KR20090027227A - 항-ｄｌｌ4 항체 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-DLL4 항체, 및 이러한 항체를 포함하는 조성물 및 이러한 항체를 사용하는 방법을 제공한다.
DLL4, 노치 수용체, 항-DLL4 항체, 혈관생성

Description

항-ＤＬＬ4 항체 및 이의 사용 방법{ANTI-DLL4 ANTIBODIES AND METHODS USING SAME}
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 항-DLL4 항체, 및 이의 용도에 관한 것이다.
혈관 공급의 발달은 다수의 생리학적 및 병리학적 프로세스의 기본 요건이다. 활발하게 성장하는 조직 예컨대 배아 및 종양은 충분한 혈액 공급을 필요로 한다. 이들은 혈관생성으로 칭해지는 프로세스를 통해 새로운 혈관 형성을 촉진하는 전-혈관생성 인자를 생산함으로써 이러한 필요를 만족시킨다. 혈관 튜브 형성은 하기 단계가 모두 또는 다수 수반되는, 복잡하지만 규칙적인 생물학적 이벤트이다: a) 내피 세포 (EC)가 기존의 EC로부터 증식하거나 기원 세포로부터 분화하는 단계; b) EC가 이동하고 융합하여 코드-유사 구조를 형성하는 단계; c) 이어서 혈관 코드에 관생성이 진행되어, 중앙의 관강이 있는 관이 형성되는 단계; d) 기존의 코드 또는 관이 싹을 내밀어 2차 관을 형성하는 단계; e) 원시 혈관총에 추가적인 리모델링 및 재성형이 진행되는 단계; 및 f) 내피 튜브를 싸도록 주변-내피 세포가 동원되어, 유지 및 조절 기능을 관에 제공하는 단계 (이같은 세포에는 작은 모세혈관에 대한 혈관주위세포, 보다 큰 혈관에 대한 평활근 세포, 심장에서의 심근 세포 가 포함된다). [Hanahan, Science 277:48-50 (1997)]; [Hogan ＆ Kolodziej, Nat. Rev. Genet. 3:513-23 (2002)]; [Lubarsky ＆ Krasnow, Cell 112:19-28 (2003)].
혈관생성이 다양한 장애의 발병기전에서 관련된다는 것이 현재 잘 확립되어 있다. 여기에는 고체 종양 및 전이, 아테롬성 동맥경화증, 수정체후방 섬유증식증, 혈관종, 만성 염증, 안내 신생혈관 질환 예컨대 증식성 망막병증, 예를 들어, 당뇨성 망막병증, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 신생혈관 녹내장, 이식된 각막 조직 및 기타 조직의 면역 거부, 류머티스 관절염 및 건선이 포함된다. [Folkman et al., J. Biol. Chem. 267:10931-34 (1992)]; [Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol. 53:217-39 (1991)]; 및 [Garner A., "Vascular diseases", Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2nd Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710].
종양 성장의 경우에, 혈관생성은 과다형성에서 신생물로의 이행, 및 종양의 성장 및 전이를 위한 자양분의 제공에 결정적인 것으로 보인다. [Folkman et al., Nature 339:58 (1989)]. 신생혈관증식은 정상 세포에 비해 종양 세포가 성장 이익과 증식 자율성을 획득하도록 한다. 종양은 이용가능한 모세혈관층으로부터의 거리로 인해 수 ㎣의 크기로만 증식할 수 있는 단일 이상 세포로서 일반적으로 시작되고, 장기간 동안 추가적인 성장 및 파종 없이 '휴면 상태'인 채로 있을 수 있다. 그후, 일부 종양 세포가 혈관생성 표현형으로 전환되어 내피 세포를 활성화시키고, 내피 세포가 증식하여 새로운 모세혈관으로 성숙된다. 이러한 새로 형성된 혈관은 1차 종양의 지속적인 성장을 허용할 뿐만 아니라, 전이성 종양 세포의 파종 및 콜 로니재형성을 또한 허용한다. 따라서, 유방암, 뿐만 아니라 여러 기타 종양에서 종양 절편 내의 미세혈관의 밀도와 환자 생존 사이에 상관관계가 관찰되었다. [Weidner et al., N. Engl. J. Med. 324:1-6 (1991)]; [Horak et al., Lancet 340:1120-24 (1992)]; [Macchiarini et al., Lancet 340:145-46 (1992)]. 혈관생성 스위치를 제어하는 정확한 메커니즘은 잘 이해되지 않았지만, 종양 덩어리의 신생혈관증식은 다수의 혈관생성 자극제와 억제제의 최종적인 균형으로부터 초래되는 것으로 생각된다 ([Folkman, Nat. Med. 1(1):27-31 (1995)]).
혈관 발달 프로세스는 엄격하게 조절된다. 지금까지, 대부분 주변 세포에 의해 생산된 분비형 인자인 상당한 수의 분자가 EC 분화, 증식, 이동 및 코드-유사 구조로의 융합을 조절하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)가 혈관생성을 자극하고 혈관 투과성을 유도하는데 수반되는 주요 인자로서 확인되었다. [Ferrara et al., Endocr. Rev. 18:4-25 (1997)]. 단일 VEGF 대립유전자의 손실조차 배아 치사를 초래한다는 발견은 혈관계의 발달 및 분화에서 이러한 인자가 수행하는 대체불가능한 역할을 가리킨다. 또한 VEGF는 종양 및 안내 장애와 관련된 신생혈관증식의 주요 매개물인 것으로 나타났다. [Ferrara et al., Endocr. Rev. 상기 문헌]. VEGF mRNA는 시험된 대다수의 인간 종양에서 과다발현된다. [Berkman et al., J. Clin. Invest. 91:153-59 (1993)]; [Brown et al., Human Pathol. 26:86-91 (1995)]; [Brown et al., Cancer Res. 53:4727-35 (1993)]; [Mattern et al., Brit. J. Cancer 73:931-34 (1996)]; [Dvorak et al., Am. J. Pathol. 146:1029-39 (1995)].
또한, 안액 내의 VEGF의 농도 수준은 당뇨병 및 기타 허혈-관련 망막병증의 환자에서 활발한 혈관 증식의 존재와 고도로 상호관련된다. [Aiello et al., N. Engl. J. Med. 331:1480-87 (1994)]. 또한, AMD 환자에서 맥락막 신생혈관막에서의 VEGF의 국소화가 연구에서 증명되었다. [Lopez et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37:855-68 (1996)].
항-VEGF 중화 항체는 누드(nude) 마우스에서 다양한 인간 종양 세포주의 성장을 억제하고 ([Kim et al., Nature 362:841-44 (1993)]; [Warren et al., J. Clin. Invest. 95:1789-97 (1995)]; [Borgstroem et al., Cancer Res. 56:4032-39 (1996)]; [Melnyk et al., Cancer Res. 56:921-24 (1996)]), 또한 허혈성 망막 장애의 모델에서 안내 혈관생성을 억제한다 ([Adamis et al., Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996)]). 따라서, 항-VEGF 모노클로날(monoclonal) 항체 또는 기타 VEGF 작용 억제제는 종양 및 다양한 안내 신생혈관 장애의 치료를 위한 전도유망한 후보물이다. 이같은 항체는, 예를 들어, EP 817,648 (1998년 1월 14일 공개); 및 WO 98/45331 및 WO 98/45332 (모두 1998년 10월 15일 공개)에 기술되어 있다. 항-VEGF 항체 중 하나인 베바시주맵은 특정 암을 치료하기 위한 화학치료법 요법과의 조합 사용에 대해 FDA의 승인을 받았고, 항-VEGF 항체 단편인 라니비주맵은 연령-관련 (습식) 황반 변성의 치료에 FDA의 승인을 받았다. 양쪽 약물 모두 진행 중인 임상 시험에서 연구되고 있다.
치료제로서의 개발에 최적인 임상 특성이 있는 작용제가 계속 요구된다는 것이 명백하다. 본원에 기술된 발명은 이러한 요구를 충족시키고, 기타 이점을 제공 한다.
특허 출원 및 공개공보를 포함하여, 본원에서 인용된 모든 참고문헌은 거명에 의해 전체적으로 본원에 포함된다.
발명의 개요
본 발명은 다양한 DLL4 결합제 (예컨대 면역접합체, 항체, 및 이의 단편)의 확인을 부분적으로 기초로 한다. DLL4는 중요하고 유리한 치료용 표적을 나타내고, 본 발명은 DLL4에 결합하는 것을 기초로 하는 조성물 및 방법을 제공한다. 본원에 기술된 바와 같은, 본 발명의 DLL4 결합제는 DLL4-노치(Notch) 수용체 경로의 발현 및/또는 활성과 관련된 병리학적 용태를 표적으로 하는데 사용하기 위한 중요한 치료 및 진단 작용제를 제공한다. 따라서, 본 발명은 DLL4 결합에 관련된 방법, 조성물, 키트 및 제조품을 제공한다.
본 발명은 DLL4에 결합하는 (예컨대 특이적으로 결합하는) 항체를 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 단리된 항-DLL4 항체를 제공하고, 이때 전장 IgG 형태의 항체는 약 1 nM이거나 이보다 양호한, 또는 약 500 pM이거나 이보다 양호한 결합 친화력으로 인간 DLL4에 특이적으로 결합한다. 당업계에 잘 확립된 바와 같이, 자신의 수용체에 대한 리간드의 결합 친화력은 임의의 다양한 분석법을 사용하여 결정될 수 있고, 다양한 정량값으로 표현될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 결합 친화력은 Kd 값으로 표현되고, 고유의 결합 친화력을 반영한다 (예를 들어, 결합성 효과가 최소화됨). 일반적으로 및 바람직하게는, 결합 친화력은 시험관 내에서 무세포 환경 또는 세포-회합 환경에서 측정된다. 본원에 기술된 것들을 포함하는 당업계에 공지된 다수의 분석법들 중 임의의 것을 사용하여 결합 친화력을 측정할 수 있고, 예를 들어, Biacore®, 방사성면역분석법 (RIA) 및 ELISA가 포함된다. 일부 실시양태에서, 단리된 항-DLL4 항체는 인간 및 마우스 DLL4 모두에 유사한 친화력으로 결합하고, 즉 인간 DLL4에 대한 결합 친화력은 마우스 DLL4에 대한 결합 친화력보다 100배를 초과하여 더 많거나 적지 않다. 일부 실시양태에서, 인간 DLL4에 대한 결합 친화력은 마우스 DLL4에 대한 결합 친화력보다 10배를 초과하여 더 많거나 적지 않다. 일부 실시양태에서, 항체는 약 1 nM이거나 이보다 양호한, 또는 약 500 pM이거나 이보다 양호한 결합 친화력으로 마우스 DLL4에 특이적으로 결합한다.
한 양상에서, 본 발명은 단리된 항-DLL4 항체를 제공하고, 이때 전장 IgG 형태의 항체는 약 2×105이거나 이보다 양호한, 또는 약 1× 105이거나 이보다 양호한 kon으로 인간 DLL4에 특이적으로 결합한다. 당업계에 잘 확립된 바와 같이, 자신의 수용체에 대한 리간드의 결합의 kon은 다양한 분석법들 중 임의의 것을 사용하여 결정될 수 있고, 다양한 정량값으로 표현될 수 있다.
한 양상에서, 본 발명은 DLL4의 리간드 결합 영역에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 DLL4 세포외 도메인을 포함하거나, 이러한 도메인으로 구성되거나 또는 이러한 도메인으로 본질적으로 구성된 폴리펩티드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 인간 DLL4의 아미노산 252-282, 1-252, 1-286, 1-324, 및/또는 219-286을 포함하거나, 이러한 아미노산으로 구성되거나 또는 이러한 아미노산으로 본질적으로 구성된 폴리펩티드에 결합한다.
한 양상에서, 본 발명은 DLL4의 결합에 대해 노치 수용체와 경쟁하는 단리된 항-DLL4 항체를 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 DLL4의 생물학적 활성을 억제하고/하거나, 감소시키고/시키거나 차단하는 단리된 항-DLL4 항체를 제공한다.
한 양상에서, 본 발명의 항-DLL4 항체는 하기를 포함한다:
(a) (i) RASQDVSTAVA (서열 10)인 서열 A1-A11을 포함하는 HVR-L1
(ii) SASFLYS (서열 11)인 서열 B1-B7을 포함하는 HVR-L2
(iii) QQSYNGPST (서열 15)인 서열 C1-C9를 포함하는 HVR-L3
(iv) GFTFTDNWIS (서열 1)인 서열 D1-D10을 포함하는 HVR-H1
(v) GVINPNSGATEYADSVKG (서열 5)인 서열 E1-E18을 포함하는 HVR-H2 및
(vi) VYYCARDNFGGYFDY (서열 9)인 서열 F1-F15를 포함하는 HVR-H3
으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 초가변 영역 (HVR) 서열; 및
(b) 서열 1-18에 도시된 서열의 하나 이상의 잔기의 변형을 포함하는 하나 이상의 변이체 HVR.
한 양상에서, 본 발명의 항-DLL4 항체는 하기를 포함한다:
(a) (i) RASQDVSTAVA (서열 10)인 서열 A1-A11을 포함하는 HVR-L1
(ii) SASFLYS (서열 11)인 서열 B1-B7을 포함하는 HVR-L2
(iii) QQSVNGPAT (서열 14)인 서열 C1-C9를 포함하는 HVR-L3
(iv) GFSFRDNWIS (서열 2)인 서열 D1-D10을 포함하는 HVR-H1
(v) GVINPNSGSTDYADSVKG (서열 3)인 서열 E1-E18을 포함하는 HVR-H2
(vi) VYYCARDNFGGYFDY (서열 9)인 서열 F1-F15를 포함하는 HVR-H3
으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 초가변 영역 (HVR) 서열; 및
(b) 서열 1-18에 도시된 서열의 하나 이상의 잔기의 변형을 포함하는 하나 이상의 변이체 HVR.
한 양상에서, 본 발명의 항-DLL4 항체는 하기를 포함한다:
(a) (i) RASQDVSTAVA (서열 10)인 서열 A1-A11을 포함하는 HVR-L1
(ii) SASFLYS (서열 11)인 서열 B1-B7을 포함하는 HVR-L2
(iii) QQSYTGTVT (서열 18)인 서열 C1-C9를 포함하는 HVR-L3
(iv) GFTFTDNWIS (서열 1)인 서열 D1-D10을 포함하는 HVR-H1
(v) GYISPNSGFTYYADSVKG (서열 8)인 서열 E1-E18을 포함하는 HVR-H2 및
(vi) VYYCARDNFGGYFDY (서열 9)인 서열 F1-F15를 포함하는 HVR-H3
으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 초가변 영역 (HVR) 서열; 및
(b) 서열 1-18에 도시된 서열의 하나 이상의 잔기의 변형을 포함하는 하나 이상의 변이체 HVR.
한 양상에서, 본 발명은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 HVR을 포함하고, 이때 각각의 HVR은 서열 1-18로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 구성되거나 또는 본질적으로 이러한 서열로 구성되며, 서열 10은 HVR-L1에 상응하고, 서열 11은 HVR-L2에 상응하고, 서열 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18은 HVR-L3에 상응하고, 서열 1 또는 2는 HVR-H1에 상응하고, 서열 3, 4, 5, 6, 7 또는 8은 HVR-H2에 상응하며, 서열 9는 HVR-H3에 상응하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함하고, 이때 각각은 순서대로 서열 10, 11, 12, 1, 3, 9를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함하고, 이때 각각은 순서대로 서열 10, 11, 13, 1, 4, 9를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함하고, 이때 각각은 순서대로 서열 10, 11, 14, 2, 3, 9를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함하고, 이때 각각은 순서대로 서열 10, 11, 15, 1, 5, 9를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함하고, 이때 각각은 순서대로 서열 10, 11, 16, 1, 6, 9를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함하고, 이때 각각은 순서대로 서열 10, 11, 17, 1, 7, 9를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함하고, 이때 각각은 순서대로 서열 10, 11, 18, 1, 8, 9를 포함한다.
본 발명의 항체 내의 변이체 HVR에는 HVR 내의 하나 이상 (예컨대 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 이상)의 잔기의 변형이 있을 수 있다.
한 실시양태에서, HVR-L3 변이체는 위치 91 (S 또는 W), 92 (Y 또는 F), 93 (T, N 또는 S), 94 (T 또는 G), 95 (P, Q, A 또는 T), 및/또는 96 (P, S, A, 또는 V)의 임의의 조합으로의 1-6개 (1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개)의 치환을 포함한다.
한 실시양태에서, HVR-H2 변이체는 위치 50 (V, L 또는 Y), 52 (N 또는 S), 52a (P 또는 S), 또는 53 (N, Q, T, 또는 I)의 임의의 조합으로의 1-4개 (1개, 2개, 3개 또는 4개)의 치환을 포함한다.
각각의 위치 뒤의 괄호 내의 문자(들)은 예시적인 치환 (즉, 대체) 아미노산을 가리킨다; 당업자에게 명백할 바와 같이, 본원에 기술된 정황에서의 치환 아미노산으로서의 기타 아미노산의 적절성을 당업계에 공지되어 있고/있거나 본원에 기술된 기술을 사용하여 일상적으로 평가할 수 있다.
한 양상에서, 본 발명은 서열 1 또는 2의 서열을 포함하는 HVR-H1 영역을 포함하는 항체를 제공한다. 한 양상에서, 본 발명은 서열 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8의 서열을 포함하는 HVR-H2 영역을 포함하는 항체를 제공한다. 한 양상에서, 본 발명은 서열 9의 서열을 포함하는 HVR-H3 영역을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열 10의 서열을 포함하는 HVR-L1 영역을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열 11의 서열을 포함하는 HVR-L2 영역을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18의 서열을 포함하는 HVR-L3 영역을 포함하는 항체를 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 하기의 서열 중 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두 를 포함하는 항체를 제공한다:
(i) 서열 1의 서열을 포함하는 HVR-H1 서열;
(ii) 서열 5의 서열을 포함하는 HVR-H2 서열;
(iii) 서열 9의 서열을 포함하는 HVR-H3 서열.
한 양상에서, 본 발명은 하기의 서열 중 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두를 포함하는 항체를 제공한다:
(i) 서열 10의 서열을 포함하는 HVR-L1 서열;
(ii) 서열 11의 서열을 포함하는 HVR-L2 서열;
(iii) 서열 15의 서열을 포함하는 HVR-L3 서열.
한 양상에서, 본 발명은 하기의 서열 중 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두를 포함하는 항체를 제공한다:
(i) 서열 1의 서열을 포함하는 HVR-H1 서열;
(ii) 서열 8의 서열을 포함하는 HVR-H2 서열;
(iii) 서열 9의 서열을 포함하는 HVR-H3 서열.
한 양상에서, 본 발명은 하기의 서열 중 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두를 포함하는 항체를 제공한다:
(i) 서열 10의 서열을 포함하는 HVR-L1 서열;
(ii) 서열 11의 서열을 포함하는 HVR-L2 서열;
(iii) 서열 18의 서열을 포함하는 HVR-L3 서열.
서열 1-18의 아미노산 서열은 도 1a 및 1b에 지시된 바와 같이 개별적인 HVR (즉, H1, H2 또는 H3)와 관련하여 번호가 매겨지고, 번호매김은 하기 기술된 바와 같은 카밧(Kabat) 번호매김 시스템과 일관된다.
한 양상에서, 본 발명은 도 1a 및 1b에 도시된 바와 같은 중쇄 HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 도 1a 및 1b에 도시된 바와 같은 경쇄 HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다.
본 발명의 항체의 일부 실시양태는 하기의 서열 52에 도시된 바와 같은 인간화 4D5 항체 (huMAb4D5-8) (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (미국 특허 번호 6,407,213 및 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93]에서 또한 언급됨)의 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
Figure 112008090840519-PCT00001
한 실시양태에서, huMAb4D5-8 경쇄 가변 도메인 서열이 위치 30, 66 및 91 (각각 상기에서 볼드체/이탤릭체로 지시된 바와 같은 Asn, Arg 및 His) 중 하나 이상에서 변형된다. 한 실시양태에서, 변형된 huMAb4D5-8 서열은 위치 30의 Ser, 위치 66의 Gly 및/또는 위치 91의 Ser을 포함한다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 하기 서열 53에 도시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다:
huMAb4D5-8에 대해 치환된 잔기가 상기에서 볼드체/이탤릭체로 지시된다.
본 발명의 항체는 DLL4에 대한 결합 활성이 실질적으로 유지되는 한, 임의의 적절한 프레임워크(framework) 가변 도메인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 서브그룹(subgroup) III 중쇄 프레임워크 컨센서스(consensus) 서열을 포함한다. 이러한 항체들의 한 실시양태에서, 프레임워크 컨센서스 서열은 위치 71, 73 및/또는 78에서의 치환을 포함한다. 이러한 항체들의 일부 실시양태에서, 위치 71은 A이고/이거나, 73은 T이고/이거나 78은 A이다. 한 실시양태에서, 이러한 항체들은 huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (미국 특허 번호 6,407,213 ＆ 5,821,337, 및 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93]에서 또한 언급됨)의 중쇄 가변 도메인 프레임워크 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 이러한 항체들은 인간 κI 경쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 이러한 항체들은 미국 특허 번호 6,407,213 ＆ 5,821,337에 기술된 바와 같은 huMAb4D5-8의 경쇄 HVR 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 이러한 항체들은 huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (미국 특허 번호 6,407,213 ＆ 5,821,337, 및 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93]에서 또한 언급됨)의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 프레임워크 서열은 서열 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 및/또는 37의 서열을 포함하고, HVR H1, H2 및 H3 서열은 각각 서열 1, 5, 및/또는 9인 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 프레임워크 서열은 서열 38, 39, 40 및/또는 41의 서열을 포함하고, HVR L1, L2 및 L3 서열은 각각 서열 10, 11 및/또는 15인 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 프레임워크 서열은 서열 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 및/또는 37의 서열을 포함하고, HVR H1, H2 및 H3 서열은 각각 서열 2, 3, 및/또는 9인 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 프레임워크 서열은 서열 38, 39, 40 및/또는 41의 서열을 포함하고, HVR L1, L2 및 L3 서열은 각각 서열 10, 11 및/또는 14인 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 프레임워크 서열은 서열 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 및/또는 37의 서열을 포함하고, HVR H1, H2 및 H3 서열은 각각 서열 1, 8 및/또는 9인 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 프레임워크 서열은 서열 38, 39, 40 및/또는 41의 서열을 포함하고, HVR L1, L2 및 L3 서열은 각각 서열 10, 11 및/또는 18인 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 프레임워크 서열은 서열 46, 47, 48, 및/또는 49의 서열을 포함하고, HVR H1, H2 및 H3 서열은 각각 서열 1, 5, 및/또는 9인 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 프레임워크 서열은 서열 42, 43, 44, 및/또는 45의 서열을 포함하고, HVR L1, L2 및 L3 서열은 각각 서열 10, 11 및/또는 15인 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 프레임워크 서열은 서열 46, 47, 48, 및/또는 49의 서열을 포함하고, HVR H1, H2 및 H3 서열은 각각 서열 2, 3, 및/또는 9인 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 프레임워크 서열은 서열 42, 43, 44, 및/또는 45의 서열을 포함하고, HVR L1, L2 및 L3 서열은 각각 서열 10, 11 및/또는 14인 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 프레임워크 서열은 서열 46, 47, 48, 및/또는 49의 서열을 포함하고, HVR H1, H2 및 H3 서열은 각각 서열 1, 8, 및/또는 9인 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 프레임워크 서열은 서열 42, 43, 44, 및/또는 45의 서열을 포함하고, HVR L1, L2 및 L3 서열은 각각 서열 10, 11 및/또는 18인 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 원하는 표적 결합 친화력이 수득되도록 친화력이 성숙된다. 한 예에서, 본 발명의 친화력이 성숙된 항체는 아미노산 위치 H28, H30, H31, H32, H33, L91, L92, L93, L94, L95 및/또는 L96 중 하나 이상에서의 치환을 포함한다. 한 예에서, 본 발명의 친화력이 성숙된 항체는 하기 치환 중 하나 이상을 포함한다: (a) 중쇄 내의, V50L, V50Y, N52S, P52aS, N53Q, N53T, N53I, S56A, S56F, T57S, D58E, D58I, D58A, D58Y, 또는 (b) 경쇄 내의, S91W, Y92F, T93N, T93S, T94G, P95Q, P95A, P95T, P96S, P96A, P96V.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 54의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 55의 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 54의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열 55의 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 56의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 57의 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 56의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열 57의 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 58의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 59의 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 58의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열 59의 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 DLL4에의 결합에 대해 상기 언급된 항체들 중 임의의 것과 경쟁하는 항체를 제공한다. 한 양상에서, 본 발명은 상기 언급된 항체들 중 임의의 것과 동일한 DLL4 상의 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
당업계에 공지된 바와 같이, 그리고 하기에 더욱 상세하게 기술된 바와 같이, 항체의 초가변 영역의 윤곽을 그리는 아미노산 위치/경계는 정황 및 당업계에 공지된 다양한 정의 (하기 기술된 바와 같음)에 따라 변할 수 있다. 가변 도메인 내의 일부 위치는 이러한 위치들이 한 기준 셋트 하에서는 초가변 영역 내에 있는 것으로 간주될 수 있지만 다른 기준 셋트 하에서는 초가변 영역의 바깥에 있는 것으로 간주될 수 있다는 점에서 하이브리드(hybrid) 초가변 위치로 고려될 수 있다. 이러한 위치들 중 하나 이상은 확장된 초가변 영역 (하기에 추가로 정의되는 바와 같음) 내에서 또한 발견될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 폴리클로날(polyclonal) 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 키메라 항체, 친화력이 성숙된 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 또는 scFv이다.
한 실시양태에서, 항체는 키메라 항체, 예를 들어, 이종성 비-인간, 인간 또는 인간화 서열 (예를 들어, 프레임워크 및/또는 불변 도메인 서열)에 그래프트된 비-인간 공여체로부터의 항원 결합 서열을 포함하는 항체이다. 한 실시양태에서, 비-인간 공여체는 마우스이다. 한 실시양태에서, 항원 결합 서열은 합성 서열이고, 예를 들어 돌연변이유발 (예를 들어, 파지 디스플레이 스크리닝 등)에 의해 수득된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 키메라 항체에는 뮤린(murine) V 영역 및 인 간 C 영역이 있다. 한 실시양태에서, 뮤린 경쇄 V 영역이 인간 카파 경쇄에 융합된다. 한 실시양태에서, 뮤린 중쇄 V 영역이 인간 IgG1 C 영역에 융합된다.
본 발명의 인간화 항체는 FR 내의 아미노산 치환이 있는 것들 및 그래프트된 CDR 내에 변화가 있는 친화력 성숙 변이체를 포함한다. CDR 또는 FR 내의 치환된 아미노산은 공여체 또는 수용체 내에 존재하는 것들에 한정되지 않는다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 증강된 CDC 및/또는 ADCC 기능 및 B-세포 사멸이 포함되는 개선된 이펙터(effector) 기능에 이르는 Fc 영역 내의 아미노산 잔기에서의 변화를 추가로 포함한다. 기타 본 발명의 항체에는 안정성을 개선시키는 특정 변화가 있는 것들이 포함된다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 감소된 이펙터 기능, 예를 들어 감소된 CDC 및/또는 ADCC 기능 및/또는 감소된 B-세포 사멸에 이르는 Fc 영역 내의 아미노산 잔기에서의 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 천연 킬러 (NK) 세포 상의 인간 Fc 수용체 및/또는 인간 보체 인자 C1q에 대한 감소된 결합 (예컨대 결합되지 않음)을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 FcγRI, FcγRIIA, 및/또는 FcγRIIIA에 대한 감소된 결합 (예컨대 결합되지 않음)을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 IgG 클래스 (예를 들어, IgG1 또는 IgG4)이고, E233, L234, G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 및/또는 P329 (EU 인덱스에 따른 번호매김)에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 돌연변이 L234A/L235A 또는 D265A/N297A를 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 본원에서 제공된 항원 결합 서열 중 임의의 것을 포 함하고, DLL4에 특이적으로 결합하는 항-DLL4 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 항체는 DLL4에 결합하고 (예컨대 특이적으로 결합하고), 일부 실시양태에서, 노치 수용체 활성화의 감소 또는 차단, 노치 수용체 하류 분자성 신호전달의 감소 또는 차단, DLL4에 대한 노치 수용체 결합의 파괴 또는 차단, 및/또는 내피 세포 증식의 촉진, 및/또는 내피 세포 분화의 억제, 및/또는 동맥 분화의 억제, 및/또는 종양 혈관 관류의 억제, 및/또는 종양, 세포 증식성 장애 또는 암의 치료 및/또는 예방; 및/또는 DLL4 발현 및/또는 활성과 관련된 장애의 치료 또는 예방 및/또는 노치 수용체 발현 및/또는 활성과 관련된 장애의 치료 또는 예방 중 임의의 1가지 이상을 포함하지만 이에 한정되지 않는, DLL4-관련 효과의 하나 이상의 양상을 조정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 DLL4에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 DLL4 세포외 도메인 (ECD)에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 DLL4 세포외 도메인으로 구성되거나 또는 본질적으로 구성되는 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 약 1 nM이거나 이보다 양호한, 또는 약 500 pM이거나 이보다 양호한 KD로 DLL4에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 약 2×105이거나 이보다 양호한, 또는 약 1×105이거나 이보다 양호한 kon으로 인간 DLL4에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 생체내에서 및/또는 시험관내에서 DLL4 활성을 감소시키고/시키거나, 억제하고/하거나, 차단한다. 일부 실시양태에서, 항체는 결합에 대해 DLL4-리간드와 경쟁한다 (DLL4에 대한 노치 수용체 결합을 감소시키고/시키거나 차단한다).
