BRPI0710411A2 - Métodos para tratar um tumor, para tratar uma condição patológica associada à angiogênese, para estimular a proliferação celular endotelial, para reduzir ou inibir a diferenciação celular endotelial, para reduzir ou inibir o desenvolvimento arterial, para reduzir ou inibir a perfusão vascular tumoral para aumentar a eficácia de um agente anti-angiogênico, usos de um antagonista de dll4 e uso de um agonisra de dll4 - Google Patents

Abstract

MéTODOS PARA TRATAR UM TUMOR, PARA TRATAR UMA CONDIçãO PATóLOGICA ASSOCIADA à ANGIOGêNESE, PARA ESTIMULAR A PROLIFERAçãO CELULAR ENDOTELIAL, PARA REDUZIR OU INIBIR A DIFERENCIAçãO CELULAR ENDOTELIAL, PARA REDUZIR OU INIBIR O DESENVOLVIMENTO ARTERIAL, PARA REDUZIR OU INIBIR A PERFUSãO VASCULAR TUMORAL, PARA AUMENTAR A EFICáCIA DE UM AGENTE ANTI-ANGIOGéNICO, USOS DE UM ANTAGONISTA DE DLL4 E USO DE UM AGONISTA DE DLL4 A presente invenção fornece métodos de uso de um modulador de DLL4 para modular o desenvolvimento vascular. Além disso, são fornecidos métodos de tratamento que utilizam moduladores de DLL4, como antagonistas de DLL4.

Description

"MÉTODOS PARA TRATAR UM TUMOR, PARA TRATAR UMA CONDIÇÃO PATOLÓGICA ASSOCIADA À ANGIOGÊNESE, PARA ESTIMULAR A PROLIFERAÇÃO CELULAR ENDOTELIAL, PARA REDUZIR OU INIBIR A DIFERENCIAÇÃO CELULAR ENDOTELIAL, PARA REDUZIR OU INIBIR O DESENVOLVIMENTO ARTERIAL, PARA REDUZIR OU INIBIR A PERFUSÃO VASCULAR TUMORAL, PARA AUMENTAR A EFICÁCIA DE UM AGENTE ANTI-ANGIOGÊNICO, USOS DE UM ANTAGONISTA DE DLL4 E USO DE UM AGONISTA DE DLL4"

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se, de modo geral, à composições e métodos que são úteis para modular o desenvolvimento vascular. Em parte, a presente invenção refere-se ao uso de antagonistas de Delta-Iike 4 (DLL4) para os diagnósticos e tratamento de disfunções associadas à angiogênese.

Antecedentes da Invenção

O desenvolvimento de um suprimento vascular é uma necessidade fundamental para muitos processos fisiológicos e patológicos. O crescimento ativo dos tecidos, como embriões e tumores, exige suprimento adequado de sangue. Eles satisfazem esta necessidade produzindo fatores pró-angiogênicos, os quais promovem a formação de novos vasos sangüíneos por meio de um processo chamado angiogênese. A formação do tubo vascular é um evento complexo, porém biologicamente ordenado, envolvendo todas ou muitas das seguintes etapas: a) células endoteliais (ECs) se proliferam a partir de ECs existentes ou diferenciadas a partir de células progenitoras; b) ECs migram e se juntam para formar estruturas similares a um cordão; c) os cordões vasculares então se submetem à tubulogênese para formar vasos com um lúmen central; d) os cordões ou vasos existentes enviam brotos para formar vasos secundários; e) o plexo vascular primitivo se submete também à reconstrução e transformação; e f) células periendoteliais são recrutadas para revestir os tubos endoteliais, fornecendo manutenção e funções de modulação aos vasos; tais células, incluindo pericitos para capilares pequenos, células musculares lisas para vasos maiores e células do miocárdio no coração. Hanahan, D. Science 277:48-50 (1997); Hogan, B. L. & Kolodziej, P. A. Nature Reviews Genetics. 3:513-23 (2002); Lubarsky, B. & Krasnow1 M. A. Cell. 112:19-28 (2003).

Está bem estabelecido agora que a angiogênese está envolvida na patogênese de diversas disfunções. Isto inclui tumores sólidos e metástases, aterosclerose, fibroplasia retrolental, hemangiomas, inflamação crônica, doenças neovasculares intraoculares, como retinopatias proliferativas, por exemplo, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade (AMD), glaucoma neovascular, rejeição imune de tecido da córnea transplantado e outros tecidos, artrite reumatóide e psoríase. Folkman et al., J. Biol. Chem., 267:10931-10934 (1992); Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physio!. 53:217-239 (1991) e Garner A., "Vascular diseases", Em: Pathobioloqy of Qcular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2a Edição (Mareei Dekker, NY, 1994), páginas 1625-1710.

No caso de crescimento tumoral, a angiogênese parece ser crucial para a transição da hiperplasia para neoplasia, e para fornecer alimento para o crescimento e metástase do tumor. Folkman et al., Nature 339:58 (1989). A neovascularização permite que as células tumorais adquiram uma vantagem no crescimento e autonomia proliferativa, comparadas às células normais. Um tumor usualmente se inicia como uma única célula anormal, que pode se proliferar apenas para um tamanho de poucos milímetros cúbicos, devido à distância dos leitos capilares disponíveis, e pode ficar "dormente", sem crescimento adicional e disseminação por um longo período de tempo. Algumas células tumorais mudam então para o fenótipo angiogênico, para ativar as células endoteliais, que se proliferam e amadurecem para novos vasos capilares sangüíneos. Esses novos vasos sangüíneos formados, não somente permitem o crescimento continuado do tumor primário, como também permite a disseminação e recolonização de células tumorais metastáticas. Consequentemente, foi observada uma correlação entre a densidade dos microvasos nos cortes de tumor e a sobrevivência dos pacientes com câncer de mama, bem como em diversos outros tumores. Weidner et ai, N. Engl J. Med. 324:1-6 (1991); Horak et al, Lancet 340:1120-1124 (1992); Macchiarini et al, Lancet 340:145-146 (1992). O mecanismo preciso que controla a troca para angiogênese não é bem conhecido, mas acredita-se que a neovascularização da massa tumoral resulte da rede equilibrada de uma grande quantidade de estimuladores e inibidores da angiogênese (Folkman, 1995, Nat Medi (1):27-31).

O processo de desenvolvimento vascular é estreitamente regulado. Até hoje, um número significante de moléculas, a maioria de fatores secretados produzidos por células adjacentes, mostraram regular a diferenciação da EC, proliferação, migração e união das estruturas similares a cordões. Por exemplo, o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) foi identificado como o fator-chave envolvido no estímulo da angiogênese e na indução da permeabilidade vascular. Ferrara et al., Endocr. Rev. 18:4-25 (1997). A descoberta de que a perda de até mesmo um único alelo do VEGF resulta na letalidade embrionária, aponta para um papel insubstituível, desempenhado por este fator no desenvolvimento e diferenciação do sistema vascular. Além disso, o VEGF mostrou ser um mediador-chave na neovascularização associada com tumores e disfunções intraoculares. Ferrara et al, Endocr. Rev., acima. O mRNA do VEGF é superexpressado pela maioria dos tumores humanos examinados. Berkman et al, J. Clin. Invest. 91:153-159 (1993); Brown et al., Human Pathoi 26:86-91 (1995); Brown et al., CancerRes. 53:4727-4735 (1993); Mattern et al., Brit. J. Câncer 73:931-934 (1996); Dvorak et ai, Am. J. Pathol. 146:1029-1039 (1995). Além disso, os níveis de concentração do VEGF nos fluidos oculares estão altamente correlacionados com a presença da proliferação ativa dos vasos sangüíneos em pacientes com diabetes e outras retinopatias relacionadas à isquemia. Aiello et al., N. Engl. J. Med. 331:1480-1487 (1994).

Além disso, estudos demonstraram a localização do VEGF nas membranas neovasculares coroidais em pacientes afetados por AMD. Lopez et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sei. 37:855-868 (1996).

Anticorpos que neutralizam o anti-VEGF suprimem o crescimento de uma variedade de linhagens celulares tumorais humanas em camundongos nus (Kim et al., Nature 362:841-844 (1993); Warren et al., J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995); Borgstrõm et al., Câncer Res. 56:4032-4039 (1996); Melnyk et al., Câncer Res. 56:921-924 (1996)) e também inibem a angiogênese intraocular em modelos de disfunções isquêmicas da retina. Adamis et al., Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996). Então, anticorpos monoclonais anti-VEGF ou outros inibidores da ação do VEGF são candidatos promissores para o tratamento de tumores e várias disfunções neovasculares intraoculares. Tais anticorpos são descritos, por exemplo, na patente EP 817.648, publicada em 14 de janeiro de 1998; e no documento W098/45331 e documento WO 98/45332, ambos publicados em 15 de outubro de 1998. Um dos anticorpos anti-VEGF, bevacizumab, foi aprovado pelo FDA para uso em combinação com um regime de quimioterapia para tratar câncer colorretal metastático (CRC). E bevacizumab está sendo investigado em muitos testes clínicos em andamento para tratar vários indícios de câncer.

Em vista do papel da angiogênese em muitas doenças e disfunções, é desejável que se tenha uma forma para modular um ou mais efeitos biológicos que causam estes processos. Está claro que continua a existir uma necessidade para agentes que tenham atributos clínicos que sejam mais eficientes para o desenvolvimento como agentes terapêuticos. A invenção descrita no presente pedido vai de encontro a esta necessidade e fornece outros benefícios.

Todas as referências citadas no presente pedido, incluindo pedidos de patente e publicações, são integralmente incorporadas como referência.

Descrição Resumida Da Invenção

A presente invenção está baseada, em parte, na verificação de que o desenvolvimento vascular é inibido pelo tratamento com um agente que modula a ativação de Delta like-4 (também denominado "DLL4") da via do receptor Notch. O tratamento com o antagonista de DLL4 resultou em proliferação celular endotelial (EC) aumentada, diferenciação celular endotelial impróprio e desenvolimento arterial impróprio na vasculatura, incluindo vasculatura tumoral. Visivelmente, o tratamento com um anticorpo anti-DLL4 resultou na inibição do crescimento tumoral em diversos cânceres diferentes. Consequentemente, a invenção fornece métodos, composições, kits e artigos manufaturados para modular (por exemplo, promover ou inibir) processos envolvidos na angiogênese e para o uso a fim de atingir condições patológicas associadas à angiogênese.

Em um aspecto, a invenção fornece métodos para tratar um tumor, um câncer e/ou uma disfunção proliferativa celular que compreende administrar uma quantidade eficaz de um antagonista de DLL4 a um sujeito que necessite desse tratamento.

Em um aspecto, a invenção fornece métodos para reduzir, inibir, bloquear ou prevenir o crescimento de um tumor ou câncer, cujos métodos compreendem administrar uma quantidade eficaz de um antagonista de anti- DLL4 a um sujeito que necessite desse tratamento.

Em um aspecto, a invenção fornece métodos para inibir a angiogênese, que compreende administrar uma quantidade eficaz de um antagonista de DLL4 (como um anticorpo anti-DLL4) a um sujeito que necessite desse tratamento.

Em um aspecto, a invenção fornece métodos para tratar uma condição patológica associada à angiogênese, que compreende administrar uma quantidade eficaz de um antagonista de DLL4 (como um anticorpo anti- DLL4) a um sujeito que necessite desse tratamento. Em algumas realizações, a condição patológica associada à angiogênese é um tumor, um câncer e/ou uma disfunção proliferativa celular. Em algumas realizações, a condição patológica associada à angiogênese é uma doença neovascular intraocular.

Em um aspecto, a invenção fornece métodos para estimular a proliferação celular endotelial, que compreende administrar uma quantidade eficaz de um antagonista de DLL4 a um sujeito que necessite desse tratamento. Em algumas realizações, o sujeito tem uma condição patológica associada à angiogênese (como um tumor, um câncer e/ou uma disfunção proliferativa celular).

Em um aspecto, a invenção fornece métodos para inibir a diferenciação celular endotelial, que compreende administrar uma quantidade eficaz de um antagonista de DLL4 a um sujeito que necessite desse tratamento. Em algumas realizações, o sujeito tem uma condição patológica associada à angiogênese (como um tumor, um câncer e/ou uma disfunção proliferativa celular).

Em um aspecto, a invenção fornece métodos para inibir o desenvolvimento arterial, que compreende administrar uma quantidade eficaz de um antagonista de DLL4 a um sujeito que necessite desse tratamento. Em algumas realizações, o sujeito tem uma condição patológica associada à angiogênese (como um tumor, um câncer e/ou uma disfunção proliferativa celular).

Em um aspecto, a invenção fornece métodos para inibir a perfusão vascular, que compreende administrar uma quantidade eficaz de um antagonista de DLL4 a um sujeito que necessite desse tratamento. Em algumas realizações, o sujeito tem uma condição patológica associada à angiogênese (como um tumor, um câncer e/ou uma disfunção proliferativa celular).

Em outro aspecto, a invenção fornece um método para aumentar a eficácia de um tratamento com agente anti-angiogênico em um sujeito que tem uma condição patológica associada à angiogênese, que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um antagonista de DLL4 em combinação com o agente anti-angiogênico. Tal método será útil no tratamento de disfunções, por exempo, câncer ou doenças neovasculares intraoculares, especialmente aquelas doenças ou estágios da disfunção que responderam de modo insuficiente ao tratamento com o agente anti-angiogênico isoladamente. O agente anti-angiogênico pode ser qualquer agente capaz de reduzir ou inibir a angiogênese, incluindo antagonistas do VEGF, como anticorpo anti-VEGF.

Em um aspecto, a invenção fornece métodos que compreendem a administração de uma quantidade eficaz de um antagonista de DLL4 (como um anticorpo anti-DLL4) em combinação com uma quantidade eficaz de outro agente terapêutico (como um agente anti-angiogênese). Por exemplo, antagonistas de DLL4 são usados em combinação com um agente anti-câncer ou um agente anti-angiogênico para tratar várias condições neoplásicas ou não-neoplásicas. Em uma realização, a condição neoplásica ou não-neoplásica é uma condição patológica associada à angiogênese. Em algumas realizações, o outro agente terapêutico é um agente anti-angiogênico, um agente anti- neoplásico e/ou um agente quimioterápico.

O antagonista de DLL4 pode ser administrado em série ou em combinação com outro agente terapêutico que seja eficaz para esses propósitos, tanto na mesma composição como em composições separadas. A administração do antagonista de DLL4 e do outro agente terapêutico (por exemplo, agente anti-câncer, agente anti-angiogênico) pode ser feita simultaneamente, por exemplo, como uma composição única ou como duas ou mais composições diferentes, usando-se as mesmas ou diferentes formas de administração. Alternativamente, ou adicionalmente, a administração pode ser feita seqüencialmente, em qualquer ordem. Alternativamente, ou adicionalmente, as etapas podem ser realizadas como uma combinação seqüencial ou simultânea, em qualquer ordem. Em certas realizações, os intervalos que variam de minutos a dias, de semanas a meses, podem estar presentes entre as administrações de duas ou mais composições. Por exemplo, o agente anti-câncer pode ser administrado primeiro, seguido pelo antagonista de DLL4. No entanto, a administração simultânea ou administração do antagonista de DLL4 primeiro é também contemplada. Consequentemente, em um aspecto, a invenção fornece métodos que compreendem administrar um antagonista de DLL4 (como um anticorpo anti-DLL4), seguido pela administração de um agente anti-angiogênico (como um anticorpo anti-VEGF, como bevacizumab). Em certas realizações, os intervalos que variam de minutos a dias, de semanas a meses, podem estar presentes entre as administrações de duas ou mais composições.

Em certos aspectos,,a invenção fornece um método para tratar uma disfunção (como um tumor, um câncer e/ou disfunção proliferativa celular) pela administração de quantidades eficazes de um antagonista de DLL4 e/ou inibidor(es) da angiogênese e um ou mais agentes quimioterápicos. Uma variedade de agentes quimioterápicos pode ser usada nos métodos de tratamento combinado da invenção. Uma lista de agentes quimioterápicos exemplares e não-limitantes contemplados é fornecida no presente pedido nas "Definições". A administração do antagonista de DLL4 e o agente terapêutico pode ser feita simultaneamente, por exemplo, como uma composição única ou como duas ou mais composições diferentes, usando-se as mesmas ou diferentes formas de administração. Alter nativamente, ou adicionalmente, a administração pode ser feita seqüencialmente, em qualquer ordem.

Alternativamente, ou adicionalmente, as etapas podem ser realizadas como uma combinação seqüencial ou simultânea, em qualquer ordem. Em certas realizações, os intervalos que variam de minutos a dias, de semanas a meses, podem estar presentes entre as administrações de duas ou mais composições.

Por exemplo, o agente quimioterápico pode ser administrado primeiro, seguido pelo antagonista de DLL4. No entanto, a administração simultânea ou administração do antagonista de DLL4 primeiro é também contemplada. Consequentemente, em um aspecto, a invenção fornece métodos que compreendem administrar um antagonista de DLL4 (como um anticorpo anti- DLL4), seguido pela administração de um agente quimioterápico. Em certas realizações, os intervalos que variam de minutos a dias, de semanas a meses, podem estar presentes entre as administrações de duas ou mais composições.

Em um aspecto, a invenção fornece o uso de um antagonista de DLL4 na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma disfunção, como uma condição patológica associada à angiogênese. Em algumas realizações, a disfunção é um tumor, um câncer e/ou uma disfunção proliferativa celular.

Em um aspecto, a invenção fornece métodos para tratar uma disfunção, que compreende administrar uma quantidade eficaz de um agonista de DLL4 a um sujeito que necessite desse tratamento. Em algumas realizações, a disfunção está associada com a expressão e/ou atividade das vias do receptor DLL4-Notch (como atividade aumentada da via do receptor DLL4-Notch). Em algumas realizações, a disfunção é uma disfunção em que a angiogênese, neovascularização e/ou hipertrofia é desejável, por exemplo, trauma vascular, feridas, lacerações, incisões, queimaduras, úlceras (por exemplo, úlceras diabéticas, úlceras por pressão, úlceras hemofílicas, úlceras de varizes), crescimento de tecido, ganho de peso, doença arterial periférica, indução do parto, crescimento capilar, epidermólise bolhosa, atrofia da retina, fraturas ósseas, fusões na coluna vertebral, rompimento do menisco, etc Em algumas realizações, a disfunção é uma disfunção em que a inibição da angiogênese é desejada. Em algumas realizações, o agonista de DLL4 é DBZ.

Antagonistas e agonistas de DLL4 são conhecidos no estado da técnica e alguns são descritos e exemplificados no presente pedido. Em algumas realizações, o antagonista de DLL4 é uma molécula que se liga ao DLL4 e neutraliza, bloqueia, inibe, anula, reduz ou interfere em um ou mais aspectos dos efeitos associados ao DLL4. Em algumas realizações, o antagonista de DLL4 é uma molécula que se liga ao receptor Notch (como Notchl, Notch2, Notch3 e/ou Notch4) e neutraliza, bloqueia, inibe, anula, reduz ou interfere em um ou mais aspectos dos efeitos associados ao DLL4. Em algumas realizações, o antagonista de DLL4 é capaz de promover a proliferação celular endotelial, inibir a diferenciação celular endotelial, inibir o desenvolvimento arterial e/ou reduzir a perfusão vascular. Como bem estabelecido no estado da técnica, a proliferação celular endotelial, a diferenciação celular endotelial, o desenvolvimento arterial e função vascular (como perfusão vascular) podem ser avaliados usando-se qualquer um de uma diversidade de testes (alguns desses estão descritos e exemplificados no presente pedido), e expressos em termos de uma diversidade de valores quantitativos. Em algumas realizações, a capacidade de um antagonista de DLL4 de promover a proliferação celular endotelial, inibir a diferenciação celular endotelial, inibir o desenvolvimento arterial e/ou reduzir a função vascular (como perfusão vascular reduzida) é avaliada relativa ao nível de proliferação celular endotelial, diferenciação celular endotelial, desenvolvimento arterial e/ou função vascular (como perfusão vascular) na ausência de tratamento com o antagonista de DLL4. Em algumas realizações, a capacidade em promover a proliferação celular endotelial, inibir a diferenciação celular endotelial, inibir o desenvolvimento arterial e/ou reduzir a função vascular (como perfusão vascular reduzida) é determinada em um teste in vitro (como o teste HUVEC descrito no presente pedido). Em algumas realizações, a capacidade em promover a proliferação celular endotelial, inibir a diferenciação celular endotelial, inibir o desenvolvimento arterial e/ou reduzir a função vascular (como perfusão vascular reduzida) é determinada em um teste in vivo (como teste de desenvolvimento da retina em camundongo descrito no presente pedido).

O antagonista de DLL4 pode ser um anticorpo anti-DLL4. Em algumas realizações, o anticorpo anti-DLL4 é um anticorpo monoclonal. Em algumas realizações, o anticorpo é um anticorpo policlonal. Em algumas realizações, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo quimérico, um anticorpo de afinidade madura, um anticorpo humanizado, e um anticorpo humano. Em algumas realizações, o anticorpo é um fragmento de anticorpo. Em algumas realizações, o anticorpo é um Fab, Fab', Fab1-SH, F(ab')2, ou scFv. Em algumas realizações, o anticorpo compreende as regiões variáveis das cadeias pesada e leve mostradas na Tabela 1.

Tabela 1

<table>table see original document page 12</column></row><table> Em uma realização, um anticorpo é um anticorpo quimérico, por exemplo, um anticorpo que compreende seqüências de ligação de antígeno de um doador não-humano enxertado com uma seqüência heteróloga não- humana, humana ou humanizada (por exemplo, estruturas e/ou seqüências do domínio constante). Em uma realização, o doador não-humano é um camundongo. Em uma realização, uma seqüência de ligação de antígeno é sintética, por exemplo, obtida por mutagênese (por exemplo, seleção de exibição por fago, etc.). Em uma realização, um anticorpo quimérico da invenção possui regiões V de murino e regiões C humanas. Em uma realização, a região V da cadeia leve de murino é unida à cadeia leve kappa humana. Em uma realização, a região V da cadeia leve de murino é unida à região C da IgG1 humana.

Anticorpos humanizados incluem aqueles que têm substituições de aminoácidos na FR e variantes de maturação de afinidade com alterações nas CDRs enxertadas. Os aminoácidos substituídos na CDR ou FR não se limitam àqueles presentes no anticorpo doador ou receptor. Em outras realizações, os anticorpos da invenção compreendem ainda trocas nos resíduos de aminoácidos na região Fc que levam à melhora na função efetora, incluindo aumento das funções CDC e/ou ADCC e destruição de célula B.

Outros anticorpos da invenção incluem aqueles que possuem trocas específicas que melhoram a estabilidade. Em outras realizações, os anticorpos da invenção compreendem ainda trocas nos resíduos de aminoácidos na região Fc que levam à diminuição na função efetora, por exemplo, diminuição das funções CDC e/ou ADCC e/ou destruição de célula B.

Em algumas realizações, o antagonista de DLL4 é uma imunoadesina DLL4.

Em um aspecto, a invenção fornece composições que compreendem um ou mais antagonistas de DLL4 e um carreador. Em uma realização, o carreador é farmaceuticamente aceitável. Em algumas realizações, o antagonista de DLL4 é um anticorpo anti-DLL4.

Em um aspecto, a invenção fornece uma composição para uso no tratamento de um tumor, um câncer e/ou disfunção proliferativa celular que compreende administrar uma quantidade eficaz de um antagonista de DLL4 e um carreador farmaceuticamente aceitável, em que dito uso compreende administração simultânea ou seqüencial de um agente anti-angiogênese. Em algumas realizações, o antagonista de DLL4 é um anticorpo anti-DLl_4. Em algumas realizações, o agente anti-angiogênese é um anticorpo anti-VEGF (como bavacizumab).

Em um aspecto, a invenção fornece uma composição para uso no tratamento de um tumor, um câncer e/ou disfunção proliferativa celular, que compreende administrar uma quantidade eficaz de um antagonista de DLL4 e um carreador farmaceuticamente aceitável, em que dito uso compreende administração simultânea ou seqüencial de um agente anti-câncer. Em algumas realizações, o antagonista de DLL4 é um anticorpo anti-DLL4. Em algumas realizações, o agente anti-câncer é um agente quimioterápico. Em algumas realizações, o uso compreende, ainda, a administração simultânea ou seqüencial de um agente anti-angiogênese. Em algumas realizações, o antagonista de DLL4 é um anticorpo anti-DLL4. Em algumas realizações, o agente anti-angiogênese é um anticorpo anti-VEGF (como bavacizumab).

Em um aspecto, a invenção fornece um artigo manufaturado que compreende um recipiente; e uma composição contida dentro do recipiente, em que a composição compreende um ou mais antagonistas de DLL4 ou agonistas de DLL4.

Em um aspecto, a invenção fornece um kit que compreende um primeiro recipiente que compreende uma composição que compreende um ou mais antagonistas de DLL4 ou agonistas de DLL4; e um segundo recipiente que compreende um tampão. Em uma realização, o tampão é farmaceuticamente aceitável. Em uma realização, o antagonista de DLL4 é um anticorpo anti-DLL4.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para preparar uma composição que compreende misturar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de DLL4 ou agonista de DLL4 com um carreador farmaceuticamente aceitável.

Breve Descrição Das Figuras

FIGURA 1: Sinalização de Notchmediada por DLL4 regula a proliferação de EC. a-c, f, testes de desenvolvimento HUVEC em géis de fibrina em 3D. Anticorpo anti-DLL4 (YW26.82) ou DBZ promoveu o desenvolvimento de HIVEC (a). A coloração de Ki67 mostrou que o anticorpo anti-DLL4 ou DBZ provocou a hiperproliferação de HUVEC (b). O anticorpo Anti-DLL4 ou DBZ aumentou o desenvolvimento de HUVEC na presença de meio condicionado SF (c). d, h, Entrega sistemática de anticorpo anti-DLL4 provocou acúmulo em massa de EC nas retinas de neonatais. As imagens confocais de aumento baixo (parte superior) e alto (parte inferior) da vascularidade da retina (corado com isolectina) (d). A coloração com Ki67 mostra a proliferação de EC aumentada nas retinas de neonatais tratados com anticorpo anti-DLL4 (h) e a ativação de Notch por DLL4 imobilizada inibiu a proliferação de HUVEC. f, O anticorpo anti-VEGF inibiu o desenvolvimento de HUVEC na presença ou ausência de DBZ. g, Regulação de VEGFR2 por Notch. Análise quantitativa de PCR da expressão de VEGFR2 em resposta ao bloqueio de Notch em cultura em gel de fibrina 3D de HUVSC (7 d) pelo anticorpo anti-DLL4 ou DBZ (esquerda) ou ativação de Notch em cultura 2D de HUVEC (36 h) por DLL4 imobilizado (direita). Anticorpo Anti-DLL4 e o DBZ foram usados nas concentrações de 5 pg/mL e 0,08 μΜ, respectivamente, (a-c, e-g).

Figura 2: Sinalização de Notch mediada por DLL4 regula a diferenciação de EC. a, Estruturas semelhantes ao lúmen (setas brancas) formadas por HUVEC que cresceram em géis de fibrina foram perdidas na presença de anticorpo anti-DLL4 ou DBZ. Em vez disso, os fluxos estavam altamente cheios de células (setas pretas), b, Regulação de TGFp2 por Notch.

Análise quantitativa de PCR da expressão de TGFP2 na resposta ao bloqueio de Notch em cultura em gel de fibrina 3D de HUVSC durante (7 d) pelo anticorpo anti-DLL4 ou DBZ (esquerda) ou pela ativação de Notch em cultura 2D de HUVEC (36 h) por DLL4 imobilizado (direita), c, O anticorpo anti-DLL4 bloqueia o desenvolvimento arterial. As imagens confocais de retinas de camundongo neonatais coradas com actina alfa de músculo liso (ASMA) e isolectina. Os camundongos neonatais foram tratados conforme descrito na Fig. 1d. d, imagens confocais de retinas de camundongo adulto com ASMA e isolectina. Os camundongos de 8 semanas de idade foram tratados com PBS ou anticorpo anti-DLL4 (10 mg/kg, duas vezes na semana) durante duas semanas.

Figura 3: Bloqueio seletivo de DLL4 e/ou VEGF interrompeu a angiogênese tumoral e inibe o crescimento do tumor, a-f, Resultados de modelos tumorais: HM7 (a), Colo205 (b), Calu6 (c), MDA-MB-435 (d), MV- 522 (e) e WEHI3 (f). Volumes médios de tumor com SE são apresentados. g-h, Estudos de histologia vascular do tumor. Imunohistoquímica do anti- CD31 em cortes de tumor de EL4 de controle, camundongos tratados com anticorpo anti-DLL4 e anti-VEGF (g). Coloração de perfusão de Iectina e anti-CD31 em cortes de tumor EL4 (h). i-p. Resultados de modelos de tumor SK-0V-3X1 (i), LL2 0), EL4 (k), H1299 (I), SKMES-1 (m), MX-1 (n), SW620 (o) e LS174T (p).

Figura 4: DLL4/Notch é dispensável na homeostase do intestino de camundongo. Os estudos de imunohistoquímica dos intestinos delgados do controle (a, d, g, j), anticorpo anti-DLL4 (10 mg/kg, duas vezes por semana durante 6 semanas) (b, e, h, k) e camundongos tratados com DBZ (30 μΓηοΙ/kg diariamente durante 5 dias) (c, f, i, I). Como mostrado pelo H&E (a, b, c) e coloração Alcian Blue (d, e, f), DBZ provocou a substituição da população de TA pelas células caliciformes. Essa alteração estava inteiramente ausente a partir do tratamento com anticorpo anti-DLL4. Colorações de Ki67 (g, h, i) e HES-1 (j> k, I) confirmaram, ainda, que o anticorpo anti-DLL4 falhou em replicar o efeito de DBZ.

Figura 5: Caracterização do anticorpo anti-DLL4. a, Mapeamento do epitopo de anticorpo anti-DLL4 (YW26.82). Representação esquemática de um conjunto de mutantes de DLL4 expresso como proteínas de fusão da porção C-terminal da fosfatase alcalina (AP) de placenta humana. A célula 293T condicionou o meio que continha as proteínas de fusão foi testada em placas de microtitulação de 96 poços revestida com anticorpo anti-DLL4 purificado (YW26.82, 0,5 Mg/mL). O DLL4.AP ligado foi detectado usando-se PNPP de 1 etapa (Pierce) como substrato e absorbância de OD 405 nm medido, b-d, Ligação seletiva de YW26.82 a DLL4. Placas Nunc Maxicorp de 96 poços revestidas com proteínas recombinantes purificadas como indicado (1 pg/mL). A ligação de YW26.82 nas concentrações indicadas foi medida pelo teste ELISA. Os anticorpos ligados foram detectados com conjugado de HRP de anticorpo anti-humano usando-se TMB como substrato e medição de absorbância OD 450 nm. O Anti-HER2 e ErbB2-ECD recombinante foram usados como controle de teste (b). A análise FACS de 293 células transitoriamente transfectadas com vetor, DLL4, Jag 1 ou DLL1 inteiros. A ligação significativa de YW26.82 foi detectadas apenas em células transfectadas com DLL4 (painel superior). A expressão de Jag 1 e DLL1 foi confirmada pela ligação de Notchl-Fc em rato recombinante (rrNotch1-Fc, painel do meio) e Notch2-Fc em rato recombinante (rrNotch2-Fc, painel inferior), respectivamente. YW26.82, rrNotch1-Fc ou rrNotch2-Fc (sistema R & D) foram usados em 2 pg/mL seguido pelo IgG-PE de cabra anti-humano (1:500, Jackson ImmunoResearch) (c). O anticorpo Anti-DLL4 bloqueou a ligação de DLL4-AP, mas não a de DLL1-AP, para rNotchl revestido, com um IC50 calculado de aproximadamente 12 nM (painel esquerdo). O anticorpo Anti-DLL4 bloqueou a ligação de DLL4-His, mas não de Jagl-His, para rNotchl revestidos, com um IC50 calculado de aproximadamente 8 nM (painel direito) (d), e, Ligação específica de YW26.82 para DLL4 expressos de forma endógena. A análise FACS de HUVEC transfectados com siRNA específicos para o controle ou para DLL4. YW26.82 foram usados em 2 pg/mL, seguido pelo IgG-PE de cabra anti-humano (1:500, Jackson ImmunoResearch) (e).

Figura 6: Supra-regulação de DLL4 por ativação de Notch. HUVECs foram estimuladas por DLL4 humano marcado com His na porção C- terminal (aminoácidos 1-404) na ausência ou presença de DBZ (0,08 μΜ). 36 h depois do estímulo, a expressão endógena de DLL4 foi examinada pela análise FACS com o anticorpo anti-DLL4.

Descrição Detalhada Da Invenção

Técnicas Gerais

As técnicas e procedimentos descritos ou com referência no presente pedido são geralmente bem conhecidos e comumente empregados usando-se metodologia convencional pelos técnicos no assunto, como, por exemplo, as metodologias amplamente utilizadas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3a. edição (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003)); a série METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames e G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow e Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, e ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)). Definições

O termo "DLL4" (alternadamente denominado "Delta Iike 4"), como usado no presente pedido, refere-se, a menos que especificamente ou contextualmente indicado de outra forma, a qualquer polipeptídeo DLL4 nativo ou variante (nativo ou sintético). O termo "seqüência nativa" especificamente inclui formas truncadas ou secretadas de ocorrência natural (por exemplo, uma seqüência de domínio extracelular), formas variantes de ocorrência natural (por exemplo, formas unidas alternativamente) e variantes alélicas de ocorrência natural. O termo "DLL4 tipo selvagem" geralmente refere-se a um polipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácido de uma proteína DLL4 de ocorrência natural. O termo "seqüência DLL4 tipo selvagem" geralmente refere- se a uma seqüência de aminoácido encontrada em um DLL4 de ocorrência natural.

O termo "receptor Notch" (alternadamente chamado de "Notch"), como usado no presente pedido, refere-se, a menos que especificamente ou contextualmente indicado de outra forma, a qualquer polipeptídeo receptor Notch nativo ou variante (nativo ou sintético). Os humanos têm quatro receptores Notch (Notchl, Notch 2, Notch3 e Notch4). Como usado no presente pedido, o termo receptor Notch inclui qualquer um ou todos os quatro receptores Notch humanos. O termo "seqüência nativa" especificamente inclui formas truncadas ou secretadas de ocorrência natural (por exemplo, uma seqüência de domínio extracelular), formas variantes de ocorrência natural (por exemplo, formas unidas alternativamente) e variantes alélicas de ocorrência natural. O termo "receptor Notch tipo selvagem" geralmente refere-se a um polipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácido de um receptor Notch de ocorrência natural. O termo "seqüência do receptor Notch tipo selvagem" geralmente refere-se a uma seqüência de aminoácido encontrada em um receptor Notch de ocorrência natural. "Ácido nucleico de DLL4" é o RNA ou DNA que codifica um polipeptídeo DLL4, conforme definido acima, ou que hibridiza com tal DNA ou RNA e permanece ligado de modo estável a estes sob condições de hibridização estringentes e têm mais que cerca de 10 nucleotídeos em comprimento. Condições de estringência são aquelas que (1) empregam baixa força iônica e alta temperatura para lavagem, por exemplo, 0,15 M de NaCl/0,015 M de citrato de sódio/NaDodSO4 a 0,1% a 50°C, ou (2) usam um agente de desnaturação durante a hibridização, como formamida, por exemplo, formamida a 50% (vol/vol) com 0,1% de albumina de soro bovino/0,1% de Ficoll/0,1% de polivinilpirrolidona/50 mM de tampão fosfato de sódio em pH 6,5 com 750 mM de NaCh, 75 mM de citrato de sódio a 42°C.

