MX2014003558A - Agentes de ligacion al factor de crecimiento endotelial vascular/ligando 4 similar a delta (vegf/dell4) y usos de los mismos. - Google Patents

Agentes de ligacion al factor de crecimiento endotelial vascular/ligando 4 similar a delta (vegf/dell4) y usos de los mismos.

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Abstract

La presente invención se refiere a agentes de ligación a VEGF, agentes de ligación a DLL4, agentes de ligación biespecíficos a VEGF/DLL4, y métodos para usar los agentes para tratar enfermedades tales como cáncer. La presente invención proporciona anticuerpos que se ligan específicamente a VEGF humano, anticuerpos que se ligan específicamente a DLL4 humano, y anticuerpos biespecíficos que se ligan específicamente a VEGF humano y/o DLL4 humano. La presente invención proporciona además métodos para usar los agentes para inhibir el crecimiento tumoral. También se describen métodos para tratar cáncer que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente o anticuerpo de la presente invención a un paciente que tiene un tumor o cáncer.

Description

AGENTES DE LIGACION AL FACTOR DE CRECIMIENTO ENDOTELIAL VASCULAR/LIGANDO 4 SIMILAR A DELTA (VEGF/DLL4) Y USOS DE LOS MISMOS Campo de la Invención La presente invención se refiere generalmente a anticuerpos y otros agentes que se ligan a VEGF, DLL4, o tanto a VEGF como DLL4 , particularmente anticuerpos biespecífieos anti-VEGF/anti-DLL4 , así como a métodos para usar los anticuerpos u otros agentes para el tratamiento de enfermedades tal como cáncer.
Antecedentes de la Invención La angiogénesis desempeña una función importante en la patogénesis de una variedad de trastornos, incluyendo tumores sólidos y metástasis. La producción de nuevos vasos sanguíneos es esencial para proporcionar oxígeno y nutrientes para el crecimiento y propagación de un tumor, y por lo tanto la angiogénesis es un buen objetivo para los productos terapéuticos para el cáncer.
La angiogénesis incluye una familia de proteínas que actúan como activadores angiogénicos , incluyendo el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF-A, por sus siglas en inglés) , VEGF-B, VEGF-C, VEGF-E, y sus receptores respectivos (VEGFR-1, VEGFR-2 , y VEGFR-3) . El VEGF-A, también referido como VEGF o factor de permeabilidad vascular (VPF, por sus REF: 247669 siglas en inglés) , existe en varias isoformas que surgen del empalme alteARNtivo de mARN de un gen VEGF individual, con el VEGFi65 que es la isoforma más biológicamente relevante.
Los anticuerpos anti-VEGF han mostrado que suprimen el crecimiento de células tumorales in vitro e in vivo. Un anticuerpo monoclonal anti-VEGF humanizado, bevacizumab (AVASTIN) se ha desarrollado y aprobado en los Estados Unidos como un producto terapéutico para el cáncer.
La trayectoria de señalización Notch es un sistema de transducción de señal universalmente conservado. Se implica en la determinación del destino celular durante el desarrollo incluyendo la formación del patrón embriónico y el mantenimiento de tejido pos-embriónico . Además, la señalización Notch se ha identificado como un factor crítico en el mantenimiento de células madre hematopoyéticas.
La trayectoria Notch se ha relacionado con la patogénesis de tumores y cánceres tanto hematológicos como sólidos. Las numerosas funciones celulares y señales microambientales asociadas con la tumorigénesis han mostrado que se modulan por la señalización de la trayectoria Notch, incluyendo la proliferación celular, apoptosis, adhesión, y angiogénesis (Leong y colaboradores, 2006, Blood, 107:2223-2233) . Además, los receptores Notch y/o ligandos Notch han mostrado que desempeñan funciones oncogénicas potenciales en una variedad de cánceres humanos, incluyendo leucemia mielogenosa aguda, leucemia linfocítica crónica de células B, linfoma de Hodgkin, mieloma múltiple, leucemia linfoblástica aguda de células T, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, cáncer de próstata y cáncer de la piel. (Leong y colaboradores, 2006, Blood, 107:2223-2233).
El ligando 4 similar a delta (DLL4, por sus siglas en inglés) es un componente importante de la trayectoria Notch y se ha identificado como un objetivo para la terapia para el cáncer. El DLL4 es un ligando Notch, caracterizado por un dominio N-terminal, un dominio Delta/Serrate/Lag-2 (DSL) y repeticiones similares a EGF en tándem dentro del dominio extracelular . Se ha reportado que el DLL4 se induce por VEGF y que el DLL4 puede actuar como un regulador de retroalimentación negativo para la proliferación vascular.
Los anticuerpos anti-DLL4 han mostrado que mejoran la proliferación y ramificación angiogénica que conduce a la angiogénesis no productiva y crecimiento tumoral disminuido (Noguera-Troise y colaboradores, 2006, Nature, 444:1032-1037). Además, un anticuerpo anti-DLL4, 21M18, ha mostrado que inhibe el crecimiento tumoral y reduce la frecuencia de célula madre cancerosas en modelos de tumor de xenoinjerto (Hoey y colaboradores, 2009, Cell Stem Cell, 5:168-177; Patente de E. U. A. No. 7,750,124).
Aunque ha habido avances significativos en el desarrollo de anticuerpos monoclonales para el uso en tratamientos del cáncer, existe a un gran potencial para mejoras adicionales. Una clase de moléculas de anticuerpo con la promesa de potencia aumentada y/o efectos secundarios reducidos (por ejemplo, toxicidad) son los anticuerpos biespecíficos .
Las moléculas biespecíficas tempranas se generaron principalmente usando reticulación química de dos anticuerpos, o fueron hibridomas o "cuadromas" híbridos. Un éxito del formato cuadroma es triomabs, que son combinaciones de ratón/rata que muestran un emparejado de cadena pesada/ligera específico d especies preferencial . Más recientemente, los avances en la ingeniería de anticuerpos han proporcionado una amplia variedad de nuevos formatos de anticuerpo, incluyendo, pero no limitado a, scFv en tándem (bi-scFv) , diacuerpos, diacuerpos en tándem (tetra-cuerpos) , diacuerpos de cadena individual, y anticuerpos de dominio variable dobles.
Es uno de los objetivos de la presente invención proporcionar moléculas mejoradas para el tratamiento del cáncer, particularmente anticuerpos biespecíficos que se liguen específicamente al VEGF humano y DLL4 humano.
Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona agentes de ligación, tales como anticuerpos, que se ligan a VEGF, DLL4 , o tanto a VEGF como DLL4 (agentes de ligación a VEGF/DLL4), así como composiciones, tales como composiciones farmacéuticas, que comprenden los agentes de ligación. Los agentes de ligación que se ligan a VEGF o DLL4 , así como por lo menos un antígeno adicional u objetivo, y composiciones farmacéuticas de tales agentes de ligación, también se proporcionan. En ciertas modalidades, los agentes de ligación son polipéptidos novedosos, tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, y otros polipéptidos relacionados con tales anticuerpos. En ciertas modalidades, los agentes de ligación son anticuerpos que se ligan específicamente al VEGF humano. En algunas modalidades, los agentes de ligación son anticuerpos que se ligan específicamente al DLL4 humano. En algunas modalidades, los agentes de ligación son anticuerpos biespecífieos que se ligan específicamente al VEGF humano y DLL4 humano. La invención proporciona además métodos para inhibir el crecimiento de un tumor al administrar los agentes de ligación a un sujeto con un tumor. La invención proporciona además métodos para tratar cáncer al administrar los agentes de ligación a un sujeto en necesidad de los mismos. En algunas modalidades, los métodos para tratar cáncer o inhibir el crecimiento tumoral comprenden células madre cancerosas objetivo con los agentes de ligación. En ciertas modalidades, los métodos comprenden reducir la frecuencia de células madre cancerosas en un tumor, reducir el número de células madre cancerosas en un tumor, reducir la tumorigenicidad de un tumor y/o reducir la tumorigenicidad de un tumor al reducir el número o frecuencia de células madre cancerosas en el tumor .
En un aspecto, la invención proporciona un agente de ligación, tal como un anticuerpo, que se liga específicamente al VEGF. En algunas modalidades, el agente de ligación inhibe la ligación de VEGF a por lo menos un receptor de VEGF. En algunas modalidades, el agente de ligación inhibe la ligación de VEGF a VEGFR-1 y/o VEGFR-2. En algunas modalidades, el agente de ligación modula la angiogénesis . En ciertas modalidades, el anticuerpo u otro agente de ligación se ligan específicamente además a y/o inhibe el DLL4 humano además del VEGF.
En algunas modalidades, el agente de ligación es un anticuerpo que comprende una CDRl de cadena pesada que comprende NYWMH (SEQ ID NO: 17), una CDR2 de cadena pesada que comprende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO: 18), y una CDR3 de cadena pesada que comprende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO: 19); y una CDRl de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO: 20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22) .
En ciertas modalidades, el agente de ligación es un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesadas que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 11; y/o una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación comprende una región variable de cadena pesada que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 11; y/o una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación comprende una región variable de cadena pesada que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 11; y/o una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación es un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 11; y/o una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 12.
En algunas modalidades, el agente de ligación es el anticuerpo 219R45, 219R45-MB-21M18 , 219R45-MB-21R79 , 219R45-MB-21R75, o 219R45-MB-21R83.
En otro aspecto, la invención proporciona un agente de ligación, tal como un anticuerpo, que se liga específicamente a DLL4 humano. En algunas modalidades, el agente de ligación inhibe la ligación de DLL4 a por lo menos un receptor Notch. En algunas modalidades, el agente de ligación inhibe la ligación de DLL4 a Notchl, Notch2 , Notch3, y/o Notch4. En algunas modalidades, el agente de ligación inhibe la señalización Notch. En algunas modalidades, el agente de ligación promueve la angiogénesis no productiva. En ciertas modalidades, el anticuerpo u otro agente de ligación se ligan específicamente además a y/o inhibe el VEGF humano además del DLL4 humano .
En algunas modalidades, el agente de ligación es un anticuerpo que se liga al DLL4 humano y comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13) o AYYIH (SEQ ID NO:79), una CDR2 de cadena pesada que comprende YIX1X2YX3X4ATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 80), en donde X es serina o alanina, X2 es serina, asparagina, o glicina, X3 es asparagina o lisina, y X4 es glicina, arginina, o ácido aspártico, y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16); y una CDR1 de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO: 20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO:21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22) . En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13) o AYYIH (SEQ ID NO: 79), una CDR2 de cadena pesada que comprende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 14), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16); y una CDR1 de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO: 20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVP TFGG (SEQ ID NO: 22) .
En ciertas modalidades, el agente de ligación es un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene por lo menos 90% o por lo menos 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 10; y/o una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 90% o por lo menos 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación es un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 10; y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 12.
En algunas modalidades, el agente de ligación es un anticuerpo 21R79 o anticuerpo 219R45-MB-21R79.
En algunas modalidades, el agente de ligación en un anticuerpo que comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO:13) o AYYIH (SEQ ID NO:79), una CDR2 de cadena pesada que comprende YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 59), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16); y una CDR1 de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO: 20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21) , y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22) .
En ciertas modalidades, el agente de ligación es un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene por lo menos 90% o por lo menos 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 58; y/o una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 90% o por lo menos 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación es un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 58; y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 12.
En algunas modalidades, el agente de ligación es un anticuerpo 21R75 o anticuerpo 219R45-MB-21R75.
En algunas modalidades, el agente de ligación en un anticuerpo que comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID N0:13) o AYYIH (SEQ ID NO:79), una CDR2 de cadena pesada que comprende YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 65), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16); y una CDR1 de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO: 20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID N0:21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22) .
En ciertas modalidades, el agente de ligación es un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene por lo menos 90% o por lo menos 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 64; y/o una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 90% o por lo menos 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación es un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 64; y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 12.
En algunas modalidades, el agente de ligación es un anticuerpo 21R83 o anticuerpo 219R45-MB-21R83.
En ciertas modalidades de cada uno de los aspectos o modalidades ya mencionadas, así como otros aspectos y/o modalidades descritas en cualquier lugar en la presente, el agente de ligación es un anticuerpo biespecífico . En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico se liga específicamente al VEGF humano y a un segundo objetivo. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico se liga específicamente al DLL4 humano y a un segundo objetivo. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico se liga específicamente a tanto VEGF humano como DLL4 humano. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico modula la angiogénesis . En ciertas modalidades, el anticuerpo biespecífico inhibe la señalización Notch. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico modula la angiogénesis e inhibe la señalización Notch. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico reduce el número de frecuencia de células madre cancerosas. En ciertas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende dos cadenas ligeras idénticas. En ciertas modalidades el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo IgG (por ejemplo, IgG2) .
En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende: un primer sito deligación a antígeno que se liga específicamente a VEGF humano, en donde el primer sitio de ligación a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende NYWMH (SEQ ID NO: 17), una CDR2 de cadena pesada que comprende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO: 18), y una CDR3 de cadena pesada que comprende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO: 19). En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende además: una CDR1 de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21) , y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22) . En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende: un primer sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a VEGF humano, en donde el primer sitio de ligación a antígeno comprende (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende NYWMH (SEQ ID NO: 17), una CDR2 de cadena pesada que comprende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO: 18), y una CDR3 de cadena pesada que comprende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO: 19), y (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO: 20) , una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22) .
En ciertas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende: un primer sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente DLL4 humano, en donde el primer sitio de ligación a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID N0:13) o AYYIH (SEQ ID NO:79), una CDR2 de cadena pesada que comprende YIX1X2YX3X4ATNYNQKFKG (SÉQ ID N0:80), en donde Xi es serina o alanina, X2 es serina, asparagina, o glicina, X3 es asparagina o lisina, y X4 es glicina, arginina, o ácido aspártico, y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16); y una CDR1 de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO: 20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVP TFGG (SEQ ID N0:22). En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende: un primer sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente DLL4 humano, en donde el primer sitio de ligación a antígeno comprende una CDRl de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:14), YISSYNGATNYNQKFKG (SEQ ID NO:15), YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 59), o YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 65) , y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16) . En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende además: una CDRl de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO:21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22). En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende: un primer sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente DLL4 humano, en donde el primer sitio de ligación a antígeno comprende (a) una CDRl de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 14), YISSYNGATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 15), YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 59), o YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 65), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16), y (b) una CDRl de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO: 20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22).
En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende: a) un primer sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a VEGF humano, y b) un segundo sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a DLL4 humano, en donde el primer sitio de ligación a antígeno comprende una CDRl de cadena pesada que comprende NYWMH (SEQ ID NO: 17), una CDR2 de cadena pesada que comprende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO: 18), y una CDR3 de cadena pesada que comprende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO: 19); en donde el segundo sitio de ligación a antígeno comprende una CDRl de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13) o AYYIH (SEQ ID NO: 79), una CDR2 de cadena pesada que comprende YIX1X2YX3X4ATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 80), en donde Xx es serina o alanina, X2 es serina, asparagina, o glicina, X3 es asparagina o lisina, y X4 es glicina, arginina, o ácido aspártico y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16); y una CDRl de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22) . En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende: a) un primer sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a VEGF humano, y b) un segundo sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente DLL4 humano, en donde el primer sitio de ligación a antígeno comprende una CDRl de cadena pesada que comprende NYWMH (SEQ ID NO: 17), una CDR2 de cadena pesada que comprende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO: 18), y una CDR3 de cadena pesada que comprende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO: 19); en donde el segundo sitio de ligación a antígeno comprende una CDRl de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 14), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16); y en donde tanto el primero como el segundo sitios de ligación a antígeno comprenden una CDRl de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21) , y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22) . En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende: a) un primer sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a VEGF humano, y b) un segundo sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente DLL4 humano, en donde el primer sitio de ligación a antígeno comprende una CDRl de cadena pesada que comprende NYWMH (SEQ ID NO: 17), una CDR2 de cadena pesada que comprende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO: 18), y una CDR3 de cadena pesada que comprende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO: 19); en donde el segundo sitio de ligación a antígeno comprende una CDRl de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende YISSYNGATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 15), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16); y en donde tanto el primero como el segundo sitios de ligación a antígeno comprenden una CDRl de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21) , y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22) . En algunas modalidades, un anticuerpo biespecífico comprende: a) un primer sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a VEGF humano, y b) un segundo sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente DLL4 humano, en donde el primer sitio de ligación a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende NYWMH (SEQ ID NO: 17), una CDR2 de cadena pesada que comprende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO: 18), y una CDR3 de cadena pesada que comprende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO: 19); en donde el segundo sitio de ligación a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 59), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16); y en donde tanto el primero como el segundo sitios de ligación a antígeno comprenden una CDR1 de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVP TFGG (SEQ ID NO: 22) . En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende: a) un primer sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a VEGF humano, y b) un segundo sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente DLL4 humano, en donde el primer sitio de ligación a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende NYWMH (SEQ ID NO: 17), una CDR2 de cadena pesada que comprende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO: 18), y una CDR3 de cadena pesada que comprende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO: 19); en donde el segundo sitio de ligación a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 65), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16); y en donde tanto el primero como el segundo sitios de ligación a antígeno comprenden una CDR1 de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22) .
En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico que se liga específicamente a VEGF humano, y comprende: una región variable de cadena pesada que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 11, y/o una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico se liga específicamente a VEGF humano, y comprende: una región variable de cadena pesada que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 11, y/o una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12.
En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico se liga específicamente DLL4 humano, y comprende: una región variable de cadena pesada que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 58, o SEQ ID NO: 64; y/o una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico se liga específicamente DLL4 humano, y comprende: una región variable de cadena pesada que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 58, o SEQ ID NO: 64; y/o una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12.
En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico se liga específicamente a VEGF humano y DLL4 humano, y comprende: (a) una primera región variable de cadena pesada que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 11; (b) una segunda región variable de cadena pesada que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:58, o SEQ ID NO:64; y (c) una primera y una segunda región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico VEGF/DLL4 comprende (a) una primera región variable de cadena pesada que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 11; (b) una segunda región variable de cadena pesada que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 9; y (c) una primera y una segunda región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico VEGF/DLL4 comprende (a) una primera región variable de cadena pesada que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 11; (b) una segunda región variable de cadena pesada que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 10; y (c) una primera y una segunda región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico VEGF/DLL4 comprende (a) una primera región variable de cadena pesada que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 11; (b) una segunda región variable de cadena pesada que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 58; y (c) una primera y una segunda región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico VEGF/DLL4 comprende (a) una primera región variable de cadena pesada que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 11; (b) una segunda región variable de cadena pesada que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 64; y (c) una primera y una segunda región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12.
En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende (a) un primer sitio de ligación a antígeno que se liga a VEGF humano con una KD entre aproximadamente 0.1 nM y aproximadamente 1.0 nM y (b) un segundo sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente DLL4 humano con un a KD entre aproximadamente 0.1 nM y aproximadamente 20 nM. En ciertas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende dos cadenas ligeras idénticas .
En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico seleccionado del grupo que consiste de 219R45-MB-21M18, 219R45-MB-21R79, 219R45-MB-21R75, y 219R45-MB-21R83.
En ciertas modalidades de cada uno de los aspectos ya mencionados, así como otros aspectos y/o modalidades descritas en cualquier lugar en la presente, el agente de ligación o anticuerpo se aisla.
En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de: SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO : 12 , SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, y SEQ ID NO: 64. En algunas modalidades, el polipéptido se aisla. En ciertas modalidades, el polipéptido es sustancialmente puro. En ciertas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo o parte de un anticuerpo, tal como un fragmento de anticuerpo.
En otro aspecto, la invención proporciona moléculas de polinucleótido aisladas que comprenden un polinucleótido que codifica los agentes de ligación y/o polipéptidos de cada uno de los aspectos ya mencionados, así como otros aspectos y/o modalidades descritos en la presente. En algunas modalidades, el polinucleótido comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO : 37 , SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO : 40 , SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, y SEQ ID NO : 74. La invención proporciona además vectores de expresión que comprenden los polinucleótidos, así como células que comprenden los vectores de expresión y/o los polinucleótidos. En algunas modalidades, la célula es una célula procariótica o una célula eucariótica .
En otros aspectos, la invención proporciona métodos para inhibir el crecimiento de un tumor, que comprende poner en contacto el tumor con una cantidad efectiva de un anticuerpo (u otro agente de ligación) que se liga a VEGF, DLL4 , o tanto a VEGF como a DLL4 , incluyendo cada uno de esos anticuerpos (u otros agentes de ligación) descritos en la presente.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo (u otro agente de ligación) que se liga a VEGF, DLL4 o a tanto VEGF como a DLL4 , incluyendo cada uno de aquellos anticuerpos (u otros agentes de ligación) descritos en la presente.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para modular la angiogénesis en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo (u otro agente de ligación) que se liga a VEGF, DLL4 o a tanto VEGF como a DLL4 , incluyendo cada uno de aquellos anticuerpos (u otros agentes de ligación) descritos en la presente .
En otro aspecto, la invención proporciona un método para reducir la tumorigenicidad de un tumor en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo (u otro agente de ligación) que se liga a VEGF, DLL4 o a tanto VEGF como DLL4 , incluyendo a cada uno de aquellos anticuerpos (u otros agentes de ligación) descritos en la presente.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para reducir la tumorigenicidad de un tumor en un sujeto al reducir la frecuencia de células madre cancerosas en un tumor, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo (u otro agente de ligación) que se liga a VEGF, DLL4 , o a tanto VEGF como DLL4, incluyendo a cada uno de aquellos anticuerpos (u otros agentes de ligación) descritos en la presente.
En otro aspecto, la invención proporciona métodos para tratar cáncer en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo (u otro agente de ligación) que se liga a VEGF, DLL , o a tanto VEGF como DLL4 , incluyendo a cada uno de esos anticuerpos (u otros agentes de ligación) descritos en la presente .
Las composiciones farmacéuticas que comprenden una gente de ligación (por ejemplo, anticuerpos) descritas en la presente y un portador farmacéuticamente aceptable se proporcionan adicionalmente, como son líneas de células que expresan y/o producen los agentes de ligación. Los métodos para tratar cáncer y/o inhibir el crecimiento tumoral en un sujeto (por ejemplo, un humano) que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende los agentes de ligación también se proporcionan.
Donde los aspectos o modalidades de la invención se describen en términos de un grupo Markush u otro agrupamiento de alternativas, la presente invención abarca no solamente la totalidad de la lista en su conjunto, sino también cada miembro del grupo individualmente y todos los subgrupos posibles del grupo principal, y también el grupo principal ausente de uno o más de los miembros del grupo. La presente invención también prevé la exclusión explícita de uno o más de cualquiera de los miembros del grupo en la invención reclamada .
Breve Descripción de las Figuras Figuras 1A-1C. Fig. 1A, CDRs de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21M18, 219R45 -MB-21M79 , 219R45 -MB-21M75 , y 219R45-MB-21M83; Fig. IB) Región variable de cadena pesada y cadena ligera SEQ ID NOs ; Fig. 1C) SEQ ID Nos dé cadena pesada y cadena ligera.
Figura 2. Ensayo HTRF para ligación simultánea de anticuerpos biespecíficos al VEGF humano y DLL4 humano. Los resultados se reportan en Unidades de Fluorescencia Relativa (RFU, por sus siglas en inglés) , que representa la relación de la intensidad de fluorescencia relativa a 665nm a la intensidad de fluorescencia relativa a 620nm. 219R45-MB-21M18 (-·-); 219R45-MB-21R79 (-¦-); 219R45 más 21M18 (-A-) ; 219R45 más 21R79 (-?-); 219R45 (-?-) ; 21M18 (-0-); 21R79 (-0-) ; anticuerpo de control LZ-1 (-?-).
Figura 3. Inhibición de la proliferación de HUVEC inducida por VEGF por los anticuerpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4. La intensidad de fluorescencia se lee usando una longitud de onda de excitación de 530nm y una longitud de emisión de 590. 219R45-MB-21M18 (-·-); 219R45-MB-21R79 (-A-) ; 219R45 (-¦-); Medio sin VEGF (-0-).
Figura 4. Inhibición de la señalización Notch inducida por DLL4 por anticuerpos biespecífieos anti-VEGF/anti-DLL4. La actividad de luciferasa se midió usando un kit de ensayo de luciferasa doble con actividad de luciferasa de Luciérnaga normalizada con la actividad de luciferasa de Renilla. 219R45-MB-21M18 (-·-); 219R45-MB-21R79 (-¦-); 21M18 (-0-) ; 21R79 (-?-) .
Figura 5. Inhibición del crecimiento de tumor de colon in viva por un anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti -DLL4. Células tumorales de colon OMP-C8 se inyectaron subcutáneamente en un injerto de piel humana en ratones NOD/SCID. LOS ratones se trataron con anticuerpo de control (-¦-), anticuerpo anti-hDLL4 21 18 (-Á-), anticuerpo anti-VEGF bevacizumab (-o-), o anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti -DLL4 219R45-MB-21M18 (-T-) . Los datos se muestran como volumen de tumor (fotones/sec) durante los días postratamiento. Los anticuerpos se administraron intraperitonealmente en una dosis de 25mg/kg una vez a la semana .
Figura 6. Tumorigenicidad de células tumorales pancreáticas después del tratamiento con anticuerpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4. Células tumorales OMP-PN8 de ratones tratados con anticuerpo de control, anticuerpo anti-hDLL4 21M18, anticuerpo anti -VEGF bevacizumab, o anticuerpos biespecíficos anti-VEGF/anti -DLL4 219R45-MB-21M18 o 219R45-MB-21R79 con o sin gemcitabina se procesaron a suspensiones de células individuales, y se trasplantaron en serie en ratones. 90 células de cada grupo de tratamiento se inyectaron subcutáneamente en ratones NOD/SCID. Los tumores se dejaron desarrollar sin ningún tratamiento. Los datos se muestran como volumen de tumor (mm3) en el día 55. La frecuencia del tumor se muestra como un número de tumores sobre el número total de ratones inyectados en cada grupo.
Figura 7. ELISA de anticuerpo biespecífico . Anticuerpos biespecíficos 219R45-MB-21M18, 219R45-MB-21R79 , 219R45-MB-21R75, y 219R45-MB-21R83 se diluyeron en solución amortiguadora de bloqueo (lx de PBS, 0.1% de gelatina, 0.1% de Polisorbato-20 , pH 7.4) que contiene 2 g/ml de biotina-DLL4-hFc. Los anticuerpos se diluyeron en serie 3 veces de 500ng/ml a 0.008ng/ml. Las muestras de anticuerpos se incubaron durante 2 horas en solución amortiguadora de bloqueo que contiene la biotina-DLL4 -hFc . Después de la incubación, las muestras de anticuerpos se transfirieron a una placa de ensayo recubierta con VEGF (100 ul/pocillo) y se incubaron durante 2 horas. Se agregó Estreptavidina-HRP a cada pocilio y se incubó durante 1 hora. El sustrato TMB se agregó a los pocilios con un desarrollo de color de 10 minutos y la reacción se detuvo con ácido sulfúrico 2M. La absorbancia se leyó a 450-650nm y los datos se analizaron usando el ajuste de 4 parámetros dentro del programa de análisis Softmax Pro.
Figura 8. Enfoque isoeléctrico capilar formado en imagen de anticuerpos biespecífieos anti-VEGF/anti-DLL4.
Figura 9. Inhibición del crecimiento del tumor del colon por anticuerpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4 en un modelo de recurrencia de tumor. Células tumorales de colon 0MP-C8 se inyectaron subcutáneamente en ratones NOD/SCID. Los ratones se trataron con anticuerpo de control (-¦-), anticuerpo anti-hDLL4 21M18 (-·-) , anticuerpo anti-VEGF bevacizumab (-A-), una combinación de 21M18 y bevacizumab (-T-) , anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 219R45- B-21M18 (-0-), o anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21R79 (-o-), todos en combinación con irinotecano. Los anticuerpos 21M18 y bevacizumab se administraron intraperitonealmente en una dosis de 7.5mg/kg una vez a la semana, los anticuerpos biespecíficos 219R45-MB-21M18 y 219R45-MB-21R79 se administraron intraperitonealmente en una dosis de 15mg/kg una vez a la semana, y el irinotecano se administró para las primeras 4 semanas en una dosis de 45mg/kg. Los datos se muestran como volumen de tumor (mm3) durante los días pos-tratamiento .
Figura 10. La tumorigenicidad de células tumorales de colon 0MP-C3 después del tratamiento con anticuerpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4. Los tumores de ratones tratados con anticuerpo de control, anticuerpo anti-hDLL4 21M18, anticuerpo anti-VEGF de bevacizumab, una combinación de 21M18 y de bevacizumab, o anticuerpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21M18 o 219R45-MB-21R79 con o sin irinotecano se procesaron a suspensiones de células individuales, y se trasplantaron en serie en ratones. 150 células de cada grupo de tratamientos se inyectaron subcutáneamente en ratones NOD/SCID. Los tumores se dejaron desarrollar sin ningún tratamiento. Los datos se muestran como volumen de tumor (mm3) en el día 68.
Figuras 11A-11B. Inhibición del crecimiento de tumor de colon in vivo por anticuerpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4. Células tumorales de colon 0MP-C8 se inyectaron subcutáneamente en ratones NOD/SCID. Los ratones se trataron con anticuerpo de control (-¦-) , anticuerpo anti-VEGF de bevacizumab (-A-) , o anticuerpos biespecíficos anti-VEGF/anti -DLL4 219R45-MB-21M18 (-0-), 219R45-MB-21R75 (-·-), 219R45-MB-21R79 (-o-) , o 219R45-MB-21R83 (-?-) . Los ratones se trataron con anticuerpos como agentes individuales (Fig. 11A) o en combinación con irinotecano (Fig. 11B) . Los anticuerpos se administraron intraperitonealmente en una dosis de 15mg/kg una vez a la semana e irinotecano en una dosis de 7.5mg/kg una a la semana. Los datos se muestran como volumen de tumor (mm3) durante los días pos -tratamiento .
Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona agentes de ligación novedosos, que incluyen pero no se limitan a polipéptidos tales como anticuerpos, que se ligan a VEGF y/o DLL4 (por ejemplo, un agente de ligación VEGF/DLL4) . Los polipéptidos y polinucleótidos relacionados, composiciones que comprenden los agentes de ligación a VEGF/DLL4, y métodos para elaborar los agentes de ligación VEGF/DLL4 también se proporcionan. Métodos para usar los agentes de ligación VEGF/DLL4 novedosos, tales como métodos para inhibir el crecimiento tumoral, métodos para tratar el cáncer, métodos para reducir la tumorigenicidad de un tumor, métodos para reducir la frecuencia de células madre cancerosas en un tumor y/o métodos para modular la angiogénesis , se proporcionan adicionalmente .
Un anticuerpo monoclonal que se liga específicamente al VEGF humanos se ha identificado, 219R45. Ese anticuerpo tiene una afinidad de ligación para el VEGF humano de aproximadamente 0.67nM, y una afinidad de ligación para VEGF de ratón de aproximadamente 23nM. Varios anticuerpos monoclonales que se ligan específicamente al DLL4 humano se han identificado, 21R79, 21R75 y 21R83. El anticuerpo 21R79 tiene una afinidad de ligación para el DLL4 humano de menor que O.lnM. Los anticuerpos biespecífieos que se ligan específicamente al VEGF humano y al DLL4 humano se han producido, 219R45-MB-21M18, 219R45 -MB-21R79 , 219R45-MB-21R75, y 219R45-MB-21R83 (secuencias CDR en las Figuras 1A-1C) . Como se usa en la presente, el WMB" dentro de un nombre de anticuerpo se refiere a "monovalente/biespecífico" . El anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21M18 tiene una afinidad de ligación para el VEGF humano de menor que 1. OnM y una afinidad de ligación para el DLL4 de aproximadamente 16nM. El anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21R79 tiene una afinidad de ligación al VEGF de menor que 1. OnM y una afinidad de ligación para el DLL4 humano de menor que l.OnM. El anticuerpo biespecífico 219R45- B-21R75 tiene una afinidad de ligación para el DLL4 humano de aproximadamente 5nM, mientras que el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21R83 tiene una afinidad de ligación para el DLL4 humano de aproximadamente InM. Los anticuerpos biespecíficos 219R45-MB-21M18 y 219R45-MB-21R79 se ligan al VEGF de ratón (Ejemplo 1, Tabla 3) . Los anticuerpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4 se ligan al VEGF humano y DLL4 simultáneamente (Ejemplo 2, Figura 2) . Los anticuerpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4 inhiben la proliferación inducida por VEGF de células HUVEC (Ejemplo 3, Figura 3). Los anticuerpos biespecíficos anti-VEGF/anti -DLL4 inhiben la señalización Notch inducida por DLL4 (Ejemplo 4, Figura 4) . Los anticuerpos biespecíficos anti-VEGF/anti -DLL4 inhiben el crecimiento tumoral (Ejemplos 5, 9, 11 y Figuras 5, 9, 11A-11B) . Los anticuerpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4 inhiben la tumorigenicidad (Ejemplos 6 y 10 y Figuras 6, 10) . Los anticuerpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4 se ligan tanto a VEGF como DLL4 en un ELISA biespecífico (Ejemplo 7, Figura 7) . Los anticuerpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4 se aislan y purifican a un producto que comprende por lo menos 90% de anticuerpo heterodimérico (Ejemplo 8, Tabla 7) .
I. Definiciones Para facilitar un entendimiento de la presente invención, una variedad de términos y frases se definen a continuación.
El término "anticuerpo" como se usa en la presente se refiere a una molécula de inmunoglobulina que reconoce y se liga específicamente a un objetivo, tal como una proteína, polipéptido, péptido, carbohidrato, polinucleótido, lípido, o combinaciones de los anteriores, a través de por lo menos un sitio de reconocimiento a antígeno dentro de la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se usa en la presente, el término abarca anticuerpos policlonales intactos, anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos de cadena individual, fragmento de anticuerpo (tales como Fab, Fab1, F(ab')2, y fragmentos Fv) , anticuerpos Fv de cadena individual (scFv) , anticuerpos multiespecífieos tales como anticuerpos biespecíficos , anticuerpos monoespecíficos , anticuerpos monovalentes, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, proteínas de fusión que comprenden un sitio de ligación a antígeno de un anticuerpo, y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprende un sitio de reconocimiento a antígeno (es decir, sitio de ligación a antígeno) siempre y cuando los anticuerpos muestren la actividad biológica deseada. Un anticuerpo puede ser cualquiera de las cinco clases principales de inmunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, o subclases (isotipos) de las mismas (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3 , IgG4 , IgAl, y IgA2), basado en la identidad de sus dominios constantes de cadena pesada referidos como alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las diferentes clases de inmunoglobulinas tienen estructuras de subunidad diferentes y bien conocidas y configuraciones tridimensionales. Los anticuerpos pueden ser desnudos o conjugados a otras moléculas, incluyendo pero no limitado a, toxinas y radioisótopos.
El término "fragmento de anticuerpo" se refiere a una porción de un anticuerpo intacto y se refiere a las regiones variables de determinación antigénicas de un anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab', F(ab')2, y fragmentos de Fv, anticuerpos lineales, anticuerpos de cadena individual, y anticuerpos multiespecífieos formados de fragmentos de anticuerpo. "Fragmento de anticuerpo" como se usa en la presente comprende un sitio de ligación a antígeno o sitio de ligación a epítopo.
El término "región variable" de un anticuerpo se refiere a la región variable de una cadena ligera de anticuerpo o la región variable de una cadena pesada de anticuerpo, ya sea sola o en combinación. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras consisten cada una de cuatro regiones marco (FR, por sus siglas en inglés) conectadas por tres regiones de determinación de complementariedad (CDRs, por sus siglas en inglés), también conocidas como "regiones hipervariables" . Las CDRs en cada cadena se mantienen juntas en proximidad cercana por regiones de estructura y, con las CDRs de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de ligación a antígeno del anticuerpo. Existen por lo menos dos técnicas para determinar las CDRs: (1) un procedimiento basado en la variabilidad de secuencia de especies cruzadas (es decir, Kabat y colaboradores, 1991, Seguences of Proteins of I munological Interest, 5a edición, National Institutes of Health, Bethesda, MD) , y (2) un procedimiento basado en estudios cristalográficos de complejos de antígenos-anticuerpo (Al-Lazikani y colaboradores, 1997, J. Mol. Biol . , 273:927-948). Además, las combinaciones de estos dos procedimientos se usan algunas veces en la técnica para determinar la CDRs .
El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a una población de anticuerpos homogéneos implicados en el reconocimiento y ligación sumamente específica de un determinante o epítopo antigénico individual. Esto es en contraste con los anticuerpos monoclonales que incluyen típicamente una mezcla de diferentes anticuerpos dirigidos contra una variedad de determinantes antigénicos diferentes. El término "anticuerpo monoclonal" abarca tanto anticuerpos monoclonales intactos como de longitud completa así como fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv) , anticuerpos de cadena individual (scFv) , proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo, y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprende un sitio de reconocimiento a antígeno (sitio de ligación a antígeno) . Adicionalmente , el "anticuerpo monoclonal" se refiere a tales anticuerpos fabricados por cualquier número de técnicas incluyendo pero no limitado a, producción de hibridoma, selección en fago, expresión recombinante , y animales transgénicos .
El término "anticuerpo humanizado" como se usa en la presente se refiere a formas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de murino) que son cadenas de inmunoglobulina específicas, inmunoglobulinas quiméricas, o fragmentos de las mismas que contienen secuencias no humanas mínimas. Típicamente, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas en las cuales los residuos de las CDRs se reemplazan por residuos de la CDRs de una especie no humana (por ejemplo, ratón, rata, conejo, o hámster) que tienen la especificidad deseada, afinidad y/o capacidad de ligación (Jones y colaboradores, 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann y colaboradores, 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen y colaboradores, 1988, Science, 239:1534-1536). En algunos casos, los residuos de región de estructura Fv de una inmunoglobulina humana se reemplazan con los residuos correspondientes en un anticuerpo de una especie no humana que tienen la especificidad deseada, afinidad, y/o capacidad de ligación. El anticuerpo humanizado se puede modificar además por la sustitución de residuos adicionales ya sea en la región de estructura Fv y/o dentro de los residuos no humanos reemplazados para refinar u optimizar la especificidad de anticuerpos, afinidad, y/o capacidad de ligación. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de por lo menos uno, y típicamente dos o tres, dominios variables que contienen, todo o sustancialmente todo de la CDRs que corresponden a la inmunoglobulina no humana mientras que todas o sustancialmente todas de las regiones de estructura son aquellas de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también puede comprender por lo menos una porción de una región o dominio constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente aquella de una inmunoglobulina humana. Ejemplos de métodos usados para generar anticuerpos humanizados se describen en, por ejemplo, Patente de E.U.A. 5,225,539.
El término "anticuerpo humano" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo producido por un humano o un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a un anticuerpo producido por un humano. Un anticuerpo humano se puede fabricar usando cualquiera de las técnicas conocidas en el campo. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende CDRs no humanas.
El término "anticuerpo quimérico" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo en donde la secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina se deriva de dos o más especies. Típicamente, la región variable de ambas cadenas ligeras y pesadas corresponde a la región variable de anticuerpos derivados de una especie de mamíferos (por ejemplo, ratón, rata, conejo, etc.) con la especificidad deseada, afinidad, y/o capacidad de ligación, mientras que las regiones constantes corresponden a las secuencias en los anticuerpos derivados de otras especies (usualmente humano) .