한 양상에서, 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 항체 및 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 담체는 제약상 허용가능한 담체이다.
한 양상에서, 본 발명은 본 발명의 항-DLL4 항체를 코딩하는 핵산을 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 핵산 및 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 담체는 제약상 허용가능한 담체이다.
한 양상에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 벡터는 임의 유형의 것, 예를 들어 재조합 벡터 예컨대 발현 벡터일 수 있다. 임의의 다양한 숙주 세포를 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵생물 세포, 예를 들어, 대장균이다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵생물 세포, 예를 들어 포유류 세포 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다.
한 양상에서, 본 발명은 본 발명의 항체의 제조 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 항-DLL4 항체 (또는 이의 단편)를 코딩하는 본 발명의 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에서 발현시키고, 상기 항체를 회수하는 것을 포함하는, 항-DLL4 항체 (본원에서 정의된 바와 같이, 전장 및 이의 단편을 포함함) 또는 면역접합체의 제조 방법을 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 용기; 및 용기 내에 함유된 조성물을 포함하고, 이때 조성물이 하나 이상의 본 발명의 항-DLL4 항체를 포함하는 제조품을 제공한다. 한 실시양태에서, 조성물은 항-혈관생성 작용제를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 항-혈관생성 작용제는 항-VEGF 항체, 예를 들어, 베바시주맵이다. 한 실시양태에서, 조성물은 본 발명의 핵산을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체를 포함하는 조성물은 담체를 추가로 포함하고, 이러한 담체는 일부 실시양태에서 제약상 허용가능한 담체이다. 한 실시양태에서, 항-혈관생성 작용제를 포함하는 제2 조성물이 용기 내에 함유된다. 한 실시양태에서, 항-혈관생성 작용제는 항-VEGF 항체, 예를 들어 베바시주맵이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 제조품은 조성물(들) (예를 들어, 항체)을 대상에게 투여하기 위한 지침서 (예컨대 본원에 기술된 방법들 중 임의의 것에 대한 지침서)를 추가로 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 항-DLL4 항체를 포함하는 조성물을 포함하는 제1 용기; 및 완충제를 포함하는 제2 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 한 실시양태에서, 완충제는 제약상 허용가능한 완충제이다. 한 실시양태에서, 항체를 포함하는 조성물은 담체를 추가로 포함하고, 이러한 담체는 일부 실시양태에서 제약상 허용가능한 담체이다. 한 실시양태에서, 키트는 조성물 (예를 들어, 항체)을 대상에게 투여하기 위한 지침서를 추가로 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 암, 종양 및/또는 세포 증식성 장애와 같은 장애의 치료용 및/또는 예방용 처치를 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 항-DLL4 항체의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 장애는 혈관생성과 관련된 병리학적 용태이다.
한 양상에서, 본 발명은 암, 종양 및/또는 세포 증식성 장애와 같은 장애의 치료용 및/또는 예방용 처치를 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 핵산의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 장애는 혈관생성과 관련된 병리학적 용태이다.
한 양상에서, 본 발명은 암, 종양 및/또는 세포 증식성 장애와 같은 장애의 치료용 및/또는 예방용 처치를 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 발현 벡터의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 장애는 혈관생성과 관련된 병리학적 용태이다.
한 양상에서, 본 발명은 암, 종양 및/또는 세포 증식성 장애와 같은 장애의 치료용 및/또는 예방용 처치를 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 숙주 세포의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 장애는 혈관생성과 관련된 병리학적 용태이다.
한 양상에서, 본 발명은 암, 종양 및/또는 세포 증식성 장애와 같은 장애의 치료용 및/또는 예방용 처치를 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 제조품의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 장애는 혈관생성과 관련된 병리학적 용태이다.
한 양상에서, 본 발명은 암, 종양 및/또는 세포 증식성 장애와 같은 장애의 치료용 및/또는 예방용 처치를 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 키트의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 장애는 혈관생성과 관련된 병리학적 용태이다.
본 발명은 DLL4의 발현 및/또는 활성, 예컨대 증가 또는 감소된 발현 및/또는 활성, 또는 원치 않는 발현 및/또는 활성과 관련된 질환 상태를 조정하는데 유용한 방법 및 조성물을 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 유효량의 항-DLL4 항체를 DLL4의 증가된 발현 및/또 는 활성과 관련된 종양, 암 및/또는 세포 증식성 장애를 치료 또는 예방하는 것을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, DLL4의 증가된 발현 및/또는 활성과 관련된 종양, 암 및/또는 세포 증식성 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 유효량의 항-DLL4 항체를 종양 또는 암의 성장을 감소시키거나, 억제하거나, 차단하거나 예방하는 것을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 종양 또는 암의 성장을 감소시키거나, 억제하거나, 차단하거나 예방하는 방법을 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 유효량의 항-DLL4 항체를 종양, 암 및/또는 세포 증식성 장애를 치료하는 것을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 종양, 암 및/또는 세포 증식성 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 유효량의 항-DLL4 항체를 혈관생성을 억제하는 것을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 혈관생성을 억제하는 방법을 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 유효량의 항-DLL4 항체를 혈관생성과 관련된 병리학적 용태를 치료하는 것을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 혈관생성과 관련된 병리학적 용태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 혈관생성과 관련된 병리학적 용태는 종양, 암 및/또는 세포 증식성 장애이다. 일부 실시양태에서, 혈관생성과 관련된 병리학적 용태는 안내 신생혈관 질환이다.
본 발명의 방법은 임의의 적절한 병리학적 상태에 영향을 미치는데 사용될 수 있다. 대표적인 장애가 본원에 기술되고, 여기에는 소세포 폐암, 신경모세포종, 흑색종, 유방 암종, 위암, 결장직장암 (CRC), 및 간세포 암종 (이러한 암들의 전이성 형태 포함)으로 구성된 군으로부터 선택된 암이 포함된다.
본 발명의 방법은 추가적인 치료 단계들을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 표적화된 세포 및/또는 조직 (예를 들어, 암 세포)이 방사선 치료 또는 화학요법제 또는 항-혈관생성 작용제에 노출되는 단계가 방법에 추가로 포함된다.
또다른 양상에서, 본 발명은 샘플 내의 DLL4-항-DLL4 항체 복합체를 검출하는 것을 포함하는 DLL4의 검출 방법을 제공한다. 본원에서 사용된 용어 "검출"은 대조군과 관련된 또는 대조군과 상관 없는 정성적 검출 및/또는 정량적 검출 (수준을 측정하는 것)을 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 DLL4 발현 및/또는 활성과 관련된 장애가 있거나 이러한 장애가 있는 것으로 추측되는 환자로부터의 생물학적 샘플 내의 DLL4-항-DLL4 항체 복합체를 검출하는 것을 포함하는, DLL4 발현 및/또는 활성과 관련된 장애를 진단하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, DLL4 발현은 증가된 발현 또는 비정상적인 발현이다. 일부 실시양태에서, 장애는 종양, 암, 및/또는 세포 증식성 장애이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 검출가능한 표지를 포함하는, 본원에 기술된 항-DLL4 항체 중 임의의 것을 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 임의의 본원에 기술된 항-DLL4 항체와 DLL4의 복합체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 복합체는 생체내 복합체 또는 시험관내 복합체이다. 일부 실시양태에서, 복합체는 암 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-DLL4 항체는 검출가능하게 표지된다.
도 1a, b: 항-DLL4 항체의 중쇄 및 경쇄 HVR 루프(loop) 서열. 도면은 중쇄 HVR 서열 H1, H2, 및 H3, 및 경쇄 HVR 서열 L1, L2 및 L3을 나타낸다. 서열 번호매김은 하기와 같다: 클론 152.26 (HVR-H1은 서열 1이고; HVR-H2는 서열 3이고; HVR-H3은 서열 9이고; HVR-L1은 서열 10이고; HVR-L2는 서열 11이고; HVR-L3은 서열 12이다); 클론 152.26.6 (HVR-H1은 서열 1이고; HVR-H2는 서열 4이고; HVR-H3은 서열 9이고; HVR-L1은 서열 10이고; HVR-L2는 서열 11이고; HVR-L3은 서열 13이다); 클론 152.26.14 (HVR-H1은 서열 2이고; HVR-H2는 서열 3이고; HVR-H3은 서열 9이고; HVR-L1은 서열 10이고; HVR-L2는 서열 11이고; HVR-L3은 서열 14이다); 클론 152.26.20 (HVR-H1은 서열 1이고; HVR-H2는 서열 5이고; HVR-H3은 서열 9이고; HVR-L1은 서열 10이고; HVR-L2는 서열 11이고; HVR-L3은 서열 15이다); 클론 152.26.34 (HVR-H1은 서열 1이고; HVR-H2는 서열 6이고; HVR-H3은 서열 9이고; HVR-L1은 서열 10이고; HVR-L2는 서열 11이고; HVR-L3은 서열 16이다); 클론 152.26.40 (HVR-H1은 서열 1이고; HVR-H2는 서열 7이고; HVR-H3은 서열 9이고; HVR-L1은 서열 10이고; HVR-L2는 서열 11이고; HVR-L3은 서열 17이다); 및 클론 152.26.82 (HVR-H1은 서열 1이고; HVR-H2는 서열 8이고; HVR-H3은 서열 9이고; HVR-L1은 서열 10이고; HVR-L2는 서열 11이고; HVR-L3은 서열 18이다).
아미노산 위치는 하기에 기술된 바와 같은 카밧 번호매김 시스템에 따라 번호가 매겨진다.
도 2 ＆ 3: 하기와 같은 서열 식별인자로 본 발명을 실행하는데 사용하기 위한 대표적인 어셉터(acceptor) 인간 컨센서스 프레임워크 서열을 도시한다:
가변 중쇄 (VH) 컨센서스 프레임워크 (도 2a, b)
인간 VH 서브그룹 I 컨센서스 프레임워크 빼기 카밧 CDR (서열 19)
인간 VH 서브그룹 I 컨센서스 프레임워크 빼기 확장된 초가변 영역 (서열 20-22)
인간 VH 서브그룹 II 컨센서스 프레임워크 빼기 카밧 CDR (서열 23)
인간 VH 서브그룹 II 컨센서스 프레임워크 빼기 확장된 초가변 영역 (서열 24-26)
인간 VH 서브그룹 III 컨센서스 프레임워크 빼기 카밧 CDR (서열 27)
인간 VH 서브그룹 III 컨센서스 프레임워크 빼기 확장된 초가변 영역 (서열 28-30)
인간 VH 어셉터 프레임워크 빼기 카밧 CDR (서열 31)
인간 VH 어셉터 프레임워크 빼기 확장된 초가변 영역 (서열 32-33)
인간 VH 어셉터 2 프레임워크 빼기 카밧 CDR (서열 34)
인간 VH 어셉터 2 프레임워크 빼기 확장된 초가변 영역 (서열 35-37)
가변 경쇄 (VL) 컨센서스 프레임워크 (도 3)
인간 VL 카파 서브그룹 I 컨센서스 프레임워크 (서열 38)
인간 VL 카파 서브그룹 II 컨센서스 프레임워크 (서열 39)
인간 VL 카파 서브그룹 III 컨센서스 프레임워크 (서열 40)
인간 VL 카파 서브그룹 IV 컨센서스 프레임워크 (서열 41)
도 4: huMAb4D5-8 경쇄 및 중쇄의 프레임워크 영역 서열을 도시한다. 위첨자/볼드체의 숫자는 카밧에 따른 아미노산 위치를 가리킨다.
도 5: huMAb4D5-8 경쇄 및 중쇄의 변형된/변이체 프레임워크 영역 서열을 도시한다. 위첨자/볼드체의 숫자는 카밧에 따른 아미노산 위치를 가리킨다.
도 6: 항체 클론 26.20, 26.14, 및 26.82의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 도시한다.
도 7: DLL4-매개 노치 신호전달이 EC 증식을 조절하였다. a-c, f, 3-D 피브린 젤에서의 HUVEC 싹내밀기 분석법. 항-DLL4 항체 (YW26.82) 또는 DBZ가 HUVEC의 싹내밀기를 촉진하였다 (a). Ki67 염색은 항-DLL4 항체 또는 DBZ가 HUVEC의 과증식을 야기하였음을 나타냈다 (b). 항-DLL4 항체 또는 DBZ는 SF 조건화 배지의 존재 하에 HUVEC의 싹내밀기를 증가시켰다 (c). d, h, 항-DLL4 항체의 전신 전달이 신생아 망막에서의 EC의 대규모의 축적을 야기하였다. 망막 혈관구조의 저배율 (위쪽) 및 고배율 (아래쪽)의 공초점 영상 (이소렉틴 염색) (d). Ki67 염색은 항-DLL4 항체로 처리된 신생아 망막에서의 증가된 EC 증식을 나타낸다 (h). e, 고정된 DLL4에 의한 노치 활성화가 HUVEC 증식을 억제하였다. f, 항-VEGF 항체가 DBZ의 존재 또는 부재 하에 HUVEC 싹내밀기를 억제하였다. g, 노치에 의한 VEGFR2의 조절. 항-DLL4 항체 또는 DBZ에 의한 HUVEC의 3-D 피브린 젤 배양 (7일)에서의 노치 차단 (왼쪽), 또는 고정된 DLL4에 의한 HUVEC의 2-D 배양 (36시간)에서의 노치 활성화 (오른쪽)에 응답한 VEGFR2 발현의 정량적 PCR 분석. 항-DLL4 항체 및 DBZ는 각각 5 ㎍/㎖ 및 0.08 μM로 사용되었다 (a-c, e-g).
도 8: DLL4-매개 노치 신호전달이 EC 분화를 조절하였다. a, 피브린 젤에서 성장 중인 HUVEC에 의해 형성된 관강-유사 구조 (백색 화살표)가 항-DLL4 항체 또는 DBZ의 존재 하에 사라졌다. 대신, 싹에 세포가 고도로 채워졌다 (흑색 화살표). b, 노치에 의한 TGFβ2의 조절. 항-DLL4 항체 또는 DBZ에 의한 HUVEC의 3-D 피브린 젤 배양 (7일)에서의 노치 차단 (왼쪽), 또는 고정된 DLL4에 의한 HUVEC의 2-D 배양 (36시간)에서의 노치 활성화 (오른쪽)에 응답한 TGFβ2 발현의 정량적 PCR 분석. c, 항-DLL4 항체가 동맥 발달을 차단한다. 알파 평활근 액틴 (ASMA) 및 이소렉틴으로 염색된 신생 마우스 망막의 공초점 영상. 신생 마우스를 도 7d에 기술된 바와 같이 처리하였다. d, ASMA 및 이소렉틴으로 염색된 성체 마우스 망막의 공초점 영상. 8주령 마우스를 PBS 또는 항-DLL4 항체 (10 ㎎/㎏, 1주일에 2번)로 2주 동안 처리하였다.
도 9: DLL4 및/또는 VEGF의 선택적인 차단이 종양 혈관생성을 파괴하였고, 종양 성장을 억제한다. a-f, 종양 모델의 결과: HM7 (a), Colo205 (b), Calu6 (c), MDA-MB-435 (d), MV-522 (e) 및 WEHI3 (f). SE와 함께 평균 종양 부피가 제시된다. g-h, 종양 혈관 조직학 연구. 대조군, 항-DLL4 항체 및 항-VEGF로 처리된 마우스로부터의 EL4 종양 절편 내의 항-CD31의 면역조직화학 (g). EL4 종양 절편에서의 렉틴 관류 및 항-CD31 염색 (h). i-p. 종양 모델 SK-OV-3X1 (i), LL2 (j), EL4 (k), H1299 (l), SKMES-1(m), MX-1(n), SW620 (o) 및 LS174T(p)의 결과.
도 10: DLL4/노치가 마우스 장의 항상성에서 비필수적이었다. 대조군 (a, d, g, j), 항-DLL4 항체 (10 ㎎/㎏, 6주 동안 일주일에 2번) (b, e, h, k), 및 DBZ (30 μM/㎏, 5일 동안 매일) (c, f, i, l)로 처리된 마우스로부터의 소장의 면역조직화학적 연구. H＆E (a, b, c) 및 알시안 블루(Alcian Blue) 염색 (d, e, f)으로 나타난 바와 같이, DBZ는 술잔 세포에 의한 TA 집단의 대체를 야기하였다. 이러한 변화는 항-DLL4 항체 처리에서는 전혀 없었다. Ki67 (g, h, i) 및 HES-1 (j, k, l) 염색에서 항-DLL4 항체가 DBZ의 효과를 복제하는데 실패하였다는 것이 추가로 확인되었다.
도 11: 항-DLL4 항체의 특성화. a, 항-DLL4 항체 모노클로날 항체 (Mab) YW26.82의 에피토프 지도작성. C-말단 인간 태반 알칼리성 포스파타제 (AP) 융합 단백질로서 발현된 DLL4 돌연변이체 셋트의 개략도. 융합 단백질을 함유하는 293T 세포 조건화 배지를 정제된 항-DLL4 항체 (YW26.82, 0.5 ㎍/㎖)로 코팅된 96-웰 미량역가 플레이트 상에서 테스트하였다. 결합된 DLL4.AP를 1-Step PNPP (Pierce)를 기질로 사용하여 OD 405 nm 흡광도 측정으로 검출하였다. b-d, YW26.82의 DLL4에 대한 선택적인 결합. 96-웰 Nunc MaxiSorp™ 플레이트를 지시된 바와 같은 정제된 재조합 단백질로 코팅하였다 (1 ㎍/㎖). 지시된 농도에서의 YW26.82의 결합을 ELISA 분석법에 의해 측정하였다. 결합된 항체를 항-인간 항체 HRP 접합체로 TMB를 기질로 사용하여 OD 450 nm 흡광도 측정으로 측정하였다. 항-HER2 및 재조합 ErbB2-ECD를 분석 대조군으로 사용하였다 (b). 벡터, 전장 DLL4, Jag1 또는 DLL1으로 일시적으로 형질감염된 293 세포의 FACS 분석. YW26.82의 현저한 결합은 DLL4로 형질감염된 세포 상에서만 검출되었다 (상부 패널). Jag1 및 DLL1의 발현이 각각 재조합 래트 노치1-Fc (rr노치1-Fc, 중간 패널) 및 재조합 래트 노치2-Fc (rr노치2-Fc, 하부 패널)의 결합에 의해 확인되었다. YW26.82, rr노치1-Fc 또는 rr노치2-Fc (R＆D system)을 2 ㎍/㎖로 사용한 후, 염소 항-인간 IgG-PE (1:500, Jackson ImmunoResearch)를 사용하였다 (c). 항-DLL4 항체는 코팅된 r노치1에 대한 DLL4-AP의 결합을 차단하였지만, DLL1-AP의 결합은 차단하지 않았고, 이때 계산된 IC50은 약 12 nM였다 (왼쪽 패널). 항-DLL4 항체는 코팅된 r노치1에 대한 DLL4-His의 결합을 차단하였지만, Jag1-His의 결합은 차단하지 않았고, 이때 계산된 IC50은 약 8 nM였다 (오른쪽 패널) (d). e, 내인성으로 발현된 DLL4에 대한 YW26.82의 특이적 결합. 대조군 또는 DLL4-특이적 siRNA로 형질감염된 HUVEC의 FACS 분석. YW26.82를 2 ㎍/㎖로 사용한 후, 염소 항-인간 IgG-PE (1:500, Jackson ImmunoResearch)를 사용하였다 (e).
도 12: 노치 활성화에 의한 DLL4의 상향조절. DBZ (0.08 μM)의 부재 또는 존재 하에 고정된 C-말단 His-태그(tag) 부착 인간 DLL4 (아미노산 1-404)에 의해 HUVEC를 자극하였다. 자극 36시간 후, 내인성 DLL4 발현을 항-DLL4 항체로의 FACS 분석에 의해 시험하였다.
본 발명은 항-DLL4 항체를 제공하고, 이는, 예를 들어, DLL4의 발현 및/또는 활성, 예컨대 증가된 발현 및/또는 활성 또는 원치 않는 발현 및/또는 활성과 관련된 질환 상태의 치료 또는 예방에 유용하다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 종양, 암 및/또는 세포 증식성 장애를 치료하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 혈관생성과 관련된 병리학적 용태를 치료하는데 사용된다.
또다른 양상에서, 본 발명의 항-DLL4 항체에서 DLL4의 검출 및/또는 단리, 예컨대 다양한 조직 및 세포 유형에서의 DLL4의 검출을 위한 시약으로서의 유용성이 발견된다.
본 발명은 항-DLL4 항체의 제조 방법, 및 항-DLL4 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다.
일반적인 기술
본원에서 기술되었거나 참조된 기술 및 절차는 당업자에 의해 전통적인 방법론, 예를 들어, [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.], [CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003))]; 시리즈 [METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.)]: [PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995))], [Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL], 및 [ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987))]에 기술된 광범위하게 활용되는 방법론을 사용하여 일반적으로 잘 이해되고 통상적으로 사용된다.
정의
"단리된" 항체는 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 이의 천연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법으로 측정시 95 중량％ 초과의 항체, 가장 바람직하게는 99 중량％ 초과로, (2) 스피닝 컵 서열분석기를 사용함으로써 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기 15개 이상을 수득하는데 충분한 정도로, 또는 (3) Coomassie™ 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하는 환원 또는 비-환원 조건 하에서의 SDS-PAGE에 의한 균질성으로 정제될 것이다. 단리된 항체에는 재조합 세포 내의 계내 항체가 포함되는데, 이는 항체의 천연 환경의 1가지 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 유사하게, 단리된 항체는 재조합 세포 주위의 배지 내의 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 1회 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"단리된" 핵산 분자는 항체 핵산의 천연 공급원 내에서 통상적으로 회합되는 1가지 이상의 오염 핵산 분자로부터 확인 및 분리된 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 천연에서 발견되는 형태 또는 환경 이외의 것이다. 따라서 단리된 핵산 분자는 천연 세포 내에 존재하는 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 단리된 핵산 분자는, 예를 들어, 핵산 분자가 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 있는 경우, 항체를 통상적으로 발현하는 세포 내에 함유된 핵산 분자를 포함한다.
용어 "카밧에서와 같은 가변 도메인 잔기 번호매김" 또는 "카밧에서와 같은 아미노산 위치 번호매김", 및 이의 변형은 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에서의 항체의 편집의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대해 사용된 번호매김 시스템을 지칭한다. 이러한 번호매김 시스템을 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축 또는 이들 내로의 삽입에 상응하는 더 적은 아미노산 또는 추가적인 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 뒤의 단일 아미노산 삽입물 (카밧에 따른 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 뒤의 삽입 잔기 (예를 들어, 카밧에 따른 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카밧 번호매김은 소정의 항체에 대해 "표준" 카밧 번호매김 서열과 항체 서열의 상동성의 영역에서의 정렬에 의해 결정될 수 있다.
본원에 사용된 "실질적으로 유사한" 또는 "실질적으로 동일한"이라는 구절은 2개의 수치값 (일반적으로, 하나는 본 발명의 항체와 관련되고, 다른 것은 기준/비교물 항체와 관련됨) 간의 충분히 높은 정도의 유사성을 나타내어서, 당업자는 2개의 값 간의 차이가 상기 값들 (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징의 문맥에서 생물학적 및/또는 통계학적 유의성이 거의 없거나 또는 없는 것으로 간주할 것이다. 상기 2개의 값 간의 차이는 기준/비교물 항체에 대한 값의 함수로서 바람직하게는 약 50％ 미만, 바람직하게는 약 40％ 미만, 바람직하게는 약 30％ 미만, 바람직하게는 약 20％ 미만, 바람직하게는 약 10％ 미만이다.
일반적으로 "결합 친화력"은 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너 (예를 들어 항원) 간의 비공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 본원에서 사용된 "결합 친화력"은 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화력을 지칭한다. 분자 X의 이의 파트너 Y에 대한 친화력은 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표현될 수 있다. 친화력은 본원에 기술된 것들을 포함하는, 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 저-친화력 항체는 일반적으로 항원에 느리게 결합하고 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 고-친화력 항체는 일반적으로 항원에 더 빠르게 결합하고 더 길게 결합을 유지하는 경향이 있다. 결합 친화력을 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 이들 중 임의의 것이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 구체적인 예시적 실시양태가 하기에 기술된다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 "Kd" 또는 "Kd 값"은 표지되지 않은 항원의 적정 시리즈의 존재 하에 Fab를 최소 농도의 (125I)-표지 항원으로 평형화시킨 후, 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅 플레이트로 포획함으로써 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화력을 측정하는 하기의 분석법에 기술된 바와 같이 Fab 버전의 당해 항체 및 이의 항원으로 수행된 방사성표지 항원 결합 분석법 (RIA)에 의해 측정된다 ([Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881)]). 분석법의 조건을 확립하기 위해, 미량역가 플레이트 (Dynex)를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 내의 포획용 항-Fab 항체 (Cappel Labs) 5 ㎍/㎖으로 하룻밤 동안 코팅하고, 이어서 PBS 내의 2％ (w/v) 소 혈청 알부민으로 실온 (약 23℃)에서 2 내지 5시간 동안 차단한다. 비-흡착성 플레이트 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 당해 Fab의 계단 희석물과 혼합한다 (예를 들어, [Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]에서의 항-VEGF 항체인 Fab-12의 평가와 일치함). 그 후, 당해 Fab를 하룻밤 동안 인큐베이션한다; 그러나, 평형에 도달되는 것을 확실히 하기 위해 인큐베이션이 더 긴 기간 (예를 들어, 65시간) 동안 계속될 수 있다. 그 후, 혼합물을 포획 플레이트에 옮겨 실온에서 인큐베이션한다 (예를 들어 1시간 동안). 그 후, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 내의 0.1％ Tween®20으로 8회 세정한다. 플레이트가 건조되면, 150 ㎕/웰의 섬광제 (MicroScint™-20; Packard)를 첨가하고, 플레이트를 10분 동안 Topcount 감마 카운터 (Packard) 상에서 카운팅한다. 최대 결합의 20％ 이하를 제공하는 각각의 Fab의 농도를 경쟁 결합 분석에 사용하기 위해 선택한다. 또다른 실시양태에 따르면, 약 10 응답 단위 (RU)의 고정된 항원 CM5 칩과 함께 25℃에서 BIAcore™-2000 또는 BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명 분석법을 이용하여 Kd 또는 Kd 값이 측정된다. 간략하게, 공급자의 지침서에 따라, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIAcore, Inc.)을 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)으로 5 ㎍/㎖ (약 0.2 μM)로 희석한 후, 5 ㎕/분의 유속으로 주입하여, 약 10 응답 단위 (RU)의 커플링된 단백질을 달성한다. 항원의 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응 기를 차단한다. 동역학 측정을 위해, Fab의 2배 계단 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)을 25℃에서 약 25 ㎕/분의 유속으로 0.05％ Tween® 20이 있는 PBS (PBST)에 주입한다. 회합 및 해리 센서그램(sensorgram)을 동시에 핏팅(fitting)함으로써 단순 일-대-일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (BIAcore Evaluation Software 버전 3.2)을 이용하여 회합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon의 비율로서 계산된다. 예를 들어, [Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881] 참조. 온-속도(on-rate)가 상기 표면 플라즈몬 공명 분석법에 의해 106 M-1S-1을 초과하면, 교반 큐벳이 있는 8000-시리즈 SLM-Aminco 분광광도계 (ThermoSpectronic) 또는 흐름-정지가 장착된 분광광도계 (Aviv Instruments)와 같은 분광광도계에서 측정된 바와 같이, 증가하는 농도의 항원의 존재 하에서의, PBS (pH 7.2) 내의 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드-패스)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭(quenching) 기술을 사용하여 온-속도를 측정할 수 있다.
본 발명에 따른 "온-속도" 또는 "회합의 속도" 또는 "회합 속도" 또는 "kon"은 약 10 응답 단위 (RU)의 고정된 항원 CM5 칩과 함께 25℃에서 BIAcore™-2000 또는 BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)를 사용하여 상기 기술된 동일한 표면 플라즈몬 공명 기술로 또한 결정될 수 있다. 간략하게, 공급자의 지침서에 따라, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIAcore, Inc.)을 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)으로 5 ㎍/㎖ (약 0.2 μM)로 희석한 후, 5 ㎕/분의 유속으로 주입하여, 약 10 응답 단위 (RU)의 커플링된 단백질을 달성한다. 항원의 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응 기를 차단한다. 동역학 측정을 위해, Fab의 2배 계단 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)을 25℃에서 약 25 ㎕/분의 유속으로 0.05％ Tween®20이 있는 PBS (PBST)에 주입한다. 회합 및 해리 센서그램을 동시에 핏팅함으로써 단순 일-대-일 랭뮤어 결합 모델 (BIAcore Evaluation Software 버전 3.2)을 이용하여 회합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon의 비율로서 계산되었다. 예를 들어, [Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881] 참조. 그러나, 온-속도가 상기 표면 플라즈몬 공명 분석법에 의해 106 M-1S-1을 초과하면, 교반 큐벳이 있는 8000-시리즈 SLM-Aminco 분광광도계 (ThermoSpectronic) 또는 흐름-정지가 장착된 분광광도계 (Aviv Instruments)와 같은 분광광도계에서 측정된 바와 같이, 증가하는 농도의 항원의 존재 하에서의, PBS (pH 7.2) 내의 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드-패스)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 사용하여 온-속도가 바람직하게 결정된다.
