

TNKS1 및 2는 각각 1,327 및 1,166 잔기를 포함하는 단백질이다. 이들은 각각 PARP-5a 및 -5b로도 지칭된다. 상기 단백질들은 약 83 ％의 서열 동일성을 공유하는데, TNKS1에만 존재하는 히스티딘/프랄린/세린-풍부 (HPS) 도메인의 부재에서 주로 상이하다. 양 단백질은 기질 결합을 위한 24 안키린-유형 반복, 자가 올리고머화와 관련된 무효 알파 모티프(sterile alpha motif) (SAM) 도메인, 및 촉매 활성을 위한 C-말단 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 (PARP) 상동성 도메인을 보유한다. NAD+ 결합 및 촉매작용에 필요한 중요한 잔기는 상기 2종의 단백질들 사이에 완전하게 보존되어 있다. 결합 상대에는 IRAP (인슐린 신호전달에 관련됨), Grb14 (인슐린 신호전달에 관련됨), NuMA (세포 주기에 관련됨), 및 Mcl-1 (세포자멸에 관련됨)이 포함된다.

본원에 기술되어 있는 효모 2종-하이브리드 분석은 TNKS1의 III, IV, 및 V 안키린 반복 도메인에 걸친 영역이 그의 악신1과의 상호작용에 필요하고도 충분하다는 것을 밝혀내었다. 또한, β-카테닌 안정화가 악신 결합 도메인 및 SAM 도메인은 필요로 하나, TNKS1의 PARP 도메인은 필요로 하지 않는다는 것이 밝혀졌다.

TNKS1 및 TNKS2는 악신 단백질 수준을 조절함에 있어 잉여적으로(redundantly) 기능한다. 적어도 SW480, HEK293, 및 DLD-1 세포에서 증명되는 바와 같이 (본원에서 기술됨), β-카테닌 인산화를 증가시키고, β-카테닌 풍부도를 감소시키고, β-카테닌 표적 유전자의 전사를 억제하기 위해서는, TNKS1 및 TNKS2가 공동-고갈될 필요가 있다. TNKS1 또는 TNKS2의 단독 고갈은 증가된 악신1/2 단백질의 수준으로 이어지지 않는다.

TNKS1 및 2는 ADP-리보스 중합체를 사용하여 자기 자신 및 기타 기질 단백질들을 변형시키며, 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제, 또는 PARP로 지칭되는 NAD⁺-의존성 효소의 족에 속한다 (문헌 [Schreiber, et al. (2006) Nature Reviews Molecular Cell Biology; 7 (7): 517]). ADP-리보스 중합체의 첨가 (파실레이팅, 또는 폴리(ADP-리보스)화로도 알려져 있음)는 세포 생존 및 세포-사멸 기능, 전사 조절, 세포 분열시의 종말체 응집 및 체세포 방추사 형성, 에너지 대사, 및 세포내 통행을 조절하는 해독-후 변형이다.

몇 가지 경우에, 표적 단백질의 파실레이팅은 유비퀴틴(ubiquitin) 의존성 분해와 연계되어 있다. 예를 들면, TNKS1에 의한 TRF1의 파실레이팅은 TRF1을 종말체로부터 해리시키고, 그의 분해를 촉진한다 (문헌 [Smith S, et al. (1998) Science; 282(5393): 1484]). 또한, TNKS의 자가파실레이팅은 TNKS의 분해를 촉진한다 (문헌 [Yeh TYJ, et al. (2006) Biochemical Journal; 399: 415]).

본원에서 기술되는 siRNA-구조(rescue) 접근법을 통하여 실험적으로 증명되는 바와 같이, 탄키라제의 촉매 (파실레이팅) 활성은 악신 단백질 수준 및 Wnt 경로 신호전달의 조절에 필요하다. XAV939와 같은 탄키라제 억제제에 의한 상기 촉매 활성의 억제는 악신 안정성은 물론, 이후의 β-카테닌 분해 및 Wnt 신호전달의 중지를 초래한다. XAV939와 같은 탄키라제 억제제는 실제로 TNKS1/2의 촉매 PARP 도메인에 견고하게 결합한다. XAV939와 같은 탄키라제 억제제는 또한 TNKS1/2의 자가-파실레이팅 능력을 방해하여, 실제로 TNKS 단백질 수준을 증가시키는 동시에, 그의 촉매 기능을 제거할 수 있다.

탄키라제 ( TNKS ) 억제 및 Wnt 신호전달 억제

본원에서 기술되는 공동-면역침전 실험을 통하여, SW480세포에서 TNKS1/2가 악신2와 결합하는 것으로 밝혀졌으며, 본원에서 기술되는 효모 2종-하이브리드 분석 실험을 통하여, 악신1/2와 TNKS1/2 사이의 강력한 결합이 증명되었다. 진화상 보전되어 있는 악신의 "탄키라제 결합 도메인" (TBD)에 의해 매개되는 바와 같은 악신과 TNKS 사이의 물리적 상호작용은 생체내에서 악신 단백질 수준을 조절함에 있어 중요하다. 본원에서 증명되는 바와 같이 (예컨대 siRNA 실험을 통하여), TNKS1/2는 악신 안정성에 영향을 주는 유일한 PARP 족 구성원이다.

본원에서 기술되는 바와 같이, 탄키라제 억제제 (예, XAV939)는 GSK3β-악신 복합체 형성을 증가시킴으로써, β-카테닌의 GSK3β-의존성 인산화 및 프로테아좀형(proteasomal) 분해를 촉진한다. 이것은 손상된 APC 기능을 가지는 세포 (예, 절단된 APC 대립유전자를 가지고 있는 결장직장 세포주 SW480)에서도 발생하는데, 탄키라제 억제제 (예, XAV939)가 그렇지 않았다면 부족하였을 세포의 β-카테닌 분해 능력을 구조할 수 있기 때문이다. XAV939와 같은 탄키라제 억제제는 TNKS1/2와 물리적으로 상호작용하며 (예컨대 형광 편광 분석에서 본원에 나타내는 바와 같이), β-카테닌 파괴 복합체의 상류 및 그의 수준 모두에서 기능할 수 있기 때문에; 상응하는 악신 전사체 수준의 증가 없이도 악신 단백질 수준의 증가를 야기한다.

본원에서 도면에 나타내고 실험적으로 증명하여 매우 상세하게 기술되는 바와 같이, TNKS1/2는 악신 안정화제 (예컨대 악신-안정화 소형 분자, 억제성 핵산, 및 융합 단백질 포함)를 위한 효율적인 표적이라는 것이 밝혀졌다. TNKS1/2에 결합하여 그의 촉매 활성을 억제하는 화합물, 및 TNKS1/2에 대한 siRNA는 악신을 안정화함과 동시에 β-카테닌의 인산화 및 분해를 촉진한다.

TNKS 길항제는 바람직하게는 TNKS 단백질 또는 전사체 수준을 감소시킴으로써가 아닌, TNKS 단백질의 촉매 활성 (예컨대 악신과 같은 표적 단백질을 파실레이팅하는 그의 능력은 물론, 그의 자가파실레이팅 능력)을 감소시키거나 억제함으로써, 작용한다. 본원에서 실험적으로 기술되는 바와 같이, TNKS는 악신과 물리적으로 결합하며, 악신 단백질 수준의 조절을 위해서는 그의 파실레이팅 활성을 필요로 한다. TNKS는 악신의 유비퀴틴화 및 분해를 촉진하며, 이것은 적어도 부분적으로 악신 또는 유비퀴틴-프로테오좀 경로 구성요소의 직접적인 파실레이팅을 통하여 매개될 수 있다.

간단히 말하자면, XAV939와 같은 탄키라제 억제제는 악신 단백질 수준을 증가시키며, 포스포-β-카테닌을 증가시키고, 세포질 β-카테닌을 감소시키며, β-카테닌 siRNA와 유사한 방식으로 β-카테닌 표적 유전자에 충격을 준다.

스크리닝 분석

본 발명은 조정제, 즉 예를 들면 악신 안정화 및/또는 TNKS 촉매 활성의 제거를 통하여 Wnt 신호 전달을 조정할 후보 또는 시험 화합물 또는 제제 (예, 펩티드, 펩티도모방물질, 소형 분자 또는 기타 약물)를 확인하기 위한 방법 (본원에서는 "스크리닝 분석"으로도 지칭됨)을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 스크리닝 방법은 악신 안정화 및/또는 TNKS 촉매 활성을 조정할 수 있음으로써, 다시 Wnt 경로 신호전달을 조정할 수 있는 제제를 확인한다. 반대로, 본 발명의 방법을 통하여 발견된 악신 불안정화제는 Wnt 신호전달을 증대시키거나, 증강하거나, 또는 다르게는 작동시키는 데에 사용될 수 있다.

Wnt의 조정제 (예, 악신 안정화의 조정제, TNKS의 조정제)에는 예를 들면 효능제 및/또는 길항제가 포함될 수 있으며, 소형 분자 (예, 본 발명의 화합물), 억제성 핵산, 및 융합 단백질이 포함될 수 있다. 본 발명 방법의 사용 예에 대해서는 본 발명의 실시예 부문에 상세하게 기술되어 있다.

본원에서 사용될 때, Wnt 신호전달의 "효능제" 또는 "모방물질"이라는 용어는 TNKS에 대한 작용 효과 (예컨대 TNKS의 촉매 특성을 증강), 및/또는 악신에 대한 불안정화 효과를 가짐으로써, Wnt 신호전달을 모방하거나 상향조절하는 (예컨대 증강하거나 보충하는) 제제를 지칭하여 의미한다. 상기 Wnt 효능제는 악신 생체활성 (예컨대 β-카테닌을 유비퀴틴화하고 분해하는 그의 능력)을 억제, 감소 또는 억압하거나, 및/또는 TNKS 활성 (예컨대 그의 파실레이팅 능력)을 작동시키거나, 및/또는 다르게는 악신 불안정화를 초래한다. "모방물질" 및 "효능제"에는 폴리펩티드, 펩티드, 지질, 탄수화물, 뉴클레오티드, 및 소형 유기 분자가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 모방물질 후보는 예를 들면 합성 소형 분자, 동물, 식물, 세균 또는 균류 세포의 추출물은 물론, 그와 같은 세포로부터의 조건화 배지에 함유되어 있는 화합물을 포함한 천연 또는 합성의 화합물일 수 있다.

Wnt 효능제는 악신 단백질과 그것이 정상적으로 결합하는 다른 Wnt 신호전달 단백질 (예, GSK3, APC, Dvl)사이의 결합 작용 또는 복합체 형성을 파괴할 수 있다 (즉, Wnt 효능제는 β-카테닌 파괴 복합체를 파괴함). 상기 효능제는 β-cat 안정화, 및 Wnt 신호 전달의 증대 또는 촉진에 기여할 수 있다. 다르게는, Wnt 효능제는 TNKS 촉매 활성을 증강하는 화합물 또는 제제일 수 있다.

본원에서 사용될 때, Wnt 신호전달의 "길항제" 또는 "억제제"라는 용어는 악신에 대한 그의 안정화 효과 및/또는 TNKS에 대한 그의 길항 효과로 인하여, Wnt 신호전달을 억제하거나, 저지하거나, 또는 다르게는 음성적으로 조절하는 제제를 지칭하여 의미한다. 상기 Wnt 길항제는 TNKS 단백질의 촉매 (예, 파실레이팅) 활성을 제거하거나, 또는 악신 단백질의 생체활성을 모방하는 (예를 들면 β-카테닌 파괴 복합체를 형성) 화합물 또는 제제일 수 있다. "억제제" 및 "길항제"는 경로를 통한 신호전달 (예, Wnt 신호전달)을 감소시키거나, 차단하거나, 또는 방지하거나, 및/또는 단백질 상호작용 및 복합체의 형성을 방지하는 제제일 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명은 악신 및/또는 TNKS 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 생물학적으로 활성인 그의 일부와 결합하거나, 또는 그의 활성을 조정하는 후보 또는 시험 화합물을 스크리닝하기 위한 분석을 제공한다. 예를 들자면, 본 발명은 악신 및/또는 TNKS 안정화를 조정할 수 있는 후보 또는 시험 화합물 또는 제제를 스크리닝하기 위한 분석을 제공한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 1차 또는 2차 (반대스크리닝(counterscreen)) 분석으로서 사용될 수 있는 악신 단백질 안정성 및/또는 수준 스크리닝을 위한 분석을 제공한다. 예를 들면, 루시퍼라제 리포터가 1차 스크리닝의 일부로서 사용되고, 이어서 악신 단백질 안정성 및/또는 수준 스크리닝이 반대스크리닝으로서 사용될 수 있다. 악신 GFP, 악신-루시퍼라제, 악신-레닐라(Renilla) 등과 같은 악신 융합 단백질들이 생성되어, 세포에서 발현된 다음, 악신이 안정화되는지를 확인하기 위하여 화합물로 처리될 수 있다.

또 다른 구현예에서는, 악신 GFP, 악신-루시퍼라제, 악신-레닐라 등과 같은 악신 융합 단백질들이 생성되어, 생체외 악신 분해 분석에 사용될 수 있다. 상기 분석은 배양된 세포, 조직 또는 배아로부터의 추출물을 사용하며, 이들은 역시 악신 융합 단백질 수준이 영향을 받는지를 확인하기 위하여 화합물로 처리된다.

Wnt/β-카테닌 경로의 소형 분자 억제제에 대한 스크리닝 분석의 구체적인 예에 대해서는 본원의 예컨대 실시예 부문에서 (예컨대 HEK293 세포에서의 Wnt-응답성 수퍼-탑플래시 (STF) 루시퍼라제 리포터 분석을 사용하여) 기술된다.

본 발명의 시험 화합물들은 하기를 포함하여 업계에 알려져 있는 조합 라이브러리법의 수많은 접근법들 중 어느 것을 사용하여 수득될 수 있다: 생물학적 라이브러리; 공간적으로 배치가능한(addressable) 평행 고체 상 또는 용액 상 라이브러리; 역콘볼루션(deconvolution)을 필요로 하는 합성 라이브러리법; '1-비드 1-화합물(one-bead one-compound)' 라이브러리법; 및 친화성 크로마토그래피 선택을 사용하는 합성 라이브러리법. 상기 생물학적 라이브러리 접근법은 펩티드 라이브러리로 제한되는 반면, 다른 4종의 접근법들은 펩티드, 비-펩티드 올리고머 또는 화합물들의 소형 분자 라이브러리에 적용가능하다 (문헌 [Lam, K.S. (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145]).

분자 라이브러리의 합성을 위한 방법의 예들은 업계의 예컨대 하기 문헌들에서 찾아볼 수 있다: [DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909]; [Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422]; [Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37: 2678]; [Cho et al., (1993) Science 261: 1303]; [Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059]; [Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061]; 및 [Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233].

화합물들의 라이브러리는 용액 중에 (예, 문헌 [Houghten (1992) Biotechniques 13: 412-421]), 또는 비드 (문헌 [Lam (1991) Nature 354: 82-84]), 칩 (문헌 [Fodor (1993) Nature 364: 555-556]), 세균 (라드너(Ladner)의 U.S. 특허 제5,223,409호), 포자 (라드너의 U.S. 특허 제'409호), 플라스미드 (문헌 [Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 1865-1869]) 또는 파지 (문헌 [Scott and Smith (1990) Science 249: 386-390]); (문헌 [Devlin (1990) Science 249: 404-406]); (문헌 [Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6378-6382]); (문헌 [Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301-310]); (상기 라드너) 상에 제공될 수 있다.

일 구현예에서, 분석은 그의 표면에서 Wnt 수용체 (예, Fzd)를 발현하는 세포를 시험 제제와 접촉시킨 후, Wnt 신호전달을 조정하는 시험 제제의 능력을 측정하는 (예컨대 악신 및/또는 TNKS 단백질 수준, 또는 악신 및/또는 TNKS의 악신-결합 단백질들과의 결합에서의 변화를 측정하는 것에 의함) 세포-기반의 분석이다. 또 다른 구현예에서는, 예를 들면 GSK3에 의한 악신 인산화에서의 변화를 측정함으로써 (예컨대 포스포-특이적 항-악신 항체의 사용을 통함), Wnt 신호전달을 조정하는 시험 제제의 능력이 측정된다. 또 다른 구현예에서는, 예를 들면, β-카테닌의 인산화 및 분해 (및/또는 그의 소정 변화)를 측정함으로써, Wnt 신호전달을 조정하는 시험 제제의 능력이 측정된다.

비제한적인 예로써, 본 발명 방법의 사용을 통하여 발견될 때의 Wnt 신호전달을 억제할 수 있는 제제는 악신을 안정화하거나 및/또는 TNKS를 길항하는 능력을 나타내게 된다. 상기 안정화는 예를 들면 총 β-카테닌 수준의 감소, 및/또는 포스포-β-카테닌 (즉 인산화된 β-카테닌) 수준의 증가로서 증명될 것이다. 상기 안정화는 또한 예를 들면 악신 단백질 수준을 증가시키는 것, TNKS 촉매 활성을 감소시키는 것, 및/또는 악신-GSK3 복합체의 형성을 증가시키는 것으로서 증명될 것이다.

상기 세포는 예를 들면 포유류 기원의 것이거나, 또는 효모 세포일 수 있다. 악신 및/또는 TNKS 단백질에 결합하는 시험 제제의 능력을 확인하는 것은 예를 들면 시험 제제를 방사성동위원소 또는 효소적 표지와 결합시켜, 악신 단백질에 대한 시험 화합물의 결합이 복합체에서 표지화된 제제를 검출하는 것에 의해 확인될 수 있도록 함으로써, 수행될 수 있다. 예를 들면, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C, 또는 ³H에 의해 시험 제제가 직접 또는 간접적인 것 중 어느 것으로 표지화된 후, 방사능방출의 직접 계수, 또는 섬광 계수에 의해 방사성동위원소가 검출될 수 있다. 다르게는, 시험 제제가 예를 들면 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 또는 루시퍼라제에 의해 효소적으로 표지화된 후, 적절한 기질의 생성물로의 전환의 측정에 의해 효소적 표지가 검출될 수 있다.

어떠한 상호작용물질(interactant)의 표지화도 없이, Wnt 신호전달을 조정하는 (예컨대 악신 및/또는 TNKS 단백질과 상호작용하는) 시험 제제의 능력을 측정하는 것 역시 본 발명의 영역에 속한다. 예를 들면, 미세생리측정기(microphysiometer)가 시험 제제 또는 단백질 중 어느 것의 표지화도 없이 악신 또는 TNKS 단백질과의 시험 제제의 상호작용을 검출하는 데에 사용될 수 있다 (문헌 [McConnell, H.M. et al. (1992) Science 257: 1906-1912]). 본원에서 사용될 때, "미세생리측정기" (예, 시토센서(Cytosensor)™)는 광-배치가능 전위차계 센서(light-addressable potentiometric sensor) (LAPS)를 사용하여 세포가 그의 주변을 산성화하는 속도를 측정하는 분석 기기이다. 이와 같은 산성화 속도에서의 변화는 리간드와 수용체 사이, TNKS와 TNKS-결합 단백질 사이, 또는 악신과 악신-결합 단백질 사이 상호작용의 지표로서 사용될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 분석은 악신 및/또는 TNKS 단백질이 발현되는 세포를 정상 조건하에서 악신 및/또는 TNKS와 결합하는 것으로 알려져 있는 단백질 (예, 본원에서 정의되는 바와 같은 악신-결합 단백질), 또는 생물학적으로 활성인 그의 일부와 접촉시켜 분석 혼합물을 형성시키는 것, 상기 분석 혼합물을 시험 제제와 접촉시키는 것; 및 악신 및/또는 TNKS 단백질과 상호작용하는 시험 제제의 능력을 측정하는 것을 포함하며, 여기서 상기 상호작용의 측정은 상기 악신 단백질과 상기 악신-결합 단백질, 또는 생물학적으로 활성인 그의 일부 사이의 결합 작용을 파괴하는 시험 제제의 능력을 측정하는 것을 포함한다. 정상적인 악신:악신-결합 단백질 결합 작용, 및/또는 TNKS:TNKS-결합 단백질 결합 작용의 상기 파괴는 정상 상태 (즉, 시험 제제가 존재하지 않는 그것)와 비교하였을 때의 β-카테닌 인산화에서의 변화에 의해 측정될 수 있다.