La frase "anticuerpo madurado por afinidad" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más CDRs del mismo que da por resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo para el antígeno, comparado con un anticuerpo precursor que no posee esas alteraciones. La definición también incluye alteraciones en los residuos no de CDR hechos en conjunción con las alteraciones a los residuos CDR. Los anticuerpos madurados por afinidad preferidos tendrán afinidades nanomolares a un picomolares para el antígeno objetivo. Los anticuerpos madurados por afinidad se producen por los procedimientos conocidos en el campo. Por ejemplo, Marks y colaboradores, 1992, Bio/'Technology 10:779-783, describe maduración por afinidad mediante transposición de dominio VH y VL. La mutagénesis aleatoria de las CDR y/o los residuos de estructura se describe por Barbas y colaboradores, 1994, PNAS, 91:3809-3813; Schier y colaboradores, 1995, Gene, 169:147-155; Yelton y colaboradores, 1995, J". Immunol . 155:1994-2004; Jackson y colaboradores, 1995, J. Immunol., 154:3310-9; y Hawkins y colaboradores, 1992, J. Mol. Biol . , 226:889-896. La mutagénesis dirigida al sitio también se puede usar para obtener anticuerpos madurados por afinidad.
Los términos "epítopo" y "determinante antigénico" se usan intercambiablemente en la presente y se refieren a esa porción de un antígeno capaz de ser reconocida y liga específicamente por un anticuerpo particular. Cuando el antígeno es un polipéptido, los epítopos se pueden formar tanto de aminoácidos contiguos como aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados de aminoácidos contiguos (también referidos como epítopos lineales) se retienen típicamente en la desnaturalización de la proteína, mientras que los epítopos formados por el plegamiento terciario (también referidos como epítopos conformacionales) se pierden típicamente en la desnaturalización de la proteína. Un epítopo incluye típicamente por lo menos 3, y más usualmente, por lo menos 5 o 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única.
Los términos "molécula heteromultimérica" o "heteromultímero" o "complejo heteromultimérico" o "polipéptido heteromultimérico" se usan intercambiablemente en la presente para referirse a una molécula que comprende por lo menos un primer polipéptido y un segundo polipéptido, en donde el segundo polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido por al menos un residuo de aminoácido. La molécula heteromultimérica puede comprender un "heterodímero" formado por el primero y segundo polipéptido o puede formar estructuras terciarias de orden superior donde están presentes los polipéptidos adicionales.
Los términos "antagonista" y "antagonístico" como se usa en la presente se refieren a cualquier molécula que bloquea parcial o completamente, inhibe, reduce, neutraliza una actividad biológica de un objetivo y/o rutas de señalización (por ejemplo, la trayectoria Notch) . El término "antagonista" se usa en la presente para incluir cualquier molécula que bloquee parcial o completamente, inhiba, reduzca o neutralice la actividad de una proteína. Las moléculas antagonistas adecuadas incluyen específicamente, pero no se limitan a, anticuerpos antagonistas o fragmentos de anticuerpo.
Los términos "modulación" y "modulan" como se usa en la presente se refiere a un cambio o una alteración en una actividad biológica. La modulación incluye, pero no se limita a, estimular o inhibir una actividad. La modulación puede ser un incremento o una disminución en la actividad (por ejemplo, una disminución en la angiogénesis o un incremento en la angiogénesis) , un cambio en las características de ligación, o cualquier otro cambio en las propiedades biológicas, funcionales inmunológicas asociadas con la actividad de una proteína, ruta, u otro punto biológico de interés.
Los términos "se liga selectivamente" o "se liga específicamente" significa que un agente de ligación o un anticuerpo reacciona o se asocia más frecuentemente, más rápidamente, con mayor duración, con mayor afinidad, o con alguna combinación de lo anterior al epítopo, proteína, o molécula objetivo que con sustancias alternativas, incluyendo proteínas no relacionadas. En ciertas modalidades, "se liga específicamente" significa, por ejemplo, que un anticuerpo se liga a una proteína con una KD por lo menos aproximadamente de 0. lm o menos, pero más usualmente menor que aproximadamente ?µ?. En ciertas modalidades, "se liga específicamente" significa que un anticuerpo se liga a un objetivo a veces con una KD de por lo menos aproximadamente de 0. ?µ? o menos, en otras veces por lo menos aproximadamente ?.??µ? o menos, y en otras veces por lo menos aproximadamente InM o menos . Debido a que la identidad de secuencia entre las proteínas homologas en diferentes especies, la ligación específica puede incluir un anticuerpo que reconoce una proteína en más de una especie (por ejemplo, VEGF humano y VEGF de ratón) . Del mismo modo, debido a la homología dentro de ciertas regiones de las secuencias de polipéptidos de diferentes proteínas, la ligación específica puede incluir un anticuerpo (u otro polipéptido o agente de ligación) que reconoce más de una proteína (por ejemplo, VEGF-A humana y VEGF-B humana) . Se entiende que, en ciertas modalidades, un anticuerpo o porción de ligación que liga específicamente un primer objetivo puede o no ligarse específicamente a un segundo objetivo. Como tal "ligación específica" no requiere necesariamente (aunque puede incluir) ligación exclusiva, ligación a un objetivo individual. De esta manera, un anticuerpo puede, en ciertas modalidades, ligarse específicamente a más de un objetivo. En ciertas modalidades, múltiples objetivos se pueden ligar por el mismo sitio de ligación a antígeno en el anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo puede, en ciertos casos, comprender dos sitios de ligación a antígenos idénticos, cada uno de los cuales se liga específicamente al mismo epítopo en dos o más proteínas. En ciertas modalidades alternativas, un anticuerpo puede ser multiespecífico y comprende por lo menos dos sitios de ligación a antígeno con especificidades diferentes. A manera de ejemplo no limitante, un anticuerpo biespecífico puede comprender un sitio de ligación a antígeno que reconoce un epítopo en una proteína (por ejemplo, VEGF humanos) y comprende además un segundo sitio de ligación a antígeno diferente que reconoce un epítopo diferente en una segunda proteína (por ejemplo, DLL4 humano) . Generalmente, pero no necesariamente, la referencia a la ligación significa ligación específica.
Los términos "polipéptido" y "péptido" y "proteínas" se usan intercambiablemente en la presente y se refieren a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados, y se puede interrumpir por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácido que se ha modificado naturalmente o por intervención; por ejemplo, formación de ligación a disulfuro, glicosilación, lapidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de etiquetado. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales) , así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Se entiende, que debido a que los polipéptidos de esta invención se pueden basar en anticuerpos, en ciertas modalidades, los polipéptidos pueden presentarse como cadenas individuales o cadenas asociadas.
Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan intercambiablemente en la presente y se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos modificados o bases, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que se pueda incorporar en un polímero por ADN o ARN polimerasa.
"Condiciones de alta severidad" se pueden identificar por aquellos que: (1) emplean resistencia iónica baja y alta temperatura para el lavado, por ejemplo cloruro de sodio 15mM/citrato de sodio 1.5mM/0.1% de dodecil sulfato de sodio a 50°C; (2) emplear durante la hibridación en un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, 50% (v/v) de formamida con 0.1% de albúmina de suero bovino/ 0.1% de Ficol/0.1% de polivinilpirrolidona/solución amortiguadora de fosfato de sodio 50mM pH 6.5 en 5x SSC (NaCl 0.75M, citrato de sodio 75mM) a 42°C; o (3) emplear durante la hibridación 50% de formamida en 5x SSC, fosfato de sodio 50mM (pH 6.8), 0.1% de pirofosfato de sodio, 5x de solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón pasado por ondas sonoras (50yg/ml) , 0.1% de SDS, y 10% de sulfato de dextrano a 42 °C, con lavados a 42°C a 0.2x de SSC y 50% formamida, seguido por un lavado de alta severidad que consiste de 0. lx de SSC que contiene EDTA a 55°C.
Los términos "idéntico" o porcentaje "de identidad" en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o polipéptidos , se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas o tienen un porcentaje especificado de nucleótidos o residuos de aminoácido que son los mismos, cuando se comparan y se alinean (espacios de introducción, si es necesario) para correspondencia máxima, no considerando ninguna sustitución de aminoácido conservadoras como parte de la identidad de secuencia. El porcentaje de identidad se puede medir usando software o algoritmos de comparación de secuencia o por inspección visual. Varios algoritmos y software que se pueden usar para obtener alineaciones de secuencias de aminoácido o nucleótidos son bien conocidos en el campo. Estos incluyen, pero no se limitan a, BLAST, ALIGN, Megalign, BestFit, GCG Wisconsin Package, y variaciones de los mismos. En algunas modalidades, dos ácidos nucleicos o polipéptidos de la invención son sustancialmente idénticos, significan que tienen por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, y en algunas modalidades por lo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de residuos de nucleótido o aminoácido, cuando se comparan y se alinean para correspondencia máxima, como es debido usando un algoritmo de comparación de secuencia o por inspección visual. En algunas modalidades, la identidad existe sobre una región de las secuencias que es por lo menos aproximadamente 10, por lo menos aproximadamente 20, por lo menos aproximadamente 40-60 residuos, por lo menos aproximadamente 60-80 residuos en longitud o cualquier valor integral entre los mismos. En algunas modalidades, la identidad existe sobre una región más larga que 60-80 residuos, tal como por lo menos aproximadamente 80-100 residuos, en algunas modalidades las secuencias son sustancialmente idénticas sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan, tal como la región de codificación de una secuencia de nucleótidos.
Una "sustitución de aminoácido conservadora" es una en la cual un residuo de aminoácido se reemplaza con otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuo de aminoácido que tienen cadenas laterales similares se han definido en el campo, incluyendo cadenas laterales básicas, (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales acidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina , metionina, triptófano) , cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) . Por ejemplo, la sustitución de una fenilalanina por una tirosina es una sustitución conservadora. De manea preferible, las sustituciones conservadoras en las secuencias de los polipéptidos y anticuerpos de la invención no anulan la ligación del polipéptido o anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos, al antígeno al cual el polipéptido o anticuerpos se liga. Los métodos para identificar las sustituciones conservadoras de nucleótidos o aminoácidos que no eliminan la ligación al antígeno son bien conocidos en el campo .
El término "vector" como se usa en la presente significa un constructo, que es capaz de suministrar, y usualmente expresar, uno o más gen (es) o secuencia (s) de interés en una célula hospedera. Ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores virales, vectores de expresión de ADN o ARN desnudo, plásmido, cósmido, o vectores fago, vectores de expresión de ADN o ARN asociados con agentes de condensación catiónicos, y vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas.
Un polipéptido, anticuerpo, polinucleótido, vector, célula, o composición que se "aisla" es un polipéptido, anticuerpo, polinucleótido, vector, célula, o composición que está en una forma no encontrada en la naturaleza. Polipéptidos aislados, polipéptidos, polinucleótidos, vectores, células, o composiciones incluyen aquellas que se han purificado a un grado que ya no están en una forma en la cual se encuentran en la naturaleza. En algunas modalidades, un polipéptido, anticuerpo, polinucleótido, vector, célula, o composición que se aisla es sustancialmente pura.
El término "sustancialmente puro" como se usa en la presente se refiere a un material que es por lo menos 50% puro (es decir, libre de contaminantes) , por lo menos 90% puro, por lo menos 95% puro, por lo menos 98% puro, o por lo menos 99% puro.
Los términos "cáncer" y "canceroso" como se usa en la presente se refiere a o describe la condición fisiológica en mamíferos en los cuales una población de células se caracteriza por crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, blastoma, sarcoma, y canceres hematológicos tales como linfoma y leucemia .
Los términos "tumor" y "neoplasma" como se usa en la presente se refiere a cualquier masa de tejido que resulta del crecimiento celular excesivo o proliferación, ya sea benigno (no canceroso) o maligno (canceroso) incluyendo lesiones pre-cancerosas .
Los términos "metástasis" como se usa en la presente se refiere al proceso por el cual un cáncer se propaga o transfiere desde el sitio de origen hasta otras regiones del cuerpo con el desarrollo de una lesión cancerosa similar en una nueva ubicación. Una célula "metastásica" o "metastasizante" es una que pierde los contactos adhesivos con células vecina y migra a través del torrente sanguíneo por nudos linfáticos desde el sitio primario de la enfermedad para invadir las estructuras corporales vecinas.
Los términos "célula madre cancerosa" y "CSC" y "célula madre tumoral" y "célula iniciadora de tumor" se usan intercambiablemente en la presente y se refieren a células de un cáncer o tumor que: (1) tienen capacidad proliferativa extensiva; (2) son capaces de división células asimétrica para generar uno o más tipos de progenie de células diferenciadas en donde las células diferenciadas tienen potencial proliferativo o de desarrollo reducido; y (3) son capaces de divisiones de células simétricas para auto renovación o auto mantenimiento. Estas propiedades confieren para las células madre cancerosas la capacidad de formar o establecer un tumor o cáncer en trasplante en serie en un hospedero inmunocomprometido (por ejemplo, un ratón) comparada con la mayoría de células tumorales que no logran formar tumores. Las células madre cancerosas se someten al auto renovación versus diferenciación en una manera caótica para formar tumores con tipos de células anormales que pueden cambiar a través del tiempo conforme se presentan las mutaciones.
Los términos "célula cancerosa" y "célula tumoral" se refiere a la población total de células derivadas de un cáncer o tumor o lesión pre-cancerosa, incluyendo ambas células no tumorigénicas, que comprenden el volumen de la población de células cancerosas, y células madre tumorigénicas (células madre cancerosas) . Como se usa en la presente, los términos "célula cancerosa" o "célula tumoral" se modificarán por el término "no tumorigénicos" cuando se refiere solamente a esas células que carecen de la capacidad de renovación y diferenciarse para distinguir esas células tumorales de las células madre cancerosas.
El término "tumorigénico" como se usa en la presente se refiere a las características funcionales de una célula madre cancerosa incluyendo las propiedades de auto renovación (que da origen a células madre cancerosas tumorigénicas adicionales) y proliferación para generar otras células tumorales (que da origen a células tumorales diferenciadas y de esta manera no tumorigénicas) .
El término "tumorigenicidad" como se usa en la presente se refiere a la capacidad de una muestra aleatoria de células del tumor para formar tumores palpables en el trasplante en serie en los hospederos inmunocomp ometidos (por ejemplo, ratones) . Esta definición también incluye poblaciones enriquecidas y/o aisladas de células madre cancerosas que forman tumores palpables en el trasplante en serie en hospederos inmunocomprometidos (por ejemplo, ratones) .
El término "sujeto" se refiere a cualquier animal (por ejemplo, un mamífero) , incluyendo, pero no limitado a, humanos, primates no humanos, caninos, felinos, roedores, y similares, que van a ser el recipiente de un tratamiento particular. Típicamente, los términos "sujeto" y "paciente" se usan intercambiablemente en la presente en referencia a un sujeto humano .
El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a un producto o compuesto aprobado (o aprobable) por una agencia reguladora del gobierno Federal o gobierno estatal o listado en la Farmacopea de E.U.A u otra farmacopea generalmente reconocida para el uso en animales, incluyendo humanos.
Los términos "excipiente, portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable" o "portador farmacéutico aceptable" se refiere a un excipiente, portador o adyuvante que se puede administrar a un sujeto, junto con por lo menos un agente de ligación (por ejemplo, un anticuerpo) de la presente descripción, y que no destruye la actividad del agente de ligación. El excipiente, portador o adyuvante no deben ser tóxicos cuando se administran con un agente de ligación en dosis suficientes para administrar un efecto terapéutico .
Los términos "cantidad efectiva" o "cantidad terapéuticamente efectiva" o "efecto terapéutico" se refieren a una cantidad de un agente de ligación, un anticuerpo, polipéptido, polinucleótido, molécula orgánica pequeña, u otro fármaco efectivo para "tratar" una enfermedad o trastorno en un sujeto o mamífero. En el caso de cáncer, la cantidad terapéuticamente efectiva de un fármaco (por ejemplo, un anticuerpo) tiene un efecto terapéutico y como tal puede reducir el número de células cancerosas; disminuir la tumorigenicidad, frecuencia tumorigénica o capacidad tumorigénica; reduce el número de frecuencia de células madre cancerosas; reduce el tamaño del tumor; reduce la población de células cancerosas; inhibe y/o detiene la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos incluyendo, por ejemplo, la propagación de cáncer en el tejido blando y huesos; inhibe y/o detiene la metástasis de células tumorales o cancerosas; inhibe y/o detiene el crecimiento de células tumorales o cancerosas; alivia a un grado uno o más de los síntomas asociados con el cáncer; reduce la morbidez y mortalidad; mejora la calidad de vida; o una combinación de tales efectos. En la medida en que el agente, por ejemplo un anticuerpo, prevenga el crecimiento y/o extermine células cancerosas existentes, se puede referir como citostático y/o citotóxico .
Los términos "que trata" o "tratamiento" o "trata" o "que alivia" o "alivia" se refiere a tanto 1) mediciones terapéuticas que curan, desaceleran, reducen los síntomas de y/o detienen la progresión de una condición o trastorno patológico diagnosticado y 2) medidas profilácticas o preventivas que previene o desaceleran el desarrollo de una condición o trastorno patológico objetivo. De esta manera aquellas personas sin necesidad de tratamiento incluyen aquellos ya con el trastorno, aquellos propensos a tener el trastorno; y aquellos a quienes el trastorno se va a prevenir. En algunas modalidades, un sujeto es exitosamente "tratado" de acuerdo con los métodos de la presente invención si el paciente muestra uno o más de lo siguiente: una reducción en el número de o ausencia completa de células cancerosas; una reducción en el tamaño del tumor; inhibición de o una ausencia de infiltración de células cancerosas en los órganos periféricos incluyendo la propagación de células cancerosas en el tejido blando y huesos; inhibición de o una ausencia de metástasis de células tumorales o cancerosas; inhibición o una ausencia del crecimiento canceroso; alivio de uno o más síntomas asociados con el cáncer específico; morbidez y mortalidad reducidas; mejora en la calidad de vida; reducción en la tumorigenicidad; reducción en el número o frecuencia de células madre cancerosas; o alguna combinación de los efectos.
Como se usa en la presente descripción y en las reivindicaciones, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen formas plurales a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera.
Se entiende que donde las modalidades se describan en la presente con el lenguaje "que comprende" de otra manera las modalidades análogas descritas en los términos de "que consiste de" y/ "que consiste esencialmente de" también se proporcionan. También se entiende que donde las modalidades se describan en la presente con el lenguaje "que consiste esencialmente de" de otra manera las modalidades análogas descritas en los términos de "que consiste de" también se proporcionan.
El término "y/o" como se usa en la frase tal como "A y/o B" en la presente se propone incluir tanto A y B; A o B; A (sola) ; y B (sola) . Del mismo modo el término "y/o" como se usa en una frase tal como "A, B, y/o C" se propone para abarcar cada una de las siguientes modalidades: A, B, y C; A, B, o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B B y C; A (sola) ; B (sola) ; y C (sola) .
II. Anticuerpos La presente invención proporciona agentes que se ligan específicamente a las proteínas VEGF humanas y/o proteínas DLL4 humano. Estos agentes se refieren en la presente como "agentes de ligación a VEGF/DLL4" . La frase "agente de ligación a VEGF/DLL4" abarca a agentes que se ligan solamente de VEGF, agentes que se ligan solamente de DLL , y agentes biespecíficos que se ligan tanto a VEGF como DLL4. En ciertas modalidades, además de ligarse específicamente a VEGF y/o DLL4 , los agentes de ligación a VEGF/DLL4 se ligan específicamente además a por lo menos un objetivo o antígeno adicional. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un polipéptido. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 se liga específicamente a VEGF humano. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 se liga específicamente a DLL4 humano. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un biespecífico . En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que se liga específicamente al VEGF humano y DLL4 humano. Las secuencias de aminoácidos (aa) de longitud completa para el VEGF humano (VEGF-A) y DLL4 humano son conocidas en la técnica y se proporciona en la presente como SEQ ID NO: 27 (VEGF) y SEQ ID NO: 23 (DLL4) .
En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 o anticuerpo se liga a VEGF y/o DLL4 con una constante de disociación (KD) de aproximadamente ?µ? o menor, aproximadamente ????? o menor, aproximadamente 40nM o menor, aproximadamente 20nM o menor, aproximadamente ???? o menor, aproximadamente InM o menor, o aproximadamente 0. InM o menor. En algunas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 o anticuerpo se ligan a VEGF y/o DLL4 con una KD de aproximadamente 20n o menor. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 o anticuerpo se liga a VEGF y/o DLL4 con una KD de aproximadamente ???? o menor. En algunas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 o anticuerpo se liga a VEGF y/o DLL4 con una KD de aproximadamente lnM o menor. En algunas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 o anticuerpo se liga a VEGF y/o DLL4 con una KD de aproximadamente 0. lnM o menor. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 se liga a tanto VEGF humano como VEGF de ratón con una KD de aproximadamente ????? o menor. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 se liga tanto a VEGF humano como VEGF de ratón con una KD de aproximadamente 50nM o menor. En algunas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 se liga a tanto DLL4 humano como DLL4 de ratón con una KD de aproximadamente ????? o menor. En algunas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 se liga tanto a DLL4 humano como a DLL4 de ratón con una KD de aproximadamente 50nM o menor. En algunas modalidades, la constante de disociación del agente de ligación (por ejemplo, un anticuerpo) a VEGF es la constante de disociación determinada usando una proteína de fusión VEGF que comprende por lo menos una porción del VEGF inmovilizado sobre un chip Biacore. En algunas modalidades, la constante de disociación del agente de ligación (por ejemplo, un anticuerpo) a DLL4 es la constante de disociación determinada usando una proteína de fusión DLL4 que comprende por lo menos una porción de DLL4 inmovilizado sobre un chip Biacore.
En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a VEGF y un segundo sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a DLL4. En algunas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 o anticuerpo se liga tanto a VEGF como DLL4 con una KD de aproximadamente ????? o menor. En algunas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 o anticuerpo se liga tanto a VEGF como a DLL4 con una KD de aproximadamente 50nM o menor. En algunas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 o anticuerpo se liga tanto a VEGF como DLL4 con una KD de aproximadamente 20nM o menor. En algunas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 o anticuerpo se liga tanto a VEGF como DLL4 con una KD of aproximadamente ???? o menor. En algunas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 o anticuerpo se liga tanto a VEGF como DLL4 con una KD de aproximadamente InM o menor. En algunas modalidades, la afinidad de uno de los sitios de ligación del antígeno puede ser más débil que la afinidad del otro sitio de ligación a antígeno. Por ejemplo, la KD de un sitio de ligación a antígeno puede ser de aproximadamente InM y la KD del segundo sitio de ligación a antígeno puede ser de aproximadamente 10nM. En algunas modalidades, la diferencia en la afinidad entre los dos sitios de ligación a antígeno puede ser de aproximadamente 2 veces o más, de aproximadamente 3 veces o más, de aproximadamente 5 veces o más, de aproximadamente 8 veces o más, de aproximadamente 10 veces o más, de aproximadamente 15 veces o más, de aproximadamente 20 veces o más, de aproximadamente 30 veces o más, de aproximadamente 50 veces o más, o de aproximadamente 100 veces o más. La modulación de las afinidades de los sitios de ligación a antígeno puede afectar la actividad biológica del anticuerpo biespecífico . Por ejemplo, la disminución de la afinidad del sitio de ligación a antígeno para DLL4 o VEGF, puede tener un efecto deseable, por ejemplo toxicidad disminuida del agente de ligación o índice terapéutico incrementado.
A manera de ejemplo no limitante, el anticuerpo biespecífico puede comprender (a) un primer sitio de ligación a antígeno que se liga a VEGF humano con una KD entre aproximadamente 0.1 nM y aproximadamente 1.0 nM, (b) un segundo sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente DLL4 humano con una KD entre aproximadamente 0.1 nM y aproximadamente 20 nM, entre aproximadamente 0.5nM y aproximadamente 20nM, entre aproximadamente 1.0 nM y lOnM. En ciertas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende dos cadenas ligeras idénticas.
En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) se liga a VEGF y/o DLL4 con una concentración efectiva máxima media (EC50) de aproximadamente ?µ? o menor, de aproximadamente ????? o menor, de aproximadamente 40nM o menor, de aproximadamente 20nM o menor, de aproximadamente ???? o menor, de aproximadamente In o menor, o aproximadamente 0. InM o menor.
En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante . En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En ciertas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo IgA, IgD, IgE, IgG, o IgM. En ciertas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo IgGl . En ciertas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo IgG2. En ciertas modalidades, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo que comprende un sitio de ligación a antígeno. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico . En algunas modalidades, el anticuerpo es monovalente, monoespecífico, bivalente, o multiespecífico . En algunas modalidades, el anticuerpo se conjuga a una porción citotóxica. En algunas modalidades, el anticuerpo se aisla.
En algunas modalidades, el anticuerpo es sustancialmente puro .
Los agentes de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, anticuerpos) de la presente invención se pueden someter a ensayo par ligación específica por cualquier método conocido en el campo. Los inmunoensayos que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que usan técnicas tales como análisis Biacore, análisis FACS, inmunofluorescencia, inmunocitoquímica, análisis Western blot, radioinmunoensayo, ELISA, inmunoensayo de "emparedado", ensayo de inmunoprecipitación, reacción de precipitación, reacción de precipitación de difusión en gel, ensayo de inmunodifusión, ensayo de aglutinación, y ensayo de fijación de complemento, ensayo inmunoradiométrico, inmunoensayo fluorescente, ensayo de fluorescencia resuelta en el tiempo homogéneo (HTRF, por sus siglas en inglés) , e inmunoensayo de proteína A. Tales ensayos son de rutina y bien conocidos en el campo (véase, por ejemplo, Ausubel y colaboradores, Editors, 1994 -present , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY) .
Por ejemplo, la ligación específica de un anticuerpo a VEGF humano y/o DLL4 humano se puede determinar usando el ELISA. Un ensayo ELISA comprende preparar el antígeno, recubrir los pocilios de una placa de microtítulo de 96 pocilios con antígeno, agregar el anticuerpo u otro agente de ligación conjugado a un compuesto detectable tal como un substrato enzimático (por ejemplo peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina) al pocilio, incubar durante un período de tiempo, y detectar la presencia del agente de ligación ligado al antígeno. En algunas modalidades el agente de ligación o anticuerpo no se conjuga a un compuesto detectable, sino en cambio un segundo anticuerpo que reconoce el agente de ligación o anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-Fc) y se conjuga a un compuesto detectable se agrega al pocilio. En algunas modalidades, en lugar de recubrir el pocilio con el antígeno, el agente de ligación o anticuerpo se puede recubrir al pocilio y un segundo anticuerpo conjugado a un compuesto detectable se puede agregar después de la adición del antígeno al pocilio recubierto. Una persona de experiencia en el campo estaría bien informada en cuanto los parámetros que se pueden modificar para incrementar la señal detectada así como otras variaciones de los ELISAS conocidos en la técnica.
En otro ejemplo, la ligación especifica de un anticuerpo a VEGF humano y/o DLL4 humano se puede determinar usando el FACS . Un ensayo de clasificación FACS puede comprender generar un constructo de cADN que exprese un antígeno como una proteína de fusión, transfecte el constructo en las células, exprese el antígeno sobre la superficie de las células, mezcle el agente de ligación o anticuerpo con las células transfectadas, e incube durante un período de tiempo. Las células ligadas por el agente de ligación o anticuerpo se pueden identificar al usar un anticuerpo secundario conjugado a un compuesto detectable. (Por ejemplo, anticuerpo anti-Fc conjugado con PE) y un citómetro de flujo. Una persona de experiencia en el campo estaría bien informado en cuanto a los parámetros que se pueden modificar para optimizar la señal detectada así como otras variaciones de FACS que pueden mejorar la clasificación (por ejemplo, clasificación para bloquear los anticuerpos) .
La afinidad de ligación de un anticuerpo u otro agente de ligación a un antígeno (por ejemplo, VEGF o DLL4) y la constante de disociación de una interacción de anticuerpo-antígeno se puede determinar por ensayos de ligación competitivos. Un ejemplo de un ensayo de ligación competitivo es un radioinmunoensayo que comprende la incubación del antígeno etiquetado (por ejemplo, 3H o 125I) , o fragmento o variante del mismo, con el anticuerpo de interés en presencia de cantidades de incremento del antígeno no etiquetado seguido por la detección del anticuerpo ligado al antígeno etiquetado. La afinidad del anticuerpo para el antígeno y las constantes de disociación de ligación se puede determinar a partir de los datos por y el análisis gráfico de Scatchard. En algunas modalidades, el análisis cinético Biacore se usa para determinar la constante de asociación y disociación de la ligación de los anticuerpos o agentes que se ligan a un antígeno (por ejemplo, VEGF o DLL4) . El análisis cinético Biacore comprende analizar la ligación y la disociación de los anticuerpos de los chips con el antígeno inmovilizado (por ejemplo, VEGF o DLL4) sobre su superficie.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un agente de ligación a VEGF (por ejemplo, un anticuerpo) que se liga específicamente al VEGF humano, en donde el agente de ligación a VEGF (por ejemplo, un anticuerpo) comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco y/o seis de las CDRs del anticuerpo 219R45 (véase la Tabla 1) . En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF comprende una o más de las CDRs de 219R45, dos o más de las CDRs de 219R45, tres o más de las CDRs de 219R45, cuatro o más de las CDRs de 219R45, cinco o más de las CDRs de 219R45, o seis de las CDRs de 219R45. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF se liga a VEGF humano y VEGF de ratón.
Tabla 1 En ciertas modalidades, la invención proporciona un agente de ligación a VEGF (por ejemplo, un anticuerpo) que se liga específicamente al VEGF humano, en donde el agente de ligación a VEGF comprende una CDRl de cadena pesada que comprende NYWMH (SEQ ID NO: 17), una CDR2 de cadena pesada que comprende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO: 18), y una CDR3 de cadena pesada que comprende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO: 19). En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF comprende además una CDRl de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO: 20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO:21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22) . En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF comprende: (a) una CDRl de cadena pesada que comprende NYWMH (SEQ ID NO: 17), una CDR2 de cadena pesada que comprende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO: 18), y una CDR3 de cadena pesada que comprende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO: 19), y (b) una CDRl de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO: 20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22) .
En ciertas modalidades, la invención proporciona un agente de ligación a VEGF (por ejemplo, un anticuerpo) que se liga específicamente a VEGF humano, en donde el agente de ligación a VEGF comprende: (a) una CDRl de cadena pesada que comprende NYWMH (SEQ ID NO: 17), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido; (b) una CDR2 de cadena pesada que comprende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO:18), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido; (c) una CDR3 de cadena pesada que comprende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO: 19), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido; (d) una CDRl de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido; (e) una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO:21), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido; y (f) una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido. En ciertas modalidades, las sustituciones de aminoácido son sustituciones conservadoras.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un agente de ligación a VEGF (por ejemplo, un anticuerpo) que se liga específicamente VEGF, en donde el agente de ligación a VEGF comprende una región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 11, y una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO:12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF comprende una región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 97%, o por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 11. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF comprende una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 97%, o por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF comprende una región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 11, y una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF comprende una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 11, y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF comprende una región variable de cadena pesada que consiste esencialmente de SEQ ID NO: 11, y una región variable de cadena ligera que consiste esencialmente de SEQ ID NO: 12. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF comprende una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 9, y una cadena ligera que comprende SEQ ID NO : 8. En algunas modalidades, el anticuerpo de ligación a VEGF u otro agente comprende una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 7, y una cadena ligera que comprende SEQ ID NO : 8.
En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF se liga a VEGF con una KD de aproximadamente ???? o menor. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF se liga a VEGF con una KD de aproximadamente InM o menor. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF se liga a VEGF con una KD de aproximadamente 0. InM o menor . En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF se liga a VEGF con una KD de aproximadamente 0.0InM o menor. En algunas modalidades, por lo menos residuo de aminoácido en por lo menos una CDR del agente de ligación a VEGF se sustituye con un aminoácido diferente de modo que la afinidad del agente de ligación a VEGF para VEGF se altera. En algunas modalidades, la afinidad del agente de ligación a VEGF se incrementa. En algunas modalidades, la afinidad del agente de ligación a VEGF se disminuye. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF se liga a VEGF humano. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF se liga a VEGF humano y VEGF de ratón.
En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF comprende la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera del anticuerpo 219R45. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF comprende la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo 219R45 (con o sin la secuencia líder) . En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF es el anticuerpo 219R45.
En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF comprende, consiste esencialmente de, o consiste de, el anticuerpo 219R45.
En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF (por ejemplo, un anticuerpo) se liga al mismo epítopo, o esencialmente al mismo epítopo, en VEGF como un anticuerpo de la invención. En otra modalidad, un agente de ligación a VEGF es un anticuerpo que se liga a un epítopo en VEGF que se traslapa con el epítopo en el VEGF ligado por un anticuerpo de la invención. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF (por ejemplo, un anticuerpo) se liga al mismo epítopo, o esencialmente al mismo epítopo, en VEGF como el anticuerpo 219R45. En otra modalidad, el agente de ligación a VEGF es un anticuerpo que se liga a un epítopo en VEGF que se traslapa con el epítopo en el VEGF ligado por el anticuerpo 219R45.
En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF inhibe la ligación de VEGF a por lo menos un receptor VEGF. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF inhibe la ligación de VEGF humano a VEGFR-1 o VEGFR-2. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF se liga específicamente VEGF y modula la angiogénesis . En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF se liga específicamente VEGF e inhibe la angiogénesis. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF se liga específicamente VEGF e inhibe el crecimiento tumoral.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un agente de ligación a DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) que se liga específicamente al DLL4 humano, en donde el agente de ligación a DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco, y/o seis de las CDRs del anticuerpo 21R79 (véase la Tabla 2) . En algunas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende una o más de las CDRs 21R79, dos o más de las CDRs 21R79, tres o más de las CDRs 21R79, cuatro o más de las CDRs 21R79, cinco o más de las CDRs 21R79, o seis de las CDRs 21R79. En ciertas modalidades, la invención proporciona un agente de ligación a DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) que se liga específicamente DLL4 humano, en donde el agente de ligación a DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) comprende una, dos , tres, cuatro, cinco, y/o seis de las CDRs del anticuerpo (véase la Tabla 2) . En algunas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende una o más de las CDRs 21R75, dos o más de las CDRs 21R75, tres o más de las CDRs 21R75, cuatro o más de las 21R75, cinco o más de las CDRs 21R75, o seis de las CDRs 21R75. En ciertas modalidades, la invención proporciona un agente de ligación a DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) que se liga específicamente al DLL4 humano, en donde el agente de ligación a DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) comprende una, dos, tres, cuatro, cinco y/o seis de las CDRs del anticuerpo 21R83 (véase la Tabla 2) . En algunas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende una o más de las CDRs 21R83, dos o más de las CDRs 21R83, tres o más de las CDRs 21R83, cuatro o más de las CDRs 21R83, cinco o más de las CDRs 21R83, o seis de las CDRs de 21R83. En algunas modalidades, el agente de ligación a DLL4 se liga a DLL4 humano y DLL4 de ratón.
Tabla 2 En ciertas modalidades, la CDR1 de cadena pesada del anticuerpo de ligación a DLL4 es una HC CDR1 mínima que comprende AYYIH (SEQ ID NO: 79).
En algunas modalidades, el agente de ligación es un anticuerpo que se liga al DLL4 humano y comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13) o AYYIH (SEQ ID NO: 79), una CDR2 de cadena pesada que comprende YIX1X2YX3X4ATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 80), en donde ?? es serina o alanina, X2 es serina, asparagina, o glicina, X3 es asparagina o lisina, y X4 es glicina, arginina, o ácido aspártico, y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16) ; y una CDR1 de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID N0:20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22) .
En ciertas modalidades, la invención proporciona un agente de ligación a DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) que se liga específicamente DLL4 humano, en donde el agente de ligación a DLL4 comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 14), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16). En algunas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende además una CDR1 de cadena ligera que comprende RASESVD YGISFMK (SEQ ID NO: 20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVP TFGG (SEQ ID NO: 22) . En ciertas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 14), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16), y (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO: 20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21) , y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22) .
En ciertas modalidades, la invención proporciona un agente de ligación a DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) que se liga específicamente DLL4 humano, en donde el agente de ligación a DLL4 comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido; (b) una CDR2 de cadena pesada que comprende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:14), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido; (c) una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido; (d) una CDR1 de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido; (e) una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21) , o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido; y (f) una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido. En ciertas modalidades, las sustituciones de aminoácido son sustituciones conservadoras.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un agente de ligación a DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) que se liga específicamente DLL4 , en donde el agente de ligación a DLL4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 10, y una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 97%, o por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 10. En ciertas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 97%, o por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 10, y una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 10, y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende una región variable de cadena pesada que consiste esencialmente de SEQ ID NO: 10, y una región variable de cadena ligera que consiste esencialmente de SEQ ID NO: 12. En algunas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 48, y una cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 8. En algunas modalidades, el anticuerpo de ligación a DLL4 u otro agente comprende una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 6, y una cadena ligera que comprende SEQ ID NO : 8. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un agente de ligación a DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) que se liga específicamente DLL4 humano, en donde el agente de ligación a DLL4 comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 59), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16). En algunas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende además una CDR1 de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID N0:21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22) . En ciertas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 59), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16), y (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO: 20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVP TFGG (SEQ ID NO: 22) .
En ciertas modalidades, la invención proporciona un agente de ligación a DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) que se liga específicamente DLL4 humano, en donde el agente de ligación a DLL4 comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende AYYIH (SEQ ID NO: 13), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido; (b) una CDR2 de cadena pesada que comprende YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO:59), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido; (c) una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido; (d) una CDR1 de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido; (e) una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21) , o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido; y (f) una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVP TFGG (SEQ ID NO: 22), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido. En ciertas modalidades, las sustituciones de aminoácido son sustituciones conservadoras.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un agente de ligación a DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) que se liga específicamente DLL4 , en donde el agente de ligación a DLL4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 58, y una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 97%, o por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 58. En ciertas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 97%, o por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 58, y una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 58, y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende una región variable de cadena pesada que consiste esencialmente de SEQ ID NO: 58, y una región variable de cadena ligera que consiste esencialmente de SEQ ID NO: 12. En algunas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 56, y una cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 8.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un agente de ligación a DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) que se liga específicamente DLL4 humano, en donde el agente de ligación a DLL4 comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 65), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16) . En algunas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende además una CDR1 de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22) . En ciertas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 65), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16), y (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO: 20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22) .
En ciertas modalidades, la invención proporciona un agente de ligación a DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) que se liga específicamente DLL4 humano, en donde el agente de ligación a DLL4 comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido; (b) una CDR2 de cadena pesada que comprende YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID N0:65), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido; (c) una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVG DY (SEQ ID NO: 16), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido; (d) una CDR1 de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido; (e) una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21) , o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido; y (f) una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones de aminoácido. En ciertas modalidades, las sustituciones de aminoácido son sustituciones conservadoras.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un agente de ligación a DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) que se liga específicamente DLL4 , en donde el agente de ligación a DLL4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 64, y una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 97%, o por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 64. En ciertas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 97%, o por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 64, y una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 64, y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende una región variable de cadena pesada que consiste esencialmente de SEQ ID NO: 64, y una región variable de cadena ligera que consiste esencialmente de SEQ ID NO: 12. En algunas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 62, y una cadena ligera que comprende SEQ ID NO : 8. En algunas modalidades, el agente es un anticuerpo biespecífico .
En algunas modalidades, el agente de ligación a DLL4 es un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 5, y una cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 8. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico .
En algunas modalidades, el agente de ligación a DLL4 se liga a DLL4 con una KD de 25nM o menor. En algunas modalidades, el agente de ligación a DLL4 se liga a DLL4 con una KD de ???? o menor. En algunas modalidades, el agente de ligación a DLL4 se liga a DLL4 con una KD de aproximadamente InM o menor. En algunas modalidades, el agente de ligación a DLL4 se liga a DLL4 con una KD de aproximadamente 0. InM o menor. En algunas modalidades, el agente de ligación a DLL4 se liga a DLL4 con una KD de aproximadamente O.OlnM o menor. En algunas modalidades, por lo menos residuo de aminoácido en por lo menos una CDR del agente de ligación a DLL4 se sustituye con un aminoácido diferente de modo que la afinidad de agente de ligación a DLL4 para DLL4 se altera. En algunas modalidades, la afinidad del agente de ligación a DLL4 se incrementa. En algunas modalidades, la afinidad del agente de ligación a DLL4 se disminuye.