본원에서 사용된 용어 "벡터"는 자신이 연결된 또다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하도록 의도된다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드"이고, 이는 추가적인 DNA 절편이 내부로 결찰될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 또다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이고, 이때 추가적인 DNA 절편은 바이러스 게놈 내로 결찰될 수 있다. 특정 벡터들은 이들이 도입된 숙주 세포 내에서 자가복제할 수 있다 (예를 들어, 박테리아 복제 기원이 있는 박테리아 벡터, 및 에피솜 포유류 벡터). 또다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입시 숙주 세포의 게놈 내로 삽입될 수 있어, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터들은 이들이 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이같은 벡터들은 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 단순히, "재조합 벡터")로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, 플라스미드가 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로 "플라스미드" 및 "벡터"는 때때로 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
본원에서 상호교환가능하게 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해, 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 이의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 어셈블리(assembly) 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 합성 후에, 예컨대 표지와의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 기타 유형의 변형은, 예를 들어, "캡(cap)", 하나 이상의 천연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 치환, 뉴클레오티드간(internucleotide) 변형, 예를 들어, 전하를 띠지 않는 연결 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등) 및 전하를 띠는 연결 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)이 있는 것, 펜던트(pendant) 모이어티(moiety) 예컨대 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-라이신 등)을 함유하는 것, 인터칼레이터(intercalator) (예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등)가 있는 것, 킬레이터 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)를 함유하는 것, 알킬화제를 함유하는 것, 변형된 연결이 있는 것 (예를 들어, 알파 아노머형(anomeric) 핵산 등), 뿐만 아니라 변형되지 않은 형태의 폴리뉴클레오티드(들)을 포함한다. 또한, 당에 통상적으로 존재하는 히드록실 기 중 임의의 것이, 예를 들어, 포스포네이트 기, 포스페이트 기로 대체될 수 있거나, 표준 보호 기에 의해 보호될 수 있거나, 또는 추가적인 뉴클레오티드에의 추가적인 연결이 제조되도록 활성화될 수 있거나, 또는 고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화되거나 탄소수 1 내지 20의 아민 또는 유기 캡핑(capping) 기 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 히드록실 또한 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 2'-O-메틸-2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 탄소환식 당 유사체, α-아노머형 당, 에피머형(epimeric) 당 예컨대 아라비노스, 자일로스 또는 릭소오스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비환식(非環式) 유사체 및 무염기성 뉴클레오시드 유사체 예컨대 메틸 리보사이드가 예를 들어 포함되는, 당업계에 일반적으로 공지된 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사 형태를 또한 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연결이 별법적인 연결 기로 치환될 수 있다. 이러한 별법적인 연결 기들에는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈") [식중 각각의 R 또는 R'은 독립적으로 H, 또는 에테르 (-O-) 연결을 임의로 함유하는 치환 또는 비치환 알킬 (1-20 C), 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아르알킬이다]로 대체된 실시양태가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연결이 동일할 필요는 없다. 상기의 기술은 RNA 및 DNA를 포함하여 본원에서 언급된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
일반적으로, 본원에서 사용된 "올리고뉴클레오티드"는 길이가 필수적이지는 않지만 일반적으로 뉴클레오티드 약 200개 미만인, 짧은, 일반적으로 단일 가닥인, 일반적으로 합성인 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 서로 배타적이지 않다. 폴리뉴클레오티드에 대한 상기 기술은 동일하게, 그리고 완전히 올리고뉴클레오티드에 적용가능하다.
펩티드 또는 폴리펩티드 서열에 관한 "백분율 (％) 아미노산 서열 동일성"은 서열들을 정렬하고, 필요하다면 갭(gap)을 도입하여, 최대 백분율의 서열 동일성을 달성한 후의 특정 펩티드 또는 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로 정의되고, 이때 어떠한 보존성 치환도 서열 동일성의 일부로 간주되지 않는다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 목적의 정렬은 당업계의 기술에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 MegAlign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교될 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대의 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라메터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원에서의 목적을 위해, ％ 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 제작되었고, 소스(source) 코드가 사용자 문서와 함께 미국 저작국(U.S. Copyright Office) (Washington D.C., 20559)에 제출되어 미국 저작권 번호 TXU510087 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc. (South San Francisco, California)를 통해 공개적으로 입수가능하다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영 체제, 바람직하게는 디지털 UNIX V4.0D 상에서의 사용에 대해 컴파일링(compiling)되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 경우, 소정의 아미노산 서열 A의 소정의 아미노산 서열 B에 대한, B와의 또는 B와 대조된 ％ 아미노산 서열 동일성(소정의 아미노산 서열 B에 대한, B와의 또는 B와 대조된 특정 ％ 아미노산 서열 동일성을 갖는 또는 포함하는 소정의 아미노산 서열 A로 별법적으로 표현될 수 있음)은 하기와 같이 계산된다:
100 × 분수 X/Y
[식중, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2의 A와 B의 정렬에서 이러한 프로그램에 의해 동일한 매치로 점수가 매겨진 아미노산 잔기의 개수이고, Y는 B 내의 아미노산 잔기의 전체 개수이다]. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A의 B에 대한 ％ 아미노산 서열 동일성은 B의 A에 대한 ％ 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않을 것임이 이해될 것이다.
달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 ％ 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞의 단락에서 기술된 바와 같이 수득된다.
본원에서 사용된 용어 "DLL4" (상호교환가능하게 "델타-유사 4"로 명명됨)는, 달리 구체적으로 또는 문맥적으로 지시되지 않는 한, 임의의 천연 또는 변이체 (천연 또는 합성) DLL4 폴리펩티드를 지칭한다. 용어 "천연 서열"은 천연 발생 말단절단(truncated) 또는 분비 형태 (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 천연 발생 변이체 형태 (예를 들어, 별법적으로 스플라이싱(splicing)된 형태) 및 천연발생 대립유전자 변이체를 명확하게 포함한다. 용어 "야생형 DLL4"는 천연 발생 DLL4 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 일반적으로 지칭한다. 용어 "야생형 DLL4 서열"은 천연 발생 DLL4에서 발견되는 아미노산 서열을 일반적으로 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "노치 수용체" (상호교환가능하게 "노치"로 명명됨)는, 달리 구체적으로 또는 문맥적으로 지시되지 않는 한, 임의의 천연 또는 변이체 (천연 또는 합성) 노치 수용체 폴리펩티드를 지칭한다. 인간에게는 4가지 노치 수용체 (노치1, 노치2, 노치3, 및 노치4)가 있다. 본원에서 사용된 용어 노치 수용체는 인간 노치 수용체 중 임의의 하나 또는 4가지 모두를 포함한다. 용어 "천연 서열"은 천연 발생 말단절단 또는 분비 형태 (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 천연 발생 변이체 형태 (예를 들어, 별법적으로 스플라이싱된 형태) 및 천연발생 대립유전자 변이체를 명확하게 포함한다. 용어 "야생형 노치 수용체"는 천연 발생 노치 수용체 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 일반적으로 지칭한다. 용어 "야생형 노치 수용체 서열"은 천연 발생 노치 수용체에서 발견되는 아미노산 서열을 일반적으로 지칭한다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 가장 광범위한 의미로 상호교환가능하게 사용되고, 모노클로날 항체 (예를 들어, 전장 또는 무손상 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 다가 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이중특이적 항체)를 포함하고, 또한 특정 항체 단편 (본원에서 더욱 상세하게 기술됨)을 포함할 수 있다. 항체는 인간 항체, 인간화 항체 및/또는 친화력 성숙 항체일 수 있다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체들 간에서 서열이 크게 상이하고 각각의 특정 항체의 자신의 특정 항원에 대한 결합 및 특이성에서 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되지 않다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 상보성-결정 영역 (CDR) 또는 초가변 영역 (HVR)으로 칭해지는 3개의 절편에 집중된다. 가변 도메인에서 더욱 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 칭해진다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 β-시트 구조를 연결하고, 일부 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는 3개의 CDR에 의해 연결된, β-시트 형상을 주로 채택한 4개의 FR을 포함한다. 각각의 사슬 내의 CDR은 FR 영역에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른 사슬로부터의 CDR들과 함께 항체의 항원-결합 부위를 형성하는데 기여한다 ([Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체가 항원에 결합하는 것에 직접적으로 관여하지는 않지만, 항체-의존적 세포형 독성에서의 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
항체를 파파인(papain)으로 소화시키면 "Fab" 단편이라고 칭해지는, 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 2개의 동일한 항원-결합 단편과, 나머지 "Fc" 단편이 생산되는데, Fc라는 명칭은 이의 쉽게 결정화되는 능력을 반영한 것이다. 펩신으로 처리하면 2개의 항원 결합 부위를 갖고 여전히 항원과 교차결합할 수 있는 F(ab')2 단편이 산출된다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 부위 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 2-사슬 Fv 종에서, 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이 단단한 비공유결합으로 회합되어 있는 이량체로 구성된다. 단일쇄 Fv 종에서, 1개의 중쇄 가변 도메인 및 1개의 경쇄 가변 도메인이 경쇄와 중쇄가 2-사슬 Fv 종에서의 것과 유사한 "이량체성" 구조로 회합될 수 있도록 가요성 펩티드 링커(linker)에 의해 공유결합으로 연결될 수 있다. 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR이 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에 항원-결합 부위를 규정하는 것은 이러한 형상 내이다. 총괄적으로, 6개의 CDR이 항원-결합 특이성을 항체에 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함한 Fv의 절반)도, 비록 전체 결합 부위보다는 낮은 친화력이지만, 항원을 인식하고 이에 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 또한 함유한다. Fab' 단편은, 항체 힌지(hinge) 영역으로부터의 1개 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇개의 잔기들이 부가되어 있어서 Fab 단편과 다르다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올 기를 갖는 Fab'에 대한 본원에서의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 힌지 시스테인을 사이에 갖는 Fab' 단편들의 쌍으로서 본래 생산되었다. 항체 단편들의 기타 화학적 커플링 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 칭해지는 명백하게 상이한 2가지 유형 중의 하나로 지정될 수 있다.
중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 여러 클래스로 지정될 수 있다. 면역글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 주요 5개 클래스가 있고, 이들 중 몇몇은 서브클래스(subclass) (이소타입(isotype)), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 칭해진다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 주지되어 있다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 일부만을 포함하고, 이때 이 부분은 무손상 항체 내에 존재할 때 이 부분과 정상적으로 관련된 기능을 하나 이상, 바람직하게는 대부분 또는 전부 유지한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하고, 따라서 항원에 결합하는 능력을 유지한다. 또다른 실시양태에서, 항체 단편, 예를 들어 Fc 영역을 포함하는 단편은 무손상 항체 내에 존재할 때 Fc 영역과 정상적으로 관련된 생물학적 기능, 예컨대 FcRn 결합, 항체 반감기 조정, ADCC 기능 및 보체 결합 중 하나 이상을 유지한다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 생체내 반감기가 무손상 항체와 실질적으로 유사한 일가 항체이다. 예를 들어, 이같은 항체 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 팔(arm)을 포함할 수 있다.
용어 "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV"는, 본원에서 사용되었을 때, 서열이 초가변성이고/이거나 구조적으로 한정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 초가변 영역을 포함한다: VH 내의 3개 (H1, H2, H3) 및 VL 내의 3개 (L1, L2, L3). 다수의 초가변 영역 서술이 사용되고 있고, 본원에 포함된다. 카밧 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 가변성을 기초로 하고, 가장 통상적으로 사용된다 ([Kabat et al., Sequences of Protenis of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]). 그 대신, 코티아(Chothia)는 구조적 루프의 위치를 지칭한다 ([Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]). AbM 초가변 영역은 카밧 CDR과 코티아 구조적 루프 간의 절충안을 나타내고, Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접촉" 초가변 영역은 입수가능한 복합체 결정 구조의 분석을 기초로 한다. 이러한 초가변 영역 각각으로부터의 잔기를 하기에 나타낸다.
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초가변 영역은 하기와 같은 "확장된 초가변 영역"을 포함할 수 있다: VL 내의 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 VH 내의 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 각각의 이러한 정의에 대해 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따라 번호가 매겨진다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 집단을 이루는 개별적인 항체들은, 모노클로날 항체의 생산 동안 발생할 수 있는 가능한 변이체들 (이같은 변이체들은 일반적으로 미량으로 존재한다)을 제외하고는, 동일하고/하거나 같은 에피토프에 결합한다. 이같은 모노클로날 항체는 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 전형적으로 포함하고, 이때 표적-결합 폴리펩티드 서열은 다수의 폴리펩티드 서열로부터의 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선별을 포함하는 프로세스에 의해 수득되었다. 예를 들어, 선별 프로세스는 다수의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀(pool)로부터 독특한 클론을 선별하는 것일 수 있다. 예를 들어, 표적에 대한 친화력 개선, 표적 결합 서열의 인간화, 세포 배양에서의 이의 생산의 개선, 생체 내에서의 이의 면역원성의 감소, 다중특이적 항체의 생성 등을 위해, 선별된 표적 결합 서열이 추가로 변경될 수 있고, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체 또한 본 발명의 모노클로날 항체라는 것을 이해하여야 한다. 여러 결정인자 (에피토프)에 대해 지시된 여러 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 이의 특이성에 더하여, 모노클로날 항체 제제는 전형적으로 다른 면역글로불린에 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 수식어구 "모노클로날"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된다는 항체의 특성을 가리키는 것이며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법 (예를 들어, [Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)]; [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; [Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조), 파지 디스플레이 기술 (예를 들어, [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)]; [Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)]; [Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004)]; [Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)]; 및 [Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)] 참조), 및 인간 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자좌 또는 유전자의 일부 또는 모두를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하기 위한 기술 (예를 들어, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; [Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)]; 미국 특허 번호 5,545,806; 5,569,825; 5,591,669 (모두 GenPharm); 5,545,807; WO 1997/17852; 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016; [Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)]; 및 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995)] 참조)이 예를 들어 포함되는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 부분에 대해서, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화력 및 능력이 있는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종의 초가변 영역 (공여자 항체)으로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체의 성능을 더욱 정련시키기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 것들에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 또한 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 임의로 포함할 것이다. 추가적인 상세사항은 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)] 참조. 또한 하기의 리뷰 문헌 및 이에 인용된 참고문헌 참조: [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma ＆ Immunol. 1:105-115 (1998)]; [Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)]; [Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)].
"키메라" 항체 (면역글로불린)에는 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 중쇄 및/또는 경쇄 부분이 있고, 사슬(들)의 나머지는 또다른 종으로부터 유래되거나 또다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이며, 뿐만 아니라 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이같은 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 4,816,567; 및 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]). 본원에서 사용되는 바와 같은 인간화 항체는 키메라 항체의 부분집합이다.
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재하는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH 도메인과 VL 도메인 간의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 개관을 위해서는, [Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)] 참조.
"항원"은 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 미리 정해진 항원이다. 표적 항원은 폴리펩티드, 탄수화물, 핵산, 지질, 합텐 또는 기타 천연 발생 또는 합성 화합물일 수 있다. 바람직하게는, 표적 항원은 폴리펩티드이다.
용어 "디아바디"는 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 내의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는, 2개의 항원-결합 부위를 갖는 소형 항체 단편을 지칭한다. 동일한 사슬 상의 두 도메인 간에 쌍을 형성하도록 하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 이루어 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 강요된다. 디아바디는, 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 더욱 상세하게 기술되어 있다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 갖고/갖거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체 제조용 기술 중 임의의 것을 사용하여 제조된 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 명확하게 제외한다.
"친화력 성숙된" 항체는 이의 하나 이상의 CDR 내에 하나 이상의 변경이 있어 이러한 변경(들)이 없는 어버이 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화력이 개선된 것이다. 바람직한 친화력 성숙된 항체는 표적 항원에 대한 친화력이 나노놀 또는 심지어 피코몰일 것이다. 친화력 성숙된 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 생산된다. [Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에 VH 및 VL 도메인 셔플링(shuffling)에 의한 친화력 성숙이 기술되어 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발이 [Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994)]; [Schier et al. Gene 169:147-155 (1995)]; [Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)]; [Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)]; 및 [Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기술되어 있다.
항체 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하고, 항체 이소타입에 의해 변한다. 항체 이펙터 기능의 예로는 C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어 B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화가 포함된다.
"항체-의존적 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정한 세포독성 세포 (예를 들어, 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구, 및 대식 세포) 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)에 결합된 분비된 IgG가 이러한 세포독성 이펙터 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하여 이어서 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성 형태를 지칭한다. 항체는 세포독성 세포를 "무장"시키고, 이같은 사멸에 절대적으로 필요하다. ADCC를 매개하는 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하지만, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현이 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464면의 표 3에 요약되어 있다. 당해 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 분석법, 예컨대 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337 또는 미국 특허 번호 6,737,056 (Presta)에 기술된 것을 수행할 수 있다. 이같은 분석법에 유용한 이펙터 세포에는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포가 포함된다. 별법적으로, 또는 추가적으로, 당해 분자의 ADCC 활성을 생체 내에서, 예를 들어, [Clynes et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 이러한 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하고 ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예로는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 포함되고, PBMC와 NK 세포가 바람직하다. 이펙터 세포는 천연 공급원으로부터, 예를 들어 혈액으로부터 단리될 수 있다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체와 결합하는 것 (감마 수용체)이고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체 (이러한 수용체들의 대립유전자 변이체 및 별법적으로 스플라이싱된 형태 포함)를 포함한다. FcγRII 수용체에는 FcγRIIA ("활성화 수용체")와 FcγRIIB ("억제 수용체")가 포함되고, 이들은 주로 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 세포질 도메인 내에 면역수용체 타이로신계 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 세포질 도메인 내에 면역수용체 타이로신계 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 ([M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)]의 개관 참조). FcR은 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)]; [Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)]; 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에 개관되어 있다. 추후에 확인될 것이 포함되는 기타 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포함된다. 이 용어는 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하고 ([Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]), 면역글로불린의 항상성을 조절하는 신생아 수용체 FcRn을 또한 포함한다. WO00/42072 (Presta)에 FcR에 대한 결합이 개선 또는 감소된 항체 변이체가 기술되어 있다. 이러한 특허 공보의 내용은 거명에 의해 본원에 명확하게 포함된다. [Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)]를 또한 참조.
FcRn에 대한 결합을 측정하는 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, [Ghetie 1997], [Hinton 2004] 참조). 인간 FcRn에 높은 친화력으로 결합하는 폴리펩티드의 혈청 반감기 및 생체 내에서의 인간 FcRn에 대한 결합을, 예를 들어, 인간 FcRn를 발현하는 트랜스제닉(transgenic) 마우스 또는 형질감염된 인간 세포주에서, 또는 Fc 변이체 폴리펩티드가 투여된 영장류에서 분석할 수 있다.
"보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재하에서의 표적 세포의 용해를 지칭한다. 전통적인 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)이 동족 항원에 결합된 항체 (적합한 서브클래스의 항체)에 결합하는 것에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, 예를 들어, [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기술된 바와 같은 CDC 분석을 수행할 수 있다.
Fc 영역 아미노산 서열이 변경되고 C1q 결합 능력이 증가 또는 감소된 폴리펩티드 변이체가 미국 특허 번호 6,194,551 B1 및 WO 99/51642에 기술되어 있다. 이러한 특허 공보의 내용은 거명에 의해 본원에 명확하게 포함된다. [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]을 또한 참조.
용어 "Fc 영역-포함 폴리펩티드"는 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 면역부착소 (하기의 정의 참조)와 같은 폴리펩티드를 지칭한다. Fc 영역의 C-말단 라이신 (EU 번호매김 시스템에 따른 잔기 447)이, 예를 들어, 폴리펩티드의 정제 동안, 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 재조합에 의해 조작함으로써 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Fc 영역이 있는 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 K447이 있는 폴리펩티드, 모든 K447이 제거된 폴리펩티드, 또는 K447 잔기가 있는 폴리펩티드와 K447 잔기가 없는 폴리펩티드의 혼합물을 포함할 수 있다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 자신이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 것이다. 바람직한 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다.
본원에서 사용된 "작동제 항체"는 당해 폴리펩티드의 기능적 활성 중 적어도 하나를 모방하는 항체이다.
본원에서의 목적을 위한 "어셉터 인간 프레임워크"는 인간 면역글로불린 프레임워크로부터, 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유래된 VL 또는 VH 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크"로부터 유래된" 어셉터 인간 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 선재(先在)하는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 아미노산 변화가 선재하는 경우, 바람직하게는 5개 이하, 바람직하게는 4개 이하, 또는 3개 이하의 아미노산 변화가 선재한다. 아미노산 변화가 VH에 선재하는 경우, 바람직하게는 이러한 변화는 위치 71H, 73H 및 78H 중 3개, 2개 또는 1개에서만 선재한다; 예를 들어, 이러한 위치에서의 아미노산 잔기가 71A, 73T 및/또는 78A일 수 있다. 한 실시양태에서, VL 어셉터 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 서열이 동일하다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선별에서 가장 통상적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열은 가변 도메인 서열의 서브그룹으로부터 선별된다. 일반적으로, 서열의 서브그룹은 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 서브그룹이다. 한 실시양태에서, VL에 대해, 서브그룹은 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 서브그룹 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH에 대해, 서브그룹은 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 서브그룹 III이다.
"VH 서브그룹 III 컨센서스 프레임워크"는 문헌 [Kabat et al.]의 가변 중쇄 서브그룹 III 내의 아미노산 서열로부터 수득된 컨센서스 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, VH 서브그룹 III 컨센서스 프레임워크 아미노산 서열은 각각의 하기 서열의 적어도 일부분 또는 모두를 포함한다: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (서열 42)-H1-WVRQAPGKGLEWV (서열 43)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (서열 44)-H3-WGQGTLVTVSS (서열 45).
"VL 서브그룹 I 컨센서스 프레임워크"는 문헌 [Kabat et al.]의 가변 경쇄 카파 서브그룹 I 내의 아미노산 서열로부터 수득된 컨센서스 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, VH 서브그룹 I 컨센서스 프레임워크 아미노산 서열은 각각의 하기 서열의 적어도 일부분 또는 모두를 포함한다: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열 46)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY (서열 47)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열 48)-L3-FGQGTKVEIK (서열 49).
"장애" 또는 "질환"은 본 발명의 물질/분자 또는 방법으로의 치료가 이로울 임의의 용태이다. 여기에는 포유동물이 당해 장애에 걸리기 쉽게 하는 병리학적인 용태를 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환이 포함된다. 본원에서 치료될 장애의 비-제한적인 예로는 악성 및 양성 종양; 암종, 모세포종, 및 육종이 포함된다.
용어 "세포 증식성 장애" 및 "증식성 장애"는 어느 정도의 비정상적인 세포 증식과 관련된 장애를 지칭한다. 한 실시양태에서, 세포 증식성 장애는 암이다.
본원에서 사용된 "종양"은 모든 신생물성 세포 성장 및 증식 (악성 또는 양성 여부와 상관 없음), 및 모든 전-암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. 용어 "암", "암성", "세포 증식성 장애", "증식성 장애" 및 "종양"은 본원에서 지칭될 때 서로 배타적이지 않다.
용어 "암" 및 "암성"은 조절되지 않은 세포 성장/증식을 전형적으로 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 용태를 지칭하거나 기술한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 이같은 암의 더욱 특정한 예로는 편평세포 암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평 암종, 복막암, 간세포 암, 위장관 암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암, 간암, 전립선 암, 외음부 암, 갑상선 암, 간 암종, 위암, 흑색종, 및 다양한 유형의 두경부암이 포함된다. 혈관생성의 조절곤란은 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 다수의 장애에 이를 수 있다. 이러한 장애에는 비-신생물성 및 신생물성 용태 모두가 포함된다. 신생물성에는 상기 기술된 것들이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 비-신생물성 장애에는 원치 않는 또는 비정상적인 비대증, 관절염, 류머티스 관절염 (RA), 건선, 건선성 플라크, 사르코이드증, 죽상동맥경화증, 죽상경화판, 당뇨성 및 기타 증식성 망막병증 (미숙아 망막병증 포함), 수정체뒤 섬유증식, 신생혈관 녹내장, 연령-관련 황반 변성, 당뇨성 황반 부종, 각막 신생혈관증식, 각막 이식 신생혈관증식, 각막 이식 거부, 망막/맥락막 신생혈관증식, 각의 신생혈관증식 (피부 홍조), 안구 신생혈관 질환, 혈관 재협착, 동정맥 기형 (AVM), 수막종, 혈관종, 혈관섬유종, 갑상선 과다형성 (그레이브(Grave) 질환 포함), 각막 및 기타 조직 이식, 만성 염증, 폐 염증, 급성 폐 손상/ARDS, 패혈증, 원발성 폐 고혈압증, 악성 폐 삼출, 뇌 부종 (예를 들어, 급성 뇌졸중/폐쇄성 두부 손상/외상과 관련됨), 활막 염증, RA에서의 판누스(pannus) 형성, 골화 근육염, 비대성 골 형성, 골관절염 (OA), 불응성 복수, 다낭성 난소 질환, 자궁내막증, 체액의 제3공간 질환 (췌장염, 구획 증후군, 화상, 장 질환), 자궁 섬유증, 조산, 만성 염증 예컨대 IBD (크론(Crohn) 질환 및 궤양성 대장염), 신장 동종이식 거부, 염증성 장 질환, 신 증후군, 원치 않는 또는 비정상적인 조직 덩어리 성장 (비-암), 혈우병성 관절, 비후성 반흔, 모발 성장의 억제, 오슬러-웨버(Osler-Weber) 증후군, 화농성 육아종, 수정체뒤 섬유증식, 공피증, 트라코마, 혈관 부착, 활막염, 피부염, 자간전증, 복수, 심낭 삼출 (예컨대 심막염과 관련된 것), 및 흉막 삼출이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용된 "치료"는 치료될 개체 또는 세포의 자연적인 과정을 변경하려는 시도에서의 임상적 개입을 지칭하고, 예방을 위해 또는 임상 병리학의 과정 도중에 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과에는 질환의 발생 또는 재발을 방지하는 것, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 전이를 방지하는 것, 질환 질행 속도를 감소시키는 것, 질환 상태의 완화 또는 고식, 및 진정 또는 개선된 예후가 포함된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환 또는 장애의 발달을 지연시키는데 사용된다.
"개체"는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간이다. 포유동물에는 농장 동물 (예컨대 소), 스포츠 동물, 애완동물 (예컨대 고양이, 개, 및 말), 영장류, 마우스 및 래트가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
치료 목적의 "포유동물"은 인간, 가축 및 농장 동물, 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소 등이 포함되는, 포유동물로 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
"유효량"은 원하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하는데 필요한 투여량에서 그리고 기간 동안 이를 달성하는데 효과적인 양을 지칭한다.
본 발명의 물질/분자, 작동제 또는 길항제의 "치료적 유효량"은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 응답을 도출하는 물질/분자, 작동제 또는 길항제의 능력과 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 또한 치료적 유효량은 물질/분자, 작동제 또는 길항제의 치료적으로 이로운 효과가 임의의 독성 또는 해로운 효과를 능가하는 양이다. "예방적 유효량"은 원하는 예방적 결과를 달성하는데 필요한 투여량에서 그리고 기간 동안 이를 달성하는데 효과적인 양을 지칭한다. 필수적이지는 않지만 전형적으로, 예방 용량은 질환 전에 또는 질환의 초기 단계에 대상에서 사용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적을 것이다.
본원에서 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포의 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 예를 들어 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포사이드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 기타 인터칼레이팅제(intercalating agent), 효소 및 이의 단편 예컨대 뉴클레오용해성(nucleolytic) 효소, 항생제, 및 박테리아, 진균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소 (이의 단편 및/또는 변이체 포함) 또는 소형-분자 독소와 같은 독소, 및 하기에 개시되는 다양한 항종양 또는 항암 작용제를 포함하도록 의도된다. 기타 세포독성제가 하기에 기술된다. 종양치사제(tumoricidal agent)는 종양 세포의 파괴를 야기한다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학 화합물이다 화학요법제의 예로는 알킬화제 예컨대 티오테파 및 CYTOXAN® 시클로스포스파미드; 알킬 술포네이트 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘 예컨대 벤조도파, 카르보퀴온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸롤로멜라민이 포함되는, 에틸렌이민 및 메틸렌라멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로카나비놀 (드로나비놀, MARINOL®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 베툴린산; 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 (HYCAMTIN®), CPT-11 (이리노테칸, CAMPTOSAR®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄프토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포사이드; 크립토파이신 (특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체인 KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕타인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴; 항생제 예컨대 엔다이인 항생제 (예를 들어, 칼리키아마이신, 특히 칼리키아마이신 감마1I 및 칼리키아마이신 오메가I1 (예를 들어, [Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)] 참조); 다이네마이신 A가 포함되는 다이네마이신; 에스페라마이신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련된 색단백질 엔다이인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라바이신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 덱토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, ADRIAMYCIN® 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 켈라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물질 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘; 안드로겐 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신제 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지퀴온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 마이탄시노이드 예컨대 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 다당류 복합체 (JHS Natural Products, Eugene, OR); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지퀴온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신 (ELDISINE®, FILDESIN®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, TAXOL® 파클리탁셀 (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE™ 크레모포르-프리(Cremophor-free), 파클리탁셀의 알부민-조작 나노입자 제형 (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), 및 TAXOTERE® 독세탁셀 (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로란부실; 젬시타빈 (GEMZAR®); 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (VELBAN®); 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴 (ONVOVIN®); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈 (NAVELBINE®); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드 예컨대 레티노산; 카페시타빈 (XELODA®); 임의의 상기 물질들의 제약상 허용가능한 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 2가지 이상의 상기 물질들의 배합물, 예컨대 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 요법에 대한 약자인 CHOP, 및 5-FU 및 류코보빈과 배합된 옥살리플라틴 (ELOXATIN™)으로의 치료 요법에 대한 약자인 FOLFOX가 포함된다.