또 다른 구현예에서, 분석은 악신 표적 분자 (예, β-cat) 및/또는 TNKS 표적 분자를 발현하는 세포를 시험 제제와 접촉시키는 것, 및 상기 악신 및/또는 TNKS 표적 분자의 활성을 조정하는 (예컨대 자극하거나 억제하는) 시험 제제의 능력을 측정하는 것을 포함하는 세포-기반의 분석이다. 악신 및/또는 TNKS 표적 분자의 활성을 조정하는 시험 화합물의 능력을 측정하는 것은 예를 들면 시험 제제의 존재 및 부재하 모두에서의 β-cat 인산화 수준을 비교하는 것에 의해 수행될 수 있다.

악신 및/또는 TNKS 표적 분자 및/또는 악신-결합 단백질에 결합하거나 그와 상호작용하는 악신 및/또는 TNKS 단백질의 능력을 측정하는 것은 직접 결합 측정용으로 상기한 방법들 중 하나에 의해 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 악신 및/또는 TNKS 표적 분자 및/또는 악신-결합 단백질에 결합하거나 그와 상호작용하는 악신 및/또는 TNKS 단백질의 능력을 측정하는 것은 표적 분자의 활성을 측정하는 것에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 표적 분자의 상기 활성은 표적의 세포 2차 메신저(messenger) (즉, 세포내 Ca^{2 +}, 디아실글리세롤, IP₃ 등)의 유도를 검출하는 것, 적절한 기질에 대한 표적의 촉매/효소적 활성을 검출하는 것, 리포터 유전자 (검출가능한 마커, 예컨대 루시퍼라제를 코딩하는 핵산에 작동적으로(operatively) 연결되어 있는 조절 요소 포함)의 유도를 검출하는 것, 또는 세포 응답, 예를 들면 발생, 분화, 또는 증식 속도를 검출하는 것에 의해 측정될 수 있다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 분석은 악신 및/또는 TNKS 단백질, 또는 생물학적으로 활성인 그의 일부가 시험 화합물과 접촉되고, 악신 및/또는 TNKS 단백질, 또는 생물학적으로 활성인 그의 일부에 결합하는 시험 화합물의 능력이 측정되는 무-세포 분석이다. 악신 및/또는 TNKS 단백질에 대한 시험 화합물의 결합은 상기한 바와 같이 직접적인 것 또는 간접적인 것 중 어느 것으로 측정될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 분석은 악신 및/또는 TNKS 단백질, 또는 생물학적으로 활성인 그의 일부를 악신 및/또는 TNKS에 결합하는 공지의 화합물과 접촉시켜 분석 혼합물을 형성시키는 것, 상기 분석 혼합물을 시험 화합물과 접촉시키는 것, 및 악신 및/또는 TNKS 단백질과 상호작용하는 시험 화합물의 능력을 측정하는 것을 포함하며, 여기서 악신 및/또는 TNKS 단백질과 상호작용하는 시험 화합물의 능력을 측정하는 것은 공지의 화합물과 비교하였을 때의 악신 및/또는 TNKS 단백질, 또는 생물학적으로 활성인 그의 일부에 우선적으로 결합하는 시험 화합물의 능력을 측정하는 것을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 상기 분석은 악신 및/또는 TNKS 단백질, 또는 생물학적으로 활성인 그의 일부가 시험 화합물과 접촉되고, 악신 및/또는 TNKS 단백질, 또는 생물학적으로 활성인 그의 일부의 활성을 조정하는 (예컨대 자극하거나 억제하는) 시험 화합물의 능력이 측정되는 무-세포 분석이다. 악신 단백질의 활성을 조정하는 시험 화합물의 능력을 측정하는 것은 예를 들면 직접 결합 측정용으로 상기한 방법들 중 하나에 의해 표적 분자에 결합하거나 악신-결합 및/또는 TNKS-결합 단백질과 상호작용하는 악신 단백질의 능력을 측정하는 것에 의해 수행될 수 있다. 표적 분자에 결합하는 악신 및/또는 TNKS 단백질의 능력을 측정하는 것은 또한 실시간 생물분자 상호작용 분석 (BIA)과 같은 기술을 사용하여 수행될 수 있다 (문헌 [Sjolander, S. and Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63: 2338-2345] 및 [Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699-705]). 본원에서 사용될 때, "BIA"는 어떠한 상호작용물질의 표지화도 없이 실시간으로 생체특이적 상호작용을 연구하기 위한 기술이다 (예, BIAcore™). 생물학적 분자들 사이의 실시간 반응의 지표로는 광학적 현상인 표면 플라스몬(plasmon) 공명 (SPR)의 변화가 사용될 수 있다.

대안적인 구현예에서, 악신 및/또는 TNKS 단백질의 활성을 조정하는 시험 화합물의 능력을 측정하는 것은 표적 분자 또는 악신-결합 및/또는 TNKS-결합 단백질의 활성을 추가 조정하는 악신 및/또는 TNKS 단백질의 능력을 측정하는 것에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 적절한 기질 상에서의 표적 분자의 촉매/효소적 활성이 전기한 바와 같이 측정될 수 있다.

또 다른 구현예에서, 상기 무-세포 분석은 악신 및/또는 TNKS 단백질, 또는 생물학적으로 활성인 그의 일부를 악신 및/또는 TNKS 단백질에 결합하는 공지의 화합물과 접촉시켜 분석 혼합물을 형성시키는 것, 상기 분석 혼합물을 시험 화합물과 접촉시키는 것, 및 악신 및/또는 TNKS 단백질과 상호작용하는 시험 화합물의 능력을 측정하는 것을 포함하며, 여기서 악신 및/또는 TNKS 단백질과 상호작용하는 시험 화합물의 능력을 측정하는 것은 표적 분자, 또는 악신-결합 및/또는 TNKS-결합 단백질에 우선적으로 결합하거나 그의 활성을 조정하는 악신 단백질의 능력을 측정하는 것을 포함한다.

화합물 및 천연 추출물들의 라이브러리를 시험하는 많은 약물 스크리닝 프로그램에서, 주어진 시간 기간 내에 조사되는 화합물의 수를 최대화하기 위해서는 고처리량의 분석이 바람직하다. 정제 또는 반-정제 단백질을 사용하여 유도될 수 있는 것과 같이 무-세포 시스템에서 수행되는 분석은 그것이 시험 화합물에 의해 매개되는 분자 표적에서의 변화의 신속한 진전 및 비교적 용이한 검출이 가능하도록 이루어질 수 있다는 점에서, 종종 "1차" 스크리닝으로서 바람직하다. 또한, 시험 화합물의 세포 독성 및/또는 생체이용률(bioavailability)의 효과가 생체외 시스템에서는 일반적으로 무시될 수 있으며, 그 대신 상기 분석은 주로 상류 또는 하류 요소와의 결합 친화성의 변경에서 드러날 수 있는 바와 같은, 분자 표적에 대한 약물의 효과에 촛점을 맞춘다.

따라서, 본 발명의 대표적인 스크리닝 분석에서, 대상 화합물은 악신 및/또는 TNKS 단백질 또는 결합 상대, 예를 들면 악신-결합 및/또는 TNKS-결합 단백질과 접촉된다. 다음에, 상기 화합물과 악신 단백질 또는 악신 결합 상대의 혼합물에 악신 및/또는 TNKS 결합 상대 또는 악신 및/또는 TNKS 단백질을 각각 함유하는 조성물이 첨가된다. 악신 단백질과 악신 결합 상대, 및/또는 TNKS 단백질과 TNKS 결합 상대의 복합체의 검출 및 정량은 악신과 결합 상대 사이의 복합체 형성을 억제 (또는 증강)함에 있어서의 화합물의 효능을 측정하기 위한 수단을 제공한다. 화합물의 효능은 다양한 농도의 시험 화합물을 사용하여 수득된 데이터로부터 투여량 응답 곡선을 생성시키는 것에 의해 평가될 수 있다. 또한, 대조 분석 역시 수행되어 비교를 위한 기준선을 제공할 수 있다. 상기 대조 분석에서는, 단리 및 정제된 악신 폴리펩티드 또는 결합 상대가 악신 결합 상대 또는 악신 폴리펩티드를 함유하는 조성물에 첨가된 후, 시험 화합물의 부재하에 복합체의 형성이 정량된다. 상기 대조 분석에서 다르게는, 단리 및 정제된 TNKS 폴리펩티드 또는 결합 상대가 TNKS 결합 상대 또는 TNKS 폴리펩티드를 함유하는 조성물에 첨가된 후, 시험 화합물의 부재하에 복합체의 형성이 정량된다.

본 발명의 상기 무-세포 분석은 단리된 단백질 (예, 악신 단백질 또는 생물학적으로 활성인 그의 일부 또는 악신-표적 분자, 및/또는 TNKS 단백질 또는 생물학적으로 활성인 그의 일부 또는 TNKS-표적 분자)의 가용성 및/또는 막-결합 형태 모두의 사용에 적합하다. 막-결합 형태의 단리된 단백질이 사용되는 (예, 악신 및/또는 TNKS-표적 분자 또는 수용체) 무-세포 분석의 경우, 가용화제를 이용하여 막-결합 형태의 단리된 단백질이 용액 중에서 유지되도록 하는 것이 바람직할 수 있다. 그와 같은 가용화제의 예에는 비-이온계 계면활성제 예컨대 n-옥틸글루코시드, n-도데실글루코시드, n-도데실말토시드, 옥타노일-N-메틸글루카미드, 데카노일-N-메틸글루카미드, 트리톤(Triton).RTM. X-100, 트리톤.RTM. X-114, 테시트(Thesit).RTM., 이소트리데시폴리(에틸렌글리콜 에테르).sub.n, 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암미니오]-1-프로판 술포네이트 (CHAPS), 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암미니오]-2-히드록시-1-프로판 술포네이트 (CHAPSO), 또는 N-도데실=N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판 술포네이트가 포함된다.

상기한 세포 기반 또는 무-세포 분석에서, 내인성 악신1 및/또는 악신2 수준은 악신1 또는 악신2 항체를 사용하여 측정될 수 있다. 또한, 악신은 세포 또는 추출물 중 어느 것 중에서의 악신 단백질 수준 측정을 가능케 하기 위하여 항원결정인자 태그에 의해 표지화될 수 있다.

상기한 세포 기반 또는 무-세포 분석에서, 내인성 TNKS1 및/또는 TNKS2 수준은 TNKS1 또는 TNKS2 항체를 사용하여 측정될 수 있다. 또한, 악신은 세포 또는 추출물 중 어느 것 중에서의 TNKS 단백질 수준 측정을 가능케 하기 위하여 항원결정인자 태그에 의해 표지화될 수 있다.

본 발명의 상기 분석 방법들 중 하나를 초과하는 구현예에서는, 단백질들 중 하나 또는 양자의 비복합체화 형태로부터 복합체화된 것의 분리를 용이하게 하는 것은 물론, 분석의 자동화를 도모하기 위하여, 악신, 악신-결합 단백질 또는 표적 분자 중 어느 것을 고정하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 상기 분석 방법들 중 하나를 초과하는 구현예에서는, 단백질들 중 하나 또는 양자의 비복합체화 형태로부터 복합체화된 것의 분리를 용이하게 하는 것은 물론, 분석의 자동화를 도모하기 위하여, TNKS, TNKS-결합 단백질 또는 표적 분자 중 어느 것을 고정하는 것이 바람직할 수 있다. 후보 화합물 존재 및 부재하의 악신 및/또는 TNKS 단백질에 대한 시험 화합물의 결합, 또는 악신 및/또는 TNKS 단백질의 표적 분자와의 상호작용은 반응물을 함유하기에 적합한 임의의 용기에서 수행될 수 있다. 그와 같은 용기의 예에는 미량역가판(microtitre plate), 시험관, 및 미세-원심분리관이 포함된다. 일 구현예에서는, 단백질들 중 하나 또는 양자가 매트릭스에 결합되는 것을 가능케 하는 도메인이 첨가된 융합 단백질이 제공될 수 있다.

예를 들면, 글루타치온-5-트랜스퍼라제/악신 융합 단백질 또는 글루타치온-5-트랜스퍼라제/표적 융합 단백질이 글루타치온 세파로스 비드 (미주리 세인트 루이스 소재 시그마 케미칼(Sigma Chemical) 사) 또는 글루타치온 유도체화(derivatized) 미량역가판 상에 흡착된 다음, 시험 화합물, 또는 시험 화합물 및 비-흡착 표적 단백질 또는 악신 단백질 중 어느 것과 조합된 후, 복합체 형성에 도움이 되는 조건하에서 (예컨대 염 및 pH의 생리학적 조건에서) 상기 혼합물이 배양될 수 있다. 배양 후, 비드 또는 미량역가판 웰은 임의의 비결합 성분들을 제거하기 위하여 세척되며, 비드의 경우 매트릭스에 고정된 복합체가 예를 들면 상기한 바와 같이 직접적인 것 또는 간접적인 것 중 어느 것으로 측정된다. 다르게는, 상기 복합체가 매트릭스로부터 해리된 후, 표준 기술을 사용하여 악신 결합 또는 활성의 수준이 측정될 수 있다.

매트릭스 상에 단백질을 고정하기 위한 다른 기술들 역시 본 발명의 스크리닝 분석에 사용될 수 있다. 예를 들면, 바이오틴 및 스트렙타비딘의 접합을 이용하여 악신 단백질, 악신-결합 단백질, 또는 악신-표적 분자 중 어느 것이 고정될 수 있다. 다른 예로는, 바이오틴 및 스트렙타비딘의 접합을 이용하여 TNKS 단백질, TNKS-결합 단백질, 또는 TNKS-표적 분자 중 어느 것이 고정될 수 있다. 바이오틴화된 단백질 또는 표적 분자는 업계에 잘 알려져 있는 기술 (예, 바이오틴화 키트, 일리노이 록포드 소재 피어스 케미칼즈(Pierce Chemicals) 사)을 사용하여 바이오틴-NHS (N-히드록시-숙신이미드)로부터 제조되어 스트렙타빈-코팅된 96 웰 플레이트 (피어스 케미칼 사)의 웰에 고정될 수 있다. 다르게는, 악신, 악신-결합 단백질, 또는 표적 분자와 반응성이나 그의 표적 분자에 대한 단백질의 결합을 방해하지는 않는 항체가 플레이트의 웰에 유도체화된 후, 비결합 표적, 악신, 또는 악신-결합 단백질이 항체 접합에 의해 웰에 포획될 수 있다. 그와 같은 복합체들의 검출 방법에는 GST-고정 복합체에 대하여 상기한 것들 이외에도 악신 단백질 또는 표적 분자와 반응성인 항체를 사용한 복합체의 면역검출은 물론, 악신 단백질 또는 표적 분자와 관련된 효소적 활성의 검출에 의존하는 효소-연관 분석이 포함된다.

또 다른 구현예에서, 악신 및/또는 TNKS 발현의 조정제는 세포가 후보 화합물과 접촉되고, 세포에서의 악신 및/또는 TNKS mRNA 또는 단백질의 발현이 측정되는 방법으로 확인된다. 후보 화합물 존재하의 mRNA 또는 단백질 발현의 수준은 후보 화합물 부재하의 mRNA 또는 단백질 발현의 수준과 비교된다. 다음에, 이와 같은 비교를 바탕으로 후보 화합물은 악신 발현의 조정제로서 확인될 수 있다. 예를 들면, 악신 및/또는 TNKS mRNA 또는 단백질의 발현이 그의 부재시에 비해 후보 화합물의 존재시에 더 큰 (통계적으로 유의성 있게 더 큰) 경우, 상기 후보 화합물은 악신 및/또는 TNKS mRNA 또는 단백질 발현의 자극제로서 확인된다. 다르게는, 악신 및/또는 TNKS mRNA 또는 단백질의 발현이 그의 부재시에 비해 후보 화합물의 존재시에 적은 (통계적으로 유의성 있게 적은) 경우, 후보 화합물은 악신 및/또는 TNKS mRNA 또는 단백질 발현의 억제제로서 확인된다. 세포에서의 악신 및/또는 TNKS mRNA 또는 단백질 발현의 수준은 악신 및/또는 TNKS mRNA 또는 단백질을 검출하는 것에 대하여 본원에서 기술되는 방법에 의해 측정될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 악신 및/또는 TNKS 단백질은 악신 및/또는 TNKS 단백질에 결합하거나 그와 상호작용하여 ("결합 단백질" 또는 "bp") 악신 및/또는 TNKS 활성을 조정하는 다른 단백질을 확인하기 위한 2종-하이브리드 분석 또는 3종-하이브리드 분석 (예를 들면 U.S. 특허 제5,283,317호; 문헌 [Zervos et al. (1993) Cell 72: 223-232]; [Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 12046-12054]; [Bartel et al., (1993) Biotechniques 14: 920-924]; [Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8: 1693-1696]; 및 브렌트(Brent)의 WO94/10300호 참조)에 "미끼(bait) 단백질"로서 사용될 수 있다. 이와 같은 결합 단백질들은 또한 예를 들면 악신-매개 신호전달 경로의 하류 요소로서 악신 및/또는 TNKS 단백질에 의한 신호의 증대에도 관련되어 있는 것으로 보인다. 다르게는, 이와 같은 결합 단백질들은 해당 결합 단백질들이 신호 전달과 관련되어 있는 비-악신 발현 세포와 관련된 세포-표면 분자인 것으로 보인다.

상기 2종-하이브리드 시스템은 분리가능한 DNA-결합 및 활성화 도메인으로 구성되는 대부분 전사 인자의 구성상 특성을 바탕으로 한다. 간단하게, 상기 분석은 2종의 서로 다른 DNA 구성체를 이용한다. 일 구성체에서는, 악신 단백질을 코딩하는 유전자가 공지 전사 인자 (예, GAL-4)의 DNA 결합 도메인을 코딩하는 유전자에 융합된다. 다른 구성체에서는, 미확인 단백질 ("먹이(prey)" 또는 "샘플")을 코딩하는 DNA 서열의 라이브러리로부터의 DNA 서열이 공지 전사 인자의 활성화 도메인을 코딩하는 유전자에 융합된다. 상기 "미끼" 및 "먹이" 단백질이 생체내에서 상호작용하여 악신-의존성 복합체를 형성할 수 있는 경우, 상기 전사 인자의 DNA-결합 및 활성화 도메인은 매우 근접하게 된다. 이와 같은 근접성은 상기 전사 인자에 응답성인 전사 조절 부위에 작동성으로 연결되어 있는 리포터 유전자 (예, LacZ)의 전사를 가능케 한다. 리포터 유전자의 발현은 검출될 수 있으며, 기능성의 전사 인자를 함유하는 세포 콜로니가 단리되어, 악신 단백질과 상호작용하는 단백질을 코딩하는 클로닝된 유전자를 수득하는 데에 사용될 수 있다.

