CN116789819A - Wnt5a调节剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种Wnt5a调节剂及其应用。本申请通过研究DNP致病机制，发现了Wnt5a这一新的镇痛靶点，为临床治疗神经病理性痛提供了新的干预策略；本申请开发了基于Wnt5a这一新的镇痛靶点的调节剂，能有效缓解神经病理性疼痛。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及Wnt5a调节剂及其应用。
背景技术
神经病理性疼痛是临床常见的一种疾病，发病率约占总人口的7-10％，其分子机制不清也无有效的治疗手段，急需发现新的治疗靶点。作为临床最多发的神经病理性疼痛之一，糖尿病性神经痛(Diabetic neuropathic pain,DNP)是糖尿病人中常见且严重的并发症。DNP的主要临床症状表现为触诱发痛、自发痛和感觉异常(刺痛感、针刺感或电击感)，25％～30％的糖尿病患者受其影响。由于DNP的发病机制尚不清楚，一直缺乏有效的治疗手段，因此阐明DNP发病机制、探索新的DNP治疗靶点至关重要。
背根神经节(Dorsal root ganglion,DRG)中的初级感觉神经元在神经病理性疼痛的产生和维持中发挥着重要作用。DRG神经元能够与循环系统中的代谢产物直接接触，更易被高血糖引发的毒性代谢产物损伤。DRG神经元的功能异常被认为是介导DNP发生和维持的直接因素。DRG中直径较大的A类神经元发出低阈值、有髓鞘的神经纤维(Aβ类，部分Aδ类)，介导轻触觉的感知。多项研究证实：在神经病理性疼痛中，A类DRG神经元在触诱发痛的发生中扮演着关键角色。近年来，有研究表明，大直径A类DRG神经元在糖尿病性神经痛发生中具有重要作用。在I型和II型糖尿病动物模型和大纤维神经病变的糖尿病患者中，均可观察到Aβ类神经纤维的损伤。在糖尿病大鼠模型中，Aβ神经纤维的自发放电和异位放电被认为是触诱发痛发生的关键因素。然而，A类DRG神经元参与糖尿病性神经痛发生的分子基础仍有待进一步研究。因此，弄清A类DRG神经元参与糖尿病性神经痛发生的机制，并以该机制为中心开发的新的DNP治疗靶点可能成为治疗糖尿病性神经痛等神经病理性疼痛的有效手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Wnt5a调节剂。
本发明的另一目的在于提供包含上述Wnt5a调节剂的药物组合物。
本发明的另一目的在于提供上述Wnt5a调节剂的应用。
本发明的另一目的在于提供预防和/或治疗神经病理性疼痛的方法。
为解决上述技术问题，本发明的第一方面提供了一种Wnt5a调节剂的用途，用于制备药物或药物组合物，所述药物或所述药物组合物用于选自下组的一种或多种用途：
(i)降低Wnt5a的活性；
(ii)减缓或阻断Wnt5a和TRPV1通道的结合；
(iii)降低TRPV1通道的活性；
(iv)抑制TRPV1通道的激活；
(v)制备预防和/或治疗由Wnt5a的活性升高引起的疾病的药物；
(vi)制备预防和/或治疗与TRPV1通道激活相关的疾病的药物；和
(vii)预防和/或治疗与由Wnt5a的活性升高引起的疾病，所述疾病优选为神经病理性疼痛及其并发症；更优选为糖尿病诱发的神经病理性疼痛(糖尿病性神经痛)。
在一些优选的方案中，所述Wnt5a调节剂选自：抗体、多肽、shRNA、dsRNA、miRNA、反义寡核苷酸、化合物或其组合。
在一些优选的方案中，所述Wnt5a调节剂选自Wnt5a中和抗体和Wnt5a抑制剂。
在一些优选的方案中，所述Wnt5a抑制剂为多肽或Box5，其中，所述多肽的序列具有至少一个可与Wnt5a特异性结合的氨基酸残基。
在一些优选的方案中，所述多肽的序列中至少部分片段与TRPV1通道的氨基酸序列中的部分片段相同。
在一些优选的方案中，所述TRPV1通道具有与Wnt5a特异性结合的区域；且
所述多肽的序列中至少部分片段和所述与Wnt5a特异性结合的区域的部分片段相同；或者，
所述多肽的序列中至少部分片段和所述与Wnt5a特异性结合的区域的部分片段同源性大于70％。
在一些优选的方案中，所述TRPV1通道的氨基酸序列中和Wnt5a特异性结合区域位于TRPV1通道胞外S5-S6环；
或者，所述TRPV1通道的氨基酸序列中和Wnt5a特异性结合区域位于TRPV1通道胞外S3-S4环。
在一些优选的方案中，所述多肽的序列包括选自N292、E611、S293、Q286、N606、S289、N605、R202、S612、E203、S210、K283、E652、E649、K208、D547、R281、R284、K808、D647、R290、N288和N653中的至少一种氨基酸残基。
在一些优选的方案中，所述多肽的序列包括选自N605、L461、K604、N606、V610、E611、P614、K616、R618、D647、L648、E649、E652和D655中至少一种氨基酸残基，优选为至少两种，更优选为至少三种，更优选为至少五种，更优选为至少七种。
在一些优选的方案中，所述多肽的序列包括选自E611、N606、K604、V610、E611、P614、K616和R618中至少一种氨基酸残基。
在一些优选的方案中，所述多肽的序列包括选自D647、L648、E649、E652和D655中至少一种氨基酸残基。
在一些优选的方案中，所述多肽具有选自如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6中所示的至少一个氨基酸序列、其片段及其修饰形式或其突变体。
本发明第二方面提供了一种Wnt5a调节剂，所述Wnt5a调节剂包括至少一种多肽，所述多肽的序列具有至少一个可与Wnt5a特异性结合的氨基酸残基；且
所述多肽的序列中至少部分片段与TRPV1通道的氨基酸序列中的部分片段相同。
在一些优选的方案中，所述TRPV1通道具有与Wnt5a特异性结合的区域；
所述多肽的序列中至少部分片段和所述与Wnt5a特异性结合的区域的部分片段相同；或者，所述多肽的序列中至少部分片段和所述与Wnt5a特异性结合的区域的部分片段同源性大于70％。
在一些优选的方案中，所述多肽的序列包括选自以下的至少一组氨基酸残基：
E611、N606和N605；
S612和N606；
E652和E649；和，
D647和E649。
在一些优选的方案中，所述多肽具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6中所示的至少一个氨基酸序列、其片段及其修饰形式或其突变体。
本发明的第三方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明第二方面所述的Wnt5a调节剂和其在药学上可接受的赋形剂。
本发明的第四方面提供了一种预防和/或治疗神经病理性疼痛及其并发症的方法，所述方法包括步骤：
向受试者施用本发明第二方面所述的Wnt5a调节剂、或本发明的第三方面所述的药物组合物。
本发明相对于现有技术而言，至少具有下述优点：
(1)本发明通过研究DNP致病机制，发现了Wnt5a这一新的镇痛靶点，为临床治疗神经病理性痛提供了新的干预策略。
(2)本发明开发了基于Wnt5a这一新的镇痛靶点的调节剂，能有效缓解神经病理性疼痛。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。
图1是根据本发明实施例中经STZ处理后DRG中不同Wnt5a亚型表达量示意图；
图2是根据本发明实施例中DRG中Wnt5a mRNA与NF200的共定位检测示意图；
图3是根据本发明实施例中DRG中Wnt5a+和NF200+神经元的面积分布统计图；
图4是根据本发明实施例中STZ处理前后，Wnt5a+、Wnt5a+/NF200+、Wnt5a+/IB4+神经元的比例示意图；
图5是根据本发明实施例中STZ处理对Wnt5a+神经元中Wnt5a表达丰度影响示意图；
图6是根据本发明实施例中q-PCR检测野生型、STZ处理、Gpr177敲除的Wnt5a表达量示意图；
图7是根据本发明实施例中Western blot检测野生型、STZ处理、Gpr177敲除的Wnt5a在DCR的含量示意图；
图8是根据本发明实施例中Western blot检测野生型、STZ处理、Gpr177敲除的Wnt5a在脑脊液的含量示意图；
图9是根据本发明实施例中Western blot检测原代培养的DRG神经元中Wnt5a的表达和分泌示意图；
图10是根据本发明实施例中原代培养的DRG神经元分泌和表达Wnt5a的定量统计示意图；
图11是根据本发明实施例中Von Frey测试鞘内注射Wnt5a特异性拮抗剂Box5对小鼠缩脚阈值的影响；
图12是根据本发明实施例中Von Frey测试鞘内注射中和性抗体Anti-Wnt5a IgG对小鼠缩脚阈值的影响；
图13是根据本发明实施例中电流钳记录中Trpv1+DRG神经元动作电位示意图；
图14是根据本发明实施例中电流钳记录中Trpv1+DRG神经元动作电位发放频率的定量统计图；
图15是根据本发明实施例中Box5灌流给药引起Trpv1+DRG神经元动作电位发放的电流阈值的影响示意图；
图16是根据本发明实施例2(F)中实验方案示意图；
图17是根据本发明实施例中Von frey测试野生型和Wnt5a CKO小鼠机械触诱发痛的缩脚阈值示意图；
图18是根据本发明实施例中Real-time PEA实验评估Wnt5a敲除对小鼠厌恶性逃避的时间的影响示意图；
图19是根据本发明实施例中DRG、腰膨大段脊髓中Cre和Wnt5a的表达水平示意图；
图20是根据本发明实施例中DRG、腰膨大段脊髓中Cre和Wnt5a的表达水平定量统计图；
图21是根据本发明实施例中卫星胶质细胞标志蛋白GS染色示意图(标尺为50μm)；
图22是根据本发明实施例中巨噬细胞标志蛋白IBA1染色示意图(标尺为50μm)；
图23是根据本发明实施例中卫星胶质细胞标志蛋白GS、巨噬细胞标志蛋白IBA1共定位示意图(标尺为50μm)；
图24是根据本发明实施例中敲除Wnt5a后PGP9.5免疫染色显示足底无毛区表皮内神经纤维末梢的分布示意图；
图25是根据本发明实施例中敲除Wnt5a后PGP9.5免疫染色显示足底无毛区表皮内神经纤维末梢的分布定量统计图；
图26是根据本发明实施例中Von frey测试鞘内注射梯度剂量Wnt5a引起的小鼠机械触诱发痛的缩脚阈值示意图；
图27是根据本发明实施例中鞘内注射Real-time PEA测试鞘内注射Wnt5a对小鼠机械刺激的厌恶性逃避反应影响示意图；
图28是根据本发明实施例中Wnt5a诱导原代培养的DRG神经元产生iCa2+活动示意图；
图29是根据本发明实施例中Ca2+活动记录中代表性神经元的实时iCa2+信号图；