이러한 정의에는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절하거나, 저하시키거나, 차단하거나 또는 억제하는 작용을 하고, 종종 전신 또는 온몸 치료의 형태인 항호르몬제가 또한 포함된다. 이들은 자체가 호르몬일 수 있다. 예로는 타목시펜 (NOLVADEX® 타목시펜 포함), EVISTA® 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 FARESTON® 토레미펜이 예를 들어 포함되는 항-에스트로겐 및 선택적인 에스트로겐 수용체 조정인자 (SERM); 항-프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향-조절제 (ERD); 난소를 저해하거나 정지시키는 기능을 하는 작용제, 예를 들어, 황체형성 호르몬-방출 호르몬 (LHRH) 작동제 예컨대 LUPRON® 및 ELIGARD® 류프롤리드 아세테이트, 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트리프테렐린; 기타 항-안드로겐제 예컨대 플루타미드, 닐루타미드 및 바이칼루타미드; 및 부신에서의 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, MEGASE® 메게스트롤 아세테이트, AROMASIN® 엑세메스탄, 포르메스타니에, 파드로졸, RIVISOR® 보로졸, FEMARA® 레트로졸, 및 ARIMIDEX® 아나스트로졸이 포함된다. 또한, 화학요법제의 이같은 정의에는 비포스포네이트 예컨대 클로드로네이트 (예를 들어, BONEFOS® 또는 OSTAC®), DIDROCAL® 에티드로네이트, NE-58095, ZOMETA® 졸레드론산/졸레드로네이트, FOSAMAX® 알렌드로네이트, AREDIA® 파미드로네이트, SKELID® 틸루드로네이트, 또는 ACTONEL® 리세드로네이트; 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 사이토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 비정상적인 세포 증식에 연루된 신호전달 경로에서의 유전자, 예를 들어, PKC-알파, Raf, H-Ras, 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R)의 발현을 억제하는 것들; 백신 예컨대 THERATOPE® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어, ALLOVECTIN® 백신, LEUVECTIN® 백신, 및 VAXID® 백신; LURTOTECAN® 토포이소머라제 1 억제제; ABARELIX® rmRH; 라파티닙 디토실레이트 (GW572016으로 또한 공지된 ErbB-2 및 EGFR 이중 타이로신 키나제 소형-분자 억제제); 및 임의의 상기 물질의 제약상 허용가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
본원에 사용된 "성장 억제제"는 시험관내 또는 생체내에서 세포 (예컨대 DLL4를 발현하는 세포)의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 따라서, 성장 억제제는 S 단계의 세포 (예컨대 DLL4를 발현하는 세포)의 백분율을 유의하게 감소시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예로는 (S 단계 이외의 장소에서) 세포 주기 진행을 차단하는 작용제, 예컨대 G1 정지 및 M-단계 정지를 유도하는 작용제가 포함된다. 전통적인 M-단계 차단제로는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산, 및 토포이소머라제 II 억제제 예컨대 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신이 포함된다. G1을 정지시키는 작용제, 예를 들어, DNA 알킬화제 예컨대 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로르에타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C 또한 S-단계 정지로 넘쳐 흐른다. 추가적인 정보는 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs", Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995)], 특히 제13면에서 발견할 수 있다. 탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀)은 모두 주목에서 유래된 항암 약물이다. 유럽형 주목에서 유래된 도세탁셀 (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer)은 파클리탁셀 (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb)의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터의 미세관의 어셈블리를 촉진하고, 탈중합을 방지함으로써 미세관을 안정화시켜, 결과적으로 세포에서의 유사분열을 억제한다.
"독소루비신"은 안트라사이클린 항생제이다. 독소루비신의 완전한 화학명은 (8S-시스)-10-[(3-아미노-2,3,6-트리데옥시-α-L-릭소-헥사피라노실)옥시]-7,8,9,10-테트라히드로-6,8,11-트리히드록시-8-(히드록시아세틸)-1-메톡시-5,12-나프타센디온이다.
용어 "항-신생물성 조성물"은 1가지 이상의 활성 치료제, 예를 들어, "항암제"를 포함하는 암을 치료하는데 유용한 조성물을 지칭한다. 치료제 (항암제, 본원에서 "항-신생물성 작용제"로 또한 명명됨)의 예로는, 예를 들어, 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제, 방사선 요법에 사용되는 작용제, 항-혈관생성 작용제, 세포자멸사성 작용제, 항-튜불린 작용제, 독소 및 암을 치료하기 위한 기타 작용제, 예를 들어, 항-VEGF 중화 항체, VEGF 길항제, 항-HER-2, 항-CD20, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 길항제 (예를 들어, 타이로신 키나제 억제제), HER1/EGFR 억제제, 에를로티닙, COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕십), 인터페론, 사이토카인, ErbB2, ErbB3, ErbB4 또는 VEGF 수용체(들) 중 하나 이상에 결합하는 길항제 (예를 들어, 중화 항체), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF) 및/또는 줄기 세포 인자 (SCF)에 대한 수용체 타이로신 키나제에 대한 억제제 (예를 들어, 이매티닙 메실레이트 (Gleevec®, Novartis)), TRAIL/Apo2, 및 기타 생체활성(bioactive) 및 유기 화학 작용제 등이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
본 출원에서 사용된 용어 "전구약물"은 어버이 약물에 비해 종양 세포에 덜 세포독성이고, 효소적으로 활성화되거나 더욱 활성인 어버이 형태로 전환될 수 있는, 제약상 활성인 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 지칭한다. 예를 들어, [Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986)] 및 [Stella et al. "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al. (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)] 참조. 본 발명의 전구약물로는 더욱 활성인 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있는, 포스페이트-함유 전구약물, 티오포스페이트-함유 전구약물, 술페이트-함유 전구약물, 펩티드-함유 전구약물, D-아미노산-변형 전구약물, 글리코실화 전구약물, 베타-락탐-함유 전구약물, 임의 치환된 페녹시아세트아미드-함유 전구약물 또는 임의 치환된 페닐아세트아미드-함유 전구약물, 5-플루오로사이토신 및 기타 5-플루오로유리딘 전구약물이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에서 사용하기 위한 전구약물 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예로는 상기 기술된 화학요법제들이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
"항-혈관생성 작용제" 또는 "혈관생성 억제제"는 혈관생성, 혈관형성, 또는 원치 않는 혈관 투과성을 직접적으로 또는 간접적으로 억제하는, 분자량이 작은 물질, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 억제성 RNA (RNAi 또는 siRNA) 포함), 폴리펩티드, 단리된 단백질, 재조합 단백질, 항체, 또는 이의 접합체 또는 융합 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 항-혈관생성 작용제는 상기 정의된 바와 같은 혈관생성 작용제에 대한 항체 또는 기타 길항제, 예를 들어, VEGF에 대한 항체, VEGF 수용체에 대한 항체, VEGF 수용체 신호전달을 차단하는 가용성 VEGF 수용체 단편 또는 소형 분자 (예를 들어, PTK787/ZK2284, SU6668, SUTENT®/SU11248 (수니티닙 말레이트), AMG706, 또는 국제 특허 출원 WO 2004/113304에 예를 들어 기술된 것들)이다. 항-혈관생성 작용제에는 천연 혈관생성 억제제, 예를 들어, 안지오스타틴, 엔도스타틴 등이 또한 포함된다. 예를 들어, [Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991)]; [Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003)] (예를 들어, 악성 흑색종에서의 항-혈관생성성 치료법이 열거되어 있는 표 3); [Ferrara ＆ Alitalo, Nature Medicine 5(12):1359-1364 (1999)]; [Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003)] (예를 들어, 항-혈관생성성 인자가 열거되어 있는 표 2); 및 [Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)] (예를 들어, 임상 시험에서 사용되는 항-혈관생성성 작용제가 열거되어 있는 표 1) 참조.
본 발명의 조성물 및 이의 제조 방법
본 발명은 항-DLL4 항체를 포함하는 조성물 (제약 조성물 포함); 및 항-DLL4 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 사용된 조성물은 DLL4에 결합하는 하나 이상의 항체, 및/또는 DLL4에 결합하는 하나 이상의 상체를 코딩하는 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 조성물은 적절한 담체, 예컨대 제약상 허용가능한 부형제 (완충제 포함)를 추가로 포함할 수 있고, 이는 당업계에 주지되어 있다.
본 발명은 단리된 항체 및 폴리뉴클레오티드 실시양태를 또한 포함한다. 본 발명은 실질적으로 순수한 항체 및 폴리뉴클레오티드 실시양태를 또한 포함한다.
본 발명의 항-DLL4 항체는 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 본 발명의 범주에는 본원에서 제공된 항-DLL4 항체의 Fab, Fab', Fab'-SH 및 F(ab')2 단편이 또한 포함된다. 이러한 항체 단편들은 전통적인 수단, 예컨대 효소에 의한 소화에 의해 생성될 수 있거나, 또는 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 이같은 항체 단편은 키메라 항체 단편 또는 인간화 항체 단편일 수 있다. 이러한 단편들은 하기 기재된 진단 및 치료 목적에 유용하다.
모노클로날 항체는 실질적으로 균질한 항체들의 집단으로부터 수득되고, 즉 집단을 이루는 개별적인 항체들은 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 수식어구 "모노클로날"은 개별적인 항체들의 혼합물이 아닌 것으로서의 항체의 특징을 가리킨다.
본 발명의 항-DLL4 모노클로날 항체를 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기술된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (미국 특허 번호 4,816,567)으로 제조할 수 있다.
하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 기타 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터를 면역화시켜, 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유발시킨다. 일반적으로 DLL4에 대한 항체가 DLL4 및 애쥬번트(adjuvant)의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 상승된다. DLL4는 당업계에 주지된 방법을 사용하여 제조될 수 있고, 이러한 방법 중 일부가 본원에서 추가로 기술된다. 예를 들어, DLL4의 재조합 생산이 하기에 기술된다. 한 실시양태에서, 면역글로불린 중쇄의 Fc 부분에 융합된 DLL4의 세포외 도메인 (ECD)을 함유하는 DLL4의 유도체로 동물을 면역화시킨다. 바람직한 실시양태에서, DLL4-IgG1 융합 단백질로 동물을 면역화시킨다. 통상적으로 모노포스포릴 지질 A (MPL)/트레할로스 디크리노미콜레이트 (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT)와 DLL4의 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 동물을 면역화시키고, 용액을 다중 부위에서 피내 주사한다. 2주 후, 동물을 부스팅(boosting)시킨다. 7일 내지 14일 후, 동물에서 채혈하여, 혈청을 항-DLL4 역가에 대해 분석한다. 역가가 정체기(plateau)에 도달할 때까지 동물을 부스팅시킨다.
별법적으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다. 그 후, 적절한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 림프구를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포가 형성된다 ([Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]).
이렇게 제조된 하이브리도마 세포를 융합되지 않은 어버이 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 바람직하게는 함유하는 적절한 배양 배지에 파종하여 성장시킨다. 예를 들어, 어버이 골수종 세포에 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 없는 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이며 (HAT 배지), 이러한 물질들은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합되고, 선별된 항체-생산 세포에 의한 안정적인 높은 수준의 항체 생산을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 감수성이 있는 것이다. 특히 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 <Salk Institute Cell Distribution Center (San Diego, California USA)>로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것, 및 <American Type Culture Collection (Rockville, Maryland USA)>으로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주 또한 인간 모노클로날 항체의 생산을 위해 기술되어 있다 ([Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 DLL4에 대해 지시된 모노클로날 항체의 생산에 대해 분석한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침전에 의해 또는 시험관내 결합 분석법, 예컨대 방사성면역분석법 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA)에 의해 측정한다.
모노클로날 항체의 결합 친화력은, 예를 들어, [Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]의 스캐차드(Scatchard) 분석에 의해 결정할 수 있다.
원하는 특이성, 친화성 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 클론을 한계 희석 절차에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 ([Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]). 이러한 목적에 적절한 배양 배지는, 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포를 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장시킬 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적절하게 분리된다.
본 발명의 항-DLL4 항체는 원하는 활성 또는 활성들이 있는 합성 항체 클론을 스크리닝하기 위해 조합형 라이브러리를 사용함으로써 제조될 수 있다. 원칙적으로, 파지 코트(coat) 단백질에 융합된 항체 가변 영역의 다양한 단편들 (Fv)을 디스플레이하는 파지를 함유하는 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 합성 항체 클론이 선별된다. 원하는 항원에 대한 친화성 크로마토그래피에 의해 이같은 파지 라이브러리가 패닝(panning)된다. 원하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현하는 클론이 항원에 흡착되고, 따라서 라이브러리 내의 비-결합 클론으로부터 분리된다. 그후, 결합 클론이 항원으로부터 용출되고, 항원 흡착/용출의 추가적인 사이클에 의해 추가로 강화될 수 있다. 당해 파지 클론을 선별하기 위한 적절한 항원 스크리닝 절차를 디자인하고, 이어서 당해 파지 클론으로부터의 Fv 서열 및 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에 기술된 적절한 불변 영역 (Fc) 서열을 이용하여 전장 항-DLL4 항체 클론을 구축함으로써 임의의 본 발명의 항-DLL4 항체를 수득할 수 있다.
항체의 항원-결합 도메인은 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH)로부터 각각 하나씩의, 아미노산 약 110개의 2개의 가변 (V) 영역으로부터 형성되고, 양쪽 모두 3개의 초가변 루프 또는 상보성-결정 영역 (CDR)을 나타낸다. [Winter et al., Ann. Rev. Immunol, 12: 433-455 (1994)]에 기술된 바와 같이, VH 및 VL가 짧은 가요성 펩티드를 통해 공유결합으로 연결된 단일쇄 Fv (scFv) 단편으로서, 또는 VH 및 VL가 불변 도메인에 각각 융합되어 비-공유결합으로 상호작용하는 Fab 단편으로서, 가변 도메인이 파지 상에 기능적으로 디스플레이될 수 있다. 본원에서 사용된 scFv 코딩 파지 클론 및 Fab 코딩 파지 클론은 총괄적으로 "Fv 파지 클론" 또는 "Fv 클론"으로 지칭된다.
VH 및 VL 유전자의 레퍼토리가 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 별도로 클로닝되어 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합될 수 있고, 그 후, [Winter et al., Ann. Rev. Immunol, 12: 433-455 (1994)]에 기술된 바와 같이 이 라이브러리를 항원-결합 클론에 대해 검색할 수 있다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 고-친화력 항체를 제공한다. 별법적으로, [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기술된 바와 같이 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자가 항원 및 또한 자가 항원에 대한 인간 항체의 단일 공급원을 제공하도록 나이브(naive) 레퍼토리가 클로닝될 수 있다. 마지막으로, [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기술된 바와 같이, 줄기 세포로부터의 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 클로닝하고, 고도로 가변성인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내 재배열이 달성되도록 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 나이브 라이브러리가 또한 합성적으로 제조될 수 있다.
사상(絲狀) 파지가 마이너(minor) 코트 단백질 pIII에 대한 융합에 의해 항체 단편을 디스플레이하는데 사용된다. 항체 단편은, 예를 들어 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에 기술된 바와 같이, 가요성 폴리펩티드 스페이서에 의해 동일한 폴리펩티드 사슬 상에서 VH 및 VL 도메인이 연결된 단일쇄 Fv 단편으로서, 또는, 예를 들어 [Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)]에 기술된 바와 같이, 1개의 사슬은 pIII에 융합되고 다른 1개는 박테리아 숙주 세포 원형질막 주위공간 내로 분비되어, 여기서 일부 야생형 코트 단백질을 치환함으로써 Fab-코트 단백질 구조의 어셈블리가 파지 표면 상에 디스플레이되게 되는 Fab 단편들로서 디스플레이될 수 있다.
일반적으로, 항체 유전자 단편을 코딩하는 핵산은 인간 또는 동물로부터 수확된 면역 세포로부터 수득된다. 항-DLL4 클론에 대해 편향된 라이브러리를 원하는 경우, 대상을 DLL4로 면역화시켜 항체 응답을 생성시키고, 지라 세포 및/또는 순환 B 세포 또는 기타 말초혈 림프구 (PBL)를 라이브러리 구축을 위해 회수한다. 바람직한 실시양태에서, DLL4 면역화가 DLL4에 대한 인간 항체를 생산하는 B 세포를 일으키도록 기능성 인간 면역글로불린 유전자 어레이를 지니는 (그리고 기능성 내인성 항체 생산 시스템이 없는) 트랜스제닉 마우스에서 항-DLL4 항체 응답을 생성시킴으로써 항-DLL4 클론에 대해 편향된 인간 항체 유전자 단편 라이브러리가 수득된다. 인간 항체-생산 트랜스제닉 마우스의 생성은 하기에서 기술된다.
적절한 스크리닝 절차를 사용하여 막에 결합된 DLL4-특이적 항체를 발현하는 B 세포를 단리함으로써, 예를 들어, DLL4 친화성 크로마토그래피로의 세포 분리 또는 플루오로크롬-표지 DLL4에 대한 세포의 흡착에 이은 유동-활성화 세포 분류 (FACS)에 의해, 항-DLL4 반응성 세포 집단에 대한 추가적인 강화가 수득될 수 있다.
별법적으로, 면역화되지 않은 도너(donor)로부터의 지라 세포 및/또는 B 세포 또는 기타 PBL을 사용하는 것은 가능한 항체 레퍼토리의 더욱 양호한 제시를 제공하고, DLL4가 항원성이 아닌 임의의 동물 (인간 또는 비-인간) 종을 사용하는 항체 라이브러리의 구축을 또한 허용한다. 시험관내 항체 유전자 구축이 혼입된 라이브러리에 대해, 재배열되지 않은 항체 유전자 절편을 코딩하는 핵산을 제공하기 위해 줄기 세포가 대상으로부터 수확된다. 당해 면역 세포는 다양한 동물 종, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 토끼목, 이리, 개, 고양이, 돼지, 소, 말, 및 조류 종 등으로부터 수득될 수 있다.
항체 가변 유전자 절편 (VH 및 VL 절편 포함)을 코딩하는 핵산이 당해 세포로부터 회수되어, 증폭된다. 재배열된 VH 및 VL 유전자 라이브러리의 경우, 림프구로부터의 게놈 DNA 또는 mRNA의 단리에 이어서 [Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989)]에 기술된 바와 같은 재배열된 VH 및 VL 유전자의 5' 및 3' 말단을 매칭(matching)시키는 프라이머로의 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행함으로써 원하는 DNA가 수득될 수 있고, 이에 의해 발현을 위한 다양한 V 유전자 레퍼토리가 제조된다. [Orlandi et al. (1989)] 및 [Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989)]에 기술된 바와 같이, 성숙형 V-도메인을 코딩하는 엑손(exon)의 5' 말단에서의 후방 프라이머 및 J-절편을 기초로 하는 전방 프라이머로, V 유전자가 cDNA 및 게놈 DNA로부터 증폭될 수 있다. 그러나, cDNA로부터의 증폭을 위해, 후방 프라이머가 [Jones et al., Biotechnol., 9: 88-89 (1991)]에 기술된 바와 같이 리더(leader) 엑손을 기초로 할 수 있고, 전방 프라이머가 [Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989)]에 기술된 바와 같이 불변 영역을 기초로 할 수 있다. 상보성을 최대화하기 위해, [Orlandi et al. (1989)] 또는 [Sastry et al. (1989)]에 기술된 바와 같이 축퇴성(degeneracy)이 프라이머에 혼입될 수 있다. 바람직하게는, 예를 들어 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]의 방법에 기술된 바와 같이, 또는 [Orum et al., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993)]의 방법에 기술된 바와 같이, 면역 세포 핵산 샘플에 존재하는 모든 이용가능한 VH 및 VL 배열을 증폭시키기 위해 각각의 V-유전자 패밀리에 표적화된 PCR 프라이머를 사용함으로써 라이브러리 다양성이 최대화된다. 증폭된 DNA의 발현 벡터 내로의 클로닝을 위해, [Orlandi et al. (1989)]에 기술된 바와 같이 한쪽 말단에서 태그로서 PCR 프라이머 내에, 또는 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)에 기술된 바와 같이 태그가 부착된 프라이머로의 추가적인 PCR 증폭에 의해, 희귀한 제한 부위가 도입될 수 있다.
합성적으로 재배열된 V 유전자의 레퍼토리가 시험관내에서 V 유전자 절편으로부터 유래될 수 있다. 대부분의 인간 VH-유전자 절편이 클로닝 및 서열분석되어 있고 ([Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)]에 보고됨), 지도가 작성되어 있다 ([Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993)]에 보고되어 있음); 이러한 클로닝된 절편들 (H1 및 H2 루프의 모든 주요 입체형태 포함)은 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기술된 바와 같이 다양한 서열 및 길이의 H3 루프를 코딩하는 PCR 프라이머로 다양한 VH 유전자 레퍼토리를 생성시키는데 사용될 수 있다. [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992)]에 기술된 바와 같이 모든 서열 다양성이 단일 길이의 긴 H3 루프에 초점이 맞춰지면서 VH 레퍼토리가 또한 제조될 수 있다. 인간 Vκ 및 Vλ 절편이 클로닝 및 서열분석되어 있고 ([Williams and Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)]에 보고됨), 합성 경쇄 레퍼토리를 제조하는데 사용될 수 있다. 광범위한 VH 및 VL 폴드(fold), 및 L3 및 H3 길이를 기초로 하는 합성 V 유전자 레퍼토리는 상당한 구조적 다양성의 항체를 코딩할 것이다. V-유전자 코딩 DNA의 증폭에 이어서, 생식계열 V-유전자 절편이 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]의 방법에 따라 시험관내에서 재배열될 수 있다.
여러가지 방식으로 VH 및 VL 유전자 레퍼토리를 함께 조합시킴으로써 항체 단편의 레퍼토리가 구축될 수 있다. 각각의 레퍼토리는 상이한 벡터에서 생성될 수 있고, 벡터는 [Hogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993)]에 예를 들어 기술된 바와 같이 시험관 내에서, 또는 조합형 감염, 예를 들어, [Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993)]에 기술된 loxP 시스템에 의해 생체 내에서 재조합될 수 있다. 생체내 재조합 접근법은 대장균 형질전환 효율에 의해 부과되는 라이브러리 크기에 대한 한계를 극복하기 위해 Fab 단편의 2-사슬 성질을 활용한다. 나이브 VH 및 VL 레퍼토리가 하나는 파지미드 상에, 나머지 하나는 파지 벡터 상에 별도로 클로닝된다. 그 후, 2개의 라이브러리가 각각의 세포가 상이한 조합을 함유하도록 파지미드-함유 박테리아의 파지 감염에 의해 조합되고, 라이브러리 크기는 존재하는 세포의 수 (약 1012개의 클론)에 의해서만 제한된다. VH 및 VL 유전자가 단일 레플리콘(replicon) 상으로 재조합되고 파지 비리온(virion) 내로 공동-패키지화되도록 양쪽 벡터 모두 생체내 재조합 신호를 함유한다. 이러한 거대한 라이브러리는 다수의 다양한 양호한 친화력 (약 10-8 M의 Kd -1)의 항체를 제공한다.
별법적으로, 레퍼토리들이, 예를 들어 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 기술된 바와 같이, 동일한 벡터 내로 순차적으로 클로닝될 수 있거나, 또는, 예를 들어 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에 기술된 바와 같이, PCR에 의해 함께 어셈블리된 후 클로닝될 수 있다. VH 및 VL DNA를 가요성 펩티드 스페이서를 코딩하는 DNA로 연결시켜 단일쇄 Fv (scFv) 레퍼토리를 형성시키는데 PCR 어셈블리가 또한 사용될 수 있다. 또다른 기술에서, [Embleton et al., Nucl Acids Res., 20: 3831-3837 (1992)]에 기술된 바와 같이, VH 및 VL 유전자를 림프구 내에서 PCR에 의해 조합시킨 후, 연결된 유전자들의 레퍼토리를 클로닝하는데 "세포내 PCR 어셈블리"가 사용된다.
나이브 라이브러리 (천연 또는 합성)에 의해 생산된 항체는 친화력이 중등도일 수 있지만 (약 106 내지 107 M-1의 Kd -1), [Winter et al. (1994), 상기 문헌]에 기술된 바와 같이 제2 라이브러리의 구축 및 이로부터의 재선별에 의해 시험관 내에서 친화력 성숙이 또한 모방될 수 있다. 예를 들어, [Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)]의 방법 또는 [Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992)]의 방법에서 에러 경향이 있는 중합효소 ([Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)]에 보고됨)를 사용함으로써 시험관 내에서 무작위로 돌연변이가 도입될 수 있다. 추가적으로, 예를 들어, 당해 CDR에 스패닝된 무작위 서열을 보유하는 프라이머로의 PCR을 사용하여, 선별된 개별적인 Fv 클론에서 1개 이상의 CDR을 무작위로 돌연변이시키고, 친화력이 더 높은 클론을 스크리닝함으로써 친화력 성숙이 수행될 수 있다. WO 9607754 (1996년 3월 14일 공개)에 면역글로불린 경쇄의 상보성 결정 영역에서 돌연변이유발을 유도하여 경쇄 유전자의 라이브러리를 생성시키는 방법이 기술되어 있다. 또다른 효과적인 접근법은 [Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992)]에 기술된 바와 같이, 파지 디스플레이에 의해 선별된 VH 또는 VL 도메인을 면역화되지 않은 도너로부터 수득된 천연 발생 V 도메인 변이체의 레퍼토리와 재조합시키고, 여러 라운드의 사슬 리셔플링(reshuffling)에서 더 높은 친화력에 대해 스크리닝하는 것이다. 이러한 기술은 친화력이 10-9 M 범위인 항체 및 항체 단편이 생산되도록 한다.
DLL4 핵산 및 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다. DLL4를 코딩하는 핵산 서열을 DLL4의 원하는 영역의 아미노산 서열을 사용하여 디자인할 수 있다. 별법적으로, GenBank 접속 번호 NM_019074의 cDNA 서열 (또는 이의 단편). DLL4는 막횡단 단백질이다. 세포외 영역은 8개의　EGF-유사 반복물, 뿐만 아니라 모든 노치 리간드들 간에 보존되고 수용체 결합에 필요한 DSL 도메인을 함유한다. 예측된 단백질은 또한 막횡단 영역, 및 어떠한 촉매성 모티프도 없는 세포질 꼬리를 함유한다. 인간 DLL4 단백질은 아미노산 685개의 단백질이고, 하기의 영역을 함유한다: 신호 펩티드 (아미노산 1-25); MNNL (아미노산 26-92); DSL (아미노산 155-217); EGF-유사 (아미노산 221-251); EGF-유사 (아미노산 252-282); EGF-유사 (아미노산 284-322); EGF-유사 (아미노산 324-360); EGF-유사 (아미노산 366-400); EGF-유사 (아미노산 402-438); EGF-유사 (아미노산 440-476); EGF-유사 (아미노산 480-518); 막횡단 (아미노산 529-551); 세포질 도메인 (아미노산 552-685). 인간 DLL4의 접속 번호는 NM_019074이고, 마우스 DLL4의 접속 번호는 NM_019454이다.
DLL4를 코딩하는 DNA는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법에는 [Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28: 716-734 (1989)]에 기술된 방법들 중 임의의 것, 예컨대 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미디트 및 H-포스포네이트 방법에 의한 화학적 합성이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 발현 숙주 세포가 선호하는 코돈이 DLL4 코딩 DNA의 디자인에 사용된다. 별법적으로, DLL4를 코딩하는 DNA는 게놈 또는 cDNA 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
DLL4를 코딩하는 DNA 분자의 구축 후, DNA 분자가 발현 벡터, 예컨대 플라스미드 내의 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결되고, 이때 제어 서열은 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 의해 인식된다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 숙주 세포와 혼화성인 종으로부터 유래된 복제 및 제어 서열을 함유한다. 통상적으로 벡터는 복제 부위, 뿐만 아니라 형질전환된 세포에서 표현형 선별을 제공할 수 있는 단백질을 코딩하는 서열을 지닌다. 원핵생물 및 진핵생물 숙주 세포에서의 발현을 위한 적절한 세포는 당업계에 주지되어 있고, 일부가 본원에서 추가로 기술된다. 진핵생물, 예컨대 효모, 또는 다세포 생물, 예컨대 포유동물로부터 유도된 세포가 사용될 수 있다.
임의로, DLL4를 코딩하는 DNA가 분비 리더 서열에 작동가능하게 연결되어, 숙주 세포에 의한 발현 생성물이 배양 배지 내로 분비된다. 분비 리더 서열의 예로는 stII, 에코틴, lamB, 헤르페스 GD, lpp, 알칼리성 포스파타제, 인버타제, 및 알파 인자가 포함된다. 단백질 A의 아미노산 36개의 리더 서열이 본원에서 사용하기에 또한 적절하다 ([Abrahmsen et al., EMBO J., 4: 3901 (1985)]).