En ciertas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera del anticuerpo 21R79. En ciertas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo 21R79 (con o sin la secuencia líder). En ciertas modalidades, el agente de ligación a DLL4 es el anticuerpo 21R79.
En ciertas modalidades, un agente de ligación a DLL4 comprende, que consiste esencialmente de, o consiste de, el anticuerpo 21R79.
En ciertas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera del anticuerpo 21R75. En ciertas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo 21R75 (con o sin la secuencia líder). En ciertas modalidades, el agente de ligación a DLL4 es el anticuerpo 21R75.
En ciertas modalidades, un agente de ligación a DLL4 comprende, que consiste esencialmente de, o consiste de, el anticuerpo 21R75.
En ciertas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera del anticuerpo 21R83. En ciertas modalidades, el agente de ligación a DLL4 comprende la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo 21R83 (con o sin la secuencia líder) . En ciertas modalidades, el agente de ligación a DLL4 es el anticuerpo 21R83.
En ciertas modalidades, un agente de ligación a DLL4 comprende, que consiste esencialmente de, o consiste de, el anticuerpo 21R83.
En algunas modalidades, un agente de ligación a DLL4 se liga a un fragmento N-terminal de DLL4 humano (aminoácidos 1-191 de SEQ ID NO: 24) . En algunas modalidades, el agente de ligación a DLL4 se liga a un epítopo que comprende los aminoácidos 40-47 de SEQ ID NO: 25. En algunas modalidades, el agente de ligación a DLL4 se liga a un epítopo que comprende los aminoácidos 113-120 de SEQ ID NO: 25. En algunas modalidades, el agente de ligación a DLL4 se liga a un epítopo que comprende los aminoácidos 40-47 de SEQ ID NO: 25 y los aminoácidos 113-120 d SEQ ID NO: 25.
En ciertas modalidades, un agente de ligación a DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) se liga al mismo epítopo, o esencialmente al mismo epítopo, en DLL4 as un anticuerpo de la invención. En otra modalidad, un agente de ligación a DLL4 es un anticuerpo que se liga a un epítopo en DLL4 que se traslapa por el epítopo en DLL4 ligado por un anticuerpo de la invención. En ciertas modalidades, un agente de ligación a DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) se liga al mismo epítopo, o esencialmente al mismo epítopo, en DLL4 como el anticuerpo 21R79. En otra modalidad, el agente de ligación a DLL4 es un anticuerpo que se liga a un epítopo en DLL4 que se traslapa por el epítopo en DLL4 ligado por el anticuerpo 21R79. En ciertas modalidades, un agente de ligación a DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) se liga al mismo epítopo, o esencialmente al mismo epítopo, en DLL4 como un anticuerpo 21R75. En otra modalidad, el agente de ligación a DLL4 es un anticuerpo que se liga a un epítopo en DLL4 que se traslapa por el epítopo en DLL4 ligado por el anticuerpo 21R75. En ciertas modalidades, un agente de ligación a DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) se liga al mismo epítopo, o esencialmente al mismo epítopo, en DLL4 como el anticuerpo 21R83. En otra modalidad, el agente de ligación a DLL4 es un anticuerpo que se liga a un epítopo en DLL4 que se traslapa por el epítopo en DLL4 ligado por el anticuerpo 21R83.
En algunas modalidades, el agente de ligación a DLL4 inhibe la ligación de DLL4 a por lo menos un receptor Notch. En ciertas modalidades, el receptor Notch es Notchl, Notch2, Notch3, o Notch4. En algunas modalidades, el agente de ligación a DLL4 se liga específicamente DLL4 e inhibe la actividad de DLL4. En algunas modalidades, el agente de ligación a DLL4 se liga específicamente DLL4 e inhibe la señalización Notch. En algunas modalidades, el agente de ligación a DLL4 se liga específicamente DLL4 y modula la angiogénesis . En algunas modalidades, el agente de ligación a DLL4 se liga específicamente DLL4 e inhibe el crecimiento tumoral . En algunas modalidades, el agente de ligación a DLL4 se liga específicamente DLL4 e inhibe la tumorigenicidad. En algunas modalidades, el agente de ligación a DLL4 se liga específicamente DLL4 y reduce el número de frecuencia de CSCs en un tumor.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un agente de ligación a VEGF/DLL4 que es un anticuerpo biespecífico . En algunas modalidades, el agente de ligación VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente al VEGF humano. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de ligación a antígeno que se liga a un objetivo asociado al tumor. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende: un primer sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a VEGF humano, en donde el primer sitio de ligación a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende NYWMH (SEQ ID NO: 17), una CDR2 de cadena pesada que comprende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO: 18), y una CDR3 de cadena pesada que comprende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO: 19). En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende además: una CDR1 de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22) . En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende: un primer sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a VEGF humano, en donde el primer sitio de ligación a antígeno comprende (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende NYWMH (SEQ ID NO: 17), una CDR2 de cadena pesada que comprende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO: 18), y una CDR3 de cadena pesada que comprende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO: 19), y (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID N0:20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21) , y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22).
En algunas modalidades, el agente de ligación VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 11. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende además una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 biespecífico comprende una primera región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 97%, o por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 11, y una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 97%, o por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un agente de ligación a VEGF/DLL4 que es un anticuerpo biespecífico . En algunas modalidades, el agente de ligación VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente DLL4 humano. En algunas modalidades, el agente de ligación VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente DLL4 humano y un segundo sitio de ligación a antígeno que se liga a un objetivo asociado a tumor. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende: un primer sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a DLL4 humano, en donde el primer sitio de ligación a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO:13) o AYYIH (SEQ ID NO:79), una CDR2 de cadena pesada que comprende YIX1X2YX3X4ATNYNQKFKG (SEQ ID N0:80), en donde Xi es serina o alanina, X2 es serina, asparagina, o glicina, X3 es asparagina o lisina, y X es glicina, arginina, o ácido aspártico y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16); y una CDRl de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO: 20) , una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22). En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende: un primer sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente DLL4 humano, en donde el primer sitio de ligación a antígeno comprende una CDRl de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 14), YISSYNGATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 15), YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 59), o YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 65), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16). En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende un primer sitio de ligación a antígeno que comprende una CDRl de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 14), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16) . En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende un primer sitio de ligación a antígeno que comprende una CDRl de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO:13), una CDR2 de cadena pesada que comprende YISSYNGATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 15), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVG DY (SEQ ID NO: 16). En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende un primer sitio de ligación a antígeno que comprende una CDRl de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 59), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID N0:16). En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende un primer sitio de ligación a antígeno que comprende una CDRl de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 65), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16). En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende además: una CDRl de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO: 20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22). En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende: un primer sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente DLL4 humano, en donde el primer sitio de ligación a antígeno comprende (a) una CDRl de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 14), YISSYNGATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 15), YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 59), o YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 65), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16), y (b) una CDRl de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO: 20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22) .
En algunas modalidades, el agente de ligación VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 58, o SEQ ID NO: 64. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende además una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 biespecífico comprende una primera región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 97%, o por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 58, o SEQ ID NO: 64; y/o una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 97%, o por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia a SEQ ID NO:12.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico) que se liga específicamente al VEGF humano y DLL4 humano. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende: a) un primer sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a VEGF humano, y b) un segundo sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a DLL4 humano, en donde el primer sitio de ligación a antígeno comprende una CDRl de cadena pesada que comprende NYWMH (SEQ ID NO: 17), una CDR2 de cadena pesada que comprende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO: 18), y una CDR3 de cadena pesada que comprende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO: 19); en donde el segundo sitio de ligación a antígeno comprende una CDRl de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13) o AYYIH (SEQ ID NO: 79), una CDR2 de cadena pesada que comprende YIX1X2YX3X4ATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 80), en donde Xi es serina o alanina, X2 es serina, asparagina, o glicina, X3 es asparagina o lisina, y X4 es glicina, arginina, o ácido aspártico, y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16); y una CDRl de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO: 20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22). En algunas modalidades, un anticuerpo biespecífico comprende un primer sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a VEGF humano, y un segundo sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a DLL4 humano, en donde el primer sitio de ligación a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende NYWMH (SEQ ID NO: 17), una CDR2 de cadena pesada que comprende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO: 18), y una CDR3 de cadena pesada que comprende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO: 19), y el segundo sitio de ligación a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 14), YISSYNGATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 15), YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO:59), o YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:65), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16); y en donde tanto el primero como el segundo sitios de ligación a antígeno comprenden una CDR1 de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO: 20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22) .
En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende un primer sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a VEGF humano, y un segundo sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a DLL4 humano, en donde el primer sitio de ligación a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende NYWMH (SEQ ID NO: 17), una CDR2 de cadena pesada que comprende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO: 18), y una CDR3 de cadena pesada que comprende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO: 19), y el segundo sitio de ligación a antígeno comprende una CDRl de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 14), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16); y en donde tanto el primero como el segundo sitios de ligación a antígeno comprenden una CDRl de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO: 20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21) , y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22) . En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico es 219R45-MB-21R79.
En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende un primer sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a VEGF humano, y un segundo sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a DLL4 humano, en donde el primer sitio de ligación a antígeno comprende una CDRl de cadena pesada que comprende NYWMH (SEQ ID NO: 17), una CDR2 de cadena pesada que comprende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO: 18) , y una CDR3 de cadena pesada que comprende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID N0:19), y el segundo sitio de ligación a antígeno comprende una CDRl de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende YISSYNGATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 15), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16); y en donde tanto el primero como el segundo sitios de ligación a antígeno comprenden una CDRl de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO: 20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVP TFGG (SEQ ID NO: 22) . En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico es 219R45-MB-21M18.
En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende un primer sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a VEGF humano, y un segundo sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a DLL4 humano, en donde el primer sitio de ligación a antígeno que comprende una CDRl de cadena pesada que comprende NYWMH (SEQ ID NO:17), una CDR2 de cadena pesada que comprende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO: 18), y una CDR3 de cadena pesada que comprende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO: 19), y el segundo sitio de ligación a antígeno comprende una CDRl de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 59), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16); y en donde tanto el primero como el segundo sitios de ligación a antígeno comprenden una CDRl de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO: 20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22) . En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico es 219R45-MB-21R75.
En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende un primer sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a VEGF humano, y un segundo sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a DLL4 humano, en donde el primer sitio de ligación a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende NYWMH (SEQ ID NO: 17), una CDR2 de cadena pesada que comprende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO: 18), y una CDR3 de cadena pesada que comprende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO: 19), y el segundo sitio de ligación a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 65), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16); y en donde tanto el primero como el segundo sitios de ligación a antígeno comprenden una CDR1 de cadena ligera que comprende RASESVD YGISFMK (SEQ ID NO:20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22) . En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico es 219R45-MB-21R83.
En algunas modalidades, el agente de ligación VEGF/DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico) comprende una primera región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 11, una segunda región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 58, O SEQ ID NO: 64, y una primera y una segunda región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 biespecífico comprende una primera región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 97%, o por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 11; una segunda región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 97%, o por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 58, o SEQ ID NO: 64; y una primera y una segunda región variable de cadena ligera que tiene por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 97%, o por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 biespecífico comprende una primera región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 11, una segunda región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 9, y una primera y una segunda región variable de cadena ligera que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 biespecífico comprende una primera región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 11, una segunda región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 10, y una primera y una segunda región variable de cadena ligera que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 biespecífico comprende una primera región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 11, una segunda región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 58, y una primera y una segunda región variable de cadena ligera que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 biespecífico comprende una primera región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 11, una segunda región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 64, y una primera y una segunda región variable de cadena ligera que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO : 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 biespecífico comprende una primera región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 11, una segunda región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 9, y una primera y una segunda región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 biespecífico comprende una primera región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 11, una segunda región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 10, y una primera y una segunda región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 biespecífico comprende una primera región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 11, una segunda región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 58, y una primera y una segunda región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 biespecífico comprende una primera región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 11, una segunda región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 64, y una primera y una segunda región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 biespecífico comprende una primera región variable de cadena pesada que consiste esencialmente de SEQ ID NO: 11, una segunda región variable de cadena pesada que consiste esencialmente de SEQ ID NO: 9, y una primera y una segunda región variable de cadena ligera que consiste esencialmente de SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 biespecífico comprende una primera región variable de cadena pesada que consiste esencialmente de SEQ ID NO: 11, una segunda región variable de cadena pesada que consiste esencialmente de SEQ ID NO: 10, y una primera y una segunda región variable de cadena ligera que consiste esencialmente de SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 biespecífico comprende una primera región variable de cadena pesada que consiste esencialmente de SEQ ID NO: 11, una segunda región variable de cadena pesada que consiste esencialmente de SEQ ID NO: 58, y una primera y una segunda región variable de cadena ligera que consiste esencialmente de SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 biespecífico comprende una primera región variable de cadena pesada que consiste esencialmente de SEQ ID NO: 11, una segunda región variable de cadena pesada que consiste esencialmente de SEQ ID NO: 64, y una primera y una segunda región variable de cadena ligera que consiste esencialmente de SEQ ID NO: 12.
En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende una región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-VEGF 219R45. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende una región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-DLL4 21M18. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende una región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-DLL4 21R79. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende una región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-DLL4 21R75. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende una región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-DLL4 21R83. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende una región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-VEGF 219R45, una región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-DLL4 21R79 y dos regiones variables de cadena ligera idénticas. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende una región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-VEGF 219R45, una región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-DLL4 21M18 y dos regiones variables de cadena ligera idénticas. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende una región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-VEGF 219 45, una región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-DLL4 21R75 y dos regiones variables de cadena ligera idénticas. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende una región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-VEGF 219R45, una región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-DLL4 21R83 y dos regiones variables de cadena ligera idénticas .
En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio CH3 y un segundo dominio CH3 , cada uno de los cuales se modifica para promover la formación de heteromultímeros . En algunas modalidades, el primero y segundo dominios CH3 se modifican usando una técnica de perillas en agujeros. En algunas modalidades, el primero y segundo dominios CH3 comprenden cambios en los aminoácidos que dan por resultado interacciones electrostáticas alteradas. En algunas modalidades, el primero y segundo dominios CH3 comprenden cambios en los aminoácidos que dan por resultado interacciones hidrofóbicas/hidrofílicas alteradas .
En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende regiones constantes de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste de: (a) una primera región constante IgGl humana, en donde los aminoácidos en las posiciones 253 y 292 se sustituyen con glutamato o aspartato, y una segunda región constante IgGl humana, en donde los aminoácidos en las posiciones 240 y 282 se sustituyen con lisina; (b) una primera región constante IgG2 humana, en donde los aminoácidos en las posiciones 249 y 288 se sustituyen con glutamato o aspartato, y una segunda región constante IgG2 humana en donde los aminoácidos en las posiciones 236 y 278 se sustituyen con lisina; (c) una primera región constante IgG3 humana, en donde los aminoácidos en las posiciones 300 y 339 se sustituyen con glutamato o aspartato, y una segunda región constante IgG3 humana en donde los aminoácidos en las posiciones 287 y 329 se sustituyen con lisina; y (d) una primera región constante IgG4 humana, en donde los aminoácidos en las posiciones 250 y 289 se sustituyen con glutamato o aspartato, y una segunda región constante IgG4 humana en donde los aminoácidos en las posiciones 237 y 279 se sustituyen con lisina.
En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región constante IgGl humana con sustituciones de aminoácido en las posiciones 253 y 292, en donde los aminoácidos son glutamato o aspartato, y una segunda región constante IgGl humana con sustituciones de aminoácido en las posiciones 240 y 282, en donde los aminoácidos son lisina. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región constante IgG2 humana con sustituciones de aminoácido en las posiciones 249 y 288, en donde los aminoácidos son glutamato o aspartato, y una segunda región constante IgG2 humana con sustituciones de aminoácido en las posiciones 236 y 278, en donde los aminoácidos son lisina. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región constante IgG3 humana con sustituciones de aminoácido en las posiciones 300 y 339, en donde los aminoácidos son glutamato o aspartato, y una segunda región constante IgG2 humana con sustituciones de aminoácido en las posiciones 287 y 329, en donde los aminoácidos son lisina. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región constante IgG4 humana con sustituciones de aminoácido en las posiciones 250 y 289, en donde los aminoácidos son glutamato o aspartato, y una segunda región constante IgG4 humana con sustituciones de aminoácido en las posiciones 237 y 279, en donde los aminoácidos son lisina.
En algunas -- modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región constante IgG2 humana con sustituciones de aminoácido en las posiciones 249 y 288, en donde los aminoácidos son glutamato, y una segunda región constante IgG2 humana con sustituciones de aminoácido en las posiciones 236 y 278, en donde los aminoácidos son lisina. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región constante IgG2 humana con sustituciones de aminoácido en las posiciones 249 y 288, en donde los aminoácidos son aspartato, y una segunda región constante IgG2 humana con sustituciones de aminoácido en las posiciones 236 y 278, en donde los aminoácidos son lisina.
En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende una cadena pesada de SEQ ID NO: 7. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende una cadena pesada de SEQ ID NO: 5. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende una cadena pesada de SEQ ID NO: 56. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende una cadena pesada de SEQ ID NO:62. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende además una cadena ligera de SEQ ID NO: 12. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende una cadena pesada de SEQ ID NO: 7, una cadena pesada de SEQ ID NO: 5, y dos cadenas ligeras de SEQ ID NO: 8. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende una cadena pesada de SEQ ID NO: 7, una cadena pesada de SEQ ID NO: 6, y dos cadenas ligeras de SEQ ID NO : 8. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende una cadena pesada de SEQ ID NO: 7, una cadena pesada de SEQ ID NO: 56, y dos cadenas ligeras de SEQ ID NO: 8. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende una cadena pesada de SEQ ID NO: 7, una cadena pesada de SEQ ID NO: 62, y dos cadenas ligeras de SEQ ID NO : 8.
En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que se liga a VEGF con una KD de aproximadamente 50nM o menor, aproximadamente 25nM o menor, aproximadamente ???? o menor, aproximadamente InM o menor, o aproximadamente 0. InM o menor. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que se liga a DLL4 con una KD de aproximadamente 50nM o menor, aproximadamente 25nM o menor, aproximadamente 10n o menor, aproximadamente InM o menor, o aproximadamente 0. InM o menor. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que se liga a VEGF con una KD de aproximadamente 50nM o menor y se liga a DLL4 con una KD de aproximadamente 50nM o menor.
En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico se liga a VEGF con una KD de aproximadamente 25nM o menor y se liga a DLL4 con una ¾ de aproximadamente 25nM o menor. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico se liga a VEGF con una KD de aproximadamente ???? o menor y se liga a DLL4 con una KD de aproximadamente ???? o menor. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico se liga a VEGF con una KD de aproximadamente InM o menor y se liga a DLL4 con una KD de aproximadamente InM o menor.
En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende un sitio de ligación a antígeno con una afinidad de ligación que es más débil que la afinidad de ligación del segundo sitio de ligación a antígeno. Por ejemplo, en algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico puede ligarse a VEGF con una KD que varía de aproximadamente 0. InM a InM y puede ligarse a DLL4 con una KD que varía de aproximadamente InM a ????. O el anticuerpo biespecífico puede ligarse a VEGF con una KD que varía de aproximadamente InM a ???? y puede ligarse a DLL4 con una KD que varía de aproximadamente 0. InM a InM. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico puede ligarse a DLL4 con una KD que varía de aproximadamente 0. InM a InM y puede ligarse a VEGF con una KD que varía de aproximadamente InM a ????. O el anticuerpo biespecífico puede ligarse a DLL4 con una KD que varía de aproximadamente InM a ???? y puede ligarse a VEGF con una KD que varía de aproximadamente 0. InM a InM en algunas modalidades, la diferencia en la afinidad entre los dos sitios de ligación a antígeno puede ser de aproximadamente 2 veces o más, ap oximadamente 3 veces o más, aproximadamente 5 veces o más, aproximadamente 8 veces o más, aproximadamente 10 veces o más, aproximadamente 15 veces o más, aproximadamente 30 veces o más, aproximadamente 50 veces o más, o aproximadamente 100 veces o más. En algunas modalidades, por lo menos residuo de aminoácido en por lo menos una CDR del sitio de ligación a antígeno para VEGF se sustituye con un aminoácido diferente de modo que la afinidad del sitio de ligación a antígeno se altera. En algunas modalidades, la afinidad del sitio de ligación a VEGF se incrementa. En algunas modalidades, la afinidad del sitio de ligación a VEGF se disminuye. En algunas modalidades, por lo menos residuo de aminoácido en por lo menos una CDR del sitio de ligación a antígeno para DLL4 se sustituye con un aminoácido diferente de modo que la afinidad del sitio de ligación a DLL4 se altera. En algunas modalidades, la afinidad del sitio de ligación a DLL4 se incrementa. En algunas modalidades, la afinidad del sitio de ligación a DLL4 se disminuye. En algunas modalidades, las afinidades de los sitios de ligación a antígeno de tanto el VEGF como DLL4 se alteARNn.
La invención proporciona polipéptidos, que incluyen pero no se limitan a anticuerpos, que se ligan específicamente a VEGF y/o DLL4. En algunas modalidades, un polipéptido se liga a VEGF humano. En algunas modalidades, un polipéptido se liga a DLL4 humano. En algunas modalidades, un polipéptido se liga a VEGF humano y VEGF de ratón. En algunas modalidades, un polipéptido se liga a DLL4 humano y DLL4 de ratón.
En algunas modalidades, un agente de ligación a VEGF comprende un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 47, y SEQ ID NO: 49.
En algunas modalidades, un agente de ligación a DLL4 comprende un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID N0:4, SEQ ID NO : 5 , SEQ NO ID : 6 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, y SEQ ID NO: 64.
En algunas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 comprende un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:l, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, y SEQ ID NO: 64.
En algunas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 comprende un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:l, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, y SEQ ID NO: 64. En algunas modalidades, el agente de ligación VEGF/DLL4 comprende además un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 47, y SEQ ID NO: 49. En algunas modalidades, el agente de ligación VEGF/DLL4 comprende además un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 8, y SEQ ID NO: 12.
En algunas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 comprende un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 47, y SEQ ID NO: 49. En algunas modalidades, el agente de ligación VEGF/DLL4 comprende además un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:l, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, y SEQ ID NO: 64. En algunas modalidades, el agente de ligación VEGF/DLL4 comprende además un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID N0:4, SEQ ID NO: 8, y SEQ ID NO: 12.
En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, anticuerpo) compite para la ligación específica a VEGF con un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 11 y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 compite con un anticuerpo 219R45 para la ligación específica a VEGF humano. En algunas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 o anticuerpo compite para la ligación específica a VEGF en un ensayo de ligación específica competitiva. En algunas modalidades, el VEGF es VEGF humano. En algunas modalidades, el VEGF es VEGF de ratón.
En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF-DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) se liga al mismo epítopo, o esencialmente al mismo epítopo, en VEGF as un anticuerpo de la invención. En otra modalidad, un agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo que se liga a un epítopo en VEGF que se traslapa por el epítopo en VEGF ligado por un anticuerpo de la invención. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) se liga al mismo epítopo, o esencialmente al mismo epítopo, en VEGF como un anticuerpo 219R45. En otra modalidad, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo que se liga a un epítopo en VEGF que se traslapa por el epítopo en VEGF ligado por anticuerpo 219R45.
En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un agente que compite para la ligación específica a VEGF con el anticuerpo 219R45 (por ejemplo, en un ensayo de ligación competitivo) .
En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, anticuerpo) compite para la ligación específica a DLL4 con un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 58, o SEQ ID NO: 64 y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO : 12. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 competes con un anticuerpo 21R79 para la ligación específica a DLL4 humano. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 competes con un anticuerpo 21R75 para la ligación específica a DLL4 humano. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 competes con un anticuerpo 21R83 para la ligación específica a DLL4 humano. En algunas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 o anticuerpo compite para la ligación específica a DLL4 en un ensayo de ligación específica competitiva. En algunas modalidades, el DLL4 es DLL4 humano. En algunas modalidades, el DLL4 es DLL4 de ratón.
En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) se liga al mismo epítopo, o esencialmente al mismo epítopo, en DLL4 como un anticuerpo de la invención. En otra modalidad, un agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo que se liga a un epítopo en DLL4 que se traslapa por el epítopo en DLL4 ligado por un anticuerpo de la invención. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 se liga al mismo epítopo, o esencialmente al mismo epítopo, en DLL4 como anticuerpo 21R79. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 se liga al mismo epítopo, o esencialmente al mismo epítopo, en DLL4 como anticuerpo 21R75. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 se liga al mismo epítopo, o esencialmente al mismo epítopo, en DLL4 como anticuerpo 21R83. En otra modalidad, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo que se liga a un epítopo en DLL4 que se traslapa por el epítopo en DLL4 ligado por anticuerpo 21R79. En otra modalidad, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo que se liga a un epítopo en DLL4 que se traslapa por el epítopo en DLL4 ligado por anticuerpo 21R75. En otra modalidad, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo que se liga a un epítopo en DLL4 que se traslapa por el epítopo en DLL4 ligado por anticuerpo 21R83.
En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un agente que compite para la ligación específica a DLL4 con el anticuerpo 21R79 (por ejemplo, en un ensayo de ligación competitivo) . En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un agente que compite para la ligación específica a DLL4 con el anticuerpo 21R75 (por ejemplo, en un ensayo de ligación competitivo) . En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un agente que compite para la ligación específica a DLL4 con el anticuerpo 21R83 (por ejemplo, en un ensayo de ligación competitivo) . En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un agente que compite para la ligación específica a DLL4 con el anticuerpo 21M18 (por ejemplo, en un ensayo de ligación competitivo) .
En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un agente que compite para la ligación específica a VEGF y/o DLL4 con el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21M18 (por ejemplo, en un ensayo de ligación competitivo) . En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un agente que compite para la ligación específica a VEGF y/o DLL4 con el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21M79 (por ejemplo, en un ensayo de ligación competitivo) . En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un agente que compite para la ligación específica a VEGF y/o DLL4 con el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21M75 (por ejemplo, en un ensayo de ligación competitivo) . En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un agente que compite para la ligación específica a VEGF y/o DLL4 con el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21 83 (por ejemplo, en un ensayo de ligación competitivo) .
En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) descrito en la presente se liga a VEGF y modula la actividad de VEGF. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un antagonista VEGF e inhibe la actividad de VEGF. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un antagonista VEGF y modula la angiogénesis . En algunas modalidades , el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un antagonista VEGF e inhibe la angiogénesis. En algunas modalidades. el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un antagonista VEGF e inhibe el crecimiento tumoral.
En ciertas modalidades , un agente de ligación a VEGF/DLL4 1 [por ejemplo, un anticuerpo) descrito en la presente se liga a DLL4 humano y modula la actividad de DLL4.
En algunas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 es un antagonista DLL4 e inhibe la actividad de DLL4. En algunas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 es un antagonista DLL4 e inhibe la actividad de Notch. En algunas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 es un antagonista DLL4 e inhibe la señalización Notch. En algunas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 es un antagonista DLL4 y modula la angiogénesis . En algunas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 es un antagonista DLL4 y promueve la angiogénesis aberrante. En algunas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 es un antagonista DLL4 e inhibe el crecimiento tumoral.
En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) descrito en la presente es un anticuerpo biespecífico que se liga a VEGF humano y modula la actividad de VEGF. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) descrito en la presente es un anticuerpo biespecífico que se liga a DLL4 humano y modula la actividad de DLL4. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) descrito en la presente es un anticuerpo biespecífico que se liga a VEGF humano y DLL4 humano y modula la actividad tanto de VEGF como DLL4. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico es un antagonista VEGF y un antagonista DLL4 e inhibe la actividad tanto de VEGF como actividad de DLL4. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico es un antagonista VEGF y un antagonista de DLL4 e inhibe la actividad de VEGF y la actividad Notch. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico es un antagonista VEGF y un antagonista DLL4 e inhibe la actividad de VEGF y la señalización Notch. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico es un antagonista VEGF y un antagonista DLL4 y modula la angiogénesis . En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico es un antagonista VEGF y un antagonista DLL4 y promueve la angiogénesis aberrante. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico es un antagonista VEGF y un antagonista DLL4 e inhibe angiogénesis. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico es un antagonista VEGF y un antagonista DLL4 e inhibe el crecimiento tumoral .
En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo o un anticuerpo biespecífico) es un antagonista de VEGF. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un antagonista de VEGF e inhibe la actividad de VEGF. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 inhibe la actividad VEGF por lo menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 20%, por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 90%, o aproximadamente 100%. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la actividad VEGF humano es un anticuerpo 219R45. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la actividad VEGF humano es un anticuerpo biespecífico que comprende el sitio de ligación a antígeno 219R45. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la actividad VEGF humano es el anticuerpo biespecífico 219R45- B-21M18. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la actividad VEGF humano es el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21R79. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la actividad VEGF humano es el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21R75. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la actividad VEGF humano es el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21R83.
En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) es un antagonista de DLL4. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un antagonista de DLL4 e inhibe la actividad de DLL4. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 inhibe la actividad de DLL4 por lo menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 20%, por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 90%, o aproximadamente 100%. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la actividad de DLL4 humano es un anticuerpo 21R79. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la actividad de DLL4 humano es un anticuerpo 21R75. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la actividad de DLL4 humano es un anticuerpo 21R83. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la actividad de DLL4 humano es un anticuerpo biespecífico que comprende el sitio de ligación a antígeno 21R79. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la actividad de DLL4 humano es un anticuerpo biespecífico que comprende el sitio de ligación a antígeno 21R75. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la actividad de DLL4 humano es un anticuerpo biespecífico que comprende el sitio de ligación a antígeno 21R83. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la actividad de DLL4 humano es el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21M18. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la actividad de DLL4 humano es el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21R79. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la actividad de DLL4 humano es el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21R75. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la actividad de DLL4 humano es el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21R83.
En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, anticuerpo) es un antagonista de la señalización Notch. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 inhibe la señalización Notch por lo menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 20%, por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 90%, o aproximadamente 100%. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la señalización Notch es un anticuerpo 21R79. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la señalización Notch es un anticuerpo 21R75. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la señalización Notch es un anticuerpo 21R83. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la señalización Notch es un anticuerpo biespecífico que comprende el sitio de ligación a antígeno 21R79. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la señalización Notch es un anticuerpo biespecífico que comprende el sitio de ligación a antígeno 21R75. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la señalización Notch es un anticuerpo biespecífico que comprende el sitio de ligación a antígeno 21R83. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la señalización Notch es el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21M18. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la señalización Notch es el anticuerpo biespecífico 219R45- B-21R79. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la señalización Notch es el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21R75. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la señalización Notch es el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21R83.
En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, anticuerpo) inhibe la ligación de VEGF a por lo menos un receptor. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 inhibe la ligación de VEGF a VEGFR-1 o VEGFR-2. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 inhibe la ligación de VEGF a por lo menos un receptor VEGF por lo menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 25%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 90%, o por lo menos aproximadamente 95%. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la ligación de VEGF humano a por lo menos un receptor VEGF es un anticuerpo 219R45. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la ligación de VEGF humano a por lo menos un receptor VEGF es un anticuerpo biespecífico que comprende el sitio de ligación a antígeno 219R45. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la ligación de VEGF humano a por lo menos un receptor VEGF es el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21M18. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la ligación de VEGF humano a por lo menos un receptor VEGF es el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21R79. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la ligación de VEGF humano a por lo menos un receptor VEGF es el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21R75. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la ligación de VEGF humano a por lo menos un receptor VEGF es el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21R83.
En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, anticuerpo) inhibe la ligación de la proteína DLL4 a por lo menos un receptor Notch. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 inhibe la ligación de DLL4 a Notchl, Notch2, Notch3 , y/o Notch4. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 inhibe la ligación de DLL4 a por lo menos un receptor Notch por lo menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 25%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 90%, o por lo menos aproximadamente 95%. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la ligación de DLL4 humano a por lo menos un receptor Notch es un anticuerpo 21R79. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la ligación de DLL4 humano a por lo menos un receptor Notch es un anticuerpo 21R75. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la ligación de DLL4 humano a por lo menos un receptor Notch es un anticuerpo 21R83. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la ligación de DLL4 humano a por lo menos un receptor Notch es un anticuerpo biespecífico que comprende el sitio de ligación a antígeno 21R79. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la ligación de DLL4 humano a por lo menos un receptor Notch es un anticuerpo biespecífico que comprende el sitio de ligación a antígeno 21R75. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la ligación de DLL4 humano a por lo menos un receptor Notch es un anticuerpo biespecífico que comprende el sitio de ligación a antígeno 21R83. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la ligación de DLL4 humano a por lo menos un receptor Notch es el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21M18. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la ligación de DLL4 humano a por lo menos un receptor Notch es el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21R79. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la ligación de DLL4 humano a por lo menos un receptor Notch es el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21R75. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que inhibe la ligación de DLL4 humano a por lo menos un receptor Notch es el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21R83.
Los ensayos in vivo e in vitro para determinar si un agente de ligación a VEGF/DLL4 (o agente de ligación a VEGF/DLL4 candidato) inhibe el VEGF o afecta la angiogénesis son conocidos en el campo. Los ensayos in vitro de angiogénesis incluyen pero no se limitan a, ensayos de proliferación de HUVEC, ensayos de formación de tubo de células endoteliales , ensayos de proliferación (o formación de brotes) , ensayos de migración de células HUVEC, y ensayos de invasión. En algunas modalidades, las células en la presencia de VEGF y la presencia de un agente de ligación a VEGF/DLL4 se comparan a las células en presencia de VEGF sin el agente de ligación a VEGF/DLL4 presente, y se evalúan para efectos en la angiogénesis (o efectos biológicos asociados con la angiogénesis) . Los ensayos in vivo de la angiogénesis incluyen, pero no se limitan a, ensayos de enchufe matrigel, ensayos de microcavidades corneales, y ensayos de membrana corioalantóica de pollo (CAM, por sus siglas en inglés) .
Los ensayos in vivo e in vitro para determinar si un agente de ligación a VEGF/DLL4 (o agente de ligación a VEGF/DLL4 candidato) inhibe la activación o señalización Notch son conocidos en el campo. Por ejemplo, los ensayos reporteros de luciferasa, basados en células que usan un vector reportero TCF/Luc que comprende múltiples copias del dominio de ligación a TCF de cadena arriba de un gen reportero de luciferasa de luciérnaga se pueden usar para medir los niveles de señalización Notch in vitro (Gazit y colaboradores, 1999, Oncogene, 18; 5959-66; TOPflash, Millipore, Billerica MA) . En algunas modalidades, un ensayo reportero de luciferasa, basado en células que usa un vector reportero a CBF/Luc que contiene múltiples copias del dominio de ligación a CBF de cadena arriba de los genes reporteros de luciferasa de luciérnaga se pueden usar. El nivel de la señalización Notch en presencia de uno o más ligandos Notch (por ejemplo, DLL4 expresado sobre la superficie de células transíectadas o proteína de fusión DLL4-FC soluble) y en presencia de un agente de ligación a VEGF/DLL4 se compara con el nivel de la señalización Notch sin el agente de ligación a VEGF/DLL4 presente.
En ciertas modalidades, los agentes de ligación a VEGF/DLL4 tienen uno o más de los siguientes efectos: inhibir la proliferación de células tumorales, inhibir el crecimiento tumoral, reducir la tumorigenicidad de un tumor, reducir la frecuencia de células madre cancerosas en un tumor, desencadenar la muerte celular de células tumorales, prevenir la metástasis de células tumorales, disminuir la supervivencia de las células tumorales, modular la angiogénesis , inhibir la angiogénesis , inhibir la angiogénesis productora, o promover la angiogénesis aberrante .
En ciertas modalidades, los agentes de ligación a VEGF/DLL4 son capaces de inhibir el crecimiento tumoral. En ciertas modalidades, los agentes de ligación a VEGF/DLL4 son capaces de inhibir el crecimiento tumoral in vivo (por ejemplo, en un modelo de ratón de xenoinjerto, y/o en un humano que tiene cáncer) . En ciertas modalidades, el crecimiento tumoral se inhibe por lo menos aproximadamente dos veces, aproximadamente tres veces, aproximadamente cinco veces, aproximadamente diez veces, aproximadamente 50 veces, aproximadamente 100 veces, o aproximadamente 1000 veces como es comparado con un tumor no tratado.
En ciertas modalidades, los agentes de ligación a VEGF/DLL4 son capaces de reducir la tumorigenicidad de un tumor. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 o anticuerpo es capaz de reducir la tumorigenicidad de un tumor que comprende células madre cancerosas en un modelo animal, tal como un modelo de xenoinjerto de ratón. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 o anticuerpo es capaz de reducir la tumorigenicidad de un tumor al disminuir el número o frecuencia de células madre cancerosas en el tumor. En ciertas modalidades, el número o frecuencia de células madre cancerosas en un tumor se reduce por lo menos aproximadamente dos veces, aproximadamente tres veces, aproximadamente cinco veces, aproximadamente diez veces, aproximadamente 50 veces, aproximadamente 100 veces, o aproximadamente 1000 veces. En ciertas modalidades, la reducción en el número o frecuencia de células madre cancerosas se determina al limitar el ensayo de dilución usando un modelo animal. Ejemplos adicionales y guía con respecto al uso para limitar los ensayos de dilución para determinar una reducción en el número o frecuencia de células madre cancerosas en un tumor se puede encontrar, por ejemplo, en el Número de Publicación Internacional O 2008/042236; Publicación de Patente de E.U.A. No. 2008/0064049; y Publicación de Patente de E.U.A. No. 2008/0178305.
En ciertas modalidades, los agentes de ligación a VEGF/DLL4 son capaces de modular la angiogénesis . En ciertas modalidades, los agentes de ligación a VEGF/DLL4 son capaces de modular la angiogénesis in vivo (por ejemplo, en un modelo de ratón de xenoinjerto, y/o en un humano que tiene cáncer) . En ciertas modalidades, los agentes de ligación a VEGF/DLL4 son capaces de inhibir la angiogénesis. En ciertas modalidades, los agentes de ligación a VEGF/DLL4 son capaces de promover la angiogénesis aberrante. En ciertas modalidades, Los agentes de ligación a VEGF/DLL4 son capaces de inhibir la angiogénesis y/o promover la angiogénesis aberrante, conduciendo a vascularización no productiva.
En ciertas modalidades, los agentes de ligación a VEGF/DLL4 descrito en la presente tiene una vida media circulante en ratones, monos cynomolgus, o humanos de por lo menos aproximadamente 2 horas, por lo menos aproximadamente 5 horas, por lo menos aproximadamente 10 horas, por lo menos aproximadamente 24 horas, por lo menos aproximadamente 3 días, por lo menos aproximadamente 1 semana, o por lo menos aproximadamente 2 semanas. En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo IgG (por ejemplo, IgGl o IgG2) que tiene una vida media circulante en ratones, monos cynomolgus, o humanos de por lo menos aproximadamente 2 horas, por lo menos aproximadamente 5 horas, por lo menos aproximadamente 10 horas, por lo menos aproximadamente 24 horas, por lo menos aproximadamente 3 días, por lo menos aproximadamente 1 semana, o por lo menos aproximadamente 2 semanas. Los métodos para incrementar (o disminuir) la vida media de agentes tales como polipéptidos y anticuerpos son conocidos en el campo. Por ejemplo, los métodos conocidos para incrementar la vida media circulante de los anticuerpos IgG incluyen la introducción de mutaciones en la región Fe que incrementa la ligación dependiente de pH del anticuerpo al receptor Fe neonatal (FcRn) en pH 6.0 (véase, por ejemplo, Publicaciones de Patente de E.U.A. Nos. 2005/0276799, 2007/0148164, y 2007/0122403) . Métodos conocidos para incrementar la vida media circulante de fragmentos de anticuerpo que carecen de la región Fe incluyen tales técnicas como PEGilación.