图30是根据本发明实施例中分析显示对Wnt5a+、Cap+反应的神经元重合度示意图和应答不同浓度Wnt5a刺激产生iCa2+活动的神经元的比例示意图；
图31是根据本发明实施例中Wnt5a诱导的DRG小神经元发放动作电位示意图；
图32是根据本发明实施例中Wnt5a、Cap诱导内向电流示意图；
图33是根据本发明实施例中脊髓切片的制备及膜片钳记录实验结果图；
图34是根据本发明实施例中Wnt5a对sEPSCs发放频率和幅值的影响图；
图35是根据本发明实施例中电流钳记录中DRG小神经元动作电位发放示意图；
图36是根据本发明实施例中DRG小神经元动作电位发放频率的定量统计图；
图37是根据本发明实施例中western blotting检测WT、db/db鼠Wnt5a分泌水平示意图；
图38是根据本发明实施例中WT、db/db鼠鞘内注射5μg Box5后小鼠机械触诱发痛的缩脚阈值示意图；
图39是根据本发明实施例中WT、db/db鼠鞘内注射4μg anti-Wnt5a抗体后小鼠机械触诱发痛的缩脚阈值示意图；
图40是根据本发明实施例中Wnt5a诱导HEK293T细胞Ca2+活动示意图；
图41是根据本发明实施例中Ca2+成像中代表性HEK293T细胞的实时Ca2+信号记录图；
图42是根据本发明实施例中转染不同类型的TRP通道时，Wnt5a诱导Ca2+活动的阳性反应细胞的百分比图；
图43是根据本发明实施例中Wnt5a诱发内向电流示意图；
图44是根据本发明实施例中Wnt5a(10ng/ml)诱导的内向电流幅值与相应阳性对照试剂诱导电流幅值的百分比图；
图45是根据本发明实施例中Wnt5a给药后，Outside-out膜片钳单通道记录图；
图46是根据本发明实施例中Wnt5a诱导单通道电流示意图；
图47是根据本发明实施例中Wnt5a-TRPV1蛋白稳定结合状态模式图；
图48是根据本发明实施例中TRPV1通道蛋白中与Wnt5a存在结合可能的氨基酸残基的结合能量示意图；
图49是根据本发明实施例中Von frey测试拮抗肽AA601-25使用后对小鼠机械触诱发痛的缩脚阈值的影响示意图；
图50是根据本发明实施例中Von frey测试拮抗肽AA453-72、AA644-56和对照肽使用后对小鼠机械触诱发痛的缩脚阈值的影响示意图；
图51是根据本发明实施例中Wnt5a(1ng/ml)或Cap(1μM)诱导的iCa2+活动示意图；
图52是根据本发明实施例中Von frey测试拮抗肽AA601-25对腹腔注射STZ的小鼠机械触诱发痛的缩脚阈值的影响示意图；
图53是根据本发明实施例中Von frey测试测试敲除Trpv1对鞘内注射Wnt5a的小鼠机械触诱发痛的缩脚阈值的影响示意图；
图54是根据本发明实施例中Von frey测试测试敲除Trpv1对腹腔注射STZ小鼠机械触诱发痛的缩脚阈值的影响示意图；
图55是根据本发明实施例中原位杂交实验检测人DRG组织切片中GPR177、WNT5AmRNA的表达示意图；
图56是根据本发明实施例中GPR177+神经元和所有DRG神经元的直径分布模式图；
图57是根据本发明实施例中GPR177+神经元中WNT5A+、NF200+神经元的比例示意图；
图58是根据本发明实施例中糖尿病患者脑脊液中Wnt5a分泌水平示意图；
图59是根据本发明实施例中糖尿病患者脑脊液中Wnt5a分泌水平与NRS评分的相关性示意图；
图60是根据本发明实施例中HEK293T细胞转染human Trpv1-EGFP质粒，Wnt5a激活HE293T细胞产生的内向电流示意图。
具体实施方式
现有技术中，神经病理性疼痛的发病机制仍不清楚。本发明人通过详尽的实验研究，证实了GPR177能够介导Wnt5a蛋白从A类DRG神经元分泌至脑脊液中，这一过程是诱导和维持DNP发生的必要条件。此外，首次发现Wnt5a是TRPV1通道的内源性强效激动剂，而且GPR177-Wnt5a-TRPV1信号轴是驱动神经痛(尤其是糖尿病性神经病理性疼痛)发病的关键机制。基于上述发现，本发明人通过动物实验证实了Wnt5a的特异性拮抗剂或Wnt5a的中和抗体能改善STZ诱导的触诱发痛。此外，本发明人还进一步设计了拮抗多肽，用于阻断Wnt5a对TRPV1的结合和激活，并通过在体实验证实，拮抗多肽能够有效抑制Wnt5a和糖尿病诱导的神经病理性痛，为临床治疗神经病理性痛提供了新的镇痛靶点和干预策略。
本发明的一些实施方式提供了一种Wnt5a调节剂的用途，用于制备药物或药物组合物，所述药物或所述药物组合物用于选自下组的一种或多种用途：
(i)降低Wnt5a的活性；
(ii)减缓或阻断Wnt5a和TRPV1通道的结合；
(iii)降低TRPV1通道的活性；
(iv)抑制TRPV1通道的激活；
(v)制备预防和/或治疗由Wnt5a的活性升高引起的疾病的药物；
(vi)制备预防和/或治疗与TRPV1通道激活相关的疾病的药物；和
(vii)预防和/或治疗与由Wnt5a的活性升高引起的疾病，所述疾病优选为神经病理性疼痛及其并发症；更优选为糖尿病诱发的神经病理性疼痛(糖尿病性神经痛)。
本发明所述的Wnt5a调节剂的形式包括但不限于小分子，肽，有机分子，环状分子，杂环分子，脂质，带电脂质，糖脂，极性脂质，非极性脂质和适体；在一些优选的实施例中，Wnt5a调节剂为多肽，例如：如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQID NO.5和SEQ ID NO.6所示的序列或它们的突变体中的任一种。
在一些优选的实施方案中，所述Wnt5a调节剂彼此之间可以形成复合物，这些复合物中的多肽可以相同，可以不同，或者是相同多肽和不同多肽的混合物。可选地，所述组合物可包含其它化合物，或者与所述多肽分离，或者与所述多肽共价或非共价结合，其中，所述化合物的非限制性示例包括可检测的部分，例如放射性的，电子密集，荧光，磷光，化学发光，显色，螯合，磁性，能量转移或插入的化合物，或核酸，核酸类似物，蛋白质，肽，抗体，抗体片段，碳水化合物，多糖，低聚糖，脂质，核苷酸，核苷酸类似物，半抗原，或有机化合物。
在一些优选的方案中，所述Wnt5a调节剂选自：抗体、多肽、shRNA、dsRNA、miRNA、反义寡核苷酸、化合物或其组合。
在一些优选的方案中，所述Wnt5a调节剂选自Wnt5a中和抗体和Wnt5a抑制剂。
在一些优选的方案中，所述Wnt5a抑制剂为多肽，其中，所述多肽的序列具有至少一个可与Wnt5a特异性结合的氨基酸残基。
在一些优选的方案中，所述Wnt5a抑制剂为Box5。
在一些优选的方案中，所述多肽的序列中至少部分片段与TRPV1通道的氨基酸序列中的部分片段相同。
在一些优选的方案中，所述TRPV1通道具有与Wnt5a特异性结合的区域；且
所述多肽的序列中至少部分片段和所述与Wnt5a特异性结合的区域的部分片段相同；或者，
所述多肽的序列中至少部分片段和所述与Wnt5a特异性结合的区域的部分片段同源性大于70％。
在一些优选的方案中，所述与Wnt5a特异性结合区域位于所述TRPV1通道胞外S5-S6环，或者所述与Wnt5a特异性结合区域位于所述TRPV1通道胞外S3-S4环。
在一些优选的方案中，所述多肽的序列包括选自N292、E611、S293、Q286、N606、S289、N605、R202、S612、E203、S210、K283、E652、E649、K208、D547、R281、R284、K808、D647、R290、N288和N653中的至少一种氨基酸残基。
在一些优选的方案中，所述多肽的序列包括选自N605、L461、K604、N606、V610、E611、P614、K616、R618、D647、L648、E649、E652和D655中至少一种氨基酸残基，优选为至少两种，更优选为至少三种，更优选为至少五种，更优选为至少七种。
在一些优选的方案中，所述多肽的序列包括选自E611、N606、K604、V610、E611、P614、K616和R618中至少一种氨基酸残基。
在一些优选的方案中，所述多肽的序列包括选自D647、L648、E649、E652和D655中至少一种氨基酸残基。
在一些优选的方案中，所述多肽具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列、其片段及其修饰形式或其突变体。
在一些优选的方案中，所述多肽具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列、其片段及其修饰形式或其突变体；更优选地，所述多肽为如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的片段，例如如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽、如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列的多肽。
在一些更优选的方案中，所述多肽具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列、其片段及其修饰形式或其突变体。
在一些优选的方案中，所述多肽具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列、其片段及其修饰形式或其突变体；更优选地，所述多肽为如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的片段，例如如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽，如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列的多肽。
在一些更优选的方案中，所述多肽具有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列、其片段及其修饰形式或其突变体。
在一些优选的方案中，所述多肽具有如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列、其片段及其修饰形式或其突变体。
发明人通过实验发现，具有选自如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽，其拮抗效果好于SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.6。
表1
本发明的一些实施方式提供了一种Wnt5a调节剂，所述Wnt5a调节剂包括至少一种多肽，所述多肽的序列具有至少一个可与Wnt5a特异性结合的氨基酸残基；且
所述多肽的序列中至少部分片段与TRPV1通道的氨基酸序列中的部分片段相同。
在一些优选的方案中，所述TRPV1通道具有与Wnt5a特异性结合的区域；