숙주 세포가 상기 기술된 본 발명의 발현 또는 클로닝 벡터로 형질감염, 바람직하게는 형질전환되고, 프로모터의 유도, 형질전환체의 선별 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자의 증폭에 적합하도록 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다.
형질감염은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되는지 여부와 상관 없이 숙주 세포 내로 발현 벡터가 들어가는 것을 지칭한다. 수많은 형질감염 방법, 예를 들어, CaPO4 침전 및 전기천공이 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 벡터의 작동의 임의의 지시가 숙주 세포 내에서 일어나는 경우 성공적인 형질감염이 일반적으로 인지된다. 형질감염 방법은 당업계에 주지되어 있고, 일부가 본원에서 추가로 기술된다.
형질전환은 DNA가 염색체외 요소로서 또는 염색체 구성요소에 의해 복제가능하도록 DNA를 생물 내로 도입하는 것을 의미한다. 사용된 숙주 세포에 따라, 이같은 세포에 적합한 표준 기술을 사용하여 형질전환이 수행된다. 형질전환 방법은 당업계에 주지되어 있고, 일부가 본원에서 추가로 기술된다.
DLL4를 생산하는데 사용된 원핵 숙주 세포는 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 일반적으로 기술된 바와 같이 배양될 수 있다.
DLL4를 생산하는데 사용된 포유류 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있고, 이러한 배지는 당업계에 주지되어 있고, 일부는 본원에서 기술된다.
본 명세서에서 언급된 숙주 세포는 시험관내 배양물 내의 세포, 뿐만 아니라 숙주 동물 내에 있는 세포를 포함한다.
DLL4의 정제는 당업계에 인지된 방법을 사용하여 달성될 수 있고, 이의 일부는 본원에서 기술된다.
정제된 DLL4는 파지 디스플레이 클론의 친화성 크로마토그래피에 의한 분리에서 사용하기 위해 아가로스 비드, 아크릴아미드 비드, 유리 비드, 셀룰로스, 다양한 아크릴계 공중합체, 히드록실 메타크릴레이트 젤, 폴리아크릴계 및 폴리메타크릴계 공중합체, 나일론, 중성 및 이온성 담체 등과 같은 적절한 매트릭스에 부착될 수 있다. DLL4 단백질을 매트릭스에 부착시키는 것은 [Methods in Enzymology, vol. 44 (1976)]에 기술된 방법에 의해 달성될 수 있다. 단백질 리간드를 다당류 매트릭스, 예를 들어 아가로스, 덱스트란 또는 셀룰로스에 부착시키기 위한 통상적으로 사용되는 기술은 담체를 할로겐화 시아노겐으로 활성화시키고 이어서 펩티드 리간드의 1차 지방족 또는 방향족 아민을 활성화된 매트릭스에 커플링시키는 것을 수반한다.
별법적으로, DLL4를 흡착 플레이트의 웰을 코팅하는데 사용할 수 있거나, 흡착 플레이트에 고정된 숙주 세포 상에서 발현시킬 수 있거나 또는 세포 분류에서 사용할 수 있거나, 또는 스트렙타비딘-코팅 비드로의 포획을 위해 비오틴에 접합시킬 수 있거나, 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 패닝하기 위한 당업계에 공지된 임의의 기타 방법에서 사용할 수 있다.
파지 입자의 적어도 일부와 흡착제의 결합에 적절한 조건 하에 파지 라이브러리 샘플을 고정된 DLL4와 접촉시킨다. 일반적으로, pH, 이온 강도, 온도 등을 포함하는 조건은 생리학적 조건을 모방하도록 선별된다. 고체 상에 결합된 파지를 세정한 후, [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 예를 들어 기술된 바와 같이 산에 의해, 또는 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에 예를 들어 기술된 바와 같이 알칼리에 의해, 또는 DLL4 항원 경쟁, 예를 들어 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]의 항원 경쟁 방법과 유사한 절차의 경쟁에 의해 용출시킨다. 단일 라운드의 선별로 파지가 20-1,000배 강화될 수 있다. 또한, 강화된 파지가 박테리아 배양에서 성장되어, 추가적인 선별 라운드에 적용될 수 있다.
선별 효율은 단일 파지 상의 다중 항체 단편들이 동시에 항원과 맞물릴 수 있는지 여부, 및 세정 동안의 해리 동역학이 포함되는 다수의 인자에 좌우된다. 신속한 해리 동역학 (및 약한 결합 친화력)의 항체는 단시간 세정, 다가 파지 디스플레이 및 고체 상 내의 항원의 높은 코팅 밀도를 사용함으로써 유지될 수 있다. 높은 밀도는 다가 상호작용을 통해 파지를 안정화시킬 뿐만 아니라, 해리된 파지의 재결합을 장려한다. 느린 해리 동역학 (및 양호한 결합 친화력)의 항체의 선별은 [Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990)] 및 WO 92/09690에 기술된 바와 같은 1가 파지 디스플레이 및 장시간 세정, 및 [Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992)]에 기술된 바와 같은 항원의 낮은 코팅 밀도를 사용함으로써 촉진될 수 있다.
DLL4에 대한 친화력이 상이한 파지 항체들을, 친화력이 약간 상이하더라도, 선별하는 것이 가능한다. 그러나, 선별된 항체의 무작위 돌연변이 (예를 들어, 상기 기술된 친화력 성숙 기술들 중 일부에서 수행되는 바와 같은 돌연변이)는 다수의 돌연변이체를 일으키기 쉽고, 이때 대부분은 항원에 결합하고 몇몇은 친화력이 더 높다. DLL4를 제한하여, 드문 고친화력 파지를 경쟁시켜 선별할 수 있다. 친화력이 더 높은 모든 돌연변이체를 유지시키기 위해, 파지가 과량의, 그러나 DLL4에 대한 표적 몰 친화력 상수보다 낮은 몰 농도의 비오틴화 DLL4와 함께 인큐베이션될 수 있다. 그후, 고친화력-결합 파지가 스트렙타비딘이 코팅된 상자성 비드에 의해 포획될 수 있다. 이같은 "평형 포획"은 친화력이 더 낮은 과량의 파지로부터 친화력이 2배 정도 더 높은 돌연변이체 클론의 단리를 허용하는 감도로 항체가 이들의 결합 친화력에 따라 선별되도록 한다. 고체 상에 결합된 파지를 세정하는데 사용된 조건이 해리 동역학을 기초로 식별하도록 또한 조작될 수 있다.
항-DLL4 클론이 활성 선별될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 노치 수용체 (예컨대 노치1, 노치2, 노치3 및/또는 노치4)와 DLL4 간의 결합을 차단하지만, 노치 수용체와 제2 단백질 간의 결합은 차단하지 않는 항-DLL4 항체를 제공한다. 이같은 항-DLL4 항체에 상응하는 Fv 클론은 (1) 상기 기술된 바와 같이 파지 라이브러리로부터 항-DLL4 클론을 단리하고, 임의로, 단리된 파지 클론 집단을 적절한 박테리아 숙주에서 성장시킴으로써 집단을 증폭시키는 단계; (2) 차단 및 비-차단 활성을 각각 원하는 DLL4 및 제2 단백질을 선별하는 단계; (3) 항-DLL4 파지 클론을 고정된 DLL4에 흡착시키는 단계; (4) 과량의 제2 단백질을 사용하여, 제2 단백질의 결합 결정인자와 중첩되거나 공유되는 DLL4-결합 결정인자를 인식하는 임의의 원치 않는 클론을 용출시키는 단계; 및 (5) 단계 (4) 후에 계속 흡착되어 있는 클론을 용출시키는 단계에 의해 선별될 수 있다. 임의로, 본원에 기술된 선별 절차를 1회 이상 반복함으로써 원하는 차단/비-차단 성질이 있는 클론이 추가로 강화될 수 있다.
본 발명의 하이브리도마-유래 모노클로날 항체 또는 파지 디스플레이 Fv 클론을 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 쉽게 단리되고 서열분석된다 (예를 들어, 하이브리도마 또는 파지 DNA 주형으로부터 당해 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 특이적으로 증폭시키도록 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용함으로써). 일단 단리되면, DNA를 발현 백터 내로 넣을 수 있고, 그 후 이를 형질감염되지 않으면 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 대장균 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서의 원하는 모노클로날 항체의 생산을 수득한다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현에 대한 리뷰 논문에는 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993)] 및 [Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992)]이 포함된다.
본 발명의 Fv 클론을 코딩하는 DNA가 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 코딩하는 공지된 DNA 서열 (예를 들어 적합한 DNA 서열이 [Kabat et al., 상기 문헌]으로부터 수득될 수 있다)와 조합되어, 전장 또는 부분적인 길이의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 클론이 형성될 수 있다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 포함하여 임의의 이소타입의 불변 영역이 이러한 목적에 사용될 수 있다는 것, 및 이같은 불변 영역이 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 한 동물 (예컨대 인간) 종의 가변 도메인 DNA로부터 유래된 후, 또다른 동물 종의 불변 영역 DNA에 융합되어 "하이브리드" 전장 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 코딩 서열(들)을 형성한 Fv 클론이 본원에서 사용된 "키메라" 및 "하이브리드" 항체의 정의에 포함된다. 바람직한 실시양태에서, 인간 가변 DNA로부터 유래된 Fv 클론이 인간 불변 영역 DNA에 융합되어 모두 인간형인 전장 또는 부분적 길이의 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 코딩 서열(들)이 형성된다.
본 발명의 하이브리도마로부터 유래된 항-DLL4 항체를 코딩하는 DNA를, 예를 들어, 하이브리도마 클론으로부터 유래된 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환함으로써, 또한 변형시킬 수 있다 (예를 들어, [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)]의 방법에서와 같이). 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 하이브리도마 또는 Fv 클론-유래 항체 또는 단편을 코딩하는 DNA를 추가로 변형시킬 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 Fv 클론 또는 하이브리도마 클론-유래 항체의 결합 특이성이 있는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체가 제조된다.
항체 단편
본 발명은 항체 단편을 포함한다. 특정 상황에서는, 전체 항체보다 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 단편의 더 작은 크기는 신속한 소거를 허용하고, 고체 종양에 대한 개선된 접근에 이를 수 있다.
항체 단편의 생산을 위하여 다양한 기술이 개발되어 왔다. 전통적으로, 이러한 단편들은 무손상 항체의 단백질분해성 소화를 통해 유도되었다 (예를 들어, [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)]; 및 [Brennan et al., Science 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 현재 이러한 단편들은 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편이 모두 대장균에서 발현되어 이로부터 분비될 수 있고, 따라서 다량의 이러한 단편들이 손쉽게 생산되도록 한다. 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 항체 단편이 단리될 수 있다. 별법적으로, Fab'-SH 단편들이 대장균으로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편이 형성될 수 있다 ([Carter et al, Bio/Technology 10:163-167 (1992)]). 또다른 접근법에 따르면, F(ab')2 단편이 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 단리될 수 있다. 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편이 미국 특허 번호 5,869,046에 기술되어 있다. 항체 단편의 생산을 위한 기타 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 또다른 실시양태에서, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 번호 5,571,894; 및 미국 특허 번호 5,587,458 참조. Fv 및 sFv는 불변 영역이 없는 무손상 결합 부위를 갖는 유일한 종이다; 따라서, 이들은 생체내 사용 동안 감소된 비특이적 결합에 적절하다. sFv의 아미노 또는 카르복시 말단에서 이펙터 단백질의 융합이 산출되도록 sFv 융합 단백질을 구축할 수 있다. [Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 상기 문헌] 참조. 또한 항체 단편은, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,641,870에 기술된 것과 같이, "선형 항체"일 수 있다. 이같은 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
인간화 항체
본 발명은 인간화 항체를 포함한다. 비-인간 항체를 인간화시키는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 인간화 항체에는 비-인간 공급원으로부터 유래된 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입되어 있을 수 있다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "수입" 잔기로 지칭되고, 이는 전형적으로는 "수입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 초가변 영역으로 인간 항체의 상응하는 서열을 치환함으로써 Winter 및 공동 연구원의 방법 ([Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525]; [Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327]; [Verhoeyen et al. (1988) Science, 239: 1534-1536])에 따라 본질적으로 수행할 수 있다. 따라서, 이같은 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 서열이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 번호 4,816,567)이다. 실제로, 전형적으로 인간화 항체는 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간화 항체를 제조하는데 사용되는 인간 가변 도메인 (경쇄 및 중쇄 모두)을 선택하는 것은 항원성을 감소시키는데 매우 중요하다. 소위 "베스트-핏(best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 서열이 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크 영역 (FR)으로서 받아들여진다 ([Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296]; [Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901]). 또다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브그룹의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크 영역을 사용한다. 여러 상이한 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크를 사용할 수 있다 ([Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285]; [Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623]).
항원에 대한 높은 친화성 및 기타 유리한 생물학적 성질을 유지시키면서 항체를 인간화시키는 것이 또한 중요하다. 이러한 목적을 이루기 위해, 한 방법에 따라, 어버이 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하는 어버이 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 프로세스에 의해 인간화 항체가 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 입수가능하고, 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체 구조를 설명하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이러한 디스플레이들의 정밀검사로 후보 면역글로불린 서열의 기능화에서 잔기들의 가능한 역할을 분석할 수 있으며, 즉, 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, 원하는 항체 특성, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화력이 달성되도록 수용자 및 수입 서열로부터 FR 잔기들을 선택하고 조합시킬 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기가 항원 결합에 영향을 미치는데 직접적으로, 그리고 가장 실질적으로 관여한다.
인간 항체
본 발명의 인간 항-DLL4 항체는 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선별된 Fv 클론 가변 도메인 서열(들)을 상기 기술된 바와 같은 공지된 인간 불변 도메인 서열(들)과 조합시킴으로써 구축될 수 있다. 별법적으로, 본 발명의 인간 모노클로날 항-DLL4 항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주가, 예를 들어, [Kozbor J. Immunol, 133: 3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]; 및 [Boerner et al., J. Immunol, 147: 86 (1991)]에 의해 기술되었다.
면역화 시, 내인성 면역글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식계열 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자를 동형접합 결실시키면 내인성 항체의 생산이 완전히 억제된다는 것이 기술되었다. 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이를 이같은 생식계열 돌연변이 마우스에게 전달하면, 항원 접종시 인간 항체가 생산될 것이다. 예를 들어, [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993)]; [Bruggermann et al., Year in Immunol., 7: 33 (1993)] 참조.
유전자 셔플링이 비-인간, 예를 들어 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도하는데 또한 사용될 수 있고, 이때 인간 항체는 출발 비-인간 항체와 친화력 및 특이성이 유사하다. "에피토프 임프린팅(imprinting)"으로 또한 칭해지는 이러한 방법에 따라, 상기 기술된 바와 같은 파지 디스플레이 기술에 의해 수득된 비-인간 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역이 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체되어, 비-인간 사슬/인간 사슬 scFv 또는 Fab 키메라의 집단이 생성된다. 항원으로의 선별로 비-인간 사슬/인간 사슬 키메라 scFv 또는 Fab의 단리가 초래되고, 여기서 인간 사슬이 1차 파지 디스플레이 클론에서 상응하는 비-인간 사슬의 제거 시 파괴된 항원 결합 부위를 복원하며, 즉, 에피토프가 인간 사슬 파트너의 선택을 좌우한다 (임프린팅한다). 나머지 비-인간 사슬을 대체하기 위해 프로세스가 반복될 때, 인간 항체가 수득된다 (PCT WO 93/06213 (1993년 4월 1일 공개) 참조). CDR 그래프팅(grafting)에 의한 비-인간 항체의 전통적인 인간화와 달리, 이러한 기술은 비-인간 기원의 FR 또는 CDR 잔기가 없는, 완전히 인간형인 항체를 제공한다.
이중특이적 항체
이중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 항원에 대한 결합 특이성이 있는 모노클로날 항체, 바람직하게는 인간 또는 인간화 모노클로날 항체이다. 본 경우에, 결합 특이성들 중 하나는 DLL4에 대한 것이고, 나머지는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 대표적인 이중특이적 항체는 DLL4 단백질의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 또한 이중특이적 항체를 사용하여 세포독성제를 DLL4를 발현하는 세포에 국소화시킬 수 있다. 이러한 항체들은 DLL4-결합 팔, 및 세포독성제 (예를 들어, 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신(ricin) A 사슬, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)에 결합하는 팔을 갖는다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체)으로 제조될 수 있다.
이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동-발현을 기초로 하고, 이때 두 중쇄는 특이성이 상이하다 ([Milstein and Cuello, Nature, 305: 537 (1983)]). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 배열(assortment)로 인해, 이러한 하이브리도마 (쿼드로마(quadroma))는 10가지 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하고, 이중 하나만이 올바른 이중특이적 구조를 갖는다. 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 이루어지는 올바른 분자의 정제는 다소 번거롭고, 생성물 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829 (1993년 5월 13일 공개) 및 [Traunecker et al., EMBO J., 10:3655 (1991)]에 개시되어 있다.
더욱 바람직한 다른 접근법에 따르면, 원하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인이 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 바람직하게는, 융합은 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부분을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합이다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합물 중 적어도 하나에 존재하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합물, 및 원한다면 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA들을 별도의 발현 벡터에 삽입하고, 적절한 숙주 세포 내로 공-형질감염시킨다. 이것은 구축에 사용된 3개의 폴리펩티드 사슬의 동등하지 않은 비율이 최적 수율을 제공하는 실시양태에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조절하는데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율의 2개 이상의 폴리펩티드 사슬의 발현으로 높은 수율이 수득되는 경우 또는 비율이 특별한 의미를 갖지 않는 경우, 2개 또는 모든 3개의 폴리펩티드 사슬에 대한 코딩 서열을 1개의 발현 벡터에 삽입할 수 있다.
이러한 접근법의 바람직한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 한쪽 팔 내의 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른쪽 팔 내의 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성 제공)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 한쪽 절반에만 면역글로불린 경쇄가 존재하여 용이한 분리 방식을 제공하기 때문에, 이러한 비대칭 구조는 원치 않는 면역글로불린 사슬 조합물로부터의 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 한다는 것이 발견되었다. 이러한 접근법이 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체의 생성을 위한 추가적인 상세한 내용은, 예를 들어, [Suresh et al., Methods in Enzymmology, 121:210 (1986)] 참조.
또다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 사이의 경계면을 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화할 수 있다. 바람직한 경계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 제1 항체 분자의 경계면으로부터의 1개 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 타이로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 큰 측쇄(들)에 대한 동일하거나 유사한 크기의 보상 "공동(cavity)"이 제2 항체 분자의 경계면 상에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 원치 않는 최종-생성물에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메커니즘을 제공한다.
이중특이적 항체에는 가교된 또는 "이종접합체" 항체가 포함된다. 예를 들어, 이종접합체 내의 항체들 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 이같은 항체들은, 예를 들어, 원치않는 세포에 대한 면역계 세포의 표적화 (미국 특허 번호 4,676,980), 및 HIV 감염의 치료 (WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 03089)를 위해서 제안되었다. 이종접합체 항체는 임의의 편리한 가교 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 다수의 가교 기술과 함께, 적절한 가교제가 당업계에 주지되어 있고, 미국 특허 번호 4,676,980에 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성시키는 기술 또한 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, 화학적 연결을 이용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. [Brennan et al., Science 229:81 (1985)]에는 무손상 항체를 단백질분해적으로 절단시켜 F(ab')2 단편을 생성시키는 방법이 기술되어 있다. 이러한 단편을 디티올 착화제인 아비산나트륨의 존재하에 환원시켜, 인접한 디티올들을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지한다. 그 후 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 그 후 Fab'-TNB 유도체 중 하나를 메르캅토에틸아민으로의 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환시키고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시킨다. 생산된 이중특이적 항체를 효소의 선택적 고정을 위한 작용제로서 사용할 수 있다.
최근의 진보로 대장균으로부터의 Fab'-SH 단편의 직접적인 회수가 용이해졌고, 이를 화학적으로 커플링시켜 이중특이적 항체를 형성시킬 수 있다. [Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)]에는 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산이 기술되어 있다. 각각의 Fab' 단편이 대장균으로부터 별도로 분비되었고, 시험관내에서 지향성으로 화학적 커플링되어, 이중특이적 항체가 형성되었다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는 HER2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상적인 인간 T 세포에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발할 수 있었다.
재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조 및 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기술되었다. 예를 들어, 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체가 생산되었다. [Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드를 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 유전자 융합에 의해 연결시켰다. 항체 동종이량체를 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성시킨 후, 다시 산화시켜 항체 이종이량체를 형성시켰다. 이러한 방법은 항체 동종이량체의 생산에 또한 이용될 수 있다. [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 기술된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편의 별법적인 제조 메커니즘을 제공하였다. 단편은 동일한 사슬 상의 두 도메인이 쌍을 이루게 하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인이 또다른 단편의 상보적인 VH 및 VL 도메인과 쌍을 이루도록 강요됨으로써, 2개의 항원 결합 부위가 형성된다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또다른 전략이 또한 보고되었다. [Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)] 참조.
2가를 초과하는 항체가 구현된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다. [Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)].
다가 항체
다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 이가 항체보다 빨리 내재화 (및/또는 이화)될 수 있다. 본 발명의 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위가 있는 다가 항체 (IgM 클래스 이외의 것)일 수 있고 (예를 들어 4가 항체), 이는 항체의 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 쉽게 생산될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다 (또는 이로 구성된다). 이러한 시나리오에서, 항체는 Fc 영역, 및 Fc 영역에 대해 아미노 말단인 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 본원에서 바람직한 다가 항체는 3 내지 약 8개, 바람직하게는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이것으로 구성된다). 다가 항체는 1개 이상의 폴리펩티드 사슬 (바람직하게는 2개의 폴리펩티드 사슬)을 포함하고, 이때 폴리펩티드 사슬(들)은 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드 사슬(들)은 VD1-(X1)n- VD2-(X2)n-Fc [식중, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 한 폴리펩티드 사슬이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1이다]를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 사슬(들)은 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 사슬; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 사슬을 포함할 수 있다. 바람직하게는 본원에서의 다가 항체는 적어도 2개 (바람직하게는 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 본원에서의 다가 항체는, 예를 들어, 약 2개 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 여기서 구현된 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로, CL 도메인을 추가로 포함한다.
항체 변이체
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 구현된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화력 및/또는 기타 생물학적 성질을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체들은 적절한 뉴클레오티드 변화를 항체 핵산 내에 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조된다. 이같은 변형에는, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환이 포함된다. 최종 구축물이 원하는 특성을 갖는다는 조건하에 결실, 삽입 및 치환의 임의 조합이 이루어져 최종 구축물에 도달될 수 있다. 아미노산 변경은 서열이 제조되는 시점에 대상 항체 아미노산 서열에 도입될 수 있다.
돌연변이유발에 바람직한 위치인 항체의 특정 잔기 또는 영역을 확인하기 위한 유용한 방법은, [Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]에 기술된 바와 같이 "알라닌-스캐닝 돌연변이유발"로 칭해진다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기들의 군이 확인되고 (예를 들어, arg, asp, his, lys, 및 glu와 같은 전하를 띠는 잔기), 중성 아미노산 또는 음성 전하를 띠는 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 치환되어, 아미노산과 항원과의 상호작용에 영향을 미친다. 그 후, 치환에 대해 기능적 감수성을 나타내는 아미노산 위치를 치환 부위에 또는 치환 부위에 대해 추가적인 또는 다른 변이체를 도입함으로써 정련한다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되지만, 돌연변이 그 자체의 성질을 미리 결정할 필요는 없다. 예를 들어, 소정의 부위에서 돌연변이의 성과를 분석하기 위해, 표적 코돈 또는 영역에서 ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발을 수행하고, 발현된 면역글로불린을 원하는 활성에 대해 스크리닝한다.
아미노산 서열 삽입에는 길이 범위가 하나의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입이 포함된다. 말단 삽입의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기가 있는 항체 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 항체가 포함된다. 항체 분자의 또다른 삽입 변이체에는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드 또는 효소 (예를 들어 ADEPT용)가 항체의 N- 또는 C-말단에 융합된 것이 포함된다.
폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 탄수화물 모이어티가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (식중 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 탄수화물 모이어티를 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이러한 트리펩티드 서열 중의 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중의 하나가 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착되는 것을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시라이신 또한 사용될 수 있다.
항체에 글리코실화 부위를 부가하는 것은 하나 이상의 상기 기술된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 이루어진다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 또한 변경은 원래의 항체의 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fc 영역에 부착된 푸코스가 없는 성숙형 탄수화물 구조를 갖는 항체가 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1 (Presta, L.)에 기술되어 있다. US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)를 또한 참조. 항체의 Fc 영역에 부착된 탄수화물 내의 양분화(bisecting) N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)을 갖는 항체가 WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.) 및 미국 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.)에 언급되어 있다. 항체의 Fc 영역에 부착된 올리고당류 내의 하나 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 항체가 WO 1997/30087 (Patel et al.)에 보고되어 있다. 또한, 항체의 Fc 영역에 부착된 탄수화물이 변경된 항체에 관한 WO 1998/58964 (Raju, S.) 및 WO 1999/22764 (Raju, S.) 참조. 글리코실화가 변형된 항원-결합 분자에 대한 US 2005/0123546 (Umana et al.)를 또한 참조.
본원에서의 바람직한 글리코실화 변이체는 Fc 영역에 부착된 탄수화물 구조에 푸코스가 없는 Fc 영역을 포함한다. 이같은 변이체는 ADCC 기능이 개선된다. 임의로, Fc 영역은 ADCC를 더욱 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334 (잔기의 Eu 번호매김)에서의 치환을 추가로 포함할 수 있다. "푸코스제거(defucosylated)" 또는 "푸코스-결핍" 항체에 관련된 문헌의 예로는 US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; [Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)]; [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614 (2004)]이 포함된다. 푸코스제거 항체를 생산하는 세포주의 예로는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 ([Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1 (Presta, L); 및 WO 2004/056312 A1 (Adams 등, 특히 실시예 11)), 및 녹아웃(knockout) 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자 FUT8이 녹아웃된 CHO 세포 ([Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614 (2004)])가 포함된다.
또다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이러한 변이체에서는 항체 분자 내의 1개 이상의 아미노산 잔기가 상이한 잔기로 대체된다. 치환성 돌연변이유발에 가장 흥미로운 부위에는 초가변 영역이 포함되지만, FR 변경 또한 구현된다. 보존적 치환이 "바람직한 치환"이라는 표제 하에 표 1에 제시된다. 이같은 치환으로 생물학적 활성이 변하게 되면, 표 1에서 "대표적 치환"으로 명명된 또는 아미노산 클래스와 관련하여 하기에 추가로 기술되는 바와 같은 더욱 실질적인 변화가 도입될 수 있고, 생성물을 스크리닝하게 된다.
본래의 잔기 대표적 치환 바람직한 치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Asp; Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신 Leu
Leu (L) 노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신 Leu
항체의 생물학적 성질에 있어서의 실질적인 변화는 (a) 예를 들어 시트 또는 나선 입체형태와 같은, 치환 영역 내의 폴리펩티드 골격의 구조; (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성; 또는 (c) 측쇄의 부피(bulk)를 유지하는 것에 대한 효과가 현저하게 상이한 치환을 선택함으로써 수행된다. 천연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 성질을 기초로 하기 군으로 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: his, lys, arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비-보존성 치환은 이들 클래스 중의 하나의 구성원을 또다른 클래스로 교환함으로써 이루어질 것이다.
치환 변이체의 한 유형에는 어버이 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 1개 이상의 초가변 영역 잔기가 치환되는 것이 수반된다. 일반적으로, 추가적인 개발용으로 선택된 생성된 변이체(들)는 이들이 유래되는 어버이 항체에 비해 생물학적 성질이 개선될 것이다. 이같은 치환 변이체를 생성시키는 간편한 방법은 파지 디스플레이를 이용한 친화력 성숙을 수반한다. 간략하게, 몇몇 초가변 영역 부위 (예를 들어, 6 내지 7개 부위)가 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환이 생성되도록 돌연변이된다. 이렇게 생성된 항체 변이체가 사상 파지 입자로부터 각각의 입자 내에 패키징된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합물로서 디스플레이된다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체를 본원에 개시된 바와 같이 이의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화력)에 대해 스크리닝한다. 변형에 대한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 알라닌-스캐닝 돌연변이 유발법을 수행하여 항원 결합에 현저하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인할 수 있다. 별법적으로 또는 추가적으로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하여 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하는 것이 유리할 수 있다. 이같은 접촉 잔기와 이웃 잔기는 본원에서 상술된 것들을 포함하여 당업계에 공지된 기술에 따른 치환에 대한 후보물이다. 일단 이같은 변이체가 생성되면, 변이체 패널을 본원에서 기술된 바와 같이 스크리닝하고, 한가지 이상의 관련 분석법에서 탁월한 성질이 있는 항체를 추가적인 개발용으로 선택할 수 있다.
