TWI583699B - Ｖｅｇｆ／ｄｌｌ４結合劑類及彼等之用途 - Google Patents

Ｖｅｇｆ／ｄｌｌ４結合劑類及彼等之用途 Download PDF

Info

Publication number
TWI583699B
TWI583699B TW101134966A TW101134966A TWI583699B TW I583699 B TWI583699 B TW I583699B TW 101134966 A TW101134966 A TW 101134966A TW 101134966 A TW101134966 A TW 101134966A TW I583699 B TWI583699 B TW I583699B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
seq
antibody
vegf
heavy chain
dll4
Prior art date
Application number
TW101134966A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201326204A (zh
Inventor
奧斯汀 葛尼
亞倫 沙圖
克里斯多夫 龐德
Original Assignee
安可美德藥物股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 安可美德藥物股份有限公司 filed Critical 安可美德藥物股份有限公司
Publication of TW201326204A publication Critical patent/TW201326204A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI583699B publication Critical patent/TWI583699B/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Description

VEGF/DLL4結合劑類及彼等之用途 相關申請案的交互參照
本申請案主張於2011年9月23日提出申請之美國臨時申請案第61/538,454號、2012年2月2日提出申請之美國臨時申請案第61/597,409號及2012年8月24日提出申請之美國臨時申請案第61/692,978號之優先權，各申請案以參照方式整體納入本文。
本發明大抵關於與VEGF、DLL4或VEGF及DLL4二者結合之抗體及其他劑，特別是抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體，以及使用該等抗體或其他劑以治療疾病諸如癌之方法。
血管生成在許多疾病之致病機轉中扮演重要角色，包括實質腫瘤及轉移。新血管之生成係提供氧氣及養分以令腫瘤生長及擴散所必需，因此血管生成係癌治療劑之良好標靶。
血管生成涉及作為血管生成活化子之蛋白質家族，包括血管內皮生長因子(VEGF-A)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-E及彼等各自之受體(VEGFR-1、VEGFR-2及VEGFR-3)。VEGF-A亦被稱為VEGF或血管通透因子(VPF)，其以得自單一VEGF基因之mRNA的不同裁剪 之多種同型存在，其中VEGF165係最具有生物重要性之同型。
抗VEGF抗體係經顯示可抑制試管內及活體內之腫瘤細胞的生長。經人化之抗VEGF單株抗體貝伐珠單抗(bevacizumab)(AVASTIN)已被發展並在美國獲准為癌治療劑。
缺口(Notch)傳訊途徑係高度保守之信號傳導系統。其涉及發育時之細胞命運決定包括胚胎模式形成及胚胎後組織維持。此外，缺口傳訊已被識別為維持造血幹細胞之關鍵因子。
缺口途徑被認為與血液及實質腫瘤及癌之致病機轉有關。許多與腫瘤發生有關之細胞功能及微環境線索已顯示其係藉由缺口途徑傳訊調節，包括細胞增生、細胞凋亡、黏附及血管生成(Leong et al.,2006,Blood,107：2223-2233)。此外，缺口受體及/或缺口配體係經顯示可於數種人癌症中扮演潛在性致癌角色，包括急性骨髓性白血病、B細胞慢性淋巴細胞性白血病、霍奇金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、T細胞急性淋巴胚細胞性白血病、腦癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、肺癌、胰癌、前列腺癌及皮膚癌。(Leong et al.,2006,Blood,107：2223-2233).
δ樣4配體(DLL4)係缺口途徑之重要成份，其被識別為癌治療之標靶。DLL4係缺口配體，其特徵為該胞外域內之N端結構域、δ/Serrate/Lag-2(DSL)結構域及串聯性EGF樣重複。報告指出DLL4係由VEGF誘導，且 DLL4可作為血管增生之負回饋調節子。
抗DLL4抗體經顯示可增進血管芽生及分支，導致非生產性血管生成及減少腫瘤生長(Noguera-Troise et al.,2006,Nature,444：1032-1037)。此外，抗DLL4抗體21M18經顯示可於異種移植腫瘤模型中抑制腫瘤生長及減少癌幹細胞之數量(Hoey et al.,2009,Cell Stem Cell,5：168-177；U.S.Patent No.7,750,124)。
雖然在用於癌治療之單株抗體的發展上有長足進步，仍有進一步改善之很大空間。一種具有增強效力及/或減少副作用(例如毒性)之可能性的抗體分子類型係雙特異性抗體。
早期的雙特異性分子大多利用化學交聯二種抗體產製，或者為經雜合之雜交瘤或「四源雜交瘤」。四源雜交瘤格式之一個成功例子係三功能性單抗(triomabs)，其為顯示優先物種特異性重鏈/輕鏈配對之小鼠/大鼠組合。最近在抗體工程化上之進展提供廣泛種類之新穎抗體格式，包括但不限於串聯scFv(bi-scFv)、雙價抗體、串聯雙價抗體(四價抗體)、單鏈雙價抗體及雙重可變結構域抗體。
本發明之目的之一在於提供用於癌治療之經改善之分子，特別是與人VEGF及人DLL4特異性結合之雙特異性抗體。
本發明提供結合劑類，諸如與VEGF、DLL4或VEGF及DLL4兩者結合之抗體類(VEGF/DLL4結合劑類)，以及組成物類諸如包含該等結合劑類之醫藥組成物類。在某些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑類係新穎多肽類，諸如抗體類、抗體片段類及其他與該等抗體類相關之多肽。在某些實施態樣中，該等結合劑類係與人VEGF特異性結合之抗體類。在一些實施態樣中，該等結合劑類係與人DLL4特異性結合之抗體類。在一些實施態樣中，該等結合劑類係與人VEGF及人DLL4特異性結合之雙特異性抗體類。本發明另提供藉由投予該等VEGF/DLL4結合劑類至患有腫瘤之個體以抑制腫瘤生長之方法。本發明另提供藉由投予該等VEGF/DLL4結合劑類至需要該等劑類之個體以治療癌之方法。在一些實施態樣中，治療癌或抑制腫瘤生長之方法包含利用該等VEGF/DLL4結合劑類以標靶癌幹細胞。在某些實施態樣中，該等方法包含減少腫瘤中癌幹細胞之頻率、減少腫瘤中癌幹細胞之數量、減少腫瘤之腫瘤發生性及/或藉由減少腫瘤中癌幹細胞之數量或頻率以減少腫瘤之腫瘤發生性。
在一態樣中，本發明提供與人VEGF特異性結合之VEGF/DLL4結合劑。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑抑制VEGF與至少一種VEGF受體結合。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑抑制VEGF與VEGFR-1及/或VEGFR-2之結合。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑調節血管生成。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3及輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、輕鏈CDR3之抗體，該重鏈CDR1包含NYWMH(SEQ ID NO：17)，該重鏈CDR2包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO：18)，該重鏈CDR3包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO：19)，且該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)，該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。
在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區，該重鏈可變區與SEQ ID NO：11具有至少80%之序列一致性，該輕鏈可變區與SEQ ID NO：12具有至少80%之序列一致性。在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區，該重鏈可變區與SEQ ID NO：11具有至少90%之序列一致性，該輕鏈可變區與SEQ ID NO：12具有至少90%之序列一致性。在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區，該重鏈可變區與SEQ ID NO：11具有至少95%之序列一致性，該輕鏈可變區與SEQ ID NO：12具有至少95%之序列一致性。在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑包含SEQ ID NO：11之重鏈可變區及/或SEQ ID NO：12之輕鏈可變區。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係抗體219R45。
在另一態樣中，本發明提供與人DLL4特異性結合之VEGF/DLL4結合劑。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑抑制DLL4與至少一種缺口受體結合。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑抑制DLL4與缺口1、缺口2、缺口3及/或缺口4之結合。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑抑制缺口傳訊。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑促進非生產性血管生成。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3及輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、輕鏈CDR3之抗體，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)，該重鏈CDR2包含YIANYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO：14)，該重鏈CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)，且該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)，該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。
在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區，該重鏈可變區與SEQ ID NO：10具有至少95%之序列一致性，該輕鏈可變區與SEQ ID NO：12具有至少95%之序列一致性。在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑包含SEQ ID NO：10之重鏈可變區及SEQ ID NO：12之輕鏈可變區。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係抗體21R79。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3及輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、輕鏈CDR3之抗體，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)，該重鏈CDR2包含YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQ ID NO：59)，該重鏈CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)，且該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)，該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。
在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區，該重鏈可變區與SEQ ID NO：58具有至少95%之序列一致性，該輕鏈可變區與SEQ ID NO：12具有至少95%之序列一致性。在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑包含SEQ ID NO：58之重鏈可變區及SEQ ID NO：12之輕鏈可變區。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係抗體21R75。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3及輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、輕鏈CDR3之抗體，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)，該重鏈CDR2包含YISNYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO：65)，該重鏈CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)，且該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)，該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。
在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區，該重鏈可變區與SEQ ID NO：64具有至少95%之序列一致性，該輕鏈可變區與SEQ ID NO：12具有至少95%之序列一致性。在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑包含SEQ ID NO：64之重鏈可變區及SEQ ID NO：12之輕鏈可變區。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係抗體21R83。
在另一態樣中，本發明提供其係雙特異性抗體之VEGF/DLL4結合劑。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體與人VEGF及第二標靶特異性結合。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體與人DLL4及第二標靶特異性結合。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體與人VEGF及人DLL4兩者特異性結合。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體調節血管生成。在某些實施態樣中，該雙特異性抗體抑制缺口傳訊。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體調節血管生成及抑制缺口傳訊。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體減少癌幹細胞之數量或頻率。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含與人VEGF特異性結合之第一抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含重鏈CDRI、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含NYWMH(SEQ ID NO：17)，該重鏈CDR2包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO：18)且該重鏈CDR3包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO：19)。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體另包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)且該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含與人VEGF特異性結合之第一抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含(a)重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3及(b)輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該重鏈CDR1包含NYWMH(SEQ ID NO：17)，該重鏈CDR2包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO：18)，該重鏈CDR3包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO：19)，且該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)，該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含與人DLL4特異性結合之第一抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)，該重鏈CDR2包含YIANYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO：14)、YISSYNGATNYNQKFKG(SEQ ID NO：15)、YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQ ID NO：59)或 YISNYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO：65)且該重鏈CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體另包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)且該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含與人DLL4特異性結合之第一抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含(a)重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3及(b)輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)，該重鏈CDR2包含YIANYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO：14)、YISSYNGATNYNQKFKG(SEQ ID NO：15)、YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQ ID NO：59)或YISNYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO：65)，該重鏈CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)，且該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)，該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含(a)與人VEGF特異性結合之第一抗原結合部位及(b)與人DLL4特異性結合之第二抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含NYWMH(SEQ ID NO：17)，該重鏈CDR2包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO：18)且該重鏈CDR3包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO：19)，其中該第二抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)，該重鏈CDR2包含YIANYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO：14)且該重鏈CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)，且其中該第一及第二抗原結合部位皆包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)且該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含(a)與人VEGF特異性結合之第一抗原結合部位及(b)與人DLL4特異性結合之第二抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含NYWMH(SEQ ID NO：17)，該重鏈CDR2包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO：18)且該重鏈CDR3包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO：19)，其中該第二抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)，該重鏈CDR2包含YISSYNGATNYNQKFKG(SEQ ID NO：15)且該重鏈CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)，且其中該第一及第二抗原結合部位皆包含輕鏈CDR1、輕 鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)且該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含(a)與人VEGF特異性結合之第一抗原結合部位及(b)與人DLL4特異性結合之第二抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含NYWMH(SEQ ID NO：17)，該重鏈CDR2包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO：18)且該重鏈CDR3包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO：19)，其中該第二抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)，該重鏈CDR2包含YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQ ID NO：59)且該重鏈CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)，且其中該第一及第二抗原結合部位皆包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)且該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含(a)與人VEGF特異性結合之第一抗原結合部位及(b)與人DLL4特異性結合之第二抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含 NYWMH(SEQ ID NO：17)，該重鏈CDR2包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO：18)且該重鏈CDR3包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO：19)，其中該第二抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)，該重鏈CDR2包含YISNYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO：65)且該重鏈CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)，且其中該第一及第二抗原結合部位皆包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)且該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係與人VEGF特異性結合之雙特異性抗體，其包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區，該重鏈可變區與SEQ ID NO：11具有至少90%之序列一致性，該輕鏈可變區與SEQ ID NO：12具有至少90%之序列一致性。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係與人VEGF特異性結合之雙特異性抗體，其包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區，該重鏈可變區與SEQ ID NO：11具有至少95%之序列一致性，該輕鏈可變區與SEQ ID NO：12具有至少95%之序列一致性。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係與人DLL4特異性結合之雙特異性抗體，其包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區，該重鏈可變區與SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：64具有至少90%之序列一致性，該輕鏈可變區與SEQ ID NO：12具有至少90%之序列一致性。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係與人DLL4特異性結合之雙特異性抗體，其包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區，該重鏈可變區與SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：64具有至少95%之序列一致性，該輕鏈可變區與SEQ ID NO：12具有至少95%之序列一致性。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係與人VEGF及人DLL4特異性結合之雙特異性抗體，其包含：(a)第一重鏈可變區，其與SEQ ID NO：11具有至少90%之序列一致性，(b)第二重鏈可變區，其與SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：64具有至少90%之序列一致性，及(c)第一及第二輕鏈可變區，其與SEQ ID NO：12具有至少90%之序列一致性。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4雙特異性抗體包含(a)第一重鏈可變區，其與SEQ ID NO：11具有至少95%之序列一致性，(b)第二重鏈可變區，其與SEQ ID NO：9具有至少95%之序列一致性，及(c)第一及第二輕鏈可變區，其與SEQ ID NO：12具有至少95%之序列一致性。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4雙特異性抗體包含(a)第一重鏈可變區，其與SEQ ID NO：11具有至少95%之序列一致性，(b)第二重鏈可變區，其與SEQ ID NO：10具有至少95%之序列一致性，及(c)第一及第二輕鏈可變 區，其與SEQ ID NO：12具有至少95%之序列一致性。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4雙特異性抗體包含(a)第一重鏈可變區，其與SEQ ID NO：11具有至少95%之序列一致性，(b)第二重鏈可變區，其與SEQ ID NO：58具有至少95%之序列一致性，及(c)第一及第二輕鏈可變區，其與SEQ ID NO：12具有至少95%之序列一致性。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4雙特異性抗體包含(a)第一重鏈可變區，其與SEQ ID NO：11具有至少95%之序列一致性，(b)第二重鏈可變區，其與SEQ ID NO：64具有至少95%之序列一致性，及(c)第一及第二輕鏈可變區，其與SEQ ID NO：12具有至少95%之序列一致性。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係選自219R45-MB-21M18、219R45-MB-21R79、219R45-MB-21R75或219R45-MB-21R83之雙特異性抗體。
在前述各種態樣之特定實施態樣以及本說明書中他處所述之其他態樣及/或實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑或抗體係經分離。
在另一態樣中，本發明提供選自下列之多肽：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63及SEQ ID NO：64。在一些實施態樣中，該多肽係經分離。在某些實施態樣中，該多肽係實質上純的。在某些實施態樣中，該多肽係抗體或抗體之部分，諸如抗體片段。
在另一態樣中，本發明提供經分離之多核苷酸分子，該經分離之多核苷酸分子包含編碼VEGF/DLL4結合劑及/或前述各種態樣以及本說明書中之其他態樣及/或實施態樣中之多肽之多核苷酸。在某些實施態樣中，該多核苷酸包含選自下列之序列：SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73及SEQ ID NO：74。本發明另提供包含該等多核苷酸之表現載體，以及包含該等表現載體及/或該等多核苷酸之細胞。在一些實施態樣中，該細胞係原核細胞或真核細胞。
在其他態樣中，本發明提供抑制腫瘤生長之方法，該方法包含使該腫瘤與有效量之VEGF/DLL4結合劑或抗體接觸，該VEGF/DLL4結合劑或抗體包括該些於本說明書中所述之各者。
在另一態樣中，本發明提供抑制個體體內腫瘤生長之 方法，該方法包含對該個體投予治療有效量之VEGF/DLL4結合劑或抗體，該VEGF/DLL4結合劑或抗體包括該些於本說明書中所述之各者。
在另一態樣中，本發明提供調節個體體內血管生成之方法，該方法包含對該個體投予治療有效量之VEGF/DLL4結合劑或抗體，該VEGF/DLL4結合劑或抗體包括該些於本說明書中所述之各者。
在另一態樣中，本發明提供減少個體體內之腫瘤的腫瘤發生之方法，該方法包含對該個體投予治療有效量之VEGF/DLL4結合劑或抗體，該VEGF/DLL4結合劑或抗體包括該些於本說明書中所述之各者。
在另一態樣中，本發明提供藉由減少腫瘤內之癌幹細胞之頻率以減少個體體內之腫瘤的腫瘤發生之方法，該方法包含對該個體投予治療有效量之VEGF/DLL4結合劑或抗體，該VEGF/DLL4結合劑或抗體包括該些於本說明書中所述之各者。
在其他態樣中，本發明提供治療個體之癌之方法，該方法包含對該個體投予治療有效量之VEGF/DLL4結合劑或抗體，該VEGF/DLL4結合劑或抗體包括該些於本說明書中所述之各者。
本發明另提供包含此處所述之VEGF/DLL4結合劑或抗體及醫藥上可接受之載劑之醫藥組成物，及表現及/或產生該VEGF/DLL4結合劑類之細胞系。本發明亦提供於個體(例如人)體內治療癌及/或抑制腫瘤生長之方法， 該方法包含對該個體投予有效量之包含該等VEGF/DLL4結合劑類之組成物。
本發明之態樣或實施態樣係以馬庫西群組或其他選擇性形式之群組描述，本發明不僅包含被標示為整體之整個群組，但亦包含該群組之個別成員及該主要群組中所有可能之亞群，且亦包含不含其中一或多個群組成員之主要群組。本發明亦設想明確排除該申請專利之發明中任何群組成員之一或多者。
本發明之詳細說明
本發明提供新穎之結合劑，包括但不限於像是抗體之多肽，該多肽與VEGF及/或DLL4結合(例如VEGF/DLL4結合劑)。本發明亦提供相關之多肽及多核苷酸、包含該VEGF/DLL4結合劑之組成物，及製備該VEGF/DLL4結合劑之方法。本發明另提供使用該新穎之VEGF/DLL4結合劑類之方法，諸如抑制腫瘤生長之方法、治療癌之方法、減少腫瘤之腫瘤發生性之方法、減少腫瘤中癌幹細胞之頻率之方法，及/或調節血管生成之方法。
與人VEGF特異性結合之單株抗體219R45係經識別。此抗體與人VEGF之結合親和性大約為0.67nM，與小鼠VEGF之結合親和性大約為23nM。數種與人DLL4特異性結合之單株抗體21R79、21R75及21R83係經識別。抗體21R79與人DLL4之結合親和性小於0.1nM。與人 VEGF及人DLL4特異性結合之雙特異性抗體係經產製，包括219R45-MB-21M18、219R45-MB-21R79、219R45-MB-21R75及219R45-MB-21R83(見圖1之CDR序列)。此處於抗體名稱中使用之「MB」係指「單價/雙特異性」。雙特異性抗體219R45-MB-21M18與人VEGF之結合親和性小於1.0nM，與人DLL4之結合親和性大約為16nM。雙特異性抗體219R45-MB-21R79與人VEGF之結合親和性小於1.0nM，與人DLL4之結合親和性小於1.0nM。雙特異性抗體219R45-MB-21R75與人DLL4之結合親和性大約為5nM，然而雙特異性抗體219R45-MB-21R83與人DLL4之結合親和性大約為1nM。雙特異性抗體219R45-MB-21M18及219R45-MB-21R79與小鼠VEGF結合(實施例1，表3)。抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體與人VEGF及人DLL4同時結合(實施例2，圖2)。抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體抑制HUVEC細胞之VEGF誘導性增生(實施例3，圖3)。抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體抑制DLL4誘導性缺口傳訊(實施例4，圖4)。抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體抑制腫瘤生長(實施例5、9、11及圖5、9、11)。抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體抑制腫瘤發生性(實施例6及10，圖6及10)。抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體在雙特異性ELISA中與VEGF及DLL4兩者結合(實施例7，圖7)。抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體係經分離及純化成包含至少90%異二聚體抗體之製品(實施例8，表7)。
I.定義
為了促進對本發明之了解，以下定義一些用語及用詞。
此處所使用之用語「抗體」係指免疫球蛋白分子，該免疫球蛋白分子藉由彼之可變區內之至少一個抗原辨認區辨識標靶且與之特異性結合，像是蛋白質、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂質或前述組合之標靶。此處所使用之該用語包含完整多株抗體、完整單株抗體、單鏈抗體、抗體片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段)、單鏈Fv(scFv)抗體、多特異性抗體諸如雙特異性抗體、單特異性抗體、單價抗體、嵌合抗體、人化抗體、人抗體、包含抗體之抗原結合部位之融合蛋白質，及任何其他包含抗原辨認區(即抗原結合部位)之經修飾之免疫球蛋白分子只要該抗體展現所欲之生物活性。抗體可為下列五種主要免疫球蛋白類型中之任一者：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，或彼等之亞型(同型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)，根據彼等之分別被稱為α、δ、ε、γ及μ之重鏈恆定結構域之形式。不同類型之免疫球蛋白具有不同且廣為周知之次單位結構及三維構型。抗體可為未經修飾(naked)或與其他分子共軛，該等其他分子包括但不限於毒素及放射性同位素。
用語「抗體片段」係指完整抗體之部分且係指完整抗體之抗原性決定可變區。抗原片段之實例包括但不限於 Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段、線性抗體、單鏈抗體及自抗體片段形成之多特異性抗體。此處所使用之「抗體片段」包含抗原結合部位或表位結合部位。
抗體之「可變區」用語係指抗體輕鏈之可變區或抗體重鏈之可變區(不論單獨或組合指稱)。重鏈及輕鏈之可變區各由四個架構區(FR)及連接該四個架構區之三個互補決定區(CDR)組成，該三個CDR又名「超變異區」。各鏈中之CDR被架構區拉近，並與來自其他鏈中之CDR一起形成該抗體之抗原結合部位。至少有兩種技術用於決定CDR：(1)基於跨種序列變異性之方法(即Kabat et al.,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Edition,National Institutes of Health,Bethesda,MD)；及(2)基於抗原-抗體複合物之結晶學研究之方法(Al-Lazikani et al.,1997,J.Mol.Biol.,273：927-948)。此外，有時該領域使用這兩種技術之組合以測定CDR。
此處所使用之用語「單株抗體」係指同源性抗體群，其高度特異性辨認及結合單一抗原性決定簇或表位。此與多株抗體相反，多株抗體通常包括多種以不同抗原決定簇為目標之不同抗體之混合。用語「單株抗體」包含完整及全長單株抗體，也包含抗體片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、單鏈(scFv)抗體、包含抗體部分之融合蛋白質、及任何其他包含抗原辨認區(抗原結合部位)之經修飾之免疫球蛋白分子。另外，「單株抗體」係指由多種技術 製備之該等抗體，該等技術包括但不限於雜交瘤產製、噬菌體選擇、重組表現及基因轉殖動物。
此處所使用之用語「人化抗體」係指非人(例如小鼠)抗體之形式，該形式係包含最少非人序列之特定免疫球蛋白鏈、嵌合性免疫球蛋白或彼等之片段。通常，人化抗體係其中CDR之殘基經非人物種(例如小鼠、大鼠、兔或倉鼠)之CDR殘基取代之人免疫球蛋白，其具有所欲之特異性、親和性及/或結合能力(Jones et al.,1986,Nature,321：522-525；Riechmann et al.,1988,Nature,332：323-327；Verhoeyen et al.,1988,Science,239：1534-1536)。在一些情況中，人免疫球蛋白之Fv架構區殘基係由具有所欲特異性、親和性及/或結合能力之非人物種之抗體的對應殘基取代。該人化抗體可進一步藉由取代Fv架構區及/或該經取代之非人殘基內之額外殘基加以修飾，以精進優化抗體特異性、親和性及/或結合能力。通常，該人化抗體將包含實質上所有之至少一個且通常兩或三個可變結構域，該可變結構域包含所有或實質上所有之對應該非人免疫球蛋白之CDR，然而所有或實質上所有之架構區係具有人免疫球蛋白共同序列之架構區。該人化抗體亦可包含至少部分之免疫球蛋白恆定區或恆定結構域(Fc)，通常為人免疫球蛋白之該部分。用於產製人化抗體之方法的實例係描述於例如美國專利第5,225,539號。
此處所使用之用語「人抗體」係指由人產製之抗體或具有對應由人產製之抗體的胺基酸序列之抗體。人抗體可利 用任何該領域已知之技術製備。此人抗體之定義特別排除包含非人CDR之人化抗體。
此處所使用之用語「嵌合抗體」係指其中該免疫球蛋白分子之胺基酸序列係源自二或多個物種之抗體。通常，輕鏈及重鏈之可變區皆對應源自一哺乳動物物種(例如小鼠、大鼠、兔等)之具有所欲特異性、親和性及/或結合能力之抗體的可變區，然而該恆定區對應源自另一物種(通常是人)之抗體中的序列。
此處所使用之用詞「親和性成熟抗體」係指在彼之一或多個CDR中具有一或多個改變之抗體，該等改變導致該抗體對抗原之親和性增加，相較於不具有該等改變之母體抗體。該定義亦包括與CDR殘基改變一起發生之非CDR殘基之改變。較佳之親和性成熟抗體將具有奈莫耳或甚至皮莫耳程度之對標靶抗原之親和性。親和性成熟抗體係藉由該領域已知之方法產製。舉例來說，Marks et al.,1992,Bio/Technology 10：779-783描述藉由VH及VL結構域替換產生之親和性成熟。CDR及/或架構區殘基之隨機突變形成係由Barbas et al.,1994,PNAS,91：3809-3813、Schier et al.,1995,Gene,169：147-155、Yelton et al.,1995,J.Immunol.155：1994-2004、Jackson et al.,1995,J.Immunol.,154：3310-9及Hawkins et al.,1992,J.Mol.Biol.,226：889-896描述。定點突變形成亦可被用來獲得親和性成熟抗體。
用語「表位」及「抗原決定簇」在此處可交換使用，係指 可被特定抗體辨識且特異性結合之抗原部分。當抗原係多肽時，表位可自連續胺基酸或藉由蛋白質之三級摺疊並列之非連續胺基酸形成。自連續胺基酸形成之表位(又稱為線性表位)通常在蛋白質變性時仍被保留，然而藉由三級摺疊形成之表位(又稱為構形表位)通常在蛋白質變性時喪失。表位通常包括至少3個及更常地至少5或8至10個呈獨特空間構形之胺基酸。
用語「異多聚分子」或「異多聚體」或「異多聚複合物」或「異多聚多肽」在此處可被交換使用，係指包含至少第一多肽及第二多肽之分子，其中該第二多肽與第一多肽之胺基酸序列有至少一個胺基酸殘基不同。該異多聚分子可包含由第一及第二多肽形成之「異二聚體」，或可形成其中存在額外多肽之更高階之三級結構。
此處所使用之用語「拮抗劑」及「拮抗性」係指任何部分或完全阻斷、抑制、減少或中和標靶之生物活性及/或傳訊途徑(例如缺口途徑)之分子。此處所使用之用語「拮抗劑」包括任何部分或完全阻斷、抑制、減少或中和蛋白質之活性的分子。適當之拮抗劑分子特別包括但不限於拮抗抗體或抗體片段。
此處所使用之用語「調節」係指生物活性之改變或變化。調節包括但不限於刺激或抑制活性。調節可為增加或減少活性(例如減少血管生成或增加血管生成)、改變結合特性，或任何其他與蛋白質、途徑或其他生物性關注點之活性有關之生物性、功能性或免疫特性之改變。
用語「選擇性結合」或「特異性結合」係指結合劑或抗體以更頻繁、更快速、更長時間、更高親和性或上述條件之某些組合與表位、蛋白質或標靶分子反應或結合，相較於可供選擇之物質包括非相關蛋白質。在某些實施態樣中，「特異性結合」係指例如抗體以大約0.1mM或更低，但通常低於大約1μM之KD與蛋白質結合。在某些實施態樣中，「特異性結合」係指抗體有時以至少約0.1μM或更低，有時以至少約0.01μM或更低，且有時以至少約1nM或更低之KD與標靶結合。由於不同物種之間的同源性蛋白質具有序列一致性，因此特異性結合可包括辨識超過一個物種之蛋白質之抗體(例如人VEGF及小鼠VEGF)。同樣地，由於不同蛋白質之多肽序列的某些區域內具有同源性，因此特異性結合可包括辨識超過一種蛋白質(例如人VEGF-A及VEGF-B)之抗體(或其他多肽或結合劑)。應了解的是，在某些實施態樣中，與第一標靶特異性結合之抗體或結合基團可能或可能不與第二標靶特異性結合。因此，「特異性結合」不一定表示(雖然可包括)排他性結合(即與單一標靶結合)。因此，在某些實施態樣中，抗體與一種以上之標靶特異性結合。在某些實施態樣中，多重標靶可能由抗體上之相同的抗原結合部位結合。舉例來說，在某些情況下，抗體可能包含二個完全相同之抗原結合部位，該二個抗原結合部位各自與二或多個蛋白質上之相同表位特異性結合。在某些可供選擇之實施態樣中，抗體可能為多特異性且包含至少二個具有不同特異性之抗原 結合部位。以非限制性實例而言，雙特異性抗體可包含一個辨識第一蛋白質(例如人VEGF)上之表位的抗原結合部位，另包含第二個辨識第二蛋白質(例如人DLL4)上之不同表位的不同抗原結合部位。一般來說(但不必然)，所謂的結合係指特異性結合。
用語「多肽」和「肽」以及「蛋白質」在此處可交換使用，這些用語係指任何長度之胺基酸的聚合物。該聚合物可為線性或分支，其可能包含經修飾之胺基酸，且其可能被非胺基酸中斷。該等用語亦包含經天然或人為干預修飾之胺基酸聚合物；例如雙硫鍵形成、糖基化、脂化、乙醯化、磷酸化或任何其他操縱或修飾，諸如與標記成份共軛。該定義亦包括例如包含一或多個胺基酸類似物(包括例如非天然胺基酸)以及該領域習知之其他修飾之多肽。應了解的是，由於本發明之多肽可能以抗體為主，因此在某些實施態樣中，該多肽可能為單鏈或相連之多個鏈。
用語「多核苷酸」及「核酸」在此處可交換使用，係指任何長度之核苷酸之聚合物，包括DNA及RNA。該核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基及/或彼等之類似物，或任何可藉由DNA或RNA聚合酶被納入聚合物中之底物。
「高度嚴謹度之條件」可識別為下列條件：(1)採用低離子張力及高溫清洗，例如於50℃之15mM氯化鈉/1.5mM檸檬酸鈉/0.1%十二基硫酸鈉；(2)在雜交期間採用變性劑，諸如甲醯胺，例如42℃之具有0.1%牛血清 白蛋白/0.1% Ficoll/0.1%聚乙烯基吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩衝液之於pH 6.5之5x SSC(0.75M NaCl，75mM檸檬酸鈉)中之50%(體積/體積)甲醯胺；或(3)於雜交期間採用42℃於5x SSC中之50%甲醯胺、50mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5x丹哈德(Denhardt’s)溶液、經超音波化之鮭魚精子DNA(50μg/ml)、0.1% SDS及10%硫酸葡聚糖，於42℃以0.2x SSC及50%甲醯胺清洗，之後於55℃以含有EDTA之0.1x SSC進行高嚴謹度清洗。
在提及二或多個核酸或多肽時，用語「一致」或百分比「一致性」係指當二或多個序列或子序列經比較及排比(需要時導入間格)以達最高對應性且不把任何保守性胺基酸取代當作序列一致性之部分時，該二或多個序列或子序列係相同或具有相同之特定百分比之核苷酸或胺基酸殘基。該百分比一致性可利用序列比較軟體或演算法測量，或藉由目視檢查測量。多種可被用於取得胺基酸或核苷酸序列排比之演算法及軟體係該領域所廣為周知。該等演算法及軟體包括但不限於BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin套裝軟體及彼等之變化性產品。在一些實施態樣中，本發明之二個核酸或多肽係實質上一致表示當彼等經比較或排比以達最高對應性時，利用序列比較演算法或目視檢查得知彼等具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%且在一些實施態樣中至少95%、96%、97%、98%、99%之核苷酸或胺基酸殘基一致性。在一些實施態樣中，一致性存在於至少約10、至少約 20、至少約40至60殘基、至少約60至80殘基長度或介於之間的任何整數長度之序列區域。在一些實施態樣中，一致性存在於60至80殘基以上之更長區域，諸如至少約80至100殘基，且在一些實施態樣中該等序列係與經比較之全長序列諸如核苷酸序列之編碼區域實質上一致。
「保守性胺基酸取代」係指其中一個胺基酸殘基被另一個具有類似側鏈之胺基酸殘基取代之取代。具有類似側鏈之胺基酸殘基群係於該領域中定義，包括鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-分支側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳香族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。舉例來說，以苯丙胺酸取代酪胺酸係保守性取代。較佳地，本發明之多肽及抗體之序列中的保守性取代不廢除含有該胺基酸序列之多肽或抗體與該多肽或抗體原本所結合之抗原之結合。識別不消除抗原結合性之核苷酸及胺基酸保守性取代之方法係該領域所廣為周知。
此處所使用之用語「載體」係指建構物，該建構物能在宿主細胞中遞送及通常表現一或多種感興趣之基因或序列。載體之實例包括但不限於病毒性載體、裸DNA或RNA表現載體、質體載體、黏質體載體、噬菌體載體、與 陽離子縮合劑有關之DNA或RNA表現載體，及包封於脂質體中之DNA或RNA表現載體。
經「分離」之多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組成物係呈現未見於天然中之形式之多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組成物。經分離之多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組成物包括該些經純化至一定程度而使彼等不再以見於天然中之形式存在者。在一些實施態樣中，經純化之多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組成物係實質上純的。
此處所使用之用語「實質上純的」係指其為至少50%純的(即不含汙染物)、至少90%純的、至少95%純的、至少98%純的或至少99%純的之物質。
此處所使用之用語「癌」及「癌性」係指稱或描述哺乳動物之生理狀況，其中細胞群具有未受調節之細胞生長之特徵。癌之實例包括但不限於癌(carcinoma)、胚細胞瘤、肉瘤及血液性癌諸如淋巴瘤及白血病。
此處所使用之用語「腫瘤」及「瘤(neoplasm)」係指任何由過度細胞生長或增生所導致之組織團塊，不論是良性(非癌性)或包括癌前性病灶之惡性(癌性)。
此處所使用之用語「轉移」係指癌藉以自原發部位擴散或轉移至身體其他區域且在新位置發展類似癌性病灶之過程。「轉移」或「轉移性」細胞係指與鄰近細胞喪失黏著接觸且經由血流或淋巴自疾病之原發部位移動以入侵鄰近身體結構之細胞。
用語「癌幹細胞」、「CSC」、「腫瘤幹細胞」及「腫瘤起始細胞」在此處可交換使用，係指源自癌或腫瘤且具有下列特性之細胞：(1)具有廣泛增生能力，(2)能進行不對稱細胞分裂以產生一或多種類型之經分化之細胞後代，其中該經分化之細胞具有減少之增生或發育能力，及(3)能進行對稱細胞分裂以自我更新或自我維持。這些特性授予癌幹細胞在連續移植至免疫不全之宿主(例如小鼠)時能形成或建立腫瘤或癌之能力，相對於大部分無法形成腫瘤之腫瘤細胞。癌幹細胞以混亂之方式進行自我更新及分化以形成具有異常且可在將來突變發生時改變之細胞類型之腫瘤。
用語「癌細胞」及「腫瘤細胞」係指源自癌或腫瘤或癌前病灶之細胞的整體族群，包括非腫瘤發生性細胞(其包含大部分之癌細胞族群)及腫瘤發生性幹細胞(癌幹細胞)。此處所使用之用語「癌細胞」或「腫瘤細胞」當僅用於指稱該些缺乏更新及分化能力之細胞時將由用語「非腫瘤發生性」修飾，以區別該些腫瘤細胞與癌幹細胞。