所述多肽的序列中至少部分片段和所述与Wnt5a特异性结合的区域的部分片段相同；或者，所述多肽的序列中至少部分片段和所述与Wnt5a特异性结合的区域的部分片段同源性大于70％。
在一些优选的方案中，所述多肽的序列包括选自以下的至少一组氨基酸残基：
E611、N606和N605；
S612和N606；
E652和E649；和，
D647和E649。
在一些优选的方案中，所述多肽的序列包括E611、N606和N605。
在一些优选的方案中，所述多肽的序列包括S612和N606。
在一些优选的方案中，所述多肽的序列包括E652和E649。
在一些优选的方案中，所述多肽的序列包括D647和E649。
本发明的另一些实施方式中提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明第二方面所述的Wnt5a调节剂和其在药学上可接受的赋形剂。
在本发明的一些实施方式中提供了一种编码所述多肽序列的核酸。
在本发明的一些实施方式中提供了包含本发明第二方面所述的核酸的载体。
在一些优选的方案中，所述载体为细菌，酵母，哺乳动物，病毒，表达，穿梭或质粒中的至少一种。当所述载体是表达载体时，所述载体可进一步包含控制元件，使得所述修饰的蛋白组成型表达或在诱导型启动子的控制下表达。
在本发明的一些实施方式中还提供了包含上述所述载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是原核或真核细胞。将所述宿主细胞或载体给予或植入哺乳动物，例如啮齿动物或人，用于治疗目的。
在本发明的一些实施方式中还提供了一种预防和/或治疗神经病理性疼痛的方法，所述方法包括步骤：
向受试者施用上述Wnt5a调节剂；
或，向受试者施用上述药物组合物；
或，向受试者施用GPR177抑制剂。
本文中，除非另有说明，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数的值，以及在适当时其分数(如整数的十分之一和百分之一)。应当理解，除非另有说明，否则本文所用的术语“一个”和“一种”是指所列举的组分中的“一个或多个”。替代方案(例如“或”)的使用应理解为意指替代方案之一、两者或其任何组合。如本文所用，术语“包括”和“包含”是同义使用的。另外，应当理解，本申请公开了包含本文所述的组分(例如，结构域或区域)和取代基的各种组合的多肽，其程度与每个多肽单独列出的程度相同。因此，单个多肽的特定组分的选择在本公开的范围内。
本文中，相对于参考数值的术语“约”及其语法等同物可以包括从该值加或减10％的值的范围，如从该值加或减10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的值的范围。例如，数量“约10”包括从9到11的数量。
如本文所用，术语“Wnt5a”是一种非典型的Wnt亚型，主要通过非典型WNT/PCP或WNT/Ca2+信号通路发挥其功能。Wnt为参与Wnt信号传导系统的蛋白，其包括例如Wnt5a，Wnt11和Wnt3a等。
如本文所用，术语“拮抗剂”指的是与受体结合，阻断该受体激动剂介导的作用的物质，例，文本中，Wnt5a拮抗剂与Wnt5a结合，阻断其与TRPV1通道结合。
如本文所用，术语“抑制剂”指的是用来阻滞或降低化学反应速度的物质，例如，本文中Wnt5a抑制剂用于阻滞或降低Wnt5a的活性。
如本文所用，术语“结合结构域”或“结合区”或“结合域”是指蛋白质、多肽、寡肽或肽或抗体或衍生自抗体的结合结构域的结构域、区、部分或位点，其具有特异性识别并结合靶分子(如抗原、配体、受体、底物或抑制剂的能力。术语“特异性结合”指的是结合结构域以等于或大于105M-1的亲和力或Ka(即特定结合相互作用的平衡缔合常数，单位为1/M)与靶标结合。
如本文所用，术语“肽”指的是包含以肽键结合的氨基酸序列的分子，与长度，翻译后修饰或功能无关。
如本文所用，术语“载体”是指多核苷酸的递送载体。在一些实施例中，在基因工程重组技术中，载体包括编码可操作插入的特定蛋白质的多核苷酸序列，以实现该蛋白质的表达。载体用于转化，转导或转染宿主细胞，并且可以在宿主细胞中表达由载体传递的遗传物质元件。本公开中的“载体”可以是任何合适的载体，包括染色体，非染色体和合成核酸载体(包括一系列适当的表达控制元件的核酸序列)。
如本文所用，术语“多肽”指的是天然存在或通过重组以化学方式或其它方式生产或改变的蛋白质，其本质上可设想为与原生蛋白质相同方式在翻译后处理的蛋白质的三维结构。本文中所述的多肽可以通过本领域已知的任何方法制备，例如通过重组DNA方法或通过化学合成方法。
如本文所用，术语多肽的“突变体”指的是所述多肽的多肽，“突变体”相对于起始多肽序列具有一个或多个突变，例如，一个或多个氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代，或者其具有一个或多个氨基酸残基插入或缺失。此类变化与起始多肽必然具有小于100％的序列一致性或相似性。在一个实施方案中，变体将具有与起始多肽的氨基酸序列约60％至小于100％的氨基酸序列一致性或相似性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，变体将具有与起始多肽的氨基酸序列约75％至小于100％、约80％至小于100％、约85％至小于100％、约90％至小于100％、约95％至小于100％的氨基酸序列一致性或相似性的氨基酸序列。
如本文所用，术语“TRPV1通道”和“辣椒素受体”可互换使用，是一种阳离子通道，指的是TRPV通道子成员之一，其在伤害性初级感觉神经元中表达，TRPV通道子成员还包括TRPV1，TRPV2，TRPV3和TRPV4等。
如本文所用，术语“TRPV1通道胞外S5-S6环”为RPV1通道外一段环状肽链，其具体氨基酸序列(鼠源)如SEQ ID NO.2所示，
SEQ ID NO.2：
EDGKNNSLPVESPPHKCRGSACRPGNSYNSLYSTCLELFKFTIGMGDLEFTENYDFKA。
SEQ ID NO.2(人源化改造后的序列)为SEQ ID NO.4：
EDGKNDSLPSESTSHRWRGPACRPPDSSYNSLYSTCLELFKFTIGMGDLEFTENYDFKA。
如本文所用，术语“TRPV1通道胞外S3-S4环”为RPV1通道外另一段环状肽链，其具体氨基酸序列(鼠源)如SEQ ID NO.1所示，
SEQ ID NO.1：AYYRPVEGLPPYKLNNTVGD。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指当使用本领域众所周知的途径施用时通常不产生过敏或其他严重不良反应的分子实体和组合物。经联邦或州政府监管机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出的用于动物中，且更特别的是人类中的分子实体和组合物被认为是“药学上可接受的”。
如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”指的是施用可以由接受患者耐受的赋形剂，。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠剂或乳化剂、固体粘合剂、分散或悬浮助剂、增溶剂、着色剂、调味剂、包衣、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂及其组合。合适的赋形剂的选择和使用教导于Gennaro,ed.,Remington:The Science and Practiceof Pharmacy,20th Ed.(Lippincott Williams&Wilkins 2003)中，以及Gennaro,ed.,Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company,19th ed.1995)中。配制剂可以进一步包括一种或多种载体、稀释剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂、白蛋白以防止小瓶表面的蛋白质损失等。
如本文所用，术语“治疗”或“改善”是指治疗性治疗或预防疾病性(prophylactic)/预防性治疗。如果接受治疗的个体中至少一种疾病的症状得到改善，或者治疗可以延迟个体中进行性疾病的恶化，或防止另外的相关疾病的发作，则该治疗为治疗性的。
如本文所用，术语“神经病理性疼痛”指的是神经系统任何部位的病变损伤引起的疼痛，例如化疗引起的神经病理性疼痛，损伤和炎症引起的神经病理性疼痛等，例如：坐骨神经痛、肋间神经痛、糖尿病性神经痛等。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
除非另有指明，本文所用的技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义，需要注意的是，本文所用的术语仅为了描述具体实施方式，而非意图限制本申请的示例性实施方式。
实施例1、DRG神经元分泌的Wnt5a是DNP发生的必要条件
本实施例中证实了DRG神经元分泌的Wnt5a是DNP发生的必要条件，此外还进一步证实了GPR177能够介导Wnt5a分泌到脑脊液，进而促进DNP的发生和维持。
(A)STZ处理对DRG中不同Wnt亚型表达的影响。
小鼠经异氟烷深度麻醉后，快速断头弃血，分离小鼠L3-L6 DRG组织，用于总RNA提取。RNA提取的具体操作方法参照RNA提取试剂盒的说明书进行，之后用40μl RNase-freeH2O洗脱RNA。测定RNA浓度后，取300ng总RNA用于cDNA合成。cDNA合成操作参照HiScript IIQ RT SuperMix试剂盒说明书进行。合成的cDNA用于实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-time PCR，qRT-PCR)，检测相应基因的表达变化。反应混合液为：10μl 2XPremix Ex TaqTM II，1μl 10μM Primer F，1μl 10μM Primer R，7μl ddH2O，1μl cDNA，总体积20μl。反应条件为：95℃2min；95℃10s，60℃50s，读板，40cycles；65℃～95℃梯度升温，0.5℃/cycle，读取melt curve。Gapdh用作内参基因，目的基因的相对表达变化采用2-ΔΔCt法计算。所得实验结果见图1。
由图1可知，经过STZ处理后，DRG中不同Wnt5a亚型表达明显升高，而其他如Wnt3、Wnt3a、Wnt7a等几乎没有改变。
(B)原位杂交与免疫组织化学法对DRG中Wnt5a mRNA与NF200的共定位检测。
