UA110315C2 - Композиція та спосіб лікування раку - Google Patents

Abstract

Винахід належить до моноклонального антитіла, що специфічно зв'язується з позаклітинним доменом DLL4 людини і впливає на ріст пухлин, які містить ракові стовбурові клітини, а також до способу лікування раку, що включає введення терапевтично ефективної кількості антитіла проти DLL4.

Description

(56) Перелік документів, взятих до уваги експертизою:

Сапег" Р. Ітргоміпд пе ейісасу ої апіїроду-разей сапсег Іпегарієз. Майте Неміємв. Сапсег. 2001, Мої. 1, Ме 2, р. 118-129.

Хи А єї а!., Ведіопз ої Огозорпіїа Моїсп Тнаї Сопігпршіе ю І ідапа Віпаїпд апа (пе Моадиаюгу ІпїМепсе ої Егіпде. уЧоштаї ої Біоіодіса! спетівігу. 2005. Мої. 280, Мо 34, р. 30158-30165.

Тах Р.Е. еі аїІ., Зедиепсе ої С. еієдапз І ад-2 геуеєаїз а сеїІ-зідпанпу дотаїп зпагей мій Река апа зеїтаге ої Огозорпіа. Майшге. 1994, Мої. 368, р. 150-154.

Модниега-Тгоїзе І. єї а!., Віоскаде ої 0114 іппірії5 Титог Стгоумй Бу Рготоїїпуд Моп-ргодисіїме

Апдіодепевів. Маштге. 2006, Мої. 444, р. 1032 - 1037.

МО 2007028110 Аг, 08.03.2007.

МО 2008/060705 Аг, 22.05.2008.

МО 2008/076379 Аг, 26.06.2008.

МО 2007143689 Аг,13.12.2007.

МО 2007/145840 Аг, 21.12.2007.

МО 2008/091222 АТ, 31.07.2008.

ОВ 2 449 354 А, 19.11.2008. (54) КОМПОЗИЦІЯ ТА СПОСІБ ЛІКУВАННЯ РАКУ (57) Реферат:

Винахід належить до моноклонального антитіла, що специфічно зв'язується з позаклітинним доменом 014 людини і впливає на ріст пухлин, які містить ракові стовбурові клітини, а також до способу лікування раку, що включає введення терапевтично ефективної кількості антитіла проти ОГІ 4.

Галузь

Даний винахід належить до галузі онкології й пропонує нові композиції та способи для діагностики й лікування раку. Даний винахід стосується антитіл проти маркера ракової стволової клітини для діагностики й лікування солідних пухлин.

Рівень техніки

Рак є найпоширенішою причиною смерті в розвинених країнах, причому більше мільйона людей отримує діагноз рак, і 500000 вмирають на рік тільки у Сполучених Штатах. У цілому визначили, що більш ніж в 1 з З осіб розвивається рак протягом життя. Існує більше 200 різних типів раку, чотири з яких - рак молочної залози, легені, ободової й прямої кишки і передміхурової залози - служить причиною більше половини всіх нових випадків (ета)! еї аї., 2003, Сапсег у. Сііп. 53:5-26).

Рак молочної залози є найпоширенішим у жінок, при цьому 12 95 жінок оцінюють як схильних до ризику розвитку захворювання протягом життя. Хоча рівень смертності зменшився завдяки ранішій детекції й покращуваним способам лікування, рак молочної залози залишається провідною причиною смерті у жінок середніх років, і метастазуючий рак молочної залози досі є невиліковним захворюванням. При його прояві більшість пацієнтів з метастазуючим раком молочної залози мають лише одну або дві уражені системи органів, проте при прогресі захворювання зазвичай безліч ділянок стають ураженими. Найбільш поширеними ділянками метастатичного ураження є місцеві рецидиви на шкірі і в м'яких тканинах стінки грудної клітини, так само як у пахвовій западині й надключичних ділянках. Найбільш поширеною ділянкою віддаленого метастазування є кістка (30-40 95 віддаленого метастазування), потім легені й печінка. | хоча лише приблизно 1-5 95 жінок з уперше діагностованим раком молочної залози мають віддалене метастазування на час діагнозу, приблизно у 50 95 пацієнтів з місцевим захворюванням, кінець кінцем, відбувається рецидив з метастазуванням протягом п'яти років. У даний час медіана виживаності від прояву віддаленого метастазування складає приблизно три роки.

Сучасні способи діагностики й визначення стадії раку молочної залози включають систему пухлина-вузол-метастаз (ТММ), засновану на розмірі пухлини, наявності пухлини в лімфатичних вузлах і наявності віддаленого метастазування (Атегісап доїпї СопттіШееє оп Сапсег: АСС

Сапсег 5іадіпд Мапиаї!. Рпйаадеї!рніа, Ра.: ГПрріпсоб-Намеп РибіїзНегв, 5ІП ед., 1997, рр 171-180;

Наттіз, 9. В.: "Зіадіпо ої Бгєаві сагсіпота" іп Нагїтів, У. В., НеПтап, 5.; Непаегзоп, І. С, Кіппе 0. МУ. (єд5.): Вгєа5зі Оібзеазе5. РПїйаде!рніа, Гірріпсойїй, 1991). Ці параметри використовують для визначення прогнозу й вибору відповідної терапії. Морфологічні ознаки пухлини також можна оцінювати, проте, оскільки пухлини зі схожими гістопатологічними ознаками можуть мати значну клінічну мінливість, цей спосіб має серйозні обмеження. Нарешті, аналізи маркерів поверхні клітин можна використовувати для розділення певних пухлин на підкласи. Наприклад, одним з чинників, що враховується при прогнозуванні й лікуванні раку молочної залози, є наявність рецептора естрогенів (ЕК), оскільки ЕК-позитивні типи раку молочної залози, як правило, відповідають більш повно на гормональні лікарські засоби, як-от: тамоксифен або інгібітори ароматази, ніж ЕК-негативні пухлини. Досі аналізи, хоча і є корисними, є лише частково такими, що їх можна передбачити, для клінічної поведінки пухлин молочної залози, та існує велика фенотипова різноманітність, наявна в типах раку молочної залози, яку неможливо детектувати сучасними діагностичними засобами й неможливо лікувати сучасними видами терапії.

Рак передміхурової залози є найбільш поширеним раком у чоловіків у розвинених країнах, що становить, як оцінюють, 33 95 від всіх нових випадків раку в США, їі є другою з найбільш частих причин смерті (ЧУетаї єї аї.,, 2003, СА Сапсег 9. Сіїп. 53:5-26). Після введення аналізу крові на специфічний антиген простати (РБА) рання детекція раку передміхурової залози надзвичайно поліпшила рівні виживаності; рівень п'ятирічної виживаності пацієнтів з місцевою і регіонарною стадією раку передміхурової залози на час діагностики складає близько 100 95.

Проте в більше 5095 пацієнтів кінець кінцем розвиватиметься місцево поширене або метастазуюче захворювання (Миїйигатаїйпдат еї а!., 2004, Сііп. Опсої. 16:505-16).

В даний час радикальна простатектомія й радіотерапія забезпечують радикальне лікування для більшості локалізованих пухлин передміхурової залози. Проте терапевтичні можливості дуже обмежені для запущених захворювань. У разі метастазуючого захворювання видалення андрогену за допомогою агоністу гормону, що вивільняє лютеїнізуючий гормон (І НКН), окремо або в поєднанні з антиандрогенами, є загальноприйнятим лікуванням. Проте, попри максимальну блокаду андрогенів, захворювання майже завжди прогресує з розвитком у більшості незалежного захворювання. В даний час не існує єдиного прийнятого лікування для стійкого до гормонів раку передміхурової залози, й загальноприйнятими є режими хіміотерапій

(Мийигатаїпдат еї аї., 2004, Сііп. Опсої. 16:505-16; Тго)ап еї а!., 2005, Апіїсапсег Нев. 25:551-

Рак ободової й прямої кишки є третім з найбільш поширених видів раку і четвертою з найбільш частих причин смерті від раку в усьому світі (Ууей» еї аї., 2005, І апсеї 365:153-65).

Приблизно 5-10 95 від всіх типів раку ободової й прямої кишки є спадковими, де однією з основних форм є родинний аденоматозний поліпоз (БАР), аутосомно-домінантне захворювання, при якому приблизно 80595 уражених індивідуумів несуть зародкову мутацію в гені аденоматозного поліпозу кишечнику (АРС). Колоректальні карциноми поширюються локально за допомогою периферичного зростання і в інших місцях за допомогою лімфатичного, гематогенного, черезчеревинного і периневрального поширення. Найбільш поширеною ділянкою екстралімфатичного ураження є печінка, причому легені є найбільш часто ураженим екстраабдомінальним органом. Інші ділянки гематогенного поширення включають кістки, нирки, надниркові залози й мозок.

Сучасна система визначення стадій для раку ободової й прямої кишки заснована на ступені проникнення пухлини через стінку кишечнику й наявності або відсутності ураження лімфатичних вузлів. Цю систему визначення стадій визначають по трьох головних класифікаціях Дюка: захворювання А за Дюком обмежене підслизовими шарами ободової або прямої кишки; захворювання В за Дюком має пухлини, які проникають через власну мускулатуру ободової або прямої кишки й можуть проникати через стінку ободової або прямої кишки; і захворювання С за

Дюком включає будь-який ступінь інвазії стінки кишечнику з метастазуванням регіонарного лімфатичного вузла. Тоді як хірургічне видалення є високоефективним для ранніх стадій раку ободової й прямої кишки, забезпечуючи показники ефективності лікування 95 95 для пацієнтів із захворюванням А за Дюком, показник знижується до 75 95 для пацієнтів із захворюванням В за

Дюком, а при наявності позитивного лімфатичного вузла при захворюванні С ж за Дюком передбачають 6095 вірогідність рецидиву протягом п'яти років. Лікування пацієнтів із захворюванням С за Дюком за допомогою післяопераційного курсу хіміотерапії знижує частоту рецидиву до 40-50 95 і в даний час є стандартом лікування для цих пацієнтів.

Рак легені є найбільш поширеним раком у всьому світі, третім з типів раку, що найчастіше діагностуються в Сполучених Штатах, і, поза сумнівом, найбільш частою причиною смерті від раку (бріго еї а!., 2002, Ат. У). Везріг. Стії. Саге Мей. 166: 1166-96; Уетаї еї аї., 2003, СА Сапсег

У. СНп. 53:5-26). Вважають, що паління цигарок є відповідальним за приблизно 87 95 всіх типів раку легені, що робить їх найбільш смертельними із захворювань, що їм запобігають. Рак легені розділяють на два головних типи, які складають більше 9095 всіх типів раку легені: дрібноклітинний рак легені (ЗСІ С) і недрібноклітинний рак легені (М5СІ С). 5СІ С складає 15- 20 95 випадків і характеризується його виникненням у великих центральних дихальних шляхах і гістологічним складом з шарів дрібних клітин з невеликою кількістю цитоплазми. ЗСІС є активнішим, ніж МЗСІ С, швидко зростаючим і рано метастазуючим. М5СІ С складає 80-85 95 від всіх випадків, і його додатково розділяють на три головні підтипи на підставі гістології: аденокарцинома, плоскоклітинна карцинома (епідермоїдна карцинома) і великоклітинна недиференційована карцинома.

Рак легені, як правило, виявляється пізно в його перебігу й, таким чином, має медіану виживаності лише 6-12 місяців після діагнозу, і загальний рівень 5-річної виживаності складає лише 5-10 95. Хоча хірургія надає найкращий шанс на лікування, вона застосовна лише для невеликої частини пацієнтів з раком легені, причому більшість покладається на хіміотерапію й радіотерапію. Попри спроби варіювати час і інтенсивність дози цих видів терапії, рівні виживаності лише трохи збільшилися за останніх 15 років (ріго еї аї!., 2002, Ат. 9. Кезріг. Ст.

Саге Мед. 166:1166-96).

Ці чотири типи раку, так само як багато інших, виявляються як солідні пухлини, що складаються з гетерогенних популяцій клітин. Наприклад, при раку молочної залози наявна суміш ракових клітин і нормальних клітин, включаючи мезенхімальні (стромальні) клітини, запальні клітини, й ендотеліальні клітини. Декілька моделей раку надають різні пояснення наявності цієї гетерогенності. Одна модель, класична модель раку, передбачає, що всі фенотипово різні популяції клітин мають здатність проліферувати й давати початок нової пухлини. В класичній моделі гетерогенність клітин пухлини є результатом зовнішніх чинників, так само як безперервних мутацій у ракових клітинах, що приводить до різноманітної популяції клітин, що викликають утворення пухлини. Ця модель заснована на ідеї, що всі популяції пухлинних клітин до певної міри мають потенціал до утворення пухлини. (Рапаї5 еї аї., 1998,

Сепе5, Спготовзотев 4 Сапсег 12:122-129; КишйкКаві/гмі єї аї., 1997, Сапсег Ве5. 57:1597-1604;

Вопзіпа єї а!., 1993, Сапсег 71:382-391; Вопзіпд єї а!., 2000, Сепе5 Спготозотез 4 Сапсег 82:

173-183; Вееттап Н еї аї., 1991, Суїотейу 12:147-54; АцбєЇїє М 5 М/егпег М, 1999, Апа/|мі. Сеї.

Раїн. 19:53; Зпеп І еї аі!., 2000, Сапсег Невз. 60:3884).

Альтернативна модель для спостережуваної гетерогенності клітин солідної пухлини витікає з внеску стволових клітин у розвиток пухлини. Згідно з цією моделлю рак виникає в результаті порушення регуляції механізмів, контролюючих нормальний розвиток і підтримку тканин. (Веасну есеї аї., 2004, Майшге 432:324). Під час нормального розвитку тварини клітини більшості або всіх тканин походять з нормальних попередників, називаних стволовими клітинами (Могтізоп еї а!., 1997, Сеї! 88:287-98; Моїттізоп еї а!., 1997, Сит. Оріп. Іттипої. 9:216-21; Моттізоп еї аї!., 1995, Аппи. Веєу. СеїІ. ЮОєм. Віої. 11:35-71). Стволовими клітинами є клітини, які: (1) мають надлишкову здатність до проліферації; 2) здатні до асиметричного ділення клітин з утворенням одного або декількох видів потомства зі зниженою здатністю до проліферації й розвитку; і (3) здатні до симетричних ділень клітин для самооновлення або самопідтримки. Найбільш добре вивченим прикладом оновлення дорослих клітин за допомогою диференціювання стволових клітин є гематопоетична система, де незрілі за розвитком попередники (гематопоетичні стволові клітини й клітини-попередники) відповідають на молекулярні сигнали з утворенням різних типів клітин крові і лімфоїдних клітин. Інші клітини, включаючи клітини кишечнику, системи проток молочної залози і шкіри, постійно поповнюються з невеликої популяції стволових клітин у кожній тканині, й нещодавні дослідження дозволяють передбачати, що більшість інших дорослих тканин також несуть стволові клітини, включаючи мозок. Пухлини, що походять зі "стволової клітини солідної пухлини" (або "ракової стволової клітини" з солідної пухлини), потім піддаються хаотичному розвитку за допомогою циклів як симетричного, так і асиметричного ділення клітин.

У цій моделі стволових клітин солідні пухлини містять окрему й обмежену (можливо, навіть рідку) підгрупу клітин, які мають загальні властивості з нормальними "стволовими клітинами", в тому що вони інтенсивно проліферують і ефективно дають початок як додатковим стволовим клітинам солідної пухлини (самооновлення), так і більшості пухлинних клітин солідної пухлини, в яких відсутній потенціал до утворення пухлини. Дійсно, мутації всередині довгоживучої популяції стволових клітин можуть викликати формування ракових стволових клітин, які лежать в основі зростання і підтримки пухлин і наявність яких робить внесок у невдачу сучасних терапевтичних способів.

Зо Походження раку зі стволових клітин уперше виявили для раку крові, гострого мієлоїдного лейкозу (АМІГ) (І арідої еї аїЇ., 1994, Маїштге 17:645-8). Пізніше показали, що злоякісні пухлини молочної залози й ободової кишки людини так само містять невелику, окрему популяцію ракових стволових клітин, збагачених за здатністю формувати пухлини у мишей з імунодефіцитом. Виявили, що популяція клітин ЕБАж, СО44ж, СО24-/низький, І іп- у пухлинах молочної залози є в 50 разів збагаченою клітинами, що викликають утворення пухлини, в порівнянні з нефракціонованими пухлинними клітинами (А!І-На)) єї а!., 2003, Ргоа Маг! Асад. 5сі. 100:3983-8). Так само виявили, що субпопуляція ЕБАжЖ, СО44-- в пухлинах ободової і прямої кишки містить єдино викликаючі утворення пухлини клітини, і додавання СО166б до цього профілю дозволяє додаткове збагачення по стволових клітинах раку ободової кишки (СОС5С) (ОСаіетба єї аі. 2007 Ргос Маї 7 Асай 5сі 104:10158-63). Можливість у перспективі виділяти викликаючі утворення пухлини ракові клітини дозволяє дослідження критичних біологічних шляхів, що лежать в основі здатності цих клітин утворювати пухлини, й, таким чином, обіцяє розвиток кращих діагностичних аналізів і лікарських засобів для пацієнтів з раком. Це наближає до мети, на яку спрямовано цей винахід.

КОРОТКИЙ ВИКЛАД

Представлені антитіла, які специфічно зв'язуються з епітопом дельта-подібного ліганду 4 (014) людини, сформованої поєднанням М-кінцевої ділянки 0/4 людини (5ЕО ІЮ МО: 27) і домену О5І. людини (З5ЕО ІЮ МО: 26), де антитіло впливає на зростання пухлини. Представлена також фармацевтична композиція, що містить антитіло за даним винаходом і фармацевтично прийнятний носій. Крім того, представлений спосіб лікування раку, що включає введення терапевтично ефективної кількості антитіла анти-О1 | 4 за даним описом.

Додаткові об'єкти й переваги винаходу частково будуть описані в подальшому описі й частково будуть очевидними з опису, або про них можна буде дізнатися з практичного здійснення винаходу. Об'єкти й переваги винаходу можна здійснити й отримати за допомогою елементів і поєднань, зокрема, вказаних у доданій формулі винаходу. Слід розуміти, що як наведений вище загальний опис, так і подальший детальний опис є лише зразковими і роз'яснювальними й не є такими, що обмежують винахід, як зазначено в формулі винаходу.

Додані креслення, включені в цей опис і складають його частину, ілюструють декілька варіантів здійснення винаходу і, разом з описом, служать для пояснення принципів винаходу. В описі і доданій формулі винаходу форми однини включають посилання на множину, якщо контекст явно не вимагає іншого.

КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР

Фігура 1: Специфічне зв'язування антитіл 21М18 анти-0ОЇ/ 14 з нативним білком поверхні клітин ОБІГ 4. Клітини НЕК 293, трансфіковані спільно повнорозмірним 01 4 і СЕР, інкубували з антитілами проти 01 4 і сортували за допомогою ЕАСЗ5. Для антитіл проти 01 І 4 21М14 і 21М18 показали специфічне зв'язування з клітинами, експресуючими 0114, як видно за лінійним взаємозв'язком між зв'язуванням антитіла анти-Оі | 4 й експресії СЕР.

Фігура 2: Антитіла проти 0/4 блокують взаємодію 0/4 людини з рецептором Моїсй. А)

Клітини НЕК 293, експресуючі 0114, інкубували з Моїсп-Ес або контрольним білком Ес за наявності антитіл анти- 0/4 або контрольних антитіл. Висока інтенсивність флуоресценції вказує на наявність зв'язування Моїсп і 01/14 за наявності контрольного антитіла (лінія 2) і антитіл 21М12 анти-О 4 (лінія 5). Низька інтенсивність флуоресценції вказує на відсутність взаємодій Моїсп ії 0/4 за відсутності Моїсй (лінія 1) і порушення взаємодій Моїсп їі 0114 за наявності антитіл анти-01 1 4 21М18 (лінія 3) і 21М14 (лінія 4). В) Клітини НЕК 293, експресуючі

Моїсй 1, інкубували з 01 4-Ес або людини, або миші. Зв'язування детектували за допомогою флуоресцентно мічених анти-Ес і аналізували за допомогою БАС5, де висока інтенсивність флуоресценції є показовою для зв'язування між 01/14 і клітинами, експресуючими Моїсй1. 21М18 блокує зв'язування 0І//4 людини (сірі квадрати), але не 0/14 миші (чорні круги) з рецептором Моїсп.

Фігура 3: Картування епітопів антитіл анти-О1 4. А) Злиті білки з вкладеними делеціями позаклітинного домену 014 людини інкубували в аналізі ЕГІ5ЗА з антитілами антих-0ОІ І 4 21М14 і 21М18. Не виявили зв'язування вище фонового у наявності злитих білків, що містять амінокислоти між 1 і 154 (ак 1-96, білий стовпець з чорними крапками; ак 1-154, чорний стовпець з білими крапками). На відміну від цього, детектували зв'язування між антитілами анти-ОІ 14 і всіма злитими білками, що містять амінокислоти між 1 і 217, включаючи домен О5І, з СО І 4 (ак 1-217, стовпець з горизонтальними смугами; ак 1-251, стовпець з діагональними смугами; ак 1- 283, заштрихований стовпець; ак 1-323, сірий стовпець з білими крапками). В) На Вестерн- блотах показали експресію білків 0/4 людини (п-0О1 4) з С-кінцевими делеціями й химерних злитих білків мишачий-людський 014 (анти-пЕс; верх). Злиті білки з 0/4 містять один або декілька з доменів 1-6, де домени 1 і 2 є М-кінцевими амінокислотами 1-154; домен З є доменом

О5ІЇ від амінокислоти 155 до 217; і кожен з доменів 4, 5 і б є доменом ЕСЕ, як графічно змальовано на С. Антитіла 21М18 впізнають білок П-ОІ | 4 лише за наявності амінокислот 1-217 (прі І 4домені1-3). На відміну від білка людини 21М18 не впізнає злиті білки (т-О І 4 домен1-3:й- рІЛ.4домена-6), містять амінокислоти 1-217 (домен1-3) 014 миші (т-О/ 14). 21М18 ще впізнає злиті білки, які містять амінокислоти 1-154 Н-01 14 (домен1-2) за наявності доменуЗ миші (й- 014 домен1-2:птОІ І 4домен3-б6). С) Показано схематичне узагальнення даних зв'язування.

Зверху показана доменна структура О/14 зі злитими білками, з 0/4, перерахованими і показаними схематично ліворуч, де білок людини представлений світло-сірим, а білок миші представлений темно-сірим. Зв'язування 21М18 з кожним фрагментом 0114 відмічене "-" у зіставленні з "-". ОЗ) Аналіз ЕГІ5А зв'язування 21М18 із фрагментами білка 0БІ/ 14, що містять заміну відповідних мишачих залишків на людські залишки у вибраних положеннях. Для 21М18 показали порушене зв'язування з фрагментами білка БІ / 4 із замінами амінокислот 68, 69 і 71 (заміна валіну, валіну і проліну) або амінокислот 142 і 144 (заміна лізину й аланіну). Е) Аналіз

ЕГІЗА зв'язування антитіл 21М18 ії 21М21 з фрагментами білка О0І/14, що містять заміну відповідних мишачих залишків на людські залишки у вибраних положеннях усередині домену

О5. Для антитіла 21М21 показали порушене зв'язування з фрагментами білка 0/4 людини, що містять амінокислотні заміни амінокислот 161 і 162 (заміна треоніну й серину). Оскільки 21М21 не порушує функцію 01 4 в аналізах передачі сигналу (див. фігуру 6), це показує, що не всі антитіла, що зв'язуються з ділянкою О5І.,, впливають на функцію О/Г 4.

Фігура 4: Вирівнювання послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга. А) Показані вихідна послідовність антитіла миші 21М18 (т-21М18-Мп, зверху), людська експресована каркасна послідовність (п-Е5Т-каркас, всередині) і послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга гуманізованого 21М18 (21М18-Н7, знизу) з консервативними амінокислотними залишками, забарвленими чорним. Відмічені три СОК, що показує збереження вихідних мишачих послідовностей у гуманізованому антитілі 21М18. Залишок цистеїну в положенні 52а за Кабаї у СОК» замінений на залишок серину й валіну без втрати специфічного зв'язування з 04 в 21М18 Н?7 ї 21М18 НО, відповідно. Заміни всередині каркасної ділянки, показані на 4А, пронумеровані 1-6 з відповідними положеннями за Кабаї у положеннях 16, 20, 27, 28, 38, 48 у бо ланцюзі Мп. В) Показані вихідна послідовність антитіла 21М18 миші (т-21М18-МП, зверху),

послідовність МИ зародкової лінії людини (п-зародкова-Мп, в середині) і послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга гуманізованого 21М18 (21М18-Н2, знизу) з консервативними амінокислотними залишками, забарвленими чорним. Відмічені три СОК, що показує збереження вихідних мишачих послідовностей у гуманізованому антитілі 21М18.

Залишок цистеїну в положенні 52а за Кабаї у СОК2 замінений на залишок серину й валіну без утрати специфічного зв'язування з 04 в 21М18 Н?7 і 21М18 НО, відповідно. П'ять збережених мишачих залишків усередині варіабельної каркасної ділянки всіх варіантів важкого ланцюга пронумеровані 1-5 у відповідних їм положеннях за Кабаї 20, 28, 38, 48 і 69.

Фігура 5: Вирівнювання послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга. Показані вихідна послідовність антитіла миші 21М18 (т-21М18-УК, зверху), послідовність зародкової лінії людини (п-зародкова МК, знизу) і послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга гуманізованого 21М18 (21М18-12, всередині) з консервативними амінокислотними залишками, забарвленими чорним. Відмічені три СОМ, що показує збереження вихідних мишачих послідовностей у гуманізованому антитілі 21М18. Два збережені мишачі залишки всередині варіабельної каркасної ділянки пронумеровані 1-2 у відповідних їм положенням за Кабаї 22 і 36.

Фігура 6: Антитіла анти-О1І І 4 блокують передачу сигналу Моїсі. Клітини НегГа, трансфіковані спільно векторами з репортером Не51-Іис і з репортером люциферази Репійа, інкубували з білком 0 4-Рс за наявності або відсутності антитіл анти-0!/ 1/4. Знижені рівні люциферази показують послаблення активації 0 4 шляху Моїсп за допомогою антитіл 21М14 і 21М18.

Фігура 7: Антитіла анти-0/ 4 модулюють експресію генів-мішеней для Моїсп у пухлинах ободової кишки. А) Виділяли пухлини ободової кишки С8, оброблені антитілами 21М18 анти- ріл4 або РВ5 (Контроль), і визначали експресію НЕ51 і АТОН-1 за допомогою кількісної КЕТ-

ПЦР. Відносна експресія гена (у-вісь) у порівнянні з клітинами після контрольної обробки показує, що обробка антитілами анти-0/14 зменшувала експресію НЕ51 і збільшувала експресію АТОН-1. В) Показано співвідношення відносної експресії (у-вісь) НЕ51 відносно

АТОНІ в колоніях лінійно виснажених клітин пухлини ободової кишки ОМР-С11 миші. Для колоній С11, покритих клітинами З3Т3 з надекспресією 04 (373-011 4), показали збільшення співвідношення експресії НЕ51/АТОНІ в порівнянні з клітинами ободової кишки, покритих клітинами 373 (373) або що не піддавалися дії покривного шару клітин (Контроль). Це

Зо збільшення співвідношення експресії НЕЗ1/"АТОНІ припиняли за допомогою інкубації з 10 мкг/мл антитіл 21М18 (21М18) або з 5 мкМ інгібітором секретази ОВА (5 мкМ 51).

Фігура 8: Антитіла анти-0/ 4 зменшують зростання пухлини. Мишам МОБ/5СІО вводили ін'єкції дисоційованих клітин ШМ-С4 і обробляли їх антитілами 21М18 анти-О1 І 4 (п-5) або РВ5 (п-10). Обробка антитілами 21М18 (ромби) зменшувала зростання пухлини, починаючи з доби 23, ізменшення аж до 54 95 спостерігали на добу 48 у порівнянні з контролями після ін'єкції РВ5 (чорні квадрати).

Фігура 9: Обробка антитілами анти-ОІ І 4 знижує кількість проліферуючих пухлинних клітин іп мімо. Виділяли пухлини ободової кишки С8, оброблені антитілами 21М18 анти-0О1 1/4 або контрольними АБ. Імуногістохімічно за допомогою антитіла проти Кіб/ показали зниження кількості проліферуючих клітин у пухлинах, оброблених 21М18, у порівнянні з контролем.

Фігура 10: Обробка антитілами анти-0ОЇ 14 у поєднанні з фторурацилом (5-3) зменшує зростання пухлини. Мишам МОБ/ЗСІО уводили ін'єкції дисоційованих клітин ШМ-С4, і обробляли їх антитілами анти-ОІ 4 або РВ5 за наявності або за відсутності 5-ЕО. А) Обробка антитілами 21М18 у поєднанні з 5-РО (круги, штрихова лінія) зменшувала зростання пухлини через 46 діб після ін'єкції пухлинних клітин більшою мірою, ніж обробка або 5-РШ (трикутники, суцільна лінія), або антитілами 21М18 (ромби, пунктирна лінія) окремо, й більшою мірою, ніж у контролях після ін'єкції РВ5 (квадрати, суцільна лінія). Об'єм пухлини в мм? вказаний на у-осі. В) Графіки вимірювань пухлини індивідуальних тварин на добу 46. Кожна крапка представляє одну тварину. Кожна з обробок антитілами 21М18 або 5-0 зменшувала розмір пухлини (мм3У) у порівнянні з контролем. Більш того, комбінована обробка антитілами 21М18 ії 5-РО мала адитивний ефект, знижуючи розмір пухлини до 1/5 розміру контролю.

Фігура 11: Обробка антитілами анти-ОЇ І 4 у поєднанні з антитілами проти ЕСЕ зменшує зростання пухлини. Мишам МОБ/5СОЮО уводили ін'єкції дисоційованих клітин ШМ-Са4, і обробляли їх антитілами анти-ОІ І 4 або РВ5 за наявності або відсутності антитіл проти ЕСЕК.

Показані графіки вимірювань пухлин індивідуальних тварин на добу 46. Кожна крапка представляє одну тварину. Кожна з обробок антитілами 21М18 або антитілами проти ЕСЕК зменшувала розмір пухлини (ммУ) в порівнянні з контролем. Більш того, комбінована обробка антитілами 21М18 і антитілами проти ЕСЕК мала адитивний ефект, знижуючи розмір пухлини до менш ніж 1/5 від розміру контролю.

Фігура 12: тАр 21М18 анти-ОІ 4 й іринотекан діють синергічно для інгібування зростання пухлини ободової кишки. Мишам МОБ/5СІЮ уводили ін'єкції дисоційованих клітин С8, і обробляли їх антитілами анти-ОІ І 4 або контрольного антитіла за наявності або за відсутності іринотекану. А) Кожна з обробок антитілами 21М18 миші (круги) або іринотеканом (трикутники) окремо зменшувала об'єм пухлини (у-вісь, мму) у порівнянні з тваринами після контрольної обробки (чорні квадрати). Проте комбіноване лікування 21М18 й іринотеканом (перегорнуті трикутники) мало синергетичний ефект, повністю припиняючи зростання пухлини аж до 55 діб після ін'єкції клітин. В) Обробка гуманізованим 21М18 (п21М18) у поєднанні з іринотеканом (іпсп) (круги) мала ефективність, схожу з ефективністю мишачого 21М18 (т21М18) (трикутники) в порівнянні з контрольним антитілом (чорні квадрати) або контрольним антитілом з іринотеканом (трикутники).

Фігура 13: Комбінована обробка анти-01/ (4 21М18 й іринотеканом запобігає повторному зростанню пухлини ободової кишки. Мишам МОБ/5СІО вводили ін'єкції дисоційованих клітин С8, і обробляли їх іринотеканом або іринотеканом у поєднанні з антитілами 21М18 анти-О 4 (п-10 на групу). А) Обробка одним іринотеканом уповільнювала зростання пухлини, проте зростання тривало після припинення лікування на добу 56 (" стрілка) в усіх, окрім двох тварин після лікування. В) На відміну від цього, обробка поєднанням іринотекану й антитіл 21М18 анти-ОІ І 4 припиняла зростання пухлини ободової кишки як під час лікування, так і протягом аж до п'яти тижнів після припинення лікування на добу 56 у всіх десяти тварин після лікування. Кожна лінія представляє криву зростання для індивідуальної тварини.

Фігура 14: Комбінована обробка анти-О1 І 4 21М18 й іринотеканом інгібує зростання пухлин ободової кишки, що прижилися, ефективніше, ніж обробка монотерапією. Мишам МОБ/ЗСІЮ уводили ін'єкції дисоційованих клітин С8 і обробляли їх антитілами анти-О1 І 4 або контрольного антитіла за наявності або відсутності іринотекану. Кожна з обробок антитілами 21М18 (ромби) або іринотеканом (трикутники) окремо зменшувала об'єм пухлини (у-вісь, ммУ) в порівнянні з тваринами після контрольної обробки (чорні квадрати). Проте комбінована обробка 21М18 плюс іринотекан (перегорнуті трикутники) інгібувала зростання пухлини ефективніше, ніж обробка або 21М18, або іринотеканом окремо.

Фігура 15: Для пухлин, оброблених антитілами анти-О1 | 4, показали знижену кількість клітин,

Зо що викликають утворення пухлин. Мишам з імунною недостатністю (п-10 на групу) вводили ін'єкції зменшуваних доз пухлинних клітин з експерименту, показаного на фігурі 14, які обробляли контрольним антитілом, іринотеканом плюс контрольне антитіло, лише антитілами 21М18 анти-0ОІ 14, або поєднанням антитіл анти-0О! 14 21М18 й іринотекану (Поєднання). А)

Результати для частоти придбання пухлин на добу 81. Об'єм пухлини (мм"У) наносили на графік у порівнянні з кількістю ін'єктованих клітин пухлини людини: 900, 300, 100 і 50 для кожної групи обробки. Кількість тварин з пухлинами, що піддаються детекції, з десяти тварин після ін'єкції для кожної дози пухлинних клітин записано під графіком об'єму пухлини для кожної дози клітин, де пухлинні клітини після контрольної обробки - ліворуч (забарвлені круги), оброблені антитілом 21М18 анти-0Ї14 пухлинні клітини - другі ліворуч (незабарвлені квадрати), оброблені іринотеканом пухлинні клітини - другі праворуч (забарвлені трикутники), й пухлинні клітини після комбінованої обробки - праворуч (незабарвлені круги). В) Підраховували частоту стволових клітин на добу 81. Частка ракових стволових клітин (у-вісь) від контрольної обробки (ліворуч) у порівнянні з пухлинними клітинами, обробленими анти-О1 | 4 (другі ліворуч), обробленими лише іринотеканом (другі праворуч) і після комбінованої обробки (праворуч), нанесена на графік з 95 95 довірчим інтервалом. Група після обробки анти-ОІ І 4 має статистично значиму різницю в порівнянні з контрольною групою (7), і комбінована група значимо відрізняється як від контрольної групи ("), так і від групи одного іринотекану (77.

Фігура 16: Комбінована обробка анти-0ОЇ!14 21М18 й іринотеканом затримує рецидив пухлини. Мишам з імунною недостатністю вводили ін'єкції дисоційованих клітин С8, і пухлини, що прижилися, приблизно 150 мм? обробляли поєднанням іринотекану (45 мг/кг, дозування двічі на тиждень) або з антитілами 21М18 анти-О1І 14, або з контрольними антитілами протягом 32 діб, після чого обробку іринотеканом припиняли. Обробку або контрольним антитілом, або 21М18 продовжували. Повторне виникнення пухлин за об'ємом пухлин (у-вісь) затримувалося в оброблених 21М18 тварин (трикутники) в порівнянні з контрольними (круги).

Фігура 17: Комбінована обробка анти-ОІ І 4 21М18 і іринотеканом затримує рецидив пухлини.

Показані індивідуальні тварини з експерименту, показаного на фігурі 16. Показаний загальний об'єм пухлини (у-вісь) у кожної тварини через 47 діб після припинення обробки іринотеканом.