Uma molécula "DLL4 quimérica" é um polipeptídeo que compreende DLL4 inteiro ou um ou mais domínios deste, unido ou ligado ao polipetídeo heterólogo. A molécula DLL4 quimérica geralmente irá compartilhar ao menos uma propiredade biológica em comum com DLL4 de ocorrência natural. Um exemplo de uma molécula DLL4 quimérica é aquela marcada com epitopo para os propósitos de purificação. Outra molécula DLL4 quimérica é uma imunoadesina DLL4.

O termo "imunoadesina DLL4" é usado alternadamente com o termo "imunoglobulina quimérica DLL4" e refere-se a uma molécula quimérica que combina com ao menos uma porção da molécula DLL4 (nativa ou variante) com uma seqüência de imunoglobulina. A seqüência de imunoglobulina, preferencialmente, mas não necessariamente, é um domínio constante da imunoglobulina (região Fe). Imunoadesinas podem possuir muitas das valiosas propriedades químicas e biológicas de anticorpos humanos. Já que as imunoadesinas podem ser construídas a partir de uma seqüência de proteína humana com a especificidade desejada, ligadas a uma seqüência de dobradiça humana apropriada ou de domínio constante (Fc), a especificidade de ligação de interesse pode ser alcançada usando-se componentes totalmente humanos. Tais imunoadesinas são minimamente imunogênicas aos pacientes e são seguras para uso contínuo ou repetido. Em algumas realizações, a região Fc é uma região Fc de seqüência nativa. Em algumas realizações, a região Fc é uma região Fc variante. Em algumas realizações, a região Fc é uma região Fe funcional.

Exemplos de imunoadesinas homomultiméricas que foram descritas para uso terapêutico incluem a imunoadesina CD4-lgG para bloqueio da ligação do HIV ao CD4 de superfície celular. Da dos obtidos de testes clínicos de Fase I, nos quais CD4-lgG foi administrado em mulheres grávidas pouco antes da entrega, sugere que esta imunoadesina pode ser útil na prevenção da transferência materno fetal do HIV (Ashkenazi et al., Intern. Rev. Immunol. 10:219-227 (1993)) Uma imunoadesina que se liga ao fator de necrose tumoral (TNF) foi também desenvolvido. TNF é uma citocina inflamatória que mostrou ser o principal mediador do choque séptico. Com base em um modelo de camundongo de choque séptico, uma imunoadesina receptora de TNF mostrou esperanças como sendo candidata para uso clínico no tratamento de choque séptico (Ashkenazi, A. et al. PNAS USA 88:10535- 10539 (1991)). ENBREL® (etanercept), uma imunoadesina que compreende uma seqüência do receptor de TNF unida a uma região Fc de IgG foi aprovada pelo Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos, em 2 de novembro de 1998, para o tratamento de artrite reumatóide. O novo uso difundido do ENBREL® no tratamento de artrite reumatóide foi aprovado pelo FDA em 6 de junho de 2000. Para informações recentes sobre bloqueadores de TNF, incluindo ENBREL®, consulte Lovell et al., N. Engl. J. Med. 342:763- 169 (2000), e editorial nas páginas 810 a 811; e Weinblatt et al., N. Engl. J. Med. 340:253-259 (1999); revisado em Maini e Taylor, Annu. Rev. Med. 51:207-229 (2000). Se os dois braços da estrutura da imunoadesina têm especificidades diferentes, a imunoadesina é chamada de "imunoadesina biespecífica" por analogia a anticorpos biespecíficos. Dietsch et ai, J. Immunol. Methods 162:123 (1993) descreve essa imunoadesina biespecífica que combina domínios extracelulares das moléculas de adesão, E-selectina e P- selectina, cada uma destas selectinas é expressa em um tipo celular diferente na natureza. Estudos de ligação indicaram que a proteína de fusão de imunoglobulina biespecífica então formada teve uma capacidade aumentada para se ligar a uma linhagem celular mielóide, em comparação às imunoadesinas monoespecíficas das quais ela foi derivada.

O termo "heteroadesina" é usado alternadamente com a expressão "adesina heteromultimérica quimérica" e refere-se a um complexo de moléculas quiméricas (seqüências de aminoácidos), nos quais cada molécula quimérica combina uma porção ativa biologicamente, como o domínio extracelular de cada um dos monômeros receptores heteromultiméricos, com o domínio de multimerização. O "domínio de multimerização" promove interação estável das moléculas quiméricas dentro do complexo heteromultimérico. Os domínios de multimerização podem interagir via uma seqüência de imunoglobulina, zíper de leucina, uma região hidrofóbica ou um tiol livre que forma uma ponte bissulfeto intermolecular entre as moléculas quiméricas do heteromultimérico quimérico. O domínio de multimerização pode compreender uma região constante de imunoglobulina. Além disso, a região de multimerização pode ser elaborada de forma que as interações estéricas não somente promovam interação estável, como também a formação de heterodímeros sobre os homodímeros, a partir de uma mistura de monômeros. "Protuberâncias" são construídas para substituir as pequenas cadeias laterais de aminoácidos da interface do primeiro polipeptídeo por cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou similar às protuberâncias são, opcionalmente, criadas sobre a interface do segundo polipeptídeo, pela substituição de grandes cadeias laterais de aminoácidos por cadeias menores (por exemplo, alanina ou treonina). A seqüência de imunoglobulina, preferencialmente, mas não necessariamente, é um domínio constante da imunoglobulina. O componente imunoglobulina nas quimeras da presente invenção podem ser obtidos a partir dos subtipos IgGi, IgG2, IgG3 ou IgG4, IgA1 IgE, IgD ou IgM, mas preferencialmente, IgGi ou IgG3.

O termo "região Fc" no presente é usado para definir uma região C-terminal de uma imunoglobulina de cadeia pesada, incluindo seqüência nativa de regiões Fc e regiões Fc variantes. Embora os limites da região Fc de uma imunoglobulina de cadeia pesada possam variar, a região Fc de cadeia pesada IgG humana é usualmente definida por se estender de um resíduo de aminoácido na posição Cys226, ou de Pro230, até a terminação carboxila deste. A Iisina C-terminal (resíduo 447, de acordo com o sistema de numeração EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a purificação do anticorpo ou pela recombinação do ácido nucleico elaborado geneticamente, que codifica uma cadeia pesada do anticorpo. Consequentemente, uma composição de anticorpos intactos pode compreender populações de anticorpo com todos os resíduos K447 removidos, populações de anticorpo sem resíduos K447 removidos, e populações de anticorpo que possuem uma mistura de anticorpos com e sem resíduos K447.

A menos que indicado de outra forma, no presente pedido a numeração dos resíduos nos domínios constantes de uma cadeia pesada de imunoglobulina é aquela do indicador EU, como em Kabat et ai, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, EU. (1991)), expressamente incorporada ao presente como referência. O "índice EU como em Kabat" refere-se à numeração de resíduos do anticorpo IgGI EU humano.

A "região Fc funcional" possui uma "função efetora" de uma região Fc de seqüência nativa. "Funções efetoras" exemplares incluem ligação C1q; citotoxicidade dependente de complemento; ligação de receptor Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; infra-regulação de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B; BCR), etc. Tais funções efetoras geralmente exigem que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um anticorpo do domínio variável) e podem ser avaliadas usando-se vários testes, conforme divulgado no presente pedido, por exemplo.

Uma "região Fc de seqüência nativa" compreende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma seqüência de aminoácido de uma região Fc encontrada na natureza. Regiões Fc humanas de seqüência incluem uma região Fc de IgGI humana de seqüência nativa (alótipos A e não A), região Fc de lgG2 humana de seqüência nativa, região Fc de lgG3 humana de seqüência nativa, região Fc de lgG4 humana de seqüência nativa, bem como variantes destas acima que ocorrem naturalmente.

Uma "região Fc variante" compreende uma seqüência de aminoácido que difere daquela região Fc de seqüência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido, preferivelmente uma ou mais substituições de aminoácido. Preferencialmente, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácido, comparada a uma região Fc de seqüência nativa ou à região Fc de um polipeptídeo parental, por exemplo, de cerca de uma a cerca de dez substituições de aminoácidos, e preferencialmente de cerca de uma a cerca de cinco substituições de aminoácidos em uma região Fc de seqüência nativa ou na região Fc do polipeptídeo parental. A região Fc variante no presente irá, preferencialmente, possuir ao menos cerca de 80% de homologia com uma região Fc de seqüência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo parental, e mais preferencialmente ao menos cerca de 90% de homologia com esta, mais preferencialmente ao menos cerca de 95% de homologia com esta.

Um anticorpo "isolado" é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de um componente de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que poderiam interferir no uso diagnóstico ou terapêutico do anticorpo, e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos.

Em realizações preferenciais, o anticorpo será purificado (1) para mais que 95% em peso de anticorpo, como determinado pelo método Lowry, e mais preferencialmenye mais que 99% em peso, (2) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de N-terminal ou seqüência de aminoácido interna pelo uso de um sequenciador de copo giratório, ou (3) até homogeneidade por SDS-PAGE sob condições de redução ou não redução usando-se Coomassie blue ou, preferencialmente, silver stain. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes, desde que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não esteja presente. Normalmente, no entanto, o anticorpo isolado será preparado por ao menos uma etapa de purificação.

Os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" são usados alternadamente no mais amplo sentido e incluem anticorpos monoclonais (por exemplo, anticorpos monoclonais completos ou intactos), anticorpos policlonais, anticorpos multivalentes, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos desde que eles exibam a atividade biológica desejada) e podem também incluir certos fragmentos de anticorpos (conforme descrito em maiores detalhes no presente pedido). Um anticorpo pode ser humano, humanizado e/ou de afinidade madura.

O termo "variável" refere-se ao fato de que certas porções do domínio variável diferenciam-se extensivamente na seqüência entre anticorpos e são usadas na ligação e especificidade de cada anticorpo específico ao seu antígeno específico. No entanto, a variabilidade não é distribuída uniformemente por todos os domínios variáveis dos anticorpos. Ela está concentrada em três segmentos chamados regiões determinadas por complementaridade (CDRs) ou regiões hipervariáveis, ambas nos domínios variáveis da cadeia leve e cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas de domínios variáveis são chamadas de regiões de estrutura (FR). Os domínios variáveis das cadeias leve e pesada nativas compreendem cada um, quatro regiões FR adotando amplamente uma configuração folha dobrada β, conectada por três CDRs1 na qual formam alças que se conectam, e em alguns casos formam parte da estrutura folha dobrada β. As CDRs em cada cadeia são mantidas bem juntas pelas regiões FR e, com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação do antígeno dos anticorpos (consulte, Kabat et ai, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Os domínios constantes não estão diretamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, como participação do anticorpo na citotoxicidade celular dependente de anticorpo.

A digestão de anticorpos por papaína produz dois fragmentos de ligação de antígeno idênticos, chamados fragmentos "Fab", cada um com um único sítio de ligação de antígeno, e um fragmento "Fc" residual, cujo nome reflete sua capacidade para cristalizar de imediato. O tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab')2 que possui dois sítios de combinação de antígeno e é ainda capaz de realizar reticulação com o antígeno.

"Fv" é um fragmento mínimo de anticorpo que contém um reconhecimento de antígeno e sítio de ligação completos. Nos tipos de Fv de cadeias duplas, esta região consiste de um dímero de uma cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve em estreita associação não covalente. Nos tipos de Fv de cadeia simples, um domínio variável de cadeia leve e um de cadeia pesada podem ser ligados covalentemente por um Iigante peptídico flexível, como aquele em que as cadeias leve e pesada podem se associar em uma estrutura análoga "diméria" àquela de tipo de Fv de cadeia dupla. É nesta configuração que as três CDRs de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação de antígeno na superfície do dímero VH-VL. Coletivemente, as seis CDRs conferem especificidade de ligação de antígeno ao anticorpo. No entanto, até um único domínio variável (ou metade de um Fv que compreende somente três CDRs específicas para um antígeno) possui a capacidade de reconhecer e se ligar a um antígeno, embora com afinidade mais baixa do que aquela do sítio de ligação completo.

O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Fragmentos Fab' diferem de fragmentos Fab pela adição de poucos resíduos na terminação carboxila de um domínio CH1 da cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab-SH é a designação no presente pedido para Fab' em que o(s) resíduo(s) cisteína dos domínios constantes produzem pelo menos um grupo tiol livre. Fragmentos do anticorpo F(ab')2 foram, originalmente, produzidos como pares de fragmentos Fab' que possuem dobradiça de cisteínas entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos são também conhecidos.

As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquer espécie de vertebrado podem ser designadas para um ou dois tipos claramente distintos, chamados kappa (κ) e lambda (λ), baseados na seqüência de aminoácidos de seus domínios constantes.

Dependendo da seqüência de aminoácido do domínio constante de suas cadeias pesadas, imunoglobulinas podem ser designadas para diferentes "classes". Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA1 IgD, IgE, IgG, e IgM, e várias destas podem também ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgAI e lgA2. Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados de α, δ, ε, γ, e μ, respectivamente. As subunidades de estruturas e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.

"Fragmentos de anticorpos" compreendem somente uma porção de um anticorpo intacto, em que a porção mantém, preferencialmente, ao menos uma, preferencialmente a maioria ou todas as funções normalmente associadas com essa porção, quando presente em um anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e fragmentos Fv; diacorpos, anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos. Em uma realização, um fragmento de anticorpo compreende um sítio ligação de antígeno do anticorpo intacto e, dessa forma, mantém a capacidade de se ligar ao antígeno. Em outra realização, um fragmento de anticorpo, por exemplo, aquele que compreende a região Fc, mantém pelo menos uma das funções biológicas normalmente associadas com a região Fc quando presente em um anticorpo intacto, como ligação FcRn1 modulação de meia vida do anticorpo, função ADCC e ligação complementar. Em uma realização, um fragmento de anticorpo é um anticorpo monovalente que tem uma meia vida in vivo substancialmente similar a um anticorpo intacto. Por exemplo, tal como um fragmento de anticorpo pode compreender um braço de ligação de antígeno ligado a uma seqüência Fc capaz de conferir estabilidade para o fragmento in vivo.

Os termos "região hipervariável", "HVR" ou "HV", quando usados no presente pedido referem-se às regiões de um domínio variável do anticorpo que são hipervariáveis na seqüência e/ou formas estruturalmente definidas como alças. Geralmente, anticorpos compreendem seis regiões hipervariáveis, três na VH (H1, H2, H3), e três na VL (L1, L2, L3). Uma série de delineamentos de regiões hipervariáveis está em uso e são englobadas no presente. As Regiões Determinadas por Complementaridade de Kabat (CDRs) são baseadas na variabilidade da seqüência e são mais comumente utilizadas (Kabat et ai, Sequences of Proteiris of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia1 ao contrário, refere-se à localização das alças estruturais (Chothia e Lesk J. Moi Biol. 196:901-917 (1987)). As regiões hipervariáveis AbM representam um acordo entre as CDRs de Kabat e alças estruturais de Chothia, e são usadas pelo programa de modelação de anticorpo AbM da Oxford Molecular. As regiões hipervariáveis de "contato" são baseadas em uma análise das estruturas cristalinas complexas disponíveis. Os resíduos de cada uma destas regiões hipervariáveis são apontados abaixo.

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Regiões hipervariáveis podem compreender "regiões hipervariáveis estendidas", como a seguir: 24 a 36 ou 24 a 34 (L1), 46 a 56 ou 50 a 56 (L2) e 89 a 97 (L3) em VL e 26 a 35 (H1), 50 a 65 ou 49 a 65 (H2) e 93 a 102, 94 a 102 ou 95 a 102 (H3) em VH. Os resíduos do domínio variável são numerados de acordo com Kabat et ai, acima, para cada uma destas definições.

"Região de estrutura" ou resíduos "FR" são aqueles resíduos de domínio variável, exceto os resíduos de região hipervariável, conforme definido no presente pedido.

O termo "anticorpo monoclonal", como usado no presente, refere- se a um anticorpo de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ou ligam-se ao(s) mesmo(s) epitopo(s), exceto por possíveis variantes que podem aparecer durante a produção do anticorpo monoclonal, tais variantes geralmente estando presentes em menores quantidades. Tal anticorpo monoclonal tipicamente inclui um anticorpo que compreende uma seqüência de polipeptídeo que se liga a um alvo, em que a seqüência de polipeptídeo de ligação alvo foi obtida por um processo que inclui a seleção de uma seqüência de polipeptídeo de ligação alvo única de uma pluralidade de seqüências de poplipepídeos. Por exemplo, o processo de seleção pode ser a seleção de um único clone de uma pluralidade de clones, como um grupo de clones de hibridoma, clones de fago ou clones de DNA recombinante. Deve-se entender que a seqüência de ligação alvo selecionada pode, também, ser alterada, por exemplo, para melhorar a afinidade para este alvo, para humanizar a seqüência de ligação alvo, para melhorar sua produção na cultura celular, para reduzir sua imunogenicidade in vivo, para criar anticorpo multiespecífico, etc., e que um anticorpo que compreende a seqüência de ligação alvo alterada é também um anticorpo monoclonal desta invenção. Em contraste com preparações de anticorpo policlonal que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antígeno. Além disso, para suas especificidades, as preparações de anticorpos monoclonais são vantajosas, pois elas são tipicamente descontaminadas de outras imunoglobulinas. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, é não sendo construído como produção requerida do anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais para serem usados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, o método de hibridoma (por exemplo., Kohler et ai, Nature, 256:495 (1975); Harlow et ai, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling et ai, em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de DNA recombinantes (consulte, por exemplo., patente US 4.816.567), tecnologias de exibição por fago (consulte, por exemplo, Clackson et ai, Nature, 352:624-628 (1991); Marks et ai, J. Mol. Bioi, 222:581-597 (1991); Sidhu et ai, J. Mol. Bioi 338(2):299-310 (2004); Lee et ai, J./Wo/.S/o/.340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sei. EUA 101 (34): 12467-12472 (2004); e Lee et ai J. Immunol. Methods 284(1-2): 119- 1 32 (2004), e tecnologias para produção de anticorpos humanos e similares a humanos em animais que possuem partes ou todos os Ioci de imunoglobulina ou genes que codificam seqüências de imunoglobulina humana (consulte, por exemplo, documento WO 1998/24893; documento WO 1996/34096; documento WO 1996/33735; documento WO 1991/10741; Jakobovits et ai, Proc. Nati Acad. Sei. EUA, 90:2551 (1993); Jakobovits et ai, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et ai, Year in Immuno., 7:33 (1993); patentes US 5.545.806, 5.569.825, 5.591.669 (todas da GenPharm), 5.545.807, documento WO 1997/17852, patentes US 5.545.807, 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126; 5.633.425 e 5.661.016; Marks et ai, Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Lonberg et ai, Nature, 368: 812- 813 (1994); Fishwild et ai, Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); e Lonberg e Huszar, Intern.

Rev. Immunoi, 13: 65-93 (1995).

Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) são anticorpos quiméricos que contêm seqüência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Em sua maioria, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor), nos quais resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador), como camundongo, rato, coelho ou primata não humano tendo especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns exemplos, resíduos da região de estrutura (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos correspondentes não humanos. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para, além disso, refinar o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs são aquelas de uma seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado, opcionalmente, também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) da imunoglobulina, tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, consulte Jones et ai, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et ai, Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Bioi 2:593-596 (1992). Consulte também os seguintes artigos de revisão e referências citadas nestes: Vaswani e Hamilton, Ann. Allergy1 Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soe. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle e Gross1 Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).

Anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) possuem uma porção das cadeias pesada e/ou leve, idêntica ou homóloga às seqüências correspondentes nos anticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencente a uma classe ou subclasse específica de anticorpo, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntica ou homóloga às seqüências correspondentes nos anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes à outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que eles exibam a atividade biológica desejada (patente US 4.816.567; e Morrison et ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA 81:6851-6855 (1984)).

Anticorpo humanizado, como usado no presente pedido, é um subconjunto de anticorpos quiméricos.

Fragmentos de anticorpos "Fv de cadeia única" ou "scFv" compreendem os domínios VH e VL do anticorpo, em que estes domínios estão presentes em uma única cadeia polipeptídica. Geralmente, o polipeptídeo scFv também compreende um polipeptídeo Iigante entre os domínios VH e VL que permite ao scFv formar a estrutura desejada para a ligação do antígeno. Para uma revisão de scFv consulte Pluckthun, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, Nova York, páginas 269-315 (1994).

Um "antígeno" é um antígeno pré-determinado ao qual um anticorpo pode se ligar seletivamente. O antígeno alvo pode ser um polipeptídeo, carboidrato, ácido nucleico, lipídeo, hapteno ou outros compostos de ocorrência natural ou sintéticos. Preferivelmente, o antígeno alvo é um polipeptídeo.

O termo "diacorpos" refere-se a fragmentos de anticorpos pequenos com dois sítios de ligação de antígeno, cujos fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia do polipeptídeo (VH - VL). Pelo uso de um Iigante que é muito curto para permitir pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação de antígeno. Diacorpos estão descritos mais inteiramente em, por exemplo, patente EP 404.097; documento WO 93/11161; e Hollinger et ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993).

Um "anticorpo humano" é aquele que possui uma seqüência de aminoácido que corresponde àquela de um anticorpo produzido por um humano e/ou que foi produzido usando-se qualquer uma das técnicas para se fazer anticorpos humanos, conforme divulgado no presente pedido. Esta definição de um anticorpo humano especificamente exclui um anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação de antígenos não humanos.

Um anticorpo de "afinidade madura" é aquele com uma ou mais alterações em uma ou mais CDRs deste, o que resulta em um aprimoramento na afinidade do anticorpo para o antígeno, comparado com um anticorpo parental que não possui aquela(s) alteração(ões). Anticorpos de afinidade madura preferidos terão afinidades nanomolar ou até afinidades picomolar para o antígeno alvo. Anticorpos de afinidade madura são produzidos por processos conhecidos no estado da técnica. Marks et ai Bio/Technology 10:779-783 (1992) descreve maturação de afinidade por mistura de domínio VH e VL. Mutagênese aleatória de CDR e/ou resíduos de estrutura é descrita por: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sei, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et ai Gene 169:147-155 (1995); Yelton et ai J. Immunol. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et ai, J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); e Hawkins etal, J. Mol. Bioi 226:889-896 (1992). "Funções efetoras" do anticorpo referem-se àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de seqüência nativa ou uma região Fc de seqüência de aminoácido variante) de um anticorpo, e variam com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem: ligação C1q e citoxicidade dependente de complemento; ligação do receptor Fc; citoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose, baixo controle de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B); e ativação de célula B.

"Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo" ou "ADCC" refere-se a uma forma de citotoxicidade na qual Ig secretada ligada aos receptores Fc (FcRs) presentes em certas células citotóxicas (por exemplo, células Natural Killer (NK), neutrófilos e macrófagos) permitem que estas células efetoras citotóxicas se liguem especificamente a uma célula alvo que produz antígeno e subseqüentemente destruam a célula alvo com citotoxinas.

Os anticorpos "armam" as células citotóxicas e são absolutamente necessários para tal destruição. As células primárias para mediação de ADCC, células NK, expressam somente FcyRIII, enquanto que monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para avaliar atividade ADCC de uma molécula de interesse, um teste ADCC in vitro, como descrito nas patentes US 5.500.362 ou 5.821.337 ou Presta, patente US 6.737.056, pode ser realizado. Células efetoras úteis para tais testes incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células Natural Killer (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal, como divulgado em Clynes etal. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

"Células efetoras humanas" são leucócitos que expressam um ou mais FcRs e desempenham funções efetoras. Preferencialmente, as células expressam pelo menos FcyRIII e desempenham função efetora ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que mediam ADCC incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC), células natural killer (NK)1 monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; com PBMCs e células NK sendo preferidas. As células efetoras podem ser isoladas de uma fonte nativa, por exemplo, do sangue.

"Receptor Fc" ou "FcR" descrevem um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de seqüência nativa. Além disso, um FcR preferido é aquele que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui subclasses dos receptores FcyRI, FcyRII, e FcyRIII, incluindo variantes alélieas e, alternativamente, formas unidas destes receptores. Receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor de ativação") e FcyRIIB (um "receptor de inibição"), que têm seqüências similares de aminoácidos que diferem primeiramente nos domínios citoplasmáticos destes. Receptor de ativação FeyRIIA contém um motivo de ativação de imuno-receptor baseado em tirosina (ITAM) em seu domínio citoplasmático. Receptor de inibição FeyRIIB contém um motivo de inibição de imuno-receptor baseado em tirosina (ITIM) em seu domínio citoplasmático. (consulte revisão M. em Daéron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRs foram revisados em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capei et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et ai, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Outros FcRs1 incluindo aqueles a serem identificados no futuro, estão englobados pelo termo "FcR" no presente pedido. O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável por transferir as IgGs maternas para os fetos (Guyer et ai, J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et ai, J. Immunol. 24:249 (1994)) e regula homeostase de imunoglobulinas.

O documento WO 00/42072 (Presta) descreve anticorpos variantes com ligação aos FcRs melhoradas ou diminuídas. O conteúdo desta publicação de patente está especificamente incorporado ao presente pedido como referência. Consulte, também, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591- 6604 (2001).

Métodos para medir ligação a FcRn são conhecidos (consulte, por exemplo, Ghetie 1997, Hinton 2004). Ligação a FcRn humano in vivo e meia- vida do soro de polipepídeos de ligação de alta afinidade a FcRn podem ser testados, por exemplo, em camundongos transgênicos ou linhagens de células humanas transfectadas que expressam FcRn humano, ou em primatas administrados com polipeptídeos Fc variantes.

"Citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" refere-se à lise de uma célula alvo na presença de complemento. Ativação da via de complemento tradicional é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (C1q) aos anticorpos (da subclasse apropriada) que são ligados aos seus antígenos cognatos. Para avaliar ativação de complemento, um teste CDC, por exemplo, como descrito em Gazzano- Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996), pode ser realizado.

Polipeptídeos variantes com seqüências de aminoácido da região Fc alteradas e capacidade de ligação C1q aumentada ou diminuída estão descritos na patente US 6.194.551B1 e documento WO 99/511642. O conteúdo destas publicações de patente está especificamente incorporado ao presente como referência. Consulte também, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

O termo "polipeptídeo que contém região Fc" refere-se a um polipeptídeo, como um anticorpo ou imunoadesina (consulte definições abaixo), que compreende uma região Fe. A lisina C-terminal (resíduo 447, de acordo com o sistema de numeração EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a purificação do polipeptídeo ou pela modificação recombinante do ácido nucleico elaborado que codifica o polipeptídeo. Consequentemente, a composição que compreende um polipeptídeo que tem uma região Fc1 de acordo com esta invenção pode compreender os polipeptídeos com K447, com todo K447 removido ou uma mistura dos polipeptídeos com ou sem o resíduo K447.

Um anticorpo "de bloqueio" ou um anticorpo "antagonista" é aquele que inibe ou reduz as atividades biológicas do antígeno ao qual se liga. Anticorpos de bloqueio ou anticorpos antagonistas preferidos inibem substancialmente ou completamente a atividade biológica do antígeno.

Administração "crônica" refere-se à administração do(s) agente(s) em um modo contínuo como contrário a um modo agudo, de forma que mantenha o efeito terapêutico inicial (atividade) por um período de tempo prolongado. Administração "intermitente" é o tratamento que não é feito consecutivamente sem interrupção, mas é, de preferência, de natureza cíclica.

Uma "disfunção" ou "doença" é qualquer condição que se beneficiaria do tratamento com uma substância/molécula ou método da invenção. Isto inclui disfunções ou doenças crônicas e agudas, incluindo aquelas condições patológicas que predispõe o mamífero para a disfunção em questão. Exemplos não Iimitantes de disfunções a serem tratadas no presente incluem tumores malignos e benignos; carcinoma, blastoma e sarcoma.

Os termos "disfunção proliferativa celular" e "disfunção proliferativa" referem-se às disfunções que estão associados a algum grau de proliferação celular anormal. Em uma realização, a disfunção celular proliferativa é câncer.

"Tumor", como usado no presente pedido, refere-se a todo crescimento e proliferação celular neoplásica, maligno ou benigno, e a todas as células e tecidos pré-cancerosos e cancerosos. Os termos "câncer", "canceroso", "disfunção proliferativa celular", "disfunção proliferativa" e "tumor" não são mutuamente exclusivos como referido no presente pedido. Os termos "câncer" e "canceroso" referem-se ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento/proliferação celular irregular. Exemplos de câncer incluem, mas não se limitam a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia. Exemplos mais específicos de tais cânceres incluem câncer celular escamoso, câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célula não-pequena, adenocarcinoma de pulmão, carcinoma escamoso de pulmão, câncer de peritônio, câncer hepatocelular, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma glandular salivar, câncer de rim, câncer de fígado, câncer de próstata, câncer de vulva, câncer de tireóide, carcinoma hepático, câncer gástrico, melanoma e vários tipos de câncer de cabeça e pescoço. A desregulação de angiogênese pode levar a muitas disfunções que podem ser tratadas por composições e métodos da invenção.

Estas disfunções incluem ambas as condições não-neoplásicas e neoplásicas. Neoplásicas incluem, mas não se limitam àquelas descritas acima. Distúrbios não neoplásticos incluem, mas não se Iimtam a hipertrofia indesejada ou anormal, artrite, artrite reumatóide (RA), psoríase, placas psoriáticas, sarcoidose, arterioesclerose, placas arterioescleróticas, diabética e outras retinopatias proliferativas incluindo retinopatia da prematuridade, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degeneração macular relativas à idade, neovascularização da córnea, neovascularização de enxerto de córnea, rejeição de enxerto de córnea, neovascularização da retina/coroidal, neovascularização da íris (rubeose), doenças neovasculares oculares, restenose vascular, deformações arteriovenosas (AVM), meningioma, hemangioma, angiofibroma, hiperplasias da tireóide (incluindo doenças de Grave), da córnea e outro tecido de transplante, inflamação crônica, inflamação de pulmão, lesão/ARDS aguda de pulmão, sepsia, hipertensão pulmonar primária, efusão pulmonar maligna, edema cerebral (por exemplo, associados com derrame agudo/lesão intracraniana/trauma), inflamação sinovial, pano formação em RA, miosite ossificante, formação de osso hipertrófica, osteoartrite (OA), ascites refratárias, doenças policísticas ovarianas, endometrioses, doenças de fluído do terceiro espaço (pancreatites, síndrome de compartimento, queimaduras, doenças de intestino), fibróide uterina, parto prematuro, inflamações crônicas tal como IBD (doenças de Crohn e colites ulcerativas), rejeição alográfica renal, doenças inflamatórias de intestino, síndrome nefrótica, crescimento indesejado ou anormal de massa de tecido (não-câncer), articulações hemofílicas, cicatrizes hipertróficas, inibição de crescimento de cabelo, síndrome Osler-Weber, fibroplasias retrolental granuloma piogênico, escleroderma, tracoma, adesões vasculares, sinovites, dermatites, pré-eclampsia, ascites, efusão pericardial (como aquela associada com pericardite) e efusão pleural.

Como usado no presente, "tratamento" refere-se à intervenção clínica em uma tentativa para alterar o curso natural do indivíduo ou célula sendo tratada, e pode ser apresentado também por profilaxia ou durante o curso da patologia clínica. Efeitos desejados de tratamento incluem prevenção de ocorrência ou recorrência da doença, alívio de sintomas, diminuição de quaisquer conseqüências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção de metástases, diminuição da taxa de progressão da doença, melhora ou estados de alívio da doença, e moderação ou prognósticos de melhora. Em algumas realizações, anticorpos são usados para retardar o desenvolvimento de uma doença ou disfunção.

Um "indivíduo" é um vertebrado, preferencialmente um mamífero, mais preferencialmente um humano. Mamíferos incluem, mas não se limitam a, animais de criação (como vacas), animais para esporte, animais domésticos (como gatos, cachorros e cavalos), primatas, camundongos e ratos.

"Mamífero", para os propósitos do tratamento, refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e de criação, de zoológico, para esportes, ou animais de estimação, como cachorros, cavalos, gatos, vacas, etc. Preferencialmente, o mamífero é um humano.

Uma "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, nas dosagens e pelo período de tempo necessário para atingir o resultado terapêutico ou profilático desejado.

Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de uma substância/molécula pode variar de acordo com fatores como o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade da substância/molécula, agonista ou antagonista, em obter uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também aquela na qual qualquer efeito tóxico ou prejudicial da substância/molécula, agonista ou antagonista, é excedido pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilaticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, na dosagem e pelo período de tempo necessário para atingir o resultado profilático desejado. Tipicamente, mas não necessariamente, desde que uma dose profilática seja usada em sujeitos, anterior à doença ou em um estágio inicial, a quantidade profilaticamente eficaz será menor que a quantidade terapeuticamente eficaz.

O termo "agente citotóxico" como usado no presente refere-se a uma substância que inibe ou previne a função de células e/ou causa destruição de células. O termo tem a intenção de incluir isótopos radioativos (por exemplo, At211, I131, I125, Y901 Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterápicos, por exemplo, metotrexato, adriamicina, alcalóides vinca (vincristina, vinblastina, etoposídeo), doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucila, daunorubicina ou outros agentes intercalantes, enzimas e fragmentos destes, como enzimas nucleoliticas, antibióticos e toxinas, como toxinas de molécula pequena ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes destes, e os vários agentes anti-tumor ou anti-câncer divulgados abaixo. Outros agentes citotóxicos são descritos abaixo. Um agente tumoricida causa destruição de células tumorais.

Um "agente quimioterápico" é um composto químico útil no tratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentes alquilantes, como tiotepa e ciclosfosfamida CYTOXAN®; alquil sulfonados como busulfano, improsulfano e piposulfano; aziridinas como benzodopa, carboquona, meturedopa, e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenemelamina, trietilenefosforamida, trietilenetiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); delta-9-tetraidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapacona; lapacol; colchicinas; ácido betulínico; uma camptotecina (incluindo a sintética análoga topotecano (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecano, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, scopolectina, e 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo adozelesina, carzelesina e bizelesina sintética análogas); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposida; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo as sintéticas análogas, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostardas de nitrogênio como clorambucila, clornafazina, clolofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloreto óxido de mecloretamina, melfalano, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrosureas como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, e ranimnustina; antibióticos como os antibióticos enedina (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gammall e caliqueamicina omega 11 (consulte, por exemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluindo dinemicina A; uma esperamicina; bem como cromóforos de neocarzinostatina e cromóforos de antiobióticos enedina cromoproteínas relacionadas), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L- norleucina, doxorubicina ADRIAMYCIN® (incluindo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina e deoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabólitos como metotrexato e 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti- adrenais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; ácido fólico restabelecedor como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracil; ansacrina; bestrabucila; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; uma epotilona; etoglucídeo; nitrato de gálio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubici na; losoxantrona; 2-etil hidrazida; procarbazina; complexos polissacarídeos PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxana; rizoxina; sizofirana; spirogermanio; ácido tenuazonico; triaziquona; 2,2',2"-tricloro trietil amina; tricotecenos (especialmente toxina T2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromana; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); tiotepa; taxóides, por exemplo, paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE™ livre de Cremofor1 formulação de paclitaxel de nanopartículas de albumina elaborada (American Pharmaceutical Partners1 Sehaumberg1 Illinois) e doxetaxel TAXOTERE® (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, France); cloranbucila; gencitabina (GEMZAR®); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos da platina como cisplatina e carboplatina; vinblastina (VELBAN®); platina; etoposide (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); oxaliplatina; leucovovina; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inibidor topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinóides como ácido retinóico; capecitabina (XELODA®); sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer dos acima; bem como combinações de dois ou mais dos acima tais como CHOP1 uma abreviação para uma terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina e prednisolona, e FOLFOX, uma abreviação para um regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATIN™) combinado com 5-FU e leucovorina.