항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이러한 방법에는 천연 공급원으로부터의 단리 (천연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우), 또는 항체의 앞서 제조된 변이체 또는 비-변이체 버젼의 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위-지정) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발 및 카세트 돌연변이유발에 의한 제조가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 면역글로불린 폴리펩티드의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 변형을 도입함으로써, Fc 영역 변이체를 생성시키는 것이 바람직할 수 있다. Fc 영역 변이체는 힌지 시스테인의 것을 포함하는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 변형 (예를 들어 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다. 본 명세서 및 당업계의 기술에 따라, 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 사용된 항체가, 예를 들어 Fc 영역에서, 야생형 대응물(counterpart) 항체와 비교하여 하나 이상의 변경을 포함할 수 있다는 것이 구현된다. 그럼에도 불구하고 이러한 항체는 이의 야생형 대응물과 비교하여 치료적 유용성에 필요한 실질적으로 동일한 특성을 유지할 것이다. 예를 들어, WO99/51642에 기술된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 초래할 특정 변경이 Fc 영역에서 이루어질 수 있는 것으로 생각된다. Fc 영역 변이체의 또다른 예에 관한 [Duncan ＆ Winter Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO94/29351를 또한 참조. WO00/42072 (Presta) 및 WO 2004/056312 (Lowman)에는 FcR에 대한 결합이 개선 또는 감소된 항체 변이체가 기술되어 있다. 이러한 특허 공보의 내용은 거명에 의해 본원에 명확하게 포함된다. [Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)]를 또한 참조. 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 수용체 FcRn ([Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)])에 대한 결합이 개선되고 반감기가 증가된 항체가 US2005/0014934 A1 (Hinton 등)에 기술되어 있다. 이러한 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환이 있는 Fc 영역을 포함한다. Fc 영역 아미노산 서열이 변경되고 C1q 결합 능력이 증가 또는 감소된 폴리펩티드 변이체가 미국 특허 번호 6,194,551 B1, WO 99/51642에 기술되어 있다. 이러한 특허 공보의 내용은 거명에 의해 본원에 명확하게 포함된다. [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]을 또한 참조.
항체 유도체
본 발명의 항체는 당업계에 공지되고 용이하게 입수가능한 추가적인 비-단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 바람직하게는, 항체의 유도체화에 적절한 모이어티는 수용성 중합체이다. 수용성 중합체의 비-제한적 예로는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어 글리세롤), 폴리비닐 알코올 및 이의 혼합물이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서의 안정성으로 인해 제작에서의 장점이 있을 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지형 또는 비-분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 변할 수 있고, 1개를 초과하는 중합체가 부착될 경우, 중합체들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 특정 성질 또는 기능, 항체 유도체가 한정된 조건 하에 치료법에서 사용될 것인지 여부 등이 포함되지만 이에 한정되지 않는 고려사항을 기초로 결정될 수 있다.
원하는 성질이 있는 항체에 대한 스크리닝
본 발명의 항체는 당업계에 공지된 다양한 분석법에 의해 이의 물리적/화학적 성질 및 생물학적 기능에 대해 특성화될 수 있다. 일부 실시양태에서, DLL4에 대한 결합; 및/또는 노치 수용체 활성화의 감소 또는 차단; 및/또는 노치 수용체 하류 분자성 신호전달의 감소 또는 차단; 및/또는 DLL4에 대한 노치 수용체 결합의 파괴 또는 차단; 및/또는 내피 세포 증식의 촉진; 및/또는 내피 세포 분화의 억제; 및/또는 동맥 분화의 억제; 및/또는 종양 혈관 관류의 억제; 및/또는 종양, 세포 증식성 장애 또는 암의 치료 및/또는 예방; 및/또는 DLL4 발현 및/또는 활성과 관련된 장애의 치료 또는 예방; 및/또는 노치 수용체 발현 및/또는 활성과 관련된 장애의 치료 또는 예방 중 임의의 1가지 이상에 대해 항체가 특성화된다.
정제된 항체를 N-말단 서열분석, 아미노산 분석, 비-변성 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC), 질량 분광법, 이온 교환 크로마토그래피 및 파파인 소화가 포함되지만 이에 한정되지 않는 일련의 분석법에 의해 추가로 특성화할 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본원에서 생산된 항체가 이의 생물학적 활성에 대해 분석된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체가 이의 항원 결합 활성에 대해 테스트된다. 당업계에 공지되고 본원에서 사용될 수 있는 항원 결합 분석법에는 웨스턴 블롯, 방사성면역분석법, ELISA (효소 결합 면역흡착 분석법), "샌드위치" 면역분석법, 면역침전 분석법, 형광 면역분석법 및 단백질 A 면역분석법과 같은 기술을 사용하는 임의의 직접적 또는 경쟁적 결합 분석법이 비제한적으로 포함된다. 실례가 되는 항원 결합 분석법이 하기의 실시예 섹션에서 제공된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 DLL4에의 결합에 대해 26.6, 26.14, 26.20, 26.34, 및/또는 26.82 항체와 경쟁하는 항-DLL4 모노클로날 항체를 제공한다. 이같은 경쟁자 항체에는 항체 26.6, 26.14, 26.20, 26.34, 및/또는 26.82가 인식하는 DLL4 에피토프와 동일하거나 이러한 에피토프와 중첩되는 DLL4 에피토프를 인식하는 항체가 포함된다. 이같은 경쟁자 항체는 표지된 26.6, 26.14, 26.20, 26.34, 및/또는 26.82 항체와의 경쟁에서 고정된 DLL4에의 결합에 대해 항-DLL4 하이브리도마 상청액을 스크리닝함으로써 수득될 수 있다. 경쟁자 항체를 함유하는 하이브리도마 상청액은 관련이 없는 항체를 함유하거나 항체를 함유하지 않는 대조군 결합 혼합물에서 검출된 결합된 표지 항체의 양과 비교하여 대상 경쟁 결합 혼합물에서 검출된 결합된 표지 항체의 양을 감소시킬 것이다. 본원에 기술된 경쟁 결합 분석법 중 임의의 것이 상기 절차에서 사용하기에 적절하다.
또다른 양상에서, 본 발명은 26.6, 26.14, 26.20, 26.34, 및/또는 26.82 항체의 1개 이상 (예컨대 2개, 3개, 4개, 5개, 및/또는 6개)의 HVR을 포함하는 항-DLL4 모노클로날 항체를 제공한다. 26.6, 26.14, 26.20, 26.34, 및/또는 26.82 항체의 1개 이상의 HVR(들)을 포함하는 항-DLL4 모노클로날 항체는, 본원에 기술된 바와 같이, 26.6, 26.14, 26.20, 26.34, 및/또는 26.82 항체의 1개 이상의 HVR(들)을 주형 항체 서열, 예를 들어 어버이 항체의 상응하는 뮤린 서열과 가장 근접한 인간 항체 서열 또는 어버이 항체 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브그룹 내의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열 상에 그래프팅시키고, 생성된 키메라 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역 서열(들)을 불변 영역 서열(들)과 함께 또는 불변 영역 서열(들) 없이 재조합 숙주 세포에서 발현시킴으로써 구축될 수 있다.
임의의 편리한 방법에 의해 원하는 성질에 대해 항-DLL4 하이브리도마 클론을 스크리닝함으로써 본원에 기술된 독특한 성질을 지니는 본 발명의 항-DLL4 항체를 수득할 수 있다. 예를 들어, DLL4에 대한 노치 수용체의 결합을 차단하거나 차단하지 않는 항-DLL4 모노클로날 항체를 원한다면, 후보물 항체를 결합 경쟁 분석법, 예컨대 플레이트 웰을 DLL4로 코팅하고, 코팅된 플레이트 상에 과량의 당해 노치 수용체 내의 항체의 용액을 층상화시키고, 결합된 항체를 효소에 의해, 예를 들어, 결합된 항체를 HRP-접합 항-Ig 항체 또는 비오틴화 항-Ig 항체와 접촉시키고 HRP 색 반응을 현상하여 (예를 들어, 플레이트를 스트렙타비딘-HRP 및/또는 과산화수소로 현상하고, ELISA 플레이트 판독기로 490 nm에서 분광광도법에 의해 HRP 색 반응을 검출함으로써) 검출하는 경쟁적 결합 ELISA에서 테스트할 수 있다.
한 실시양태에서, 전부가 아니라 약간의 이펙터 기능을 지니는 변경된 항체가 본 발명에서 구현되고, 이러한 이펙터 기능은 이를 항체의 생체내 반감기가 중요하지만 특정 이펙터 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 해로운 다수의 용도에 바람직한 후보물이도록 만든다. 특정 실시양태들에서, 생산된 면역글로불린의 Fc 활성이 오직 원하는 성질만이 유지되는 것을 확실히 하기 위해 측정된다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/결핍을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석법이 수행될 수 있다. 예를 들어, 항체에 FcγR 결합이 없지만 (따라서, ADCC 활성이 없기 쉬움), FcRn 결합 능력은 유지되는 것을 확실히 하기 위해 Fc 수용체 (FcR) 결합 분석법이 수행될 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현이 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464면의 표 3에 요약되어 있다. 당해 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석법의 예가 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기술되어 있다. 이같은 분석법에 유용한 이펙터 세포에는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포가 포함된다. 별법적으로 또는 추가적으로, 당해 분자의 ADCC 활성을 생체 내에서, 예를 들어, [Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같이 동물 모델에서 평가할 수 있다. 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성이 없다는 것을 확인하기 위해 C1q 결합 분석법이 또한 수행될 수 있다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, 예를 들어, [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기술된 바와 같은 CDC 분석법이 수행될 수 있다. 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 실시예 섹션에 기술된 것들을 이용하여 FcRn 결합 및 생체내 소거/반감기 결정을 또한 수행할 수 있다.
벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
본 발명의 항체의 재조합 생산을 위해, 이를 코딩하는 핵산이 단리되어, 추가적인 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내로 삽입된다. 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 쉽게 단리 및 서열분석된다 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써). 다수의 벡터가 이용가능하다. 벡터의 선택은 사용될 숙주 세포에 부분적으로 좌우된다. 일반적으로, 바람직한 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 (일반적으로 포유류) 기원의 세포이다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 포함하여 임의의 이소타입의 불변 영역이 이러한 목적에 사용될 수 있다는 것, 및 이같은 불변 영역이 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
a. 원핵생물 숙주 세포를 사용한 항체 생성
i. 벡터 구축
본 발명의 항체의 폴리펩티드 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 표준 재조합 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 원하는 폴리뉴클레오티드 서열을 하이브리도마 세포와 같은 항체 생산 세포로부터 단리 및 서열분석할 수 있다. 별법적으로, 뉴클레오티드 합성기 또는 PCR 기술을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 합성할 수 있다. 일단 수득되면, 폴리펩티드를 코딩하는 서열이 원핵생물 숙주에서 이종성 폴리뉴클레오티드를 복제 및 발현시킬 수 있는 재조합 벡터 내로 삽입된다. 당업계에서 입수가능하고 공지된 다수의 벡터들을 본 발명의 목적을 위해 사용할 수 있다. 적합한 벡터의 선별은 벡터 내로 삽입될 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환될 특정 숙주 세포에 주로 좌우될 것이다. 각각의 벡터는 기능 (이종성 폴리뉴클레오티드의 증폭 또는 발현, 또는 양쪽 모두) 및 자신이 거주하는 특정 숙주 세포와의 혼화성에 따라 다양한 성분을 함유한다. 벡터 성분은 복제 기원, 선별 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위 (RBS), 신호 서열, 이종성 핵산 삽입물 및 전사 종결 서열을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
일반적으로, 숙주 세포와 혼화성인 종으로부터 유래된 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 플라스미드 벡터가 이러한 숙주들과 함께 사용된다. 벡터는 통상적으로 복제 부위, 뿐만 아니라 형질전환된 세포에서 표현형 선별을 제공할 수 있는 마킹(marking) 서열을 보유한다. 예를 들어, 전형적으로 대장균은 대장균 종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322를 사용하여 형질전환된다. pBR322는 앰피실린 (Amp) 및 테트라사이클린 (Tet) 저항성을 코딩하는 유전자를 함유하고, 따라서 형질전환된 세포를 확인하기 위한 용이한 수단을 제공한다. pBR322, 이의 유도체, 또는 기타 미생물 플라스미드 또는 박테리오파지는 내인성 단백질의 발현을 위해 미생물에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 또한 함유할 수 있거나, 또는 함유하도록 변형될 수 있다. 특정 항체의 발현에 사용된 pBR322 유도체의 예가 미국 특허 번호 5,648,237 (Carter 등)에 상세하게 기술되어 있다.
또한, 숙주 미생물과 혼화성인 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 파지 벡터가 이러한 숙주와 관련되어 형질전환 벡터로 사용될 수 있다. 예를 들어, 박테리오파지 예컨대 λGEM™-11이 감수성 숙주 세포 예컨대 대장균 LE392를 형질전환시키는데 사용될 수 있는 재조합 벡터를 제조하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 각각의 폴리펩티드 성분을 코딩하는 2개 이상의 프로모터-시스트론(cistron) 쌍을 포함할 수 있다. 프로모터는 시스트론의 발현을 조정하는, 시스트론의 상류 (5')에 위치하는 번역되지 않는 조절 서열이다. 전형적으로 원핵생물 프로모터는 유도성 및 구성성의 2가지 부류에 속한다. 유도성 프로모터는 배양 조건에서의 변화, 예를 들어 영양소의 존재 또는 부재 또는 온도에서의 변화에 응답하여 이의 제어 하에 있는 시스트론의 전사 수준 증가를 개시시키는 프로모터이다.
다양한 잠재적인 숙주 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터가 주지되어 있다. 선별된 프로모터는 제한 효소 소화를 통해 공급원 DNA로부터 프로모터를 제거하고 단리된 프로모터 서열을 본 발명의 벡터 내로 삽입함으로써 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 시스트론 DNA에 작동가능하게 연결될 수 있다. 천연 프로모터 서열 및 다수의 이종성 프로모터 모두 표적 유전자의 증폭 및/또는 발현을 지시하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이종성 프로모터들이 이용되는데, 이들이 일반적으로 천연 표적 폴리펩티드 프로모터와 비교하여 더욱 양호한 전사 및 발현된 표적 유전자의 더욱 높은 수율을 허용하기 때문이다.
원핵생물 숙주와 사용하기에 적절한 프로모터에는 PhoA 프로모터, β-갈락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 및 하이브리드 프로모터 예컨대 tac 또는 trc 프로모터가 포함된다. 그러나, 박테리아에서 기능성인 기타 프로모터 (예컨대 기타 공지된 박테리아 또는 파지 프로모터)가 또한 적절하다. 이들의 뉴클레오티드 서열은 공개되어 있고, 따라서 당업자가 임의의 필요한 제한 부위를 공급하는 링커 또는 어댑터(adaptor)를 사용하여 표적 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 시스트론에 이들을 작동가능하게 결찰시킬 수 있도록 한다 ([Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269]).
본 발명의 한 양상에서, 재조합 벡터 내의 각각의 시스트론은 발현된 폴리펩티드의 막을 가로지르는 이동을 지시하는 분비 신호 서열 성분을 포함한다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 또는 벡터 내로 삽입되는 표적 폴리펩티드 DNA의 일부분일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 선별된 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱 (즉, 신호 펩티드분해효소에 의해 절단)되는 것이어야 한다. 이종성 폴리펩티드에 천연인 신호 서열을 인식 및 프로세싱하지 않는 원핵생물 숙주 세포에 대해서, 신호 서열이 알칼리성 포스파타제, 페니실린분해효소, Ipp, 또는 열-안정성 장독소 II (STII) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA 및 MBP로 구성된 군으로부터 예를 들어 선택된 원핵생물 신호 서열로 치환된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 발현 시스템의 양쪽 시스트론에서 사용된 신호 서열은 STII 신호 서열 또는 이의 변이체이다.
또다른 양상에서, 본 발명에 따른 면역글로불린의 생산은 숙주 세포의 세포질에서 일어날 수 있고, 따라서 각각의 시스트론 내의 분비 신호 서열의 존재를 필요로 하지 않는다. 이와 관련하여, 면역글로불린 경쇄 및 중쇄가 세포질 내에서 발현되고, 폴딩(folding)되고, 어셈블리되어 기능성 면역글로불린이 형성된다. 특정 숙주 균주 (예를 들어, 대장균 trxB- 균주)는 디술피드 결합 형성에 유리한 세포질 조건을 제공함으로써, 발현된 단백질 서브유닛의 정확한 폴딩 및 어셈블리를 허용한다. [Proba and Pluckthun, Gene, 159:203 (1995)].
본 발명의 항체를 발현시키는데 적절한 원핵생물 숙주 세포에는 고세균(Archaebacteria) 및 진정세균(Eubacteria), 예컨대 그람(Gram)-음성 또는 그람-양성 생물이 포함된다. 유용한 박테리아의 예로는 에쉐리키아(Escherichia) (예를 들어, 대장균), 바실루스(Bacillus) (예를 들어, 바실루스 서브틸리스(B. subtilis)), 엔테로박테리아(Enterobacteria), 슈도모나스(Pseudomonas) 종 (예를 들어, 슈도모나스 아에루기노사(P. aeruginosa)), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세샌스(Serratia marcescans), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 시겔라(Shigella), 리조비아(Rhizobia), 비트레오실라(Vitreoscilla), 또는 파라코쿠스(Paracoccus)가 포함된다. 한 실시양태에서, 그람-음성 세포가 사용된다. 한 실시양태에서, 대장균 세포가 본 발명의 숙주로서 사용된다. 대장균 균주의 예로는 균주 W3110 ([Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219]; ATCC® 기탁 번호 27,325), 및 유전자형이 W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR인 균주 33D3이 포함되는 이의 유도체가 포함된다 (미국 특허 번호 5,639,635). 기타 균주 및 이의 유도체, 예컨대 대장균 294 (ATCC 31,446), 대장균 B, 대장균 λ 1776 (ATCC 31,537) 및 대장균 RV308 (ATCC 31,608)가 또한 적절하다. 이러한 예들은 제한적이기보다는 예시적인 것이다. 규정된 유전자형을 갖는 상기 언급된 박테리아 중 임의의 것의 유도체를 구축하는 당법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, [Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990)]에 기술되어 있다. 박테리아의 세포 내에서의 레플리콘의 복제가능성을 고려하여 적합한 박테리아를 선택하는 것이 일반적으로 필요하다. 예를 들어, pBR322, pBR325, pACYC177, 또는 pKN410과 같은 주지된 플라스미드가 레플리콘을 공급하는데 사용된 경우 대장균, 세라티아, 또는 살모넬라 종이 숙주로서 적절하게 사용될 수 있다. 전형적으로, 숙주 세포는 최소량의 단백질분해성 효소를 분비하여야 하고, 세포 배양물 내에 추가적인 프로테아제 억제제가 바람직하게 혼입될 수 있다.
ii. 항체 생산
숙주 세포를 상기 기술된 발현 벡터로 형질전환시키고, 프로모터 유도, 형질전환체 선별 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자의 증폭에 적합하도록 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양한다.
형질전환은 염색체외 요소로서 또는 염색체 구성요소에 의해 DNA가 복제가능하도록 DNA를 원핵생물 숙주 내로 도입하는 것을 의미한다. 사용된 숙주 세포에 따라, 형질전환은 이같은 세포에 적합한 표준 기술을 사용하여 수행된다. 염화 칼슘을 사용하는 칼슘 처리가 상당한 세포벽 장벽을 함유하는 박테리아 세포에 대해 일반적으로 사용된다. 또다른 형질전환 방법은 폴리에틸렌 글리콜/DMSO를 사용한다. 사용된 또다른 기술은 전기천공이다.
본 발명의 폴리펩티드를 생산하는데 사용된 원핵생물이 당업계에 공지되고 선별된 숙주 세포의 배양에 적절한 배지에서 성장된다. 적절한 배지의 예는 루리아 브로스 (LB: luria broth) + 필요한 영양소 보충물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지는 발현 벡터를 함유하는 원핵생물 세포의 성장을 선별적으로 허용하는, 발현 벡터의 구축을 기초로 선택된 선별제를 또한 함유한다. 예를 들어, 앰피실린이 앰피실린 저항성 유전자를 발현하는 세포의 성장을 위해 배지에 첨가된다.
탄소, 질소 및 무기 포스페이트 공급원 이외의 임의의 필요한 보충물이 단독으로 또는 또다른 보충물 또는 배지 예컨대 복합 질소 공급원과의 혼합물로서 도입되어 적합한 농도로 또한 포함될 수 있다. 임의로, 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 디티오에리트리톨 및 디티오트레이톨로 구성된 군으로부터 선택된 1가지 이상의 환원제를 함유할 수 있다.
원핵생물 숙주 세포를 적절한 온도에서 배양한다. 예를 들어, 대장균 성장에 대해, 바람직한 온도는 약 20℃ 내지 약 39℃ 범위이고, 더욱 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 37℃, 더욱 더 바람직하게는 약 30℃이다. 배지의 pH는, 주로 숙주 생물에 따라, 약 5 내지 약 9 범위의 임의의 pH일 수 있다. 대장균에 대해, pH는 바람직하게는 약 6.8 내지 약 7.4, 더욱 바람직하게는 약 7.0이다.
유도성 프로모터가 본 발명의 발현 벡터에서 사용되는 경우, 프로모터의 활성화에 적절한 조건 하에 단백질 발현이 유도된다. 본 발명의 한 양상에서, PhoA 프로모터가 폴리펩티드의 전사를 제어하는데 사용된다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포가 유도를 위한 포스페이트-제한 배지에서 배양된다. 바람직하게는, 포스페이트-제한 배지는 C.R.A.P 배지이다 (예를 들어, [Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263: 133-147] 참조). 당업계에 공지된 바와 같이, 사용된 벡터 구축물에 따라, 다양한 기타 유도제가 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 발현된 본 발명의 폴리펩티드가 숙주 세포의 원형질막 주위공간 내로 분비되어 이로부터 회수된다. 단백질 회수는, 일반적으로 삼투압 쇼크, 초음파처리 또는 용해와 같은 수단에 의해, 미생물을 파괴시키는 것을 전형적으로 수반한다. 일단 세포가 파괴되면, 세포 잔해물 또는 전체 세포를 원심분리 또는 여과에 의해 제거할 수 있다. 단백질이, 예를 들어, 친화성 수지 크로마토그래피에 의해, 추가로 정제될 수 있다. 별법적으로, 단백질이 배양 배지 내로 옮겨진 후, 여기에서 단리될 수 있다. 배양물로부터 세포를 제거할 수 있고, 생산된 단백질의 추가적인 정제를 위해 배양 상청액이 여과 및 농축된다. 발현된 폴리펩티드를 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 (PAGE) 및 웨스턴 블롯 분석법과 같은 통상적으로 공지된 방법을 사용하여 추가로 단리 및 확인할 수 있다.
본 발명의 한 양상에서, 항체 생산이 대량으로 발효 공정에 의해 수행된다. 다양한 대규모 페드-뱃치(fed-batch) 발효 절차가 재조합 단백질의 생산에 이용가능하다. 대규모 발효는 용량이 1000 리터 이상이고, 바람직하게는 약 1,000 내지 100,000 리터의 용량이다. 이러한 발효는 산소 및 영양소, 특히 글루코스 (바람직한 탄소/에너지 공급원)을 분배하기 위해 진탕기 임펠러(impeller)를 사용한다. 소규모 발효는 체적 용량이 약 100 리터 이하인 발효기에서의 발효를 일반적으로 지칭하고, 약 1 리터 내지 약 100 리터 범위일 수 있다.
발효 공정에서, 단백질 발현의 유도는 세포가 적절한 조건 하에 원하는 밀도, 예를 들어, 약 180-220의 OD550으로 성장한 후에 전형적으로 개시되고, 이러한 단계에서 세포는 초기 정지기 상태이다. 당업계에 공지되고 상기 기술된 바와 같이, 사용된 벡터 구축물에 따라, 다양한 유도제가 사용될 수 있다. 유도 전에 더 짧은 기간 동안 세포가 성장될 수 있다. 세포는 일반적으로 약 12-50 시간 동안 유도될 수 있지만, 더 길거나 더 짧은 유도 시간도 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 생산 수율 및 품질을 개선하기 위해, 다양한 발효 조건이 변형될 수 있다. 예를 들어, 분비된 항체 폴리펩티드의 정확한 어셈블리 및 폴딩을 개선하기 위해, 샤페론(chaperone) 단백질, 예컨대 Dsb 단백질 (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD 및/또는 DsbG) 또는 FkpA (샤페론 활성이 있는 펩티딜프롤릴 시스,트랜스-이소머라제)을 과발현하는 추가적인 벡터가 원핵생물 숙주 세포를 공동-형질감염시키는데 사용될 수 있다. 샤페론 단백질은 박테리아 숙주 세포에서 생산된 이종성 단백질의 정확한 폴딩 및 가용성을 촉진시키는 것으로 증명되었다. [Chen et al. (1999) J Bio Chem 274: 19601-19605]; 미국 특허 번호 6,083,715 (Georgiou 등); 미국 특허 번호 6,027,888 (Georgiou 등); [Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: 17100-17105]; [Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: 17106-17113]; [Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39: 199-210].
발현된 이종성 단백질 (특히 단백질분해적으로 민감한 것들)의 단백질분해를 최소화하기 위해, 단백질분해성 효소가 결핍된 특정 숙주 균주가 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, 공지된 박테리아 프로테아제 예컨대 프로테아제 III, OmpT, DegP, Tsp, 프로테아제 I, 프로테아제 Mi, 프로테아제 V, 프로테아제 VI 및 이의 조합물을 코딩하는 유전자에서의 유전자 돌연변이(들)을 초래하기 위해 숙주 세포 균주가 변형될 수 있다. 일부 대장균 프로테아제-결핍 균주가 입수가능하고, 예를 들어, [Joly et al. (1998), 상기 문헌]; 미국 특허 번호 5,264,365 (Georgiou 등); 미국 특허 번호 5,508,192 (Georgiou 등); [Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)]에 기술되어 있다.
한 실시양태에서, 단백질분해성 효소가 결핍되고 1가지 이상의 샤페론 단백질을 과발현하는 플라스미드로 형질전환된 대장균 균주가 본 발명의 발현 시스템에서 숙주 세포로 사용된다.
iii. 항체 정제
당업계에 공지된 표준 단백질 정제 방법을 사용할 수 있다. 하기의 절차들은 대표적인 적절한 정제 절차들이다: 면역친화성 또는 이온-교환 컬럼에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 양이온-교환 수지 예컨대 DEAE 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 및 세파덱스(Sephadex) G-75가 예를 들어 사용되는 젤 여과.
한 양상에서, 고체 상 위에 고정된 단백질 A가 본 발명의 전장 항체 생성물의 면역친화성 정제에 사용된다. 단백질 A는 고친화력으로 항체의 Fc 영역에 결합하는 스타필로코쿠스 아우레아스(Staphylococcus aureus)로부터의 41kD 세포벽 단백질이다. [Lindmark et al. (1983) J. Immunol. Meth. 62: 1-13]. 단백질 A가 고정되는 고체 상은 유리 또는 실리카 표면을 포함하는 컬럼, 더욱 바람직하게는 제어형(controlled) 다공성 유리 컬럼 또는 규산 컬럼일 수 있다. 일부 용도에서, 오염물의 비특이적 부착을 방지하도록 컬럼이 글리세롤과 같은 시약으로 코팅되었다.
정제의 첫번째 단계로서, 상기 기술된 바와 같은 세포 배양물로부터 유래된 제제를 단백질 A가 고정된 고체 상 위에 적용하여, 당해 항체가 단백질 A에 특이적으로 결합하도록 한다. 그후, 고체 상을 세정하여 고체 상에 비-특이적으로 결합된 오염물을 제거한다. 마지막으로, 당해 항체를 고체 상으로부터 용출에 의해 회수한다.
b. 진핵생물 숙주 세포를 사용한 항체 생성:
벡터 성분은 신호 서열, 복제 기원, 1가지 이상의 마커 유전자, 인핸서(enhancer) 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열 중 1가지 이상을 일반적으로 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
(i) 신호 서열 성분
진핵생물 숙주 세포에서 사용하기 위한 벡터는 당해 성숙형 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 신호 서열 또는 특정 연결 부위가 있는 기타 폴리펩티드를 또한 함유할 수 있다. 바람직하게 선택된 이종성 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식 및 프로세싱 (즉, 신호 펩티드분해효소에 의해 절단)되는 것이다. 포유류 세포 발현에서, 포유류 신호 서열뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어, 단순 헤르페스 gD 신호가 이용가능하다.
이같은 전구체 영역에 대한 DNA가 항체를 코딩하는 DNA에 리딩 프레임 내에서 결찰된다.
(ii) 복제 기원
일반적으로, 복제 기원 성분은 포유류 발현 벡터에 요구되지 않는다. 예를 들어, SV40 기원이 오직 초기 프로모터를 함유하기 때문에 전형적으로 사용될 수 있다.
(iii) 선별 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선별성 마커로 또한 명명되는 선별 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 기타 독소, 예를 들어, 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 저항성을 부여하거나, (b) 관련된 경우, 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 입수가능하지 않은 결정적인 영양소를 공급하는 단백질을 코딩한다.
선별 계획의 한 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종성 유전자로 성공적으로 형질전환된 세포들은 약물 저항성을 부여하는 단백질을 생산하고, 따라서 선별 계획에서 살아 남는다. 이같은 우성 선별의 예는 약물 네오마이신, 마이코페놀산 및 히그로마이신을 사용한다.
포유류 세포에 대한 적절한 선별성 마커의 또다른 예는 항체 핵산을 받아들이는데 적격인 세포의 확인을 가능하게 하는 것들, 예컨대 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 탈아미노효소, 오르니틴 탈카르복실효소 등이다.
예를 들어, DHFR 선별 유전자로 형질감염된 세포가 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 모든 형질전환체를 배양함으로써 처음으로 확인될 수 있다. 야생형 DHFR이 사용될 때의 적합한 숙주 세포에는, 예를 들어, DHFR 활성이 결핍된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (예를 들어, ATCC CRL-9096)가 포함된다.