Фігура 18: Поєднання анти-0ОЇЇ4 21М18 ії анти-МЕСЕ зменшує зростання пухлини.

Імплантували пухлинні клітини С17 і через дві доби починали обробку контрольним антитілом бо (чорні квадрати, суцільна лінія), 21М18 (трикутники, штрихова лінія), анти-МЕСЕ (ромби,

суцільна лінія) або поєднанням обох антитіл (круги, пунктирна лінія). Кожне антитіло дозували при 10 мг/кг, вводили двічі на тиждень, і були присутні по 10 тварин на групу. Як 21М18, так і анти-МЕСЕ знижували зростання пухлини, й поєднання було ефективнішим, ніж будь-яке окреме антитіло.

ОПИС ВАРІАНТІВ ЗДІЙСНЕННЯ

Термін "антитіло" використовують на позначення молекули імуноглобуліну, який розпізнає і специфічно зв'язує мішень, як-от: білок, поліпептид, пептид, вуглевод, полінуклеотид, ліпід або поєднання вищезгаданого, за допомогою щонайменше однієї ділянки впізнавання антигену всередині варіабельної ділянки молекули імуноглобуліну. В конкретних варіантах здійснення антитіла за даним винаходом включають антитіла-антагоністи, які специфічно зв'язують маркерний білок ракової стволової клітини і заважають, наприклад, зв'язуванню ліганду, димеризації рецептора, експресії маркерного білка ракової стволової клітини та/або нижчій передачі сигналу маркерним білком ракової стволової клітини. В конкретних варіантах здійснення описані антитіла включають антитіла-агоністи, які специфічно зв'язують маркерний білок ракової стволової клітини і сприяють, наприклад, зв'язуванню ліганду, димеризації рецептору й/або передачі сигналу маркерним білком ракової стволової клітини. В конкретних варіантах здійснення описані антитіла не перешкоджають або не сприяють біологічній активності маркерного білка ракової стволової клітини, проте інгібують зростання пухлини за допомогою, наприклад, інтерналізації та/або розпізнавання імунною системою антитіла. Як застосовують тут, термін "антитіло" охоплює інтактні поліклональні антитіла, інтактні моноклональні антитіла, фрагменти антитіл (такі як фрагменти Еар, Раб, Е(ар)2 і Ем), одноланцюгові мутанти Ем (5СЕм), мультиспецифічні антитіла, такі як біспецифічні антитіла, отримані, щонайменше, з двох інтактних антитіл, химерні антитіла, гуманізовані антитіла, антитіла людини, злиті білки, що містять частину антитіла, яка впізнає антиген, і будь-яку іншу модифіковану молекулу імуноглобуліну, що містить ділянку впізнавання антигену, поки антитіла мають бажано біологічну активність. Антитіло може належати до будь-якого з п'яти головних класів імуноглобулінів: ІдА, дО, ІДЕ, дз і ІдМ, або їх підкласів (ізотипів) (наприклад, Ід, Ідс2,

ІЧОЗ, Ідс4, ІДА1 і ІдДАг), основаних на ідентичності константних доменів їх важких ланцюгів, що позначаються альфа, дельта, епсилон, гамма і мю відповідно. Різні класи імуноглобулінів мають

Зо різні й добре відомі субодиничні структури й тривимірні конфігурації. Антитіла можуть бути голими або кон'югованими з іншими молекулами, такими як токсини, радіоактивні ізотопи тощо.

Як застосовують тут, термін "фрагмент антитіла" стосується частини інтактного антитіла і стосуються варіабельних ділянок інтактного антитіла, які впізнають антиген. Приклади фрагментів антитіл включають як необмежуючі приклади фрагменти Раб, Раб, Е(ар)2 ї Ем, лінійні антитіла, одноланцюгові антитіла й мультиспецифічні антитіла, сформовані із фрагментів антитіл. "Ем антитіло" стосується мінімального фрагмента антитіла, що містить повну ділянку впізнавання й зв'язування антигену або у вигляді двох ланцюгів, у яких варіабельний домен одного важкого й одного легкого ланцюга формують нековалентний димер, або у вигляді одного ланцюга (5сЕму), в якому варіабельний домен одного важкого й одного легкого ланцюга ковалентно зв'язані гнучким пептидним лінкером, так що два ланцюги сполучено в подібну димерну структуру. В цій конфігурації визначальні комплементарність ділянки (СОК) кожного варіабельного домену взаємодіють для визначення антигенсполучної специфічності димеру Ем.

Альтернативно один варіабельний домен (або половину з Ем) можна використовувати для впізнавання й зв'язування антигену, хоча, як правило, з нижчою афінністю. "Моноклональне антитіло", як застосовують тут, стосується гомогенної популяції антитіл, залучених у високоспецифічне впізнавання і зв'язування однієї антигенної детермінанти, або епітопу. В цьому їх відмінність від поліклональних антитіл, які, як правило, включають різні антитіла, спрямовані проти різних антигенних детермінант. Термін "моноклональне антитіло" охоплює як інтактні, так і повнорозмірні моноклональні антитіла, так само як фрагменти антитіл (такі як баб, Раб, Е(ар)2, Ем), одноланцюгові мутанти (5СЕм), злиті білки, містять частину антитіла, й будь-яку іншу модифіковану молекулу імуноглобуліну, що містить ділянку впізнавання антигену. Більш того, "моноклональне антитіло" стосується таких антитіл, отриманих будь-якою кількістю способів, включаючи, як необмежуючі приклади, гібридому, фаговий відбір, рекомбінантну експресію й трансгенних тварин.

Як застосовують тут, термін "гуманізоване антитіло" стосується форм антитіл, що не належать людині (наприклад, мишачих), які є специфічними ланцюгами імуноглобулінів, химерними імуноглобулінами або їх фрагментами, що містять мінімальні послідовності, що не належать людині. Як правило, гуманізованими антитілами є імуноглобуліни людини, в яких бо залишки з визначальних компліментарність ділянок (СОК) усередині ділянки впізнавання антигену (або гіперваріабельної ділянки) з варіабельної ділянки ланцюга або ланцюгів антитіла замінені залишками з СОК видів, що не стосуються людини (наприклад, миші, щура, кроля, хом'яка), що має бажану специфічність, афінність та ємкість. У деяких випадках залишки каркасної ділянки (ЕК) варіабельного ланцюга імуноглобуліну людини замінені відповідними залишками антитіла з видів, що не стосуються людини, що мають бажану специфічність, афінність і ємкість. Гуманізоване антитіло можна додатково модифікувати за допомогою заміни додаткового залишку або у варіабельній каркасній ділянці, й усередині замінених залишків, що не належать людині, для поліпшення й оптимізації специфічності, афінності та/або ємкості антитіла. Як правило, гуманізоване антитіло міститиме по суті всі з, щонайменше, одного і, як правило, двох або трьох, або чотирьох варіабельних доменів, що містять всі або по суті всі з ділянок СОК, відповідних імуноглобуліну, що не стосується людини, тоді як всі або переважно всі ділянки ЕК є ділянками ЕК з консенсусною послідовністю імуноглобуліну людини.

Гуманізоване антитіло може також містити щонайменше частину константної ділянки або домену імуноглобуліну (Ес), як правило, з імуноглобуліну людини. Приклади способів, вживаних для одержання гуманізованих антитіл, описані в Патенті США 5225539.

Термін "антитіло людини", як застосовують тут, позначає антитіло, що продукується людиною, або антитіло, що має амінокислотну послідовність, відповідну антитілу, що продукується людиною, отримане з використанням будь-якого способу, відомого в даній галузі.

Це визначення антитіла людини охоплює інтактні або повнорозмірні антитіла, їхні фрагменти, та/або антитіла, що містять щонайменше один поліпептид важкого і/або легкого ланцюга людини, наприклад, таке як антитіло, що містить поліпептиди легкого ланцюга миші й важкого ланцюга людини. "Гібридними антитілами" є молекули імуноглобуліну, в яких пари важких і легких ланцюгів з антитіл з різними ділянками антигенних детермінант об'єднані разом, так що отриманий тетрамер може впізнавати і зв'язувати два різні епітопи або два різні антигени.

Термін "химерні антитіла" стосуються антитіл, де амінокислотна послідовність молекули імуноглобуліну отримана з двох або декількох видів. Як правило, варіабельна ділянка як легкого, так і важкого ланцюгів відповідає варіабельній ділянці антитіл, отриманих з одного вигляду ссавців (наприклад, миша, щур, кріль і так далі), з бажаною специфічністю, афінністю і ємкістю, тоді як константні ділянки є гомологічними послідовностям антитіл, отриманих з іншого виду (зазвичай людина), щоб уникнути викликання імунної відповіді в цього виду.

Термін "епітоп" або "антигенна детермінанта" використовують тут взаємозамінно, і вони позначають ту частину антигену, яку може впізнавати й специфічно зв'язувати конкретне антитіло. Коли антигеном є поліпептид, епітопи можуть бути сформовані як із сусідніх амінокислот, так і не з сусідніх амінокислот, що розташовуються поруч за допомогою четвертинного згортання білка. Епітопи, сформовані з сусідніх амінокислот, як правило, зберігаються при денатурації білка, тоді як епітопи, сформовані за допомогою четвертинного згортання, як правило, втрачаються при денатурації білка. Епітоп, як правило, містить щонайменше 3 і більш зазвичай, щонайменше, 5 або 8-10 амінокислот в унікальній просторовій конформації.

Конкуренцію між антитілами визначають за допомогою аналізу, в якому тестований імуноглобулін інгібує специфічне зв'язування контрольного антитіла із загальним антигеном.

Відомі багаточисленні типи аналізів конкурентного зв'язування, наприклад: твердофазний прямий або непрямий радіоїмунний аналіз (КІА), твердофазний прямий або непрямий ферментний імуноаналіз (ЕЇА), конкурентний сендвіч-аналіз (див. еїапії еї аї., Меїпоа5 іп

Епгутоїіоду 9:242-253 (1983)); твердофазний прямий біотин-авідиновий ЕЇА (дивися КігкКІапа еї а!., У. Іттипої. 137:3614-3619 (1986)); твердофазний прямий аналіз з міткою, твердофазний прямий сендвіч-аналіз з міткою (див. Нагіом/ апа І апе, "Апіїродіе5, А І арогаїогу Мапиа!" Соїа зргіпд Нагброг Ргез5 (1988)); твердофазний прямий аналіз КІА з міткою з використанням мітки І1- 125 (див. Могеї! єї аїЇ., Моїес. Іттипої. 25(1):7-15 (1988)); твердофазний прямий біотин- авідиновий ЕЇІА (Спеипо еї аї., Мігоїоду 176:546-552 (1990)) і прямий КІА з міткою (МоІдеппацег еї аім, Зсапа. У. Іттипої. 32:77-82 (1990). Як правило, такий аналіз включає використання очищеного антигену, пов'язаного з твердою поверхнею, або клітин, що несуть який-небудь з них, неміченого тестованого імуноглобуліну й міченого контрольного імуноглобуліну.

Конкурентне інгібування вимірюють за допомогою визначення кількості мітки, зв'язаної з твердою поверхнею або клітинами за наявності тестованого імуноглобуліну. Зазвичай тестований імуноглобулін наявний у надлишку. Антитіла, ідентифіковані за допомогою конкурентного аналізу (конкуруючі антитіла), включають антитіла, що зв'язуються з тим же самим епітопом, що й контрольне антитіло, та антитіла, що зв'язуються з сусіднім епітопом, 60 досить близьким до епітопу, що зв'язується контрольним антитілом, щоб виникала стерична перешкода. Зазвичай, коли конкуруюче антитіло наявне в надлишку, воно інгібуватиме специфічне зв'язування контрольного антитіла із загальним антигеном, щонайменше, на 50 або 75 90.

Те, що антитіло "вибірково зв'язується" або "специфічно зв'язується", означає, що антитіло реагує або зв'язується частіше, швидше, з більшою тривалістю, з більшою афінністю або з яким-небудь поєднанням вищезгаданого з епітопом, ніж з іншими речовинами, включаючи неродинні білки. "Вибірково зв'язується" або "специфічно зв'язується" означає, наприклад, що антитіло зв'язується з білком з Ко, щонайменше, приблизно 0,1 мМ, проте більш зазвичай щонайменше приблизно імкм. "Вибірково зв'язується" або "специфічно зв'язується" інколи означає, що антитіло зв'язується з білком інколи з Ко, щонайменше, приблизно 0,1 мкм або краще й інколи, щонайменше, приблизно з 0,01 мкм або краще. Через ідентичність послідовності між гомологічними білками в різних видах специфічне зв'язування може включати антитіло, яке впізнає маркерний білок ракової стволової клітини більше, ніж в одному вигляді.

Як застосовують тут, терміни "неспецифічне зв'язування" й "фонове зв'язування" при використанні відносно взаємодії антитіла й білка або пептиду стосуються взаємодії, яка не залежить від наявності конкретної структури (тобто антитіло зв'язується з білками взагалі, а не з конкретною структурою, як-от епітоп).

Терміни "виділений" або "очищений" стосується матеріалу, який є по суті або в основному вільним від компонентів, які в нормі супроводжують його в його природному стані. Чистоту й гомогенність, як правило, визначають з використанням способів аналітичної хімії, таких як електрофорез у поліакриламідному гелі або високоефективна рідинна хроматографія. Білок (наприклад, антитіло) або нуклеїнова кислота з даного опису, який є переважаючою молекулою, наявною в препараті, є по суті очищеним. Зокрема, виділена нуклеїнова кислота відокремлена від відкритих рамок зчитування, які природно фланкують ген і кодують білки, відмінні від білка, що кодується геном. Виділене антитіло відокремлене від інших білків, що не належать до імуноглобуліну, і від інших імуноглобулінових білків з іншою антигенсполучною специфічністю.

Він означає також, що нуклеїнова кислота або білок у деяких варіантах здійснення є, щонайменше, на 80 95 чистими, в деяких варіантах здійснення, щонайменше, на 85 95 чистими, в деяких варіантах здійснення, щонайменше, на 90 95 чистими, в деяких варіантах здійснення, щонайменше, на 95 95 чистими і в деяких варіантах здійснення, щонайменше, на 99 95 чистими.

Як застосовують тут, терміни "рак" і "раковий" позначають або описують фізіологічний стан у ссавців, при якому популяція клітин характеризується нерегульованим зростанням клітин.

Приклади раку включають як необмежуючі приклади карциному, лімфому, бластому, саркому й лейкоз. Конкретніші приклади таких типів раку включають плоскоклітинний рак, дрібноклітинний рак легені, недрібноклітинний рак легені, аденокарциному легені, плоскоклітинну карциному легені, рак очеревини, гепатоцелюлярний рак, рак шлунково-кишкового тракту, рак підшлункової залози, гліобластому, рак шийки матки, рак яєчника, рак печінки, рак сечового міхура, гепатому, рак молочної залози, рак ободової кишки, рак ободової і прямої кишки, карциному ендометрію або матки, карциному слинної залози, рак нирки, рак печінки, рак передміхурової залози, рак жіночих зовнішніх статевих органів, рак щитовидної залози, карциному печінки й різних типів раку голови й шиї.

Терміни "проліферативне порушення" й "проліферативне захворювання" стосуються порушень, пов'язаних з аномальною проліферацією клітин, як-от рак. "Пухлина" й "неоплазія", як застосовують тут, стосуються будь-якої маси тканини, утвореної в результаті надлишкового зростання або проліферації клітин, чи то доброякісної (нераковою), чи то злоякісної (ракової), включаючи передракові вогнища. "Метастаз", як застосовують тут, позначає процес, за допомогою якого рак поширюється або переноситься від ділянки виникнення до інших ділянок організму з розвитком схожого ракового вогнища в новій локалізації. "Метастатична" або "метастазуюча" клітина є клітиною, що втрачає адгезійні контакти з сусідніми клітинами й мігрує через кровотік або лімфу від первинної ділянки захворювання для проникнення в сусідні структури організму.

Терміни "ракова стволова клітина", "стволова клітина пухлини", або "стволова клітина солідної пухлини" використовують тут взаємозамінно, й вони позначають популяцію клітин з солідної пухлини, які: (1) мають широку здатність до проліферації; 2) здатні до асиметричного ділення клітин з утворенням одного або декількох видів диференційованого потомства зі зниженою здатністю до проліферації й розвитку; і (3) здатні до симетричних ділень клітин для самооновлення або самопідтримки. Ці властивості "ракових стволових клітин", "стволових клітин пухлини" або "стволових клітин солідної пухлини" додають цим раковим стволовим клітинам здатність формувати пальповані пухлини при серійній трансплантації миші з імунною 60 недостатністю, на відміну від більшості ракових клітин, які нездатні формувати пухлини. Ракові стволові клітини піддаються самооновленню, на противагу диференціюванню хаотичним чином з формуванням пухлин з аномальними типами клітин, які можуть мінятися з часом при виникненні мутацій. Стволові клітини солідної пухлини відрізняються від "ракової стволової лінії", представленої в патенті США Мо 6004528. У цьому патенті "ракову стволову лінію" визначають як повільно зростаючий тип клітин-попередників, який сам має небагато мутацій, але який піддається симетричним, а не асиметричним діленням клітин в результаті змін, що викликають утворення пухлини, які відбуваються в оточенні клітин. Ця гіпотеза "ракової стволової лінії" таким чином, передбачає, що пухлинні клітини з високим рівнем мутацій, швидко проліферуючі, виникають переважно в результаті аномального оточення, яке примушує відносно нормальні стволові клітини накопичуватися й потім піддаватися мутаціям, що примушує їх ставати раковими клітинами. В патенті США Мо 6004528 передбачають, що таку модель можна використовувати для поліпшення діагностики раку. Модель стволової клітини солідної пухлини фундаментально відрізняється від моделі "ракової стволової лінії" і в результаті має корисні властивості, що не надаються моделлю "ракової стволової лінії". По- перше, стволові клітини солідної пухлини не є "позбавленими мутацій". "Позбавлену мутацій ракову стволову лінію", описану в патенті США Мо 6004528, можна вважати передраковим вогнищем, тоді як стволовими клітинами солідної пухлини є ракові клітини, які самі по собі можуть містити мутації, відповідальні за утворення пухлин, починаючи від передракового стану до пізньої стадії раку. Тобто стволові клітини солідної пухлини ("ракові стволові клітини") будуть включені в клітини з високим рівнем мутацій, що їх відрізняють від "ракової стволової лінії" в патенті США Мо. 6004528. По-друге, генетичні мутації, які призводять до раку, можуть переважно бути властивими стволовим клітинам солідної пухлини, так само як бути зовнішніми.

Модель стволової клітини солідної пухлини передбачає, що виділені стволові клітини солідної пухлини можуть викликати додаткові пухлини при трансплантації (таким чином, пояснюючи метастазування), в той час модель "ракової стволової лінії" передбачатиме, що клітини трансплантованої "ракової стволової лінії" будуть нездатні викликати нову пухлину, оскільки це їхнє аномальне оточення було таким, що викликає утворення пухлини. Дійсно, можливість трансплантувати дисоційовані й виділені за фенотипом стволові клітини солідної пухлини мишам (у оточення, яке дуже відрізняється від нормального оточення в пухлині), де вони ще формують нові пухлини, відрізняє даний винахід від моделі "ракової стволової лінії". По-третє, стволові клітини солідної пухлини, ймовірно, діляться як симетрично, так і асиметрично, так що симетричне ділення клітин не є обов'язковою властивістю. По-четверте, стволові клітини солідної пухлини можуть ділитися швидко або повільно, залежно від багатьох змінних, так що повільна швидкість проліферації не є визначальною характеристикою.

Терміни "ракова клітина", "пухлинна клітина" і граматичні еквіваленти стосуються загальної популяції клітин, отриманих з пухлини або передракового вогнища, включаючи як не викликаючі утворення пухлини клітини, що складають більшість популяції пухлинних клітин, так і викликаючі утворення пухлини стволові клітини (ракові стволові клітини).

Як застосовують тут, термін "викликаючий утворення пухлини" стосується функціональних властивостей стволової клітини солідної пухлини, включаючи властивості самооновлення (утворення додаткових ракових стволових клітин, що викликають утворення пухлини) й проліферації для одержання всіх інших клітин пухлини (утворення диференційованих і, таким чином, не викликаючих утворення пухлини пухлинних клітин), що дозволяє стволовим клітинам солідної пухлини утворювати пухлину.

Як застосовують тут, терміни "раковий(ї) маркер(и) стволової клітини", "маркер(и) ракової стволової клітини", "маркер(и) стволової клітини пухлини" або "маркер(и) стволової клітини солідної пухлини" стосуються гена або генів, або білка, поліпептиду, або пептиду, експресованому за допомогою гена або генів, рівень експресії якого, окремо або в поєднанні з іншими генами, корелює з наявністю ракових клітин, що викликають утворення пухлини, на відміну від клітин, що не викликають утворення пухлини. Кореляція може стосуватися або збільшеної, або зменшеної експресії гена (наприклад, збільшених або зменшених рівнів мРНК або пептиду, що кодується геном).

Як застосовують тут, терміни "біопсія" або "біоптат тканини" стосуються зразка тканини або рідини, який відбирають у суб'єкта з метою визначення, чи містить зразок ракову тканину. В деяких варіантах здійснення біоптат тканини або рідини отримують, оскільки підозрюють, що суб'єкт страждає на рак, і потім біоптат тканини або рідини досліджують на наявність або відсутність раку.

Як застосовують тут, термін "суб'єкт" стосується будь-якої тварини (наприклад, ссавця), включаючи, як необмежуючі приклади, людину, приматів, що не належать до людини, гризунів й тому подібне, яка призначена, щоб бути реципієнтом конкретного лікування. Як правило, терміни "суб'єкт" і "пацієнт" використовують взаємозамінно тут у відношенні до суб'єкта-людини. "Фармацевтично прийнятний" стосується того, що схвалено або може бути схвалено органом регулювання федерального або державного уряду або перераховано в ИЦ.5.

РПпапгтасореїа або іншій загальновідомій фармакопеї для вживання для тварин, включаючи людину. "Фармацевтично прийнятна сіль" стосується солі сполуки, яка є фармацевтично прийнятною й має бажану фармакологічну активність вихідної сполуки. "Фармацевтично прийнятний наповнювач, носій або ад'ювант" стосується наповнювача, носія або ад'юванту, що його можна вводити суб'єктові разом, щонайменше, з одним антитілом з даного опису і який не порушує його фармакологічну активність і є не токсичним при введенні в дозах, достатніх для доставки терапевтичної кількості сполуки. "Фармацевтично прийнятний носій" стосується розчинника, ад'юванту, наповнювача або носія, з яким уводять щонайменше одне антитіло з даного опису. "Проліки" стосуються похідної терапевтично ефективної сполуки, якій необхідна трансформація всередині організму для одержання терапевтично ефективної сполуки. Проліки можуть бути фармакологічно неактивними до переведення в терапевтично ефективну вихідну сполуку.

Термін "терапевтично ефективна кількість" стосується кількості антитіла, поліпептиду, полінуклеотиду, малої органічної молекули або іншого лікарського засобу, ефективного для "лікування" захворювання або порушення у суб'єкта або ссавця. В разі раку терапевтично ефективна кількість лікарського засобу може зменшувати кількість ракових клітин; зменшувати розмір пухлини; інгібувати або зупиняти інфільтрацію ракових клітин у периферичні органи, включаючи, наприклад, поширення раку в м'яку тканину і кістку; інгібувати й зупиняти метастазування пухлини; інгібувати й зупиняти зростання пухлини; полегшувати до деякої міри один або декілька симптомів, пов'язаних з раком, зменшувати захворюваність і смертність; покращувати якість життя; або поєднувати такі ефекти. В тих випадках, коли лікарський засіб запобігає зростанню існуючих ракових клітин і/або вбиває їх, його можна позначати цитостатичним і цитотоксичним.

Зо Як застосовують тут, "постановка діагнозу" або "діагностична інформація" стосується будь- якої інформації, включаючи, наприклад, наявність ракових стволових клітин, яка є корисною для визначення, чи має пацієнт захворювання або стан, і/або для класифікації захворювання або стану за фенотиповою категорією або будь-якою категорією, що має значення відносно до прогнозу або можливої відповіді на лікування (чи то на лікування взагалі, чи то на будь-яке конкретне лікування) захворювання або стану. Так само, діагноз стосується надання будь-якого типу діагностичної інформації, включаючи, як необмежуючі приклади, інформацію, чи має суб'єкт, ймовірно, стан (як-от пухлина), чи містить пухлина суб'єкта ракові стволові клітини, інформацію відносно характеру або класифікації пухлини, наприклад пухлину з високим ризиком або пухлину з низьким ризиком, інформацію відносно прогнозу та інформацію, корисну для вибору відповідного лікування. Вибір лікування може включати вибір конкретного хіміотерапевтичного засобу або іншого способу лікування, такого як хірургія або радіоактивне опромінення, або вибір відносно зупинки або проведення лікування.

Як застосовують тут, терміни "надання прогнозу", "прогностична інформація" або "прогнозна інформація" стосуються надання інформації, включаючи, наприклад, наявність ракових стволових клітин у пухлині суб'єкта, інформацію відносно впливу наявності раку (наприклад, як визначено діагностичними способами за даним винаходом) на майбутнє здоров'я суб'єкта (наприклад, очікувану захворюваність або смертність, вірогідність придбання раку й ризик метастазування).

Такі терміни, як "лікування" або "обробка", або "лікувати", або "полегшення", або "полегшувати", стосуються як 1) терапевтичних заходів, які виліковують, уповільнюють, зменшують симптоми і/або зупиняють прогрес діагностованого патологічного стану або порушення, так і 2) профілактичних або застережливих заходів, які запобігають і/або уповільнюють розвиток наміченого патологічного стану або порушення. Таким чином, ті, хто потребує лікування, включають тих, хто вже має порушення, тих, хто схильний до придбання порушення, й тих, хто підлягає запобіганню порушенню. Суб'єкта успішно "лікують" згідно зі способами за даним винаходом, якщо для пацієнта показують одне або декілька з наступного: зниження кількості або повна відсутність ракових клітин; зменшення розміру пухлини; інгібування або відсутність інфільтрації ракових клітин у периферичні органи, включаючи, наприклад, поширення раку в м'яку тканину й кістку; інгібування або відсутність метастазування 60 пухлини; інгібування або відсутність зростання пухлини; полегшення одного або декількох симптомів, пов'язаних з конкретним раком; зниження захворюваності й смертності; поліпшення якості життя; або яке-небудь поєднання ефектів.

Як застосовують тут, терміни "полінуклеотид" або "нуклеїнова кислота" стосуються полімеру, що складається з безлічі нуклеотидних одиниць (рибонуклеотид або дезоксирибонуклеотид або родинні структурні варіанти), зв'язаних за допомогою фосфодіефірних зв'язків, включаючи як необмежуючі приклади ДНК або РНК. Термін охоплює послідовності, які містять будь-який з відомих аналогів основ з ДНК і РНК, включаючи, як необмежуючі приклади, 4-ацетилцитозин, 8-гідрокси-Мб-метиладенозин, азиридинілцитозин, псевдоіїзоцитозин, 5(карбоксигідроксилметил)уурацил, 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5- карбоксиметил-амінометил-2-тіоурацил, 5-карбоксиметиламінометилурацил, дигідроурацил, інозин, Мб-ізопентеніладенін, 1-метиладенін, 1-метилпсевдоурацил, 1-метилгуанін, 1- метилінозин, 2,2-диметилгуанін, 2-метиладенін, 2-метилгуанін, З-метилцитозин, 5- метилцитозин, Мб-метиладенін, 7-метилгуанін, 5-метиламінометилурацил, 5- метоксіамінометил-2-тіоурацил, бета-О-манозилквеуозин, 5'-метоксикарбоніл-метилурацил, 5- метоксіурацил, 2-метилтіо-Мб-ізопентеніладенін, метиловий ефір урацил-5-оксіоцтової кислоти, урацил-5-оксіоцтову кислоту, оксибутоксозин, псевдоурацил, квеуозин, 2-тіоцитозин, 5-метил-2- тіоурацил, 2-тіоурацил, 4-тіоурацил, 5-метилурацил, метиловий ефір М-урацил-5-оксіоцтової кислоти, урацил-5-оксіоцтову кислоту, псевдоурацил, квеуозин, 2-тіоцитозин і 2,6-діамінопурин.

Фраза "суворі умови гібридизації" стосується умов, за яких зонд буде гібридизуватися з його підпослідовністю-мішенню, як правило, у складній суміші нуклеїнових кислот, але не з іншими послідовностями. Суворі умови є залежними від послідовності й будуть різними за різних обставин. Довші послідовності специфічно гібридизуються при вищих температурах. Детальне керівництво з гібридизації нуклеїнових кислот представлене в Ті)ї55еп, Тесппіднез іп Віоспетівігу апа Моїесшіаг Віоіоду - Нубгіаігайоп м/йй Мисієїс Ргорев, "Омег/ем» ої ргіпсіріе5 ої пубіідіганоп апа

Те зігаїеду ої писієїс асій аззаувз" (1993). Як правило, вибирають суворі умови, що є приблизно на 5-10 С нижчі за термічну точку плавлення (Тіт) для конкретної послідовності при певній іонній силі і рН. Тт є температурою (при певній іонній силі, рН їі концентрації нуклеїнової кислоти), при якій 50 95 зондів, комплементарних мішеней, гібридизується з послідовністю- мішенню при рівновазі (оскільки послідовності-мішені наявні в надлишку, при Тт 50 905 зондів

Зо зайнято при рівновазі). Суворих умов можна також досягати за допомогою додавання дестабілізаторів, таких як формамід. Для вибіркової або специфічної гібридизації позитивний сигнал, щонайменше, вдвічі перевищує фон, переважно в 10 разів перевищує фонову гібридизацію. Зразкові суворі умови гібридизації можуть бути наступними: 50 95 формамід,

Б5хЗЗС і 1 95 505, інкубація при 42 "С, або 5х5560, 1 95 505, інкубація при 65 "С, з промиванням у 0,2х5С і 0,1 95 505 при 65 "С.

Термін "ген" стосується послідовності нуклеїнової кислоти (наприклад, ДНК), яка містить кодуючі послідовності, необхідні для одержання поліпептиду, попередника або РНК (наприклад,

РРНК, тРНК). Поліпептид може кодувати повнорозмірна кодуюча послідовність або будь-яка частина кодуючої послідовності, поки зберігаються бажана активність або функціональні властивості (наприклад, ферментативна активність, зв'язування ліганду, передача сигналу, імуногенність і так далі) повнорозмірного поліпептиду або фрагмента. Термін охоплює також кодуючу ділянку структурного гена й послідовності, локалізовані поряд з кодуючою ділянкою як з 5-, так ії з 3-кінців на відстані приблизно 1 т.п.н. або більше на кожному кінці, так що ген відповідає довжині повнорозмірної мРНК. Послідовності, локалізовані на 5' кодуючій ділянці й наявні в мРНК, позначають як 5'-нетрансльовані послідовності. Послідовності, локалізовані на 3' або нижче кодуючої ділянки й наявні в мРНК, позначають як 3'-нетрансльовані послідовності.

Термін "ген" охоплює як кДНК, так і геномні форми гена. Форма геному або клон гена містить кодуючу ділянку, що переривається некодуючими послідовностями, названими "інтрони" або "вбудовані ділянки", або "вбудовані послідовності" Інтронами є фрагменти гена, які транскрибуються в ядерну РНК (тяЯРНК); інтрони можуть містити регуляторні елементи, такі як енхансери. Інтрони віддаляються або "піддаються сплайсингу" з ядерного або первинного транскрипту; інтрони, таким чином, відсутні в транскрипті матричної РНК (мРНК). мРНК функціонує під час трансляції для визначення послідовності або порядку амінокислот у виникаючому поліпептиді. На додаток до наявних інтронів, геномні форми гена можуть також містити послідовності, локалізовані як на 5-, так і на 3-кінці послідовностей, наявних у транскрипті РНК. Ці послідовності позначають як "фланкуючі" послідовності або ділянки (ці фланкуючі послідовності локалізовані до 5' або 3' від нетрансльованих послідовностей, наявних у транскрипті МРНК). 5'-/Бланкуюча ділянка може містити регуляторні послідовності, такі як промотори й енхансери, які контролюють транскрипцію гена або впливають на неї. 3'-

фланкуюча ділянка може містити послідовності, які управляють термінацією транскрипції, посттранскрипційним розщеплюванням й поліаденілюванням.

Термін "рекомбінантний" при використанні відносно клітини, нуклеїнової кислоти, білка або вектору позначає те, що клітина, нуклеїнова кислота, білок або вектор були модифіковані введенням гетерологічної нуклеїнової кислоти або білка, зміною природної нуклеїнової кислоти або білка, або що клітина отримана з модифікованої таким чином клітини. Таким чином, наприклад, рекомбінантні клітини експресують гени, не виявлені в природній (не рекомбінантній) формі клітини, або експресують природні гени, які є надекспресованими або іншим чином аномально експресованими, наприклад, експресованими у вигляді фрагментів, що не зустрічаються в природі, або варіантів сплайсингу. Терміном "рекомбінантна нуклеїнова кислота" тут позначають нуклеїнову кислоту, спочатку отриману іп міо, як правило, за допомогою маніпуляції з нуклесовою кислотою, наприклад, з використанням полімераз і ендонуклеаз, у формі, в нормі не виявленій у природі За цим способом досягають функціонального зв'язування різних послідовностей. Таким чином, виділену нуклеїнову кислоту, в лінійній формі, або експресуючий вектор, отриманий іп мйго лігуванням молекул ДНК, які в нормі не є сполученими, обидва вважають рекомбінантними для цілей за даним винаходом.

Зрозуміло, що після одержання рекомбінантної нуклеїнової кислоти і введення у клітину або організм-господаря, вона буде реплікуватися нерекомбінантним чином, тобто з використанням іп мімо клітинного апарату клітини-господаря, а не маніпуляцій іп міо; проте такі нуклеїнові кислоти, одного дня отримані рекомбінантним чином, хоча вони й реплікуються потім нерекомбінантним чином, все ще вважають рекомбінантними для цілей винаходу. Подібним чином, "рекомбінантним білком" є білок, отриманий з використанням рекомбінантних способів, тобто за допомогою експресії рекомбінантної нуклеїнової кислоти, як описано вище.

Як застосовують тут, термін "гетерологічний ген" стосується гена, наявного не у своєму природному оточенні. Наприклад, гетерологічний ген включає ген з одних видів, уведений в інші види. Гетерологічний ген включає також ген, природний для організму, який є зміненим яким- небудь чином (наприклад, підданим мутаціям, доданим у багатьох копіях, зв'язаним з неприродними регуляторними послідовностями і так далі). Гетерологічні гени відрізняються від ендогенних генів тим, що послідовності гетерологічного гена, як правило, приєднані до послідовностей ДНК, які не виявлені зв'язаними з послідовностями гена на хромосомі, або зв'язані з частинами хромосоми, не виявленими в природі (наприклад, гени, експресовані в локусах, де гени в нормі не експресовані).

Як застосовують тут, термін "вектор" використовують відносно до молекул нуклеїнової кислоти, які переносять фрагмент(и) ДНК від однієї клітини до іншої. Термін "носій" інколи використовують взаємозамінно з "вектором". Вектори часто отримують з плазмід, бактеріофагів або вірусів рослин або тварин. "Лігування" стосується процесу формування фосфодіефірних зв'язків між двома фрагментами дволанцюжкової нуклеїнової кислоти. Якщо не передбачено інакше, лігування можна здійснювати з використанням відомих буферів і умов за допомогою 10 одиниць Т4 Днк- лігази ("лігази") на 0,5 мкг приблизно еквімолярних кількостей фрагментів ДНК, що підлягають лігуванню. Лігування нуклеїнової кислоти може служити для зв'язування двох білків разом у рамці зчитування для одержання одного білка, або злитого білка.