Também incluídos nesta definição estão os agentes anti- hormonais que agem para regular, reduzir, bloquear ou inibir os efeitos de hormônios que podem promover o crescimento do câncer, e estão muitas vezes na forma de tratamento sistêmico ou do corpo inteiro. Eles podem ser os próprios hormônios. Exemplos incluem anti-estrógenos e moduladores seletivos do receptor de estrógeno (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo tamoxifen NOLVADEX®), raloxifeno EVISTA®, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona e toremifene FARESTON®; anti-progesteronas; infra-reguIadores de receptores de estrógeno (ERDs); agentes de função de supressão ou bloqueio dos ovários, por exemplo, agonistas de hormônios que liberam hormônio luteinizante (LHRH) como acetato de Ieuprolida LUPRON® e ELIGARD®, acetato de goserelina, acetato de buserelina e tripterelina; outros anti- androgênicos como flutamida, nilutamida e bicalutamida; e inibidores aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrógeno nas glândulas adrenais como, por exemplo, 4(5)-imidazolas, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano (ARO MAS IN®), formestano, fadrozola, vorozola RIVISOR®, Ietrozola FEMARA®, e anastrozola ARIMIDEX®. Além disso, tal definição de agentes quimioterápicos inclui bisfosfonatos como clodronato (por exemplo, BONEFOS® ou O STAC®), etidronato DIDROCAL®, NE-58095, ácido zoledrônico/zoledronato ZOMETA®, alendronato FOSAMAX®, pamidronato AREDIA®, tiludronato SKELID®, ou risedronato ACTONEL®; bem como troxacitabina (uma 1,3-dioxolana nucleosídeo citosina análoga); oligonucleotídeos anti-sentido, em específico aqueles que inibem expressão de genes nas vias de sinalização implicadas na proliferação celular anormal como, por exemplo, PKC-alfa, Raf1 H-Ras, e receptor do fator de crescimento epidermal (EGF-R); vacinas como vacina THERATOPE® e vacinas de terapia g6enica, por exemplo, vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN®, e vacina VAXID®; inibidor topoisomerase 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; lapatinib ditosilato (um duplo inibidor de molécula pequena de tirosina quinase EGFR e ErbB2 também conhecido como GW572016); e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um dos acima.

Um "agente inibitório de crescimento", quando usado no presente, refere-se a um composto ou composição que inibe o crescimento de uma célula, (como uma célula que expressa DLL4) tanto in vitro como in vivo. Dessa forma, o agente inibitório de crescimento pode ser aquele que reduz significativamente a porcentagem de células (como células que expressam DLL4) na fase S. Exemplos de agentes inibitórios de crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (em um local, exceto na fase S), como agentes que induzem a interrupção de G1 e interrupção da fase M. Bloqueadores clássicos da fase M incluem as vincas (vincristina e vinblastina), taxanos e inibidores topoisomerase Il tais como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposídeo e bleomicina. Esses agentes que capturam G1 também se espalham na captura da fase S1 por exemplo, agentes alcalinizantes de DNA tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracil e ara-C. Informações adicionais podem ser encontradas em The Molecular Basis of Câncer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, entitulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et ai (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente pág. 13. Os taxanos (paclitaxel e docetaxel) são drogas anti-câncer, ambas derivadas do teixo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado do teixo europeu, é um análogo semi-sintético do paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel e docetaxel promovem a montagem de microtúbulos de dímeros de tubulina e estabilizam microtúbulos pela prevenção da despolimerização, que resulta na inibição de mitose nas células.

"Doxorubicina" é um antibiótico antraciclina. A nomenclatura química completa de doxorubicina é (8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-trideoxi-a-L- lixo-hexapiranosil)oxi]-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11 -trihidroxi-8-(hidroxiacetil)-1 - metoxi-5,12-naftacenediona.

Uma "doença neovascular intraocular" é uma doença caracterizada pela neovascularização ocular. Exemples de doenças neovascular intraoculares incluem, mas não se limitam a, retinopatias proliferativas, neovascularização coroidal (CNV), degeneração macular relativa à idade (AMD)1 retinopatia diabética ou outras retinopatias relacionadas à isquemia, edema macular diabético, miopia patológica, doença de von Hippel- Lindau, histoplasmose do olho, oclusões da veia da retina, incluindo Oclusão da Veia Central da Retina (CRVO), neovascularização da córnea, neovascularização da retina, etc.

A "patologia" de uma doença inclui todos os fenômenos que compreendem o bem- estar do paciente. Para câncer, isto inclui, sem limitação, crescimento celular anormal ou descontrolado, metástase, interferência no funcionamento normal de células vizinhas, liberação de citocinas ou outros produtos secretórios em níveis anormais, supressão ou agravação de resposta inflamatória ou imunológica, etc.

Administração "em combinação com" um ou mais agentes terapêuticos adicionais inclui simultânea (concorrente) e administração consecutiva, em qualquer ordem.

"Carreadores", como usado no presente, inclui carreadores farmaceuticamente aceitáveis, excipientes ou estabilizantes que sejam atóxicos para a célula ou mamífero sendo exposto a estas dosagens e concentrações empregadas. Freqüentemente o carreador fisiologicamente aceitável é uma solução aquosa tamponada em pH. Exemplos de carreadores fisiologicamente aceitáveis incluem tampões como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptídeo de baixo peso molecular (menos que aproximadamente 10 resíduos); proteínas, como soro de albumina, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; açúcares de álcool como manitol ou sorbitol; contra-íons formadores de sal como sódio; e/ou tensoativos não iônicos como TWEENpolietileno glicol (PEG) e PLURONICS™.

Um "lipossomo" é uma vesícula pequena composta de vários tipos de lipídeos, fosfolipídeos e/ou tensoativo, que é útil para a entrega de uma droga (como um polipeptídeo DLL4 ou anticorpo deste) para um mamífero. Os componentes do lipossomo estão comumente dispostos em uma formação de bicamada, similar ao arranjo lipídico das membranas biológicas.

Os termos "VEGF" e "VEGF-A" são usados alternadamente para se referir ao fator de crescimento celular endotelial vascular de 165 aminoácidos e fatores de crescimento celular endotelial vasculares relacionados, com 121, 145, 183, 189 e 206 aminoácidos, conforme descrito por Leung et al. Science, 246:1306 (1989), e Houck et ai Moi Endocrin., 5:1806 (1991) e Robinson & Stringer, Journal of Cell Science, 144(5):853-865 (2001), junto com as forma alélicas que ocorrem naturalmente e formas processadas destes.

Um "antagonista do VEGF" refere-se a uma molécula capaz de neutralizar, bloquear, inibir, anular, reduzir ou interferir nas atividades do VEGF, incluindo sua ligação a um ou mais receptores do VEGF Antagonistas do VEGF incluem anticorpos anti-VEGF e fragmentos de ligação de antígeno destes, moléculas receptoras e derivados que se ligam especificamente ao VEGF, dessa forma, seqüestrando sua ligação para um ou mais receptores, anticorpos receptores anti-VEGF e antagonistas de receptores VEGF, como inibidores de tirosina quinase VEGFR de molécula pequena, proteínas de fusão, por exemplo, VEGF-Trap (Regeneron), VEGF121-gelonin (Peregrine). Antagonistas do VEGF também incluem antagonistas variantes do VEGF, moléculas antisense dirigidas ao VEGF, aptâmeros de RNA e ribozimas contra VEGF ou receptores do VEGF.

Um "anticorpo anti-VEGF" é um anticorpo que se liga ao VEGF com afinidade e especificidade suficientes. O anticorpo anti-VEGF pode ser usado como um agente terapêutico para atingir e interferir em doenças ou condições em que a atividade do VEGF esteja envolvida. Consulte, por exemplo, patentes US 6.582.959, 6.703.020; documento WO 98/45332; documento WO 96/30046; documento WO 94/10202, documento WO 2005/044853; patente EP 0666868B1; pedidos de patente US 20030206899, 20030190317, 20030203409, 20050112126, 20050186208 e 20050112126; Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004) e documento WO 2005012359. Um anticorpo anti-VEGF usualmente não se ligará a outro VEGF homólogo, como VEGF-B ou VEGF-C, nem a outros fatores de crescimento, como PIGF, PDGF ou bFGF. O anticorpo anti-VEGF "Bevacizumab (BV)", também conhecido como "rhuMAb VEGF" ou "Avastin®", é um anticorpo monoclonal recombinante anti-VEGF humanizado recombinante, gerado de acordo com Presta et al. Câncer Res. 57:4593-4599 (1997). Ele compreende regiões de estrutura de IgGI humana mutadas e regiões determinantes de complementaridade de ligação de antígeno do A4.6.1, anticorpo monoclonal anti-hVEGF murino, que bloqueia a ligação do VEGF humano aos seus receptores. Aproximadamente 93% da seqüência de aminoácido de Bevacizumab, incluindo a maioria das regiões de estrutura, é derivada de IgGI humana, e cerca de 7% da seqüência é derivada do anticorpo A4.6.1. murino. Bevacizumab tem um peso molecular de aproximadamente 149.000 daltons e é glicosilado. Bevacizumab e outros anticorpos anti-VEGF humanizados, incluindo o fragmento do anticorpo anti- VEGF "ranibizumab", também conhecido como "Lucentis®", estão, ainda, descritos na patente US 6.884.879, emitida em 26 de fevereiro de 2005.

Os termos "atividade biológica" e "ativo biologicamente", em relação ao polipeptídeo DLL4, referem-se às propriedades físico-químicas e às funções biológicas associadas ao DLL4. Em algumas realizações, "atividade biológica" do DLL4 inclui uma ou mais de: ligação a um receptor Notch (por exemplo, Notchl1 Notch2, Notch3, Notch4), ativação de um receptor Notch e ativação da sinalização molecular a jusante do receptor Notch. Neste contexto, o termo "modulado" inclui tanto promoção como inibição.

Um "antagonista de DLL4" refere-se a uma molécula capaz de neutralizar, bloquear, inibir, anular, reduzir ou interferir nas atividades de DLL4, incluindo, por exemplo, redução ou bloqueio da ativação do receptor Notch, redução ou bloqueio da sinalização molecular a jusante do receptor Notch, interrupção ou bloqueio de ligação do receptor Notch ao DLL4, e/ou inibição de diferenciação celular endotelial, e/ou inibição de diferenciação arterial. Antagonistas de DLL4 incluem anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno destes, proteínas, peptídeos, glicoproteínas, glicopeptídeos, polissacarídeos, oligossacarídeos, ácidos nucleicos, moléculas bio-orgânicas, peptidomiméticos, agentes farmacológicos e seus metabólitos, seqüências controle de transcrição e tradução, e similares. Antagonistas também incluem moléculas pequenas inibidoras de uma proteína e proteínas de fusão, moléculas receptoras e derivadas que se ligam especificamente a uma proteína, através disso, seqüestrando sua ligação ao seu alvo, antagonistas variantes da proteína, moléculas siRNA dirigidas a uma proteína, moléculas antisense dirigidas a uma proteína, aptâmeros de RNA e ribozimas contra uma proteína. Em algumas realizações, o antagonista de DLL4 é uma molécula que se liga ao DLL4 e neutraliza, bloqueia, inibe, anula, reduz ou interfere em uma ou mais atividades biológicas de DLL4. Em algumas realizações, o antagonista de DLL4 é uma molécula que se liga ao receptor Notch (como Notchl, Notch2, Notch3 e/ou Notch4) e neutraliza, bloqueia, inibe, anula, reduz ou interfere em uma ou mais atividades biológicas de DLL4. Em algumas realizações, o antagonista de DLL4 modula um ou mais aspectos dos efeitos associados ao DLL4, incluindo, mas não se limitando a qualquer redução ou bloqueio da ativação do receptor Notch, redução ou bloqueio da sinalização molecular a jusante do receptor Notch, interrupção ou bloqueio da ligação do receptor Notch ao DLL4, e/ou promoção da proliferação celular endotelial, e/ou inibição da proliferação celular endotelial, e/ou inibição da diferenciação arterial, e/ou inibição da perfusão vascular tumoral, e/ou tratamento e/ou prevenção de um tumor, disfunção proliferativa celular ou um câncer; e/ou tratamento ou prevenção de uma disfunção associada à expressão de DLL4 e/ou atividade e/ou tratamento ou prevenção de uma disfunção associada com a expressão e/ou atividade de receptor Notch.

O termo "composição anti-neoplásica" refere-se a uma composição útil no tratamento de câncer, que compreende pelo menos um agente terapêutico ativo, por exemplo, "agente anti-câncer". Exemplos de agentes terapêuticos (agentes anti-câncer, também denominados "agentes anti-neoplásicos" no presente pedido) incluem, mas não se limitam a, por exemplo, agentes quimioterápicos, agentes inibidores do crescimento, agentes citotóxicos, agentes usados na radioterapia, agentes anti-angiogênese, agentes apoptóticos, agentes anti-tubulina, toxinas e outros agentes para tratar o câncer, por exemplo, anticorpo que neutraliza anti-VEGF, antagonista do VEGF, anti-HER-2, anti-CD20, antagonistas do receptor do fator de crescimento epidermal (EGFR) (por exemplo, um inibidor tirosina quinase), inibidor HER1/EGFR, erlotinib, um inibidor COX-2 (por exemplo, celecoxib), interferons, citocinas, antagonistas (por exemplo, que neutralizam anticorpos) que se ligam a um ou mais dos receptores ErbB2, ErbB3, ErbB4 ou VEGF, inibidores para o receptor tirosina quinase para o fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF) e/ou fator de célula-tronco (SCF) (por exemplo, mesilato de imatinib (Gleevec® Novartis)), TRAIL/Apo2L e outros agentes químicos orgânicos e bioativos, etc.

O termo "pró-droga", como usado neste pedido, refere-se a uma forma precursora ou derivada de uma substância farmaceuticamente ativa que é menos citotóxicas às células tumorais, em comparação à droga parental e é capaz de ser ativada enzimaticamente ou convertida na forma parental mais ativa. Consulte, por exemplo, Wilman1 "Prodrugs in Câncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, páginas 375-382, 615° Encontro Belfast (1986) e Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Deiivery, Borchardt et al., (ed.), páginas 247-267, Humana Press (1985). As pró-drogas desta invenção incluem, mas não se limitam a pró-drogas contendo fosfato, pró-drogas contendo tiofosfato, pró- drogas contendo sulfato, pró-drogas contendo peptídeo, pró-drogas modificadas com D-aminoácido, pró-drogas glicosiladas, pró-drogas contendo beta-lactama, pró-drogas contendo fenoxiacetamida opcionalmente substituídas ou pró-drogas contendo fenilacetamida opcionalmente substituídas, pró-drogas 5-fluorocitosina e outras 5-fluorouridina que podem ser convertidas em drogas citotóxicas livres mais ativas. Exemplos de drogas citotóxicas que podem ser derivadas para uma forma pró-droga para uso nesta invenção incluem, mas não se limitam àqueles agentes quimioterápicos descritos acima.

Um "fator ou agente angiogênico" é um fator de crescimento que estimula o desenvolvimento dos vasos sangüíneos, por exemplo, promove a angiogênese, crescimento endotelial, estabilidade dos vasos sangüíneos e/ou vasculogênese, etc. Por exemplo, fatores angiogênicos, incluem, mas não se limitam a, por exemplo, VEGF e membros da família VEGF, PIGF, família PDGF, família do fator de crescimento do fibroblasto (FGFs), Iigantes TIE (Angiopoietinas), efrinas, ANGPTL3, DLL4, etc. Também inclui fatores que aceleram a cicatrização, como hormônio do crescimento, fator I de crescimento similar à insulina (IGF-I), VIGF, fator de crescimento epidermal (EGF), CTGF e membros desta família, TGF-α e TGF-β. Consulte, por exemplo, Klagsbrun e D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991); Streit e Detmar1 Oncogene, 22:3172-3179 (2003); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999); Tonini et ai., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (por exemplo, Tabela 1 listandofatores angiogênicos) e, Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003).

Um "agente anti-angiogênese" ou "inibidor de angiogênese" refere-se a uma substância de peso molecular pequeno, um polinucleotídeo (incluindo, por exemplo, um inibidor de RNA (RNAi ou RNAsi)), um polipeptídeo, uma proteína isolada, uma proteína recombinante, um anticorpo, proteínas conjugadas ou proteínas de fusão destes, que inibem a angiogênese, vasculogênese ou permeabilidade vascular indesejável, tanto diretamente como indiretamente. Por exemplo, um agente anti-angiogênese é um anticorpo ou outro antagonista para um agente angiogênico, conforme definido acima, por exemplo, anticorpos para VEGF, anticorpos para receptores de VEGF, moléculas pequenas que bloqueiam a sinalização do receptor de VEGF (por exemplo, PTK787/ZK2284, SU6668, SUTENT/SU11248 (malato de sunitinib), AMG706), ou aqueles descritos, por exemplo, no pedido de patente internacional documento WO 2004/113304). Agentes anti-angiogênese também incluem inibidores de angiogênese nativos, por exemplo, endostatina, etc. Consulte, por exemplo, Klagsbrun e D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991); Streit e Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003) (por exemplo, Tabela 3 listando terapia anti-angiogênica em melanoma maligno); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999); Tonini et ai, Oncogene, 22:6549- 6556 (2003) (por exemplo, Tabela 2 listando fatores angiogênicos) e, Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003) (por exemplo, Tabela 1 listando agentes anti- angiogênicos usados em testes clínicos).

Métodos E Composições Da Invenção

A presente invenção está baseada, em parte, na descoberta de que o desenvolvimento vascular é inbido pelo tratamento com um agente que modula a ativação de Delta like-4 (alternadamente denominado "DLL4") da via do receptor Notch. O tratamento com o antagonista de DLL4 resultou em proliferação celular endotelial (EC) aumentada, diferenciação celular endotelial incorreta e desenvolimento arterial impróprio na vasculatura, incluindo vasculatura tumoral. Visivelmente, o tratamento com um anticorpo anti-DLL4 resultou na inibição do crescimento tumoral em diversos cânceres diferentes. Sem se ater à teoria, acredita-se que a proliferação EC aumentada e a diferenciação prejudicada resultem na função vascular tumoral incorreta, levando à inibição do crescimento tumoral. Consequentemente, acredita-se que antagonistas de DLL4 demonstrem uma ampla abordagem eficaz para o tratamento de câncer.

Consequentemente, a invenção fornece métodos, composições, kits e artigos manufaturados para modular (por exemplo, promover ou inibir) os processos envolvidos na angiogênese e para uso em atingir condições patológicas associadas à angiogênese, como câncer.

Contempla-se que, de acordo com a presente invenção, os moduladores de DLL4 e/ou combinações de moduladores de DLL4 e outros agentes podem ser usados para tratar várias disfunções.

Consequentemente, a invenção engloba métodos para inibir a angiogênese usando-se uma quantidade eficaz de um antagonista de DLL4 (como um anticorpo anti-DLL4 ou uma imunoadesina DLL4) para inibir a ativação de DLL4 de receptores Notch (como Notchl, Notch2, Notch3 e/ou Notch4). Em outro aspecto, a invenção fornece métodos para inibir a angiogênese, que compreende administrar uma quantidade eficaz de um antagonista de DLL4 a um sujeito que necessite desse tratamento. Em algumas realizações, o antagonista de DLL4 é capaz de promover a proliferação celular endotelial, inibir a diferenciação celular endotelial, inibir o desenvolvimento arterial e/ou reduzir a perfusão vascular. Em outro aspecto, a invenção fornece métodos para estimular a proliferação celular endotelial tratar, inibir a diferenciação celular endotelial, inibir o desenvolvimento arterial e/ou reduzir a perfusão vascular, que compreende administrar uma quantidade eficaz de um antagonista de DLL4 a um sujeito que necessite desse tratamento.

Exemplos de disfunções neoplásicas a serem tratadas com um anatgonista de DLL4 (como um anticorpo anti-DLL4) incluem, mas não se limitam àquelas descritas pelos termos "câncer" e "canceroso". Condições não- neoplásicas que são receptivas ao tratamento com antagonistas úteis na invenção incluem, mas não se limitam a, por exemplo, hipertrofia indesejada ou anormal, artrite, artrite reumatóide (RA), psoríase, placas psoriáticas, sarcoidose, arterioesclerose, placas arterioescleróticas, edema de infarte do miocárdio, retinopatia diabética e outras retinopatias proliferativas incluindo retinopatia da prematuridade, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degeneração macular relativa à idade, neovascularização da córnea, edema macular diabético, neovascularização da córnea, neovascularização de enxerto de córnea, rejeição de enxerto de córnea, neovascularização da retina/coroidal, neovascularização da íris (rubeose), doenças neovasculares oculares, restenose vascular, malformações arteriovenosas (AVM), meningioma, hemangioma, angiofibroma, hiperplasias da tireóide (incluindo doença de Grave), transplante de córnea e outro tecido, inflamação crônica, inflamação de pulmão, lesão/ARDS aguda de pulmão, sepsia, hipertensão pulmonar primária, efusão pulmonar maligna, edema cerebral (por exemplo, associados com derrame agudo/lesão intracraniana /trauma), inflamação sinovial, pano formação em RA1 miosite ossificante, formação de osso hipertrófica, osteoartrite (OA), ascites refratárias, doenças policísticas ovarianas, endometriosesV doenças de fluído do terceiro espaço (pancreatites, síndrome de compartimento, queimaduras, doenças de intestino), fibróide uterina, parto prematuro, inflamações crônicas tal como IBD (doenças de Crohn e colites ulcerativas), rejeição alográfica renal, doença inflamatória de intestino, síndrome nefrótica, crescimento indesejado ou anormal de massa de tecido (não canceroso), obesidade, crescimento de massa de tecido adiposo, articulações hemofílicas, cicatrizes hipertróficas, inibição de crescimento de cabelo, síndrome Osler-Weber, fibroplasias retrolental granuloma piogênico, escleroderma, tracoma, adesões vasculares, sinovites, dermatites, pré- eclampsia, ascites, efusão pericardial (como aquela associada com pericardite) e efusão pleural. Exemplos adicionais de disfunções a serem tratadas com um antagonista de DLL4 (como um anticorpo anti-DLL4) incluem uma disfunção epitelial ou cardíaca.

Moduladores de DLL4, por exemplo, agonistas ou ativadores de DLL4, podem ser utilizados para o tratamento de disfunções patológicas. Em algumas realizações, os moduladores de DLL4, por exemplo, agonistas de DLL4, podem ser utilizados no tratamento de disfunções patológicas onde a inibição da angiogênese é desejada. Moduladores de DLL4, por exemplo, agonistas de DLL4, podem ser utilizados no tratamento de disfunções patológ icas onde a inibição da angiogênese ou neovascularização e/ou hipertrofia é desejada, que inclui, mas não se limita a trauma vascular, feridas, lacerações, incisões, queimaduras, úlceras (por exemplo, úlcera diabética, úlceras por pressão, úlceras hemofílicas, úlceras de varizes), crescimento de tecido, ganho de peso, doença arterial periférica, indução do parto, crescimento capilar, epidermólise bolhosa, atrofia da retina, fraturas ósseas, fusões na coluna vertebral, rompimento do menisco, etc

Combinação De Terapias

Como indicado acima, a invenção fornece terapias combinadas nas quais um antagonista de DLL4 (como um anticorpo anti-DLL4) é administrado com outra terapia. Por exemplo, antagonistas de DLL4 são usados em combinação com um agente anti-câncer ou um agente anti- angiogênico para tratar várias condições neoplásicas ou não-neoplásicas. Em uma realização, a condição neoplásica ou não-neoplásica é caracterizada por disfunção patológica associada à angiogênese anormal ou indesejada. O antagonista de DLL4 pode ser administrado em série ou em combinação com outro agente que seja eficaz para esses propósitos, tanto na mesma composição como em composições separadas. Alternativamente, ou adicionalmente, inibidores múltiplos de DLL4 podem ser administrados.

A administração do antagonista de DLL4 (ou agonista de DLL4) e o outro agente terapêutico (por exemplo, agente anti-câncer, agente anti- angiogênico) pode ser feita simultaneamente, por exemplo, como uma composição única ou como duas ou mais composições diferentes, usando-se as mesmas ou diferentes rotas de administração. Alternativamente ou adicionalmente, a administração pode ser feita seqüencialmente, em qualquer ordem. Alternativamente ou adicionalmente, as etapas podem ser realizadas como uma combinação seqüencial ou simultânea, em qualquer ordem.

Em certas realizações, os intervalos que variam de minutos a dias, de semanas a meses, podem estar presentes entre as administrações de duas ou mais composições. Por exemplo, o outro agente terapêutico pode ser administrado primeiro, seguido pelo antagonista de DLL4. No entanto, a administração simultânea ou administração do antagonista de DLL4 primeiro é também contemplada. Consequentemente, em um aspecto, a invenção fornece métodos que compreendem administrar uma quantidade eficaz de um antagonista de DLL4 (como um anticorpo anti-DLL4), seguido pela administração de um agente anti-angiogênico (como anti-VEGF). Em certas realizações, os intervalos que variam de minutos a dias, de semanas a meses, podem estar presentes entre as administrações de duas ou mais composições.

As quantidades eficazs dos agentes terapêuticos administrados em combinação com um antagonista de DLL4 (ou agonista de DLL4) será de acordo com a discrição do médico ou veterinário. A administração e ajuste da dosagem são feitos para atingir o gerenciamento máximo das condições a serem tratadas. A dose dependerá adicionalmente de tais fatores, como o tipo de agente terapêutico a ser usado e o paciente específico a ser tratado. Dosagens adequadas para o agente anti-câncer são aquelas atualmente usadas e podem ser diminuídas devido a ação combinada (sinergia) do agente anti-câncer e do antagonista de DLL4. Em certas realizações, a combinação dos inibidores potencializa a eficácia de um único inibidor. O termo "potencializa" refere-se a um aprimoramento na eficácia de um agente terapêutico, em sua dose comum ou aprovada. Consulte, também, a seção entitulada Composições Farmacêuticas no presente pedido.

Tipicamente, o antagonista de DLL4 e agentes anti-câncer são adequados para a mesma doença ou similar, para bloquear ou reduzir uma disfunção patológica como um tumor, um câncer ou uma disfunção proliferativa celular. Em uma realização, o agente anti-câncer é um agente anti- angiogênese.

A terapia anti-angiogênica em relação ao câncer é uma nova estratégia de tratamento de câncer voltada para a inibição do desenvolvimento de vasos sangüíneos no tumor, necessários para fornecer nutrientes e manter o crescimento do tumor. Devido à angiogênese estar envolvida tanto no crescimento do tumor primário como metástase, o tratamento anti-angiogênico fornecido pela invenção é capaz de inibir o crescimento neoplásico do tumor no sítio primário, bem como prevenir metástases de tumor nos locais secundários, permitindo então o ataque aos tumores por outros terapêuticos.

Muitos agentes anti-angiogênicos foram identificados e são conhecidos no estado da técnica, incluindo aqueles listados no presente pedido, por exemplo, listados nas Definições e, por exemplo, por Carmeliet e Jain, Nature 407:249-257 (2000); Ferrara et ai., Nature Reviews.Drug Discovery, 3:391-400 (2004) e Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003). Consulte, também, pedido de patente US 20030055006. Em uma realização, um antagonista de DLL4 é usado em combinação com um anticorpo que neutraliza anti-VEGF (ou fragmento) e/ou outro antagonista do VEGF ou um antagonista do receptor do VEGF, incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, receptores do VEGF solúvel (por exemplo, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, neuropilinas (por exemplo, NRP1, NRP2)) fragmentos, aptâmeros capazes de bloquear VEGF ou VEGFR, anticorpos que neutralizam anticorpos anti-VEGFR, moléculas de baixo peso molecular inibidoras do VEGFR tirosina quinase (RTK), estratégias antisense para o VEGF, ribozimas contra VEGF ou receptores do VEGF, antagonistas variantes do VEGF e qualquer combinação destes. Alternativamente ou adicionalmente, dois ou mais inibidores da angiogênese podem ser co-administrados ao paciente em adição ao antagonista do VEGF e outro agente. Em certas realizações, um ou mais agentes terapêuticos adicionais, por exemplo, agentes anti-câncer podem ser administrados em combinação com antagonista de DLL4, antagonista do VEGF e/ou um agente anti-angiogênese.

Em certos aspectos da invenção, outros agentes terapêuticos úteis para combinação de terapia contra tumor com um antagonista de DLL4 (ou agonista de DLL4) incluem outras terapias contra o câncer (por exemplo, cirurgias, tratamentos radiológicos (por exemplo, cirurgia, tratamentos radiológicos (por exemplo, envolvendo radiação ou administração de substâncias radioativas), quimioterapia, tratamento com agentes anti-câncer listados no presente pedido e conhecidos no estado da técnica, ou combinação destes). Alternativamente ou adicionalmente, dois ou mais anticorpos que se ligam ao mesmo ou a dois ou mais antígenos diferentes, divulgados no presente pedido, podem ser co-administrados ao paciente. Algumas vezes, também pode ser benéfico administrar uma ou mais citocinas ao paciente.

Agentes Quimioterápicos

Em um aspecto, a invenção fornece métodos para tratar uma disfunção (como um tumor, um câncer e/ou disfunção proliferativa celular) pela administração de quantidades eficazs de um antagonista de DLL4 (ou agonista de DLL4) e/ou inibidor(es) da angiogênese e um ou mais agentes quimioterápicos. Uma variedade de agentes quimioterápicos pode ser usada nos métodos de tratamento combinado da invenção. Uma lista de agentes quimioterápicos exemplares e não Iimitantes contemplados é fornecida no presente pedido nas "Definições". A administração do antagonista de DLL4 e o outro agente terapêutico pode ser feita simultaneamente, por exemplo, como uma composição única ou como duas ou mais composições diferentes, usando-se as mesmas ou diferentes rotas de administração. Alternativamente ou adicionalmente, a administração pode ser feita seqüencialmente, em qualquer ordem. Alternativamente ou adicionalmente, as etapas podem ser realizadas como uma combinação seqüencial ou simultânea, em qualquer ordem. Em certas realizações, os intervalos que variam de minutos a dias, de semanas a meses, podem estar presentes entre as administrações de duas ou mais composições. Por exemplo, o agente quimioterápico pode ser administrado primeiro, seguido pelo antagonista de DLL4. No entanto, a administração simultânea ou administração do antagonista de DLL4 primeiro é também contemplada. Consequentemente, em um aspecto, a invenção fornece métodos que compreendem administrar uma quantidade eficaz de um antagonista de DLL4 (como um anticorpo anti-DLL4), seguido pela administração de um agente quimioterápico. Em certas realizações, os intervalos que variam de minutos a dias, de semanas a meses, podem estar presentes entre as administrações de duas ou mais composições.

Será entendido pelos técnicos no assunto que doses apropriadas dos agentes quimioterápicos geralmente estarão em torno daquelas já empregadas nas terapias clínicas, em que quimioterápicos são administrados sozinhos ou em combinação com outros quimioterápicos. Variação nas doses provavelmente ocorrerá, dependendo da condição a ser tratada. O médico que administra o tratamento será capaz de determinar a dose apropriada para o sujeito específico.

Recidiva De Crescimento Tumoral

A invenção também fornece métodos e composições para inibição ou prevenção de recidiva de crescimento tumoral ou recidiva de crescimento de célula cancerosa. Recidiva de crescimento tumoral ou recidiva de crescimento de célula cancerosa é usada para descrever uma condição em que pacientes foram submetidos ou tratados com uma ou mais terapias atualmente disponíveis (por exemplo, terapias de câncer, como quimioterapia, terapia de radiação, cirurgia, terapia hormonal e/ou terapia/imunoterapia biológica, terapia com anticorpo anti-VEGF, particularmente um regime terapêutico padrão para o câncer específico) que não foi clinicamente adequada para tratar os pacientes, ou os pacientes não tiveram mais qualquer efeito benéfico da terapia, de forma que estes pacientes precisam de terapia eficaz adicional. Como usado no presente pedido, a frase também pode se referir a uma condição do paciente "não responsivo/refratário", por exemplo, que descreve pacientes que respondem à terapia ainda sofrendo dos efeitos colaterais, desenvolvem resistência, não respondem à terapia, não respondem satisfatoriamente à terapia, etc. Em várias realizações, um câncer é de recidiva de crescimento tumoral ou recidiva de crescimento de célula cancerosa quando o número de células cancerosas não foi reduzido significativamente, aumentou, o tamanho do tumor não foi reduzido significativamente, aumentou ou fracassou em qualquer redução adicional no tamanho ou no número de células cancerosas. Pode-se determinar in vivo ou in vitro se as células cancerosas são de recidiva de crescimento tumoral ou de recidiva de crescimento de célula tumoral, por qualquer método de avaliação da efetividade ou tratamento de células cencerosas conhecido no estado da técnica, usando-se os significados aceitos pelo estado da técnica para tal contexto: "recidiva", "refratário" ou "não responsivo". Um tumor resistente ao tratamento com anti-VEGF é um exemplo de uma recidiva de crescimento tumoral.

A invenção fornece métodos de bloqueio ou redução de recidiva de crescimento tumoral ou recidiva de crescimento de célula cancerosa em um sujeito, pela administração de um ou mais antagonistas de DLL4 (ou agonista de DLL4) para bloquear ou reduzir a recidiva de crescimento tumoral ou recidiva de crescimento de célula cancerosa em um sujeito. Em certas realizações, o antagonista pode ser administrado depois dos terapêuticos contra o câncer. Em certas realizações, os antagonistas de DLL4 são administrados simultaneamente à terapia contra o câncer. Alternativamente ou adicionalmente, a terapia com antagonista de DLL4 se alterna com outra terapia contra o câncer, que pode ser realizada em qualquer ordem. A invenção também engloba métodos para administrar um ou mais anticorpos inibidores para prevenir o princípio ou recorrência de câncer em pacientes predispostos a ter câncer. Geralmente, o sujeito foi ou está ao mesmo tempo sendo submetido à terapia contra câncer. Em uma realização, a terapia contra câncer é um tratamento com um agente anti-angiogênese, por exemplo, um antagonista do VEGF. O agente anti-angiogênese inclui aqueles conhecidos no estado da técnica e aqueles encontrados nas Definições no presente pedido. Em uma realização, o agente anti-angiogênese é um anticorpo anti-VEGF ou fragmento que neutraliza o VEGF (por exemplo, A4.6.1 humanizado, AVASTIN ® (Genentech, South San Francisco, CA), Y0317, M4, G6, B20, 2C3, etc.). Consulte, por exemplo, patentes US 6.582.959, 6.884.879, 6.703.020; documento WO 98/45332; documento WO 96/30046; documento WO 94/10202; patente EP 0666868B1; pedidos de patente US 20030206899, 20030190317, 20030203409 e 20050112126; Popkov et ai, Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004) e documento WO 2005012359. Agentes adicionais podem ser administrados em combinação com o antagonista do VEGF e um antagonista de DLL4, para bloquear ou reduzir a recidiva de crescimento tumoral ou recidiva de crescimento de célula cancerosa, por exemplo, consulte seção entitulada Combinação de Terapias no presente pedido.