小鼠DRG组织切片中Wnt5a mRNA的表达利用原位杂交实验检测。小鼠经异氟烷深度麻醉后，进行心脏灌流。30ml预冷的、RNase-free的PBS和4％PFA依次灌注。取小鼠L3-L6DRG，置于4％PFA中，于4℃后固定6～12h；随后置于20％蔗糖溶液中脱水。充分脱水后的组织块，于PBS中漂洗2～3次，修剪去多余组织，于OCT中速冻包埋，在冷冻切片机中切片。DRG组织切10μm厚度，用于贴片染色。原位杂交实验的操作参照RNAscope原位杂交试剂盒使用说明书进行，Wnt5a的探针均选择Cy3染料进行标记。RNAscope操作完成后，DRG切片在避光条件下继续进行免疫组织化学染色。组织切片用封闭液于室温封闭1～2h，加一抗chicken anti-NF200(1:1000)置于4℃孵育18～20h。之后，PBS洗片4次，每次10min。加对应的Alexa 488荧光染料偶联的二抗(1:500，Jackson ImmunoResearch)，置于室温避光孵育2h。PBS洗片4次，每次10min。用含抗淬灭剂的封片剂封片，室温避光晾干，于荧光显微镜下观察或-20℃保存。所得实验结果见图2。
图2中，白色箭头指示存在共定位的细胞。标尺为50μm。
由图2可知，DRG中Wnt5a mRNA与NF200存在共定位。
(C)DRG中Wnt5a+和NF200+神经元的面积分布模式。
使用免疫组织化学染色法进行的定量统计。免疫组织化学染色利用荧光显微镜，在相同拍摄条件下获取不同分组的组织图像。采用Image J软件和NIS Element AR软件进行荧光信号强度的定量分析。在每张图片中选取4～6个无荧光信号的区域，所获取信号值的平均值作为背景信号的荧光强度(background intensity)。当细胞的荧光信号≥2X(background intensity+standard deviation)时，将之视为阳性细胞；当阳性细胞可见清晰细胞核轮廓时，用于细胞面积的定量分析。统计来自至少3只小鼠的779个Wnt5a+神经元，并计算Wnt5a+神经元在不同面积区间的分布比例。
由图3可知，Wnt5a+神经元与NF200+的A类DRG神经元具有基本相同的分布特征。
(D)STZ处理前后，Wnt5a+、Wnt5a+/NF200+、Wnt5a+/IB4+神经元的比例。
使用免疫组织化学染色法对Wnt5a+、Wnt5a+/NF200+、Wnt5a+/IB4+神经元的比例进行的定量统计。每组各统计来自至少3只小鼠的1020-1203个DRG神经元，并分别计算STZ处理前后，Wnt5a+、Wnt5a+/NF200+、Wnt5a+/IB4+神经元的比例。
由图4可知，经STZ处理后，Wnt5a+、Wnt5a+/NF200+神经元比例显著升高，而Wnt5a+/IB4+神经元的比例不变。1.25％的DRG神经元共表达IB4和Wnt5a，这一比例在STZ模型鼠中未出现明显变化。
(E)STZ处理对Wnt5a+神经元中Wnt5a表达丰度的影响。
使用免疫组织化学染色法对经STZ处理和未经STZ处理的小鼠的DCR切片中Wnt5a荧光信号强度进行定量统计。其中，每组各统计来自3只小鼠的9张DRG切片，各含137～166Wnt5a+神经元用于Wnt5a荧光信号强度定量统计。
由图5可知，经STZ处理后，Wnt5a+神经元中Wnt5a表达丰度明显增加。
(F)qRT-PCR检测DRG中Wnt5a的表达。
RNA提取
小鼠经异氟烷深度麻醉后，快速断头弃血，分离小鼠L3-L6 DRG组织，用于总RNA提取。RNA提取的具体操作方法参照RNA提取试剂盒的说明书进行，之后用40μl RNase-freeH2O洗脱RNA。测定RNA浓度后，取300ng总RNA用于cDNA合成。cDNA合成操作参照HiScript IIQ RT SuperMix试剂盒说明书进行。
Real-time PCR
合成的cDNA用于实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)，检测相应基因的表达变化。反应混合液为：10μl 2XPremix Ex TaqTM II，1μl 10μMPrimer F，1μl 10μM Primer R，7μl ddH2O，1μl cDNA，总体积20μl。反应条件为：95℃2min；95℃10s，60℃50s，读板，40cycles；65℃～95℃梯度升温，0.5℃/cycle，读取melt curve。Gapdh用作内参基因，目的基因的相对表达变化采用2-ΔΔCt法计算。qRT-PCR实验中Gapdh作为内参基因，western blot实验检测ACTIN作为loading control。
由图6可知，经STZ处理后，WT与CKO小鼠DRG中Wnt5a的表达量都升高，表明敲除Gpr177并不抑制Wnt5a的mRNA表达。
(G)Western blot检测DRG中Wnt5a的表达。
DRG组织加适量预冷的RIPA裂解液，置于预冷的研磨磨具中，用全自动样品快速研磨机匀浆裂解。组织匀浆液转移至无菌离心管中，4℃、10000g离心10min，将上清转移至新的离心管中。BCA法测定蛋白质浓度，取50～100μl组织匀浆液，加入1/4体积的4X蛋白质样品处理液，沸水浴10min。室温10000g离心3min，取20～30μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE浓缩胶浓度5％，分离胶浓度10％或12％。SDS-PAGE电泳结束后，进行westernblotting操作。转膜结束后，用封闭液于室温封闭1～2h。将Goat Anti-Wnt5a(1:1000)、用一抗稀释液稀释后，于4℃孵育15～18h。随后，用TBST洗膜5次，每次5min。将HRP-偶联的相应二抗(Earthox，1:10000)稀释于TBST溶液(含3％BSA)中，于室温孵育2h。随后，依次用TBST漂洗5次、TBS漂洗1次，每次5min。洗膜后，于化学发光成像系统中显色。ACTIN用作loading control。采用Image J软件进行信号强度的定量分析。
由图7可知，经STZ处理后，DRG组织中Wnt5a蛋白的强度降低是由于其大量分泌到脑脊液中(图8)，而敲除Gpr177后，经STZ处理DRG组织中Wnt5a蛋白的强度升高是由于其无法分泌到脑脊液(图8)所以堆积在细胞中。
(H)脑脊液中Wnt5a分泌水平的检测。
小鼠深度麻醉后，从头至枕骨粗隆作中线切开，钝性分离枕骨至寰椎肌肉，露出白色硬脑膜，从小脑延髓池用玻璃电极抽取脑脊液，每只小鼠采集脑脊液10～20μl，于4℃1000g离心5min去除细胞。取上清，迅速置于-80℃保存。剔除存在明显血液污染的脑脊液样本。取5μl脑脊液与5μl PBS混匀后，加1/3体积的4X样品处理液，沸水浴处理后，室温10000g离心3min，取上清液用于SDS-PAGE电泳和western blotting操作。转膜结束后，用封闭液于室温封闭1～2h。将Goat Anti-Wnt5a(1:1000)、用一抗稀释液稀释后，于4℃孵育15～18h。随后，用TBST洗膜5次，每次5min。将HRP-偶联的相应二抗(Earthox，1:10000)稀释于TBST溶液(含3％BSA)中，于室温孵育2h。随后，依次用TBST漂洗5次、TBS漂洗1次，每次5min。洗膜后，于化学发光成像系统中显色。ACTIN用作阴性对照，CSF标志蛋白TTR(Transthyretin)用作loading control。采用Image J软件进行信号强度的定量分析。
图8中，上方柱状图表示Wnt5a分泌水平的定量统计，检测ACTIN作为阴性对照，检测CSF标志蛋白TTR(Transthyretin)作为loading control；下方为western blot检测Wnt5a、ACTIN、TTR结果图。
由图8可知，经STZ处理后，脑脊液中Wnt5a分泌水平升高，但敲除Gpr177后，经STZ处理脑脊液中Wnt5a分泌水平明显降低，与野生型接近，结合上图7中的实验结果，可以推断经过敲除Gpr177影响Wnt5a从DRG分泌至脑脊液的过程。
(I)DRG神经元原代培养与Wnt5a分泌的检测
小鼠经异氟烷深度麻醉后，快速断头弃血，75％酒精表面消毒后，于冰上快速分离小鼠全部DRG组织置于冰冷的PBS中。弃尽PBS后，加入1ml酶溶液(Collagenase A 20mg/100ml，Dispase II 300mg/100ml溶于PBS)于37℃消化1h；500g离心5min，收集消化后的组织。加入2ml DMEM培养基(含10％FBS、1X Pen/Strep)，机械吹打组织至无明显团块。将细胞悬液全部转移，并铺于15％BSA溶液的上层，500g离心10min。轻轻抽取上层溶液，仅保留离心管底部的细胞团沉淀，加2ml DMEM培养基重悬细胞，吹打成单细胞悬液，500g离心10min。弃尽上清，加适量体积的Neurobasal培养基(含2％B27、1mM L-Glutamine、50ng/mlNGF2.5S、2ng/ml GDNF、1X Pen/Strep)，重悬并吹打成单细胞悬液。细胞悬液滴在poly-D-Lys和laminin预包被的培养皿或细胞爬片上，置于37℃CO2培养箱中培养30min，使DRG神经元以较高的细胞密度贴壁在细胞爬片上。随后，加适量体积的Neurobasal培养基，置于37℃CO2培养箱中过夜培养后，用于相应实验。
DRG神经元于37℃培养24h后，弃尽培养基，并用37℃预热的Neurobasal基础培养基漂洗3次。每皿加入2ml Neurobasal培养基(含0.5％B27、1％青链霉素)，于37℃CO2培养箱中培养12h。收集培养基，于4℃1000g离心5min，去除细胞及细胞碎片。收集上清液，加入10％三氯乙酸(Trichloroacetic acid，TCA)，置于4℃轻摇10min，以沉淀培养基中的蛋白质。随后，4℃15000g离心10min，弃尽上清，加100μl 1X样品处理液，沸水浴处理10min，室温10000g离心5min，取15μl上清用于Western blotting检测Wnt5a的分泌水平。结果见图9。采用Image J软件对western blotting中条带的信号强度进行定量分析，结果见图10。
图9为三次独立重复实验的代表图。检测ACTIN用作阴性对照和loading control。
由图9-10可知，经STZ处理后，培养DRG细胞培养液中Wnt5a蛋白的强度增加是由于Wnt5a从STZ处理的DRG神经元分泌到培养液中，而敲除Gpr177后，经STZ处理DRG细胞裂解液中Wnt5a蛋白的强度升高是由于其无法分泌到培养液所以堆积在细胞中。
(A，B)鞘内注射Wnt5a特异性拮抗剂Box5(A)、中和性抗体Anti-Wnt5a IgG(B)改善STZ诱导的触诱发痛。
Von Frey测试
在实验开始前2～3天，每天将小鼠放到行为学测试间适应1h。行为学测试房间应保持安静、光照充足、温度22±2℃、湿度40～60％。所有行为学实验均采用单盲法进行测试和分析。