Як застосовують тут, термін "експресія гена" стосується процесу переведення генетичної інформації, закодованої в гені, в РНК (наприклад, мРНК, рРНК, тРНК, або мяРНК) за допомогою "транскрипції" гена (наприклад, за допомогою ферментативної дії РНК-полімерази), і, для кодуючих білок генів, у білок за допомогою "трансляції" мРНК. Експресію гена можна регулювати на багатьох стадіях процесу. "Підвищувальна регуляція" або "активація" стосується регуляції, яка збільшує продукцію продуктів експресії гена (наприклад, РНК або білка), тоді як "знижуюча регуляція" або "репресія" стосується регуляції, яка зменшує продукцію. Молекули (наприклад, чинники транскрипції), які залучені в підвищувальну регуляцію, або знижуючу регуляцію, часто називають "активаторами" і "репресорами", відповідно.

Терміни "поліпептид", "пептид", "білок" і "фрагмент білка" використовують тут взаємозамінно для позначення полімеру із залишків амінокислот. Терміни застосовують до полімерів амінокислот, у яких один або декілька залишків амінокислот є штучним хімічним міметиком відповідної в природі амінокислоти, так само як до полімерів амінокислот, що зустрічаються в природі, і полімерів амінокислот, що не зустрічаються в природі.

Термін "амінокислота" стосується тих, що зустрічаються в природі і синтетичних амінокислот, так само аналогів амінокислот і міметиків амінокислот, які функціонують схожим чином з амінокислотами, що зустрічаються в природі. Амінокислотами, що зустрічаються в 60 природі, є амінокислоти, що кодуються генетичним кодом, так само як амінокислоти, які є модифікованими пізніше, наприклад гідроксипролін, гамма-карбоксиглутамат і О-фосфосерин.

Аналоги амінокислот стосуються сполук, які мають таку саму основну хімічну структуру, як амінокислоти, що зустрічаються в природі, наприклад альфа-вуглець, який є пов'язаним з воднем, карбоксильною групою, аміногрупою і К-групою, наприклад гомосерин, норлейцин, метіонінсульфоксид, метіонінметилсульфоній. Такі аналоги можуть мати модифіковані К-групи (наприклад, норлейцин) або модифіковані пептидні остови, але зберігати таку саму основну хімічну структуру, як амінокислота, що зустрічається в природі. Міметики амінокислот стосуються хімічних сполук, які мають структуру, що відрізняється від основної хімічної структури амінокислоти, але які функціонують схожим чином з амінокислотою, що зустрічається в природі. "Консервативно модифіковані варіанти" застосовують до послідовностей як амінокислот, так і нуклеїнової кислоти. "Варіанти амінокислот" стосуються послідовностей амінокислот. У відношенні до конкретних послідовностей нуклеїнової кислоти, консервативно модифіковані варіанти стосуються тих нуклеїнових кислот, які кодують ідентичні або по суті ідентичні послідовності амінокислот, або коли нуклеїнова кислота не кодує амінокислотну послідовність, по суті ідентичних або зв'язаних (наприклад, близьких у природі) послідовностей. Через виродженість генетичного коду велика кількість функціонально ідентичних нуклеїнових кислот кодує більшість білків. Наприклад, кодони СА, СС, (СО і СИ всі кодують амінокислоту аланін. Таким чином, у кожному положенні, де кодон визначає аланін, кодон можна замінювати на інший з відповідних описаних кодонів без зміни кодованого поліпептиду. Такими варіантами нуклеїнової кислоти є "мовчазні варіанти", які є одним з видів консервативно модифікованих варіантів. Кожна послідовність нуклеїнової кислоти тут, яка кодує поліпептид, описує також мовчазні варіанти нуклеїнової кислоти. Фахівцеві в даній галузі відомо, що в конкретному контексті кожен кодон у нуклеїновій кислоті (окрім АОС, який зазвичай є єдиним кодоном для метіоніну, і ТО, який зазвичай є єдиним кодоном для триптофану) можна модифікувати з одержанням функціонально ідентичної молекули. Відповідно, під мовчазними варіантами нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, маються на увазі в описаній послідовності відносно до продукту експресії але не відносно до дійсної послідовності зонда. Що стосується послідовностей амінокислот, фахівцеві в даній галузі відомо, що окремі заміни, делеції або вставки в послідовність нуклеїнової кислоти, пептиду, поліпептиду або білка, які замінюють, додають або делетують окрему амінокислоту або невеликий відсоток амінокислот у кодованій послідовності, є "консервативно модифікованим варіантом", включаючи ті, де зміни приводять до заміни амінокислоти на хімічно схожу амінокислоту. Таблиці консервативних замін, що представляють функціонально схожі амінокислоти, добре відомі в даній галузі. Такі консервативно модифіковані варіанти є доповненням і не виключають поліморфні варіанти, міжвидові гомологи й алелі за винаходом. Як правило, консервативні заміни включають: 1)

Аланін (А), Гліцин (0); 2) Аспарагінову кислоту (0), Глутамінову кислоту (Е); 3) Аспарагін (М),

Глутамін (0); 4) Аргінін (К), Лізин (К); 5) Ізолейцин (І), Лейцин (І), Метіонін (М), Валін (М); б)

Фенілаланін (Є), Тирозин (У), Триптофан (УМ); 7) Серин (5), Треонін (Т); і 8) Цистеїн (С), Метіонін (М) (див., наприклад, Стеідпоп, Ргоїеїіп5 (1984)).

Термін "мічений епітопом", як застосовують тут, стосуються химерного поліпептиду, що містить послідовність маркерного білка або домену ракової стволової клітини, або її частину, злиту з "епітопом-міткою". Поліпептид епітопа-мітки містить досить залишків амінокислот для надання епітопа для впізнавання антитілом, проте є досить коротким, так що він не заважає активності маркерного білка ракової стволової клітини. Відповідні епітопи-мітки, як правило, мають щонайменше шість залишків амінокислот, зазвичай між приблизно 8 і приблизно 50 залишками амінокислот та інколи між приблизно 10 і приблизно 20 залишками.

Загальноприйняті епітопи-мітки включають мітки Ес, НА, Ніз і ГГ А.

Даний винахід стосуються композицій і способів для дослідження, діагностики, характеристики й лікування раку. Зокрема, даний винахід стосується антитіл проти маркерів стволових клітин солідної пухлини і способів використання цих антитіл для інгібування зростання пухлини й лікування раку у пацієнтів-людей. У конкретних варіантах здійснення антитіла за даним винаходом включають антитіла-антагоністи, які специфічно зв'язують маркерний білок ракової стволової клітини і заважають, наприклад, зв'язуванню ліганду, димеризації рецептора, експресії маркерного білка ракової стволової клітини й передачі сигналу маркерним білком ракової стволової клітини. В конкретних варіантах здійснення описані антитіла включають антитіла-агоністи, які специфічно зв'язують маркерний білок ракової стволової клітини і сприяють, наприклад, зв'язуванню ліганду, димеризації рецептора, й передачі сигналу маркерним білком ракової стволової клітини. В конкретних варіантах 60 здійснення описані антитіла не перешкоджають або не сприяють біологічній активності маркерного білка ракової стволової клітини, проте інгібують зростання пухлини за допомогою, наприклад, інтерналізації й розпізнавання імунною системою антитіла. В конкретних варіантах здійснення антитіла специфічно впізнають більш за один маркерний білок клітин солідної пухлини.

Представлено виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з епітопом 01/14 людини, сформованим поєднанням М-кінцевої ділянки 01 І4 людини (5ЕО ІО МО: 27) і О5І. людини (ЗЕО

ІЮО МО: 26), де антитіло впливає на зростання пухлини. В конкретних варіантах здійснення антитілом є моноклональне антитіло. В конкретних варіантах здійснення антитілом є химерне антитіло. В конкретних варіантах здійснення антитілом є гуманізоване антитіло. В конкретних варіантах здійснення антитілом є антитіло людини. Крім того, представлена фармацевтична композиція, що містить антитіло за даним описом і фармацевтично прийнятний носій.

Крім того, представлений спосіб лікування раку, що включає введення терапевтично ефективної кількості антитіла або фармацевтичної композиції за даним описом. У конкретних варіантах здійснення антитіло кон'юЮгують з цитотоксичною групою. В конкретних варіантах здійснення спосіб додатково включає введення щонайменше одного терапевтичного засобу, придатного для здійснення комбінованої терапії. В конкретних варіантах здійснення пухлинні клітини вибрані з клітин пухлини молочної залози, пухлини ободової і прямої кишки, пухлини легені, пухлини передміхурової залози, пухлини підшлункової залози й пухлини голови і шиї.

Подібно до тканин, з яких вони походять, солідні пухлини складаються з гетерогенної популяції клітин. Те, що більшість цих клітин не викликають утворення пухлини, дозволяє передбачати, що розвиток й підтримка солідних пухлин також засновані на невеликій популяції стволових клітин (тобто викликаючих пухлину ракових клітин) із здатністю проліферувати й ефективно давати початок як додатковим стволовим клітинам пухлин (самооновлення), так і більшості більш диференційованих пухлинних клітин, які не мають потенціалу викликати утворення пухлини (тобто не викликаючих утворення пухлини ракові клітини). Концепцію ракових стволових клітин вперше представили незабаром після відкриття гематопоетичних стволових клітин (НЗС) і довели експериментально для гострого мієлогенного лейкозу (АМІ) (Рак єї аї., 1971, 9). Маї!. Сапсег Іпві. 46:411-22; І арідої єї аї!., 1994, Маште 367:645-8; Воппеї 4 ріск, 1997, Маї. Меа. 3:730-7; Норі еї аї., 2004, Маї. Іттипої. 5:738-43). Пізніше виділили

Зо стволові клітини з солідних пухлин на підставі їх експресії унікального набору рецепторів поверхні клітин і оцінки їхніх властивостей самооновлення й проліферації в культурі і в моделях на тваринах з ксенотрансплантацією. Виявили лінійну популяцію ЕБАНСЮ44-С024-/низький, більш ніж у 50 разів збагачену за здатністю утворювати пухлини в порівнянні з нефракціонованими пухлинними клітинами (АІ-На)) єї а!., 2003, Ргос. Маг. Асад. сі. 100:3983-8).

Можливість виділяти викликаючі утворення пухлини ракові стволові клітини з безлічі пухлинних клітин, що не викликають утворення пухлини, привела до ідентифікації маркерів ракових стволових клітин, генів з диференціальною експресією в ракових стволових клітинах у порівнянні з пухлинними клітинами, що не викликають утворення пухлин, або нормальним епітелієм молочної залози з використанням аналізу на мікрочіпах За даним винаходом використовують знання цих ідентифікованих маркерів ракової стволової клітини для діагностики й лікування раку.

Маркери ракової стволової клітини за даним винаходом стосуються 0І 4 людини, ліганду рецептора Моїсй. Шлях передачі сигналу Моїспй є одним з декількох критичних регуляторів формування ембріональної картини, постембріональної підтримки тканин і біології стволових клітин. Конкретніше, передача сигналу Моїсп залучена в процес латерального гальмування між сусідніми клітинами, що визначає їхню долю, і грає важливу роль у визначенні шляху розвитку клітини під час асиметричних ділень клітин. Нерегульована передача сигналів Моїсй зв'язана з безліччю типів раку людини, де вона може змінювати напрям розвитку пухлинних клітин для підтримки їх у недиференційованому й проліферативному стані (Вгеппап апа Вгом/п, 2003,

Вгеазі Сапсег Кез. 5:69). Таким чином, канцерогенез може тривати, захоплюючи механізми гомеостазу, контролюючі нормальний розвиток і репарацію тканин за допомогою популяцій стволових клітин (Веаспу еї аІ!., 2004, Майшге 432:324).

Рецептор Моїсп вперше ідентифікували у мутантів Огозорпйа. Гаплонедостатність Моїсй у

Югозорпйа призводить до вирізів на краю крила, тоді як втрата функції приводить до ембріонального летального "нейрогенного" фенотипу, коли клітини епідермісу перемикають розвиток на нервову тканину (Моопг, 1919, Сепеї. 4:252; Роцізоп, 1937, РМАБЗ 23:133; Ропцїзоп, 1940, 9. Ехр. 2001. 83:271). Рецептором Моїсі є однопрохідний трансмембранний рецептор, що містить безліч тандемних повторів, подібних до епідермального чинника зростання (ЕСЕ) і багатих цистеїном повторів Моїсп/ ІМ-12 усередині великого позаклітинного домену (У/пагіоп еї

Ге) а!., 1985, СеїІ 43:567; Кіаа еї а!., 1986, Мої. Сеї! Віої!. 6:3094; огляд в Агіамапізв єї а!., 1999, бсіепсе

284:770). Ідентифікували чотири білки Моїсп ссавців (МОТСНІ, МОТСН2, МОТСНЗ і МОТСНЯ), і мутації в цих рецепторах незмінно приводять до аномалій розвитку й патологій людини, включаючи важкі типи раку, як детально описано нижче (сгіаІеу, 1997, Мої. СеїЇ Мецгозсі. 9:103;

Уошеї б Тошгппіег-І аззегуе, 1998, Зетіп. СеІПОєм. Віої. 9:619-25).

Рецептор Моїсп активують однопрохідні трансмембранні ліганди сімейства Оейа, 5егтаїеай,

Ї аа-2 (051). Відомі ліганди Моїсі у ссавців, Оека-подібний 1 (0111), ОенКа-подібний З (01ІЗ3), Оена- подібний 4 (04), даддей 1 і даддей 2, характеризуються доменом ЮО5І і тандемними ЕСЕ- подібними повторами всередині позаклітинного домену. Позаклітинний домен рецептора Моїсп взаємодіє з позаклітинним доменом його лігандів, як правило, на сусідніх клітинах, що приводить до двох протеолітичних розщеплювань Моїсй, позаклітинного розщеплювання, опосередкованого протеазою АБАМ, і розщеплювання всередині трансмембранного домену, опосередкованого гамма-секретазою. Це останнє розщеплювання утворює внутрішньоклітинний домен Моїсп (МІСО). Потім МІСО входить у ядро, де він активує сімейство чинників транскрипції

СВЕТ, супресор Наїгіез5 ІЗЩ(Н)І, Гад-2 (С5І) як головні нижчестоячі ефектори для збільшення транскрипції ядерних основних чинників транскрипції спіраль-петля-спіраль з сімейства Нагїгу і

Епнапсег ої рій ГЕ (5рі)) (Апамапіз єї аї., 1999, 5сіепсе 284:770; Вгеппап апа Вгомп, 2003, Вгеаві

Сапсег Ке5. 5:69; І5зо еї аї., 2003, Апегіозсієг. ТПготр. Мазс. ВіоЇ. 23:543). Альтернативні внутріклітинні шляхи, що залучають цитоплазматичний білок ЮОеМех, ідентифікований у

Огозорпійа, може також існувати у ссавців (Магііпе? еї а!., 2002, Си. Оріп. Сепеї. Оеєум. 12:524- 33), і цей залежний від Юейех шлях може діяти для супресії експресії генів-мішеней М/пі (Вгеппап еї а!., 1999, Ситт. Віої. 9:707-710; І амтепсе еї аї!., 2001, Си. Віо!. 11:375-85).

Гематопоетичні стволові клітини (НБС) є найбільш вивченими стволовими клітинами в організмі, й передача сигналу Моїсі є залученою як у їх нормальну підтримку, так і в лейкемічну трансформацію (Коррег «5 НаЇди, 2004, Раїйої. Опсої. Ке5. 10:69-73). НЗС є рідкою популяцією клітин, які можуть зберігатися в стомальній ніші всередині дорослого кісткового мозку. Ці клітини характеризуються як унікальним профілем експресії генів, так і здатністю постійно давати почало більш диференційованим клітинам-попередникам для реконструювання всієї гематопоетичної системи. Конститутивна активація передачі сигналів МоїЇсСп1 в НЗС і клітинах- попередниках приводить до утворення іморталізованих ліній клітин, з яких утворюються як

Зо лімфоїдні, так і мієлоїдні клітини іп міїго і в довготривалих аналізах реконструкції (Магпит-Ріппеу еї аІ., 2000, Маї. Мед. 6:1278-81), і присутність Уаддей 1 збільшує приживлення популяцій клітин кісткового мозку людини, збагачених за НЗС (Кагапи еї аї!., 2000, 9. Ехр. Мей. 192:1365-72).

Пізніше показали передачу сигналів Моїсй у НС іп мімо і показали, що вона залучена в інгібування диференціювання НЗС. Більш того, передача сигналів Моїсі, мабуть, необхідна для опосередкованого УуУпі самооновлення НС (Оипсап еї аї., 2005, Маї. Іттипої. 6:314).

Шлях передачі сигналів Моїсп також грає центральну роль у підтримці нервових стволових клітин і залучений як у їх нормальну підтримку, так і в злоякісні пухлини мозку (Коррег 4 Найди, 2004, Раїйої. Опсої. Ве5. 10:69-73; Ригому/ єї а!., 2005, Сапсег Вевз. 65:2353-63; НаПанап еї аї., 2004, Сапсег Ве. 64:7794-800). Нервові стволові клітини дають початок всім нейрональним і гліальним клітинам у нервовій системі ссавців у ході розвитку, і зовсім нещодавно їх ідентифікували в дорослому мозку (Саде, 2000, Зсіепсе 287:1433-8). Для мишей, дефіцитних за

Моїсп1, генам-мішеням Моїсй Неб1, З і 5 і регулювальникові передачі сигналів Моїсй пенесиліну 1 (РБ1), показали знижену кількість ембріональних нервових стволових клітин. Більше того, кількість дорослих нервових стволових клітин знижена в мозку гетерозиготних за Р51 мишей (МаКкатига еї аї., 2000, У. Мешйговсі. 20:283-93; Ніїоз5пі єї аі., 2002, Сепе5з Оєм. 16:846-58).

Зменшення кількості нервових стволових клітин, мабуть, є результатом їх передчасного диференціювання в нейрони (Найакеуата еї аїЇ.,, 2004, Оем. 131:5539-50), що дозволяє передбачати, що передача сигналів Моїсй регулює диференціювання й самооновлення нервових стволових клітин.

Неправильна передача сигналів Моїсп залучена в ряд типів раку людини. Ген МОТСНІ у людини вперше ідентифікували в підгрупі Т-клітинних гострих лімфобластних лейкозів як транслокований локус, що приводить до активації шляху Моїсі (Еї5еп еї аї., 1991, СеїІ 66:649- 61). Конститутивна активація передачі сигналів МоїсСй1 в Т-клітинах у моделях на мишах так само викликає Т-клітинні лімфоми, що дозволяє передбачати її роль як причину (Кобеу еї аї., 1996, Сеї! 87:483-92; Реаг евї а!., 1996, У. Ехр. Мед. 183:2283-91; Мап еї а!., 2001, Віоса 98:3793-9;

ВеїІаміа єї аІ., 2000, ЕМВО 3. 19:3337-48). Нещодавно виявили, що точкові мутації, вставки й делеції в МОТСНІ, що приводять до неправильної передачі сигналів МОТСНІ, часто наявні при

Т-клітинному гострому лімфобластному лейкозі/лімфомі як у дітей, так і у дорослих (Реаг 5

Авівг, 2004, Си. Оріп. Нетай!. 11:416-33).

Часта вставка вірусу пухлини молочної залози миші в локуси як МоїЇсСп1!, так і МоїсН4 в пухлинах молочної залози й отримані в результаті активовані фрагменти білка Моїсп в першу чергу залучені в передачу сигналів Моїсп при раку молочної залози (Саанап 85 СаПанап, 1987,

У. Мігої! 61:66-74; Втеппап 5 Вгомпп, 2003, Вгєазі Сапсег Везв. 5:69; Роїнй; еї а!., 2004, бЗетіп. Сапсег

ВіоІ. 14:341-7). Подальші дослідження трансгенних мишей підтвердили роль Моїсп у розгалуженні проток у ході нормального розвитку молочної залози, й конститутивно активна форма Моїсп4 в епітеліальних клітинах молочної залози інгібує диференціювання епітелію й приводить до утворення пухлин (Упаррап вї а!., 1992, Сепез в Юем. 6:345-5; СаПанап єї а!., 1996,

Сапсег Вез. 56:1775-85; Зтійй еї аї!., 1995, Сеї! Стгоулпи ОіМег. 6:563-77; богіапо єї а!., 2000, Ії. у.

Сапсег 86:652-9; Оунепаавєї!е еї а!., 1998, Оєм. Віо! 196:204-17; Роїйї єї аІ., 2004, бетіп. Сапсег

ВіоІ. 14:341-7). У даний час доказ ролі Моїспй при раку молочної залози людини обмежений експресією рецепторів Моїспй при карциномах молочної залози і її кореляцією з результатом хвороби (Меї7еп еї а!., 2002, Маї. Меа. 8:979-86; Раїт єї а!., 2004, Іпі. У. Мої. Меа. 14:779-86).

Більш того, надекспресію для шляху Моїсп спостерігали при раку шийки матки (7адоигаз еї аї., 1995, РМАБ5 92:6414-89, нирковоклітинному раку (Кає еї аї., 2000, Іпї У. Сапсег 88:726-32), плоскоклітинному раку голови й шиї (Іеєїнапаки! єї аіІ., 2000, Опсодепе 19:3220-4), раку ендометрію (Зигикі еї аї., 2000, Іпі. 9. Опсої. 17:1131-9), і нейробластомах (мап І ітрі еї аї., 2000,

Мед. Реаїаїг. Опсої. 35:554-8), що вказує на потенційну роль Моїсп у розвитку низки неоплазій.

Цікаво, що передача сигналів Моїсй може грати роль у підтримці в недиференційованому стані

Аре-мутантних неопластичних клітин ободової кишки (мап Е5 45 СіІемег5, 2005, Тгепаз Мої. Меа. 11:496-502).

Шлях Моїсп залучений також у багато аспектів розвитку судин, включаючи проліферацію, міграцію, диференціювання гладких м'язів, ангіогенез і артеріально-венозне диференціювання (Ізо еї а!., 2003, Апегіозсіег. Тпготь. Мазе. Віої. 23:543). Наприклад, гомозиготні нульові мутації в

Моїср-1/4 і даддеа-1, так само як гетерозиготна втрата 014, приводить до важких, хоча й різних, дефектів у розвитку артерій і васкуляризації жовткового мішка. Більш того, для БІ -дефіцитних і

Моїсп-2-гіпоморфних ембріонів миші показали геморагію, яка, ймовірно, є результатом слабкого розвитку судинних структур (Заїйе еї аї., 2004, РМАБ, 101:15949-54; Ктерз вї а!., 2000, Сепез ЮОвєм. 14:1343-52; Хие єї аї., 1999, Нит. Ме! Сепеї. 8:723-30; Нгаре де Аповеїїв еї аї!., 1997, Майшге

Ко) 386:717-21; Местідні єї аї., 2001, Юєм. 128:491-502). У людини мутації в "ЛОСЕО1 пов'язані з синдромом Алажіля, порушенням розвитку, що включає дефекти судин, а мутації в МОТСНЗ є відповідальними за успадковану судинну деменцію (САВАЗБІЇ), при якій гомеостаз у судині є дефектним (Чошіе! єї аї., 1996, Масиге 383:707-10).

Ідентифікація 01/14, як експресованого в ракових стволових клітинах у порівнянні з нормальним епітелієм молочної залози, дозволяє передбачати націлювання шляху Моїсй на знищення не лише більшості клітин, що не викликають утворення пухлини ракових клітин, але також клітин, що викликають утворення пухлини, відповідальних за утворення й повторну появу солідних пухлин. Більш того, через значну роль ангіогенезу в утворенні й підтримці пухлини, націлювання на шлях Моїспй за допомогою антитіла проти 0/4 також може ефективно інгібувати ангіогенез, позбавляючи злоякісну пухлину живильних речовин і роблячи внесок до її знищення.

Таким чином, даний винахід стосується маркера ракової стволової клітини, експресію якого можна аналізувати для діагностики або моніторування захворювання, пов'язаного з раком. У деяких варіантах здійснення експресію маркера ракової стволової клітини визначають за експресією полінуклеотиду, наприклад такого, як мРНК, що кодує маркер ракової стволової клітини. Полінуклеотид можна детектувати й оцінювати кількісно за допомогою будь-якої кількості способів, добре відомих фахівцям у даній галузі. В деяких варіантах здійснення мРНК, що кодує маркер ракової стволової клітини, детектують гібридизацією іп 5йи зрізів тканини, наприклад, з біоптату пацієнта. В деяких варіантах здійснення РНК виділяють з тканини і проводять детекцію, наприклад, за допомогою Нозерн-блотингу, кількісною КТ-ПЦР або мікрочіпів. Наприклад, можна виділяти тотальну РНК із зразка тканини, і праймери, які специфічно гібридизуються з маркером ракової стволової клітини й ампліфікують його, можна використовувати для детекції експресії маркерного полінуклеотиду ракової стволової клітини з використанням КТ-ПЦР.

У конкретних варіантах здійснення експресію маркера ракової стволової клітини можна визначати за допомогою детекції відповідного поліпептиду. Поліпептид можна детектувати й оцінювати кількісно за допомогою будь-якої кількості способів, добре відомих фахівцям у даній галузі В деяких варіантах здійснення маркерний поліпептид ракової стволової клітини детектують з використанням аналітичних біохімічних способів, наприклад, таких як бо електрофорез, капілярний електрофорез, високоефективна рідинна хроматографія (НРІ С) або тонкошарова хроматографія (ТС). Виділений поліпептид можна також секвенувати загальноприйнятими способами. В деяких варіантах здійснення білковий маркер ракової стволової клітини детектують за допомогою антитіл, індикованих проти білка, з використанням, наприклад, імунофлуоресценції або імуногістохімії, на зрізах тканин. Альтернативно з антитілами проти маркера ракової стволової клітини можна детектувати експресію, наприклад,

ЕГІ5А, ЕГАС5, Вестерн-блотингу, імунопреципітації або білкових мікрочіпів. Наприклад, можна виділити з біоптату пацієнта ракові стволові клітини й детектувати експресію маркерного білка ракової стволової клітини флуоресцентний мічених антитіл з використанням ЕАС5. За іншим способом клітини, експресуючі маркер ракової стволової клітини, можна детектувати іп мімо з використанням мічених антитіл у звичайній системі відеодокументації. Наприклад антитіла, що мітяться парамагнітними ізотопами, можна використовувати для магнітно-резонансної томографії (МК).

У деяких варіантах здійснення даного винаходу діагностичний аналіз включає визначення того, експресується чи ні маркер ракової стволової клітини в пухлинних клітинах, з використанням, наприклад, імуногістохімії, гібридизації іп вйи або КТ-ПЦР. У інших варіантах здійснення діагностичний аналіз включає визначення рівнів експресії маркера ракової стволової клітини з використанням, наприклад, кількісного КТ-ПЦР. У деяких варіантах здійснення діагностичний аналіз додатково включає визначення рівнів експресії маркера ракової стволової клітини в порівнянні з контрольною тканиною, наприклад, як-от нормальний епітелій.

Детекцію експресії маркера ракової стволової клітини можна потім використовувати для надання прогнозу й вибору терапії. Прогноз може бути заснований на будь-якому відомому ризику, на який вказує експресія маркера ракової стволової клітини. Більш того, детекцію маркера ракової стволової клітини можна використовувати для вибору відповідної терапії, включаючи, наприклад, лікування за допомогою антитіл проти детектованого маркерного білка ракової стволової клітини. У конкретних варіантах здійснення антитіло специфічно зв'язується з позаклітинним доменом маркерного білка ракової стволової клітини, такого як ліганд рецептора

Моїсп, ОГІ 4.

У контексті даного винаходу відповідне антитіло є засобом, який може мати один або декілька з наступних ефектів, наприклад: заважати експресії маркера ракової стволової клітини;

Зо заважати активації шляху передачі сигналу ракової стволової клітини, наприклад, за допомогою стеричного інгібування взаємодій між маркером ракової стволової клітини і його лігандом, рецептором або співрецепторами; активувати шляхи передачі сигналу ракової стволової клітини, наприклад, за допомогою дії як ліганду або сприяння зв'язуванню ендогенного ліганду; або зв'язуватися з маркером ракової стволової клітини та інгібувати проліферацію пухлинної клітини.

У конкретних варіантах здійснення антитіла проти маркера ракової стволової клітини діють поза клітиною для модуляції функції білкового маркера ракової стволової клітини. В деяких варіантах здійснення позаклітинне зв'язування антитіла проти маркера ракової стволової клітини може інгібувати передачу сигналу білювим маркером ракової стволової клітини, наприклад, за допомогою інгібування активації, властивої маркеру ракової стволової клітини (наприклад, кіназної активності), і за допомогою стеричного інгібування взаємодії, наприклад, маркера ракової стволової клітини з його лігандом, з його рецептором, з співрецептором або з позаклітинним матриксом. У деяких варіантах здійснення позаклітинне зв'язування антитіла проти маркера ракової стволової клітини може здійснювати знижуючу регуляцію експресії маркера ракової стволової клітини на поверхні клітини, наприклад, за допомогою інтерналізації білкового маркера ракової стволової клітини або зменшення перенесення маркера ракової стволової клітини на поверхню клітини. В деяких варіантах здійснення позаклітинне зв'язування антитіла проти маркера ракової стволової клітини може стимулювати передачу сигналу білковим маркером ракової стволової клітини, наприклад, за допомогою дії як ліганду- приманки або збільшення зв'язування ліганду.

У конкретних варіантах здійснення антитіла проти маркера ракової стволової клітини зв'язуються з білковим маркером ракової стволової клітини і мають один або декілька з наступних ефектів: інгібують проліферацію пухлинних клітин, запускають клітинну смерть пухлинних клітин, стимулюють диференціювання пухлинних клітин у тип клітин з меншою здатністю викликати утворення пухлин або запобігають метастазуванню пухлинних клітин. У конкретних варіантах здійснення антитіла проти маркера ракової стволової клітини запускають клітинну смерть за допомогою кон'юЮгованого токсину, хіміотерапевтичного засобу, радіоактивного ізотопу або іншого такого засобу. Наприклад, антитіло проти маркера ракової стволової клітини кон'югують з токсином, який активується в пухлинних клітинах, експресуючих бо маркер ракової стволової клітини, за допомогою інтернализації білка.

У конкретних варіантах здійснення антитіла проти маркера ракової стволової клітини опосередкують клітинну смерть клітини, експресуючої білковий маркер ракової стволової клітини, через антитілозалежну клітинну цитотоксичність (АЮОСС). АОСС залучає лізис клітин за допомогою ефекторних клітин, які впізнають Ес-фрагмент антитіла. Багато лімфоцитів, моноцитів, тканинних макрофагів, гранулоцитів й еозинофілів, наприклад, мають Ес рецептори й можуть опосередкувати цитоліз (Оійтап, 1994, у). Сііп. Опсої. 12:1497).

У конкретних варіантах здійснення антитіла проти маркера ракової стволової клітини запускають клітинну смерть клітини, експресуючої білковий маркер ракової стволової клітини за допомогою активації комплемент-залежної цитотоксичності (СОС). СОС залучає зв'язування комплементу сироватки з Ес-фрагментом антитіла й подальшу активацію каскаду білків комплементу, що приводить до руйнування мембрани клітин і можливої клітинної смерті.

Відомо, що біологічну активність антитіл у великій мірі визначають константні домени або ділянка Ес молекули антитіла (Шапапие апа Вепасег!таї, Техіроок ої Іттипоіоду, 2па Еайіоп,

ММіШіате 8 УМіКіп5, р. 218 (1984)). Антитіла різних класів і підкласів відрізняються в цьому відношенні, так само як антитіла того самого підкласу, але з різних видів. З антитіл людини (ДМ є класом антитіл, що найефективніше зв'язує комплемент, потім слідують Ідс1, доз і Ідса2, тоді як Ідс4, ймовірно, є абсолютно нездатним активувати каскад комплементу (ОШтап, 1994, ..

Сіїп. Опсої. 12:1497; ОепПегів єї аї.,, 1998, Іттипої. Нем. 163:59-76). Відповідно до даного винаходу отримані антитіла цих класів, що мають бажану біологічну активність.

Здатність будь-якого конкретного антитіла проти ракової стволової клітини опосередкувати лізис клітини-мішені за допомогою активації комплементу і/або АЮСС можна аналізувати.

Клітини, що становлять інтерес, вирощують і мітять іп міїгто; антитіло додають до культури клітин у поєднанні або з комплементом сироватки, або з імунними клітинами, які можна активувати за допомогою комплексів антигена з антитілом. Цитоліз клітин-мішеней детектують, наприклад, за вивільненням мітки з лігованих клітин. Фактично скринінг антитіл можна проводити з використанням власної сироватки пацієнта як джерела комплементу й/та імунних клітин.

Антитіло, яке здатне активувати комплемент або опосередкувати АОСС у тесті іп міго, можна потім використовувати терапевтично для цього конкретного пацієнта.

У конкретних варіантах здійснення антитіла проти маркера ракової стволової клітини можуть

Зо запускати клітинну смерть, інгібуючи ангіогенез. Ангіогенезом є процес, за допомогою якого нові кровоносні судини формуються з передіснуючих судин, і є фундаментальним процесом, необхідним для нормального зростання, наприклад, під час ембріонального розвитку, загоєння ран і у відповідь на овуляцію. Для зростання солідних пухлин більше 1-2 мм? також необхідний ангіогенез для постачання живильними речовинами й киснем, без яких пухлинні клітини гинуть.

У конкретних варіантах здійснення антитіло проти маркера ракової стволової клітини націлене на клітини судин, які експресують маркер ракової стволової клітини, включаючи, наприклад, ендотеліальні клітини, гладком'язові клітини, або компоненти позаклітинного матриксу, необхідні для збирання судини. В конкретних варіантах здійснення антитіло проти маркера ракової стволової клітини інгібує передачу сигналу чинником зростання, необхідну для залучення, об'єднання, підтримки або виживання клітин судини.

Антитіла проти маркера ракової стволової клітини знаходять вживання в діагностичних і терапевтичних способах, описаних тут. У конкретних варіантах здійснення антитіла за даним винаходом використовують для детекції експресії білкового маркера ракової стволової клітини в біологічних зразках, наприклад, таких як біоптат тканини пацієнта, плевральний випіт або зразок крові Можна отримувати зрізи біоптатів тканини й детектувати білок, наприклад, імунофлуоресценції або імуногістохімії. Крім того, можна виділяти окремі клітини із зразка й детектувати експресію білка у фіксованих або живих клітинах за допомогою аналізу ГАС5. У конкретних варіантах здійснення антитіла можна використовувати на білкових чіпах для детекції експресії маркера ракової стволової клітини, наприклад, на пухлинних клітинах, у лізатах клітин або в інших зразках білка. В конкретних варіантах здійснення антитіла за даним винаходом використовують для інгібування зростання пухлинних клітин за допомогою приведення антитіл у контакт з пухлинними клітинами в аналізах на основі клітин іп міо, в моделях на тваринах іп мімо і так далі. У конкретних варіантах здійснення антитіла використовують для лікування раку в пацієнта за допомогою введення терапевтично ефективної кількості антитіла проти маркера ракової стволової клітини.

Антитіла за винаходом можна отримувати будь-якими загальноприйнятими способами, відомими в даній галузі. Наприклад, поліклональні антитіла можна отримувати імунізацією тварини (наприклад, кроля, щура, миші, віслюка й так далі) за допомогою множинних підшкірних або внутрішньочеревинних ін'єкцій відповідного антигена (очищеного фрагмента пептиду, 60 повнорозмірного рекомбінантного білка, злитого білка тощо), необов'язково кон'югованого з гемоціаніном морського блюдечка (КІН), сироватковим альбуміном і так далі, розведеного в стерильному сольовому розчині й об'єднаного з ад'ювантом (наприклад, повним або неповним ад'ювантом Фрейнда) для одержання стабільної емульсії. Потім поліклональне антитіло виділяють з крові, асцитів і т.п. імунізованої таким чином тварини. Зібрана кров згортається, і сироватку декантують, освітлюють центрифугуванням і аналізують за титром антитіла.

Поліклональні антитіла можна виділяти з сироватки або асцитів згідно із загальноприйнятими в даній галузі способами, включаючи афінну хроматографію, іонообмінну хроматографію, гель- електрофорез, діаліз тощо.

Моноклональні антитіла можна отримувати з використанням способів гібридоми, таких як описані в Копіег апа Міїєїтеїп (1975) Маїшге 256:495. З використанням способу гібридоми мишу, хом'яка або іншу відповідну тварину-господаря імунізують, як описано вище, щоб викликати продукцію лімфоцитами антитіл, що специфічно зв'язуються 3 імунізуючим антигеном.