En algunas modalidades, los agentes de ligación a VEGF/DLL4 son anticuerpos. Los anticuerpos policlonales se pueden preparar mediante cualquier método conocido. En algunas modalidades, los anticuerpos policlonales se producen al inmunizar un animal (por ejemplo, un conejo, rata, ratón, cabra, burro) con unan un antígeno de interés (por ejemplo, un fragmento de péptido purificado, proteína recombinante de longitud completa, o proteína de fusión por múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales . El antígeno se puede conjugar opcionalmente a un portador tal como hemocianina de lapa californiana (KLH, por sus siglas en inglés) o albúmina de suero. El antígeno (con o sin una proteína portadora) se diluye en solución salina estéril y se combina usualmente con un adyuvante (por ejemplo, Adyuvante de Freund Completo o Incompleto) para formar una emulsión estable. Después de un breve de tiempo suficiente, los anticuerpos policlonales se recubren del animal inmunizado, usualmente de sangre o ascitis. Los anticuerpos policlonales se pueden purificar de suero o ascitis de acuerdo con los métodos estándares en el campo incluyendo, pero no limitado a, cromatografía por afinidad, cromatografía de intercambio de iones, electroforesis en gel y diálisis.
En algunas modalidades, los agentes de ligación a VEGF/DLL4 son anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando métodos de hibridoma conocidos por una persona de experiencia en el campo (véase por ejemplo, Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495-497). En algunas modalidades, el uso del método de hibridoma, un ratón, hámster, u otro animal hospedero apropiado, se inmuniza como se describe en lo anterior para inducir de los linfocitos la producción de anticuerpos que se ligan específicamente al antígeno de inmunización. En algunas modalidades, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. En algunas modalidades, el antígeno de inmunización puede ser una proteína humana o una porción de la misma. En algunas modalidades, el antígeno de inmunización puede ser una proteína de ratón o una porción de la misma.
Después de la inmunización, los linfocitos se aislan y se fusionan con una línea de células de mieloma adecuadas, usando, por ejemplo, polietilenglicol . Las células de hibridoma se seleccionan usando medios especializados como son conocidos en el campo y los linfocitos no fusionados y las células de mieloma no sobreviven al proceso de selección. Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales dirigidos contra específicamente un antígeno elegido se puede identificar por una variedad de métodos incluyendo, pero no limitado a, inmunoprecipitación, inmunotinción, y ensayos de ligación in vitro (por ejemplo, citometría de flujo, FACS, ELISA, y radioinmunoensayo) . Los hibridomas se pueden propagar ya sea en cultivo in vitro usando métodos estándares (J.W. Goding, 1996, Anticuerpos monoclonales: Principies and Practice, 3a Edición, Academic Press, San Diego, CA) o in vivo como tumores ascíticos en un animal. Los anticuerpos monoclonales se pueden purificar del medio de cultivo o fluido ascítico de acuerdo con los métodos estándares en la técnica incluyendo, pero no limitado a, cromatografía por afinidad, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis en gel, y diálisis.
En ciertas modalidades, anticuerpos monoclonales se pueden elaborar usando técnicas de ADN recombinantes como es conocido por una persona experta en el campo. Los polinucleótidos que codifican un anticuerpo monoclonal se aislan de células B maduras o células de hibridoma, tales como por RT-PCR usando cebadores de oligonucleótidos que amplifican específicamente los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo, y su secuencia se determina usando técnicas estándares. Los polinucleótidos aislados que codifican loas cadenas pesadas y ligeras luego se clonan en vectores de expresión adecuados que producen los anticuerpos monoclonales cuando se transfectan en células hospederas tales como E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) , o células de mieloma que de otra manera no producen proteínas de inmunoglobulina .
En ciertas otras modalidades, los anticuerpos monoclonales recombinantes, o fragmentos de los mismos, se pueden aislar de bibliotecas de expresión en fago que expresan dominios variables o CDRs de una especie deseada (véase por ejemplo, McCafferty y colaboradores, 1990, Nature, 348:552-554; Clackson y colaboradores, 1991, Nature, 352:624- 628; y Marks y colaboradores, 1991, J. Mol. Biol . , 222:581-597) .
El polinucleótido(s) que codifica un anticuerpo monoclonal se puede modificar, por ejemplo, al usar tecnología de ADN recombinante para genera anticuerpos alternativos. En algunas modalidades, los dominios constantes de las cadenas ligeras y pesadas de, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de ratón se pueden sustituir para esas regiones de, por ejemplo, un anticuerpo humano para generar un anticuerpo quimérico, o para un polipéptido no de inmunoglobulina para generar un anticuerpo de fusión. En algunas modalidades, las regiones constantes se truncan o remueven para generar el fragmento de anticuerpo deseado de un anticuerpo monoclonal. La mutagénesis dirigida al sitio o de alta densidad de la región variable se puede usar para utilizar la especificidad, afinidad, etc., de un anticuerpo monoclonal .
En algunas modalidades, un anticuerpo monoclonal contra VEGF y/o DLL4 es un anticuerpo humanizado. Típicamente, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas en las cuales los residuos de las CDRs se reemplazan por residuos de una CDR de una especie no humana (por ejemplo, ratón, rata, conejo, hámster, etc.) que tienen la especificidad deseada, afinidad, y/o capacidad de ligación usando métodos conocidos por una persona experta en el campo. En algunas modalidades, los residuos de región de estructura Fv de una inmunoglobulina humana se reemplazan con los residuos correspondientes en un anticuerpo de una especie no humana que tiene la especificidad deseada, afinidad, y/o capacidad de ligación. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado se puede modificar adicionalmente por la sustitución de residuos adicionales ya sea en la región de estructura Fv y/o dentro de los residuos no humanos reemplazados para refinar y optimizar la especificidad del anticuerpo, afinidad y/o capacidad. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de por lo menos una, y típicamente dos tres, regiones de dominio variables que contienen todas o sustancialmente todas, de las CDRs que corresponden a la inmunoglobulina no humana mientras que todas, o sustancialmente todas, de las regiones de estructuras son aquellas de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado también puede comprender por lo menos una porción de una región o dominio constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente aquella de una inmunoglobulina humana. En ciertas modalidades, tales anticuerpos humanizados se usan terapéuticamente debido a que pueden reducir la antigenicidad y respuestas de HAMA (anticuerpo anti-ratón humano) cuando se administra a un sujeto humano. Una persona experta en el campo sería capaz de obtener un anticuerpo humanizado funcional con inmunogenicidad reducida siguiendo las técnicas conocidas (véase por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 5,225,539; 5,585,089; 5,693,761; y 5,693,762).
En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos se pueden preparar directamente usando varias técnicas conocidas en el campo. En algunas modalidades, los anticuerpos humanos se pueden generar de linfocitos B humanos inmortalizados inmunizados in vitro o de linfocitos aislados de un individuo inmunizado. En cualquier caso, las células que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno objetivo se pueden generar y aislar (véase, por ejemplo, Colé y colaboradores, 1985, Anticuerpos monoclonales and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77; Boemer y colaboradores, 1991, J. Immunol . , 147:86-95; y Patentes de E.U.A. NOS. 5,750,373; 5,567,610; y 5,229,275). En algunas modalidades, el anticuerpo humano se puede seleccionar de una biblioteca en fago, donde la biblioteca en fago expresa anticuerpos humanos (Vaughan y colaboradores, 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets y colaboradores, 1998, PNAS, 95:6157-6162; Hoogenboom y Winter, 1991, J. Mol. Biol . , 227:381; Marks y colaboradores, 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Alternativamente, la tecnología de expresión en fago se puede usar para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in -vitro, de repertorios de genes de dominio variables de inmunoglobulina de donadores inmunizados. Las técnicas para la generación y uso de bibliotecas en fago de anticuerpos también se describen en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,969,108; 6,172,197; 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915; 6,593,081; 6,300,064; 6,653,068; 6,706,484; y 7,264,963; y Rothe y colaboradores, 2008, J. Mol. Bio., 376:1182-1200. Una vez que los anticuerpos se identifican, las estrategias de maduración por afinidad conocidas en el campo incluyendo pero no limitado a, transposición de cadena (Marks y colaboradores, 1992, Bio/Technology, 10:779-783) y mutagénesis dirigida al sitio, se pueden emplear para generar anticuerpos humanos de alta afinidad.
En algunas modalidades, los anticuerpos humanos se pueden hacer en ratones transgénicos que contienen sitios de inmunoglobulina humana. En la inmunización estos ratones son capaces de producir el repertorio completo de anticuerpos humanos en la ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Este procedimiento se describe en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; y 5,661,016.
Esta invención también abarca anticuerpos biespecíficos . Los anticuerpos biespecíficos son capaces de reconocer y ligar específicamente por lo menos dos antígenos o epítopos diferentes. Los epítopos diferentes pueden estar ya sea dentro de la misma molécula (por ejemplo, dos epítopos en una sola proteína) o en diferentes moléculas (por ejemplo, un epítopo en una proteína y un epítopo en una segunda proteína) . En algunas modalidades, un anticuerpo biespecífico tiene potencia mejorada como es comparado con un anticuerpo individual o una combinación de más de un anticuerpo. En algunas modalidades, un anticuerpo biespecífico tiene toxicidad reducida como es comparado con un anticuerpo individual o a una combinación de más de un anticuerpo. Es conocido por aquellas personas de experiencia en el campo que cualquier agente de ligación (por ejemplo, anticuerpo) puede tener farmacocinética única (PK) (por ejemplo, línea media circulante) . En algunas modalidades, un anticuerpo biespecífico tiene la capacidad de sincronizar la PK de dos agentes de ligación activos en donde los dos agentes de ligación individuales tienen diferentes perfiles de PK. En algunas modalidades, un anticuerpo biespecífico tiene la capacidad de concentrar las acciones de dos agentes de ligación (por ejemplo, anticuerpos) en un área común (por ejemplo, un tumor y/o entorno de tumor) . En algunas modalidades, un anticuerpo biespecífico tiene la capacidad de concentrar las acciones de dos agentes de ligación (por ejemplo, anticuerpos) a un objetivo común (por ejemplo, un tumor o una célula tumoral) . En algunas modalidades, un anticuerpo biespecífico tienen la capacidad de fijar como objetivo las acciones de dos agentes de ligación (por ejemplo, anticuerpos) a más de una ruta o función biológica.
En ciertas modalidades, el anticuerpo biespecífico se liga específicamente a VEGF y un segundo objetivo. En ciertas modalidades, el anticuerpo biespecífico se liga específicamente a DLL4 y un segundo objetivo. En ciertas modalidades, el anticuerpo biespecífico se liga específicamente a VEGF y DLL4. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico se liga específicamente a VEGF humano y DLL4 humano. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo humano monoclonal o humano humanizado. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico inhibe la angiogénesis y reduce el número o frecuencia de células madre cancerosas. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico inhibe el crecimiento de vasos sanguíneos e inhibe la maduración de vasos sanguíneos. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico previene la hiperproliferación endotelial. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico tiene toxicidad disminuida y/o efectos secundarios. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico tiene toxicidad disminuida y/o efectos secundarios como es comparado con una mezcla de los dos anticuerpos individuales o los anticuerpos como agentes individuales. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico tiene un índice terapéutico incrementado. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico tiene un índice terapéutico incrementado como es comparado con una mezcla de los dos anticuerpos individuales o los anticuerpos como agentes individuales.
En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico puede reconocer específicamente y ligarse a un primer objetivo de antígeno, (por ejemplo, DLL4) así como un segundo objetivo de antígeno, tal como una molécula efectora en un leucocito (por ejemplo, CD2 , CD3 , CD28, o B7) o un receptor Fe (por ejemplo, CD64, CD32, o CD16) para enfocar los mecanismos de defensa celulares a la célula que expresa el primer objetivo de antígeno. En algunas modalidades, los anticuerpos biespecífieos se pueden usar para dirigir los agentes de citotoxicidad a las células que expresan un antígeno objetivo particular. Estos anticuerpos poseen un sitio de ligación a antígeno (por ejemplo, a DLL4 humano) y un segundo sitio que se liga a un agente citotóxico o un quelante de radionucleídos , tal como EOTUBE, DPTA, DOTA, o TETA.
Las técnicas para hacer anticuerpos biespecíficos son conocidas por aquellas personas expertas en el campo, véase por ejemplo, Millstein y colaboradores, 1983, Nature, 305:537-539; Brennan y colaboradores, 1985, Science, 229:81; Suresh y colaboradores, 1986, Methods in Enzymol . , 121:120; Traunecker y colaboradores, 1991, EMBO J., 10:3655-3659; Shalaby y colaboradores, 1992, J. Exp. Med., 175:217-225; Kostelny y colaboradores, 1992, J. Immunol . , 148:1547-1553; Gruber y colaboradores, 1994, J. Immunol . , 152:5368; Patente de E.U.A. No. 5,731,168; Publicación Internacional No. WO 2009/089004; y Publicación de Patente de E.U.A. No. 2011/0123532. En algunas modalidades, los anticuerpos biespecíficos comprenden regiones constantes de cadena pesada o modificaciones en los aminoácidos que son parte de la interface entre las dos cadenas pesadas . En algunas modalidades, los anticuerpos biespecíficos se pueden generar usando una estrategia de "perillas en agujeros" (véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5,731,168; Ridgway y colaboradores, 1996, Prot . Engin. , 9:617-621). Algunas veces la terminología de "perillas" y "agujeros" se reemplaza con los términos "protuberancias" y "cavidades" . En algunas modalidades, los anticuerpos biespecíficos pueden comprender regiones bisagra variantes incapaces de formar ligaciones de disulfuro entre las cadenas pesadas (véase, por ejemplo, WO 2006/028936) . En algunas modalidades, las modificaciones pueden comprender cambios en los aminoácidos que dan por resultado interacciones electrostáticas alteradas. En algunas modalidades, las modificaciones pueden comprender cambios en los aminoácidos que dan por resultado interacciones hidrofóbicas/hidrofílicas alteradas .
Los anticuerpos biespecíficos pueden ser anticuerpos intactos o fragmento de anticuerpo que comprende sitios de ligación a antígeno. Los anticuerpos con más de dos valencias también se contemplan. Por ejemplo, los anticuerpos biespecífieos se pueden preparan (Tutt y colaboradores, 1991, J. Immunol., 147:60). De esta manera, en ciertas modalidades los anticuerpos a VEGF y/o DLL4 son multiespecíficos .
En ciertas modalidades, los anticuerpos (u otros polipéptidos) descritos en la presente pueden ser monoespecífieos . En ciertas modalidades, cada uno del uno o más sitios de ligación a antígeno que un anticuerpo contiene es capaz de ligarse (o ligarse) a un epítopo homólogo en diferentes proteínas.
En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo pueden tener diferentes funciones o capacidades que los anticuerpos intactos; por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden tener penetración incrementada del tumor. Varias técnicas son conocidas para la producción de los fragmentos de anticuerpo incluyendo, pero no limitado a, digestión proteolítica de anticuerpos intactos. En algunas modalidades, los fragmentos de anticuerpo incluyen un fragmento F(ab')2 producido por la digestión de pepsina de una molécula de anticuerpo. En algunas modalidades, los fragmentos de anticuerpo incluyen un fragmento Fab generado al reducir los puentes de disulfuro de un fragmento F(ab')2. En otras modalidades, los fragmentos de anticuerpo incluyen un fragmento Fab generado por el tratamiento de la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor. En ciertas modalidades, los fragmentos de anticuerpo se producen recombinantemente . En algunas modalidades, los fragmentos de anticuerpo incluyen Fv o fragmentos de Fv de cadena individual (scFv) . Los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv, y scFv se pueden expresar en y secretar de E. coli u otras células hospederas, permitiendo la producción de grandes cantidades de estos fragmentos. En algunas modalidades, los fragmentos de anticuerpo se aislan de las bibliotecas de fago de anticuerpos como se plantea en la presente. Por ejemplo, los métodos se pueden usar para la construcción de bibliotecas de expresión Fab (Huse y colaboradores, 1989, Science, 246:1275-1281) para permitir la identificación rápida y efectiva de los fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada para VEGF y/o DLL4 o derivados, fragmentos, análogos u homólogos de los mismos. En algunas modalidades, los fragmentos de anticuerpo son fragmentos de anticuerpo lineales. En ciertas modalidades, los fragmentos de anticuerpo son monoespecífieos o biespecíficos . En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un scFv. Se pueden usar varias técnicas para la producción de anticuerpos de cadena individual específicos a VEGF o DLL4 (véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 4,946,778).
Además puede ser deseable, especialmente en el caso de los fragmentos de anticuerpo, modificar un anticuerpo a fin de alterar (por ejemplo, incrementar o disminuir) su vida media en suero. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante la incorporación de un epítopo de ligación a receptor de rescate en el fragmento de anticuerpo mediante mutación de la región apropiada en el fragmento de anticuerpo o al incorporar el epítopo en una etiqueta de péptido que luego se fusiona al fragmento de anticuerpo en cualquier extremo o en la parte intermedia (por ejemplo, por síntesis de ADN o péptidos) .
Los anticuerpos heteroconjugados también están dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados se componen de dos anticuerpos covalentemente unidos. Tales anticuerpos, por ejemplo, se han propuesto para fijar como objetivo células inmunes a células no deseadas (véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 4,676,980). También se contempla que los anticuerpos heteroconjugados se pueden preparar in vitro usando métodos conocidos en la química de proteína sintética, incluyendo aquellas que implican agentes de reticulación. Por ejemplo, las inmunotoxinas se pueden construir usado una reacción de intercambio de disulfuro o al formar una ligación de tioéter. Ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4 -mercaptobutirimidato .
Para los propósitos de la presente invención, se debe apreciar que los anticuerpos modificados pueden comprender cualquier tipo de región variable que proporcione la asociación del anticuerpo con el objetivo (es decir, VEGF humano o DLL4 humano) . En este aspecto, la región variable puede comprender o ser derivado de cualquier tipo de mamífero que se pueda inducir a totalizar una respuesta humoral y generar inmunoglobulinas contra el antígeno deseado. Como tal, la región variable de los anticuerpos modificados puede ser, por ejemplo, humano, murino, primate no humano (por ejemplo, monos cynomolgus, macacos, etc.) o de origen de conejo. En algunas modalidades, tanto las regiones variables como constantes de las inmunoglobulinas modificadas son humanas. En otras modalidades, las regiones variables de los anticuerpos compatibles (usualmente derivados de una fuente no humana) se pueden diseñar o adaptar específicamente para mejorar las propiedades de ligación o para reducir la inmunogenicidad de la molécula. En este aspecto, las regiones variables útiles en la presente invención se pueden humanizar o alterar de otra manera a través de la inclusión de secuencias de aminoácido importadas.
En ciertas modalidades, los dominios variables en tanto las cadenas pesadas como ligeras se alteran por el reemplazo o por lo menos parcial de una o más CDRs y, si es necesario, por el reemplazo de la región de estructura parcial y la modificación y/o alteración de secuencia. Aunque las CDRs se pueden derivar de un anticuerpo de la misma clase o aún subclase como el anticuerpo del cual las regiones de estructura se derivan, se prevé que las CDRs se pueden derivar de un anticuerpo de diferente clase y frecuentemente de un anticuerpo de una especie diferente. Puede no ser necesario reemplazar todas las CDRs con todas las CDRs de una región variable donadora para transferir la capacidad de ligación a antígeno de un dominio variable a otro. Más bien, puede ser solo necesario transferir esos residuos que son requeridos para mantener la actividad del sitio de ligación a antígeno.
Las alteraciones a la región variable no obstante, aquellos expertos en el campo apreciarán que los anticuerpos modificados de esta invención comprenderán anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos de longitud completa o fragmentos inmunoreactivos de los mismos) en los cuales por lo menos una fracción de uno o más de los dominios de región constante se han detectado o de otra manera alterado para proporcionar características bioquímicas deseadas tales como localización incrementada de tumor o vida media de suero incrementada cuando se compara con anticuerpo de aproximadamente la misma inmunogenicidad que comprende una región constante relativa o inalterada. En algunas modalidades, la región constante de los anticuerpos modificados comprenderá una región constante humana. Las modificaciones a la región constante compatible con esta invención comprenden adiciones, supresiones o sustituciones de uno o más aminoácidos en uno o más dominios. Los anticuerpos modificados dados a conocer en la presente pueden contener alteraciones o modificaciones a uno o más de los tres dominios constantes de cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) y/o al dominio constante de cadena ligera (CL) . En algunas modalidades, uno o más dominios se suprimen parcial o completamente de las regiones constantes de los anticuerpos modificados. En algunas modalidades, los anticuerpos modificados comprenderán constructos o variantes suprimidos de dominio en donde el dominio CH2 completo se ha removido (constructos ACH2) . En algunas modalidades, el dominio de región constante omitido se reemplazó por un espaciador de aminoácido corto (por ejemplo, residuos de 10 aminoácidos) que proporcionan algo de la flexibilidad molecular impartida típicamente por la región constante ausente.
En algunas modalidades, los anticuerpos modificados se diseñan para fusionar el dominio CH3 directamente a la región bisagra del anticuerpo. En otras modalidades, un espaciador de péptido se inserta entre la región bisagra y los dominios CH2 y/o CH3 modificados. Por ejemplo, los constructos se pueden expresar en donde el dominio CH2 se ha suprimido y el dominio CH3 (modificado o no modificado) se une a la región bisagra con un espaciador de 5-20 aminoácidos. Tal espaciador se puede agregar para asegura que los elementos reguladores del dominio constante permanezcan libres y accesibles o que la región bisagra permanezca flexible. Sin embargo, cabe destacar que los espaciadores de aminoácidos pueden, en algunos casos, probar ser inmunogénicos e inducen una respuesta inmune indeseada contra el constructo. Por consiguiente, en ciertas modalidades, cualquier espaciador agregado al constructo será relativamente no inmunogénico para mantener las calidades biológicas deseadas de los anticuerpos modificados.
En algunas modalidades, los anticuerpos modificados pueden tener solamente una supresión parcial de un dominio o sustitución constante de pocos o aún un aminoácido individual. Por ejemplo, la mutación de un aminoácido individual en las áreas seleccionadas del dominio CH2 puede ser suficiente para reducir sustancialmente la ligación de Fe e incrementar en consecuencia la localización de la célula cancerosa y/o penetración del tumor. Similarmente, puede ser deseable simplemente suprimir la parte de uno o más dominios de región constante que controlan una función efectora específica (por ejemplo ligación de Clq de complemento) que se modula. Tales supresiones parciales de las regiones constantes pueden mejorar las características seleccionadas del anticuerpo (vida media en suero) mientras que dejan intactas otras funciones deseables asociadas con el dominio de región constante sujeto. Por otra parte, como se alude en o anterior, las regiones constantes de los anticuerpos divulgados y dados a conocer se pueden modificar a través de la mutación o sustitución de uno o más aminoácidos que potencia el perfil del consultor resultante. En este aspecto puede ser posible alterar la actividad proporcionada por un sitio de ligación conservado (por ejemplo, ligación a Fe) mientras que mantiene sustancialmente la configuración y perfil inmunogénico del anticuerpo modificado. En ciertas modalidades, los anticuerpos modificados comprenden la adición de uno o más aminoácidos a la región constante para potenciar las características deseables tal como disminuir o incrementar la función efectora y proporcionar más sitios de unión de citotoxina o carbohidratos.
Es conocido en el campo que la región constante media varias funciones efectoras. Por ejemplo, la ligación del componente Cl del complemento a la región Fe de los anticuerpos IgG o IgM (ligados al antígeno) activa el sistema complementario. La activación del complemento es importante en la opsonización y lisis de los patógenos celulares. La activación del complemento también activa la respuesta inflamatoria y también se puede aplicar en la hipersensibilidad autoinmune. Además, la región Fe de un anticuerpo puede ligarse a una respuesta que expresa un receptor Fe (FcR) . Existe una variedad de receptores Fe que son específicos para diferentes clases de anticuerpos, incluyendo IgG (receptores gamma) , IgE (receptores épsilon) , IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu) . La ligación del anticuerpo a los receptores Fe en las superficies celulares desencadena una variedad de respuestas biológicas importantes y diversas incluyendo el agobio y destrucción de las partículas recubiertas con anticuerpo, eliminación de los complejos inmunes, lisis de las células objetivo recubiertas con anticuerpo por células exterminadoras (llamado citotoxicidad de células dependientes de anticuerpos o ADCC) , liberación de mediadores inflamatorios, transferencia placentaria y control de la producción de inmunoglobulina .
En ciertas modalidades, los anticuerpos modificados proporcionan funciones efectoras alteradas que, a su vez, afectan el perfil biológico del anticuerpo administrado. Por ejemplo, en algunas modalidades, la supresión o inactivación (a través de mutaciones puntuales u otros medios) de un dominio de región constante puede reducir la ligación del receptor Fe del anticuerpo modificado circulante incrementando de esta manera la localización de células cancerosas y/o penetración del tumor. En otras modalidades, las modificaciones de la región constante incrementan la vida media en suero del anticuerpo. En otras modalidades, las modificaciones de región constante reducen la vida media en suero del anticuerpo. En algunas modalidades, la región constante se modifica para eliminar las ligaciones de disulfuro o porciones de oligosacáridos . Las modificaciones a la región constante de acuerdo con esta invención se pueden hacer fácilmente usando técnicas de ingeniería bioquímica molecular bien conocidas por aquellas personas de experiencia en el campo.
En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 que es un anticuerpo no tiene una o más funciones efectoras. Por ejemplo, en algunas modalidades, el anticuerpo no tiene actividad de ADCC, y/o ninguna actividad de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) . En ciertas modalidades, el anticuerpo no se liga a un receptor Fe, y/o factores de complemento. En ciertas modalidades, el anticuerpo no tiene una función efectora.
La presente invención abarca además variantes equivalentes que son sustancialmente homólogos a los anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos, o fragmentos de anticuerpo de los mismos, expuestos en la presente. Estos pueden contener, por ejemplo, mutaciones de sustituciones conservadoras, es decir la sustitución de uno o más aminoácidos por aminoácidos similares. Por ejemplo, la sustitución conservadora se refiere a la sustitución de un aminoácido con otro aminoácido dentro de la misma clase general tal como, por ejemplo, un aminoácido ácido con otro aminoácido ácido, un aminoácido básico con otro aminoácido básico o un aminoácido neutro con otro aminoácido neutro. Lo que se propone para una sustitución de aminoácido conservadora es bien conocido en el campo y se describe en la presente .
De esta manera, la presente invención proporciona métodos para producir un anticuerpo que se liga a VEGF y/o DLL4 , incluyendo anticuerpos biespecíficos que se ligan específicamente a tanto VEGF como DLL4. En algunas modalidades, el método para producir un anticuerpo que se liga a VEGF y/o DLL4 comprende el uso de técnicas de hibridoma. En algunas modalidades, el método para generar un anticuerpo que se liga a VEGF o DLL4 o un anticuerpo biespecífico que se liga a VEGF y DLL4 comprende la clasificación de una biblioteca en fago humana. La presente invención proporciona además métodos para identificar un anticuerpo que se liga a VEGF y/o DLL4. En algunas modalidades, el anticuerpo se identifica por la clasificación FACS para ligarse a VEGF o una porción del mismo. En algunas modalidades, el anticuerpo se identifica por la clasificación FACS para ligarse a DLL4 o una porción del mismo. En algunas modalidades, el anticuerpo se identifica por la clasificación de FACS para ligarse tanto a VEGF como a DLL4 o una porción de los mismos. En algunas modalidades, el anticuerpo se identifica por la clasificación usando ELISA para la ligación a VEGF. En algunas modalidades, el anticuerpo se identifica por la clasificación usando el ELISA para la ligación a DLL4. En algunas modalidades, el anticuerpo se identifica por la clasificación usando el ELISA para ligarse a VEGF y DLL4. En algunas modalidades, el anticuerpo se identifica por la clasificación FACS para el bloqueo de la ligación de VEGF humano a un receptor VEGF humano. En algunas modalidades, el anticuerpo se identifica por la clasificación FACS para el bloqueo de la ligación de DLL4 humano a un receptor Notch humano. En algunas modalidades, el anticuerpo se identifica por la clasificación para la inhibición o bloqueo de la señalización Notch. En algunas modalidades, el anticuerpo se identifica por la clasificación para la inhibición o bloqueo de la actividad de VEGF (por ejemplo, inducción de proliferación de HUVEC) . En algunas modalidades, el anticuerpo se identifica por la clasificación para la modulación del angiogénesis .
En algunas modalidades, un método para generar un anticuerpo VEGF humano comprende inmunizar un mamífero con un polipéptido que comprende los aminoácidos 27-232 de VEGF humano. En algunas modalidades, un método para generar un anticuerpo a VEGF humano comprende inmunizar un mamífero con un polipéptido que comprende por lo menos una porción de los aminoácidos 27-232 del VEGF humano. En algunas modalidades, el método comprende además aislar los anticuerpos o células productoras de anticuerpos del mamífero. En algunas modalidades, un método para generar un anticuerpo monoclonal que se liga a VEGF comprende: inmunizar un mamífero con un polipéptido que comprende por lo menos una porción de los aminoácidos 27-232 del VEGF humano, y aislar las células productoras de anticuerpos del mamífero inmunizado. En algunas modalidades, el método comprende además fusionar las células productoras de anticuerpos con células de una línea de células de mieloma para formar células de hibridoma. En algunas modalidades, el método el método comprende además seleccionar una célula de hibridoma que expresa un anticuerpo que se liga al VEGF. En ciertas modalidades, el mamífero es un ratón. En algunas modalidades, el anticuerpo se selecciona usando un polipéptido que comprende por lo menos una porción de los aminoácidos 27-232 del VEGF humano.
En algunas modalidades, un método para generar un anticuerpo al DLL4 humano comprende inmunizar un mamífero con una polipéptido que comprende los aminoácidos 27-529 del DLL4 humano. En algunas modalidades, un método para generar un anticuerpo al DLL4 humano comprende inmunizar un mamífero con un polipéptido que comprende por lo menos una porción de los aminoácidos 27-529 del DLL4 humano. En algunas modalidades, un método para generar un anticuerpo monoclonal que se liga a DLL4 comprende: inmunizar un mamífero con una polipéptido que comprende por lo menos una porción de los aminoácidos 27-529 del DLL4 humano, y aislar las células productoras del anticuerpo del mamífero inmunizado. En algunas modalidades, el método comprende además fusionar las células productoras de anticuerpos con células de una línea de células de mieloma para formar células de hibridoma. En algunas modalidades, el método comprende además seleccionar una célula de hibridoma que expresa un anticuerpo que se liga a DLL4. En ciertas modalidades, el mamífero es un ratón. En algunas modalidades, el anticuerpo se selecciona usando un polipéptido que comprende por lo menos una porción de los aminoácidos 27-529 del DLL4 humano.
En algunas modalidades, un método para generar un anticuerpo a VEGF humano comprende clasificar una biblioteca de expresión de anticuerpos para anticuerpos que se ligan a VEGF humano. En algunas modalidades, un método para generar un anticuerpo DLL4 humano comprende clasificar una biblioteca de expresión de anticuerpos para anticuerpos que se ligan al DLL4 humano. En algunas modalidades, un método para generar un anticuerpo al VEGF humano y/o al DLL4 humano comprende clasificar una biblioteca de expresión de anticuerpos para anticuerpos biespecíficos que se ligan al VEGF humano y DLL4 humano. En algunas modalidades, la biblioteca de expresión de anticuerpos es una biblioteca de fagos. En algunas modalidades, la clasificación comprende inmunoplaqueteo . En algunas modalidades, la biblioteca de expresión de anticuerpos (por ejemplo, una biblioteca de fagos) se clasifica usando por lo menos una porción de los aminoácidos 27-232 del VEGF humano. En algunas modalidades, los anticuerpos identificados en la primera clasificación, se clasifican contra el uso de por lo menos una porción de los aminoácidos 27-529 del DLL4 humano para identificar un anticuerpo biespecífico que se liga a VEGF y DLL4. En algunas modalidades, la biblioteca de expresión de anticuerpos (por ejemplo, una biblioteca de fagos) se clasifica usando por lo menos una porción de los aminoácidos 27-529 del DLL4 humano. En algunas modalidades, los anticuerpos identificados en la primera clasificación, se clasifican contra el uso de por lo menos una porción de los aminoácidos 27-232 del VEGF humano para identificar un anticuerpo biespecífico que liga a VEGF y DLL4. En algunas modalidades, el anticuerpo identificado en las clasificaciones es un antagonista VEGF. En algunas modalidades, el anticuerpo identificado en la clasificación inhibe las actividades biológicas inducidas por VEGF. En algunas modalidades, el anticuerpo identificado en la clasificación es un antagonista DLL4. En algunas modalidades, el anticuerpo identificado en la clasificación inhibe la señalización Notch inducida por DLL4. En algunas modalidades, el anticuerpo identificado en la clasificación se liga tanto al VEGF humano como el VEGF de ratón. En algunas modalidades, el anticuerpo identificado en la clasificación se liga a tanto el DLL4 humano como el DLL4 de ratón.
En ciertas modalidades, los anticuerpos descritos en la presente se aislan. En ciertas modalidades, los anticuerpos descritos en la presente son sustancialmente puros.
En algunas modalidades de la presente invención, los agentes de ligación a VEGF/DLL4 son polipéptidos . Los polipéptidos pueden ser polipéptidos recombinantes , polipéptidos naturales, o polipéptidos sintéticos que comprenden un anticuerpo, o fragmento del mismo, que se ligan a VEGF y/o DLL4. Se reconocerá en el campo que algunas secuencias de aminoácidos de los agentes de ligación descritos en la presente se pueden variar sin efecto significativo en la estructura o función de la proteína. De esta manera, la invención incluye además variaciones d los polipéptidos que muestran actividad sustancial o que incluyen regiones de un anticuerpo, o fragmento del mismo, contra el VEGF humano y/o DLL4 humano. En algunas modalidades, las variaciones de secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de ligación a VEGF/DLL4 incluyen supresiones, inserciones, inversiones, repeticiones y/u otros tipos de sustituciones.
En algunas modalidades, los polipéptidos descritos en la presente se aislan. En algunas modalidades, los polipéptidos descritos en la presente son sustancialmente puros.
Los polipéptidos, análogos y variantes de los mismos, se pueden modificar adicionalmente para contener porciones químicas adicionales no normalmente parte del polipéptido. Las porciones derivadas pueden mejorar o de otra manera modular la solubilidad, la vida media biológica, y/o absorción del polipéptido. Las porciones también pueden reducir o eliminar los efectos secundarios indeseables de los polipéptidos y variantes. Un estudio general para las pociones químicas se puede encontrar en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edición, 2005, University of the Sciences, Filadelfia, PA.
El polipéptidos descrito en la presente se puede producir mediante cualquier método adecuado conocido en el campo. Tales métodos varían de métodos de síntesis de proteínas directos para construir una secuencia de ADN que codifica secuencias de polipéptidos y que expresa esa secuencia en un hospedero adecuado. En algunas modalidades, una secuencia de ADN se construye usando tecnología recombinante al aislar o al sintetizar una secuencia de ADN que codifica una proteína de tipo silvestre de interés. Opcionalmente, la secuencia se puede mutagenizar por mutagénesis específica de sitio para proporcionar análogos funcionales de la misma. Véase, por ejemplo, Zoeller y colaboradores, 1984, PNAS, 81:5662-5066 y Patente de E.U.A. No. 4,588,585.
En algunas modalidades, una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés se puede construir por síntesis química usando un sintetizador de oligonucleótidos . Los oligonucleótidos se pueden diseñar basados en la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado y al seleccionar esos codones que son favorecidos en la célula hospedera en la cual el polipép ido recombinante de interés se producirá. Métodos estándares se pueden aplicar para sintetizar una secuencia de polinucleótidos que codifican un polipéptido aislado de interés. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos completa se puede usar para construir un gen de nuevo traducido. Además, un oligómero de ADN que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido aislado particular se puede sintetizar. Por ejemplo, varios oligonucleótidos pequeños que codifican porciones de polipéptido deseado se pueden sintetizar y luego ligar. Los oligonucleótidos individuales contienen típicamente terminales 5' o 3' para el ensamblaje complementario.
Una vez ensambladas (por síntesis, mutagénesis dirigida al sitio, u otro método) , las secuencias de polinucleótidos que codifican un polipéptido particular de interés se puede insertar en un vector de expresión y ligar operativamente a una secuencia de control de expresión apropiada para expresión de la proteína en un hospedero deseado. El ensamblaje apropiado se puede confirmar por la secuenciación de nucleótidos, mapeo de enzimas de restricción, y/o expresión de un polipéptido biológicamente activo en un hospedero adecuado. Como se conoce bien en el campo, a fin de obtener niveles de expresión alta de un gen transfectado en un hospedero, el gen se debe ligar operativamente a la secuencia de control de expresión transcripcionales y/o traduccionales que son funcionales en el hospedero de expresión elegido.
En ciertas modalidades, los vectores de expresión recombinantes se usan para amplificar y expresar los anticuerpos que codifican ADN, o fragmentos de los mismos, contra el VEGF y/o DLL4 humanos. Por ejemplo, los vectores de expresión recombinantes pueden ser constructos de ADN replicables que tienen fragmentos de ADN derivados de cADN sintéticos que codifican una cadena de polipéptidos de un agente de ligación a VEGF/DLL4, tal como un anticuerpo anti-VEGF o un anticuerpo anti-DLL4, o un fragmento del mismo, ligados operativamente a un elementos reguladores transcripcionales y/o traduccionales adecuados derivados de genes de mamífero, microbiano, virales, o de insecto. Una unidad transcripcional comprende generalmente un ensamblaje de (1) un elemento genético o elementos que tienen una función reguladora en la expresión génica, por ejemplo, promotores o potenciadores transcripcionales, (2) una secuencia estructural o de codificación que se transcribe en mARN y se traduce en proteína, y (3) secuencias de inicio y terminación de transcripción y traducción apropiadas. Los elementos reguladores pueden incluir una secuencia operadora para controlar la transcripción. La capacidad de replicaciones en un hospedero, usualmente conferido por un origen de replicación, y un gene de selección para facilitar el reconocimiento de los transformantes se pueden incorporar adicionalmente . Las regiones de ADN están "operativamente ligadas" cuando se relacionan funcionalmente entre sí. Por ejemplo, el ADN para un péptido de señal (líder secretor) se liga operativamente al ADN para un polipéptido si se expresa como un percusor el cual participa en la secreción del polipéptido; un promotor se liga operativamente a una secuencia de codificación si controla una transcripción de la secuencia; o un sitio de ligación a ribosoma se liga operativamente a una secuencia de codificación y se coloca para permitir la traducción. En algunas modalidades, los elementos estructurales propuestos para el uso en los sistemas de expresión de levadura incluyen una secuencia líder que permite la secreción extracelular de la proteína traducida por una célula hospedera. En otras modalidades, en situaciones donde la proteína recombinante se expresa sin una secuencia líder o de transporte, puede incluir un residuo de metionina N-terminal. Esto residuo se puede escindir de manera opcional subsecuentemente de la proteína recombinante expresada para proporcionar un producto final.