본 발명은 추가적으로 상기한 스크리닝 분석에 의해 확인되는 신규 제제, 및 그러한 분석의 사용에 의한 상기 제제의 제조 방법에 관한 것이다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명에는 상기언급된 스크리닝 분석들 (예컨대 세포-기반 분석 또는 무-세포 분석) 중 어느 하나의 단계를 포함하는 방법에 의해 수득가능한 화합물 또는 제제가 포함된다. 예를 들면, 일 구현예에서, 본 발명에는 표적 분자를 발현하는 세포를 시험 화합물과 접촉시키는 것, 및 표적 분자에 결합하거나 그의 활성을 조정하는 시험 화합물의 능력을 측정하는 것을 포함하는 방법에 의해 수득가능한 화합물 또는 제제가 포함된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명에는 표적 분자를 발현하는 세포를 악신 및/또는 TNKS 단백질 또는 생물학적으로 활성인 그의 일부와 접촉시켜 분석 혼합물을 형성시키는 것, 상기 분석 혼합물을 시험 화합물과 접촉시키는 것, 및 표적 분자와 상호작용하거나 그의 활성을 조정하는 시험 화합물의 능력을 측정하는 것을 포함하는 방법에 의해 수득가능한 화합물 또는 제제가 포함된다.

또 다른 구현예에서, 본 발명에는 악신 및/또는 TNKS 단백질 또는 생물학적으로 활성인 그의 일부를 시험 화합물과 접촉시키는 것, 및 악신 및/또는 TNKS 단백질 또는 생물학적으로 활성인 그의 일부에 결합하거나 그의 활성을 조정하는 (예컨대 자극하거나 억제하는) 시험 화합물의 능력을 측정하는 것을 포함하는 방법에 의해 수득가능한 화합물 또는 제제가 포함된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명에는 악신 및/또는 TNKS 단백질 또는 생물학적으로 활성인 그의 일부를 악신 및/또는 TNKS 단백질에 결합하는 공지의 화합물과 접촉시켜 분석 혼합물을 형성시키는 것, 상기 분석 혼합물을 시험 화합물과 접촉시키는 것, 및 악신 및/또는 TNKS 단백질과 상호작용하거나 그의 활성을 조정하는 시험 화합물의 능력을 측정하는 것을 포함하는 방법에 의해 수득가능한 화합물 또는 제제가 포함된다.

따라서, 본원에서 기술되는 바와 같이 확인되는 제제를 적절한 동물 모델에서 추가적으로 사용하는 것은 본 발명의 영역에 속한다. 예를 들면, 본원에서 기술되는 바와 같이 확인되는 제제 (예, 악신 및/또는 TNKS 조정제, 안티센스 악신 및/또는 TNKS 핵산 분자, 또는 악신 및/또는 TNKS-결합 상대)는 해당 제제를 사용한 치료의 효능, 독성, 또는 부작용을 측정하기 위한 동물 모델에 사용될 수 있다. 다르게는, 본원에서 기술되는 바와 같이 확인되는 제제는 해당 제제의 작용 기작을 측정하기 위한 동물 모델에 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 상기한 스크리닝 분석에 의해 확인되는 신규 제제의 본원에서 기술되는 바와 같은 진단, 예지, 및 치료를 위한 용도에 관한 것이다. 따라서, 해당 제제를 본원에서 기술되는 바와 같은 진단, 예지, 또는 치료에서의 용도를 위한 약물 또는 제약 조성물의 설계, 제제화, 합성, 제조, 및/또는 생산에 사용하는 것은 본 발명의 영역에 속한다. 예를 들면, 일 구현예에서, 본 발명에는 상기한 스크리닝 분석들 중 하나에 의해 수득가능한 화합물의 구조 및/또는 특성을 참조하여 약물 또는 제약 조성물을 합성 또는 제조하는 방법이 포함된다.

예를 들면, 약물 또는 제약 조성물은 표적 분자 (예, 악신 하류의 단백질, 예컨대 β-cat)를 발현하는 세포가 시험 화합물과 접촉되고, 표적 분자에 결합하거나 그의 활성을 조정하는 시험 화합물의 능력이 측정되는 방법에 의해 수득되는 화합물의 구조 및/또는 특성을 기반으로 합성될 수 있다. 또 다른 대표적인 구현예에서, 본 발명에는 악신 및/또는 TNKS 단백질 또는 생물학적으로 활성인 그의 일부가 시험 화합물과 접촉되고, 악신 및/또는 TNKS 단백질 또는 생물학적으로 활성인 그의 일부에 결합하거나 그의 활성을 조정하는 (예컨대 자극하거나 억제하는) 시험 화합물의 능력이 측정되는 방법에 의해 수득가능한 화합물의 구조 및/또는 특성을 기반으로 하는, 약물 또는 제약 조성물의 합성 또는 제조 방법이 포함된다.

본 발명의 화합물

본원에서 추가적으로 정의하자면, "본 발명의 화합물"이라는 용어 및 유사 용어는 예를 들면 Wnt 경로 신호전달을 (예컨대 악신 안정화 및/또는 TNKS 촉매 활성의 억제를 통하여) 길항하는 데에 사용될 수 있는 화합물을 기술하기 위하여 본원에서 사용된다. 상기 화합물에는 XAV939가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 화합물에는 "본 발명의 화합물"의 제약상 허용되는 염, 거울상이성질체, 입체이성질체, 회전이성질체, 호변이성질체, 부분입체이성질체, 또는 라세미체 등도 포함된다.

제약 조성물

본원에서 기술될 때의 조성물은 제약 조성물일 수 있다. 본 발명은 생리학적으로 상용성인 담체와 혼합된 Wnt 신호전달 길항제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 상기 제약 조성물은 Wnt 신호전달-관련 장애의 치료, 개선, 진단, 또는 예방을 위하여 온혈 동물, 특히 인간 (또는 온혈 동물, 특히 인간으로부터 유래하는 세포 또는 세포주)에게 투여하기에 적합하다.

활성 성분 이외에도, 이러한 제약 조성물은 제약상 사용될 수 있는 상당량의 1종 이상의 무기 또는 유기, 고체 또는 액체의 제약상 허용되는 담체, 및 생리학적으로 허용되는 희석제 (예컨대 물, 포스페이트 버퍼링된 식염수, 또는 식염수)를 함유할 수 있다.

본원에서 "치료적 유효량" 및 "유효량"이라는 구는 임상적으로 유의성 있는 숙주 활성, 기능 및 응답의 결핍을, 약 15 ％ 이상, 바람직하게는 50 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상 감소시키고, 가장 바람직하게는 그것을 예방하기에 충분한 양을 의미하기 위하여 사용된다. 다르게는, 치료적 유효량은 임상적으로 유의성 있는 숙주 이상/증상의 개선을 야기하기에 충분하다.

상기 유효량은 대상의 크기 및 중량, 병의 유형, 또는 구체적인 본 발명의 화합물과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 본 발명 화합물의 선택이 "유효량"을 구성하는 것에 영향을 줄 수 있다. 업계 일반의 숙련자라면, 본원에서 포함되는 요인들을 연구하여 과도한 실험 없이도 본 발명 화합물의 유효량에 관한 결정을 할 수 있을 것이다.

투여 처방계획이 유효량을 구성하는 것에 영향을 줄 수 있다. 본 발명의 화합물은 Wnt 신호전달-관련 장애의 발병 전 또는 후 중 어느 것에 대상에게 투여될 수 있다. 또한, 수개의 분할된 투약량은 물론, 시차 투약량이 매일 또는 순차적으로 투여될 수 있거나, 상기 투여량이 연속적으로 주입될 수 있거나, 또는 일시 주사될 수 있다. 또한, 본 발명 화합물(들)의 투약량은, 치료 또는 예방 상황의 요건에 의해 지시되는 대로, 비례적으로 증가 또는 감소될 수 있다.

"제약 제제" 또는 "제약 조성물"이라는 말에는 포유류, 예컨대 인간에의 투여에 적합한 제제가 포함된다. 본 발명의 화합물이 포유류, 예컨대 인간에 대한 약제로서 투여되는 경우, 그것은 그 자체로, 또는 제약상 허용되는 담체와의 조합으로써 예컨대 0.1 내지 99.5 ％ (더욱 바람직하게는 0.5 내지 90 ％)의 활성 성분을 함유하는 제약 조성물로 제공될 수 있다.

"제약상 허용되는"이라는 구는 생리학적으로 허용되며, 통상적으로 인간에게 투여되었을 때 위장 전도, 어지럼증 등과 같은 알러지 또는 유사 부적절 반응을 일으키지 않는 분자체 및 조성물을 지칭한다. 바람직하게는, 본원에서 사용될 때, "제약상 허용되는"이라는 용어는 연방 또는 주 정부의 관리 기관에 의해 승인되었거나, 또는 U.S. 약전 또는 기타 일반적으로 인식되어 있는 약전에 동물, 더욱 구체적으로는 인간에서 사용하도록 열거되어 있다는 것을 의미한다.

"제약상 허용되는 담체"라는 구에 대해서는 업계에 인식되어 있으며, 여기에는 본 발명의 화합물을 포유류에게 투여하는 데에 적합한, 제약상 허용되는 물질, 조성물 또는 운반체가 포함된다. 상기 운반체에는 대상 제제를 하나의 장기 또는 신체 부분으로부터 또 다른 장기 또는 신체 부분으로 운반 또는 수송하는 것과 관련된 액체 또는 고체 충전재, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질이 포함된다. 각 담체는 제제 중의 다른 성분들과 상용성이며 환자에게 해롭지 않다는 의미에서 "허용가능"해야 한다. 제약상 허용되는 담체로서 사용될 수 있는 물질의 일부 예에는 하기가 포함된다: 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 슈크로스; 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스, 및 그의 유도체, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 분말 트라가칸스(tragacanth); 맥아; 젤라틴; 활석; 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌약 왁스; 오일, 예컨대 땅콩 오일, 면실 오일, 홍화 오일, 참깨 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 대두 오일; 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 아가; 버퍼링제, 예컨대 수산화 마그네슘 및 수산화 알루미늄; 알긴산; 무-발열물질수; 등장 식염수; 링거 용액; 에틸 알콜; 포스페이트 버퍼 용액; 및 제약 제제화에 사용되는 기타 비-독성의 상용성인 물질들. 적합한 제약 담체에 대해서는 E.W. 마틴(Martin)의 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences"]에 기술되어 있다.

침윤제, 에멀션화제 및 윤활제, 예컨대 나트륨 라우릴 술페이트 및 마그네슘 스테아레이트는 물론, 착색제, 이형제, 코팅제, 감미제, 향미제 및 방향제, 보존제 및 항산화제 역시 조성물에 존재할 수 있다.

제약상 허용되는 항산화제의 예에는 하기가 포함된다: 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 염산염, 나트륨 비술페이트, 나트륨 메타비술페이트, 나트륨 술파이트 등; 유용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, α-토코페롤 등; 및 금속 킬레이팅제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등.

본 발명의 제제에는 경구, 비내, 국소, 협측, 설하, 직장내, 질내 및/또는 비경구 투여에 적합한 것들이 포함된다. 상기 제제들은 단위 투약량 형태로 편리하게 제공될 수 있으며, 제약 업계에 잘 알려져 있는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 단일 투약량 형태를 제조하기 위하여 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 생성시키는 화합물의 해당량일 것이다. 일반적으로 100 ％ 중에서, 상기 양은 약 1 ％ 내지 약 99 ％, 바람직하게는 약 5 ％ 내지 약 70 ％, 가장 바람직하게는 약 10 ％ 내지 약 30 ％의 활성 성분 범위일 것이다.

이러한 제제 또는 조성물의 제조 방법은 본 발명의 화합물을 담체, 및 임의로 1종 이상의 부속 성분과 조합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 상기 제제는 본 발명의 화합물을 액체 담체, 또는 미세하게 분할된 고체 담체, 또는 이들 양자와 균일하고 친밀하게 조합시킨 다음, 필요에 따라 생성물을 성형하는 것에 의해 제조된다.

경구 투여용으로 적합한 본 발명의 제제는 각각 사전결정량의 본 발명 화합물을 활성 성분으로서 함유하는 캡슐, 사셰, 환약, 정제, 로젠지 (가향 기반의 보통 슈크로스 및 아카시아 또는 트라가칸스 사용), 분말, 과립, 또는 수성 또는 비-수성 액체 중의 용액 또는 현탁액, 또는 수-중-유 또는 유-중-수 액체 에멀션, 또는 엘릭시르 또는 시럽, 또는 향정제 (불활성 기제, 예컨대 젤라틴 및 글리세린, 또는 슈크로스 및 아카시아 사용) 및/또는 구강 세정액 등의 형태일 수 있다. 본 발명의 화합물은 거환약, 연질약 또는 페이스트로서 투여될 수도 있다.

경구 투여를 위한 본 발명의 고체 투약 형태 (캡슐, 정제, 환약, 당의정, 분말, 과립 등)에서, 활성 성분은 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 예컨대 나트륨 시트레이트 또는 디칼슘 포스페이트, 및/또는 하기 중 어느 것과 혼합된다: 충전재 또는 증량제, 예컨대 전분, 락토스, 슈크로스, 글루코스, 만니톨, 및/또는 규산; 예를 들면 카르복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 슈크로스 및/또는 아카시아와 같은 바인더; 습윤제, 예컨대 글리세롤; 분해제, 예컨대 아가-아가, 칼슘 카르보네이트, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 소정 실리케이트, 및 나트륨 카르보네이트; 용액 지연제, 예컨대 파라핀; 흡수 가속제, 예컨대 4차 암모늄 화합물; 예를 들면 세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트와 같은 침윤제; 흡수제, 예컨대 카올린 및 벤토나이트 점토; 윤활제, 예컨대 활석, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 술페이트, 및 이들의 혼합물; 및 착색제. 캡슐, 정제 및 환약의 경우, 상기 제약 조성물은 버퍼링제를 포함할 수도 있다. 유사한 유형의 고체 조성물이 락토스 또는 유당은 물론, 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제들을 사용하는 연질 및 경질-충전 젤라틴 캡슐에 충전재로서 사용될 수도 있다.

정제는 임의로 1종 이상의 부속 성분과 함께 압축 또는 성형하는 것에 의해 제조될 수 있다. 압축 정제는 바인더 (예컨대 젤라틴 또는 히드록시프로필메틸 셀룰로스), 윤활제, 불활성 희석제, 보존제, 분해제 (예컨대 나트륨 전분 글리콜레이트 또는 가교-결합 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스), 표면-활성제 또는 분산제를 사용하여 제조될 수 있다. 성형 정제는 불활성 액체 희석제에 의해 가습된 분말화 화합물의 혼합물을 적합한 기계에서 성형함으로써 제조될 수 있다.

본 발명 제약 조성물의 정제 및 기타 고체 투약 형태, 예컨대 당의정, 캡슐, 환약 및 과립은 임의로 눈을 새기거나, 또는 코팅 및 외피, 예컨대 장용 코팅 및 약제-제제화 업계에 잘 알려져 있는 기타 코팅을 사용하여 제조될 수 있다. 그것은 예를 들면 원하는 방출 프로필을 제공하는 다양한 비율의 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 기타 중합체 매트릭스, 리포좀 및/또는 미세구체를 사용하여 내부 활성 성분의 저속 또는 조절 방출을 제공하도록 제제화될 수도 있다. 그것은 예를 들면 세균-저지 필터를 통한 여과에 의해, 또는 멸균수에 용해될 수 있는 멸균 고체 조성물 또는 소정의 기타 멸균 주사가능 매체 형태의 멸균제를 도입하는 것에 의해, 사용 직전에 멸균될 수 있다. 이러한 조성물은 임의로 불투명화제를 함유할 수도 있으며, 임의로 지연 방식으로 위장관로의 소정 부분에서만, 또는 주로 그곳에서 활성 성분(들)을 방출하는 조성물일 수 있다. 사용될 수 있는 삽입(embedding) 조성물의 예에는 중합체 물질 및 왁스가 포함된다. 상기 활성 성분은 경우에 따라 1종 이상의 상기한 부형제와 함께인 미세-캡슐화 형태일 수도 있다.

본 발명 화합물의 경구 투여를 위한 액체 투약 형태에는 제약상 허용되는 에멀션, 미세에멀션, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르가 포함된다. 활성 성분 이외에도, 상기 액체 투약 형태는 예를 들면 물 또는 기타 용매, 가용화제 및 에멀션화제, 예컨대 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일 (특히 면실, 땅콩, 옥수수, 배(germ), 올리브, 피마자 및 참깨 오일), 글리세롤, 테트라히드로퓨릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물과 같이, 업계에서 통상적으로 사용되는 불활성 희석제를 함유할 수 있다.

불활성 희석제 이외에, 경구용 조성물은 침윤제, 에멀션화제 및 현탁제, 감미제, 향미제, 착색제, 방향제 및 보존제와 같은 보조제들을 포함할 수도 있다.

현탁액은 활성 화합물 이외에도 예를 들면 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미세결정질 셀룰로스, 알루미늄 메타수산화물, 벤토나이트, 아가-아가 및 트라가칸스, 및 이들의 혼합물과 같은 현탁제를 함유할 수 있다.

직장 또는 질내 투여를 위한 본 발명 제약 조성물의 제제는 1종 이상의 본 발명 화합물을, 예를 들면 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜, 좌약 왁스 또는 살리실레이트를 포함하고, 실온에서는 고체이나, 체온에서는 액체이며 그에 따라 직장 또는 질강에서 용융되어 활성 화합물을 방출하게 되는, 1종 이상의 적합한 비자극성 부형제 또는 담체와 혼합하는 것에 의해 제조될 수 있는 좌약으로서 제공될 수 있다.

질내 투여에 적합한 본 발명의 제제에는 적절하다고 업계에 알려져 있는 것과 같은 담체를 함유하는 질좌약, 탐폰, 크림, 젤, 페이스트, 발포액 또는 분무 제제도 포함된다.

본 발명 화합물의 국소 또는 경피 투여를 위한 투약 형태에는 분말, 분무액, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 젤, 용액, 패치 및 흡입제가 포함된다. 상기 활성 화합물은 멸균 조건하에서 제약상 허용되는 담체, 및 필요할 수도 있는 임의의 보존제, 버퍼, 또는 추진제와 혼합될 수 있다.

상기 연고, 페이스트, 크림 및 젤은 본 발명의 활성 화합물 이외에도, 부형제, 예컨대 동물 및 식물 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸스, 셀룰로스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 활석 및 산화 아연, 또는 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.