DLL4

DLL4 é uma proteína transmembrana. A região extracelular contém 8 repetições similares ao EGF, bem como um domínio DSL que é conservado entre todos os Iigantes Notch e é necessário para ligação do receptor. A proteína prevista também contém uma região transmembrana e uma cauda citoplasmática desprovida de qualquer motivo catalítico. A proteína DLL4 humana é uma proteína com 685 aminoácidos e contém as seguintes regiões: peptídeo sinal (aminoácidos 1 a 25), MNNL (aminoácidos 26 a 92), DSL (aminoácidos 155 a 217), Similar ao EGF (aminoácidos 221 a 251), Similar ao EGF (aminoácidos 252 a 282), Similar ao EGF (aminoácidos 284 a 322), Similar ao EGF (aminoácidos 324 a 360), Similar ao EGF (aminoácidos 366 a 400), Similar ao EGF (aminoácidos 402 a 438), Similar ao EGF (aminoácidos 440 a 476), Similar ao EGF (aminoácidos 480 a 518), transmembrana (aminoácidos 529 a 551), domínio citoplasmático (aminoácidos 552 a 685). Seqüências de ácidos nucleicos e de aminoácidos de DLL4 são conhecidas no estado da técnica e são, ainda, discutidas no presente pedido. A seqüência de ácido nucleico que codifica DLL4 pode ser elaborada usando-se a seqüência de aminoácido da região desejada de DLL4. Alternativamente, a seqüência de cDNA (ou fragmentos deste) de DLL4 pode ser usada. O número de acesso de DLL4 humano é NM_019074, e número de acesso de DLL4 de camundongo é NM 019454.

DLL4 se liga aos receptores Notch. A via de Notch conservada evolutivamente é uma chave reguladora de muitos processos de desenvolvimento, bem como do próprio sistema de renovação de órgãos pós- natal. Desde invertebrados até mamíferos, a sinalização Notch guia as células através de uma miríade de decisões do destino celular e influencia a proliferação, diferenciação e apoptose (Miele e Osborne, 1999). A família Notch consiste de receptores de superfície celular conservados estruturalmente, que são ativados por ligantes da membrana da família do gene DSL (chamados de Delta e Serrate de Drosophila e Lag-e de C.elegans). Os mamíferos têm quatro receptores (Notchl, Notch2, Notch3, Notch4) e cinco ligantes (Jag1, Jag2, DLL1, DII3 e DLL4). Mediante ativação pelos ligantes presentes nas células vizinhas, os receptores Notch passam por clivagens proteolíticas sucessivas. Isto conduz à liberação do Domínio Intracelular de Notch (NICD), que se desloca para o núcleo e forma um complexo transcricional com a proteína de ligação do DNA1 RBP-Jk, também conhecida como CSL [para CBF1/Su(H)/Lag- 1] e outros co-fatores transcricionais. Os genes de alvo primário de ativação de Notch incluem o gene da família HES (Hairyl Enhancer of Split) e genes relacionados ao HES (Hey, CHF, HRT1 HESR), que alternadamente regulam os efetores transcricionais a jusante em um tecido e modo específico de tipos celulares (Iso etal., 2003; Li e Harris, 2005).

Moduladores De DLL4

Moduladores de DLL4 são moléculas que modulam a atividade de DLL4, por exemplo, agonistas e antagonistas. O termo "agonista de DLL4" é usado para se referir aos análogos peptídicos e não peptídicos de DLL4 (como os DLL4 multimerizados descritos no presente pedido), e a outros agentes, desde que eles tenham a capacidade fornecer sinal através do receptor Notch nativo (por exemplo, Notchl, Notch2, Notch3, Notch4). O termo "agonista" é definido no contexto da função biológica de um receptor Notch. Em certas realizações, os agonistas possuem as atividades biológicas de um DLL4, conforme definido acima, como ligação a um receptor Notch (por exemplo, Notchl, Notch2, Notch3, Notch4), ativação de um receptor Notch e ativação da sinalização molecular a jusante do receptor Notch. Em algumas realizações, os agonistas de DLL4 inibem a proliferação de célula endotelial, promovem a diferenciação de célula epitelial e/ou promovem o desenvolvimento arterial. Em algumas realizações, os agonistas de DLL4 inibem o desenvolvimento vascular.

Moduladores de DLL4 são conhecidos no estado da técnica e alguns são descritos e exemplificados no presente pedido. Uma lista de antagonistas de DLL4 exemplares e não Iimitantes contemplados (como anticorpo anti-DLL4 e uma imunoadesina DLL4) é fornecida no presente pedido nas "Definições".

Os moduladores úteis na presente invenção podem ser caracterizados por suas propriedades físico-químicas e funções biológicas por vários testes conhecidos no estado da técnica. Em algumas realizações, os antagonistas de DLL4 são caracterizados por qualquer uma ou mais de: ligações a DLL4, ligação ao receptor Notch, redução ou bloqueio da ativação do receptor Notch, redução ou bloqueio da sinalização molecular a jusante do receptor Notch, interrupção ou bloqueio da ligação do receptor Notch a DLL4 e/ou promoção da proliferação celular endotelial, e/ou inibição da proliferação celular endotelial, e/ou inibição da diferenciação arterial, e/ou inibição da perfusão vascular tumoral, e/ou tratamento e/ou prevenção de um tumor, disfunção proliferativa celular ou um câncer; e/ou tratamento ou prevenção de uma disfunção associada à expressão de DLL4 e/ou atividade e/ou tratamento ou prevenção de uma disfunção associada com a expressão e/ou atividade de receptor Notch. Em algumas realizações, os agonistas de DLL4 são caracterizados por qualquer uma ou mais de: ligação a um receptor Notch (por exemplo, Notchl, Notch2, Notch3, Notch4), ativação de um receptor Notch, ativação da sinalização molecular a jusante do receptor Notch1 proliferação celular endotelial, promoção da diferenciação celular epitelial e/ou promoção do desenvolvimento arterial. Métodos para a caracterização de antagonistas e agonistas de DLL4 são conhecidos no estado da técnica e alguns são descritos e exemplificados no presente pedido.

Anticorpos

Anticorpos DLL4 são conhecidos no estado da técnica e alguns são descritos e exemplificados no presente pedido. Os anticorpos anti-DLL4 são, preferencialmente, monoclonais. Também englobados dentro do escopo da invenção estão os fragmentos Fab, Fab', Fab1-SH e F(ab')2, dos anticorpos anti-DLL4 fornecidos no presente pedido. Estes fragmentos de anticorpos podem ser criados por meios tradicionais, como digestão enzimática ou podem ser gerados por técnicas recombinantes. Tais fragmentos de anticorpos podem ser quiméricos ou humanizados. Estes fragementos são úteis para o diagnóstico e propósitos terapêuticos apresentados abaixo.

Anticorpos monoclonais são obtidos de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto pela possível ocorrência natural de mutações que podem estar presentes em menor quantidade. Dessa forma, o modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos distintos.

Anticorpos monoclonais anti-DLL4 podem ser fabricados usando- se o método de hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et aí., Nature 256: 495 (1975) ou podem ser fabricados por métodos de DNA recombinante (patente US 4.816.567).

No método de hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado, como hamster, é imunizado para gerar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que irão se ligar especificamente à proteína usada para imunização. Anticorpos para DLL4 geralmente são cultivados em animais por múltiplas injeções subcutâneas (sc) ou intraperitoniais (ip) de DLL4 e um adjuvante. DLL4 pode ser preparado usando-se métodos bem conhecidos no estado da técnica, alguns destes são também descritos no presente pedido. Por exemplo, a produção recombinante de DLL4 está descrita abaixo. Em uma realização, os animais são imunizados com um derivado de DLL4 que contém o domínio extracelular (ECD) de DLL4 ligado à porção Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Em uma realização preferida, os animais são imunizados com uma proteína de fusão DLL4-lgG1. Os animais geralmente são imunizados contra conjugados imunogênicos ou derivados do DLL4 com lipídeo monofosforil A (MPL)/trealose dicrinomicolato (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT) e a solução é injetada intradermicamente em múltiplos locais. Duas semanas depois os animais são estimulados. Sete a catorze dias depois os animais são sangrados e o soro é analisado para titulação do anti-DLL4. Os animais são estimulados até a titulação platô.

Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são então fundidos com uma linhagem de células de mieloma, utilizando-se um agente de fusão apropriado, como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, páginas 59-103 (Academic Press, 1986)).

As células de hibridoma preparadas desta forma são semeadas e cultivadas em meio de cultura adequado, que contém preferencialmente uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevida das células de mieloma parentais não fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma parentais não contêm a enzima hipoxantina-guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura selecionado para os hibridomas tipicamente incluirá hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias que evitam o crescimento de células com deficiência em HGPRT.

Células de mieloma preferidas são aquelas que se fundem eficientemente, apoiam a produção de anticorpos estáveis em alto nível pelas células produtoras de anticorpos selecionadas e são sensíveis a um meio como meio HAT. Entr e estas, linhagens celulares de mieloma preferidas são as linhagens de mieloma murino, como aquelas derivadas de tumores de camundongos MOPC-21 e MPC-11 disponíveis pelo Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia, EUA, e SP-2 ou células X63-Ag8- 653 disponíveis pela Coleção Americana de Tipos de Cultura, Rockville, Maryland, EUA. Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma humano de camundongo também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); e Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51-63 (Mareei Dekker, Inc., Nova York, 1987)).

O meio de cultura no qual as células de hibridoma estão crescendo é testado para a produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra DLL4. Preferencialmente, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada por imunoprecipitação ou por um teste de ligação in vitro, como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas (ELISA).

A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada pela análise Scatchard de Munson et al, Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Após células de hibridoma serem identificadas para produção de anticorpos de especificidade, afinidade e/ou atividade desejadas, os clones podem ser subclonados pela limitação de procedimentos de diluição e cultivados por métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, páginas 59-103 (Academic Press1 1986)). O meio de cultura adequado para este propósito inclui, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores de ascite em um animal.

Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluido de ascite ou soro, por procedimentos de purificação de imonuglobulina convencionais, como por exemplo, proteína A Sefarose, cromatografia sobre hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálises ou cromatografia de afinidade.

Os anticorpos anti-DLL4 da invenção podem ser fabricados usando-se bibliotecas combinatórias para seleção de clones de anticorpos sintéticos com a atividade ou atividades desejadas. Em princípio, clones de anticorpos sintéticos são selecionados pela separação de bibliotecas de fago contendo fagos que exibem vários fragmentos da região variável do anticorpo (Fv) unida à proteína de revestimento do fago. Tais bibliotecas de fago são agrupadas por cromatografia de afinidade contra o antígeno desejado. Clones que expressam fragmentos Fv capazes de se ligar ao antígeno desejado são adsorvidos ao antígeno e, então, separados dos clones sem ligação na biblioteca. Os clones de ligação são então eluídos do antígeno e, também, podem ser aprimorados por ciclos adicionais de adsorção/elução de antígeno.

Qualquer um dos anticorpos anti-DLL4 podem ser obtidos pelo projeto de um procedimento de triagem de antígeno adequado para selecionar o clone de fago de interesse seguido pela construção de um clone do anticorpo anti-DLL4 inteiro usando-se as seqüências Fv do clone de fago de interesse e seqüências de região constante adequadas (Fc) descritas em Kabat et ai, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, NIH Publicação 91-3242, Bethesda MD (1991), volumes 1 a 3. O domínio de ligação de antígeno de um anticorpo é formado por duas regiões variáveis (V) com cerca de 110 aminoácidos, uma cadeia leve (VL) e uma pesada (VH)1 e ambas apresentam três alças hipervariáveis e regiões determinadas por complementaridade (CDRs). Os domínios variáveis podem ser exibidos de forma funcional no fago, tanto como fragmentos Fv de cadeia única (scFv), nos quais VH e VL estão ligadas covalentemente através de um peptídeo curto e flexível, ou como fragmentos Fab1 nos quais eles estão ligados a um domínio constante e interagem de forma não covalente, como descrito em Winter etal., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Como usado no presente pedido, scFv que codificam clones de fago e Fab que codificam clones de fago são coletivamente chamados de "clones de fago Fv" ou "clones Fv".

Repertórios de genes VH e VL podem se clonados separadamente por reação em cadeia da polimerase (PCR) e recombinados aleatoriamente em bibliotecas de fago, que podem então ser escolhidas para clones de ligação de antígeno como descrito em Winter et ai, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Bibliotecas de fontes imunizadas fornecem anticorpos com alta afinidade ao imunógeno, sem a necessidade da construção de hibridomas. Alternativamente, o repertório nativo pode ser clonado para fornecer uma fonte única de anticorpos humanos para uma variedade de antígenos próprios e também não-próprios, sem qualquer imunização, conforme descrito por Griffiths et ai, EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente, bibliotecas virgens podem, também, ser feitas sinteticamente pela clonagem dos segmentos do gene V rearranjados a partir de células-tronco, e usando-se primers de PCR que contém seqüência aleatória para codificar as regiões altamente variáveis de CDR3 e para realizar o rearranjo in vitro, conforme descrito por Hoogenboom e Winter, J. Moi Biol., 227: 381-388 (1992).

Fago filamentoso é usado para exibir fragmentos de anticorpos pela fusão à proteína de revestimento plll menor. Os fragmentos de anticorpos podem ser exibidos como fragmentos Fv de cadeia única, nos quais os domínios VH e VL estão conectados na mesma cadeia polipeptídica por um espaçador polipeptídico flexível, por exemplo, conforme descrito por Marks et ai, J. Moi Biol., 222: 581-597 (1991), ou como fragmentos Fab, nos quais uma cadeia está unida a plll e a outra é secretada no periplasma da célula hospedeira bacteriana onde o conjunto de uma estrutura de proteína de revestimento de Fab torna-se exibida na superfície do fago pelo deslocamento de algumas proteínas de revestimento tipo selvagem, por exemplo, conforme descrito em Hoogenboom et ai, Nuci Acids Res., 19: 4133-4137 (1991).

Em geral, ácidos nucleicos que codificam fragmentos de gene do anticorpo são obtidos a partir de células imunes colhidas a partir de humanos ou animais. Se uma biblioteca induzida em favor de clones anti-DLL4 é desejada, o sujeito é imunizado com DLL4 para gerar uma resposta do anticorpo, e as células do baço e/ou células B de circulação e outros linfócitos do sangue periférico (PBLs) são recuperados a partir da construção da biblioteca. Em uma realização preferida, uma biblioteca de fragmento de gene de anticorpo humano, induzida em favor de clones anti-DLL4 é obtida pela geração de um anticorpo anti-DLL4 de reação em camundongos transgênicos que carregam um arranjo do gene imunoglobulina humano funcional (e sem um sistema de produção de anticorpo endógeno funcional), como aquela imunização DLL4 que ativa células B para produção de anticorpos humanos contra DLL4. A geração de camundongos trasngênicos que produzem anticorpos humanos está descrita abaixo.

Aprimoramentos adicionais para populações de células reativas anti-DLL4 podem ser obtidos pelo uso de um procedimento de seleção adequado para isolar células B que expressam anticorpo ligado à membrana específico para DLL4, por exemplo, pela separação celular com cromatografia de afinidade a DLL4 ou adsorção de células a DLL4 marcado com fluorcromo seguido pela seleção celular ativada por fluxo (FACS).

Alternativamente, o uso de células do baço e/ou células B ou outras PBLs de um doador imunizado fornece uma melhor representação do possível repertório do anticorpo, e também permite a construção de uma biblioteca de anticorpo usando-se qualquer espécie animal (humana ou não- humana) em que DLL4 não é antigênico. Para bibliotecas que incorporam a contrução do gene do anticorpo in vitro, células-tronco são colhidas do sujeito para fornecer ácidos nucleicos que codificam segmentos de gene de anticorpo não rearranjados. As células imunes de interesse podem ser obtidas a partir de uma variedade de espécies animais, como humanos, camundongos, ratos, lagomorfos, caprinos, caninos, felinos, suínos, bovinos, eqüinos, espécies de aves, etc.

Ácidos nucleicos que codificam segmentos de gene variável do anticorpo (incluindo segmentos VH e VL) são recuperados a partir de células de interesse e amplificados. No caso de bibliotecas de gene VH e VL rearranjados, o DNA desejado pode ser obtido pelo isolamento do DNA genômico ou RNA a partir dos linfócitos seguido pela reação em cadeia da polimerase (PCR) com primers que são compatíveis com as terminações 5' e 3' dos genes VH e VL rearranjados, conforme descrito em Orlandi et ai, Proc. Nati Acad. Sei. (USA), 86: 3833-3837 (1989), com isso fazendo diversos repertórios do gene V para expressão. Os genes V podem ser amplificados a partir do cDNA e DNA genômico, com primers reversos na terminação 5' do exon que codifica o domínio-V maduro e primers forward apoiados no segmento-J como descrito em Orlandi et al. (1989) e em Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989). No entanto, para amplificação do cDNA, primers reversos podem, também, estar apoiados no exon líder como descrito em Jones et al., Biotechnol., 9: 88-89 (1991), e primers forward na região constante, conforme descrito em Sastry et al., Proc. Nati Acad. Sci (USA), 86: 5728-5732 (1989). Para maximizar a complementaridade, a degeneração pode ser incorporada nos primers, conforme descrito em Orlandi et al (1989) ou Sastry et ai (1989).

Peferencialmente, a diversidade da biblioteca é maximizada pelo uso de primers de PCR direcionados à família do gene V, a fim de amplificar todas as disposições VH e VL disponíveis presentes na amostra de ácido nucleico da célula imune, por exemplo, conforme descrito no método de M.arks et ai, J. Moi Biol., 222: 581-597 (1991) ou conforme descrito no método de Orum et ai, NucleicAcids Res., 21: 4491-4498 (1993). Para clonagem do DNA amplificado nos vetores de expressão, sítios de restrição raros podem ser introduzidos no primer de PCR como um tag em uma terminação, conforme descrito em Orlandi et al. (1989), ou para posterior amplificação por PCR com um primer tag, conforme descrito em Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991).

Repertórios de genes V rearranjados sinteticamente podem ser derivados in vitro a partir de segmentos do gene V. A maioria dos segmentos do gene VH humano foi clonado e sequenciado (relatado em Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)), e mapeado (relatado em Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993); estes segmentos clonados (incluindo todas as principais conformações da alça H1 e H2) podem ser usados para gerar repertórios de gene VH diversos com primers de PCR que codificam alças H3 da seqüência e comprimento diversos, conforme descrito em Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Repertórios VH podem, também, ser feitos com toda a diversidade de seqüência focada na alça H3 longa de um único comprimento, conforme descrito em Barbas et al., Proc. Nati Acad. Sei. USA, 89: 4457-4461 (1992). Segmentos humanos Vk e VA foram clonados e sequenciados (relatado em Williams e Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)) e podem ser usados para fazer repertórios de cadeia leve sintéticos. Repertórios do gene V sintético, baseado em uma variação de cópias de VH e VL, e comprimento de L3 e H3, irão codificar anticorpos de diversidade estrutural considerável. Seguindo amplificação de DNAs que codificam gene, segmentos do gene V de linhagem germinativa podem ser rearranjados in vitro de acordo com os métodos de Hoogenboom e Winter1 J. Moi Biol., 227: 381- 388 (1992).

Repertórios de fragmentos de anticorpo podem ser construídos pela combinação de repertórios dos genes VH e VL juntos, de diversas maneiras. Cada repertório pode ser criado em diferentes vetores, e os vetores recombinados in vitro, por exemplo, conforme descrito em Hogrefe et ai, Gene, 128: 119-126 (1993), ou in vivo por infecção combinatória, por exemplo, o sistema IoxP descrito em Waterhouse et ai., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993). A abordagem de recombinação in vivo explora as duas cadeias naturais de fragmentos Fab para superar o limite de tamanho da biblioteca, imposto pela eficiência de transformação em E. coli. Repertórios virgens VH e VL são clonados separadamente, um em um fagomídeo e o outro em um vetor fago. As duas bibliotecas são então combinadas pela infecção por fago da bactéria contendo o fagomídeo, de forma que cada célula contenha uma combinação diferente e o tamanho da biblioteca estaja limitado apenas pelo número de células presentes (cerca de 1012 clones). Ambos os vetores contêm sinais de recombinação in vivo, de forma que os genes VH e VL são recombinados em um único replicon e são co-empacotados em fagos vírions. Estas bibliotecas enormes fornecem um grande número de anticorpos diversos com boa afinidade (Kd"1 de cerca de 10"8 M).

Alternativamente, os repertórios podem ser clonados seqüencialmente em um mesmo vetor, por exemplo, conforme descrito em Barbas et ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 88: 7978-7982 (1991), ou montados juntos por PCR e então clonados, por exemplo, conforme descrito em Clackson et ai., Nature, 352: 624-628 (1991). A montagem de PCR também pode ser usada para unir DNAs de VH e VL que codificam um espaçador peptídico flexível para formar repertórios Fv (scFv) de cadeia única. Ainda outra técnica, "na montagem PCR na célula" é usada para combinar genes VH e VL com linfócitos por PCR e, então, clonar repertórios de genes ligados, conforme descrito em Embleton etal., Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992).

Os anticorpos produzidos pelas bibliotecas virgens (tanto natural como sintéticas) podem ser de afinidade moderada (Kd"1 de cerca de 106 a 107 M-1), mas a maturação da afinidade pode ser imitada in vitro pela construção e nova seleção de bibliotecas secundárias, conforme descrito em Winter et al. (1994), acima Por exemplo, a mutação pode ser introduzida aleatoriamente in vitro usando-se polimerase com tendência ao erro (relatado em Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)) no método de Hawkins et ai., J. Moi Biol., 226: 889-896 (1992) ou no método de Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992). Adicionalmente, a maturação da afinidade pode ser realizada pela mutação aleatória de uma ou mais CDRs, por exemplo, usando- se PCR com primers que carregam seqüência aleatória abrangente da CDR de interesse nos clones Fv individuais selecionados e assim selecionando clones de afinidade mais alta. O documento WO 9607754 (publicado em 14 de março de 1996) descreveu um método para indução de mutagênese em uma região determinada por complementaridade da cadeia leve de uma imunoglobulina para criar uma biblioteca de genes da cadeia leve. Outra abordagem eficaz é recombinar os domínios VH ou VL selecionados pela exibição por fago com repertórios de domínios V variantes que ocorrem naturalmente, obtidos a partir de doadores não imunizados e selecionar afinidade mais alta em diversos ciclos de mistura de cadeia, conforme descrito em Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992). Esta técnica permite a produção de anticorpos e fragmentos de anticopos com afinidades na faixa de 10-9 M.

Seqüências de ácidos nucleicos e de aminoacidos de DLL4 são conhecidas na técnia e são, ainda, discutidas no presente pedido. DNAs que codificam o DLL4 podem ser preparados por uma variedade de métodos conhecidos no estado da técnica. Estes métodos incluem, mas não se limitam à síntese química por qualquer um dos métodos descritos em Engels et ai, Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28: 716-734 (1989), como os métodos triéster, fosfito, fosforamidito e H-fosfonatos. Em uma realização, os códons preferidos pela expressão de células hospedeiras são usados na criação do DNA que codifica DLL4. Alternativamente, o DNA que codifica DLL4 pode ser isolado a partir de uma biblioteca genômica ou cDNA.

Seguindo a construção da molécula de DNA que codifica DLL4, a molécula de DNA é ligada de maneira funcional a uma seqüência controle de expressão em um vetor de expressão, como um plasmídio, sendo que a seqüência controle é reconhecida por uma célula hospedeira transformada com o vetor. Em geral, vetores plasmídeos contêm replicação e seqüências controle que são derivadas de espécies compatíveis com a célula hospedeira. O vetor geralmente carrega um sítio de replicação, assim como seqüências que codificam proteínas que são capazes de fornecer seleção fenotípica em células transformadas. Vetores adequados para expressão em células hospedeiras procariontes e eucariontes são conhecidos no estado da técnica e alguns são ainda descritos no presente pedido. Organismos eucariontes, como leveduras ou células derivadas de organismos multicelulares, como mamíferos, podem ser usados.

Opcionalmente, o DNA que codifica DLL4 está operacionalmente ligado a uma seqüência líder secretória resultando na secreção da expressão do produto pela célula hospedeira no meio de cultura. Exemplos de seqüências líder secretórias incluem stll, ecotina, lamb, herpes GD, Ipp, fosfatase alcalina, invertase e fator alfa. A seqüência líder de 36 aminoácidos da proteína A também é adequada para uso no presente pedido (Abrahmsen et al., EMBO J., 4: 3901 (1985)). Células hospedeiras são transfectadas e, preferencialmente, transformadas com os vetores de expressão ou de clonagem desta invenção e cultivadas em meio convencional de nutriente modificado como apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes ou amplificar os genes que codificam as seqüências desejadas.

Transfecção refere-se ao recolhimento de um vetor de expressão por uma célula hospedeira, se quaisquer seqüências de codificação são ou não expressas. Diversos métodos de transfecção são conhecidos para os técnicos no assunto, por exemplo, precipitação e eletroporação por CaPO4. A transfecção correta é geralmente reconhecida quando qualquer indicação da operação deste vetor ocorre dentro da célula hospedeira. Métodos para transfecção são bem conhecidos no estado da técnica, e alguns são ainda descritos no presente pedido.

Transformação significa introdução de DNA em um organismo, de forma que o DNA seja replicável, tanto como um elemento extracromossomal como por integrante cromossomal. Dependendo da célula hospedeira usada, a transformação é feita com o uso de técnicas padrão, apropriadas para tais células. Métodos para transformação são bem conhecidos no estado da técnica, e alguns são ainda descritos no presente pedido.

Células hospedeiras procariontes usadas para produzir DLL4 podem ser cultivadas conforme descrito em Sambrook et al, acima.

As células hospedeiras de mamífero usadas para produzir DLL4 podem ser cultivadas em diversos meios, que são bem conhecidos no estado da técnica e alguns destes são descritos no presente pedido.

As células hospedeiras referidas nesta divulgação incluem células na cultura in vitro, bem como células que estão em um hospedeiro animal.

A purificação de DLL4 pode ser realizada usando-se métodos reconhecidos no estado da técnica, alguns destes estão descritos no presente pedido.

O DLL4 purificado pode ser fixado a uma matriz adequada como microesferas de agarose, microesferas de acrilamida, microesferas de vidro, celulose, vários copolímeros acrílicos, géis hidroxil metacrilato, copolímeros poliacrílicos e polimetacrílicos, nylon, carreadores neutros e iônicos, e similares, para uso na separação cromatográfica de afinidade dos clones de exibição por fago. A ligação da proteína DLL4 à matriz pode ser realizada pelos métodos descritos em Methods in Enzymology, vol. 44 (1976). Uma técnica comumente empregada para fixar proteínas Iigantes às matrizes de polissacarídeo, por exemplo, agarose, dextrano ou celulose, envolve ativação do carreador com halóides cianogênios e subsequente acoplamento das aminas alifáticas ou aromáticas primárias do peptídeo Iigante à matriz ativada.

Alternativamente, DLL4 pode ser usada para revestir os poços das placas de adsorção, expressas nas células hospedeiras afixadas às placas de adsorção, ou usada na seleção celular, ou conjugada à biotina para captura com microesferas revestidas de estreptavidina, ou usada em qualquer outro método conhecido no estado da técnica para panorama de bibliotecas de exibição por fago.

As amostras de biblioteca de fago são contatadas com DLL4 imobilizada sob condições adequadas para ligação de ao menos uma porção das partículas de fago com o adsorvente. Normalmente, as condições, incluindo pH, força iônica, temperatura e similares são selecionadas para imitar as condições fisiológicas. Os fagos ligados à fase sólida são lavados e então eluídos pelo ácido, por exemplo, conforme descrito em Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88: 7978-7982 (1991), ou por base alcalina, por exemplo, conforme descrito em Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), ou por competição de antígeno DLL4, por exemplo, em um procedimento similar ao método de competição de antígeno de Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991). Fagos podem ser enriquecidos de 20 a 1000 vezes em um único ciclo de seleção. Além disso, os fagos enriquecidos podem ser cultivados em cultura de bactéria e sujeitos a ciclos posteriores de seleção.

A eficiência de seleção depende de muitos fatores, incluindo a cinética de dissociação durante a lavagem, e se os fragmentos múltiplos de anticorpos em um único fago podem simultaneamente juntar-se ao antígeno. Anticorpos com cinética de dissociação rápida (e afinidade de ligação fraca) podem ser mantidos pelo uso de lavagens curtas, exibição por fago multivalente e alta densidade de revestimento de antígeno na fase sólida. A alta densidade não apenas estabiliza o fago através de interações multivalentes, mas favorece a religação do fago que foi dissociado. A seleção de anticorpos com cinética de dissociação lenta (e boa afinidade de ligação) pode ser mantida pelo uso de lavagens longas e exibição por fago monovalente conforme descrito em Bass et ai, Proteins, 8: 309-314 (1990) e no documento WO 92/09690, e uma baixa densidade de revestimento de antígeno como descrito em Marks et al., Biotechnoi, 10: 779-783 (1992).

É possível selecionar entre anticorpos de fago de diferentes afinidades, mesmo com afinidades que diferem levemente, para DLL4. No entanto, é provável que a mutação aleatória de um anticorpo selecionado (por exemplo, como realizado em algumas das técnicas de maturação de afinidade descritas acima) dê origem a muitos mutantes, a maioria para ligação ao antígeno, e poucos com maior afinidade. Com DLL4 limitante, fago de afinidade alta rara poderia ser concorrente. Para manter todos os mutantes com afinidade mais alta, os fagos podem ser incubados com excesso de DLL4 biotinilado, mas com o DLL4 biotinilado a uma concentração de menor molaridade do que a afinidade constante molar alvo para DLL4. Os fagos de alta afinidade de ligação podem, então, ser capturados pelas esferas paramagnéticas revestidas com estreptavidina. Tal "captura de equilíbrio" permite que os anticorpos sejam selecionados de acordo com suas afinidades de ligação, com sensibilidade que permita o isolamento de clones mutantes com a menor afinidade possível de duas vezes a partir de um grande excesso de fagos com afinidade mais baixa. As condições usadas nas lavagens de fagos ligados a uma fase sólida podem ser manipuladas para discriminar com base na cinética de dissociação.

Clones anti-DLL4 podem ter atividade selecionada. Em uma realização, a invenção fornece anticorpos anti-DLL4 que bloqueiam a ligação entre um receptor Notch (como Notchl, Notch2, Notch3 e/ou Notch4) e DLL4, mas não bloqueiam a ligação entre um receptor Notch e uma segunda proteína. Clones Fv que correspondem a tais anticorpos anti-DLL4 podem ser selecionados por (1) isolamento dos clones anti-DLL4 a partir de uma biblioteca de fago como descrito acima, e opcionalmente, amplificação da população isolada de clones de fago pelo crescimento da população em um hospedeiro bacteriano adequado; (2) seleção de DLL4 e uma segunda proteína contra atividade de bloqueio e não-bloqueio, respectivamente, é desejado; (3) adsorção dos clones de fago anti-DLL4 para DLL4 imobilizado; (4) uso de um excesso da segunda proteína para eluir qualquer clone não desejado que reconheça determinantes de ligação de DLL4, que se sobreponha ou compartilhe os determinantes de ligação desta segunda proteína; (5) eluição dos clones que permaneçam adsorvidos após a etapa (4). Opcionalmente, os clones com propriedades desejadas de bloqueio/não-bloqueio podem ser ainda enriquecidos pela repetição dos procedimentos de seleção descritos no presente pedido, uma ou mais vezes.

O DNA que codifica anticorpos monoclonais derivados de hibridoma ou fagos que exibem clones Fv é facilmente isolado e sequenciado usando-se procedimentos convencionais (por exemplo, pelo uso de primers de oligonucleotídeos criadas para amplificar especificamente as regiões de codificação das cadeias leve e pesada de interesse, a partir do hibridoma ou molde de DNA de fago). Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfectados em células hospedeiras como células E. coli, células COS de símios, células de ovário de hamster Chinês (CHO), ou células de mieloma que, de outra forma, não produzem proteína da imunoglobulina para obter a síntese dos anticorpos monoclonais desejados nas células hospedeiras recombinantes. Os artigos de revisão sobre expressão recombinante em bactérias de DNA que codifica anticorpo incluem Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) e Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992).

O DNA que codifica os clones Fv da invenção pode ser combinado com seqüências de DNA conhecidas que codificam regiões constantes da cadeia pesada e/ou leve (por exemplo, as seqüências de DNA apropriadas podem ser obtidas a partir de Kabat et al., acima) para formar clones que codificam cadeias pesadas e/ou leves, completas ou parciais. Aprecia-se que regiões constantes de qualquer isotipo possam ser usadas para este propósito, incluindo regiões constantes IgG, IgM1 IGA, IgD e IgE, e que tais regiões constantes possam ser obtidas a partir de qualquer espécie humana ou animal. O clone Fv derivado a partir do DNA de domínio variável de uma espécie animal (como humana) e, então, fundido ao DNA de região constante de outra espécie animal, para formar seqüências de codificação para cadeias pesadas e/ou leves "híbridas" completas, está incluído na definição de anticorpo "quimérico" e "híbrido", como usado no presente pedido. Em uma realização preferida, um clone Fv derivado do DNA variável humano é fundido ao DNA de região constante humana para formar seqüências de codificação para todas as cadeias pesadas e/ou leves humanas completas ou parciais.

O DNA que codifica um anticorpo anti-DLL4 a partir de um hibridoma pode ser também modificado, por exemplo, pela substituição das seqüências de codificação pelos domínios constantes de cadeias pesada e leve humanas no lugar das seqüências de murino homólogas, derivadas a partir do clone de hibridoma (por exemplo, como no método de Morrison, et ai, Proc. Nat.Acad.Sei.USA, 81: 6851-6855 (1984)). O DNA que codifica um hibridoma ou anticorpo derivado do clone ou fragmento Fv pode ser ainda modificado pela junção covalente à seqüência codificadora da imunoglobulina de toda ou parte da seqüência codificadora para um polipeptídeo não- imunoglobulina. Desta maneira, anticorpos "quiméricos" ou "hídridos" são preparados para ter a especificidade de ligação dos anticorpos derivados dos clone Fv ou clones de hibridoma.

Fragmentos De Anticorpos

A presente invenção engloba fragmentos de anticorpos. Em certas circunstâncias existem vantagens em se usar fragmentos de anticorpos ao invés de anticorpos inteiros. O menor tamanho dos fragmentos permite rápida liberação e pode levar à melhora do acesso a tumores sólidos.

Foram desenvolvidas várias técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados via digestão proteolítica de anticorpos intactos (ver, por exemplo, Morimoto et ai, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) e Brennan et ai, Science, 229:81 (1985)). Entretanto, esses fragmentos podem ser agora produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Fragmentos de anticorpo Fab, Fv e ScFv podem todos ser expressos e secretados por E. coli, permitindo assim a fácil produção de grandes quantidades desses fragmentos. Os fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir de bibliotecas de fago de anticorpos discutidas acima. Alternativamente, fragmentos de Fab'-SH podem ser recuperados diretamente de E. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos de F(ab')2 (Carter et ai, Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, fragmentos de F(ab')2 podem ser isolados diretamente a partir da cultura de células hospedeiras recombinantes. Fragmentos Fab e F(ab')2 com meia-vida aumentada in vivo que compreendem resíduos do epitopo de ligação do receptor de resgate estão descritos na patente US 5.869.046. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos serão evidentes para os técnicos no assunto. Em outras realizações, o anticorpo de escolha é um fragmento Fv de cadeia única (scFv). Consulte documento WO 93/07378, patentes US 5.571.894 e US 5.587.458. Fv e sFv são os únicos tipos com sítios de combinação intactos desprovidos de regiões constantes, então, eles são adequados para ligação não específica reduzida durante o uso in vivo. Proteínas de fusão sFv podem ser construídas para produzir fusão de uma proteína efetora, tanto na terminação amina como carboxila de um sFv. Consulte Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, acima. O fragmento de anticorpo pode, também, ser um "anticorpo linear", por exemplo, conforme descrito na patente US 5.641.870, por exemplo. Tais fragmentos de anticorpos lineares podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.

Anticorpos Humanizados

A presente invenção engloba anticorpos humanizados. Vários métodos para humanizar anticorpos não humanos são conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, um anticorpo humanizado pode ter um ou mais resíduos de aminoácido introduzidos neste, a partir de uma fonte não humana.