La elección de una secuencia de control de expresión y un vector de expresión depende de la elección del hospedero. Una pre-variedad de combinaciones de hospedero/vector de expresión se pueden emplear. Los vectores de expresión útiles para los hospederos eucarióticos incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden secuencias de control de expresión de SV40, virus de papiloma bovino, adenovirus y citomegalovirus . Los vectores de expresión útiles para hospederos bacterianos incluyen plásmidos bacterianos conocidos, tales como plásmidos de E. coli incluyendo pCRl, pBR322, pMB9, y sus derivados, y plásmidos de intervalo de hospedero más amplios, tal como M13 y otros fagos de ADN de hebra individual filamentosos .
Los agentes de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, polipéptidos) de la presente invención se pueden expresar de uno o más vectores. Por ejemplo, en algunas modalidades, un polipéptido de cadena pesada se expresa por un vector, un segundo polipéptido de cadena pesada se expresa por un segundo vector y un polipéptido de cadena ligera se expresa por un tercer vector. En algunas modalidades, un primer polipéptido de cadena pesada y un polipéptido de cadena ligera se expresa por un vector y un segundo polipéptido de cadena pesada se expresa por un segundo vector. En algunas modalidades, los polipéptidos de cadena pesada se expresan por un vector y un polipéptido de cadena ligera se expresa por un segundo vector. En algunas modalidades, tres polipéptidos se expresan de un vector. De esta manera, en algunas modalidades, un primer polipéptido de cadena pesada, un segundo polipéptido de cadena pesada, y un polipéptido de cadena ligera se expresan por un vector individual.
Células hospederas adecuadas para la expresión de un polipéptido o anticuerpo de ligación a VEGF/DLL4 (o una proteína de VEGF o DLL4 para el uso como un antígeno) incluyen procariotas, células de levadura, células de insecto, o células eucarióticas superiores bajo el control de los promotores apro i dos. Los procariotas incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo E. coli o Bacillus. Las células eucarióticas superiores incluyen líneas de células establecidas de origen de mamífero como se describe a continuación. Los sistemas de traducción sin células también se emplean. Los vectores de clonación y expresión apropiados para el uso con hospederos celulares bacterianos, fúngicos, de levadura y de mamífero se describen en Pouwels y colaboradores, 1985, Cloning Vectors : A Laboratory Manual, Elsevier, New York, NY. La información adicional con respecto a los métodos de producción de proteínas, incluyendo producción de anticuerpos, se puede encontrar, por ejemplo, en la Publicación de Patente de E.U.A. No. 2008/0187954; Patentes de E.U.A. Nos. 6,413,746; 6,660,501; Publicación de Patente Internacional No. WO 04/009823.
Varios sistemas de cultivo de células de mamífero o insecto se pueden usar para expresar polipéptidos recombinantes . La expresión de proteínas recombinantes en células de mamífero puede ser deseable debido a que estas proteínas esta generalmente de manera correcta plegadas, apropiadamente modificadas y biológicamente funcionales. Ejemplos de líneas de células hospederas de mamífero adecuadas incluyen, pero no se limitan a, líneas de células COS-7 (derivadas de reunión de monos) , L-929 (derivadas de fibroblastos de murino) , C127 (derivadas de tumor mamario de murino) 3T3 (derivadas de fibroblasto de murino) , CHO (derivadas de ovario de hámster Chino) , HeLa (derivadas de cáncer cervical humanos) , BHK (derivadas de fibroblasto de riñon de hámster) , HEK-293 (derivadas de riñon embriónico humano) y variantes de estas líneas de células. Los vectores de expresión de mamífero pueden comprender elementos no transcritos tal como un origen de replicación, un promotor y potenciador adecuados ligados al gen que se expresa, y otra secuencia no transcrita de flanqueo 5' o 3' , y secuencias no traducidas 5' o 3', tal como sitio de ligación a ribosomas necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donadores de empalme y aceptores, y secuencia de terminación transcripcionales . La expresión de proteína recombinante en baculovirus también ofrece un método sólido para producir proteínas correctamente plegadas y biológicamente funcionales. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insectos son bien conocidos por aquellas personas de experiencia en el campo (véase, por ejemplo, Luckow y Summers, 1988, Bio/Technology, 6:47) .
De esta manera, la presente invención proporciona células que comprenden los agentes de ligación a VEGF/DLL4 descrito en la presente. En algunas modalidades, las células producen los agentes de ligación a VEGF/DLL4 descrito en la presente. En ciertas modalidades, las células producen un anticuerpo. En algunas modalidades, las células producen un agente de ligación a VEGF, tal como un anticuerpo anti-VEGF. En algunas modalidades, las células producen un anticuerpo biespecífico que se liga a VEGF. En algunas modalidades, las células producen un agente de ligación a DLL4 , tal como un anticuerpo anti-DLL4. En algunas modalidades, las células producen un anticuerpo biespecífico que se liga a DLL4. En ciertas modalidades, las células producen un agente de ligación a VEGF/DLL4 biespecífico, tal como un anticuerpo biespecífico que se liga a VEGF y DLL4. En ciertas modalidades, las células producen el anticuerpo 219R45. En ciertas modalidades, las células producen el anticuerpo 21R79. En ciertas modalidades, las células producen el anticuerpo 21R75. En ciertas modalidades, las células producen el anticuerpo 21R83. En ciertas modalidades, las células producen un anticuerpo biespecífico que comprende un sitio de ligación a antígeno del anticuerpo 219R45. En ciertas modalidades, las células producen un anticuerpo biespecífico que comprende un sito de ligación a antígeno del anticuerpo 21R79. En ciertas modalidades, las células producen un anticuerpo biespecífico que comprende un sitio de ligación a antígeno del anticuerpo 21R75. En ciertas modalidades, las células producen un anticuerpo biespecífico que comprende un sitio de ligación a antígeno del anticuerpo 21R83. En ciertas modalidades, las células producen un anticuerpo biespecífico que comprende un sitio de ligación a antígeno del anticuerpo 219R45 y un sitio de ligación a antígeno del anticuerpo 21R79. En ciertas modalidades, las células producen un anticuerpo biespecífico que comprende un sitio de ligación a antígeno del anticuerpo 219R45 y un sitio de ligación a antígeno del anticuerpo 21M18. En ciertas modalidades, las células producen un anticuerpo biespecífico que comprende un sitio de ligación a antígeno del anticuerpo 219R45 y un sitio de ligación a antígeno del anticuerpo 21R75. En ciertas modalidades, las células producen un anticuerpo biespecífico que comprende un sitio de ligación a antígeno del anticuerpo 219R45 y un sitio de ligación a antígeno del anticuerpo 21R83. En ciertas modalidades, las células producen el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21M18. En ciertas modalidades, las células producen el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21R79. En ciertas modalidades, las células producen el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21R75. En ciertas modalidades, las células producen el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21R83.
Las proteínas producidas por un hospedero transformado se pueden purificar de acuerdo con cualquier método adecuado. Los métodos estándares incluyen cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, de afinidad y de columna de dimensionamiento) , centrif gación, solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Las etiquetas de afinidad tal como hexa-histidina, dominio de ligación a maltosa, secuencia de recubrimiento de influenza, y glutationa-S-transíerasa se pueden unir a la proteína para permitir la fácil purificación por el pasaje sobre una columna de afinidad apropiada. La cromatografía de afinidad usada para la purificar inmunoglobulinas puede incluir cromatografía de Proteína A, Proteína G y Proteína L. las proteínas aisladas se pueden caracterizar físicamente usando tales técnicas como proteólisis, cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) , espectrometría de masas (MS, por sus siglas en inglés) , resonancia magnética nuclear (NMR, por sus siglas en inglés) , enfoque isoeléctrico (IEF, por sus siglas en inglés) , cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC, por sus siglas en inglés) , y cristalografía de rayos X. La pureza de las proteínas aisladas se pueden determinar usando técnicas conocidas por aquellas personas de experiencia en el campo, incluyendo pero no limitado a, SDS-PAGE, SEC, electroforesis en gel capilar, IEF, y enfoque isoeléctrico capilar (cIEF) .
En algunas modalidades, los sobrenadantes del sistema de expresión que secretan proteína recombinante en los medios de cultivo primero se pueden concentrar usando un filtro de concentración de proteínas comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultra filtración Amicon o Millipore Pellicon. Después de la etapa de concentración, el material concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación adecuada. En algunas modalidades, se puede emplear una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos dietilaminoetilo pendientes (DEAE) . Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa, u otros tipos empleados comúnmente en la purificación de proteínas. En algunas modalidades, se puede emplear una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores catiónicos adecuados incluyen varias matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo . En algunas modalidades, se puede emplear un medio de hidroxiapatita, incluyendo pero no limitado a, hidroxiapatita de cerámica (CHT) . En ciertas modalidades, una o más etapas de HPLC de fase inversa que emplea un medio RP-HPLC hidrofóbico, por ejemplo, gel de sílice que tienen grupos metilo pendientes u otros alifáticos, se pueden emplear para purificar adicionalmente una proteína recombinante (por ejemplo, un agente de ligación a VEGF/DLL4) . Algo o todo de las etapas de purificación anteriores, en varias combinaciones, se pueden emplear para proporcionar una proteína recombinante homogénea.
En algunas modalidades, las proteínas heterodiméricas tales como anticuerpos biespecífieos se purifican de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos en la presente. En algunas modalidades, los anticuerpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4 se aislan y/o purifican usando por los menos una etapa de cromatografía. En algunas modalidades, la por lo menos una etapa de cromatografía comprende cromatografía de afinidad. En algunas modalidades, la por lo menos una etapa de cromatografía comprende además cromatografía de intercambio aniónico. En algunas modalidades, el producto de anticuerpo aislado y/o purificado comprende por lo menos 90% de anticuerpo heterodimérico . En algunas modalidades, el producto de anticuerpo aislado y/o purificado comprende por lo menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de anticuerpo heterodimérico. En algunas modalidades, el producto de anticuerpo aislado y/o purificado comprende aproximadamente 100% de anticuerpo heterodimérico.
En algunas modalidades, la proteína recombinante producida en el cultivo bacteriano se puede aislar, por ejemplo, por extracción inicial de pelotillas de células, seguido por una o más de etapas de cromatografía de concentración, de salación, de intercambio de iónico a acuoso, o exclusión de tamaño. La HPLC se puede emplear para etapas de purificación final. Las células microbianas empleadas en la expresión de una proteína recombinante se pueden alterar por cualquier método conveniente, incluyendo ciclado de congelación-descongelación, sonicación, alteración mecánica, o uso de agentes de lisado celular.
Los métodos conocidos en el campo para purificar anticuerpos y otras proteínas también incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en las Publicación de Patentes de E.U.A. Nos. 2008/0312425; 2008/0177048; y 2009/0187005.
En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un polipéptido que no tiene un anticuerpo. Una variedad de métodos para identificar y producir polipéptidos no de anticuerpos que se ligan con alta afinidad a un objetivo de proteínas son objetivos en el campo. Véase, por ejemplo, Skerra, 2007, Curr. Opin. Biotechnol . , 18:295-304; Hosse y colaboradores, 2006, Protein Science, 15:14-27; Gilí y colaboradores, 2006, Curr. Opin. Biotechnol., 17:653-658; Nygren, 2008, FEBS J. , 275:2668-76; y Skerra, 2008, FEBS J., 275:2677-83. En ciertas modalidades, la tecnología de expresión en fago o células de mamífero se pueden usar para producir e/o identificar un polipéptido de ligación a VEGF/DLL4 que no es un anticuerpo. En ciertas modalidades, el polipéptido comprende un andamio de proteínas de un tipo seleccionado del grupo que consiste de proteína A, proteína G, una lipocalina, un dominio de fibronectina, y un dominio de repetición consenso de anquirina, y tioredoxina.
En ciertas modalidades, los agentes o anticuerpos de ligación a VEGF/DLL4 se pueden usar en cualquiera de una variedad de formas conjugadas (es decir, un inmunoconjugado o radioconjugado) o no conjugadas. En ciertas modalidades, los anticuerpos se pueden usar en una forma no conjugada para aprovechar los mecanismos de defensa naturales del sujeto incluyendo citotoxicidad dependiente de complemento y toxicidad celular dependiente de anticuerpo para eliminar células malignas o cancerosas.
En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo o polipéptido) se conjuga a un agente citotóxico. En algunas modalidades, el agente citotóxico es un agente quimioterapéutico que incluye, pero no se limita a, metotrexato, adriamicina, doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucilo, daunorubicina u otros agentes intercaladores . En algunas modalidades, el agente citotóxico es una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal o fragmentos de los mismos, incluyendo, pero no limitado a, cadena de difteria A, fragmentos activos no de ligación de toxina de difteria, cadena de exotoxina A, cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Pitolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y tricotecenos . En algunas modalidades, el agente citotóxico es un radioisótopo para producir radioconjugado o anticuerpo radio conjugado. Una variedad de radionúclidos son disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados incluyendo, pero no limitado a, 90Y, 125I, 131I, 1231 , niIn, ??, Rn, Sm, Cu, Ga, Ho, Lu, Re, Re y 212-Bt,i· . Los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de moléculas pequeñas, tales como caliqueamicinas, maitansinoides , tricotecenos, y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina, también se pueden usar. Los conjugados de un anticuerpo y agentes citotóxicos se pueden hacer usando una variedad de agentes de acoplamiento a proteínas bifuncionales , incluyendo, pero no limitado a, propionato de N-succinimidil-3 - (2-piridiiditiol) (SPDP) , iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HC1 adipimidato de dimetilo) , esteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tal como glutareldehído) , compuestos bis-azido (tal como hexanodiamina de bis (p-azidobenzoilo) ) , derivados de bis-diazonio (tal como bis- (p-diazoniumbenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tal como tolueno 2,6-diisocianato) , compuestos de flúor bis-activos (tal como 1,5-difluoro-2 , 4 -dinitrobenzeno) .
III. Polinucleótidos En ciertas modalidades, la invención abarca polinucleótidos que comprenden polinucleótidos que codifican un polipéptido (o un fragmento de un polipéptido) que liga específicamente a VEGF, DLL4 , tanto VEGF como DLL4. El término "polinucleótidos que codifican un polipéptido" abarca un polinucleótido que incluye solamente secuencia de codificación para el polipéptido, así como un polinucleótido que incluye secuencias de codificación y/o no de codificación adicionales. Por ejemplo, en algunas modalidades, la invención proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un anticuerpo al VEGF humano codifica un fragmento de tal anticuerpo (por ejemplo, un fragmento que comprende el sitio de ligación a antígeno) . En algunas modalidades, la invención proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un anticuerpo DLL4 humano o codifica un fragmento de tal anticuerpo (por ejemplo, un fragmento que comprende el sitio de ligación a antígeno. Los polinucleótidos de la invención pueden estar en la forma de ARN o en la forma de ADN. El ADN incluye cADN, ADN genómico, y ADN sintético; y puede ser de doble hebra o hebra individual, y si es de hebra individual puede ser la hebra de codificación o hebra no de codificación (anti-sentido) En ciertas modalidades, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO : 12 , SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, y SEQ ID NO: 64. En ciertas modalidades, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62, y SEQ ID NO: 64. En algunas modalidades, el polinucleótido comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 , SEQ IE ) NO: 31, SEQ ID NO: :32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO :34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: :36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO :38, SEQ ID NO : 39 , SEQ ID NO; :40, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO :51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: :53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO :55, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: :61, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO :67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: :69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO :71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: :73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO :75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, y SEQ ID NO: 78.
En ciertas modalidades, del polinucleótido comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos por lo menos aproximadamente 80% idéntica, por lo menos aproximadamente 85% idéntica, por lo menos aproximadamente 90% idéntica, por lo menos aproximadamente 95% idéntica, y en algunas modalidades, por lo menos aproximadamente 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: :30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO :32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: :34, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO :53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: : 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO :66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: :68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO :70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: :72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO :74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: :77, y SEQ ID NO :78 . En ciertas modalidades, el polinucleótido comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos por lo menos aproximadamente 80% idéntica, por lo menos aproximadamente 85% idéntica, por lo menos aproximadamente 90% idéntica, por lo menos aproximadamente 95% idéntica, y en algunas modalidades, por lo menos aproximadamente 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO :35, SEQ ID NO : 36 , SEQ ID NO : 37 , SEQ ID NO : 38 , SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO : 40 , SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73 , SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, y SEQ ID NO: 78. También se proporciona un polinucleótido que comprende un polinucleótido que se híbrida a SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO :34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO :38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO :51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO :55, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO :67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO :71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO :75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, y SEQ ! ID NO :78. En ciertas modalidades, la hibridación está bajo condiciones de alta severidad.
En ciertas modalidades, los polinucleótidos comprenden la secuencia de codificación para el polipéptido maduro fusionado en el mismo marco de lectura a un polinucleótido que ayuda, por ejemplo, en la expresión y secreción de un polipéptido de una célula hospedera (por ejemplo, una secuencia líder que funciona como una secuencia secretora para controlar el transporte de un polipéptido de la células) . El polipéptido que tiene una secuencia líder es una proteína y puede tener la secuencia líder escindida por la célula hospedera para formar la forma madura del polipéptido. Los polinucleótidos también pueden codificar una proteína que es la proteína madura más los residuos de aminoácidos 5' adicionales. Una proteína madura que tiene una pro-secuencia es una proteína y es una forma inactiva de la proteína. Una vez que la pro-secuencia se escinde permanece una proteína activa madura.
En ciertas modalidades, los polinucleótidos comprenden la secuencia de codificación para el polipéptido maduro fusionado en el mismo marco de lectura a una secuencia marcadora que permite, por ejemplo, la purificación del polipéptido codificado. Por ejemplo, la secuencia marcadora puede ser una etiqueta de hexa-histidina suministrad por un vector pQE-9 para proporcionar la purificación del polipéptido maduro fusionado al marcador en el caso de un hospedero bacteriano, o la secuencia marcadora puede ser una etiqueta de hemaglutinina (HA) derivada de la proteína de hemaglutinina de influenza cuando un hospedero mamífero (por ejemplo, células COS-7) se usa. En algunas modalidades, la secuencia marcadora es una etiqueta FLAG, un péptido de la secuencia DYKDDDDK (SEQ ID NO: 45) que se puede usar en conjunción con otras etiquetas de afinidad.
La presente invención se refiere adicionalmente a variantes de los polinucleótidos descritos anteriormente en la presente que codifican, por ejemplo, fragmentos, análogos, y/o derivados.
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona polinucleótidos que comprende polinucleótidos que tienen una secuencia de nucleótidos por lo menos aproximadamente 80% idéntica, por lo menos aproximadamente 85% idéntica, por lo menos aproximadamente 90% idéntica, por lo menos aproximadamente 95% idéntica, y en algunas modalidades, por lo menos aproximadamente 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende un agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo), o fragmento del mismo, descrito en la presente.
Como se usa en la presente, la frase un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos por lo menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia de nucleótidos de referencia se propone para referirse a esa secuencia de nucleótidos de polinucleótidos que es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia de polinucleótidos puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos de por lo menos 95% idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia se pueden suprimir o sustituir con otro nucleótido, o una variedad de nucleótidos hasta 5% de los nucleótidos totales y en la secuencia de referencia se puede insertar en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden presentarse en las posiciones 5' o 3' terminal de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.
Las variantes de polinucleótidos pueden contener alteraciones en las regiones de codificación, regiones no de codificación, o ambas. En algunas modalidades, una variante de polinucleótido contiene alteraciones que producen sustituciones silenciosas, adiciones, o supresiones, pero no altera las propiedades o actividades del polipéptido codificado. En algunas modalidades, una variante de polinucleótido comprende sustituciones silenciosas que da por resultado ningún cambio a la secuencia de aminoácidos del polipéptido (debido a la degeneración del código genético) . Las variantes de polinucleótido se pueden producir por una variedad de razones, por ejemplo, para optimizar la expresión del codón para un hospedero particular (es decir, cambiar los codones en el mARN humano a aquellos preferidos por un hospedero bacteriano tal como E. coli) . En algunas modalidades, una variante de polinucleótido comprende por lo menos una mutación silenciosa en una región no de codificación o de codificación de la secuencia.
En algunas modalidades, una variante de polinucleótido se produce para modular o alterar la expresión (o niveles de expresión) del polipéptido codificado. En algunas modalidades, una variante de polinucleótido se produce para incrementar la expresión del polipéptido codificado. En algunas modalidades, una variante de polinucleótido se produce para disminuir la expresión de polipéptido codificado. En algunas modalidades, una variante de polinucleótido tiene expresión incrementada del polipéptido codificado como es comparado con una secuencia de polinucleótido parenteral . En algunas modalidades, una variante de polinucleótido tiene expresión disminuida del polipéptido codificado como es comparado con una secuencia de polinucleótido parenteral.
En algunas modalidades, por lo menos una variante de polinucleótido se produce (sin cambiar la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado) para incrementar la producción de una molécula heteromultimérica . En algunas modalidades, por lo menos una variante de polinucleótido se produce (sin cambiar la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado) para incrementar la producción de un anticuerpo biespecífico .
En ciertas modalidades, los polinucleótidos se aislan.
En ciertas modalidades, los polinucleótidos son sustancialmente puros.
Los vectores y células que comprenden los polinucleótidos descritos en la presente también se proporcionan. En algunas modalidades, un vector de expresión comprende una molécula de polinucleótidos . En algunas modalidades, una célula hospedera comprende un vector de expresión que comprende la molécula de polinucleótido . En algunas modalidades, una célula hospedera comprende una molécula de polinucleótido.
IV. Métodos de uso y composiciones farmacéuticas Los agentes de ligación (incluyendo polipéptidos y anticuerpos) de la invención que se ligan (por ejemplo, se ligan específicamente) a VEGF y/o DLL4 son útiles en una variedad de aplicaciones incluyendo, pero no limitado a, métodos de tratamiento terapéuticos, tales como el tratamiento de cáncer. En ciertas modalidades, los agentes son útiles para inhibir la actividad de VEGF, inhibir la señalización Notch inducida por DLL4 , inhibir el crecimiento tumoral, reducir el volumen de tumor, reducir la frecuencia de células madre cancerosas en un tumor, reducir la tumorigenicidad de un tumor, modular la angiogénesis , y/o inhibir la angiogénesis. Los métodos de uso pueden ser in vitro, ex vivo, o in vivo. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 es un antagonista de VEGF humano. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 es un antagonista de DLL4 humano. En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 es un antagonista de tanto VEGF como DLL4.
En ciertas modalidades, los agentes de ligación a VEGF/DLL4 se usan en el tratamiento de una enfermedad asociada con la angiogénesis , es decir angiogénesis incrementada y/o angiogénesis aberrante. En ciertas modalidades, la enfermedad es una enfermedad dependiente de la angiogénesis. En ciertas modalidades, los agentes de ligación a VEGF/DLL4 se usan en el tratamiento de trastornos caracterizados por niveles incrementados de células madre y/o células progenitoras .
La presente invención proporciona métodos para inhibir el crecimiento de un tumor usando los agentes de ligación a VEGF/DLL4 o anticuerpos descritos en la presente. En ciertas modalidades, el método para inhibir el crecimiento de un tumor comprende poner en contacto una célula tumoral con un agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, anticuerpo) in vifcro. Por ejemplo, una línea de células inmortalizadas o una línea de células cancerosas se cultivan en el medio al cual se agrega un anticuerpo anti-VEGF, un anticuerpo anti-DLL4, o un anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 para inhibir el crecimiento de células tumorales. En algunas modalidades, las células tumorales se aislan de una muestra de paciente tal como, por ejemplo, una biopsia de tejido, efusión plural, o muestra de sangre y se cultiva en el medio al cual se agrega un agente de ligación a VEGF/DLL4 par a inhibir el crecimiento de células tumorales.
En algunas modalidades, el método para inhibir el crecimiento de un tumor comprende poner en contacto un tumor o células tumorales con un agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, anticuerpo) in vivo. En ciertas modalidades, poner en contacto un tumor o célula tumoral con un agente de ligación a VEGF/DLL4 se lleva a cabo en un modelo animal. Por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF, un anticuerpo anti-DLL4, o un anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 se puede administrar a un animal hospedero inmunocomprometido (por ejemplo, ratones NOD/SCID) que tienen un xenoinjerto de tumor. En algunas modalidades, las células tumorales y/o células madre cancerosas se aislan de una muestra de paciente tal como, por ejemplo, una biopsia de tejido, efusión pleural, o muestra de sangre y se inyecta en un animal hospedero inmunocomprometido (por ejemplo, ratones NOD/SCID) que luego se les administra un agente de ligación a VEGF/DLL4 para inhibir el crecimiento de células tumorales. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 se administra al mismo tiempo o poco después de la introducción de las células tumorigénicas en el animal para prevenir el crecimiento tumoral ("modelo preventivo") . En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 se administra como un producto terapéutico después de que el tumor se ha desarrollado a un tamaño especificado ("modelo terapéutico"). En ciertas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que se liga específicamente al VEGF humano y DLL4 humano.
En ciertas modalidades, el método para inhibir el crecimiento de un tumor comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de ligación a VEGF/DLL4. En ciertas modalidades, el sujeto es un humano. En ciertas modalidades, el sujeto tiene un tumor o ha tenido un tumor que se removió. En ciertas modalidades, el tumor comprende células madre cancerosas. En ciertas modalidades, la frecuencia de células madre cancerosas en el tumor se reduce por la administración del agente de ligación a VEGF/DLL4. La invención también proporciona un método para reducir la frecuencia de células madre cancerosas en un tumor, que comprende poner en contacto el tumo con una cantidad efectiva de un agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 ) . En algunas modalidades, un método para reducir la frecuencia de células madre cancerosas en un tumor en un sujeto, comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de ligación a VEGF/DLL4.
En algunas modalidades, el tumor es un tumor sólido. En ciertas modalidades, el tumor es un tumor seleccionado del grupo que consiste de tumor colorectal, tumor de colon, tumor pancreático, tumor de pulmón, tumor de ovario, tumor de hígado, tumor de mama, tumor de riñon, tumor de próstata, tumor gastrointestinal, melanoma, tumor cervical, tumor de la vejiga, glioblastoma, y tumor de cabeza y cuello. En ciertas modalidades, el tumor es un tumor colorectal o un tumor de colon. En ciertas modalidades, el tumor es un tumor de ovario. En algunas modalidades, el tumor es un tumor de pulmón. En ciertas modalidades, el tumor es un tumor pancreático. En ciertas modalidades, el tumor es un tumor de mama .
La presente invención proporciona además métodos para tratar cáncer que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de ligación a VEGF/DLL4 a un sujeto. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 se liga a VEGF, e inhibe o reduce el crecimiento del cáncer. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 se liga a DLL4 , e inhibe o reduce el crecimiento del cáncer. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que se liga a VEGF y DLL4, e inhibe o reduce el crecimiento del cáncer. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 se liga a VEGF, interfiere con las interacciones del receptor VEGF/VEGF, e inhibe o reduce el crecimiento del cáncer. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 se liga a DLL4 , interfiere con las interacciones DLL4/Notch, e inhibe o reduce el crecimiento del cáncer. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 se liga a tanto VEGF como DLL4 , interfiere con las interacciones del receptor VEGF/VEGF y con las interacciones DLL4/Notch, e inhibe o reduce el crecimiento del cáncer. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 se liga a DLL4, y reduce la frecuencia de células madre cancerosas en el cáncer.
La presente invención proporciona métodos para tratar cáncer que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de ligación a agente de ligación a VEGF/DLL4 a un sujeto (por ejemplo, un sujeto en necesidad de tratamiento). En ciertas modalidades, el sujeto es un humano. En ciertas modalidades, el sujeto tiene un tumor canceroso. En ciertas modalidades, el sujeto ha tenido un tumor removido.
El cáncer/tumor del sujeto, puede, en algunas modalidades, ser refractario a ciertos tratamiento (s) . Como un ejemplo no limitante, el cáncer del sujeto (o tumor) puede ser quimiorefractario . En ciertas modalidades, el cáncer del sujeto puede ser resistente a la terapia anti-VEGF o terapia anti-DLL4, o ambas.
En ciertas modalidades, el cáncer es un cáncer seleccionado del grupo que consiste de cáncer colorectal, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de mama, cáncer de riñon, cáncer de próstata, cáncer gastrointestinal, melanoma, cáncer cervical, cáncer de la vejiga, glioblastoma, y cáncer de cabeza y cuello. En ciertas modalidades, el cáncer es cáncer de ovario. En ciertas modalidades, el cáncer es cáncer colorectal o cáncer de colon. En ciertas modalidades, el cáncer es cáncer pancreático. En ciertas modalidades, el cáncer es cáncer de mama. En ciertas modalidades, el cáncer es cáncer de próstata. En ciertas modalidades, el cáncer es cáncer de pulmón. En algunas modalidades, el cáncer es un cáncer hematológico tal como leucemia o linforna. En algunas modalidades, la leucemia o linforna es una leucemia de células B o lin orna. En algunas modalidades, la leucemia o linforna es una leucemia o linforna de células T. En algunas modalidades, el cáncer hematológico es leucemia mielogenosa aguda, linforna de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, leucemia linfocítica aguda, leucemia de células capilares, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiple, linfoma de células T cutáneo, o leucemia linfoblástica aguda de células T.
La invención también proporciona métodos para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto, en donde la enfermedad o trastorno se asocia con la angiogénesis . En algunas modalidades, la enfermedad o trastorno se asocia con angiogénesis aberrante. En algunas modalidades, la enfermedad o trastorno se asocia con angiogénesis incrementada. De esta manera, la presente invención proporciona métodos para modular la angiogénesis en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de los agentes de ligación a VEGF/DLL4 descrito en la presente. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo que se liga al VEGF humano. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo que se liga a DLL4 humano. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que se liga al VEGF humano. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que se liga al DLL4 humano. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que se liga al VEGF humano y DLL4 humano .
Se proporcionan adicionalmente métodos para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto, en donde la enfermedad o trastorno se caracteriza por un nivel incrementado de células madre y/o células progenitoras . En algunas modalidades, os métodos de tratamiento comprenden administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de ligación a VEGF/DLL4, polipéptido, o anticuerpo al sujeto.
En ciertas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que se liga específicamente al VEGF humano y DLL4 humano. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende un primer sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente al DLL4 humano, en donde el primer sitio de ligación a antígeno comprende una CDRl de cadena pesada que comprende NYWMH (SEQ ID NO: 17), una CDR2 de cadena pesada que comprende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO: 18), y una CDR3 de cadena pesada que comprende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO: 19), y el segundo sitio de ligación a antígeno comprende una CDRl de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 14), YISSYNGATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 15), YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO:59), o YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:65), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16); y en donde tanto el primero como el segundo sitios de ligación a antígeno comprenden una CDRl de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVP TFGG (SEQ ID NO: 22) . En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende un primer sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a DLL4 humano, en donde el primer sitio de ligación a antígeno comprende una CDRl de cadena pesada que comprende NYWMH (SEQ ID NO: 17), una CDR2 de cadena pesada que comprende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO: 18), y una CDR3 de cadena pesada que comprende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO: 19), y el segundo sitio de ligación a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 14), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16); y en donde tanto el primero como el segundo sitios de ligación a antígeno comprenden una CDR1 de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21) , y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22). En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende un primer sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a DLL4 humano, en donde el primer sitio de ligación a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende NYWMH (SEQ ID NO: 17), una CDR2 de cadena pesada que comprende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO: 18), y una CDR3 de cadena pesada que comprende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO: 19), y el segundo sitio de ligación a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende YISSYNGATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 15), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16); y en donde tanto el primero como el segundo sitios de ligación a antígeno comprenden una CDR1 de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO: 20) , una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO:22) . En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende un primer sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a DLL4 humano, en donde el primer sitio de ligación a antígeno comprende una CDRl de cadena pesada que comprende NYWMH (SEQ ID NO: 17), una CDR2 de cadena pesada que comprende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO: 18), y una CDR3 de cadena pesada que comprende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO: 19), y un segundo sitio de ligación a antígeno que comprende una CDRl de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 59), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16); y en donde tanto el primero como el segundo sitios de ligación a antígeno comprenden una CDRl de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO: 20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21) , y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22) . En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico comprende un primer sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de ligación a antígeno que se liga específicamente a DLL4 humano, en donde el primer sitio de ligación a antígeno comprende una CDRl de cadena pesada que comprende NYWMH (SEQ ID NO: 17), una CDR2 de cadena pesada que comprende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO: 18), y una CDR3 de cadena pesada que comprende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO: 19), y el segundo sitio de ligación a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 65) , y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16); y en donde tanto el primero como el segundo sitios de ligación a antígeno comprenden una CDR1 de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO: 20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22) .
En ciertas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el anticuerpo biespecífico VEGF/DLL4 comprende una primera región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 11, una segunda región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 58, o SEQ ID NO: 64, y una primera región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico VEGF/DLL4 comprende una primera región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 11, una segunda región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 9, y una primera y una segunda región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico VEGF/DLL4 comprende una primera región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 11, una segunda región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 10, y una primera y una segunda región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico VEGF/DLL4 comprende una primera región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 11, una segunda región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 58, y una primera y una segunda región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico VEGF/DLL4 comprende una primera región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 11, una segunda región variable de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 64, y una primera y una segunda región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12.
En algunas modalidades de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo anti-VEGF. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-VEGF es un anticuerpo 219R45. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo anti-DLL4. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-DLL4 es un anticuerpo 21R79. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-DLL4 es un anticuerpo 21R75. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-DLL4 es un anticuerpo 21R83. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende un sitio de ligación a antígeno del anticuerpo 219R45. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende un sitio de ligación a antígeno del anticuerpo 21R79. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende un sitio de ligación a antígeno del anticuerpo 21R75. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende un sitio de ligación a antígeno del anticuerpo 21R83. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de ligación a antígeno del anticuerpo 219R45 y un segundo sitio de ligación a antígeno del anticuerpo 21R79. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de ligación a antígeno del anticuerpo 219R45 y un segundo sitio de litación a antígeno del anticuerpo 21M18. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de ligación a antígeno del anticuerpo 219R45 y un segundo sitio de ligación a antígeno del anticuerpo 21R75. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de ligación a antígeno del anticuerpo 219R45 y un segundo sitio de ligación a antígeno del anticuerpo 21R83. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21M18. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21R79. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21R75. En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 es el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21R83.
La presente invención proporciona además las composiciones f rmacéuticas que comprende los agentes de ligación descrito en la presente. En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas comprenden además un vehículo farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones farmacéuticas encuentran uso en la inhibición del crecimiento tumoral y/o para tratar el cáncer en un sujeto (por ejemplo, un paciente humano) .
En ciertas modalidades, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprende anticuerpos biespecíficos , en donde por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 98%, por lo menos aproximadamente 99% de los anticuerpos en la composición son anticuerpos biespecíficos o anticuerpos heterodiméricos. En ciertas modalidades, los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos IgG (por ejemplo, IgG2 o IgGl) . En ciertas modalidades, menor que aproximadamente 10%, menor que aproximadamente 5%, menor que aproximadamente 2% o menor que aproximadamente 1% de los anticuerpos totales en las composiciones son anticuerpos monoespecífieos o anticuerpos homodiméricos . En ciertas modalidades, los anticuerpos en la composición por lo menos aproximadamente 98% heterodiméricos.
En ciertas modalidades, las formulaciones se preparan para almacenamiento y uso al combinar un anticuerpo o agente purificado de la presente invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, un portador o excipiente) . Los vehículos f rmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, soluciones amortiguadoras no tóxicas tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; sales como cloruro de sodio; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservadores tales como cloruro de amono de octadecildimetilbencilo, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio, fenol, butilo o alcohol bencílico, alquil-parabenos , tales como metil o propil-parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol , 3-pentanol, y m-cresol; polipéptidos de peso molecular bajo (por ejemplo, menor que aproximadamente 10 residuos de aminoácido) ; proteínas tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidona; los aminoácidos tal como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; carbohidratos tales como monosacáridos , disacáridos, glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; azúcares tales como, sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contra- iones formadores de sal tal como sodio; complejos de metal tal como complejos de proteína Zn; y surfactantes no iónicos tal como T EEN o polietilenglicol (PEG) . (Remington: The Science and Practice of Phar acy, 21a Edición, 2005, University of the Sciences, Filadelfia, PA) .
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar en cualquier variedad de formas para cualquier tratamiento local sistémico. La administración puede ser tópica por parches epidérmicos o transdérmicos, ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, rocíos, líquidos, y polvos; pulmonar por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo por nebulizador, intra-traqueal , e intranasal; oral; o parenteral incluyendo intravenosa, intraarterial , intratumoral , subcutánea, intraperitoneal , intramuscular (por ejemplo, inyección o infusión) , o intracraneal (por ejemplo, intratecal o intraventricular) .
La formulación terapéutica puede estar en una forma de dosificación unitaria. Tales formulaciones incluyen tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, gránulos, soluciones o suspensiones en agua o medios no acuosos, o supositorios. En las composiciones sólidas tales como tabletas el ingrediente activo principal se mezcla con un portador farmacéutico. Los ingredientes para la formación de tabletas convencionales incluyen almidón de maíz, lactosa, sacarosa, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato de magnesio, fosfato de dicalcio o gomas, y diluyentes (por ejemplo, agua) . Estos se pueden usar para formar una composición de pre-formulación sólida que contiene una mezcla homogénea de un compuesto de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable no tóxica de la misma. La composición de pre-formulacion sólida luego se subdivide en formas de dosificación unitarias de un tipo descrito en lo anterior. Las tabletas, pildoras, etc., de la formulación o composición se pueden recubrir o de otra manera componer para proporcionar una forma de dosificación que permite la ventaja de la acción prolongada. Por ejemplo, la tableta o pildora puede comprender una composición interna cubierta por un componente exterior. Adicionalmente, los dos componentes se pueden separar por una capa entérica que sirve para resistir la desintegración y permite que el componente interior pase intacto a través del estómago o que se retarde en la liberación. Una variedad de materiales se puede usar para tales capas o recubrimientos entéricos, tales materiales incluyen una variedad de ácidos poliméricos y mezclas de ácidos poliméricos con tales materiales como goma laca, alcohol cetílico y acetato de celulosa.
Los agentes o anticuerpos de ligación a VEGF/DLL4 o descritos en la presente también se pueden atrapar en microcápsulas . Tales microcápsulas se preparan, por ejemplo, por técnicas de co-acervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacilato) , respectivamente, en sistemas de administración de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones como se describe en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edición, 2005, University of the Sciences en Filadelfia, PA.
En ciertas modalidades, las formulaciones farmacéuticas incluyen un agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) de la presente invención formado en complejo con liposomas. Los métodos para producir liposomas son bien conocidos por aquellas personas expertas en el campo. Por ejemplo, algunos liposomas se pueden generar por evaporación de fase inversa con una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol, y fosfatidiletanolamina derivada con PEG (PEG-PE) . Los liposomas se pueden extruír a través de filtros de tamaño de poro definidos para producir liposomas con el diámetro deseado.
En ciertas modalidades, las preparaciones de liberación sostenidas se pueden producir. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen un agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) , donde las matrices están en la forma de artículos formados (por ejemplo, películas o microcápsulas) . Ejemplos adicionales de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles, tales como poli (2-hidroxietil-metacrilato) o poli (alcohol vinílico) , polilacturos , copolímeros de ácido L-glutámico y 7-etil-L- glutamato, acetato de etileno-vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tal como LUPRON DEPOTMR (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolido) , isobutirato de acetato de sacarosa, y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico.
En ciertas modalidades, además de administrar un agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) , el método o tratamiento comprende además administrar por lo menos un agente terapéutico adicional. Un agente terapéutico adicional se puede administrar antes de, concurrentemente con, y/o subsecuentemente a, la administración del agente de ligación a VEGF/DLL . Las composiciones farmacéuticas que comprende un agente de ligación a VEGF/DLL4 y el agente (s) terapéutico adicional también se pueden proporcionar. En algunas modalidades, el por lo menos un agente terapéutico adicional comprende 1, 2, 3, o más agentes terapéuticos adicionales .