实验当天将小鼠放入长10cm X宽10cm X高13cm的透明观察格中，观察格置于高30cm的金属丝铁网上。待小鼠安静后，用von Frey纤维丝(0.02-2g)对小鼠后足底中部进行刺激。小鼠受到刺激3s内表现出抬脚、甩脚、舔脚等行为，即为有反应。按照Dixon’s up-down的方法，首先用0.16g von Frey丝刺激，小鼠有反应时选择相邻的强度小的von Frey丝刺激，小鼠无反应则选择强度大的von Frey丝刺激。以此类推，依次选择不同强度的vonFrey丝刺激，每次刺激持续3s，每两次刺激间隔5s以上，共完成6次刺激，对照反应量表评估小鼠的缩脚阈值(Paw withdrawal threshold)，用于评估小鼠的机械触诱发痛(Mechanical allodynia)行为。
在STZ注射前、注射后4周分别测量其缩脚阈值。确认小鼠的机械痛敏后，鞘内注射(intrathecal injection，i.t.)梯度剂量的Box5或Anti-Wnt5a IgG，用于评估拮抗Wnt5a对STZ引起的机械触诱发痛行为的影响。注射Saline或Goat IgG作为阴性对照。结果见图11。
由图11可知，鞘内注射Wnt5a特异性拮抗剂Box5后，小鼠缩脚阈值提高了，说明Box5有助于降低小鼠痛感。
由图12可知，鞘内注射中和性抗体Anti-Wnt5a IgG后，小鼠的缩脚阈值提高了，说明中和性抗体Anti-Wnt5a IgG有助于降低小鼠痛感。
(C，D)Box5抑制糖尿病小鼠Trpv1+DRG神经元的超兴奋性。
Trpv1-ChR2/EYFP小鼠注射Vehicle或STZ后3～4周，取DRG组织进行DRG神经元的原代培养。利用全细胞膜片钳记录技术检测STZ处理对Trpv1+DRG神经元兴奋性的影响。灌流Box5，检测拮抗Wnt5a对Trpv1+DRG神经元兴奋性的影响。
全细胞膜片钳记录(Whole-cell patch clamp recordings)：采用MultiClamp700B放大器和Digidata 1550B数字化仪进行原代培养的DRG神经元、HEK293T细胞的全细胞膜片钳记录。采用P-97微电极拉制仪拉制玻璃电极。用于全细胞记录时，电极尖端电阻值控制在4–6MΩ。在电流钳模式下，通过记录电极向细胞内依次注入不同强度的内向电流(600ms)，用于记录DRG神经元的动作电位发放。结果见图13和图14。
由图13和图14可知，经STZ处理后，Trpv1+DRG神经元动作电位升高，经STZ+Box5处理后Trpv1+DRG神经元动作电位发放频率下降，同未经STZ处理的对照组接近，可以推断Box5有助于抑制糖尿病小鼠Trpv1+DRG神经元的超兴奋性。
(E)Box5灌流给药引起Trpv1+DRG神经元动作电位发放的电流阈值的影响。
在电流钳模式下，通过记录电极向细胞内依次注入不同强度的内向电流(600ms)，用于记录DRG神经元的动作电位发放，结果见图15，图15中，激活DRG神经元所需的最小电流即为Rheobase。
由图15可知，Box5灌流给药引起Trpv1+DRG神经元动作电位发放的电流阈值升高。
(F)Wnt5a CKO小鼠准备、STZ造模、行为学测试、组织样本收集的实验方案
取4-5周龄的Wnt5aflox/flox小鼠，经鞘内注射AAV9-CAG-Cre-mCherry(1011VG)病毒后，用作Wnt5a CKO鼠；注射AAV9-CAG-mCherry(1011VG)病毒的Wnt5aflox/flox小鼠作为WT对照组。病毒注射后3周，进行Von frey测试测定小鼠的缩脚阈值；之后，腹腔注射STZ180mg/kg体重，用于构建I型糖尿病模型。STZ注射后7d，尾静脉采血，用ONETOUCH@UltraEasy血糖仪测定随机血糖水平，随机血糖≥16.6mmol/L，即为造模成功。在STZ注射后1～6周，测定小鼠的机械触诱发痛；在STZ注射后4周，进行Real-time PEA实验，评估Wnt5a敲除对STZ诱导的疼痛厌恶性情绪的影响；在STZ注射后6周，完成行为学测试后，取小鼠DRG和足底皮肤组织，用于相应实验。图16为时间轴，显示了Wnt5a CKO小鼠准备、STZ造模、行为学测试、组织样本收集的实验方案。
(G)DRG中敲除Wnt5a改善糖尿病小鼠的触诱发痛并改善糖尿病小鼠对机械刺激的厌恶性逃避反应。
WT和Wnt5a CKO小鼠，腹腔注射STZ(180mg/kg体重)诱导I型糖尿病模型；在STZ注射前、注射后1～6周，进行Von frey测试，测定小鼠的机械触诱发痛，评估Wnt5a敲除对STZ诱导的触诱发痛行为的影响。
在STZ注射后4周，进行Real-time PEA实验，评估Wnt5a敲除对STZ诱导的疼痛厌恶性情绪的影响。结果见图17。
实时位置逃避实验(real-time place escape/avoidance，PEA)：用于评估小鼠神经病理性痛的情绪成分。Real-time PEA测试箱由两个相连的长30cm X宽28cm X高50cm的箱子组成，以黑白相间的横条纹和竖条纹区分。将小鼠放入测试箱中，用ANY-maze软件记录小鼠运动轨迹。Real-time PEA实验分为三个连续的阶段，依次为Pre-stimulation、Stimulation、Post-stimulation。Pre-stimulation阶段：在无任何刺激的条件下，小鼠在两箱之间自由活动，时长10min；Stimulation阶段：根据小鼠在Pre-stimulation阶段表现出的偏好性，当小鼠进入偏好侧时用0.4g von Frey丝刺激其后爪足底，当小鼠进入非偏好侧时不施加任何刺激，让小鼠在两箱之间活动，时长10min；Post-stimulation阶段：在无任何刺激的条件下，小鼠在两箱之间自由活动，时长10min。分析Pre、Stimulation、Post三个阶段，小鼠进入Stimulation一侧的总时间。计算小鼠在刺激前后进入Stimulation一侧的时间差，即Pre-Post，作为小鼠受刺激后表现出厌恶性逃避的时间(Aversion time)。结果见图18。
由图17可知；Wnt5a CKO小鼠经过STZ处理后，小鼠机械触诱发痛的缩脚阈值升高，表明Wnt5a敲除有利于缓解小鼠触诱发痛行为。
由图18可知；Wnt5a CKO的小鼠受刺激后表现出厌恶性逃避的时间增长，表明Wnt5a敲除有利于缓解STZ诱导的疼痛厌恶性情绪。
以下实验结果显示了敲除Wnt5a后，糖尿病性外周神经病变改善。
(A，B)RT-PCR检测DRG、腰膨大段脊髓中Cre和Wnt5a的表达水平和对表达水平的定量统计。
取WT和Wnt5a CKO小鼠的DRG和脊髓腰膨大段组织，提取总RNA，合成cDNA。之后进行PCR实验，检测Wnt5a、Cre在DRG和脊髓组织中表达水平。PCR反应混合液为：10μl 2XPremix TaqTM II，1μl 10μM Primer F，1μl 10μM Primer R，7μl ddH2O，1μl cDNA，总体积20μl。反应条件为：94℃3min；94℃10s，58℃15s，72℃30s，35cycles；72℃5min。PCR结束，进性琼脂糖凝胶电泳，检测相应基因的表达水平。Gapdh用作内参基因。采用Image J软件对凝胶电泳中条带的信号强度进行定量分析。结果见图19和图20。
由图19和图20可知；DRG中Cre的表达水平高度升高，而Wnt5a的表达水平大为降低；腰膨大段脊髓中Cre的表达水平略微升高，但是Wnt5a的表达水平基本不变。表明Wnt5a被选择性在DRG中敲除。
(C-E)鞘内注射的AAV9病毒在DRG组织中主要感染DRG神经元。
病毒感染的mCherry/Cre信号与神经元标志物Nissl Wnt5a CKO小鼠的DRG组织切片用于免疫组织化学染色，评估AAV9-Cre/mCherry在DRG中的表达情况。
组织切片用封闭液于室温封闭1～2h，加一抗goat anti-IBA1(巨噬细胞标志蛋白IBA1)(1:1000)或rabbit anti-GS(卫星胶质细胞标志蛋白GS)(1:10000)置于4℃孵育18～20h。之后，PBS洗片4次，每次10min。加对应的Alexa488荧光染料偶联的二抗(1:500，Jackson ImmunoResearch)或荧光标记的染料NeuroTrace 640/660-Nissl(1:800)，置于室温避光孵育2h。PBS洗片4次，每次10min。用含抗淬灭剂的封片剂封片，室温避光晾干，于荧光显微镜下观察或-20℃保存。
由图21、图22和图23可知，AAV9-Cre/mCherry与DRG神经元共定位，但是与巨噬细胞标志蛋白IBA1和卫星胶质细胞标志蛋白GS没有共定位，表明鞘内注射的AAV9病毒在DRG组织中主要感染DRG神经元。
(F，G)DRG中敲除Wnt5a改善糖尿病小鼠的外周神经病变。
在Vehicle或STZ处理后6周，取WT、Wnt5a CKO小鼠的足底皮肤组织，经冰冻切片(30μm厚度，漂在含0.01％叠氮钠的PBS溶液中)后，用于免疫组织化学染色，评估Wnt5a CKO对STZ引起的外周神经病变的影响。
组织切片用封闭液于室温封闭1～2h，加一抗rabbit anti-PGP9.5(1:2000)置于4℃孵育18～20h。之后，PBS洗片4次，每次10min。加对应的AlexaCy3荧光染料偶联的二抗(1:500，Jackson ImmunoResearch)，置于室温避光孵育2h。PBS洗片4次，每次10min。用含抗淬灭剂的封片剂封片，室温避光晾干，于荧光显微镜下观察或-20℃保存。
皮肤组织切片经PGP9.5染色后，选取梅氏小体(Meissner's corpuscles)区域的组织切片，用于表皮中神经末梢分支(intra-epidermal nerve fiber，IENF)的定量统计。每张组织切片经Z轴叠加(20μm)后，取复合图像用于PGP9.5+神经末梢的定量分析。由真皮层延伸至表皮层的、完整的PGP9.5+神经纤维分支计入IENF的定量统计。
图24和图25中，白色星号指示完整的神经末梢。
由图24和图25可知，DRG中敲除Wnt5a后，经STZ处理的小鼠PGP9.5免疫染色显示足底无毛区表皮内神经纤维末梢的分布量增加，表明DRG中敲除Wnt5a有助于改善糖尿病小鼠的外周神经病变。
实施例2、Wnt5a激活DRG伤害性感觉神经元，增强脊髓背角兴奋性突触传递，引起神经病理性痛表型
本实施例中证实了GPR177介导分泌的Wnt5a是DNP发生的必要条件和诱发神经病理性痛的关键分子。
(A)鞘内注射Wnt5a引起触诱发痛
1ng或10ng Wnt5a溶解于10μl Saline，用于鞘内注射。
取WT Naive小鼠，鞘内注射梯度剂量的Wnt5a，进行Von frey测试，评估外源性Wnt5a引起的机械触诱发痛行为。结果见图26，鞘内注射Saline用作阴性对照。