Лімфоцити можна також імунізувати іп міїго. Після імунізації лімфоцити виділяють і зливають з відповідною лінією клітин мієломи з використанням, наприклад, поліетиленгліколю для одержання клітин гібридоми, які потім можна відбирати від незлитих лімфоцитів і клітин мієломи. Гібридоми, які продукують моноклональні антитіла, спрямовані специфічно проти вибраного антигена, як визначено імунопреципітацією, імуноблотингом або аналізом зв'язування іп міго (наприклад, радіоїмунний аналіз (КІА), твердофазний імуноферментний аналіз (ЕГІЗА)), можна потім розмножувати або в культурі іп мійто з використанням загальноприйнятих способів (сСодіпд, Мопосіопа! Апііїбодієв: Ргіпсіріе5 апа Ргасіїсе, Асадетіс

Ргез5, 1986), або іп мімо у вигляді асцитних пухлин у тварині. Моноклональні антитіла можна потім очищати з культурального середовища або асцитної рідини, як описано для поліклональних антитіл вище.

Альтернативно моноклональні антитіла можна також отримувати з використанням способів рекомбінантної ДНК, як описано в патенті США 4816567. Полінуклеотиди, що кодують моноклональне антитіло, виділяють із зрілих В-клітин або клітин гібридоми, наприклад, за допомогою КТ-ПЦР з використанням олігонуклеотидних праймерів, специфічно ампліфікуючих гени, що кодують важкий і легкий ланцюги антитіла, і їх послідовність визначають з використанням загальноприйнятих способів. Виділені полінуклеотиди, що кодують важкий і

Зо легкий ланцюги, клонують потім у придатні експресуючі вектори, при трансфекції яких у клітини- господарі, такі як клітини Е. соїї, клітини мавпи СО5, клітини яєчника китайського хом'яка (СНО) або клітини мієломи, що в інших випадках не продукують імуноглобуліновий білок, клітини- господарі утворюють моноклональні антитіла. Рекомбінантні моноклональні антитіла або їхні фрагменти з бажаних видів можна також виділяти з бібліотек фагового дисплея, експресуючих

СОК з бажаного вигляду, як описано в (МсСаїйегіу еї аї., 1990, Майшге, 348:552-554; СІаск5оп єї а!., 1991, Мате, 352:624-628; і Магкз еї аї., 1991, 9. Мої. Віої, 222:581-597).

Полінуклеотид(и), що кодують моноклональне антитіло, можна далі модифікувати низкою різних способів з використанням способу рекомбінантної ДНК для одержання альтернативних антитіл. У деяких варіантах здійснення константні домени легкого й важкого ланцюгів, наприклад, з моноклонального антитіла миші, можна замінювати на 1) ці ділянки, наприклад, з антитіла людини для одержання химерного антитіла або 2) на поліпептид, що не належить до імуноглобулінів, для одержання злитого антитіла. У деяких варіантах здійснення константні ділянки укорочують або видаляють для одержання бажаного фрагмента антитіла з моноклонального антитіла. Сайт-специфічний або високодозвільний мутагенез варіабельної ділянки можна використовувати для оптимізації специфічності, афінности і т.д. моноклонального антитіла.

У деяких варіантах здійснення даного винаходу моноклональне антитіло проти маркера ракової стволової клітини є гуманізованим антитілом. Гуманізованими антитілами є антитіла, що містять мінімальні послідовності з антитіл, що не належать людині (наприклад, мишачих), усередині варіабельних ділянок. Такі антитіла використовують терапевтично для зменшення антигенності й відповідей НАМА (антитіло людини проти антитіла миші) при введенні людині. На практиці, гуманізованими антитілами, як правило, є антитіла людини з мінімумом аж до відсутності послідовностей, що не належать людині. Антитілом людини є антитіло, продуковане людиною, або антитіло, що має амінокислотну послідовність, відповідну антитілу, що продукується людиною.

Гуманізовані антитіла можна отримувати з використанням різних способів, відомих у даній галузі. Антитіло можна гуманізувати заміною СОК з антитіла людини на СОК з антитіла, що не належить людині (наприклад, миші, щура, кроля, хом'яка тощо), що має бажану специфічність, афінність і ємкість, слідуючи способам (допез еї аї., 1986, Маїйиге, 321:522-525; Віесптапп 6ї аї., 60 1988, Маїйге, 332:323-327; Метоеєуєп еї аїЇ., 1988, Зсієпсе, 239:1534-1536). Гуманізоване антитіло можна далі модифікувати за допомогою заміни додаткового залишку або у варіабельній людській каркасній ділянці, й/або всередині замінених та що не належать людині залишків, для поліпшення й оптимізації специфічності, афінності та/або ємкості антитіла.

Вибір варіабельних доменів важких і/або легких ланцюгів людини для вживання для використання для одержання гуманізованих антитіл може бути важливим для зменшення антигенності. Згідно зі способом "найкращої відповідності" проводять скринінг послідовності варіабельного домену антитіла гризунів проти повної бібліотеки відомих послідовностей амінокислот варіабельних доменів людини. Таким чином, у конкретних варіантах здійснення людську амінокислотну послідовність, найбільш гомологічну послідовності антитіла гризуна, з якої узяті СОК, використовують як людську каркасну ділянку (ЕК) для гуманізованого антитіла (бітв єї аї., 1993, У. Іттипої, 151:2296; СпоїШйіа еї аї!., 1987, 9. Мої. Віої, 196:901). За іншим способом використовують конкретну ЕК, виведену з консенсусної послідовності всіх людських антитіл конкретної підгрупи легких або важких ланцюгів, і її можна використовувати для декількох різних гуманізованих антитіл (Сагег еї аї., 1992, РМА5, 89; 4285; Ргезіа еї а!., 1993, 9.

Ітітипої, 151:2623). У конкретних варіантах здійснення використовують поєднання способів для відбору варіабельної ЕК людини для використання для одержання гуманізованих антитіл.

Крім того зрозуміло, що антитіла (наприклад, гризунів), що підлягають гуманізації, повинні зберігати високу афінність до антигена, так само як інші сприятливі біологічні властивості. Для досягнення цієї мети гуманізовані антитіла можна отримувати способом аналізу вихідної послідовності антитіла гризуна, що підлягає гуманізації, і різних послідовностей - кандидатів для гуманізації. Тривимірні моделі імуноглобулінів є доступними і відомими фахівцям у даній галузі. Комп'ютерні програми можна використовувати для ілюстрації і виводу на екран можливих тривимірних конформаційних структур вибраних послідовностей антитіл-кандидатів.

Дослідження таких моделей дозволяє аналіз можливої ролі залишків у функціонуванні антитіла, що підлягає гуманізації, тобто аналіз залишків, що впливають на здатність імуноглобуліну- кандидата зв'язувати його антиген. Таким чином, можна вибирати й поєднувати залишки ЕЕ. з вихідного антитіла й реципієнтного гуманізованого антитіла, так щоб досягати бажаних характеристик антитіла. Як правило, залишки в СОМ ділянці впізнавання антигена (або гіперваріабельній ділянці) зберігають з вихідного антитіла (наприклад, антитіла гризуна з

Зо бажаними властивостями зв'язування антигена) в гуманізованому антитілі для зв'язування антигена. В конкретних варіантах здійснення щонайменше один додатковий залишок усередині варіабельної ЕК зберігають з вихідного антитіла в гуманізованому антитілі. В конкретних варіантах здійснення аж до шести додаткових залишків у варіабельній ЕЕ зберігають з вихідного антитіла в гуманізованому антитілі.

Амінокислоти з варіабельних ділянок зрілих важкого і легкого ланцюгів імуноглобулінів позначають Ну і Їх, відповідно, де х є номером, що позначає положення амінокислоти згідно зі схемою з Кабаї, Зедиепсе5 ої Ргоїеіп5 ої Іттипоїіодіса! Іпіегеб5і, Ш.5. Юерагітепі ої Неайй і

Нитап 5Зегмісев5, 1987, 1991. Кабраї перераховує багато послідовностей амінокислот для антитіл для кожної підгрупи й перераховує амінокислоту, що зустрічається найчастіше, для кожного положення залишку в кожній підгрупі для одержання консенсусної послідовності. Кабаї використовує спосіб для надання номера залишку кожній амінокислоті в перерахованій послідовності, й цей спосіб для надання номерів залишків став стандартним у даній галузі.

Схему Караї можна розширювати на інші антитіла, не включені в його перелік, за допомогою вирівнювання даного антитіла з однією з консенсусних послідовностей за Кабраї у співвідношенні з консервативними амінокислотами. З використанням системи нумерації Кабаї легко ідентифікувати амінокислоти в еквівалентних положеннях у різних антитілах. Наприклад, амінокислота в положенні 50 антитіла людини займає положення, еквівалентне положенню амінокислоти 50 антитіла миші. Більш того, будь-які дві послідовності антитіла можна однозначно вирівнювати, наприклад, для визначення відсотка ідентичності, з використанням системи нумерації Караї так що кожна амінокислота в послідовності одного антитіла є вирівняною з амінокислотою в іншій послідовності, що має той самий номер за Кабаї. Після вирівнювання, якщо ділянку даного антитіла (наприклад, повну зрілу варіабельну ділянку важкого або легкого ланцюга) порівнюють з такою ж ділянкою контрольного антитіла, відсоток ідентичності послідовності між ділянками даного й контрольного антитіла є кількістю положень, зайнятих такою самою амінокислотою в ділянці як даного, так і контрольного антитіла, діленою на загальну кількість вирівняних положень двох ділянок, де пропуски не рахують, помножену на 100 для переведення у відсотки.

У прикладі 1 нижче описане одержання зразкових гуманізованих антитіл проти 01/14, специфічно зв'язуючих 04 людини, маркер ракової стволової клітини з даного опису (21М18 60 НеІ2, депозит в АТСС МоМо РТА-8427 і 21М18 Н7І2, номер депозиту в АТСС РТА-8425,

депоновані 10 травня 2007 г.; (Атегісап Туре Сийиге СоПесіоп (АТСС) 10801 Опімегзйу Віма.,

Мапаззаз, МА 20110-2209 ОБА)). У конкретних варіантах здійснення гуманізовані антитіла містять ділянку впізнавання антигена, що не належить людині, отриману з моноклонального антитіла миші 21М18. Зокрема, в конкретних варіантах здійснення одну або декілька СОК важкого ланцюга з вихідного антитіла гризуна, СОК1 (ЗЕО ІЮ МО: 1), СОК2 (5ЕО ІО МО: 2; 5ЕО

ІО МО: З або ЗЕО ІО МО: 4, які розрізняються в положенні 52а за Кара) і СОКЗ (ЗЕО І МО: 5), зберігають у гуманізованому антитілі 21М18. У конкретних варіантах здійснення одну або декілька з СОК легкого ланцюга вихідного антитіла гризуна, СОК1 (ЗЕО ІЮ МО: 9), СОК2 (5ЕО

ІО МО: 10) ї СОКЗ (5ЕО ІО МО: 11), зберігають у гуманізованому антитілі 21М18. У конкретних варіантах здійснення гуманізовані антитіла додатково містять щонайменше одну заміну ЕК усередині варіабельної ділянки або важкого, або легкого ланцюга людини.

У конкретних варіантах здійснення даний винахід стосується гуманізованого антитіла, що специфічно зв'язує епітоп 014 людини, сформований поєднанням М-кінцевої ділянки ОІГ І 4 людини (ЗЕО ІО МО: 27) і 05 людини (5ЕО ІЮ МО: 26), де антитіло впливає на зростання пухлини. В конкретних варіантах здійснення гуманізованим антитілом є інтактне антитіло до. У конкретних варіантах здійснення гуманізованим антитілом є інтактне антитіло Ідс». У конкретних варіантах здійснення гуманізованим антитілом є фрагмент антитіла. У конкретних варіантах здійснення гуманізованим антитілом є фрагмент Раб.

У конкретних варіантах здійснення гуманізоване антитіло за даним винаходом містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (Мн), що містить ділянку впізнавання антигена, яка не належить людині, й людську варіабельну каркасну ділянку. В конкретних варіантах здійснення ділянка впізнавання антигена, яка не належить людині, містить визначальні комплементарність ділянки (СОК), що походять від гризунів. У конкретних варіантах здійснення ділянка впізнавання антигена, яка не належить людині, містить СОК з антитіла миші. У конкретних варіантах здійснення СОК гризунів отримані з моноклонального антитіла 21М18, де 21М18 містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, позначену ЗЕО ІЮ МО: 6. У конкретних варіантах здійснення, де гуманізоване антитіло містить ділянку Мн, що містить амінокислотну послідовність (а) СОМКІ (5ЕО ІЮ МО: 1), СОК2 (ЗЕО ІО МО: 2; ЗЕО ІЮ МО: З або 5ЕО ІО МО: 4) і

СОМЗ (5ЕО ІО МО: 5) або (Б) 5ЕО ІО МО: 6, ЗЕО ІЮ МО: 7 або 5ЕО ІО МО: 8.

Зо У конкретних варіантах здійснення варіабельна каркасна ділянка важкого ланцюга людини містить експресовані послідовності людини. В конкретних варіантах здійснення щонайменше один залишок у варіабельній каркасній ділянці людини є заміненим. У конкретних варіантах здійснення щонайменше один залишок у варіабельній каркасній ділянці важкого ланцюга людини наявний у положенні, вибраному з групи, що складається з 16, 20, 27, 28, 38 і 48, на підставі системи нумерації Кабраї. У конкретних варіантах здійснення положення 16, 20, 27, 28, 38 і 48 замінені на підставі системи нумерації Караї. У конкретних варіантах здійснення щонайменше один залишок у варіабельній каркасній ділянці людини замінений на залишок, що займає відповідне положення в антитілі, що містить ділянку впізнавання антигена, що не належить людині.

У конкретних варіантах здійснення варіабельна каркасна ділянка важкого ланцюга людини містить ІЗН(М) 1-18. У конкретних варіантах здійснення щонайменше один залишок у варіабельній каркасній ділянці людини є заміненим. В конкретних варіантах здійснення щонайменше один залишок у варіабельній каркасній ділянці важкого ланцюга людини наявний у положенні, вибраному з групи, що складається з 20ОН, 28Н, З8Н, 48Н і 69Н на підставі системи нумерації Караї. У конкретних варіантах здійснення положення 2ОН, 28Н, З8Н, 48Н і 69Н замінені на підставі системи нумерації Кабраї. У конкретних варіантах здійснення щонайменше один залишок у варіабельній каркасній ділянці людини замінений на залишок, що займає відповідне положення в антитілі, що містить ділянку впізнавання антигена, яка не належить людині.

У конкретних варіантах здійснення гуманізоване антитіло за даним винаходом містить варіабельну ділянку легкого ланцюга (Мі), що містить ділянку впізнавання антигена, що не належить людині, й людську варіабельну каркасну ділянку. В конкретних варіантах здійснення ділянка впізнавання антигена, що не належить людині, містить СОК, що походять від гризунів. У конкретних варіантах здійснення ділянка впізнавання антигена, що не належить людині, містить

СОК з антитіла миші. У конкретних варіантах здійснення СОК отримані з моноклонального антитіла 21М18, де 21М18 містить ділянку Мі, позначену ЗЕО ІЮ МО: 12. У конкретних варіантах здійснення ділянка Мі містить амінокислотну послідовність (а) СОКІ (5ЕО ІЮ МО: 9), СОК2 (5ЕО

ІО МО: 10) ї СОКЗ (ЗЕО ІЮ МО: 11) або (6) 5ЕО І МО: 12.

У конкретних варіантах здійснення варіабельна каркасна ділянка легкого ланцюга людини бо містить ІЗК(М) 4-1. У конкретних варіантах здійснення щонайменше один залишок у варіабельній каркасній ділянці легкого ланцюга людини є заміненим. У конкретних варіантах здійснення щонайменше один залишок у варіабельній каркасній ділянці людини наявний у положенні, вибраному з групи, що складається з 221 і 36Ї на підставі системи нумерації Кабаї.

У конкретних варіантах здійснення положення 221 і зб! замінені на підставі системи нумерації

Кабаї. У конкретних варіантах здійснення щонайменше один залишок з варіабельної каркасної ділянки людини замінений на залишок, що займає відповідне положення в антитілі, що містить ділянку впізнавання антигена, що не належить людині.

У конкретних варіантах здійснення антитіло за даним винаходом є антитілом, що конкурує з антитілом 21М18 за специфічне зв'язування з 0/4 людини, де антитіло 21М18 містить: (а) важкий ланцюг з варіабельною ділянкою, позначеною ЗЕО ІО МО: 6, 5ЕО ІЮ МО: 7 або 5ЕО І

МО: 8, і (Б) легкий ланцюг з варіабельною ділянкою, позначеною 5ЕО ІЮ МО: 12. У конкретних варіантах здійснення антитілом є гуманізоване антитіло або антитіло людини.

У конкретних варіантах здійснення гуманізоване антитіло, що специфічно зв'язується з епітопом 014 людини, сформованим поєднанням М-кінцевої ділянки ОЇ 4 людини (5ЕО ІЮ МО: 27) і домену О5Ї людини (5ЕО ІЮ МО: 26), де антитіло містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має щонайменше 90 95 ідентичність послідовності з «ЕО ІЮ МО: 6, ЗЕО ІЮО МО: 7 або 5ЕО ІО МО: 8, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має щонайменше 90 95 ідентичність послідовності з «ЕО ІЮ МО:12. У деяких варіантах здійснення варіабельна ділянка важкого ланцюга має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності з ЗЕО ІЮ МО: 6, 5ЕО ІЮ МО: 7 або 5ЕО ІО МО: 8, і варіабельна ділянка легкого ланцюга має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності 3 5ЕО ІЮ МО: 12. У деяких варіантах здійснення варіабельна ділянка важкого ланцюга має щонайменше 99 95 ідентичність послідовності з «ЕО ІЮ МО: 6, ЗЕО ІЮ МО: 7 або

ЗЕБЕО ІЮ МО: 8, і варіабельна ділянка легкого ланцюга має щонайменше 99 95 ідентичність послідовності з БЕО ІЮ МО: 12.

У конкретних варіантах здійснення даний винахід стосується виділеної молекули полінуклеотиду, що кодує гуманізоване антитіло, що специфічно зв'язується з епітопом 0 | 4 людини, сформованим поєднанням М-кінцевої ділянки 0/4 людини (ЗЕО ІЮО МО: 27) і О5І людини (ЗЕО ІЮ МО: 26), де антитіло містить ділянку Мн, що містить ділянку впізнавання антигена, що не належить людині, коюдуючу СОКІ (ЗЕО ІЮ МО: 1), СОК2 (ЗЕО ІЮ МО: 2, 5ЕО ІЮ

Зо МО: З або 5ЕО ІО МО: 4) і СОКЗ (ЗЕО ІО МО: 5), і людську варіабельну каркасну ділянку, кодуючу ІЗН(М) 1-18. У конкретних варіантах здійснення даний винахід стосується виділеної молекули полінуклеотиду, що кодує гуманізоване антитіло, що специфічно зв'язується з епітопом 014 людини, сформованим поєднанням М-кінцевої ділянки ОЇ 4 людини (5ЕО ІЮ МО: 27) і 05 людини (ЗЕО ІЮ МО: 26), де молекула полінуклеотиду вибрана з групи, що складається з: (а) молекули полінуклеотиду, що кодує амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО: 6, ЗЕО ІЮ МО: 7 або 5ЕО ІЮО МО: 8, і (Б) молекули полінуклеотиду, яка гібридизується з молекулою, комплементарною молекулі полінуклеотиду згідно з (а) в суворих умовах гібридизації. У конкретних варіантах здійснення даний винахід стосується виділеної молекули полінуклеотиду, що кодує гуманізоване антитіло, що специфічно зв'язується з епітопом 0/4 людини, сформованим поєднанням М-кінцевої ділянки 0/4 людини (ЗЕО ІЮ МО: 27) і О5І людини (ЗЕО ІЮ МО: 26), де молекула полінуклеотиду вибрана з групи, що складається з (а)

ЗЕО ІЮ МО: 13, 5ЕБЕО ІЮ МО: 14 або 5ЕО ІЮ МО: 15 ї (Б) молекули полінуклеотиду, яка гібридизується з молекулою, комплементарною молекулі полінуклеотиду згідно з (а) в суворих умовах гібридизації.

У конкретних варіантах здійснення даний винахід стосується виділеної молекули полінуклеотиду, що кодує гуманізоване антитіло, що специфічно зв'язується з епітопом 0 | 4 людини, сформованим поєднанням М-кінцевої ділянки 0/4 людини (ЗЕО ІЮ МО: 27) і О5І людини (ЗЕО І МО: 26), де антитіло містить ділянку Мі, що містить ділянку впізнавання антигена, що не належить людині, коюодуючу СОКІ1 (5ЕО ІЮ МО: 9), СОК2 (5ЕО ІЮО МО: 10) ії СОКЗ (ЗЕО ІО МО: 11), і людську варіабельну каркасну ділянку, що містить ІЗК(М) 4-1. У конкретних варіантах здійснення даний винахід стосується виділеної молекули полінуклеотиду, що кодує гуманізоване антитіло, що специфічно зв'язується з епітопом 0/4 людини, сформованим поєднанням М-кінцевої ділянки 0/4 людини (ЗЕО ІЮО МО: 27) і О5І. людини (5ЕО ІЮ МО: 26), де молекула полінуклеотиду вибрана з групи, що складається з: (а) молекули полінуклеотиду, що кодує амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 12 їі (Б) молекули полінуклеотиду, яка гібридизується з молекулою, комплементарною молекулі полінуклеотиду згідно з (а) в суворих умовах гібридизації. В конкретних варіантах здійснення даний винахід стосується виділеної молекули полінуклеотиду, що кодує гуманізоване антитіло, що специфічно зв'язується з епітопом 014 людини, сформованим поєднанням М-кінцевої ділянки ОЇ 4 людини (5ЕО ІЮ МО: 60 27) і 05 людини (ЗЕО ІЮ МО: 26), де молекула полінуклеотиду вибрана з групи, що складається з (а) БЕО ІО МО: 16 і (р) молекули полінуклеотиду, яка гібридизується з молекулою, комплементарною молекулі полінуклеотиду згідно з (а) в суворих умовах гібридизації.

У конкретних варіантах здійснення представлений експресуючий вектор, що містить виділену молекулу полінуклеотиду за даним винаходом. У конкретних варіантах здійснення представлена клітина-господар, що містить експресуючий вектор, що містить виділену молекулу полінуклеотиду за даним винаходом.

У конкретних варіантах здійснення даний винахід відноситься до способу лікування раку в пацієнта, що включає введення пацієнтові терапевтично ефективної кількості гуманізованого антитіла за даним описом. У конкретних варіантах здійснення рак включає рак молочної залози, рак ободової й прямої кишки, рак легені, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози або рак голови й шиї.

У конкретних варіантах здійснення даний винахід стосується набору, що містить контейнер і композицію, що міститься там, де композиція містить гуманізоване антитіло за даним описом і додатково містить вкладиш в упаковку, який зазначає, що композицію можна використовувати для лікування раку.

Крім того, повністю людські антитіла можна отримати безпосередньо з використанням різних способів, відомих у даній галузі. Можна отримати іморталізовані В-лімфоцити людини, імунізовані іп міо або виділені з імунізованого індивідуума, продукуючі антитіло, спрямоване проти антигена-мішені (див., наприклад, Соїе еї аЇ., Мопосіопа! Апіїбодіе5 апа Сапсег Тнегару,

Аїап К. І і55, р. 77 (1985); Воетег еї а!., 1991, 9. Іттипої., 147 ():86-95; і патент США 5750373).

Антитіло людини можна також відбирати з фагової бібліотеки, де фагова бібліотека експресує антитіла людини (мМацопап еї аї., 1996, Маї. Віотесп., 14:309-314; ЗНевів єї аї., 1998, Ргос. Магі!.

Асад. 5сі., 95:6157-6162; Ноодепроот апа М/іпіег, 1991, У. Мої. Віої, 227:381; Магкз еї а!., 1991, 9.

МОЇ. Віої, 222:581). Антитіла людини можна також отримувати в трансгенних мишах, що містять локуси імуноглобулінів людини, які здатні після імунізації продукувати повний репертуар антитіл людини за відсутності продукції ендогенних імуноглобулінів. Цей спосіб описаний у патентах

США 5545807, 5545806, 5569825, 5625126, 5633425 і 5661016.

Цей винахід стосується також біспецифічних антитіл, що специфічно впізнають маркер ракової стволової клітини. Біспецифічні антитіла є антитілами, здатними специфічно впізнавати

Зо і зв'язувати щонайменше два різні епітопи. Різні епітопи можуть знаходитися або всередині тієї самої молекули (наприклад, того самого маркерного поліпептиду ракової стволової клітини), або на різних молекулах, так що, наприклад, антитіла можуть специфічно впізнавати і зв'язувати маркер ракової стволової клітини, так само, як, наприклад, 1) ефекторну молекулу на лейкоциті, таку як Т-клітинний рецептор (наприклад, СОЗ) або Ес рецептор (наприклад, СОбА, сО32 або СО16), або 2) цитотоксичний засіб, як детально описано нижче. Біспецифічні антитіла можуть бути інтактними антитілами або фрагментами антитіл.

Зразкові біспецифічні антитіла можуть зв'язуватися 3 двома різними епітопами, щонайменше один з яких походить з поліпептиду за винаходом. Альтернативне анти-антигенне плече молекули імуноглобуліну можна об'єднувати з плечем, яке зв'язується із запускаючою молекулою на лейкоциті, як-от молекула Т-клітинного рецептора (наприклад СО2, СОЗ, С028 або В7), або Ес рецептори для Ідс, так щоб сфокусувати клітинні механізми захисту на клітині, експресуючій конкретний антиген. Біспецифічні антитіла можна також використовувати, щоб спрямовувати цитотоксичні засоби до клітин, які експресують конкретний антиген. Ці антитіла мають антигензв'язуюче плече й плече, що зв'язує цитотоксичний засіб або хелатор радіоактивного ізотопу, такий як ЕОТОВЕ, ОРТА, ЮОТА або ТЕТА. Способи одержання біспецифічних антитіл є загальноприйнятими в даній галузі (Міїї5ієїп еї аї., 1983, Маїиге 305:537- 539; Вгеппап еї аї., 1985, бЗсієпсе 229:81; Бигевзп єї аї!., 1986, МеїШойдв іп Епгутої. 121:120;

ТгашпескКег еї аї., 1991, ЕМ5ОУ. 10:3655-3659; ЗНаїару еї а!., 1992, У. Ехр. Мед. 175:217-225;

Козів!пу вї а!., 1992, 9. Іттипої. 148:1547-1553; Огибег еї аї., 1994, 9. Ітттипої. 152:5368; і патент

США 5731168). Мають на увазі також антитіла більш ніж з двома валентностями. Наприклад, можна отримувати триспецифічні антитіла (Тий еї аї., У. Іттипої. 147:60 (1991).

У конкретних варіантах здійснення представлений фрагмент антитіла, наприклад, для збільшення проникнення в пухлину. Відомі різні способи для одержання фрагментів антитіл: традиційно ці фрагменти отримують за допомогою протеолітичного розщеплювання інтактних антитіл (наприклад, Могітоїйо еї аї!., 1993, Уоигпаї ої Віоспетісаї! апа Віорпузіса! Меїпоаз» 24:107- 117; Вгеппап еї а1., 1985, Зсіепсе, 229:81). У конкретних варіантах здійснення фрагменти антитіл отримують рекомбінантним чином. Фрагменти антитіл Раб, Ем і 5сЕм всі можна експресувати в Е. соїї і секретувати з неї або інших клітин-господарів, таким чином, забезпечуючи одержання великих кількостей цих фрагментів. Такі фрагменти антитіл можна також виділяти з фагових 60 бібліотек антитіл, що обговорюються вище. Фрагмент антитіла може також бути лінійними антитілами, як описано, наприклад, у патенті США 5641870, і може бути моноспецифічним або біспецифічним. Інші способи для одержання фрагментів антитіл будуть очевидними практикуючому фахівцеві в даній галузі.

Відповідно до даного винаходу способи можна адаптувати для одержання одноланцюгових антитіл, специфічних для поліпептиду за винаходом (див. патент США Мо 4946778). Крім того, способи можна адаптувати для конструювання експресуючих бібліотек Раб (Низе, еї а!., Зсіепсе 246:1275-1281 (1989)), щоб дозволяти швидку й ефективну ідентифікацію моноклональних фрагментів Раб з бажаною специфічністю для ліганду рецептора Моїсі І | 4 або його похідних, фрагментів або гомологів. Фрагменти антитіл, що містять ідіотипи до поліпептиду за винаходом, можна отримувати способами з даної галузі включаючи як необмежуючі приклади: (а) фрагмент К(ар)2, отриманий розщеплюванням пепсином молекули антитіла; (5) фрагмент Раб, отриманий відновленням дисульфідних містків фрагмента К(аб)2; (с) фрагмент Раб, отриманий обробкою молекули антитіла папаїном і поновлюючим засобом, і (4) фрагменти Гу.

Може додатково бути бажаним, особливо в разі фрагментів антитіл, модифікувати антитіло, щоб збільшити час його напівжиття в сироватці. Цього можна досягати, наприклад, включенням епітопа зв'язування рецептора порятунку у фрагмент антитіла за допомогою мутації відповідної ділянки фрагмента антитіла або за допомогою включення епітопа в пептидну мітку, яку потім зливають з фрагментом антитіла або на кінці, або всередині (наприклад, за допомогою синтезу

ДНК або пептиду).

Гетерокон'юговані антитіла також входять в обсяг даного винаходу. Гетерокон'юговані антитіла складені з двох ковалентно зв'язаних антитіл. Такі антитіла запропоновані, наприклад, для націлювання імунних клітин на небажані клітини (патент США Мо 4676980). Передбачають, що антитіла можна отримувати іп міго з використанням відомих способів хімії синтезу білка, включаючи способи, що включають засоби для перехресного зшивання. Наприклад, імунотоксини можна конструювати з використанням реакції дисульфідного обміну або за допомогою формування тіоефірного зв'язку. Приклади відповідних реагентів для цієї мети включають імінотіолат і метил-4-меркаптобутиримідат.

Для цілей даного винаходу слід брати до уваги, що модифіковані антитіла можуть містити будь-який тип варіабельної ділянки, яка забезпечує зв'язок антитіла з поліпептидами ОІ | 4

Зо людини. В цьому відношенні варіабельна ділянка може міститися в будь-якому типі або бути отриманою з будь-якого типа ссавця, якого можна індукувати для підйому гуморальної відповіді й одержання імуноглобулінів проти бажаного асоційованого з пухлиною антигена. Через це варіабельна ділянка модифікованих антитіл може походити, наприклад, з людини, миші, примату, що не належить до людини (наприклад, яванських макак, макак і т.д.), або вовчих. У деяких варіантах здійснення як варіабельні, так і константні ділянки модифікованих імуноглобулінів є людськими. В інших варіантах здійснення варіабельні ділянки відповідних антитіл (як правило, отриманих з джерела, що не стосується людини) можна конструювати або специфічно пристосовувати для поліпшення властивостей зв'язування або зменшення імуногенності молекули. В цьому відношенні варіабельні ділянки, застосовні за даним винаходом, можна гуманізувати або іншим чином змінювати за допомогою включення імпортованих послідовностей амінокислот.

Варіабельні домени як у важких, так і в легких ланцюгах змінюють, щонайменше, частковою заміною однієї або декількох СОК і, якщо необхідно, частковою заміною каркасної ділянки й зміною послідовності. Хоча СОК можна отримувати з антитіла того самого класу або навіть підкласу, як і антитіло, з якого отримані каркасні ділянки, передбачають, що СОК будуть отримані з антитіла іншого класу й переважно з антитіла з іншого вигляду. Може не бути необхідним замінювати всі СОК на повні СОК з донорної варіабельної ділянки для перенесення антигензв'язуючої здатності одного варіабельного домену до іншого. Радше, може бути необхідним лише перенести ті залишки, які необхідні для підтримки активності ділянки зв'язування антигена. Зважаючи на пояснення, наведені в патентах США МоМо5585089, 5693761 і 5693762, це буде повністю в межах компетенції фахівців у даній галузі, або за допомогою виконання загальноприйнятих експериментів, або за допомогою тестування методом спроб і помилок для одержання функціонального антитіла зі зменшеною імуногенністю.

Попри зміни у варіабельній ділянці, фахівці в даній галузі братимуть до уваги, що модифіковані антитіла за даним винаходом включатимуть антитіла або їхні імунореактивні фрагменти, в яких щонайменше частина з одного або декількох доменів константної ділянки делетовані або іншим чином змінені для забезпечення бажаних біохімічних характеристик, таких як покращувана локалізація пухлини або зменшений час напівжиття в сироватці в порівнянні з антитілом приблизно такої самої імуногенності, що містить нативну або незмінену 60 константну ділянку. В деяких варіантах здійснення константна ділянка модифікованого антитіла міститиме людську константну ділянку. Модифікації константної ділянки, сумісні з цим винаходом, включають додавання, делеції або заміни однієї або декількох амінокислот в одному або декількох доменах. Тобто модифіковані антитіла, описані тут, можуть містити зміни або модифікації одного або декількох з трьох константних доменів важкого ланцюга (СНІ, СН2 або СНЗ) і/або константного домену легкого ланцюга (СІ). У деяких варіантах здійснення винаходу передбачають модифіковані константні ділянки, де один або декілька доменів є частково або повністю делетованими. В деяких варіантах здійснення модифіковані антитіла міститимуть конструкції або варіанти з делетованими доменами, де видалений цілий домен

СНІ (конструкції ДСН»2). У деяких варіантах здійснення видалений домен константної ділянки замінюватимуть на короткий амінокислотний спейсер (наприклад, 10 залишків), що забезпечує певну частину гнучкості молекули, як правило, забезпечуваною відсутньою константною ділянкою.

В даній галузі відомо, що, окрім своєї конфігурації, константна ділянка опосередкує декілька ефекторних функцій. Наприклад, зв'язування компонента комплементу С1 з антитілами активує систему комплементу. Активація комплементу є важливою для опсонізації й лізису клітинних патогенів. Активація комплементу також стимулює запальну відповідь і може також бути залученою в аутоїммунну гіперчутливість. Крім того, антитіла зв'язуються з клітинами через ділянку Ес, за допомогою ділянки рецептора Ес у ділянці Ес антитіла, що зв'язується з рецептором Ес (ЕСЕ) на клітині. Існує низька рецепторів Ес, які є специфічними для різних класів антитіла, включаючи Ідс (гамма-рецептори), ІДЕ (ета-рецептори), ІДА (альфа-рецептори) і (ІМ (мю-рецептори). Зв'язування антитіла з рецепторами Ес на поверхнях клітин запускає низку важливих і різноманітних біологічних відповідей, включаючи поглинання й руйнування покритих антитілом часток, кліренс імунних комплексів, лізис покритих антитілом клітин-мішеней клітинами-кілерами (називаний антитілозалежною опосередкованою клітинами цитотоксичністю або АОСС), вивільнення медіаторів запалення, передачу через плаценту й контроль продукції імуноглобуліну. Хоча різні рецептори Ес і ділянки рецепторів вивчені до певної міри, існує ще багато невідомого про їх локалізацію, структуру й функціонування.

Без обмеження обсягу даного винаходу вважають, що антитіла, що містять константні ділянки, модифіковані, як описано в даному описі, забезпечують змінені ефекторні функції, які, у

Зо свою чергу, впливають на біологічний профіль введеного антитіла. Наприклад, делеція або інактивація (за допомогою точкових мутацій або інших способів) домену константної ділянки може зменшувати зв'язування рецептора Ес з циркулюючим модифікованим антитілом, таким чином, покращуючи локалізацію пухлини. В інших випадках може бути наявним те, що модифікації константної ділянки відповідно до даного винаходу зменшують зв'язування комплементу й, таким чином, зменшують час напівжиття в сироватці і неспецифічне зв'язування кон'югованого цитотоксину. Інші модифікації константної ділянки можна використовувати для видалення дисульфідних зв'язків або олігосахаридних груп, що дозволяє покращувану локалізацію завдяки збільшеній антигенній специфічності або гнучкості антитіла. Так само, модифікації константної ділянки згідно з цим винаходом можна легко здійснити з використанням добре відомих біохімічних способів або способів молекулярної інженерії повністю в межах компетенції фахівця в даній галузі.