분말 및 분무액은 본 발명의 화합물 이외에도, 부형제, 예컨대 락토스, 활석, 규산, 수산화 알루미늄, 칼슘 실리케이트 및 폴리아미드 분말, 또는 이러한 물질들의 혼합물을 함유할 수 있다. 추가적으로, 분무액은 통상적인 추진제, 예컨대 클로로플루오로히드로카본 및 휘발성 비치환 탄화수소, 예컨대 부탄 및 프로판을 함유할 수 있다.

경피 패치는 신체에 대한 본 발명 화합물의 조절 전달을 제공한다는 부가적인 장점을 가진다. 그와 같은 투약 형태는 화합물을 적당한 매체에 용해 또는 분산시키는 것에 의해 제조될 수 있다. 피부를 통한 화합물의 흐름을 증가시키기 위하여, 흡수 증강제가 사용될 수도 있다. 그와 같은 흐름의 속도는 속도 조절 막을 제공하는 것, 또는 활성 화합물을 중합체 매트릭스 또는 젤 중에 분산시키는 것 중 어느 것에 의해 조절될 수 있다.

안과 제제, 눈 연고, 분말, 용액 등 역시 본 발명의 영역에 속할 것으로 생각된다.

비경구 투여에 적합한 본 발명의 제약 조성물은 항산화제, 버퍼, 정균물질, 원하는 수용자의 혈액과의 등장성을 제제에 부여하는 용질, 또는 현탁제 또는 증점제를 함유할 수 있는, 1종 이상의 제약상 허용되는 멸균 등장의 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀션, 또는 사용 직전에 멸균 주사가능 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는 멸균 분말과의 조합으로써 1종 이상의 본 발명 화합물을 포함한다.

본 발명의 제약 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예에는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트가 포함된다. 적당한 유동성은 예를 들면 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.

이러한 조성물은 보조제 예컨대 보존제, 침윤제, 에멀션화제 및 분산제를 함유할 수도 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항세균제 및 항균제, 예를 들면 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 포함에 의해 보장될 수 있다. 조성물에 등장화제, 예컨대 당, 염화 나트륨 등을 포함시키는 것 역시 바람직할 수 있다. 또한, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같이 흡수를 지연시키는 제제의 포함에 의해 주사가능 제약 형태의 연장된 흡수가 초래될 수 있다.

일부 경우,약물의 효과를 연장하기 위해서는, 피하 또는 근육내 주사로부터의 약물의 흡수를 늦추는 것이 바람직하다. 이것은 저조한 수용성을 가지는 결정질 또는 비정질 물질의 액체 현탁액의 사용에 의해 성취될 수 있다. 따라서, 약물의 흡수 속도는 그의 용해 속도에 따라 달라지며, 이것은 다시 결정 크기 및 결정질 형태에 따라 달라질 수 있다. 다르게는, 비경구적으로-투여 약물 형태의 지연 흡수는 약물을 오일 운반체에 용해 또는 현탁시키는 것에 의해 성취될 수 있다.

주사가능 데포(depot) 형태는 폴리락티드-폴리글리콜리드와 같은 생분해성 중합체 내에 대상 화합물의 미세캡슐화 매트릭스를 형성시키는 것에 의해 제조된다. 약물 대 중합체의 비, 및 사용되는 구체적인 중합체의 특성에 따라, 약물방출의 속도가 조절될 수 있다. 다른 생분해성 중합체의 예에는 폴리(오르소에스테르) 및 폴리(무수물)이 포함된다. 데포 주사가능 제제는 또한 신체 조직과 상용성인 리포좀 또는 미세에멀션 내에 약물을 포획하는 것에 의해 제조된다.

본 발명의 제제는 경구용으로, 비경구용으로, 국소용으로 또는 직장용으로 제공될 수 있다. 물론 그것은 각 투여 경로에 적합한 형태로 제공된다. 예를 들면, 그것은 주사, 주입 또는 흡입에 의한 주사, 흡입, 눈 로션, 연고, 좌약 등의 투여에 의해; 로션 또는 연고에 의해 국소적으로; 및 좌약에 의해 직장용으로, 정제 또는 캡슐 형태로 투여된다. 경구 및/또는 IV 투여가 바람직하다.

본원에서 사용될 때의 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여되는"이라는 구는 장내 및 국소 투여가 아닌 다른, 보통 주사에 의한 투여 양식을 의미하며, 여기에는 비제한적으로 정맥내, 근육내, 동맥내, 수막강내, 포내, 안와내, 심장내, 피내, 복막내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 수강내 및 흉골내 주사 및 주입이 포함된다.

본원에서 사용될 때의 "전신적 투여", "전신적으로 투여되는", "말초 투여" 및 "말초적으로 투여되는"이라는 구는 환자의 시스템에 들어가도록 하는 직접 중추 신경계에 대한 것이 아니어서 대사 및 기타 유사 과정에 적용되는, 화합물, 약물 또는 기타 물질의 투여, 예를 들면 피하 투여를 의미한다.

이러한 화합물들은 경구, 예를 들면 분무에 의한 것과 같은 비내, 직장, 질내, 비경구, 분말, 연고 또는 액적에 의한 것과 같은 수조내(intracisternal) 및 국소 (협측 및 설하 포함)에 의한 것을 포함하여, 임의의 적합한 투여 경로에 의해 치료를 위하여 인간 및 기타 동물에게 투여될 수 있다.

선택되는 투여 경로에 관계없이, 적합한 수화 형태로, 및/또는 본 발명 제약 조성물에 사용될 수 있는 본 발명의 화합물은 업계 숙련자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제약상 허용되는 투약 형태로 제제화된다.

본 발명 제약 조성물에서의 활성 성분의 실제 투약량 수준은 환자에 독성이 아니면서도, 특정 환자, 조성물 및 투여 양식에 있어서의 원하는 치료 응답을 달성하는 데에 효과적인 활성 성분의 양을 얻을 수 있도록 변화될 수 있다.

선택되는 투약량 수준은 사용되는 구체적인 본 발명 화합물, 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 구체적인 화합물의 배설률, 치료 기간, 사용되는 구체적인 화합물과 조합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성, 중량, 상태, 일반적인 건강 및 선행 의료 이력, 및 의료 업계에 잘 알려져 있는 유사 요인을 포함한 다양한 요인들에 따라 달라지게 된다.

업계 일반의 숙련도를 가지는 의사 또는 수의사라면, 요구되는 제약 조성물의 유효량을 쉽게 결정 및 처방할 수 있다. 예를 들면, 상기 의사 또는 수의사는 제약 조성물에 사용되는 본 발명 화합물의 투여량을 원하는 치료 효과를 달성하기 위하여 요구되는 것에 비해 더 낮은 수준에서 시작하여 원하는 효과가 달성될 때까지 투약량을 점증시킬 수 있다.

일반적으로, 본 발명 화합물의 적합한 하루 투여량은 치료 효과를 산출하는 데에 효과적인 최저 투여량인 화합물의 양일 것이다. 그와 같은 유효 투여량은 일반적으로 상기한 요인들에 따라 달라지게 된다. 일반적으로, 표시된 진통 효과를 위하여 사용될 때의 환자에 대한 본 발명 화합물의 정맥내 및 피하 투여량은 킬로그램 체중 당 하루 약 0.0001 내지 약 100 mg, 더욱 바람직하게는 kg 당 하루 약 0.01 내지 약 50 mg, 더욱 더 바람직하게는 kg 당 하루 약 1.0 내지 약 100 mg의 범위일 것이다. 유효량은 Wnt 신호전달-관련 장애를 치료하는 양이다.

필요에 따라, 활성 화합물의 효과적인 하루 투여량은 적절한 간격으로 별도 투여되는 2, 3, 4, 5, 6 이상의 하위-투여량으로, 임의로는 단위 투약 형태로 하루 종일 투여될 수 있다.

본 발명의 화합물은 단독으로 투여되는 것이 가능하지만, 제약 조성물로서 상기 화합물을 투여하는 것이 바람직하다.

합성 절차

본 발명의 화합물은 비제한적으로 하기의 조건들 중 임의의 1종 이상을 포함하여 업계 숙련자에게 알려져 있는 절차를 사용함으로써, 통상적으로 가용한 화합물들로부터 제조된다:

문맥상 다르게 표시되지 않는 한 본 명세서의 영역 내에서는, 본 발명 화합물의 원하는 구체적인 최종 생성물의 구성요소가 아닌 용이하게 제거가능한 기만이 "보호 기"로 지칭된다. 이와 같은 보호 기에 의한 관능기의 보호, 상기 보호 기 자체, 및 그의 절단 반응에 대해서는 예를 들면 표준 참조문헌 저작들 예컨대 [Science of Synthesis: Houben-Weyl Methods of Molecular Transformation. Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany. 2005. 41627 pp. (URL: http://www.science-of-synthesis.com (Electronic Version, 48 Volumes))]; [J.F.W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, London and New York 1973], [T.W. Greene and P.G.M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", Third edition, Wiley, New York 1999], ["The Peptides"; Volume 3 (editors: E. Gross and J. Meienhofer), Academic Press, London and New York 1981], ["Methoden der organischen Chemie" (Methods of Organic Chemistry), Houben Weyl, 4th edition, Volume 15/I, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974], [H.-D. Jakubke and H. Jeschkeit, "Aminosauren, Peptide, Proteine" (Amino acids, Peptides, Proteins), Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach, and Basel 1982], 및 [Jochen Lehmann, "Chemie der Kohlenhydrate: Monosaccharide und Derivate" (Chemistry of Carbohydrates: Monosaccharides and Derivatives), Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974.]에 기술되어 있다. 보호 기의 특성은 그것이 예를 들면 가용매제거(solvolysis), 환원, 광분해에 의해, 또는 다르게는 생리학적 조건하에서 (예컨대 효소적 절단에 의해) 용이하게 (즉 원치않는 2차 반응의 발생 없이) 제거될 수 있다는 것이다.

본 발명 화합물의 산 부가염은 제약상 허용되는 산으로부터 가장 적합하게 형성되며, 여기에는 예를 들면 무기 산 예컨대 염산, 브롬화수소산, 황산 또는 인산 및 유기 산 예컨대 숙신산, 말레산, 아세트산 또는 푸마르산을 사용하여 형성되는 것들이 포함된다. 다른 제약상 허용가능하지 않은 염 예컨대 옥살레이트는 예를 들면 실험실에서 사용하기 위한, 또는 이후의 제약상 허용되는 산 부가염으로의 전환을 위한 본 발명 화합물의 단리에 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 영역 내에 포함되는 것은 본 발명의 용매화물 및 수화물이다.

제공된 화합물 염의 원하는 화합물 염으로의 전환은 제공된 염의 수용액이 염기 예컨대 나트륨 카르보네이트 또는 수산화 칼륨의 용액으로 처리되어 유리 염기를 방출하고, 다음에 이것이 에테르와 같은 적절한 용매로 추출되는, 표준 기술을 적용하는 것에 의해 달성된다. 다음에, 상기 유리 염기가 수성 부분으로부터 분리되어 건조된 후, 필수 산으로 처리됨으로써, 원하는 염이 산출된다.

본 발명 소정 화합물의 생체내 가수분해가능 에스테르 또는 아미드는 유리 히드록시 또는 아미노 관능기를 가지는 화합물을 염화 메틸렌 또는 클로로포름과 같은 불활성 용매 중에서 염기의 존재하에 원하는 에스테르의 산 염화물로 처리하는 것에 의해 형성될 수 있다. 적합한 염기에는 트리에틸아민 또는 피리딘이 포함된다. 역으로, 유리 카르복시 기를 가지는 본 발명의 화합물은 활성화, 및 이후의 적합한 염기 존재하의 원하는 알콜을 사용한 처리를 포함할 수 있는 표준 조건을 사용하여 에스테르화될 수 있다.

제약상 허용되는 부가염의 예에는 비제한적으로 비-독성의 무기 및 유기 산 부가염 예컨대 염산으로부터 유래하는 염산염, 브롬화수소산으로부터 유래하는 브롬화수소산염, 질산으로부터 유래하는 질산염, 과염소산으로부터 유래하는 과염소산염, 인산으로부터 유래하는 포스페이트, 황산으로부터 유래하는 황산염, 포름산으로부터 유래하는 포르메이트, 아세트산으로부터 유래하는 아세테이트, 아코니트산으로부터 유래하는 아코네이트, 아스코르브산으로부터 유래하는 아스코르베이트, 벤젠술폰산으로부터 유래하는 벤젠술포네이트, 벤조산으로부터 유래하는 벤조에이트, 신남산으로부터 유래하는 신나메이트, 시트르산으로부터 유래하는 시트레이트, 엠본산으로부터 유래하는 엠보네이트, 에난트산으로부터 유래하는 에난테이트, 푸마르산으로부터 유래하는 푸마레이트, 글루탐산으로부터 유래하는 글루타메이트, 글리콜산으로부터 유래하는 글리콜레이트, 락트산으로부터 유래하는 락테이트, 말레산으로부터 유래하는 말레에이트, 말론산으로부터 유래하는 말로네이트, 만델산으로부터 유래하는 만델레이트, 메탄 술폰산으로부터 유래하는 메탄술포네이트, 나프탈렌-2-술폰산으로부터 유래하는 나프탈렌-2-술포네이트, 프탈산으로부터 유래하는 프탈레이트, 살리실산으로부터 유래하는 살리실레이트, 소르브산으로부터 유래하는 소르베이트, 스테아르산으로부터 유래하는 스테아레이트, 숙신산으로부터 유래하는 숙시네이트, 타르타르산으로부터 유래하는 타르타레이트, p-톨루엔 술폰산으로부터 유래하는 톨루엔-p-술포네이트 등이 포함된다. 특히 바람직한 염은 본 발명 화합물의 나트륨, 라이신 및 아르기닌 염이다. 이와 같은 염들은 업계에 잘 알려져 있으며 기술되어 있는 절차에 의해 형성될 수 있다.

제약상 허용되는 것으로 간주될 수 없는 옥살산과 같은 기타 산들이 본 발명의 화학적 화합물 및 그의 제약상 허용되는 산 부가염을 수득하는 데에 중간생성물로서 유용한 염의 제조에 유용할 수 있다.

본 발명 화학적 화합물의 금속염에는 카르복시 기를 함유하는 본 발명 화학적 화합물의 나트륨염과 같은 알칼리 금속염이 포함된다.

본 발명에 따라 수득가능한 이성질체의 혼합물은 원래 알려져 있는 방식에 의해 개별 이성질체로 분리될 수 있는데; 부분입체이성질체는 예를 들면 다상 용매 혼합물 사이에서의 분배, 재결정화, 및/또는 예컨대 실리카 겔 상에서의 크로마토그래피 분리에 의해, 또는 예컨대 역상 컬럼 상에서의 중압 액체 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있으며, 라세미체는 예를 들면 광학적으로 순수한 염-형성 반응물과의 염의 형성, 및 그렇게 수득가능한 부분입체이성질체 혼합물의 예를 들면 분별 결정화 또는 광학적으로 활성인 컬럼 물질 상에서의 크로마토그래피에 의한 분리에 의해 분리될 수 있다.

중간생성물 및 최종 생성물은 예컨대 크로마토그래피법, 분배법, (재-)결정화 등을 사용한 표준 방법에 따라 후처리 및/또는 정제될 수 있다.

일반 공정 조건

본 개시 전체에 걸쳐 언급되는 모든 공정에는 일반적으로 하기가 적용된다.

본 발명의 화합물을 합성하기 위한 공정 단계들은 예를 들면 사용되는 반응물에 대하여 불활성이며 그들을 용해시키는 용매 또는 희석제를 포함한 용매 또는 희석제의 부재, 또는 통상적으로는 존재하에, 반응 및/또는 반응물의 특성에 따라 촉매, 축합제 또는 중화제, 예를 들면 이온 교환제, 예컨대 H+ 형태의 양이온 교환제의 부재 또는 존재하에, 감소되거나, 정상적이거나 상승된 온도, 예를 들면 대략 -80 ℃ 내지 대략 150 ℃, 예컨대 -80 내지 -60 ℃, 실온, -20 내지 40 ℃, 또는 환류 온도를 포함한 예컨대 약 -100 ℃ 내지 약 190 ℃의 온도 범위에서, 주변 압력 하 또는 밀폐 용기 중에서, 경우에 따라 가압하에서, 및/또는 불활성 분위기에서, 예를 들면 아르곤 또는 질소 분위기하에서, 구체적으로 언급된 것들을 포함하여 원래 알려져 있는 반응 조건하에 수행될 수 있다.

반응의 모든 단계에서, 형성되는 이성질체 혼합물은, 예를 들면 문헌 [Science of Synthesis: Houben-Weyl Methods of Molecular Transformation. Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany. 2005]에 기술되어 있는 방법과 유사하게, 개별 이성질체, 예컨대 부분입체이성질체 또는 거울상이성질체로, 또는 임의의 원하는 이성질체 혼합물, 예컨대 라세미체 또는 부분입체이성질체 혼합물로 분리될 수 있다.

임의의 구체적인 반응에 적합한 용매가 선택될 수 있는 용매들에는, 공정의 기술에서 다르게 표시되지 않는 한, 구체적으로 언급된 것들, 또는 예를 들면 물, 에스테르, 예컨대 저급 알킬-저급 알카노에이트, 예컨대 에틸 아세테이트, 에테르, 예컨대 지방족 에테르, 예컨대 디에틸 에테르, 또는 고리형 에테르, 예컨대 테트라히드로퓨란 또는 디옥산, 액체 방향족 탄화수소, 예컨대 벤젠 또는 톨루엔, 알콜, 예컨대 메탄올, 에탄올 또는 1- 또는 2-프로판올, 니트릴, 예컨대 아세토니트릴, 할로겐화 탄화수소, 예컨대 염화 메틸렌 또는 클로로포름, 산 아미드, 예컨대 디메틸포름아미드 또는 디메틸 아세트아미드, 염기, 예컨대 헤테로고리형 질소 염기, 예컨대 피리딘 또는 N-메틸피롤리딘-2-온, 카르복실산 무수물, 예컨대 저급 알칸산 무수물, 예컨대 아세트산 무수물, 고리형, 선형 또는 분지형 탄화수소, 예컨대 시클로헥산, 헥산 또는 이소펜탄, 또는 상기 용매들의 혼합물, 예컨대 수용액이 포함된다. 상기 용매 혼합물은 예를 들면 크로마토그래피 또는 분배에 의한 후처리에 사용될 수도 있다.

그의 염을 포함한 상기 화합물들은 수화물의 형태로 수득될 수도 있거나, 또는 그의 결정이 예를 들면 결정화에 사용된 용매를 포함할 수 있다. 서로 다른 결정질 형태들이 존재할 수 있다.

본 발명은 공정의 어느 단계에서 중간생성물로서 수득가능한 화합물이 개시 물질로서 사용되어 나머지 공정 단계들이 수행되거나, 또는 상기 반응 조건하에서 개시 물질이 형성되어 예를 들면 보호된 형태 또는 염의 형태인 유도체의 형태로 사용되거나, 또는 본 발명에 따른 공정에 의해 수득가능한 화합물이 상기 공정 조건하에서 제조된 후, 제자리에서 추가적으로 처리되는, 공정의 형태들에 관한 것이기도 하다.