由图26可知，随着鞘内注射Wnt5a梯度增加，小鼠机械触诱发痛的缩脚阈值梯度减少，而且随着注射后时间的增加，小鼠机械触诱发痛的缩脚阈值逐渐恢复至和对照同一水平。表明鞘内注射Wnt5a引起触诱发痛。
(B)鞘内注射Wnt5a引起小鼠对机械刺激的厌恶性逃避反应
10ng Wnt5a溶解于10μl Saline，用于鞘内注射。注射10μl Saline作为阴性对照。
取WT Naive小鼠，鞘内注射10ng Wnt5a，进行Real-time PEA测试，评估外源性Wnt5a引起的疼痛厌恶性情绪。结果见图27，鞘内注射Saline用作阴性对照。
由图27可知，鞘内注射Wnt5a可以引起小鼠对机械刺激的厌恶性逃避反应。
本实施例中还证实了，Wnt5a以剂量依赖性地方式诱导C类DRG神经元产生iCa2+活动，诱导DRG小神经元产生内向电流，增强脊髓背角SOM+中间神经元的兴奋性突触传递，从而诱发DNP的产生。
(C-E)Wnt5a以剂量依赖性地方式诱导C类DRG神经元产生iCa2+活动。
钙成像实验
取AdvillinCre:GCaMP6flox/-的DRG进行原代培养，用于钙成像实验，通过监测GCamp6蛋白的荧光变化，检测Wnt5a诱导的神经元钙反应。原代培养的DRG神经元在正常的细胞外液灌流下，使用ALA-VM8自动给药系统给药0.1～10ng/ml Wnt5a、1μM Capsaicin等15～30s，两次给药间隔用ECS冲洗5min。细胞图像在470nm激发光波长下，由高速扫描相机Flash4.0LT以0.5fps速度连续记录细胞内荧光强度的变化。细胞图像由visiview软件在20X物镜下全视野记录，细胞荧光信号的变化也利用visiview软件进行分析。以无细胞区域的荧光值作为背景信号，实时荧光强度减去背景信号为细胞的实时荧光信号F，细胞在基线状态的平均荧光强度为F0，以△F(F-F0)表示细胞的荧光强度变化。以△F/F0表示细胞内荧光信号的实时变化，给药后△F/F0≥0.1即表示细胞有钙反应。
由图28、29和30可知，随着Wnt5a剂量的提升，DRG神经元产生iCa2+活动逐渐增强，表明Wnt5a以剂量依赖性地方式诱导C类DRG神经元产生iCa2+活动。
(F)Wnt5a诱导DRG小神经元发放动作电位。
全细胞膜片钳记录(Whole-cell patch clamp recordings)：采用MultiClamp700B放大器和Digidata 1550B数字化仪进行原代培养的DRG神经元的全细胞膜片钳记录。在电流钳模式下，1ng/ml Wnt5a由ALA-VM8自动给药系统给药5s，记录Wnt5a诱导的DRG小神经元(直径＜25μm)动作电位发放。灌流1μm Cap作为阳性对照。结果见图31。
由图31可知，Wnt5a诱导DRG小神经元发放动作电位。
(G)Wnt5a诱导DRG小神经元产生内向电流。
全细胞膜片钳记录(Whole-cell patch clamp recordings)：采用MultiClamp700B放大器和Digidata 1550B数字化仪进行原代培养的DRG神经元的全细胞膜片钳记录。在电压钳模式下，1ng/ml Wnt5a由ALA-VM8自动给药系统给药5s，记录Wnt5a诱导的DRG小神经元(直径＜25μm)的内向电流。灌流0.1μm Cap作为阳性对照。结果见图32。
由图32可知，Wnt5a可以诱导DRG小神经元产生内向电流。
(H，I)Wnt5a增强脊髓背角SOM+中间神经元的兴奋性突触传递。
脊髓切片的制备及膜片钳记录：SOMCre:Ai14小鼠(年龄4～8周)用于脊髓片记录。腹腔注射乌拉坦(Urethane 1.5-2.0g/kg体重)，待小鼠深度麻醉后，快速断头、于冰上迅速分离小鼠腰段(L4-L5)脊髓，并立即置于充氧的、预冷的切片液中。使用震动切片机切片，刀片垂直于脊髓长轴，切片厚度控制在300～400μm之间。脊髓片置于充氧(95％O2、5％CO2)的切片液中，于室温孵育2h以上，之后进行膜片钳记录。采用P-97微电极拉制仪拉制玻璃电极，电极尖端电阻值控制在5～10MΩ。以电压钳模式将细胞膜电位钳制在-70mV，记录脊髓背角板层II层的中间神经元或SOM+中间神经元的自发性兴奋性突触后电流(spontaneousexcitatory postsynaptic current，sEPSC)。信号采集频率为10kHz，滤波频率为2kHz。结果见图33和图34。
图33中，左侧：电极记录脊髓背角SOM+神经元的代表性图片。红色箭头指示电极钳制的SOM+神经元。右侧：sEPSC记录的代表性图片。a，b表示Wnt5a(10ng/mL)给药前后的sEPSCs记录的局部放大图。
图34中，Wnt5a对sEPSCs发放频率(左侧)和幅值(右侧)的影响。n.s.，notsignificant。*P<0.05。
由图33和图34可知，Wnt5a可以增强脊髓背角SOM+中间神经元的兴奋性突触传递。
WT和Gpr177 CKO小鼠，腹腔注射STZ(180mg/kg体重)诱导I型糖尿病模型；在STZ注射后4-5周，取DRG组织进行神经元的原代培养，进行全细胞膜片钳电生理记录。在电流钳模式下，通过记录电极向细胞内依次注入不同强度的内向电流(600ms)，记录DRG神经元的动作电位发放。灌流10μg/ml Box5，评估Box5对DRG神经元兴奋性的影响。灌流vehicle作为阴性对照。
由图35和图36可知，Box5和Gpr177敲除能缓解DRG小神经元超兴奋。
实施例3、拮抗Wnt5a能够改善db/db小鼠的触诱发痛
本实施例验证了DRG中GPR177介导的Wnt5a分泌参与II型糖尿病性神经痛，并证实了通过拮抗Wnt5a(通过施用Wnt5a中和抗体或Wnt5a抑制剂)，可显著改善糖尿病性神经痛。
(D)db/db小鼠脑脊液中Wnt5a分泌水平升高。
取WT、db/db鼠，采集脑脊液10～20μl，于4℃1000g离心5min去除细胞。取上清，迅速置于-80℃保存。剔除存在明显血液污染的脑脊液样本。取5μl脑脊液与5μl PBS混匀后，加1/3体积的4X样品处理液，沸水浴处理后进行western blotting操作检测Wnt5a分泌水平。ACTIN用作阴性对照，CSF标志蛋白TTR(Transthyretin)用作loading control。采用Image J软件进行信号强度的定量分析。
图37中，ACTIN作为阴性对照，TTR作为loading control。
由图37可知，db/db小鼠脑脊液中Wnt5a分泌水平升高。
(E，F)拮抗Wnt5a能够改善db/db小鼠的触诱发痛。
WT、db/db鼠鞘内注射5μg Box5(E)或4μg anti-Wnt5a抗体(F)，分别在注射前、注射后0.5h～1d，进行von frey测试，评估拮抗Wnt5a对II型糖尿病模型鼠的机械触诱发痛行为的影响。结果见图38和图39。
由图38和图39可知，拮抗Wnt5a能够改善db/db小鼠的触诱发痛。
实施例4、Wnt5a选择性激活TRPV1通道，且能在HEK293T细胞中诱发TRPV1单通道电活动
本实施例中证实了Wnt5a选择性激活TRPV1通道，诱发单通道活动，这是糖尿病诱发神经病理性痛表型的关键机制。
(A-C)在过表达TRPV1、TRPA1、TRPM8的HEK293T细胞中，Wnt5a选择性地激活TRPV1、诱发快速Ca2+活动。
HEK293T细胞系的培养与转染：HEK293T细胞使用DMEM培养基(含10％FBS、1X Pen/Strep)于37℃CO2培养箱中培养。细胞生长至密度超过90％后，用0.25％Trypsin于37℃消化2min后，进行传代操作。传代后24h，细胞密度达到50％～60％时，利用Lipofectamine2000进行质粒DNA转染。以60mm培养皿为例，每皿准备2～3μg质粒DNA和opti-MEM培养基混合液125μl，准备4～6μl Lipofectamine 2000和opti-MEM培养基混合液125μl，分别混匀后，1:1混合，置于室温静置5～10min。将混合液滴加至培养皿中，轻摇混匀，于培养箱中培养24～48h后，用于相应实验。
HEK293T细胞转染质粒DNA后，于37℃CO2培养箱中培养24-36h，用钙染料Fluo-2AM(2μM，含0.02％F127)于37℃孵育30min，随后进行钙成像实验。钙成像实验中，细胞图像由高速连续的单色光源在激发光340/380nm波长下连续交替激发，由高速扫描相机Flash4.0LT以0.5fps速度连续记录细胞内荧光强度的变化，以340nm/380nm下荧光信号的比值表示钙信号的强度。
图40中，上方为转染DsRed-N1空载质粒的HEK293T细胞图；下方为转染Trpv1-DsRed-N1质粒的HEK293T细胞图。
由图40、图41可知，Wnt5a可以诱导HEK293T细胞Ca2+活动。
由图42可知，转染不同类型的TRP通道时，Wnt5a选择性激活TRPV1通道。
(D)在过表达TRPV1的HEK293T细胞中，Wnt5a激活TRPV1诱导内向电流。
HEK293T细胞转染质粒Trpv1-EGFP-N1后，于37℃CO2培养箱中培养24～36h，随后进行全细胞膜片钳记录实验。在电压钳模式下，将细胞膜电位钳制在-70mV，记录10ng/mlWnt5a激活HE293T细胞产生的内向电流。灌流100nM Cap作为阳性对照。Wnt5a、Cap分别给药10s，两次给药间隔5min。结果见图43。
图43中，左侧为Wnt5a诱发内向电流的代表性图片。右侧为Wnt5a诱发内向电流幅值的定量统计。
由图43可知，在过表达TRPV1的HEK293T细胞中，Wnt5a激活TRPV1诱导内向电流。
(E)转染不同类型的TRP通道时，Wnt5a诱导内向电流的幅度。
HEK293T细胞转染质粒Trpv1-EGFP、Trpv2-EGFP、Trpv3-EGFP、Trpa1-EGFP后，于37℃CO2培养箱中培养24～36h，随后进行全细胞膜片钳记录实验。在电压钳模式下，将细胞膜电位钳制在-70mV，记录10ng/ml Wnt5a激活HE293T细胞产生的内向电流。1μM Cap、1mM 2-APB、100μM AITC分别用作TRPV1、TRPV2/TRPV3、TRPA1电流记录的阳性对照，并比较Wnt5a与相应阳性对照诱导的最大电流值。结果见图44。
由图44可知，Wnt5a诱导Trpv1通道内向电流最强。
(F)在Outside-out膜片钳单通道记录中，Wnt5a激活TRPV1、诱发单通道活动。