Estes resíduos de aminoácidos não humanos são freqüentemente chamados de resíduos "importados", os quais são tipicamente retirados de um domínio variável "importado". Humanização pode ser essencialmente apresentada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), por substituição de seqüências de região hipervariável por seqüências correspondentes de um anticorpo humano. Consequentemente, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (patente US 4.816.567), nos quais substancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substituído pela seqüência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de região hipervariável e, possivelmente, alguns resíduos FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.

A escolha de domínios variáveis humano, tanto leve como pesado, para serem usados na fabricação de anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o método conhecido como "melhor ajuste", a seqüência do domínio variável de um anticorpo de roedor é selecionada em relação à biblioteca completa das seqüências conhecidas do domínio variável humano. A seqüência humana que é mais próxima àquela do roedor é então aceita como a estrutura humana para o anticorpo humanizado (Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901. Outro método usa uma estrutura específica derivada da seqüência consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo específico de cadeias leve ou pesada. A mesma estrutura pode ser usada para diversos anticorpos humanizados diferentes (Carter et al. (1992) Proc. Nati Acad. Sei. USA, 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 1 51:2623.

É ainda importante que anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo com um método, anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise de seqüências parentais e vários produtos humanizados conceituais, usando-se modelos tridimensionais das seqüências parental e humanizada. Modelos tridimensionais da imunoglobulina estão comumente disponíveis e são familiares para aqueles técnicos no assunto. Programas de computador que ilustram e exibem possíveis estruturas de conformação tridimensional das seqüências de imunoglobulina candidata selecionada estão disponíveis. A inspeção destas exibições permite análise do papel provável no funcionamento da seqüência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata se ligar ao seu antígeno. Desta maneira, resíduos FR podem ser selecionados e combinados a partir do receptor e de seqüências importadas, de forma que a características desejada do anticorpo, como o aumento de afinidade para o(s) antígeno(s) alvo(s), seja atingidas. Em geral, resíduos de região hipervariável são diretamente e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação ao antígeno.

Anticorpos Humanos

Anticorpos anti-DLL humanos podem ser construídos pela combinação de seqüências de domínio variável do clone Fv selecionadas a partir de bibliotecas de exibição por fago com seqüências humanas do domínio constante, conforme descrito acima. Alternativamente, anticorpos anti-DLL4 monoclonais humanos podem ser produzidos pelo método de hibridoma. Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma de camundongo- humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos foram descritas, por exemplo, por Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et ai, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51-63 (Mareei Dekker, Inc., Nova York, 1987); e Boemerefa/., J. Immunol., 147: 86 (1991).

Agora é possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, mediante imunização, de produzir repertório completo de anticorpos humanos na ausência da produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene (JH) da região de união da cadeia pesada do anticorpo em camundongos de linhagem germinativa mutante e quimérica resulta na inibição completa da produção de anticorpo endógeno. A transferência do conjunto de gene de imunoglobulina da linhagem germinativa humana em tais linhagens germinativas de camundongo mutante resultará na produção de anticorpos humanos, mediante desafio com antígeno. Consulte, por exemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al, Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann etal., Yearin Immunol., 7: 33 (1993).

A mistura de genes pode também ser usada para derivar anticorpos humanos a partir de anticorpos não humanos de roedores, por exemplo, onde o anticorpo humano possui afinidades e especificidades similares com o anticorpo não humano de partida. De acordo com este método, que é também chamado de "imprinting do epitopo", a região variável das cadeias leve ou pesada de um fragmento de anticorpo não-humano obtido pelas técnicas de exibição por fago, conforme descrito acima, é substituída por um repertório de genes do domínio V humano, criando uma população de cadeias scFv não-humanas/humanas ou FAB quiméricas. A seleção com antígenos resulta no isolamento de uma cadeia não-humana/cadeia quimérica humana scFv ou Fab, em que a cadeia humana restaura o sítio de ligação de antígeno, destruído pela remoção da cadeia não humana correspondente no clone primário exibido por fago, isto é, o epitopo dirige (imprime) a escolha da cadeia humana parceira. Quando o processo é repetido com o objetivo de substituir o domínio V da cadeia não humana remanescente, um anticorpo humano é obtido (consulte pedido de patente PCT documento WO 93/06213, publicado em 1 de abril de 1993). Diferente da humanização tradicional de anticorpos não humanos por enxerto de CDR, esta técnica fornece anticorpos completamente humanos, que não possuem estrutura ou resíduos FR ou CDR de origem não humana.

Anticorpos Biespecíficos

Os anticorpos biespecíficos são monoclonais, preferencialmente humanos ou humanizados, anticorpos que possuem especificidades de ligação a pelo menos dois antígenos diferentes. No caso presente, uma das especificidades de ligação é para DLL4 e a outra é para qualquer outro antígeno. Anticorpos biespecíficos exemplares podem se ligar a dois epitopos diferentes da proteína DLL4. An ticorpos biespecíficos podem, também, ser usados para localizar agentes citotóxicos para células que expressam DLL4. Estes anticorpos possuem um braço de ligação de DLL4 e um braço que se liga ao agente citotóxico (por exemplo, saporina, anti-interferon-α, alcalóide da vinca, ricina de cadeia A, metotrexato ou hapteno de isótopo radioativo). Anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos inteiros ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab')2).

Métodos de fabricação de anticorpos biespecíficos são conhecidos no estado da técnica. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos é baseada na coexpressão de dois pares da cadeia leve e cadeia pesada da imunoglobulina, onde as duas cadeias pesadas têm especificidades diferentes (Millstein e Cuello., Nature, 305: 537 (1983)). Devido à escolha aleatória das cadeias leve e pesada da imunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de dez moléculas de anticorpos diferentes, das quais apenas uma possui a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que é normalmente realizada por meio de etapas de cromatografia de afinidade, que é um tanto problemática e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentos similares são divulgados no documento WO 93/08829 publicado em 13 de maio de 1993, e em Trauneckeref al., EMBO J. 10: 3655 (1991).

De acordo com uma abordagem diferente e mais preferida, domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação de antígeno-anticorpo) são fundidos às seqüências do domínio constante da imunoglobulina. A fusão é, preferencialmente, com um domínio constante da cadeia pesada da imunoglobulina, que compreende ao menos parte das regiões de dobradiça, CH2 e CH3. É preferível ter a primeira região constante da cadeia pesada (CH1), contendo o sítio necessário para a ligação da cadeia leve, presente em ao menos uma das fusões. Os DNAs que codificam as fusões da cadeia pesada da imunoglobulina e, se desejado, da cadeia leve da imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados e são cotransfectados em um organismo hospedeiro adequado. Isso fornece grande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos do polipeptídeo em realizações onde razões desiguais das três cadeias polipeptídicas utilizadas na construção fornecem o máximo de rendimento. É possível, no entanto, inserir seqüências de codificação para duas ou todas as três cadeias polipeptídicas em um único vetor de expressão, quando a expressão de ao menos duas cadeias polipeptídicas em razões iguais resulta em altos rendimentos, ou quando as razões não são de significância específica.

Em uma realização preferida desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada da imunoglobulina híbrida com primeira especificidade de ligação em um braço, e um par de cadeias leve e cadeia pesada da imunoglobulina híbrida (que fornece uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Concluiu-se que essa estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado, a partir das combinações da cadeia da imunoglobulina indesejadas, pois a presença da cadeia leve da imunoglobulina em apenas metade da molécula biespecífica fornece uma maneira fácil para separação. Esta abordagem é descrita no documento WO 94/04690. Para maiores detalhes de geração de anticorpos biespecíficos, consulter, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

De acordo com outra abordagem, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser elaborada geneticamente para maximizar a porcentagem de heterodímeros que são recuperados a partir da cultura de células recombinantes. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio CH3 de um domínio constante do anticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias laterais de aminoácidos pequenos da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas por cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou similar à(s) cadeia(s) lateral(is) grande(s) são criadas sobre a interface da segunda molécula de anticorpo, pela substituição de grandes cadeias laterais de aminoácidos por cadeias menores (por exemplo, alanina ou treonina). Isso fornece um mecanismo de aumento de produção do heterodímero sobre outros produtos finais indesejados, como homodímeros.

Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado à avidina e o outro à biotina. Tais anticorpos, por exemplo, foram propostos para atingir células do sistema imunológico para células indesejadas (patente US 4.676.980), e para o tratamento de infecções por HIV (documento WO 91/00360, documento WO 92/00373 e patente EP 03089). Anticorpos heteroconjugados podem ser fabricados usando-se qualquer método de reticulação conveniente. Os agentes de reticulação adequados são bem conhecidos no estado da técnica e estão divulgados na patente US 4.676.980, juntamente com uma série de técnicas de reticulação.

As técnicas para geração de anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpos também foram descritas na literatura. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser preparados usando-se ligações químicas. Brennan et ai, Science, 229: 81 (1985) descreve um procedimento em que anticorpos intactos são proteolicamente clivados para gerar fragmentos F(ab')2. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente complexante ditiol arsenato de sódio para estabilizar ditióis próximos e prevenir formação de bissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab1 gerados são então convertidos para derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados do Fab1-TNB é então reconvertido para o Fab-tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar de outro derivado do Fab1-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser usados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas.

Recente progresso facilitou a recuperação direta de fragmentos de Fab'-SH de E. coli, que podem ser acoplados quimicamente para formar anticorpos biespecíficos. Shalaby et ai, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) descreve a produção de uma molécula F(ab')2 do anticorpo biespecífico humanizado em sua totalidade. Cada fragmento Fab' foi secretado separadamente a partir de E. coli e submetido ao acoplamento químico direcionado in vitro para formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de se ligar a células que superexpressam o receptor HER2 e células T humanas normais, bem como acionar a atividade lítica dos linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor de mama humano.

Diversas técnicas de fabricação e isolamento de fragmentos de anticorpos biespecíficos, diretamente a partir de cultura celular recombinante, também foram descritas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos foram produzidos usando-se zíper de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Os peptídeos de fecho de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab1 de dois anticorpos diferentes por fusão gênica. Os homodímeros de anticorpos foram reduzidos na região de dobradiça para formarem monômeros e então reoxidados para formarem os heterodímeros do anticorpo. Este método também pode ser utilizado para a produção de homodímeros do anticorpo. A tecnologia de "diacorpos" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993) forneceu um mecanismo alternativo para fabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) por um ligante que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Consequentemente, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a parear com os domínios VL e VH complementares de outro fragmento, através disso, formando dois sítios de ligação de antígeno. Outra estratégia para fabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos pelo uso de dímeros Fv de cadeia única (sFv) também foi relatada. Ver Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

Anticorpos com mais de duas valências são contemplados. Por exemplo, anticorpos triespecíficos podem ser preparados. Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).

Anticorpos Multivalentes

Um anticorpo multivalente pode ser internalizado (e/ou catabolizado) mais rápido do que um anticorpo bivalente por uma célula que expressa um antígeno ao qual os anticorpos se ligam. Os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos multivalentes (exceto da classe IgM) com três ou mais sítios de ligação de antígeno (por exemplo, anticorpos tetravalentes), que podem ser facilmente produzidos por expressão recombinante de ácido nucleico que codifica as cadeias polipeptídicas do anticorpo. O anticorpo multivalente pode compreender um domínio de dimerização e três ou mais sítios de ligação de antígeno. O domínio de dimerização preferido compreende (ou consiste de) uma região Fc ou uma região de dobradiça. Neste cenário, o anticorpo irá compreender uma região Fc e três ou mais sítios de ligação ao antígeno amino-terminal para a região Fe. O anticorpo multivalente preferido no presente pedido compreende de (ou consiste de) três a cerca de oito, mais preferencialmente, quatro sítios de ligação de antígeno. O anticorpo multivalente compreende pelo menos uma cadeia polipeptídica (e preferencialmente duas cadeias polipeptídicas), em que a(s) cadeia(s) polipeptídica(s) compreende(m) dois ou mais domínios variáveis.

Por exemplo, a cadeia(s) polipeptídica(s) pode(m) compreender VD1-(X1)n- VD2-(X2)n-Fc, sendo que VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 é um segundo domínio variável, Fc é uma cadeia polipeptídica de uma região Fc, X1 e X2 representam um aminoácido ou polipeptídeo, e η é 0 ou 1. Por exemplo, a cadeia polipeptídica pode compreender: VH-CHI-Iigante flexível-VH-CH1- cadeia da região Fc ; ou VH-CH1-VH-CH1-cadeia da região Fe. O anticorpo multivalente preferido no presente pedido compreende, ainda, ao menos dois (e preferencialmente quatro) polipeptídeos do domínio variável da cadeia leve. O anticorpo multivalente no presente pedido pode, por exemplo, compreender aproximadamente dois a oito polipeptídeos do domínio variável da cadeia leve. Os polipeptídeos do domínio variável da cadeia leve, aqui contemplados, compreendem um domínio variável da cadeia leve e, opcionalmente, também compreendem um domínio CL.

Anticorpos Variantes

Em algumas realizações, modificação(ões) da seqüência de aminoácido dos anticorpos descritos no presente pedido estão contempladas. Por exemplo, pode ser desejável aprimorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Seqüências de aminoácidos variantes do anticorpo são preparadas por introdução apropriada de trocas de nucleotídeos no ácido nucleico do anticorpo, ou por síntese peptídica. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções, inserções e/ou substituições de resíduos dentro das seqüências de aminoácido do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção, e substituição são feitas para se chegar à construção final, contanto que a construção final possua as características desejadas. As alterações no aminoácido podem ser introduzidas na seqüência de aminoácido do anticorpo do sujeito no momento que a seqüência é produzida.

Um método útil para identificação de certos resíduos ou regiões do anticorpo que são localizações preferidas para mutagênese é chamado "mutagênese de varredura de alanina" como descrito por Cunningham e Wells (1989) Science, 244:1081-1085. Aqui, um resíduo ou grupo de resíduos alvos são identificados (por exemplo, resíduos carregados tais como arg, asp, his, lys, e glu) e substituídos por um aminoácido carregado negativamente ou neutro (mais preferivelmente alanina ou polialanina) para afetar a interação de aminoácidos com antígeno. Essas localizações de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional para as substituições então são ainda refinadas pela introdução de outras variantes nos sítios de substituição.

Consequentemente, enquanto o sítio para a introdução da variação de seqüência de aminoácido é pré-determinado, a natureza da mutação por si mesma não precisa ser pré-determinada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação em um dado sítio, varredura de ala ou mutagênese randômica é conduzida no códon ou região alvo e as imunoglobulinas expressas são selecionadas para a atividade desejada.

Inserções de seqüência de aminoácidos incluem fusões na terminação amina e/ou carboxila, variando em comprimento de um resíduo até polipeptídeos que contêm uma centena ou mais de resíduos, bem como inserções intrasequência de resíduos de aminoácido únicos ou múltiplos.

Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo metionil N-terminal ou o anticorpo fundido a um polipeptídeo citotóxico. Outras variantes insercionais da molécula do anticorpo incluem a fusão do N- ou C- terminal do anticorpo a uma enzima (por exemplo, à ADEPT) ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida de soro do anticorpo.

Glicosilação de polipeptídeos é tipicamente tanto N-Iigado como O-ligado. N-ligado refere-se à conexão do componente carboidrato à cadeia lateral de um resíduo asparagina. As seqüências de tripeptídio asparagina-X- serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são seqüências de reconhecimento para conexão enzimática do componente carboidrato para a cadeia lateral asparagina. Dessa forma, a presença de ambas as seqüências de tripeptídios em um polipeptídio cria um sítio de glicosilação potencial. Glicosilação O-Iigado refere-se à conexão de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um hidroxi-aminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina possam também ser usadas.

A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é convenientemente realizada por alteração da seqüência de aminoácido, como aquela que contém uma ou mais das seqüências de tripeptídeos descritas acima (para sítios de glicosilação N-ligado). A alteração pode também ser feita por adição de, ou substituição de, um ou mais resíduos de serina ou treonina à seqüência do anticorpo original (para sítios de glicosilação O-ligado).

Onde o anticorpo compreende uma região Fc, o carboidrato conectado a este pode ser alterado. Por exemplo, anticorpos com uma estrutura de carboidrato madura que é desprovida de fucose conectada a uma região Fc do anticorpo estão descritos no pedido de patente US 2003/0157108 (Presta, L.). Consulte também patente US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) Anticorpos com uma N-acetilglucosamina dividida (GIcNAc) no carboidrato fixado a uma região Fc do anticorpo estão referidos no documento WO 2003/011878, Jean-Mairet et al. e patente US 6.602.684, Umana et al. Anticorpos com ao menos um resíduo galactose no oligossacarídeo conectado a uma região Fc do anticorpo estão relatados no documento WO 1997/30087, Patel et al. Consulte, também, documento WO 1998/58964 (Raju, S.) e documento WO 1999/22764 (Raju, S.) que relaciona anticorpos com carboidrato alterado fixado à região Fc destes. Consulte também patente US 2005/0123546 (Umana et al.) nas moléculas de ligação de antígeno com glicosilação modificada.

A variante de glicosilação preferida no presente compreende uma região Fc1 em que uma estrutura de carboidrato é fixada à região Fc desprovida de fucose. Tais variantes possuem função ADCC melhorada. Opcionalmente, a região Fe também compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que também melhoram ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333 e/ou 334 da região Fc (numeração de resíduos Eu). Exemplos de tais publicações relacionadas a anticorpos "defucosilados" ou "deficientes em fucose" incluem: patente US 2003/0157108; documento WO 2000/61739; documento WO 2001/29246; patente US 2003/0115614; patente US 2002/0164328; patente US 2004/0093621; patente US 2004/0132140; patente US 2004/0110704; patente US 2004/0110282; patente US 2004/0109865; documento WO 2003/085119; documento WO 2003/084570; documento WO 2005/035586; documento WO 2005/035778; documento W02005/053742; Okazaki et al. J. Moi Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Exemplos de linhagens celulares que produzem anticorpos defucosilados incluem células Lecl 3 CHO deficientes em proteína de defucosilação (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); pedido de patente US 2003/0157108 A1, Presta, L; e documento WO 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente no Exemplo 11), e linhagens celulares knockout, como gene alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, células CHO knockout (Yamane-Ohnuki et ai Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)).

Outro tipo de variante é uma variante de substituição do aminoácido. Estas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula do anticorpo substituído por um resíduo diferente. Os sítios de maior interesse para mutagênese substitucional incluem as regiões hipervariáveis, mas alterações FR também são contempladas. Substituições conservativas são mostradas na Tabela 2 sob o título de "substituições preferidas". Se tais substituições resultarem em uma alteração na atividade biológica, então mais trocas substanciais, denominadas "substituições exemplares" na Tabela 2, ou também como descritas abaixo na referência para classes de aminoácido, podem ser introduzidas e os produtos selecionados.

Tabela 2

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Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são realizadas pela seleção de substituições que diferem significativamente em seus efeitos na manutenção (a) da estrutura do esqueleto do polipeptídeo na área de substituição, por exemplo, como uma conformação folha ou helicoidal (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo ou (c) da massa da cadeia lateral. Resíduos que ocorrem naturalmente podem ser divididos em grupos baseados nas propriedades comuns das cadeias laterais:

(1) hidrofóbica: norleucina, met, ala, vai, leu, ile;

(2) hidrofílica neutra: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) ácida: asp, glu;

(4) básica: his, lys, arg;

(5) resíduos que influenciam na orientação da cadeia: gly, pro; e

(6) aromática: trp, tyr, phe.

Substituições não conservativas irão conferir troca de um membro de uma destas classes por outra classe.

Um tipo de variante substitucional envolve substituição em um ou mais resíduos de região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, um anticorpo humano ou humanizado). Geralmente, a variante(s) resultante(s) selecionada(s) para posterior desenvolvimento terá propriedades biológicas melhoradas relativas ao anticorpo parental a partir do qual elas são geradas. Uma maneira conveniente para gerar tais variantes substitucionais envolve maturação de afinidade usando-se exibição porfago. Resumidamente, diversos sítios da região hipervariável (por exemplo, sítios 6-7) são mutados para gerar todas as possíveis substituições de aminoácido em cada sítio. Os anticorpos dessa forma gerados são exibidos a partir de partículas de fago filamentoso como fusões para o gene Ill produto de M13 empacotado no interior de cada partícula. As variantes de fago exibidas são então selecionadas para suas atividades biológicas (por exemplo, afinidade de ligação), conforme divulgado no presente pedido. Com o objetivo de identificar candidatos para sítios de região hipervariável para modificações, pode ser realizada mutagênese de varredura de alanina para identificar resíduos da região hipervariável que contribuem significativamente para ligação ao antígeno. Alternativamente ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos para substituições de acordo com as técnicas elaboradas no presente pedido. Uma vez que tais variantes são geradas, as variantes do painel são sujeitas à seleção, como descrito no presente pedido, e anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para posterior desenvolvimento.

Moléculas de ácido nucleico que codificam seqüências variantes de aminoácido do anticorpo são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos no estado da técnica. Estes métodos incluem, mas não se limitam ao isolamento de uma fonte natural (no caso de ocorrer seqüência variante de aminoácido naturalmente) ou preparação por mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou sítio-dirígida), mutagênese por PCR e mutagênese cassette de uma variante preparada anteriormente ou uma versão não variante do anticorpo. Pode ser desejável introduzir uma ou mais modificações de aminoácido em uma região Fc dos polipeptídeos de imunoglobulina, através disso, gerando uma região Fc variante. A região Fc variante pode compreender uma seqüência de região Fc humana (por exemplo, uma região Fc de IgGi, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) que compreende uma modificação de aminoácido (por exemplo, uma substituição) em uma ou mais posições de aminoácido incluindo a dobradiça de cisteína.

Conforme esta descrição e os ensinos técnicos, é contemplado que em algumas realizações, um anticorpo usado nos métodos pode compreender uma ou mais alterações quando comparado ao anticorpo tipo selvagem correspondente, por exemplo, na região Fc. Estes anticorpos, apesar de tudo, manteriam substancialmente as mesmas características necessárias para utilidade terapêutica quando comparados aos seus correspondentes de tipo selvagem. Por exemplo, acredita-se que certas alterações podem ser feitas na região Fc que resultariam em ligação C1q alterada (isto é, ambas melhoradas ou reduzidas) e/ou Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC), por exemplo, conforme descrito no documento WO 99/51642. Consulte também Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988); patente US 5.648.260; patente US 5.624.821; e documento WO 94/29351 com relação a outros exemplos de regiões Fc variantes. O documeto WO 00/42072 (Presta) e documento WO 2004/056312 (Lowman) descrevem anticorpos variantes com ligação aos FcRs melhoradas ou diminuídas. O conteúdo destas publicações de patente está especificamente incorporado ao presente como referência. Consulte, também, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001). Anticorpos com aumento de meia vida e ligação melhorada para o receptor Fc neonatal (FcRn), que é responsável por transferir as IgGs maternas para os fetos (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol.24:249 (1994)), estão descritos na patente US 2005/0014934A1 (Hinton et al.). Estes anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições nesta, que melhoram ligação da região Fc ao FcRn. Polipeptídeos variantes com seqüências de aminoácido da região Fc alteradas e capacidade de ligação C1q aumentada ou diminuída estão descritos na patente US 6.194.551 B1, documento WO 99/511642. O conteúdo destas publicações de patente está especificamente incorporado ao presente como referência. Consulte também, Idusogie et ai J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

Anticorpos Derivados Os anticorpos podem ser, ainda, modificados para conter porções não proteináceas adicionais que são conhecidas no estado da técnica e facilmente disponíveis. Preferencialmente, as proções adequadas para derivatização do anticorpo são polímeros solúveis em água. Exemplos não limitantes de polímeros solúveis em água incluem, mas não se limitam a, polietileno glicol (PEG), copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, 1carboximetilcelulose, dextrana, álcool polivinil, pirrolidona polivinil, poli-1, 3- dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero anidrido etileno/maleico, poliaminoácidos (tanto homopolímeros como copolímeros aleatórios), e dextrana ou poli(n-vinil pirrolidona)polietileno glicol, homopolímeros de propropileno glicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilado (por exemplo, glicerol), álcool polivinil e misturas destes. Propionaldeído de polietileno glicol pode ter vantagens na fabricação devido a sua estabilidade em água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular, e pode ser ramificado ou não ramificado. O número de polímeros fixados ao anticorpo pode variar, e se mais de um polímero for fixado, eles podem ser moléculas iguais ou diferentes. Em geral, o número e/ou tipos de polímeros usados para derivação pode ser determinado com base nas considerações que incluem, mas não se limitam a, propriedades específicas ou funções do anticorpo a ser melhorado, se o anticorpo derivado será usado em uma terapia sob condições definidas, etc.

Seleção De Anticorpos Com Propriedades Desejadas

Os anticorpos podem ser caracterizados por suas propriedades físico-químicas e funções biológicas por vários testes conhecidos no estado da técnica. Em algumas realizações, os anticorpos são caracterizados para uma ou mais ligações a DLL4, redução ou bloqueio da ativação do receptor Notch, redução ou bloqueio da sinalização molecular a jusante do receptor Notch, interrupção ou bloqueio da ligação do receptor Notch a DLL4 e/ou promoção da proliferação celular endotelial, e/ou inibição da proliferação celular endotelial, e/ou inibição da diferenciação arterial, e/ou inibição da perfusão vascular tumoral, e/ou tratamento e/ou prevenção de um tumor, disfunção proliferativa celular ou um câncer; e/ou tratamento ou prevenção de uma disfunção associada à expressão de DLL4 e/ou atividade e/ou tratamento ou prevenção de uma disfunção associada com a expressão e/ou atividade de receptor Notch.

Os anticorpos purificados podem ser, ainda, caracterizados por uma série de testes incluindo, mas não se limitando a, sequenciamento N- terminal, análise de aminoácido, cromatografia líquida de alta eficiência de exclusão por tamanho sem desnaturação (HPLC), espectrometria de massa, cromatografia de troca iônica e digestão por papaína.

Em certas realizações da invenção, os anticorpos produzidos no presente pedido são analisados para suas atividades biológicas. Em algumas realizações, os anticorpos da presente invenção são testados para suas atividades de ligação ao antígeno. Os testes de ligação ao antígeno que são conhecidos no estado da técnica e podem ser usados no presente pedido incluem sem limitação, qualquer teste de ligação competitiva usando-se técnicas tais como western blots, radioimunoensaios, ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado à enzima), imunoensaios "sanduíche", testes de imunoprecipitação, imunoensaios fluorescentes e imunoensaios de proteína A. Um teste ilustrativo de ligação de antígeno é fornecido abaixo na seção de Exemplos.

Os anticorpos anti-DLL4 que possuem as propriedades exclusivas descritas no presente pedido podem ser obtidos pela seleção dos clones de hibridoma de anti-DLL4 para as propriedades desejadas, por qualquer método conveniente e alguns deles são descritos e exemplificados no presente pedido. Por exemplo, se um anticorpo monoclonal anti-DLL4 que bloqueia ou não a ligação dos receptores Notch a DLL4 é desejado, o anticorpo candidato pode ser testado em um teste de competição de ligação, como ELISA de ligação competitiva, no qual os poços das placas são revestidos com DLL4 e a solução do anticorpo com excesso de receptor Notch é colocada em camadas nas placas revestidas, e o anticorpo ligado é detectado enzimaticamente, por exemplo, colocando em contato o anticorpo ligado com o anticorpo anti-lg conjugado a HRP ou anticorpo anti-lg biotinilado, e revelando a reação de cor de HRP, por exemplo, pela revelação das placas com estreptavidina-HRP e/ou peróxido de hidrogênio e detectando a reação de cor de HRP por espectrofotometria a 490 nm com um leitor de placa ELISA.

Em uma realização, o anticorpo é um anticorpo alterado que possui algumas, mas não todas as funções efetoras, que fazem deste um candidato desejável para muitas aplicações em que a meia vida do anticorpo in vivo é ainda importante para certas funções efetoras (como complemento e ADCC), desnecessárias ou deletérias. Em certas realizações, as atividades Fc da imunoglobulina produzida são medidas para assegurar que somente as propriedades desejadas sejam mantidas. Testes de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo podem ser conduzidos para confirmar a redução/depleção de atividades CDC e/ou ADCC. Por exemplo, testes de ligação do receptor Fc (FcR) podem ser conduzidos para assegurar que o anticorpo seja desprovido de ligação ao FcyR (então provavelmente sendo desprovido de atividade ADCC), mas mantenha capacidade de ligação ao FcRn. As células primárias para mediação de ADCC1 células NK1 expressam somente Fc(RIII, enquanto que monócitos expressam Fc(RI, Fc(RII e Fc(RIII. A expressão FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet1 Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Um exemplo de um ensaio in vitro para avaliar atividade ADCC de uma molécula de interesse está descrito nas patentes US 5.500.362 ou 5.821.337. Células efetoras úteis para tais testes incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células Natural Killer (NK). Alternativamente ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal, conforme divulgado em Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998). Testes de ligação C1q podem, também, ser realizados para confirmar se o anticorpo é incapaz de se ligar a C1q e então desprovido de atividade CDC. Para avaliar ativação de complemento, um teste CDC, por exemplo, conforme descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996), pode ser realizado. Ligação FcRn e determinações de liberação/meia vida in vivo também podem ser realizadas usando-se métodos conhecidos no estado da técnica, por exemplo, aqueles descritos na seção de Exemplos.

Vetores, Células Hospedeiras E Métodos Recombinantes

Para produção de um anticorpo recombinante, o ácido nucleico que o codifica é isolado e inserido em um vetor replicante para posterior clonagem (amplificação do DNA) ou para expressão. O DNA que codifica o anticorpo é facilmente isolado e sequenciado usando-se procedimentos convencionais (por exemplo, pelo uso de sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias leves e pesadas do anticorpo). Muitos vetores estão disponíveis. A escolha do vetor depende em parte da célula hospedeira a ser usada. G eralmente, células hospedeiras preferidas são tanto de origem procarionte como eucarionte (geralmente de mamíferos). Aprecia-se que regiões constantes de qualquer isotipo possam ser usadas para este propósito, incluindo regiões constantes IgG1 IgM1 IGA, IgD e IgE1 e que tais regiões constantes possam ser obtidas a partir de qualquer espécie humana ou animal.

A. Geração De Anticorpos Usando-se Células Hospedeiras Procariontes

I. Construção Do Vetor

Seqüências de polinucleotídeo que codificam componentes polipeptídicos do anticorpo podem ser obtidas usando-se técnicas de recombinação padrão. Seqüências de polinucleotídeos desejadas podem ser isoladas e sequenciadas a partir de células que produzem anticorpo, como células de hibridoma. Alternativamente, polinucleotídeos podem ser sintetizados usando-se sintetizador de nucleotídeo ou técnicas de PCR. Uma vez obtidas, as seqüências que codificam os polipeptídeos são inseridas em um vetor recombinante capaz de replicar e expressar polinucleotídeos heterólogos em hospedeiros procariontes. Muitos vetores que estão disponíveis e conhecidos no estado da técnica podem ser usados para o propósito da presente invenção. A seleção de um vetor apropriado será principalmente dependente do tamanho dos ácidos nucleicos a serem inseridos no vetor e da célula hospedeira específica a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém vários componentes, dependendo da sua função (amplificação e/ou expressão de polinucleotídeo heterólogo) e da sua compatibilidade com a célula hospedeira específica na qual reside. Os componentes do vetor geralmente incluem, mas não se limitam a uma origem de replicação, um gene marcador de seleção, um promotor, um sítio de ligação de ribossomo (RBS), uma seqüência sinal, um inserto heterólogo de ácido nucleico e uma seqüência de terminação de transcrição.

Em geral, vetores plasmídeos que contêm replicon e seqüências de controle que são derivadas de espécies compatíveis com a célula hospedeira são usados em conexão com estes hospedeiros. O vetor geralmente carrega um sítio de replicação, bem como seqüências marcadoras que são capazes de fornecer seleção fenotípica em células transformadas. Por exemplo, E. coli é tipicamente transformada usando-se pBR322, um plasmídio derivado de uma espécie E. coli. pBR322 contém genes que codificam resistência à ampicilina (Amp) e tetraciclina (Tet) e, dessa forma, fornece meios fáceis para identificar células transformadas. pBR322, suas derivadas, ou outro plasmídio microbiano ou bacteriófago também podem conter, ou serem modificados para conter promotores que podem ser usados pelo organismo microbiano para expressão de proteínas endógenas. Exemplos de pBR322 derivados usados para expressão de anticorpos específicos estão descritos em detalhes em Carter etal., patente US 5.648.237.

Além disso, vetores fago que contêm replicon e seqüências controle que são compatíveis com o microorganismo hospedeiro podem ser usados como vetores de transformação em conexão com estes hospedeiros. Por exemplo, bacteriófago como XGEM™.-11 pode ser utilizado na fabricação de um vetor recombinante, que pode ser usado para transformar células hospedeiras suscetíveis como E. coli LE392.

O vetor de expressão pode compreender dois ou mais pares de promotor-cistron, que codificam um dos componentes do polipeptídeo. Um promotor é uma seqüência reguladora não traduzida localizado a montante (5') para um cistron que modula sua expressão. Promotores procariontes tipicamente situam-se em duas classes: induzíveis e constitutivos. Promotor induzível é um promotor que inicia o aumento dos níveis de transcrição do cistron sob seu controle na resposta para mudanças na condição da cultura, por exemplo, a presença ou ausência de um nutriente ou uma mudança na temperatura.

Um amplo número de promotores reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais é bem conhecido. O promotor selecionado pode ser ligado de forma funcional ao cistron do DNA que codifica as cadeias leve ou pesada pela remoção do promotor da fonte de DNA1 via digestão da enzima de restrição e inserção da seqüência do promotor isolada no vetor. Ambos, seqüência do promotor nativo e muitos promotores heterólogos, podem ser usados para amplificação e/ou expressão direta dos genes alvo. Em algumas realizações, promotores heterólogos são utilizados, já que eles geralmente permitem maior transcrição e alta produção do gene alvo expresso, quando comparado ao promotor polipeptídico alvo nativo.

Promotores adequados para uso em hospedeiros procariontes incluem o promotor PhoA1 os sistemas promotores β-galactamase e lactose, um sistema promotor triptofano (trp) e promotores híbridos como o promotor tac ou o trc. No entanto, outros promotores que são funcionais em bactéria (como outros promotores bacterianos ou fagos conhecidos) são também adequados. Suas seqüências de nucleotídeo foram publicadas, com isso, permitindo a um técnico no assunto ligá-los de forma funcional aos cistrons que codificam as cadeias alvo leve e pesada (Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269) usando-se ligantes ou adaptadores para fornecer qualquer sítio de restrição necessário.

Em um aspecto da invenção, cada cistron no vetor recombinante compreende um componente seqüência sinal de secreção que direciona a translocação dos polipeptídeos expressos através de uma membrana. Em geral, a seqüência sinal pode ser um componente do vetor, ou esta pode ser uma parte do DNA do polipeptídeo alvo que é inserido no vetor. A seqüência sinal selecionada para o propósito desta invenção deve ser aquela reconhecida e processada (isto é, clivada por uma peptidase sinal) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procariontes que não reconhecem e processam as seqüências sinal nativas para os polipeptídeos heterólogos, a seqüência sinal é substituída por uma seqüência sinal procarionte selecionada, por exemplo, do grupo que consiste em fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp1 ou líderes enterotoxina Il (STII) estáveis ao calor, LamB1 PhoE1 PeIB1 OmpA e MBP. Em uma realização da invenção, as seqüências sinal usadas em ambos os cistrons do sistema de expressão são seqüências sinal STII ou variantes destas.