전구약물

본 발명은 또한 본 발명 화합물의 제약상 허용되는 전구약물을 함유하는 제약 조성물, 및 본 발명 화합물의 제약상 허용되는 전구약물을 투여하는 것을 통한 Wnt 신호전달-관련 장애의 치료 방법을 포함한다. 예를 들면, 자유 아미노, 아미도, 히드록시 또는 카르복실 기를 가지는 본 발명의 화합물은 전구약물로 전환될 수 있다. 전구약물에는 아미노산 잔기, 또는 2개 이상 (예, 2, 3 또는 4개) 아미노산 잔기의 폴리펩티드 사슬이 아미드 결합 또는 에스테르 결합을 통하여 본 발명 화합물의 자유 아미노, 히드록시 또는 카르복실산 기에 공유 결합되어 있는 화합물이 포함된다. 상기 아미노산 잔기에는 통상적으로 3글자 기호에 의해 지칭되는 20 종의 천연 발생 아미노산들이 포함되며, 또한 4-히드록시프롤린, 히드록시라이신, 데모신, 이소데모신, 3-메틸히스티딘, 노르발린, 베타-알라닌, 감마-아미노부티르산, 시트룰린 호모시스테인, 호모세린, 오르니틴 및 메티오닌 술폰이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 추가적인 유형의 전구약물들 역시 포함된다. 예를 들면, 자유 카르복실 기가 아미드 또는 알킬 에스테르로서 유도체화될 수 있다. 자유 히드록시 기는, 문헌 [Advanced Drug Delivery Reviews, 1996, 19, 115]에 개설되어 있는 바와 같이, 비제한적으로 헤미숙시네이트, 포스페이트 에스테르, 디메틸아미노아세테이트, 및 포스포릴옥시메틸옥시카르보닐을 포함한 기들을 사용하여 유도체화될 수 있다. 히드록시 및 아미노 기의 카르바메이트 전구약물 역시 포함되며, 카르보네이트 전구약물, 히드록시 기의 술포네이트 에스테르 및 술페이트 에스테르도 마찬가지이다. 아실 기가 비제한적으로 에테르, 아민 및 카르복실산 관능기를 포함한 기에 의해 임의 치환된 알킬 에스테르일 수 있거나, 또는 아실 기가 상기한 바와 같은 아미노산 에스테르인 (아실옥시)메틸 및 (아실옥시)에틸 에테르로서의 히드록시 기의 유도체화 역시 포함된다. 이와 같은 유형의 전구약물들에 대해서는 문헌 [J. Med. Chem. 1996, 39, 10]에 기술되어 있다. 자유 아민은 아미드, 술폰아미드 또는 포스폰아미드로서 유도체화될 수도 있다. 이러한 전구약물 잔기들 모두는 비제한적으로 에테르, 아민 및 카르복실산 관능기를 포함한 기들을 도입할 수 있다.

따라서, 본 발명의 화합물에 대한 모든 언급들은 경우에 따라 본 발명 화합물의 상응하는 전구-약물 및 부형제들 역시 언급하고 있는 것으로 이해되어야 한다.

융합 단백질

본 발명은 키메라 또는 융합 단백질을 제공한다. 본원에서 사용될 때, ""키메라 단백질" 또는 "융합 단백질"은 이종유래의 폴리펩티드 (즉, 본 발명의 동일한 폴리펩티드가 아닌 다른 폴리펩티드)에 작동적으로 연결되어 있는 본 발명 폴리펩티드의 전부 또는 일부 (바람직하게는 생물학적으로 활성인 것)를 포함한다. 융합 단백질 내에서, "작동적으로 연결된"이라는 용어는 본 발명의 폴리펩티드와 이종유래의 폴리펩티드가 골격 중에 서로 융합되어 있음을 표시하고자 하는 것이다. 상기 이종유래 폴리펩티드는 본 발명 폴리펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 융합될 수 있다.

한 가지 유용한 융합 단백질은 본 발명의 폴리펩티드가 GST 서열의 C 말단에 융합되어 있는 GST 융합 단백질이다. 상기 융합 단백질은 본 발명 재조합 폴리펩티드의 정제를 용이하게 할 수 있다.

또 다른 구현예에서, 융합 단백질은 그의 N 말단에 이종유래 신호 서열을 함유한다. 예를 들면, 본 발명 폴리펩티드의 원래 신호 서열이 제거된 후, 또 다른 단백질 유래의 신호 서열로 치환될 수 있다. 예를 들면, 바큘로바이러스(baculovirus) 외피 단백질의 gp67 분비 서열이 이종유래의 신호 서열로서 사용될 수 있다 (문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992]). 진핵 이종유래 신호 서열의 다른 예로써, 멜리틴(melittin) 및 인간 태반 알칼리성 포스파타제 (스트라타진(Stratagene) 사; 캘리포니아 라 졸라 소재)의 분비 서열이 포함된다. 또 다른 예에서, 유용한 원핵 이종유래 신호 서열로는 phoA 분비 신호 (상기 문헌 [Sambrook et al.]) 및 단백질 A 분비 서열 (파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech) 사; 뉴저지 피스카타웨이 소재)이 포함된다.

또 다른 구현예에서, 상기 융합 단백질은 본 발명 폴리펩티드의 전부 또는 일부가 면역글로뷸린 단백질 족의 구성원으로부터 유래하는 서열에 융합되어 있는 면열글로뷸린 융합 단백질이다. 본 발명의 상기 면역글로뷸린 융합 단백질은 제약 조성물에 도입되어 대상에게 투여됨으로써, 리간드 (가용성 또는 막 결합)와 세포 표면 상의 단백질 (수용체) 사이의 상호작용을 억제하고, 그에 의해 생체내 신호 전달을 억제할 수 있다. 상기 면역글로뷸린 융합 단백질은 본 발명 폴리펩티드 인지체 리간드의 생체이용률에 영향을 주기 위하여 사용될 수 있다. 리간드/수용체 상호작용의 억제는 증식성 및 분화성 장애를 치료하는 것, 및 세포 생존을 조정 (예컨대 촉진 또는 억제)하는 것 모두에 치료적으로 유용할 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 면역글로뷸린 융합 단백질은 대상에서 본 발명의 폴리펩티드에 대해 야기되는 항체를 생성시키기 위한 면역원으로서, 리간드를 정제하기 위하여, 그리고 스크리닝 분석에서는 수용체의 리간드와의 상호작용을 억제하는 분자를 확인하기 위하여 사용될 수 있다.

본 발명의 키메라 단백질 및 융합 단백질은 표준 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 융합 유전자는 자동화 DNA 합성기를 포함한 통상적인 기술에 의해 합성될 수 있다. 다르게는, 2개의 연속되는 유전자 단편 사이에 이후 어닐링되어 재증폭됨으로써 키메라 유전자 서열을 생성시킬 수 있는 상보적인 돌출부를 발생시키는 앵커 프라이머를 사용하여, 유전자 단편의 PCR 증폭이 수행될 수 있다 (예컨대 상기 문헌 [Ausubel et al.] 참조). 또한, 이미 융합 잔기 (예, GST 폴리펩티드)를 코딩하고 있는 많은 발현 벡터들이 시중에서 구입가능하다. 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 그와 같은 발현 벡터에 클로닝됨으로써, 융합 잔기가 골격 내에서 본 발명의 폴리펩티드에 연결될 수 있다.

RNAi

본 발명은 소형 간섭 리보핵산(small interfering ribonucleic acid) 서열 (siRNA)은 물론, siRNA를 사용하여 TNKS1/2 유전자, 또는 세포 또는 포유류에서 악신 안정화를 초래하는 기타 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 siRNA를 사용하여, TNKS1/2 유전자 또는 악신 안정화를 초래하는 유전자의 비정상적인 발현에 의해 야기되거나, 상기 유전자가 필수 구성원인 경로의 비정상적인 신호전달에 의해 야기되는 포유류에서의 병리학적 이상 및 질병을 포함한 Wnt 신호전달-관련 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. siRNA는 RNA 간섭 (RNAi)으로 알려져 있는 과정을 통하여 mRNA의 서열-특이적 분해를 유도한다.

본 발명의 siRNA는 길이가 30 뉴클레오티드 미만, 일반적으로는 길이가 19-24 뉴클레오티드이며, TNKS1/2 유전자 또는 악신 안정화를 초래하는 기타 유전자 mRNA 전사체의 적어도 일부에 대하여 실질적으로 상보성인 영역을 가지는 RNA 가닥 (안티센스 가닥)을 포함한다. 이러한 siRNA의 사용은 예를 들면 Wnt 신호전달 경로에 관련되어 있는 유전자 mRNA의 표적화된 분해를 가능케 한다.

본 발명에 따른 상기 siRNA 분자는 RNA 간섭 ("RNAi")을 매개한다. "RNAi"라는 상기 용어에 대해서는 업계에 잘 알려져 있으며, 통상적으로는 표적 유전자에 상보적인 영역을 가지는 siRNA에 의한 세포에서의 하나 이상의 표적 유전자의 억제를 의미하는 것으로 이해된다. siRNA에 대하여 RNAi를 매개하는 그의 능력을 시험하기 위한 다양한 분석들이 업계에 알려져 있다 (예를 들면 문헌 [Elbashir et al., Methods 26 (2002), 199-213] 참조). 유전자 발현에 대한 본 발명에 따른 siRNA의 효과는 통상적으로, 본 발명에 따른 RNA 분자로 처리되지 않은 세포와 비교하였을 때, 10 ％, 33 ％, 50 ％, 90 ％, 95 ％ 또는 99 ％ 이상 억제된 표적 유전자의 발현을 초래하게 된다.

본 발명에 따른 "siRNA" 또는 "소형-간섭 리보핵산"은 하기의 양태들을 포함하여, 업계에 알려져 있는 의미들을 가진다. 상기 siRNA는 생리학적 조건하에서 상보성 영역을 따라 하이브리드화하는 2 가닥의 리보뉴클레오티드로 구성된다. 상기 가닥들은 별도이나, 소정 구현예에서는 그들이 분자 링커에 의해 연결될 수 있다. 상기 개별 리보뉴클레오티드들은 변형되지 않은 천연 발생 리보뉴클레오티드, 변형되지 않은 천연 발생 데옥시리보뉴클레오티드일 수 있거나, 또는 본원의 다른 곳에서 기술되는 바와 같이 화학적으로 변형되거나 합성될 수 있다.

본 발명에 따른 siRNA 분자는 표적 유전자 mRNA의 영역과 실질적으로 동일한 이중-가닥의 영역을 포함한다. 표적 유전자의 상응하는 서열과 100 ％의 동일성을 가지는 영역이 적합하다. 이와 같은 상태는 "완전히 상보성인" 것으로 지칭된다. 그러나, 상기 영역은 표적화되는 mRNA 영역의 길이에 따라 표적 유전자의 상응 영역과 비교하여 1, 2 또는 3개의 불일치를 함유할 수도 있으며, 그에 따라 완전히 상보성이 아닐 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 RNA 분자는 하나의 주어진 유전자를 특이적으로 표적화한다. 원하는 mRNA만을 표적화하기 위하여, 상기 siRNA 반응물은 표적 mRNA에 대한 100 ％의 상동성, 및 세포 또는 생물체에 존재하는 모든 다른 유전자에 대한 2개 이상의 불일치 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 특이적 표적 서열의 발현을 효과적으로 억제하기 위한 충분한 서열 동일성을 가지는 siRNA를 분석 및 확인하는 방법에 대해서는 업계에 알려져 있다. 서열 동일성은 업계에 알려져 있으며 (문헌 [Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991], 및 거기에서 인용되는 참조문헌들 참조), 예를 들면 결핍(default) 파라미터를 사용하여 베스트피트(BESTFIT) 소프트웨어 프로그램에서 실행되는 바와 같은 스미스-워터맨 알고리듬(Smith-Waterman algorithm)에 의해 뉴클레오티드 서열들 사이의 ％ 차이를 계산하는 (예컨대 위스콘신 대학교 제네틱 컴퓨팅 그룹(Genetic Computing Group)), 서열 비교 및 정렬 알고리듬에 의해 최적화될 수 있다.

RNAi 반응물의 효율에 영향을 주는 또 다른 요인은 표적 유전자의 표적 영역이다. RNAi 반응물에 의한 억제에 효과적인 표적 유전자의 영역은 실험에 의해 결정될 수 있다. 적합한 mRNA 표적 영역은 코딩 영역일 수 있다. 또한 적합한 것은 5'-UTR, 3'-UTR, 및 스플라이싱 연결부와 같은 비해독 영역이다. 예를 들면, 문헌 [Elbashir S.M. et al, 2001 EMBO J., 20, 6877-6888]에 기술되어 있는 바와 같은 핵산전달감염 분석이 이와 같은 목적을 위하여 수행될 수 있다. 숙련자에게 잘 알려져 있는 수많은 다른 적합한 분석 및 방법들이 업계에 존재한다.

본 발명에 있어서, 표적에 상보성인 siRNA 영역의 길이는 10 내지 100 뉴클레오티드, 12 내지 25 뉴클레오티드, 14 내지 22 뉴클레오티드, 또는 15, 16, 17 또는 18 뉴클레오티드일 수 있다. 상응하는 표적 영역에 대한 불일치가 존재하는 경우, 상보성 영역의 상기 길이는 일반적으로 약간 더 길 필요가 있다.

siRNA가 돌출된 말단 (표적에 대하여 상보성일 수 있거나, 아닐 수 있음), 또는 표적 유전자가 아닌 자신에 대하여 상보성인 추가 뉴클레오티드를 보유할 수 있기 때문에, 각 별도 가닥 siRNA의 총 길이는 10 내지 100 뉴클레오티드, 15 내지 49 뉴클레오티드, 17 내지 30 뉴클레오티드 또는 19 내지 25 뉴클레오티드일 수 있다.

"각 가닥은 49 뉴클레오티드 이하임"이라는 구는 모든 변형 또는 비변형 뉴클레오티드를 포함하나, 가닥의 3' 또는 5' 말단에 첨가될 수 있는 임의의 화학적 잔기는 포함하지 않은, 가닥의 연속되는 뉴클레오티드의 총 수를 의미한다. 가닥에 삽입된 짧은 화학적 잔기는 계수되지 않으며, 2개의 별도 가닥을 연결하도록 설계된 화학적 링커도 연속되는 뉴클레오티드를 생성시키는 것으로는 간주되지 않는다.

"5' 말단 또는 3' 말단 중 하나 이상에서의 1 내지 6 뉴클레오티드 돌출부"라는 구는 생리학적 조건하에서 2개의 별도 가닥으로부터 형성되는 상보성 siRNA의 구조를 지칭한다. 말단 뉴클레오티드들이 siRNA 이중-가닥 영역의 일부인 경우, 상기 siRNA는 블런트 말단으로 간주된다. 하나 이상의 뉴클레오티드가 일 말단에서 쌍을 이루지 않는 경우, 돌출부가 생성된다. 상기 돌출부 길이는 돌출된 뉴클레오티드의 수에 의해 측정된다. 돌출된 뉴클레오티드는 양 가닥의 5' 말단 또는 3' 말단 중 어느 것 상에 존재할 수 있다.

본 발명에 따른 siRNA는 하나 이상의 가닥에 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것에 의해 경구 전달에 적합한 고도의 생체내 안정성을 부여한다. 따라서, 본 발명에 따른 siRNA는 하나 이상의 변형되거나 비-천연인 리보뉴클레오티드를 함유한다. 많은 공지의 화학적 변형들에 대한 장황한 기술이 공개 PCT 특허 출원 WO 200370918호에 제시되어 있으므로, 여기에서는 반복하지 않도록 한다. 경구 전달에 적합한 변형에 대해서는 본원의 실시예 및 상세한 설명에 더욱 구체적으로 제시되어 있다. 적합한 변형에는 당 잔기 (즉, 예를 들면 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE와 같은 당 잔기의 2' 위치 (문헌 [Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504]), 즉 알콕시알콕시 기), 또는 염기 잔기 (즉 교호하는 뉴클레오티드 사슬에서 또 다른 특정 염기와 쌍을 이루는 능력을 유지하는 비-천연 또는 변형 염기)에 대한 변형이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 기타 변형에는 비제한적으로 포스포에스테르 기를 치환하는 것 (예를 들면 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트를 사용하여 인접 리보뉴클레오티드를 연결)을 포함한 소위 '골격' 변형이 포함된다. 마지막으로, 본원에서 종종 3' 캡(cap) 또는 5' 캡으로 지칭되는 말단 변형이 중요할 수 있다. 캡은 업계 숙련자에게 알려져 있는 더욱 복잡한 화학으로 구성될 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명은 TNKS1/2 유전자 또는 악신 안정화를 초래하는 기타 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중-가닥 리보핵산 (dsRNA) 분자를 제공한다. 상기 dsRNA는 서로 상보성인 2개 이상의 서열을 포함한다. 상기 dsRNA는 제1 서열을 포함하는 센스 가닥 및 제2 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다. 상기 안티센스 가닥은 TNKS1/2 유전자 또는 악신 안정화를 초래하는 기타 유전자를 코딩하는 mRNA의 적어도 일부에 실질적으로 상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 상보성 영역은 길이가 30 뉴클레오티드 미만, 일반적으로는 길이가 19-24 뉴클레오티드이다. 상기 dsRNA는 TNKS1/2 유전자 또는 악신 안정화를 초래하는 기타 유전자를 발현하는 세포와 접촉시 상기 유전자의 발현을 40 ％ 이상 억제한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 dsRNA 중 하나를 포함하는 세포를 제공한다. 상기 세포는 일반적으로 포유류 세포, 예컨대 인간 세포이다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 dsRNA 중 하나 이상, 및 제약상 허용되는 담체 또는 전달 운반체를 포함하는, 생물체, 일반적으로는 인간 대상에서 TNKS1/2 유전자 또는 악신 안정화를 초래하는 기타 유전자의 발현을 억제하기 위한 제약 조성물을 제공한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기의 단계들을 포함하는, 세포에서 TNKS1/2 유전자 또는 악신 안정화를 초래하는 기타 유전자의 발현을 억제하기 위한 방법을 제공한다:

(a) 이중-가닥 리보핵산 (dsRNA)를 세포에 도입하는 단계 (여기서 상기 dsRNA는 서로 상보성인 2개 이상의 서열을 포함함) (상기 dsRNA는 제1 서열을 포함하는 센스 가닥 및 제2 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함함. 상기 안티센스 가닥은 TNKS1/2 유전자 또는 악신 안정화를 초래하는 기타 유전자를 코딩하는 mRNA의 적어도 일부에 실질적으로 상보성인 상보성 영역을 포함하며, 여기서 상기 상보성 영역은 길이가 30 뉴클레오티드 미만, 일반적으로는 길이가 19-24 뉴클레오티드이고, 상기 dsRNA는 TNKS1/2 유전자 또는 악신 안정화를 초래하는 기타 유전자를 발현하는 세포와 접촉시 상기 유전자의 발현을 40 ％ 이상 억제함); 및

(b) TNKS1/2 유전자 또는 악신 안정화를 초래하는 기타 유전자 mRNA 전사체의 분해를 야기하기에 충분한 시간 동안 단계 (a)에서 생성된 세포를 유지함으로써, 세포에서의 상기 유전자의 발현을 억제하는 단계.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명 siRNA 중 하나의 하나 이상의 가닥을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 조절 서열을 포함하는, 세포에서 TNKS1/2 유전자 또는 악신 안정화를 초래하는 기타 유전자의 발현을 억제하기 위한 벡터를 제공한다.