此處所使用之用語「腫瘤發生性」係指癌幹細胞之功能特性，包括自我更新(導致額外之腫瘤發生性癌幹細胞)及增生以產生所有其他腫瘤細胞(導致經分化及因此非腫瘤發生性腫瘤細胞)之特性。
此處所使用之用語「腫瘤發生性」係指源自腫瘤之隨機細胞樣本在連續移植至免疫不全宿主(例如小鼠)時形成明顯腫瘤之能力。此定義亦包括當連續移植至免疫不全宿 主(例如小鼠)時形成明顯腫瘤之經富集及/或經分離之癌幹細胞族群。
用語「個體」係指任何動物(例如哺乳動物)，包括但不限於人、非人靈長動物、犬、貓、囓齒動物及該類似動物，該動物將成為特定治療之接受者。通常，關於人個體之用語「個體」及「病患」在此處可交換使用。
用語「醫藥上可接受」係指經美國聯邦政府之管理機關或州政府核准(或可核准)或經明列於美國藥典或其他普遍公認之藥典中以用於動物(包括人)之產品或化合物。
用語「醫藥上可接受之賦形劑、載劑或佐劑」或「可接受之醫藥載劑」係指可與本發明之至少一種結合劑(例如抗體)一起投予至個體之賦形劑、載劑或佐劑，且該賦形劑、載劑或佐劑不破壞該結合劑之活性。該賦形劑、載劑或佐劑當與足以達到治療效應之劑量之結合劑一起投予時應不具毒性。
用語「有效量」或「治療有效量」或「治療效應」係指有效「治療」個體或哺乳動物之疾病或疾患之結合劑、抗體、多肽、多核苷酸、小型有機分子或其他藥物之量。以癌為例，藥物(例如抗體)之治療有效量具有治療效應且因此可減少癌細胞之數量；降低腫瘤發生性、腫瘤發生頻率或腫瘤發生能力；減少癌幹細胞之數量或頻率；減少腫瘤大小；減少癌細胞群；抑制及/或停止癌細胞浸潤至週邊器官包括例如癌擴散至軟組織及骨；抑制及/或停止腫瘤或癌細胞轉移；抑制及/或停止腫瘤或癌細胞生長；緩解一 或多種與癌相關之症狀之嚴重程度；減少發病率及死亡率；促進生活品質；或該等效應之組合。以該劑舉例來說抗體預防現存癌細胞生長及/或殺死現存癌細胞之方面而言，其可被稱為細胞靜止性及/或細胞毒性。
用語「治療」或「緩和」係指1)治療性措施，該措施治癒、減緩、減輕經診斷之病理狀況或疾患之症狀及/或停止該經診斷之病理狀況或疾患之進展及2)預防性或防範性措施，該措施預防或減緩標靶病理狀況或疾患之發展。因此該些需要治療者包括該些已罹患該疾患者、該些易於罹患該疾患者，以及該些欲預防該疾患者。在一些實施態樣中，個體係經本發明之方法成功「治療」，若該病患顯示下列一或多項：癌細胞之數量減少或完全消失；腫瘤大小減少；抑制或缺乏癌細胞浸潤至週邊器官包括癌細胞擴散至軟組織及骨；抑制或缺乏腫瘤或癌細胞轉移；抑制或缺乏癌生長；緩解一或多種與該特定癌相關之症狀；減少發病率及死亡率；改善生活品質；減少腫瘤發生性；減少癌幹細胞之數量或頻率；或一些效應之組合。
如本揭示內容及申請專利範圍中所使用者，單數形式之「一」(a,an)及「該」(the)包含複數形式除非上下文另外清楚地說明。
應了解的是，只要此處之實施態樣係以用語「包含」描述，其亦提供其他以「由...組成」及/或「實質上由...組成」之用語所描述之類似實施態樣。也應了解的是，只要此處之實施態樣係以用語「實質上由...組成」描述，其亦提供其 他以「由...組成」之用語所描述之類似實施態樣。
當使用於此處諸如「A及/或B」之片語中，用語「及/或」係意圖包括A及B兩者、A或B、A(單獨)及B(單獨)。同樣地，使用於片語諸如「A、B及/或C」中之用語「及/或」係意圖包含下列實施態樣中之各者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A(單獨)；B(單獨)；及C(單獨)。
II.抗體
本發明提供與人VEGF蛋白質及/或人DLL4蛋白質特異性結合之劑類。該等劑類在此處被稱為「VEGF/DLL4結合劑」。該用語「VEGF/DLL4結合劑」包含僅與VEGF結合之劑、僅與DLL4結合之劑，及與VEGF及DLL4兩者結合之雙特異性劑。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係抗體。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係多肽。在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑與人VEGF特異性結合。在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑與人DLL4特異性結合。在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體。在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係與人VEGF及人DLL4特異性結合之雙特異性抗體。人VEGF(VEGF-A)及人DLL4之全長胺基酸(aa)序列係該領域已知，在此處以SEQ ID NO：27(VEGF)及SEQ ID NO：23(DLL4)表示。
在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑或抗體以 大約1μM或更低、大約100nM或更低、大約40nM或更低、大約20nM或更低、大約10nM或更低、大約1nM或更低、或大約0.1nM或更低之解離常數(KD)與VEGF及/或DLL4結合。在一些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑或抗體以大約20nM或更低之KD與VEGF及/或DLL4結合。在一些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑或抗體以大約10nM或更低之KD與VEGF及/或DLL4結合。在一些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑或抗體以大約1nM或更低之KD與VEGF及/或DLL4結合。在一些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑或抗體以大約0.1nM或更低之KD與VEGF及/或DLL4結合。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑以大約100nM或更低之KD與人VEGF及小鼠VEGF兩者結合。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑以大約50nM或更低之KD與人VEGF及小鼠VEGF兩者結合。在一些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑以大約100nM或更低之KD與人DLL4及小鼠DLL4兩者結合。在一些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑以大約50nM或更低之KD與人DLL4及小鼠DLL4兩者結合。在一些實施態樣中，該結合劑(例如抗體)與VEGF之解離常數係利用VEGF融合蛋白測得之解離常數，該VEGF融合蛋白包含至少部分之固定於Biacore晶片上之VEGF。在一些實施態樣中，該結合劑(例如抗體)與DLL4之解離常數係利用DLL4融合蛋白測得之解離常數，該DLL4融合蛋白包含至少部分之固定於Biacore 晶片上之DLL4。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含與VEGF特異性結合之第一抗原結合部位及與DLL4特異性結合之第二抗原結合部位。在一些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑或抗體以大約100nM或更低之KD與VEGF及DLL4二者結合。在一些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑或抗體以大約50nM或更低之KD與VEGF及DLL4二者結合。在一些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑或抗體以大約20nM或更低之KD與VEGF及DLL4二者結合。在一些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑或抗體以大約10nM或更低之KD與VEGF及DLL4二者結合。在一些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑或抗體以大約1nM或更低之KD與VEGF及DLL4二者結合。在一些實施態樣中，該抗原結合部位之一的親和性可能低於另一抗原結合部位之親和性。舉例來說，一抗原結合部位之KD可能為大約1nM，第二抗原結合部位之KD可能為大約10nM。在一些實施態樣中，該二個抗原結合部位之間的親和性差異可能為大約2倍或2倍以上、大約3倍或3倍以上、大約5倍或5倍以上、大約8倍或8倍以上、大約10倍或10倍以上、大約15倍或15倍以上、大約20倍或20倍以上、大約30倍或30倍以上、大約50倍或50倍以上、或大約100倍或100倍以上。調整二個抗原結合部位之親和性可能影響該雙特異性抗體之生物活性。舉例來說，降低該抗原結合 部位對DLL4或VEGF之親和性可能具有所欲效應，例如降低該結合劑之毒性或增加治療指數。
在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑(例如抗體)以大約1μM或更低、大約100nM或更低、大約40nM或更低、大約20nM或更低、大約10nM或更低、大約1nM或更低、或大約0.1nM或更低之半數最高有效濃度(EC50)與VEGF及/或DLL4結合。在某些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑(例如抗體)以大約1μM或更低、大約100nM或更低、大約40nM或更低、大約20nM或更低、大約10nM或更低、大約1nM或更低、或大約0.1nM或更低之半數最高有效濃度(EC50)與VEGF及/或DLL4結合。
在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係抗體。在一些實施態樣中，該抗體係重組抗體。在一些實施態樣中，該抗體係單株抗體。在一些實施態樣中，該抗體係嵌合抗體。在一些實施態樣中，該抗體係人化抗體。在一些實施態樣中，該抗體係人抗體。在某些實施態樣中，該抗體係IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗體。在某些實施態樣中，該抗體係IgG1抗體。在某些實施態樣中，該抗體係IgG2抗體。在某些實施態樣中，該抗體係包含抗原結合部位之抗體片段。在一些實施態樣中，該抗體係雙特異性抗體。在一些實施態樣中，該抗體係單價、單特異性、雙價或多特異性。在一些實施態樣中，該抗體係與細胞毒性基團共軛。在一些實施態樣中，該抗體係經分離。在一些 實施態樣中，該抗體係實質上純的。
本發明之VEGF/DLL4結合劑(例如抗體)之特異性結合可使用該領域已知之任何方法檢測。可使用之免疫檢測包括但不限於競爭性及非競爭性檢測系統，該等系統利用諸如Biacore分析、FACS分析、免疫螢光、免疫細胞化學、西方墨點分析、放射性免疫測定、ELISA、「三明治式」免疫測定、免疫沉澱分析、沉澱反應、膠體擴散沉澱反應、免疫擴散分析、凝集測定、補體固定測定、免疫放射分析、螢光免疫分析、均相時間分辨螢光分析(HTRF)及蛋白質A免疫分析之技術。該等檢測係例行性檢測且為該領域中廣為周知(見例如Ausubel et al.,Editors,1994-present,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,New York,NY)。
舉例來說，抗體與人VEGF及/或人DLL4之特異性結合可利用ELISA測定。ELISA測定包含準備抗原，以抗原包覆96孔微量板之孔槽，添加與可檢測之化合物諸如酶受質(例如辣根過氧化酶或鹼性磷酸酶)共軛之抗體或其他結合劑至孔槽，培養一段時間後，檢測與該抗原結合之結合劑之存在。在一些實施態樣中，結合劑或抗體不與可檢測之化合物共軛，而是將辨識該結合劑或抗體(例如抗Fc抗體)且與可檢測之化合物共軛之第二抗體加入孔槽中。在一些實施態樣中，不以抗原包覆孔槽，反而是以結合劑或抗體包覆孔槽，並於添加抗原至該經包覆之孔槽後加入與可檢測之化合物共軛之第二抗體。該領域之技藝人 士將了解可經修改以增加經檢測之信號之參數以及該領域所知之ELISA之其他變數。
在另一例中，抗體與人VEGF及/或人DLL4之特異性結合可利用FACS測定。FACS篩選測定可包含產製cDNA建構物以表現抗原為融合蛋白質，將該建構物轉染至細胞中，使該抗原表現在細胞表面，使該結合劑或抗體與該經轉染之細胞混合，並培養一段時間。被結合劑或抗體結合之細胞可利用與可檢測之化合物共軛之二級抗體(例如與PE共軛之抗Fc抗體)及流式細胞分析識別。該領域之技藝人士將了解可經修改以優化經檢測之信號之參數以及其他可增進篩選(例如篩選阻斷抗體)之FACS變數。
抗體或其他結合劑與抗原(例如VEGF或DLL4)之結合親和性及抗體-抗原交互反應之解離速率可藉由競爭性結合測定決定。競爭性結合測定之一實例係放射性免疫測定，其包含在漸增量之未經標記之抗原存在下，培養經標記之抗原(例如3H或125I)或彼之片段或變異體與感興趣之抗體，之後檢測與該經標記之抗原結合之抗體。該抗體與抗原之親和性及結合解離速率可由斯卡查德(Scatchard)圖分析之資料測定。在一些實施態樣中，Biacore動力學分析係用於測定與抗原(例如VEGF或DLL4)結合之抗體或劑之結合及解離速率。Biacore動力學分析包含分析抗體與晶片表面上經固定之抗原(例如VEGF或DLL4)之結合及解離。
在某些實施態樣中，本發明提供與人VEGF特異性結 合之VEGF結合劑(例如抗體)，其中該VEGF結合劑(例如抗體)包含抗體219R45之1、2、3、4、5及/或6個CDR(見表1)。在一些實施態樣中，該VEGF結合劑包含219R45之1個或更多之CDR、219R45之2個或更多之CDR、219R45之3個或更多之CDR、219R45之4個或更多之CDR、219R45之5個或更多之CDR或219R45之所有6個CDR。在一些實施態樣中，該VEGF結合劑與人VEGF及小鼠VEGF結合。
在某些實施態樣中，本發明提供與人VEGF特異性結合之VEGF結合劑(例如抗體)，其中該VEGF結合劑包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含NYWMH(SEQ ID NO：17)，該重鏈CDR2包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO：18)且該重鏈CDR3包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO：19)。在一些實施態樣中，該VEGF結合劑另包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及 輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)且該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。在某些實施態樣中，該VEGF結合劑包含：(a)包含NYWMH(SEQ ID NO：17)之重鏈CDR1，包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO：18)之重鏈CDR2及包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO：19)之重鏈CDR3，及(b)包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)之輕鏈CDR1，包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)之輕鏈CDR2及包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)之輕鏈CDR3。
在某些實施態樣中，本發明提供與人VEGF特異性結合之VEGF結合劑(例如抗體)，其中該VEGF結合劑包含：(a)包含NYWMH(SEQ ID NO：17)之重鏈CDR1，或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體；(b)包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO：18)之重鏈CDR2，或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體；(c)包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO：19)之重鏈CDR3，或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體；(d)包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)之輕鏈CDR1，或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體；(e)包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)之輕鏈CDR2，或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體；及(f)包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)之輕鏈CDR3，或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體。在某些實施態樣中，該胺基酸取代係保守性取代。
在某些實施態樣中，本發明提供與VEGF特異性結合之VEGF結合劑(例如抗體)，其中該VEGF結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區與SEQ ID NO：11具有至少約80%之序列一致性，該輕鏈可變區與SEQ ID NO：12具有至少80%之序列一致性。在某些實施態樣中，該VEGF結合劑包含與SEQ ID NO：11具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性之重鏈可變區。在某些實施態樣中，該VEGF結合劑包含與SEQ ID NO：12具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該VEGF結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區與SEQ ID NO：11具有至少約95%之序列一致性，該輕鏈可變區與SEQ ID NO：12具有至少約95%之序列一致性。在某些實施態樣中，該VEGF結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：11，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：12。在某些實施態樣中，該VEGF結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區實質上由SEQ ID NO：11組成，該輕鏈可變區實質上由SEQ ID NO：12組成。在一些實施態樣中，該VEGF結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：49且該輕鏈含有SEQ ID NO：8。在一些實施態樣中，該VEGF結合抗體或其他劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：7且該輕鏈含有SEQ ID NO：8。
在一些實施態樣中，該VEGF結合劑以大約10nM或更低之KD與VEGF結合。在一些實施態樣中，該VEGF結合劑以大約1nM或更低之KD與VEGF結合。在一些實施態樣中，該VEGF結合劑以大約0.1nM或更低之KD與VEGF結合。在一些實施態樣中，該VEGF結合劑以大約0.01nM或更低之KD與VEGF結合。在一些實施態樣中，該VEGF結合劑之至少一個CDR中之至少一個胺基酸殘基係經不同之胺基酸取代，以使該VEGF結合劑與VEGF之親和性改變。在一些實施態樣中，該VEGF結合劑之親和性係增加。在一些實施態樣中，該VEGF結合劑之親和性係減少。在一些實施態樣中，該VEGF結合劑與人VEGF結合。在一些實施態樣中，該VEGF結合劑與人VEGF及小鼠VEGF結合。
在某些實施態樣中，該VEGF結合劑包含219R45抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該VEGF結合劑包含219R45抗體(有或無前導序列)之重鏈及輕鏈。在某些實施態樣中，VEGF結合劑係219R45抗體。
在某些實施態樣中，VEGF結合劑包含抗體219R45、實質上由抗體219R45組成或由抗體219R45組成。
在某些實施態樣中，VEGF結合劑(例如抗體)與 VEGF上由本發明之抗體所結合之相同表位或實質上相同之表位結合。在另一實施態樣中，VEGF結合劑係與VEGF上之表位結合之抗體，該表位與由本發明之抗體所結合之VEGF上之表位重疊。在某些實施態樣中，VEGF結合劑(例如抗體)與VEGF上由抗體219R45所結合之相同表位或實質上相同之表位結合。在另一實施態樣中，該VEGF結合劑係與VEGF上之表位結合之抗體，該表位與由抗體219R45所結合之VEGF上之表位重疊。
在一些實施態樣中，該VEGF結合劑抑制VEGF與至少一種VEGF受體結合。在某些實施態樣中，該VEGF結合劑抑制人VEGF與VEGFR-1或VEGFR-2之結合。在一些實施態樣中，該VEGF結合劑與VEGF特異性結合並調節血管生成。在一些實施態樣中，該VEGF結合劑與VEGF特異性結合並抑制血管生成。在一些實施態樣中，該VEGF結合劑與VEGF特異性結合並抑制腫瘤生長。
在某些實施態樣中，本發明提供與人DLL4特異性結合之DLL4結合劑(例如抗體)，其中該DLL4結合劑(例如抗體)包含抗體21R79之1、2、3、4、5及/或6個CDR(見表2)。在一些實施態樣中，該DLL4結合劑包含21R79之1個或更多之CDR、21R79之2個或更多之CDR、21R79之3個或更多之CDR、21R79之4個或更多之CDR、21R79之5個或更多之CDR或21R79之所有6個CDR。在某些實施態樣中，本發明提供與人DLL4特異性結合之DLL4結合劑(例如抗體)，其中該DLL4結合 劑(例如抗體)包含抗體21R75之1、2、3、4、5及/或6個CDR(見表2)。在一些實施態樣中，該DLL4結合劑包含21R75之1個或更多之CDR、21R75之2個或更多之CDR、21R75之3個或更多之CDR、21R75之4個或更多之CDR、21R75之5個或更多之CDR或21R75之所有6個CDR。在某些實施態樣中，本發明提供與人DLL4特異性結合之DLL4結合劑(例如抗體)，其中該DLL4結合劑(例如抗體)包含抗體21R83之1、2、3、4、5及/或6個CDR(見表2)。在一些實施態樣中，該DLL4結合劑包含21R83之1個或更多之CDR、21R83之2個或更多之CDR、21R83之3個或更多之CDR、21R83之4個或更多之CDR、21R83之5個或更多之CDR或21R83之所有6個CDR。在一些實施態樣中，該DLL4結合劑與人DLL4及小鼠DLL4結合。
在某些實施態樣中，本發明提供與人DLL4特異性結 合之DLL4結合劑(例如抗體)，其中該DLL4結合劑包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)，該重鏈CDR2包含YIANYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO：14)且該重鏈CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)。在一些實施態樣中，該DLL4結合劑另包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)且該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。在某些實施態樣中，該DLL4結合劑包含：(a)包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)之重鏈CDR1，包含YIANYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO：14)之重鏈CDR2及包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)之重鏈CDR3，及(b)包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)之輕鏈CDR1，包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)之輕鏈CDR2及包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)之輕鏈CDR3。
在某些實施態樣中，本發明提供與人DLL4特異性結合之DLL4結合劑(例如抗體)，其中該DLL4結合劑包含：(a)包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)之重鏈CDR1，或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體；(b)包含YIANYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO：14)之重鏈CDR2，或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體；(c)包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)之 重鏈CDR3，或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體；(d)包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)之輕鏈CDR1，或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體；(e)包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)之輕鏈CDR2，或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體；及(f)包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)之輕鏈CDR3，或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體。在某些實施態樣中，該胺基酸取代係保守性取代。
在某些實施態樣中，本發明提供與DLL4特異性結合之DLL4結合劑(例如抗體)，其中該DLL4結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區與SEQ ID NO：10具有至少約80%之序列一致性，該輕鏈可變區與SEQ ID NO：12具有至少80%之序列一致性。在某些實施態樣中，該DLL4結合劑包含與SEQ ID NO：10具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性之重鏈可變區。在某些實施態樣中，該DLL4結合劑包含與SEQ ID NO：12具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該DLL4結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區與SEQ ID NO：10具有至少約95%之序列一致性，該輕鏈可變區與SEQ ID NO：12具有至少約95%之序列一致性。在某些實施態樣中，該DLL4結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變 區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：10，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：12。在某些實施態樣中，該DLL4結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區實質上由SEQ ID NO：10組成，該輕鏈可變區實質上由SEQ ID NO：12組成。在一些實施態樣中，該DLL4結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：48且該輕鏈含有SEQ ID NO：8。在一些實施態樣中，該DLL4結合抗體或其他劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：6且該輕鏈含有SEQ ID NO：8。在一些實施態樣中，該抗體係雙特異性抗體。
在某些實施態樣中，本發明提供與人DLL4特異性結合之DLL4結合劑(例如抗體)，其中該DLL4結合劑包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)，該重鏈CDR2包含YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQ ID NO：59)且該重鏈CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)。在一些實施態樣中，該DLL4結合劑另包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)且該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。在某些實施態樣中，該DLL4結合劑包含：(a)包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)之重鏈CDR1，包含YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQ ID NO：59)之重鏈CDR2及包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)之重鏈CDR3， 及(b)包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)之輕鏈CDR1，包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)之輕鏈CDR2及包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)之輕鏈CDR3。
在某些實施態樣中，本發明提供與人DLL4特異性結合之DLL4結合劑(例如抗體)，其中該DLL4結合劑包含：(a)包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)之重鏈CDR1，或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體；(b)包含YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQ ID NO：59)之重鏈CDR2，或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體；(c)包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)之重鏈CDR3，或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體；(d)包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)之輕鏈CDR1，或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體；(e)包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)之輕鏈CDR2，或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體；及(f)包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)之輕鏈CDR3，或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體。在某些實施態樣中，該胺基酸取代係保守性取代。
在某些實施態樣中，本發明提供與DLL4特異性結合之DLL4結合劑(例如抗體)，其中該DLL4結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區與SEQ ID NO：58具有至少約80%之序列一致性，該輕鏈可變區與 SEQ ID NO：12具有至少80%之序列一致性。在某些實施態樣中，該DLL4結合劑包含與SEQ ID NO：58具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性之重鏈可變區。在某些實施態樣中，該DLL4結合劑包含與SEQ ID NO：12具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該DLL4結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區與SEQ ID NO：58具有至少約95%之序列一致性，該輕鏈可變區與SEQ ID NO：12具有至少約95%之序列一致性。在某些實施態樣中，該DLL4結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：58，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：12。在某些實施態樣中，該DLL4結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區實質上由SEQ ID NO：58組成，該輕鏈可變區實質上由SEQ ID NO：12組成。在一些實施態樣中，該DLL4結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：56且該輕鏈含有SEQ ID NO：8。
在某些實施態樣中，本發明提供與人DLL4特異性結合之DLL4結合劑(例如抗體)，其中該DLL4結合劑包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)，該重鏈CDR2包含YISNYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO：65)且該重鏈CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)。在一些實施態 樣中，該DLL4結合劑另包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)且該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。在某些實施態樣中，該DLL4結合劑包含：(a)包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)之重鏈CDR1，包含YISNYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO：65)之重鏈CDR2及包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)之重鏈CDR3，及(b)包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)之輕鏈CDR1，包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)之輕鏈CDR2及包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)之輕鏈CDR3。
在某些實施態樣中，本發明提供與人DLL4特異性結合之DLL4結合劑(例如抗體)，其中該DLL4結合劑包含(a)包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)之重鏈CDR1，或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體；(b)包含YISNYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO：65)之重鏈CDR2，或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體；(c)包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)之重鏈CDR3，或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體；(d)包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)之輕鏈CDR1，或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體；(e)包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)之輕鏈CDR2，或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代 之變異體；及(f)包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)之輕鏈CDR3，或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體。在某些實施態樣中，該胺基酸取代係保守性取代。
在某些實施態樣中，本發明提供與DLL4特異性結合之DLL4結合劑(例如抗體)，其中該DLL4結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區與SEQ ID NO：64具有至少約80%之序列一致性，該輕鏈可變區與SEQ ID NO：12具有至少80%之序列一致性。在某些實施態樣中，該DLL4結合劑包含與SEQ ID NO：64具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性之重鏈可變區。在某些實施態樣中，該DLL4結合劑包含與SEQ ID NO：12具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該DLL4結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區與SEQ ID NO：64具有至少約95%之序列一致性，該輕鏈可變區與SEQ ID NO：12具有至少約95%之序列一致性。在某些實施態樣中，該DLL4結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：64，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：12。在某些實施態樣中，該DLL4結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區實質上由SEQ ID NO：64組成，該輕鏈可變區實質上由SEQ ID NO：12組成。在一些實施態樣中，該DLL4結合劑包含重鏈及輕 鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：62且該輕鏈含有SEQ ID NO：8。在一些實施態樣中，該劑係雙特異性抗體。
在一些實施態樣中，該DLL4結合劑係包含重鏈及輕鏈之抗體，其中該重鏈含有SEQ ID NO：5且該輕鏈含有SEQ ID NO：8。在一些實施態樣中，該抗體係雙特異性抗體。
在一些實施態樣中，該DLL4結合劑以25nM或更低之KD與DLL4結合。在一些實施態樣中，該DLL4結合劑以10nM或更低之KD與DLL4結合。在一些實施態樣中，該DLL4結合劑以大約1nM或更低之KD與DLL4結合。在一些實施態樣中，該DLL4結合劑以大約0.1nM或更低之KD與DLL4結合。在一些實施態樣中，該DLL4結合劑以大約0.01nM或更低之KD與DLL4結合。在一些實施態樣中，該DLL4結合劑之至少一個CDR中之至少一個胺基酸殘基係經不同之胺基酸取代，以使該DLL4結合劑與DLL4之親和性改變。在一些實施態樣中，該DLL4結合劑之親和性係增加。在一些實施態樣中，該DLL4結合劑之親和性係減少。
在某些實施態樣中，該DLL4結合劑包含21R79抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該DLL4結合劑包含21R79抗體(有或無前導序列)之重鏈及輕鏈。在某些實施態樣中，該DLL4結合劑係21R79抗體。
在某些實施態樣中，DLL4結合劑包含抗體21R79、 實質上由抗體21R79組成或由抗體21R79組成。
在某些實施態樣中，該DLL4結合劑包含21R75抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該DLL4結合劑包含21R75抗體(有或無前導序列)之重鏈及輕鏈。在某些實施態樣中，該DLL4結合劑係21R75抗體。
在某些實施態樣中，DLL4結合劑包含抗體21R75、實質上由抗體21R75組成或由抗體21R75組成。
在某些實施態樣中，該DLL4結合劑包含21R83抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該DLL4結合劑包含21R83抗體(有或無前導序列)之重鏈及輕鏈。在某些實施態樣中，該DLL4結合劑係21R83抗體。
在某些實施態樣中，DLL4結合劑包含抗體21R83、實質上由抗體21R83組成或由抗體21R83組成。
在一些實施態樣中，DLL4結合劑與人DLL4之N端片段(SEQ ID NO：24之胺基酸1至191)結合。在一些實施態樣中，該DLL4結合劑與包含SEQ ID NO：25之胺基酸40至47之表位結合。在一些實施態樣中，該DLL4結合劑與包含SEQ ID NO：25之胺基酸113至120之表位結合。在一些實施態樣中，該DLL4結合劑與包含SEQ ID NO：25之胺基酸40至47及SEQ ID NO：25之胺基酸113至120之表位結合。
在某些實施態樣中，DLL4結合劑(例如抗體)與 DLL4上由本發明之抗體所結合之相同表位或實質上相同之表位結合。在另一實施態樣中，DLL4結合劑係與DLL4上之表位結合之抗體，該表位與由本發明之抗體所結合之DLL4上之表位重疊。在某些實施態樣中，DLL4結合劑(例如抗體)與DLL4上由抗體21R79所結合之相同表位或實質上相同之表位結合。在另一實施態樣中，該DLL4結合劑係與DLL4上之表位結合之抗體，該表位與由抗體21R79所結合之DLL4上之表位重疊。在某些實施態樣中，DLL4結合劑(例如抗體)與DLL4上由抗體21R75所結合之相同表位或實質上相同之表位結合。在另一實施態樣中，該DLL4結合劑係與DLL4上之表位結合之抗體，該表位與由抗體21R75所結合之DLL4上之表位重疊。在某些實施態樣中，DLL4結合劑(例如抗體)與DLL4上由抗體21R83所結合之相同表位或實質上相同之表位結合。在另一實施態樣中，該DLL4結合劑係與DLL4上之表位結合之抗體，該表位與由抗體21R83所結合之DLL4上之表位重疊。
在一些實施態樣中，該DLL4結合劑抑制DLL4與至少一種缺口受體結合。在某些實施態樣中，該缺口受體係缺口1、缺口2、缺口3或缺口4。在一些實施態樣中，該DLL4結合劑與DLL4特異性結合並抑制DLL4活性。在一些實施態樣中，該DLL4結合劑與DLL4特異性結合並抑制缺口傳訊。在一些實施態樣中，該DLL4結合劑與DLL4特異性結合並調節血管生成。在一些實施態樣中， 該DLL4結合劑與DLL4特異性結合並抑制腫瘤生長。在一些實施態樣中，該DLL4結合劑與DLL4特異性結合並抑制腫瘤發生。在一些實施態樣中，該DLL4結合劑與DLL4特異性結合並減少腫瘤中之CSC之數量或頻率。
在某些實施態樣中，本發明提供其係雙特異性抗體之VEGF/DLL4結合劑。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含與人VEGF特異性結合之第一抗原結合部位。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含與人VEGF特異性結合之第一抗原結合部位及與腫瘤相關標靶結合之第二抗原結合部位。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含與人VEGF特異性結合之第一抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含NYWMH(SEQ ID NO：17)，該重鏈CDR2包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO：18)且該重鏈CDR3包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO：19)。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體另包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)且該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含與人VEGF特異性結合之第一抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含(a)重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈 CDR3及(b)輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該重鏈CDR1包含NYWMH(SEQ ID NO：17)，該重鏈CDR2包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO：18)，該重鏈CDR3包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO：19)，且該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)，該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含與SEQ ID NO：11具有至少約80%序列一致性之第一重鏈可變區。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體另包含與SEQ ID NO：12具有至少80%序列一致性之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該雙特異性VEGF/DLL4結合劑包含第一重鏈可變區及輕鏈可變區，該第一重鏈可變區與SEQ ID NO：11具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性，該輕鏈可變區與SEQ ID NO：12具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性。
在某些實施態樣中，本發明提供其係雙特異性抗體之VEGF/DLL4結合劑。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含與人DLL4特異性結合之第一抗原結合部位。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含與人DLL4特異性結合之第一抗原結合部位及與腫瘤相關標靶結合之第二抗原結合 部位。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含與人DLL4特異性結合之第一抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)，該重鏈CDR2包含YIANYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO：14)、YISSYNGATNYNQKFKG(SEQ ID NO：15)、YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQ ID NO：59)或YISNYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO：65)且該重鏈CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體包含第一抗原結合部位，該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)，該重鏈CDR2包含YIANYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO：14)且該重鏈CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體包含第一抗原結合部位，該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)，該重鏈CDR2包含YISSYNGATNYNQKFKG(SEQ ID NO：15)且該重鏈CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體包含第一抗原結合部位，該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)，該重鏈CDR2包含YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQ ID NO：59)且該重鏈 CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體包含第一抗原結合部位，該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)，該重鏈CDR2包含YISNYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO：65)且該重鏈CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體另包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)且該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含與人DLL4特異性結合之第一抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含(a)重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3及(b)輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)，該重鏈CDR2包含YIANYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO：14)、YISSYNGATNYNQKFKG(SEQ ID NO：15)、YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQ ID NO：59)或YISNYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO：65)，該重鏈CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)，且該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)，該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含與SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：64具有至少約80%序列一致性之第一重鏈可變區。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體另包含與SEQ ID NO：12具有至少80%序列一致性之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該雙特異性VEGF/DLL4結合劑包含第一重鏈可變區及/或輕鏈可變區，該第一重鏈可變區與SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：64具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性，該輕鏈可變區與SEQ ID NO：12具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性。