Em outro aspecto, a produção das imunoglobulinas de acordo com a invenção pode ocorrer no citoplasma da célula hospedeira, e então não necessita da presença das seqüências sinal de secreção em cada cistron. Nesta consideração, as cadeias leve e pesada da imunoglobulina são expressas, dobradas e montadas para formar imunoglobulinas funcionais no citoplasma. Certas linhagens de hospedeiros (por exemplo, as linhagens E. coli trxB) fornecem condições no citoplasma que são favoráveis para formação de pontes bissulfeto, com isso, permitindo a dobra e montagem apropriadas das subunidades de proteína expressa. Proba e Pluckthun Gene, 159:203 (1995).

Células hospedeiras procariontes adequadas para expressar anticorpos incluem Archaebacteria e Eubacteria, como organismos Gram negativos ou Gram positivos. Exemplos de bactérias úteis incluem Escherichia (por exemplo, E. coli), Bacilli (por exemplo, B. subtilis), Enterobacteria, espécie Pseudomonas (por exemplo, P. aeruginosa), Salmoriella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiellal Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, ou Paracoccus. Em uma realização, são usadas células gram negativas. Em uma realização, células de E. coli são usadas como hospedeiros para a invenção. Exemplos de linhagens de E. coli incluem linhagem W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), páginas 1190-1219; depósito ATCC No. 27.325) e derivadas destas, incluindo linhagem 33D3 tendo genótipo W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 Iac Iq lacL8 AompTA(nmpc-fepE) degP41 kanR (patente US 5.639.635). Outras linhagens e derivadas destas, como E. coli 294 (ATCC 31.446), E. coli Β, E. coliX 1776 (ATCC 31.537) e E. coli RV308(ATCC 31.608) são também adequadas. Estes exemplos são mais ilustrativos do que limitantes. Métodos para construção de derivados de qualquer uma das bactérias acima mencionadas que têm genótipos definidos são conhecidos no estado da técnica e descritos, por exemplo, e Bass et aí., Proteins, 8:309-314 (1990). Geralmente, é necessário selecionar a bactéria apropriada levando-se em consideração a replicabilidade do replicon nas células de uma bactéria. Por exemplo, espécies E. coli, Serratia ou Salmoriella podem ser adequadas para serem usadas como hospedeiras quando plasmídios bem conhecidos, como pBR322, pBR325, pACYC177 ou pKN410 são usados para fornecer o replicon.

Tipicamente, a célula hospedeira deve secretar quantidades mínimas de enzimas proteolíticas, e inibidores de protease adicionais podem ser, de forma desejável, incorporados na cultura celular.

ii. Produção De Anticorpo

Células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão descritos acima e cultivadas em meio convencional de nutriente modificado, apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes ou amplificar os genes que codificam as seqüências desejadas.

Transformação significa introdução de DNA no hospedeiro procarionte, de forma que o DNA seja replicável, tanto como um elemento extracromossomal ou por integrante cromossomal. Dependendo da célula hospedeira usada, a transformação é feita com o uso de técnicas padrão, apropriadas para tais células. O tratamento com cálcio, que emprega cloreto de cálcio, é geralmente usado para células bacterianas que contêm barreiras substanciais na parede celular. Outro método para transformação emprega polietilenoglicol/DMSO. Ainda outra técnica usada é a eletroporação.

Células procariontes usadas para produzir os polipeptídeos são cultivadas em meio conhecido no estado da técnica e adequado para cultura de células hospedeiras selecionadas. Exemplos de meios adequados incluem caldo Iuria (LB) mais suplementos de nutrientes necessários. Em algumas realizações, o meio também contém um agente de seleção, escolhido com base na construção do vetor de expressão para, seletivamente, permitir o crescimento de células procariontes que contêm o vetor de expressão. Por exemplo, a ampicilina é adicionada no meio para o crescimento de células com genes que expressam resistência à ampicilina.

Qualquer suplemento necessário, além das fontes de carbono, nitrogênio e fosfato inorgânico, podem ser também incluídos em concentrações apropriadas, introduzido sozinho ou como uma mistura com outro suplemento ou meio, como uma fonte de nitrogênio complexa. Opcionalmente, o meio de cultura pode conter um ou mais agentes de redução selecionados do grupo que consiste de glutationa, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol e ditiotreitol.

As células hospedeiras procariontes são cultivadas em temperaturas adequadas. Para o crescimento de E. coli, por exemplo, a temperatura preferida varia de cerca de 20°C a cerca de 39°C, mais preferencialmente de cerca de 25°C a cerca de 37°C, até mais preferencialmente cerca de 30°C. O pH do meio pode ter qualquer variação de pH de aproximadamente 5 para cerca de 9, dependendo principalmente do organismo hospedeiro. Para E. coli, o pH é preferencialmente de cerca de 6,8 a cerca de 7,4, e mais preferencialmente cerca de 7,0.

Se um promotor induzível é usado no vetor de expressão, a expressão de proteína é induzida sob condições adequadas para a ativação do promotor. Em um aspecto da invenção, promotores PhoA são usados para controlar transcrição dos polipeptídeos. Consequentemente, as células hospedeiras transformadas são cultivadas em um meio Iimitante de fosfato para indução. Preferencialmente, o meio Iimitante de fosfato é o meio C.R.A.P (consulte, por exemplo, Simmons et ai, J. Immunoi Methods (2002), 263:133- 147). Uma variedade de outros indutores pode ser usada, de acordo com a construção do vetor empregada, como é conhecido no estado da técnica.

Em uma realização, os polipeptídeos expressos da presente invenção são secretados e recuperados a partir do periplasma das células hospedeiras. A recuperação de proteína tipicamente envolve o rompimento do microorganismo, geralmente por tais meios como choque osmótico, sonicação ou lise. U ma vez que as células são rompidas, fragmentos de células ou células inteiras podem ser removidos por centrifugação ou filtração. As proteínas podem ser também purificadas, por exemplo, por cromatografia de afinidade em resina. Alternativamente, as proteínas podem ser transportadas para o meio de cultura e isoladas neste. As células podem ser removidas da cultura e a cultura sobrenadante pode ser filtrada e concentrada para posterior purificação das proteínas produzidas. Os polipeptídeos expressos podem ser posteriormente isolados e identificados, usando-se métodos comumente conhecidos, como eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e teste Western blot.

Em um aspecto da invenção, a produção de anticorpo é conduzida em grande quantidade por um processo de fermentação. Vários processos de fermentação de batelada em larga escala estão disponíveis para a produção de proteínas recombinantes. Fermentações em larga escala têm pelo menos 1000 litros de capacidade, preferencialmente de cerca de 1.000 a 100.000 litros de capacidade. Estes fermentadores usam agitadores de impulsão para distribuir o oxigênio e os nutrientes, especialmente a glicose (a fonte preferida de carbono/energia). Fermentação em pequena escala refere-se geralmente à fermentação em um fermentador que não tem mais do que aproximadamente 100 litros em capacidade de volume, e pode variar de cerca de 1 litro a cerca de 100 litros.

Em um processo de fermentação, a indução da expressão de proteína é tipicamente iniciada depois das células terem crescido sob condições adequadas para uma densidade desejada, por exemplo, uma OD550 de cerca de 180 a 220, na qual os estágios das células são de fase estacionária primária. Uma variedade de indutores pode ser usada, de acordo com a construção do vetor empregada, como é conhecido no estado da técnica e descrito acima. As células podem ser cultivadas por períodos mais curtos, antes da indução. As células são usualmente induzidas por cerca de 12a 50 horas, no entanto, tempos de indução mais longos ou mais curtos podem ser usados.

Para aprimorar o rendimento da produção e a qualidade dos polipeptídeos, várias condições de fermentação podem ser modificadas. Por exemplo, para aprimorar a montagem e dobras apropriadas dos polipeptídeos do anticorpo secretado, vetores adicionais que superexpressam proteínas chaperonas, como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD e ou DsbG) ou FkpA (um peptidilprolil eis, transisomerase com atividade de chaperona) podem ser usados para co-transformar as células procariontes hospedeiras. Foi demonstrado que as proteínas chaperonas facilitam a dobra e a solubilidade apropriada de proteínas heterólogas produzidas em células hospedeiras bacterianas. Chen et al. (1999) J Bio Chem 274:19601-19605; Georgiou et al., patente US 6.083.715; Georgiou et al., patente US 6.027.888; Bothmann e Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm e Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie etal. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210.

Para minimizar proteólises de proteínas heterólogas expressas (especialmente aquelas que são proteoliticamente sensíveis), certas linhagens de células hospedeiras, deficientes em enzimas proteolíticas, podem ser usadas para a presente invenção. Por exemplo, linhagens de células hospedeiras podem ser modificadas para efetuar mutação(ões) genética(s) em genes que codificam proteases bacterianas conhecidas como Protease III, OmpT1 DegP, Tsp, Protease I, Protease Mi, Protease V, Protease Vl e combinações destas. Algumas linhagens de E. coli deficientes em protease estão disponíveis e descritas, por exemplo, em Joly et al. (1998), acima; Georgiou et al., patente US 5.264.365, Georgiou et al., patente US 5.508.192; Hara et ai, MicrobialDrug Resistance, 2:63-72 (1996).

Em uma realização, linhagens de E. coli deficientes em enzimas proteolíticas e transformadas com plasmídeos que superexpressam uma ou mais proteínas chaperonas são usadas como células hospedeiras no sistema de expressão.

III. Purificação De Anticorpo

Métodos de purificação de proteína padrão conhecidos no estado da técnica podem ser empregados. Os procedimentos a seguir são procedimentos de purificação adequados exemplares: fracionamento em imunoafinidade ou colunas de troca iônica, precipitação em etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica ou em resina de troca catiônica como DEAE, chromatofocusing, SDS-PAGE, precipitação com sulfato de amônio e filtração em gel, usando-se, por exemplo, Sephadex G-75.

Em um aspecto, a Proteína A imobilizada em uma fase sólida é usada para purificação de imunoafinidade dos produtos de anticorpo inteiro. A Proteína A é uma proteína com parede celular de 41 kD de Staphylococcus aureas que se liga com alta afinidade a uma região Fc dos anticorpos. Lindmark et al. (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13. A fase sólida na qual a Proteína A é imobilizada é preferencialmente uma coluna que compreende um vidro ou superfície de sílica, mais preferencialmente, uma coluna de vidro poroso controlado ou uma coluna de ácido silícico. Em algumas aplicações, a coluna foi revestida com um reagente, como glicerina, na tentativa de prevenir a aderência de contaminantes não específicos.

Como primeiro passo da purificação, a preparação derivada da cultura celular, como descrita acima, é aplicada na fase sólida da Proteína A imobilizada para permitir ligação específica do anticorpo de interesse à Proteína A. A fase sólida é então lavada para remover contaminantes não especificamente ligados à fase sólida. Finalmente, o anticorpo de interesse é recuperado da fase sólida por eluição.

b. Geração De Anticorpos Usando-Se Células Hospedeiras Eucariontes Os componentes do vetor geralmente incluem, mas não se limitam a um ou mais dos seguintes: uma seqüência sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento enhancer, um promotor e uma seqüência de terminação de transcrição.

(O Componente Seqüência Sinal

Um vetor para uso em uma célula hospedeira eucarionte pode também conter uma seqüência sinal ou outro polipeptídeo que tem um sítio de clivagem específico no N-terminal da proteína madura ou polipeptídeo de interesse. A seqüência sinal heteróloga selecionada, preferencialmente, é aquela reconhecida e processada (isto é, clivada por uma peptidase sinal) pela célula hospedeira. Na expressão em células de mamíferos, a seqüência sinal de mamíferos, bem como líderes secretórios virais, por exemplo, o sinal gD de herpes simplex, estão disponíveis.

O DNA para tal região precursora é ligado na fase de leitura ao DNA que codifica o anticorpo.

(li) Origem De Replicação Geralmente, um componente origem de replicação não é necessário para vetores de expressão em mamíferos. Por exemplo, a origem SV40 pode tipicamente ser usada somente porque esta contém o promotor primário.

(iii) Componente Gene De Seleção Vetores de expressão e clonagem podem conter um gene de seleção, também chamado de marcador selecionável. Genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência aos antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, quando relevante, ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis a partir de meios complexos.

Um exemplo de um esquema de seleção utiliza uma droga para interromper o crescimento de uma célula hospedeira. Essas células, que são sucessivamente transformadas com um gene heterólogo, produzem uma proteína que confere resistência à droga e, dessa forma, sobrevivem ao regime de seleção. Exemplos de tal seleção dominante usam as drogas neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Outro exemplo de marcadores de seleção adequados para as células de mamíferos são aqueles capazes de identificar células competentes para ocupar o ácido nucleico do anticorpo, como DHFR, timidina quinase, metalotioneína-l e II, preferencialmente, genes da metalotioneína de primatas, adenosina deaminase, ornitina decarboxilase, etc.

Por exemplo, células transformadas com o gene de seleção DHFR são as primeiras identificadas pelo cultivo de todos os transformantes em um meio de cultura que contém metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR. Uma célula hospedeira apropriada quando o DHFR tipo selvagem é empregado é a linhagem celular ovariana de hamster Chinês (CHO) deficiente na atividade de DHFR (por exemplo, ATCC CRL-9096).

Alternativamente, células hospedeiras (particularmente hospedeiros tipo selvagem que contém DHFR endógeno) transformadas ou co- transformadas com seqüências de DNA que codificam um anticorpo, proteína DHFR tipo selvagem, e outro marcador selecionável como aminoglicosídeo 3'- fosfotransferase (APH) podem ser selecionadas pelo crescimento celular em um meio que contém um agente de seleção para o marcador selecionável, como um antibiótico aminoglicosídico, por exemplo, canamicina, neomicina, ou G418. Consulte patente US 4.965.199.

(IV) Componente Promotor

Vetores de expressão e clonagem usualmente contêm um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e é ligado de forma funcional ao ácido nucleico do polipeptídeo do anticorpo. Seqüências promotoras são conhecidas para eucariontes. Virtualmente todos os genes eucariontes têm uma região rica em AT localizada aproximadamente de 25 a 30 bases a montante do sítio onde a transcrição é iniciada. Outra seqüência encontrada de 70 a 80 bases a montante do início da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT onde N pode ser qualquer nucleotídeo (SEQ ID NO: 3). Na extremidade 3' da maioria dos genes eucariontes está uma seqüência AATAAA, que pode ser o sinal para adição da cauda poli A à extremidade 3' da seqüência de codificação (SEQ ID NO: 4). Todas estas seqüências são adequadamente inseridas em vetores de expressão de eucariontes.

A transcrição do polipeptídeo do anticorpo a partir de vetores em células hospedeiras de mamíferos é controlada, por exemplo, por promotores obtidos a partir de genomas de vírus, como vírus polioma, vírus fowlpox, adenovírus (como Adenovírus 2), vírus de papiloma bovino, vírus de sarcoma de aves, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite-B e Vírus Simian 40 (SV40); a partir de promotores heterólogos de mamíferos, por exemplo, o promotor actina ou um promotor imunoglobulina; a partir de promotores de choque térmico, desde que tais promotores fornecidos sejam compatíveis com os sistemas da célula hospedeira.

Os promotores iniciais e finais do vírus SV40 são convenientemente obtidos como um fragmento de restrição SV40, que também contém a origem de replicação viral SV40. O promotor inicial imediato do citomegalovírus humano é convenientemente obtido como um fragmento de restrição Hindlll Ε. Um sistema para expressão de DNA em hospedeiros mamíferos que utiliza o vírus de papiloma bovino como um vetor é divulgado na patente US 4.419.446. Uma modificação deste sistema está descrita na patente US 4.601.978. Alternativamente, a repetição terminal longa do Vírus do Sarcoma de Rous pode ser usada como promotor.

ív) Componente Elemento Enhancer

A transcrição do DNA que codifica o polipeptídeo do anticorpo desta invenção por eucariontes mais evoluídos é freqüentemente aumentada pela inserção de uma seqüência enhancer no vetor. Muitas seqüências enhancer são agora conhecidas a partir de genes de mamífero (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina). Tipicamente, no entanto, poderá ser usado um enhancer de um vírus de célula eucarionte. Exemplos incluem o enhancer SV40 no último lado da origem de replicação (bp 100-270), o enhancer do promotor inicial do citomegalovírus, o enhancer do polioma no último lado da origem de replicação e enhancers de adenovírus. Consulte também Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) nos elementos enhancing para ativação de promotores de eucariontes. O enhancer pode ser ligado no vetor na posição 5' ou 3' à seqüência de codificação do polipeptídeo do anticorpo, mas está preferencialmente localizado em um sítio 5' do promotor.

(vi) Componente Terminação De Transcrição

Vetores de expressão usados em célula hospedeiras eucariontes tipicamente também irão conter seqüências necessárias para a terminação da transcrição e para estabilização do mRNA. Tais seqüências estão comumente disponíveis nas regiões não traduzidas 5', ocasionalmente 3' de eucariontes ou DNAs virais ou cDNAs Estas regiões contêm segmentos de nucleotídeos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do mRNA que codifica um anticorpo. Um componente da terminação de transcrição útil é a região de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino. Consulte documento WO 94/11026 e o vetor de expressão divulgado no presente pedido.

(vil) Seleção E Transformação De Células Hospedeiras

Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do DNA nos vetores no presente pedido incluem células eucariontes mais evoluídas descritas no presente pedido, incluindo células hospedeiras de vertebrados. A propagação de células de vertebrados na cultura (cultura de tecido) tomou-se um procedimento de rotina. Exemplos de linhagens de célula hospedeira de mamíferos úteis são linhagens CV1 de rim de macaco transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura de suspensão, Graham etal., J. Gen Virol. 36:59 (1977)) {tc "Graham et AL., J. Gen Viroi 36V59 (1977)) " \f D}; células de rim de filhotes de hamster (BHK, ATCC CCL 10); células ovarianas de hamsterChinês/-DHFR (CHO, Urlaub etal., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 77:4216 (1980)) {tc "Urlaub etal., Proc. NatL Acad. Sei. USA 77Y4216 (1980))" \f D}; células de sertoli de camundongo (TM4, Mather1 Biol. Reprod. 23:243- 251 (1980) {tc "Mather, Biol. Reprod. 23V243-251 (1980) " \f D}; células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humana (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather etal., Annals N.Y. Acad. Sei. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2).

Células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão ou de clonagem descritos acima para produção de anticorpo e cultivadas em meio convencional de nutriente modificado como apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes ou amplificar os genes que codificam as seqüências desejadas. (viu) Cultura De Células Hospedeiras

As células hospedeiras usadas para produzir um anticorpo desta invenção podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Meios comercialmente disponíveis como F10 de Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo ((MEM)1 (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Meio Modificado de Eagle de Dulbecco ((DMEM)1 Sigma) são adequados para cultivar as células hospedeiras. Além disso, qualquer um dos meios descritos em Ham et aí., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et ai, Anal. Biochem. 102:255 (1980), patentes US 4.767.704, 4.657.866, 4.927.762, 4.560.655 ou 5.122.469; documentos WO 90/03430, WO 87/00195 ou patente US Re. 30.985 podem ser usados como meios de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um destes meios pode ser suplementado, conforme necessário, com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (como insulina, transferrina ou fator de crescimento epidermal), sais (como cloreto de sódio, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões (como HEPES), nucleotídeos (como adenosina e timidina), antibióticos (como droga GENTAMYCIN™), elementos traço (definidos como componentes inorgânicos usualmente presentes em concentração final na faixa micromolar) e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Qualquer outro suplemento necessário também pode ser incluído na concentração apropriada que seria conhecida pelos técnicos no assunto. As condições de cultura, como temperatura, pH e similares, são aquelas previamente usadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e serão evidentes para um técnico no assunto.

(ix) Purificação De Anticorpo

Quando se utilizam técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente, ou diretamente secretado no meio. Se o anticorpo é produzido intracelularmente, como um primeiro passo, o fragmento particulado, tanto das células hospedeiras como fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, por centrifugação ou uItrafiItração. Quando o anticorpo é secretado no meio, sobrenadantes de tais sistemas de expressão são, geralmente, primeiro concentrados usando-se um filtro de concentração de proteína disponível comercialmente, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de protease como PMSF pode ser incluído em qualquer um dos passos antecedentes para inibir proteólises, e antibióticos podem ser incluídos para prevenir o crescimento de contaminantes imprevistos.

A composição de anticorpo preparada a partir das células pode ser purificada usando-se, por exemplo, cromatografia em hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise e cromatografia por afinidade, com cromatografia por afinidade sendo a técnica de purificação preferida. A adequação da proteína A como um Iigante de afinidade depende da espécie e isotipo de qualquer domínio Fc da imunoglobulina que está presente no anticorpo. A proteína A pode ser usada para purificar anticorpos que são baseados em cadeias pesadas γ1, γ2, ou γ4 humana (Lindmark et al, J. Immunol. Meth. 62:1- (1983)). A proteína G é recomendada para todos os isótopos de camundongo e para γ3 humano (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). A matriz para a qual o Iigante de afinidade é ligado é freqüentemente agarose, mas outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis, como vidro poroso controlado ou poli(estireno-divinil)benzeno, permitem velocidades mais rápidas de fluxo e tempo de processamento mais curto do que aquele que pode ser atingido com agarose. Quando o anticorpo compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) é útil para a purificação. Outras técnicas para purificação de proteína, como fracionamento em uma coluna de troca iônica, precipitação em etanol, HPLC Fase Reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina SEPHAROSE™, cromatografia em uma resina de troca aniônica ou catiônica (como uma coluna de ácido poliaspártico), chromatofocusing, SDS- PAGE e precipitação em sulfato de amônio estão também disponíveis, dependendo do anticorpo a ser recuperado.

Após qualquer etapa de purificação preliminar, a mistura que compreende o anticorpo de interesse e os contaminantes pode ser submetida à cromatografia de interação hidrofóbica em pH baixo, usando-se um tampão de eluição a um pH entre cerca de 2,5 a 4,5, preferencialmente realizada em baixas concentrações de sal (por exemplo, de cerca de 0 a 0,25M de sal).

Imunoconjugados

A invenção contempla imunoconjugados (alternativamente chamados "conjugados anticorpo-droga" ou "ADC"), que compreendem anticorpos anti-DLL4 conjugados a um agente citotóxico, como um agente quimioterápico, uma droga, um agente inibitório do crescimento, uma toxina (por exemplo, uma toxina ativa enzimaticamente de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal ou fragmentos destas) ou um isótopo radioativo (isto é, um radioconjugado).

O uso de conjugados anticorpo-droga para a entrega local de agentes citotóxicos ou citostáticos, isto é, drogas para destruir ou inibir células tumorais no tratamento de câncer (Syrigos e Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz e Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172; patente US 4.975.278) permite a entrega direcionada do componente droga para tumores, e acumulação intracelular nestes, onde a administração sitêmica destes agentes droga não conjugados podem resultar em um nível inaceitável de toxicidade para células normais, bem como para células de tumor a serem eliminadas (Baldwin et ai, (1986) Lancet páginas (15 de março de 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: A Review," em Monoclonal Antibodies "84: Biological And Clinicai Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), páginas 475-506). A máxima eficiência com mínima toxicidade é procurada através disso. Tanto os anticorpos policlonais como anticorpos monoclonais foram relatados como úteis nestas estratégias (Rowle et ai, (1986) Câncer Immunol. Immunother., 21:183-87). As drogas usadas nestes métodos incluem daunomicina, doxorubicina, metotrexato e vindesina (Rowle et ai, (1986) acima). Toxinas usadas nos conjugados anticorpo-toxina incluem toxinas bacterianas como toxina de difteria, toxinas vegetais tais como ricina, toxinas de molécula pequena como geldanamicina Mandler et al. (2000) Jour. of the Nat. Câncer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinóides (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:8618-8623) e caliqueamicina (Lode et al. (1998) Câncer Res. 58:2928; Hinman et al. (1993) Câncer Res. 53:3336-3342). As toxinas podem realizar seus efeitos citotóxicos e citostáticos por mecanismos que incluem ligação à tubulina, ligação ao DNA ou inibição da topoisomerase. Algumas drogas citotóxicas tendem a ser inativas ou menos ativas quando conjugadas com grandes anticorpos ou Iigantes do receptor de proteína.

ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetano, Biogen/ldec) é um conjugado anticorpo-radioisótopo, composto de um anticorpo monoclonal kappa IgGI murino dirigido contra o antígeno CD20, encontrado na superfície de linfócitos B normais e malignos, e radioisótopos111 In ou 90Y ligados por um quelante Iigante tiouréia (Wiseman et al (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):76 6-77; Wiseman et al (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69). Embora ZEVALIN possua atividade contra Linfoma não Hodgkin de célula-B (NHL), a administração resulta em citopenias graves e prolongadas na maioria dos pacientes. MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals), um conjugado anticorpo-droga composto de um anticorpo hu CD33 ligado à caliqueamicina, foi aprovada em 2000 para o tratamento de leucemia mielóide aguda por injeção (Drugs of the Future (2000) 25(7):686; nas patentes US 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). Cantuzumab mertansina (Immunogen, Inc.), um conjugado anticorpo-droga composto de anticorpo huC242 ligado, via Iigante bissulfeto SPP1 ao componente droga maitansinóide, DM1, está avançada nos testes de Fase II para o tratamento de cânceres que expressam CanAg1 como de cólon, pancreático, gástrico e outros. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), um conjugado anticorpo-droga composto do anticorpo monoclonal de antígeno de membrana específico anti-próstata (PSMA) ligado ao componente droga maitansinóide, DM1, está em desenvolvimento para o tratamento potencial de tumores de próstata. Os pepitídeos auristatina, auristatina E (AE) e monometilauristatina (MMAE), sintéticos análogos de dolastatina, foram conjugados a anticorpos monoclonais quiméricos cBR96 (específico para Lewis Y em carcinomas) e cAC10 (específico para CD30 em malignidades hematológicas) (Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784) e estão em desenvolvimento terapêutico.

Agentes quimioterápicos úteis na geração de tais imunoconjugados estão descritos no presente pedido (por exemplo, acima). Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos destas que podem ser usadas incluem cadeia de difiteria A, fragmentos ativos não Iigantes de toxina de difiteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A da ricina, cadeia A da abrina, cadeia A da modeccina, alfa-sarcina, proteína Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor momordica charantia, curcina, crotina, inibidor sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Consulte, por exemplo, documento WO 93/21232 publicado em 28 de outubro de 1993. Uma variedade de radionuclídeos está disponível para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem 212Bi, 131I1 131In, 90Y e 186Re. Conjugados de anticorpo e agente citotóxico são fabricados usando-se uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncionais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT)1 derivados bifuncionais de imidoésteres (como dimetil adipimidato HCI), ésteres ativos (como disuccinimidil suberato), aldeídos (como glutaraldeído), compostos bis-azido (como bis (p-azidobenzoil) hexanediamina), derivados de bis-diazônio (como bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (como tolueno 2,6-diisocianato) e compostos bis-ativos de flúor (como 1,5- diflúor-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina ricina pode ser preparada conforme descrito em Vitetta et ai, Science, 238: 1098 (1987). O ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triamino penta acético (MX-DTPA) marcado com carbono-14 é um agente quelante exemplar para conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Consulte documento WO 94/11026.

Conjugados de um anticorpo e uma ou mais toxinas de molécula pequena, como caliqueamicinas, maitansinóides, dolastatinas, aurostatinas, tricotecenos e CC1065, e os derivados destas toxinas que possuem toxina ativa, são também contemplados no presente pedido.

i. Maitansina E Maitansinóides

Em algumas realizações, o imunoconjugado compreende um anticorpo (inteiro ou fragmentos), conjugado a uma ou mais moléculas de maitansinóides.

Maitansinóides são inibidores mitóticos que agem pela inibição da polimerização de tubulina. A maitansina foi isolada pela primeira vez do arbusto do Leste Africano Maytenus serrata (patente US 3.896.111).

Subseqüentemente, foi descoberto que certos micróbios também produzem maitansinóides, como maitansinol e ésteres de maitansinol C-3 (patente US 4.151.042). Maitansinol sintético e derivados, e análogos destes, estão divulgados, por exemplo, nas patentes US 4.137.230, 4.248.870, 4.256.746, 4.260.608, 4.265.814, 4.294.757, 4.307.016, 4.308.268, 4.308.269, 4.309.428, 4.313.946, 4.315.929, 4.317.821, 4.322.348, 4.331.598, 4.361.650, 4.364.866, 4.424.219, 4.450.254, 4.362.663 e 4.371.533.

Componentes droga maitansinóide são componentes droga atrativos em conjugados anticorpo-droga porque eles são: (i) relativamente acessíveis para serem preparados por fermentação ou modificação química, derivação de produtos de fermentação; (ii) receptivos para derivatização com grupos funcionais adequados para conjugação por meio de ligantes não bissulfeto para anticorpos; (iii) estáveis no plasma e; (iv) eficazes contra uma variedade de linhagens celulares tumorais.

Imunoconjugados contendo maitansinóides, métodos para produzir os mesmos e seus usos terapêuticos estão divulgados, por exemplo, nas patentes US 5.208.020, 5.416.064 e patente Européia EP 0 425 235 B1, cujas divulgações são expressamente incorporadas ao presente como referência. Liu et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) descreveram imunoconjugados que compreendem um maitansinóide designado DM1 ligado ao anticorpo monoclonal C242 diretamente contra câncer colorretal humano. Foi descoberto que o conjugado é altamente citotóxico dirigido à cultura de células cancerosas de cólon, e mostrou ter atividade anti-tumor em testes de crescimento de tumor in vivo. Chari et al, Câncer Research 52:127-131 (1992) descrevem imunoconjugados no qual um maitansinóide foi conjugado via um Iigante bissulfeto a um anticorpo murino A7, que se liga a um antígeno de linhagem de células de câncer de cólon humano ou a outro anticorpo monoclonal murino TA.1 que se liga ao oncogene HER- 2/neu. A citotoxicidade do conjugado TA.1-maitansinóide foi testada in vitro na linhagem celular SK-BR-3 de câncer de mama humano, que expressa antígenos de superfície 3 χ 105 HER-2 por célula. A droga conjugada atingiu um grau de citotoxicidade similar à droga maitansinóide livre, que poderia ser aumentada para elevar o número de moléculas de maitansinóides por molécula de anticorpo. O conjugado A7-maitansinóide mostrou baixa citotoxicidade sistêmica em camundongos.

Conjugados anticorpo-maitansinóides são preparados por ligações químicas em um anticorpo e uma molécula maitansinóide sem diminuição significante da atividade biológica, tanto do anticorpo como da molécula de maitansinóide. Consulte, por exemplo, patente US 5.208.020 (a divulgação desta é expressamente incorporada ao presente como referência). Uma média de conjugação de 3 a 4 moléculas de maitansinóide por molécula de anticorpo mostrou eficácia no aumento da citotoxicidade das células alvo, sem afetar negativamente a função ou a solubilidade do anticorpo, no entanto, seria esperado que até uma molécula de toxina/anticorpo aumentasse a citotoxicidade acima daquela do anticorpo nu. Maitansinóides são bem conhecidos no estado da técnica e podem ser sintetizados por técnicas conhecidas ou isolados a partir de fontes naturais. Maitansinóides adequados são divulgados, por exemplo, na patente US 5.208.020 e em outras patentes e publicações não patente referidas acima. Maitansinóides preferidos são maitansinol e análogos do maitansinol, modificados no anel aromático ou em outras posições da molécula de maitansinol, como vários ésteres de maitansinol.

Existem muitos grupos de ligação conhecidos no estado da técnica para fazer conjugações anticorpo-maitansinóides, incluindo, por exemplo, aqueles divulgados na patente US 5.208.020 ou na patente EP 0 425 235 B1, Chari et al., CancerResearch 52:127-131 (1992), e pedido de patente US 10/960.602, depositado em 8 de outubro de 2004, as divulgações destas são expressamente incorporadas ao presente como referência. Conjugados anticorpo-maitansinóide que compreendem o componente ligante SMCC podem ser preparados conforme divulgado no pedido de patente US 10/960.602, depositado em 8 de outubro de 2004. Os grupos de ligação incluem grupos bissulfeto, grupos tioéter, grupos de ácido lábil, grupos fotolábil, grupos lábil peptidase ou grupos lábil esterase, conformeo divulgado nas patentes identificadas acima, grupos bissulfeto e tioéter sendo preferidos. Grupos Iigantes adicionais estão descritos e exemplificados no presente pedido.

Conjugados do anticorpo e maitansinóide podem ser produzidos usando-se uma variedade de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados de imidoésteres bifuncionais (como dimetil adipimidato HCI), ésteres ativos (como disuccinimidil suberato), aldeídos (como glutaraldeído), compostos de bis-azido (como bis (p-azidobenzoil) hexanediamina), derivados de bis-diazônio (como bis-(p-diazoniumbenzoil)- etilenediamina), diisocianatos (como tolueno 2,6-diisocianato), e compostos de flúor bis-ativo (como 1,5-diflúor-2,4-dinitrobenzeno). Agentes de acoplamento particularmente preferidos para fornecer uma ligação bissulfeto incluem N- succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson et ai, Biochem. J. 173:723-737 [1978]) e N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP).

O ligante pode ser fixado á molécula de maitansinóide em várias posições, dependendo do tipo de ligação. Por exemplo, uma ligação éster pode ser formada por reação com um grupo hidroxila, usando-se técnicas convencionais de acoplamento. A reação pode ocorrer na posição C-3 que tem um grupo hidroxila, na posição C-14 modificada com hidroximetila, na posição C-15 modificada com um grupo hidroxila e na posição C-20 tendo um grupo hidroxila. Em uma realização preferida, a ligação é formada na posição C-3 do maitansinol ou em um análogo do maitansinol.

ii. Auristatinas E Dolastatinas Em algumas realizações, o imunoconjugado compreende um anticorpo conjugado aos análogos peptídicos das dolastatinas ou dolostatinas e derivados, as auristatinas (patentes US. 5635483; 5780588). Dolastatinas e auristatinas mostraram não interferir na dinâmica dos microtúbulos, hidrólise de GTP e divisão nuclear e celular (Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) e possuem atividade anti-câncer (US 5663149) e antifúngica (Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). Os componentes droga dolastatina ou auristatina podem ser fixados ao anticorpo através da terminação N (amina) ou terminação C (carboxila) do componente droga peptídica (documento WO 02/088172).

Realizações de auristatina exemplares incluem o N-terminal ligado aos componentes droga monometilauristatina DE e DF, divulgados em "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", patente US número de série 10/983.340, depositada em 5 de novembro 2004, a divulgação desta é expressamente incorporada ao presente como referência.

Tipicamente, componentes droga com base em peptídeos podem ser preparados pela formação de uma ligação peptídica entre dois ou mais aminoácidos e/ou fragmentos peptídicos. Tais ligações peptídicas podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese de fase líquida (consulte E. Schrõder e K. Lubke, "The Peptides", volume 1, páginas 76-136, 1965, Academic Press) que é bem conhecido no campo da química de peptídeos. Os componentes droga auristatina/dolastatina podem ser preparados de acordo com os métodos de: patentes US 5635483, US 5780588; Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soe. 111:5463-5465; Pettit et al (1998) Anti- CancerDrug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; e Pettit et al (1996) J. Chem. Soe. Perkin Trans. 15:859-863. Consulte também Doronina (2003) Nat Bioteehnol 21 (7):778-784; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", patente US série número 10/983,340, depositada em 5 de novembro de 2004, integralmente incorporada ao presente (divulgando, por exemplo, Iigantes e métodos de preparação de compostos monometilvalina, como MMAE e MMAF conjugados a ligantes).