별법적으로, 항체, 야생형 DHFR 단백질, 및 또다른 선별성 마커 예컨대 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스페라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질감염되거나 공동-형질감염된 숙주 세포 (특히 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)를 아미노글리코시드성 항생제, 예를 들어, 카나마이신, 네오마이신 또는 G418과 같은 선별성 마커에 대한 선별제를 함유하는 배지에서의 세포 성장에 의해 선별할 수 있다. 미국 특허 번호 4,965,199 참조.
(iv) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 숙주 생물에 의해 인식되고 항체 폴리펩티드 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 일반적으로 함유한다. 사실상 모든 진핵생물 유전자에는 전사가 개시되는 부위로부터 염기 약 25개 내지 30개 상류에 위치한 AT-풍부 영역이 있다. 다수의 유전자의 전사 시작부분으로부터 염기 70개 내지 80개 상류에서 발견된 또다른 서열은 CNCAAT 영역 [식중, N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있다] (서열 60)이다. 대부분의 진핵생물 유전자의 3' 말단에는 코딩 서열의 3' 말단에 대한 폴리A 꼬리의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열 (서열 61)이 있다. 모든 이러한 서열들이 진핵생물 발현 벡터 내로 적절하게 삽입된다.
포유류 숙주 세포에서의 벡터로부터의 항체 폴리펩티드 전사는, 예를 들어, 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)와 같은 바이러스의 게놈으로부터, 이종성 포유류 프로모터, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 또는 열-쇼크 프로모터로부터 수득된 프로모터에 의해 제어될 수 있고, 단, 이같은 프로모터들은 숙주 세포 시스템과 혼화성이다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터가 SV40 바이러스 복제 기원을 또한 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 사이토메갈로바이러스의 극초기 프로모터가 HindIII E 제한 단편으로 편리하게 수득된다. 소 유두종 바이러스를 벡터로 사용하여 포유류 숙주에서 DNA를 발현시키기 위한 시스템이 미국 특허 번호 4,419,446에 개시되어 있다. 이러한 시스템의 변형이 미국 특허 번호 4,601,978에 기술되어 있다. 별법적으로, 라우스(Rous) 육종 바이러스의 긴 말단 반복물이 프로모터로 사용될 수 있다.
(v) 인핸서 요소 성분
고급 진핵생물에 의한 본 발명의 항체 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사가 벡터 내로 인핸서 서열을 삽입함으로써 종종 증가될 수 있다. 다수의 인핸서 서열이 포유류 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질, 및 인슐린)로부터 현재 공지되어 있다. 그러나, 전형적으로, 진핵생물 세포 바이러스로부터의 인핸서가 사용될 것이다. 예로는 복제 기원의 후기 측면 상의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 후기 측면 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다. 진핵생물 프로모터의 활성화를 위한 인핸싱 요소에 대해 [Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)]를 또한 참조. 인핸서는 항체 폴리펩티드-코딩 서열에 대해 5' 또는 3'인 위치에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5'인 부위에 위치한다.
(vi) 전사 종결 성분
진핵생물 숙주 세포에서 사용된 발현 벡터는 전사의 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 또한 전형적으로 함유할 것이다. 이같은 서열은 진핵생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5', 및 때때로 3'의 비번역 영역으로부터 통상적으로 입수가능하다. 이러한 영역들은 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분 내에 폴리아데닐화 단편으로 전사된 뉴클레오티드 절편을 함유한다. 한 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO94/11026 및 이에 개시된 발현 벡터 참조.
(vii) 숙주 세포의 선별 및 형질전환
본원에서의 벡터 내의 DNA를 클로닝 또는 발현시키기 위한 적절한 숙주 세포는 척추동물 숙주 세포를 포함하는, 본원에 기술된 고급 진핵생물 세포를 포함한다. 배양 (조직 배양)에서의 척추동물 세포의 증식은 일상적인 절차가 되었다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (293 또는 현탁액 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 ([Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 세포주 (Hep G2)이다.
숙주 세포를 항체 생산을 위해 상기 기술된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고, 프로모터 유도, 형질전환체 선별 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자의 증폭에 적합하도록 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양한다.
(viii) 숙주 세포 배양
본 발명의 항체를 생산하는데 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 시판되는 배지 예컨대 햄(Ham) F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 둘베코(Dulbecco) 변형 이글(Eagle) 배지 ((DMEM), Sigma)가 숙주 세포를 배양하는데 적절하다. 또한, [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)], [Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980)], 미국 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re.30,985에 기술된 배지들 중 임의의 것을 숙주 세포에 대한 배양 배지로 사용할 수 있다. 임의의 이러한 배지에 필요하다면 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예컨대 HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대 GENTAMYCIN™ 약물), 미량원소 (마이크로몰 범위의 최종 농도로 일반적으로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지 공급원이 보충될 수 있다. 임의의 기타 필요한 보충물이 당업자에게 공지된 적합한 농도로 또한 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현에 선택된 숙주 세포와 종전에 사용된 조건들이고, 당업자에게 명백할 것이다.
(ix) 항체의 정제
재조합 기술을 사용할 때, 항체는 세포 내에서 생산될 수 있거나, 또는 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포 내에서 생산되는 경우, 첫번째 단계로서, 입자성 잔해물 (숙주 세포 또는 용해된 단편)이, 예를 들어, 원심분리 또는 초원심분리에 의해, 일반적으로 제거된다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 일반적으로 이같은 발현 시스템으로부터의 상청액을 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어, Amicon 또는 Millipore Pellicon® 초원심분리 유닛을 사용하여 먼저 농축한다. 프로테아제 억제제 예컨대 PMSF가 단백질용해를 억제하기 위해 임의의 상기 단계에 포함될 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제가 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물을, 예를 들어, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석, 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있고, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화성 리간드로서의 단백질 A와 같은 친화성 시약의 적절성은 항체 내에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소타입에 좌우된다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄를 기초로 하는 항체를 정제하는데 사용될 수 있다 ([Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)]). 단백질 G는 모든 마우스 이소타입 및 인간 γ3에 대해 권장된다 ([Guss et al., EMBO J. 5: 15671575 (1986)]). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 대부분 아가로스이지만, 기타 매트릭스가 이용가능하다. 기계적으로 안정적인 매트릭스 예컨대 제어형 다공성 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성될 수 있는 것에 비해 더 빠른 유속 및 더 짧은 프로세싱 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX™ 수지 (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ)가 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 기타 기술 예컨대 이온-교환 컬럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE™ 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예컨대 폴리아스파르트산 컬럼) 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전이 회수될 항체에 따라 또한 이용가능하다.
임의의 예비 정제 단계(들)에 이어서, 당해 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물에 약 2.5-4.5 사이의 pH에서 용출 완충제를 사용하는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피가 적용될 수 있고, 이는 바람직하게는 낮은 염 농도 (예를 들어, 약 0-0.25 M 염)에서 수행된다.
면역접합체
본 발명은 세포독성제 예컨대 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)에 접합된 임의의 본원에 기술된 항-DLL4 항체를 포함하는 면역접합체 ("항체-약물 접합체" 또는 "ADC"로 상호교환가능하게 명명됨)를 또한 제공한다.
암의 치료에서 세포독성제 또는 세포증식억제제, 즉 종양 세포를 사멸시키거나 억제하는 약물의 국소적 전달을 위해 항체-약물 접합체를 사용하는 것 ([Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614]; [Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172]; 미국 특허 4,975,278)은 종양에 대한 약물 모이어티의 표적화 전달 및 그곳에서의 세포내 축적을 허용하고, 반면에 접합되지 않은 이러한 약물 작용제의 전신 투여는 제거하려고 하는 종양 세포뿐만 아니라 정상 세포에 허용할 수 없는 수준의 독성을 초래할 수 있다 ([Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05]; [Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506]). 이에 의해 최소 독성으로의 최대 효율이 추구된다. 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 모두 이러한 전략에 유용한 것으로 보고되었다 ([Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87]). 이러한 방법에서 사용된 약물로는 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 및 빈데신이 포함된다 ([Rowland et al., (1986) 상기 문헌]). 항체-독소 접합체에 사용된 독소로는 박테리아 독소 예컨대 디프테리아 독소, 식물 독소 예컨대 리신, 소형 분자 독소 예컨대 젤다나마이신 ([Mandler et al (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581]; [Mandler et al (2000) Bioorganic ＆ Med. Chem. Letters 10:1025-1028]; [Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791]), 메이탄시노이드 (EP 1391213; [Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623]), 및 칼리키아마이신 ([Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928]; [Hinman et al (1993) Cancer Res. 53:3336- 3342])이 포함된다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합, 또는 토포이소머라제 억제가 포함되는 메커니즘에 의해 이들의 세포독성 및 세포증식억제 효과를 달성할 수 있다. 일부 세포독성 약물은 대형 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 접합되었을 때 불활성이거나 덜 활성인 경향이 있다.
ZEVALIN® (이브리튜모맵 티욱세탄, Biogen/Idec)은 정상 및 악성 B 림프구의 표면 상에서 발견되는 CD20 항원에 대해 지시된 뮤린 IgG1 카파 모노클로날 항체, 및 티오우레아 링커-킬레이터에 의해 결합된 111In 또는 90Y 방사성동위원소로 구성된 항체-방사성동위원소 접합체이다 ([Wiseman et al (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77]; [Wiseman et al (2002) Blood 99(12):4336-42]; [Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63]; [Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69]). ZEVALIN에 B-세포 비-호지킨(non-Hodgkin) 림프종 (NHL)에 대한 활성이 있긴 하지만, 대부분의 환자에서는 투여로 심각한 장기간의 혈구감소증이 초래된다. 칼리키아마이신에 연결된 huCD33 항체로 구성된 항체-약물 접합체인 MYLOTARG™ (젬투주맵 오조가마이신, Wyeth Pharmaceuticals)은 주사에 의한 급성 골수성 백혈병의 치료에 대해 2000년에 승인되었다 ([Drugs of the Future (2000) 25(7):686]; 미국 특허 번호 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). 디술피드 링커 SPP를 통해 메이탄시노이드 약물 모이어티 DM1에 연결된 huC242 항체로 구성된 항체-약물 접합체인 칸투주맵 메르탄신 (Immunogen, Inc.)은 CanAg를 발현하는 암, 예컨대 결장, 췌장, 위장 및 기타 암의 치료에 대한 제III상 시험으로 진행되고 있다. 메이탄시노이드 약물 모이어티 DM1에 연결된 항-전립선 특이적 막 항원 (PSMA) 모노클로날 항체로 구성된 항체-약물 접합체인 MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologies, Immunogen Inc.)는 전립선 종양의 잠재적인 치료에 대해 개발 중이다. 오리스타틴 펩티드인 오리스타틴 E (AE) 및 모노메틸오리스타틴 (MMAE) (돌라스타틴의 합성 유사체)이 키메라 모노클로날 항체 cBR96 (암종 상의 루이스(Lewis) Y에 특이적) 및 cAC10 (혈액학적 악성종양 상의 CD30에 특이적)에 접합되었고 ([Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784]), 치료용으로 개발 중이다.
면역접합체의 생성에 유용한 화학요법제가 본원에 (예를 들어, 상기에) 기술되어 있다. 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 이의 단편으로는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 포함된다. 예를 들어, WO 93/21232 (1993년 10월 28일 공개) 참조. 다양한 방사성핵종이 방사성접합된(radioconjugated) 항체의 생산에 이용가능하다. 예로는 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 및 186Re가 포함된다. 다양한 이관능성 단백질 커플링제 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오르 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 항체와 세포독성제의 접합체를 만들 수 있다. 예를 들어, [Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987)]에 기술된 바와 같이 리신 면역독소를 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 대표적인 킬레이트화제이다. WO 94/11026 참조.
1가지 이상의 소형 분자 독소, 예컨대 칼리키아마이신, 메이탄시노이드, 돌라스타틴, 오로스타틴, 트리코테센 및 CC1065 및 독소 활성이 있는 이러한 독소들의 유도체와 항체의 접합체 또한 본원에서 구현된다.
i. 메이탄신 및 메이탄시노이드
일부 실시양태에서, 면역접합체는 하나 이상의 메이탄시노이드 분자에 접합된 본 발명의 항체 (전장 또는 단편)를 포함한다.
메이탄시노이드는 튜불린 중합을 억제함으로써 작용하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카 관목 마이테누스 세라타(Maytenus serrata)에서 최초로 단리되었다 (미국 특허 번호 3,896,111). 이어서, 특정 미생물이 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르를 또한 생산한다는 것이 발견되었다 (미국 특허 번호 4,151,042). 합성 메이탄시놀 및 이의 유도체 및 유사체가, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; 및 4,371,533에 개시되어 있다.
메이탄시노이드 약물 모이어티는 (i) 발효 또는 발효 생성물의 화학적 변형, 유도체화에 의해 비교적 제조하기가 쉽고, (ii) 비-디술피드 링커를 통한 항체에의 접합에 적절한 관능기로 유도체화될 수 있으며, (iii) 혈장에서 안정적이고, (iv) 다양한 종양 세포주에 대해 효과적이기 때문에 항체 약물 접합체에서 매력적인 약물 모이어티이다.
메이탄시노이드를 함유하는 면역접합체, 이의 제조 방법, 및 이의 치료 용도가, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1에 개시되어 있고, 이들의 개시내용은 거명에 의해 본원에 명백하게 포함된다. [Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)]에는 인간 결장직장암에 대해 지시된 모노클로날 항체 C242에 연결된 DM1으로 명명된 메이탄시노이드를 포함하는 면역접합체가 기술되어 있다. 이 접합체는 배양된 결장암 세포에 대해 고도로 세포독성인 것으로 발견되었고, 생체내 종양 성장 분석법에서 항종양 활성을 나타냈다. [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]에는 인간 결장암 세포주 상의 항원에 결합하는 뮤린 항체 A7 또는 HER-2/neu 종양유전자에 결합하는 또다른 뮤린 모노클로날 항체 TA.1에 메이탄시노이드가 디술피드 링커를 통해 접합된 면역접합체가 기술되어 있다. TA.1-메이탄시노이드 접합체의 세포독성을 세포 당 3×105 개의 HER-2 표면 항원을 발현하는 인간 유방암 세포주 SK-BR-3 상에서 시험관내 테스트하였다. 약물 접합체는 유리 메이탄시노이드 약물과 유사한 정도의 세포독성을 달성하였고, 이는 항체 분자 당 메이탄시노이드 분자의 수를 증가시킴으로써 증가될 수 있었다. A7-메이탄시노이드 접합체는 마우스에서 낮은 전신 세포독성을 나타냈다.
항체 또는 메이탄시노이드 분자의 생물학적 활성을 현저하게 감소시키지 않으면서 항체를 메이탄시노이드 분자에 화학적으로 연결시킴으로써 항체-메이탄시노이드 접합체가 제조될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,208,020 (이의 개시내용은 거명에 의해 본원에 명백하게 포함됨) 참조. 항체 분자 당 평균 3-4개의 메이탄시노이드 분자가 접합되는 것이 항체의 기능 또는 용해도에 음성적으로 영향을 미치지 않으면서 표적 세포의 세포독성을 증강시키는 것에서 효율을 나타냈지만, 1개의 독소 분자/항체도 네이키드(naked) 항체를 사용하는 것에 비해 세포독성을 증강시킬 것으로 예상되었다. 메이탄시노이드는 당업계에 주지되어 있고, 공지된 기술에 의해 합성할 수 있거나 또는 천연 공급원으로부터 단리할 수 있다. 적절한 메이탄시노이드가, 예를 들어, 미국 특허 5,208,020 및 상기 언급된 기타 특허 및 비-특허 간행물들에 개시되어 있다. 바람직한 메이탄시노이드는 메이탄시놀, 및 방향족 고리에서 또는 메이탄시놀 분자의 기타 위치에서 변형된 메이탄시놀 유사체, 예컨대 다양한 메이탄시놀 에스테르이다.
미국 특허 5,208,020 또는 EP 특허 0 425 235 B1, [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)], 및 미국 특허 출원 번호 10/960,602 (2004년 10월 8일 출원) (이들의 개시내용은 거명에 의해 본원에 명백하게 포함됨)에 기술된 것들을 예를 들어 포함하여, 항체-메이탄시노이드 접합체의 제조를 위한 다수의 연결기가 당업계에 공지되어 있다. 링커 성분 SMCC를 포함하는 항체-메이탄시노이드 접합체가 미국 특허 출원 번호 10/960,602 (2004년 10월 8일 출원)에 개시된 바와 같이 제조될 수 있다. 연결기로는 상기 언급된 특허에 개시된 바와 같은 디술피드 기, 티오에테르 기, 산-불안정 기, 광-불안정 기, 펩티다제-불안정 기, 또는 에스테라제-불안정 기가 포함되고, 디술피드 및 티오에테르 기가 바람직하다. 추가적인 연결기가 본원에서 기술되고 예시된다.
다양한 이관능성 단백질 커플링제 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오르 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 항체와 메이탄시노이드의 접합체를 제조할 수 있다. 특히 바람직한 커플링제로는 디술피드 연결을 제공하는 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP) 및 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP) ([Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 [1978]])가 포함된다.
링커는, 연결 유형에 따라, 다양한 위치에서 메이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들어, 통상적인 커플링 기술을 사용하여 히드록실 기와의 반응에 의해 에스테르 연결이 형성될 수 있다. 반응은 히드록실 기가 있는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록실 기로 변형된 C-15 위치, 및 히드록실 기가 있는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 연결은 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.
ii. 오리스타틴 및 돌라스타틴
일부 실시양태에서, 면역접합체는 돌라스타틴 또는 돌라스타틴 펩티드 유사체 및 유도체인 오리스타틴 (미국 특허 번호 5635483; 5780588)에 접합된 본 발명의 항체를 포함한다. 돌라스타틴 및 오리스타틴은 미세관 역학, GTP 가수분해, 및 핵 및 세포 분할을 방해하는 것으로 나타났고 ([Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584]), 항암 (미국 5663149) 및 항진균 활성 ([Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965])이 있다. 돌라스타틴 또는 오리스타틴 약물 모이어티는 펩티드성 약물 모이어티의 N (아미노) 말단 또는 C (카르복실) 말단을 통해 항체에 부착될 수 있다 (WO 02/088172).
대표적인 오리스타틴 실시양태에는 발명의 영문 명칭이 "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"인 US 일련 번호 10/983,340 (2004년 11월 5일 출원)에 개시된 N-말단 연결 모노메틸오리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF가 포함되고, 상기 특허의 개시 내용은 전체적으로 거명에 의해 명백하게 포함된다.
전형적으로, 펩티드를 기재로 하는 약물 모이어티는 2개 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 간에 펩티드 결합을 형성시킴으로써 제조될 수 있다. 이같은 펩티드 결합은, 예를 들어, 펩티드 화학 분야에 주지된 액체 상 합성 방법 ([E. Schroeder and K. Luebke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press] 참조)에 따라 제조될 수 있다. 오리스타틴/돌라스타틴 약물 모이어티는 US 5,635,483; US 5,780,588; [Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465]; [Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277]; [Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725]; 및 [Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863]의 방법에 따라 제조될 수 있다. 또한 [Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784]; 발명의 영문 명칭이 "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"인 US 일련 번호 10/983,340 (2004년 11월 5일 출원)를 또한 참조하고, 이들은 전체적으로 거명에 의해 포함된다 (예를 들어, 링커에 접합된 MMAE 및 MMAF와 같은 모노메틸발린 화합물의 제조 방법 및 링커가 개시됨).
iii. 칼리키아마이신
또다른 실시양태들에서, 면역접합체는 하나 이상의 칼리키아마이신 분자에 접합된 본 발명의 항체를 포함한다. 칼리키아마이신 패밀리의 항생제는 피코몰 이하의 농도에서 이중-가닥 DNA 파손을 일으킬 수 있다. 칼리키아마이신 패밀리의 접합체의 제조를 위해서는, 미국 특허 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (모두 American Cyanamid Company) 참조. 사용될 수 있는 칼리키아마이신의 구조적 유사체로는 γ1 I, α2 I, α3 I, N-아세틸-γ1 I, PSAG 및 θI 1이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다 ([Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993)], [Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998)] 및 상기 언급된 American Cyanamid의 미국 특허들). 항체가 접합될 수 있는 또다른 항-종양 약물은 항-폴레이트제(antifolate)인 QFA이다. 칼리키아마이신과 QFA 모두 세포내 작용 부위를 갖고, 형질 막을 쉽게 통과하지 않는다. 따라서, 항체에 의해 매개된 내재화를 통한 이러한 작용제들의 세포성 흡수는 이들의 세포독성 효과를 크게 증강시킨다.
iv. 기타 세포독성제
본 발명의 항체에 접합될 수 있는 기타 항종양제로는 BCNU, 스트렙토조이신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 미국 특허 5,053,394, 5,770,710에 기술된 LL-E33288 복합체로 총체적으로 공지된 작용제 패밀리, 뿐만 아니라 에스페라마이신 (미국 특허 5,877,296)이 포함된다.
사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 이의 단편에는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 아에루기노사 유래), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 포함된다. 예를 들어, WO 93/21232 (1993년 10월 28일 공개) 참조.
본 발명에서 뉴클레오라이틱(nucleolytic) 활성이 있는 화합물 (예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제 예컨대 데옥시리보뉴클레아제; DNase)과 항체 간에 형성된 면역접합체가 추가로 구현된다.
종양의 선택적인 파괴를 위해, 항체는 고도로 방사성인 원자를 포함할 수 있다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성접합된 항체의 생산에 이용가능하다. 예로는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다. 접합체가 검출용으로 사용되는 경우, 이는 섬광조영술 연구용 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화 (MRI)로 또한 공지됨)를 위한 스핀 표지, 예컨대 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
방사성- 또는 기타 표지가 공지된 방식으로 접합체에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 수소 대신 불소-19를 예를 들어 수반하는 적절한 아미노산 전구체를 사용하여 펩티드가 생합성되거나 화학적 아미노산 합성에 의해 합성될 수 있다. tc99m 또는 I123, Re186, Re188 및 In111과 같은 표지는 펩티드 내의 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 이트륨-90은 라이신 잔기를 통해 부착될 수 있다. IODOGEN 방법 ([Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57])을 사용하여 요오드-123을 혼입시킬 수 있다. ["Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)]에 기타 방법들이 상세하게 기술되어 있다.
다양한 이관능성 단백질 커플링제 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오르 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 항체와 세포독성제의 접합체를 만들 수 있다. 예를 들어, [Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987)]에 기술된 바와 같이 리신 면역독소를 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성뉴클레오디드를 항체에 접합시키기 위한 대표적인 킬레이트화제이다. WO 94/11026 참조. 링커는 세포 내에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광-불안정 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 ([Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 번호 5,208,020)를 사용할 수 있다.
본 발명의 화합물은 시판 (예를 들어, Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL., U.S.A)로부터 시판)되는 하기의 가교제 시약으로 제조된 ADC를 명백하게 구현하지만, 이에 한정되지 않는다: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트). [2003-2004 Applications Handbook and Catalog, pp 467-498] 참조.
v. 항체-약물 접합체의 제조
본 발명의 항체-약물 접합체 (ADC)에서, 항체 (Ab)는 항체 당 1개 이상의 약물 모이어티 (D), 예를 들어 약 1개 내지 약 20개의 약물 모이어티에 링커 (L)을 통해 접합된다. 화학식 I의 ADC는, (1) 항체의 친핵성(nucleophilic) 기와 이가 링커 시약이 반응하여 공유 결합을 통해 Ab-L이 형성된 후, 약물 모이어티 D와 반응하는 것; 및 (2) 약물 모이어티의 친핵성 기가 이가 링커 시약과 반응하여 공유 결합을 통해 D-L이 형성된 후, 항체의 친핵성 기와 반응하는 것을 포함하여, 당업자에게 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 사용하여, 여러가지 경로에 의해 제조될 수 있다. ADC를 제조하는 추가적인 방법이 본원에 기술된다.
Ab-(L-D)p
링커는 하나 이상의 링커 성분으로 구성될 수 있다. 대표적인 링커 성분으로는 6-말레이미도카프로일 ("MC"), 말레이미도프로파노일 ("MP"), 발린-시트룰린 ("val-cit"), 알라닌-페닐알라닌 ("ala-phe"), p-아미노벤질옥시카르보닐 ("PAB"), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트 ("SPP"), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1 카르복실레이트 ("SMCC"), 및 N-숙신이미딜 (4-요오도아세틸) 아미노벤조에이트 ("SIAB")가 포함된다. 추가적인 링커 성분이 당업계에 공지 되어 있고, 일부는 본원에 기술된다. 발명의 영문 명칭이 "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"인 US 일련 번호 10/983,340 (2004년 11월 5일 출원)를 또한 참조하고, 이의 내용은 전체적으로 거명에 의해 본원에 포함된다.
일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 대표적인 아미노산 링커 성분에는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드 또는 펜타펩티드가 포함된다. 대표적인 디펩티드에는 발린-시트룰린 (vc 또는 val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (af 또는 ala-phe)이 포함된다. 대표적인 트리펩티드에는 글리신-발린-시트룰린 (gly-val-cit) 및 글리신-글리신-글리신 (gly-gly-gly)이 포함된다. 아미노산 링커 성분을 이루는 아미노산 잔기에는 천연 발생 아미노산, 뿐만 아니라 소수 아미노산 및 비-천연 발생 아미노산 유사체, 예를 들어 시트룰린이 포함된다. 아미노산 링커 성분은 특정 효소, 예를 들어 종양-관련 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소 절단을 위해 디자인되고, 선택성이 최적화될 수 있다.
항체 상의 친핵성 기로는 (i) N-말단 아민 기, (ii) 측쇄 아민 기, 예를 들어 라이신, (iii) 측쇄 티올 기, 예를 들어 시스테인, 및 (iv) 항체가 글리코실화된 경우 당 히드록실 또는 아미노 기가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 아민, 티올 및 히드록실 기는 친핵성이고, (i) 활성 에스테르 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트, 및 산 할로겐화물; (ii) 알킬 및 벤질 할로겐화물 예컨대 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드 기가 포 함되는 링커 시약 및 링커 모이어티 상의 친전자성 기와 공유 결합을 형성하도록 반응할 수 있다. 특정 항체에는 환원성 사슬간 디술피드, 즉 시스테인 다리가 있다. 항체는 DTT (디티오트레이톨)와 같은 환원제로의 처리에 의해 링커 시약과의 접합에 반응성이도록 될 수 있다. 따라서 각각의 시스테인 다리는, 이론적으로, 2개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. 아민이 티올로 전환되는 라이신과 2-이미노티올란 (트라우트(Traut) 시약)의 반응을 통해 추가적인 친핵성 기가 항체 내로 도입될 수 있다. 반응성 티올기는 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 그 이상의 시스테인 잔기를 도입함으로써 (예를 들어, 하나 이상의 비-천연 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 돌연변이체 항체를 제조함으로써) 항체 (또는 이의 단편) 내로 도입될 수 있다.
본 발명의 항체-약물 접합체는 친전자성 모이어티를 도입하는 항체의 변형에 의해 또한 생산될 수 있고, 이 모이어티는 링커 시약 또는 약물 상의 친핵성 치환체와 반응할 수 있다. 글리코실화된 항체의 당이, 예를 들어 페리오데이트 산화 시약으로 산화되어, 링커 시약 또는 약물 모어어티의 아민 기와 반응할 수 있는 알데히드 또는 케톤 기를 형성할 수 있다. 생성된 이민 쉬프(Schiff) 염기 기는 안정적인 연결을 형성할 수 있거나, 또는, 예를 들어 보로히드리드 시약에 의해, 환원되어 안정적인 아민 연결을 형성할 수 있다. 한 실시양태에서, 글리코실화된 항체의 탄수화물 부분과 갈락토스 산화효소 또는 소듐 메타-페리오데이트의 반응으로 약물 상의 적절한 기와 반응할 수 있는 단백질 내의 카르보닐 (알데히드 및 케톤) 기가 산출될 수 있다 ([Hermanson, Bioconiugate Techniques]). 또다른 실시양태 에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유하는 단백질이 소듐 메타-페리오데이트와 반응하여, 제1아미노산 대신 알데히드의 생산이 초래될 수 있다 ([Geoghegan ＆ Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146]; US 5362852). 이같은 알데히드는 약물 모이어티 또는 링커 친핵체와 반응할 수 있다.
또한, 약물 모이어티 상의 친핵성 기로는 (i) 활성 에스테르 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트, 및 산 할로겐화물; (ii) 알킬 및 벤질 할로겐화물 예컨대 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드 기가 포함되는 링커 시약 및 링커 모이어티 상의 친전자성 기와 공유 결합을 형성하도록 반응할 수 있는 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드 기가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
별법적으로, 예를 들어, 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해, 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질을 만들 수 있다. DNA의 구간은 서로 인접한 또는 접합체의 원하는 성질을 파괴하지 않는 링커 펩티드를 코딩하는 영역에 의해 분리된 접합체의 두 부분을 코딩하는 각각의 영역을 포함할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 종양 예비-표적화에서 사용하기 위해 항체가 "수용체" (예컨대 스트렙타비딘)에 접합될 수 있고, 이때 항체-수용체 접합체가 환자에게 투여된 후, 결합되지 않은 접합체는 혈액순환으로부터 소거제를 사용하여 제거되고, 이어서 세포독성제 (예를 들어 방사성뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)가 투여된다.