在某些實施態樣中，本發明提供與人VEGF及人DLL4特異性結合之VEGF/DLL4結合劑(例如雙特異性抗體)。在一些實施態樣中，雙特異性抗體包含與人VEGF特異性結合之第一抗原結合部位及與人DLL4特異性結合之第二抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含NYWMH(SEQ ID NO：17)，該重鏈CDR2包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO：18)且該重鏈CDR3包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO：19)，其中該第二抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO；13)，該重鏈CDR2包含YIANYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO：14)、 YISSYNGATNYNQKFKG(SEQ ID NO：15)、YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQ ID NO：59)或YISNYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO：65)且該重鏈CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)，且其中該第一及第二抗原結合部位皆包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)且該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。
在一些實施態樣中，該雙特異性抗體包含與人VEGF特異性結合之第一抗原結合部位及與人DLL4特異性結合之第二抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含NYWMH(SEQ ID NO：17)，該重鏈CDR2包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO：18)且該重鏈CDR3包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO：19)，其中該第二抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)，該重鏈CDR2包含YIANYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO：14)且該重鏈CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)，且其中該第一及第二抗原結合部位皆包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)且該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體係 219R45-MB-21R79。
在一些實施態樣中，該雙特異性抗體包含與人VEGF特異性結合之第一抗原結合部位及與人DLL4特異性結合之第二抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含NYWMH(SEQ ID NO：17)，該重鏈CDR2包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO：18)且該重鏈CDR3包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO：19)，其中該第二抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)，該重鏈CDR2包含YISSYNGATNYNQKFKG(SEQ ID NO：15)且該重鏈CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)，且其中該第一及第二抗原結合部位皆包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)且該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體係219R45-MB-21M18。
在一些實施態樣中，該雙特異性抗體包含與人VEGF特異性結合之第一抗原結合部位及與人DLL4特異性結合之第二抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含NYWMH(SEQ ID NO：17)，該重鏈CDR2包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO：18)且該重鏈CDR3 包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO：19)，其中該第二抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)，該重鏈CDR2包含YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQ ID NO：59)且該重鏈CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)，且其中該第一及第二抗原結合部位皆包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)且該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體係219R45-MB-21R75。
在一些實施態樣中，該雙特異性抗體包含與人VEGF特異性結合之第一抗原結合部位及與人DLL4特異性結合之第二抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含NYWMH(SEQ ID NO：17)，該重鏈CDR2包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO：18)且該重鏈CDR3包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO：19)，其中該第二抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)，該重鏈CDR2包含YISNYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO：65)且該重鏈CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)，且其中該第一及第二抗原結合部位皆包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)且該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體係219R45-MB-21R83。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑(例如雙特異性抗體)包含第一重鏈可變區、第二重鏈可變區及第一及第二輕鏈可變區，該第一重鏈可變區與SEQ ID NO：11具有至少約80%之序列一致性，該第二重鏈可變區與SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：64具有至少約80%之序列一致性，且該第一及第二輕鏈可變區與SEQ ID NO：12具有至少80%之序列一致性。在某些實施態樣中，該雙特異性VEGF/DLL4結合劑包含第一重鏈可變區、第二重鏈可變區及第一及第二輕鏈可變區，該第一重鏈可變區與SEQ ID NO：11具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性，該第二重鏈可變區與SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：64具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性，且該第一及第二輕鏈可變區與SEQ ID NO：12具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性。在某些實施態樣中，該雙特異性VEGF/DLL4結合劑包含第一重鏈可變區、第二重鏈可變區及第一及第二輕鏈可變區，該第一重鏈可變區與SEQ ID NO：11具有至少約95%之序列一致性，該第 二重鏈可變區與SEQ ID NO：9具有至少約95%之序列一致性，且該第一及第二輕鏈可變區與SEQ ID NO：12具有至少約95%之序列一致性。在某些實施態樣中，該雙特異性VEGF/DLL4結合劑包含第一重鏈可變區、第二重鏈可變區及第一及第二輕鏈可變區，該第一重鏈可變區與SEQ ID NO：11具有至少約95%之序列一致性，該第二重鏈可變區與SEQ ID NO：10具有至少約95%之序列一致性，且該第一及第二輕鏈可變區與SEQ ID NO：12具有至少約95%之序列一致性。在某些實施態樣中，該雙特異性VEGF/DLL4結合劑包含第一重鏈可變區、第二重鏈可變區及第一及第二輕鏈可變區，該第一重鏈可變區與SEQ ID NO：11具有至少約95%之序列一致性，該第二重鏈可變區與SEQ ID NO：58具有至少約95%之序列一致性，且該第一及第二輕鏈可變區與SEQ ID NO：12具有至少約95%之序列一致性。在某些實施態樣中，該雙特異性VEGF/DLL4結合劑包含第一重鏈可變區、第二重鏈可變區及第一及第二輕鏈可變區，該第一重鏈可變區與SEQ ID NO：11具有至少約95%之序列一致性，該第二重鏈可變區與SEQ ID NO：64具有至少約95%之序列一致性，且該第一及第二輕鏈可變區與SEQ ID NO：12具有至少約95%之序列一致性。在某些實施態樣中，該雙特異性VEGF/DLL4結合劑包含第一重鏈可變區、第二重鏈可變區及第一及第二輕鏈可變區，該第一重鏈可變區包含SEQ ID NO：11，該第二重鏈可變區包含SEQ ID NO：9，且該第 一及第二輕鏈可變區包含SEQ ID NO：12。在某些實施態樣中，該雙特異性VEGF/DLL4結合劑包含第一重鏈可變區、第二重鏈可變區及第一及第二輕鏈可變區，該第一重鏈可變區包含SEQ ID NO：11，該第二重鏈可變區包含SEQ ID NO：10，且該第一及第二輕鏈可變區包含SEQ ID NO：12。在某些實施態樣中，該雙特異性VEGF/DLL4結合劑包含第一重鏈可變區、第二重鏈可變區及第一及第二輕鏈可變區，該第一重鏈可變區包含SEQ ID NO：11，該第二重鏈可變區包含SEQ ID NO：58，且該第一及第二輕鏈可變區包含SEQ ID NO：12。在某些實施態樣中，該雙特異性VEGF/DLL4結合劑包含第一重鏈可變區、第二重鏈可變區及第一及第二輕鏈可變區，該第一重鏈可變區包含SEQ ID NO：11，該第二重鏈可變區包含SEQ ID NO：64，且該第一及第二輕鏈可變區包含SEQ ID NO：12。在某些實施態樣中，該雙特異性VEGF/DLL4結合劑包含第一重鏈可變區、第二重鏈可變區及第一及第二輕鏈可變區，該第一重鏈可變區實質上由SEQ ID NO：11組成，該第二重鏈可變區實質上由SEQ ID NO：9組成，且該第一及第二輕鏈可變區實質上由SEQ ID NO：12組成。在某些實施態樣中，該雙特異性VEGF/DLL4結合劑包含第一重鏈可變區、第二重鏈可變區及第一及第二輕鏈可變區，該第一重鏈可變區實質上由SEQ ID NO：11組成，該第二重鏈可變區實質上由SEQ ID NO：10組成，且該第一及第二輕鏈可變區實質上由SEQ ID NO：12組成。在某些實施態樣中， 該雙特異性VEGF/DLL4結合劑包含第一重鏈可變區、第二重鏈可變區及第一及第二輕鏈可變區，該第一重鏈可變區實質上由SEQ ID NO：11組成，該第二重鏈可變區實質上由SEQ ID NO：58組成，且該第一及第二輕鏈可變區實質上由SEQ ID NO：12組成。在某些實施態樣中，該雙特異性VEGF/DLL4結合劑包含第一重鏈可變區、第二重鏈可變區及第一及第二輕鏈可變區，該第一重鏈可變區實質上由SEQ ID NO：11組成，該第二重鏈可變區實質上由SEQ ID NO：64組成，且該第一及第二輕鏈可變區實質上由SEQ ID NO：12組成。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含源自抗VEGF抗體219R45之重鏈可變區。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含源自抗DLL4抗體21M18之重鏈可變區。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含源自抗DLL4抗體21R79之重鏈可變區。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含源自抗DLL4抗體21R75之重鏈可變區。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含源自抗DLL4抗體21R83之重鏈可變區。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含源自抗VEGF抗體219R45之重鏈可變區、源自抗DLL4抗體21R79之重鏈可變區及二個完全一致之輕鏈可變區。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗 體，其包含源自抗VEGF抗體219R45之重鏈可變區、源自抗DLL4抗體21M18之重鏈可變區及二個完全一致之輕鏈可變區。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含源自抗VEGF抗體219R45之重鏈可變區、源自抗DLL4抗體21R75之重鏈可變區及二個完全一致之輕鏈可變區。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含源自抗VEGF抗體219R45之重鏈可變區、源自抗DLL4抗體21R83之重鏈可變區及二個完全一致之輕鏈可變區。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含第一CH3結構域及第二CH3結構域，該第一CH3結構域及第二CH3結構域各自經改質以促進異多聚體之形成。在一些實施態樣中，該第一及第二CH3結構域係利用突點對應孔洞技術加以改質。在一些實施態樣中，該第一及第二CH3結構域包含胺基酸之改變，該等胺基酸之改變導致不同之靜電交互作用。在一些實施態樣中，該第一及第二CH3結構域包含胺基酸之改變，該等胺基酸之改變導致不同之疏水性/親水性交互作用。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含選自下列之重鏈恆定區：(a)其中位置253及292之胺基酸係經麩胺酸或天冬胺酸取代之第一人IgG1恆定區，及其中位置240及282之胺基酸係經離胺酸取代之第二人IgG1恆定區；(b)其中位置249及288之胺基酸係經麩胺酸或天冬胺酸取代之第一人IgG2恆定 區，及其中位置236及278之胺基酸係經離胺酸取代之第二人IgG2恆定區；(c)其中位置300及339之胺基酸係經麩胺酸或天冬胺酸取代之第一人IgG3恆定區，及其中位置287及329之胺基酸係經離胺酸取代之第二人IgG3恆定區；及(d)其中位置250及289之胺基酸係經麩胺酸或天冬胺酸取代之第一人IgG4恆定區，及其中位置237及279之胺基酸係經離胺酸取代之第二IgG4恆定區。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含在位置253及292具有胺基酸取代之第一人IgG1恆定區及在位置240及282具有胺基酸取代之第二人IgG1恆定區，其中該第一人IgG1恆定區中之胺基酸係麩胺酸或天冬胺酸，其中該第二人IgG1恆定區中之胺基酸係離胺酸。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含在位置249及288具有胺基酸取代之第一人IgG2恆定區及在位置236及278具有胺基酸取代之第二人IgG2恆定區，其中該第一人IgG2恆定區中之胺基酸係麩胺酸或天冬胺酸，其中該第二人IgG2恆定區中之胺基酸係離胺酸。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含在位置300及339具有胺基酸取代之第一人IgG3恆定區及在位置287及329具有胺基酸取代之第二人IgG3恆定區，其中該第一人IgG3恆定區中之胺基酸係麩胺酸或天冬胺酸，其中該第二人IgG3恆定區中之胺基酸係離胺酸。在一些 實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含在位置250及289具有胺基酸取代之第一人IgG4恆定區及在位置237及279具有胺基酸取代之第二人IgG4恆定區，其中該第一人IgG4恆定區中之胺基酸係麩胺酸或天冬胺酸，其中該第二人IgG4恆定區中之胺基酸係離胺酸。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含在位置249及288具有胺基酸取代之第一人IgG2恆定區及在位置236及278具有胺基酸取代之第二人IgG2恆定區，其中該第一人IgG2恆定區中之胺基酸係麩胺酸，其中該第二人IgG2恆定區中之胺基酸係離胺酸。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含在位置249及288具有胺基酸取代之第一人IgG2恆定區及在位置236及278具有胺基酸取代之第二人IgG2恆定區，其中該第一人IgG2恆定區中之胺基酸係天冬胺酸，其中該第二人IgG2恆定區中之胺基酸係離胺酸。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO：7之重鏈。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO：5之重鏈。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO：56之重鏈。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO：62之重鏈。在一些實施態樣中， 該雙特異性抗體另包含SEQ ID NO：12之輕鏈。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO：7之重鏈、SEQ ID NO：5之重鏈及SEQ ID NO：8之二條輕鏈。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO：7之重鏈、SEQ ID NO：6之重鏈及SEQ ID NO：8之二條輕鏈。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO：7之重鏈、SEQ ID NO：56之重鏈及SEQ ID NO：8之二條輕鏈。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO：7之重鏈、SEQ ID NO：62之重鏈及SEQ ID NO：8之二條輕鏈。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其以約50nM或更低、約25nM或更低、約10nM或更低、約1nM或更低、或約0.1nM或更低之KD與VEGF結合。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其以約50nM或更低、約25nM或更低、約10nM或更低、約1nM或更低、或約0.1nM或更低之KD與DLL4結合。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其以約50nM或更低之KD與VEGF結合，且以約50nM或更低之KD與DLL4結合。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體以約25nM或更低之KD與VEGF結合，且以約25nM或更低之KD與DLL4結合。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體以約10nM或更低之KD與VEGF結合，且以約10nM或更低之KD與 DLL4結合。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體以約1nM或更低之KD與VEGF結合，且以約1nM或更低之KD與DLL4結合。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含一個結合親和性相較於第二抗原結合部位之結合親和性為弱之抗原結合部位。舉例來說，在一些實施態樣中，該雙特異性抗體可能以自約0.1nM至1nM之KD與VEGF結合，且可能以自約1nM至10nM之KD與DLL4結合。或者該雙特異性抗體可能以自約1nM至10nM之KD與VEGF結合，且可能以自約0.1nM至1nM之KD與DLL4結合。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體可能以自約0.1nM至1nM之KD與DLL4結合，且可能以自約1nM至10nM之KD與VEGF結合。或者該雙特異性抗體可能以自約1nM至10nM之KD與DLL4結合，且可能以自約0.1nM至1nM之KD與VEGF結合。在一些實施態樣中，該二個抗原結合部位之間的親和性差異可能為大約2倍或2倍以上、大約3倍或3倍以上、大約5倍或5倍以上、大約8倍或8倍以上、大約10倍或10倍以上、大約15倍或15倍以上、大約30倍或30倍以上、大約50倍或50倍以上或大約100倍或100倍以上。在一些實施態樣中，該VEGF抗原結合部位之至少一個CDR中之至少一個胺基酸殘基係經不同之胺基酸取代，以使該VEGF結合部位之親和性改變。在一些實施態樣中，該VEGF結合部位之親和性係增加。在一些實施態樣中，該 VEGF結合部位之親和性係減少。在一些實施態樣中，該DLL4抗原結合部位之至少一個CDR中之至少一個胺基酸殘基係經不同之胺基酸取代，以使該DLL4結合部位之親和性改變。在一些實施態樣中，該DLL4結合部位之親和性係增加。在一些實施態樣中，該DLL4結合部位之親和性係減少。在一些實施態樣中，VEGF及DLL4抗原結合部位二者之親和性係經改變。
本發明提供與VEGF及/或DLL4特異性結合之多肽，包括但不限於抗體。在一些實施態樣中，多肽與人VEGF結合。在一些實施態樣中，多肽與人DLL4結合。在一些實施態樣中，多肽與人VEGF及小鼠VEGF結合。在一些實施態樣中，多肽與人DLL4及小鼠DLL4結合。
在一些實施態樣中，VEGF結合劑包含多肽，該多肽包含選自下列之序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：47及SEQ ID NO：49。
在一些實施態樣中，DLL4結合劑包含多肽，該多肽包含選自下列之序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63及SEQ ID NO：64。
在一些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑包含多肽， 該多肽包含選自下列之序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63及SEQ ID NO：64。
在一些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑包含多肽，該多肽包含選自下列之序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63及SEQ ID NO：64。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑另包含多肽，該多肽包含選自下列之序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：47及SEQ ID NO：49。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑另包含多肽，該多肽包含選自下列之序列：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：12。
在一些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑包含多肽，該多肽包含選自下列之序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：47及SEQ ID NO：49。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑另包含多肽，該多肽包含選自下列之序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63及SEQ ID NO：64。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑另包含多肽，該多肽包含選自下列之序列：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：12。
在某些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑(例如抗體)與抗體競爭與VEGF之特異性結合，該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：11，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：12。在某些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑與抗體219R45競爭與人VEGF之特異性結合。在一些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑或抗體於試管內競爭性結合測定中競爭與VEGF之特異性結合。在一些實施態樣中，該VEGF係人VEGF。在一些實施態樣中，該VEGF係小鼠VEGF。
在某些實施態樣中，VEGF-DLL4結合劑(例如抗體)與VEGF上由本發明之抗體所結合之相同表位或實質上相同之表位結合。在另一實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑係與VEGF上之表位結合之抗體，該表位與由本發明之抗體所結合之VEGF上之表位重疊。在某些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑(例如抗體)與VEGF上由抗體219R45所結合之相同表位或實質上相同之表位結合。在另一實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係與VEGF上之表位結合之抗體，該表位與由抗體219R45所結合之VEGF上之表位重疊。
在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係與抗體219R45競爭與VEGF之特異性結合之劑(例如於競爭性結合測定中)。
在某些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑(例如抗體)與抗體競爭與DLL4之特異性結合，該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：64，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：12。在某些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑與抗體21R79競爭與人DLL4之特異性結合。在某些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑與抗體21R75競爭與人DLL4之特異性結合。在某些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑與抗體21R83競爭與人DLL4之特異性結合。在一些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑或抗體於試管內競爭性結合測定中競爭與DLL4之特異性結合。在一些實施態樣中，該DLL4係人DLL4。在一些實施態樣中，該DLL4係小鼠DLL4。
在某些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑(例如抗體)與DLL4上由本發明之抗體所結合之相同表位或實質上相同之表位結合。在另一實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑係與DLL4上之表位結合之抗體，該表位與由本發明之抗體所結合之DLL4上之表位重疊。在某些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑與DLL4上由抗體21R79所結合之相同表位或實質上相同之表位結合。在某些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑與DLL4上由抗體21R75所結合之相同 表位或實質上相同之表位結合。在某些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑與DLL4上由抗體21R83所結合之相同表位或實質上相同之表位結合。在另一實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係與DLL4上之表位結合之抗體，該表位與由抗體21R79所結合之DLL4上之表位重疊。在另一實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係與DLL4上之表位結合之抗體，該表位與由抗體21R75所結合之DLL4上之表位重疊。在另一實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係與DLL4上之表位結合之抗體，該表位與由抗體21R83所結合之DLL4上之表位重疊。
在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係與抗體21R79競爭與DLL4之特異性結合之劑(例如於競爭性結合測定中)。在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係與抗體21R75競爭與DLL4之特異性結合之劑(例如於競爭性結合測定中)。在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係與抗體21R83競爭與DLL4之特異性結合之劑(例如於競爭性結合測定中)。在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係與抗體21M18競爭與DLL4之特異性結合之劑(例如於競爭性結合測定中)。
在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係與雙特異性抗體219R45-MB-21M18競爭與VEGF及/或DLL4之特異性結合之劑(例如於競爭性結合測定中)。在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係與雙特異性抗體219R45-MB-21M79競爭與VEGF及/或DLL4之特異性結 合之劑(例如於競爭性結合測定中)。在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係與雙特異性抗體219R45-MB-21M75競爭與VEGF及/或DLL4之特異性結合之劑(例如於競爭性結合測定中)。在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係與雙特異性抗體219R45-MB-21M83競爭與VEGF及/或DLL4之特異性結合之劑(例如於競爭性結合測定中)。
在某些實施態樣中，此處所描述之VEGF/DLL4結合劑(例如抗體)與VEGF結合且調節VEGF活性。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係VEGF拮抗劑且抑制VEGF活性。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係VEGF拮抗劑且調節血管生成。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係VEGF拮抗劑且抑制血管生成。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係VEGF拮抗劑且抑制腫瘤生長。
在某些實施態樣中，此處所描述之VEGF/DLL4結合劑(例如抗體)與人DLL4結合且調節DLL4活性。在一些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑係DLL4拮抗劑且抑制DLL4活性。在一些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑係DLL4拮抗劑且抑制缺口活性。在一些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑係DLL4拮抗劑且抑制缺口傳訊。在一些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑係DLL4拮抗劑且調節血管生成。在一些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑係DLL4拮抗劑且促進異常血管生成。在一些實施態樣中， VEGF/DLL4結合劑係DLL4拮抗劑且抑制腫瘤生長。
在某些實施態樣中，此處所描述之VEGF/DLL4結合劑(例如抗體)係與人VEGF結合且調節VEGF活性之雙特異性抗體。在某些實施態樣中，此處所描述之VEGF/DLL4結合劑(例如抗體)係與人DLL4結合且調節DLL4活性之雙特異性抗體。在某些實施態樣中，此處所描述之VEGF/DLL4結合劑(例如抗體)係與人VEGF及人DLL4結合且調節VEGF及DLL4二者活性之雙特異性抗體。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體係VEGF拮抗劑及DLL4拮抗劑，且抑制VEGF活性及DLL4活性二者。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體係VEGF拮抗劑及DLL4拮抗劑，且抑制VEGF活性及缺口活性。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體係VEGF拮抗劑及DLL4拮抗劑，且抑制VEGF活性及缺口傳訊。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體係VEGF拮抗劑及DLL4拮抗劑且調節血管生成。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體係VEGF拮抗劑及DLL4拮抗劑且促進異常血管生成。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體係VEGF拮抗劑及DLL4拮抗劑且抑制血管生成。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體係VEGF拮抗劑及DLL4拮抗劑且抑制腫瘤生長。
在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑(例如抗體或雙特異性抗體)係VEGF之拮抗劑。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係VEGF之拮抗劑且抑制VEGF活性。在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑抑制至 少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約50%、至少約75%、至少約90%或約100%之VEGF活性。在某些實施態樣中，抑制人VEGF活性之VEGF/DLL4結合劑係抗體219R45。在某些實施態樣中，抑制人VEGF活性之VEGF/DLL4結合劑係包含219R45之抗原結合部位之雙特異性抗體。在某些實施態樣中，抑制人VEGF活性之VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體219R45-MB-21M18。在某些實施態樣中，抑制人VEGF活性之VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體219R45-MB-21R79。在某些實施態樣中，抑制人VEGF活性之VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體219R45-MB-21R75。在某些實施態樣中，抑制人VEGF活性之VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體219R45-MB-21R83。
在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑(例如抗體)係DLL4之拮抗劑。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係DLL4之拮抗劑且抑制DLL4活性。在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑抑制至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約50%、至少約75%、至少約90%或約100%之DLL4活性。在某些實施態樣中，抑制人DLL4活性之VEGF/DLL4結合劑係抗體21R79。在某些實施態樣中，抑制人DLL4活性之VEGF/DLL4結合劑係抗體21R75。在某些實施態樣中，抑制人DLL4活性之VEGF/DLL4結合劑係抗體21R83。在某些實施態樣中，抑制人DLL4活性之VEGF/DLL4結合劑 係包含21R79之抗原結合部位之雙特異性抗體。在某些實施態樣中，抑制人DLL4活性之VEGF/DLL4結合劑係包含21R75之抗原結合部位之雙特異性抗體。在某些實施態樣中，抑制人DLL4活性之VEGF/DLL4結合劑係包含21R83之抗原結合部位之雙特異性抗體。在某些實施態樣中，抑制人DLL4活性之VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體219R45-MB-21M18。在某些實施態樣中，抑制人DLL4活性之VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體219R45-MB-21R79。在某些實施態樣中，抑制人DLL4活性之VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體219R45-MB-21R75。在某些實施態樣中，抑制人DLL4活性之VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體219R45-MB-21R83。
在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑(例如抗體)係缺口傳訊之拮抗劑。在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑抑制至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約50%、至少約75%、至少約90%或約100%之缺口傳訊。在某些實施態樣中，抑制缺口傳訊之VEGF/DLL4結合劑係抗體21R79。在某些實施態樣中，抑制缺口傳訊之VEGF/DLL4結合劑係抗體21R75。在某些實施態樣中，抑制缺口傳訊之VEGF/DLL4結合劑係抗體21R83。在某些實施態樣中，抑制缺口傳訊之VEGF/DLL4結合劑係包含21R79之抗原結合部位之雙特異性抗體。在某些實施態樣中，抑制缺口傳訊之VEGF/DLL4結合劑係包含21R75之抗原結合部位之雙特異性抗體。在某些實施 態樣中，抑制缺口傳訊之VEGF/DLL4結合劑係包含21R83之抗原結合部位之雙特異性抗體。在某些實施態樣中，抑制缺口傳訊之VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體219R45-MB-21M18。在某些實施態樣中，抑制缺口傳訊之VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體219R45-MB-21R79。在某些實施態樣中，抑制缺口傳訊之VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體219R45-MB-21R75。在某些實施態樣中，抑制缺口傳訊之VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體219R45-MB-21R83。
在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑(例如抗體)抑制VEGF與至少一種受體結合。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑抑制VEGF與VEGFR-1或VEGFR-2之結合。在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑抑制至少約10%、至少約25%、至少約50%、至少約75%、至少約90%或至少約95%之VEGF與至少一種VEGF受體結合。在某些實施態樣中，抑制人VEGF與至少一種VEGF受體結合之VEGF/DLL4結合劑係抗體219R45。在某些實施態樣中，抑制人VEGF與至少一種VEGF受體結合之VEGF/DLL4結合劑係包含219R45之抗原結合部位之雙特異性抗體。在某些實施態樣中，抑制人VEGF與至少一種VEGF受體結合之VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體219R45-MB-21M18。在某些實施態樣中，抑制人VEGF與至少一種VEGF受體結合之VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體219R45-MB-21R79。在某些實施態樣中，抑制人 VEGF與至少一種VEGF受體結合之VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體219R45-MB-21R75。在某些實施態樣中，抑制人VEGF與至少一種VEGF受體結合之VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體219R45-MB-21R83。
在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑(例如抗體)抑制DLL4蛋白質與至少一種缺口受體結合。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑抑制DLL4與缺口1、缺口2、缺口3及/或缺口4之結合。在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑抑制至少約10%、至少約25%、至少約50%、至少約75%、至少約90%或至少約95%之DLL4與至少一種缺口受體結合。在某些實施態樣中，抑制人DLL4與至少一種缺口受體結合之VEGF/DLL4結合劑係抗體21R79。在某些實施態樣中，抑制人DLL4與至少一種缺口受體結合之VEGF/DLL4結合劑係抗體21R75。在某些實施態樣中，抑制人DLL4與至少一種缺口受體結合之VEGF/DLL4結合劑係抗體21R83。在某些實施態樣中，抑制人DLL4與至少一種缺口受體結合之VEGF/DLL4結合劑係包含21R79之抗原結合部位之雙特異性抗體。在某些實施態樣中，抑制人DLL4與至少一種缺口受體結合之VEGF/DLL4結合劑係包含21R75之抗原結合部位之雙特異性抗體。在某些實施態樣中，抑制人DLL4與至少一種缺口受體結合之VEGF/DLL4結合劑係包含21R83之抗原結合部位之雙特異性抗體。在某些實施態樣中，抑制人DLL4與至少一種缺口受體結合之 VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體219R45-MB-21M18。在某些實施態樣中，抑制人DLL4與至少一種缺口受體結合之VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體219R45-MB-21R79。在某些實施態樣中，抑制人DLL4與至少一種缺口受體結合之VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體219R45-MB-21R75。在某些實施態樣中，抑制人DLL4與至少一種缺口受體結合之VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體219R45-MB-21R83。
用於測定VEGF/DLL4結合劑(或候選VEGF/DLL4結合劑)是否抑制VEGF或影響血管生成之體內及試管內測定係該領域所知。血管生成之試管內測定包括但不限於HUVEC增生試驗、內皮細胞血管形成試驗、芽生(或芽形成)試驗、HUVEC細胞移動試驗及侵入試驗。在一些實施態樣中，比較有VEGF存在及VEGF/DLL4結合劑存在時之細胞與有VEGF存在但無VEGF/DLL4結合劑存在之細胞，評估對血管生成之影響(或與血管生成有關之生物效應)。血管生成之體內試驗包括但不限於基質膠填塞(matrigel plug)試驗、角膜微囊袋試驗及雞胚絨毛尿囊膜(CAM)試驗。
用於測定VEGF/DLL4結合劑(或候選VEGF/DLL4結合劑)是否抑制缺口活化或傳訊之體內及試管內測定係該領域所知。舉例來說，可使用以細胞為基底之螢光素酶報告試驗測量試管內之缺口傳訊量，其利用含有多副TCF結合結構域與下游螢火蟲螢光素酶報告基因之TCF/Luc報告 載體(Gazit et al.,1999,Oncogene,18；5959-66；TOPflash,Millipore,Billerica MA)。在一些實施態樣中，以細胞為基底之螢光素酶報告基因試驗利用含有多副CBF結合結構域與下游螢火蟲螢光素酶報告基因之CBF/Luc報告載體可被使用。在一或多種缺口配體(例如表現於經轉染之細胞表面之DLL4或可溶性DLL4-Fc融合蛋白)存在及VEGF/DLL4結合劑存在時之缺口傳訊量係與無VEGF/DLL4結合劑存在時之缺口傳訊量比較。
在某些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑具有下列一或多種效應：抑制腫瘤細胞增生、抑制腫瘤細胞生長、減少腫瘤之腫瘤發生性、減少腫瘤中癌幹細胞之頻率、引發腫瘤細胞之細胞死亡、預防腫瘤細胞之轉移、降低腫瘤細胞之存活、調節血管生成、抑制血管生成、抑制生產性血管生成或促進異常血管生成。
在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑可抑制腫瘤生長。在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑可抑制體內腫瘤生長(例如於異種移植小鼠模型及/或於罹患癌之人體內)。在某些實施態樣中，相較於未經治療之腫瘤，腫瘤生長係經抑制至少約二倍、約三倍、約五倍、約十倍、約50倍、約100倍、或約1000倍。
在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑可減少腫瘤之腫瘤發生性。在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑或抗體可於動物模型諸如小鼠異種移植模型中減少包含癌幹細胞之腫瘤的腫瘤發生性。在某些實施態樣中，該 VEGF/DLL4結合劑或抗體可藉由減少腫瘤中癌幹細胞之數量或頻率以減少腫瘤之腫瘤發生性。在某些實施態樣中，腫瘤中癌幹細胞之數量或頻率係減少至少約二倍、約三倍、約五倍、約十倍、約50倍、約100倍、或約1000倍。在某些實施態樣中，癌幹細胞之數量或頻率減少係藉由使用動物模型之限制稀釋試驗測定。有關使用限制稀釋試驗以測定腫瘤中癌幹細胞之數量或頻率減少之其他實例及指南可見例如國際公開號WO 2008/042236、美國專利公開號2008/0064049及美國專利公開號2008/0178305。
在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑可調節血管生成。在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑可調節體內血管生成(例如於異種移植小鼠模型及/或於罹患癌之人體內)。在某些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑可抑制血管生成。在某些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑可促進異常血管生成。在某些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑可抑制血管生成及/或促進異常血管生成，導致非生產性血管分布。
在某些實施態樣中，此處描述之VEGF/DLL4結合劑於小鼠、長尾獼猴(cynomolgus monkey)或人體內具有至少約2小時、至少約5小時、至少約10小時、至少約24小時、至少約3天、至少約1週、或至少約2週之循環半衰期。在某些實施態樣中，此處描述之VEGF/DLL4結合劑係IgG(例如IgG1或IgG2)抗體，其於小鼠、長尾獼猴或人體內具有至少約2小時、至少約5小時、至少約 10小時、至少約24小時、至少約3天、至少約1週、或至少約2週之循環半衰期。增加(或減少)劑諸如多肽及抗體之半衰期之方法係該領域所知。舉例來說，增加IgG抗體循環半衰期之已知方法包括導入突變至Fc區，此增加pH 6.0時抗體對新生兒Fc受體(FcRn)之pH依賴性結合(見例如美國專利公開號2005/0276799、2007/0148164及2007/0122403)。增加缺乏Fc區之抗體片段的循環半衰期之已知方法包括像是PEG化之技術。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係抗體。多株抗體可利用任何已知之方法製備。在一些實施態樣中，多株抗體係藉由以感興趣之抗原(例如經純化之肽片段、全長重組蛋白或融合蛋白)藉由多重皮下或腹腔內注射之方式免疫動物(例如兔、大鼠、小鼠、山羊、驢)產製。該抗原可任意選擇地與載劑共軛，諸如鑰孔狀帽貝血藍素(KLH)或血清白蛋白。該抗原(不論有無載劑蛋白質)係經無菌鹽水稀釋，且通常與佐劑(例如完全或不完全弗氏(Freund’s)佐劑)組合以形成穩定乳液。在經過足夠時間後，自經免疫之動物(通常是血液或腹水中)回收多株抗體。該多株抗體可根據該領域之標準方法自血清或腹水純化，該等方法包括但不限於親和性層析、離子交換層析、膠體電泳及透析。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係單株抗體。單株抗體可利用該領域之技藝人士已知之雜交瘤方法製備(見例如Kohler and Milstein,1975,Nature,256：495- 497)。在一些實施態樣中，使用雜交瘤方法係將小鼠、倉鼠或其他適當之宿主動物經上述方法免疫，以誘發淋巴細胞產製與該免疫抗原特異性結合之抗體。在一些實施態樣中，淋巴細胞可於試管內免疫。在一些實施態樣中，該免疫抗原可為人蛋白質或彼之部分。在一些實施態樣中，該免疫抗原可為小鼠蛋白質或彼之部分。