La terapia de combinación con por lo menos dos agentes terapéuticos usa frecuentemente agentes que trabajan por mecanismos de acción diferentes, aunque no se requiere. La terapia de combinación que usa agentes con diferentes mecanismos de acción puede dar por resultado efectos de aditivo o sinérgicos. La terapia de combinación puede permitir una dosis más baja de cada agente que se use en la monoterapia, reduciendo de esta manera los efectos secundarios tóxicos y/o incrementando el índice terapéutico de por lo menos uno de los agentes. La terapia de combinación puede disminuir la probabilidad de que las células cancerosas resistentes se desarrollen. En algunas modalidades, la terapia de combinación comprende un agente terapéutico que afecta principalmente (por ejemplo, inhibe o extermina) células no tumorigénicas y un agente terapéutico que afecta principalmente (por ejemplo, inhibe o extermina) CSCs tumorigénicos .
Las clases útiles de agentes terapéuticos incluyen, por ejemplo, agentes anti-tubulina, auristatinas , aglutinantes de la hendidura menor de ADN, inhibidores de replicación de ADN, agentes de alquilación (por ejemplo, complejos de platino tales como cisplatina, mono (platino) , bis (platino) complejos de platina tri-nucleares y carboplatina) , antraciclinas , antibióticos, antifolatos, antimetabolitos , sintetizadores de quimioterapia, duocarmicinas , etoposidos, pirimidinas fluoradas, ionoforos, lexitropsinas , nitrosoureas , platinóles, antimetabolitos de purina, puromicinas, sintetizadores de radiación, esteroides, taxanos, inhibidores de topoisomerasa, alcaloides de la vinca, o similares. En ciertas modalidades, el segundo agente terapéutico es un agente de alquilación, un anti-metabolito, un antimitótico, un inhibidor de topoisomerasa o un inhibidor de angiogénesis .
En algunas modalidades, el segundo agente terapéutico es un complejo de platino tal como carboplatina o cisplatina. En algunas modalidades, el agente terapéutico adicional es un complejo de platino en combinación con un taxano.
Los agentes terapéuticos que se pueden administrar en combinación con los agentes de ligación a VEGF/DLL4 incluyen agentes quimioterapéuticos . De esta manera, en algunas modalidades, el método o tratamiento implica la administración de un agente o anticuerpo de ligación a anti-VEGF de la presente invención en combinación con un agente quimioterapéutico o cóctel de múltiples agentes quimioterapéuticos diferentes. En algunas modalidades, el método o tratamiento implica la administración de un agente o anticuerpo de ligación a anti-DLL4 de la presente invención en combinación con un agente quimioterapéutico o cóctel de múltiples agentes quimioterapéuticos diferentes. En algunas modalidades, el método o tratamiento implica la administración de un anticuerpo biespecífico de la presente invención que se liga a VEGF y DLL4 , en combinación con un agente quimioterapéutico o coctel de múltiples agente quimioterapéuticos diferentes.
Los agentes quimioterapéuticos útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, agentes de alquilación tal como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN) ; sulfonatos de alquilo tal como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tal como benzodopa, carboquona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenemelamina, trietilenfosforamida, trietilenetiofosfaoramida y trimetilolomelamima; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, cloAR fazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina , fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina nimustina, ranimustina ; antibióticos tales como aclacinomisinas , actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicin, caliqueamicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas , dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU) ; análogos de ácido fólico tal como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tal como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tal como ancitabina, azacitidina, 6- azauridina, carmofor, arabinosida de citosina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5- FU; andrógenos tales como calusterona, propionato de drornostañolona, epitiostanol , mepitiostana, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedores de ácido fólico tal como ácido folínico; aceglatona; glicósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptinio; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol ; nitracrina; pentostatina ; fenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK; razoxana; sizofuran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2 , 21 , 211 -triclorotrietilamina ; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol ; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosido (Ara-C) ; taxoides, por ejemplo paclitaxel (TAXOL) y docetaxel (TAXOTERE) ; clorambucilo; gemcitabina; 6-1ioguanina; mercaptopurina ; análogos de platino tales como cisplatina y carboplatina; vinblastina; platino; etopósido (VP-16) ; ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina ; ibandronato; CPT11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO) ; ácido retinoico; esperamicinas ; capecitabina (XELODA) ; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores. Los agentes quimioterapéuticos también incluyen agentes anti-hormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal en los tumores tales como anti-estrógenos que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4 (5) -imidazolos inhibidores de aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, y toremifeno (FARESTON) ; y anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolido, y goserelina; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores . En ciertas modalidades, el segundo agente terapéutico es cisplatina. En ciertas modalidades, el segundo agente terapéutico es carboplatina . En ciertas modalidades, el segundo agente terapéutico es paclitaxel.
En ciertas modalidades, el agente quimioterapéutico es un inhibidor de topoisomerasa . Los inhibidores de topoisomerasa son agentes quimioterapéuticos que interfieren con la acción de una enzima de topoisomerasa (por ejemplo, topoisomerasa I o II) . Los inhibidores de topoisomerasa incluyen, pero no se limitan a, doxorubicina HC1, citrato de daunorubicina, mitoxantrona HC1, actinomicina D, etopósido, topotecano HC1, tenipósido (VM-26) , e irinotecano, así como sales farmacéuticamente aceptables, ácidos, o derivados de cualquiera de estos. En ciertas modalidades, el segundo agente terapéutico es irinotecano.
En ciertas modalidades, el agente quimioterapéutico es un anti-metabolito . Un anti-metabolito es un químico con una estructura que es similar a un metabolito requerido para las reacciones bioquímicas normales, todavía suficientemente diferente para interferir con una o más de las funciones normales de las células, tal como la división celular. Los anti-metabolitos incluyen, pero no se limitan a, gemcitabina, fluorouracilo, capecitabina, metotrexato sódico, ralitrexed, pemetrexed, tegafur, citosina arabinosido, tioguanina, 5-azacitidina, 6-mercaptopurina, azatioprina, 6 -tioguanina, pentostatina, fosfato de fludarabina, y cladribina, así como sales farmacéuticamente aceptables, ácidos, o derivados de cualquiera de estos. En ciertas modalidades, el segundo agente terapéutico es gemcitabina.
En ciertas modalidades, el agente quimioterapéutico es un agente antimitótico, incluyendo, pero no limitado a, agentes que se ligan a la tubulina. En algunas modalidades, el agente es un taxano. En ciertas modalidades, el agente es paclitaxel o docetaxel, o una sal farmacéuticamente aceptable, ácido, o derivado de paclitaxel o docetaxel. En ciertas modalidades, el agente es paclitaxel (TAXOL) , docetaxel (TAXOTERE) , paclitaxel ligado a albúmina (ABRAXA E) , DHA-paclitaxel , o PG-paclitaxel . En ciertas modalidades alternativas, el agente antimitótico comprende un alcaloide de la vinca, tal como vincristina, vinblastina, vinorelbina, o vindesina, o sales farmacéuticamente aceptables, ácidos, o derivados de los mismos. En algunas modalidades, el agente antimitótico es un inhibidor de quinesina Eg5 o un inhibidor de una cinasa mitótica tal como Aurora A o Plkl . En ciertas modalidades, donde el agente quimioterapéutico administrado en combinación con un agente de ligación a VEGF/DLL4 es un agente antimitótico, el cáncer o tumor que se trata es cáncer de mama o un tumor de mama.
En algunas modalidades, un segundo agente terapéutico comprende un agente tal como una molécula pequeña. Por ejemplo, el tratamiento puede implicar la administración combinada de un agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo un anticuerpo) de la presente invención con una molécula pequeña que actúa como un inhibidor contra las proteínas asociadas a tumor adicionales incluyendo, pero no limitado a, EGFR, ErbB2, HER2 , y/o VEGF. En ciertas modalidades, el segundo agente terapéutico es una molécula pequeña que inhibe una ruta de células madre cancerosas. En algunas modalidades, el segundo agente terapéutico es un inhibidor de molécula pequeña de la trayectoria Notch. En algunas modalidades, el segundo agente terapéutico es un inhibidor de la molécula pequeña de la ruta Wnt . En algunas modalidades, el segundo agente terapéutico es un inhibidor de molécula pequeña de la ruta BMP. En algunas modalidades, el segundo agente terapéutico es una molécula pequeña que inhibe la señalización de ß-catenina.
En algunas modalidades, un segundo agente terapéutico comprende una molécula biológica, tal como un anticuerpo. Por ejemplo, el tratamiento puede implicar la administración combinada de n agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo un anticuerpo) de la presente invención con otros anticuerpos contra proteínas asociadas a tumor adicionales que incluyen, pero no limitado a, anticuerpos que se ligan a EGFR, ErbB2, HER2, y/o VEGF. En ciertas modalidades, el segundo agente terapéutico es un anticuerpo que es un anticuerpo marcador de células madre anti-cancerosas . En algunas modalidades, el segundo agente terapéutico es un anticuerpo que se liga a un componente de la trayectoria Notch. En algunas modalidades, el segundo agente terapéutico es un anticuerpo que se liga a un componente de la ruta nt . En ciertas modalidades, el segundo agente terapéutico es un anticuerpo que inhibe una ruta de células madre cancerosas. En algunas modalidades, el segundo agente terapéutico es un inhibidor de anticuerpo de la trayectoria Notch. En algunas modalidades, el segundo agente terapéutico es un inhibidor de anticuerpo de la ruta Wnt. En algunas modalidades, el segundo agente terapéutico es un inhibidor de anticuerpo de la ruta BMP. En algunas modalidades, el segundo agente terapéutico es un anticuerpo que inhibe la señalización de ß-catenina. En ciertas modalidades, el segundo agente terapéutico es un anticuerpo que es un inhibidor o modulador de angiogénesis (por ejemplo, un anticuerpo receptor anti-VEGF o VEGF) . En ciertas modalidades, el segundo agente terapéutico es bevacizumab (AVASTIN) , trastuzumab (HERCEPTIN) , panitumumab (VECTIBIX) , o cetuximab (ERBITUX) . La administración combinada puede incluir la coadministración, ya sea en una formulación farmacéuticamente individual o usando formulaciones separadas, o a la administración consecutiva en cualquier orden pero generalmente dentro de un período de tiempo tal que todos los agentes activos puedan ejercer sus actividades biológicas simultáneamente.
Adicionalmente , el tratamiento con un agente de ligación a VEGF/DLL4 descrito en la presente puede incluir tratamiento de combinación con otras moléculas biológicas, tal como una o más citocinas (por ejemplo, linfocinas, interleucinas , factores de necrosis tumoral, y/o factores de crecimiento) o se pueden acompañar por la remoción quirúrgica de tumores, células cancerosas, o cualquier otra terapia evaluada necesaria por un médico tratante.
En ciertas modalidades, el tratamiento implica la administración de un agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo un anticuerpo) de la presente invención en combinación con terapia de radiación. El tratamiento con un agente de ligación a VEGF/DLL4 puede presentarse antes, concurrentemente con, o subsecuente a la administración de la terapia de radiación. Los programas de dosificación para tal terapia de radiación se pueden determinar por el profesional médico experto.
Se apreciará que la combinación de un agente de ligación a VEGF/DLL4 y un agente terapéutico adicional se puede administra en cualquier orden o concurrentemente. El tratamiento con un agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) se puede presentar antes, concurrentemente con, o subsecuente a la administración de las quimioterapias . La administración combinada puede incluir co-administración, ya sea en una sola formulación farmacéutica o usando formulaciones separadas, co-administración consecutiva en cualquier orden pero generalmente dentro de un período de tiempo tal que todos los agentes activos puedan ejercer sus actividades biológicas simultáneamente. Los programas de preparación y dosificación para tales agentes quimioterapéuticos se pueden usar de acuerdo con las instrucciones del fabricante o como se determine empíricamente por el profesional experto. Los programas de preparación y dosificación para tal quimioterapia también se describen en The Chemotherapy Source Book, 4a Edición, 2008, M. C. Perry, Editor, Lippincott, Williams & Wilkins, Filadelfia, PA.
En algunas modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 se administrará a pacientes que se han sometido previamente al tratamiento con un segundo agente terapéutico. En ciertas otras modalidades, el agente de ligación a VEGF/DLL4 y un segundo agente terapéutico se administrarán sustancialmente de manera simultánea o concurrentemente. Por ejemplo, un sujeto se le puede administrar un agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) mientras que se somete a un curso de tratamiento con un segundo agente terapéutico (por ejemplo, quimioterapia) . En ciertas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 se administrará dentro de 1 año del tratamiento con un segundo agente terapéutico. En ciertas modalidades alternativas, un agente de ligación a VEGF/DLL4 se administrará dentro de 10, 8, 6, 4, o 2 meses de cualquier tratamiento con un segundo agente terapéutico. En ciertas otras modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 se administrará dentro de 4 , 3, 2, o 1 semanas de cualquier tratamiento con un segundo agente terapéutico. En algunas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 se administrará dentro de 5 , 4, 3, 2, o 1 días de cualquiera tratamiento con un segundo agente terapéutico. Se apreciará adicionalmente que los dos (o más) agentes o tratamientos se pueden administrar al sujeto dentro de una cuestión de horas o minutos (es decir, sustancialmente de manera simultánea) .
Para el tratamiento de una enfermedad, la dosificación apropiada de un agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) de la presente invención depende del tipo de enfermedad que se trata, la gravedad y curso de la enfermedad, la sensibilidad de la enfermedad, si el agente de ligación a VEGF/DLL4 o anticuerpo se administra para propósitos terapéuticos o preventivos, terapia previa, el historial clínico del paciente, y así sucesivamente, todo en la discreción del médico que trata. El agente o anticuerpo de ligación a VEGF/DLL4 se puede administrar una vez o como una serie de tratamientos separados durante varios días a varios meses, o hasta que se lleve a cabo una cura o se logre una disminución del estado de enfermedad (por ejemplo, reducción en el tamaño del tumor) . Los programas de dosificación óptimos se pueden calcular de mediciones de acumulación de fármacos en el cuerpo del paciente y vararán dependiendo de la potencia relativa de un anticuerpo o agente individual. El médico que administra puede determinar las dosificaciones óptimas, metodologías de dosificación, y velocidades de repetición. En ciertas modalidades, la dosificación de un agente o anticuerpo de ligación a VEGF/DLL4 es de aproximadamente 0.0lug a aproximadamente 100mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0. l g a aproximadamente 100mg/kg de peso corporal, de aproximadamente ^g a aproximadamente 100mg/kg de peso corporal, de aproximadamente lmg a aproximadamente 100mg/kg de peso corporal, de aproximadamente lmg a aproximadamente 80mg/kg de peso corporal de aproximadamente lOmg a aproximadamente 100mg/kg de peso corporal, de aproximadamente lOmg a aproximadamente 75mg/kg de peso corporal , o de aproximadamente lOmg a aproximadamente 50mg/kg de peso corporal. En ciertas modalidades, la dosificación del anticuerpo u otro agente de ligación a VEGF/DLL4 es de aproximadamente 0. lmg a aproximadamente 20mg/kg de peso corporal. En ciertas modalidades, la dosificación se puede administrar una vez o más diariamente, semanalmente , mensualmente , o al año. En ciertas modalidades, el anticuerpo u otro agente de ligación a VEGF/DLL4 se administra una vez cada semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, o una vez cada mes.
En algunas modalidades, un agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo) se puede administrar en una dosis de "carga" más alta inicial, seguido por una o más dosis más bajas. En algunas modalidades, la frecuencia de administración también puede cambiar. En algunas modalidades, un régimen de dosificación puede comprender administrar una dosis inicial, seguido por dosis adicionales (o dosis "de mantenimiento") una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada 3 semanas, o una vez cada mes. Por ejemplo, un régimen de dosificación puede comprender administrar una dosis de carga inicial, seguido por una dosis de mantenimiento semana de, por ejemplo, la mitad de la dosis inicial. O un régimen de dosificación puede comprender administrar una dosis de carga inicial, seguido por dosis de mantenimiento de, por ejemplo la mitad de la dosis inicial cada dos semanas. 0 un régimen de dosificación puede comprender administrar tres dosis iniciales durante 3 semanas, seguido por dosis de mantenimiento de, por ejemplo, la misma cantidad cada dos semanas. 0 un régimen de dosificación puede comprender administrar una dosis inicial seguido por dosis adicionales cada 3 semanas o una vez al mes. El médico que trata puede estimar las velocidades de repetición para la dosificación basado en los tiempos de residencia medidos y las concentraciones del fármaco en los fluidos o tejidos corporales. El progreso de la terapia se puede supervisar por técnicas y ensayos convencionales.
Como es conocido por aquellas personas de experiencia en el campo, la administración de cualquier agente terapéutico puede conducir a efectos secundarios y/o toxicidades. En algunos casos, los efectos secundarios y/o toxicidades son tan graves como para impedir la administración del agente particular en una dosis terapéuticamente efectiva. En algunos casos, la terapia de fármacos se debe descontinuar, y se pueden probar otros agentes. Sin embargo, muchos agentes en la misma clase terapéutica muestran frecuentemente efectos secundarios y/o toxicidades similares, lo que significa que el paciente tiene que detener ya sea la terapia, o si es posible, sufrir de los efectos secundarios desagradables asociados con el agente terapéutico.
Los efectos secundarios de los agentes terapéuticos pueden incluir, pero no se limitan a, urticaria, sarpullido, comezón, nausea, vomito, apetito disminuido, diarrea, escalofríos, fiebre, fatiga, molestias musculares y dolor, dolores de cabeza, presión arterial baja, presión arterial alta, hipocalemia, recuentos sanguíneos bajos, sangrado, y problemas cardiacos.
De esta manera, un aspecto de la presente invención se dirige a métodos para tratar cáncer en un paciente que comprende administrar un anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 usando un régimen de dosificación intermitente, que puede reducir los efectos secundarios y/o toxicidad asociadas con la administración del anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4. Como se usa en la presente, "dosificación intermitente" se refiere a un régimen de dosificación que usa un intervalo de dosificación de más de una vez a la semana, por ejemplo, dosificación de una vez cada 2 semanas, una vez cada 3 semanas, una vez cada 4 semanas, etc. En algunas modalidades, un método para tratar cáncer en un paciente humano comprende administrar al paciente una dosis efectiva de un anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 de acuerdo con un régimen de dosificación intermitente. En algunas modalidades, un método para tratar cáncer en un paciente humano comprende administrar al paciente una dosis efectiva de un anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 de acuerdo con un régimen de dosificación intermitente, e incrementar el índice terapéutico del anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4. En algunas modalidades, el régimen de dosificación intermitente comprende administrar una dosis inicial de un anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 al paciente, y administrar dosis subsecuentes del anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 a aproximadamente una vez cada 2 semanas. En algunas modalidades, el régimen de dosificación intermitente comprende administrar una dosis inicial de un anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 al paciente, y administrar dosis subsecuentes de anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 a aproximadamente una vez cada 3 semanas. En algunas modalidades, el régimen de dosificación intermitente comprende administrar una dosis inicial de un anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 al paciente, y administrar dosis subsecuentes del anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti -DLL4 aproximadamente una vez cada 4 semanas.
En algunas modalidades, la dosis subsecuente en un régimen de dosificación intermitente son aproximadamente la misma cantidad o menor que la dosis inicial. En otras modalidades, la dosis subsecuente es una cantidad mayor que la dosis inicial. Como es sabido por aquellas personas de experiencia en el campo, las dosis usadas variaran dependiendo de los objetivos clínicos que se logren. En algunas modalidades, la dosis inicial es de aproximadamente 0.25mg/kg a aproximadamente 20mg/kg. En algunas modalidades, la dosis inicial es de aproximadamente 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20mg/kg. En ciertas modalidades, la dosis inicial es de aproximadamente 0.5mg/kg. En ciertas modalidades, la dosis inicial es de aproximadamente lmg/kg. En ciertas modalidades, la dosis inicial es de aproximadamente 2.5mg/kg. En ciertas modalidades, la dosis inicial es de aproximadamente 5mg/kg. En ciertas modalidades, la dosis inicial es de aproximadamente 7.5mg/kg. En ciertas modalidades, la dosis inicial es de aproximadamente 10mg/kg. En ciertas modalidades, la dosis inicial es de aproximadamente 12.5mg/kg. En ciertas modalidades, la dosis inicial es de aproximadamente 15mg/kg. En ciertas modalidades, la dosis inicial es de aproximadamente 20mg/kg. En algunas modalidades, las dosis subsecuentes son de aproximadamente 0.25mg/kg a aproximadamente 15mg/kg. En ciertas modalidades, las dosis subsecuentes son de aproximadamente 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15mg/kg. En ciertas modalidades, las dosis subsecuentes son de aproximadamente 0.5mg/kg. En ciertas modalidades, las dosis subsecuentes son de aproximadamente lmg/kg. En ciertas modalidades, las dosis subsecuentes son de aproximadamente 2.5mg/kg. En ciertas modalidades, las dosis subsecuentes son de aproximadamente 5mg/kg. En algunas modalidades, las dosis subsecuentes son de aproximadamente 7.5mg/kg. En algunas modalidades, las dosis subsecuentes son de aproximadamente 10mg/kg. En algunas modalidades, las dosis subsecuentes son de aproximadamente 12.5mg/kg.
En algunas modalidades, el régimen de dosificación intermitente comprende: (a) administrar al paciente una dosis inicial de un anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 de aproximadamente 2.5mg/kg y (b) administrar dosis subsecuentes de aproximadamente 2.5 mg/kg una vez cada 2 semanas. En algunas modalidades, el régimen de dosificación intermitente comprende: (a) administrar al paciente una dosis inicial de un anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 de aproximadamente 5mg/kg y (b) administrar dosis subsecuentes de aproximadamente 5 mg/kg una vez cada 2 semanas . En algunas modalidades, el régimen de dosificación intermitente comprende: (a) administrar al paciente una dosis inicial de un anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 de aproximadamente 2.5mg/kg y (b) administrar dosis subsecuentes de aproximadamente 2.5 mg/kg una vez cada 3 semanas. En algunas modalidades, el régimen de dosificación intermitente comprende: (a) administrar al paciente una dosis inicial de un anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 de aproximadamente 5mg/kg y (b) administrar dosis subsecuentes de aproximadamente 5 mg/kg una vez cada 3 semanas. En algunas modalidades, el régimen de dosificación intermitente comprende: (a) administrar al paciente una dosis inicial de un anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 de aproximadamente 2.5mg/kg y (b) administrar dosis subsecuentes de aproximadamente 2.5 mg/kg una vez cada 4 semanas. En algunas modalidades, el régimen de dosificación intermitente comprende: (a) administrar al paciente una dosis inicial de un anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 de aproximadamente 5mg/kg y (b) administrar dosis subsecuentes de aproximadamente 5 mg/kg una vez cada 4 semanas. En ciertas modalidades, la dosis inicial y la dosis de mantenimiento son diferentes, por ejemplo, la dosis inicial es de aproximadamente 5mg/kg y la dosis subsecuente son de aproximadamente 2.5mg/kg. En ciertas modalidades, un régimen de dosificación intermitente puede comprender una dosis de carga, la dosis inicial es de aproximadamente 20mg/kg y las dosis subsecuentes son de aproximadamente 2.5mg/kg o aproximadamente 5mg/kg administradas una vez cada 2 semanas, una vez cada 3 semanas, o una vez cada 4 semanas.
Otro aspecto de la presente invención se dirige a métodos para reducir la toxicidad de un anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 en un paciente humano que comprende administrar al paciente el anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 usando un régimen de dosificación intermitente. Otro aspecto de la presente invención se dirige a métodos para reducir los efectos secundarios de un anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 en un paciente humano que comprende administrar al paciente el anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 usando un régimen de dosificación intermitente. Otro aspecto de la presente invención se dirige a métodos para incrementar el índice terapéutico de un anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 de un paciente humano que comprende administrar al paciente el anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti -DLL4 usando un régimen de dosificación intermitente.
La elección del método de administración para la dosis iniciales y subsecuentes se hace de acuerdo con la capacidad del paciente animal o humano de tolerar la introducción del anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 en el cuerpo. De esta manera, en cualquiera de los aspectos y/o modalidades descritas en la presente, la administración del anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 puede ser mediante inyección intravenosa o intravenosamente. En algunas modalidades, la administración es por infusión intravenosa. En cualquiera de los aspectos y/o modalidades descritas en la presente, la administración del anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti -DLL4 puede ser por una vía no intravenosa.
V. Kits que comprenden los agentes de ligación a VEGF/DLL4 La presente invención proporciona kits que comprenden los agentes de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, anticuerpos) descritos en la presente y que se pueden usar para llevar a cabo los métodos descritos en la presente. En ciertas modalidades, un kit comprende por lo menos un anticuerpo purificado contra VEGF y/o DLL4 en uno o más contenedores. En algunas modalidades, los kits contienen todos los componentes necesarios y/o suficientes para llevar a cabo un ensayo de detección, incluyendo todos los controles, indicaciones para llevar a cabo los ensayos, y cualquier software necesario para análisis y presentación de los resultados. Una persona experta en el campo reconocerá fácilmente que los agentes de ligación a VEGF/DLL4 dados a conocer de la presente invención se pueden incorporar fácilmente en uno de los formatos de kit establecidos que son bien conocidos en el campo.
Se proporcionan además kits que comprenden un agente de ligación a VEGF/DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 ) , así como por lo menos un agente terapéutico adicional. En ciertas modalidades, el segundo (o más) agente terapéutico es un agente quimioterapéutico . En ciertas modalidades, el segundo (o más) agente terapéutico es un inhibidor de angiogénesis .
Modalidades de la presente descripción se pueden definir adicionalmente por referencia a los siguientes ejemplos no limitantes, que se describen en preparación detallad en ciertas modalidades de la presente descripción y métodos para usar los anticuerpos de la presente descripción. Será evidente para aquellas personas expertas en el campo que muchas modificaciones, tanto materiales como métodos, se pueden practicar sin apartarse del alcance de la presente descripción.
EJEMPLOS Ejemplo 1 Afinidades de ligación de los anticuerpos anti-VEGF/anti-DLL4 Las KDs de los anticuerpos parenterales anti-VEGF 219R45 (formato IgG) , anti-DLL4 21R79 (formato IgG) , anti-DLL4 21M18 (formato IgG) y anticuerpos biespecíficos 219R45-MB-21M18 y 219R45-MB-21R79 se determinaron usando un sistema Biacore 2000 de Biacore LifeSciences (GE Healthcare) . Proteínas de DLL4-FC humanas o DLL4 -Fe de ratón recombinantes se inmovilizaron sobre chips de carboxilo CM5 usando química basada en amina estándar (NHS/EDC) y se bloquearon con etanolamina. La VEGFi65 humana o VEGF165 de ratón recombinantes se biotinilaron y se inmovilizaron sobre chips de estreptavidina . Los anticuerpos se diluyeron en serie 2 veces de ????? a 0.78nM en HBS-P (HEPES 0.01M pH7.4 , NaCl 0.15M, 0.005% v/v de Polisorbato 20). Para cada anticuerpo, las 8 diluciones se inyectaron secuencialmente sobre un chip específico. Los datos cinéticos se recolectaron a través del tiempo y se ajustaron usando ecuación de ajuste global simultáneo para producir constantes de afinidad (valores KD) para cada anticuerpo biespecífico .
Tabla 3 Como se muestra en la Tabla 3, el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21M18 tuvo una constante de afinidad (KD) para el VEGF humano de 0.36nM y una KD para el DLL4 humano de 16nM. El anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21R79 tuvo una KD para el VEGF humano de 0.68nM y una KD para el DLL4 humano de 0.53nM. Ambos anticuerpos biespecífieos mostraron ligación más débil al VEGF de ratón como es comparado con el VEGF humano y ningún anticuerpo se ligó al DLL4 de ratón. De esta manera, ambos anticuerpos biespecíficos mostraron afinidad de ligación similar al VEGF humano y 219R45-MB-21R79 mostró aproximadamente una ligación 30 veces más potente al DLL4 humano que el 219R45-MB-21M18. Adicionalmente, el anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21R79 tuvo una afinidad de ligación similar a VEGF humano a pesar del hecho de que el anticuerpo biespecífico es monovalente para VEGF como es comparado con el anticuerpo parenteral bivalente .
Se identificaron varios anticuerpos anti-DLL4 adicionales que tuvieron afinidades de ligación intermedias con las KDs de 21M18 y 21R79. Dos de estos anticuerpos anti-DLL4 se usaron para producir anticuerpos biespecífieos anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21R75 y 219R45-MB-21R83. Usando el sistema Biacore 2000 como se describe en lo anterior, las KDs de los anticuerpos biespecífieos 219R45-MB-21R75 y 219R45-MB-21R83 al de DLL4 humano se determinaron. Una comparación de la afinidad de ligación al DLL4 humano de estos cuatro anticuerpos biespecífieos anti-VEGF/anti-DLL4 se muestra en la Tabla 4.
Las CDRs para los anticuerpos biespecífieos anti-VEGF/anti -DLL4 219R45-MB-21M18 , 219R45-MB-21R79 , 219R45-MB-21R75, y 219R45-MB-21R83 se muestran en la Figura 1A. La región variable de cadena pesada y cadena ligerea SEQ ID NOs se muestran en la Figura IB y la SEQ ID Nos de cadena pesada y cadena ligera (con o sin secuencia señal) como se muestra en la Figura 1C.
El anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 219R45- B-21M18 comprende una (a) cadena pesada codificada por el ADN que comprende SEQ ID NO: 75 depositado con American Type Culture Collection (ATCC) , 10801 University Boulevard, Manassas, VA, EUA, bajo las condiciones del Tratado de Budapest del 21 de Septiembre del 2012, y se le asignó el número de designación PTA , (b) una cadena pesada codificada por el ADN que comprende SEQ ID NO: 33 depositado con ATCC bajo las condiciones del Tratado de Budapest del 21 de Septiembre del 2012, y se le asignó el número de designación PTA , y (c) una cadena ligera codificada por el ADN que comprende SEQ ID NO: 34 depositado con el ATCC bajo las condiciones del Tratado de Budapest el 21 de Septiembre de 2012, y se le asignó el número de designación PTA El anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21R79 comprende (a) una cadena pesada codificada por el ADN que comprende SEQ ID NO: 31 depositada con ATCC bajo las condiciones del Tratado de Budapest el 21 de Septiembre del 2012, y se le asignó el número de designación PTA , (b) una cadena pesada codificada por el ADN que comprende SEQ ID NO: 33 depositada con ATCC bajo las condiciones del Tratado de Budapest el 21 de Septiembre del 2012 y se le asignó el número de designación PTA , y (c) una cadena ligera codificada por el ADN que comprende SEQ ID NO: 34 depositada con ATCC bajo las condiciones del Tratado de Budapest el 21 de Septiembre del 2012, y se le asignó el número de designación PTA .
En anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 y 219R45-MB-21R83 comprende (a) una cadena pesada codificada por el ADN que comprende SEQ ID NO: 72 depositada con ATCC bajo las condiciones del Tratado de Budapest el y se le asignó el número de designación PTA , (b) una cadena pesada codificada por el ADN que comprende SEQ ID NO: 33 depositada con ATCC bajo las condiciones del Tratado de Budapest el 21 de Septiembre del 2012, y se le asignó el número de designación PTA , e (c) una cadena ligera codificada por el ADN que comprende SEQ ID NO: 34 depositada con ATCC bajo las condiciones del Tratado de Budapest el 21 de Septiembre del 2012, y se le asignó el número de designación en PTA .
El anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21R75 comprende (a) una cadena pesada codificada por el ADN que comprende SEQ ID NO: 74 depositada con ATCC bajo las condiciones del Tratado de Budapest el 21 de Septiembre del 2012 y se le asignó el número de designación PTA , (b) una cadena pesada codificada por el ADN que comprende SEQ ID NO: 33 depositada con ATCC bajo las condiciones del Tratado de Budapest el 21 de Septiembre del 2012 y se le asignó el número de designación PTA y (c) una cadena ligera codificada por el ADN que comprende SEQ ID NO: 34 depositada con ATCC bajo las condiciones del Tratado de Budapest el 21 de Septiembre del 2012 y se le asignó el número designación PTA .
Tabla 4 Ejemplo 2 Ensayo HTRF para la ligación simultánea de anticuerpos biespecífieos a VEGF humano y DLL4 humano.
Para caracterizar las capacidades de ligación de ciertos anticuerpos y/o mezcla de anticuerpos a tanto VEGF como DLL4, se llevaron a cabo ensayos de fluorescencia resueltos en el tiempo homogéneo (HTRF) . Los anticuerpos sometidos a prueba fueron los anticuerpos biespecífieos anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21M18 y 219R45- B-21R79 , los anticuerpos parenterales 219R45 (anti-VEGF) , 21M18 (anti-DLL4 ) , 21R79 (anti-DLL4), una combinación de 219R45 y 21M18, una combinación de 219R45 y 21R79. Los anticuerpos o mezclas de anticuerpos se diluyeron en serie 2 veces de 3000nM a 2.9n en solución amortiguadora de ligación (IX de PBS, 0.1% de gelatina, 0.1% Polisorbato 20, fluoruro de potasio 400m ) y se colocaron en una placa de 96 pocilios blancos. Un volumen igual de solución que contiene 4 g/ml de hDLL4 - Fe etiquetado con d2 y 21.4ng/ml de hVEGFi65 etiquetado con tripato de Europio se agregaron a cada pocilio para un volumen final de ???µ? (concentraciones finales de fluoróforo aceptores y donadores fueron de 2ug/ml y 10.7ng/ml, respectivamente) . Las placas de ensayo se incubaron durante 2 horas durante la noche y se leyeron sobre un lector de Micro placas SpectraMax M5e (Molecular Devices, Sunnyvale CA) en una longitud de onda de excitación de 314nm.
Como se muestra en la Figura 2, los anticuerpos biespecíficos anti-VEGF/anti -DLL4 219R45-MB-21M18 y 219R45-MB-21R79, fueron capaz de ligarse tanto a hVEGF como a hDLL4 simultáneamente. De manera importante, ninguna de las combinaciones de los anticuerpos parenterales (es decir, 219R45 y 21M18 o 219R45 y 21R79) fueron capaces de ligarse a VEGF y DLL4 simultáneamente. Estos resultados muestran claramente que los anticuerpos biespecíficos an i-VEGF/anti -DLL4 219R45-MB-21M18 y 219R45-MB-21R79 son capaces de funcionar de manera diferente que una simple mezcla de los dos anticuerpos individuales.
Ejemplo 3 Inhibición de la proliferación de HUVEC por anticuerpos biespecífieos anti-VEGF/anti-DLL4 Células HUVEC se obtuvieron de Lonza (Walkersville MD) y se cultivaron en un medio de crecimiento (M199, 10% de FBS inactivado por calor (HI-FBS) , 50ug/ml de EGS , IX de heparina, L-glutamina lmM) . Para de proliferación de HUVEC, una placa de 96 pocilios se pre-recubrió con 50µ1 de 10ug/ml de solución tipo I de colágeno de cola de rata (colágeno I en ácido acético 0.02N) y se incubó a 4°C durante la noche. Después de la incubación, la palca se aspiró completamente para remover la solución de colágeno I no ligada y se lavó una vez con 200µ1 de DPBS . Las células HUVEC se removieron de la superficie de los matraces de crecimiento usando un reactivo sub-clon de células endoteliales y se centrifugó a 1200 rpm durante 5 minutos a 4°C. Las células se volvieron a suspender en un medio de inanición/ensayo (M199 y 2% de HI-FBS, IX de heparina, 5U/ml heparina-glutamina) en una densidad de 105 células/ml. Las células se sembraron en una placa de ensayo recubierta con colágeno a 5000 células/pocilio, 50ul/pocillo . Las células se incubaron durante 3 horas a 37°C, se lavaron una vez, se volvieron a alimentar con lOOul de medio de ensayo, y se incubaron durante la noche a 37°C. Al siguiente día, los anticuerpos biespecíficos 219 45-MB-21M18, 219R45-MB-21R79 , en anticuerpo parenteral 219R45, o el anticuerpo de control LZ1 se prepararon en una mezcla con VEGF humano (R&D Biosystems, Minneapolis M ) . Los anticuerpos se diluyeron en serie 5 veces de 20uM a 0.25nM en solución amortiguadora de ensayo en combinación con hVEGF (concentración final 5ng/ml) . La mezcla se pre-incubó a 37°C durante 2 horas. El medio se removió de la placa de ensayo, y ???µ? de la mezcla de anticuerpo/hVEGF se agregó a cada pocilio. Después de 3-4 días de incubación, el medio se removió y una alícuota reciente de la mezcla de anticuerpo/hVEGF se agregó a cada pocilio y se dejó incubar durante otros 4 días. En el día 7, 20µ1 de reactivo Azul Alamar (Invitrogen, Carlsbad, CA) se agregó a cada pocilio y se incubó a 37 °C durante 5-6 horas. La placa se leyó con un lector de Micro placas SpectraMax M5e (Molecular Devices, Sunnyvale CA) usando una longitud de onda de excitación de 539nm y una longitud de onda de emisión de 590nm.
Como se muestra en la Figura 3, los anticuerpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21M18 y 219R45-MB-21R79, así como el anticuerpo anti-VEGF parenteral 219R45 mostraron proliferación de HUVEC. Estos resultados muestran que los anticuerpos biespecíficos fueron capaces de inhibir la proliferación inducida por VEGF de células HUVEC.
Ejemplo 4 Inhibición de la señalización Notch inducida por DLL4 por anticuerpos específicos.
Células PC3 humanas se transíectaron con un vector de expresión que codifica un receptor Notch2 humano de longitud completa y un vector reportero de luciferasa de luciérnaga (reportero 8xCBF- luciferasa) que es responsable de la señalización Notch. Las células también se transíectaron con un reportero de luciferasa Renilla (Promega, Madison WI) como un control interno para la eficiencia de la transfección. La proteína DLL4 humana purificada se recubrió sobre placas de 96 pocilios a lOOng/pocillo y las células PC3-luc que expresan Notch2 se agregaron a los pocilios. Anticuerpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21 18 , 219R45-MB-21R79, anticuerpos anti-DLL4 parenterales 21M18, 21R79 o un anticuerpo de control LZ1 se diluyeron en serie 5 veces de 20ug/ml a 0.064ug/ml, se agregaron a los jgocillos apropiados, y se incubaron durante la noche. La actividad de la luciferasa se determinó usando un kit de ensayo de luciferasa doble (Promega, Madison, WI) con actividad de luciferasa de luciérnaga normalizada con la actividad de luciferasa Renilla .
Como se muestra en la Figura 4, el anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21R79 y los anticuerpos anti-DLL4 parenterales 21M18 y 21R79 inhibieron la señalización Notch inducida por DLL4. El anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21M18 inhibió la señalización Notch inducida por DLL4 solamente en consideraciones de anticuerpo altas. Estos resultados mostraron que el anticuerpo biespecífico anticuerpo 219R45-MB-21R79, y a un grado menor del anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21M18 , fueron capaces de inhibir la señalización Notch inducida por DLL4. De esta manera, en combinación con los resultados presentados en el Ejemplo 3, los anticuerpos biespecífieos anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21R79 y 219R45-MB-21M18, habían mostrado la capacidad de inhibir las funciones de señalización y/o proliferación inducidas tanto por VEGF como de DLL4.
Ejemplo 5 Inhibición del crecimiento tumoral in vivo por un anticuerpo biespecífico en un modelo de injerto de piel humana.