Слід зазначити, що модифіковані антитіла можна конструювати для злиття домену СНЗ безпосередньо з шарнірною ділянкою відповідного модифікованого антитіла. В інших конструкціях може бути бажаним надати пептидний спейсер між шарнірною ділянкою й модифікованими доменами СНІ і СНЗ. Наприклад, можна експресувати сумісні конструкції, де домен СН2 делетований, і залишковий домен СНЗ (модифікований або немодифікований) приєднаний до шарнірної ділянки за допомогою спейсера з 5-20 амінокислот. Такий спейсер можна додавати, наприклад, щоб гарантувати, що регуляторні елементи константного домену залишаються вільними й доступними, або що шарнірна ділянка залишається гнучкою. Проте слід зазначити, що в деяких випадках можна довести, що амінокислотні спейсери є імуногенними й викликають небажану імунну відповідь проти конструкції. Відповідно будь-якій спейсер, що додається до конструкції, має бути відносно неімуногенним або навіть зовсім виключеним, якщо можна зберегти бажані біохімічні якості модифікованого антитіла.

Слід розуміти, що, окрім делеції цілих доменів константної ділянки, антитіла за даним винаходом можна отримувати за допомогою часткової делеції або заміни декількох або навіть окремої амінокислоти. Наприклад, мутація окремої амінокислоти у вибраних ділянках домену

СН2 може бути достатньою, щоб переважно зменшити зв'язування Ес і таким чином поліпшити локалізацію пухлини. Так само, може бути бажаним просто делетувати ту частину одного або декількох доменів константної ділянки, яка контролює ефекторну функцію (наприклад, 60 зв'язування комплементу СІ С)), що підлягає модуляції. Такі часткові делеції константних ділянок можуть покращувати вибрані характеристики антитіла (час напівжиття в сироватці), в той же час залишаючи незайманими інші бажані функції, зв'язані з даним доменом константної ділянки.

Більш того, як згадано вище, константні ділянки описаних антитіл можна модифікувати за допомогою мутації або заміни однієї або декількох амінокислот, що покращує параметри отриманої конструкції. В цьому відношенні може бути можливим порушити активність, що забезпечується консервативною ділянкою зв'язування (наприклад, зв'язування Ес), в той же час по суті зберігаючи конфігурацію й імуногенний профіль модифікованого антитіла. Конкретні варіанти здійснення можуть містити додавання однієї або декількох амінокислот до константної ділянки для посилення бажаних характеристик, таких як ефекторна функція, або забезпечення більшого приєднання цитотоксину або вуглеводу. В таких варіантах здійснення може бути бажаним вставляти або повторювати специфічні послідовності, отримані з вибраних доменів константної ділянки.

Крім того, даний винахід стосується варіантів і еквівалентів, які є по суті гомологічними химерним, гуманізованим і людським антитілам або фрагментам цих антитіл, указаним тут.

Вони можуть містити, наприклад, мутації - консервативні заміни, тобто заміну однієї або декількох амінокислот на схожі амінокислоти. Наприклад, консервативна заміна відноситься до заміни однієї амінокислоти на іншу всередині того самого загального класу, наприклад, однієї кислої амінокислоти на іншу кислу амінокислоту, однієї основної амінокислоти на іншу основну амінокислоту або однієї нейтральної амінокислоти на іншу нейтральну амінокислоту. Що мають на увазі під консервативною амінокислотною заміною, добре відомо в даній галузі.

Винахід стосується також імунокон'югатів, що містить антитіло, кон'юговане з цитотоксичним засобом. Цитотоксичні засоби включають хіміотерапевтичні засоби, що інгібують зростання засобу, токсини (наприклад, ферментативний активний токсин, що походить з бактерій, грибів, рослин або тварин, або його фрагменти), радіоактивні ізотопи (тобто радіокон'югат) і так далі.

Хіміотерапевтичні засоби, застосовні для одержання таких імунокон'югатів, включають, наприклад, метотрексат, адріаміцин, доксорубіцин, мелфалан, мітоміцин С, хлорамбуцил, даунорубіцин або інші інтеркалюючі засоби. Ферментативні активні токсини та їхні фрагменти, які можна використовувати, включають ланцюг А дифтерійного токсину, незв'язуючі активні фрагменти дифтерійного токсину, ланцюг А екзотоксину, ланцюг А рицину, ланцюг А абрину,

Зо ланцюг А модецину, альфа-сарцин, білки АїПІецйгійев Тогаї, білки-ді«антини, білки РНпуюіаса атегісапа (РАРІ, РАРІЇ і РАР-5), інгібітор тотогаїса спагапійа, курцин, кротин, інгібітор зараопагіа ойісіпаїї5, гелонін, мітогелін, рестриктоцин, феноміцин, еноміцин і трикотецени. В деяких варіантах здійснення антитіла можна кон'югувати з радіоактивними ізотопами, такими як зо, 125), т191|, 125), 17, 105АН, 153517, 67би, 67(З3а, 196Но, 177|Ї у, 186Де і 188Ке, з використанням будь- якого з низки добре відомих хелаторів або прямого мічення. В інших варіантах здійснення описані композиції можуть містити антитіла, приєднані до лікарських засобів, проліків або лімфокінів, як-от інтерферон. Кон'югати антитіла й цитотоксичного засобу отримують з використанням безлічі біфункціональних засобів для зшивання білків, таких як М-сукцинімідил- 3-(2-піридилдитіол)іпропіонат (5РОР), імінотіолан (ІТ), біфункціональні похідні імідоефірів (такі як диметиладипімідат НС), активні складні ефіри (такі як дисукцинімідилсуберат), альдегіди (такі як глутаральдегід), біс-азидосполуки (такі як біс(п-азидобезоїл)гександіамін), похідні біса- діазонію (такі як біс-(п-діазонійбезоїл)етилендіамін), діїзоціанати (такі як толуол-2,б-діїзоціанат) і біс-активні сполуки фтору (такі як 1,5-дифтор-2,4-динітробензол). Кон'югати антитіла й одного або декількох низькомолекулярних токсинів, таких як каліхеаміцин, майтанзиноїди, трихотецен і

СС1065, і похідних цих токсинів, що мають активність токсину, також можна використовувати. В деяких варіантах здійснення можна отримувати комплекси модифікованих антитіл з іншими імунологічно активними лігандами (наприклад, антитілами або їхніми фрагментами), де отримана молекула зв'язується як з неопластичною клітиною, так і з ефекторною клітиною, як- от Т-клітина.

Незалежно від того, яким чином отримані застосовні параметри, антитіла за даним винаходом можна використовувати в будь-якій з низки кон'югованих (тобто імунокон'югат) або некон'югованих форм. Альтернативно антитіла за даним винаходом можна використовувати в некон'югованій або "голій" формі, щоб використовувати природні механізми захисту суб'єкта, включаючи комплемент-залежну цитотоксичність (СОС) і антитілозалежну клітинну токсичність (АОСС) для знищення злоякісних клітин. Вибір, яке з кон'югованого або некон'югованого модифікованого антитіла використовувати, залежатиме від типу й стадії раку, використання допоміжного лікування (наприклад, хіміотерапії або зовнішнього опромінення) й стану пацієнта.

Слід розуміти, що фахівець у даній галузі може легко зробити такий вибір з урахуванням пояснень тут.

Антитіла за даним винаходом можна аналізувати за імуноспецифічним зв'язуванням за допомогою будь-якого способу, відомого в даній галузі. Імуноаналізи, які можна використовувати, включають як необмежуючі приклади, конкурентні й неконкурентні системи аналізу з використанням таких способів, як аналіз ВіАсоге, аналіз РАС5, імунофлуоресценція, імуноцитохімія, Вестерн-блотинг, радіоіїмунні аналізи, ЕГІ5А, "сендвіч"-імуноаналізи, аналізи імунопреципітації, реакції преципітації, реакції преципітації з дифузією в гелі, аналізи імунодифузії, аналізи аглютинації, аналізи зв'язування комплементу, імунорадіометричні аналізи, флуоресцентні імуноаналізи й імуноаналізи з білком А. Такі аналізи є загальноприйнятими й добре відомі в даній галузі (див., наприклад, А!йзибеї еї аї., едв5, 1994,

Ситепі Ргоїосої5 іп МоїІесшіаг Віоіоду, Мої. 1, дхопп Уміеу 5 5оп5, Іпс., Мем/ ХогКк, наведений тут як посилння в повному обсязі).

У деяких варіантах здійснення імуноспецифічність антитіла проти маркера ракової стволової клітини визначають з використанням ЕГІЗА. Аналіз ЕГІЗА включає одержання антигена, покриття лунок 9б-лункового мікропланшета для титрування антигеном, додавання антитіла проти маркера ракової стволової клітини, кон'югованого зі сполукою, що піддається детекції, як- от субстрат ферменту (наприклад, пероксидази хріну або лужної фосфатази), в лунки, інкубацію протягом певного часового проміжку й детекцію наявності антигену. В деяких варіантах здійснення антитіло проти маркера ракової стволової клітини не є кон'югованим зі сполукою, що піддається детекції, але замість цього в лунку додають вторинне кон'юговане антитіло, яке впізнає антитіло проти маркера ракової стволової клітини. В деяких варіантах здійснення замість покриття лунки антигеном лунки можна покривати антитілом проти маркера ракової стволової клітини, і вторинне антитіло, кон'юговане зі сполукою, що піддається детекції, можна додавати після додавання антигена в покриту лунку. Фахівець в даній галузі буде обізнаний як про параметри, які можна модифікувати для збільшення детектованого сигналу, так і про інші варіанти ЕГ ІЗА, відомі в даній галузі (див., наприклад, А!йзибеї еї аї., ед5, 1994, Сигтепі Ргоїосої5 іп Моїєсшіаг Віоіоаду, Мої. 1, донп У/йеу 4. бопв, Іпс., Мем Хогк аї 11.21).

Афінність зв'язування антитіла з антигеном-маркером ракової стволової клітини і швидкість дисоціації при взаємодії антитіло-антиген можна визначати за допомогою конкурентних аналізів зв'язування. Одним прикладом конкурентного аналізу зв'язування є радіоїмунний аналіз, що включає інкубацію міченого антигена (наприклад, УН або "25І), або його фрагмента або варіанту, з антитілом, що становить інтерес, за наявності збільшуваних кількостей неміченого антигену, з подальшою детекцією антитіла, пов'язаного з міченим антигеном. Афінність антитіла проти маркера ракової стволової клітини й швидкості дисоціації при зв'язуванні можна визначити з даних за допомогою аналізу графіка Ськетчарда. В деяких варіантах здійснення аналіз кінетики

ВІАсоге використовують для визначення швидкостей зв'язування й дисоціації антитіл проти маркера ракової стволової клітини. Аналіз кінетики ВіАсоге включає аналіз зв'язування й дисоціації антитіл по чіпах з імобілізованими антигенами - маркерами ракової стволової клітини на їх поверхні.

У конкретних варіантах здійснення винахід стосується виділених полінуклеотидів, які кодують поліпептид, що містить антитіло або його фрагмент, проти 0/4 людини. Таким чином, термін "полінуклеотид, що кодує поліпептид" стосується полінуклеотиду, що включає лише кодуючі послідовності для поліпептиду, так само як полінуклеотиду, що включає додаткові кодуючі й некодуючі послідовності. Полінуклеотиди за винаходом можуть бути присутніми у формі РНК або у формі ДНК. ДНК включає кДНК, геномну ДНК й синтетичну ДНК і може бути дволанцюжковою або одноланцюжковою, і, якщо є однолнцюжковою, може бути кодуючим ланцюгом або некодуючим (антисмисловим) ланцюгом.

Крім того, даний винахід стосується варіантів описаних тут вище полінуклеотидів, що кодують, наприклад, фрагменти, аналоги й похідні. Варіант полінуклеотиду може бути алельним варіантом полінуклеотиду, що зустрічається в природі, або варіантом полінуклеотиду, що не зустрічається в природі. В конкретних варіантах здійснення полінуклеотид може мати кодуючу послідовність, що є алельним варіантом, що зустрічається в природі, кодуючої послідовності описаних поліпептидів. Як відомо в даній галузі, алельний варіант є альтернативною формою послідовності полінуклеотиду, що має, наприклад, заміну, делецію або додавання одного або декількох нуклеотидів, які по суті не змінюють функцію кодованого поліпептиду.

У конкретних варіантах здійснення полінуклеотиди містять кодуючу послідовність для зрілого поліпептиду, злитого в тій самій рамці зчитування з полінуклеотидом, що допомагає, наприклад, експресії й секреції поліпептиду з клітини-господаря (наприклад, лідерна послідовність, яка функціонує як секреторна послідовність для контролю транспорту поліпептиду з клітини). Поліпептид, що має лідерну послідовність, являє собою пребілок і може бо мати лідерну послідовність, що відщеплюється клітиною-господарем для формування зрілої форми поліпептиду. Полінуклеотиди можуть також кодувати пробілок, який є зрілим білком плюс додаткові 5'-залишки амінокислот. Зрілий білок, що має пропослідовність, є пробілком і є неактивною формою білка. Після віддеплення пропослідовності залишається активний зрілий білок.

У конкретних варіантах здійснення полінуклеотиди містять кодуючу послідовність для зрілого поліпептиду, злиту в тій самій рамці зчитування з маркерною послідовністю, яка дозволяє, наприклад, очищення кодованого поліпептиду. Наприклад, маркерна послідовність може бути гексагістидиновою міткою, що надається вектором роОЕ-9, для забезпечення очищення зрілого поліпептиду, злитого з маркером, в разі бактерійного господаря, або маркерна послідовність може бути міткою гемаглютинін (НА), отриманою з білка гемаглютиніну грипу, при використанні господаря-ссавця (наприклад, клітини СО5-7).

У конкретних варіантах здійснення даний винахід стосується виділених молекул нуклеїнової кислоти, що мають нуклеотидну послідовність, щонайменше, на 80 95 ідентичну, щонайменше, на 85 95 ідентичну, щонайменше, на 90 95 ідентичну, щонайменше, на 95 95 ідентичну й в деяких варіантах здійснення, щонайменше, на 96 95, 97 9», 98 95 або 99 95 ідентичну полінуклеотиду, що кодує поліпептид, що містить антитіло або його фрагмент, проти 0/4 людини.

Під полінуклеотидом, що має нуклеотидну послідовність, щонайменше, наприклад, на 95 95 "ідентичну" контрольній нуклеотидній послідовності мають на увазі, що нуклеотидна послідовність полінуклеотиду є ідентичною контрольній послідовності, за винятком того, що послідовність полінуклеотиду може містити аж до п'яти точкових мутацій на кожних 100 нуклеотидів контрольної нуклеотидної послідовності. Іншими словами, для одержання полінуклеотиду, що має нуклеотидну послідовність, щонайменше, на 95595 ідентичну контрольній нуклеотидній послідовності, аж до 5 95 нуклеотидів у контрольній послідовності можна делетувати або замінювати іншим нуклеотидом, або кількість нуклеотидів аж до 5 95 всіх нуклеотидів у контрольній послідовності можна вставляти в контрольну послідовність. Ці мутації контрольної послідовності можуть бути присутніми в М- або С-кінцевих положеннях контрольної нуклеотидної послідовності або в будь-якому місці між цими кінцевими положеннями, є розподіленими або окремо серед нуклеотидів у контрольній послідовності, або в одній або декількох безперервних групах усередині контрольної послідовності.

Зо На практиці, чи є будь-яка конкретна молекула нуклеїнової кислоти, щонайменше, на 80 95 ідентичною, щонайменше, на 85 95 ідентичною, щонайменше, на 90 95 ідентичною і в деяких варіантах здійснення, щонайменше, на 95 95, 96 9», 97 У», 98 95 або 99 95 ідентичній контрольній послідовності, можна визначити загальноприйнятим способом з використанням відомих комп'ютерних програм, таких як програма Везнії (М/5сопвзіп зедциепсе Апаїузі5 Раскаде, Мегвіоп 8 г піх, Сепеїйсв ботршиег Стор, Опімегейу Везеєагсі Рак, 575 бсієпсе Опме, Мадізоп, МІ 53711). У Везйнї використовують алгоритм локальної гомології з з:тйп апа Умагегтап, Адмапсев іп Арріє4 Маїпетаїйіс5 2:482 489 (1981), для знаходження найкращої ділянки гомології між двома послідовностями. Коли Везійй або будь-яку іншу програму вирівнювання послідовності використовують для визначення того, чи є конкретна послідовність, наприклад, на 9595 ідентичною контрольній послідовності відповідно до даного винаходу, параметри встановлюють так, що відсоток ідентичності розраховують відносно повної довжини контрольної нуклеотидної послідовності і що дозволяють пропуски аж до 595 від загальної кількості нуклеотидів у контрольній послідовності.

Варіанти полінуклеотиду можуть містити зміни в кодуючих ділянках, некодуючих ділянках, або і в тих, і в інших. У деяких варіантах здійснення варіанти полінуклеотиду містять зміни, які приводять до мовчазних замін, додавань або делецій, але не змінюють властивості або активності кодованого поліпептиду. В деяких варіантах здійснення варіанти нуклеотиду отримані за допомогою мовчазних мутацій, через виродженість генетичного коду. Варіанти полінуклеотиду можна отримувати з безлічі причин, наприклад, для оптимізації експресії кодонів для конкретного господаря (зміни кодонів в мРНК людину на кодони, переважні для бактерійного господаря, такого як Е. соїЇ).

Поліпептиди за даним винаходом можуть бути рекомбінантними поліпептидами, природними поліпептидами або синтетичними поліпептидами, включаючи антитіло або його фрагмент, проти 0/4 людини. В даній галузі відомо, що деякі послідовності амінокислот за винаходом можна змінювати без значного ефекту на структуру або функції білка. Таким чином, винахід, крім того, стосується варіантів поліпептидів, які мають значну активність або які містять ділянки антитіла або його фрагмента проти білка О0//4 людини. Такі мутанти включають делеції, вставки, інверсії, повтори і заміни типу.

Поліпептиди й аналоги можна додатково модифікувати, щоб вони містили додаткові хімічні бо групи, що в нормі не складають частину білка. Ці дериватизировані групи можуть покращувати розчинність, біологічний час напівжиття або всмоктування білка. Групи можуть також зменшувати або виключати будь-які бажані побічні ефекти білків і тому подібне Огляд цих груп можна знайти в КЕМІМСТОМ'Є РНАКМАСЕШТІСАЇ 5СІЕМСЕ5, 201п ейа., Маск Рибіїхпіпд Со.,

Еавіоп, РА (2000).

Виділені поліпептиди, описані тут, можна отримувати будь-яким відповідним способом, відомим у даній галузі. Такі способи лежать у діапазоні від способів прямого синтезу білка до конструювання послідовності ДНК, що кодує послідовності поліпептиду, й експресії цих послідовностей у придатному трансформованому господарі. В деяких варіантах здійснення послідовність ДНК конструюють з використанням рекомбінантного способу за допомогою виділення або синтезу послідовності ДНК, що кодує білок дикого типу, що становить інтерес.

Необов'язково послідовність можна піддавати мутагенезу за допомогою сайт-специфічного мутагенезу для одержання її функціональних аналогів. Див., наприклад 2оеїег еї а!., Ргос. Маї 7.

Асад. 5сі. ОБА 81:5662-5066 (1984) і патент США Мо 4588585.

У деяких варіантах здійснення послідовність ДНК, що кодує поліпептид, що становить інтерес, конструюватимуть за допомогою хімічного синтезу з використанням синтезатора олігонуклеотидів. Такі олігонуклеотиди можна конструювати на підставі амінокислотної послідовності бажаного поліпептиду й вибирати ті кодони, які є переважними в клітині-господарі, в якій продукуватимуть рекомбінантний поліпептид, що становить інтерес. Загальноприйняті способи можна застосовувати для синтезу виділеної послідовності полінуклеотиду, що кодує виділений поліпептид, що становить інтерес. Наприклад, повну амінокислотну послідовність можна використовувати для конструювання зворотнотрансльованого гена. Крім того, можна синтезувати олігомер ДНК, що містить нуклеотидну послідовність, що кодує конкретний виділений поліпептид. Наприклад, декілька невеликих олігонуклеотидів, що кодують частини бажаного поліпептиду, можна синтезувати й потім лігувати. Індивідуальні олігонуклеотиди, як правило, містять 5'- або 3'-виступаючі кінці для комплементарного збирання.

Після збирання (за допомогою синтезу, сайт-спрямованого мутагенезу або іншого способу) послідовності полінуклеотиду, що кодує конкретний виділений поліпептид, що становить інтерес, вставлятимуть у експресуючий вектор і функціонально зв'язуватимуть з контролюючою експресію послідовністю, відповідною для експресії білка в бажаному господарі. Правильне

Зо збирання можна підтверджувати нуклеотидним секвенуванням, рестрикційним картуванням і експресією біологічно активного поліпептиду у відповідному господарі. Як добре відомо в даній галузі, щоб отримати високі рівні експресії трансфікованого гена в господарі, ген необхідно функціонально зв'язувати з послідовностями для транскрипційного і трансляційного контролю експресії, які є функціональними у вибраному експресуючому господарі.

Рекомбінантні експресуючі вектори використовують для ампліфікації та експресії ДНК, кодуючої злиті з маркером ракової стволової клітини поліпептиди. Рекомбінантні експресуючі вектори являють собою здатні до реплікації конструкції ДНК, що мають синтетичні або отримані з КДНК фрагменти ДНК, кодуючої поліпептид, що зливається з маркером ракової стволової клітини або біоеквівалентний аналог, функціонально зв'язаний з відповідними регуляторними елементами для транскрипції або трансляції, отриманими з генів ссавців, мікроорганізмів, вірусів або комах. Одиниця транскрипції, як правило, містить сукупність (1) генетичного елементу або елементів, що мають регуляторну роль в експресії генів, наприклад промотори транскрипцій або енхансери, (2) структурної або кодуючої послідовності, транскрибованої в

МРНК і трансльованої в білок, і (3) відповідних послідовностей ініціації й термінації транскрипції й трансляції, як детально описано нижче. Такі регуляторні елементи можуть включати послідовність оператора для контролю транскрипції. Здатності реплікуватися в господарі зазвичай додає точка початку реплікації, й, крім того, можна включати селективний ген для полегшення розпізнавання трансформантів. Ділянки ДНК є функціонально зв'язаними, коли вони функціонально зв'язані одна з одною. Наприклад, ДНК для сигнального пептиду (секреторний лідер) є функціонально зв'язаною з ДНК для опполіпептиду, якщо вона експресується у вигляді попередника, що бере участь у секреції поліпептиду; промотор є функціонально зв'язаним з кодуючою послідовністю, якщо він контролює транскрипцію послідовності; або ділянка зв'язування рибосоми є функціонально пов'язаною з кодуючою послідовністю, якщо вона розташована так, щоб дозволяти трансляцію. Як правило, функціонально зв'язаний означає сусідній і, в разі секреторних лідерів, означає сусідній і в рамці зчитування. Структурні елементи, призначені для використання у дріжджових системах експресії, включають лідерну послідовність, що дозволяє позаклітинну секрецію трансльованого білка клітиною-господарем. Альтернативно, коли рекомбінантний білок експресують без лідерної або транспортної послідовності, він може містити М-кінцевий залишок метіоніну. Цей

Зо залишок можна, необов'язково, потім відщеплювати від експресованого рекомбінантного білка для одержання кінцевого продукту.

Вибір послідовності для контролю експресії й експресуючого вектора залежатиме від вибору господаря. Можна застосовувати широкий вибір поєднань експресуючий господар/вектор.

Застосовні експресуючі вектори для еукаріотичних господарів включають, наприклад, вектори, що містять послідовності для контролю експресії з 5М40, вірусу бичачої папіломи, аденовірусу й цитомегаловірусу. Застосовні експресуючі вектори для бактерійних господарів включають відомі бактерійні плазміди, такі як плазміди з ЕзПегіспіа соїї, включаючи РСЕ. 1, рВК322, рМВОа і їхні похідні, плазміди з широким спектром господарів, такі як М'1т3 і ниткоподібні фаги з одноланцюгової ДНК.

Відповідні клітини-господарі для експресії білкового маркера ракової стволової клітини включають прокаріоти, дріжджі, комах або клітини вищих еукаріот під контролем відповідних промоторів. Прокаріоти включають грамнегативні і грампозитивні організми, наприклад Е. соїї або бацили. Клітини вищих еукаріот включають стабільні лінії клітин, що походять із ссавців, як описано нижче. Можна застосовувати також безклітинні системи трансляції. Придатні клонуючі та експресуючі вектори для використання з клітинами-господарями бактерій, грибів, дріжджів і ссавців описані в Роцуеї5 еї аїЇ. (Сіопіпд Месіоге: А ІГарогаїогу Мапиаї, ЕІбеміег, М.М., 1985), релевантний опис якого таким чином наведений тут як посилання.

Різні системи культур клітин ссавців або комах також переважно використовують для експресії рекомбінантного білка. Можна здійснювати експресію рекомбінантних білків у клітинах ссавців, оскільки такі білки, як правило, є правильно згорнутими, відповідним чином модифікованими й повністю функціональними. Приклади відповідних ліній клітин-господарів ссавців включають лінії СО5-7 клітин нирок мавпи, описані Сіи2тап (Сеї!І 23:175, 1981), та інші лінії клітин, здатні експресувати відповідний вектор, включаючи, наприклад, І -клітини, лінії клітин С127, ЗТ3, яєчника китайського хом'яка (СНО), НегГа і ВНК. Експресуючі вектори ссавців можуть містити нетранскрибовані елементи, як-от точка початку реплікації, відповідні промотор і енхансер, приєднані до гену, що підлягає експресії, та інші 5- або 3'-фланкуючі нетранскрибовані послідовності, і 5'- або 3-нетрансльовані послідовності, такі як необхідні ділянки зв'язування рибосоми, ділянка поліаденілювання, донорні й акцепторні ділянки

Зо сплайсингу, й послідовності термінації транскрипції. Огляд бакуловірусних систем для продукції гетерологічних білків у клітинах комах наведений у ГисКом/ апа Зиттегв, Віо/Гесппоіоду 6:47 (1988).

Білки, що продукуються трансформованим господарем, можна очищати будь-яким придатним способом. Такі загальноприйняті способи включають хроматографію (наприклад, іонообмінну, афінну й розділялючу за розміром колонкову хроматографію), центрифугування, диференціальну розчинність або будь-який інший загальноприйнятий спосіб очищення білка.

Аффінні мітки, такі як гексагістидин, зв'язуючий мальтозу домен, послідовність оболонки вірусу грипу й глутатіон-5-трансфераза, можна приєднувати до білка, щоб забезпечувати легке очищення пропусканням через відповідну афінну колонку. Виділені білки можна також характеризувати фізично з використанням таких способів, як протеоліз, ядерний магнітний резонанс і рентгенівська кристалографія.

Наприклад, супернатанти з систем, що секретують рекомбінантний білок у культуральне середовище, можна спочатку концентрувати з використанням комерційно доступного фільтру для концентрації білка, наприклад пристрою для ультрафільтрації Атісоп або МійПіроге Реїїсоп.

Після стадії концентрації концентрат можна наносити на придатну матрицю для очищення.

Альтернативно можна застосовувати аніонообмінну смолу, наприклад матрицю або субстрат, що мають виступаючі групи діетиламіноетилу (ОЕАЕ). Матриці можуть являти собою акриламід, агарозу, декстран, целюлозу або інші типи, загальноприйняті для очищення білка.

Альтернативно можна застосовувати стадію катіонного обміну. Придатні катіонообмінники включають різні нерозчинні матриці, що містять сульфопропільні або карбоксиметильні групи.

Нарешті, одну або декілька стадій зворотнофазової високоефективної рідинної хроматографії (АР-НРІ С), що включають гідрофобне середовище КР-НРІ С, наприклад силікагель, що має виступаючі метильні або інші аліфатичні групи, можна застосовувати для додаткового очищення композиції білок ракової стволовий клітини-Ес. Деякі або всі з вищезазначених стадій очищення, в різних поєднаннях, також можна застосовувати для одержання гомогенного рекомбінантного білка.

Рекомбінантний білок, продукований у бактерійній культурі, можна виділяти, наприклад, за допомогою вихідного відділення від осадів клітин з подальшими однією або декількома стадіями концентрації, висолювання, іонного обміну у водних розчинах або ексклюзійної хроматографії. бо Високоефективну рідинну хроматографію (НРІС) можна застосовувати для кінцевих стадій очищення. Клітини мікроорганізмів, вживані для експресії рекомбінантного білка, можна руйнувати будь-яким придатним способом, включаючи цикли заморожування й відтавання, обробку ультразвуком, механічне руйнування або вживання засобів для лізису клітин.

Даний винахід відноситься до способів інгібування зростання клітин, що викликають утворення пухлини, експресуючих маркер ракової стволової клітини, з використанням антитіл проти маркера ракової стволової клітини, описаних тут. У конкретних варіантах здійснення спосіб інгібування зростання клітин, що викликають утворення пухлини, експресуючих маркер ракової стволової клітини, включає приведення клітини в контакт з антитілом проти маркера ракової стволової клітини іп міт. Наприклад, іморталізовану лінію клітин або лінію ракових клітин, експресуючих маркер ракової стволової клітини, культивують у середовищі, до якого додають антитіло проти експресованого маркера ракової стволової клітини для інгібування зростання клітин. У деяких варіантах здійснення пухлинні клітини, що містять стволові клітини пухлини, виділяють зі зразка від пацієнта, наприклад, як-от біоптат тканини, плевральний випіт або зразок крові, й культивують у середовищі, до якого додають антитіло проти маркера ракової стволової клітини для інгібування зростання клітин.

У деяких варіантах здійснення спосіб інгібування зростання клітин, що викликають утворення пухлини, експресуючих маркер ракової стволової клітини, включає приведення клітини в контакт з антитілом проти маркера ракової стволової клітини іп мімо. У конкретних варіантах здійснення приведення клітини, що викликає утворення пухлини, в контакт з антитілом проти маркера ракової стволової клітини здійснюють у моделі на тваринах.

Наприклад, ксенотрансплантати, експресуючі маркер ракової стволової клітини, вирощують у мишах з імунною недостатністю (наприклад, мишах МОБ/ЗСІЮВ), яким уводять антитіло проти маркера ракової стволової клітини для інгібування зростання пухлини. В деяких варіантах здійснення ракові стволові клітини, експресуючі маркер ракової стволової клітини, виділяють із зразка від пацієнта, наприклад, такого як біоптат тканини, плевральний випіт або зразок крові, та ін'єктгують мишам з імунною недостатністю, яким потім уводять антитіло проти маркера ракової стволової клітини для інгібування зростання пухлинної клітини. В деяких варіантах здійснення антитіло проти маркера ракової стволової клітини вводять у той самий час або відразу після введення клітин, що викликають утворення пухлини, тварині для запобігання

Зо зростанню пухлини. В деяких варіантах здійснення антитіло проти маркера ракової стволової клітини вводять як лікарський засіб після того, як клітини, що викликають утворення пухлини, вирощують до певного розміру.

Крім того, даний винахід стосуються фармацевтичних композицій, що містять антитіла, націлені на маркер ракової стволової клітини. Ці фармацевтичні композиції знаходять вживання в інгібуванні зростання пухлинної клітини й лікуванні раку в пацієнтів-людей.

Склади отримують для зберігання й використання за допомогою об'єднання очищеного антитіла за даним винаходом з фармацевтично прийнятним сполучним засобом (наприклад, носієм, наповнювачем) (Кептіпдіоп, Те Зсіепсе апа Ргасіїсе ої Рпаппасу 201п Еайіоп Маск

Рибіїєпіпо, 2000). Придатні фармацевтично прийнятні носії включають як необмежуючі приклади нетоксичні буфери, як-от фосфат, цитрат та інші органічні кислоти; солі, як-от хлорид натрію; антиоксиданти, включаючи аскорбінову кислоту й метіонін; консерванти (наприклад, хлорид октадецилдиметил-бензиламонію; хлорид гексаметонію; хлорид бензалконію; хлорид бензетонію; фенольний, бутиловий або бензиловий спирт; алкілларабени, як-от метил або пропілпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол і м-крезол); низькомолекулярні поліпептиди (наприклад, менш ніж приблизно 10 залишків амінокислот); білки, як-от сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; низькомолекулярні полімери, як-от полівінілпіролідон; амінокислоти, такі як гліцин, глутамін, аспарагін, гістидин, аргінін або лізин; вуглеводи, такі як моносахариди, дисахариди, глюкоза, маноза або декстрини; хелатуючі агенти, як-от ЕДТА; цукри, як-от сахароза, маніт, трегалоза або сорбіт; солетвірні протиіони, такі як натрій; комплекси з металами (наприклад, комплекси 7п-білок) і неіонні поверхнево-активні речовини, як-от ТУМЕЕМ або полієтиленгліколь (РЕ).

Фармацевтичну композицію за даним винаходом можна вводити будь-якою кількістю способів, або для місцевого, або для системного лікування. Введення може бути місцевим (наприклад, на слизові оболонки, включаючи вагінальну й ректальну доставку), наприклад, черезшкірні пластири, мазі, лосьйони, креми, гелі, краплі, супозиторії, спреї, рідини й порошки; введенням у легені (наприклад, за допомогою інгаляції або інсуфляції порошків або аерозолів, за допомогою інгалятора включно; інтратрахеальне, інтраназальне, епідермальне й черезшкірне); пероральне або парентеральне, включаючи внутрішньовенне, внутрішньоартеріальне, підшкірне, внутрішньочеревинне або внутрішньом'язове введення або бо інфузію; або інтракраніальне (наприклад, інтратекальне або інтравентрикулярне) введення.

Терапевтичний склад може існувати в одиничній дозованій формі. Такі склади включають пігулки, пілюлі, капсули, порошки, гранули, розчини або суспензії у воді або неводному середовищі, або супозиторії для перорального, парентерального або ректального введення, або для введення за допомогою інгаляції. У твердих композиціях, як-от пігулки, принциповий активний інгредієнт змішують з фармацевтичним носієм. Загальноприйняті таблетуючі інгредієнти включають кукурудзяний крохмаль, лактозу, сахарозу, сорбіт, тальк, стеаринову кислоту, стеарат магнію, фосфат дикальцію або смоли та інші розріджувачі (наприклад, воду) для формування твердої заздалегідь складеної композиції, що містить гомогенну суміш сполуки за даним винаходом або її нетоксичної фармацевтично прийнятної солі. Тверду заздалегідь складену композицію потім розділяють на одиничні дозовані форми описаного вище типу.

Пігулки, пілюлі тощо з нової композиції можуть бути покритими або отриманими іншим чином для надання лікарської форми, що надає перевагу сповільненої дії. Наприклад, пігулка або пілюля може містити внутрішню композицію, покриту зовнішнім компонентом. Більше того, два компоненти можна розділяти ентеросолюбільним шаром, який служить для стійкості до дезинтеграції та дозволяє внутрішньому компоненту проходити інтактним через шлунок або затримувати вивільнення. Безліч матеріалів можна використовувати для таких ентеросолюбільних шарів або покриттів, такі матеріали включають низку полімерних кислот і сумішей полімерних кислот з такими матеріалами, як шелак, цетиловий спирт і ацетат целюлози.

Фармацевтичні склади включають антитіла за даним винаходом в комплексі з ліпосомами (Ерзівїп, вї а!., 1985, Ргос. Маї). Асад. за. ОА 82:3688; Нуапо, єї а!., 1980, Ргос. Маїй!. Асай. 50.

ОБА 77:4030; і патенти США 4485045 і 4544545). Ліпосоми зі збільшеним часом циркуляції описані в патенті США 5013556. Деякі ліпосоми можна отримувати зворотнофазовим випаровуванням за допомогою ліпідної композиції, що містить фосфатидилхолін, холестерин і дериватизирований РЕС фосфатидилетаноламін (РЕС-РЕ). Ліпосоми екструдують через фільтри з певним розміром пор для одержання ліпосом бажаного діаметру.