在免疫後，淋巴細胞係經分離，然後利用例如聚乙二醇與適當之骨髓瘤細胞系融合。該雜交瘤細胞係利用該領域已知之特殊培養基篩選，未融合之淋巴細胞及骨髓瘤細胞在篩選後不會存活。產製特異性拮抗選定抗原之單株抗體之雜交瘤可利用多種方法識別，該等方法包括但不限於免疫沉澱、免疫轉漬及試管內結合試驗(例如流式細胞分析、FACS、ELISA及放射性免疫測定)。該等雜交瘤可利用標準方法(J.W.Goding,1996,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,3rd Edition,Academic Press,San Diego,CA)於試管內培養增殖，或於體內例如動物之腹水腫瘤增殖。該單株抗體可根據該領域之標準方法自培養基或腹水液體純化，該等方法包括但不限於親和性層析、離子交換層析、膠體電泳及透析。
在某些實施態樣中，單株抗體可利用該領域之技藝人士已知之重組DNA技術製備。編碼單株抗體之多核苷酸係自成熟B細胞或雜交瘤細胞分離，像是藉由RT-PCR使用寡核苷酸引子以特異性擴增編碼該抗體之重鏈及輕鏈之基因，該等多核苷酸之序列係利用標準技術測定。該經分 離之編碼重鏈及輕鏈之多核苷酸接著被選殖至適當表現載體，該載體在轉染至原本不產製免疫球蛋白之宿主細胞諸如大腸桿菌(E.coli)、類人猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞後產製單株抗體。
在某些其他實施態樣中，重組單株抗體或彼之片段可自表現所欲物種之可變結構域或CDR之噬菌體展示庫分離(見例如McCafferty et al.,1990,Nature,348：552-554、Clackson et al.,1991,Nature,352：624-628及Marks et al.,1991,J.Mol.Biol.,222：581-597)。
編碼單株抗體之多核苷酸可藉由例如使用重組DNA技術改質以產製可供選擇之抗體。在一些實施態樣中，例如小鼠單株抗體之輕鏈及重鏈之恆定結構域可被例如人抗體之該些區域取代以產製嵌合抗體，或以非免疫球蛋白多肽取代以產製融合抗體。在一些實施態樣中，該等恆定區係經截短或移除以產製所欲之單株抗體之抗體片段。可變區之定點或高密度突變形成可被用於最佳化單株抗體之特異性、親和性等。
在一些實施態樣中，拮抗VEGF及/或DLL4之單株抗體係人化抗體。通常，人化抗體係其中源自CDR之殘基經源自具有所欲特異性、親和性及/或結合能力之非人物種(例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠等)之CDR的殘基取代之人免疫球蛋白，該取代係利用該領域之技藝人士已知之方法進行。在一些實施態樣中，人免疫球蛋白之Fv架構區殘基係由具有所欲特異性、親和性及/或結合能力之非 人物種之抗體的對應殘基取代。在一些實施態樣中，人化抗體可進一步藉由取代Fv架構區及/或該經取代之非人殘基內之額外殘基加以修飾，以精進優化抗體特異性、親和性及/或能力。通常，人化抗體將包含實質上所有之至少一個且通常兩或三個可變結構域，該可變結構域包含所有或實質上所有之對應該非人免疫球蛋白之CDR，然而所有或實質上所有之架構區係具有人免疫球蛋白共同序列之架構區。在一些實施態樣中，人化抗體亦可包含至少部分之免疫球蛋白恆定區或恆定結構域(Fc)，通常為人免疫球蛋白之該部分。在某些實施態樣中，該等人化抗體係用於治療用途，因為當投予至人個體時它們可能減少抗原性及HAMA(人抗小鼠抗體)反應。該領域之技藝人士將能遵循已知技術獲得具有減少免疫原性之功能性人化抗體(見例如美國專利第5,225,539、5,585,089、5,693,761及5,693,762號)。
在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係人抗體。人抗體可利用該領域已知之多種技術直接製備。在一些實施態樣中，人抗體可自試管內免疫之永生化人B淋巴細胞產製或自經免疫之個體分離之淋巴細胞產製。不論何種情況，產製直接拮抗標靶抗原之抗體的細胞可被製造及分離(見例如Cole et al.,1985,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77；Boemer et al.,1991,J.Immunol.,147：86-95；及美國專利第5,750,373、5,567,610及5,229,275號)。在一些實施態樣中，該人抗 體可選自噬菌體分子庫，其中該噬菌體分子庫表現人抗體(Vaughan et al.,1996,Nature Biotechnology,14：309-314；Sheets et al.,1998,PNAS,95：6157-6162；Hoogenboom and Winter,1991,J.Mol.Biol.,227：381；Marks et al.,1991,J.Mol.Biol.,222：581)。或者，噬菌體展示技術可被用來自未經免疫接種之捐贈者的免疫球蛋白可變區結構域基因庫試管內產製人抗體及抗體片段。產製及使用抗體噬菌體庫之技術亦描述於美國專利第5,969,108、6,172,197、5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915、6,593,081、6,300,064、6,653,068、6,706,484及7,264,963號，及Rothe et al.,2008,J.Mol.Bio.,376：1182-1200。一旦抗體係經識別，該領域已知之親和性成熟策略包括但不限於鏈洗牌(chain shuffling)(Marks et al.,1992,Bio/Technology,10：779-783)及定點突變形成可被用於產製高親和性人抗體。
在一些實施態樣中，人抗體可於包含人免疫球蛋白基因座之基因轉殖小鼠中製備。經免疫後，這些小鼠可產製整套人抗體而不產製內源性免疫球蛋白。此方法係於美國專利第5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425及5,661,016號中描述。
本發明亦包含雙特異性抗體。雙特異性抗體可特異性辨識及結合至少二種不同抗原或表位。不同表位可位於相同分子內(例如二個表位位於單一蛋白質上)或位於不同分子上(例如一表位位於一蛋白質上，一表位位於第二蛋 白質上)。在一些實施態樣中，雙特異性抗體相較於個別抗體或超過一種抗體之組合具有增強之效力。在一些實施態樣中，雙特異性抗體相較於個別抗體或超過一種抗體之組合具有減少之毒性。該領域之技藝人士已知的是任何結合劑(例如抗體)可能具有獨特之藥物動力學(PK)(例如循環半衰期)。在一些實施態樣中，雙特異性抗體具有同步兩種活性結合劑之PK之能力，其中該兩種個別結合劑具有不同PK特性。在一些實施態樣中，雙特異性抗體具有集中兩種結合劑(例如抗體)之作用於相同區域(例如腫瘤及/或腫瘤環境)之能力。在一些實施態樣中，雙特異性抗體具有集中兩種結合劑(例如抗體)之作用於相同標靶(例如腫瘤及/或腫瘤細胞)之能力。在一些實施態樣中，雙特異性抗體具有使兩種結合劑(例如抗體)之作用以超過一種生物途徑或功能為標靶之能力。
在某些實施態樣中，該雙特異性抗體與VEGF及第二標靶特異性結合。在某些實施態樣中，該雙特異性抗體與DLL4及第二標靶特異性結合。在某些實施態樣中，該雙特異性抗體與VEGF及DLL4特異性結合。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體與人VEGF及人DLL4特異性結合。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體係單株人或人化抗體。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體抑制血管生成及減少癌幹細胞之數量或頻率。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體抑制血管生長及抑制血管成熟。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體預防內皮過度增生。在一些實施態 樣中，該雙特異性抗體具有減少之毒性及/或不良反應。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體相較於二種個別抗體之混合物或作為單一劑之抗體具有減少之毒性及/或不良反應。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體具有增加之治療指數。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體相較於二種個別抗體之混合物或作為單一劑之抗體具有增加之治療指數。
在一些實施態樣中，該雙特異性抗體可特異性辨識及結合第一抗原標靶(例如DLL4)及第二抗原標靶像是在淋巴細胞上之效應分子(例如CD2、CD3、CD28或B7)或Fc受體(例如CD64、CD32或CD16)以使細胞性防禦機制集中於表現第一抗原標靶之細胞。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體可被用於引導細胞毒性劑至表現特定標靶抗原之細胞。這些抗體具有抗原結合部位(例如拮抗人DLL4)及與細胞毒性劑或放射性核種螯合劑諸如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA結合之第二部位。
製備雙特異性抗體之技術係該領域之技藝人士所知，見例如Millstein et al.,1983,Nature,305：537-539；Brennan et al.,1985,Science,229：81；Suresh et al.,1986,Methods in Enzymol.,121：120；Traunecker et al.,1991,EMBO J.,10：3655-3659；Shalaby et al.,1992,J.Exp.Med.,175：217-225；Kostelny et al.,1992,J.Immunol.,148：1547-1553；Gruber et al.,1994,J.Immunol.,152：5368；美國專利第5,731,168號；國際公開 號WO 2009/089004及美國專利公開號2011/0123532。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體包含在兩個重鏈之間的介面部分具有胺基酸修飾之重鏈恆定區。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體可利用「突點對應孔洞」策略產製(見例如美國專利第5,731,168號；Ridgway et.al.,1996,Prot.Engin.,9：617-621)。有時「突點」及「孔洞」之用語係以「隆突」及「空腔」取代。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體可能包含無法在重鏈之間形成雙硫鍵接之變異絞鏈區(見例如WO 2006/028936)。在一些實施態樣中，該等修飾可能包含胺基酸之改變，該等胺基酸之改變導致不同之靜電交互作用。在一些實施態樣中，該等修飾可能包含胺基酸之改變，該等胺基酸之改變導致不同之疏水性/親水性交互作用。
雙特異性抗體可為完整抗體或包含抗原結合部位之抗體片段。本發明亦考慮超過兩價之抗體。例如，可製備三特異性抗體(Tutt et al.,1991,J.Immunol.,147：60)。因此，在某些實施態樣中，拮抗VEGF及/或DLL4之抗體係多特異性。
在某些實施態樣中，此處描述之抗體(或其他多肽)可為單特異性。在某些實施態樣中，抗體所包含之一或多個抗原結合部位之各者係能結合不同蛋白質上之同源性表位。
在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係抗體片段。抗體片段可具有與完整抗體不同之功能或能力，例如 抗體片段可具有增加之腫瘤穿透。已知用於產製抗體片段之各種技術包括但不限於完整抗體之蛋白水解消化。在一些實施態樣中，抗體片段包括由胃蛋白酶消化抗體分子所產製之F(ab')2片段。在一些實施態樣中，抗體片段包括藉由減少F(ab')2片段之雙硫鍵所產製之Fab片段。在其他實施態樣中，抗體片段包括藉由以木瓜酶及還原劑處理抗體分子所產製之Fab片段。在某些實施態樣中，抗體片段係經重組產製。在一些實施態樣中，抗體片段包括Fv或單鏈Fv(scFv)片段。Fab、Fv及scFv抗體片段可在大腸桿菌或其他宿主細胞中表現及分泌，允許大量產製這些片段。在一些實施態樣中，抗體片段係自如此處討論之抗體噬菌體庫分離。舉例來說，可利用方法建構Fab表現庫(Huse et al.,1989,Science,246：1275-1281)以允許快速有效地識別對VEGF及/或DLL4具有所欲特異性之單株Fab片段或彼之衍生物、片段、類似物或同源物。在一些實施態樣中，抗體片段係線性抗體片段。在某些實施態樣中，抗體片段係單特異性或雙特異性。在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係scFv。各種技術可被用於產製對VEGF或DLL4具有特異性之單鏈抗體(見例如美國專利第4,946,778號)。
另外所欲的是(尤其是以抗體片段為例)修飾抗體以改變(例如增加或減少)彼之血清半衰期。此可藉由例如使抗體片段中之適當區域發生突變以納入救援受體結合表位至抗體片段中達成，或藉由將該表位納入肽標籤中然後 使該肽標籤與抗體片段之末端或中間融合(例如藉由DNA或肽合成)達成。
異源共軛抗體亦屬於本發明之範圍內。異源共軛抗體係由二個共價連接之抗體組成。該等抗體被計劃用於例如使免疫細胞以非所欲之細胞為標靶(見例如美國專利第4,676,980號)。亦考慮到該等異源共軛抗體可利用已知之合成蛋白質化學方法於試管內製備，包括該些涉及交聯劑之方法。舉例來說，免疫毒素可利用雙硫交換反應或藉由形成硫醚鍵加以建構。為達此目的之適當試劑實例包括亞胺基硫醇鹽及甲基-4-巰基丁亞胺酸酯。
就本發明之目的而言，應了解的是經改質之抗體可包含任何類型之提供該抗體與標靶(即人VEGF或人DLL4)連接之可變區。在這方面，該可變區可包含或衍生自任何種類之可被誘導以啟動體液性反應及產製拮抗該所欲抗原之免疫球蛋白之哺乳動物。因此，該經改質之抗體之可變區可為例如人、小鼠、非人靈長動物(例如長尾獼猴(cynomolgus monkey)、獼猴等)或兔來源。在一些實施態樣中，該經改質之免疫球蛋白之可變區及恆定區皆為人來源。在其他實施態樣中，相容性抗體之可變區(通常源自非人來源)可經工程化或特別改質以促進該分子之結合特性或減少免疫原性。在這方面，可用於本發明之可變區可經人化或藉由納入輸入胺基酸序列以另行改變。
在某些實施態樣中，重鏈及輕鏈之可變結構域係藉由 至少部分取代一或多個CDR及(若需要的話)部分取代架構區及序列修飾及/或改變加以改變。雖然CDR可能源自與架構區來源之抗體相同類型或甚至相同亞型之抗體，一般設想CDR可能源自不同類型之抗體且通常源自不同物種之抗體。要轉移一可變結構域之抗原結合能力至另一可變結構域不一定需要將所有CDR取代成捐贈者可變區之所有CDR。相反地，可能只需要轉移該些維持抗原結合部位之活性所需之殘基即可。
儘管對可變區進行改變，該領域之技藝人士將了解，本發明之經改質之抗體將包含其中至少部分之一或多個恆定結構域已被刪除或以其他方式改變之抗體(例如全長抗體或彼之免疫反應性片段)以提供所欲之生化特徵，像是相較於包含原始或未經改變之恆定區之大約相同免疫原性之抗體具有增加之腫瘤定位或增加之血清半衰期。在一些實施態樣中，該經改質之抗體之恆定區將包含人恆定區。與本發明相容之恆定區修飾包含添加、刪除或取代一或多個結構域中之一或多個胺基酸。此處所揭示之經改質之抗體可能包含對三個重鏈恆定結構域之一或多者(CH1、CH2或CH3)及/或對輕鏈恆定結構域(CL)之改變或修飾。在一些實施態樣中，一或多個結構域係自該經改質之抗體的恆定區部分或全部刪除。在一些實施態樣中，該經改質之抗體將包含其中整個CH2結構域被移除之結構域刪除建構體或變異體(△CH2建構體)。在一些實施態樣中，該缺少之恆定區結構域係由短胺基酸間隔子(例如10 個胺基酸殘基)取代，以提供通常由該缺少恆定區授予之一些分子柔韌性。
在一些實施態樣中，該經改質之抗體係經工程化以直接融合CH3結構域與該抗體之絞鏈區。在其他實施態樣中，肽間隔子被插入絞鏈區與經修飾之CH2及/或CH3結構域之間。舉例來說，其中CH2結構域被刪除且剩餘之CH3結構域(經修飾或未經修飾)係以5至20個胺基酸間隔子與絞鏈區連接之建構體可被表現。該間隔子可被添加以確保恆定區之調節元件維持自由及可接近，或該絞鏈區維持可彎折。然而，應注意胺基酸間隔子在一些情況中可能證實具有免疫原性，且誘發拮抗該建構體之非所欲免疫反應。因此，在某些實施態樣中，任何添加至建構體之間隔子將為相對非免疫原性，以維持該經改質之抗體之所欲生物性質。
在一些實施態樣中，該經改質之抗體可能僅具有部分建構體結構域刪除或取代少數或甚至單一個胺基酸。舉例來說，在CH2結構域之選擇區域中之單一胺基酸突變可能足以實質上減少Fc結合，因此增加癌細胞定位及/或腫瘤穿透。類似地，可能可行的是單純刪除該一或多個恆定區結構域中控制所欲調節之特定效應功能(例如補體C1q結合)之部分。該恆定區之部分刪除可增進該抗體之選擇特性(血清半衰期)，同時保留其他與該主題恆定區結構域完整有關之所欲功能。另外，如上所述，該揭示抗體之恆定區可經由一或多個胺基酸之突變或取代改質以增進該形 成建構物之特性。在這方面可能擾亂由保守性結合位點所提供之活性(例如Fc結合)，然而實質上維持該經改質之抗體的構造及免疫原性特性。在某些實施態樣中，該經改質之抗體包含添加一或多個胺基酸至恆定區以增進所欲特徵諸如減少或增加效應功能或提供更多細胞毒素或碳水化合物連接位點。
該領域已知的是恆定區媒介數種效應功能。舉例來說，補體之C1成分與(結合至抗原之)IgG或IgM抗體之Fc區結合活化該補體系統。補體活化於細胞病原體之調理作用及溶解中至為重要。補體活化亦刺激發炎反應，且亦與自體免疫超敏性有關。此外，抗體之Fc區可與表現Fc受體(FcR)之細胞結合。有一些Fc受體對不同類型之抗體具有特異性，包括IgG(γ受體)、IgE(ε受體)、IgA(α受體)及IgM(μ受體)。抗體與細胞表面上之Fc受體結合引發多種重要且多變之生物反應，包括吞噬及破壞抗體包覆顆粒、清空免疫複合物、藉由殺手細胞溶解經抗體包覆之標靶細胞(稱為抗體依賴性細胞細胞毒性或ADCC)、釋放發炎介質、胚胎轉移及控制免疫球蛋白之產製。
在某些實施態樣中，該經改質之抗體具有經改變之效應功能，該經改變之效應功能因此影響該投予抗體之生物特性。舉例來說，在一些實施態樣中，刪除或不活化(經由點突變或其他方法)恆定區結構域可能減少循環中經改質之抗體與Fc受體結合，因此增加癌細胞定位及/或腫瘤 穿透。在其他實施態樣中，恆定區修飾增加抗體之血清半衰期。在其他實施態樣中，恆定區修飾減少抗體之血清半衰期。在一些實施態樣中，恆定區係經修飾以消除雙硫鍵或寡糖基團。根據本發明之恆定區修飾可利用該領域之技藝人士廣為周知之生化或分子工程技術輕易進行。
在某些實施態樣中，其係抗體之VEGF/DLL4結合劑不具有一或多種效應功能。例如在一些實施態樣中，該抗體不具ADCC活性及/或不具補體依賴性細胞毒性(CDC)活性。在某些實施態樣中，該抗體不與Fc受體及/或補體因子結合。在某些實施態樣中，該抗體不具效應功能。
本發明另包含實質上與此處前述之嵌合抗體、人化抗體、人抗體或彼等之抗體片段同源之變異體及相等物。這些可包含例如保守性取代突變，即以類似胺基酸取代一或多個胺基酸。例如，保守性取代係指以同一大類之胺基酸取代另一胺基酸，像是例如以一酸性胺基酸取代另一酸性胺基酸、以一鹼性胺基酸取代另一鹼性胺基酸或以一中性胺基酸取代另一中性胺基酸。保守性胺基酸取代之目的係該領域廣為周知並於此處描述。
因此，本發明提供產製與VEGF及/或DLL4結合之抗體之方法，包括與VEGF及DLL4兩者特異性結合之雙特異性抗體。在一些實施態樣中，用於產製與VEGF及/或DLL4結合之抗體之方法包含利用雜交瘤技術。在一些實施態樣中，產製與VEGF或DLL4結合之抗體或與VEGF及DLL4結合之雙特異性抗體之方法包含篩選人噬菌體 庫。本發明另提供識別與VEGF及/或DLL4結合之抗體之方法。在一些實施態樣中，該抗體係藉由FACS篩選與VEGF或彼之部分之結合加以識別。在一些實施態樣中，該抗體係藉由FACS篩選與DLL4或彼之部分之結合加以識別。在一些實施態樣中，該抗體係藉由FACS篩選與VEGF及DLL4兩者或彼等之部分之結合加以識別。在一些實施態樣中，該抗體係藉由利用ELISA篩選與VEGF結合加以識別。在一些實施態樣中，該抗體係藉由利用ELISA篩選與DLL4結合加以識別。在一些實施態樣中，該抗體係藉由利用ELISA篩選與VEGF及DLL4結合加以識別。在一些實施態樣中，該抗體係藉由FACS篩選人VEGF與人VEGF受體結合之阻斷加以識別。在一些實施態樣中，該抗體係藉由FACS篩選人DLL4與人缺口受體結合之阻斷加以識別。在一些實施態樣中，該抗體係藉由篩選對缺口傳訊之抑制或阻斷加以識別。在一些實施態樣中，該抗體係藉由篩選對VEGF活性(例如誘導HUVEC增生)之抑制或阻斷加以識別。在一些實施態樣中，該抗體係藉由篩選對血管生成之調節加以識別。
在一些實施態樣中，產製抗人VEGF之抗體之方法包含以包含人VEGF之胺基酸27至232之多肽免疫哺乳動物。在一些實施態樣中，產製抗人VEGF之抗體之方法包含以包含至少部分之人VEGF之胺基酸27至232的多肽免疫哺乳動物。在一些實施態樣中，該方法另包含自該哺乳動物分離抗體或抗體產製細胞。在一些實施態樣中，產 製與VEGF結合之單株抗體之方法包含：以包含至少部分之人VEGF之胺基酸27至232的多肽免疫哺乳動物，及自該經免疫之哺乳動物分離抗體產製細胞。在一些實施態樣中，該方法另包含使該抗體產製細胞與骨髓瘤細胞系之細胞融合以形成雜交瘤細胞。在一些實施態樣中，該方法另包含篩選表現與VEGF結合之抗體之雜交瘤細胞。在某些實施態樣中，該哺乳動物係小鼠。在一些實施態樣中，該抗體係利用包含至少部分之人VEGF之胺基酸27至232的多肽篩選。
在一些實施態樣中，產製抗人DLL4之抗體之方法包含以包含人DLL4之胺基酸27至529之多肽免疫哺乳動物。在一些實施態樣中，產製抗人DLL4之抗體之方法包含以包含至少部分之人DLL4之胺基酸27至529的多肽免疫哺乳動物。在一些實施態樣中，產製與DLL4結合之單株抗體之方法包含：以包含至少部分之人DLL4之胺基酸27至529的多肽免疫哺乳動物，及自該經免疫之哺乳動物分離抗體產製細胞。在一些實施態樣中，該方法另包含使該抗體產製細胞與骨髓瘤細胞系之細胞融合以形成雜交瘤細胞。在一些實施態樣中，該方法另包含篩選表現與DLL4結合之抗體之雜交瘤細胞。在某些實施態樣中，該哺乳動物係小鼠。在一些實施態樣中，該抗體係利用包含至少部分之人DLL4之胺基酸27至529的多肽篩選。
在一些實施態樣中，產製抗人VEGF之抗體之方法包含在抗體表現庫中篩選與人VEGF結合之抗體。在一些實 施態樣中，產製抗人DLL4之抗體之方法包含在抗體表現庫中篩選與人DLL4結合之抗體。在一些實施態樣中，產製抗人VEGF及/或人DLL4之抗體之方法包含在抗體表現庫中篩選與人VEGF及人DLL4結合之雙特異性抗體。在一些實施態樣中，該抗體表現庫係噬菌體庫。在一些實施態樣中，該篩選包含篩選(panning)。在一些實施態樣中，該抗體表現庫(例如噬菌體庫)係利用至少部分之人VEGF之胺基酸27至232篩選。在一些實施態樣中，在初次篩選被識別之抗體再次利用至少部分之人DLL4之胺基酸27至529篩選以識別與VEGF及DLL4結合之雙特異性抗體。在一些實施態樣中，該抗體表現庫(例如噬菌體庫)係利用至少部分之人DLL4之胺基酸27至529篩選。在一些實施態樣中，在初次篩選被識別之抗體再次利用至少部分之人VEGF之胺基酸27至232篩選以識別與VEGF及DLL4結合之雙特異性抗體。在一些實施態樣中，在篩選中被識別之抗體係VEGF拮抗劑。在一些實施態樣中，在篩選中被識別之抗體抑制由VEGF誘導之生物活性。在一些實施態樣中，在篩選中被識別之抗體係DLL4拮抗劑。在一些實施態樣中，在篩選中被識別之抗體抑制由DLL4誘導之缺口傳訊。在一些實施態樣中，在篩選中被識別之抗體與人VEGF及小鼠VEGF兩者結合。在一些實施態樣中，在篩選中被識別之抗體與人DLL4及小鼠DLL4兩者結合。
在某些實施態樣中，此處所述之抗體係經分離。在某 些實施態樣中，此處所述之抗體係實質上純的。
在本發明之一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係多肽。該多肽可為包含與VEGF及/或DLL4結合之抗體或彼之片段之重組多肽、天然多肽或合成多肽。該領域將同意此處所述之結合劑的一些胺基酸序列可變化而不會對該蛋白質之結構或功能造成顯著影響。因此，本發明另包括多肽之變異體，該變異體顯示實質活性或包括拮抗人VEGF及/或DLL4之抗體之區域或彼等之片段。在一些實施態樣中，VEGF/DLL4結合多肽之胺基酸序列變異體包括刪除、插入、倒位、重複及/或其他類型之取代。
在一些實施態樣中，此處所述之多肽係經分離。在一些實施態樣中，此處所述之多肽係實質上純的。
該多肽、類似物及彼等之變異體可另經改質以包含正常非該多肽之部分的額外化學基團。該等衍生化基團可增進或以其他方式調節該多肽之溶解性、生物半衰期及/或吸收。該等基團亦可減少或消除該多肽及變異體之非所欲之不良反應。有關化學基團之介紹可見Remington：The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,2005,University of the Sciences,Philadelphia,PA.
此處所述之多肽可藉由該領域已知之任何適當方法產製。該等方法從直接蛋白質合成方法至建構編碼多肽序列之DNA序列及在適當宿主中表現該等序列皆可。在一些實施態樣中，DNA序列係利用重組技術建構，其藉由分離或合成編碼感興趣之野生型蛋白質之DNA序列。可任意 選擇地，該序列可藉由定點突變形成突變以提供彼之功能性類似物。見例如Zoeller et al.,1984,PNAS,81：5662-5066及美國專利第4,588,585號。
在一些實施態樣中，編碼感興趣之多肽之DNA序列可藉由化學合成利用寡核苷酸合成器建構。寡核苷酸可根據該所欲多肽之胺基酸序列設計，並選擇該些將產製感興趣重組多肽之宿主細胞所偏好之密碼子。標準方法可被用於合成編碼經分離之感興趣多肽之多核苷酸序列。舉例來說，完全胺基酸序列可被用於建構反轉譯基因。另外，可合成包含編碼經分離之特定多肽之核苷酸序列之DNA寡聚體。例如，多個編碼該所欲多肽之部分的小型寡核苷酸可被合成然後連接。個別寡核苷酸通常包含5'或3'懸端以用於互補組裝。
一經組裝(藉由合成、定點突變形成或其他方法)，該編碼感興趣之特定多肽之多核苷酸序列可被插入表現載體並可操作性連接適合該蛋白質於所欲宿主內表現之表現控制序列。適當組裝可藉由核苷酸定序、限制酶定位及/或於適當宿主內表現生物活性多肽證實。如該領域所廣為周知，為了在宿主內獲得高表現量之經轉染之基因，該基因必須可操作性連接在選定之表現宿主內具功能性之轉錄及轉譯表現控制序列。
在某些實施態樣中，重組表現載體被用於擴增及表現拮抗人VEGF及/或DLL4之DNA編碼抗體或彼之片段。舉例來說，重組表現載體可為可複製之DNA建構體，其 具有與適當轉錄及/或轉譯調節元件可操作性連接之編碼VEGF/DLL4結合劑(諸如抗VEGF抗體或抗DLL4抗體或彼之片段)之多肽鏈的合成性或cDNA衍生性DNA片段，該調節元件係源自哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因。轉錄單位通常包含下列之組合：(1)於基因表現中具有調節作用之基因元件，例如轉錄啟動子或增強子，(2)經轉錄成mRNA然後轉譯成蛋白質之結構或編碼序列，及(3)適當之轉錄及轉譯啟動及終止序列。調節元件可包括操作子序列以控制轉錄。通常由複製起點授予之於宿主內複製之能力及有利轉形物辨識之選擇基因可被額外納入。DNA區係「可操作性連接」當它們彼此之間係功能性相關。舉例來說，信號肽之DNA(分泌前導序列)係可操作性連接多肽之DNA，若其被表現為參與該多肽分泌之前體；啟動子係可操作性連接編碼序列，若其控制該序列之轉錄；或核糖體結合位點係可操作性連接編碼序列，若其位置係為了允許轉譯。在一些實施態樣中，適用於酵母菌表現系統之結構元件包括使宿主細胞得以胞外分泌經轉譯之蛋白質之前導序列。在其他實施態樣中，當重組蛋白質係於無前導或轉運序列存在時表現之情況中，其可包括N端甲硫胺酸殘基。此殘基之後可任意選擇地與該經表現之重組蛋白質切開以提供最終產物。
表現控制序列及表現載體之選擇取決於宿主選擇。多樣化之表現宿主/載體組合可被採用。可用於真核宿主之表現載體包括例如包含源自SV40、牛乳頭狀瘤病毒、腺 病毒及巨細胞病毒之表現控制序列之載體。可用於細菌宿主之表現載體包括已知之細菌質體，像是源自大腸桿菌之質體(包括pCR1、pBR322、pMB9及彼等之衍生物)，及廣泛宿主範圍質體像是M13及其他絲狀單股DNA噬菌體。
本發明之VEGF/DLL4結合劑(例如多肽)可由一或多個載體表現。例如在一些實施態樣中，一重鏈多肽係由一載體表現，第二重鏈多肽係由第二載體表現，且輕鏈多肽係由第三載體表現。在一些實施態樣中，第一重鏈多肽及輕鏈多肽係由一載體表現，且第二重鏈多肽係由第二載體表現。在一些實施態樣中，二條重鏈多肽係由一載體表現，且輕鏈多肽係由第二載體表現。在一些實施態樣中，三條多肽係由一載體表現。因此，在一些實施態樣中，第一重鏈多肽、第二重鏈多肽及輕鏈多肽係由單一載體表現。
用於表現VEGF/DLL4結合多肽或抗體(或用來作為抗原之VEGF或DLL4蛋白質)之適當宿主細胞包括原核生物、酵母菌細胞、昆蟲細胞或在適當啟動子控制下之高級真核細胞。原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性有機體，例如大腸桿菌(E.coli)或桿菌(Bacillus)。高級真核細胞包括如下所述之哺乳動物來源之株化細胞系。不含細胞之轉譯系統亦可被採用。適用於細菌性、真菌性、酵母菌性及哺乳動物細胞性宿主之適當選殖及表現載體係描述於Pouwels et al.,1985,Cloning Vectors：A Laboratory Manual,Elsevier,New York,NY。有關蛋白質產製(包括抗體產製)方法之額外資訊可見於例如美國專利公開號2008/0187954；美國專利第6,413,746、6,660,501號；及國際專利公開號WO 04/009823。
多種哺乳動物或昆蟲細胞培養系統可被用於表現重組多肽。於哺乳動物細胞中表現重組蛋白質係為所欲，因為這些蛋白質通常經過正確折疊、適當改質且具生物功能性。適當哺乳動物宿主細胞系之實例包括但不限於COS-7(猴腎來源)、L-929(小鼠纖維母細胞來源)、C127(小鼠乳房腫瘤來源)、3T3(小鼠纖維母細胞來源)、CHO(中國倉鼠卵巢來源)、HeLa(人子宮頸癌來源)、BHK(倉鼠腎纖維母細胞來源)、HEK-293(人胚胎腎來源)細胞系及這些細胞系之變異株。哺乳動物表現載體可包含非轉錄元件(諸如複製起點、與所欲表現之基因相連之適當啟動子及增強子，及其他5'或3'側翼非轉錄序列)及5'或3'非轉譯序列(諸如必要之核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供點及受點，及轉錄終止序列)。於桿狀病毒(baculovirus)中表現重組蛋白質亦提供產製正確摺疊及具生物功能之蛋白質之強健方法。用於在昆蟲細胞中產製異源性蛋白質之桿狀病毒系統係該領域之技藝人士所廣為周知(見例如Luckow and Summers,1988,Bio/Technology,6：47)。
因此，本發明提供包含此處所述之VEGF/DLL4結合劑之細胞。在一些實施態樣中，該等細胞產製此處所述之 VEGF/DLL4結合劑。在某些實施態樣中，該等細胞產製抗體。在一些實施態樣中，該等細胞產製VEGF結合劑，諸如抗VEGF抗體。在一些實施態樣中，該等細胞產製與VEGF結合之雙特異性抗體。在一些實施態樣中，該等細胞產製DLL4結合劑，諸如抗DLL4抗體。在一些實施態樣中，該等細胞產製與DLL4結合之雙特異性抗體。在某些實施態樣中，該等細胞產製雙特異性VEGF/DLL4結合劑，諸如與VEGF及DLL4結合之雙特異性抗體。在某些實施態樣中，該等細胞產製抗體219R45。在某些實施態樣中，該等細胞產製抗體21R79。在某些實施態樣中，該等細胞產製抗體21R75。在某些實施態樣中，該等細胞產製抗體21R83。在某些實施態樣中，該等細胞產製包含源自抗體219R45之抗原結合部位之雙特異性抗體。在某些實施態樣中，該等細胞產製包含源自抗體21R79之抗原結合部位之雙特異性抗體。在某些實施態樣中，該等細胞產製包含源自抗體21R75之抗原結合部位之雙特異性抗體。在某些實施態樣中，該等細胞產製包含源自抗體21R83之抗原結合部位之雙特異性抗體。在某些實施態樣中，該等細胞產製包含源自抗體219R45之抗原結合部位及源自抗體21R79之抗原結合部位之雙特異性抗體。在某些實施態樣中，該等細胞產製包含源自抗體219R45之抗原結合部位及源自抗體21M18之抗原結合部位之雙特異性抗體。在某些實施態樣中，該等細胞產製包含源自抗體219R45之抗原結合部位及源自抗體21R75之抗原結合部位之雙特異 性抗體。在某些實施態樣中，該等細胞產製包含源自抗體219R45之抗原結合部位及源自抗體21R83之抗原結合部位之雙特異性抗體。在某些實施態樣中，該等細胞產製雙特異性抗體219R45-MB-21M18。在某些實施態樣中，該等細胞產製雙特異性抗體219R45-MB-21R79。在某些實施態樣中，該等細胞產製雙特異性抗體219R45-MB-21R75。在某些實施態樣中，該等細胞產製雙特異性抗體219R45-MB-21R83。
由經轉形之宿主產製之蛋白質可根據任何適當方法純化。標準方法包括層析(例如離子交換、親和性及尺寸柱層析)、離心、差別溶解或藉由任何其他用於蛋白質純化之標準技術。親和性標籤諸如六組胺酸、麥芽糖結合結構域、流感外套序列及麩胱甘肽-S-轉移酶可被連接至該蛋白質以允許藉由通過適當親和性管柱之輕易純化。用於純化免疫球蛋白之親和性層析可包括蛋白質A、蛋白質G及蛋白質L層析。經分離之蛋白質可經物理特徵化，使用像是蛋白水解、大小排除層析(SEC)、質譜分析(MS)、核磁共振(NMR)、等電點沉澱(IEF)、高效液相層析(HPLC)及x光結晶之技術。經分離之蛋白質之純度可利用該領域之技藝人士已知之技術測定，該等技術包括但不限於SDS-PAGE、SEC、毛細管膠體電泳、IEF及毛細管等電點沉澱(cIEF)。
在一些實施態樣中，源自分泌重組蛋白質至培養基之表現系統的上清液可利用商用蛋白質濃縮過濾器先行濃 縮，例如使用阿密康(Amicon)或密里博(Millipore)Pellicon超過濾單位濃縮。在濃縮步驟之後，該濃縮液可被加至適當純化基材。在一些實施態樣中，可採用陰離子交換樹脂，例如具有二乙基胺基乙基(DEAE)懸掛基團之基材或基質。該基材可為丙烯醯胺、洋菜糖、葡聚糖、纖維素或其他常用於蛋白質純化之基材。在一些實施態樣中，可採用陽離子交換步驟。適當之陽離子交換基材包括包含磺丙基或羧甲基之各種不可溶基材。在一些實施態樣中，可採用羥磷灰石基質，包括但不限於陶瓷羥磷灰石(CHT)。在某些實施態樣中，一或多種應用疏水性逆相HPLC基質(例如具有懸掛甲基或其他脂肪族基團之矽膠)之逆相HPLC步驟可被採用以進一步純化重組蛋白質(例如VEGF/DLL4結合劑)。上述之一些或所有純化步驟之各種組合可被應用以提供均質性重組蛋白質。
在一些實施態樣中，異二聚體蛋白質諸如雙特異性抗體係根據此處所述之任何方法純化。在一些實施態樣中，抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體係利用至少一種層析步驟分離及/或純化。在一些實施態樣中，該至少一種層析步驟包含親和性層析。在一些實施態樣中，該至少一種層析步驟另包含陰離子交換層析。在一些實施態樣中，該經分離及/或純化之抗體產物包含至少90%之異二聚抗體。在一些實施態樣中，該經分離及/或純化之抗體產物包含至少95%、96%、97%、98%或99%之異二聚抗體。在一些實施態樣中，該經分離及/或純化之抗體產物包含大約100% 之異二聚抗體。
在一些實施態樣中，於細菌培養中生產之重組蛋白質可被分離，例如藉由自細胞團塊初步萃取，接著進行一或多次濃縮、鹽析、水性離子交換或大小排除層析步驟。HPLC可被使用於最終純化步驟。用於表現重組蛋白質之微生物細胞可藉由任何方便方法破碎，包括冷凍解凍循環、超音波震盪、機械破碎或使用細胞溶解劑。
該領域已知之用於純化抗體及其他蛋白質之方法亦包括例如該些於美國專利公開號2008/0312425、2008/0177048及2009/0187005所述者。
在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係非抗體之多肽。用於識別及產製以高親和性與蛋白質標靶結合之非抗體多肽之各種方法係該領域所知。見例如Skerra,2007,Curr.Opin.Biotechnol.,18：295-304；Hosse et al.,2006,Protein Science,15：14-27；Gill et al.,2006,Curr.Opin.Biotechnol.,17：653-658；Nygren,2008,FEBS J.,275：2668-76及Skerra,2008,FEBS J.,275：2677-83。在某些實施態樣中，噬菌體或哺乳動物細胞展示技術可被用於生產及/或識別非抗體之VEGF/DLL4結合多肽。在某些實施態樣中，該多肽包含選自蛋白A、蛋白G、脂質運載蛋白(lipocalin)、纖維黏連蛋白結構域、錨蛋白(ankyrin)共同重複結構域或硫氧還蛋白類型之蛋白質支架。
在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑或抗體可 以數種共軛(即免疫共軛物或放射共軛物)或非共軛形式之任一者被使用。在某些實施態樣中，該等抗體可以非共軛形式被使用以駕馭個體之天然防禦機制，包括補體依賴性細胞毒性及抗體依賴性細胞毒性，以消滅惡性或癌細胞。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑(例如抗體或多肽)係與細胞毒性劑共軛。在一些實施態樣中，該細胞毒性劑係化學治療劑，包括但不限於甲胺喋呤(methotrexate)、甲烯土黴素(adriamicin)、多柔比星(doxorubicin)、黴法蘭(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、氯芥苯丁酸(chlorambucil)、正定黴素(daunorubicin)或其他插入劑。在一些實施態樣中，該細胞毒性劑係細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素及彼等之片段，包括但不限於白喉毒素A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素(abrin)A鏈、莫迪素(modeccin)A鏈、α-次黃嘌呤(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、瀉果素(curcin)、巴豆素(crotin)、肥皂草(saponaria officinalis)抑制劑、白樹毒素(gelonin)、絲裂膠素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及新月毒素(trichothecene)。在一些實施 態樣中，該細胞毒性劑係放射性同位素以產製放射共軛物或經放射共軛之抗體。多種放射性核種可用於產製經放射共軛之抗體，其包括但不限於90Y、125I、131I、123I、111In、131In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re、188Re及212Bi。本發明亦可使用抗體與一或多種小分子毒素之共軛物，該等毒素諸如卡利奇黴素(calicheamicins)、類美坦素(maytansinoids)、新月毒素(trichothecenes)、CC1065及具有毒素活性之該些毒素之衍生物。抗體與細胞毒性劑之共軛物可利用各種雙官能性蛋白偶合劑製備，包括但不限於N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、二亞胺環硫丁烷(IT)、亞胺酸酯之雙官能基衍生物(諸如己二亞胺二甲酯HCl)、活性酯之雙官能基衍生物(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺)、醛之雙官能基衍生物(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對-疊氮苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙-(對-重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如2,6-二異氰酸甲苯酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝苯)。
III.多核苷酸
在某些實施態樣中，本發明包含多核苷酸，該等多核苷酸包含編碼與VEGF、DLL4或VEGF及DLL4兩者特異性結合之多肽(或多肽之片段)的多核苷酸。用語「編碼多肽之多核苷酸」包含僅包括該多肽之編碼序列之多核苷 酸，以及包括額外之編碼及/或非編碼序列之多核苷酸。舉例來說，在一些實施態樣中，本發明提供包含編碼抗人VEGF之抗體或編碼該種抗體之片段(例如包含該抗原結合部位之片段)的多核苷酸序列之多核苷酸。在一些實施態樣中，本發明提供包含編碼抗人DLL4之抗體或編碼該種抗體之片段(例如包含該抗原結合部位之片段)的多核苷酸序列之多核苷酸。本發明之多核苷酸可為RNA之形式或DNA之形式。DNA包括cDNA、基因組DNA及合成性DNA；可為雙股或單股，若單股可為編碼股或非編碼(反義)股。
在某些實施態樣中，該多核苷酸包含編碼包含選自下列之序列之多肽的多核苷酸：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63及SEQ ID NO：64。在某些實施態樣中，該多核苷酸包含編碼包含選自下列之序列之多肽的多核苷酸：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：62及SEQ ID NO：64。在一些實施態樣中，該多核苷酸包含選自下列之 多核苷酸序列：SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73及SEQ ID NO：74。
在某些實施態樣中，該多核苷酸包含具有核苷酸序列之多核苷酸，該核苷酸序列與包含選自下列序列之多核苷酸具有至少約80%一致性、至少約85%一致性、至少約90%一致性、至少約95%一致性，且在一些實施態樣中至少約96%、97%、98%或99%一致性：SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73及SEQ ID NO：74。在某些實施態樣中，該多核苷酸包含具有核苷酸序列之多核苷酸，該核苷酸序列與包含選自下列序列之多核苷酸具有至少約80%一致性、至少約85%一致性、至少約90%一致性、至少約95%一致性，且在一些實施態樣中至少約96%、97%、98%或99%一致 性：SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73及SEQ ID NO：74。本發明亦提供包含與下列序列雜交之多核苷酸之多核苷酸：SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73及SEQ ID NO：74。在某些實施態樣中，該雜交係於高度嚴謹度條件下發生。
在某些實施態樣中，該等多核苷酸包含融合至多核苷酸之相同閱讀框的成熟多肽之編碼序列，該編碼序列有助於例如多肽自宿主細胞之表現及分泌(例如作為分泌序列以控制源自細胞之多肽之運輸的前導序列)。具有前導序列之多肽係前體蛋白，該前導序列可由宿主細胞切割以形成成熟形式之多肽。該等多核苷酸亦可編碼蛋白原，蛋白原係成熟蛋白質加上額外之5'胺基酸殘基。具有原序列(prosequence)之成熟蛋白質係蛋白原，其係不活化形式 之蛋白質。一旦原序列被切割後，剩下即為活性成熟蛋白質。
在某些實施態樣中，該多核苷酸包含融合至標誌序列之相同閱讀框的成熟多肽之編碼序列，以允許例如用於純化該經編碼之多肽。舉例來說，該標誌序列可為由PQE-9載體供應之六組胺酸標籤以提供在細菌宿主之例中用於純化與該標記融合之成熟多肽，或當使用哺乳動物宿主(例如COS-7細胞)時該標誌序列可為源自流感血球凝集素蛋白質之血球凝集素(HA)標籤。在一些實施態樣中，該標誌序列係FLAG標籤，即可與其他親和性標籤搭配使用之序列DYKDDDDK之肽(SEQ ID NO：45)。
本發明另關於上述多核苷酸編碼片段、類似物及/或衍生物之變異體。
在某些實施態樣中，本發明提供多核苷酸，該等多核苷酸包含具有核苷酸序列之多核苷酸，該核苷酸序列與編碼包含此處所述之VEGF/DLL4結合劑(例如抗體)或彼之片段之多肽的多核苷酸具有至少約80%一致性、至少約85%一致性、至少約90%一致性、至少約95%一致性，及在一些實施態樣中至少約96%、97%、98%或99%一致性。
如此處所使用之用語，具有與參考核苷酸序列至少例如95%「一致性」之核苷酸序列之多核苷酸係意圖表示該多核苷酸之核苷酸序列係與該參考序列相同，除了該多核苷酸序列可在該參考核苷酸序列之每100個核苷酸中包括 最多五個點突變。換言之，為了獲得具有與參考核苷酸序列至少95%一致性之核苷酸序列之多核苷酸，在參考序列中最多5%之核苷酸可被刪除或以另一核苷酸取代，或參考序列中總核苷酸數量之最多5%之核苷酸可被插入該參考序列中。這些參考序列之突變可發生在該參考核苷酸序列之5'或3'端位置或該些末端位置之間的任何位置，這些位置個自分散在參考序列之核苷酸之中或在參考序列內以一或多個連續族群存在。
多核苷酸變異體可包含編碼區、非編碼區或兩區中之改變。在一些實施態樣中，多核苷酸變異體包含產生靜默取代、添加或刪除之改變，但不改變該經編碼之多肽的性質或活性。在一些實施態樣中，多核苷酸變異體包含導致該多肽之胺基酸序列無改變之靜默取代(由於基因密碼之簡併)。多核苷酸變異體可為了多種原因產製，例如為了最佳化密碼子於特定宿主之表現(例如將人mRNA中之密碼子改變成該些細菌宿主諸如大腸桿菌所偏好之密碼子)。在一些實施態樣中，多核苷酸變異體在序列之非編碼或編碼區包含至少一個靜默突變。
在一些實施態樣中，多核苷酸變異體係經產製以調節或改變該經編碼之多肽的表現(或表現量)。在一些實施態樣中，多核苷酸變異體係經產製以增加該經編碼之多肽的表現。在一些實施態樣中，多核苷酸變異體係經產製以減少該經編碼之多肽的表現。在一些實施態樣中，多核苷酸變異體相較於親代多核苷酸序列增加該經編碼之多肽之 表現。在一些實施態樣中，多核苷酸變異體相較於親代多核苷酸序列減少該經編碼之多肽之表現。
在一些實施態樣中，至少一種多核苷酸變異體係經產製(不改變該經編碼之多肽的胺基酸序列)以增加異多聚分子之產製。在一些實施態樣中，至少一種多核苷酸變異體係經產製(不改變該經編碼之多肽的胺基酸序列)以增加雙特異性抗體之產製。
在某些實施態樣中，多核苷酸係經分離。在某些實施態樣中，多核苷酸係實質上純的。
本發明亦提供此處所述之包含該多核苷酸之載體及細胞。在一些實施態樣中，表現載體包含多核苷酸分子。在一些實施態樣中，宿主細胞包含表現載體，該表現載體包含該多核苷酸分子。在一些實施態樣中，宿主細胞包含多核苷酸分子。
IV.使用方法及醫藥組成物
本發明之VEGF/DLL4結合劑(包括多肽及抗體)可用於各種應用，包括但不限於治療性處理方法諸如癌之治療。在某些實施態樣中，該劑可用於抑制VEGF活性、抑制DLL4誘導之缺口傳訊、抑制腫瘤生長、減少腫瘤體積、減少腫瘤中癌幹細胞之頻率、減少腫瘤之腫瘤發生性、調節血管生成及/或抑制血管生成。使用方法可為試管內、體外或體內。在某些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑係人VEGF之拮抗劑。在某些實施態樣中， VEGF/DLL4結合劑係人DLL4之拮抗劑。在某些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑係VEGF及DLL4兩者之拮抗劑。
在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係用於治療與血管生成有關之疾病，即增加之血管生成及/或異常之血管生成。在某些實施態樣中，該疾病係依賴血管生成之疾病。在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係用於治療特徵為幹細胞及/或祖細胞之量增加之疾病。
本發明提供利用此處所述之VEGF/DLL4結合劑或抗體以抑制腫瘤生長之方法。在某些實施態樣中，該抑制腫瘤生長之方法包含於試管內使腫瘤細胞與VEGF/DLL4結合劑(例如抗體)接觸。舉例來說，永生化細胞系或癌細胞系係於培養基中培養，其中添加抗VEGF抗體、抗DLL4抗體或抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體以抑制腫瘤細胞生長。在一些實施態樣中，腫瘤細胞係自病患樣本分離諸如像是組織活體檢查、胸膜滲液或血液樣本，並於其中添加VEGF/DLL4結合劑以抑制腫瘤細胞生長之培養基中培養。
在一些實施態樣中，該抑制腫瘤生長之方法包含於體內使腫瘤或腫瘤細胞與VEGF/DLL4結合劑(例如抗體)接觸。在某些實施態樣中，使腫瘤或腫瘤細胞接觸VEGF/DLL4結合劑係於動物模型中進行。舉例來說，抗VEGF抗體、抗DLL4抗體或抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體可能被投予至具有腫瘤異種移植之免疫不全宿主動物(例如NOD/SCID小鼠)。在一些實施態樣中，腫瘤細胞 及/或癌幹細胞係自病患樣本分離諸如像是組織活體檢查、胸膜滲液或血液樣本，並注射至免疫不全宿主動物(例如NOD/SCID小鼠)，該動物接著被投予VEGF/DLL4結合劑以抑制腫瘤細胞生長。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係於導入腫瘤發生細胞至動物之同時或短時間內投予，以預防腫瘤生長(「預防模型」)。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係於腫瘤生長至特定大小後投予以作為治療之用(「治療模型」)。在某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係與人VEGF及人DLL4特異性結合之雙特異性抗體。
在某些實施態樣中，抑制腫瘤生長之方法包含對個體投予治療有效量之VEGF/DLL4結合劑。在某些實施態樣中，該個體係人。在某些實施態樣中，該個體具有腫瘤或腫瘤已被移除。在某些實施態樣中，該腫瘤包含癌幹細胞。在某些實施態樣中，該腫瘤中癌幹細胞之頻率係藉由投予VEGF/DLL4結合劑而減少。本發明亦提供減少腫瘤中癌幹細胞之頻率之方法，該方法包含使該腫瘤接觸有效量之VEGF/DLL4結合劑(例如抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體)。在一些實施態樣中，減少個體之腫瘤中癌幹細胞之頻率之方法包含對該個體投予治療有效量之VEGF/DLL4結合劑。
在一些實施態樣中，該腫瘤係實質腫瘤。在某些實施態樣中，該腫瘤係選自結直腸腫瘤、結腸腫瘤、胰腫瘤、肺腫瘤、卵巢腫瘤、肝腫瘤、乳房腫瘤、腎腫瘤、前列腺 腫瘤、胃腸道腫瘤、黑色素瘤、子宮頸腫瘤、膀胱腫瘤、神經膠母細胞瘤或頭頸腫瘤之腫瘤。在某些實施態樣中，該腫瘤係結直腸腫瘤或結腸腫瘤。在某些實施態樣中，該腫瘤係卵巢腫瘤。在一些實施態樣中，該腫瘤係肺腫瘤。在某些實施態樣中，該腫瘤係胰腫瘤。在某些實施態樣中，該腫瘤係乳房腫瘤。