III. Caliqueamicina

Em outras realizações, o imunoconjugado compreende um anticorpo conjugado a uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A família de antibióticos caliqueamicina é capaz de produzir quebra na fita dupla de DNA em concentrações sub-picomolar. Para a preparação de conjugados da família caliqueamicina, consulte patentes US 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, 5.877.296 (todas concedidas à American Cyanamid Company). Estruturas análogas de caliqueamicina que podem ser usadas incluem, mas não se limitam a, γ1', α2', 03', N-acetil-γ1', PSAG e θ'1 (Hinman et al., CancerResearch 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Câncer Research 58:2925-2928 (1998) e as patentes US supracitadas para American Cyanamid). Outra droga anti-tumor que o anticorpo pode ser conjugado é QFA, que é um antifolato. Tanto caliqueamicina como QFA têm sítios intracelulares de ação e não atravessam de imediato a membrana plasmática. Então, a percepção celular destes agentes através da internalização mediada pelo anticorpo aumenta muito seus efeitos citotóxicos.

iv. Outros Agentes Citotóxicos

Outros agentes anti-tumor que podem ser conjugados com os anticorpos incluem BCNU, estreptozoicina, vincristina e 5-fluorouracil, a família de agentes conhecida coletivamente como complexo LL-E33288, descrita nas patentes US 5.053.394, 5.770.710, bem como esperamicinas (patente US 5.877.296).

Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos destas que podem ser usadas incluem cadeia de difiteria A, fragmentos ativos não ligantes de toxina de difiteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A da ricina, cadeia A da abrina, cadeia A da modecina, alfa-sarcina, proteína de Aleurites fordii, proteínas da diantina, proteínas da Phytolaca americana (PAPI, PAPlI1 e PAP-S), inibidor momordica charantia, curcina, crotina, inibidor sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Consulte, por exemplo, documento WO 93/21232 publicado em 28 de outubro de 1993.

A presente invenção contempla, ainda, um imunoconjugado formado entre um anticorpo e um componente com atividade nucleolítica (por exemplo, uma ribonuclease ou uma DNA endonuclease, como uma desoxirribonuclease; DNase).

Para destruição seletiva do tumor, o anticorpo pode compreender um átomo altamente radioativo. Uma variedade de isótopos radioativos está disponível para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Quando o conjugado é usado para detecção, este pode compreender um átomo radioativo para estudos cintigráficos, por exemplo, tc99m ou I123, ou um marcador giratório para imagem de ressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecida como imagem de ressonância magnética, mri), como novamente iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolinio, manganês ou ferro.

O rádio ou outros marcadores podem ser incorporados no conjugado de um modo conhecido. Por exemplo, o pepitídeo pode ser biosintetizado, ou pode ser sintetizado por síntese química de aminoácido, usando-se aminoácidos precursores adequados envolvendo, por exemplo, flúor-19 no lugar de hidrogênio. Marcadores como tc99m ou I123, Re186, Re188 e In111 podem ser fixados via um resíduo de cisteína no peptídeo. Itrio-90 pode ser fixado via um resíduo de lisina. O método IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57) pode ser usado para incorporar iodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) descreve outros métodos em detalhes.

Conjugados do anticorpo e agente citotóxico podem ser produzidos usando-se uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncionais, como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC)1 iminotiolano (IT)1 derivados de imidoésteres bifuncionais (como dimetil adipimidato HCI), ésteres ativos (como disuccinimidil suberato), aldeídos (como glutaraldeído), compostos de bis-azido (como bis (p-azidobenzoil) hexanediamina), derivados de bis-diazônio (como bis-(p-diazoniumbenzoil)- etilenediamina), diisocianatos (como tolueno 2,6-diisocianato) e compostos de flúor bis-ativo (como 1,5-diflúor-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina ricina pode ser preparada como descrito em Vitetta et ai., Science 238:1098 (1987). O ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triamino penta acético (MX-DTPA) marcado com carbono-14 é um agente quelante exemplar para conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Consulte documento WO 94/11026. O Iigante pode ser um "ligante clivável" que facilita a liberação da droga citotóxica na célula. Por exemplo, pode ser usado um ligante ácido lábil, ligante sensível a peptidase, ligante fotolábil, ligante dimetil ou ligante que contém bissulfeto (Chari et ai., CancerResearch 52:127-131 (1992); patente US 5.208.020).

Os compostos expressamente contemplam, mas não se limitam a ADC preparado com reagentes reticulantes: BMPS, EMCS1 GMBS1 HBVS1 LC-SMCC, MBS1 MPBH1 SBAP1 SIA1 SIAB1 SMCC1 SMPB1 SMPH1 sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, e sulfo-SMPB, e SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona) benzoato) que estão comercialmente disponíveis (por exemplo, pela Pierce Biotecnologia, Inc., Rockford, IL., E.U.A). Consulte páginas 467- 498, 2003-2004 Applications Handbook and Cataiog. ν. Preparação De Conjugados Anticorpo-Droga

Nos conjugados anticorpo-droga (ADC)1 um anticorpo (Ab) é conjugado a um ou mais componentes droga (D), por exemplo, de cerca 1 a cerca de 20 componentes droga por anticorpo, através de um Iigante (L). A ADC da Fórmula I pode ser preparada por diversas rotas, empregando reações de química orgânica, condições e reagentes conhecidos pelos técnicos no assunto, incluindo: (1) reação de um grupo nucleofílico de um anticorpo com um reagente Iigante bivalente, para formar Ab-L, via uma ligação covalente, seguida por reação com um componente drogaD; e (2) reação de um grupo nucleofílico de um componente droga com um reagente Iigante bivalente, para formar D-L, via uma ligação covalente, seguida por reação com o grupo nucleofílico de um anticorpo. Métodos adicionais para preparar ADC estão descritos no presente pedido.

Ab-(L-D)p I

O Iigante pode ser composto de um ou mais componentes ligantes. Componentes Iigantes exemplares incluem 6-maleimidocaproil ("MC"), maleimidopropanoil ("MP"), valina-citrulina ("val-cit"), alanina-fenilalanina ("ala- phe"), p-aminobenziloxicarbonil ("PAB"), N-Succinimidil 4-(2-piridiltio) pentanoato ("SPP"), N-Succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1 carboxilato ("SMCC'), e N-Succinimidil (4-iodo-acetil) aminobenzoato ("SIAB"). Componentes ligantes adicionais são conhecidos no estado da técnica e alguns são descritos no presente pedido. Consulte também "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", patente US número de série 10/983.340, depositada em 5 de novembro 2004, a divulgação desta é expressamente incorporada ao presente como referência.

Em algumas realizações, o ligante pode compreender resíduos de aminoácidos. Componentes ligantes de aminoácidos exemplares incluem um dipeptídeo, um tripeptídeo, um tetrapeptídeo ou um pentapeptídeo. Dipeptídeos exemplares incluem: valina-citrulina (vc ou val-cit), alanina-fenilalanina (af ou ala-phe). Tripeptídeos exemplares incluem: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) e glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly). Resíduos de aminoácidos que compreendem um componente Iigante aminoácido incluem aqueles de ocorrência natural, bem como aminoácidos menores e análogos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente, como citrulina. Com ponentes Iigantes aminoácido podem ser projetados e otimizados em sua seletividade para clivagem enzimática por uma enzima específica, por exemplo, uma protease associada ao tumor, catepsina B, C e D, ou uma protease plasmina.

Grupos nucleofílicos nos anticorpos incluem, mas não se limitam a: (i) grupos amina N-terminal, (ii) grupos amina da cadeia lateral, por exemplo, lisina, (iii) grupos tiol da cadeia lateral, por exemplo, cisteína, e (iv) grupos de açúcares hidroxila ou amina onde o anticorpo é glicosilado. Amina, tiol e grupos hidroxila são nucleofílicos e capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos nos componentes ligantes e reagentes ligantes incluindo: (i) ésteres ativos como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformatos e ácidos alóides; (ii) alcila e benzil alóides como haloacetamidas; (iii) aldeídos, cetonas, carboxila e grupos maleimida. Certos anticorpos têm bissulfeto que permite redução entre cadeias, isto é, pontes de cisteína. Anticorpos podem ser produzidos por reação para conjugação com ligantes reagentes pelo tratamento com um agente de redução como DTT (ditiotreitol). Cada ponte de cisteína formará teoricamente, dessa forma, dois nucleófilos tiol reativos. Grupos nucleofílicos adicionais podem ser introduzidos nos anticorpos através da reação de lisinas com 2-iminotiolano (reagente de Traut) que resulta na conversão de uma amina em um tiol. Grupos tiol reativos podem ser introduzidos no anticorpo (ou fragmento deste) pela introdução de um, dois, três, quatro ou mais resíduos de cisteína (por exemplo, preparando anticorpos mutantes que compreendem um ou mais resíduos de aminoácido cisteína não nativos). Conjugados anticorpo-droga podem ser também produzidos por modificações do anticorpo para introduzir componentes eletrofílicos, que podem reagir com o substituinte nucleofílico no reagente Iigante ou droga. Os açúcares de anticorpos glicosilados podem ser oxidados, por exemplo, com reagentes oxidantes de periodato, para formar grupos aldeído ou cetona, que podem reagir com o grupo amina de reagentes Iigantes ou componentes droga.

A resultante imina dos grupos de base de Schiff pode formar uma ligação estável, ou pode ser reduzida, por exemplo, por reagentes boroidrido para formar ligações amino estáveis. Em uma realização, a reação da porção carboidrato de um anticorpo glicosilado, tanto com galactose oxidase como com metaperiodato de sódio, pode produzir grupos carbonil (aldeído e cetona) na proteína que pode reagir com grupos apropriados na droga (Hermanson, Bioconjugate Techniques). Em outra realização, proteínas que contêm serina N-terminal ou resíduos treonina podem reagir com metaperiodato de sódio, que resulta na produção de um aldeído no lugar do primeiro aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; patente US 5362852). Tal aldeído pode reagir com um componente droga ou nucleófilo ligante.

Da mesma maneira, grupos nucleofílicos em um componente droga incluem, mas não se limitam a: amina, tiol, hidroxila, hidrazido, oximo, hidrazino, tiosemicarbazona, hidrazino carboxilato, e grupos aril hidrazido capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos nos componentes Iigantes e reagentes ligantes, incluindo: (i) ésteres ativos como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformatos e ácidos alóides; (ii) alcila e benzil alóides como haloacetamidas; (iii) aldeídos, cetonas, carboxila e grupos maleimida.

Alternativamente, uma proteína de fusão que compreende o anticorpo e agente citotóxico pode ser produzida, por exemplo, por técnicas recombinantes ou síntese peptídica. O comprimento do DNA pode compreender regiões respectivas que codificam as duas porções do conjugado, tanto adjacentes uma à outra como separadas por uma região que codifica um pepitídeo Iigante que não anula as propriedades desejadas do conjugado.

Em ainda outra realização, o anticorpo pode ser conjugado a um "receptor" (como estreptavidina) para utilização no tumor pré-direcionado em que a conjugação anticorpo receptor é administrada ao paciente, seguida por remoção do conjugado não ligado da circulação, usando-se um agente de limpeza e então administração de um "ligante" (por exemplo, avidina) que é conjugada a um agente citotóxico (por exemplo, um radionucleotídeo).

Modificações Covalentes Aos Polipeptídeos DLL4

Modificações covalentes de polipeptídeos antagonistas ou agonistas (por exemplo, um fragmento de polipeptídeo antagonista), uma molécula de fusão DLL4 (por exemplo, uma imunoadesina DLL4), um anticorpo anti-DLL4), estão incluídos dentro do escopo desta invenção. Elas podem ser feitas por síntese química, por clivagem enzimática ou química do polipeptídeo, se aplicável. Outros tipos de modificações covalentes do polipeptídeo são introduzidos na molécula, pela reação de resíduos de aminoácidos alvo do polipeptídeo com um agente de derivação, que é capaz de reagir com as cadeias laterais ou com os resíduos N ou C terminais selecionados, ou pela incorporação de um aminoácido modificado ou aminoácido não natural na cadeia polipeptídica em crescimento, por exemplo, Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991); Noren et al. Science 244:182 (1989); e publicações de pedidos de patente US 20030108885 e 20030082575.

Resíduos cisteinil mais comuns reagem com α-haloacetatos (e aminas correspondentes), como ácido cloroacético ou cloroacetamida, para fornecer carboximetil ou derivados de carboxiamidometil. Resíduos cisteinil também são derivados pela reação com bromotrifluoroacetona, ácido a-bromo- P-(5-imidozoi)propiônico, cloroacetil fosfato, N-alquilmaleimidas, 3-nitro-2-piridiI bissulfeto, metil 2-piridil bissulfeto, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4- nitrofenol ou cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazola.

Resíduos de histidina são derivados pela reação com dietilpirocarbonato em pH 5,5 a 7,0, pois este agente é relativamente específico para a cadeia lateral de histidil. Para-bromofenacil brometo também é útil, a reação é tipicamente realizada em cacodilato de sódio a 0,1 M em pH 6,0.

Lisinil e resíuos amino-terminais reagem com anidridos de ácido carboxílico ou succínico. A derivação com estes agentes possui efeito de reversão de carga dos resíduos lisinil. Outros reagentes adequados para derivação de resíduos que contêm α-amino incluem imidoésteres, como metil picolinimidato, piridoxal fosfato, piridoxal, cloroborohidreto, ácido trinitrobenzenosulfônico, O-metilisouréia, 2,4-pentanediona e reação catalisada por transaminase com glioxilato.

Resíduos arginil são modificados pela reação com um dos diversos reagentes convencionais, entre eles fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2- ciclohexanodiona e ninidrina. A derivatização de resíduos de arginina exige que a reação seja realizada em condições alcalinas devido ao alto pKa do grupo funcional guanidina. Além disso, estes reagentes podem reagir com os grupos da lisina como também o grupo arginina épsilon-amino.

A modificação específica de resíduos tirosil pode ser feita, com interesse específico na introdução de marcas espectrais nos resíduos tirosil pela reação com compostos aromáticos diazônio ou tetranitrometano. Mais comumente, N-acetilimidizola e tetranitrometano são usados para formar espécies O-acetil tirosil e derivados 3-nitro, respectivamente. Resíduos tirosil são tratados com iodo usando-se 125I ou 131I para preparar proteínas marcadas para uso em radioimunoensaio.

Grupos laterais carboxila (aspartil ou glutamil) são seletivamente modificados pela reação com carbodiimidas (R-N=C=N-R'), onde ReR' são diferentes grupos alquil, como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil) carbodiimida ou 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil) carbodiimida. Além disso, resíduos aspartil e glutamil são convertidos para resíduos asparaginil e glutaminil pela reação com íons amônio.

Resíduos glutaminil e asparaginil são freqüentemente deamidados para os resíduos glutamil e aspartil correspondentes, respectivamente. Estes resíduos são deamidados sob condições neutras ou básicas. A forma deamidada destes resíduos esta incluída dentro do escopo desta invenção.

Outras modificações incluem hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxila de resíduos seril ou treonil, metilação dos grupos α-amino de lisina, arginina e cadeias laterais de histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., São Francisco, páginas 79-86 (1983)), acetilação da amina N-terminal, e amidação de qualquer grupo carboxila C-terminal.

Outro tipo de modificação covalente envolve glicosídeos acoplados, quimicamente ou enzimaticamente, a um polipeptídeo da invenção. Estes procedimentos são vantajosos já que eles não necessitam de produção do polipeptídeo em uma célula hospedeira que possui capacidades de glicosilação para glicosilação N ou O-ligadas. Dependendo do modo de acoplamento usado, o(s) açúcar(es) pode(m) ser ligado(s) a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxila livres, (c) grupos sulfidril livres, como aqueles de cisteína, (d) grupos hidroxila livres, como aqueles de serina, treonina ou hidroxiprolina, (e) resíduos aromáticos, como aqueles de fenilalanina, tirosina ou triptofano, ou (f) o grupo amida de glutamina. Estes métodos estão descritos no documento WO 87/05330 publicado em 11 de setembro de 1987 e em Aplin e Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., páginas. 259-306 (1981).

A remoção de qualquer componente carboidrato presente em um polieptídeo da invenção pode ser realizada quimicamente ou enzimaticamente. A desglicosilação química necessita de exposição do polipeptídeo ao composto ácido trifluormetanosulfônico, ou um composto equivalente. Este tratamento resulta na clivagem da maioria ou de todos os açúcares, exceto a ligação de açúcar (N-acetilglucosamina ou N-acetilgalactosamina), e ao mesmo tempo deixando o polipeptídeo intacto. A Desglicosilação química está descrita por Hakimudddin, et ai., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) e por Edge et ai., Anal.Biochem., 118:131 (1981). A clivagem enzimática de componentes carboidratos, por exemplo, nos anticorpos, pode ser alcançada pelo uso de uma variedade de endo e exoglicosidases, conforme descrito por Thotakura et ai., Meth.Enzymol. 138:350 (1987).

Outro tipo de modificação covalente de um polipeptídeo da invenção compreende ligação do polipeptídeo a uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo, polietilenoglicol, polipropilenoglicol, ou polioxialquileno, da maneira apresentada nas patentes US 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 ou 4.179.337.

Formulações Farmacêuticas

Formulações terapêuticas que compreendem um anticorpo são preparadas para armazenamento pela mistura do anticorpo tendo o grau desejado de purificação com carreadores opcionais farmaceuticamente aceitáveis, excipientes ou estabilizantes (Remingtorr. The Science and Practice of Pharmacy 20a edição (2000)), na forma de soluções aquosas, formulações liofilizadas ou desidratadas. Carreadores aceitáveis, excipientes ou estabilizantes são atóxicos para receptores na dosagem e concentrações empregadas, e incluem tampões como fosfato, citrato, histidina e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (como octadecildimetilbenzil cloreto de amõnio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butil ou benzil; alquil parabenos como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3- pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos que cerca de 10 resíduos); proteínas, como soro de albumina, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; açúcares como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra íons formadores de sais de como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos Zn-proteína); e/ou tensoativos não-iônicos como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG).

A formulação no presente pedido pode, também, conter mais de um componente ativo, de acordo com o necessário para a indicação específica sendo tratada, preferencialmente aqueles com atividades complementares que não afetem contrariamente um ao outro. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação e nas quantidades eficazs para o propósito pretendido.

Os ingredientes ativos podem também ser inseridos na microcápsula preparada, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsula de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de distribuição de droga coloidal (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou nas macroemulsões. Tais técnicas estão divulgadas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20a edição (2000).

As formulações a serem usadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isto é facilmente realizado por filtração através de membranas de filtração estéreis. Preparações de liberação contínua podem ser preparadas. Suitable examples of sustained-release preparations include semipermeable matrices of solid hydrophobic polymers containing the immunoglobulin, which matrices are in the form of shaped articles, e.g., films, or microcapsule.

Exemplos de matrizes de liberação contínua incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou poli(vinilálcool)), polilactídeos (patente US 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e γ etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinil não degradável, copolímeros de ácido glicólico-ácido lático degradáveis tal como o LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis compostas de copolímeros ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolido), e ácido poli-D-(-)- 3-hidroxibutírico. Enquanto polímeros como acetato de etileno-vinil e ácido lático-ácido glicólico permitem liberação de moléculas por mais de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas por períodos de tempo mais curtos. Imunoglobulinas quando encapsuladas permanecem no corpo por um longo tempo, elas podem desnaturar ou se agregar como um resultado da exposição à umidade a 37°C, que resulta em uma perda de atividade biológica e possíveis mudanças na imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser desenvolvidas para a estabilização, dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se o mecanismo de agregação é revelado como sendo de formação de ligação S-S intermolecular através de intercâmbio tio-bissulfeto, a estabilização pode ser alcançada pela modificação de resíduos sulfidril, liofilização de soluções ácidas, controle da umidade do conteúdo, uso apropriado dos aditivos e desenvolvimento de composições de matriz polimérica específica.

É ainda contemplado que um agente útil na invenção possa ser introduzido por terapia gênica em um sujeito. Terapia gênica refere-se à terapia realizada pela administração de um ácido nucleico a um sujeito. Nas aplicações de terapia gênica, os genes são introduzidos nas células com o objetivo de alcançar a síntese in vivo de um produto genético terapeuticamente eficaz, por exemplo, pela substituição de um gene defeituoso. "Terapia gênica" inclui tanto a terapia gênica convencional, onde um efeito durável é alcançado por um único tratamento, como administração dos agentes terapêuticos do gene, que envolve administração única ou repetida de um DNA ou mRNA terapeuticamente eficaz. RNAs e DNAs antisense podem ser usados como agentes terapêuticos para bloquear a expressão de certos genes in vivo. Consulte, por exemplo, DLL4-siRNA descritos nos Exemplos. Já foi mostrado que oligonucleotídeos curtos antisense ρ odem ser importados para células onde eles agem como inibidores, apesar das baixas concentrações intracelulares ocasionadas pela absorção restrita da membrana celular. (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:4143-4146 (1986)). Os oligonucleotídeos podem ser modificados para aumentar sua absorção, por exemplo, pela substituição de seus grupos fosfodiésteres por grupos não carregados. Para revisões gerais dos métodos de terapia gênica, consulte, por exemplo, Goldspiel et al. Clinicai Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu e Wu Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573- 596 (1993); Mulligan Science 260:926-932 (1993); Morgan e Anderson Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); e May TIBTECH 11:155-215 (1993). Métodos comumente conhecidos no estado da técnica de tecnologia de DNA recombinante que podem ser usados são descritos em Ausubel et al. eds. (1993) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; e Kriegler (1990) Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY.

Dosagem E Administração

As moléculas são administradas a um paciente humano de acordo com métodos conhecidos, como administração intravenosa como um bolus ou por infusão contínua por um período de tempo, por rotas intramuscular, intraperitonial, intracérebro-espinhal, subeutânea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, ou inalação, e/ou por administração subcutânea.

Em certas realizações, o tratamento da invenção envolve a administração combinada de um antagonista de DLL4 e um ou mais agentes anti-câncer, por exemplo, agentes anti-angiogênese. Em uma realização, agentes anti-câncer adicionais estão presentes, por exemplo, um ou mais agentes anti-angiogênese diferentes, um ou mais agentes quimioterápicos, etc. A invenção também contempla a administração de múltiplos inibidores, por exemplo, múltiplos anticorpos para o mesmo antígeno ou múltiplos anticorpos para moléculas ativas de câncer diferentes. Em uma realização, um coquetel de diferentes agentes quimioterápicos é administrado com o antagonista de DLL4 e/ou com um ou mais agentes anti-angiogênese. A administração combinada inclui co-administração, usando-se formulações separadas ou uma formulação farmacêutica única e/ou administração consecutiva, em qualquer ordem. Por exemplo, um DLL4 pode preceder, seguir, alternar com a administração dos agentes anti-câncer, ou pode ser fornecido simultaneamente a estes. Em uma realização, há um período de tempo para ambos (ou todos) os agentes ativos exercerem simultaneamente suas atividades biológicas.

Para a prevenção ou tratamento de doenças, a dosagem apropriada de um antagonista de DLL4 dependerá do tipo de doença a ser tratada, conforme definido acima, a severidade da mesma e o desenvolvimento da doença, se o inibidor é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, o histórico clínico do paciente e resposta ao inibidor, e o critério do médico em questão. O inibidor é adequadamente administrado ao paciente uma vez ou no decorrer de uma série de tratamentos. Em um regime de combinação de terapia, as composições da invenção são administradas em uma quantidade terapeuticamente eficaz ou em uma quantidade terapeuticamente sinérgica. Como usado no presente pedido, uma quantidade terapeuticamente eficaz é aquela em que a administração de uma composição da invenção e/ou co-administração do antagonista de DLL4 e um ou mais agentes terapêuticos, resulte na redução ou inibição da doença ou condição alvo. O efeito da administração de uma combinação de agentes pode ser aditivo. Em uma realização, o resultado da administração é um efeito sinérgico.

Uma quantidade terapeuticamente sinérgica é aquela quantidade de antagonista de DLL4 e um ou mais agentes terapêuticos, por exemplo, um inibidor da angiogênese, necessária para, significativamente ou de forma sinérgica, reduzir ou eliminar condições ou sintomas associados com uma doença específica.

Dependendo do tipo e severidade da doença, cerca de 1 pg/kg a 50 mg/kg (por exemplo, 0,1 a 20 mg/kg) de antagonista de DLL4 ou inibidor da angiogênese é uma dosagem candidata inicial para administração ao paciente, se, por exemplo, para uma ou mais administrações separadas ou para infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode variar de aproximadamente 1pg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores acima mencionados. Para administrações repetidas no decorrer de vários dias ou por mais tempo, dependendo da condição, o tratamento é mantido até que ocorra uma supressão dos sintomas da doença No entanto, outros regimes de dosagem podem ser funcionais. Tipicamente, o médico irá administrar a(s) molécula(s) da invenção até alcançar a(s) dosagem(ns) que forneça(m) o efeito biológico necessário. O progresso desta terapia da invenção é facilmente monitorado por técnicas e testes convencionais.

Por exemplo, a preparação e programação de dosagens para inibidores da angiogênese, por exemplo, anticorpos anti-VEGF, como AVASTIN® (Genentech), pode ser usada de acordo com instruções do fabricante ou conforme determinado empiricamente pelo técnico no assunto. Em outro exemplo, a preparação e a programação de dosagens para tais agentes quimioterápicos podem ser usadas de acordo com instruções do fabricante ou conforme determinado empiricamente pelo técnico no assunto. A preparação e a programação de dosagens para quimioterapia também são descritas em Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins1 Baltimore1 MD (1992).

Eficácia Do Tratamento

A eficácia do tratamento da invenção pode ser medida por vários pontos de medição comumente usados na valiação de disfunções neoplásicas ou não-neoplásicas. Por exemplo, tratamentos contra o câncer podem ser avaliados, mas não limitados, por exemplo, pelo peso do tumor ou tamanho da redução, tempo de progressão, duração de sobrevida, sobrevida livre de progressão, taxa geral de resposta, duração da resposta e qualidade de vida. Devido aos agentes anti-angiogênicos descritos no presente pedido serem dirigidos à vasculatura e não necessariamente às próprias células neoplásicas, eles representam uma classe exclusiva de drogas anti-câncer e, dessa forma, exigem medições e definições exclusivas de respostas clínicas às drogas. Por exemplo, a redução do tumor em mais de 50% em uma análise bidimensional é o padrão de corte para afirmar uma resposta. No entanto, os inibidores podem causar inibição da dispersão metastática sem redução do tumor primário, ou podem simplesmente exercer um efeito de interrupção no crescimento do tumor. Consequentemente, abordagens para se determinar a eficácia da terapia podem ser empregadas, incluindo, por exemplo, medições de marcadores, no plasma ou urinários, de angiogênese e medições da resposta através de imagem radiólogica.

Os Exemplos a seguir são oferecidos somente para propósitos ilustrativos, e não têm a intenção de limitar o escopo da presente invenção em qualquer modo.

As divulgações de todas as patentes e referências de literatura citadas no presente relatório descritivo são integralmente incorporadas ao presente como referência.

Exemplos

Reagentes disponíveis comercialmente referidos nos Exemplos foram usados de acordo com as instruções do fabricante, a menos que indicado de outra forma. A fonte dessas células identificadas nos Exemplos a seguir e ao longo do relatório descritivo, por números de acesso ATCC é a Coleção Americana de Tipos de Cultura, Manassas1 VA 20108. As referências citadas nos Exemplos são listadas nos Exemplos a seguir. Todas as referências citadas no presente pedido são incorporadas como referência.

Exemplo 1

Materiais E Métodos

Os materiais e métodos a seguir foram usados nos Exemplos.

Teste De Microesferas De Gel De Fibrina HUVEC

Os detalhes do teste de microesfera de gel de fibrina HUVEC foram descritos (Nakatsu, Μ. N. et al. Microvasc Res 66, 102-12 (2003). Resumidamente, 3 microesferas de Cytodex (Amersham Pharmacia Biotech) foram revestidas com 350-400 HUVECS por microesfera. Cerca de 200 microesferas revestidas com HUVEC foram embebidas em coágulo de fibrina em um poço de uma placa de cultura de tecido de 12 poços. 8X 104 células SF foram plaqueadas sobre o topo do coágulo. Os testes foram determinados entre o dia 7 e o dia 9 por imunocoloração e por imagem. Em alguns experimentos, os brotos de HUVEC foram visualizados pela coloração com biotina-anti-CD31 (clone WM59, eBioscience) e estreptavidina-Cy3 . Para a coloração do núcleo de HUVEC, os géis foram fixados durante a noite em 2% de paraformaldeído (PFA) e corados com 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Sigma). Para a coloração de Ki67, os géis de fibrina foram tratados com tripsina-EDTA em 10X por 5 min para remover a camada superior do SF, neutralizado com 10% de FBS em PBS e fixado durante a noite em 4% de PFA. Os géis de fibrina foram, então, bloqueados com 10% de soro de cabra em PBS durante 4 h, incubado durante a noite com Ki67 de coelho anti- camundongo (pronto para o uso, clone Sp6, LabVision), seguido pela detecção secundária com lgG-Ci3 anti-coelho (Jackson ImmunoResearch). Todas as incubações durante a noite foram feitas a 4°C.

Estudo Da Retina De Camundongo Neonatal

Os camundongos CD1 neonatais das mesmas ninhadas foram injetados i.p. com PBS ou com YW26.82 (10 mg/kg) em P1 e P3. Os olhos foram coletados em P5 e fixados com 4% de PFA em PBS durante a noite. As retinas dissecadas foram bloqueadas com 10% de soro de cabra em PBST durante 3 h e, então, incubadas durante a noite com anticorpos primários. O coquetel primário incluía isolectina biotinilada B4 (25 pg/mL, Bandeiraea simplicifolia; Sigma) e um dos seguintes: Ki67 de coelho anti-camundongo (1:1, pronto para o uso, clone Sp6, Lab Vision) ou SMA anti-alfa conjugado com Ci3 (1:2000, Sigma-AIdrich), com 10% de soro em PBLEC (1% de Triton X- 100, CaCI2 a 0,1 mM, MgCI2 a 0,1 mM em PBS em pH 6,8). As retinas foram, então, lavadas em PBST e incubadas durante a noite com uma combinação de anticorpo secundário de Alexa 488 estreptavina (1:200, Molecular Probes) e IgG anti-coelho Cy3 (1:200, Jackson ImmunoResearch). Depois da coloração completa, as retinas foram pós- fixadas com 4% de PFA em PBS. Todas as incubações durante a noite foram feitas a 4°C. As imagens das retinas lisas montadas foram capturadas pelo microscópio confocal de fluorescência.

Modelos De Tumor

Foram usados camundongos fêmea bege nus de 8 a 10 semanas de idade. Para obter os tumores subcutâneos, os camundongos foram injetados com 0,1 mL de suspensão de células contendo 50% de matrigel (BD Bioscience) no flanco posterior direito. 5X106 células HM7 de câncer de cólon humano, 10X10^6 cél ulas Colo205 de carcinoma de cólon humano, 10X10^6 células Calu6 de carcinoma de pulmão humano, 10X106 células MV-522 de carcinoma de pulmão, 10X106 células de WEHI-3 de leucemia de camundongo, 10X10^6 de células EL4 de camundongo, 10X106 células SK-OV-3 X1 de câncer ovariano humano, 10X106 células LL2 de câncer de pulmão de camundongo, 10X10^6 células EL4 de Iinfoma/ leucemia ou 10X106 células H1299 de câncer de pulmão de célula não pequena foram injetados em cada camundongo. Para

O modelo MDA-MB-435 de melanoma humano, os camundongos foram injetados com enchimento de gordura mamária com 0,1 mL de suspensão de célula (5X106) contendo 50% de matrigel. O anticorpo anti-DLL4 YW26.82 foi administrado via i.p. (10 mg/kg de peso corpóreo, duas vezes por semana). Para os modelos de tumor a seguir, cada camundongo de teste recebeu um fragmento de tumor subcutâneo (1 mm3) implantado no flanco direito: SKMES-

1 de câncer de pulmão de célula não pequena, MX-1 de câncer de mama humano, SW620 de câncer colorretal humano e LS174T de adenocarcinoma. O crescimento do tumor foi quantificado por medições do calibre. O volume do tumor (mm3) foi determinado pela medida do comprimento (I) e largura (w) e, então, calculado o volume (V =lw2/2). Foram incluídos em cada grupo de 10 a 15 animais. A comparação estatística dos grupos de tratamento foi realizada usando-se o teste t de Estudante bicaudal.

Marcação E Imunohistoquímica Da Vascularidade Do Tumor

Os camundongos foram anestesiados com Isoflurano. Lectina de Lycopersicon esculentum marcada com FITC (150 pg em 150 μL de NaCI a 0,9 %; Vector Laboratories) foi injetado i.v. e permitido que circulasse durante 5 min antes da perfusão sistêmica. A vasculatura foi perfundida transcardialmente com 1% de PFA em PBS durante 3 min. Os tumores foram removidos e pós-fixados por imersão no mesmo fixador durante 2h, seguido por uma incubação em 30% de sacarose durante a noite para crioproteção e, então, embebidos em OCT. Os cortes (de 4 pm de espessura) foram corados com CD31 anti-camundongo (1:50, BD Pharmigen), seguidos por IgG de cabra anti-rato Alexa 594 (1:800, Molecular Probes).

Histologia E Imunohistoquímica De Intestestino De Camündongo

Os tecidos de intestino delgado de camündongo embebidos em parafina e fixados em formalina foram cortados na espessura de 3 pm. A identificação histoquímica dos tipos celulares de intestino foi realizada com Alcian-blue, como recomendado pelo fabricante (PolyScientific). Para a coloração com anti-Ki67, os cortes foram pré-tratados com Target Retrieval Solution [Solução de Recuperação de Alvo] (S1700, DAKO) e incubados com anti-Ki67 de coelho (1:200, clone SP6, Neomarkers). O anticorpo secundário de cabra anti-coelho em 7,5 g/ml (Vector Ibs) foi detectado com o Kit Vectastain ABC Elite (Vector labs). Todos os cortes corados com Ki67 foram corados para contagem com hematoxilina de Mayer. Para a coloração de HES-1, foi usado HES-1 anti-rato (clone NM1, MBL, International), seguido porTSA-HRP.

RNA De Interferência

Pequeno RNA dúplex de interferência SMARTpool (siRNA) que atingem DLL4 humano e siRNA #2 que não atingem Si Controle foram adquiridos junto à Dharmacon. A transfecção de siRNR dúplex (50 nM) foi feita com HUVECs a 40% de confluência usando-se Optimem-1 e Lipfectamine 2000 (Invitrogen). A FACS foi feita 48 h depois da transfecção do siRNA. As seqüência dos 4 siRNA SMART pool anti-DLL4 foram as seguintes:

CAACTGCCCTTATGGC Illll (SEQ ID NO: 5) (Oligo 1, sense),

AAAGCCATAAGGGCAGTTGTT (SEQ ID NO: 6) (Oligo 1, antisense),

CAACTGCCCTTCAATTTCATT (SEQ ID NO: 7) (Oligo 2, sense),

TGAAATTGAAGGGCAGTTGTT (SEQ ID NO: 8) (Oligo 2, antisense),

TGACCAAGATCTCAACTACTT (SEQ ID NO: 9) (Oligo 3, sense),

GTAGTTGAGATCTTGGTCATT (SEQ ID NO: 10) (Oligo 3, antisense), GGCCAACTATGCTTGTGAATT (SEQ ID NO: 11) (Oligo 4, sense), TTCACAAGCATAGTTGGCCTT (SEQ ID NO: 12) (Oligo 4, antisense).