본 발명의 억제성 핵산 화합물은 시중에서 구입가능한 자동화 DNA 합성기, 예를 들면 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems) (캘리포니아 포스터 시티 소재) 사의 모델 380B, 392 또는 394 DNA/RNA 합성기 등의 기기에서 통상적인 수단에 의해 합성될 수 있다. 포스포르아미디트(Phosphoramidite) 화학이 사용될 수 있다. 본 발명의 상기 억제성 핵산 화합물은 변형될 수도 있는데, 예를 들면 많은 참조문헌에 기술되어 있는 예컨대 포스포로티오에이트, 포르포로디티오에이트, 포스포르아미디트 등과 같은 뉴클레아제 내성 골격이 사용될 수 있다. 상기 억제성 핵산의 길이는 생물학적 활성이 억제되는 것을 보장하기에 충분해야 한다. 따라서, 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드의 경우에는, 특이적 결합이 원하는 표적 폴리뉴클레오티드에서만 이루어지고 다른 뜻밖의 부위에서는 그렇지 않게 되는 것을 보장하기에 충분하도록 커야 한다. 길이의 상위 범위는 길이가 약 30-40 뉴클레오티드를 초과하는 올리고머를 합성 및 정제하는 것의 불편성 및 비용, 더 짧은 올리코뉴클레오티드에 비해 더 긴 올리고뉴클레오티드의 불일치에 대한 더 큰 내성등을 포함하여, 몇 가지 요인에 의해 결정된다. 바람직하게는, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 약 15 내지 40 뉴클레오티드 범위의 길이를 가진다. 더욱 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오티드 잔기는 약 18 내지 25 뉴클레오티드 범위의 길이를 가진다.

소형 간섭 RNA (siRNA) 분자로도 지칭되는 이중-가닥 RNA, 즉 센스-안티센스 RNA는 TNKS1/2 유전자 또는 악신 안정화를 초래하는 기타 유전자에 대한 핵산의 발현을 억제하는 데에 사용될 수도 있다. RNA 간섭은 하나의 가닥이 표적 mRNA의 코딩 영역에 상응하는 외인성의 짧은 RNA 이중체가 투여되는 방법이다 (문헌 [Elbashir et al. (2001) Nature 411: 494]). 세포에의 진입시, siRNA 분자는 외인성 RNA 이중체의 분해 뿐만 아니라, 내인성의 메신저 RNA를 포함하여 동일한 서열을 가지는 단일-가닥 RNA의 분해도 야기한다. 따라서, 상기 기술이 촉매 기작을 통하여 작용하는 것으로 여겨지기 때문에, siRNA는 통상적인 안티센스 RNA 방법론에 비해 더욱 강력하고 효과적일 수 있다. 바람직한 siRNA 분자는 통상적으로 19 내지 25 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 약 21 뉴클레오티드 길이이다. 표적 세포에 siRNA를 전달하기 위한 효과적인 전략에는 예를 들면 물리적 또는 화학적 핵산전달감염을 사용한 전달이 포함된다.

다르게는, siRNA는 예를 들면 기능성 siRNA 또는 그의 전구체의 전사를 가능케 하는 다양한 PolIII 프로모터 발현 카세트를 사용하여 세포에서 발현될 수 있다. 예컨대 문헌 [Scherr et al. (2003) Curr. Med. Chem. 10(3): 245]; [Turki et al. (2002) Hum. Gene Ther. 13(18): 2197]; [Cornell et al. (2003) Nat. Struct. Biol. 10(2): 91]을 참조하라. 본 발명은 또한 예를 들면 미세-RNA (miRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)와 같이 RNA 간섭 (RNAi)을 매개할 수 있는 다른 소형 RNA도 포함한다.

하기의 실시예는 본 발명의 양태들을 수행함에 있어 본 발명자들에 의해 사용된 대표적인 기술들이다. 이러한 기술들이 본 발명의 실행을 위한 대표적인 바람직한 구현예이기는 하지만, 업계 숙련자라면, 본 개시내용에 비추어 본 발명의 기술사상 및 의도 영역으로부터 벗어나지 않고도 수많은 변형들이 만들어질 수 있다는 것을 알고 있을 것이라는 것이 인식되어야 한다.

[ 실시예 ]

실시예 1: 소형 분자 Wnt 억제제를 확인하기 위한 스크리닝 분석

Wnt/β-카테닌 경로의 소형 분자 억제제를 확인하기 위하여, HEK293 세포에서 Wnt-응답성 수퍼-탑플래시 (STF) 루시퍼라제 리포터 분석을 사용하여 100만 종이 넘는 화합물로 고-처리량 화합물 스크리닝을 수행하였다. 그의 선택성 프로필 및 가능성을 바탕으로, 이후의 연구는 본원에서 XAV939로 지칭되는 화합물에 초점을 맞추었다. XAV939는 HEK293 세포에서 Wnt3A 자극 STF 활성을 강하게 억제하였으나, CRE, NF-κB, 또는 TGFβ 루시퍼라제 리포터에는 영향을 주지 않았다. 반면, XAV939의 밀접한 구조 유사체인 LDW643은 Wnt3A 유도 STF 리포터에 대하여 활성을 가지지 않았다. XAV939 처리가 HEK293 세포에서 β-카테닌의 Wnt3A-유도 축적을 차단하는 것으로 밝혀짐으로써, 화합물이 β-카테닌 상류의 WNT 경로 활성을 조정한다는 것을 표시하였다.

XAV939가 β-카테닌 분해를 촉진하기 위하여 파괴 복합체의 상류에서, 또는 그의 수준에서 기능하는지의 여부를 시험하기 위하여, 결장직장암 세포주 SW480에서의 화합물 처리의 효과를 시험하였다. 상기 SW480 세포주는 절단된 APC 대립유전자에 근거하며, 그에 따라 손상된 파괴 복합체 활성을 가진다. 흥미롭게도, XAV939는 무손상 WNT 경로 단계들을 가지는 HEK293 세포에서와 같은 정도로 크게는 아니지만, SW480 세포에서도 STF 활성을 억제하였다. 이와 같은 STF 활성의 감소에 부합하여, XAV939는 SW480 세포에서 β-카테닌 풍부도는 감소시켰으나, β-카테닌 인산화 (S33/S37/T41)는 상당히 증가시킴으로써, XAV939가 β-카테닌의 인산화-의존성 분해를 촉진한다는 것을 암시하였다. 이러한 발견은 XAV939가, 아마도 파괴 복합체의 활성을 조정하는 것에 의해, 손상된 APC 기능을 가지는 세포에서도 β-카테닌 분해를 복구할 수 있다는 것을 나타낸다.

어떻게 XAV939가 파괴 복합체의 활성을 증가시킬 수 있는지를 조사하기 위하여, 공지의 WNT 경로 구성요소의 단백질 수준에 대한 화합물 처리의 효과를 연구하였다. 놀랍게도, 악신1 및 악신2의 단백질 수준은 XAV939 처리 후 강하게 증가된 반면, 그의 전사체 수준은 화합물 처리에 의해 영향을 받지 않았다. 또한, 아마도 증가된 악신 단백질 수준에 응답한 악신 복합체로의 GSK3β의 강화된 보충 때문에, 악신-GSK3β 복합체 형성의 강한 증가가 관찰되었다. 이와 같은 현상은 절단된 APC를 가지는 또 다른 결장직장암 세포주인 DLD-1 세포에서 악신1/2 단백질 수준, β-카테닌 분해, 및 β-카테닌 표적 유전자 발현에 대한 XAV939의 효과를 관찰함으로써 확인되었다.

중요하게도, SW480 세포에서의 악신1/2의 siRNA-매개 고갈은 β-카테닌 분해에 대한 XAV939의 효과를 역전시켜, STF 리포터에 대한 XAV939의 억제 활성을 감소시킴으로써, XAV939가 악신1/2 단백질 수준을 증가시키는 것에 의해 WNT 신호전달을 억제한다는 것을 추가적으로 표시하였다. 종합하여, 이러한 발견들은 XAV939가 GSK3β-악신 복합체 형성을 증가시키고, 그에 의해 β-카테닌의 GSK3β-의존성 인산화 및 프로테오좀 분해를 촉진한다는 것을 증명하고 있다.

적어도 실시예 1에 기술되어 있는 상기 수퍼탑플래시(STF)법은 하기와 같이 제조된 플라스미드를 사용한다: pTA-Luc (클론테크(Clontech) 사)에 12개의 TCF 결합 부위를 삽입하는 것에 의해 수퍼탑플래시 리포터를 생성시켰다. GFP 또는 FLAG 항원결정인자 중 어느 것을 사용하여 아미노 말단에 마우스 악신1 및 그의 돌연변이를 융합하고, 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터의 조절하에 레트로바이러스 벡터로 클로닝하였다. 인간 TNKS1/2 및 그의 돌연변이를 아미노 말단에 융합된 FLAG 항원결정인자로 표지한 후, 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터의 조절하에 포유류 발현 벡터로 클로닝하였다. 3개의 HA 항원결정인자와 카르복실 말단에서 융합된 초파리 악신을 메탈로티오네인 프로모터의 조절하에 초파리 발현 벡터에 클로닝하였다. 마우스 악신1의 아미노 말단 단편 (아미노산1-87)을 코딩하는 서열을 Tet-조절 발현 벡터 pcDNA4-TO (인비트로겐(invitrogen) 사)에 클로닝하였다. 게이트웨이(Gateway) 기술 (인비트로겐 사)을 사용하여 수종의 단백질들을 발현 벡터 pDEST15 (인비트로겐 사, 캘리포니아 칼스배드 소재): TNKS1-P(1088-1327), TNKS2-P(934-1166), TNKS2-SP (872-1166), PARP1-P (662-1014) 및 PARP16-P (93-273)로 클로닝하였다.

실시예 3: XAV939 는 탄키라제를 억제함으로써 악신 단백질 수준을 조절함

실시예 3a: iTRAQ 정량 화학적 단백질체 접근법

XAV939가 악신 단백질 수준을 상향조절하는 세포 효능 표적(들)을 확인하기 위하여, 3-채널 iTRAQ 정량 화학적 단백질체 접근법을 사용하였다. 이와 같은 전략은 HEK293 세포 용해질로부터의 친화성 포획(affinity capture) 세포 단백질에 대한 XAV939의 생물활성 유사체의 고정을 바탕으로 한다. 비-특이적 결합으로부터 특이적 결합을 구분하기 위하여, 고정된 화합물과의 배양 전에 과량 (20 μM)의 모 화합물 XAV939, 비활성 유사체 LDW643, 또는 DMSO를 세포 용해질에 투입함으로써, 경쟁 실험을 수행하였다. 고정된 화합물, 예컨대 추정 효능 표적(들) 및 잠재적 제외-표적들에 대한 특이적 결합은 XAV939와 경쟁해야 하였으나, LDW643과는 그렇지 않았다.

화학적 펩티드 표지 기술인 iTRAQ를 사용하여, 3종의 샘플을 다중화하고, LC-MS/MS 분석에 의해 운반체 (DMSO)에 비교한 결합 치환율 (％ 경쟁)을 정량하였다. 총 699종의 단백질을 정량하였다. 그러나, 폴리(ADP-리보스)폴리머라제 PARP1 (93 ％ 경쟁), PARP2 (88 ％ 경쟁), PARP5a/TNKS1 (79 ％ 경쟁), 및 PARP5b/TNKS2 (74 ％ 경쟁)을 포함한 18종의 단백질만이 가용성 XAV939와 유의성 있게 그리고 특이적으로 경쟁-완료(competed-off) (>65 ％, 평균의 >2σ)되었다. 또한, 공지의 PARP1 기질들, 예컨대 KU70 복합체 구성요소들 (XRCC5, XRCC6) 및 FACT 구성요소들 (SUPT16H, SSRP1)을 함유하는 수종의 단백질 모듈이, 아마도 PARP1에 동반된 공동-정제로 인하여, 유의성 있게 경쟁되었다. 대부분의 단백질들이 경쟁되지 않음으로써 (평균의 <2σ), 이들이 용액 중의 유리 화합물에 대한 결합과는 구별되는 결합 양식에 의해 친화성 매트릭스에 증강된 매우 풍부한 저친화성 바인더 또는 단백질 중 어느 것이라는 것을 암시한다.

문헌[Bantscheff et al (2007)]에 기술되어 있는 바와 같이 iTRAQ 절차를 수행하였다. 간단하게 말하자면, 젤 레인을 분리 범위를 가로질러 슬라이스로 절단하여, 젤-내 트립신 분해에 적용한 후, iTRAQ 표지화 (어플라이드 바이오시스템즈 사)에 적용하였다. DMSO 운반체 대조로부터 추출된 펩티드를 iTRAQ 시약 116으로 표지화한 후, 각각 iTRAQ 시약 114 및 115로 표지화된 화합물-처리 샘플로부터의 추출물과 합쳤다. 액체 크로마토그래피-LTQ 상에서의 직열 질량 분광법-오비트랩(Orbitrap) 질량 분광계 (써모-피니간(Thermo-Finnigan) 사)에 의해 서열분석을 수행하였다. iTRAQ 리포터 이온의 검출을 가능케 하는 펄스-Q 해리를 사용하여 직열 질량 스펙트럼을 생성시켰다. 펩티드 질량 및 단편 데이터를 사용하여 마스코트(Mascot) (매트릭스 사이언스(Matrix Science) 사)를 사용한 IPI 데이터베이스의 사내 조율 버젼을 구하였다. 데코이(decoy) 데이터베이스를 사용하여 단백질의 정체를 입증하였다. 사내 개발 소프트웨어를 사용하여 iTRAQ 리포터 이온-기반의 정량을 수행하였다.

실시예 3b: 화합물 경쟁

확인된 PARP 단백질에 대한 생체내 결합의 친화성을 확립하기 위하여 투여량 응답 화합물 경쟁 실험을 수행하였는데, XAV939가 0.1 μM에서 TNKS 결합을 차단하며, 1 μM에서 PARP1/2 결합을 차단한다는 것을 보여주었다. 예상한 바와 같이, 비활성 화합물 LDW643은 이와 같은 분석에서 활성을 가지지 않았다. Cy5-표지화된 XAV939 및 재조합 PARP 단백질을 사용하여 상기 화합물 결합을 추가적으로 특성화하였다. XAV939는 TNKS1 및 TNKS2의 촉매 (PARP) 도메인에 견고하게 결합하는 것으로 밝혀졌다 (각각 Kd 0.099 μM 및 0.093 μM). XAV939는 또한 낮은 결합 친화성을 가지기는 하지만 (Kd 1.2 μM), 재조합 PARP1에도 결합하였다.

TNKS1, TNKS2 및 PARP1의 XAV939에 대한 친화성 (평형 해리 상수, Kd)을 측정하기 위하여, 50 mM 트리스-HCl pH 8.0/50 mM NaCl/0.08 ％ 트리톤 X-100/10 mM MgCl2 중 Cy5에 접합된 50 nM XAV939 (XAV939^Cy5)를 사용한 TNKS1, TNKS2 또는 PARP1의 PARP 도메인을 함유하는 GST 융합 단백질의 적정을 블랙 384 웰 플레이트에서 30 ℃로 2시간 동안 배양하였다. 이어서, 퍼킨-엘머 엔비젼 플레이트 리더(Perkin-Elmer Envision Plate Reader)에서 Cy5 FP에 대하여 최적화된 광학기기 (최적화된 Cy5 FP 듀얼 에미션 라벨(Dual Emission Label), 퍼킨 엘머 사)를 사용하여 형광 편광 (FP) 값을 수득하였다. 미가공 mP [1000 × (S-G*P/S+G*P)] 데이터를 익스포팅한 후, 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)을 사용하여 1-부위 총 결합 포화 알고리듬으로 분석하였다.

실시예 3c: siRNA 실험

어떤 PARP 족 구성원(들)이 XAV939-유도 악신 단백질 축적의 실제 효능 표적인지를 확인하기 위하여, 그의 siRNA-매개 기능-손실 표현형을 평가하였다. 가까운 족 구성원들 간의 잠재적 중복성을 피하기 위하여, 2종의 탄키라제 이원물질(paralog) TNKS1 및 TNKS2는 물론, PARP1 및 PARP2를 동시에 표적화하였다. 특히, TNKS1과 TNKS2의 공동-고갈은 악신1 및 악신2 모두의 단백질 수준을 증가시킴으로써 XAV939의 효과를 비유전성표현변이화한(phenocopied) 반면, PARP1/2 녹다운은 악신 단백질 수준에 영향을 주지 않았다. XAV939가 PARP1에 비해 TNKS1/2에 대하여 더 높은 친화성을 나타낸다는 사실과 함께, 상기 발견은 TNKS1 및 TNKS2가 XAV939의 세포 효능 표적임을 강하게 암시한다.

추가적인 siRNA를 사용하여 TNKS1과 TNKS2의 공동-고갈이 SW480 세포에서 β-카테닌 인산화를 증가시키고, β-카테닌 풍부도를 감소시키며, β-카테닌 표적 유전자의 전사를 억제한다는 것을 추가 입증하였다. 특히, TNKS1 또는 TNKS2 단독의 고갈은 증가된 악신1/2 단백질 수준으로 이어지지 않음으로써, TNKS1 및 TNKS2가 악신 단백질 수준을 조절함에 있어 중복성으로 기능한다는 것을 나타내었다. TNKS1 및 TNKS2의 공동-고갈은 또한 HEK293 및 DLD-1 세포에서 XAV939를 비유전성표현변이화하였다.

많은 핵심 Wnt 경로 구성요소들이 진화상 보존되었기 때문에, 초파리 세포에서 악신 단백질 수준와 Wnt 신호전달을 함께 조절하는 TNKS의 능력을 시험하였다. 초파리 TNKS를 표적으로 하는 이중-가닥 RNA (dsRNA)는 S2 세포에서 외인성으로 발현된 초파리 악신의 단백질 수준은 증가시켰으나 mRNA 수준은 증가시키지 않았다. 또한, TNKS dsRNA는 Wnt/윙리스 리포터는 특이적으로 억제하였으나, BMP 또는 JAK/STAT 경로 활성에는 영향을 주지 않았다. 이러한 결과는 악신 단백질 수준 및 Wnt 신호전달을 조절함에 있어서의 TNKS에 대하여 진화상 보존된 역할을 뒷받침한다.

TNKS1 및 TNKS2는 폴리-ADP-리보실화 (파실레이팅)로 지칭되는 다수 ADP-리보스 단위의 첨가를 통하여 그의 기질을 해독-후 변형시키는 폴리-(ADP-리보스) 폴리머라제 (PARP) 족의 구성원이다. siRNA-구조 접근법을 사용하여 TNKS의 파실레이팅 활성이 악신 단백질 수준을 조절하는 데에 필수적인지를 확인하였다. 내인성 TNKS1/TNKS2를 고갈시킴과 동시에, 독시시클린-응답성 프로모터로부터 외인성 siRNA-내성 야생형 TNKS2의 발현 또는 촉매적으로 비활성인 TNKS2-M1054V 돌연변이를 도입하였다 (문헌 [Sbodio, J.I., et al. (2002) Biochem J 361, 451-9]). 야생형의 발현은 악신1 단백질 발현에 대한 TNKS1/2 siRNA의 효과를 구조하였으나, 돌연변이 TNKS2는 그렇지 않음으로써, 탄키라제의 촉매 활성이 악신 단백질 수준 및 Wnt 경로 신호전달의 조절에 필요하다는 것을 암시하였다.