本發明另提供治療癌之方法，該方法包含對個體投予治療有效量之VEGF/DLL4結合劑。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑與VEGF結合，且抑制或減少癌之生長。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑與DLL4結合，且抑制或減少癌之生長。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係與VEGF及DLL4結合之雙特異性抗體，且抑制或減少癌之生長。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑與VEGF結合、干擾VEGF/VEGF受體交互作用，且抑制或減少癌之生長。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑與DLL4結合、干擾DLL4/缺口交互作用且抑制或減少癌之生長。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑與VEGF及DLL4兩者結合、干擾VEGF/VEGF受體交互作用及DLL4/缺口交互作用，且抑制或減少癌之生長。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑與DLL4結合，且減少癌中癌幹細胞之頻率。
本發明提供治療癌之方法，該方法包含對個體(例如需要治療之個體)投予治療有效量之VEGF/DLL4結合劑。在某些實施態樣中，該個體係人。在某些實施態樣 中，該個體罹患癌性腫瘤。在某些實施態樣中，該個體罹患之腫瘤已經移除。
在某些實施態樣中，該癌係選自結直腸癌、胰癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、乳癌、腎癌、前列腺癌、胃腸癌、黑色素瘤、子宮頸癌、膀胱癌、神經膠母細胞瘤或頭頸癌之癌。在某些實施態樣中，該癌係卵巢癌。在某些實施態樣中，該癌係結直腸癌或結腸癌。在某些實施態樣中，該癌係胰癌。在某些實施態樣中，該癌係乳癌。在某些實施態樣中，該癌係前列腺癌。在某些實施態樣中，該癌係肺癌。在一些實施態樣中，該癌係血癌諸如白血病或淋巴瘤。在一些實施態樣中，該白血病或淋巴瘤係B細胞白血病或淋巴瘤。在一些實施態樣中，該白血病或淋巴瘤係T細胞白血病或淋巴瘤。在一些實施態樣中，該血癌係急性骨髓性白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、急性淋巴細胞性白血病、髮樣細胞白血病、慢性淋巴細胞性白血病、多發性骨髓瘤、皮膚T細胞淋巴瘤或T細胞急性淋巴胚細胞白血病。
本發明亦提供治療個體之疾病或病狀之方法，其中該疾病或病狀係與血管生成有關。在一些實施態樣中，該疾病或病狀係與異常血管生成有關。在一些實施態樣中，該疾病或病狀係增加之血管生成有關。因此，本發明提供調節個體之血管生成之方法，該方法包含對該個體投予治療有效量之任何此處所述之VEGF/DLL4結合劑。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係與人VEGF結合之抗 體。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係與人DLL4結合之抗體。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係與人VEGF結合之雙特異性抗體。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係與人DLL4結合之雙特異性抗體。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係與人VEGF及人DLL4結合之雙特異性抗體。
本發明另提供治療個體之疾病或病狀之方法，其中該疾病或病狀之特徵為幹細胞及/或祖細胞之量增加。在一些實施態樣中，該治療方法包含對該個體投予治療有效量之VEGF/DLL4結合劑、多肽或抗體。
在此處所述之任何方法的某些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係與人VEGF及人DLL4特異性結合之雙特異性抗體。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體包含與人VEGF特異性結合之第一抗原結合部位及與人DLL4特異性結合之第二抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含NYWMH(SEQ ID NO：17)，該重鏈CDR2包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO：18)且該重鏈CDR3包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO：19)，其中該第二抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)，該重鏈CDR2包含YIANYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO：14)、YISSYNGATNYNQKFKG(SEQ ID NO：15)、YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQ ID NO：59)或YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO：65)且該重鏈CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)，且其中該第一及第二抗原結合部位皆包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)且該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體包含與人VEGF特異性結合之第一抗原結合部位及與人DLL4特異性結合之第二抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含NYWMH(SEQ ID NO：17)，該重鏈CDR2包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO：18)且該重鏈CDR3包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO：19)，其中該第二抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)，該重鏈CDR2包含YIANYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO：14)且該重鏈CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)，且其中該第一及第二抗原結合部位皆包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)且該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體包含與人VEGF特異性結合之第一抗原結合部位及與人DLL4特異性結合之第二抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含NYWMH(SEQ ID NO：17)，該重鏈CDR2包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO：18)且該重鏈CDR3包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO：19)，其中該第二抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)，該重鏈CDR2包含YISSYNGATNYNQKFKG(SEQ ID NO：15)且該重鏈CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)，且其中該第一及第二抗原結合部位皆包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)且該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體包含與人VEGF特異性結合之第一抗原結合部位及與人DLL4特異性結合之第二抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含NYWMH(SEQ ID NO：17)，該重鏈CDR2包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO：18)且該重鏈CDR3包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO：19)，其中該第二抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)，該重鏈CDR2包含YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQ ID NO：59)且該重鏈CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)，且其中該第一及第二抗原結合部位皆包含輕鏈CDR1、輕 鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)且該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體包含與人VEGF特異性結合之第一抗原結合部位及與人DLL4特異性結合之第二抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含NYWMH(SEQ ID NO：17)，該重鏈CDR2包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO：18)且該重鏈CDR3包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO：19)，其中該第二抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)，該重鏈CDR2包含YISNYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO：65)且該重鏈CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)，且其中該第一及第二抗原結合部位皆包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)且該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。
在此處所述之任何方法之某些實施態樣中，該VEGF/DLL4雙特異性抗體包含第一重鏈可變區、第二重鏈可變區及第一及第二輕鏈可變區，該第一重鏈可變區與SEQ ID NO：11具有至少約80%之序列一致性，該第二重鏈可變區與SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：58 或SEQ ID NO：64具有至少約80%之序列一致性，且該第一及第二輕鏈可變區與SEQ ID NO：12具有至少80%之序列一致性。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4雙特異性抗體包含第一重鏈可變區、第二重鏈可變區及第一及第二輕鏈可變區，該第一重鏈可變區與SEQ ID NO：11具有至少約80%之序列一致性，該第二重鏈可變區與SEQ ID NO：9具有至少約80%之序列一致性，且該第一及第二輕鏈可變區與SEQ ID NO：12具有至少80%之序列一致性。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4雙特異性抗體包含第一重鏈可變區、第二重鏈可變區及第一及第二輕鏈可變區，該第一重鏈可變區與SEQ ID NO：11具有至少約80%之序列一致性，該第二重鏈可變區與SEQ ID NO：10具有至少約80%之序列一致性，且該第一及第二輕鏈可變區與SEQ ID NO：12具有至少80%之序列一致性。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4雙特異性抗體包含第一重鏈可變區、第二重鏈可變區及第一及第二輕鏈可變區，該第一重鏈可變區與SEQ ID NO：11具有至少約80%之序列一致性，該第二重鏈可變區與SEQ ID NO：58具有至少約80%之序列一致性，且該第一及第二輕鏈可變區與SEQ ID NO：12具有至少80%之序列一致性。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4雙特異性抗體包含第一重鏈可變區、第二重鏈可變區及第一及第二輕鏈可變區，該第一重鏈可變區與SEQ ID NO：11具有至少約80%之序列一致性，該第二重鏈可變區與SEQ ID NO：64具有至少約80%之序列一致 性，且該第一及第二輕鏈可變區與SEQ ID NO：12具有至少80%之序列一致性。
在此處所述之任何方法的一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係抗體。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係抗VEGF抗體。在一些實施態樣中，該抗VEGF抗體係抗體219R45。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係抗DLL4抗體。在一些實施態樣中，該抗DLL4抗體係抗體21R79。在一些實施態樣中，該抗DLL4抗體係抗體21R75。在一些實施態樣中，該抗DLL4抗體係抗體21R83。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係包含源自抗體219R45之抗原結合部位之雙特異性抗體。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係包含源自抗體21R79之抗原結合部位之雙特異性抗體。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係包含源自抗體21R75之抗原結合部位之雙特異性抗體。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係包含源自抗體21R83之抗原結合部位之雙特異性抗體。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含源自抗體219R45之第一抗原結合部位與源自抗體21R79之第二抗原結合部位。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含源自抗體219R45之第一抗原結合部位及源自抗體21M18之第二抗原結合部位。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含源自抗體219R45之第一抗原結合部位及源自抗體 21R75之第二抗原結合部位。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體，其包含源自抗體219R45之第一抗原結合部位及源自抗體21R83之第二抗原結合部位。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體219R45-MB-21M18。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體219R45-MB-21R79。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體219R45-MB-21R75。在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑係雙特異性抗體219R45-MB-21R83。
本發明另提供包含此處所述之VEGF/DLL4結合劑之醫藥組成物。在某些實施態樣中，該醫藥組成物另包含醫藥上可接受之載具。該等醫藥組成物於個體(例如人病患)中具有抑制腫瘤生長及/或治療癌之用途。
在某些實施態樣中，供儲存及使用之調製劑係藉由組合本發明之經純化之抗體或劑與醫藥上可接受之載具(例如載劑或賦形劑)加以製備。適當之醫藥上可接受之載具包括但不限於非毒性緩衝劑諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；鹽諸如氯化鈉；抗氧化劑包括抗壞血酸及甲硫胺酸；保存劑諸如十八基二甲基苄基氯化銨、六甲氯胺、氯化苯甲烴銨、氯化苄乙氧銨、酚醇、丁醇、苄醇、烷基對羥苯甲酸酯類諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇及間甲酚；低分子量多肽(例如少於約10個胺基酸殘基)；蛋白質諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物諸如聚乙烯基吡 咯烷酮；胺基酸諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；碳水化合物諸如單醣、雙醣、葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合劑諸如EDTA；糖類諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；鹽形成反離子諸如鈉；金屬複合物(例如鋅蛋白質複合物)；及非離子性界面活性劑諸如TWEEN或聚乙二醇(PEG)。(Remington：The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,2005,University of the Sciences,Philadelphia,PA)。
本發明之醫藥組成物可以任何數量之方式經局部或系統投予。投予可為藉由表皮貼片、經皮貼片、軟膏、乳液、乳膏、膠劑、滴劑、栓劑、噴劑、液劑及粉劑之局部投予；藉由吸入或噴入粉劑或氣霧劑之經肺投予，包括藉由噴霧器、氣管內或鼻內投予；經口；或非經腸投予包括靜脈內、動脈內、腫瘤內、皮下、腹膜內、肌肉內(例如注射或輸注)或顱內(例如脊椎鞘內或心室內)投予。
該治療調製劑可呈單位劑量形式。該等調製劑包括錠劑、丸劑、膠囊、粉劑、顆粒劑、水或非水性介質之溶液或懸浮液、或栓劑。在固態組成物諸如錠劑中，該主要活性成分係與醫藥載劑混合。習用之製錠成分包括玉米澱粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或膠、及稀釋劑(例如水)。這些可被用來形成含有本發明之化合物或彼之無毒性、醫藥上可接受之鹽的均質混合物之固體預調製組成物。該固體預調製組成物接著被分成上述種類之單位劑量形式。錠劑、丸劑等調製劑或 組成物可經包覆或經其他方式複合以提供提供具有長效優點之劑型。舉例來說，錠劑或丸劑可包含由外部成份包覆之內部組成物。另外，該兩種成份可以腸溶層分開，該腸溶層用來抵抗崩解，以使該內部成份完整通過胃或被延遲釋放。多種物質可被用於該腸溶層或包覆層，該等物質包括多種聚合酸及聚合酸與諸如蟲膠、鯨臘醇及醋酸纖維素之物質之混合物。
此處所述之VEGF/DLL4結合劑或抗體亦可被包封於微膠囊中。該等微膠囊係藉由例如凝聚技術或藉由界面聚合化製備，例如分別於膠體藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球、微乳化液、奈米微粒及奈米微囊)或於巨乳化液中之羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(異丁烯酸甲酯)微膠囊，如Remington：The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,2005,University of the Sciences in Philadelphia,PA所述。
在某些實施態樣中，醫藥調製劑包括與脂質體複合之本發明之VEGF/DLL4結合劑(例如抗體)。產製脂質體之方法係該領域之技藝人士所知。舉例來說，有些脂質體可利藉由逆相蒸發含有磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG-衍生性磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之脂質組成物加以產製。脂質體可被擠壓通過定義孔徑大小之濾網以產生具有所欲直徑之脂質體。
在某些實施態樣中，持續釋放之製劑可被產製。持續釋放製劑之適當實例包括含有VEGF/DLL4結合劑(例如 抗體)之固相疏水性聚合物之半透性基體，其中該基體係呈形狀物件之形式(例如膜或微膠囊)。持續釋放基體之額外實例包括聚酯、水凝膠(諸如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚交酯、L-麩胺酸及7乙基-L-麩胺酸鹽之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物及柳菩林(leuprolide acetate)所組成之注射型微球)、蔗糖乙酸異丁酸酯及聚-D-(-)-3-羥丁酸。
在某些實施態樣中，除了投予VEGF/DLL4結合劑(例如抗體)之外，該方法或治療另包含投予至少一種額外之治療劑。額外之治療劑可於投予該VEGF/DLL4結合劑之前、之同時及/或之後投予。本發明亦提供包含VEGF/DLL4結合劑與該額外治療劑之醫藥組成物。在一些實施態樣中，該至少一種額外治療劑包含1、2、3或更多種額外之治療劑。
含有至少二種治療劑之組合療法通常使用具有不同作用機轉之劑，雖然並非必要。使用不同作用機轉之劑的組合療法可能導致加成或協同效應。組合療法可能允許相較於單一療法使用較低劑量之各劑，藉以減少其中至少一種劑之毒性不良反應及/或增加治療指數。組合療法可能減少抗藥性癌細胞發生之可能性。在一些實施態樣中，組合療法包含主要影響(例如抑制或殺滅)非腫瘤發生性細胞之治療劑及主要影響(例如抑制或殺滅)腫瘤發生性CSC之治療劑。
有用類別之治療劑包括例如抗微管蛋白劑、耳抑素、DNA次要凹槽結合劑、DNA複製抑制劑、烷化劑(例如鉑複合物諸如順鉑(cisplatin)、單(鉑)、二(鉑)及三核鉑複合物及卡鉑(carboplatin))、蒽環類(anthracycline)、抗生素、抗葉酸劑、抗代謝物、化學療法致敏劑、雙聯黴素(duocarmycin)、依托泊苷(etoposide)、氟化嘧啶、離子載體、萊克西托素(lexitropsin)、亞硝基尿素、普拉汀諾(platinol)、嘌呤抗代謝物、嘌呤黴素(puromycin)、放射線致敏劑、類固醇、紫杉烷、拓撲異構酶抑制劑、長春花生物鹼或該類似物。在某些實施態樣中，第二治療劑係烷化劑、抗代謝物、抗有絲分裂劑、拓撲異構酶抑制劑或血管生成抑制劑。在一些實施態樣中，第二治療劑係鉑複合物諸如卡鉑或順鉑。在一些實施態樣中，該額外之治療劑係鉑複合物與紫杉烷之組合。
可與VEGF/DLL4結合劑組合投予之治療劑包括化學治療劑。因此，在一些實施態樣中，該方法或治療牽涉投予本發明之抗VEGF結合劑或抗體與化學治療劑或多種不同化學治療劑之雞尾酒組合之組合。在一些實施態樣中，該方法或治療牽涉投予本發明之抗DLL4結合劑或抗體與化學治療劑或多種不同化學治療劑之雞尾酒組合之組合。在一些實施態樣中，該方法或治療牽涉投予本發明之與VEGF及DLL4結合之雙特異性抗體與化學治療劑或多種不同化學治療劑之雞尾酒組合之組合。
可用於本發明之化學治療劑包括但不限於：烷化劑諸如噻替派(thiotepa)及環磷醯胺(cyclophosphamide)(CYTOXAN)；烷基磺酸鹽諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶諸如苯多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、甲基優瑞多巴(meturedopa)及優瑞多巴(uredopa)；伸乙亞胺(ethylenimines)及甲基三聚氰胺(methylmelamines)包括阿草特胺(altretamine)、三亞乙基三聚氰胺(triethylenemelamine)、三乙烯磷醯胺(trietylenephosphoramide)、三乙烯硫磷醯胺(triethylenethiophosphoramide)及三羥甲基三聚氰胺(trimethylolmelamime)；氮芥子氣諸如氯芥苯丁酸(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、cholophosphamide、雌二醇氮芥(estramustine)、異環磷酸胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、黴法蘭(melphalan)、新氮芥(novembichin)、膽甾醇苯乙酸氮芥(phenesterine)、松龍苯芥(prednimustine)、氯乙環磷醯胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥(uracil mustard)；亞硝基脲(nitrosourea)諸如卡氮芥(carmustine)、吡葡亞硝脲(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、羅氮芥(lomustine)、尼氮芥(nimustine)、雷諾氮芥(ranimustine)；抗生素諸如阿克拉黴素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、 安曲黴素(anthramycin)、氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、卡利奇黴素(calicheamicin)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、達克黴素(dactinomycin)、正定黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-羰基-L-正白胺酸、多柔比星(doxorubicin)、表阿黴素(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycins)、黴酚酸、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、波弗黴素(porfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黴黑素(streptonigrin)、鏈脲佐菌素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、鳥苯美司(ubenimex)、新制癌菌素(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝劑諸如甲胺喋呤(methotrexate)及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物諸如二甲葉酸(denopterin)、甲胺喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲蝶呤(trimetrexate)；嘌呤類似物諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-硫唑脲嘧啶(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、二去氧尿苷、去氧氟 尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄性素諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、硫雄甾醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內酮(testolactone)；抗腎上腺劑諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑諸如亞葉酸；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基酮戊酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；貝斯特氮芥(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatrexate)；脫葉非素(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾弗米素(elformithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸鎵(gallium nitrate)；羥基脲；香菇糖(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofuran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺 (2,2',2"-trichlorotriethylamine)；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托汀(gacytosine)；阿拉伯糖苷(Ara-C)；類紫杉醇(taxoids)例如太平洋紫杉醇(TAXOL)及多西紫杉醇(TAXOTERE)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰嘌呤(mercaptopurine)；鉑類似物諸如順鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春鹼(vinblastine)；鉑(platinum)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；異環磷醯胺(ifosfamide)；絲裂黴素C；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼(vincristine)；長春瑞濱(vinorelbine)；溫諾平(navelbine)；米托蒽醌(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道諾黴素(daunomycin)；胺喋呤(aminopterin)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT11；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；視黃酸；埃斯培拉黴素(esperamicin)；卡培他濱(capecitabine)(XELODA)及上述任一劑之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。化學治療劑亦包括用來調節或抑制荷爾蒙對腫瘤之作用的抗荷爾蒙劑，諸如抗雌激素劑包括例如它莫西芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制劑4(5)-咪唑、4-羥基它莫西芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬 (keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene)(FARESTON)；及抗雄性素劑諸如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、柳普林(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；及上述任一劑之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。在某些實施態樣中，該第二治療劑係順鉑。在某些實施態樣中，該第二治療劑係卡鉑。在某些實施態樣中，該第二治療劑係太平洋紫杉醇(paclitaxel)。
在某些實施態樣中，該化學治療劑係拓撲異構酶抑制劑。拓撲異構酶抑制劑係干擾拓撲異構酶(例如拓撲異構酶I或II)之活性的化學治療劑。拓撲異構酶抑制劑包括但不限於鹽酸多柔比星(doxorubicin HCl)、檸檬酸正定黴素(daunorubicin citrate)、鹽酸米托蒽醌(mitoxantrone HCl)、放線菌素D、依托泊苷(etoposide)、鹽酸拓撲替康(topotecan HCl)、替尼泊苷(teniposide)(VM-26)及伊立替康(irinotecan)，以及這些任一劑之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。在某些實施態樣中，該第二治療劑係伊立替康。
在某些實施態樣中，該化學治療劑係抗代謝劑。抗代謝劑係一化學物質，其結構類似正常生化反應所需之代謝物，但仍有足夠之不同處以干擾一或多種細胞正常功能，諸如細胞分裂。抗代謝劑包括但不限於吉西他濱(gemcitabine)、氟脲苷(fluorouracil)、卡培他濱(capecitabine)、甲胺喋呤鈉、雷替曲塞 (ralitrexed)、培美曲塞(pemetrexed)、替加氟(tegafur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、硫鳥嘌呤、5-氮雜胞苷、6-巰基嘌呤、硫唑嘌呤、6-硫鳥嘌呤、噴司他丁(pentostatin)、磷酸氟達拉濱(fludarabine phosphate)及克拉屈濱(cladribine)，以及這些任一劑之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。在某些實施態樣中，該第二治療劑係吉西他濱(gemcitabine)。
在某些實施態樣中，該化學治療劑係抗有絲分裂劑，包括但不限於與微管蛋白結合之劑。在一些實施態樣中，該劑係紫杉烷。在某些實施態樣中，該劑係太平洋紫杉醇(paclitaxel)或多西紫杉醇(docetaxel)，或太平洋紫杉醇或多西紫杉醇之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。在某些實施態樣中，該劑係太平洋紫杉醇(TAXOL)、多西紫杉醇(TAXOTERE)、白蛋白結合型太平洋紫杉醇(ABRAXANE)、DHA-太平洋紫杉醇或PG-太平洋紫杉醇。在某些替代性實施態樣中，該抗有絲分裂劑包含長春花生物鹼，諸如長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、長春瑞濱(vinorelbine)或長春地辛(vindesine)或彼等之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。在一些實施態樣中，該抗有絲分裂劑係驅動蛋白(kinesin)Eg5之抑制劑或有絲分裂激酶諸如Aurora A或Plk1之抑制劑。在某些實施態樣中，當該與VEGF/DLL4結合劑組合投予之化學治療劑係抗有絲分裂劑時，該經治 療之癌或腫瘤係乳癌或乳房腫瘤。
在一些實施態樣中，第二治療劑包含諸如小分子之劑。舉例來說，治療可涉及組合投予本發明之VEGF/DLL4結合劑(例如抗體)與作為其他腫瘤相關性蛋白質之抑制劑的小分子，其他腫瘤相關性蛋白質包括但不限於EGFR、ErbB2、HER2及/或VEGF。在某些實施態樣中，該第二治療劑係抑制癌幹細胞途徑之小分子。在一些實施態樣中，該第二治療劑係缺口途徑之小分子抑制劑。在一些實施態樣中，該第二治療劑係Wnt途徑之小分子抑制劑。在一些實施態樣中，該第二治療劑係BMP途徑之小分子抑制劑。在一些實施態樣中，該第二治療劑係抑制β-連環蛋白傳訊之小分子。
在一些實施態樣中，第二治療劑包含生物性分子像是抗體。舉例來說，治療可涉及組合投予本發明之VEGF/DLL4結合劑(例如抗體)與拮抗其他腫瘤相關性蛋白質之其他抗體，包括但不限於與EGFR、ErbB2、HER2及/或VEGF結合之抗體。在某些實施態樣中，該第二治療劑係抗癌幹細胞標記抗體之抗體。在一些實施態樣中，該第二治療劑係與缺口途徑之成份結合之抗體。在一些實施態樣中，該第二治療劑係與Wnt途徑之成份結合之抗體。在某些實施態樣中，該第二治療劑係抑制癌幹細胞途徑之抗體。在一些實施態樣中，該第二治療劑係缺口途徑之抗體抑制劑。在一些實施態樣中，該第二治療劑係Wnt途徑之抗體抑制劑。在一些實施態樣中，該第二治療 劑係BMP途徑之抗體抑制劑。在一些實施態樣中，該第二治療劑係抑制β-連環蛋白傳訊之抗體。在某些實施態樣中，該第二治療劑係血管生成抑制劑或調節劑之抗體(例如抗VEGF或VEGF受體抗體)。在某些實施態樣中，該第二治療劑係貝伐珠單抗(bevacizumab)(AVASTIN)、曲妥珠單抗(trastuzumab)(HERCEPTIN)、帕尼單抗(panitumumab)(VECTIBIX)或西妥昔單抗(cetuximab)(ERBITUX)。組合投予可包括於單一醫藥調製劑中共投或利用分開之調製劑共投，或以任何順序連續投予但通常在一段期間內以使所有活性劑可同步展現彼等之生物活性。
另外，以此處所述之VEGF/DLL4結合劑治療可包括與其他生物分子組合治療，像是一或多種細胞介素(例如淋巴介質、介白素、腫瘤壞死因子及/或生長因子)，或可伴隨手術移除腫瘤、癌細胞或任何其他主治醫師認為必要之治療。
在某些實施態樣中，治療涉及投予本發明之VEGF/DLL4結合劑(例如抗體)與放射治療之組合。VEGF/DLL4結合劑之治療可發生於投予放射治療之前、之同時或之後。該放射治療之投予計畫可由經驗豐富之執業醫生決定。
將了解的是，VEGF/DLL4結合劑與額外治療劑之組合可以任何順序投予或同時投予。VEGF/DLL4結合劑(例如抗體)之治療可發生於投予化學治療之前、之同時 或之後。組合投予可包括於單一醫藥調製劑中共投或利用分開之調製劑共投，或以任何順序連續投予但通常在一段期間內以使所有活性劑可同步展現彼等之生物活性。該等化學治療劑之準備及投予計畫可根據製造商之說明使用或由經驗豐富之醫生憑經驗決定。該等化學治療之準備及投予計畫亦描述於The Chemotherapy Source Book,4th Edition,2008,M.C.Perry,Editor,Lippincott,Williams & Wilkins,Philadelphia,PA。
在一些實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑將被投予至已先接受第二治療劑治療之病患。在某些其他實施態樣中，該VEGF/DLL4結合劑與第二治療劑將被實質上同步或同時投予。舉例來說，個體可能在接受第二治療劑(例如化學治療)之療程時被給予VEGF/DLL4結合劑(例如抗體)。在某些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑將於接受第二治療劑治療之一年內被投予。在某些替代性實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑將於接受第二治療劑之任何治療的10、8、6、4或2個月內被投予。在某些其他實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑將於接受第二治療劑之任何治療的4、3、2或1周內被投予。在一些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑將於接受第二治療劑之任何治療的5、4、3、2或1天內被投予。將另外了解的是，該二(或多)種劑或治療可在數小時或數分鐘內(即實質上同步)被投予至個體。
以疾病之治療而言，本發明之VEGF/DLL4結合劑 (例如抗體)之適當劑量取決於所欲治療之疾病類型、該疾病之嚴重性及病程、該疾病之反應性、該VEGF/DLL4結合劑或抗體係經投予以達治療或預防目的、先前治療、該病患之臨床病史等，所有皆由主治醫師斟酌。該VEGF/DLL4結合劑或抗體可經投予一次或在數天至數月期間投予之治療系列，或直到達成療效或達到減少之疾病狀態(例如腫瘤大小減少)。理想投藥計畫可自藥物累積於病患體內之測量值加以計算，且將視個別抗體或劑之相對強度而異。主治醫師可決定理想劑量、投藥方法及重複頻率。在某些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑或抗體之劑量係自約0.01μg至約100mg/kg體重、自約0.1μg至約100mg/kg體重、自約1μg至約100mg/kg體重、自約1mg至約100mg/kg體重、自約1mg至約80mg/kg體重、自約10mg至約100mg/kg體重、自約10mg至約75mg/kg體重、或自約10mg至約50mg/kg體重。在某些實施態樣中，該抗體或其他VEGF/DLL4結合劑之劑量係自約0.1mg至約20mg/kg體重。在某些實施態樣中，劑量可於每天、每周、每月或每年給予一次或多次。在某些實施態樣中，該抗體或其他VEGF/DLL4結合劑係給予每周一次、每二周一次、每三周一次或每月一次。
在一些實施態樣中，VEGF/DLL4結合劑(例如抗體)可以初始較高之「負荷」劑量投予，之後投予一或多次較低劑量。在一些實施態樣中，投予之頻率亦可能改變。在一些實施態樣中，投藥計畫可能包含投予初始劑量，然 後每周、每二周、每三周或每月投予一次額外劑量(或「維持」劑量)。舉例來說，投藥計畫可能包含投予初始負荷劑量，然後投予例如一半初始劑量之每周維持劑量。或投藥計畫可能包含投予初始負荷劑量，然後每隔一周投予例如一半初始劑量之維持劑量。或投藥計畫可能包含三周投予三次初始劑量，然後每隔一周投予例如相同量之維持劑量。或投藥計畫可能包含投予初始劑量，然後每3周或每月投予一次額外劑量。主治醫師可根據在體液或組織中測量之藥物的停留時間及濃度以預估投藥之重複頻率。治療之進展可藉由習知技術及檢測加以監測。
如該領域之技藝人士所知，投予任何治療劑可能導致不良反應及/或毒性。在一些情況中，不良反應及/或毒性非常嚴重以至於無法投予治療有效劑量之特定劑。在一些情況中，藥物治療必須中斷，並嘗試其他劑。然而，許多相同治療類別之劑通常展現類似之不良反應及/或毒性，表示病患必須停止治療，或可能的話忍受與該治療劑有關之不適不良反應。
治療劑之不良反應可能包括但不限於麻疹、皮膚紅疹、發癢、噁心、嘔吐、食慾減低、下痢、畏寒、發燒、疲倦、肌肉痛、頭痛、低血壓、高血壓、低血鉀、低血球數、出血及心臟問題。
因此，本發明之一態樣係關於治療病患之癌之方法，該方法包含利用間歇性投藥計畫投予抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體，其可能減少與投予抗VEGF/抗DLL4雙特異 性抗體有關之不良反應及/或毒性。此處所使用之「間歇性投藥」係指利用超過一周一次之投藥間隔之投藥計畫，例如每2周、每3周、每4周投藥一次等。在一些實施態樣中，治療人病患之癌之方法包含根據間歇性投藥計畫對該病患投予有效劑量之抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體。在一些實施態樣中，治療人病患之癌之方法包含根據間歇性投藥計畫對該病患投予有效劑量之抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體及增加該抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體之治療指數。在一些實施態樣中，該間歇性投藥計畫包含對病患投予初始劑量之抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體，接著大約每2周投予一次抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體之後續劑量。在一些實施態樣中，該間歇性投藥計畫包含對病患投予初始劑量之抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體，接著大約每3周投予一次抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體之後續劑量。在一些實施態樣中，該間歇性投藥計畫包含對病患投予初始劑量之抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體，接著大約每4周投予一次抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體之後續劑量。
在一些實施態樣中，間歇性投藥計畫中之後續劑量係大約與初始劑量相同或少於之量。在其他實施態樣中，該後續劑量之量係高於該初始劑量。如該領域之技藝人士所知，使用之劑量將視所欲達成之臨床目標而異。在一些實施態樣中，該初始劑量係約0.25mg/kg至約20mg/kg。在一些實施態樣中，該初始劑量係約0.5、1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mg/kg。在某些實施態樣中，該初始劑量係約0.5mg/kg。在某些實施態樣中，該初始劑量係約1mg/kg。在某些實施態樣中，該初始劑量係約2.5mg/kg。在某些實施態樣中，該初始劑量係約5mg/kg。在某些實施態樣中，該初始劑量係約7.5mg/kg。在某些實施態樣中，該初始劑量係約10mg/kg。在某些實施態樣中，該初始劑量係約12.5mg/kg。在某些實施態樣中，該初始劑量係約15mg/kg。在某些實施態樣中，該初始劑量係約20mg/kg。在一些實施態樣中，該後續劑量係約0.25mg/kg至約15mg/kg。在某些實施態樣中，該後續劑量係約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15mg/kg。在某些實施態樣中，該後續劑量係約0.5mg/kg。在某些實施態樣中，該後續劑量係約1mg/kg。在某些實施態樣中，該後續劑量係約2.5mg/kg。在某些實施態樣中，該後續劑量係約5mg/kg。在一些實施態樣中，該後續劑量係約7.5mg/kg。在一些實施態樣中，該後續劑量係約10mg/kg。在一些實施態樣中，該後續劑量係約12.5mg/kg。
在一些實施態樣中，該間歇性投藥計畫包含：(a)對病患投予約2.5mg/kg之抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體之初始劑量及(b)每2周投予一次約2.5 mg/kg之後續劑量。在一些實施態樣中，該間歇性投藥計畫包含：(a)對病患投予約5mg/kg之抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體 之初始劑量及(b)每2周投予一次約5 mg/kg之後續劑量。在一些實施態樣中，該間歇性投藥計畫包含：(a)對病患投予約2.5mg/kg之抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體之初始劑量及(b)每3周投予一次約2.5 mg/kg之後續劑量。在一些實施態樣中，該間歇性投藥計畫包含：(a)對病患投予約5mg/kg之抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體之初始劑量及(b)每3周投予一次約5 mg/kg之後續劑量。在一些實施態樣中，該間歇性投藥計畫包含：(a)對病患投予約2.5mg/kg之抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體之初始劑量及(b)每4周投予一次約2.5 mg/kg之後續劑量。在一些實施態樣中，該間歇性投藥計畫包含：(a)對病患投予約5mg/kg之抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體之初始劑量及(b)每4周投予一次約5 mg/kg之後續劑量。在某些實施態樣中，該初始劑量與維持劑量不同，例如初始劑量係約5mg/kg，後續劑量係約2.5mg/kg。在某些實施態樣中，間歇性投藥計畫可能包含負荷劑量，例如初始劑量係約20mg/kg，後續劑量係每2周、每3周或每4周投予一次約2.5mg/kg或約5mg/kg。
本發明之另一態樣關於減少抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體於人病患之毒性之方法，該方法包含利用間歇性投藥計畫投予抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體至該病患。本發明之另一態樣關於減少抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體於人病患之不良反應之方法，該方法包含利用間歇性投藥計畫投予抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體至該病患。本發 明之另一態樣關於增加抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體於人病患之治療指數之方法，該方法包含利用間歇性投藥計畫投予抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體至該病患。
選擇初始及後續劑量之遞送方法係根據動物或人病患耐受抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體導入體內之能力而定。因此，在此處所述之任何態樣/或實施態樣中，抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體之投予可能藉由靜脈注射或經靜脈投予。在一些實施態樣中，該投予係藉由靜脈輸注。在此處所述之任何態樣/或實施態樣中，抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體之投予可能藉由非靜脈途徑投予。
V.包含VEGF/DLL4結合劑之套組
本發明提供包含此處所述之VEGF/DLL4結合劑(例如抗體)之套組，其可被用於實施此處所述之方法。在某些實施態樣中，套組包含於一或多個容器中之至少一種經純化之抗VEGF及/或DLL4之抗體。在一些實施態樣中，該套組包含所有實施檢測試驗所必需及/或足以實施檢測試驗之成份，包括所有對照物、使用說明及任何必要軟體以供結果分析及表現。該領域之技藝人士將顯而易見的是，本發明所揭示之VEGF/DLL4結合劑可被輕易納入該領域所廣為周知之已建立之套組格式之一。
本發明另提供包含VEGF/DLL4結合劑(例如抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體)以及至少一種額外治療劑之套組。在某些實施態樣中，該第二(或更多)治療劑係 化學治療劑。在某些實施態樣中，該第二(或更多)治療劑係血管生成抑制劑。
本發明之實施態樣可藉由參考下列非限制性實施例進一步定義，以下實施例描述本發明之某些抗體之詳細製備及使用本發明之抗體之方法。該領域之技藝人士將顯而易見的是，許多在材料及方法上之調整可加以實施而不背離本發明之範圍。
實施例1 抗VEGF/抗DLL4抗體之結合親和性
親代抗體抗VEGF抗體219R45(IgG形式)、抗DLL4抗體21R79(IgG形式)、抗DLL4抗體21M18(IgG形式)及雙特異性抗體219R45-MB-21M18及219R45-MB-21R79之KD係利用Biacore LifeSciences公司(GE醫療集團)之Biacore 2000系統測定。重組人DLL4-Fc或小鼠DLL4-Fc蛋白質係利用標準胺基底化學(NHS/EDC)被固定於CM5羧基晶片上，並以乙醇胺封閉。重組人VEGF165或小鼠VEGF165係經生物素基化並固定於鏈黴抗生物素蛋白晶片上。該等抗體以HBS-P(0.01M HEPES pH7.4，0.15M NaCl，0.005% v/v聚山梨醇酯20(Polysorbate 20))自100nM連續2倍稀釋至0.78nM。各種抗體之所有8個稀釋倍數皆被依序注射至特定晶片上。收集一段時間之動力學資料並將該等動力學資 料利用同步整體擬合方程式擬合以產生各雙特異性抗體之親和性常數(KD值)。