Антитіла можна також укладати в мікрокапсули. Такі мікрокапсули отримують, наприклад, способами коацервації або міжповерхневої полімеризації, наприклад, гідроксиметилцелюлозні або желатинові мікрокапсули й полі(метилметацилатні) мікрокапсули, відповідно, в колоїдних

Зо системах доставки лікарського засобу (наприклад, ліпосоми, альбумінові мікросфери, мікроемульсії, наночастки й нанокапсули) або в макроемульсіях, як описано в Кетіпдіоп, Те

Зсієпсе апа Ргасіїсе ої Рнаптасу 201п Ед. Маск Рибіїзпіпа (2000).

Крім того, можна отримувати препарати зі сповільненим вивільненням. Придатні приклади препаратів сповільненого вивільнення включають напівпроникні матриці з твердих гідрофобних полімерів, що містять антитіло, де матриці знаходяться у формі сформованих виробів (наприклад плівок або мікрокапсул)у. Приклади матриць для сповільненого вивільнення включають поліефіри, гідрогелі, такі як полі(2-гідроксіетилметакрилат), або полі(вініловий спирт), полілактиди (патент США 3773919), співполімери І-глутамінової кислоти і 7-етилаі-ї - глутамату, недеградовний етиленвінілацетат, деградовані співполімери молочної кислоти й гліколевої кислоти, такі як ГОРКОМ ОЕРОТ ТМ (ін'єктовані мікросфери складаються із співполімеру молочної кислоти й гліколевої кислоти й ацетату леупроліду), і полі-О-(-)-3- гідроксимасляну кислоту.

У деяких варіантах здійснення лікування включає комбіноване введення антитіла за даним винаходом і хіміотерапевтичного засобу або коктейля з декількох різних хіміотерапевтичних засобів. Лікування антитілом може відбуватися до, під час або після введення хіміотерапії. Типи хіміотерапії, передбачувані за винаходом, включають хімічні речовини або лікарські засоби, які є відомими в даній галузі й комерційно доступними, такі як доксорубіцин, 5-фторурацил, арабінозид цитозину ("АКА-С"), циклофосфамід, тіотепа, бусульфан, цитоксин, таксол, метотрексат, цисплатин, мелфалан, вінбластин і карбоплатин. Комбіноване введення може включати спільне введення, або в одному фармацевтичному складі, або з використанням окремих складів, або послідовне введення у будь-якому порядку, але, як правило, протягом такого періоду часу, що всі активні засоби можуть одночасно проявляти їхні види біологічної активності. Препарат і розклади дозування для таких хіміотерапевтичних засобів можна використовувати згідно з інструкціями виробника, або як визначив емпірично фахівець у даній галузі. Препарат і розклади дозування для такої хіміотерапії описані також у СпетоїПпегару

Зегмісе Ес., М. С. Регту, УМіПатв»в 5 УМїКіпо, Вайітоге, Ма. (1992).

У конкретних варіантах здійснення винаходу лікування включає комбіноване введення антитіла за даним винаходом і другого терапевтичного засобу. Як застосовують тут, "другий терапевтичний засіб" включає як необмежуючі приклади хіміотерапевтичний засіб, бо радіотерапію, цитокін і антитіло проти іншого асоційованого з пухлиною антигена.

У інших варіантах здійснення лікування включає комбіноване введення антитіла за даним винаходом і радіотерапії. Лікування антитілом може відбуватися до, під час або після введення радіотерапії. Можна використовувати будь-які розклади дозування для такої радіотерапії, як визначив фахівець у даній галузі.

У інших варіантах здійснення лікування може включати комбіноване введення антитіл за даним винаходом з іншими антитілами проти додаткових асоційованих з пухлиною антигенів, включаючи, як необмежуючі приклади, антитіла, що зв'язують рецептор ЕСЕ (ЕСЕК) (ЕгрпихФ), рецептор егоВ2 (НЕК) (НегсерііпФ) і чинник зростання ендотелію судин (МЕСЕ) (АмабвііпФ)).

Більш того, лікування може включати введення одного або декількох цитокінів, його можна супроводжувати хірургічним видаленням ракових клітин або будь-якою іншою терапією, що її вважає необхідною лікар.

Для лікування захворювання придатна доза антитіла за даним винаходом залежить від типу захворювання, що підлягає лікуванню, важкості й перебігу захворювання, можливості відповіді захворювання на лікування, від того, чи то вводять антитіло для терапевтичних або застережливих цілей, попередньої терапії, історії хвороби пацієнта й тому подібного, все на розсуд лікаря. Антитіло можна вводити однократно або протягом серії обробок, що тривають від декількох днів до декількох місяців, або до досягнення ефекту лікування або послаблення стану захворювання (наприклад, зменшення розміру пухлини). Оптимальні розклади дозування можна розрахувати за вимірюваннями накопичення лікарського засобу в організмі пацієнта, й вони мінятимуться залежно від відносної активності індивідуального антитіла. Лікар, що здійснює введення, може легко визначити оптимальні дози, способи дозування й частоту повторень. Як правило, доза складає від 0,01 мкг до 100 мг на кг маси тіла, та її можна вводити один або кілька разів на добу, тиждень, місяць або рік. Лікар може визначити частоту повторень для дозування на підставі вимірювання періодів часу утримування й концентрацій лікарського засобу в рідинах або тканинах організму.

Даний винахід стосується наборів, які містять описані тут антитіла і які можна використовувати для здійснення описаних тут способів. У конкретних варіантах здійснення набір містить щонайменше одне очищене антитіло проти маркера ракової стволової клітини в одному або кількох контейнерах. У деяких варіантах здійснення набори містять усі компоненти, необхідні й достатні для здійснення аналізу для детекції, включаючи всі контролі, інструкції для здійснення аналізів, і будь-яке необхідне програмне забезпечення для аналізу й представлення результатів. Фахівцеві в даній галузі добре зрозуміло, що описані антитіла за даним винаходом можна легко включати в один із загальноприйнятих форматів наборів, добре відомих у даній галузі.

Варіанти здійснення з даного опису можна додатково визначити, виходячи з наступних прикладів, які детально описують одержання антитіл за даним описом і способи використання антитіл за даним описом. Фахівцям у даній галузі буде очевидно, що на практиці можна здійснювати безліч модифікацій, як матеріалів, так і способів, без відхилення від обсягу даного опису. За можливістю, на всіх кресленнях використовуватимуть ті самі номери для посилань для позначення однакових або схожих частин. Як застосовують тут і в доданій формулі винаходу форми однини включають множину об'єктів посилання, якщо контекст явно не вимагає іншого. Таким чином, наприклад, посилання на "антитіло" включає безліч таких антитіл, або одне або декілька антитіл та їх еквівалентів, відомих фахівцям у даній галузі. Більше того, всі числа, що описують кількості інгредієнтів, умови реакцій, чистоту, довжини поліпептидів і полінуклеотидів та ін., вживані в описі, Є модифікованими терміном "приблизно", якщо немає інших вказівок. Відповідно, числовими параметрами, вказаними в описі й формулі винаходу, є наближення, які можуть змінюватися залежно від бажаних властивостей за даним винаходом.

ПРИКЛАДИ

Приклад 1: Одержання моноклональних й гуманізованих антитіл проти 0 І 4

Одержання антигена

Фрагмент рекомбінантного поліпептиду позаклітинного домена 0/4 людини отримували як антиген для одержання антитіла. Загальноприйнятий спосіб рекомбінантної ДНК використовували для виділення полінуклеотиду, що кодує амінокислоти 1-522 0114 (5ЕО І

МО: 25). Цей полінуклеотид лігували в рамці зчитування з М-кінця, або з міткою Ес людини, або з гістидиновою міткою, й клонували в переносний плазмідний вектор для опосередкованої бакуловірусом експресії в клітинах комах. Загальноприйняті протоколи трансфекції, інфекції й культивування клітин використовували для одержання рекомбінантних клітин комах, експресуючих відповідний поліпептид 0/4 (О'Кейеу еї аї., Васшоміги5 ехргев5зіоп месіог5: А

І абогаїогу Мапиаї, Охтога: Охіога Опімегейу Ргезз (1994)).

Відщеплення ендогенної сигнальної послідовності 0/4 людини приблизно визначали з використанням програмного забезпечення для передбачення відщеплення 5ІСМАЇГ Р 3.0, проте дійсна точка відщеплення іп мімо може відрізнятися на пару амінокислот у будь-якому напрямі.

Передбачене розщеплювання 0114 відбувається між амінокислотами 1 і 26, таким чином, антигенний білок 0 4 містить приблизно від амінокислоти 27 до амінокислоти 522. Антигенний білок очищали з кондиціонованого середовища клітин комах з використанням афінної хроматографії з білком А і Міх-хелатом. Очищений антигенний білок потім діалізували проти

РВЗ (рн-7), концентрували приблизно до 1 мг/мл і фільтрували в стерильних умовах для підготовки для імунізації.

Імунізація

Мишей (п-3) імунізували очищеним антигенним білком 01/14 (Апіїбоду ЗоІшіоп5; Моипіаїп

Міем,, СА) з використанням загальноприйнятих способів. Проводили скринінг крові від індивідуальних мишей приблизно через 70 діб після початкової імунізації по впізнаванню антигена з використанням аналізів ЕГІЗА і ЕАС5 (детально описаних нижче). Двох тварин з найбільш високими титрами антитіл вибрали для кінцевої стимуляції антигеном, після якої клітини селезінки виділяли для одержання гібридоми. Клітини гібридоми розсівали по 1 клітині на лунку в 96-лунковому планшеті, і проводили скринінг супернатанту з кожної лунки за допомогою аналізів ЕГІ5А і РАС5З проти антигенного білка. Вибрали декілька гібридом з високим титром антитіл і розмножували в статичній культурі у флаконі. Антитіла очищали з супернатанту гібридоми з використанням хроматографії на агарозі з білюм А або білком б. Очищені моноклональні антитіла знову тестували за допомогою ЕАС5 і визначали ізотип для відбору антитіл ІБ і ІМ.

Аналіз ЕАС5

Для відбору моноклональних антитіл, продукованих клонами гібридом, що впізнають нативний білок поверхні клітин 01/14, використовували аналіз РГАС5. Проводили спільну трансфекцію клітин НЕК293 експресуючими векторами, що кодують повнорозмірний клон кДНК рі ії маркер трансфекції СЕР. Через 24-48 годин після трансфекції клітини збирали в суспензії та інкубували на льоду з антитілами проти 014 або контрольними дО для детекції фонового зв'язування антитіла. Клітини промивали, й первинні антитіла детектували за допомогою

Зо вторинних антитіл проти антитіл миші, кон'югованих з флуоресцентним хромофором. Потім мічені клітини сортували за допомогою ЕБАС5 для ідентифікації антитіл проти 01/14, що специфічно впізнають експресію на поверхні клітин нативного білка поверхні клітин 0 | 4.

Моноклональні антитіла 21М14 і 21М18 впізнавали 0/4 на трансфікованих клітинах (Фіг. 1).

Антитіло миші 21М18 депонували в Американській колекції типових культур (Мо. ХРТА-8670).

Потім визначали здатність антитіл, направлених проти 01/14, перешкоджати взаємодії між ра ї Моїсі, з використанням проточної цитометрії. Клітини НЕК 293, стабільно трансдуковані

КДНК І 4, інкубували або з МоїспІ-ЕСЕ10-15-Ес, або з контрольним білком-Ес за наявності анти-ОЇ 4 або контрольних антитіл. Зв'язування злитих з Ес білків з клітинами, експресуючими рі 4, детектували за допомогою РЕ-кон'югованого антитіла кози проти Ес і поточної цитометрії.

Здатність антитіл проти 0/4 інгібувати зв'язування Моїсі з 0 | 4, таким чином, визначали за зменшенням інтенсивності флуоресценції. Як показано на фігурі 2А, інгібування зв'язування

Моїсп спостерігали з антитілами миші 21М14 і 21М18, але не 21М12. Більш того, 21М18 миші специфічно зв'язує 0/4 людини, але не мишиі, і блокує зв'язування 01 І 4 людини, але не 0 І 4 миші, з клітинами, експресуючими Моїсп! (Фіг. 28). Ці дані вказують на те, що 21М18 в експериментах з ксенотрансплантатами націлено на 01 І 4 людини, експресований на пухлинних клітинах, а не на 0 Г4 миші, експресований у судинній системі.

Картування епітопів

Для ідентифікації антитіл, що впізнають конкретні ділянки позаклітинного домена 0114, проводили картування епітопів. Експресуючі плазмідні вектори для ссавців, що містять промотор СММ вище за полінуклеотиди, що кодують вкладені серії делеційних фрагментів позаклітинного домена 0114, злитого з білком Ес, отримували з використанням загальноприйнятого способу рекомбінантної ДНК. Додаткові конструкції, що кодують фрагменти рії4, що являють собою химеру 01/14 людини і миші, злиту з Ес білком, також отримували з використанням загальноприйнятого способу рекомбінантної ДНК. Сконструйовані додаткові серії злитих білків 0 | 4-ї5, що містять заміни конкретних амінокислот. Ці рекомбінантні злиті білки експресували в тимчасово трансфікованих клітинах НЕК 293, з яких відбирали кондиціоноване середовище для ЕГІЗА через від двадцяти чотири до сорока восьми годин після трансфекції. Фрагменти злитого білка 01 І 4 фіксували на планшетах, покритих антитілами проти Ес людини. Потім антитілам проти 0114 дозволяли взаємодіяти із зв'язаними бо фрагментами 0114 і вимірювали зв'язування за допомогою подальшої інкубації з антитілом проти антитіл миші, кон'югованим з НЕР, і детекції активності НЕР (Фігура ЗА). Як показано на фігурі З, моноклональні антитіла миші 21М14 і 21М18 впізнають епітоп, що міститься в межах амінокислот 1-217 БІГ 4. Ця ділянка містить мотив, названий домен "051. (ОеКа/Зетагелад-2)", наявний у декількох лігандах Моїсі (Тах еї аї., 1994, Маїште 368:150-4). Крім того, перевіряли тА проти 01 4 за зв'язуванням фрагментів злитого білка ОІ І 4 за допомогою аналізу Вестерн- блотингом (Фіг. ЗВ). Ця робота показує специфічне для людини зв'язування 21М18 з 0114 в межах амінокислот 1-154 за наявності домена О5І, присутнього в межах амінокислот 155-217.

Це вказує на раніше недооцінену важливість цієї М-кінцевої послідовності для функції 0 І 4. Ця робота підсумовувана в схематичній формі (Фіг. З3С), де зв'язування з 21М18 або відсутність зв'язування позначена "«" або "-", відповідно. Зв'язування 21М18 додатково характеризували за допомогою перевірки зв'язування 21М18 з серіями фрагментів білка 0 І 4 (0 І 4домен1-6), що містять конкретні заміни амінокислот, замінюючі амінокислоти 014 людини на відповідні амінокислоти миші. Проводили скринінг злитих білків за зв'язуванням з 21М18 за допомогою

ЕГІЗА. Декілька положень ідентифікували як важливі для зв'язування 21М18, як показано (Фіг. 30). Для 21М18 показали порушене зв'язування з фрагментами білка 01/14 із замінами амінокислот 68, 69 і 71 (заміна валіну, валіну і проліну) або амінокислоти 142 і 144 (заміна лізину й аланіну). На відміну від цього, відмітне антитіло 21М21 зв'язується з епітопом, що міститься в межах ділянки О5І (Фіг. ЗЕ), але це антитіло не впливає на функцію 01/14, як показано на фігурі б, показуючи, що зв'язування з О5І не передбачає функціональність антитіла.

Химерні антитіла

Після ідентифікації моноклональних антитіл, що специфічно впізнають 0114, ці антитіла модифікують для подолання імунної відповіді людини проти антитіла миші (НАМА), коли антитіла використовують як терапевтичні засоби. В конкретних варіантах здійснення варіабельні ділянки важкого ланцюга й легкого ланцюга вибраного моноклонального антитіла виділяють за допомогою КТ-ПЦЕ з клітин гібридоми і лігують в рамці зчитування з константними ділянками важкого ланцюга й легкого ланцюга каппа Ідс:ї людини, відповідно, в експресуючих векторах для ссавців. Альтернативно використовують експресуючий ІД людини вектор, як-от

ТСАЕ 5.3, який містить гени константної ділянки важкого ланцюга і легкого ланцюга каппа Ідс1

Зо на тій самій плазміді (Ргезіоп еї а!., 1998, ІпТесіоп 8 Іттипйу 66:4137-42). Потім експресуючі вектори, що кодують химерні важкий і легкий ланцюги, спільно трансфікують у клітини яєчника китайського хом'яка (СНО) для продукції химерного антитіла. Імунореактівность і афінность химерних антитіл порівнюють з початковими антитілам миші за допомогою ЕГІЗА і ЕАС5.

Гуманізовані антитіла

У конкретних варіантах здійснення отримують гуманізовані антитіла анти-О/ 14. Виділяли й секвенували варіабельні домени моноклонального антитіла миші 21М18 з лінії гібридоми з використанням виродженої ПЦР, по суті, як описано в ІагтіскК, .М., еї аї., 1989, Віоспет.

Віорпу5. Ке5. Сотт. 160:1250, і допев5, 5.1. 5 Вепаїд, М.М., 1991, Віо/ГесппоІоду 9:88. Потім варіабельні каркасні ділянки важкого й легкого ланцюгів людини, ймовірно, що є структурно схожими з послідовностями амінокислот вихідного антитіла 21М18, вибирали як людські каркасні ділянки для гуманізації. Для ідентифікації людських каркасних ділянок-кандидатів передбачені послідовності білка, що кодуються мишачими варіабельними доменами Мн і М. з 21М18, порівнюють з послідовностями антитіла людини, кодованими експресованою кДНК людини, з використанням пошуків ВІ А5Т для людської послідовності, депонованої в бепрапк. З використанням цього способу експресовані послідовності КДНК людини (наприклад, депрапк

АУЗ393019, 0С295533) вибирають для подальшого аналізу при конструюванні каркаса важкого ланцюга.

Відмінності амінокислот між гуманізованими каркасами важких ланцюгів-кандидатів і важким ланцюгом вихідного моноклонального антитіла 21М18 миші оцінюють за можливою важливістю, й приймають рішення, чи робить внесок кожна відмінність у положенні в правильне згортання антитіла 21М18. Для цього аналізу керуються вивченням вирішених кристалічних структур інших фрагментів антитіл (наприклад, структури Тар 2Е8, як описано в Тгакпапом еї а!., Асіа СтгуємаїПодг

О Віої СтузіаПйодг, 1999, 55:122-28). Структури моделюють з використанням комп'ютерного програмного забезпечення, включаючи тої, диіскК РОВ і Рутої. Розглядають потенційний внесок амінокислоти в даному положенні на упаковку каркаса з В-аркушів, взаємодію між варіабельними доменами важкого й легкого ланцюгів, ступінь відкритості для розчинника бічного ланцюга амінокислоти й вірогідність того, що амінокислота робитиме внесок до розташування петель СОК. За цим аналізом хімічно синтезували п'ять ланцюгів Мн-кандидатів, що зливаються в рамці зчитування з константною ділянкою Ід52 людини. Важкі ланцюги- бо кандидати містять: ії) функціональний людський каркас, що містить вибрані заміни в синтетичній каркасній ділянці на підставі аналізу вірогідного внеску у функцію зв'язування 21М18, і ї) СОК вихідного антитіла 21М18 миші (ЗЕО ІО МО: 1, 2 і 5).

Так само ідентифікували відмінності амінокислот між легсим ланцюгом вибраного каркаса

ІСК(М) 4-1 людини і легким ланцюгом вихідного моноклонального антитіла миші 21М18, ї потім приймали рішення, чи робить внесок кожна відмінність у положенні в правильне згортання антитіла 21М18. За цим аналізом хімічно синтезували п'ять ланцюгів Мі-кандидатів. Перший легкий ланцюг-кандидат містить: ї) повний людський каркас ІСК(М) 4-1 ї ії) СОК вихідного антитіла 21М18 миші (ЗЕО ІЮО МО: 9, 10 їі 11). Чотири додаткових легких ланцюги-кандидати містять: ї) людську каркасну ділянку ІЗК(М) 4-1 зі збільшуваною кількістю мишачих залишків з 21М18, залишених у каркасній ділянці, і і) СОК вихідного антитіла 21М18 миші (ЗЕО ІО МО: 9, 10 ї 11).

Функціональність кожного варіанту-кандидата гуманізованих важкого й легкого ланцюгів тестували за допомогою спільної трансфекції в клітини ссавців. Кожен із п'яти гуманізованих важких ланцюгів 21М18-кандидатів, описаних вище, трансфікували спільно з кКДНК легкого ланцюга 21М18 миші в клітини НЕК 293, і кондиціоноване середовище аналізували за активністю зв'язування антигена 014 за допомогою ЕГІ5ЗА. Вибрали варіант важкого ланцюга 21М18, що має найміцніше зв'язування. Цей варіант - "21М18 Нг" - містить, на додаток до мишачих СОК, заміни в 6 положеннях каркаса всередині каркаса Мп, положеннях 16, 20, 27, 28, 38 і 48 за Кабаї (Фіг. 4А). Потім гуманізований важкий ланцюг 21М18 Н2 трансфікували спільно з кожним з п'яти гуманізованих легких ланцюгів-кандидатів у клітини НЕК 293, ї кондиціоновані середовища знову аналізували за зв'язуванням антигена за допомогою ЕГІЗА. Виявили, що один варіант легкого ланцюга має краще зв'язування, ніж інші кандидати, - "21М18 12" - що зберігає мишачі залишки в положеннях 22 і 36 за КаБбаї (фіг. 5).

Потім змінювали окремий залишок цистемну в СОМК2 Н2 (5ЕБО ІЮ МО: 2). Зокрема, синтезували два варіанти важкого ланцюга На2 із залишком цистеїну в положенні 52а за Карбаї, модифікованого до залишку серину (варіант Н7; ЗЕО ІЮ МО: 3) або валіну (варіант НО; 5ЕО ІЮ

МО: 4). Ці важкі ланцюги спільно з 1/2 трансфікували в клітини НЕК 293, і знову аналізували кондиціоновані середовища. Для обох варіантів (21М18 Н7І2 і 21М18 НОІ2) за допомогою

ЕГІЗА показали специфічне зв'язування антигена. Таким чином, СОК2 важкого ланцюга 21М18

Ко) містить ЗЕО ІЮО МО: 2, З або 4, в яких осад у положенні 52а за Кабаї містить залишок цистеїну, серину або валіну.

У конкретних варіантах здійснення отримували гуманізовані антитіла анти-ОІ І 4. Виділяли й секвенували варіабельні домени моноклонального антитіла миші 21М18 з лінії гібридоми з використанням виродженої ПЦрР по суті, як описано в І агтіскК, У.М., еї аї!., 1989, Віоспет. Віорпув.

Кев. Сотт. 160:1250 і допев5, 5.Т. 85. Вепаїд, М.М., 1991, Віо/ТесппоіІоду 9:88. Потім варіабельні каркасні ділянки важкого й легкого ланцюгів людини, найбільш схожі з послідовностями амінокислот вихідного антитіла 21М18, вибирали як людські каркасні ділянки для гуманізації.

Для ідентифікації найбільш схожих з людськими каркасних ділянок-кандидатів передбачені послідовності білка, що кодуються мишачими варіабельними доменами Мн і Мі з 21М18, порівнювали з варіабельними доменами Ід, що кодуються геномом людини, з використанням пошуків ВГА5БТ для людської послідовності, депонованої в бепрапк. З використанням цього способу ІСН(М) 1-18 вибрали як людську каркасну ділянку важкого ланцюга і ІК(М) 4-1 вибрали як людську каркасну ділянку легкого ланцюга.

Ідентифікували відмінності амінокислот між вибраним людським каркасом важкого ланцюга

ІСНІ(М) 1-18 і важким ланцюгом вихідного моноклонального антитіла 21М18 миші, й потім приймали рішення, чи робить внесок кожна відмінність у положенні в правильне згортання антитіла 21М18. Для цього аналізу керувалися вивченням вирішених кристалічних структур інших фрагментів антитіл (наприклад, структури Тар 2Е8, як описано в Тгакпапом еї аї., Асіа

Стувіайоаг ОО Віо! СгувіаНйодг, 1999, 55:122-28). Структури моделювали з використанням комп'ютерного програмного забезпечення, включаючи .тої, диск РОВ і Рутої. Розглядали потенційний внесок амінокислоти в даному положенні на упаковку каркаса з В-аркушів, взаємодію між варіабельними доменами важкого й легкого ланцюгів, ступінь відкритості для розчинника бічного ланцюга амінокислоти й вірогідність того, що амінокислота робитиме внесок до розташування петель СОК. За цим аналізом хімічно синтезували п'ять ланцюгів Мн- кандидатів, злитих в рамці зчитування з константною ділянкою Ід52 людини. Перший важкий ланцюг-кандидат містив: її) повний людський каркас ІСН(М) 1-18 ії її) СОК вихідного антитіла 21М18 миші (ЗЕО ІО МО: 1, 2 ії 5). Чотири додаткових легких ланцюги-кандидати містили: і) людську каркасну ділянку ІЗН(М) 1-18 зі збільшуваною кількістю мишачих залишків, з 21М18, залишених у каркасній ділянці, і ї) СОК вихідного антитіла 21М18 (ЗЕО ІО МО: 1, 2 і 5).

Так само ідентифікували відмінності амінокислот між легеим ланцюгом вибраного каркаса

ІСК(М) 4-1 людини і легким ланцюгом вихідного моноклонального антитіла миші 21М18, ї потім приймали рішення, чи робить внесок кожна відмінність у положенні в правильне згортання антитіла 21М18. За цим аналізом хімічно синтезували п'ять ланцюгів Мі-кандидатів. Перший легкий ланцюг-кандидат містив: ) повний людський каркас ІСК(М) 4-1 ї ї) СОК вихідного антитіла 21М18 миші (ЗЕО ІЮО МО: 9, 10 їі 11). Чотири додаткових легких ланцюги-кандидати містили: ї) людську каркасну ділянку ІЗК(М) 4-1 зі збільшуваною кількістю мишачих залишків, з 21М18, залишених у каркасній ділянці, і і) СОК вихідного антитіла 21М18 миші (ЗЕО ІО МО: 9, ї 11). 10 Функціональність кожного варіанту-кандидата гуманізованих важкого й легкого ланцюгів тестували за допомогою спільної трансфекції у клітини ссавців. Кожен з п'яти гуманізованих важких ланцюгів 21М18-кандидатів, описаних вище, трансфікували спільно з кКДНК легкого ланцюга 21М18 миші в клітини НЕК 293, і потім кондиціоновані середовища аналізували за активністю зв'язування антигена 014 за допомогою ЕГІ5ЗА. Вибрали варіант важкого ланцюга 21М18, що має найміцніше зв'язування. Цей варіант - "21М18 На2г" - містив, на додаток до мишачих СОК, мишачі залишки у п'яти положеннях каркаса, положеннях 20, 28, 38, 48 і 69 за

Кава! (Фіг. 4). Потім гуманізований важкий ланцюг 21М18 Н2 трансфікували спільно з кожним з п'яти гуманізованих легких ланцюгів-кандидатів у клітини НЕК293, і кондиціоновані середовища знову аналізували за зв'язуванням антигена за допомогою ЕГІЗА. Виявили, що один варіант легкого ланцюга має краще зв'язування, ніж інші кандидати - "21М18 12" - що зберігає мишачі залишки в положеннях 22 і 36 за Кабаї (Фіг. 5).

Потім змінювали окремий залишок цистеїну в СОМК2 Н2 (5БО ІЮ МО: 2). Зокрема, синтезували два варіанти важкого ланцюга Н2 із залишком цистеїну в положенні 52а за Кабаї, модифікованого до залишку серину (варіант Н7; 5ЕО ІЮ МО: 3), або валіну (варіант НО; ЗЕО ІЮ

МО: 4). Ці важкі ланцюги спільно з 1/2 трансфікували в клітини НЕК293, і знову аналізували кондиціоновані середовища. Для обох варіантів (21М18 Н7І2 і 21М18 НОІ2) за допомогою

ЕГІЗА показали специфічне зв'язування антигена. Таким чином, СОК2 важкого ланцюга 21М18 містить ЗЕО ІЮО МО: 2, З або 4, в яких осад у положенні 52а за Кабаї містить залишок цистеїну, серину або валіну.

Зо Потім гуманізовані антитіла 21М18 характеризували додатково. Зокрема, афінність зв'язування гуманізованих антитіл 21М18, очищених за допомогою хроматографії з білком А, визначали з використанням Віасоге. Визначили, що афінність складає приблизно 0,33 нМ для варіанту 21М18 Н2гІ2.

Гуманізовані антитіла 21М18 депоновані в АТСС (21М18 НОЇ 2, номер депозиту в АТСОС РТА- 8427 і 21М18 Н7І2, АТСС номер депозиту РТА-8425, депоновані 10 травня 2007 р.).

Антитіла людини

У деяких варіантах здійснення антитіла людини, що специфічно впізнають позаклітинний домен 01/14, виділяли з використанням способу фагового дисплея. Проводили скринінг бібліотеки синтетичних антитіл, що містить варіабельні домени антитіл людини, за специфічним і високоафінним впізнаванням антигена 014, описаного вище. Касети СОК у бібліотеці міняли за допомогою унікальних фланкуючих ділянок рестрикції для оптимізації антитіла. Потім оптимізовані людські варіабельні ділянки клонували в експресуючий Ід вектор, що містить важкий ланцюг і легсий ланцюг каппа їдс:ї людини, для експресії антитіл людини в клітинах ссавців СНО.

Приклад 2: Аналізи іп міїто для оцінки антитіл анти-О1 І 4

В даному прикладі описані репрезентативні аналізи іп міо для тестування активності антитіл, отриманих анти-О1І 4, з проліферації клітин, активації шляху Моїсй й цитотоксичності.

Аналіз проліферації

Експресію 0 14 в різних лініях ракових клітин оцінюють кількісно з використанням аналізу

Тадтап. Лінії клітин, ідентифіковані як експресуючі 011 4, розсівають при щільності 107 клітин на лунку в 96-лункові мікропланшети для культивування клітин і дозволяють розмножуватися протягом 24 годин. Потім клітини культивують протягом додаткових 12 годин у свіжій ОМЕМ з 2 96 ЕС5, у цій крапці до культурального середовища додають антитіла анти-О1 І 4 порівняно з контрольними антитілами за наявності 10 мкмоль/л ВКОИ. Після мічення ВКОШ культуральне середовище видаляють, і клітини фіксують при кімнатній температурі протягом 30 хвилин в етанолі і проводять реакцію протягом 90 хвилин 3 кон'югованим з пероксидазою моноклональним антитілом проти ВКОШ (клон ВМО 6НВ, фрагменти Раб). Субстрат проявляють у розчині, що містить тетраметилбензидин, і зупиняють через 15 хвилин за допомогою 25 мкл 1 моль/л Нг5О». Кольорову реакцію вимірюють за допомогою автоматичного зчитувача планшетів бо для ЕГІЗБА з використанням фільтру 450 нм (ОМ Місгоріасе Кеайдег; Віо-Най Іарогаюгієв,

Кісптопа, СА). Всі експерименти здійснюють у трьох паралелях. Визначають здатність антитіл анти-О І 4 інгібувати проліферацію клітин у порівнянні з контрольними антитілами.

Аналіз активації шляху

У конкретних варіантах здійснення визначають іп міо здатність антитіл анти-ОГ | 4 блокувати активацію шляху передачі сигналів Моїсп. Клітини Неї! а, культивовані в ОМЕМ, доповненій антибіотиками і 10 95 ЕС5, піддавали спільній трансфекції 1) репортерним вектором

Невз1-Сис, що містить промотор Не5і! вище репортерного гену люциферази світляка, для вимірювання рівнів передачі сигналів Моїсп (дагтіації еї а!., 1995, Маїште 377:355-8) у відповідь на ліганд 014 і 2) репортером - люциферазою Кепійа (Рготеда; Мадізоп, М/І) як внутрішнім контролем ефективності трансфекції. Потім трансфіковані клітини додавали в культуральні планшети, покриті протягом ночі 10 мкг/мл білка 01/1/4-Бс. Потім в середовище для культивування клітин додавали антитіла анти-О1/ І 4. Через сорок вісім годин після трансфекції рівні люциферази вимірювали з використанням набору для подвійного аналізу люциферази (Рготеда; Мадізоп, М/І), де активність люциферази світляка нормалізували за активністю люциферази Кепійа. Таким чином визначали здатність антитіл інгібувати індуковану 0/4 активацію шляху Моїсй. Інгібування активації 0//4 з активації шляху Моїсп спостерігали за допомогою антитіл миші анти-ОГ І 4 21М14 ї 21М18 (Фіг. 6). На відміну від цього, антитіло анти- ріЛ4 21М21 не інгібувало зв'язування Моїсі (Фіг. б), не дивлячись на зв'язування з доменом

О5І 0 4 (Фіг. ЗЕ).

У конкретних варіантах здійснення визначали здатність антитіл анти-0! 4 модулювати активацію нижчестоячих генів. Виділяли клітини пухлини ободової кишки С8 від тварин, оброблених антитілами 21М18 миші (детально описаних нижче), і експресію генів шляху Моїсп

НЕ51 ї АТОН-визначали за допомогою КТ-ПЦР. Тотальну РНК з пухлинної тканини виділяли за допомогою набору КМеавзу Рібгоиз5 Тіз5це (Оіадеп, МаІепсіа, СА) згідно з інструкціями виробника.

Якість зразків РНК визначали за співвідношенням 260 нм/280 нм. Цілісність РНК визначали за допомогою електрофорезу аліквоти зразка РНК в денатуруючому агарозном гелі, забарвленому бромідом етидію (ЕїВг). Співвідношення рРНК 285 до 185 у гелі візуалізували з використанням камери РійогСпет, доставленої з програмним забезпеченням АрпаЕаза ЕС. Зразки РНК елюювали вільною від Рнкази водою і зберігали при -80 "С. ЕТ-ПЦР з детекцією в реальному

Зо часі здійснювали за допомогою нерозтяжного зонда з подвійною флуоресценцією, що містить репортерний фарбник 3-ТАМАА ЕБАМ (б-карбоксифлуоресцеїн) і 3-ТАМАА (б-карбокси- тетраметилродамін). Сто мікрограмів тотальної РНК використовували для ПЦР з детекцією в реальному часі в кінцевому об'ємі 25 мкл, що містить зворотну транскриптазу, 1Х буфер

Тадтап (Арріїеай Віозузіет5, Бозіег Сйу, СА) і суміш праймерів/зондів. Реакції проводили в системі АВІ 7900 НТ Раві Кеаї Тіте РОК (Арріїєа Віозубіет5, Ровіег Спу, СА): 30 хвил при 48 "С, 10 хвил при 95 "С ії 40 циклів з 15 сек при 95 "С, і 1 хвил при 60 "С. Результати аналізували з використанням програмного забезпечення 5052.3 (Арріїед Віозувієтв5). Всі набори праймерів і зондів отримували з АрріФєй Віозуєіет»5 (Бовієї Сйу, СА). Рівень експресії генів-мішеней нормалізували за рівнем експресії гена домашнього господарства Сиз В і виражали як відносну кількість. Обробка антитілами 21М18 миші анти-ОІ І 4 знижувала експресію НЕ51 і збільшувала експресію АТОН-1 в порівнянні з пухлинами після контрольної обробки (Фіг. 7А).

У деяких варіантах здійснення отримували колонії лінійно виснажених пухлинних клітин миші ОМР-С11 з використанням умов культивування для підтримки клітин, що викликають утворення пухлини, іп міїгто. Ці колонії пухлинних клітин покривали клітинами ЗТ3З з відсутністю (3Т3) або наявністю 014 людини (01 4), надекспресованого на поверхні клітин, за наявності або відсутності 10 мкг/мл мишачого 21М18 або 5 мкм інгібітору гамма-секретази (51; тобто 082). Включали також контроль без покриття. Тоді як клітини 3Т3-01 І 4 індукували експресію гена НЕ51 ї супресували експресію гена АТОНІ (показано як співвідношення НЕ51: АТОНІ), або 21М18, або 51 окремо інгібірували індуковані 0/4 зміни генів-мішеней Моїсй.