이와 같은 연구에서 사용된 siRNA의 서열을 하기와 같이 표 I에 나타내었다:

<표 I>

실시예 3d: 자가파실레이팅 활성 분석

이와 같은 상기 발견을 바탕으로, 탄키라제의 파실레이팅 활성을 억제하는 것에 의해 악신 단백질 수준을 조절하는 XAV939의 능력을 시험하였다. 생체외 파실레이팅 분석을 사용하여 TNKS2의 C-말단 PARP 도메인 (GST-TNKS2^PARP)을 효율적으로 자가-파실레이팅하였는데, 이것은 XAV939에 의해 완전히 억제되었다. 반면, 비활성 대조 화합물 LDW643에 의해서는 자가-파실레이팅이 영향을 받지 않았다. TNKS의 자가-파실레이팅이 유비퀴틴-프로테오좀 경로를 통하여 그의 분해를 촉진하는 것으로 보고된 바 있다 (문헌 [Yeh, T.Y. et al. (2006) Biochem J 399, 415-25]). XAV939처리는 TNKS 단백질 수준을 상당히 증가시키는 것으로 밝혀졌는데, 이는 XAV939가 생체내에서 TNKS 자가-파실레이팅 역시 억제한다는 것을 암시한다. 종합하여, 이러한 유전적 및 생화학적 분석들은 XAV939가 TNKS의 촉매 활성을 억제하는 것에 의해 악신 단백질 수준을 증가시킨다는 것을 암시한다.

TNKS의 자가-파실레이팅에 대한 화합물의 효과를 평가하기 위하여, 하기와 같이 생체외 자가 파실레이팅 분석을 수행하였다:

NAD⁺를 이용하는 탄키라제는 자체 (자가파실레이팅) 또는 표적화된 단백질 (기질 파실레이팅)의 폴리(ADP-리보실)화를 촉매한다. 각 반응 전환시, 상기 효소는 한 단위의 NAD⁺를 소모하고, 한 단위의 ADP-리보스를 중합체 사슬에 첨가하며, 한 단위의 니코틴아미드를 방출한다. 상기 자가파실레이팅 활성 분석은 니코틴아미드 형성, 및 탄키라제 소형 분자 억제제의 존재하 니코틴아미드 형성의 감소를 모니터링하도록 설계된다. 니코틴아미드의 정량은 액체 크로마토그래피/질량 분광법 (LC/MS)에 의해 수행된다. 상기 분석은 384-웰 포맷으로 설정되며, 고처리량 스크리닝에 적합하다.

일반적으로, 상기 자가파실레이팅 반응은 하기를 함유하는 반응 용액에서 40 μL의 부피로 수행되었다: 5 μL의 화합물 (20 ％ DMSO 중), 분석 버퍼 (50 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.02 ％ 트윈-20, 8 ％ 글리세롤) 중 15 μL의 탄키라제, 20 μL의 NAD⁺. 최종 반응 혼합물은 0.0086-18.75 μM로 변화하는 농도를 가지는 화합물 (억제제), 2.5 ％ DMSO, 20 nM GST-TNKS2P (또는 60 nM GST-TNKS1P), 250 μM NAD⁺를 함유한다. 모든 반응이 384-웰 그라이너(Greiner) 편평-저 플레이트 (코스타(Costar) 사, 카탈로그 번호 781201)에서 120분 동안 실온으로 진행된 다음, 500 nM의 d4-니코틴아미드 (CDN 아이소토프스, 인크. (Isotopes, Inc.) 사, 카탈로그 번호 D3457)를 함유하는 20 ％ 포름산 10 μL의 첨가에 의해 중지된다. LC/MS 분석 전에, 2 분취량의 아세토니트릴을 첨가한 후, 침전/원심분리법에 의해 반응 혼합물 중 단백질을 제거하였다. 다음에, 수득된 상청액을, 니코틴아미드 및 중수소화 내부 표준이 하이퍼카브(Hypercarb) 컬럼 (2.1×20 mm, 5 μM 입자, 써모 사이언티픽 인크(Thermo Scientific Inc) 사)에 의해 지체되며, 구배 용리되고, 전기분무 이온화의 양성 모드에서 작동되는 질량 분광계에 의해 검출되는 LC/MS/MS 시스템 (아길렌트(Agilent) 1200SL LC 시스템, LEAP CTC HTC 오토샘플러 및 씨엑스(Sciex) API 4000 질량 분광계)에 적용하였다.

상기 LC는 0.8분에 5 내지 95 ％의 아세토니트릴 구배로 1 mL/분의 유속에서 진행되었다. 25 mM의 암모늄 비카르보네이트를 수성 이동상에, 0.1 ％ 수산화 암모늄을 아세토니트릴 이동상에 첨가하였다. 상기 질량 분광계는 MRM 모드로 진행되었으며, 니코틴아미드 및 d4-니코틴아미드에 대한 질량 전이는 각각 123→80 및 127→84이었다. 억제제의 활성을 평가하거나 IC50 곡선을 도시하기 위하여, 상응하는 샘플 웰에 있어서의 상대적 응답 (효소적 반응으로부터 생성되는 니코틴아미드 대 내부 표준인 d4-니코틴아미드의 비)을 기록하였다. 주의: IC₅₀ < 0.0086 nM 또는 IC₅₀ > 10 μM은 실제 IC₅₀이 실험 범위를 벗어났음을 표시함. 탄키라제1 및 탄키라제2 분석에서 사용된 단백질은 각각 절단된 N-GST-탄키라제1 (1088-1327) 및 절단된 N-GST-탄키라제2 (934-1166)이었다.

실시예 4: 악신의 보존된 N-말단 도메인에 대한 TNKS 의 결합이 악신 단백질 수준의 조절에 중요함

어떻게 TNKS가 악신 단백질 수준을 조절하는지를 조사하기 위하여, 공동-면역침전 실험을 수행하였는데, TNKS1 및 TNKS2가 SW480 세포에서 악신2와 결합하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 효모 2종-하이브리드 분석에서 악신1/2와 TNKS1/2 사이의 강한 결합이 검출되었다. 상기 2종-하이브리드분석은 하기와 같이 수행되었다:

매치메이커(Matchmaker) 2종-하이브리드 시스템 3 (클론테크(Clontech) 사)을 사용하여 제조자의 지침에 따라 효모 2종-하이브리드 분석을 수행하였다. 간단하게 말하자면, 마우스 악신1의 서로 다른 단편들을 미끼 플라스미드 pGBK-T7으로 클로닝하고, 인간 TNKS1의 서로 다른 단편들을 먹이 플라스미드 pGAD-T7으로 클로닝하였다. 미끼 및 먹이 플라스미드를 사용하여 AH109 세포를 형질전환시켰다. Trp- 및 Leu- 플레이트 상에서 이중 형질전환이 선택되었으며, 필터 융기(lift)의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-3-D-갈락토피라노시드 (X-gal) 염색에 의해 LacZ 발현을 조사하였다.

악신1에서의 TNKS 결합 도메인을 한정하기 위하여, 다양한 악신1 단편들을 TNKS1에 결합하는 그의 능력에 대하여 시험하였다. 놀랍게도, 악신 내 아미노산의 가장 보존된 부분을 포함하는 악신1의 소형 N-말단 영역 (아미노산 19-30)이 TNKS1과 상호작용하는 데에 필요하면서도 충분하였다. 본원에서 TBD (탄키라제-결합 도메인)으로 명명된 이와 같은 소형 N-말단 도메인을 통한 악신1의 TNKS1과의 특이적 상호작용은 GST 풀-다운 및 공동-면역침전 분석에 의해 추가적으로 입증되었다.

pcDNA4-TO-악신1 1-87을 HEK293-TRX 세포 (인비트로겐 사)에 안정적으로 핵산전달감염시키는 것에 의해 아미노 말단 악신1의 유도가능 발현이 달성되었으며, 24시간 동안의 10 ng/ml 독시시클린에 의해 세포를 유도하였다. 이중 루시퍼라제 분석 키트 (프로메가(Promega) 사)를 사용하여 제조자의 지침에 따라 루시퍼라제 분석을 수행하였다.

악신과 TNKS 사이의 물리적 상호작용을 파괴하는 것의 기능적 결과를 평가하였다. 야생형 GFP-악신1을 발현하는 세포는 XAV939 처리에 응답하여 강하게 증가되는 낮은 기본 단백질 수준을 나타내는 반면, GFP-악신1Δ19-30을 발현하는 세포는 이미 화합물 처리에 대하여 더 이상 응답하지 않는 높은 기본 단백질 수준을 나타낸다. 중요하게도, IRAP 또는 TRF1 중 어느 것의 이종유래 TNKS 결합 도메인을 GFP-악신1Δ19-30에 융합시킴으로써 TNKS1-악신1 상호작용을 복구하는 것은 그의 XAV939에 대한 응답을 완전히 복구하였다. 이러한 결과는 악신 N-말단 도메인의 과발현이 TNKS의 결합에 대하여 내인성 악신과 경쟁할 수 있으며, 그에 따라 내인성 악신1의 단백질 수준을 증가시킬 수 있음을 나타낸다. 실제로, GFP-악신1N (아미노산 1-87)이 과발현되나, 삭제된 TBD (아미노산 19-30 결핍)를 가지지는 않는 돌연변이는 그의 mRNA 발현에 영향을 주지 않으면서도 내인성 악신1 단백질 수준을 실질적으로 증가시켰다. 종합하면, 이러한 발견들은 진화상 보존된 TBD에 의해 매개되는 악신과 TNKS 사이의 물리적 상호작용이 생체내에서 악신 단백질 수준을 조절하는 데에 중요하다는 것을 나타낸다.

탄키라제는 기질 결합을 위한 안키린 반복 도메인, 자가-올리고머화를 위한 SAM 도메인, 및 촉매 활성을 위한 PARP 도메인을 함유한다. 우리는 효모 2종-하이브리드 분석을 사용하여, TNKS1의 III, IV 및 V 안키린 반복 도메인을 포괄하는 영역이 그의 악신1과의 상호작용에 필요하고도 충분하다는 것을 밝혔다. Wnt 신호전달에 대한 TNKS 과발현의 효과를 시험하였는데, HEK293 세포에서의 TNKS1의 일시적인 핵산전달감염이 STF 리포터 활성을 급격하게 증가시키고 β-카테닌을 안정화한다는 것이 밝혀졌다. 이와 같은 활성은 TNKS1의 상기 악신 결합 도메인 및 SAM 도메인을 필요로 하나, PARP 도메인은 필요로 하지 않는다. 과발현된 TNKS는 SAM 도메인 매개 올리고머화를 통하여 대형 격자-유사 구조를 형성한다고 보고되어 있다 (문헌 [De Rycker, M. et al. (2004) Mol Cell Biol 24, 9802-12]). 우리는 과발현된 TNKS가 이와 같은 격자-유사 구조 내에 악신을 포획하여, 그것이 β-카테닌 분해 복합체에서의 그의 정상적인 기능을 수행하는 것을 막는 것으로 가설을 세웠다.

실시예 5: 면역블롯팅 , 면역침전 및 GST 풀-다운 분석

RIPA 버퍼 (50 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 ％ NP-40, 0.5 ％ 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1 ％ SDS, 1 mM EDTA)에서의 세포 용해에 의해 총 세포 용해질을 제조하였다. SDS-PAGE에 의해 동일한 양의 단백질을 용해시켜, 니트로셀룰로스 막으로 옮긴 후, 표시된 항체로 표지화하였다. 공동-면역침전 실험을 위하여, EBC 버퍼 (50 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5 ％ NP-40, 1 mM EDTA)에서 세포를 용해시키고, 투명해진 세포 용해질을 표시된 항체 및 단백질 G-세파로스 비드와 함께 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 상기 비드를 용해 버퍼로 5회 세척하였다. 결합된 단백질을 SDS 샘플 버퍼에 용해시키고, SDS-PAGE에 의해 용해시킨 후, 표시된 항체로 블롯팅하였다. 생체내에서의 단백질 유비퀴틴화 및 파실레이팅을 검출하기 위하여, 5 mM NEM 및 5 μM ADP-HPD가 보충된 RIPA 버퍼로 세포를 용해시켜 데유비퀴티나제 및 PARG의 활성을 차단하고, 이후 표시된 항체를 사용하여 면역침전시켰다.

GST 풀다운 분석을 위하여, 에셔리키아 콜리(Escherichia coli)에서 GST-악신1 융합 단백질을 제조하고, 글루타치온-아가로스 비드 (아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences) 사)를 사용하여 정제하였다. Flag-TNKS1을 과발현하는 HEK293 세포를 EBC 버퍼로 용해시키고, 투명해진 용해질을 GST 융합 단백질로 충전된 글루타치온-아가로스 비드에서 4 ℃로 4시간 동안 배양한 후, EBC 버퍼를 사용하여 비드를 5회 세척하였다. 결합된 물질을 SDS-PAGE에 의해 용해시킨 후 표시된 항체로 블롯팅하였다. 세포질 용해질을 생성시키기 위하여, 세포를 저장성 버퍼 (10 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 10 mM KCl)에 분쇄 투입하고, 4회의 냉동-해빙 주기 후의 원심분리에 의해 세포 용해질을 투명화시켰다. 상기 모든 실험에서, 용해 버퍼에는 1× 프로테아제 억제제 칵테일 (시그마 사) 및 1× 포스파타제 억제제 칵테일 (업스테이트(Upstate) 사)을 첨가하였다. 이와 같은 연구에 사용된 시중의 항체에는 염소 항-악신1 항체 (R&D 시스템즈(Systems) 사), 토끼 항-악신2 항체 및 토끼 항-포스포-β-카테닌 (pSer33/37/Thr41) 항체 (셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology) 사), 마우스 항-TNKS 항체 (아브캄(Abcam) 사), 마우스 항-HA (HA.11) 항체 (코반스(Covance) 사), 마우스 항-β-카테닌 항체, 토끼 항-폴리(ADP-리보스) 항체, 및 토끼 항-PARP1 항체 (BD 파밍젠(Pharmingen) 사), 마우스 항-유비퀴틴 항체 (MBL 사), 토끼 항-GFP 항체 (클론테크 사), 마우스 항-튜뷸린 및 마우스 항-Flag (M2) 항체 (시그마 사)가 포함된다.

실시예 6: XAV939 는 악신의 유비퀴틴화 및 파실레이 팅을 조정하는 것에 의해 악신을 안정화시킴

XAV939 처리에 응답하는 악신 단백질 수준의 증가는 해독 또는 단백질 안정성의 조정으로 인한 것일 수 있다. 후자의 가능성에 부합하여, XAV939 처리는 SW480 세포에서 내인성 악신2의 반감기를 상당히 연장시키는 것으로 밝혀졌다. 악신1의 폴리-유비퀴틴화가 프로테아좀 억제제 MG132의 첨가 후 상당히 증가되기 때문에, 악신의 분해는 유비퀴틴-프로테아좀 경로에 의해 매개되는 것으로 보인다. 반면, XAV939의 MG132와의 공동-처리는 악신1 및 악신2 폴리-유비퀴틴화를 상당히 감소시킴으로써, XAV939가 해당 폴리-유비퀴틴화를 방지함으로써 악신을 안정화할 수 있다는 것을 암시한다.

TNKS의 자가-파실레이팅 또는 TNKS-매개 TRF1 파실레이팅은 각각 증가된 유비퀴틴화, 및 TNKS 또는 TRF1의 분해로 이어진다 (문헌 [Yeh, T.Y., et al. (2006) Biochem J 399, 415-25]; [Chang, W., et al. (2003) Genes Dev 17, 1328-33]). TNKS가 악신과 물리적으로 결합하며, 악신 단백질 수준의 조절을 위해 그의 파실레이팅 활성을 필요로 한다는 내부적 발견과 함께, 상기는 악신 분해가 TNKS에 의한 직접적인 파실레이팅을 통하여 촉진될 수 있다는 것을 암시한다. 실제로, TNKS2는 생체외에서 TBD를 함유하는 악신1 단편 (아미노산 1-280)을 파실레이팅할 수 있었으며, 이것은 XAV939 처리에 의해 완전히 억제되었다. PAR 변형을 특이적으로 인식하는 항체를 사용하여, 외인성으로 발현되는 GFP-악신이 세포에서 파실레이팅된다는 것을 발견하였다. 또한, 파실레이팅 신호는 XAV939 존재하에서 강하게 감소됨으로써, 악신 파실레이팅이 생체내에서 TNKS에 의해 매개될 수 있다는 것을 암시하였다.

XAV939로 세포를 처리하여 내인성 악신2 수준을 증가시켰는데, 이것은 내인성 악신2 유비퀴틴화 및 파실레이팅을 검출하기에 더 용이하게 하였다. XAV939가 세척 제거된 후 1시간 이내에, 악신2는 신속하게 분해되었다. 예상대로, MG132를 사용한 세포의 처리는 악신2 분해를 차단하고, 그의 폴리-유비퀴틴화를 강하게 증가시켰다. 그러나, XAV939와 MG132를 사용한 공동-처리는 악신2의 유비퀴틴화를 완전치 차단하였다. 흥미롭게도, 악신-2와 공동-이동되는 항-PAR 항체 반응성 신호가 MG132 단독으로 세포가 처리된 경우에는 검출되었으나, 세포가 XAV939로도 처리된 경우에는 사라졌다. 종합하자면, 이러한 발견들은 TNKS가 악신의 유비퀴틴화 및 분해를 촉진하며, 이것은 적어도 부분적으로 악신의 직접적인 파실레이팅을 통하여 매개될 수 있다는 것을 암시한다.

실시예 7: XAV939 는 APC -돌연변이 DLD -1 암 세포의 콜로니 형성을 억제함

APC 돌연변이 결장직장암을 구성적으로 활성인 β-카테닌 신호전달과 연결짓는 강한 유전적 증거는 WNT 경로 억제제를 확인하기 위한 많은 노력들을 낳았지만, 조절곤란화된 WNT 경로 활성을 특이적으로 방해하는 약학적 억제제를 발견하는 것은 까다로운 것으로 입증되었다. XAV939가 APC 돌연변이 세포에서도 β-카테닌 신호전달을 억제할 수 있었다는 내부적 발견을 바탕으로, APC-돌연변이 결장직장암 세포의 증식을 억제하는 그의 능력에 대하여 이 화합물을 시험하였다. β-카테닌을 표적으로 하는 유도가능 shRNA들을 사용하여 일단의 세포주들을 스크리닝하였을 때, 결장직장암 세포주 DLD-1이 shRNA-매개 β-카테닌 억제에 가장 민감한 것으로 밝혀졌다. 또한, XAV939에 의한 β-카테닌 표적 유전자의 조절은 SW480 세포에 비해 DLD-1에서 더욱 강력하였다. 어떠한 WNT 경로 돌연변이에도 근거하지 않으며 β-카테닌 고갈에 비민감성인 RKO 결장직장암 세포주를 음성 대조로서 사용하였다. 저혈청 성장 조건하에서, XAV939는 DLD-1 세포의 콜로니 형성을 상당히 억제한 반면, 비활성 구조 유사체 LDW643은 가장 높은 농도에서도 증식에 영향을 주지 않았다. 중요하게도, XAV939는 β-카테닌 비의존성 RKO 세포에서 콜로니 형성에 영향을 주지 않았다.