如表3所示，雙特異性抗體219R45-MB-21M18對人VEGF之親和性常數(KD)為0.36nM，對人DLL4之KD為16nM。雙特異性抗體219R45-MB-21R79對人VEGF之KD為0.68nM，對人DLL4之KD為0.53nM。兩種雙特異性抗體皆顯示對小鼠VEGF相較於對人VEGF較弱之結合，且兩種抗體皆不與小鼠DLL4結合。因此，兩種雙特異性抗體皆顯示對人VEGF類似之結合親和性，且219R45-MB-21R79相較於219R45-MB-21M18顯示對人DLL4之結合強大約30倍。另外，雙特異性抗體219R45-MB-21R79相較於雙價親代抗體對人VEGF具有類似之結合親和性，儘管該雙特異性抗體對VEGF係單價。
數種其他具有結合親和性介於21M18及21R79之KD之間的抗DLL4抗體係經識別。其中二種抗DLL4抗體被用於產製抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21R75及219R45-MB-21R83。使用如上所述之Biacore 2000系統，雙特異性抗體219R45-MB-21R75及219R45-MB-21R83對人DLL4之KD係經測定。這四種抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體對人DLL4之結合親和性之比較係顯示於表4。
抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21M18、219R45-MB-21R79、219R45-MB-21R75及219R45-MB-21R83之CDR係顯示於圖1A。該重鏈及輕鏈可變區SEQ ID NO係顯示於圖1B，重鏈及輕鏈SEQ ID NO(有或無信號序列)係顯示於圖1C。
抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21M18包含(a)由包含SEQ ID NO：75之DNA編碼之重鏈，SEQ ID NO：75係於2012年9月21日根據布達佩斯條約之條件寄存於美國菌種保存中心(ATCC)(地址10801 University Boulevard,Manassas,VA,USA)，編號為PTA-＿＿＿，(b)由包含SEQ ID NO：33之DNA編碼之重鏈，SEQ ID NO：33係於2012年9月21日根據布達佩斯條約之條件寄存於ATCC，編號為PTA-＿＿＿，及(c)由包含SEQ ID NO：34之DNA編碼之輕鏈，SEQ ID NO：34係於2012年9月21日根據布達佩斯條約之條件寄存於ATCC，編號為PTA-＿＿＿。
抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21R79包含(a)由包含SEQ ID NO：31之DNA編碼之重鏈，SEQ ID NO：31係於2012年9月21日根據布達佩斯條約之條件寄存於ATCC，編號為PTA-＿＿＿，(b)由包含SEQ ID NO：33之DNA編碼之重鏈，SEQ ID NO：33係於2012年9月21日根據布達佩斯條約之條件寄存於ATCC，編號為PTA-＿＿＿，及(c)由包含SEQ ID NO：34之DNA編碼之輕鏈，SEQ ID NO：34係於2012年9月21日根據布達佩斯條約之條件寄存於ATCC，編號為PTA-＿＿＿。
抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21R83包含(a)由包含SEQ ID NO：72之DNA編碼之重鏈，SEQ ID NO：72係根據布達佩斯條約之條件寄存於ATCC，編號為PTA-＿＿＿，(b)由包含SEQ ID NO：33之DNA編碼之重鏈，SEQ ID NO：33係於2012年9月21日根據布達佩斯條約之條件寄存於ATCC，編號為PTA-＿＿＿，及(c)由包含SEQ ID NO：34之DNA編碼之輕鏈，SEQ ID NO：34係於2012年9月21日根據布達佩斯條約之條件寄存於ATCC，編號為PTA-＿＿＿。
抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21R75包含(a)由包含SEQ ID NO：74之DNA編碼之重鏈，SEQ ID NO：74係於2012年9月21日根據布達佩斯條約之條件寄存於ATCC，編號為PTA-＿＿＿，(b)由包含SEQ ID NO：33之DNA編碼之重鏈，SEQ ID NO：33係於2012年9月21日根據布達佩斯條約之條件寄存於ATCC，編號為PTA-＿＿＿，及(c)由包含SEQ ID NO：34之DNA編碼之輕鏈，SEQ ID NO：34係於2012年9月21日根據布達佩斯條約之條件寄存於ATCC，編號為PTA-＿＿＿。
實施例2 雙特異性抗體與人VEGF及人DLL4之同步結合之HTRF試驗
為了瞭解某些抗體及/或抗體混合物與VEGF及DLL4之結合能力，進行均相時間差螢光分析(HTRF)試驗。受檢測之抗體係抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21M18及219R45-MB-21R79、親代抗體219R45(抗VEGF)、21M18(抗DLL4)、21R79(抗DLL4)、219R45與21M18之組合或219R45與21R79之組合。抗體或抗體混合物係以結合緩衝液(1X PBS，0.1%明膠，0.1%聚山梨醇酯20，400mM氟化鉀)自3000nM經2倍連續稀釋至2.9nM，然後置於白色96孔盤。相等體積之包含4μg/ml之經d2標記之hDLL4-Fc及21.4ng/ml之經銪(Europium)穴合物標記之hVEGF165之溶液被加至各孔以使終體積達100μl(接受者及捐贈者螢光團之終濃度分別為2μg/ml及10.7ng/ml)。該檢測盤經培養2小時至隔夜，並於SpectraMax M5e微量盤讀取儀(分子儀器(Molecular Devices)公司，Sunnyvale CA)以激發波長 314nm讀取。
如圖2所示，抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21M18及219R45-MB-21R79能與hVEGF及hDLL4同時結合。重要的是，不論何種親代抗體之組合(即219R45及21M18或219R45及21R79)皆無法與VEGF及DLL4同時結合。這些結果清楚顯示，抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21M18及219R45-MB-21R79相較於僅二種個別抗體之混合物能具有不同之作用。
實施例3 抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體抑制HUVEC增生
HUVEC細胞係得自龍沙(Lonza)公司(Walkersville MD)，將其培養於生長培養基(M199，10%熱失活之FBS(HI-FBS)，50μg/ml EGS，1X肝素，1mM L-麩醯胺酸)。在HUVEC增生試驗中，96孔盤係經50μl之10μg/ml大鼠尾膠原蛋白第I型溶液(膠原蛋白I於0.02N醋酸中)預先包覆，並於4℃隔夜培養。在培養後，將孔盤中之液體徹底吸除，以移除未經結合之膠原蛋白I溶液，並以200μl DPBS清洗一次。利用內皮細胞亞克隆試劑自生長角瓶表面取出HUVEC細胞，並於4℃以1200 rpm離心5分鐘。細胞以飢餓/測試培養基(M199及2% HI-FBS，1X肝素，5U/ml肝素-麩醯胺酸)重懸為密度105細胞/ml。這些細胞以5000細胞/孔、50ul/孔被接種 於經膠原蛋白包覆之檢測盤上。細胞於37℃培養3小時後清洗一次，重新加入100ul檢測培養基，並於37℃隔夜培養。隔天，雙特異性抗體219R45-MB-21M18、219R45-MB-21R79、親代抗體219R45或對照抗體LZ1係經製備於含有人VEGF(R&D Biosystems,Minneapolis MN)之混合物中。該抗體與hVEGF之組合係以檢測緩衝液自20μM經5倍連續稀釋至0.25nM(hVEGF之終濃度為5ng/ml)。該混合物於37℃預先培養2小時。自檢測盤移除培養基，於各孔加入100μl之抗體/hVEGF混合物。培養3至4天後移除培養基，並加入新鮮等分之該抗體/hVEGF混合物至各孔，使其再培養4天。第7天時，20μl之阿爾瑪藍(Alamar Blue)試劑(英維特基(Invitrogen)公司，Carlsbad,CA)被加至各孔，於37℃培養5至6小時。該盤於SpectraMax M5e微量盤讀取儀(Molecular Devices,Sunnyvale CA)上利用激發波長539nm及發射波長590nm讀取。
如圖3所示，抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21M18及219R45-MB-21R79以及親代抗VEGF抗體219R45抑制HUVEC增生。這些結果顯示該等雙特異性抗體能抑制經VEGF誘導之HUVEC細胞增生。
實施例4 雙特異性抗體抑制經DLL4誘導之缺口傳訊
人PC3細胞係經編碼全長人缺口2受體之表現載體及 對缺口傳訊有反應之螢火蟲螢光素酶報告載體(8xCBF-螢光素酶報告子)轉染。該等細胞亦經水母(Renilla)冷光酶報告子(普羅麥加(Promega)公司，Madison WI)轉染，以作為轉染效率之內部對照。經純化之人DLL4蛋白質以100ng/孔被包覆於96孔盤，在該等孔槽中加入缺口2-表現性PC3-luc細胞。抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21M18、219R45-MB-21R79、親代抗DLL4抗體21M18、21R79或對照抗體LZ1係自20ug/ml經5倍連續稀釋至0.064ug/ml，它們被添加至適當孔槽並培養隔夜。螢光素酶活性係利用雙重螢光素酶套組(Promega,Madison,WI)測定，其中螢火蟲螢光素酶活性係經正常化至水母冷光酶活性。
如圖4所示，抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21R79及親代抗DLL4抗體21M18及21R79抑制經DLL4誘導之缺口傳訊。雙特異性抗體219R45-MB-21M18僅於高抗體濃度時抑制經DLL4誘導之缺口傳訊。這些結果顯示雙特異性抗體219R45-MB-21R79及效果較差之雙特異性抗體219R45-MB-21M18能抑制經DLL4誘導之缺口傳訊。因此，連同實施例3之結果，抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21R79及219R45-MB-21M18顯示抑制經VEGF誘導及經DLL4誘導之傳訊及/或增生功能之能力。
實施例5 雙特異性抗體於人皮膚移植模型中抑制體內腫瘤生長
包含人皮膚移植及人腫瘤細胞之人皮膚移植模型已被報告。人皮膚移植係經建立，接著將人腫瘤細胞植入該皮膚移植中，以使該腫瘤細胞得以生長於具有人基質及血管之環境中(Tahtis et al.,2003,Mol.Cancer Ther.2：229-737)。人皮膚樣本係取自新生兒包皮組織，並移植至NOD-SCID小鼠之側腹。建立該皮膚移植後，經螢光素酶標記之OMP-C8結腸腫瘤細胞(20,000細胞)被皮內注射至該人皮膚之中。腫瘤生長係利用生物發光造影之IVIS造影系統(Caliper Life Sciences,Mountain View,CA)監測。讓腫瘤繼續生長直到它們到達每秒1.2 x 106光子。負瘤小鼠(n=6小鼠/組)係經隨機分組，以接受對照Ab、抗hDLL4抗體21M18、抗VEGF抗體貝伐珠單抗(bevacizumab)或抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21M18治療。動物每周治療一次，抗體劑量25mg/kg係經腹膜內投予。於所示天數之腫瘤生長係藉由生物發光造影監測。
如圖5所示，抗hDLL4抗體21M18及抗VEGF抗體貝伐珠單抗(bevacizumab)皆抑制此人皮膚移植/人腫瘤模型中之腫瘤生長。另外，雙特異性抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21M18比單獨之抗DLL4抗體或抗VEGF抗體更為有效。這些資料顯示以雙特異性抗體同時拮抗DLL4及VEGF之效用。
實施例6 OMP-PN8胰腫瘤細胞在經抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體治療後之腫瘤發生性
負荷OMP-PN8胰腫瘤之小鼠係利用對照抗體(15 mg/kg)、抗hDLL4抗體21M18(15 mg/kg)、抗VEGF抗體貝伐珠單抗(bevacizumab)(15 mg/kg)或抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21M18或219R45-MB-21R79(30 mg/kg)治療，並添加或不添加吉西他濱(gemcitabine)(70 mg/kg)。經治療4周之後，採收腫瘤並加以處理成單細胞懸浮液，利用免疫磁珠去除小鼠細胞以純化人腫瘤細胞。將各治療組中90個人腫瘤細胞轉移至新的小鼠世代(n=10小鼠/組)。讓腫瘤在無任何治療下生長55天，以電子卡尺測量腫瘤體積。
圖6顯示各組中個別小鼠之腫瘤體積。分離自經抗hDLL4抗體21M18治療之小鼠的細胞大幅減低腫瘤發生性，其中10隻小鼠中的5隻發生腫瘤，相較於分離自經對照抗體治療之小鼠的細胞，其中10隻小鼠中的9隻發生腫瘤。腫瘤生長頻率之減少表示癌幹細胞頻率減少。相反地，貝伐珠單抗治療未導致腫瘤生長頻率減少，10隻中的10隻小鼠皆發生腫瘤。與貝伐珠單抗類似的是，以吉西他濱(gemcitabine)做為單一劑治療對腫瘤生長頻率無影響，因為10隻中的10隻小鼠皆發生腫瘤。抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21M18及219R45-MB-21R79皆減少腫瘤生長頻率(分別為10隻中的5隻小鼠 發生腫瘤及10隻中的4隻小鼠發生腫瘤)。與吉西他濱組合治療似乎對腫瘤生長頻率沒有影響。這些資料顯示以DLL4為標靶減少癌幹細胞頻率，單獨以VEGF為標靶時則無。重要的是，這些資料顯示抗DLL4抗體之抗CSC活性被保存於雙特異性抗體。
實施例7 雙特異性抗體ELISA
VEGF(ATGEN公司，南韓)以2ug/ml(100μl/孔)被包覆至紐克(Nunc)公司maxisorb孔盤上，於2至8℃隔夜培養。雙特異性抗體219R45-MB-21M18、219R45-MB-21R79、219R45-MB-21R75及219R45-MB-21R83係利用含有2μg/ml生物素-DLL4-hFc之封閉液(1x PBS，0.1%明膠，0.1%聚山梨醇酯20，pH 7.4)稀釋。該等抗體係自500ng/ml連續稀釋3倍至0.008ng/ml。抗體樣本係於含有生物素-DLL4-hFc之封閉液中培養2小時。在培養後，抗體樣本係經轉移至該VEGF包覆測試板(100 ul/孔)並培養2小時。鏈黴抗生物素蛋白HRP(傑克森免疫研究(Jackson ImmunoResearch)公司，West Grove,PA)被添加至各孔並培養1小時。TMB受質被加至各孔中等待10分鐘以發色，該反應係以2M硫酸停止。吸光度係於450-650nm讀取，資料利用Softmax Pro分析程式(分子儀器(Molecular Devices)公司，Sunnyvale,CA)之四參數擬合功能分析。
圖7顯示雙特異性抗體219R45-MB-21M18(空心圓圈)、219R45-MB-21R79(空心方塊)、219R45-MB-21R75(空心三角形)及219R45-MB-21R83(空心菱形)相較於參照抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體(實心圓圈)之滴定曲線。雙特異性抗體相較於參照雙特異性抗體之相對效力係顯示於表5。
雙特異性抗體219R45-MB-21R79最為有效，其效力約為219R45-MB-21M18之7倍，這反應該21R79抗原結合部位之較高親和性。
實施例8 雙特異性抗體產製
雙特異性抗體係利用GS-CHO細胞系生產。CHOK1SV細胞(Lonza Biologics)係經由電穿孔轉染感興趣之基因以及麩醯胺酸合成酶(GS)以作為可選擇之標誌。轉染株及次選殖株係經抗體產量之篩選，高生產細胞係經選擇以供大量生產。細胞係利用饋料批式方法於饋料批式生物反應器生長。在收集細胞培養液(HCCF)中累積之抗體係利用層析技術分離及純化。
雙特異性抗體細胞系219R45-MB-21M18.010.017及 219R45-MB-21R79.017.003係於5L攪拌槽生物反應器中培養14天。細胞系219R45-MB-21M18.010.017生產之終抗體力價為3.0g/L，細胞系219R45-MB-21R79.017.003生產之終抗體力價為0.8g/L。細胞系219R45-MB-21R75.101及219R45-MB-21R83.113係利用饋料批式方法培養於25L WAVE生物反應器系統(GE Healthcare)，達到終抗體力價0.4g/L。雙特異性抗體細胞系219R45-MB-21M18AG.138.007、219R45-MB-21M18AG.038.009、219R45-MB-21M18AG.142.002、219R45-MB-21R79AG.072.014及219R45-MB-21R83AG.129.003係於5L攪拌槽生物反應器中培養14至15天。細胞系219R45-MB-21M18AG.138.007在14天後生產之終抗體力價為1.0 g/L。細胞系219R45-MB-21M18AG.038.009在14天後生產之終抗體力價為1.6 g/L。細胞系219R45-MB-21M18AG.142.002在14天後生產之終抗體力價為2.6 g/L。細胞系219R45-MB-21R79AG.072.014在15天後生產之終抗體力價為2.1 g/L。細胞系219R45-MB-21M18AG.038.009在15天後生產之終抗體力價為2.4 g/L。培養液係自這四種細胞系之各者藉由過濾收集，以進行蛋白質A親和性層析。蛋白質A管柱係經一系列緩衝液清洗，抗體利用低pH洗脫液洗脫。初步特徵化該雙特異性抗體之純度係利用大小排除層析(SEC-HPLC)及等電點沉澱(IEF)實施。
大小排除層析(SFC)係用於測定該抗體產品之純 度。SEC係廣為周知之層析方法，其中溶液中之分子(例如抗體)係根據彼等之大小被分離。SEC可被用於區別抗體產品與聚集物及/或雜質，並測定該抗體產品相較於總混合物之百分比。如此處所使用，SEC無法區別同聚抗體及異二聚雙特異性抗體。
成像毛細管等電聚焦(icIEF)係用於測定雙特異性抗體異二聚體之特性及純度。使用icIEF，抗體之電荷異構體係根據彼等之pI分離，該結果係抗體之電荷分布之「指紋」。成像毛細管等電聚焦方法亦可作為純度之測定，其藉由雙特異性抗體異二聚體之獨特pI以分離彼等與任何同型二聚體產物或雜質。
雙特異性抗體樣本係於ProteinSimple ICE280儀器(ProteinSimple公司，Santa Clara,CA)藉由icIEF分析。以此分析而言，將蛋白質混合物導入毛細管，施加高電壓至該毛細管，兩性電解質會沿著該毛細管之長度建立線性pH梯度。在電場之影響下，pI標誌及蛋白質混合物皆沿著毛細管之長度移動，直到pH值到達該靜電荷係零之處。一旦聚焦之後，ICE280儀器利用280-nm UV相機進行全管柱成像檢測，以監測該毛細管內之蛋白質異構體之型式。該形成之電泳圖係利用內部pI標誌校正，經整合以建立該蛋白質混合物之不同帶電異構體之個別百分比區域。數種抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體之電荷特性係顯示於圖8。以此實驗而言，蛋白質A洗出液係利用MilliQ水稀釋至濃度6.6mg/ml。總共18μl之樣本係與 100μL之8M尿素、70μl之0.5%甲基纖維素、8μL之3-10Pharmalyte、2μl之高pI標誌及2μl之低pI標誌混合至終體積200μl。表6顯示源自細胞系219R45-MB-21M18.010.017、219R45-MB-21R79.017.002、219R45-MB-21R75.101、219R45-MB-21R83.113、219R45-MB-21M18.138.007、219R45-MB-21M18AG.038.009、219R45-MB-21M18AG.142.002、219R45-MB-21R79AG.072.014及219R45-MB-21R83AG.129.003之抗體產物在經蛋白質A親和性層析後藉由SEC-HPLC測定之百分比。表6亦顯示源自細胞系219R45-MB-21M18.010.017、219R45-MB-21R79.017.002、219R45-MB-21R75.101、219R45-MB-21R83.113、219R45-MB-21M18.138.007、219R45-MB-21M18AG.038.009、219R45-MB-21M18AG.142.002、219R45-MB-21R79AG.072.014及219R45-MB-21R83AG.129.003之異二聚體抗體在經蛋白質A親和性層析後藉由icIEF分析之百分比。
該雙特異性抗體產物之純度可藉由額外層析步驟進一步增加。在蛋白質A親和性層析之後，該洗出液組分被維持於室溫中低pH不少於60分鐘以使病毒失活。該抗體溶液(蛋白質A管柱洗出液，pH經調整)被加至強陰離子交換管柱。收集與陰離子交換層析樹脂結合之產物相關及方法相關雜質及該流出組分(抗體產物)。在一些情況中，純度係藉由使用多模態層析樹脂諸如陶瓷羥磷灰石以進一步提高。在一些情況中，該抗體產物之緩衝液交換係利用超過濾及滲濾技術進行，之後加入賦形劑。該經調製之抗體係經無菌過濾至無菌容器，並冷藏或冷凍儲存。該雙特異性抗體之純度利用SEC-HPLC及IEF再次測定。
如表7所示，在蛋白質A層析之後利用額外之層析步驟純化抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體導致分離出純度(由SEC分析)95%至約99%之抗體產物。IEF之分析顯示，源自細胞系219R45-MB-21M18.010.017之經純化之抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體係98.5%異二聚體，源自細 胞系219R45-MB-21R79.017.002之抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體係99.3%異二聚體，源自細胞系219R45-MB-21R75.101之抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體係98.2%異二聚體，源自細胞系219R45-MB-21R83.113之抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體係91.4%異二聚體，源自細胞系219R45-MB-21M18.138.007之抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體係100%異二聚體，源自細胞系219R45-MB-21M18AG.142.002之抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體係100%異二聚體，源自細胞系219R45-MB-21R79AG.072.014之抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體係100%異二聚體，及源自細胞系219R45-MB-21R83AG.129.003之抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體係100%異二聚體。這些結果顯示陰離子交換層析步驟相較於僅用蛋白質A層析純化大幅增加異二聚體抗體之百分比。添加多模態層析步驟諸如陶瓷羥磷灰石亦可提高單體純度(由SEP-HPLC測定)。
實施例9 抑制體內腫瘤復發模型中之OMP-C8結腸腫瘤生長
OMP-C8結腸腫瘤異種移植之單細胞懸浮液(20,000細胞)係經皮下注射至6至8周齡NOD/SCID小鼠之側腹。讓腫瘤生長33天直到達到平均體積240mm3。小鼠係經隨機分組(每組n=10)並接受抗hDLL4抗體21M18、抗VEGF抗體貝伐珠單抗(bevacizumab)、抗體21M18 與貝伐珠單抗之組合、抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21M18、抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21R79或對照抗體之治療，且所有治療組皆添加伊立替康(irinotecan)。抗體及伊立替康係藉由腹腔注射每周投予。抗體21M18及貝伐珠單抗係以7.5mg/kg之劑量投予，雙特異性抗體219R45-MB-21M18及219R45-MB-21R79係以15mg/kg投予，及伊立替康係以45mg/kg投予。伊立替康係經投予4周，之後停止投予伊立替康，但繼續投予抗體。監測腫瘤生長，於所示時間點以電子卡尺測量腫瘤體積。資料以平均值±SEM表示。
如圖9所示，在停止伊立替康治療之後，抗hDLL4抗體21M18持續抑制腫瘤生長。相反地，抗VEGF抗體貝伐珠單抗無法在伊立替康停止後抑制腫瘤復發。抗DLL4抗體21M18與抗VEGF抗體貝伐珠單抗之組合相較於各劑單獨使用導致較大程度之抑制腫瘤復發。另外，抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21M18相較於該兩種抗體之混合物能更有效地抑制腫瘤復發。
實施例10 減少OMP-C8結腸腫瘤之腫瘤發生性
OMP-C8結腸腫瘤異種移植之單細胞懸浮液(20,000細胞)係經皮下注射至6至8周齡NOD/SCID小鼠之側腹。讓腫瘤生長33天直到達到平均體積300mm3。小鼠係經隨機分組(每組n=5)並接受抗DLL4抗體21M18、抗 VEGF抗體貝伐珠單抗(bevacizumab)、抗體21M18與貝伐珠單抗之組合、抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21M18、抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21R79或對照抗體之治療，這些治療另添加或不添加伊立替康(irinotecan)。抗體及伊立替康係藉由腹腔注射每周投予。抗體21M18及貝伐珠單抗係以7.5mg/kg之劑量投予，雙特異性抗體219R45-MB-21M18及219R45-MB-21R79係以15mg/kg投予，及伊立替康係以45mg/kg投予。於4周後收集腫瘤，將其處理成單細胞懸浮液，然後分離人腫瘤細胞。將源自各實驗組之150個腫瘤細胞經皮下注射至新的小鼠世代(每組n=10)，讓腫瘤生長不予治療。監測腫瘤生長，以電子卡尺測量腫瘤體積。
第68天之個別腫瘤體積係顯示於圖10。作為單一劑使用之抗DLL4抗體21M18、21M18與抗VEGF抗體貝伐珠單抗之組合、雙特異性抗體219R45-MB-21M18、雙特異性抗體219R45-MB-21R79及伊立替康皆減少腫瘤生長頻率。相反地，作為單一劑使用之抗VEGF貝伐珠單抗相較於對照抗體並不影響腫瘤生長頻率。在伊立替康與抗體組合治療之組別中，雙特異性抗體219R45-MB-21M18最能有效減少腫瘤生長頻率。
實施例11 抑制體內OMP-C8結腸腫瘤生長
OMP-C8結腸腫瘤異種移植之單細胞懸浮液(50,000細胞)係經皮下注射至6至8周齡NOD/SCID小鼠之側腹。讓腫瘤生長21天直到達到平均體積80mm3。小鼠係經隨機分組(每組n=8)並接受抗DLL4抗體21M18、抗VEGF抗體貝伐珠單抗(bevacizumab)、抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21M18、219R45-MB-21R75、219R45-MB-21R79、219R45-MB-21R83或對照抗體之單獨治療，或與伊立替康組合治療。抗體及伊立替康係藉由腹腔注射每周投予。貝伐珠單抗及雙特異性抗體219R45-MB-21M18、219R45-MB-21R75、219R45-MB-21R79及219R45-MB-21R83係以15mg/kg之劑量投予，伊立替康係以7.5mg/kg之劑量投予。監測腫瘤生長，於所示時間點以電子卡尺測量腫瘤體積。資料以平均值±SEM表示。
作為單一劑投予時，所有四種抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體相較於抗VEGF抗體貝伐珠單抗顯示增加之抗腫瘤活性。與伊立替康組合時，抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21M18及219R45-MB-21R83之治療導致最高之抑制腫瘤生長(圖11)。
在治療期後，製備腫瘤切片並以蘇木精及伊紅(H&E)染色分析。經219R45-MB-21M18及219R45-MB-21R83與伊立替康之組合治療之腫瘤顯示暗粉紅色染色區，提供廣泛鈣化之證據。此為高度壞死腫瘤組織之特徵。
應了解此處所描述之實施例及實施態樣僅供說明示範之目的，各種對於彼等之修飾或改變將由該領域之技藝人士建議且將被納入本申請案之精神與範圍內。
所有此處所提及之公開資料、專利、專利申請案、網站及編號/資料庫序列包括多核苷酸及多肽序列在此係以參照方式整體納入此處以符合所有目的，和特別且獨立指出個別公開資料、專利、專利申請案、網站或編號/資料庫序列各自以參照方式被納入之範圍相同。
圖1：1A)抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21M18、219R45-MB-21M79、219R45-MB-21M75及219R45-MB-21M83之重鏈及輕鏈CDR；1B)重鏈及輕鏈可變區SEQ ID NO；1C)重鏈及輕鏈SEQ ID NO。
圖2：雙特異性抗體與人VEGF及人DLL4之同步結合之HTRF試驗。結果係以相對螢光單位(RFU)表示，其代表在665nm時之相對螢光強度與在620nm時之相對螢光強度之比值。219R45-MB-21M18(-●-)，219R45-MB-21R79(-■-)，219R45加21M18(-▲-)，219R45加21R79(-□-)，219R45(-▼-)，21M18(-◇-)，21R79(-○-)，對照抗體LZ-1(-△-)。
圖3：藉由抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體抑制經VEGF誘導之HUVEC增生。螢光強度係利用530nm之激發波長及590之發射波長讀取。219R45-MB-21M18(-●- )，219R45-MB-21R79(-▲-)，219R45(-■-)，不含VEGF之介質(-◇-)。
圖4：藉由抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體抑制經DLL4誘導之缺口傳訊。螢光素酶活性係利用雙重螢光素酶套組測量，其中螢火蟲螢光素酶活性係經正常化至水母冷光酶活性。219R45-MB-21M18(-●-)，219R45-MB-21R79(-■-)，21M18(-○-)；21R79(-□-)。
圖5：藉由抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體抑制活體內之結腸腫瘤生長。OMP-C8結腸腫瘤細胞係經皮下注射至NOD/SCID小鼠之人皮膚移植物。小鼠係利用對照抗體(-■-)、抗hDLL4抗體21M18(-▲-)、抗VEGF抗體貝伐珠單抗(bevacizumab)(-○-)或抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21M18(-▼-)治療。資料係以治療後天數之腫瘤體積(光子/秒)顯示。抗體係以25mg/kg每周一次之劑量經腹膜內投予。
圖6：胰腫瘤細胞在經抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體治療後之腫瘤發生性。源自經下列劑治療之小鼠的OMP-PN8腫瘤細胞係經處理為單細胞懸浮液，並連續移植至小鼠：有或無吉西他濱(gemcitabine)之對照抗體、抗hDLL4抗體21M18、抗VEGF抗體貝伐珠單抗、或抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21M18或219R45-MB-21R79。源自各治療組之90個細胞係經皮下注射至NOD/SCID小鼠。允許腫瘤在無治療之情況下生長。資料係以第55天之腫瘤體積(mm3)顯示。腫瘤頻率 係以腫瘤數量除以每組中經注射之小鼠總數計算。
圖7：雙特異性抗體ELISA。雙特異性抗體219R45-MB-21M18、219R45-MB-21R79、219R45-MB-21R75及219R45-MB-21R83係利用含有2μg/ml生物素-DLL4-hFc之封閉液(1x PBS，0.1%明膠，0.1%聚山梨醇酯20，pH 7.4)稀釋。該等抗體係自500ng/ml連續稀釋3倍至0.008ng/ml。抗體樣本係於含有生物素-DLL4-hFc之封閉液中培養2小時。在培養後，抗體樣本係經轉移至VEGF包覆測試板(100 ul/孔)並培養2小時。鏈黴抗生物素蛋白HRP被添加至各孔並培養1小時。TMB受質被加至各孔中等待10分鐘以發色，該反應係以2M硫酸停止。吸光度係於450-650nm讀取，資料利用Softmax Pro分析程式內之四參數擬合功能分析。
圖8：抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體之成像毛細管等電聚焦分析。
圖9：抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體於腫瘤復發模型中抑制結腸腫瘤生長。OMP-C8結腸腫瘤細胞係經皮下注射至NOD/SCID小鼠。小鼠經下列治療：對照抗體(-■-)、抗hDLL4抗體21M18(-●-)、抗VEGF抗體貝伐珠單抗(bevacizumab)(-▲-)、21M18與bevacizumab之組合(-▼-)、抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21M18(-◇-)或抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21R79(-○-)，以上皆與伊立替康(irinotecan)組合。抗體21M18及bevacizumab係以 7.5mg/kg每周一次之劑量經腹膜內投予，雙特異性抗體219R45-MB-21M18及219R45-MB-21R79係以15mg/kg每周一次之劑量經腹膜內投予，伊立替康係以45mg/kg之劑量於前四周投予。資料以治療後天數之腫瘤體積(mm3)顯示。
圖10：OMP-C3結腸腫瘤細胞在經抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體治療後之腫瘤發生性。源自經下列劑治療之小鼠的腫瘤係經處理為單細胞懸浮液，並連續移植至小鼠：有或無伊立替康(irinotecan)之對照抗體、抗hDLL4抗體21M18、抗VEGF抗體貝伐珠單抗、21M18與貝伐珠單抗之組合、或抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21M18或219R45-MB-21R79。源自各治療組之150個細胞係經皮下注射至NOD/SCID小鼠。允許腫瘤在無治療之情況下生長。資料係以第68天之腫瘤體積(mm3)顯示。
圖11：藉由抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體抑制活體內之結腸腫瘤生長。OMP-C8結腸腫瘤細胞係經皮下注射至NOD/SCID小鼠。小鼠係經下列劑治療：對照抗體(-■-)、抗VEGF抗體bevacizumab(-▲-)、或抗VEGF/抗DLL4雙特異性抗體219R45-MB-21M18(-◇-)、219R45-MB-21R75(-●-)、219R45-MB-21R79(-○-)或219R45-MB-21R83(-▼-)。小鼠係以單一劑(圖11A)或該劑與irinotecan之組合(圖11B)治療。抗體係以15mg/kg每周一次之劑量及irinotecan係以7.5mg/kg 每周一次之劑量經腹膜內投予。資料以治療後天數之腫瘤體積(mm3)顯示。
<110> 安可美德藥物股份有限公司(OncoMed Pharmaceuticals,Inc.)
<120> VEGF/DLL4結合劑類及彼等之用途
<140> TW 101134966
<141> 2012-09-24
<150> US 61/692,978
<151> 2012-08-24
<150> US 61/597,409
<151> 2012-02-10
<150> US 61/538,454
<151> 2011-09-23
<160> 80
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21M18重鏈含信號序列
<400> 1
<210> 2
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R79重鏈含信號序列
<400> 2
<210> 3
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 219R45重鏈含信號序列
<400> 3
<210> 4
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 輕鏈含信號序列
<400> 4
<210> 5
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21M18重鏈不含預期信號序列
<400> 5
<210> 6
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R79重鏈不含預期信號序列
<400> 6
<210> 7
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R79重鏈不含預期信號序列
<400> 7
<210> 8
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 輕鏈不含預期信號序列
<400> 8
<210> 9
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21M18重鏈可變區
<400> 9
<210> 10
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R79重鏈可變區
<400> 10
<210> 11
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R79重鏈可變區
<400> 11
<210> 12
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 輕鏈可變區
<400> 12
<210> 13
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R75、21R79、21R83及21M18重鏈CDR1
<400> 13
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R79重鏈CDR2
<400> 14
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21M18重鏈CDR2
<400> 15
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R75、21R79、21R83及21M18重鏈CDR3
<400> 16
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 219R45重鏈CDR1
<400> 17
<210> 18
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 219R45重鏈CDR2
<400> 18
<210> 19
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 219R45重鏈CDR3
<400> 19
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 輕鏈CDR1
<400> 20
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 輕鏈CDR2
<400> 21
<210> 22
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 輕鏈CDR3
<400> 22
<210> 23
<211> 522
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 23
<210> 24
<211> 496
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 24
<210> 25
<211> 128
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 25
<210> 26
<211> 63
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 26
<210> 27
<211> 232
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 27
<210> 28
<211> 206
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 28
<210> 29
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21M18重鏈核苷酸序列(13B版本1)
<400> 29
<210> 30
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R79重鏈核苷酸序列(13B版本1)
<400> 30
<210> 31
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R79重鏈核苷酸序列(13B版本2)
<400> 31
<210> 32
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 219R45重鏈核苷酸序列(13A版本1)
<400> 32
<210> 33
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 219R45重鏈核苷酸序列(13A版本2)
<400> 33
<210> 34
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 輕鏈核苷酸序列
<400> 34
<210> 35
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21M18重鏈可變區核苷酸序列
<400> 35
<210> 36
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R79重鏈可變區核苷酸序列(13B)
<400> 36
<210> 37
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R79重鏈可變區核苷酸序列(13B版本2)
<400> 37
<210> 38
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 219R45重鏈可變區核苷酸序列(13A版本1)
<400> 38
<210> 39
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 219R45重鏈可變區核苷酸序列(13A版本2)
<400> 39
<210> 40
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 輕鏈可變區核苷酸序列
<400> 40
<210> 41
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 41
<210> 42
<211> 326
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 42
<210> 43
<211> 377
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 43
<210> 44
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 44
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FLAG肽
<400> 45
<210> 46
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 親代21R79重鏈
<400> 46
<210> 47
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 親代219R45重鏈
<400> 47
<210> 48
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 親代21R79重鏈不含預期信號序列
<400> 48
<210> 49
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 親代219R45重鏈不含信號序列
<400> 49
<210> 50
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 親代21R79重鏈可變區
<400> 50
<210> 51
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 親代219R45重鏈可變區
<400> 51
<210> 52
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 親代21R79重鏈含信號序列
<400> 52
<210> 53
<211> 1398
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 親代219R45重鏈含信號序列
<400> 53
<210> 54
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 親代21R79及219R45輕鏈可變區
<400> 54
<210> 55
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 親代21R79及210R45輕鏈
<400> 55
<210> 56
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R75重鏈不含預期信號序列
<400> 56
<210> 57
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R75重鏈含預期信號序列
<400> 57
<210> 58
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R75重鏈可變區
<400> 58
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R75重鏈CDR2
<400> 59
<210> 60
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R75重鏈含信號序列(13B版本1)
<400> 60
<210> 61
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R75重鏈含信號序列(13B版本S1-2)
<400> 61
<210> 62
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R83重鏈不含預期信號序列
<400> 62
<210> 63
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R83重鏈含預期信號序列
<400> 63
<210> 64
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R83重鏈可變區
<400> 64
<210> 65
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R83重鏈CDR2
<400> 65
<210> 66
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R83重鏈含信號序列(13B版本1)
<400> 66
<210> 67
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R75重鏈含信號序列(13B版本S1-2)
<400> 67
<210> 68
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R75重鏈可變區(13B版本1)
<400> 68
<210> 69
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R75重鏈可變區(13B版本2)
<400> 69
<210> 70
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R83重鏈可變區(13B版本1)
<400> 70
<210> 71
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R75重鏈可變區(13B版本2)
<400> 71
<210> 72
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R83重鏈含信號序列(13B版本2)
<400> 72
<210> 73
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R83重鏈可變區(13B版本2)
<400> 73
<210> 74
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R75重鏈含信號序列(13B版本2)
<400> 74
<210> 75
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21M18重鏈(版本2)
<400> 75
<210> 76
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21M18重鏈可變區(版本2)
<400> 76
<210> 77
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R75重鏈含信號序列(13B版本1T)
<400> 77
<210> 78
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21R83重鏈含信號序列(13B版本1T)
<400> 78
<210> 79
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可供選擇之21R75、21R79、21R83及21M18重鏈CDR1
<400> 79
<210> 80
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗DLL4重鏈CDR2一致序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa係絲胺酸或丙胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa係絲胺酸、天冬醯胺酸或甘胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa係天冬醯胺酸或離胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa係甘胺酸、精胺酸或天冬胺酸
<400> 80