Аналіз комплементзалежної цитотоксичності

У конкретних варіантах здійснення лінії ракових клітин, експресуючих 0114, або ракові стволові клітини, виділені із зразка пацієнта, пасированого як ксенотрансплантат у мишах з імунною недостатністю (як детально описано нижче), використовують для вимірювання комплементзалежної цитотоксичності (СОС), опосередкованої антитілом анти-ОІ 14. Клітини суспендують у 200 мкл культурального середовища КРМІ 1640, доповненого антибіотиками і 596 ЕВ5, до 106 клітин/мл. Потім суспендовані клітини змішують з 200 мкл сироватки або сироватки після теплової инактивації з антитілами анти-ОІ 4 або контрольними антитілами у трьох паралелях. Суміші клітин інкубують протягом 1-4 годин при 37 "С в 5595 СО». Потім оброблені клітини збирають, ресуспендують у 100 мкл міченого РІТС анексину МУ, розчиненого в бо культуральному середовищі, й інкубують при кімнатній температурі протягом 10 хвилин. 100 мл розчину йодиду пропідію (25 мкг/мл), розведеного в НВ55, додають і інкубують протягом 5 хвилин при кімнатній температурі. Клітини збирають, ресуспендують у культуральному середовищі й аналізують поточною цитометрією. Поточною цитометрією забарвлених БІТС клітин отримують спільний рахунок клітин, і поглинання йодиду пропідію мертвими клітинами у вигляді відсотка від загальної кількості клітин використовують для вимірювання клітинної смерті за наявності сироватки й антитіл анти-О1 І 4 в порівнянні з сироваткою після теплової інактивації й контрольними антитілами. Таким чином визначають здатність антитіл анти-ОІ | 4 опосередкувати комплементзалежну цитотоксичність.

Аналіз антитілозалежної клітинної цитотоксичності

У конкретних варіантах здійснення лінії ракових клітин, експресуючих 0114, або ракові стволові клітини, виділені зі зразка від пацієнта, пасивованого у вигляді ксенотрансплантату в мишах з імунною недостатністю (як детально описано нижче), використовують для вимірювання антитілозалежної клітинної цитотоксичності (АДЮОСС), опосередкованої антитілом анти-Оі 4.

Клітини суспендують у 200 мкл вільною від фенолу червоного культурального середовища

ЕРМІ 1640, доповненого антибіотиками і 5 95 ЕВ5 при 106 клітин/мл.

Мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМС) виділяють з гепаринізованої периферичної крові за допомогою центрифугування в градієнті щільності РісоїІ-Радие для використання як ефекторних клітин. Потім клітини-мішені (Т) змішують з ефекторними клітинами

РВМС (Е) у співвідношеннях Е/! 25:1, 10:11 ії 5:11 у 96б-лункових планшетах за наявності щонайменше одного антитіла анти-0ОЇ14 або контрольного антитіла. Контролі включають інкубацію окремо клітин-мішеней і окремо ефекторних клітин за наявності антитіла. Суміші клітин інкубують протягом 1-6 годин при 37 "С в 5 95 СО». Вивільнену лактатдегідрогеназу (І ОН), стабільний цитозольний фермент, що вивільняється при лізисі клітин, вимірюють потім за допомогою колориметричного аналізу (нерадіоактивний аналіз цитотоксичності СуотТох9б6;

Рготеда; Мадізоп, УМ). Збирають дані поглинання при 490 нм за допомогою загальноприйнятого 96-лункового зчитувача для планшетів і коректують за фоном. Відсоток специфічної цитотоксичности розраховують за формулою: 9 цитотоксичності - 100 х (експериментальне вивільнення ОН - спонтанне вивільнення ОН ефекторами - спонтанне вивільнення ІОН мішенями)/максимальне вивільнення ІОН мішенями - спонтанне вивільнення

Зо МОН мішенями). Таким чином визначають здатність антитіл анти-0ОЇ 14 опосередкувати антитілозалежну клітинну цитотоксичність.

Приклад 3: Запобігання зростанню пухлини іп мімо з використанням антитіл анти-О І 4

В даному прикладі описано використання антитіл проти 014 для запобігання зростанню пухлини в моделі ксенотрансплантату. В конкретних варіантах здійснення пухлинні клітини зі зразка від пацієнта (біоптату солідної пухлини або плеврального випоту), які пасирували як ксенотрансплантат у мишах, готують для повторного пасирування в експериментальних тваринах. Пухлинну тканину видаляють у стерильних умовах, розрізають на дрібні шматки, повністю подрібнюють з використанням стерильних лез і отримують суспензії окремих клітин за допомогою ферментативного розщеплювання й механічного руйнування. Зокрема, клітини плеврального випоту або отримані шматки пухлини змішують з ультрачистою колагеназою ІІІ в культуральному середовищі (200-250 одиниць колагенази на мл) і інкубують при 37 "С протягом 1-4 годин з піпетуванням вгору і вниз через 10-мл піпетку кожні 15-20 хвилин. Оброблені клітини фільтрують через 40-мкм нейлонову сітку, промивають забуференним сольовим розчином

Хенка (НВБЗ5), що містить 2 95 телячої сироватки після теплової інактивації (НІС5) і 25 мМ

НЕРЕЗ (рН 7,4). Потім дисоційовані пухлинні клітини ін'єктують підшкірно в жирові тіла молочної залози мишей МОБ/5СЕО, щоб викликати зростання пухлини.

У конкретних варіантах здійснення дисоційовані пухлинні клітини спочатку сортують на викликаючі утворення пухлини і невикликаючі утворення пухлини клітини на підставі маркерів поверхні клітин перед ін'єкцією експериментальним тваринам. Зокрема, пухлинні клітини, дисоційовані, як описано вище, двічі промивають забуференим Нере5 сольовим розчином (НВЗ5), що містить 2 95 телячу сироватку після теплової інактивації (НІС5), і ресуспендують до 105 клітин на 100 мкл. Додають антитіла, й клітини інкубують протягом 20 хвилин на льоду з подальшими двома промиваннями НВ5З5/2 95 НІС5. Антитіла включають анти-ЕБА (Мінепуї

Віоїтес, Айбигп, СА), анти-СО44, анти-СО24 і лінійні маркери анти-С0О2-СО03, -СО10, -С016, -

Сор18, -С031, -С064 і -СО01406 (разом позначені як І іп; ВО Віозсіепсе5, Зап Чщозе, СА). Антитіла безпосередньо кон'югують з флуорохромами для позитивного або негативного відбору клітин, експресуючих ці маркери. Клітини миші видаляють відбором проти клітин Н2ка»х і клітин СО45-- миші, і мертві клітини видаляють з використанням визначального життєздатність фарбника

БАРІ. Проточну цитометрию здійснюють на ГАСсСЗАГгіа (ВО Віозсіепсе5, Зап дозе, СА). Профілі бо бічного розсіяння і прямого розсіяння використовують для виключення кластерів клітин. Потім виділені клітини, що викликають утворення пухлини ЕБАж, СО44ж, СО24-/низький, І іп- ін'єктують підшкірно мишам МОБ/5СІЮ, щоб викликати зростання пухлини.

У конкретних варіантах здійснення антитіла проти 0114 аналізували за їхньою здатністю зменшувати зростання клітин пухлини ободової кишки ШМ-С4. Дисоційовані клітини 0М-С4А (10000 на тварину) ін'єктували підшкірно в ділянку правого боку мишей МОБ/ЗСІЮ у віці 6-8 тижнів. Через добу після ін'єкції пухлинних клітин тваринам ін'єктували внутрішньочеревинно (Мр.) 10 мг/кг антитіл 21М18 миші проти 0114 (п-5) або РВ5 (п-10) двічі на тиждень протягом перебігу експерименту. Зростання пухлини моніторували щонеділі, поки не детектували зростання, й після цієї точки зростання пухлини вимірювали двічі на тиждень протягом всього 8 тижнів. Обробка антитілом 21М18 зменшувала зростання пухлини на 54 95 в порівнянні з контролями після ін'єкції РВ5З (Фіг. 8).

Потім визначали здатність антитіл анти-О 4 впливати на проліферацію іп мімо. Виділяли пухлини ободової кишки С8 від тварин, оброблених антитілами 21М18 миші або контрольними антитілам, і експресію Кіб7, маркера проліферації клітин, визначали за допомогою імуноцитохімії. Зокрема, фіксовані формаліном, залиті в парафін пухлини нарізували на зрізи товщиною 4 мкм. Зрізи депарафінізували в ксилолі й регідратували у дістилюючій воді.

Імуногістохімію здійснювали згідно із загальноприйнятими способами. Коротко, зрізи занурювали в цитратний буфер (рН б) у водяній бані протягом 20 хвилин у камері проти спікання для вивільнення антигенів. Зрізи охолоджували протягом приблизно 45 хвилин і промивали в РВ5. Зрізи інкубували з пероксидом водню (Зідта-Аїагісй, Зі І оці5, МО) протягом 10 хвилин при кімнатній температурі для видалення ендогенної пероксидази перед додаванням первинного антитіла. Антитіла кроля проти Кіб/ людини (Месіог І арогайфогіе5 Іпс., Вигіпдате,

СА) в розведенні 1:50 в буфері для розведення (1 95 МН, 1 95 ВБА, 0,1 95 Тх-100, 0,05 95 Ммам3 в РВ5) додавали до кожного зрізу й інкубували протягом 1 години або протягом ночі при 4 "с.

Зрізи промивали тричі в буфері для промивання (желатин 10 95, Тх-100 10 95, в РВ5), кожного разу протягом 5 хвилин. Розчин вторинного антитіла проти антитіл кроля, кон'югованого з НКР (Іттргевзз апіі-Нарбії рге-аїшщей, Месіог І арогайгієз Іпс., Випіпдате, СА), наносили на стекла й інкубували протягом 30 хвилин. Після інтенсивного промивання в буфері для промивання додавали Месіог Мома Кеа (Уесіог І арогафгієз Іпс., Вигіпдате, СА). Стекла промивали водою,

Зо піддавали контрастному фарбуванню за допомогою гематоксиліну й заливали середовищем для постійної заливки (Месіатоцпі, Месіог Іарогафоге5 Іпс., Вигіпдате, СА). Обробка антитілами 21М18 миші анти-О1 І 4 зменшувала кількість клітин, експресуючих Кіб7, в порівнянні з пухлинами після контрольної обробки (Фіг. 9).

Приклад 4: Запобігання й лікування зростання пухлини іп мімо з використанням антитіл анти- рі 4 в комбінованій терапії

Антитіла проти 01 І--4 у поєднанні з фФторурацилом

У конкретних варіантах здійснення аналізували антитіла анти-0ОЇ/4 у поєднанні з хіміотерапією за здатністю зменшувати зростання клітин пухлини ободової кишки ОМ-С4 іп мімо.

Дисоційовані клітини ШМ-С4 (10000 на тварину) ін'єктували підшкірно в ділянку правого боку мишей МОБ/5СІЮ у віці 6-8 тижнів. Через добу після ін'єкції пухлинних клітин тваринам ін'єктували внутрішньочеревинно (і.р.) 10 мг/кг антитіл 21М18 миші анти-О1І 14 або РВЗ5 двічі на тиждень протягом перебігу експерименту за наявності або за відсутності супутнього лікування хіміотерапевтичним засобом антиметаболітом фторурацилом (5-Е), що вводиться один раз на тиждень. Зростання пухлини моніторували щонеділі, поки не детектували зростання, й після цієї точки зростання пухлини вимірювали двічі на тиждень протягом всього 8 тижнів. Обробка антитілами 21М18 миші анти-ОІ 4 у поєднанні з 5-ЕЮ зменшувала зростання пухлини більшою мірою, ніж кожна з обробок окремо (Фіг. 10).

Антитіла проти 01 І -4 у поєднанні з антитілами проти ЕСЕК або МЕСЕ

У конкретних варіантах здійснення антитіла анти-О1І І 4 тестували у поєднанні з антитілами проти рецептора ЕСЕ (ЕСЕК) за здатністю впливати на частоту придбання пухлини іп мімо.

Дисоційовані клітини ШМ-С4 (10000 на тварину) ін'єктували підшкірно в ділянку правого боку мишей МОБ/5СІЮ у віці 6-8 тижнів. Через добу після ін'єкції пухлинних клітин тваринам (п-10) ін'єктували внутрішньочеревинно (і.р.) 10 мг/кг антитіл 21М18 миші анти-ОЇ 4, антитіл проти

ЕСЕК, поєднання антитіл анти-0О/ 1/4 і проти ЕСЕК, або РВ5. Пухлини детектували в усіх тварин, оброблених антитілами анти-ОІ І 4 або проти ЕСЕБК, і в 9 з 10 контрольних тварин. На відміну від цього, лише 2 з 10 тварин, оброблених поєднанням антитіл анти-О1 І 4 і проти ЕСЕК, мали пухлини, що піддавалися детекції, через декілька тижнів після обробки (Фіг. 11). Більш того, обробка антитілами 21М18 миші анти-0/1/4 у поєднанні з антитілами проти ЕСЕК знижувала частоту утворення пухлин в порівнянні з кожною з обробок окремо (Фіг. 11).

У конкретних варіантах здійснення антитіла анти-ОІ І 4 тестували в поєднанні з антитілами проти рецептора ЕСЕ (ЕСЕК) за здатністю впливати на частоту придбання пухлини іп мімо.

Пухлинні клітини С17 імплантували мишам (п-10 на групу), і через дві доби починали обробку контрольним антитілом, 21М18 миші, антитілами проти МЕСЕ, або поєднанням обох антитіл.

Кожне антитіло дозували при 10 мг/кг, вводячи двічі на тиждень. Як 21М18, так і анти-МЕСЕ зменшували зростання пухлини, й поєднання було ефективнішим, ніж кожне з антитіл окремо (Фіг. 18).

Антитіла проти ОІ І--4 у поєднанні з іринотеканом

У конкретних варіантах здійснення антитіла проти 0114 тестували у поєднанні з хіміотерапевтичним засобом іринотеканом. У деяких варіантах здійснення дисоційовані пухлинні клітини ОМР-С8 (10000 на тварину) ін'єккгували підшкірно в ділянку правого боку мишей МОБ/5СІЮ у віці 6-8 тижнів. Через добу після ін'єкції пухлинних клітин тваринам ін'єктгували внутрішньочеревинно (ір.) 10 мг/кг антитіл 21МІ8 миші проти 01/14 або контрольного антитіла двічі на тиждень протягом перебігу експерименту за наявності або за відсутності супутнього лікування хіміотерапевтичним засобом іринотеканом, що вводиться один раз на тиждень в дозі 7,5 мг/кг. Зростання пухлини моніторували щонеділі, поки не детектували зростання, й після цієї точки зростання пухлини вимірювали двічі на тиждень. Обробка антитілами 21М18 проти 01/14 у поєднанні з іринотеканом зменшувала зростання пухлини більшою мірою, ніж кожна з обробок окремо (Фіг. 12А). Крім того, тоді як зростання пухлини продовжувалося або посилювалося в більшості тварин після припинення щотижневої обробки 7,5 мг/кг одного іринотекану, поєднання 10 мг/кг, двічі на тиждень, 21М18 проти ОГ 4 їі 7,5мг/кг іринотекану один раз на тиждень запобігало подальшому зростанню пухлини ободової кишки після припинення обробки на добу 56 протягом більш ніж п'яти тижнів (Фіг. 13).

У конкретних варіантах здійснення гуманізовані антитіла Н712 21М18 проти 01 | 4 тестували в поєднанні з іринотеканом. У деяких варіантах здійснення дисоційовані пухлинні клітини С8 (10000 на тварину) ін'єктували підшкірно в ділянку правого боку мишей МОБ/ЗСІЮ у віці 6-8 тижнів. Через добу після ін'єкції пухлинних клітин тваринам ін'єктували внутрішньочеревинно (М р.) 10 мг/кг гуманізованих антитіл 21М18 проти 01 4, мишачих антитіл 21М18 або контрольних антитіл двічі на тиждень протягом перебігу експерименту за наявності або за відсутності

Зо супутнього лікування хіміотерапевтичним засобом іринотеканом, що вводиться один раз на тиждень в дозі 7,5 мг/кг. Зростання пухлини моніторували щонеділі, поки не детектували зростання, й після цієї точки зростання пухлини вимірювали двічі на тиждень. Для обробки гуманізованими антитілами 21М18 проти 0114 у поєднанні з іринотеканом показали ефективність проти зростання пухлини, схожу з ефективністю 21М18 миші (Фіг. 128).

У деяких варіантах здійснення комбіновану терапію 21М18 миші анти-О1 1 4 і іринотеканом використовували для лікування пухлин ободової кишки, що прижилися. Дисоційовані клітини С8 (10000 на тварину) ін'єктували підшкірно в ділянку правого боку мишей МОБ/ЗСІЮ у віці 6-8 тижнів. Коли ін'єктовані клітини утворювали пухлини приблизно 60 мм, починали лікування.

Тварину ін'єктували внутрішньочеревинно (і.р.) 10 мг/кг антитіл 21М18 миші анти-О1 | 4 або контрольних антитіл двічі на тиждень протягом перебігу експерименту за наявності або за відсутності супутнього лікування хіміотерапевтичним засобом іринотеканом, що вводиться один раз на тиждень у дозі 7,5 мг/кг. Обробка антитілами 21М18 миші анти-ОЇ/ 14 у поєднанні з іринотеканом зменшувала зростання пухлин ободової кишки, що прижилися, більшою мірою, ніж кожна з обробок окремо (Фіг. 14).

У деяких варіантах здійснення комбінована терапія з подальшою обробкою антитілом затримувала рецидив пухлини. Дисоційовані клітини С8 (10000 на тварину) ін'єктували підшкірно в ділянку правого боку мишей МОБ/ЗСІЮО у віці 6-8 тижнів. Коли ін'єктовані клітини утворювали пухлини приблизно 150 мм, починали обробку. Тварині вводили внутрішньочеревинно (і.р.) 10 мг/кг 21М18 миші анти-ОЇ 4 або контрольних антитіл двічі на тиждень у поєднанні з іринотеканом при 7,5 мг/кг один раз на тиждень всього протягом 32 діб.

Потім комбіновану обробку припиняли, і тварин обробляли 21М18 анти-ОІ І 4 або контрольних антитіл протягом залишку експерименту. Обробка антитілами 21М18 анти-О01//4 після комбінованої терапії значно затримувала рецидив зростання пухлини в порівнянні з тваринами після контрольної обробки (Фіг. 16). Показаний також об'єм індивідуальних пухлин на добу 47 після зупинки обробки іринотеканом (Фіг. 17).

Ірінотекан підсилює зменшення частоти ракових стволових клітин антитілом бі І -4

У конкретних варіантах здійснення здатність антитіл 21М18 анти-0О/14, окремо або в поєднанні з іринотеканом, зменшувати частоту ракових стволових клітин визначали з використанням аналізу лімітуючих розведень. Пухлини ободової кишки С8 від мишей, 60 оброблених або контрольними антитілами, або антитілами 21М18 миші анти-О1 4,

іринотеканом або антитілами 21М18 миші анти-ОЇ 14 у поєднанні з іринотеканом, як описано вище, виділяли після 38 діб обробки. Виділені пухлини (п-3 на експериментальну групу) обробляли, як описано нижче. Пухлини видаляли й подрібнювали з використанням стерильного леза. Для одержання суспензій окремих клітин розчин для обробки, що містить колагеназу/ гіалуронідазу:диспазу (1:18 з 10Х), в середовищі МЕВМ (Сатбргех, Еазі Киїйетгога, МУ) з

Днказою І в розведенні 1:100 (М/огіпіпдіоп, І акежмоса, МУ), змішували з суспензією пухлини й інкубували протягом 1 год. при 37 "С. Клітини центрифугували й ресуспендували в 1 мл середовища АСК (0,15 М МНеСІ, 10 мМ КНСО», 0,1 мм МагЕДТА у дистильованій воді) на льоду протягом 2 хвилин для видалення еритроцитів. Клітини центрифугували й ресуспендували в концентрації 1 х 107 клітин/мл у буфері для ГАС5 і потім інкубували з біотинільованими антитілами миші (проти СО45 миші-біотин у розведенні 1:200 і антитіло щура проти НЬкКа миші- біотин у розведенні 1:100, Віої едепа, Зап Оієдо, СА) на льоду протягом 30 хвилин з подальшим додаванням магнітних намистин із стрептавідином (Іпмігодеп, Сагізрадй, СА) для видалення клітин миші. Клітини людини, що залишилися в суспензії, збирали, підраховували й розводили до бажаної концентрації для подальшого використання. Потім серійні розведення клітин людини повторно ін'єктували мишам з імунною недостатністю. Зокрема, мишам ін'єктували 900, 300, 100 або 50 виділених пухлинних клітин людини в ділянку правого боку (п-10 на групу). Об'єм пухлини оцінювали двічі на тиждень.

Після завершення дослідження на добу 81 відсоток мишей з пухлинами, що піддаються детекції, знижувалося в усіх групах після ін'єкції пухлинних клітин, оброблених антитілом 21М18 анти-ОЇ 14, ії навіть більше знижувався для оброблених 21М18 анти-ОІ | 4-іринотеканом пухлинних клітин у порівнянні з клітинами після контрольної обробки або обробки одним іринотеканом (Фіг. 15А). З використанням цих частот утворення пухлин розраховували частоту стволових клітин з використанням статистики Пуассона, представленої в програмному забезпеченні ІЇ-Саїстм (доступному для завантаження З пЕрулммли.в5іе тсеїЇ.сот/зеагсп/детаишКазр). Коротко, на підставі статистики розподілу Пуассона, точно одна стволова клітина існує серед відомої кількості ін'єктованих клітин, якщо в 37 9о тварин не можуть розвинутися пухлини. Обробка пухлин одним іринотеканом збільшувала кількість ракових стволових клітин від 1:93 в пухлинах після контрольної обробки до 1:82. На

Зо відміну від цього, антитіла анти-О/ І 4 зменшували частоту ракових стволових клітин від 1:93 в пухлинах після контрольної обробки до 1:238 в оброблених антитілом анти-О1 | 4 пухлинах і до 1:573 в пухлинних клітинах після комбінованої обробки 21М18 анти-О1 | 4 - іринотеканом (Фіг. 158).

Приклад 5: Обробка пухлин іп мімо з використанням антитіла анти-ОІ І 4

В даному прикладі описано використання гуманізованих антитіл 21М18 проти 01/14 для лікування раку в моделі ксенотрансплантату. В конкретних варіантах здійснення пухлинні клітини із зразка від пацієнта (біоптату солідної пухлини або плеврального випоту), які пасирували як ксенотрансплантат у мишах, готують для повторного пасирування в експериментальних тваринах. Пухлинну тканину видаляють, розрізають на дрібні шматки, повністю подрібнюють з використанням стерильних лез і отримують суспензії окремих клітин за допомогою ферментативного розщеплювання й механічного руйнування. Потім дисоційовані пухлинні клітини ін'єктують підшкірно мишам МОБ/ЗСІЮ, щоб викликати зростання пухлини, або в жирові тіла молочної залози, для пухлин молочної залози, або в бік, для пухлин, що не стосуються молочної залози. Альтернативно виділяють і ін'єктують пухлинні клітини, що викликають утворення пухлин, ЕБА, СО444, СО24-/низький, І іп-, як детально описано нижче.

Після ін'єкції пухлинних клітин у тварин моніторять зростання пухлин. Після того, як пухлини досягають середнього розміру приблизно 100 мм3, починають обробку антитілом. Кожній тварині вводять 100 мкг гуманізованих антитіл 21М18 анти-ОІ | 4 або контрольних антитіл і.р. від двох до п'яти разів на тиждень протягом всього б тижнів. Розмір пухлини оцінювали двічі на тиждень протягом цих 6 тижнів. Таким чином визначають здатність гуманізованих антитіл анти- рі4 запобігати подальшому зростанню пухлини або зменшувати розмір пухлини в порівнянні з контрольними антитілами.

У кінцевій точці обробки антитілом пухлини збирають для подальшого аналізу. У деяких варіантах здійснення частину пухлини аналізують за допомогою імунофлуоресценції для оцінки проникнення антитіла в пухлину й відповіді пухлини. Частина кожної зібраної пухлини від мишей, оброблених анти-01 4 і оброблених контрольним антитілом, заморожують свіжими в рідкому азоті, заливають в О0.С.Т. і нарізають у кріостаті на зрізи 10 мкм на предметні стекла. У деяких варіантах здійснення частину кожної пухлини фіксують формаліном, заливають у парафін і нарізають на мікротомі на зрізи 10 мкм на предметні стекла. Потім зрізи фіксують і бо інкубують з міченими хромофором антитілами, що специфічно впізнають ін'єктовані антитіла,

для детекції антитіл проти рецептора І | 4 або контрольних антитіл, наявних у біоптаті пухлині.

Більш того, антитіла, що детектують різні типи пухлинних клітин і клітин, що рекрутуються в пухлину, наприклад, такі як антитіла проти МЕ кадгерину (СО144) або проти РЕСАМ-1 (СО31) для детекції клітин ендотелію судин, антитіла проти альфі-актину гладких м'язів для детекції гладком'язових клітин судин, антитіла проти Кіб7 для детекції проліферуючих клітин, аналізу

ТИМЕ!/!. для детекції вмираючих клітин, антитіла проти фрагмента внутріклітинного домена (ІСО)

Моїсі! для детекції передачі сигналів Моїсй, можна використовувати для оцінки ефектів обробки антитілом, наприклад, на ангіогенез, зростання пухлини й морфологію пухлини.

У конкретних варіантах здійснення оцінюють також ефект обробки гуманізованим антитілом проти 0114 на експресію генів пухлинних клітин. Тотальну РНК виділяють з частини кожної зібраної пухлини з оброблених антитілом проти 0/14 і оброблених контрольним антитілом мишей і використовують для кількісної КТ-ПЦР. Аналізують рівні експресії 014, рецепторів

Моїс, компонентів шляху передачі сигналів Моїсп, так само як додаткових ідентифікованих раніше маркерів ракових стволових клітин (наприклад, СО44) відносно гена домашнього господарства САРОН як внутрішнього контролю. Таким чином визначають зміни експресії генів у пухлинних клітинах після обробки антитілом проти І І 4.

Крім того, оцінюють ефект обробки антитілом проти 014 на наявність ракових стволових клітин у пухлині. Зразки пухлини від мишей, оброблених антитілом проти 0114 в порівнянні з контрольним антитілом, нарізають на дрібні шматки, повністю подрібнюють з використанням стерильних лез і отримують суспензії окремих клітин за допомогою ферментативного розщеплювання й механічного руйнування. Потім дисоційовані пухлинні клітини аналізують за допомогою аналізу ЕАС5 за наявністю ракових стволових клітин, що викликають утворення пухлини, на підставі експресії маркерів поверхні клітин ЕБАж, СО44ж, СО24-/низький, І іп-, як детально описано вище.

Потім можна оцінювати здатність викликати утворення пухлини для клітин, виділених на підставі експресії ЕБАхю, СО44, СО24-/низький, І іп- після обробки антитілом проти БІ І 4. Ракові стволові клітини ЕБАж, СО44, СО24-/низький, Гіп-, виділені з мишей, оброблених антитілом проти ОЇ Г4 в порівнянні з контрольним антитілом, повторно ін'єктують підшкірно в жирові тіла молочної залози мишей МОБ/ЗСІЮ. Потім визначають здатність викликати утворення пухлини для ракових стволових клітин на підставі кількості ін'єктованих клітин, необхідних для надійного утворення пухлини.

Приклад 6: Лікування раку людини з використанням гуманізованих антитіл проти ОГ І 4

В даному прикладі описані способи лікування раку з використанням гуманізованих антитіл проти 0/4 для націлювання на пухлини, що містять ракові стволові клітини й/або пухлинні клітини, в яких детектована експресія рецептора Моїсіп або ліганда рецептора Моїсп. Наявність експресії маркера ракової стволової клітини можна спочатку визначити за біоптатом пухлини.

Пухлинні клітини з біоптату пацієнта з діагнозом рак відбирають у стерильних умовах. У деяких варіантах здійснення біоптат тканини заморожують свіжим у рідкому азоті, заливають в О.С.Т. їі нарізають у кріостаті на зрізи 10 мкм на предметні стекла. В деяких варіантах здійснення біоптат тканини фіксують формаліном, заливають у парафін і нарізають на мікротомі на зрізи 10 мкм на предметні стекла. Зрізи інкубують з антитілами проти ОІ / 4 для детекції експресії білка.

Можна також визначати присутність ракових стволових клітин. Зразки біоптату тканини нарізають на дрібні шматки, повністю подрібнюють з використанням стерильних лез і піддають клітини ферментативному розщеплюванню й механічному руйнуванню для одержання суспензії окремих клітин. Потім дисоційовані пухлинні клітини інкубують з антитілами проти -ЕБА-СО44, -

СО24, -Ііп ії -0 1.4 для детекції ракових стволових клітин, і наявність стволових клітин пухлини

ЕБАч, СО44, СО24-/низький, Гіп-, 0 4-4 визначають за допомогою поточної цитометрії, як детально описано вище.

Пацієнтів, пухлини яких діагностовані як експресуючі рецептор Моїсп або ліганд рецептора

Моїсп, лікують гуманізованими антитілами проти 0/4. У конкретних варіантах здійснення гуманізовані антитіла проти 0114, отримані, як описано вище, очищають і складають з придатним фармацевтичним носієм для ін'єкції. У деяких варіантах здійснення пацієнтів лікують антитілами проти 0114, щонайменше, один раз на місяць протягом щонайменше 10 тижнів. У деяких варіантах здійснення пацієнтів лікують антитілами проти 0/4, щонайменше один раз на тиждень протягом щонайменше приблизно 14 тижнів. Кожне введення антитіла має складати фармацевтично ефективну дозу. В деяких варіантах здійснення вводять від приблизно 2 до приблизно 100 мг/мл антитіла проти ОІ | 4. У деяких варіантах здійснення вводять від приблизно 5 до приблизно 40 мг/мл антитіла проти 0/4. Антитіло можна вводити до, під час або після загальноприйнятих режимів радіотерапії або хіміотерапії з використанням одного або декількох бо хіміотерапевтичним засобів, як-от оксаліплатин, фторурацил, лейковорин або стрептозоцин.

Пацієнтів моніторять, щоб визначити, чи приводить таке лікування до відповіді проти пухлини, наприклад, на підставі регресії пухлини, зниження частоти виникнення нових пухлин, нижчої експресії пухлинного антигена, зменшення кількостей ракових стволових клітин або інших способів оцінки прогнозу захворювання.

Інші варіанти здійснення винаходу будуть очевидними фахівцям у даній галузі з огляду на опис й практичне здійснення винаходу, описаних тут. Мають на увазі, що опис й приклади розглядають лише як ілюстративні, де дійсний обсяг і суть винаходу вказані у викладеній нижче формулі винаходу. Повний уміст публікацій, патентів і патентних заявок, процитованих тут, наведений в описі як посилання.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

ЗЕСНО МО: 14СОВ важкого панцюга)

ТАН

БЕСНО МО: 240042 важкого ланцюга, Не)

УВСУМОАТМУМОКЕКОИ

БЕСНО МО: З(СОМУ важкого ланцюга ІН)

УБВУМОАТМУМОКЕКО

5ЕСНІНМСК А (ООН важкого ланцюга На)

МОМ МСЗАТМУМОКККО

БЕСЛЮНМО: СОКУ важкого панцюга) во уМОу

ВЕСНОЮ МО: 6 (Варіабельна ділянка важкого панцюга, Ме)

СМОЇ ОВО КР ОАВУКІВОКАВОМЗЕ ТАТИ УК ОАР ОВО ВАЛОМ СУМОАТМУМОКЕКОВУТЕТТОТВ

ТВТАУМЕКЗВОНИМ ААУ КУ САВОХОТ ОСС ИОСОТЬИТУа

ЯЕСИСНМО: 7 (Варіабельна ділянка важкого панцюга.

ОСМОЇ УОБОАЕУККРОАЗУКІВСКАВОУВЕТАУ НИ КІЗАРОСССЕМ ОВ УМСАТМУМОКЕКОВУТЕТТОТУ

ТУТАУМЕ КВК АУТУСАКСОУОУ ОЮУСМОТ УСТ УТ У Є

БОЮ МО: 8 (Варіабельна діпвнка важкого паншюга, МОЇ

ОМОЇ УОЗСАК УКВ ОВ УКІВСКАВО У ВЕ ТА УТ УКОАВОСОС ЕТЛО УМА ТМУМОКЕКОВУТЕТТОТВ

ТТАУМЕ БІК ВОЮТАЧТУУСАНОХОТЮУОМО МУ СсІСТ УГА

ЗО МО: 9 (СО легкого панцшена)

КАВЕВАУЧУСІЗЕМЕ.