外面向外单通道记录(Outside-out single channel recording)：用PatchMaster(HEKA)软件和HEKA EPC10放大器进行单通道膜片钳记录。用于单通道记录时，电极尖端电阻值控制在6-10MΩ。为了最大限度地封接上只带有一个离子通道的细胞膜片，在HEK293T细胞转染后约8小时进行单通道记录。所有记录均在室温(22±1℃)下进行。完成单通道膜片钳制后，将电极尖端移至给药管附近，10ng/ml Wnt5a采用重力驱动给药系统(RSC-200，Bio-Logic)以灌流的方式给药。在80mV电压钳制下进行记录，电流采样频率为10kHz，滤波频率为2.9kHz。转染空载对照质粒、TRPA1-EGFP质粒作为阴性对照。结果见图45。
由图45可知，Wnt5a激活TRPV1，诱发单通道活动。
(G)在过表达TRPV1的HEK293T细胞中，Wnt5a激活TRPV1单通道的I/V曲线。
在±80mV、±60mV、±40mV的不同电压钳制下分别进行记录，单通道电流强度经滤波处理后用于I/V曲线的绘制。电流采样频率为10kHz，滤波频率为2.9kHz。结果见图46。
图46中，左侧为不同电压钳制下，Wnt5a诱导单通道电流的代表性图。右侧为Wnt5a诱导单通道电流的I/V曲线。
由图46可知，在过表达TRPV1的HEK293T细胞中，Wnt5a激活TRPV1单通道电流。
实施例5、测定Wnt5a和TRPV1之间潜在结合位点、拮抗肽的设计与验证
本实施例中测定了Wnt5a和TRPV1之间潜在结合位点，并设计了多种拮抗肽和对照肽，证实了拮抗肽能抑制Wnt5a诱导的iCa2+活动，在体实验进一步验证了拮抗肽能改善糖尿病小鼠的触诱发痛表型。
(A)利用Rosetta软件进行计算机模拟获得的Wnt5a-TRPV1蛋白稳定结合状态模式图。
分子建模实验
采用HHpred服务器(https://toolkit.tuebingen.mpg.de/#/)，以WNT信号复合物结构(PDB ID:6AHY)为模板，对Wnt5a蛋白进行同源结构建模。为了对TRPV1(mTRPV1)的开放态进行建模，我们以DkTx-和RTX结合TRPV1的开放态模型(PDB ID:3j5q)作为模板，并采用2015.25版Rosetta分子建模组件进行membrane-symmetry-loop建模。随后，通过Rosetta分子建模组件relax应用，对Wnt5a、mTRPV1结构模型进一步细化；并选择最低能量评分的分子模型进一步进行分子结构建模；共生成20000个分子模型用于蛋白质对接实验。为获得最佳的蛋白质对接模型，筛选总能量得分(Rosetta energy term name:score)最低的1000个对接模型；从这1000个模型中进一步筛选出具有最低界面评分的10个模型(Rosetta energyterm name:I_sc)；为了定量分析蛋白质结构对接的结果，利用residue_energy_breakdown应用对筛选出的10个模型进行进一步分解，主要分解为范德华力(VDW)、氢键(hbond_sc)和静电(fa_elec)。以吸引力(fa_atr)和排斥力(fa_rep)的总和作为范德华力(VDW)。为了明确Wnt5a和mTRPV1通道的相互作用位点的空间分布，我们在TRPV1通道上绘制每个氨基酸残基的VDW、氢键和静电能。以筛选出的10个模型为基础，计算VDW、氢键和静电能的平均值。所有的Wnt5a和TRPV1分子图像均采用UCSF Chimera 1.12软件绘制。结果见图47。
(B)TRPV1通道蛋白中与Wnt5a存在结合可能的氨基酸残基的结合能量。
利用residue_energy应用计算Wnt5a与mTRPV1通道间潜在结合位点的总结合能，以深红色表示总结合能大于-0.6R.E.U(Rosetta energy unit)的氨基酸残基。并根据TRPV1与Wnt5a相互作用的潜在位点及对应的TRPV1氨基酸序列，设计拮抗肽，用于阻断TRPV1与Wnt5a之间的相互作用。将拮抗肽AA601-25序列中所有的可能结合位点突变为丙氨酸残基，作为对照肽。
图48中，TRPV1中氨基酸残基的结合能大于-0.6R.E.U(Rosetta energy unit)的呈深色。下方为根据预测的潜在结合位点设计的拮抗肽。对照肽Control(Ctl)peptide是多肽AA601-25的突变形式，将具有结合可能的位点替换为丙氨酸。
其中，AA601-25的序列信息为：EDGKNNSLPVESPPHKCRGSACRPG(SEQ ID NO.3)。
AA453-72的序列信息为：AYYRPVEGLPPYKLNNTVGD(SEQ ID NO.1)。
AA644-56的序列信息为：TCLELFKFTIGMG(SEQ ID NO.6)。
人源化AA601-25的序列信息为：EDGKNDSLPSESTSHRWRGPACRPP(SEQ ID NO.5)。
Control(Ctl)peptide：EDGANASLPAAAAAHACAGSACAPG(SEQ ID NO.7)。
(C,D)拮抗肽对Wnt5a诱导的触诱发痛表型的影响。
WT小鼠，鞘内注射1ng Wnt5a与不同的拮抗肽；在鞘内注射前、注射后0.5h-3d，进行Von frey测试，测定小鼠的机械触诱发痛，评估不同形式、不同剂量的拮抗肽对Wnt5a诱导的触诱发痛行为的影响。注射vehicle作为阴性对照。结果见图49和图50。
由图49和图50可知，拮抗肽AA601-25的使用能明显提高小鼠机械触诱发痛的缩脚阈值，而对照肽没有影响。表明拮抗肽抑制Wnt5a诱导的触诱发痛表型。
(E)拮抗肽AA601-25抑制Wnt5a诱导的iCa2+活动，但不影响Cap诱导的iCa2+活动。
取AdvillinCre:GCaMP6flox/-的DRG进行原代培养，用于钙成像实验。使用ALA-VM8自动给药系统灌流1ng/ml Wnt5a或1μM Cap。第一次灌流Wnt5a或Cap时，将其与拮抗肽AA601-25混合，灌流15s后，使用正常细胞外液冲洗5min；单独灌流Wnt5a或Cap 15s。以单独灌流Wnt5a或Cap诱导的iCa2+活动强度为参照，计算第一次Wnt5a或Cap灌流诱导的iCa2+活动强度的最大幅值，评估拮抗肽对Wnt5a或Cap诱导的DRG神经元iCa2+活动的影响。结果见图51。
图51中，左侧为Wnt5a(1ng/ml)或Cap(1μM)诱导的iCa2+活动的实时变化曲线；右侧为Wnt5a(1ng/ml)或Cap(1μM)诱导的iCa2+活动中△Fmax/F0的定量分析。
由图51可知，拮抗肽AA601-25抑制Wnt5a诱导的iCa2+活动，但不影响Cap诱导的iCa2+活动。
(F)拮抗肽AA601-25能够改善糖尿病小鼠的触诱发痛表型。
WT小鼠，腹腔注射STZ(180mg/kg体重)诱导I型糖尿病模型；在STZ注射前、注射后4周，进行Von frey测试，测定小鼠的机械触诱发痛。鞘内注射梯度剂量的拮抗肽AA601-25，在鞘内注射后0.5h-1d，进行Von frey测试，测定小鼠的机械触诱发痛，评估AA601-25对STZ诱导的触诱发痛行为的影响。鞘内注射vehicle作为阴性对照。结果见图52。
由图52可知，拮抗肽AA601-25能够改善糖尿病小鼠的触诱发痛表型。
此外，本实施例还证实了Trpv1的缺失可以阻断Wnt5a诱导的触诱发痛表型。
(G)敲除Trpv1阻断Wnt5a诱导的触诱发痛表型。
WT和Trpv1-/-小鼠，鞘内注射1ng Wnt5a；在Wnt5a注射前、注射后0.5h-2d，分别进行Von frey测试，测定小鼠的机械触诱发痛，评估Trpv1敲除对Wnt5a诱导的触诱发痛行为的影响。结果见图53。
由图53可知，敲除Trpv1阻断Wnt5a诱导的触诱发痛表型。
(H)敲除Trpv1能够改善STZ诱导的神经病理性痛表型。
WT和Trpv1-/-小鼠，腹腔注射STZ(180mg/kg体重)诱导I型糖尿病模型；在STZ注射前、注射后1-6周，进行Von frey测试，测定小鼠的机械触诱发痛，评估Trpv1敲除对STZ诱导的触诱发痛行为的影响。结果见图54。
由图54可知，敲除Trpv1能够改善STZ诱导的神经病理性痛表型。
实施例6、GPR177-Wnt5a-TRPV1信号轴可作为DNP临床治疗的潜在靶点
(A)在人的DRG中，GPR177表达在NF200+的DRG神经元中，且与WNT5A mRNA共表达。
人DRG组织切片中GPR177、WNT5A mRNA的表达利用原位杂交实验检测，Dapb探针作为阴性对照。人DRG取出后置于4％PFA中固定2～4天，于30％蔗糖溶液中脱水2天以上，至组织块沉淀。充分脱水后的组织块，于PBS中漂洗2～3次，修剪去多余组织，于OCT中速冻包埋，在冷冻切片机中切片。DRG组织切10μm厚度，用于贴片染色。原位杂交实验的操作参照RNAscope原位杂交试剂盒使用说明书进行。RNAscope操作完成后，DRG切片在避光条件下继续进行免疫组织化学染色。组织切片用封闭液于室温封闭1～2h，加一抗chicken anti-NF200(1:1000)置于4℃孵育18～20h。之后，PBS洗片4次，每次10min。加对应的Alexa488荧光染料偶联的二抗(1:500，Jackson ImmunoResearch)，置于室温避光孵育2h。PBS洗片4次，每次10min。用含抗淬灭剂的封片剂封片，室温避光晾干，于荧光显微镜下观察或-20℃保存。结果见图55。
图55中，白色箭头指示GPR177与NF200或WNT5A存在共定位的细胞。NC表示阴性对照探针原位杂交染色结果。
由图55可知，人DRG组织切片中GPR177表达在NF200+的DRG神经元中，且与WNT5AmRNA共表达。
(B)GPR177+神经元和所有DRG神经元的直径分布模式图。
采用NIS Element AR软件进行荧光信号强度的定量分析。在每张图片中选取4～6个无荧光信号的区域，所获取信号值的平均值作为背景信号的荧光强度(backgroundintensity)。当细胞的荧光信号≥2X(background intensity+standard deviation)时，将之视为阳性细胞；当阳性细胞可见清晰细胞核轮廓时，用于细胞面积的定量分析。统计GPR177+神经元和所有DRG神经元的细胞面积，并计算其在不同面积区间的分布比例。结果见图56。
由图56可知，GPR177+神经元主要分布在中等到大直径的人DRG神经元中。
(C)GPR177+神经元中WNT5A+、NF200+神经元的比例。
采用NIS Element AR软件进行荧光信号强度的定量分析。在每张图片中选取4～6个无荧光信号的区域，所获取信号值的平均值作为背景信号的荧光强度(backgroundintensity)。当细胞的荧光信号≥2X(background intensity+standard deviation)时，将之视为阳性细胞；当阳性细胞可见清晰细胞核轮廓时，用于细胞面积的定量分析。统计来自至少4张DRG切片，并计算GPR177+神经元中WNT5A+、NF200+神经元的比例。结果见图57。