Claims (25)

  1. 一種雙特異性抗體，其包含：a)與人血管內皮生長因子(VEGF)特異性結合之第一抗原結合部位，及b)與人δ樣配體4(DLL4)特異性結合之第二抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3’該重鏈CDR1包含NYWMH(SEQ ID NO：17)，該重鏈CDR2包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO：18)且該重鏈CDR3包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO：19)；其中該第二抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)或AYYIH(SEQ ID NO：79)，該重鏈CDR2包含YIX1X2YX3X4ATNYNQKFKG(SEQ ID NO：80)，其中X1為絲胺酸或丙胺酸，X2為絲胺酸、天冬醯胺酸或甘胺酸，X3為天冬醯胺酸或離胺酸，及X4為甘胺酸、精胺酸或天冬胺酸，且該重鏈CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)；且其中該第一及第二抗原結合部位皆包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)且該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。
  2. 如申請專利範圍第1項之雙特異性抗體，其中該第二抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)，該重鏈CDR2包含YIANYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO：14)、YISSYNGATNYNQKFKG(SEQ ID NO：15)、YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQ ID NO：59)或YISNYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO：65)，且該重鏈CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)。
  3. 如申請專利範圍第2項之雙特異性抗體，其包含：(a)第一重鏈可變區，其包含SEQ ID NO：11；(b)第二重鏈可變區，其包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：64；及(c)第一及第二輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO：12。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之雙特異性抗體，其包含第一CH3結構域及第二CH3結構域，該第一CH3結構域及第二CH3結構域各自經改質以促進異多聚體之形成。
  5. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之雙特異性抗體，其中該第一及第二CH3結構域係根據靜電效應加以改質。
  6. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之雙特異性抗體，其為單株抗體、重組抗體、嵌合抗體、人化抗體、 人抗體、IgG1抗體或IgG2抗體。
  7. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之雙特異性抗體，其包含在對應SEQ ID NO：42之位置249及288的位置處具有胺基酸取代之第一人IgG2恆定區，及在對應SEQ ID NO：42之位置236及278的位置處具有胺基酸取代之第二人IgG2恆定區，其中該第一人IgG2恆定區中之胺基酸係經麩胺酸或天冬胺酸(aspartate)替代，且其中該第二人IgG2恆定區中之胺基酸係經離胺酸替代。
  8. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之雙特異性抗體，其：(i)抑制VEGF與至少一種VEGF受體結合；(ii)抑制DLL4與至少一種缺口(Notch)受體結合；(iii)抑制Notch傳訊，及/或(iv)調節血管生成。
  9. 如申請專利範圍第1項之雙特異性抗體，其包含(a)SEQ ID NO：7之重鏈；(b)SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：56之重鏈；及(c)SEQ ID NO：8之二個輕鏈。
  10. 一種雙特異性抗體，其係選自219R45-MB-21R83、219R45-MB-21M18、219R45-MB-21R79或219R45-MB-21R75，其中：219R45-MB-21R83含有由包含SEQ ID NO：74之DNA所編碼之重鏈、由包含SEQ ID NO：33之DNA所編碼之重鏈及由包含SEQ ID NO：34之DNA所編碼之輕鏈；219R45-MB-21M18含有由包含SEQ ID NO：75之DNA所編碼之重鏈、由包含SEQ ID NO：33之DNA所編碼之重鏈 及由包含SEQ ID NO：34之DNA所編碼之輕鏈；219R45-MB-21R79含有由包含SEQ ID NO：31之DNA所編碼之重鏈、由包含SEQ ID NO：33之DNA所編碼之重鏈及由包含SEQ ID NO：34之DNA所編碼之輕鏈；及219R45-MB-21R75含有由包含SEQ ID NO：72之DNA所編碼之重鏈、由包含SEQ ID NO：33之DNA所編碼之重鏈及由包含SEQ ID NO：34之DNA所編碼之輕鏈。
  11. 一種與人VEGF特異性結合之經分離之抗體，其包含：(a)重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含NYWMH(SEQ ID NO：17)，該重鏈CDR2包含DINPSNGRTSYKEKFKR(SEQ ID NO：18)且該重鏈CDR3包含HYDDKYYPLMDY(SEQ ID NO：19)；及(b)輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)且該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。
  12. 如申請專利範圍第11項之抗體，其包含：(a)重鏈可變區，其包含SEQ ID NO：11；及(b)輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO：12。
  13. 如申請專利範圍第11項之抗體，其包含：(a)重鏈，其包含SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：7；及(b)輕鏈，其包含SEQ ID NO：8。
  14. 如第11至13項中任一項之抗體，其抑制VEGF與至少一種VEGF受體結合。
  15. 如第11至13項中任一項之抗體，其係單株抗體、重組抗體、嵌合抗體、人化抗體、人抗體、雙特異性抗體、IgG1抗體、IgG2抗體或包含抗原結合部位之抗體片段。
  16. 一種與人DLL4特異性結合之經分離之抗體，其包含：(a)重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)或AYYIH(SEQ ID NO：79)，該重鏈CDR2包含YIX1X2YX3X4ATNYNQKFKG(SEQ ID NO：80)，其中X1為絲胺酸或丙胺酸，X2為天冬醯胺酸或甘胺酸，X3為天冬醯胺酸或離胺酸，及X4為精胺酸或天冬胺酸，且該重鏈CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)；且(b)輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含RASESVDNYGISFMK(SEQ ID NO：20)，該輕鏈CDR2包含AASNQGS(SEQ ID NO：21)且該輕鏈CDR3包含QQSKEVPWTFGG(SEQ ID NO：22)。
  17. 如申請專利範圍第16項之抗體，其包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TAYYIH(SEQ ID NO：13)，該重鏈CDR2包含YISNYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO65)、YIANYNRATNYNQKFKG(SEQ ID NO：14)或YIAGYKDATNYNQKFKG(SEQ ID NO：59)，且該重鏈 CDR3包含RDYDYDVGMDY(SEQ ID NO：16)。
  18. 如申請專利範圍第17項之抗體，其包含：(a)重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：58；及(b)輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：12。
  19. 如申請專利範圍第16至18項中任一項之抗體，其係單株抗體、重組抗體、嵌合抗體、人化抗體、人抗體、雙特異性抗體、IgG1抗體、IgG2抗體或包含抗原結合部位之抗體片段。
  20. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至19項中任一項之抗體及醫藥上可接受之載劑。
  21. 一種經分離之多核苷酸分子，其包含編碼如申請專利範圍第1至19項中任一項之抗體的核苷酸序列。
  22. 一種如申請專利範圍第1至19項中任一項之抗體於製備藥物之用途，該藥物係用於治療癌。
  23. 如申請專利範圍第22項之用途，其中該癌係選自結直腸癌、結腸癌、卵巢癌、胰癌、肺癌、肝癌、乳癌、腎癌、前列腺癌、胃腸道癌、黑色素瘤、子宮頸癌、膀胱癌、神經膠母細胞瘤、頭頸癌、淋巴瘤或白血病。
  24. 如申請專利範圍第22或23項之用途，其中該癌之治療包含至少一種另外的治療劑。
  25. 如申請專利範圍第24項之用途，其中該另外的治療劑係化學治療劑或第二抗體。
TW101134966A 2011-09-23 2012-09-24 Ｖｅｇｆ／ｄｌｌ４結合劑類及彼等之用途 TWI583699B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161538454P 2011-09-23 2011-09-23
US201261597409P 2012-02-10 2012-02-10
US201261692978P 2012-08-24 2012-08-24