ЗО О МО: 104 СОКО легкого панцюга)

ААСЧОСЬе

БЕСИСЕНМО 1 (СОКУ легкого ланцюга)

ОСБКЕУРИУТКОС:

ЗВО ОМ: 12 (Варіабельна ділянка легкого панцюга)

ОІММ ТОБОЮ АУВІСЕКАТПОСВАВЕВМОМУЄСІВК МКУ ООКАЕСОРРКИ ІХАЛЕМОСеОУРОВЕ ОБОВ ток ТЕТБЗалЕВУАЛУЄТЄСООВКЕУТРА ТВОВИТКУЄВІ

БЕСНЕМО: 13 (Послідовність нуклевтидів важкого панцюга, На; варлабенльна ділянка)

АТОБАСТОСАЮЄТОВАОЮСАТОСТОТТОСТВОТОСТОСТОСТАСАСОЛОСТОАСТОССАВОТТСАОСТОСТОСАЄ

ТСТООАВСТОАОВТОДАСААВССТОВООСТАОСОТОААВАТСАОСТОСАВОССТАВОСОАТАЄСТОСТТТАСАССТ

ТАСТАСАТОСАСТО ВО ТОЛАВСАВОССССТОСАСААСООСТОДАЮТОВАТОСОВАТАТА ТСАВСТОТ ТАСАДОСОА

ЗСТАСААДАСТАСААСОДО ДАВ ТТОСААВОМСАВОСТСАССТТСАСААСАВАСАСЛАССАОСААСВСАСАОССТАСАТО

ВАВСТОДОСАВОСТВЗАВААВСВАССАСАСАВССОТ ОТАСТАСТОТОСТАВОВАСТАСОАСТАСВАСОТОВОВАТО

ЗАСТАСТОВОВССАЛОСААСССТОВТСАСОВТСАОСТСА

ЗО МО: 14 Послідовність нуклеотидів важкого ланцюга, НЯ варіавельна ділянка)

АТОСАСТОСАССТОВАССАТОСТОТТОСТОВТОВСТаСТОСТАСАВОАОСТСАСТОССАВОТТОАОСТОВТОСАЄ

ТСТОВАВСТОАВОТОЛАВАДОССТИОВОСТАВОССТОДЛАВАТСАОСТОСЛАВОСТАВСОСАТАСТОСТТТАСАВСТ

ТАСПАСАТОСАСТООСТОААОСАОВОСОЮЄТООАСАЛОВОСТООАОЮТОВАТОВОАТАТАТСАВСТОСТАСААЛОСОА

ОСТАСАААСТАСААОСАВААСТ ТОААСМЮСАВОВТСАССТТСАСДАСАВАСАСААСКАСВАОСАСАСССТАСАТОЮА

ВСТОАОБАВОСТОАОЛАВСОАСОАСАСАВОСОТСТАСТАСТО ТОСТАВОСВАСТАСВАСТАССАСОСТОВОВАТО

ВАСТАСТОВОВССЛАВОААСОСТОВ САС ТСАОСТОА

5ЕОИОЮ МО: 154 Послідовність нуклеотидів важкого панцюга, НО)

АТОБАСТІВАЄСТОСАОСАТОСТОТ ТСТОВТООСТОСТОСТАСАВОАОСТОАСТООСАВОТТСАССТОСТОСАВ

ТетЗадастТОАаОТаДАВААССТОВО СТАС ВААВАТСАВСТОСААООСТАВСОВАТАСТОСТТТАСАВСТ

ТАСТАСАТОСАСТО ВО ТОААВСАВОСЮССТОВАСАЛОВОСТОВАВТОВАТСООЗАТАТАТОАОСИТСТАСААСОВА

ОСТАСАДАСТАСААССАВААОТТСААВОССАО ОСИ ТСЛОСТТСАСААСАСАСАСЛАССАСАЛОСАСАВОСТАСАТО

ВАЙСТОАВОАВССТОАВААОСОВАСОАСАСАВОСОТОТАСТАЄТОТОСТАВОВАСТАСОАСТАССАСОТОВОСА

ТО БАСТАСТОВОВССААОВААСОСТОВ ТСАССОТСАЮСТСА

ЗО МО: ТБ Послідаеність нуклеотидів легкого панцюга)

АТОВТОСТОСАСАСССАВСТОТТОАТТТСССТОСТОСТСТОСАТОЛОСОВАОССТАСОВОВАСАТОСТІЗАТОАОС

САОТОСОСТОАСТОССТООСТОТОТ ОС ТОВ СВАВАОВООВССАССАТИ ПТО САСАВССАВСОААТОСИ ТОК

ААТТАТОССАТТТССТТ М ОАЛОТОЮТТ ССАОСАВАЛАССАОВАСЛИОССТОСТААОСТОСТСАТТТАОЮСТОСА

ТОСААССААООВО ТОССИССТОССТОДСАОВ ПОТ ОССИССАОВСОССТ СОВОААСАЦАТТТСАСТ САСТАТСАОЄ

АБССТОСАВОСТОДЛАСВАТОТООСТО ТОСТАТТАСТОТСАВСААЛОСААСОЮАОСТОССТТОСАСАТТСООСАСОАОСО

АССАЛОСТОСАДАТСАААССТАСЄТЮ ТОВСТІ СОСССТОСОТСТТОАТСТТОССОСССАОССАТОЛОСАССТОЛАА

АСОСПІОСАСТОССЛОСО ТОСТИ ТОССТОСТОЛАТААСТТОТАТОСООБОБАВООСАААВТОСАЮТОСААСОТОСАТ

ВАСОССОСТОСАААВСООСААСТ ОСА ОДОСВОЮЮ ГПСАСАВАВОСАОДАСАО САЛО ВАСАОСАО ТАС

АВСАСССТОВАСССТОАОСАЛАВССОАСТАСЗАВАЛАСАСАААВТСТАСОССТОСВЗАЛОТСАСССАТСАВОВОСТО

АОСАСОСОСОТСАОАААВАВЮТТОДАСАОВСОВОСАВТОТТОА

ЗЕСИСУ МО: 17 (Послідовність-нуклевотидів СЗТ важкого панцюга)

АСАВСТТАСТАСАТОСАС

5ЕСНЮ МО: ТВ (Послідовність нуклеотидів СОМ важкого панцюга, На)

АТАТСАОСТОТТАСААСООАОСТАСАВАСТАСААССАСААСТТСААОВОС

СИС НМО: 19 Послідовність нуклеютидів СІНО важкого панцюга, НА

АТАТСАОСТОСТАСААСОВАССТАСАЛАСТАСААССАВААВТТОААВООС

5ЕСТЮ МО: 20 (Послідовність нуклевтидів СО важкого ланцюга СЮМКО, НО)

АТАТСАВСОТОТАСААСООАБСТАСАААСТАСААССЛОААВТТСвАСВОС

ЕС МОГ «(Послідовність нуклеотидів СОКУ важкого ланцюга)

АООЛВАСТАСЄЗАЄСТАСОАСІ ПІЗООАТОСАСТАХ

БЕСНО МО:29 (Послідовність нуклеотидів СК легкого ланцюги)

АВБАВССАВСОААТОСОТОСОАТААТТАТОВСА ТТ ССТТАТОДАВ

ЗББИНО МО: 23 (Поспідовність нуклеотидів СОМКО пегкого панцюга)

ОСТОСАТОСААССАДОВОТОЄ

ЗЕСНЮ МО: 24 (Послідовність нуклестидів СОКЗ легкого панцюга)

САПСАЛАВСАЛОВАВОТОССТТОВАСАТТСОвАОСА

ВЕСНОЮ МОСК 25 Антитен ТЛ. 4 пюдини)

МАААБКВАЗСМАЦАЛ УАЛМСЧИНААСЗБВУВОКО ОЄРІМЕ КОМ АЗОВРСЕВОСАТЕЕКУСЬКИРОА

МУБРІЕРСТЕСТУВТЕУ,ВТМОЕАУНООВВООБИМЕСОСРЕМЕ ПУВОТЕЗЛЕ АТ НАВСООІНЕЕАКРРО

АСВКІЛІССЮВЬУОМУА ЛІ ОБОВ ПОТУ КУСОК КОККАМОНЕСНИУОЧеОСМ

СОСЬРОМУ ТО СОСОРІС ЯЗ СНЕОМОУСВКРАЄСЬСТЬ СМ ОСТ ОМ СІ НМ ОСНО ТОВТРИ

ЕМО КОООГ МУТНІ РОКНОАТОВНВ ОВО СТСВРО ТО МОСКЕСЗЕСОБМЕСВМООВОК

ВОБОСТНС СРО КУ МСЕНЯТЯСАВЕРОК МИОВОКЕНМОВАМУАСЕСТРМЕ ПЗВМСЕККУЮВСТВ

МеСсАМОВОСЬМАОВАМОСВСАВО КТ ОТ УСЕСНУВОСАНУЕСАНОВЗТСНІЙ ЄМОЦМСТОРАСЕБОВНО

КУНТЯІВАСАВВРСЕМКАТОУ ПАТ ОТЕМОМСР УВК УЯВСЕЕРУЄ

ЗО НО МО В іДдомен СЕ. СТ людини)

ЛОБ ОТЕТТВКУБУВУ ЄВИ ОЗ ОСА СИЧ У УС МОУ МЖК

ЗКСОНО МОХ 27 пченінцєва ділянка СОЯ водяна)

МАЛАВВОАСУУ А ОА БОКОВИМ АВОКРСЕ РОСТЕ НИ КНКОХ

АЗОВ ЧУ МТУ МІК АМОСОВА БМЕТУВЕСТ КВ ПЕДА РЕАК О

АМВКІАЮВОВЬАУСНОМ

Claims (13)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Антитіло, що специфічно зв'язує ОІ І 4 людини, яке являє собою: (а) антитіло 21М18 Н7І2, кодоване плазмідою, депонованою в АТСС під номером депозиту РТА-8425, (б) антитіло 21М18 НеОІ2, кодоване плазмідою, депонованою в АТСС під номером депозиту РТА-8427, або (в) моноклональне антитіло, що включає - варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотні послідовності СОК: СОКІ1, СОР2 та СОКЗ, де: СОМ є 5БЕО ІЮ МО: 1, СО2 є ЗЕО ІЮ МО: 3, ЗЕО ІЮ МО: 2 або ЗЕО ІЮ МО: 4, та СОМКЗ є 5ЕО ІЮО МО: 5; та - варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотні послідовності СОК: СОКІ1, СОР2 та СОКЗ, де: СОМ є 5ЕО ІЮ МО: 9, СОКО2 є БЕО ІЮО МО: 10, та СОМЗ є 5ЕО ІЮ МО: 11.

2. Антитіло за п. 1(в), де СОК2 важкого ланцюга є 5ЕО ІЮ МО: 3.

3. Антитіло за п. 2, де антитіло включає: (а) варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має принаймні 90 95 ідентичність послідовності з ЗБОЮ МО: 7, та р) варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має принаймні 90 95 ідентичність послідовності з ЗЕО І МО: 12.

4. Антитіло за п. 1(в), де амінокислотна послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга являє собою 5ЕО ІЮ МО: 7, 5ЕО ІЮ МО: 6 або 5ЕО ІО МО: 8 та амінокислотна послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга являє собою ЗЕО ІЮ МО: 12. Зо

5. Антитіло за п. 4, що включає варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 7, та варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 12.

6. Антитіло за будь-яким з пп. 1(в)-5, де антитіло являє собою гуманізоване антитіло.

7. Ізольований полінуклеотид, що кодує поліпептид, що містить антитіло відповідно до будь- якого з пп. 1-6.

8. Ізольований полінуклеотид, який являє собою плазміду, депоновану в АТСС під номером депозиту РТА-8425 або РТА-8427.

9. Гібридома, що секретує антитіло 21М18, депонована в АТСС 28 вересня 2007 р. і що має номер депозиту в АТСС РТА-8670.

10. Фармацевтична композиція, що включає антитіло за будь-яким з пп. 1-6 та фармацевтично прийнятний носій.

11. Застосування антитіла відповідно до будь-якого з пп. 1-6 для лікування раку.

12. Застосування за п. 11, де лікування раку включає введення антитіла та другого терапевтичного агента.

13. Застосування антитіла відповідно до будь-якого з пп. 1-6 для виготовлення лікарського засобу для лікування раку.

рвана кекс кість пені п нн В ї і | ! ! і ! : Н Н я Н ! | ! ! ї і Н й : : ; Же Му ї КА і : хв щи ХЕ ї х. хо ЖИ К, ї роми лм КК ше ше і гуд Ме "бук З ЇВ бо МОВ і Вб 0, пек о те я кі СЕ В АН ; ; Кі кози М СОВА Кк й Н Мі у ат М ! гЯ хі Вк Кок и и ДА НН з Кі М КО оо ї х що ОНИ КК ше ин с м НН Ши с в і Ея у о ТК Сех Б ї З МІ АХ ДОМА УК кт З Зх - КВ сх о он СІМ ї хх кої сс Ме х . М я ЕВ І : Ко вв УМ т і Е я АТЗ СЕУ ОК х З А х ЧИ кк» ж Ба ПУХУ ке ЗУ хх Б Кая 1 КУ Вх Жах хх т г, 7 г ке ж. Ко Ба ї т ОК : Н и АННИ - Е а ач У ж І: і Жах 7 ї Н ще -ї 2 Н вох В з ІЗ БЖ Як Е БО " Н у х Н Її 1 нн нн и Мито Х боемщкужюмх Укрк й серете

ЖУК. охо» УК жееюноф специфічне зв'язування знтити АТМ зна з нативзним Віл певержні кунтян СЯ

ФГ.

і: «ех пен нн нн п а и не ; : ї деететеі сті осек ст нян тн кктіттінккктт ке ААМККАКААНЯ, ія Я "Я Р х і га й еннннненнн вин Е О збе: НН : : Щі Мод їі ох | І Е ї ЗХ МКК У УЮ клі ХУ І і ОКХ й ОО : ї ГУ ї З Шосе М я І З ; 1 їж б, те Х маже а ам іх і нх Ш Щ і і І ви Б і ЖЕ х ї і "Ж важ ї і ї Н В Зо.

ІЗ і і і і із | Я о Може з кам І БМ 1 7 з І Туя пеннЯю ї НЕ: ! Я З х не ВАВ Н ее В ї ! Я І З З Е А ЗЕ У |! : і: х : З З МОЖЕ в АВ ХА ЗЕ Н Е і ї м М Хооосодююююююю хх кА АХА АААКАА КА АК ААААК КАЖАН шк З в і в ШЕ ЕН З 1 5 Я У ії; «Ж 5 3 САН Зм, Мая -ї х «КВК о ІЗ З. «х оо 0 КУ БЕ Будем кож - т кити и Ех зе ГОЛОВКИ ІЯ Я Ж мед ТУБННЕЧИЙ Я З ще се Х У й х ч НУ ЩЕ З я я Ка й КН я я З я В ких ЕВ) 5 ЩЕ Ж зі СУЯ : З ЕХ КЕ с КЗ КЕ іеннаі МВ й тм ах ту утри о У ЗК» скаже антитіла зт блокують ВЗН НЕ людини здвецевторем ВЕНсй ФІГУ ; хо

В. З З «Кк: т У кю юю я тю кю вв ж вв Ж Кк тк тт тт у ут лю мя ! піку ч«д ї «френч еуютжтуд пен под тннн пос ОО вним КЕН, Н о з. ок п хі М рн ти ІЗ до їх х я НН о ще У Е х м о и ВХ хх ! то ОККО ОЗ ох х КУ нн п. шо НО Я Ї Ж дві СО 5 (ЩЕ Вова ФюЮюФ( (Ю Й Е ! о. М. ДО кн КК ЗО ! Га і ОН В Ве В В бок : ОО ОЗ З ОО І т ВВ ин С КИ КВ им АК МОВАХ Н с. ! клю ОО с я що З АВ ХНН і і 53 00 Шин 0000 х : Ох СКК ння НК НН ОКО МКМ В СОКУ МНЕ Н Валютні | ВАК о ОО и Ве ОО Н зак: пінні пнекекжтценкх КЕН о КОКО ОО: жк, ГУ сохккню кр ХОМ о : ДМ пуск З пиво І ее ккАКкккАях, оо КВУ Н ХМК соя СК юю юнак лан МКМ МНК ТЕ фл ВО ВО ПЕВ З КМ В С о КОМ ! СЕ не ММК КМ, НИ ОК с і погеєєтужнт я МВВ МО ККУ : зм Що «УК ЩА ЖУК діа Їж Вас і і З Та Н Н Н : і Кже 7 : Н Н Н : Н Іво оку ща СУК КУ долини Картування егнталів ветити прати ОМ УВаНнНЯя еп анти тЕ прати С а

ВГ.

ях щ ке; У І; І Ж «З Кк Же У ск ; З й - їх в с 5 Ж що Ж ка «Же Їх я Вооше Мо З в З ше ше; З Ме г ях Кк Ще З» 3 ях Кз ЕК. Ж Я Ж їх ХХ ож Н х ко Є х ех в Б свв зак ше кан ше Ше А ОО Ом 7 мк Ж ву 5 ее : Гак тех І 3 дю ш що М Ж - МОЖ Що 8» ко -к Фа че с Х В в во же ж ши и Ше: уж х г я у с т МА - х ск -оОх ве хе є хі і с ще Ь 23 ТЗ ие и Ви А А ав в шо ок М Ок Ж в Фо і ; ре З їх 5 х С се и и я ж ше бу Я зх З «їх дк З Кен х Нися Зк В з ж ШЕ - в Ж ще те т дк с му М дк ка -- ж ши ше ши и ен Б, їй Б о и Як т Щі НВ Ше: в м из чн ни г п о и х с КУ чих Й У КН НК : ще ОО КК КК ОХ КК ХХ ОЕМ ах ПО У ОО КО о В й нн о ОО БВВВ а З КОХ с Я окон сійний щен таль о. і. с и 0 експраесь і ОКХ ОКО КО КОЖ УК Б М СВ КО х КЕ ТАК х . ОККО ТКУ о. ОО ОК В КОКО КОКО оС ОХ З С ху -. ЗК КОЖ ОКХ о З ОХ М ХЕ ее У

КВ . ОВО ОВ НН. о МЖК У | КО КК. М в п В С кання Кт КИ сао КЗ . «у. охіхуєтх Ж Сх З, МАН з з І; Ії 45 дах ут ОО «ооже Му КА Ух Кен СНИ зва ТЕУ ОУН С о - ук КК КВК. ол КЕ с ою а ма полу. КК В ОО Кши о ОО ЖЖ тд МЕ В п ви БЕ ск Мох. КК Ще Повх я Коойту НОВ, п ЦЕ о: У ВИН С НЯ З ОК хх реак у и ци ік 00 : У ни шин МОя М гий Спа КВ. - ЖЖ бек і М ж ев ЗнНгО ЗВ

Ж я м ке хх ЩО ЩО 5 Че и ЕІ МОЖ Ку Кк Ку ШУ КО ЩО Кт хе й МО хе Ж М Ще Ме Бе Ме Во Що оо цу Ко БЕЖ БМ ІН НО Оу му ом шо зак Ж СМ В ОХ хау о сх В ІЗ Же В Б І В БЕ З МК сов а БА В 5ь Ке

П.Я фрагмент 1 Мі зв'язування пив в в «КАТА Ж ЮК вГН і Я домів нео ох пе домі- ЩІ Ж її ж» Ох пе Те домі гГгфФФіі з ох ШИ ОК НЯ Я домі п Ех Ві домі ОО а ом дор КОКО ОЦЯ домі: КЕ й з г Я укл ї-Х ВЕН а дом ЩІ х пе Я дам НС Я доменне ПОЗ олу т ; Б УНК НН поси пе дані с, Те дви є ІІ ОЗ » Я Я домі ТЯ Я дома о « ОМ а демісзеногьйденаее КОП О г: ще х скажу ОККО ве ВЕНА дамі с ек доми вв Ко БО ; Ї; УКВ УКХ Х го ; АКНЕ я З ук хе о Км З СЯ дамі єль г Ялом І з ГО р пою Х с 25 : знання ух Ко я ххх ххкєюююєюкихх созгю-- То ке Кз ЗІ ке і. З З | окчччжкюююю жк юАКА КУ ВМ ММ МКК» Е ЕХ ВО г. сехххкк кю ху С ення КЗ кдд З КЕ : Р ОО За БЗ пи ; ж : Ох и » . ї шо - : 5 ях ї М Ж т у - Ж ха З ще Х дух І Й З і М ЗХ ЩО ЖЕК СКУ З 5 я ОК пекан М Н ше . М с Зх г В : І ще Е їі с. й і . і з о ї Х з Хе М З ЖК. Ух Ме В х КК дек і В я В. с. З. . о їх | соб о о о й и: х дае М М 2 ЖЕ т вм Ох 5 х божу Е й й. і. ше. у її. ШЕ. і т я жк Е ще а Ко ЗО КЕ. З сК ще МА а М оно. Н Її ї КО» З 5 Ж п З 5 З Кт й вк Як -- і І. ш- 0. і. ш що : і. 5 Ку Щщ. ві й. щ : 3 : ВО З Же ОЗ КО вх Ж КОХ й СК ЩЕ Щ-5 : х З ХХ КУ МЕ 5 З ХО. ХХ соомннн Я ЕН о . КО КО о ве ЕЕ. ЗВ га Сх ЩО р З хі ї потен ЩЕ ВВЕ Зк БК Се ще Кв я КК Же ВЕ чех Е - | . і . її. Хо КО - ЩЕ ЕЯ В ДІД З і . о і ККД . а Ї В с щи чех Ж ХУ но З ї КО с нн з пш і . ші » х 2; ї х х ї Х Ж ї ! жоче ей п дв її. Її: Кур ! Ба ж Ке Зеловаь З Я ЩО ЕК ЕІ. маххолнннн дО С ху занаванях ОН З НОВ : іх хе ща віях ЗВ жи: ЧЕ А я по по чек и. ох ! че рек їЖЕ Ей знак Зах с ї. З Н же се ч- В ев) с ж «В ях І ще хо ще ; КК ху В ее щ ше ваше Ї дк а ре 35 ; ; х ОЕ зай. ж й 23 жо Ко КУ У х Мо 5 су у де сх - І й ЗЕ у ме га : в що 0 кеВ Зх У зе о Яку хЗ Ж ОК, че Є щі ких чхий: ех М Б і у КІ щі ще що -а і: ше х ке -й ЕК ще хо о Зо Зк то і -к Зх ак й З У хо М ко се к УВ з Ба ж х. х гав З обу с - і ке ох ІЗ Її ко ях око еВ ре СЯ - ні й ех - НК кое -ш яв. ся М 3 Б А ЗУ З 2 ЗІ

ДВ, друюютнннсхя досі ттесеосссевеннюют хчжжжжньни кА птн КУ З) онсомеотокх не дон текли ям ї | нк й з : з й ще со по ВЕ ї не ен ІК ЗКУ Зона ЗХ ХВ З ЗОЗ щ КОХ МК нн ВХ ;

НЕ. і ше о . и Ж 1 ВО ШЕ ШЕ. ВО ши о Н ЖК ОЗ КЕ КОХ СХ ХХ З ЕКО і вої Ох КО МЕ ОБО ВК М ЗОЗ В" З ; В ЗІ ВОК ВХ МО ХХ КИ КІННИХ . Е с. шо п. Я 5 о Ж ЕЕ щі. щі ш о - о і с. с ш. шини ШЕ їх ОХ ХК ОКО ОО з С нини Я - ї- БА и С Бе і КЗ 5: а -4 шт: о. о п . о БО. : о ш що Кеди ОХ М ХАКІ СЗМКЯ Її І ВО о. ше ще о. Е . о о 5 5 щ. ше о о.

ШЕ. 0 З рн й Шо ш. о. З 55 що й до -Н шк щі. о ш че ЗХ е-- М ВЕ х МО КЕКВ ТОБ ше - 5.5 СО Б СОЯ ЗЕМ : Ж н- Н Кох С я: еко МКК й УТ нини ЩЕ М СНО ЗБ. І Є ї САУ їв ше | ; З ДО МК ; Ух ш ФІГ Свгна в-зІВ : тинальва о ее, : за у | х зх. Є хх МУК вх шеесх в х Де ек ї х с х УА КБя «КЕ к вва ОК З ООН КУМ хм Ж КК й МКК КК а КК сн о КОКО УКВ зве ях ех як Е СО С її: о КУ Жиа. ох 5-5 ВЕК духова вузи СЕК КК ОО УКХ ПО в казав. кі УКВ Ка пове пн пк Е ж її ох та а ККУ її КЕ ОКХ сміх ОКХ Хо у о ВХ ; ше с. ЗЕ ВЕУ КОХ ПОКК її: ЕЕ КОВО ОКУ ! ШИ т ас с що позна хх «М яХ --я ЖЖ ПКУ АК КК КК Ко МОХ З я ОК а 5 а: же ій ще й хх ЖЖ ооо», КК ке В ВЗ а з У жвава. ЕЕ ОО ОО ев 3 х З Ж Ох сухе ОО Зх У: ОМА А Ім | шо 535 ВОІВ с кОм ща їз у везівівітя Сигнальна пов підевні де вЖЕЖХ хів вх х КОМУ - доянци» ІщІЕ вок яв М пе ОО з и ж вки» у ЕН КАК КИ КО УМ і з тах ве жан М мс гі й Мих з : ОМ ОКО у оо ЖК му х Н Не тк хї Везик Я пд КВ Ши 3-5 с ІНВ кажу. «« ЗУ КК ЕХО Ох х й ДЕК МК У ВО ЕК хи ду г за Ме пишних о. о ще п а ов нку ве КІМУй й п ОБ с в є ХЗМІК хх ЕХ ПК КК СОКУ ОО ОБО ХХ УВХ СКМ че вузів ки ВО : ЕХ КЕ о осві ВЕ тра 5 СОТ КК КВК: ВЕК ВО ЕН ОК ЕКЗ хвіївен тв 3 КУА В В ав ОК п. і, заж38- яз Ж шу ОКО ши ш їж ЗК хо ЗХ У ЩІ МО ОХ ЯЗ В фліі хна врівновиння песто: з пес вВнент веннай давненут: вана лювої ДЕ півбельної ділинкКИ ої діпянки важкого г зЗЖЕ ОЇ паца

3 С. ЗА

«іенальна погпідзеність гру» Й й я ух х пилу, о алажикня Х. ХО жо АННИ вва хи С ОВ В В В фхдаувійї вас М и Кая вих заміе-жа ж В жо ПК: жа я 5 ЗУ жена феи ж ек ЕН ЧО ф-ваувійна тю ЖЕ СС ува І ОО М М В СК вені. ек за» 5 МОВО к- Ветевіне хтЖ ЗБ МО вне сьа ча ОМ Вирівневання послішовності варіабельної діпники пегкого ванцюга ї Мох МУК сх УМ ОК В х ЗХ х ОМ х УН ше. С с о. 5 ж у і о. о. с а о. с сс. ССС її їв о о ВХ о. о. п 4 ЗК хх З ож Х о МОВ ХХ. ОК ВМ

БИ... і С щ З о с. . о. о. . о . с ох ККЗ ОХ А ВК ОККО ВК ВВ ОО ші ЕЕ ОО ОХ . В В и» о. о с о й Еш, С і З Ж КОЖНУ ОК х ОМ КВ УС

Фо. в. с о. о о с с /

ше . ОО о. ОО . БО схо: ВВ МУ п о. о. о: а МОБ п. о о. КО ОО о. о. З о. і Ех КО с, СС, ЦСЦСЦДЦи Ж в . о ОВО КОХ Ї о СО о. І о з Ох ОБО ОК о о . ОО о. В В БОБ: Ох і ща нн п Б с 0 Й шиї ї У я й ск ак из х у се кх - ех ї ; бе ше ж З Б'є В в Се хе. Билини. : Бе ЗВ їе Моноклональні антитна В : щх в / Не о А А КИ В КИ В В В ВК а р Ку дитихіна ЗАМ ВМІВ вні С Я блокують передачу сигналу МИ шо У ух.

нКжї Скружх я АТОоВА Я зве Би т Ба м о З 0 о ЇХ ва | МО М Ваш зе М о ВЗ доні Зі З с ШЕ І д ОВ у Нюх еВ КО у В кочмране с Кантваль як І жк Же ще МЕВНАТОНІ відношення у СМР-СТІ єю г ПИКА МУКУ У У УЖ У У КУ У я юки я я я юю я КАК ВАК ЛАВ КМ УМ У миють ях МАМ ЖИ МКВВВВЮВВЮЮю та ЩЕ Й ї ре їх Е : і НКИ ї ч З дя і Гай І ЗХ Е Бк 3 о. ! 1 о ! З 7 0 В завнх КВН ; Н Е : В 5 У збе т і ши о. о. о. ШЕ 3 З КО ПЕН ЗККЕКН КК і м ПЕРЕ КЕ ПЕВ КЕНЕ ес: КУ 55 5 55 5 ЩЕ КеВТрОль зт ЗВ : ма є МОН КУН МА ЗІМВТЗ б С Антена ати Я модулюють вколпонеєтю пенівчмиеней дна еневВ у пухлинах зенадево кими

«НГ. У ху

ЧУ ЧИ НЕ Жах Щ кофе В : і ! ОЗ уА- МИ я Е ї ; ще й ї г З | | си ФУ х Е їй Й Е й ри : ее ке З

І. Ж джених но шк: КО НК Щоденно ! не у ЩЕ я фбккнсюмю же с ще м по і ї Мк. о. ко. щк Кей з що Я ц вес кореневою го: ЕН по ве ее Що Щщ : песни не рн рон 3 КН ИН ння і з з ш «в КУ КУ х Мане о А НКЯ К «ж у З З УмМеннцення пухлини т є і З жііУуюЮтТьЬ ЗрОСТання . ЗАЛА самтио МН А зменшують зростанні д заз ЗАЛІВ гато У е пили ит Вин кишки ШМЬСЯ пухлини ОбОоДдОВ киці СОСКУ сах ОО Ка кове подо о кв ев: спе: рореннвювеевхвньнсе КЕ ЕВ ОК ви о . о. . тов п. 0. а о. Ох с ша о. ЗУ З сх ща хо КЕ УМО УК ОККО ЗМО п М ВЕ З в. и . с с хо КН . шо ОО. с о шк КО х о МОЯ ме о. Ох п. кож: В 5 о. ЗМК М й. о о : КН В КК й МОХУ СОМ о ОО БУ У МТК ВК Ов ОК ОКА МК ве У БО ще ше ше о КУ Я ам, З ОКХ МУ УТ За зЕй ЯК СА ох. а ЖУКА ОО Кс т я КУ ВЯ є Й о іш с є: НН чи хв пе Ж де в: ще у їх ЗСУ КЗ Зх З Ух З Же М з і. ех я БА . о. о. ях . п Я КМ МЖК ЖЕ ЕК МК м Ж МНК, У ОЗ хх Шо Тье що ХК а по ще У о у Ох хе р. і, КВ 5 А а ИЙ а Ко ОС і ся вв х СОН КАК окха, НЕ се М Я шо. В жи ШЕ ве о оч а кг ДУМ я ОО ж ії: 5 я ЖК оикюоюдкю здані що хе Лобож чш-. і . у Б КК нон о ША о в я шу ОКА стЗ те іпькишть ввалкВеруючих ІМ зате Я знижує КІЬКИТЬ зволювевуюча Амтучіло 1 МІВ зт Я скоб ій Шо лпухпинних КЕТРИН Р У: ЯНГ, В

З пе Н саканкфййнккк Мо і що САДКІВ щу : око ВІМНА НИ " ли й аг Е Кі е песееффрєння ВК.

ЕХ і БУ А я сен Я : ГКС х я т ще: Я я сю ЗДАВ З Ї Ж ск.

Ше сй и і; КАХ Б я ке ей о і В ї улкнкн й і: 5 кі сх я «В ен Й ще : ясна сн Й хе Й я день іще х - ще » Ка г КК КЗ ШЕ СС ВИ вх пе щк нний с Бе -а7 ва Во БУ К: С ххх дних як я хз : й ООН С: ооо кеш: ШВИ за - з р а 5 Я 5 й шо БЛНТУЧ зе щі хатку Антитійа ант СН у повднанні З З-РО хмемшують звостання НЯ-СЯ пухлини ебодової КиВІи а Тов що ЩОМОх с

5. Є г ве ! КЗ я "З З сою ЕЗ ц п, бою 5 щю» й Же Май» зв і І ЕСУ а й оррвноння Контроль ззхаєв ПОРО КОВВ ура от ща 1 МіВнвотькО Ки Поєднання днтиті амти СЯ та поюти ЕОКА інибує зростання МАМО пухнини ФО бо

З У Я КУ як тах 0 жбюх БОМТОЮДЬ й ак «фе виь Ж ж соді НМОТОВОВ во т я се ВНТ ЗХ рр ваКи

Во. і х ВН юку і Ку ; , З но Я ре Й нн У ОБ КК Ж т а ой ех. Я мч гі Н шк | не пе КУ протн ринатаюдну он Хек ОО В ЕК НК УНН «8 8 Б В 5 8 В КН що зон МОНТНЕНМ ЛК ще . й дх щ «йо КДНТИЦИЬ М В шиноТакаМ ЕЕ Ку що - ; задню МОТО Ко винетнкам ше ; і де -- шк кое МАТКИ Біне мжаю п й Х Б ЖЕ яко ор ї ні и де ЕКЗ мк. А щі я ; хай ще с ж То ще ; й хх : ж ШЕ м в: ВИ НЕ ої НІ АВК Я вити Я б динотекан діють зинечна дич інпоування остання пухлини вослюво киш

ЧНГ. Я вт 3 ц «ух, хх пинотекан Б ПИ їх Тож пи нн НН МВП НН НН НН НО ше я Не із Ще Тееуй ї й хх нн ня тки : о | а НЕ Ка ї кА ІК Мен о ще п п Доля Тажеті п. ї ШИ й шеннц мн нн М а ДНУ : хх І ш ОКУ ще Ку ня Тіт : а ня ен ни ни Дуіунжжнюккинкннх. 00 сл В Х щкй ей ВК х - Енн кн о он мно ех мий 5 шк Кк мсжн ге НЕСОВКО рних ри ше ЗУ ще Дункан КК ВК ккксккнн В НК Б Ку Ка не ОКУ М І Кай се и ох У ун о С ее сн нн я суку КК хе ех А дек Н В з й ча хКух хх ОК ух у мих кн ех г вон Єр Кс зн ек кн У Ж я: як У ш р У - я в Кі У х КН ЗАМ В з іринотека й ізинотекаю ж як УЖ теки т ДК усю у ую У У у ух іт пе реко От сан нн нн БОКИ нище ЖОМУ Куди ААКАК НК АКА КАНА нн няння як ал АНАННя ту де ко 1... БАКУ з ддитнеттиитит и снтетут тин дент тт тонну дуття рин БУ Нева ОА: нн нанні М и кн вій нн нан це

КА. Дали утік АТАК КАК ЖАКА тт Мак х У У ЖК Думехичнінкуькак как КККККК А КАК КК КК КК КК Тк тююююююх є гу хі й Ще ння и: . х коор В МВ у в в в ЗИ З М В В В З В КУ А і ечи кг везуть КУМІк ий тую хі АЗК ірирзіу ти тіки и коміннована осока антена Я я 11 в ормнотеканом запобие повторному здостнню пухлини вООЗдаВОїкиНЖи НГ Я

Мих ре. З ж З пи екв КК у ; зей КОЗИ АМО щи | кефір ЛЕТИ Я М ВК зу» Вей ПИМОТОКОМ х Х с яку Оз вила сх сн; ке со В НЕ ЕН Ж ВІ хе З не. ЖАХ що и ка аа ою хх : ОА х ОХ Кн о м В нок он Ме у ей що Ого г тре крчеути ірифттелетню х ще КОХ З ММ м хо ван З чесні М 5 «й щ ВЕ 5 ДВ пСлЛя нектування клітин Кемсновзанв обробка вит ОБ МІВ В ринстеканом інлшує зВОостання пухним сбодової кишки, ще прижилисв, «офективннне, ніженнниюка менотеватею

ФГ. 18 жк ут вх ун с вх сузкхіз Й хх, сх зростання пухинни ень КБ еЕке КІ рН: З дю з Е- с З ж Зк КУ 5 х Ше » киш з а І ї Б ЕН Й Й Кв ЇХ х ВК ее ав в І в хІ | ба т - МУ че с З і зу в с Е в я ре що МОЖ ' а її ШИ ч і з у ям : з 3 м ва З ; й ; ; З Ко 5 Ех З ря я 5 мк Й Кя ще Ес - г КУ й Й КУ ва «ке ге Й Ех їх . х К-Я х как ж я жое ге -в. 5 жа ж за З ц ща КЯ хх и сжкююююю ОТ й же їде ЗД ово ооіфоссюск В осо сосоюо осо ооо фак оо о вн зх дода ооо росою нос дою ВВ оо ообфею я оо ЯК ни зх ши ши ше и ши ши ше не НН НН НИ З НН п п ІК ме м С НВ о нн: НЕ М п ШОН и в п ва п М сс кН НЕ М ФО ОВ. стро Ж ОМ а ке Га ц ота ща ЛИ т що ча Я ще їх ЦЕ ТУ ТВ г МЕ но ОО ОКУ і Фо Де щі Кк 5 Я ду тк Е імя КУШАСУ ни о шо щ їх а І НН НН м шк ше й Не З НИ НН ШИ НН НЕ НН В СЕ н ан по он НН и п З хе ок ех ОО ЖОВ а ШО Коміннована зоробка анти Я ЯМИ В й ринотеаканом зменшує мастоту вакулстволових клітин

МІГ. БА

Частота ваку ствОоплОвиИхХ кИилиН абз ша ре г зи ВО КК Кк БОНН с о ха 5 МОХ ОО Ка я ВОМ КВ й ан о 0ОШ я 3 НО 5555 жо ж х ДОМОМ о у

МОЯ БО МО ОО й Додін ее не ее . Контосв» Яні фїимо Коб. збрБоока Я кВ х х ; ке с КОХ Мез баз З ГЕС І дж 05 проти Контровю зве в ж 0 ОБ проти івинетекану Камевнована збробка ант Я ЗМ В В зинотеканом зменшує частоту вакусстволових кпітим ФН, ї5 щ Аве есмене дез зільки як З ї ОВТ овнОоТекан МУ я: з ОО якорі КО і зе С М В ЮВИМОТеКИУ чу З Її ХА о ї ге КВ. ї г Х КІ кю КЕ. у сш й й в ШК Я ; с Б: З я хх я де го кВ ща ЕЕ ще ні після їн єктування кити Комбінована обробка вити Я ЕМ й шШинОотеквном затримує рецидив пухлини

ЯНГ. 16 З їн я З г ж чи гнУ З В М же ва 5 ки 5 в г ; : - у зони ж Езинотекан Іввнотекан-я 1 МВ Комбіноввив обробка ант Я У НМ ірянотвканом зменшує об'єм пухлини через 47 діб птсля припинення сорока енотеквном

ВГ. У

НН: х ч їх мі хе То зее КОНТЮОВУ МАЮ б. В зе: СІНА ГУ со Ж ВК ся я зе ПрОТЕУЮОК х ке з. А М Со МТОХ х во зе «ей МІР НТУ МІЯ в Я й - хх х к в юю : У рег К: с -дх ; ко ще З кан м жів оно ВК ох два З 5 ча Як Ба ЗУ щі жк Поєдмання вити Я ВМ З гпраоти УКСОК зменшує зростання пухпиня фа