Ligante Notch: ELISA De Bloqueio De Notch

As placas de microtitulação de 96 poços foram revestidas com Notchl-Fc recombinante de rato (rrNotch1-Fc, R&D Systems) a 0,5 pg/mL. O meio condicionado que continha DLL4-AP (aminoácido 1-404 do DLL4 fundido à fosfatase alcalina de placenta humana) foi usado no teste. Para preparar o meio condicionado, 293 células foram temporariamente transfectadas com os plasmídios que expressam DLL4-AP com o reagente Fugen6 (Roche Molecular Biochemicals). Cinco dias após a transfecção, o meio condicionado foi colhido, filtrado e armazenado a 4°C. Os anticorpos purificados titulados de 0,15 a 25 pg/mL foram pré-incubados durante 1 h em temperatura ambiente com meio condicionado DLL4-AP em uma diluição que concediam 50%, no máximo, de ligação que se pode alcançar para rrNotch1-Fc revestido. A mistura anticorpo/DLL4-AP foi, então, adicionado à placa revestida com rrNotch1-Fc durante 1 h em temperatura ambiente, depois disso as placas foram lavadas várias vezes em PBS. O DLL4-AP ligado foi detectado usando-se PNPP de 1 etapa (Pierce) como substrato e a absorbância medida em OD 405 nm. Um teste idêntico foi realizado com DLL1-AP (DLL1 humano, aminoácido 1-445). Testes semelhantes foram realizados com DLL4-His purificado (DLL4 humano marcado com His na porção C-terminal, aminoácido 1-404) e Jagl-His (R&D System). Os Iigantes ligados marcados com His foram detectados com Mab anti-His de camundongo (1 pg/mL, Roche Molecular Biochemicals), de cabra anti-camundongo biotinilado (Jackson ImmunoResearch) e Estreptavidina-AP (Jackson ImmunoResearch).

Extração De RNA E RT-PCR Quantitativo Em Tempo Real

A extração do RNA total de HUVEC em cultura 2-D foi feita usando-se RNeasy Mini Kit (Qiagen) seguindo as instruções do fabricante. Para extrair o RNA total de HUVEC que cresceram em géis de fibrina, os géis de fibrina foram tratados com EDTA com tripsina em 10X (Gibso) durante 5 min para remover os fibroblastos da camada superior, seguido pela neutralização com 10% de FBS em PBS. Os grânulos de gel foram, então, removidos dos poços de cultura de tecido e submetidos à centrifugação (10K durante 5 min) em microtubos para remover o fluido em excesso. Os "pellets" resultantes do gel foram Iisados com tampão de Iise (RNeasy Mini Kit) e ainda processados como as HUVECs em cultura 2-D. A qualidade do RNA foi avaliado usando-se RNA 6000 Nano Chips e o Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). As reações de RT-PCR quantitativo em tempo real foram feitas em triplicata usando-se 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems). GAPDH humano foi usado como gene de referência para normalização. Os níveis de expressão são expressos como a média (± SEM) das vezes de alterações no mRNA em relação ao controle de 3 determinações independentes. O primer forward e reverso e as seqüências da sonda para VEGFR2, TGFP2 e GAPDH foram as seguintes.

TGFP2

Forward: GTA AAG TCT TGC AAA TGC AGC TA (SEQ ID NO: 13)

Reverso: CAT CAT CAT TAT CAT CAT CAT TGT C (SEQ ID NO: 14) Sonda: AAT TCT TGG AAA AGT GGC AAG ACC AAA AT (SEQ ID NO: 15)

VEGFR2

Forward: CTT TCC ACC AGC AGG AAG TAG (SEQ ID NO: 16)

Reverso: TGC AGT CCG AGG TCC TTT (SEQ ID NO: 17) Sonda: CGC ATT TGA TTT TCA TTT CGA CAA CAG A (SEQ ID NO: 18) GAPDH

Forward: GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC (SEQ ID NO: 19)

Reverso: GAA GGT GAA GGT CGG AGT C (SEQ ID NO: 20) Sonda: CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC (SEQ ID NO: 21)

Exemplo 2

Geração De Anticorpos Anti-DLL4 Em Fago

As bibliotecas de anticorpo em fago sintético foram construídas sobre uma estrutura simples (anticorpo anti-ErbB2 humanizado, 4D5) pela introdução de diversidade dentro das regiões determinantes de complementaridade (CDR) de cadeias pesadas e leves (Lee, C. V. et al. J Mol Biol 340, 1073-93 (2004); Liang, W. C. et al. J Biol Chem 281, 951-61 (2006)). A panoramização da placa com bibliotecas virgens foi realizada contra o DLL4 humano marcado com His (aminoácido 1-404) imobilizado sobre imunoplacas maxisorp. Depois de quatro ciclos de enriquecimento, os clones foram colhidos aleatoriamente e Iigantes foram identificadas usando-se ELISA em fago. Os hDLL4 resultantes que se ligaram a clones foram ainda selecionados com proteína DLL4 de murino marcada com His para identificar os clones de cruzamento de espécies. Para cada fago positivo, as regiões variáveis das cadeias pesada e leve foram subclonadas em vetor de expressão pRK, os quais foram elaborados geneticamente para expressar as cadeias IgG inteiras. Os constructos da cadeia pesada e da cadeia leve foram co-transfectados em células 293 ou CHO e os anticorpos expressos foram purificados a partir do meio sem soro usando-se coluna de afinidade com proteína A. Os anticorpos purificados foram testados por ELISA para o bloqueio da interação entre DLL4 e Notchl-Fc de rato e por FACS para ligação para linhagens celulares estáveis que expressam tanto DLL4 humano inteiro como DLL4 murino. Para maturação de afinidade, as bibliotecas de fagos com três combinações diferentes de alças de CDR (CDR-L3, H1 e H2) derivadas do clone inicial de interesse foram construídas por estratégia de aleatoriedade leve, de forma que cada posição selecionada foi mutada para um resíduo de tipo não selvagem ou mantida como tipo selvagem em uma freqüência de cerca de 50:50 (Liang et al., 2006, acima). Os clones de alta afinidade foram, então, identificados por meio de quatro ciclos de panoramização de fase de solução contra as proteínas DLL4 marcadas com His de humano e murino com estringência aumentada progressivamente.

Exemplo 3

Caracterização Do Anticorpo Anti-DLL4

O mapeamento do epitopo de Mab YW26.82 anti-DLL4: Mab 26.82 anti-DLL4 reconhecido como uma ligação determinante presente em EGF semelhante a repetição número 2 (EGL2) do domínio extracelular (ECD) do DLL4 humano. O EGL2 compreende aminoácidos 252-282 do ECD DLL4 humano. Resumidamente, ECD DLL4 mutantes foram expressas como proteínas de fusão fosfatase alcalina e ligação ao anticorpo como avaliado. A Fig. 5a descreve uma representação esquemática de um conjunto de DLL4 mutantes expressos como as proteínas de fusão fosfatase alcalina (AP) de porção C-terminal de placenta humana. Os parênteses indicam as seqüências de DLL4 incluídas nas proteínas de fusão. Os meios condicionados com célula 293T que continha as proteínas de fusão foram testados em placas de microtitulação de 96 poços revestidas com Mab anti-DLL4 purificado (YW26.82, 0,5 pg/mL). O DLL4.AP ligado foi detectado usando-se PNPP de 1 etapa (Pierce) como substrato e a absorbância foi medida em OD 405 nm. Mab YW26.82 ligado a constructos que compreendem o domínio EGL2 do DLL4 e não ligados a um constructo com ausência do domínio EGL2 do DLL4. Isso demonstrou que o Mab YW 26.82 anti-DLL4 reconheceu um epitopo no domínio EGL2 do ECD do DLL4 humano.

Mab YW26.82 se liga seletivamente ao DLL4 humano e de camundongo. Placas Nunc Maxicorp de 96 poços foram revestidas com proteínas recombinantes purificadas como indicado (1 pg/ml). A ligação de YW26.82 nas concentrações indicadas foi medida pelo teste ELISA. Os anticorpos ligados foram detectados com conjugado de HRP de anticorpo anti- humano usando-se TMB como substrato e medição de absorbância a OD 450 nm. O ECD anti-HER2 e ErbB2-ECD recombinante foram usados como controle de teste (Figura 5b). Os resultados desse experimento são mostrados na Figura 5b. O Mab YW26.82 se ligou a DLL4 humano e de camundongo e não apresentou ligação detectável ao DLL1 humano e JAG1 humano. Esses resultados demonstraram que o Mab YW26.82 se liga seletivamente ao DLL4.

A análise FACS de 293 células transitoriamente transfectadas com o vetor, DLL4 inteiro, Jag 1 ou DLL1 também demonstrou que o Mab YW26.82 se liga seletivamente ao DLL4. Como mostrado na Figura 5c, a ligação significativa de YW26.82 foi apenas detectada em células transfectadas com DLL4 (painel superior). Não foi detectada ligação significativa em células transfectadas com DLL1 ou Jag1. A expressão de Jagl e DLL1 foi confirmada pela ligação de Notchl-Fc recombinante de rato (rrNotch1-Fc, painel do meio) e Notch2-Fc recombinante de rato (rrNotch2-Fc, painel inferior), respectivamente. YW26.82, rrNotch1-Fc ou rrNotch2-Fc (R & D System) foram usados em 2 pg/mL seguido pelo IgG-PE de cabra anti-humano (1:500, Jackson ImmunoResearch) (c).

Os experimentos de competição demonstraram que o Mab YW26.82 bloqueou eficazmente e seletivamente a interação do Notch com DLL4, mas não outros Iigantes do Notch. Como mostrado na Figura 5d, Mab anti-DLL4 bloqueou a ligação de DLL4-AP, mas não a de DLL4-AP, para rNotchl revestido, com um IC50 calculado de aproximadamente 12 nM (painel esquerdo). O Mab anti-DLL4 bloqueou a ligação de DLL4-His, mas não de Jagl-His, para rNotchl revestido, com um IC50 de aproximadamente 8 nM (painel direito).

O Mab YW26.82 anti-DLL4 se liga especificamente ao DLL4 expresso de forma endógena nas células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC). A análise FACS de HUVEC transfectadas com controle ou siRNA específico para DLL4 foi realizado. YW26.82 foi usado a 2 pg/mL, seguido pelo IgG-PE de cabra anti-humano (1:500, Jackson ImmunoResearch). Os resultados desse experimento são mostrados na Figura 5e. A ligação foi observada em HUVECs não transfectadas (controle) e para HUVECs transfectadas com um siRNA controle. Por outro lado, a ligação estava significativamente reduzida em HUVECs transfectadas com siRNA de DLL4. Esses experimentos demonstraram que o Mab YW26.82 anti-DLL4 se liga especificamente ao DLL4 expresso de forma endógena em HUVEC.

Exemplo 4

Tratamento Com Anticorpo Anti-DLL4 Aumentou A Proliferação De

Célula Endotelial in vitro

As células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) que cresceram em géis de fibrina na presença de células de fibroblasto de pele (FS) humana co-cultivadas geraram o desenvolvimento de uma estrutura semelhante a um lúmen (Nakatsu, Μ. N. et al. Microvasc Res 66, 102-12 (2003)). A adição de anticorpo YW26.82 anti-DLL4 aumentou de maneira marcante o comprimento e o número de brotos (Fig. 1a). O processamento proteolítico de Notch, catalisado pela atividade de y- secretase de um complexo protéico, é uma etapa essencial durante a ativação do Notch (Baron, M. Semin Cell Dev Biol 14, 113-9 (2003)). De forma interessante, a dibenzazepina inibidora de y-secretase (DBZ) (van Es, J. H. et al. Nature 435, 959-63 (2005); Milano, J. et al. Toxicol Sci 82, 341-58 (2004)) apresentou o mesmo efeito sobre o desenvolvimento de HUVEC. Dado os diferentes mecanismos desses dois tratamentos, o desenvolvimento aumentado foi claramente atribuível à atenuação da sinalização Notch. A coloração de Ki67 revelou que o desenvolvimento de EC aumentado foi devido à proliferação elevada de célula (Fig. 1b). No teste de gel de fibrina original, o desenvolvimento de HUVEC e a conseqüente formação do lúmen são apoiados pelas células SF co- cultivadas. Pela substituição das células SF com meio condicionado, o Mab anti-DLL4 e DBZ ainda eram capazes de aumentar o desenvolvimento de HUVEC (Fig. 1c), o que dá suporte a uma função autônoma de EC da sinalização DLL4/Notch. No experimento contrário, a ativação de Notch pela proteína DLL4 imobilizada resultou em uma inibição significativa do crescimento (Fig. 1e). Esses resultados sugerem que o estado de ativação da sinalização de DLL4/Notch está estritamente associado à proliferação de EC.

Exemplo 5

Tratamento Com Anticorpo Anti-DLL4 Aumentou A Proliferação De Célula Endotelial in vivo

A retina de camundongo com nascimento precoce desenvolveu um estereótipo de padrão vascular em uma seqüência bem definida de eventos (Stone, J. & Dreher, Z. J Comp Neurol 255, 35-49 (1987); Gerhardt, H. et al. J Cell Biol 161, 1163-77 (2003); Fruttiger, M. Invest Ophthalmol Vis Sci 43, 522-7 (2002)). A expressão dinâmica e proeminente de DLL4 no crescimento de ECs nas retinas de neonatais sugere uma possível função para o DLL4 na regulação do desenvolvimento vascular da retina (Claxton, S. & Fruttiger, M. Gene Expr Patterns 5, 123-7 (2004)). A distribuição sistêmica do YW26.82 causou uma profunda modificação da vascularidade da retina. Um acúmulo massivo de ECs ocorreu na retina, gerando uma estrutura semelhante a uma folha com morfologia vascular primitiva (Fig. 1d). Um aumento significativo de Ki67 marcado nas EC foi observado, o que indica uma proliferação de EC elevada (Fig. 1h). Portanto, esse fenótipo hiperproliferativo das EC da retina pelo bloqueio de DLL4 em camundongos neonatais corroboram com os achados in vitro. Exemplo 6

Função Essencial De PLL4/Notch Na Regulação Da Proliferação De

Célula Epitelial

O VEGF controla vários aspectos fundamentais das EC (Ferrara, N. Exs, 209-31 (2005); Coultas1 L. et al. Nature 438, 937-45 (2005)). É menos entendido, entretanto, como a sinalização do VEGF é integrada nos processos vasculares complexos, como diferenciação arteriovenosa (AV) e organização hierárquica vascular, os eventos evidentemente demandam vias de sinalização altamente coordenadas. Os estudos genéticos em "peixe zebra" sugerem que o VEGF age a montante da via de Notch durante a diferenciação endotelial arterial (Lawson, N. D. et al. Development 128, 3675-83 (2001)). Nós descobrimos que o estímulo de VEFG de HUVEC causou a expressão superficial aumentada de DLL4 (dados não apresentados), o que é coerente com um artigo recente sobre o aumento da regulação do mRNA de DLL4 pelo estímulo de VEGF (Patel, N. S. et al. CancerRes 65, 8690-7 (2005)). De modo interessante, o próprio DLL4 é supra-regulado seguindo a ativação de Notch (Figura 6), sugerindo um mecanismo de feedback positivo pelo qual o DLL4 eficazmente transmite a sinalização de VEGF à via de Notch. Resumidamente, HUVECs foram estimuladas pelo DLL4 humano marcado com His na porção C- terminal (aminoácidos 1-404) na ausência ou presença de DBZ (0,08 μΜ). 36 h depois do estímulo, a expressão endógena de DLL4 foi examinada pela análise FACS com o anticorpo anti-DLL4.

De forma notável, a hiperproliferação das ECs resultantes do bloqueio da sinalização de Notch ainda era dependente de VEGF. Na cultura em gel de fibrina 3-D, o tratamento com Mab anti-VEGF aboliu a maior parte do desenvolvimento de EC, tanto na presença como na ausência de DBZ (Fig. 1f), aumentando a possibilidade de que o comportamento hiperproliferativo pudesse ser, em parte, devido à sinalização aumentada de VEGF. Realmente, o bloqueio do Nocth por YW26.82 ou por DBZ resultou na supra-regulação de VEGFR2 (Fig. 1g). Reciprocamente, a ativação de Notch pelo DLL4 imobilizado suprimiu a expressão de VEGFR2 (Fig. 1g). Portanto, enquanto o VEGF pode agir a montante da via DLL4/Notch, o DLL4/Notch é capz de ajuste fino da resposta por meio da regulação negativa da expressão de VEGFR2.

Exemplo 7

Tratamento Com Anticorpo Anti-DLL4 Bloqueou A Diferenciação De Célula Endotelial E Bloqueou O Desenvolvimento Arterial

Além do aumento na proliferação de EC1 a antagonização de DLL4/Notch provocou uma alteração morfológica drástica dos brotos de EC no gel de fibrina. As estruturas multicelulares semelhantes ao lúmen estavam em geral ausentes (Fig. 2a), o que sugere a diferenciação defeituosa de EC. Nas retinas tratadas com Mab YW26.82, o padrão característico das artérias e veias alternadas radialmente estava seriamente interrompido. A coloração da actina do músculo liso anti-α (ASMA), que está associada com as artérias da retina, estava completamente ausente (Fig. 2c). Essa observação foi extraordinariamente semelhante ao desenvolvimento arterial defeituoso em embriões DLL4+/-. Esses achados, de diferentes ângulos, destacam a função essencial do DLL4/Notch na diferenciação da regulação de EC.

Exemplo 8

Expressão De TGFg Estava Ligada Ao Estado De Ativação De Notch

Semelhante à via de Notch, a sinalização de TGFp é dependente do contexto e tem efeitos diversos e freqüentemente opostos sobre a diferenciação celular, a proliferação e inibição do crescimento. Além disso, a via TGFp foi envolvida nos processos vasculares (Urness, L. D. et al, Nat Genet 26, 328-31 (2000); Oshima, M. et al, Dev Biol 179, 297-302 (1996); Larsson, J. et al. Embo J 20, 1663-73 (2001)). Por exemplo, a deficiência do receptor de activina quinase 1 (ALK1), um receptor TGFp do tipo I específico de EC1 resultou em uma rede de EC primitiva nos sacos vitelínicos e mau funcionamento arteriovenoso (AVM)1 um fenótipo compartilhado por camundongos com sinalização defeituosa de Nocth (Urness, L. D. et al, Nat Genet 26, 328-31 (2000); Iso, T. et al, ArterioscIerThromb Vasc Biol 23, 543-53 (2003)). Isso nos leva a investigar a possível correlação entre essas duas vias. Nós descobrimos que a expressão de TGFP2 (Fig. 2b) estava estritamente ligada ao estado de ativação de Notch, o que sugere que a via de TGFp poderia agir a jusante da via de Notch. Ao mesmo tempo, nossos achados apoiam um modelo em que o eixo DLL4/Notch, que serve como uma "rota de sinalização", integra a sinalização de VEGF através da regulação da expressão de DLL4 e envolve a via de TGFp para promover a diferenciação de EC.

Exemplo 9

Tratamento Com Anticorpo Anti-DLL4 Inibiu O Crescimento Tumoral In vivo Para direcionar a possível função da sinalização de DLL4/Notch durante a angiogênese tumoral, nós investigamos o impacto do bloqueio de DLL4 sobre o crescimento tumoral nos modelos tumorais pré-clínicos (Fig. 3a-d). Nos modelos de tumor xenográfico HM7, Colo205 e Calu6 (Fig. 3a-c) o tratamento com YW26.82 foi iniciado após o estabelecimento do tumor (tamanho de tumor ≥250 mm3 ). Em todos os três modelos, uma separação nas taxas de crescimento entre os grupos controle e de tratamento tornou-se evidente três dias após a dosagem. O volume do tumor do grupo de tratamento permaneceu estático durante duas semanas de tratamento. Além disso, para tumores subcutâneos, Mab anti-DLL4 também inibiu o crescimento dos tumores em enchimentos de gordura mamária de camundongo. No modelo de tumor MDA-MB-435, o tratamento foi iniciado 14 dias após a injeção de célula tumoral. Uma diferença nas curvas de crescimento do tumor entre os grupos controle e de tratamento foi evidente em seis dias após a dosagem, e se tornou significativamente crescente com a continuação do tratamento (Fig. 3d).

Nós também investigamos o impacto do bloqueio de DLL4 e/ou VEGF sobre o crescimento de vários tumores nos modelos tumorais pré- clínicos (Fig. 3e-f, i-p). Nos modelos de tumor xenográfico MV-522 e WEHI3, o tratamento com YW26.82 e/ou com VEGF foi iniciado após o estabelecimento do tumor (tamanho de tumor > 250 mm3). No modelo MV-522, o tratamento com YW26.82 e com anti-VEGF inibiu o crescimento tumoral individualmente, mas a combinação dos dois tratamentos foi mais eficaz. No modelo WEHI3, o tratamento com anti-VEGF não apresentou efeito sobre o crescimento tumoral, enquanto que o tratamento com YW26.82 apresentou inibição significativa do crescimento tumoral. Nos modelos SK-OV-3X1, LL2, EL4, H1299, SKMES-1, MX-1, SW620 e LS174T, o tratamento com YW26.82 (5 mg/kg, IP, duas vezes por semana) e/ou o tratamento com anti-VEGF (5 mg/kg, IP, duas vezes por semana) foi administrado depois do estabelecimento dos tumores. Em cada um desses modelos, o tratamento com YW26.82 inibiu isoladamente o crescimento tumoral. Além disso, em todos esses modelos, nos quais a combinação foi testada, o YW26.82 exibiu uma eficácia aumentada em combinação com o anti- VEGF.

Exemplo 10

Tratamento Com Anticorpo Anti-DLL4 Aumentou A Proliferação De

Célula Endotelial

Em consideração ao crescimento tumoral, nós usamos o modelo tumoral de Iinfoma de camundongo EL4 para os estudos de histologia vascular. Nós descobrimos que o tratamento com Mab anti-DLL4 resultou em um aumento surpreendente na densidade de célula endotelial (Fig. 3g). Em contrapartida, o anti-VEGF apresentou efeito completamente oposto (Fig. 3g), embora ambos os tratamentos tenham exibido uma eficácia semelhante nesse modelo. Exemplo 11

Tratamento Com Anticorpo Anti-DLL4 Inibiu A Perfusão Vascular Tumoral

Uma vez que o bloqueio in vitro da via DLL4/Notch comprometeu a formação da estrutura semelhante ao lúmen pelas ECs (Fig. 2a), foi investigado se o tratamento com Mab anti-DLL4 provocava defeito semelhante na vascularidade do tumor e afetava a eficiência do fluxo sangüíneo. A perfusão sistêmica com FITC-Ietina revelou que o tratamento com Mab anti- DLL4 resultou na redução acentuada de Iectina marcada nos vasos do tumor (Fig. 3h). De forma notável, foi apresentado que o mau funcionamento arteriovenoso em camundongos deficientes em ALK-1 provoca circulação sangüínea anômala (Urness, L. D. et al, Nat Genet 26, 328-31 (2000)). Dado a função essencial da sinalização do DLL4/Notch na diferenciação AV, nas retinas dos embriões e dos de nascimento precoce, o Mab anti-DLL4 poderia ter impacto na especificação do destino celular das ECs tumorais e causar fluxo de sangue direcional defeituoso. Realmente, nos tumores Colo205 tratados com Mab anti-DLL4, houve regiões onde a alta densidade de EC estava associada com a baixa viabilidade do conteúdo celular do tumor, o que implica na função vascular insatisfatória. Mais estudos utilizando técnicas de imagem vascular são necessários para garantir as idéias na precisão dos defeitos vasculares.

Exemplo 12

DLL4/Notch é Dispensável Na Homeostase Do Intestino De Camundongo.

Um consenso principal sobre a inibição global de Notch é que ele pode ser deletério, dada as funções pleiotrópicas da sinalização de Notch na regulação da homeostase dos sistemas de auto-renovação pós-natal. Por exemplo, a sinalização de Notch é necessária para manter as células criptoprogenitoras indiferenciadas nos intestinos (van Es, J. H. et al. Nature 435, 959-63 (2005); Fre1 S. et ai Nature 435, 964-8 (2005)). Realmente, os inibidores y-secretase, os quais bloquearam indiscriminadamente todas as atividades de Notch, provocaria efeitos colaterais indesejados nos roedores, devido ao seu aumento massivo nas células caliciformes dentro do compartimento da cripta (Milano, J. et ai Toxicol Sci 82, 341-58 (2004); Wong, G. T. et al. J Biol Chem 279, 12876-82 (2004)). Nós examinamos os intestinos delgados de camundongos tratados com Mab anti-DLL4 por análise imunohistoquímica. In contrast to DBZ treatment, no differences in epithelial crypt cell differentiation or proliferation profiles were identified between anti- DLL4 Mab and control groups after six weeks of treatment (Fig.4). Além disso, o Mab anti-DLL4 não modificou a expressão do gene alvo Notch HES-1 na população de amplificação transitória (TA) que se dividiu rapidamente (Fig.4). Esses resultados apoiam a noção de que a sinalização DLL4/Notch é amplamente restrita ao sistema vascular.

Exemplo 13

Tratamento Com Anticorpo Anti-DLL4 Não Gera Impacto Na Vasculatura

Da Retina De Adulto

Enquanto o bloqueio de DLL4 apresentou um impacto profundo sobre o desenvolvimento vascular da retina em camundongo neonatal, a administração de anticorpo anti-DLL4 não apresentou impacto sobre a vasculatura da retina do adulto (Fig. 2d). Dessa forma, a sinalização de DLL4/Notch é essencial durante a angiogênese ativa, mas desempenha uma função menos importante na manutenção dos vasos normais. De acordo com essa noção, durante o curso do tratamento com Mab anti-DLL4, nenhuma perda de peso aparente ou morte de animal foi observada em camundongos que produziram tumoral, quando dosados com 10 mg/kg, duas vezes por semana, por até 8 semanas. Nos modelos tumorais, o Mab anti-DLL4 e o anti- VEGF exibiram efeitos opostos sobre a vasculatura tumoral, sugerindo que não existem mecanismos de sobreposição de ação.

O relatório descritivo antecedente é considerado suficiente para permitir que um técnico no assunto pratique a invenção. Entretanto, várias modificações da invenção, além daquelas apresentadas e descritas no presente pedido, se tornarão evidentes para os técnicos no assunto a partir da descrição anterior e são incluídas no escopov das reivindicações anexas. LISTAGEM DE SEQUENCIA

<110> GENENTECH, INC. Minhong YAN

<120> COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA MODULAR O DESENVOLVIMENTO VASCULAR <130> P2372R1

<150> US 60/811,357 <151> 06-06-2006

<150> US 60/866,767 <151> 21-11-2006

<160> 21

<210> 1

<211> 115

<212 > PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência de Anticorpo

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly x 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr 20 25 30

Asp Asn Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Gly Tyr Ile Ser Pro Asn Ser Gly Phe Thr Tyr Tyr 50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 VO 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Phe Gly Gly Tyr Phe 95 100 105 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 110 115

<210> 2

<211> 109

<212 > PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Seqüência de Anticorpo

Ser Val 15

Val Ser 30

Pro Lys 45

Pro Ser 60

Thr Ile 75

Cys Gln 90

Lys Val 105

Glu Ile Lys Arg

<210> 3

<211> 6

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<220>

<221> CAAT_sinal modificado_base

<222> 2

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 15 10

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 20 25

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val 50 · 55

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 65 70

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Thr Tyr Tyr 80 85

Gln Ser Tyr Thr Gly Thr Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr 95 100 223> CAAT box

400> 3 cncaat 6

210> 4 211> 6 212> DNA

213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada <220>

<221> polyA_signal <222> inteiro

<223> Sinal de Poliadenilação

<400> 4 aataaa 6

<210> 5 <211> 21 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> siRNA

<400> 5 caactgccct tatggctttt t 21

<210> 6 <211> 21 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> siRNA <400> 6

aaagccataa gggcagttgt t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

223 > siRNA

400> 7

caactgccct tcaatttcat t 21

210> 8 211> 21 212> DNA

213> Seqüência Artificial 220>

223> siRNA 400> 8

tgaaattgaa gggcagttgt t 21

<210> 9 <211> 21 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> SiRNA

<400> 9 tgaccaagat ctcaactact t 21

<210> 10 <211> 21 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> siRNA

<400> 10 gtagttgaga tcttggtcat t 21

<210> 11 <211> 21 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> siRNA 400> 11

ggccaactat gcttgtgaat t 21

210> 12 211> 21 212> DNA

213> Seqüência Artificial 220>

223> siRNA 400> 12

ttcacaagca tagttggcct t 21

210> 13 211> 20 212> DNA

213> Seqüência Artificial 220>

223> Oligonucleotxdeo Iniciador 400> 13

aagtcttgca aatgcagcta 20

:210> 14

:211> 25

:212> DNA

:213> Seqüência Artificial :220>

:223> Oligonucleotídeo Iniciador :400> 14

catcatcatt atcatcatca ttgtc 25

:210> 15 :211> 29 :212> DNA

:213> Seqüência Artificial :220>

:223> Oligonucleotídeo Sonda

400> 15

aattcttgga aaagtggcaa gaccaaaat :210> 16 :211> 21 :212> DNA

:213> Seqüência Artificial :220>

:223> Oligonucleotideo Iniciador :400> 16

ctttccacca gcaggaagta g 21

210> 17 211> 18 212> DNA

213> Seqüência Artificial

:220>

:223> Oligonucleotideo Iniciador :400> 17

tgcagtccga ggtccttt 18

:210> 18 :211> 28 :212 > DNA

:213> Seqüência Artificial

220>

223> Oligonucleotídeo Sonda 400> 18

cgcatttgat tttcatttcg acaacaga 28

210 > 19 211> 20 212> DNA

213> Seqüência Artificial 220>

223> Oligonucleotídeo Iniciador 400> 19

gaagatggtg atgggatttc 20

210> 20 211> 19

Claims (48)

1. MÉTODO PARA TRATAR UM TUMOR, câncer ou disfunção proliferativa celular, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz de um antagonista de DLL4 a um sujeito que necessite desse tratamento, de modo que o tumor, câncer ou disfunção proliferativa celular seja tratado.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tumor, câncer ou disfunção proliferativa celular é câncer de cólon, câncer de pulmão, melanoma ou linfoma.

3. MÉTODO PARA TRATAR UMA CONDIÇÃO PATOLÓGICA ASSOCIADA À ANGIOGÊNESE, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz de um antagonista de DLL4 a um sujeito que necessite desse tratamento, de modo que a condição patológica associada à angiogênese seja tratada, sendo que o antagonista de DLL4 é capaz de estimular a proliferação celular endotelial, inibir a diferenciação celular endotelial, inibir o desenvolvimento arterial, ou inibir a perfusão vascular.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a condição patológica associada à angiogênese é um tumor, um câncer, e/ou uma disfunção proliferativa celular.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a condição patológica associada à angiogênese é uma doença neovascular intraocular.

6. MÉTODO PARA ESTIMULAR A PROLIFERAÇÃO CELULAR ENDOTELIAL, em um sujeito que necessite desse tratamento, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz de um agonista de DLL4 ao sujeito, de modo que a proliferação celular endotelial seja estimulada.

7. MÉTODO PARA REDUZIR OU INIBIR A DIFERENCIAÇÃO CELULAR ENDOTELIAL, em um sujeito que necessite desse tratamento, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz de um antagonista de DLL4 ao sujeito, de modo que a diferenciação celular endotelial seja inibida.

8. MÉTODO PARA REDUZIR OU INIBIR O DESENVOLVIMENTO ARTERIAL, em um sujeito que necessite desse tratamento, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz de um antagonista de DLL4 ao sujeito, de modo que o desenvolvimento arterial seja inibido.

9. MÉTODO PARA REDUZIR OU INIBIR A PERFUSÃO VASCULAR TUMORAL, em um sujeito que necessite desse tratamento, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz de um antagonista de DLL4 ao sujeito, de modo que a perfusão vascular tumoral seja inibida.

10. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um agente anti-angiogênico.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o agente anti-angiogênico é administrado antes ou subseqüentemente à administração do antagonista de DLL4.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o agente anti-angiogênico é administrado simultaneamente ao antagonista de DLL4.

13. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que o agente anti-angiogênico é um antagonista do fator de crescimento celular endotelial vascular (VEGF).

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o antagonista de VEGF é um anticorpo anti-VEGF.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-VEGF é bevacizumab.

16. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar uma quantidade eficaz de um agente quimioterápico.

17. MÉTODO PARA AUMENTAR A EFICÁCIA DE UM AGENTE ANTI-ANGIOGÊNICO, em um sujeito que tem uma condição patológica associada à angiogênese, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um antagonista de DLL4 em combinação com o agente anti-angiogênico, aumentando assim a atividade inibitória do dito agente anti-angiogênico.

18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a condição patológica associada à angiogênese é um tumor, um câncer, e/ou uma disfunção proliferativa celular.

19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a condição patológica associada à angiogênese é uma doença neovascular intraocular.

20. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o antagonista de DLL4 é um anticorpo anti- DLL4.

21. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o antagonista de DLL4 é uma imunoadesina de DLL4.

22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o anticorpo DLL4 é um anticorpo monoclonal.

23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o anticorpo DLL4 é um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, ou um anticorpo quimérico.

24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o anticorpo DLL4 é um fragmento de anticorpo.

25. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo é um Fab, Fab', Fab1-SH, F(ab')2, ou scFv.

26. USO DE UM ANTAGONISTA DE DLL4, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para tratar um tumor, câncer ou disfunção proliferativa celular.

27. USO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o tumor, câncer ou disfunção proliferativa celular é câncer de cólon, câncer de pulmão, melanoma ou linfoma.

28. USO DE UM ANTAGONISTA DE DLL4, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para tratar uma condição patológica associada à angiogênese, em que o antagonista de DLL4 é capaz de estimular a proliferação celular endotelial, inibir a diferenciação celular endotelial, inibir o desenvolvimento arterial ou inibir a perfusão vascular.

29. USO, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a condição patológica associada à angiogênese é um tumor, um câncer e/ou uma disfunção proliferativa celular.

30. USO, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a condição patológica associada à angiogênese é uma doença neovascular intraocular.

31. USO DE UM AGONISTA DE DLL4, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para estimular a proliferação celular endotelial.

32. USO DE UM ANTAGONISTA DE DLL4, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para reduzir ou inibir a diferenciação celular endotelial.

33. USO DE UM ANTAGONISTA DE DLL4, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para reduzir ou inibir o desenvolvimento arterial.

34. USO DE UM ANTAGONISTA DE DLL4, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para reduzir ou inibir a perfusão vascular tumoral.

35. USO, de acordo com uma das reivindicações 26 a 34, caracterizado pelo fato de que o medicamento compreende ainda um agente anti-angiogênico.

36. USO, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o agente anti-angiogênico é um antagonista do fator de crescimento celular endotelial vascular (VEGF).

37. USO, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o antagonista de VEGF é um anticorpo anti-VEGF.

38. USO, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-VEGF é bevacizumab.

39. USO, de acordo com uma das reivindicações 26 a 38, caracterizado pelo fato de que o medicamento compreende ainda um agente quimioterápico.

40. USO DE UM ANTAGONISTA DE DLL4, em combinação com o agente anti-angiogênico, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para aumentar a eficácia de um agente anti-angiogênico.

41. USO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a condição patológica associada à angiogênese é um tumor, um câncer e/ou uma disfunção proliferativa celular.

42. USO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a condição patológica associada à angiogênese é uma doença neovascular intraocular.

43. USO, de acordo com uma das reivindicações 26 a 42, caracterizado pelo fato de que o antagonista de DLL4 é um anticorpo anti- DLL4.

44. USO, de acordo com uma das reivindicações 26 a 42, caracterizado pelo fato de que o antagonista de DLL4 é uma imunoadesina de DLL4.

45. USO, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o anticorpo DLL4 é um anticorpo monoclonal.

46. USO, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o anticorpo DLL4 é um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico.

47. USO, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o anticorpo DLL4 é um fragmento de anticorpo.

48. USO, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo é um Fab, Fab', Fab1-SH, F(ab')2, ou scFv.