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201326204A TW201326204A (zh) 2013-07-01
TWI583699B true TWI583699B (zh) 2017-05-21

Family

ID=47914946

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW101134966A TWI583699B (zh) 2011-09-23 2012-09-24 Ｖｅｇｆ／ｄｌｌ４結合劑類及彼等之用途

Country Status (33)

Country Link
US (8) US8858941B2 (zh)
EP (2) EP3485903B1 (zh)
JP (1) JP6170496B2 (zh)
KR (1) KR102091293B1 (zh)
CN (2) CN107722122B (zh)
AU (1) AU2013201095C1 (zh)
BR (1) BR112014007035B1 (zh)
CA (1) CA2849562C (zh)
CL (1) CL2014000725A1 (zh)
CO (1) CO6940382A2 (zh)
CR (1) CR20140172A (zh)
CY (1) CY1121148T1 (zh)
DK (2) DK3485903T3 (zh)
EA (1) EA029958B1 (zh)
ES (2) ES2707580T3 (zh)
FI (1) FI3485903T3 (zh)
HK (1) HK1199209A1 (zh)
HR (2) HRP20230078T1 (zh)
HU (2) HUE042192T2 (zh)
IL (1) IL231628B (zh)
IN (1) IN2014KN00871A (zh)
LT (2) LT2758073T (zh)
MX (2) MX361712B (zh)
MY (1) MY188192A (zh)
NI (1) NI201400024A (zh)
PE (1) PE20141537A1 (zh)
PL (2) PL2758073T3 (zh)
PT (2) PT3485903T (zh)
RS (2) RS63965B1 (zh)
SG (1) SG11201400870WA (zh)
SI (2) SI3485903T1 (zh)
TW (1) TWI583699B (zh)
WO (1) WO2013044215A1 (zh)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL2066694T3 (pl) 2006-09-29 2016-04-29 Oncomed Pharm Inc Kompozycje i sposoby diagnozowania i leczenia nowotworu
CN102459346B (zh) 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
EP2470568A2 (en) 2009-08-29 2012-07-04 Abbott Laboratories Therapeutic dll4 binding proteins
ES2895226T3 (es) 2009-10-16 2022-02-18 Mereo Biopharma 5 Inc Combinación terapéutica y uso de anticuerpos antagonistas de DLL4 y agentes antihipertensivos
SG10201501562VA (en) 2010-03-02 2015-04-29 Abbvie Inc Therapeutic dll4 binding proteins
MX341579B (es) 2010-08-03 2016-08-25 Abbvie Inc * Inmunoglobulinas de dominio variable doble y usos de las mismas.
US8551479B2 (en) 2010-09-10 2013-10-08 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating melanoma
US9527925B2 (en) 2011-04-01 2016-12-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2
PE20141537A1 (es) 2011-09-23 2014-11-17 Oncomed Pharm Inc Agentes de ligacion al factor de crecimiento endotelial vascular/ligando 4 similar a delta (vegf/dll4) y usos de los mismos
US9550830B2 (en) 2012-02-15 2017-01-24 Novo Nordisk A/S Antibodies that bind and block triggering receptor expressed on myeloid cells-1 (TREM-1)
KR102134088B1 (ko) 2012-08-24 2020-07-14 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 Ror1 암을 치료하고 전이를 저해하는데 이용을 위한 항체와 백신
US20150368329A1 (en) * 2012-10-15 2015-12-24 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods of Treating Ocular Diseases
EP2914961A4 (en) 2012-10-31 2016-04-20 Oncomed Pharm Inc METHODS AND MONITORING A TREATMENT BY AN ANTAGONIST OF DLL4
TW202210507A (zh) 2012-11-01 2022-03-16 美商艾伯維有限公司 抗-vegf/dll4雙重可變區域免疫球蛋白及其用途
PL3020731T3 (pl) * 2013-07-09 2019-11-29 Ablbio Nowe podwójnie nakierowane białko specyficznie wiążące się z dll4 i vegf oraz zastosowanie tego białka
WO2015130751A1 (en) * 2014-02-26 2015-09-03 Medimmune, Llc Methods of treatment with dll4 antagonists
EP3125937A4 (en) * 2014-04-04 2017-11-01 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Treatment of gastric cancer
TWI593967B (zh) * 2014-05-01 2017-08-01 高雄醫學大學 二級抗體所辨識之抗原決定位及其用途
US9914774B2 (en) 2014-07-11 2018-03-13 Genentech, Inc. Notch pathway inhibition
JP6738316B2 (ja) 2014-07-17 2020-08-12 ノヴォ ノルディスク アクティーゼルスカブ 粘度を低下させるためのｔｒｅｍ−１抗体の部位特異的変異誘発
KR102390359B1 (ko) * 2014-09-29 2022-04-22 삼성전자주식회사 폴리펩타이드, 이를 포함하는 항 VEGF 항체 및 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체
ES2808153T3 (es) * 2014-10-31 2021-02-25 Mereo Biopharma 5 Inc Terapia de combinación para tratamiento de enfermedad
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
EP3353204B1 (en) * 2015-09-23 2023-10-18 Mereo BioPharma 5, Inc. Bi-specific anti-vegf/dll4 antibody for use in treating platinum-resistant ovarian cancer
WO2017175086A1 (en) * 2016-04-05 2017-10-12 Pfizer Inc. Cell culture process
CN105669871A (zh) * 2016-04-19 2016-06-15 中国药科大学 一种胸腺肽α1的融合蛋白
EP3474854A4 (en) 2016-06-27 2020-02-19 The Regents of The University of California DRUG ASSOCIATIONS FOR THE TREATMENT OF CANCER
CA3058790A1 (en) * 2017-04-24 2018-11-01 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anti-cd33 antibody agents
US20190056350A1 (en) * 2017-08-18 2019-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Image capillary isoelectric focusing to analyze protein variants in a sample matrix
US11155618B2 (en) 2018-04-02 2021-10-26 Bristol-Myers Squibb Company Anti-TREM-1 antibodies and uses thereof
WO2020102644A2 (en) 2018-11-15 2020-05-22 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods and monitoring of treatment with vegf/dll4 binding agent
KR20220094193A (ko) 2019-11-07 2022-07-05 온세르나 테라퓨틱스, 인크. 종양 미세환경의 분류
CN111234003B (zh) * 2020-02-07 2022-02-01 中国人民解放军第四军医大学 一种用于癌症靶向治疗的短肽及基于其的超声响应纳米载药微泡和应用
AU2022245322A1 (en) 2021-03-25 2023-10-05 Oncxerna Therapeutics, Inc. Targeted therapies in cancer
CN114369158B (zh) * 2021-09-28 2024-04-19 北京亦科信息菌素研究院有限公司 一种抗新冠病毒的信息菌素及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010129304A2 (en) * 2009-04-27 2010-11-11 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules

Family Cites Families (204)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US994637A (en) 1910-09-14 1911-06-06 Dexter Folder Co Paper-cutting machine.
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
CA1176659A (en) 1981-09-14 1984-10-23 Gerhard Degischer Process for producing n-substituted-n-acetyl-2,6- dialkylanilines
US4588585A (en) 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5681718A (en) 1986-03-14 1997-10-28 Celltech Limited Methods for enhanced production of tissue plasminogen activator in cell culture using alkanoic acids or salts thereof
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5219837A (en) 1990-06-21 1993-06-15 Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of stimulating myelination of cells
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
DK0814159T3 (da) 1990-08-29 2005-10-24 Genpharm Int Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
WO1992009690A2 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US6582959B2 (en) 1991-03-29 2003-06-24 Genentech, Inc. Antibodies to vascular endothelial cell growth factor
IL101728A (en) 1991-05-03 2007-08-19 Univ Yale Human Abandonment and Delta, Restrictive Areas of Effect in Tophoric Proteins, and Methods Based on Them
ATE463573T1 (de) 1991-12-02 2010-04-15 Medimmune Ltd Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
US5786158A (en) 1992-04-30 1998-07-28 Yale University Therapeutic and diagnostic methods and compositions based on notch proteins and nucleic acids
US20050112121A1 (en) 1992-04-30 2005-05-26 Yale University Therapeutic and diagnostic methods and compositions based on notch proteins and nucleic acids
US5840299A (en) 1994-01-25 1998-11-24 Athena Neurosciences, Inc. Humanized antibodies against leukocyte adhesion molecule VLA-4
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
CA2226087C (en) 1995-06-28 2012-01-31 Imperial Cancer Research Technology, Ltd. Nucleotide and protein sequences of vertebrate delta genes and methods based thereon
AU725609C (en) 1995-08-18 2002-01-03 Morphosys Ag Protein/(poly)peptide libraries
US7264963B1 (en) 1995-08-18 2007-09-04 Morphosys Ag Protein(poly)peptide libraries
US5730977A (en) 1995-08-21 1998-03-24 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Anti-VEGF human monoclonal antibody
JPH09124697A (ja) 1995-11-01 1997-05-13 Toagosei Co Ltd ペプチド及びモノクローナル抗体
EP0861894B1 (en) 1995-11-17 2006-03-08 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Differentiation-suppressive polypeptide
US20020137890A1 (en) 1997-03-31 2002-09-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6121045A (en) 1997-04-04 2000-09-19 Millennium Biotherapeutics, Inc. Human Delta3 nucleic acid molecules
US20060122373A1 (en) 1997-04-04 2006-06-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Delta3, FTHMA-070, Tango85, Tango77, SPOIL,NEOKINE, Tango129 and integrin alpha subunit protein and nucleic acid molecules and uses thereof
US20030180784A1 (en) 1997-04-04 2003-09-25 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel human Delta3 compositions and therapeutic and diagnostic uses therefor
EP0972041B2 (en) 1997-04-04 2017-01-18 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel human delta3 compositions and therapeutic and diagnostic uses therefor
JP3957765B2 (ja) 1997-04-07 2007-08-15 ジェネンテク・インコーポレイテッド 抗ｖｅｇｆ抗体
US20020032315A1 (en) 1997-08-06 2002-03-14 Manuel Baca Anti-vegf antibodies
US20070059302A1 (en) 1997-04-07 2007-03-15 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
US7951917B1 (en) 1997-05-02 2011-05-31 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
CA2288600C (en) 1997-05-02 2010-06-01 Genentech, Inc. A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
AU730782B2 (en) 1997-05-14 2001-03-15 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Novel differentiation-inhibitor
WO1998057621A1 (en) 1997-06-18 1998-12-23 The Trustees Of Columbia University In The City Ofnew York Angiogenic modulation by notch signal transduction
US6004528A (en) 1997-09-18 1999-12-21 Bergstein; Ivan Methods of cancer diagnosis and therapy targeted against the cancer stemline
WO2000002897A2 (en) 1998-07-13 2000-01-20 Yale University Delta cleavage products and methods based thereon
CA2337492A1 (en) 1998-07-27 2000-02-10 Amgen Inc. Delta-related polypeptides
US6342221B1 (en) 1999-04-28 2002-01-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody conjugate compositions for selectively inhibiting VEGF
DE60044997D1 (de) 1999-07-02 2010-11-04 Morphosys Ag Erzeugung spezifischer bindungspartner die an von genomischen dns-fragmenten oder ests kodierten (poly)peptiden binden
US6703221B1 (en) 1999-08-19 2004-03-09 Chiron Corporation Notch receptor ligands and uses thereof
CA2491610A1 (en) 1999-12-01 2001-06-07 Kevin P. Baker Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20110131679A2 (en) * 2000-04-19 2011-06-02 Thomas La Rosa Rice Nucleic Acid Molecules and Other Molecules Associated with Plants and Uses Thereof for Plant Improvement
US20020028488A1 (en) 2000-06-19 2002-03-07 Sujay Singh Transgenic avian species for making human and chimeric antibodies
US6984522B2 (en) 2000-08-03 2006-01-10 Regents Of The University Of Michigan Isolation and use of solid tumor stem cells
US8044259B2 (en) 2000-08-03 2011-10-25 The Regents Of The University Of Michigan Determining the capability of a test compound to affect solid tumor stem cells
US6689744B2 (en) 2000-09-22 2004-02-10 Genentech, Inc. Notch receptor agonists and uses
EP2354149B1 (en) 2000-12-12 2017-08-30 MedImmune, LLC Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
US7667004B2 (en) 2001-04-17 2010-02-23 Abmaxis, Inc. Humanized antibodies against vascular endothelial growth factor
JP2004537314A (ja) 2001-07-25 2004-12-16 ロランティス リミテッド ノッチシグナル伝達モジュレーターを検出する方法
US7820178B2 (en) 2001-08-01 2010-10-26 University of Brisol VEGF isoforms and their use as anti-angiogenic, anti-vasodilatory, anti-permeability and anti-proliferative agents
US6833441B2 (en) 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
CA2465304A1 (en) 2001-11-14 2003-05-22 Lorantis Limited Composition comprising inhibitors of the notch signalling pathway for the modulation of the immune system
AU2002339157A1 (en) 2001-11-14 2003-05-26 Lorantis Limited Inhibitors of the notch signalling pathway for use in the treatment of cancer
US20050137130A1 (en) 2001-11-14 2005-06-23 Bodmer Mark W. Medical treatment
JP2005511754A (ja) 2001-12-07 2005-04-28 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 乳癌幹細胞の予測的同定および特徴づけ
US8034904B2 (en) 2002-06-14 2011-10-11 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
CN100480260C (zh) 2002-07-18 2009-04-22 克鲁塞尔荷兰公司 抗体混合物的重组生产
GB0216648D0 (en) 2002-07-18 2002-08-28 Lonza Biologics Plc Method of expressing recombinant protein in CHO cells
GB0218879D0 (en) 2002-08-14 2002-09-25 Lorantis Ltd Medical treatment
EP1537145A1 (en) 2002-09-10 2005-06-08 Lorantis Limited Pharmaceutical compositions and medical treatments comprising notch ligand proteins
WO2004024068A2 (en) 2002-09-11 2004-03-25 Genentech, Inc. Novel composition and methods for the treatment of immune related diseases
US7365168B2 (en) 2002-10-15 2008-04-29 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
CN1511850A (zh) 2002-12-31 2004-07-14 王小宁 Mhc-肽抗体多聚体的制备方法
WO2004110490A2 (en) 2003-06-06 2004-12-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of vegf inhibitors for tumor regression
US7758859B2 (en) 2003-08-01 2010-07-20 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
US20050106667A1 (en) 2003-08-01 2005-05-19 Genentech, Inc Binding polypeptides with restricted diversity sequences
CA2534898A1 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Immunomedics, Inc. Bispecific antibodies for inducing apoptosis of tumor and diseased cells
FR2859725B1 (fr) 2003-09-16 2006-03-10 Neovacs Procede a haut rendement pour l'obtention d'anticorps humains neutralisant l'activite biologique d'une cytokine humaine
JP2008504002A (ja) 2003-11-12 2008-02-14 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）結合ポリペプチド改変体、ダイマーＦｃ結合タンパク質、およびそれらに関連する方法
EP1699818A2 (en) 2003-12-05 2006-09-13 Angiogenetics Sweden AB Angiogenesis affecting polypeptides, proteins, and compositions, and methods of use
AU2005209909B8 (en) 2004-02-03 2009-01-15 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for characterizing, regulating, diagnosing, and treating cancer
EP1725585A2 (en) 2004-03-10 2006-11-29 Lonza Ltd Method for producing antibodies
EP1753442A2 (en) 2004-06-10 2007-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of administering and using vegf inhibitors for the treatment of human cancer
JP4838794B2 (ja) 2004-06-15 2011-12-14 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 心臓毒性医薬の結果として心血管合併症に罹患するリスクを診断するための心臓ホルモンの使用
WO2006009809A2 (en) 2004-06-18 2006-01-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vegf inhibitors for the treatment of malignant pleural effusion
EP1615036B1 (en) 2004-07-07 2007-09-19 F.Hoffmann-La Roche Ag Multimarker panel for diabetes type 1 and 2
US20080312425A1 (en) 2004-08-30 2008-12-18 Lonza Biologics Plc. Ion Exchange Chromatography and Purification of Antibodies
AU2005282700A1 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Genentech, Inc. Heteromultimeric molecules
WO2006027693A2 (en) 2004-09-09 2006-03-16 Exonhit Therapeutics Sa Tumor specific genes and variant rnas and uses thereof as targets for cancer therapy and diagnosis
EP1810979B1 (en) 2004-09-22 2012-06-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. STABILIZED HUMAN IgG4 ANTIBODIES
US20060134121A1 (en) 2004-10-29 2006-06-22 Gavin Thurston DII4 antagonists, assays, and therapeutic methods thereof
US8048418B2 (en) 2004-10-29 2011-11-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic methods for inhibiting tumor growth with combination of Dll4 antagonists and VEGF antagonists
CA2586781A1 (en) 2004-11-10 2006-05-18 Hubrecht Laboratorium Treatment of an intestinal adenoma and/or adenocarcinoma by inhibition of notch pathway activation
US7598043B2 (en) 2004-11-19 2009-10-06 Cornell Research Foundation, Inc. Use of vascular endothelial growth factor receptor 1+ cells in treating and monitoring cancer and in screening for chemotherapeutics
US7432107B2 (en) 2005-01-24 2008-10-07 Roche Diagnostics Operations, Inc. Cardiac hormones for assessing cardiovascular risk
EP1986012B1 (en) 2005-01-24 2012-06-06 F. Hoffmann-La Roche AG The use of Bnp-type peptides for assessing the risk of suffering from heart failure as a consequence of volume overload
JP2008537538A (ja) 2005-02-11 2008-09-18 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｖｅｇｆ拮抗剤及び降圧剤の治療的組み合わせ
AU2006232287B2 (en) 2005-03-31 2011-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
ES2707152T3 (es) 2005-04-15 2019-04-02 Macrogenics Inc Diacuerpos covalentes y usos de los mismos
AU2006244885B2 (en) 2005-05-09 2011-03-31 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Human monoclonal antibodies to programmed death 1(PD-1) and methods for treating cancer using anti-PD-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics
WO2006124667A2 (en) 2005-05-12 2006-11-23 Zymogenetics, Inc. Compositions and methods for modulating immune responses
BRPI0611009A2 (pt) 2005-06-02 2010-08-10 Galaxy Biotech Llc usos de um anticorpo monoclonal (mab), e, de um anticorpo anti-hgf de neutralização
CN101237880B (zh) 2005-08-12 2011-09-21 瑞泽恩制药公司 通过vegf拮抗剂的皮下给药治疗疾病
US7774903B2 (en) 2005-08-16 2010-08-17 Lummus Corporation Roller gin apparatus, method and system
EP1928486A2 (en) 2005-09-01 2008-06-11 Vasgene Therapeutics, Inc. Methods for using and identifying modulators of delta-like 4
US7906116B2 (en) 2005-09-01 2011-03-15 Parkash Gill Methods for using and identifying modulators of Delta-like 4
AR056142A1 (es) 2005-10-21 2007-09-19 Amgen Inc Metodos para generar el anticuerpo igg monovalente
JP5129149B2 (ja) 2005-10-31 2013-01-23 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 癌を処置および診断するための組成物および方法
PT1962895E (pt) 2005-12-16 2013-03-28 Regeneron Pharma Utilização terapêutica de um antagonista dll4 e de um inibidor fcev para inibição de crescimento de tumores
WO2007098387A2 (en) 2006-02-17 2007-08-30 Gilead Colorado, Inc. Antihypertensive therapy
US8133857B2 (en) 2006-03-07 2012-03-13 The Brigham and Women's FHospital, Inc. NOTCH inhibition in the treatment of atherosclerosis
WO2011053822A2 (en) 2009-11-01 2011-05-05 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Notch inhibition in the treatment and prevention of obesity and metabolic syndrome
US7354582B2 (en) 2006-03-10 2008-04-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of VEGF antagonists for the treatment of malignant gliomas
PL1999154T3 (pl) 2006-03-24 2013-03-29 Merck Patent Gmbh Skonstruowane metodami inżynierii heterodimeryczne domeny białkowe
BRPI0710411A2 (pt) 2006-06-06 2012-04-10 Genentch Inc Empresa Americana Métodos para tratar um tumor, para tratar uma condição patológica associada à angiogênese, para estimular a proliferação celular endotelial, para reduzir ou inibir a diferenciação celular endotelial, para reduzir ou inibir o desenvolvimento arterial, para reduzir ou inibir a perfusão vascular tumoral para aumentar a eficácia de um agente anti-angiogênico, usos de um antagonista de dll4 e uso de um agonisra de dll4
AU2007319672B2 (en) 2006-06-06 2011-06-30 Genentech, Inc. Anti-DLL4 antibodies and methods using same
US7919092B2 (en) 2006-06-13 2011-04-05 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to notch receptors
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
MX2009000674A (es) 2006-08-07 2009-02-04 Regeneron Pharma Metodos terapeuticos para el tratamiento de trastornos oculares vasculares con antagonistas de dll4.
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
PL2066694T3 (pl) 2006-09-29 2016-04-29 Oncomed Pharm Inc Kompozycje i sposoby diagnozowania i leczenia nowotworu
UA110315C2 (uk) * 2006-09-29 2015-12-25 Oncomed Pharm Inc Композиція та спосіб лікування раку
MX2009004027A (es) 2006-10-20 2009-09-28 Schering Corp Anticuerpos anti factor de crecimiento endotelial vascular completamente humanos y metodos de uso.
US8466154B2 (en) 2006-10-27 2013-06-18 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods and compositions related to wrapping of dehydrons
WO2008070042A2 (en) 2006-12-04 2008-06-12 Medimmune, Inc. High potency recombinant antibodies, methods for producing them and use in cancer therapy
ZA200903489B (en) 2006-12-11 2010-08-25 Genentech Inc Compositions and methods for treating a neoplasm
RU2448979C2 (ru) 2006-12-14 2012-04-27 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Антитела человека к дельта-подобному лиганду-4 человека
MX2009006779A (es) 2006-12-19 2009-08-27 Genentech Inc Antagonistas especificos para terapia con adyuvantes y neo-adyuvantes y el tratamiento de tumores en etapa temprana.
EP2120996A2 (en) 2006-12-20 2009-11-25 Vasgene Therapeutics, Inc. Methods for using and identifying modulators of delta-like 4
US7691980B2 (en) 2007-01-09 2010-04-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enhanced capacity and purification of antibodies by mixed mode chromatography in the presence of aqueous-soluble nonionic organic polymers
WO2008091222A1 (en) 2007-01-26 2008-07-31 Bioinvent International Ab Dll4 signaling inhibitors and uses thereof
CA2686414A1 (en) 2007-05-04 2008-11-13 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating disorders associated with salt or fluid retention
GB0709333D0 (en) 2007-05-15 2007-06-20 Smart Targeting Ltd Binding protein
CN101918579A (zh) 2007-10-22 2010-12-15 先灵公司 完全人抗-vegf抗体和使用方法
WO2009053987A1 (en) 2007-10-25 2009-04-30 University Of Bristol Antibodies specific to pro-angiogenic isoforms of vascular endothelial growth factor (vegf)
TWI468417B (zh) 2007-11-30 2015-01-11 Genentech Inc 抗－ｖｅｇｆ抗體
WO2009075565A1 (en) 2007-12-12 2009-06-18 Erasmus University Medical Center Rotterdam Methods for controlling vasculogenesis
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
WO2009092010A1 (en) 2008-01-18 2009-07-23 Gagnon Peter S Enhanced purification of phosphorylated and non-phosphorylated biomolecules by apatite chromatography
EP2260058A2 (en) 2008-04-07 2010-12-15 Ablynx N.V. Single variable domains against the notch pathways
HUE036780T2 (hu) 2008-04-09 2018-07-30 Genentech Inc Új kompozíciók és eljárások immunológiai vonatkozású betegségek kezelésére
US20100260668A1 (en) 2008-04-29 2010-10-14 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
EP2282769A4 (en) * 2008-04-29 2012-04-25 Abbott Lab DUAL VARIABLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND ITS USES
WO2010005567A2 (en) 2008-07-08 2010-01-14 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Notch1 receptor binding agents and methods of use thereof
JP2011528798A (ja) 2008-07-23 2011-11-24 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 抗血管形成療法のモニター
WO2010010153A1 (en) 2008-07-23 2010-01-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Identification of subjects being susceptible to anti-angiogenesis therapy
KR20110057244A (ko) 2008-09-19 2011-05-31 메디뮨 엘엘씨 Ｄｌｌ4에 대한 항체 및 이의 용도
CA2742968C (en) 2008-11-07 2020-06-09 Fabrus Llc Combinatorial antibody libraries and uses thereof
UA105198C2 (ru) * 2008-12-12 2014-04-25 Берингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх Антитело против инсулиноподобных факторов роста
RU2011147051A (ru) 2009-04-20 2013-05-27 Дженентек, Инк. Адъювантная терапия рака
WO2010124009A2 (en) 2009-04-21 2010-10-28 Schering Corporation Fully human anti-vegf antibodies and methods of using
TWI513465B (zh) 2009-06-25 2015-12-21 Regeneron Pharma 以ｄｌｌ４拮抗劑與化學治療劑治療癌症之方法
CA2766166A1 (en) 2009-07-08 2011-01-13 Amgen Inc. Design of stable and aggregation free antibody fc molecules through ch3 domain interface engineering
EP2470568A2 (en) 2009-08-29 2012-07-04 Abbott Laboratories Therapeutic dll4 binding proteins
SG178602A1 (en) 2009-09-01 2012-04-27 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
UY32917A (es) 2009-10-02 2011-04-29 Boehringer Ingelheim Int Moléculas de unión a dll-4
UY32920A (es) * 2009-10-02 2011-04-29 Boehringer Ingelheim Int Moleculas de unión biespecíficas para la terapia anti-angiogénesis
ES2895226T3 (es) 2009-10-16 2022-02-18 Mereo Biopharma 5 Inc Combinación terapéutica y uso de anticuerpos antagonistas de DLL4 y agentes antihipertensivos
CN102686609A (zh) 2009-10-23 2012-09-19 加文医学研究所 修饰的可变域分子及其生产和使用方法
US20110165162A1 (en) * 2009-12-01 2011-07-07 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for Treating Cancers Comprising K-ras Mutations
JO3183B1 (ar) 2010-01-29 2018-03-08 Regeneron Pharma طرق لمعالجة أمراض المناعة الذاتية مضادات dll4
AU2011215685B2 (en) 2010-02-12 2015-08-20 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for identifying and isolating cells expressing a polypeptide
EP2539367A2 (en) 2010-02-23 2013-01-02 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-angiogenesis therapy for the treatment of ovarian cancer
SG10201501562VA (en) * 2010-03-02 2015-04-29 Abbvie Inc Therapeutic dll4 binding proteins
BR112013010857A2 (pt) 2010-11-02 2016-09-13 Abbott Laboratoires imonoglubulinas de duplo domínio variável e usos das mesmas
US20130323265A1 (en) 2010-11-15 2013-12-05 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating cancer with dll4 antagonists
WO2012092539A2 (en) 2010-12-31 2012-07-05 Takeda Pharmaceutical Company Limited Antibodies to dll4 and uses thereof
TWI530489B (zh) 2011-03-22 2016-04-21 必治妥美雅史谷比公司 雙（氟烷基）－１，４－苯二氮呯酮化合物
EP2721070A1 (en) 2011-06-17 2014-04-23 Harris, Adrian, L. Methods of enhancing the response to radiation in tumor therapy using anti-dll4 antibodies
PE20141537A1 (es) 2011-09-23 2014-11-17 Oncomed Pharm Inc Agentes de ligacion al factor de crecimiento endotelial vascular/ligando 4 similar a delta (vegf/dll4) y usos de los mismos
EP2855522A1 (en) 2012-02-03 2015-04-08 MedImmune Limited Process for reducing antibody aggregate levels and antibodies produced thereby
PL2825558T3 (pl) 2012-03-13 2019-11-29 Hoffmann La Roche Terapia skojarzona w leczeniu raka jajnika
SG11201407190TA (en) 2012-05-15 2014-12-30 Bristol Myers Squibb Co Cancer immunotherapy by disrupting pd-1/pd-l1 signaling
WO2014062245A2 (en) 2012-05-31 2014-04-24 Sorrento Therapeutics Inc. Antigen binding proteins that bind dll-4
AR092325A1 (es) 2012-05-31 2015-04-15 Regeneron Pharma Formulaciones estabilizadas que contienen anticuerpos anti-dll4 y kit
KR101535341B1 (ko) 2012-07-02 2015-07-13 한화케미칼 주식회사 Dll4에 특이적으로 결합하는 신규한 단일클론항체 및 이의 용도
HRP20211641T1 (hr) 2012-07-13 2022-02-04 Roche Glycart Ag Bispecifična protutijela anti-vegf/anti-ang-2 i njihova primjena u liječenju vaskularnih očnih bolesti
MX2015003894A (es) 2012-09-28 2015-07-17 Boehringer Ingelheim Int Combinaciones farmaceuticas que comprenden aglutinantes duales de angiopoyetina-2 / dll4 agentes anti-vegf.
US20150368329A1 (en) 2012-10-15 2015-12-24 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods of Treating Ocular Diseases
EP2914961A4 (en) 2012-10-31 2016-04-20 Oncomed Pharm Inc METHODS AND MONITORING A TREATMENT BY AN ANTAGONIST OF DLL4
TW202210507A (zh) 2012-11-01 2022-03-16 美商艾伯維有限公司 抗-vegf/dll4雙重可變區域免疫球蛋白及其用途
AR093445A1 (es) 2012-11-14 2015-06-10 Regeneron Pharma Metodos para tratar el cancer de ovario con antagonistas de dll4
US20140154255A1 (en) 2012-11-30 2014-06-05 Abbvie Biotherapeutics Inc. Anti-vegf antibodies and their uses
PL3020731T3 (pl) 2013-07-09 2019-11-29 Ablbio Nowe podwójnie nakierowane białko specyficznie wiążące się z dll4 i vegf oraz zastosowanie tego białka
BR112016000853A2 (pt) 2013-07-16 2017-12-12 Genentech Inc métodos para tratar ou retardar, reduzir ou inibir a recidiva ou a progressão do câncer e a progressão de uma doença imune-relacionada em um indivíduo, para aumentar, melhorar ou estimular uma resposta ou função imune em um indivíduo e kit
WO2015130751A1 (en) 2014-02-26 2015-09-03 Medimmune, Llc Methods of treatment with dll4 antagonists
EP3125937A4 (en) 2014-04-04 2017-11-01 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Treatment of gastric cancer
US9914774B2 (en) 2014-07-11 2018-03-13 Genentech, Inc. Notch pathway inhibition
JP2017522311A (ja) 2014-07-16 2017-08-10 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｔｉｇｉｔ阻害剤及び抗癌剤を使用する癌の治療方法
AP2017009765A0 (en) 2014-08-19 2017-02-28 Merck Sharp & Dohme Anti-tigit antibodies
ES2808153T3 (es) 2014-10-31 2021-02-25 Mereo Biopharma 5 Inc Terapia de combinación para tratamiento de enfermedad
KR102644115B1 (ko) 2014-12-23 2024-03-05 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Tigit에 대한 항체
EP3353204B1 (en) 2015-09-23 2023-10-18 Mereo BioPharma 5, Inc. Bi-specific anti-vegf/dll4 antibody for use in treating platinum-resistant ovarian cancer
CR20180225A (es) 2015-09-25 2018-07-09 Genentech Inc Anticuerpo anti-tigit y métodos de uso
WO2020102644A2 (en) 2018-11-15 2020-05-22 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods and monitoring of treatment with vegf/dll4 binding agent

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010129304A2 (en) * 2009-04-27 2010-11-11 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules

Also Published As

Publication number Publication date
AU2013201095A1 (en) 2013-04-11
BR112014007035B1 (pt) 2021-05-04
CL2014000725A1 (es) 2014-09-05
US8858941B2 (en) 2014-10-14
AU2013201095B2 (en) 2015-09-17
EP3485903B1 (en) 2022-11-16
IL231628A0 (en) 2014-05-28
US20160362499A1 (en) 2016-12-15
US9879084B2 (en) 2018-01-30
US20130164295A1 (en) 2013-06-27
CN104168914A (zh) 2014-11-26
PT3485903T (pt) 2023-02-17
BR112014007035A2 (pt) 2017-04-11
US10730940B2 (en) 2020-08-04
ES2707580T3 (es) 2019-04-04
PL2758073T3 (pl) 2019-04-30
DK2758073T3 (en) 2019-01-14
EA201490622A1 (ru) 2014-08-29
CN107722122B (zh) 2022-05-27
HUE061002T2 (hu) 2023-04-28
EP3485903A1 (en) 2019-05-22
NZ623724A (en) 2016-09-30
HRP20190044T1 (hr) 2019-02-22
US20230279101A1 (en) 2023-09-07
SI3485903T1 (sl) 2023-02-28
KR20140082719A (ko) 2014-07-02
CY1121148T1 (el) 2020-05-29
US20210061903A1 (en) 2021-03-04
US20170183406A1 (en) 2017-06-29
WO2013044215A4 (en) 2013-06-27
HK1199209A1 (zh) 2015-06-26
EP2758073A4 (en) 2015-04-29
CN107722122A (zh) 2018-02-23
DK3485903T3 (da) 2023-02-06
AU2013201095C1 (en) 2019-12-05
PL3485903T3 (pl) 2023-06-12
MY188192A (en) 2021-11-24
MX361712B (es) 2018-12-14
US20180305449A1 (en) 2018-10-25
EA029958B1 (ru) 2018-06-29
CA2849562C (en) 2020-07-21
US20150098949A1 (en) 2015-04-09
CA2849562A1 (en) 2013-03-28
CO6940382A2 (es) 2014-05-09
MX2014003558A (es) 2014-06-23
IN2014KN00871A (zh) 2015-08-21
KR102091293B1 (ko) 2020-03-20
JP6170496B2 (ja) 2017-07-26
NI201400024A (es) 2014-06-26
US9574009B2 (en) 2017-02-21
ES2938628T3 (es) 2023-04-13
RS63965B1 (sr) 2023-03-31
CR20140172A (es) 2014-06-19
WO2013044215A9 (en) 2014-04-03
JP2014530599A (ja) 2014-11-20
HUE042192T2 (hu) 2019-06-28
TW201326204A (zh) 2013-07-01
LT3485903T (lt) 2023-02-27
LT2758073T (lt) 2019-01-10
IL231628B (en) 2018-12-31
RS58201B1 (sr) 2019-03-29
US9376488B2 (en) 2016-06-28
SI2758073T1 (sl) 2019-02-28
MX2018010331A (es) 2020-09-02
FI3485903T3 (fi) 2023-01-31
PT2758073T (pt) 2019-02-01
PE20141537A1 (es) 2014-11-17
HRP20230078T1 (hr) 2023-05-12
WO2013044215A1 (en) 2013-03-28
CN104168914B (zh) 2017-08-08
SG11201400870WA (en) 2014-04-28
EP2758073B1 (en) 2018-10-31
EP2758073A1 (en) 2014-07-30
US20190062424A1 (en) 2019-02-28
US11512128B2 (en) 2022-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI583699B (zh) Ｖｅｇｆ／ｄｌｌ４結合劑類及彼等之用途
TWI636061B (zh) Ｒｓｐｏ３結合劑及彼之用途
JP6967003B2 (ja) がんの処置のための方法および組成物
TW201518728A (zh) 使用Ｗｎｔ途徑抑制劑進行治療之方法及對該治療之監測
TW201429489A (zh) 使用Ｗｎｔ途徑結合劑來治療神經內分泌腫瘤之方法
US20160319034A1 (en) Met-binding agents and uses thereof
US20160137744A1 (en) Met-binding agents and uses thereof
US20170157245A1 (en) Treatment of gastric cancer
AU2017210673B2 (en) VEGF/DLL4 binding agents and uses thereof
NZ623724B2 (en) Vegf/dll4 binding agents and uses thereof