Un modelo de injerto de piel humana se ha reportado que comprende un injerto de piel humana y células tumorales humanas. Se establece un injerto de piel humana y luego las células tumorales humanas se implantan en el injerto de piel, permitiendo que las células tumorales se desarrollen en un entorno con estroma y vasculatura humana (Tahtis y colaboradores, 2003, Mol. Cáncer Ther. 2:229-737). Las muestras de piel humana se obtuvieron de tejido de prepucio neonatal y se injertó en el flanco lateral de ratones NOD-SCID. Después del establecimiento del injerto de piel, células tumorales de colon OMP-C8 etiquetadas con luciferasa (20,000 células) se inyectaron intradérmicamente en la piel humana. El crecimiento tumoral se supervisó por formación de imágenes de bioluminiscencia usando un sistema de formación de imágenes IVIS (Caliper Life Sciences, Mountain View, CA) . Los tumores se dejaron desarrollar hasta que alcanzaron 1.2 x 106 fotones por segundo. Los ratones que llevan tumor (n = 6 ratones/grupo) se eligieron al azar y se trataron con Ab de control, anticuerpo anti-hDLL4 21M18, anticuerpo anti-VEGF de bevacizumab, o anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 219R45- B-21M18. Los animales se trataron una vez a la semana y los anticuerpos se administraron intraperitonealmente en una dosis de 25mg/kg. El crecimiento tumoral se supervisó por formación de imágenes de bioluminiscencia en los días indicados .
Como se muestra en la Figura 5, tanto el anticuerpo anti-hDLL4 21M18 como el anticuerpo anti-VEGF de bevacizumab inhibieron el crecimiento tumoral en este modelo de injerto de piel humana/tumor humano. Adicionalmente, el anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21M18 fue más efectivo que ya sea el anticuerpo anti-DLL4 o el anticuerpo anti-VEGF solo. Estos datos muestran la utilidad fijar como objetivo simultáneamente el DLL4 y VEGF con un anticuerpo biespecífico.
Ejemplo 6 Tumorigenicidad de células tumorales pancreáticas OMP-PN8 después del tratamiento con anticuerpos biespecífieos anti-VEGF/anti-DLL4.
Ratones que llevan tumores pancreáticos 0MP-PN8 se trataron con anticuerpo de control (15 mg/kg) , anticuerpo anti-hDLL4 21M18 (15 mg/kg) , anticuerpo anti-VEGF de bevacizumab (15 mg/kg) , o anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21M18 o 219R45-MB-21R79 (30 mg/kg) con o sin gemcitabina (70 mg/kg) . Después de cuatro semanas de tratamiento, los tumores se recolectaron, se procesaron a suspensiones de células individuales y las células tumorales humanas se purificaron por agotamiento inmunomagnético de células de murino. 90 células tumorales humanas de cada grupo del tratamiento se transfirieron a un nuevo cohorte de ratones (n = 10 ratones/grupo) . Los tumores se dejaron desarrollar durante 55 días sin ningún tratamiento y los volúmenes del tumor se midieron con calibradores electrónicos.
La Figura 6 muestra el volumen de tumor de los ratones individuales en cada grupo. Las células aisladas de ratones tratados con anticuerpo anti-hDLL4 21M18 tuvieron un tumorigenicidad disminuida en gran medida, 5 de 10 ratones tuvieron tumores, como es comparada con las células aisladas de ratones tratados con el anticuerpo de control donde 9 de 10 ratones tuvieron tumores. La reducción en la frecuencia del crecimiento tumoral indica una reducción en la frecuencia de células madre cancerosas. En contraste, el tratamiento con bevacizumab no dio por resultado reducción de la frecuencia del crecimiento tumoral, 10 de 10 ratones tuvieron tumores. Similar al bevacizumab, el tratamiento con gemcitabina como un solo agente no tuvieron efecto en la frecuencia del crecimiento tumoral ya que 10 de 10 ratones tuvieron tumores. Los anticuerpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21M18 y 219R45-MB-21R79 ambos redujeron la frecuencia del crecimiento tumoral (5 de 10 ratones tuvieron tumores y 4 de 10 ratones tuvieron tumores, respectivamente) . El tratamiento de combinación con gemcitabina pareció que no tiene efecto en la frecuencia del crecimiento tumoral . Estos datos indican que el DLL4 objetivo reduce la frecuencia de células madre cancerosas mientras que el VEGF objetivo solo no lo hace. De manera importante, estos datos indican que la actividad anti-CSC del anticuerpo anti-DLL4 se retiene en un anticuerpo biespecífico.
Ejemplo 7 ELISA de Anticuerpo Biespecífico El VEGF (ATGEN, Corea del Sur) se recubrió sobre placas Nunc maxisorb a 2ug/ml ( ???µ?/pocillo) y se incubó durante la noche a 2-8°C. Los anticuerpos biespecíficos 219R45-MB-21M18 , 219R45-MB-21R79, 219R45-MB-21R75 , y 219R45-MB-21R83 se diluyeron en solución amortiguadora de bloqueo (lx de PBS, 0.1% de gelatina 0.1% de Polisorbato-20 , pH 7.4) que contiene 2µg/ml de biotina-DLL4-hFc . Los anticuerpos se diluyeron en serie 3 veces de 500ng/ml a 0.008ng/ml . Las muestras de anticuerpo se incubaron durante 2 horas en solución amortiguadora de bloqueo que contiene la biotina-DLL4 -hFc . Después de la incubación, las muestras de anticuerpo se transfirieron a la placa de ensayo recubierta con VEGF (100 ul/pocillo) y se incubaron durante 2 horas. Estreptavidina-HRP (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) se agregó a cada pocilio y se incubó durante 1 hora. El substrato TMB se agregó a los pocilios con un desarrollo de color de 10 minutos y la reacción se detuvo con ácido sulfúrico 2M. La absorbancia se leyó a 450-650nm y los datos se analizaron usando el ajuste de 4 parámetros dentro del programa de análisis Softmax Pro (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) .
La Figura 7 muestra las curvas de titulación de los anticuerpos biespecíficos 219R45-MB-21M18 (círculos abiertos) , 219R45-MB-21R79 (cuadrados abiertos) , 219R45-MB-21R75 (triángulos abiertos) , y 219R45-MB-21R83 (triángulos abiertos) en comparación con un anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 de referencia (círculos sólidos) . Las potencias relativas para los anticuerpos biespecíficos como es comparado con el anticuerpo biespecífico de referencia se muestran en la Tabla 5.
El anticuerpo biespecífico 219R45-MB-21R79 que el más potente, aproximadamente 7 veces más potente que 219R45-MB-21M18, que reflejó la afinidad más alta del sitio de ligación a antígeno 21R79.
Ejemplo 8 Producción de Anticuerpos Biespecíficos Los anticuerpos biespecíficos se produjeron usando una línea de células GS-CHO. Las células CH0K1SV (Lonza Biologics) se transíectaron a través de electroporación con el gen(s) de interés acoplado con glutamina sintetasa (GS) como el marcador seleccionable . Los transfectantes y subclones se clasificaron para la productividad de anticuerpos y los productores altos se seleccionaron para la producción de mayor escala. Las células se desarrollaron usando un proceso de lote de alimentación y bioreactores de lote de alimentación. El anticuerpo acumulado en el fluido de cultivo de células recolectadas (HCCF) se aisló y se purificó usando técnicas de cromatografía.
Líneas de células de anticuerpo biespecíficos 219R45-MB-21M18.010.017 y 219R45-MB-21R79.017.003 se cultivaron en bioreactores de tanque agitados de 5L durante 14 días . Las líneas de células 219R45-MB-21M18.010.017 produjeron un título de anticuerpo final de 3. Og/L y la línea de células 219R45- B-21R79.017.003 produjo un título de anticuerpo final de 0.8g/L. Las líneas de células 219R45-MB-21R75.101 y 219R45-MB-21R83.113 se cultivaron en sistemas de bioreactor WAVE de 25L (GE Healthcare) usando un proceso de lote de alimentación que logró títulos de anticuerpo finales de 0.4g/L. Las líneas de células de anticuerpos biespecífieos 219R45- B-21M18AG.138.007, 219R45-MB-21M18AG .038.009 , 219R45-MB-21M18AG.142.002, 219R45-MB-21R79AG.072.014 y 219R45-MB- 21R83AG.129.003 se cultivaron en bioreactores de tanque de agitado de 5 L durante 14 - 15 días . La línea de células 219R45-MB -21M18AG. 138.007 produjo un título de anticuerpo final de 1.0 g/L después de 14 días . La línea de células 219R45- B -21M18AG. 038.009 produjo un título de anticuerpo final de 1.6 g/L después de 14 días . La línea de células 219R45- B -21M18AG. 142.002 produjo un título de anticuerpo final de 2.6 g/L después de 14 días . La línea de células 219R45-MB -21R79AG. 072.014 produjo un título de anticuerpo final de 2.1 g/L después de 15 días . La línea de células 219R45-MB -21M18AG. 038.009 produjo un título de anticuerpo final de 2.4 g/L después de 15 días. El fluido de cultivo se recolectó por filtración de cada una de estas cuatro líneas de células y se sometió a la cromatografía de afinidad de proteína A. La columna de proteína A se lavó con una serie de soluciones amortiguadoras y los anticuerpos se eluyeron usando una solución amortiguadora de elución con pH bajo. La caracterización inicial de la pureza de los anticuerpos biespecífieos se llevó a cabo usando cromatografía de exclusión de tamaño (SEC-HPLC) y en foque isoeléctrico (IEF) .
La cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) se usó para determinar la pureza del producto de anticuerpo. La SEC es un método cromatográfico bien conocido en el cual las moléculas (por ejemplo, anticuerpos) en solución se separan por su tamaño. La SEC se puede usar para distinguir un producto de anticuerpo de agregado y/o impurezas, y para determinar el porcentaje del producto de anticuerpo como es comparado con la mezcla total. Como se usa en la presente, la SEC no distingue entre un anticuerpo homomérico y un anticuerpo biespecífico heterodimérico .
El enfoque isoeléctrico capilar de imagen (icIEF) se usó para determinar la identidad y pureza de los heterodímeros de anticuerpo biespecífico. Usando el icIEF, las isoformas de carga del anticuerpo se separan de acuerdo con su pl y el resultado es una "huella" de la distribución de carga del anticuerpo. El método icIEF también puede servir como una determinación de pureza al separar los heterodímeros de anticuerpo biespecífico por su pl distinta de cualquiera de los productos o impurezas de homodímeros.
Las muestras de anticuerpo biespecífieos se analizaron por icIEF en un instrumento ProteinSimple ICE280 (ProteinSimple , Santa Clara, CA) . Para este análisis, una mezcla de proteínas se introduce en un capilar, se aplica voltaje alto a través del capilar y los anfolitos establecen un gradiente de pH lineal a lo largo de la longitud del capilar. Bajo la influencia del campo eléctrico, los marcadores de pl y la mezcla de protección ambos migran la longitud del capilar hasta que se alcanza un valor de pH donde la carga neta es cero. Una vez enfocado, el instrumento ICE280 usa una detección de formación de imágenes de columna completa con una cámara UV de 280-nm para supervisar el patrón de las isoformas de proteína dentro del capilar. El electroferograma resultante se calibra usando marcadores de pl internos y se integra para establecer el porcentaje de área respectivas de las isoformas cargadas diferentes de la mezcla de proteínas. Los perfiles de carga de varios anticuerpos específicos anti-VEGF/anti-DLL4 se muestran en la Figura 8. Para este experimento, se diluyeron eluatos de Proteína A con agua MilliQ a una concentración de 6.6mg/ml . Un total de 18µ1 de la muestra se mezclaron con 100uL de 8M urea, 70µ1 de 0.5% de metilcelulosa, 8µ1? de 3-10 Pharmalyte, 2µ1 de marcador de pl alto y 2µ1 de marcador de pl bajo a un volumen final de 200µ1. La Tabla 6 muestra el porcentaje del producto de anticuerpo de las líneas de células 219R45-MB-21M18.010.017, 219R45- B-21R79.017.002 , 219R45 -MB-21R75.101 , 219R45-MB-21R83.113 , 219R45 -MB-21M18.138.007 , 219R45-MB-21M18AG.038.009, 219R45-MB-21M18AG.142.002 , 219R45-MB- 21R79AG.072.014, y 219R45-MB-21R83AG .129.003 después de la cromatografía de afinidad de Proteína A como es determinado por SEC-HPLC. La Tabla 6 también muestra el porcentaje de los anticuerpos heterodiméricos de las líneas de células 219R45-MB-21M18.010.017, 219R45-MB-21R79.017.002 , 219R45-MB- 21R75.101, 219R45-MB-21R83.113, 219R45-MB-21M18.138.007 , 219R45-MB-21M18AG.038.009, 219R45 -MB-21M18AG .142.002 , 219R45-MB-21R79AG.072.014, y 219R45-MB-21R83AG.129.003 después de la cromatografía de afinidad de Proteína A como es analizado por icIEF.
Tabla 6 La pureza del producto de anticuerpo biespecífico se puede incrementar adicionalmente por etapas de cromatografía adicionales. Después de la cromatografía de afinidad de Proteína A, la fracción de eluato se mantuvo en un pH bajo por no menos de 60 minutos a temperatura ambiente para la inactivación viral. La solución de anticuerpos (eluato de columna de Proteína A, pH ajustado) se cargó sobre una columna de intercambio aniónico potente. Las impurezas relacionadas con el producto y proceso ligadas a la resina de cromatografía de intercambio aniónico y a la fracción de flujo pasante (producto de anticuerpo) se recolectó. En algunos casos, la pureza se mejoró adicionalmente mediante el uso de una resina de cromatografía multimodal tal como hidroxiapatita de cerámica. En algunos casos, el intercambio de solución amortiguadora del producto de anticuerpo se llevó a cabo usando técnicas de ultrafiltración y diaf iltración, después de lo cual los excipientes se agregaron. El anticuerpo formulado se filtró estéril en contenedores estériles y se almacenó refrigerado o congelado. La pureza de los anticuerpos biespecífieos se volvió a evaluar usando SEC-HPLC y IEF.
Tabla 7 Como se muestra en la Tabla 7, la purificación de los anticuerpos biespecífieos anti-VEGF/anti-DLL4 con etapas de cromatografía adicional después de la Proteína A dio por resultado el aislamiento de los productos de anticuerpo que fueron 95% a aproximadamente 99% puros como es analizado por SEC. El análisis por IEF determinó que el anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 purificado de la línea de células 219R45-MB-21M18.010.017 fue de 98.5% heterodimérico, el anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 de la línea de células 219R45-MB-21R79.017.002 fue 99.3% heterodimérico, el anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 de la línea de células 219R45-MB-21R75.101 fue 98.2% heterodimérico, el anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 de la línea de células 219R45-MB-21R83.113 fue 91.4% heterodimérico, el anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 de la línea de células 219R45-MB-21M18.138.007 fue 100% heterodimérico, el anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 de la línea de células 219R45-MB-21M18AG.142.002 fue 100% heterodimérico, el anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 de la línea de células 219R45-MB-21R79AG.072.014 fue 100% heterodimérico, y el anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 de la línea de células 219R45-MB-21R83AG.129.003 fue 100% heterodimérico. Estos resultados mostraron que la etapa de cromatografía de intercambio aniónico incrementó en gran medida el porcentaje de anticuerpos heterodiméricos como es comparado con la purificación con la cromatografía de Proteína A sola. La adición de una etapa de cromatografía multi-modal tal como hidroxiapatita de cerámica también puede mejorar la pureza monomérica (como es determinado por SEP-HPLC) .
Ejemplo 9 Inhibición del crecimiento tumoral de colon 0MP-C8 en el modelo de recurrencia de tumor in vivo Suspensiones de células individuales de xenoinjertos de tumor de colon 0MP-C8 (20,000 células) se inyectaron cutáneamente en los flancos de ratones NOD/SCID de 6-8 semanas de edad. Los tumores se dejaron desarrollar durante 33 días hasta que alcanzaron un volumen promedio de 240mm3. Los ratones se eligieron al azar (n = 10 por grupo) y se trataron con anticuerpo anti-hDLL4 21M18, anticuerpo anti-VEGF bevacizumab, una combinación de anticuerpos 21M18 y bevacizumab, anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 219R45- B-21M18, anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21R79, o el anticuerpo de control, todos en combinación con irinotecano. Los anticuerpos y el irinotecano se dosificaron semanalmente por inyección en la cavidad intraperitoneal . Los anticuerpos 21M18 y bevacizumab se dosificaron a 7.5mg/kg, los anticuerpos biespecíficos 219R45-MB-21M18 y 219R45-MB-21R79 se dosificaron a 15mg/kg, y el irinotecano se dosificó a 45mg/kg. El irinotecano se dosificó durante cuatro semanas, tiempo en el cual, se descontinuó y la administración de los anticuerpos continuó. El crecimiento tumoral se supervisó y los volúmenes de tumor se midieron con calibradores electrónicos en los puntos de tiempo indicados. Los datos se expresan como media ± S.E.M.
Como se muestra en la Figura 9, el anticuerpo anti-hDLL4 21M18 continuó mostrando crecimiento tumoral después de que se detuvo el tratamiento con irinotecano. En contraste, el anticuerpo anti-VEGF bevacizumab no fue capaz de inhibir el crecimiento de nuevo del tumor después de que se había detenido la administración de irinotecano. La combinación del anticuerpo anti-DLL4 21M18 y el anticuerpo anti-VEGF bevacizumab dio por resultado mayor inhibición del crecimiento de nuevo del tumor que cualquier agente solo. Adicionalmente, el anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21M18 fue más efectivo en inhibir el crecimiento de nuevo del tumor que la mezcla de los dos anticuerpos.
Ejemplo 10 Reducción en la tumorigenicidad de tumores de colon OMP-C8 Suspensiones de células individuales de xenoinjerto de tumor de colon OMP-C8 (20,000 células) se inyectaron subcutáneamente en los flancos de ratones NOD/SCID de 6-8 semanas de edad. Los tumores se dejaron desarrollar durante 33 días hasta que alcanzaron un volumen promedio de 300mm3. Los ratones se eligieron al azar (n = 5 por grupo) y se trataron con anticuerpo anti-DLL4 21M18, anticuerpo anti-VEGF bevacizumab, una combinación de anticuerpos 21M18 y bevacizumab, anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21 18, anticuerpo biespecífico anti-VEGF/anti -DLL4 219R45-MB-21R79, o el anticuerpo de control, ya sea en combinación con irinotecano o sin irinotecano. Los anticuerpos e irinotecanos se dosificaron semanalmente por inyección en la cavidad intraperitoneal . Los anticuerpos 21M18 y bevacizumab se dosificaron a 7.5mg/kg, los anticuerpos biespecíficos 219R45-MB-21 18 y 219R45-MB-21R79 se dosificaron a 15mg/kg, e el irinotecano se dosificó a 45mg/kg. Los tumores se recolectaron después de 4 semanas, se procesaron en suspensiones de células individuales, y las células tumorales humanas se aislaron. 150 células tumorales de cada grupo experimental se inyectaron subcutáneamente en un nuevo cohorte de ratones (n = 10 por grupo) y los tumores se dejaron desarrollar sin tratamiento. El crecimiento tumoral se supervisó y los volúmenes de tumor se midieron con calibradores electrónicos.
Los volúmenes de tumor individuales en el día 68 se muestran en la Figura 10. El anticuerpo anti-DLL4 21M18, la combinación de 21M18 con el anticuerpo unanti-VEGF bevacizumab, los anticuerpos biespecíficos 219R45-MB-21M18 y 219R45-MB-21R79, y el irinotecano redujeron la frecuencia del crecimiento tumoral como agentes individuales. En contraste, el bevacizumab anti-VEGF como un solo agente no tuvo efecto en la frecuencia del crecimiento tumoral como es comparado con el anticuerpo de control. En los grupos tratados con una combinación de irinotecano y anticuerpos, el anticuerpo biespecífico 219R45 -MB-21M18 tuvo el efecto más grande en la reducción de la frecuencia del crecimiento tumoral.
Ejemplo 11 Inhibición del crecimiento tumoral del colon 0MP-C8 in vivo Suspensiones de células individuales de xenoinjertos de tumor de colon 0MP-C8 (50,000 células) se inyectaron subcutáneamente en los flancos de ratones NOD/SCID de 6.8 semanas de edad. Los tumores se dejaron desarrollar durante 21 días hasta que alcanzaron un volumen promedio de 80mm3. Los ratones se eligieron al azar (n = 8 por grupo) y se trataron con el anticuerpo anti-DLL4 21M18, el anticuerpo anti-VEGF bevacizumab, los anticuerpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21M18, 219R45-MB-21R75, 219R45-MB-21R79, 219R45-MB-21R83 , o el anticuerpo de control, ya sea solos o en combinación con irinotecano. Los anticuerpos y el irinotecano se dosificaron semanalmente por inyección en la cavidad intraperitoneal . El bevacizumab y los anticuerpos biespecíficos 219R45-MB-21M18, 219R45-MB-21R75 , 219R45-MB-21R79, y 219R45-MB-21R83 se dosificaron en 15mg/kg, y el irinotecano se dosificó a 7.5mg/kg. El crecimiento tumoral se supervisó y los volúmenes de tumor se midieron con calibradores electrónicos en los puntos de tiempo indicados. Los datos se expresan como media ± S.E.M.
Como agentes individuales, los cuatro anticuerpos biespecíficos anti -VEGF/anti-DLL4 mostraron actividad antitumor mejorada relativa con el anticuerpo anti-VEGF bevacizumab. En combinación con el irinotecano, el tratamiento con los anticuerpos biespecíficos anti-VEGF/anti-DLL4 219R45-MB-21M18 y 219R45-MB-21R83 dio por resultado la inhibición más grande del crecimiento tumoral (Figura 11) .
Después de la fase de tratamiento, las secciones de tumor se prepararon y se analizaron por tinción de hematoxilina y eosina (H&E) . Los tumores tratados con 219R45-MB-21M18 y 219R45-MB-21R83 en combinación con irinotecano mostraron regiones de tinción rosadas oscuras que proporcionan evidencia de calificación extensiva. Esto es característico del tejido tumoral sumamente necrótico.
Ejemplo 12 Estudio de toxicidad no de GLP de anticuerpos biespecíficos en monos cynomolgus Un estudio de toxicidad no GLP en monos cynomolgus se inició para evaluar y comparar el perfil de toxicidad de algunos de los anticuerpos biespecíficos . Los animales se dosificaron con 0 mg/kg (control) , 5 mg/kg (dosis baja) , o 30 mg/kg (dosis alta) de anticuerpo biespecífico anti-DLL4/anti-VEGF (219R45-MB-21M18, 219R45-MB-21R83 , o 219R45-MB-21R79) cada 2 semanas a través de infusión IV. 3 mujeres y 3 hombres se dosificaron en cada grupo. Después de 15 semanas, los pesos corporales medios fueron menores en los animales que recibieron la dosis alta de 219R45- B-21R79 que en animales que recibieron la dosis alta de ya sea 219R45-MB-21R18 o 219R45-MB-21R83. Además, los niveles de albúmina de suero medios fueron menores en animales que recibieron 219R45-MB-21R79 que en aquellos que recibieron ya sea 219R45-MB-21R18 o 219R45-MB-21R83. Aunque preliminares en carácter, estos resultados tempranos sugieren que 219R45-MB-21R18 y 219R45-MB-21R83 pueden tener un perfil de toxicidad superior comparados con 219R45- B-21R79.
Se va a entender que los ejemplos y modalidades descritos en la presente son para propósitos ilustrativos solamente y que varias modificaciones o cambios en vista de los mismos serán sugeridos a personas expertas en el campo y se van a incluir dentro del espíritu y ámbito de esta solicitud.
Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente, sitios de internet, y números de acceso/secuencias de bases de datos incluyendo tanto secuencias de polinucleótidos y polipéptidos citadas en la presente se incorporan por este medio a manera de referencia en la presente en su totalidad para todos los propósitos al mismo grado como si cada publicación individual, patente, solicitud de patente, sito de internet, o número de acceso/secuencia de base de datos se indicó específica e individualmente para ser incorporada de esta manera a manera de referencia.
BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS Cadena pesada con secuencia señal (subrayada) 21M18 (SEQ ID NO:l) MKHL FFLLLVAAPR VLSQVQLVQSGAEVKKPGASVKISC ASGYSFTAYYIHWVKQAP GQGLEWIGYISSYNGATNYNQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYD YDVGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTC VDHKPSNTKVDKTVERKC CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP LDSDGS FFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Cadena pesada con secuencia señal (subrayada) 21R79 (SEQ ID NO: 2) MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAP GQGLE IGYIA Y RATNY QKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYD YDVGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTC VDHKPSNTKVDKTVERKC CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVQF WYVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQP REPQVYTLPPSREEMTK QVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGS FFLYSELTVDKSRWQQG VFSCSV HEALHNHYTQKSLSLSPGK Cadena pesada con secuencia señal (subrayada) 219R45 (SEQ ID NO: 3) MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYW HWVRQAP GQGLE MGDINPSNGRTSYKEKFKRRVTLSVDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYFCTIHYD DKYYPLMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVS NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVER KCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKG QPREPQVYTLPPSREKMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE ESNGQPENNYKTTPP LKSD GSFFLYSKLTVDKSR QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Cadena ligera con secuencia señal (subrayada) (SEQ ID N0:4) MVLQTQVFISLLLWISGAYGDIVMTQSPDSLAVSLGERATISCRASESVDNYGISFMKWF QQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEVPW TFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL FYPREAKVQ KVADNLQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Cadena pesada sin secuencia señal predicha 21 18 (SEQ ID NO: 5) QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAPGQGLEWIGYISSYNGATNY NQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVQFN YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRV VSVLTWHQD LNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSELTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Cadena pesada sin secuencia señal predicha 21R79 (SEQ ID NO: 6) QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAPGQGLEWIGYIANYNRATNY NQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSWTVPSSNFGTQTYTC VDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRV VSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTK Q VSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPEN YKTTPPMLDSDGSFFLYSELTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Cadena pesada sin secuencia señal predicha 219R45 (SEQ ID NO: 7) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGDINPSNGRTSY KEKFKRRVTLSVDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYFCTIHYDDKYYPLMDYWGQGTLVTVS SASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTC VDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVH AKTKPREEQFNSTF RWSVLTWHQDWLNGKEYKC VSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREKMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLKSDGSFFLYSKLTVDKSR QQG VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Cadena ligera sin secuencia señal predicha (SEQ ID NO: 8) DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCRASESVDNYGISFMKWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGS GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVI FPPSDEQLKSGTASWCLLN FYPREAKVQ KVADNLQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Región variable de cadena pesada 21M18 (SEQ ID NO: 9) QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAPGQGLEWIGYISSYNGATNY NQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYWGQGTLVTVSS Región variable de cadena pesada 21R79 (SEQ ID NO: 10) QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIH VKQAPGQGLEWIGYIANYNRATNY NQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVG DY GQGTLVTVSS Región variable de cadena pesada 219R45 (SEQ ID NO: 11) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH VRQAPGQGLEWMGDINPSNGRTSY KEKFKRRVTLSVDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYFCTIHYDDKYYPLMDYWGQGTLVTVSS Región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 12) DIV TQSPDSLAVSLGERATISCRASESVDNYGISFMKWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGS GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEVPWTFGGGTKVEI CDR1 de cadena pesada 21R75, 21R79, 21R83, y 21M18 (SEQ ID NO: 13) TAYYIH CDR1 de cadena pesada al eARNtiva 21R75, 21R79, 21R83, y 21M18 (SEQ ID NO:79) AYYIH CDR2 de cadena pesada 21R79 (SEQ ID NO: 14) YIANYNRATNYNQKFKG CDR2 de cadena pesada 21M18 (SEQ ID NO: 15) YISSYNGATNYNQKFKG CDR3 de cadena pesada 21R75, 21R79, 21R83, y 21M18 (SEQ ID NO:16) RDYDYDVGMDY CDR1 de cadena pesada 219R45 (SEQ ID NO: 17) NYWMH CDR2 de cadena pesada 219R45 (SEQ ID NO: 18) DINPSNGRTSYKEKFKR CDR3 de cadena pesada 219R45 (SEQ ID NO: 19) HYDDKYYPLMDY CDR1 de cadena ligera (SEQ ID NO: 20) RASESVDNYGISFMK CDR2 de cadena ligera (SEQ ID NO: 21) AASNQGS CDR3 de cadena ligera (SEQ ID NO: 22) QQSKEVPWTFGG DLL4 humano con secuencia señal (subrayada) (SEQ ID NO: 23) MAAASRSASGWALLLLVALWQQRAAGSGVFQLQLQEFINERGVLASGRPCEPGCRTFFRV CLKHFQAWSPGPCTFGTVSTPVLGTNSFAVRDDSSGGGRNPLQLPFNFTWPGTFSLIIE AWHAPGDDLRPEALPPDALIS IAIQGSLAVGQNWLLDEQTSTLTRLRYSYRVICSDNYY GDNCSRLCKKRNDHFGHYVCQPDGNLSCLPGWTGEYCQQPICLSGCHEQNGYCSKPAECL CRPGWQGRLCNECIPHNGCRHGTCSTP QCTCDEGWGGLFCDQDLNYCTHHSPCKNGATC SNSGQRSYTCTCRPGYTGVDCELELSECDSNPCRNGGSCKDQEDGYHCLCPPGYYGLHCE HSTLSCADSPCFNGGSCRERNQGANYACECPPNFTGSNCEKKVDRCTSNPCANGGQCLNR GPSRMCRCRPGFTGTYCELHVSDCARNPCAHGGTCHDLENGLMCTCPAGFSGRRCEVRTS IDACASSPCFNRATCYTDLSTDTFVCNCPYGFVGSRCEFPVG DLL4 humano sin secuencia señal predicha (SEQ ID NO: 24) SGVFQLQLQEFINERGVLASGRPCEPGCRTFFRVCLKHFQAWSPGPCTFGTVSTPVLGT NSFAVRDDSSGGGRNPLQLPFNFTWPGTFSLIIEAWHAPGDDLRPEALPPDALISKIAIQ GSLAVGQNWLLDEQTSTLTRLRYSYRVICSDNYYGDNCSRLCKKRNDHFGHYVCQPDGNL SCLPGWTGEYCQQPICLSGCHEQNGYCSKPAECLCRPGWQGRLCNECIPHNGCRHGTCST PWQCTCDEGWGGLFCDQDLNYCTHHSPCKNGATCSNSGQRSYTCTCRPGYTGVDCELELS ECDSNPCRNGGSCKDQEDGYHCLCPPGYYGLHCEHSTLSCADSPCFNGGSCRERNQGANY ACECPPNFTGSNCEKKVDRCTSNPCANGGQCLNRGPSRMCRCRPGFTGTYCELHVSDCAR NPCAHGGTCHDLENGLMCTCPAGFSGRRCEVRTSIDACASSPCFNRATCYTDLSTDTFVC NCPYGFVGSRCEFPVG Región N-Terminal de DLL4 humano (SEQ ID NO: 25) SGVFQLQLQEFINERGVLASGRPCEPGCRTFFRVCLKHFQAWSPGPCTFGTVSTPVLGT NSFAVRDDSSGGGRNPLQLPFNFTWPGTFSLIIEAWHAPGDDLRPEALPPDALISKIAIQ GSLAVGQN Dominio DSL de DLL4 humano (SEQ ID NO: 26) WLLDEQTSTLTRLRYSYRVICSDNYYGDNCSRLCKKRNDHFGHYVCQPDGNLSCLPGWTG EYC VEGF humano-A con secuencia señal (subrayada) (SEQ ID NO: 27) lyLNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVD IFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEM SFLQHNKCECRPKKDRARQEKKSVRGKGKGQKRKRKKSRYKSWSVYVGARCCLMPWSLPG PHPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR VEGF humano-A sin secuencia señal predicha (SEQ ID NO: 28) APMAEGGGQNHHEWKF DVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGC CNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQEKKSVRG KGKGQKRKRKKSRYKSWSVYVGARCCLMPWSLPGPHPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSC KNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR Secuencia de nucleótidos de cadena pesada 21M18 (13B Versión 1) (SEQ ID NO:29) ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCCAGATGGGTGCTGTCCCAG GTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATCTCC TGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGCTTACTACATCCACTGGGTCAAGCAGGCCCCT GGGCAGGGCCTGGAATGGATCGGCTACATCTCCTCCTACAACGGCGCCACCAACTACAAC CAGAAATTCAAGGGCCGCGTGACCTTCACCACCGACACCTCCACCTCCACCGCCTACATG GAACTGCGGTCCCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGACTACGAC TACGACGTGGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCTCTGCCTCC ACCAAGGGCCCATCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCTGAGTCTACC GCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAAC TCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTG TACTCCCTGTCTAGCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACC TGTAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAGCGGAAGTGC TGCGTGGAGTGCCCTCCTTGTCCTGCTCCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTC CCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTG GTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTG TCTGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCAGCAAGACCAAGGGCCAGCCT CGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCAGCCGGGAAGAAATGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCT AACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTATGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTGTACTCCGAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC TCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTG TCTCCTGGCAAGTAG Secuencia de nucleótidos de cadena pesada 21R79 (13B Versión 1) (SEQ ID NO:30) ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCCAGATGGGTGCTGTCCCAG GTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATCTCC TGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGCCTACTACATCCACTGGGTGAAACAGGCACCA GGCCAGGGACTGGAATGGATCGGCTATATCGCCAACTACAACCGGGCCACCAACTACAAC CAGAAATTCAAGGGCCGCGTGACCTTCACCACCGACACCTCCACCTCCACAGCCTACATG GAACTGCGGTCCCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGACTACGAC TACGACGTGGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCCGCCTCC ACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCTGAGTCTACC GCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAAC TCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTG TACTCCCTGTCTAGCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACC TGTAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAGCGGAAGTGC TGCGTGGAGTGCCCTCCTTGTCCTGCTCCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTC CCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTG GTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTG TCTGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCAGCAAGACCAAGGGCCAGCCT CGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCAGCCGGGAAGAAATGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCT AACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTATGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTGTACTCCGAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC TCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTG TCTCCTGGCAAGTAG Secuencia de nucleótidos de cadena pesada 21R79 (13B Versión 2) (SEQ ID NO:31) ATGAAGCACCTATGGTTCTTTCTATTATTAGTGGCCGCTCCCCGTTGGGTGTTATCGCAG GTTCAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCATCCGTGAAAATAAGT TGCAAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGGTTAAACAGGCACCA GGACAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCGCTAATTATAATAGAGCTACAAACTATAAC CAAAAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCTCGACAGCATACATG GAATTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCGCTAGAGATTATGAT TATGATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCTGCATCC ACTAAGGGACCATCCGTGTTCCCTTTGGCCCCTTGCTCTCGTTCGACCTCTGAATCGACT GCCGCTCTGGGATGCCTCGTGAAAGATTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTTTCCTGGAAC TCGGGCGCCCTAACCTCTGGCGTGCACACATTCCCTGCCGTGCTACAGTCTTCTGGCCTA TACTCTTTATCTTCGGTTGTTACCGTACCTTCTTCTAACTTCGGAACCCAAACTTACACC TGTAACGTAGACCACAAGCCTTCGAACACCAAGGTGGACAAGACTGTTGAGCGAAAGTGC TGCGTTGAGTGCCCTCCATGTCCTGCACCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTC CCTCCAAAACCTAAGGACACTCTAATGATCTCTCGGACTCCTGAGGTGACTTGCGTGGTT GTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGAGTCGAG GTGCACAATGCAAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTT TCTGTGTTGACCGTTGTGCACCAAGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCAGCAAGACCAAGGGCCAGCCT CGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCAGCCGGGAAGAAATGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTTGAGTGGGAGTCT AACGGACAGCCGGAGAACAACTACAAGACTACGCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTGTACTCCGAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC TCATGCTCCGTAATGCACGAAGCCTTGCACAATCACTACACTCAAAAGTCCCTATCCTTA TCTCCTGGCAAGTAG Secuencia de nucleótidos de cadena pesada 219R45 (13? Versión 1) (SEQ ID NO:32) ATGAAGCATCTGTGGTTTTTCCTGTTGCTCGTGGCGGCACCCAGATGGGTGTTGTCCCAA GTGCAGCTGGTCCAGAGCGGGGCTGAGGTGAAGAAACCCGGAGCAAGCGTAAAAGTATCG TGTAAGGCCTCGGGGTACACGTTTACAAACTACTGGATGCATTGGGTGCGGCAGGCTCCG GGACAGGGGTTGGAATGGATGGGTGACATTAACCCCTCAAATGGCAGAACATCATATAAG GAAAAGTTCAAACGCCGCGTCACACTCTCCGTGGACAAGTCAAGCTCGACTGCGTACATG GAACTTTCGTCGCTGAGGTCGGAGGACACGGCAGTGTACTTTTGCACCATCCATTATGAT GACAAGTATTACCCTCTGATGGATTATTGGGGTCAGGGTACGTTGGTCACCGTCTCCAGC GCGTCGACGAAAGGTCCCTCGGTATTTCCCCTCGCCCCCTGCTCGAGGTCGACATCCGAA TCAACAGCTGCCCTCGGCTGCCTGGTCAAAGACTACTTCCCAGAGCCGGTAACGGTGTCG TGGAACTCGGGAGCGCTTACGTCCGGAGTCCACACATTTCCGGCGGTACTGCAATCCTCG GGACTGTATTCGTTGTCGTCAGTGGTGACTGTCCCGTCCTCCAATTTCGGGACTCAGACC TATACGTGCAACGTCGACCACAAACCCTCAAACACCAAGGTGGATAAGACAGTGGAGCGC AAGTGCTGCGTGGAGTGTCCCCCGTGTCCGGCACCCCCTGTCGCCGGACCCTCAGTCTTT TTGTTTCCGCCGAAGCCCAAAGATACACTCATGATCTCAAGAACGCCCGAGGTAACATGC GTGGTGGTCGATGTAAGCCACGAGGATCCAGAAGTACAATTCAATTGGTATGTAGACGGG GTCGAGGTCCATAACGCAAAGACGAAACCGAGGGAAGAGCAGTTCAATTCGACTTTCCGG GTGGTGTCGGTGCTTACAGTCGTACATCAGGACTGGTTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGT AAAGTATCGAATAAGGGCCTTCCAGCGCCGATTGAAAAGACCATCTCCAAGACCAAAGGA CAGCCACGAGAGCCGCAAGTCTATACGCTTCCTCCCAGCCGAGAAAAGATGACTAAAAAC CAGGTATCGCTTACGTGTCTCGTCAAGGGTTTCTACCCTTCGGACATCGCGGTGGAATGG GAGAGCAATGGACAACCGGAAAACAACTACAAGACGACACCGCCTATGTTGAAAAGCGAT GGATCGTTTTTCCTCTATTCGAAACTCACGGTCGATAAGTCACGGTGGCAGCAGGGGAAT GTGTTCTCCTGTTCAGTGATGCACGAGGCGCTCCACAATCACTATACCCAGAAAAGCCTG TCACTTTCCCCGGGAAAATGA Secuencia de nucleótidos de cadena pesada 219R45 (13A Versión 2) (SEQ ID NO:33) ATGAAGCACCTCTGGTTCTTCCTGCTCCTCGTGGCTGCTCCTCGGTGGGTCCTCTCCCAA GTGCAGCTGGTCCAGAGCGGGGCTGAGGTGAAGAAACCCGGAGCTTCCGTCAAAGTCTCC TGTAAGGCTTCCGGATACACCTTTACCAACTATTGGATGCACTGGGTGCGGCAGGCTCCT GGACAAGGGCTGGAATGGATGGGAGACATCAATCCTTCCAATGGCAGAACCTCCTACAAG GAAAAATTCAAACGGCGGGTCACACTCTCCGTGGACAAGTCTAGCTCCACAGCTTACATG GAACTCTCCTCCCTGCGGTCCGAAGACACAGCTGTCTACTTCTGCACCATCCACTACGAC GACAAGTACTACCCTCTGATGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTGTCCAGC GCTTCCACAAAAGGACCCTCCGTCTTTCCCCTCGCCCCCTGCTCCCGGTCCACATCCGAA TCAACAGCTGCCCTCGGCTGCCTGGTCAAAGACTACTTCCCAGAGCCTGTCACAGTGTCC TGGAACTCCGGAGCTCTCACATCCGGAGTCCACACATTTCCTGCTGTGCTCCAATCCTCC GGACTGTATTCCCTCTCCTCCGTGGTGACAGTGCCTTCCTCCAATTTCGGGACACAGACC TATACATGCAACGTGGACCACAAACCCTCCAACACCAAAGTCGATAAGACAGTGGAGCGC AAGTGCTGCGTGGAGTGTCCCCCTTGTCCTGCTCCCCCTGTGGCTGGACCTTCCGTCTTT CTGTTTCCTCCTAAACCTAAAGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCCGAGGTCACATGC GTGGTCGTCGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAAGTCCAATTTAATTGGTATGTGGACGGG GTGGAGGTCCATAACGCTAAGACCAAACCTAGGGAAGAGCAGTTCAATTCCACTTTCCGG GTGGTGTCCGTGCTGACCGTCGTTCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAAGAATACAAATGC AAAGTCTCTAATAAGGGCCTCCCTGCTCCTATTGAAAAAACAATTTCCAAAACAAAAGGA CAACCTCGGGAGCCTCAAGTCTACACACTGCCACCTTCCCGGGAAAAAATGACAAAAAAT CAAGTCTCCCTCACATGTCTCGTCAAGGGATTCTACCCTTCCGACATTGCTGTGGAATGG GAATCCAATGGACAACCTGAAAACAACTACAAGACAACACCTCCTATGCTCAAAAGCGAT GGGTCCTTTTTCCTCTATTCCAAACTCACAGTCGATAAGTCTCGGTGGCAGCAGGGGAAT GTGTTCTCCTGTTCCGTGATGCACGAGGCTCTCCACAATCACTATACCCAGAAAAGCCTG TCCCTCTCCCCTGGAAAATGA Secuencia de nucleótidos de cadena ligera (SEQ ID NO: 34) ATGGTGCTGCAGACCCAGGTGTTCATCTCCCTGCTGCTGTGGATCTCCGGCGCCTACGGC GACATCGTGATGACCCAGTCCCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGAGAGCGGGCCACC ATCTCTTGCAGAGCCTCCGAGTCCGTGGACAACTACGGCATCTCCTTCATGAAGTGGTTC CAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCAAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCAACCAGGGATCT GGCGTGCCCGACCGGTTCTCTGGATCCGGCTCTGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAGC TCCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCAAAGAGGTGCCCTGG ACCTTCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCCTCCGTGTTC ATCTTCCCACCCTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGAACCGCCTCCGTCGTGTGCCTGCTG AACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCC GGCAACTCCCAGGAATCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCC TCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTG ACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGTTAG Secuencia de nucleotidos de región variable de cadena pesada 21M18 (SEQ ID NO: 35) CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATC TCCTGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGCTTACTACATCCACTGGGTCAAGCAGGCC CCTGGGCAGGGCCTGGAATGGATCGGCTACATCTCCTCCTACAACGGCGCCACCAACTAC AACCAGAAATTCAAGGGCCGCGTGACCTTCACCACCGACACCTCCACCTCCACCGCCTAC ATGGAACTGCGGTCCCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGACTAC GACTACGACGTGGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCTCT Secuencia de nucleotidos de región variable de cadena pesada 21R79 (13B) (SEQ ID NO:36) CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATC TCCTGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGCCTACTACATCCACTGGGTGAAACAGGCA CCAGGCCAGGGACTGGAATGGATCGGCTATATCGCCAACTACAACCGGGCCACCAACTAC AACCAGAAATTCAAGGGCCGCGTGACCTTCACCACCGACACCTCCACCTCCACAGCCTAC ATGGAACTGCGGTCCCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGACTAC GACTACGACGTGGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCC Secuencia de nucleotidos de región variable de cadena pesada 21 79 (13B Versión 2) (SEQ ID NO: 37) CAGGTTCAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCATCCGTGAAAATA AGTTGCAAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGGTTAAACAGGCA CCAGGACAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCGCTAATTATAATAGAGCTACAAACTAT AACCAAAAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCTCGACAGCATAC ATGGAATTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCGCTAGAGATTAT GATTATGATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCT Secuencia de nucleotidos de región variable de cadena pesada 219R45 (13A versión 1) (SEQ ID NO:38) CAAGTGCAGCTGGTCCAGAGCGGGGCTGAGGTGAAGAAACCCGGAGCAAGCGTAAAAGTA TCGTGTAAGGCCTCGGGGTACACGTTTACAAACTACTGGATGCATTGGGTGCGGCAGGCT CCGGGACAGGGGTTGGAATGGATGGGTGACATTAACCCCTCAAATGGCAGAACATCATAT AAGGAAAAGTTCAAACGCCGCGTCACACTCTCCGTGGACAAGTCAAGCTCGACTGCGTAC ATGGAACTTTCGTCGCTGAGGTCGGAGGACACGGCAGTGTACTTTTGCACCATCCATTAT GATGACAAGTATTACCCTCTGATGGATTATTGGGGTCAGGGTACGTTGGTCACCGTCTCC AGC Secuencia de nucleotidos de región variable de cadena pesada 219R45 (13A Versión 2) (SEQ ID NO:39) CAAGTGCAGCTGGTCCAGAGCGGGGCTGAGGTGAAGAAACCCGGAGCTTCCGTCAAAGTC TCCTGTAAGGCTTCCGGATACACCTTTACCAACTATTGGATGCACTGGGTGCGGCAGGCT CCTGGACAAGGGCTGGAATGGATGGGAGACATCAATCCTTCCAATGGCAGAACCTCCTAC AAGGAAAAATTCAAACGGCGGGTCACACTCTCCGTGGACAAGTCTAGCTCCACAGCTTAC ATGGAACTCTCCTCCCTGCGGTCCGAAGACACAGCTGTCTACTTCTGCACCATCCACTAC GACGACAAGTACTACCCTCTGATGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTGTCC AGC Secuencia de nucleótidos de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO:40) GACATCGTGATGACCCAGTCCCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGAGAGCGGGCCACC ATCTCTTGCAGAGCCTCCGAGTCCGTGGACAACTACGGCATCTCCTTCATGAAGTGGTTC CAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCAAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCAACCAGGGATCT GGCGTGCCCGACCGGTTCTCTGGATCCGGCTCTGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAGC TCCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCAAAGAGGTGCCCTGG ACCTTCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAG Región constante de cadena pesada de IgGl humana (SEQ ID NO:41) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYIC VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRWSVLTVLHQD LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTK QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQG VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Región constante de cadena pesada de IgG2 humana (SEQ ID NO: 42) ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTC VDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFR WSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTK QVSLTCLVKGFYPSDIAVE ESNGQPE NY TTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Región constante de cadena pesada de IgG3 humana (SEQ ID NO:43) ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS NSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYTC VNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSC DTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQY STFRWSVLTVLH QDWLNGKEYKC VSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTK QVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESSGQPE Y TTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHE ALHNRFTQKSLSLSPGK Región constante de cadena pesada de IgG4 humana (SEQ ID NO:44) ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTC VDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTY RWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN YKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR QEG VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK Péptido FLAG (SEQ ID NO: 45) DYKDDDDK Cadena pesada 21R79 parenteral con cadena no modificada de secuencia señal subrayada (SEQ ID NO: 46) MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLVQSGAEV KPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAP GQGLEWIGYIANYNRATNYNQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYD YDVGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKC CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFN YVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQP REPQVYTLPPSREEMTK QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP LDSDGS FFLYSKLTVDKSR QQG VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Cadena pesada de 219R45 parenteral con secuencia señal subrayada (SEQ ID NO: 47) MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLVQSGAEVIOPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAP GQGLEWMGDINPSNGRTSYKEKFKRRVTLSVDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYFCTIHYD DKYYPLMDY GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVER KCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKG QPREPQVYTLPPSREEMTK QVSLTCLVKGFYPSDIAVE ESNGQPENNYKTTPPMLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Cadena pesada 21R79 parenteral sin secuencia señal predicha (SEQ ID NO:48) QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAPGQGLEWIGYIA YNRATNY NQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGWTFPAVLQSSG LYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRV VSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVE ESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG V FSCSV HEALHNHYTQKSLSLSPGK Cadena pesada 21R45 sin secuencia señal (SEQ ID NO: 49) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH VRQAPGQGLEWMGDINPSNGRTSY KEKFKRRVTLSVDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYFCTIHYDDKYYPLMDY GQGTLVTVS SASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSW SGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTC VDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTF RWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada 21R79 parenteral (SEQ ID NO: 50) CAAGTGCAGCTCGTGCAGTCAGGGGCGGAGGTCAAGAAGCCGGGAGCATCGGTCAAAATC TCGTGTAAGGCCTCGGGGTACTCCTTTACTGCGTATTACATCCATTGGGTAAAGCAGGCG CCAGGGCAGGGATTGGAGTGGATTGGGTATATCGCCAATTACAATCGCGCGACGAACTAT AACCAGAAATTCAAGGGAAGGGTGACCTTCACAACGGATACATCGACATCGACGGCCTAC ATGGAACTTCGCAGCCTGCGATCAGATGACACGGCGGTATACTATTGCGCAAGAGATTAC GACTATGATGTGGGAATGGACTATTGGGGTCAAGGTACTCTGGTCACAGTCTCCTCC Secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada 219R45 parenteral (SEQ ID NO: 51) CAGGTACAGCTCGTGCAATCGGGGGCAGAGGTCAAAAAGCCCGGTGCGTCGGTAAAGGTC AGCTGCAAAGCGTCAGGTTATACATTCACGAATTACTGGATGCATTGGGTCAGACAGGCC CCTGGACAAGGGCTTGAATGGATGGGAGATATCAATCCGTCGAACGGACGGACTAGCTAT AAGGAGAAGTTTAAGAGGCGCGTAACACTGTCGGTGGACAAATCGTCCTCAACGGCCTAC ATGGAGTTGTCATCCCTGCGGTCGGAAGATACGGCGGTCTACTTCTGTACTATCCACTAT GACGATAAGTACTACCCGCTTATGGACTACTGGGGTCAGGGAACATTGGTAACCGTGAGC AGC Secuencia de nucleótidos de cadena pesada con secuencia señal 21R79 parenteral (SEQ ID NO: 52) ATGAAACACTTGTGGTTTTTCCTCTTGCTCGTGGCAGCTCCTCGGTGGGTACTTTCACAA GTGCAGCTCGTGCAGTCAGGGGCGGAGGTCAAGAAGCCGGGAGCATCGGTCAAAATCTCG TGTAAGGCCTCGGGGTACTCCTTTACTGCGTATTACATCCATTGGGTAAAGCAGGCGCCA GGGCAGGGATTGGAGTGGATTGGGTATATCGCCAATTACAATCGCGCGACGAACTATAAC CAGAAATTCAAGGGAAGGGTGACCTTCACAACGGATACATCGACATCGACGGCCTACATG GAACTTCGCAGCCTGCGATCAGATGACACGGCGGTATACTATTGCGCAAGAGATTACGAC TATGATGTGGGAATGGACTATTGGGGTCAAGGTACTCTGGTCACAGTCTCCTCCGCCAGC ACCAAGGGCCCTAGCGTCTTCCCTCTGGCTCCCTGCAGCAGGAGCACCAGCGAGAGCACA GCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAAC TCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTC TACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACC TGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGT TGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTC CCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTG GTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTC AGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTC TCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCC CGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTC AGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC AATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTC TCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTG TCTCCGGGTAAA Secuencia de nucleótidos de cadena pesada con secuencia señal 219R45 parenteral (SEQ ID NO: 53) ATGAAACACCTCTGGTTCTTTTTGCTCCTGGTGGCAGCTCCCCGATGGGTGCTTAGCCAG GTACAGCTCGTGCAATCGGGGGCAGAGGTCAAAAAGCCCGGTGCGTCGGTAAAGGTCAGC TGCAAAGCGTCAGGTTATACATTCACGAATTACTGGATGCATTGGGTCAGACAGGCCCCT GGACAAGGGCTTGAATGGATGGGAGATATCAATCCGTCGAACGGACGGACTAGCTATAAG GAGAAGTTTAAGAGGCGCGTAACACTGTCGGTGGACAAATCGTCCTCAACGGCCTACATG GAGTTGTCATCCCTGCGGTCGGAAGATACGGCGGTCTACTTCTGTACTATCCACTATGAC GATAAGTACTACCCGCTTATGGACTACTGGGGTCAGGGAACATTGGTAACCGTGAGCAGC GCGTCCACAAAGGGCCCTAGCGTCTTCCCTCTGGCTCCCTGCAGCAGGAGCACCAGCGAG AGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCG TGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCA GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACC TACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGC AAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTC CTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGC GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGC GTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGT GTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGC AAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGG CAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAAC CAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGG GAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGAC GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAAC GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC TCCCTGTCTCCGGGTAAA Secuencia de nucleótidos de región variable de cadena ligera 21R79 y 219R45 parenteral (SEQ ID NO:54) GACATCGTGATGACCCAGTCCCCTGACTCCCTGGCTGTGTCCCTGGGCGAGAGGGCCACC ATCTCCTGCAGAGCCAGCGAATCCGTCGATAATTATGGCATTTCCTTTATGAAGTGGTTC CAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACGCTGCATCCAACCAAGGGTCC GGGGTCCCTGACAGGTTCTCCGGCAGCGGGTCCGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGC AGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCTGTCTATTACTGTCAGCAAAGCAAGGAGGTGCCTTGG ACATTCGGAGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA Secuencia de nucleótidos de cadena ligera 21R79 y 219R45 parenteral (SEQ ID NO: 55) ATGGTGCTCCAGACCCAGGTCTTCATTTCCCTGCTGCTCTGGATCAGCGGAGCCTACGGG GACATCGTGATGACCCAGTCCCCTGACTCCCTGGCTGTGTCCCTGGGCGAGAGGGCCACC ATCTCCTGCAGAGCCAGCGAATCCGTCGATAATTATGGCATTTCCTTTATGAAGTGGTTC CAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACGCTGCATCCAACCAAGGGTCC GGGGTCCCTGACAGGTTCTCCGGCAGCGGGTCCGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGC AGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCTGTCTATTACTGTCAGCAAAGCAAGGAGGTGCCTTGG ACATTCGGAGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCCCCCTCCGTCTTC ATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAAAGCGGCACTGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTG AATAACTTCTATCCCCGGGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAAAGC GGCAACTCCCAGGAGAGCGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGC AGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCCGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTC ACCCATCAGGGCCTGAGCAGCCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGTTGA Cadena pesada sin secuencia señal predicha 21R75 (SEQ ID NO:56) QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAPGQGLEWIGYIAGYKDATNY NQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRV VSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTIS TKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPE NYKTTPPMLDSDGSFFLYSELTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Cadena pesada con secuencia señal predicha 21R75 (subrayada) (SEQ ID NO: 57) MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAP GQGLEWIGYIAGYKDATNYNQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYD YDVGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKC CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPE YKTTPPMLDSDGS FFLYSELTVDKSRWQQG VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Región variable de cadena pesada 21R75 (SEQ ID NO: 58) QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAPGQGLEWIGYIAGYKDATNY NQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYWGQGTLVTVSS CDR2 de cadena pesada 21R75 (SEQ ID NO: 59) YIAGYKDATNYNQKFKG Secuencia de nucleótidos de cadena pesada con secuencia señal 21R75 (13B Versión 1) (SEQ ID NO: 60) ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCCAGATGGGTGCTGTCCCAG GTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATCTCC TGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGCCTACTACATCCACTGGGTCAAGCAGGCCCCT GGACAGGGCCTGGAATGGATCGGCTATATCGCCGGCTACAAGGACGCCACCAACTACAAC CAGAAATTCAAGGGCAGAGTGACCTTCACCACCGACACCTCCACCTCTACCGCCTACATG GAACTGCGGTCCCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGACTACGAC TACGACGTGGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCCTCTGCTTCC ACCAAGGGCCCCTCCGTGTTTCCTCTGGCCCCTTGCTCCAGATCCACCTCCGAGTCTACC GCCGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACAGTGTCTTGGAAC TCTGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTG TACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACTGTGCCCTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACC TGTAACGTGGACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAACGGAAGTGC TGCGTGGAATGCCCCCCTTGTCCTGCCCCTCCTGTGGCTGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTC CCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTG GTGGATGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTG TCCGTGCTGACCGTGGTGCATCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCTCTAAGACCAAGGGACAGCCC CGCGAGCCCCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCC AACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCA TTCTTCCTGTACAGCGAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC TCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTG AGCCCCGGCAAG Secuencia de nucleótidos de cadena pesada con secuencia señal 21R75 (13B Versión IT) (SEQ ID NO:77) ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCCAGATGGGTGCTGTCTCAG GTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATCTCC TGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGCCTACTACATCCACTGGGTCAAGCAGGCCCCT GGACAGGGCCTGGAATGGATCGGCTATATCGCCGGCTACAAGGACGCCACCAACTACAAC CAGAAATTCAAGGGCAGAGTGACCTTCACCACCGACACCTCCACCTCTACCGCCTACATG GAACTGCGGTCCCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGACTACGAC TACGACGTGGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCCTCTGCTTCC ACCAAGGGCCCCTCCGTGTTTCCTCTGGCCCCTTGCTCCAGATCCACCTCCGAGTCTACC GCCGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACAGTGTCTTGGAAC TCTGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTG TACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACTGTGCCCTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACC TGTAACGTGGACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAACGGAAGTGC TGCGTGGAATGCCCCCCTTGTCCTGCCCCTCCTGTGGCTGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTC CCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTG GTGGATGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTG TCCGTGCTGACCGTGGTGCATCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCTCTAAGACCAAGGGACAGCCC CGCGAGCCCCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCC AACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCA TTCTTCCTGTACAGCGAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC TCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTG AGCCCCGGCAAG Secuencia de nucleótidos de cadena pesada con secuencia señal 21R75 (13B Versión Sl-2) (SEQ ID NO: 61) ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCCAGATGGGTGCTGTCCCAG GTTCAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCATCCGTGAAAATAAGT TGCAAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGGTTAAACAGGCACCA GGACAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCGCTGGATATAAAGATGCTACAAACTATAAC CAAAAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCTCGACAGCATACATG GAATTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCGCTAGAGATTATGAT TATGATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCTGCATCC ACTAAGGGACCATCCGTGTTCCCTTTGGCCCCTTGCTCTCGTTCGACCTCTGAATCGACT GCCGCTCTGGGATGCCTCGTGAAAGATTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTTTCCTGGAAC TCGGGCGCCCTAACCTCTGGCGTGCACACATTCCCTGCCGTGCTACAGTCTTCTGGCCTA TACTCTTTATCTTCGGTTGTTACCGTACCTTCTTCTAACTTCGGAACCCAAACTTACACC TGTAACGTAGACCACAAGCCTTCGAACACCAAGGTGGACAAGACTGTTGAGCGAAAGTGC TGCGTTGAGTGCCCTCCATGTCCTGCACCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTC CCTCCAAAACCTAAGGACACTCTAATGATCTCTCGGACTCCTGAGGTGACTTGCGTGGTT GTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGAGTCGAG GTGCACAATGCAAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTT TCTGTGTTGACCGTTGTGCACCAAGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCAGCAAGACCAAGGGCCAGCCT CGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCAGCCGGGAAGAAATGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTTGAGTGGGAGTCT AACGGACAGCCGGAGAACAACTACAAGACTACGCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTGTACTCCGAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC TCATGCTCCGTAATGCACGAAGCCTTGCACAATCACTACACTCAAAAGTCCCTATCCTTA TCTCCTGGCAAG Cadena pesada sin secuencia señal predicha 21R83 (SEQ ID NO:62) QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAPGQGLEWIGYISNY RATNY NQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRV VSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVEGFYPSDIAVE ESNGQPEN YKTTPP LDSDGSFFLYSELTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Cadena pesada con secuencia señal predicha 21R83 (subrayada) (SEQ ID NO: 63) MKHL FFLLLVAAPRWVLSQVQLVQSGAEV KPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAP GQGLE IGYISNYNRATNY QKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYD YDVGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVS N SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTC VDHKPSNTKVDKTVERKC CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPE NYKTTPPMLDSDGS FFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Región variable de cadena pesada 21R83 (SEQ ID NO: 64) QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAPGQGLEWIGYISNYNRATNY NQKFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYWGQGTLVTVSS CDR2 de cadena pesada 21R83 (SEQ ID NO: 65) YISNYNRATNYNQKFKG Secuencia de nucleótidos de cadena pesada con secuencia señal 21R83 subrayada (13B Versión 1) (SEQ ID NO: 66) ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCCAGATGGGTGCTGTCCCAG GTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATCTCC TGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGCCTACTACATCCACTGGGTCAAGCAGGCCCCT GGACAGGGCCTGGAATGGATCGGCTACATCTCCAACTACAACCGGGCCACCAATTACAAC CAGAAATTCAAGGGCCGCGTGACCTTCACCACCGACACCTCTACCTCTACCGCCTACATG GAACTGCGGTCCCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGACTACGAC TACGACGTGGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCTAGCGCTTCC ACCAAGGGCCCCTCCGTGTTTCCTCTGGCCCCTTGCTCCAGATCCACCTCCGAGTCTACC GCCGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACAGTGTCCTGGAAC TCTGGCGCTCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTG TACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACTGTGCCCTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACC TGTAACGTGGACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAACGGAAGTGC TGCGTGGAATGCCCCCCTTGTCCTGCCCCTCCTGTGGCTGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTC CCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTG GTGGATGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTG TCCGTGCTGACCGTGGTGCATCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCTCTAAGACCAAGGGACAGCCC CGCGAGCCCCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCC AACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCA TTCTTCCTGTACAGCGAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC TCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTG AGCCCCGGCAAG Secuencia de nucleótidos de cadena pesada con secuencia señal 21R83 subrayada (13B Versión IT) (SEQ ID NO: 78) ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCCAGATGGGTGCTGTCTCAG GTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATCTCC TGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGCCTACTACATCCACTGGGTCAAGCAGGCCCCT GGACAGGGCCTGGAATGGATCGGCTACATCTCCAACTACAACCGGGCCACCAATTACAAC CAGAAATTCAAGGGCCGCGTGACCTTCACCACCGACACCTCTACCTCTACCGCCTACATG GAACTGCGGTCCCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGACTACGAC TACGACGTGGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCTAGCGCTTCC ACCAAGGGCCCCTCCGTGTTTCCTCTGGCCCCTTGCTCCAGATCCACCTCCGAGTCTACC GCCGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACAGTGTCCTGGAAC TCTGGCGCTCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTG TACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACTGTGCCCTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACC TGTAACGTGGACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAACGGAAGTGC TGCGTGGAATGCCCCCCTTGTCCTGCCCCTCCTGTGGCTGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTC CCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTG GTGGATGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAA GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTG TCCGTGCTGACCGTGGTGCATCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCTCTAAGACCAAGGGACAGCCC CGCGAGCCCCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCC AACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCA TTCTTCCTGTACAGCGAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC TCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTG AGCCCCGGCAAG Secuencia de nucleótidos de cadena pesada con secuencia señal 21R75 subrayada (13B Versión Sl-2) (SEQ ID NO: 67) ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCCAGATGGGTGCTGTCCCAG GTTCAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCATCCGTGAAAATAAGT TGCAAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGGTTAAACAGGCACCA GGACAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCGCTGGATATAAAGATGCTACAAACTATAAC CAAAAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCTCGACAGCATACATG GAATTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCGCTAGAGATTATGAT TATGATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCTGCATCC ACTAAGGGACCATCCGTGTTCCCTTTGGCCCCTTGCTCTCGTTCGACCTCTGAATCGACT GCCGCTCTGGGATGCCTCGTGAAAGATTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTTTCCTGGAAC TCGGGCGCCCTAACCTCTGGCGTGCACACATTCCCTGCCGTGCTACAGTCTTCTGGCCTA TACTCTTTATCTTCGGTTGTTACCGTACCTTCTTCTAACTTCGGAACCCAAACTTACACC TGTAACGTAGACCACAAGCCTTCGAACACCAAGGTGGACAAGACTGTTGAGCGAAAGTGC TGCGTTGAGTGCCCTCCATGTCCTGCACCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTC CCTCCAAAACCTAAGGACACTCTAATGATCTCTCGGACTCCTGAGGTGACTTGCGTGGTT GTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGAGTCGAG GTGCACAATGCAAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTT TCTGTGTTGACCGTTGTGCACCAAGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCAGCAAGACCAAGGGCCAGCCT CGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCAGCCGGGAAGAAATGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTTGAGTGGGAGTCT AACGGACAGCCGGAGAACAACTACAAGACTACGCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTGTACTCCGAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC TCATGCTCCGTAATGCACGAAGCCTTGCACAATCACTACACTCAAAAGTCCCTATCCTTA TCTCCTGGCAAG Secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada 21R75 (13B Versión 1) (SEQ ID NO:68) CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATC TCCTGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGCCTACTACATCCACTGGGTCAAGCAGGCC CCTGGACAGGGCCTGGAATGGATCGGCTATATCGCCGGCTACAAGGACGCCACCAACTAC AACCAGAAATTCAAGGGCAGAGTGACCTTCACCACCGACACCTCCACCTCTACCGCCTAC ATGGAACTGCGGTCCCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGACTAC GACTACGACGTGGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCCTCT Secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada 21R75 (13B Versión 2) (SEQ ID NO: 69) CAGGTTCAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCATCCGTGAAAATA AGTTGCAAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGGTTAAACAGGCA CCAGGACAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCGCTGGATATAAAGATGCTACAAACTAT AACCAAAAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCTCGACAGCATAC ATGGAATTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCGCTAGAGATTAT GATTATGATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCT Secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada 21R83 (13B Versión 1) (SEQ ID NO:70) CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATC TCCTGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCGCCTACTACATCCACTGGGTCAAGCAGGCC CCTGGACAGGGCCTGGAATGGATCGGCTACATCTCCAACTACAACCGGGCCACCAATTAC AACCAGAAATTCAAGGGCCGCGTGACCTTCACCACCGACACCTCTACCTCTACCGCCTAC ATGGAACTGCGGTCCCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGACTAC GACTACGACGTGGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCTAGC Secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada 21 75 (13B Versión 2) (SEQ ID N0:71) CAGGTTCAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCATCCGTGAAAATA AGTTGCAAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGGTTAAACAGGCA CCAGGACAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCGCTGGATATAAAGATGCTACAAACTAT AACCAAAAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCTCGACAGCATAC ATGGAATTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCGCTAGAGATTAT GATTATGATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCT Secuencia de nucleótidos de cadena pesada con secuencia señal 21R83 subrayada (13B Versión 2) (SEQ ID NO:72) ATGAAGCACCTATGGTTCTTTCTATTATTAGTGGCCGCTCCCCGTTGGGTGTTATCGCAG GTTCAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCATCCGTGAAAATAAGT TGCAAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGGTTAAACAGGCACCA GGACAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCTCCAATTATAATAGAGCTACAAACTATAAC CAAAAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCTCGACAGCATACATG GAATTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCGCTAGAGATTATGAT TATGATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCTGCATCC ACTAAGGGACCATCCGTGTTCCCTTTGGCCCCTTGCTCTCGTTCGACCTCTGAATCGACT GCCGCTCTGGGATGCCTCGTGAAAGATTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTTTCCTGGAAC TCGGGCGCCCTAACCTCTGGCGTGCACACATTCCCTGCCGTGCTACAGTCTTCTGGCCTA TACTCTTTATCTTCGGTTGTTACCGTACCTTCTTCTAACTTCGGAACCCAAACTTACACC TGTAACGTAGACCACAAGCCTTCGAACACCAAGGTGGACAAGACTGTTGAGCGAAAGTGC TGCGTTGAGTGCCCTCCATGTCCTGCACCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTC CCTCCAAAACCTAAGGACACTCTAATGATCTCTCGGACTCCTGAGGTGACTTGCGTGGTT GTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGAGTCGAG GTGCACAATGCAAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTT TCTGTGTTGACCGTTGTGCACCAAGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCAGCAAGACCAAGGGCCAGCCT CGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCAGCCGGGAAGAAATGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTTGAGTGGGAGTCT AACGGACAGCCGGAGAACAACTACAAGACTACGCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTGTACTCCGAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC TCATGCTCCGTAATGCACGAAGCCTTGCACAATCACTACACTCAAAAGTCCCTATCCTTA TCTCCTGGCAAGTAG Secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada 21R83 (13B Versión 2) (SEQ ID NO:73) CAGGTTCAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCATCCGTGAAAATA AGTTGCAAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGGTTAAACAGGCA CCAGGACAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCTCCAATTATAATAGAGCTACAAACTAT AACCAAAAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCTCGACAGCATAC ATGGAATTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCGCTAGAGATTAT GATTATGATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCT Secuencia de nucleótidos de cadena pesada con secuencia señal 21R75 subrayada (13B Versión 2) (SEQ ID NO:74) ATGAAGCACCTATGGTTCTTTCTATTATTAGTGGCCGCTCCCCGTTGGGTGTTATCGCAG GTTCAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCATCCGTGAAAATAAGT TGCAAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGGTTAAACAGGCACCA GGACAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCGCTGGATATAAAGATGCTACAAACTATAAC CAAAAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCTCGACAGCATACATG GAATTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCGCTAGAGATTATGAT TATGATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCTGCATCC ACTAAGGGACCATCCGTGTTCCCTTTGGCCCCTTGCTCTCGTTCGACCTCTGAATCGACT GCCGCTCTGGGATGCCTCGTGAAAGATTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTTTCCTGGAAC TCGGGCGCCCTAACCTCTGGCGTGCACACATTCCCTGCCGTGCTACAGTCTTCTGGCCTA TACTCTTTATCTTCGGTTGTTACCGTACCTTCTTCTAACTTCGGAACCCAAACTTACACC TGTAACGTAGACCACAAGCCTTCGAACACCAAGGTGGACAAGACTGTTGAGCGAAAGTGC TGCGTTGAGTGCCCTCCATGTCCTGCACCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTC CCTCCAAAACCTAAGGACACTCTAATGATCTCTCGGACTCCTGAGGTGACTTGCGTGGTT GTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGAGTCGAG GTGCACAATGCAAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTT TCTGTGTTGACCGTTGTGCACCAAGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCAGCAAGACCAAGGGCCAGCCT CGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCAGCCGGGAAGAAATGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTTGAGTGGGAGTCT AACGGACAGCCGGAGAACAACTACAAGACTACGCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTGTACTCCGAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC TCATGCTCCGTAATGCACGAAGCCTTGCACAATCACTACACTCAAAAGTCCCTATCCTTA TCTCCTGGCAAGTAG Secuencia de nucleótidos de cadena pesada 21M18 (versión 2) (SEQ ID NO:75) ATGAAGCACCTATGGTTCTTTCTATTATTAGTGGCCGCTCCCCGTTGGGTGTTATCGCAG GTTCAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCATCCGTGAAAATAAGT TGCAAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGGTTAAACAGGCACCA GGACAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCTCCTCTTATAATGGAGCTACAAACTATAAC CAAAAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCTCGACAGCATACATG GAATTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCGCTAGAGATTATGAT TATGATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCTGCATCC ACTAAGGGACCATCCGTGTTCCCTTTGGCCCCTTGCTCTCGTTCGACCTCTGAATCGACT GCCGCTCTGGGATGCCTCGTGAAAGATTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTTTCCTGGAAC TCGGGCGCCCTAACCTCTGGCGTGCACACATTCCCTGCCGTGCTACAGTCTTCTGGCCTA TACTCTTTATCTTCGGTTGTTACCGTACCTTCTTCTAACTTCGGAACCCAAACTTACACC TGTAACGTAGACCACAAGCCTTCGAACACCAAGGTGGACAAGACTGTTGAGCGAAAGTGC TGCGTTGAGTGCCCTCCATGTCCTGCACCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTC CCTCCAAAACCTAAGGACACTCTAATGATCTCTCGGACTCCTGAGGTGACTTGCGTGGTT GTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGAGTCGAG GTGCACAATGCAAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTT TCTGTGTTGACCGTTGTGCACCAAGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTG TCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCAGCAAGACCAAGGGCCAGCCT CGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCAGCCGGGAAGAAATGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGTCTGGTGGAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTTGAGTGGGAGTCT AACGGACAGCCGGAGAACAACTACAAGACTACGCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTGTACTCCGAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC TCATGCTCCGTAATGCACGAAGCCTTGCACAATCACTACACTCAAAAGTCCCTATCCTTA TCTCCTGGCAAGTAG Región variable de cadena pesada 21M18 (versión 2) (SEQ ID NO:76) CAGCTAGTTCAGTCTGGAGCGGAAGTTAAGAAACCTGGAGCATCCGTGAAAATAAGTTGC AAGGCATCCGGTTACTCGTTCACCGCATACTATATCCACTGGGTTAAACAGGCACCAGGA CAGGGACTTGAATGGATCGGATATATCTCCTCTTATAATGGAGCTACAAACTATAACCAA AAATTCAAAGGACGCGTGACTTTCACAACTGACACCTCAACCTCGACAGCATACATGGAA TTACGGTCCCTACGGTCTGACGACACTGCCGTTTACTATTGCGCTAGAGATTATGATTAT GATGTTGGAATGGACTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCT Secuencia consenso de cadena pesada CDR2 de cadena pesada Anti-DLL4 (SEQ ID NO: 80): YIX1X2YX3X4ATNY QKFKG , donde Xj. es serina o alanina, X2 es serina, asparagina, o glicina, X3 es asparagina o lisina, y X4 es glicina, arginina, o ácido aspártico.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (30)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Un anticuerpo biespecífico, caracterizado porque comprende : a) un primer sitio de ligación a antígeno que liga específicamente el factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF) , y b) un segundo sitio de ligación a antígeno que liga específicamente el ligando 4 similar a delta humano (DLL4), en donde el primer sitio de ligación a antígeno comprende una CDRl de cadena pesada que comprende NY MH (SEQ ID NO : 17), una CDR2 de cadena pesada que comprende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO: 18), y una CDR3 de cadena pesada que comprende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO : 19); en donde el segundo sito de ligación a antígeno comprende una CDRl de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13) o AYYIH (SEQ ID NO:79), una CDR2 de cadena pesada que comprende YIX1X2YX3XATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 80), en donde Xi es serina o alanina, X2 es serina, asparagina, o glicina, X3 es asparagina o lisina, y X4 es glicina, arginina, o ácido aspártico, y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16); y en donde tanto el primero como el segundo sitios de ligación a antígeno comprenden una CDR1 de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22) .
2. El anticuerpo biespecífico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el segundo sitio de ligación a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13) , una CDR2 de cadena pesada que comprende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 14), YISSYNGATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 15), YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO:59), o YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO:65), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16) .
3. El anticuerpo biespecífico de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado porque comprende : (a) una primera región variable de cadena pesada que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 11; (b) una segunda región variable de cadena pesada que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 58, o SEQ ID NO: 64; y (c) una primera y segunda región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12.
4. El anticuerpo biespecífico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque comprende un primer dominio y un segundo dominio CH3 , cada uno de los cuales se modifica para promover la formación de heteromultímeros .
5. El anticuerpo biespecífico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el primero y segundo dominios CH3 se modifican basados en efectos electrostáticos.
6. El anticuerpo biespecífico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo IgGl, o un anticuerpo IgG2.
7. El anticuerpo biespecífico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque comprende una primera región constante IgG2 humana con sustituciones de aminoácidos en las posiciones que corresponden a las posiciones 249 y 288 de SEQ ID NO: 42, en donde los aminoácidos se reemplazan con glutamato o aspartato, y la segunda región constante IgG2 humana con sustituciones de aminoácido en las posiciones que corresponden a las posiciones 236 y 278 de SEQ ID NO: 42, en donde los aminoácidos se reemplazan con lisina.
8. El anticuerpo biespecífico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque: (i) inhibe la ligación de VEGF a por lo menos un receptor VEGF; (ii) inhibe la ligación de DLL4 a por lo menos un receptor Notch; (iii) inhibe la señalización Notch; y/o (iv) modula la angiogénesis .
9. Un anticuerpo biespecífico que se liga específicamente a VEGF humano y DLL4 humano, caracterizado porque: (a) una cadena pesada de SEQ ID NO: 7; (b) una cadena pesada de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO: 56, o SEQ ID NO: 62; y (c) dos cadenas ligeras de SEQ ID NO: 8.
10. Un anticuerpo biespecífico, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de 219R45-MB-21M18, 219R45-MB- 21R79, 219R45-MB-21R75, y 219R45-MB-21R83.
11. Un anticuerpo aislado que se liga específicamente al VEGF humano, caracterizado porque comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende NY MH (SEQ ID NO: 17), una CDR2 de cadena pesada que comprende DINPSNGRTSYKEKFKR (SEQ ID NO: 18), y una CDR3 de cadena pesada que comprende HYDDKYYPLMDY (SEQ ID NO : 19); y (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ED NO: 20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVP TFGG (SEQ ID NO: 22) .
12. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque comprende: (a) una región variable de cadena pesada que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 11; y (b) una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 12.
13. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque comprende: (a) una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 49 o SEQ ID NO: 7; y (b) una cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 8.
14. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-13, caracterizado porque inhibe la ligación de VEGF a por lo menos un receptor VEGF.
15. Un anticuerpo aislado que se liga específicamente al DLL4 humano, caracterizado porque comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13) o AYYIH (SEQ ID NO:79), una CDR2 de cadena pesada que comprende YIX [X2YX3X4ATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 80), caracterizado porque Xi es serina o alanina, X2 es serina, asparagina, o glicina, X3 es asparagina o lisina, y X4 es glicina, arginina, o ácido aspártico, y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16) ; y (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende RASESVDNYGISFMK (SEQ ID NO:20), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNQGS (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSKEVPWTFGG (SEQ ID NO: 22).
16. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende TAYYIH (SEQ ID NO: 13) , una CDR2 de cadena pesada que comprende YIANYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 14), YIAGYKDATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 59), o YISNYNRATNYNQKFKG (SEQ ID NO: 65), y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDYDYDVGMDY (SEQ ID NO: 16) .
17. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15 o reivindicación 16, caracterizado porque comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 58, o SEQ ID NO: 64; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 12.
18. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-17, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo IgGl, un anticuerpo IgG2, o un fragmento de anticuerpo que comprende un sitio de ligación a antígeno.
19. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, y un portador farmacéuticamente aceptable .
20. Una célula, caracterizada porque comprende o produce el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18.
21. Una molécula de polinucleótido aislada, caracterizada porque comprende un polinucleótido que codifica el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18.
22. Un vector, caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 21.
23. Una célula, caracterizada porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 22.
24. Un polipéptido, caracterizado porque comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ED NO: 12, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, y SEQ ID NO: 64.
25. Uso del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer.
26. El uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 25, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer colorectal, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de mama, cáncer de riñon, cáncer de próstata, cáncer gastrointestinal, melanoma, cáncer cervical, cáncer de la vejiga, glioblastoma, cáncer de cabeza y cuello, linfoma y leucemia .
27. El uso del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en la fabricación de un medicamento para inhibir el crecimiento de un tumor.
28. El uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 27, en donde el tumor se selecciona del grupo que consiste de tumor colorectal, tumor de colon, tumor de ovario, tumor pancreático, tumor de pulmón, tumor de hígado, tumor de mama, tumor de riñon, tumor de próstata, tumor gastrointestinal, melanoma, tumor cervical, tumor de la vejiga, glioblastoma, y tumor de cabeza y cuello.
29. El uso del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25-28, en donde el uso comprende el anticuerpo y por lo menos un agente terapéutico adicional.
30. Un método para la producción de un anticuerpo, caracterizado porque comprende expresar por lo menos un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 21, en una célula.
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