由图57可知，GPR177+神经元中WNT5A+、NF200+神经元的比例均较高。
(D)糖尿病患者脑脊液中Wnt5a分泌水平检测。
图58中，No DNP表示无神经病理性痛症状(NRS评分≤2)的糖尿病人。DNP表示患有神经病理性痛(NRS评分≥4)的糖尿病人。检测ACTIN作为阴性对照，丽春红染色作为loading control。
由图58可知，糖尿病患者脑脊液中Wnt5a分泌显著增多。
(E)糖尿病患者脑脊液中Wnt5a分泌水平与NRS评分的相关性分析。
人脑脊液的分析：对参与研究的患者根据数值评定量表(NRS)评分法进行疼痛评分，将患者根据NRS评分分为两组：疼痛组患者疼痛持续3个月以上，NRS评分≥4；无痛组患者NRS评分≤2。采集脑脊液样本约1ml，于4℃1000g离心10min，取上清，并置于-80℃保存。取5μl脑脊液与5μl PBS混匀后，加1/3体积的4X样品处理液，沸水浴处理10min后，室温10000g离心3min，取全部上清用于Western blotting实验，检测Wnt5a在脑脊液中的分泌。丽春红染色作为loading对照，检测ACTIN作为阴性对照。
采用Image J软件对western blotting中条带的信号强度进行定量分析。并对脑脊液中Wnt5a信号强度与糖尿病患者的NRS评分进行相关性分析，计算皮尔逊相关系数(pearson correlation coefficient)。结果见图59。皮尔逊相关系数(pearsoncorrelation coefficient)r＝0.91、P＝0.02。
由图59可知，糖尿病患者脑脊液中Wnt5a分泌水平越高，痛感越强。
(F)Wnt5a激活人的TRPV1通道、诱发内向电流。
HEK293T细胞转染human Trpv1-EGFP质粒后，于37℃CO2培养箱中培养24～36h，随后进行全细胞膜片钳记录实验。在电压钳模式下，将细胞膜电位钳制在-70mV，记录10ng/mlWnt5a激活HE293T细胞产生的内向电流。灌流100nM Cap作为阳性对照。结果见图60。
图60中，上方为Wnt5a诱发内向电流的代表性图片。下方为Wnt5a诱发内向电流幅值的定量统计。
由图60可知，在HEK293T细胞中过表达人的TRPV1通道，Wnt5a激活人的TRPV1通道、诱发内向电流。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江大学
<120> Wnt5a调节剂及其应用
<130> P220081-1CNCNB5
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
Ala Tyr Tyr Arg Pro Val Glu Gly Leu Pro Pro Tyr Lys Leu Asn Asn
1 5 10 15
Thr Val Gly Asp
20
<210> 2
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
Glu Asp Gly Lys Asn Asn Ser Leu Pro Val Glu Ser Pro Pro His Lys
1 5 10 15
Cys Arg Gly Ser Ala Cys Arg Pro Gly Asn Ser Tyr Asn Ser Leu Tyr
20 25 30
Ser Thr Cys Leu Glu Leu Phe Lys Phe Thr Ile Gly Met Gly Asp Leu
35 40 45
Glu Phe Thr Glu Asn Tyr Asp Phe Lys Ala
50 55
<210> 3
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
Glu Asp Gly Lys Asn Asn Ser Leu Pro Val Glu Ser Pro Pro His Lys
1 5 10 15
Cys Arg Gly Ser Ala Cys Arg Pro Gly
20 25
<210> 4
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
Glu Asp Gly Lys Asn Asp Ser Leu Pro Ser Glu Ser Thr Ser His Arg
1 5 10 15
Trp Arg Gly Pro Ala Cys Arg Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Asn Ser Leu
20 25 30
Tyr Ser Thr Cys Leu Glu Leu Phe Lys Phe Thr Ile Gly Met Gly Asp
35 40 45
Leu Glu Phe Thr Glu Asn Tyr Asp Phe Lys Ala
50 55
<210> 5
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
Glu Asp Gly Lys Asn Asp Ser Leu Pro Ser Glu Ser Thr Ser His Arg
1 5 10 15
Trp Arg Gly Pro Ala Cys Arg Pro Pro
20 25
<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
Thr Cys Leu Glu Leu Phe Lys Phe Thr Ile Gly Met Gly
1 5 10
Claims (16)
1.一种Wnt5a调节剂的用途，其特征在于，用于制备药物或药物组合物，所述药物或所述药物组合物用于选自下组的一种或多种用途：
(i)降低Wnt5a的活性；
(ii)减缓或阻断Wnt5a和TRPV1通道的结合；
(iii)降低TRPV1通道的活性；
(iv)抑制TRPV1通道的激活；
(v)制备预防和/或治疗由Wnt5a的活性升高引起的疾病的药物；
(vi)制备预防和/或治疗与TRPV1通道激活相关的疾病的药物；和
(vii)预防和/或治疗与由Wnt5a的活性升高引起的疾病。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述Wnt5a调节剂选自：Wnt5a中和抗体和Wnt5a抑制剂。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述Wnt5a抑制剂为多肽或Box5，其中，所述多肽的序列具有至少一个可与Wnt5a特异性结合的氨基酸残基。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述多肽的序列中至少部分片段与TRPV1通道的氨基酸序列中的部分片段相同。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述TRPV1通道具有与Wnt5a特异性结合的区域；
所述多肽的序列中至少部分片段和所述与Wnt5a特异性结合的区域的部分片段相同；或者，所述多肽的序列中至少部分片段和所述与Wnt5a特异性结合的区域的部分片段同源性大于70％。
6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述多肽序列包括选自N292、E611、S293、Q286、N606、S289、N605、R202、S612、E203、S210、K283、E652、E649、K208、D547、R281、R284、K808、D647、R290、N288和N653中的至少一种氨基酸残基。
7.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述多肽序列包括选自E611、N606、K604、V610、E611、P614、K616和R618中至少一种氨基酸残基；
或者，所述多肽序列包括选自D647、L648、E649、E652和D655中至少一种氨基酸残基。
8.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述多肽具有选自如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6中所示的至少一个氨基酸序列、其片段及其修饰形式或其突变体。
9.一种Wnt5a调节剂，其特征在于，所述Wnt5a调节剂包括至少一种多肽，所述多肽的序列具有至少一个可与Wnt5a特异性结合的氨基酸残基；且
所述多肽的序列中至少部分片段与TRPV1通道的氨基酸序列中的部分片段相同。
10.根据权利要求9所述的Wnt5a调节剂，其特征在于，所述TRPV1通道具有与Wnt5a特异性结合的区域；
所述多肽的序列中至少部分片段和所述与Wnt5a特异性结合的区域的部分片段相同；或者，所述多肽的序列中至少部分片段和所述与Wnt5a特异性结合的区域的部分片段同源性大于70％。
11.根据权利要求9所述的Wnt5a调节剂，其特征在于，所述多肽的序列包括N292、E611、S293、Q286、N606、S289、N605、R202、S612、E203、S210、K283、E652、E649、K208、D547、R281、R284、K808、D647、R290、N288和N653中的至少一种氨基酸残基。
12.根据权利要求9所述的Wnt5a调节剂，其特征在于，所述多肽的序列包括选自E611、N606、K604、V610、E611、P614、K616和R618中至少一种氨基酸残基；
或者，所述多肽的序列包括D647、L648、E649、E652和D655中至少一种氨基酸残基。
13.根据权利要求9所述的Wnt5a调节剂，其特征在于，所述多肽的序列包括选自以下的至少一组氨基酸残基：
E611、N606和N605；
S612和N606；
E652和E649；和，
D647和E649。
14.根据权利要求9至13中任一项所述的Wnt5a调节剂，其特征在于，所述多肽具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6中所示的至少一个氨基酸序列、其片段及其修饰形式或其突变体。
15.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求9至12中任一项所述的Wnt5a调节剂和其在药学上可接受的赋形剂。
16.一种预防和/或治疗神经病理性疼痛及其并发症的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
向受试者施用如权利要求9至14中任一项所述的Wnt5a调节剂、或如权利要求15所述的药物组合物。
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