콜로니 형성 분석은 하기와 같이 수행하였다: 6-웰 플레이트에, DLD1 및 RKO 세포를 각각 500 및 1000 세포/웰로 저혈청 성장 배지 (0.5 ％ FBS)에 접종하였다. 플레이팅 16시간 후, 표시된 농도로 화합물을 첨가하였다. 콜로니 형성이 관찰될 때까지 매 2일마다 배지를 보충하였다. 버퍼링된 포르말린 중 2 mg/ml 크리스탈 바이올렛의 용액으로 콜로니를 염색하여, 분자 화상화기(Molecular Imager) ChemiDoc XRS 시스템 (바이오래드(BioRad) 사)에서 화상화하였다.

TNKS1/TNKS2는 유사분열 과정, 종말체 유지, 및 GLUT4 수송을 조절하는 것으로 기술되어 있다 (문헌 [Canudas, S., et al. (2007) Embo J 26, 4867-78 (2007)]; [Seimiya, H., et al. (2002) J Biol Chem 277, 14116-26]). 특히, TNKS1은 자매 종말체 결합의 해제 또는 양극성 방추사의 조립에 필요한 것으로 제안되고 있으며, TNKS1 녹다운은 강한 유사분열 중지를 야기하는 것으로 보고되어 있다 (문헌 [Chang, P., et al. (2005) Nat Cell Biol 7, 1133-9]; [Dynek, J.N., et al. (2004) Science 304, 97-100]). 그러나, XAV939 처리 또는 개별/조합 TNKS1/TNKS2 siRNA 녹다운을 사용하는 것은 저혈청 또는 고혈청 조건 모두에서 본 연구에서 사용되는 세포주를 가지는 어떠한 명백한 유사분열 중지 표현형도 초래하지 않음으로써, XAV939가 항-유사분열 기능을 통하여 DLD1 세포의 증식을 억제하지는 않는다는 것을 입증한다.

DLD1 세포에 대한 XAV939의 항-증식성 효과가 대신 악신 단백질 수준의 증가에 의해 매개되었을 경우, 악신1/2 발현의 녹다운은 화합물 처리의 항-증식성 효과를 구조할 것으로 예상될 수 있다. 실제로, 악신1/2의 siRNA-매개 고갈은 XAV939의 항-증식성 효과를 완전히 제거하였다. 종합하자면, 이러한 발견은 DLD1 세포에서의 XAV939의 항-증식성 효과가 WNT 경로 신호전달의 악신-의존성 억제로 인한 것임을 표시한다.

적어도 실시예 6에서 기술된 세포 배양법을 하기와 같이 수행하였다: 5 ％ CO2를 함유하는 37 ℃의 가습 배양기에서, HEK293, SW480, DLD1, 및 RKO 세포를 10 ％ FCS가 보충된 DMEM 또는 RPMI1640에서 성장시켰다. 퓨젠(Fugene) 6 (로체(Roche) 사)를 사용하여 플라스미드 핵산전달감염을 수행하고, 다르마펙트(Darmafect) 1 (다마콘(Dhamacon) 사)을 사용하여 제조자의 지침에 따라 siRNA 핵산전달감염을 수행하였다.

실시예 8: 재료 및 방법

실험을 수행하고 결과를 달성하기 위하여 사용되며, 본원에서 언급되나 상기에서 상세하게 기술되지는 않은 모든 재료 및 방법은 하기와 같다:

실시예 8a: 정량 RT - PCR

RNeasy 미니 키트 (키아젠(Qiagen) 사)를 사용하여 화합물 또는 siRNA 처리된 세포로부터의 총 RNA를 추출한 후, 타크만(Taqman) 역전사 시약 (어플라이드 바이오시스템즈 사)을 사용하여 사용자의 지침에 따라 역전사하였다. ABI PRISM 7900HT 서열 검출 시스템을 사용하여 전사체 수준을 산정하였다. 실시간 PCR은 0.6 μl의 2O× 어쎄이-온-디맨드 믹스(Assay-on-Demand mix) (각 프라이머에 대하여 18 μM의 예비혼합 농도, 및 5 μM의 프로브), 6 μl의 타크만 유니버설 PCR 마스터 믹스, 및 5.4 μl의 cDNA 주형으로 구성되는 12 μl 반응액에서 수행하였다. 사용된 열주기 조건은 50 ℃에서 2분, 95 ℃에서 10분, 이어서 95 ℃에서 15초 및 60 ℃에서 1분의 40 주기이었다. 모든 실험은 3반복으로 수행하였다. 표준화를 위하여 살림 유전자(housekeeping gene) GUSB를 사용하는 비교 C_T법을 사용하여 유전자 발현 분석을 수행하였다.

실시예 8B: 펄스-상 실험

대사적 표지화 전일, 10 cm 플레이트에 2백만 세포/플레이트로 SW480 세포를 접종하였다. 다음 날, 세포를 PBS로 3회 세척한 후, L-메티오닌이 없는 DMEM (미디어테크(Mediatech) 사)으로 1시간 동안 결핍화한 후, 이어서 ³⁵S-메티오닌 (100 μCi/ml) (아머샴 사)을 사용하여 30분 동안 표지화하였다. 표지화 완료 후, 배지를 제거하고, 100× 과량의 냉 메티오닌을 함유하는 배지로 대체하였다. 표시된 시점에 RIPA에 의해 세포 용해질을 수확하였다. 동일한 양의 방사능표지화된 용해질을 항-악신2 항체에 의해 밤새 면역침전시켰다. SDS-PAGE 이틀 전에 RIPA 버퍼를 사용하여 면역침전물을 철저하게 세척한 후, 이동시켰다. 포스포화상화기에 의해 방사능 신호를 검출하였다.

실시예 8C: 화합물 친화성 정제

화합물 결합 및 친화성 정제를 기술된 바와 같이 본질적으로 수행하였다 (문헌 [Bantscheff et al 2007]). 1°아민 기를 가지는 유도체화 생체활성 유사체 LDW639를 합성하여 NHS-활성화 세파로스 4 비드 (아머샴 사) 상에 결합시켰다. 도운스(Dounce) 균질화기를 사용하여 얼음 상에서 용해 버퍼 (50 mM 트리스/HCl, pH 7.5, 5 ％ 글리세롤, 1.5 mM MgCl₂, 150 mM NaCl, 20 mM NaF, 1 mM Na₃VO₄, 1 mM DTT, 5 □M 칼리큘린(calyculin) A, 0.8 ％ 이게팔(Igepal)-CA630 및 프로테아제 억제제 칵테일) 중에 293T 세포를 균질화하였다. 원심분리에 의해 용해질을 예비-투명화하고, 브래드포드(Bradford) 분석에 의해 단백질 수준을 측정하였다. 화합물 X 및 Y를 디메틸 술폭시드 (DMSO)에 용해시키고, 4 ℃에서 30분 동안 20 μM의 최종 농도로 (또는 DMSO 단독) 용해질에 첨가하였다. 다음에, 100 μL의 음성 대조-매트릭스를 첨가한 후, 4 ℃에서 다시 60분 동안 배양을 계속하였다. 원심분리 후, 비드를 컬럼 (모비테크(MoBiTech) 사)으로 이동시켜, 세척하였다. 결합된 물질을 NuPAGE LDS 샘플 버퍼 (인비트로겐 사)를 사용하여 용리하고, 용리액을 환원하여, 알킬화하고, 4-12 ％ NuPAGE 겔 (인비트로겐 사) 상에서 분리한 후, 콜로이드 쿠마씨(Coomassie)로 염색하였다.

실시예 8D: 초파리 리포터 분석

S2R 세포를 384-웰 플레이트에 접종하고, 표시된 dsRNA로 3일 동안 처리하였다. 다음에, Wnt 리포터 분석용 2.5 ng Lef-Luc 및 2.5 ng pPac-Lef1, BMP 리포터 분석용 5 ng pcopHSP-BRE-Luc, 또는 JAK/STAT 분석용 18 ng Draf-Luc와 함께, 0.5 ng pPac-레닐라를 가지는 에펙텐(Effectene) (키아젠 사)을 사용하여 세포를 핵산전달감염시켰다. 캐리어 DNA로서 PUC19를 첨가하여 각 웰 당 DNA 25 ng으로 만들었다. 핵산전달감염 24시간 후, 12.5 ％의 윙리스 조건화 배지, 50 ng/ml의 재조합 인간 BMP-2 (R&D 시스템즈 사), 또는 50 ％ UPD 조건화 배지를 첨가하고, 48시간 후에 듀오-글로(Duo-Glo) 루시퍼라제 분석 키트 (프로메가(Promega) 사)를 사용하여 루시퍼라제 분석을 수행하였다. T7-결합 프라이머를 사용하여 S2R 세포 RNA로부터 증폭된 PCR 단편들이 (백색용으로, 정방향 5'-ACCTGTGGACGCCAAGG-3' (서열); 역방향, 5'-AAAAGAAGTCGACGGCTTC-3' (서열). TNKS 용, 정방향 5'-GATAGGATTGCGGATGAGGA-3' (서열); 역방향, 5'-TCCAATGAAGAAGAATCGGG-3' (서열)) MEGA스크립트(script) 고수율 전사 키트 (암비온(Ambion) 사)를 사용한 dsRNA 제조에 사용되었다. 악신에 대한 TNKS 고갈의 영향을 시험하기 위하여, DAxin-3XHA로 안정하게 핵산전달감염된 S2R 세포를 24-웰 플레이트에 접종한 후, 표시된 dsRNA로 5일 동안 처리하였다.

Claims (49)

1. 탄키라제 (TNKS)의 촉매 활성을 조정하는 제제를 유효량으로 Wnt 신호전달-관련 장애의 치료, 예방 또는 개선을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, Wnt 신호전달-관련 장애의 치료, 예방 또는 개선 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 제제가 탄키라제 (TNKS)의 촉매 활성을 감소시키거나 제거하는 것인 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 제제가 억제성 핵산인 방법.
4. 제2항에 있어서, 상기 제제가 융합 단백질인 방법.
5. 제2항에 있어서, 상기 제제가 본 발명의 화합물인 방법.
6. 제2항에 있어서, Wnt 신호전달-관련 장애가 Wnt 신호전달의 비정상적인 상향조절과 관련되는 것인 방법.
7. 제6항에 있어서, Wnt 신호전달-관련 장애가 암인 방법.
8. 제7항에 있어서, Wnt 신호전달-관련 장애가 결장암인 방법.
9. 제6항에 있어서, Wnt 신호전달-관련 장애가 골관절염인 방법.
10. 제6항에 있어서, Wnt 신호전달-관련 장애가 다낭성 신장병인 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 제제가 탄키라제 (TNKS)의 촉매 활성을 증강시키는 것인 방법.
12. 제11항에 있어서, Wnt 신호전달-관련 장애가 Wnt 신호전달의 비정상적인 하향조절과 관련되는 것인 방법.
13. 제12항에 있어서, Wnt 신호전달-관련 장애가 골다공증인 방법.
14. 제12항에 있어서, Wnt 신호전달-관련 장애가 비만 또는 당뇨병인 방법.
15. 제12항에 있어서, Wnt 신호전달-관련 장애가 뉴런 변성 질병인 방법.
16. 탄키라제 (TNKS)의 촉매 활성을 조정할 수 있는 제제를 투여하여 Wnt 경로 신호 전달을 조정하는 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 제제가 탄키라제 (TNKS)의 촉매 활성을 감소시키거나 제거하여 Wnt 경로 신호전달을 억제하는 것인 방법.
18. 제17항에 있어서, 상기 제제가 억제성 핵산인 방법.
19. 제17항에 있어서, 상기 제제가 융합 단백질인 방법.
20. 제17항에 있어서, 상기 제제가 본 발명의 화합물인 방법.
21. a) Wnt 신호전달 경로가 활성인 생물학적 샘플을, Wnt 신호전달을 허용하며 악신 단백질 수준 또는 안정성이 측정될 수 있는 조건하에서, 시험 제제의 존재 및 부재하에 접촉시키는 것; 및
    b) 상기 시험 제제의 존재 및 부재 모두에서 악신 단백질 수준 또는 안정성을 측정하는 것
    을 포함하며, 여기에서 (i) 시험 제제의 부재시와 비교할 때 시험 제제의 존재시의 악신 단백질 수준 또는 안정성의 감소는 시험 제제가 Wnt 경로 신호 전달의 효능제임을 확인해주고, (ii) 시험 제제의 부재시와 비교할 때 시험 제제의 존재시의 악신 단백질 수준 또는 안정성의 증가는 시험 제제가 Wnt 경로 신호 전달의 길항제임을 확인해주는 것인, Wnt 경로 신호 전달을 조정할 수 있는 제제의 확인 방법.
22. 제21항에 있어서, 악신 단백질 수준 또는 안정성의 증가가 총 β-카테닌 수준의 감소, 포스포-β-카테닌 수준의 증가, 악신 단백질 수준의 증가 또는 악신-GSK3 복합체 형성의 증가에 의해 측정되는 것인 방법.
23. 제21항에 있어서, 악신 단백질 수준 또는 안정성의 감소가 총 β-카테닌 수준의 증가, 포스포-β-카테닌 수준의 감소, 악신 단백질 수준의 감소 또는 악신-GSK3 복합체 형성의 감소에 의해 측정되는 것인 방법.
24. 제21항에 있어서, 상기 제제가 소형 분자인 방법.
25. 제21항에 있어서, 상기 제제가 억제성 핵산인 방법.
26. 제21항에 있어서, 상기 제제가 융합 단백질인 방법.
27. a) Wnt 신호전달 경로가 활성인 생물학적 샘플을, Wnt 신호전달을 허용하며 악신 단백질 수준 또는 안정성이 측정될 수 있는 조건하에서, 시험 제제의 존재 및 부재하에 접촉시키는 것; 및
    b) 상기 시험 제제의 존재 및 부재 모두에서 악신 단백질 수준 또는 안정성을 측정하는 것
    을 포함하며, 여기에서 (i) 시험 제제의 부재시와 비교할 때 시험 제제의 존재시의 악신 단백질 수준 또는 안정성의 감소는 시험 제제가 Wnt 신호전달의 비정상적인 하향조절과 관련된 장애를 치료하는 데에 유용함을 확인해주고, (ii) 시험 제제의 부재시와 비교할 때 시험 제제의 존재시의 악신 단백질 수준의 증가는 시험 제제가 Wnt 신호전달의 비정상적인 상향조절과 관련된 장애를 치료하는 데에 유용함을 확인해주는 것인, Wnt 신호전달-관련 장애의 치료에 유용한 제제의 확인 방법.
28. 제27항에 있어서, 악신 단백질 수준 또는 안정성의 증가가 총 β-카테닌 수준의 감소, 포스포-β-카테닌 수준의 증가, 악신 단백질 수준의 증가 또는 악신-GSK3 복합체 형성의 증가에 의해 측정되는 것인 방법.
29. 제27항에 있어서, 악신 단백질 수준 또는 안정성의 감소가 총 β-카테닌 수준의 증가, 포스포-β-카테닌 수준의 감소, 악신 단백질 수준의 감소 또는 악신-GSK3 복합체 형성의 감소에 의해 측정되는 것인 방법.
30. 제27항에 있어서, 상기 제제가 소형 분자인 방법.
31. 제27항에 있어서, 상기 제제가 억제성 핵산인 방법.
32. 제27항에 있어서, 상기 제제가 융합 단백질인 방법.
33. a) Wnt 신호전달 경로가 활성인 생물학적 샘플을, Wnt 신호전달을 허용하며 악신 단백질 수준 또는 안정성이 측정될 수 있는 조건하에서, 시험 제제의 존재 및 부재하에 접촉시키는 것; 및
    b) 상기 시험 제제의 존재 및 부재 모두에서 악신 단백질 수준 또는 안정성을 측정하는 것
    을 포함하며, 여기에서 (i) 시험 제제의 부재시와 비교할 때 시험 제제의 존재시의 악신 단백질 수준 또는 안정성의 감소는 시험 제제가 탄키라제(TNKS) 효능제임을 확인해주고, (ii) 시험 제제의 부재시와 비교할 때 시험 제제의 존재시의 악신 단백질 수준 또는 안정성의 증가는 시험 제제가 TNKS 길항제임을 확인해주는 것인, 탄키라제(TNKS)의 촉매 활성을 억제할 수 있는 제제의 확인 방법.
34. 제33항에 있어서, 악신 단백질 수준 또는 안정성의 증가가 총 β-카테닌 수준의 감소, 포스포-β-카테닌 수준의 증가, 악신 단백질 수준의 증가 또는 악신-GSK3 복합체 형성의 증가에 의해 측정되는 것인 방법.
35. 제33항에 있어서, 악신 단백질 수준 또는 안정성의 감소가 총 β-카테닌 수준의 증가, 포스포-β-카테닌 수준의 감소, 악신 단백질 수준의 감소 또는 악신-GSK3 복합체 형성의 감소에 의해 측정되는 것인 방법.
36. 제33항에 있어서, 상기 제제가 소형 분자인 방법.
37. 제33항에 있어서, 상기 제제가 억제성 핵산인 방법.
38. 제33항에 있어서, 상기 제제가 융합 단백질인 방법.
39. Wnt 신호전달 경로가 활성인 세포를 시험 제제와 접촉시키는 것 및 악신 단백질 수준 또는 안정성에서의 변화를 검출하는 것을 포함하는, Wnt 신호전달-관련 장애의 치료에 유용한 제제의 확인 방법.
40. 제39항에 있어서, 악신 단백질 수준 또는 안정성의 증가가 총 β-카테닌 수준의 감소, 포스포-β-카테닌 수준의 증가, 악신 단백질 수준의 증가 또는 악신-GSK3 복합체 형성의 증가에 의해 측정되는 것인 방법.
41. 제39항에 있어서, 악신 단백질 수준 또는 안정성의 감소가 총 β-카테닌 수준의 증가, 포스포-β-카테닌 수준의 감소, 악신 단백질 수준의 감소 또는 악신-GSK3 복합체 형성의 감소에 의해 측정되는 것인 방법.
42. 탄키라제(TNKS)의 촉매 활성을 감소시키거나 제거하는 제제를 유효량으로 종양 세포 성장의 억제를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 종양 세포 성장의 억제 방법.
43. 제42항에 있어서, 상기 제제가 억제성 핵산인 방법.
44. 제42항에 있어서, 상기 제제가 융합 단백질인 방법.
45. 제42항에 있어서, 상기 제제가 본 발명의 화합물인 방법.
46. 탄키라제(TNKS)의 촉매 활성을 감소시키거나 제거하는 제제를 유효량으로 종양 세포의 세포자멸을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 종양 세포에서 세포자멸을 유도하는 방법.
47. 제46항에 있어서, 상기 제제가 억제성 핵산인 방법.
48. 제46항에 있어서, 상기 제제가 융합 단백질인 방법.
49. 제46항에 있어서, 상기 제제가 본 발명의 화합물인 방법.

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