제약 제형
수용액, 동결 건조 제형 또는 기타 건조 제형의 형태로, 원하는 정도의 순도를 갖는 항체를 임의의 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제 ([Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)])와 혼합함으로써 본 발명의 항체를 포함하는 치료용 제형이 보관용으로 제조된다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 포스페이트, 시트레이트, 히스티딘 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌이 포함되는 항산화제; 방부제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀, 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기)의 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린이 포함되는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이트화제 예컨대 EDTA; 당 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 카운터 이온 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
본원에서의 제형은 치료될 특정 적응증에 필요하다면 1가지를 초과하는 활성 화합물, 바람직하게는 서로에게 역효과를 일으키지 않는 보완적인 활성을 갖는 것 들을 또한 함유할 수 있다. 이같은 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합되어 적절하게 존재한다.
활성 성분은 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 예를 들어 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀션, 나노입자 및 나노캡슐) 내에, 또는 마크로에멀션 내에 포획될 수 있다. 이같은 기술은 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)]에 개시되어 있다.
생체내 투여에 사용될 제형은 반드시 무균성이어야 한다. 이는 무균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 수행된다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적절한 예로는 본 발명의 면역글로불린을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 히드로젤 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산과 γ-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 예컨대 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동안 분자가 방출될 수 있도록 하는 한편, 특정 히드로젤은 단백질을 더 짧은 기간 동안 방출한다. 캡슐화된 면역글로불린이 신체 내에 장기간 동안 유지될 때, 37℃의 수분에 노출된 결과로 변성되거나 응집하여, 생물학적 활성의 손실 및 면역원성에서의 가능한 변화가 초래될 수 있다. 수반되는 메커니즘에 따라 안정화를 위해 합리적인 전략이 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메커니즘이 티오-디술피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 발견되면, 안정화는 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량의 제어, 적합한 첨가제의 사용, 및 특정 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 달성될 수 있다.
용도
본 발명의 항체는, 예를 들어, 시험관내, 생체외 및 생체내 치료 방법에서 사용될 수 있다.
한 양상에서, 본 발명은 증가된 DLL4의 발현 및/또는 활성과 관련된 종양, 암 및/또는 세포 증식성 장애를 치료 또는 예방하는 방법으로, 이같은 치료를 필요로 하는 대상에게 유효량의 항-DLL4 항체를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 종양 또는 암의 성장을 감소시키거나, 억제하거나, 차단하거나 또는 방지하는 방법으로, 이같은 치료를 필요로 하는 대상에게 유효량의 항-DLL4 항체를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 종양, 암 및/또는 세포 증식성 장애를 치료하는 방 법으로, 이같은 치료를 필요로 하는 대상에게 유효량의 항-DLL4 항체를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 혈관생성을 억제하는 방법으로, 이같은 치료를 필요로 하는 대상에게 유효량의 항-DLL4 항체를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 혈관생성과 관련된 병리학적 용태를 치료하는 방법으로, 이같은 치료를 필요로 하는 대상에게 유효량의 항-DLL4 항체를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 혈관생성과 관련된 병리학적 용태는 종양, 암 및/또는 세포 증식성 장애이다. 일부 실시양태에서, 혈관생성과 관련된 병리학적 용태는 안내 신생혈관 질환이다.
또한, 본 발명의 항체의 적어도 일부는 다른 종으로부터의 항원에 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는, 예를 들어, 항원을 함유하는 세포 배양물에서, 인간 대상에서, 또는 본 발명의 항체가 교차-반응하는 항원이 있는 기타 포유류 대상 (예를 들어 침팬지, 비비, 명주원숭이, 사이노몰거스 및 붉은털원숭이, 돼지 또는 마우스)에서, 특정 항원 활성에 결합하는데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 항원 활성이 억제되도록 항체를 항원과 접촉시킴으로써 항원 활성을 억제하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 항원은 인간 단백질 분자이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 대상 내의 항원이 결합되도록 본 발명의 항체를 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 증가된 항원 발현 및/또는 활성과 관련된 장애를 앓고 있는 대상 내의 항원을 결합시키는 방법에 사용될 수 있다. 바람 직하게는, 항원은 인간 단백질 분자이고, 대상은 인간 대상이다. 별법적으로, 대상은 본 발명의 항체가 결합하는 항원을 발현하는 포유동물일 수 있다. 또한 추가적으로, 대상은 (예를 들어 항원의 투여에 의해 또는 항원 트랜스진(transgene)의 발현에 의해) 항원이 도입된 포유동물일 수 있다. 본 발명의 항체는 치료 목적을 위해 인간 대상에게 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 수의학 목적을 위해 또는 인간 질환의 동물 모델로서, 면역글로불린이 교차-반응하는 항원을 발현하는 비-인간 포유동물 (예를 들어 영장류, 돼지 또는 마우스)에 투여될 수 있다. 후자와 관련하여, 이같은 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료 효능을 평가하는데 (예를 들어 투여량 및 투여의 경시적 과정을 테스트하는데) 유용할 수 있다.
본 발명의 항체는 하나 이상의 항원 분자의 발현 및/또는 활성과 관련된 질환, 장애 또는 용태의 치료, 억제, 진행 지연, 재발 예방/지연, 경감, 또는 예방에 사용될 수 있다.
대표적인 장애에는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병 또는 악성 림프구가 포함된다. 이같은 암의 더욱 특정한 예로는 편평세포 암 (예를 들어 상피 편평세포 암), 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 암종이 포함되는 폐암, 복막암, 간세포 암, 위장암이 포함되는 위암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 요로암, 간세포암, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암, 간암, 전립선 암, 외음부 암, 갑상선 암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 흑색종, 다발성 골수종 및 B-세포 림프종, 뇌, 뿐만 아니라 두경부 암, 및 관련된 전이가 포함된다. 일부 실시 양태에서, 암은 소세포 폐암, 신경모세포종, 흑색종, 유방 암종, 위암, 결장직장암 (CRC), 및 간세포 암종으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 암은 비-소세포 폐암, 결장직장암 및 유방 암종 (이러한 암들의 전이 형태 포함)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 세포독성제(들)와 접합된 항체를 포함하는 면역접합체가 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 면역접합체 및/또는 이것이 결합되는 항원이 세포에 의해 내재화되어, 면역접합체가 결합하는 표적 세포를 사멸시키는 것에서의 면역접합체의 치료 효능의 증가가 초래된다. 한 실시양태에서, 세포독성제는 표적 세포 내의 핵산을 표적으로 하거나 방해한다. 한 실시양태에서, 세포독성제는 미세관 중합을 표적으로 하거나 방해한다. 이같은 세포독성제의 예로는 임의의 본원에서 언급된 화학요법제들 (예컨대 메이탄시노이드, 오리스타틴, 돌라스타틴, 또는 칼리키아마이신), 방사성 동위원소, 또는 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제가 포함된다.
본 발명의 항체는 치료법에서 단독으로 또는 다른 조성물과 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 또다른 항체, 화학요법제(들) (화학요법제들의 칵테일 포함), 기타 세포독성제(들), 항-혈관생성 작용제(들), 사이토카인 및/또는 성장 억제제(들)와 공동-투여될 수 있다. 본 발명의 항체가 종양 성장을 억제하는 경우, 이를 종양 성장을 또한 억제하는 하나 이상의 다른 치료제(들), 예를 들어, VEGF에 대한 항체가 포함되는 항-VEGF 작용제와 조합하는 것이 특히 요망될 수 있다. 별법적으로, 또는 추가적으로, 환자에게 조합 방사선 치료법 (예를 들 어, 방사성 표지된 작용제, 예컨대 항체와의 외부 방사선 조사 또는 치료법)을 제공할 수 있다. 상기 언급된 이같은 조합 치료법은 조합 투여 (2가지 이상의 작용제가 동일한 또는 별개의 제형에 포함되는 경우), 및 개별 투여를 포함하며, 개별 투여의 경우 본 발명의 항체의 투여는 보조 요법 또는 요법들의 투여 전 및/또는 후에 일어날 수 있다.
조합 치료법
상기 지시된 바와 같이, 본 발명은 항-DLL4 항체가 또다른 치료법과 함께 투여되는 조합 치료법을 제공한다. 예를 들어, 항-DLL4 항체가 다양한 신생물성 또는 비-신생물성 용태를 치료하기 위해 항암 치료제 또는 항-신생혈관증식 치료제와 조합되어 사용된다. 한 실시양태에서, 신생물성 또는 비-신생물성 용태는 비정상적인 또는 원치않는 혈관생성과 관련된 병리학적 장애를 특징으로 한다. 항-DLL4 항체는 이러한 목적에 효과적인 또다른 작용제와 순차적으로, 또는 동일한 조성물 내에서 또는 별도의 조성물로서 조합되어 투여될 수 있다. 별법적으로, 또는 추가적으로, 다수의 DLL4 억제제들이 투여될 수 있다.
항-DLL4 항체는 동시에, 예를 들어, 단일 조성물로서, 또는 동일한 또는 상이한 투여 경로를 사용하는 둘 이상의 별개의 조성물로서 투여될 수 있다. 별법적으로 또는 추가적으로, 임의의 순서로 순차적으로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 둘 이상의 조성물 투여 사이에 수분 내지 수일에서 수주 내지 수개월까지 범위의 간격이 있을 수 있다. 예를 들어, 먼저 항암제를 투여한 후, DLL4 억제제를 투여할 수 있다. 그러나, 동시 투여, 또는 항-DLL4 항체를 먼저 투여하는 것 또한 구현된다.
항-DLL4 항체와 조합되어 투여되는 치료제의 유효량은 의사 또는 수의사의 재량일 수 있다. 치료될 용태의 최대 관리를 달성하도록 투여량 투여 및 조정이 이루어진다. 용량은 사용되는 치료제의 유형 및 치료되는 특정 환자와 같은 인자에 추가적으로 좌우될 것이다. 항암제의 적절한 투여량은 현재 사용되는 것이고, 항암제와 항-DLL4 항체의 조합 작용 (상승작용)으로 인해 낮아질 수 있다. 특정 실시양태에서, 억제제들의 조합은 단일 억제제의 효능을 강화시킨다. 용어 "강화시킨다"는 일반적인 또는 허가된 용량에서의 치료제의 효능에서의 개선을 지칭한다. 본원에서의 제약 조성물 섹션을 또한 참조한다.
전형적으로, 항-DLL4 항체 및 항암제는 동일하거나 유사한 질환에 적절하여, 종양 성장 또는 암 세포의 성장과 같은 병리학적 장애를 차단하거나 감소시킨다. 한 실시양태에서, 항암제는 항-혈관생성 작용제이다.
암과 관련된 항-혈관생성 치료법은 영양소를 제공하여 종양 성장을 지지하는데 요구되는 종양 혈관의 발달을 억제하는 것을 목표로 하는 암 치료 전략이다. 혈관생성이 원발성 종양 성장 및 전이 모두에서 수반되기 때문에, 본 발명이 제공하는 항-혈관생성 치료는 원발성 부위에서의 종양의 신생물성 성장을 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 2차 부위에서의 종양의 전이를 예방할 수 있고, 따라서 다른 치료제에 의한 종양의 공격을 허용한다.
본원에서, 예를 들어, 정의 섹션에서 열거된 것들, 및 [Carmeliet and Jain, Nature 407:249-257 (2000)]; [Ferrara et al., Nature Reviews:Drug Discovery, 3:391-400 (2004)]; 및 [Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)]에 의한 것들을 포함하여 다수의 항-혈관생성 작용제가 확인되었고, 당업계에 공지되어 있다. 또한, 미국 특허 출원 US20030055006 참조. 한 실시양태에서, 항-DLL4 항체는 가용성 VEGF 수용체 (예를 들어, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, 뉴로필린 (예를 들어, NRP1, NRP2)) 단편, VEGF 또는 VEGFR을 차단할 수 있는 앱타머(aptamer), 중화 항-VEGFR 항체, VEGFR 타이로신 키나제 (RTK)의 저분자량 억제제, VEGF에 대한 안티센스 전략, VEGF 또는 VEGF 수용체에 대한 리보자임, VEGF의 길항제 변이체; 및 이들의 임의의 조합물을 예를 들어 포함하지만 이에 한정되지 않는 항-VEGF 중화 항체 (또는 단편) 및/또는 또다른 VEGF 길항제 또는 VEGF 수용체 길항제와 조합되어 사용된다. 별법적으로, 또는 추가적으로, VEGF 길항제 및 기타 작용제에 더하여 둘 이상의 혈관생성 억제제가 임의로 환자에게 공동-투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 추가적인 치료제, 예를 들어, 항암제가 항-DLL4 항체, VEGF 길항제, 및 항-혈관생성 작용제와 조합되어 투여될 수 있다.
본 발명의 특정 양상에서, 항-DLL4 항체와의 조합 종양 치료법에 유용한 기타 치료제에는 또다른 암 치료법 (예를 들어, 수술, 방사선 치료 (예를 들어, 방사성 물질의 조사 또는 투여가 수반됨), 화학요법, 본원에서 열거되고 당업계에 공지된 항암제로의 치료, 또는 이의 조합)이 포함된다. 별법적으로, 또는 추가적으로, 동일한 또는 2개 이상의 상이한 본원에 개시된 항원에 결합하는 2개 이상의 항체가 환자에게 공동-투여될 수 있다. 때때로, 환자에게 하나 이상의 사이토카인을 또한 투여하는 것이 이로울 수 있다.
화학요법제
특정 양상에서, 본 발명은 암에 걸리기 쉽거나 암으로 진단된 환자에게 유효량의 DLL4 길항제 및/또는 혈관생성 억제제(들) 및 하나 이상의 화학요법제를 투여함으로써 종양 성장 또는 암 세포의 성장을 차단하거나 감소시키는 방법을 제공한다. 다양한 화학요법제가 본 발명의 조합 치료 방법에서 사용될 수 있다. 구현되는 화학요법제의 대표적이고 비-제한적인 목록이 본원에서 "정의" 섹션에서 제공된다.
당업자에게 이해될 바와 같이, 일반적으로 화학요법제의 적합한 용량은 화학요법제가 단독으로 또는 다른 화학요법제와 조합되어 투여되는 임상 치료법에서 이미 사용된 용량 정도일 것이다. 치료될 용태에 따라 투여량에서의 변동이 발생할 것이다. 치료를 관리하는 의사는 개별적인 대상에 대한 적합한 용량을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명은 재발성 종양 성장 또는 재발성 암 세포 성장을 억제하거나 방지하기 위한 방법 및 조성물을 또한 제공한다. 재발성 종양 성장 또는 재발성 암 세포 성장은 하나 이상의 현재 이용가능한 치료법 (예를 들어, 암 치료법, 예컨대 화학요법, 방사선 치료법, 수술, 호르몬 치료법 및/또는 생물학적 치료법/면역요법, 항-VEGF 항체 치료법, 특히 특정 암에 대한 표준 치료 요법)을 받고 있거나 이러한 치료법으로 처리된 환자에서, 이러한 치료법이 환자를 치료하는데 임상적으로 적절하지 않거나 환자가 이러한 치료법으로부터 더이상 어떠한 이로운 효과도 얻지 못해서, 환자가 추가적인 효과적인 치료법을 필요로 하는 용태를 기술하도록 사용된 다. 본원에서 사용된 상기 구절은 "비-응답성/불응성" 환자의 용태를 또한 지칭할 수 있고, 이는, 예를 들어, 치료법에 응답하지만 부작용을 겪는 환자, 저항성이 발달된 환자, 치료법에 응답하지 않는 환자, 치료법에 만족스럽게 응답하지 않는 환자 등을 기술한다. 다양한 실시양태에서, 암은 암 세포의 수가 유의하게 감소되지 않았거나, 증가되었거나, 또는 종양 크기가 유의하게 감소되지 않았거나, 증가되었거나, 또는 암 세포의 수 또는 크기에서 추가적으로 감소되지 못한 경우에 재발성 종양 성장 또는 재발성 암 세포 성장이다. 암 세포가 재발성 종양 성장 또는 재발성 암 세포 성장인지를 결정하는 것은, 이같은 정황에서의 "재발성" 또는 "불응성" 또는 "비-응답성"의 당업계에서 허용되는 의미를 사용하여, 암 세포에 대한 치료의 유효성을 평가하기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생체내에서 또는 시험관내에서 이루어질 수 있다. 항-VEGF 치료에 저항성인 종양은 재발성 종양 성장의 예이다.
본 발명은 대상에서 재발성 종양 성장 또는 재발성 암 세포 성장을 차단하거나 감소시키기 위해 하나 이상의 항-DLL4 항체를 투여함으로써 대상에서 재발성 종양 성장 또는 재발성 암 세포 성장을 차단하거나 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 길항제는 암 치료제 이후에 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-DLL4 항체는 암 치료법과 동시에 투여된다. 별법적으로, 또는 추가적으로, 항-DLL4 항체 치료법이 또다른 암 치료법과 교대될 수 있고, 이는 임의의 순서로 수행될 수 있다. 본 발명은 암에 걸리기 쉬운 환자에서 암의 발병 또는 재발을 예방하기 위해 하나 이상의 억제성 항체를 투여하는 방법을 또한 포함한다. 일반적 으로, 대상은 암 치료법을 겪었거나, 동시에 겪고 있는 중이다. 한 실시양태에서, 암 치료법은 항-혈관생성 작용제, 예를 들어, VEGF 길항제로의 치료이다. 항-혈관생성 작용제로는 당업계에 공지된 것, 및 본원의 정의 섹션에서 확인되는 것들이 포함된다. 한 실시양태에서, 항-혈관생성 작용제는 항-VEGF 중화 항체 또는 단편 (예를 들어, AVASTIN® (Genentech, South San Francisco, CA) 또는 LUCENTIS® (Genentech, South San Francisco, CA)), Y0317, M4, G6, B20, 2C3 등)이다. 예를 들어, 미국 특허 6,582,959, 6,884,879, 6,703,020; WO98/45332; WO 96/30046; WO94/10202; EP 0666868B1; 미국 특허 출원 20030206899, 20030190317, 20030203409, 및 20050112126; [Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)]; 및 WO2005012359 참조. 추가적인 작용제가 재발성 종양 성장 또는 재발성 암 세포 성장을 차단하거나 감소시키기 위하여 VEGF 길항제 및 항-DLL4 항체와 조합되어 투여될 수 있고, 예를 들어, 본원의 조합 치료법이라는 제목 하의 섹션을 참조한다.
본 발명의 항체 (및 보조 치료제)는 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비내, 및 원한다면 국소 치료용의 병변내 또는 유리체내 투여를 포함하는 임의의 적절한 수단에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 항체는 펄스 주입에 의해, 특히 항체의 용량을 감쇠시키면서, 적절하게 투여될 수 있다. 투여가 단기간인지 또는 장기간인지 여부에 부분적으로 의존적으로, 임의의 적절한 경로, 예를 들어, 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의해 투약이 이루어질 수 있다.
본 발명의 항체 조성물은 우수한 의료 업무와 일치하는 방식으로 제형, 조제 및 투여될 것이다. 이러한 정황에서 고려되는 인자는 치료될 특정 장애, 치료될 특정 포유동물, 개별적인 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료인에게 공지된 기타 인자를 포함한다. 항체는 반드시 그럴 필요는 없지만, 임의로 당해 장애를 예방하거나 치료하는데 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제형된다. 이같은 기타 작용제의 유효량은 제형 내에 존재하는 본 발명의 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 기타 상기 논의된 인자에 좌우된다. 일반적으로 이들은 본원에서 상기 기술된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 지금까지 사용된 투여량의 약 1 내지 99 ％로 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적합한 투여량 (단독으로 또는 화학요법제와 같은 기타 작용제와 조합되어 사용될 경우)은 치료될 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 치료법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 응답, 및 주치의의 재량에 의존할 것이다. 항체는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들어, 1회 이상의 별도의 투여에 의한 것이든 또는 연속 주입에 의한 것이든, 약 1 ㎍/㎏ 내지 15 ㎎/㎏ (예를 들어 0.1 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏)의 항체가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 한 전형적인 일일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 ㎍/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 이상의 범위일 수 있다. 수 일 이상에 걸친 반복 투여를 위해, 용태에 따라, 치료는 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 일반적으로 지속될 것이 다. 한 대표적인 항체 투여량은 약 0.05 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏ 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 ㎎/㎏, 2.0 ㎎/㎏, 4.0 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏ (또는 이의 임의의 조합) 중 1가지 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이같은 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다 (예를 들어, 약 2 내지 20회, 예를 들어 약 6회 용량의 항체가 환자에게 제공되도록). 초기의 높은 로딩 용량에 이어서 1회 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 대표적인 용량 처방계획은 약 4 ㎎/㎏의 초기 로딩 용량에 이어서 약 2 ㎎/㎏의 항체를 매주 유지 용량으로 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 또다른 투여량 처방계획이 유용할 수 있다. 이러한 치료법의 진행은 통상적인 기술 및 분석법에 의해 쉽게 모니터링된다.
본 발명의 항-DLL4 항체는 특정 세포 또는 조직에서 DLL4 발현을 검출하는 분석법 (예컨대 진단용 또는 예후용 분석법)에서 유용하고, 이때 항체는 하기 기술된 바와 같이 표지되고/되거나 불용성 매트릭스 상에 고정된다.
또다른 양상에서, 본 발명은 샘플 내의 DLL4-항-DLL4 항체 복합체를 검출하는 것을 포함하는 DLL4의 검출 방법을 제공한다. 본원에서 사용된 용어 "검출"은 대조군과 비교하는 또는 대조군과 비교하지 않는 정성적 및/또는 정량적 검출 (수준 측정)을 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 DLL4 발현 및/또는 활성과 관련된 장애가 있거나 이러한 장애가 있는 것으로 추측되는 환자로부터의 생물학적 샘플 내의 DLL4-항-DLL4 항체 복합체를 검출하는 것을 포함하는 DLL4 발현 및/또는 활성과 관련된 장애를 진단하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, DLL4 발현은 증가된 발현 또 는 비정상적인 (원치 않는) 발현이다. 일부 실시양태에서, 상기 장애는 종양, 암, 및/또는 세포 증식성 장애이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 검출가능한 표지를 포함하는 임의의 본원에 기술된 항-DLL4 항체를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 임의의 본원에 기술된 항-DLL4 항체와 DLL4의 복합체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 복합체는 생체내에 또는 시험관내에 존재한다. 일부 실시양태에서, 상기 복합체는 암 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-DLL4 항체는 검출가능하게 표지된다.
항-DLL4 항체는 다수의 주지된 검출 분석 방법 중 임의의 것에서 DLL4의 검출에 사용될 수 있다. 예를 들어, 원하는 공급원으로부터 샘플을 수득하고, 샘플을 항-DLL4 항체와 혼합하여 항체가 혼합물 내에 존재하는 임의의 DLL4와 항체/DLL4 복합체를 형성하도록 하고, 혼합물 내에 존재하는 임의의 항체/DLL4 복합체를 검출함으로써 생물학적 샘플을 DLL4에 대해 분석할 수 있다. 특정 샘플에 적절한 당업계에 공지된 방법에 의해 분석법을 위해 생물학적 샘플을 제조할 수 있다. 샘플을 항체와 부가혼합하는 방법 및 항체/DLL4 복합체를 검출하는 방법은 사용된 분석법의 유형에 따라 선택된다. 이같은 분석법에는 면역조직화학, 경쟁적 및 샌드위치 분석법, 및 입체적 억제 분석법이 포함된다.
DLL4에 대한 분석 방법은 모두 하기 시약들 중 하나 이상을 사용한다: 표지된 DLL4 유사체, 고정된 DLL4 유사체, 표지된 항-DLL4 항체, 고정된 항-DLL4 항체 및 입체적 접합체. 표지된 시약은 "트레이서(tracer)"로 또한 알려져 있다.
사용된 표지는 DLL4와 항-DLL4 항체의 결합을 방해하지 않는 임의의 검출가능한 관능기이다. 면역분석법에서의 사용에 대해 수많은 표지가 공지되어 있고, 예로는 직접적으로 검출될 수 있는 모이어티, 예컨대 플루오로크롬, 화학발광제 및 방사성 표지, 뿐만 아니라 반응 또는 유도체화되어야 검출되는 모이어티, 예컨대 효소가 포함된다. 이같은 표지의 예로는 하기의 것들이 포함된다:
사용된 표지는 DLL4와 항-DLL4 항체의 결합을 방해하지 않는 임의의 검출가능한 관능기이다. 면역분석법에서의 사용에 대해 수많은 표지가 공지되어 있고, 예로는 직접적으로 검출될 수 있는 모이어티, 예컨대 플루오로크롬, 화학발광제 및 방사성 표지, 뿐만 아니라 반응 또는 유도체화되어야 검출되는 모이어티, 예컨대 효소가 포함된다. 이같은 표지의 예로는 하기의 것들이 포함된다: 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플로오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루세리퍼라제, 예를 들어, 개똥벌레 루시페라제 및 박테리아 루시페라제 (미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 양고추냉이 과산화효소 (HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 당류 산화효소, 예를 들어, 글루코스 산화효소, 갈락토스 산화효소 및 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소, 과산화수소를 사용하여 HRP와 같은 염료 전구체를 산화시키는 효소와 커플링된 헤테로고리형 산화효소 예컨대 요산분해효소 및 잔틴 산화효소, 락토퍼옥시다제 또는 마이크로퍼옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정적인 유 리 라디칼 등.
이러한 표지를 단백질 또는 폴리펩티드에 공유 결합시키는데 통상적인 방법이 이용가능하다. 예를 들어, 커플링제 예컨대 디알데히드, 카르보디이미드, 디말레이미드, 비스-이미데이트, 비스-디아조화 벤지딘 등을 사용하여 항체에 상기 기술된 형광성, 화학발광성 및 효소 표지로 태그를 붙일 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 3,940,475 (형광측정법) 및 3,645,090 (효소); [Hunter et al., Nature, 144: 945 (1962)]; [David et al., Biochemistry, 13: 1014-1021 (1974)]; [Pain et al., J. Immunol. Methods, 40: 219-230 (1981)]; 및 [Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407-412 (1982)] 참조. 본원에서 바람직한 표지는 양고추냉이 과산화효소 및 알칼리성 포스파타제와 같은 효소이다. 효소가 포함되는 이같은 표지를 항체에 접합시키는 것은 면역분석법 기술의 당업자에게 표준 조작 절차이다. 예를 들어, [O'Sullivan et al., "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay", Methods in Enzymology, ed. J.J. Langone and H. Van Vunakis, Vol. 73 (Academic Press, New York, New York, 1981), pp. 147-166] 참조.
특정 분석 방법에서는 시약의 고정이 요구된다. 고정은 용액에 유리 상태로 남아 있는 임의의 DLL4로부터 항-DLL4 항체를 분리시킨다. 통상적으로 이는 분석 절차 전에 항-DLL4 항체 또는 DLL4 유사체를 불용화시킴으로써, 예컨대 수불용성 매트릭스 또는 표면에의 흡착 (Bennich 등, US 3,720,760)에 의해, 공유결합 커플링 (예를 들어, 글루타르알데히드 가교를 사용함)에 의해, 또는 나중에 항-DLL4 항 체 또는 DLL4 유사체를 불용화시킴으로써, 예를 들어, 면역침전에 의해 달성된다.
샘플 내의 단백질의 발현을 면역조직화학 및 염색 프로토콜을 사용하여 시험할 수 있다. 조직 절편의 면역조직화학적 염색은 신뢰할 수 있는, 샘플 내의 단백질의 존재를 평가 또는 검출하는 방법인 것으로 판명되었다. 면역조직화학 ("IHC") 기술은, 일반적으로 발색 또는 형광 방법에 의해, 항체를 사용하여 계내에서 세포성 항원을 프로빙(probing) 및 가시화한다. 샘플 제조를 위해, 포유동물 (전형적으로 인간 환자)로부터의 조직 또는 세포 샘플을 사용할 수 있다. 샘플의 예로는 암 세포 예컨대 결장암 세포, 유방암 세포, 전립선암 세포, 난소암 세포, 폐암 세포, 위암 세포, 췌장암 세포, 림프종 세포, 및 백혈병 세포가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 샘플은 수술에 의한 절제, 흡인 또는 생검을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 다양한 절차에 의해 수득될 수 있다. 조직은 신선하거나 냉동될 수 있다. 한 실시양태에서, 샘플은 고정되어 파라핀 등에 매립된다. 조직 샘플은 통상적인 방법에 의해 고정 (즉, 보존)될 수 있다. 당업자는 샘플이 조직학적으로 염색되거나 다른 방식으로 분석되는 목적에 의해 고정제가 선택된다는 것을 이해할 것이다. 당업자는 고정 길이가 조직 샘플의 크기 및 사용된 고정제에 좌우된다는 것을 또한 이해할 것이다.
IHC는 형태학적 염색 및/또는 형광 계내 혼성화와 같은 추가적인 기술과 조합되어 수행될 수 있다. 2가지의 일반적인 IHC 방법이 이용가능하다; 직접 및 간접 분석법. 첫번째 분석법에 따르면, 표적 항원 (예를 들어, DLL4)에 대한 항체의 결합이 직접적으로 결정된다. 이러한 직접 분석법은 추가적인 항체 상호작용 없이 가시화될 수 있는 표지된 시약, 예컨대 형광 태그 또는 효소-표지된 1차 항체를 이용한다. 전형적인 간접 분석법에서는, 접합되지 않은 1차 항체가 항원에 결합한 후, 표지된 2차 항체가 1차 항체에 결합한다. 2차 항체가 효소 표지에 접합된 경우, 발색 또는 형광 기질이 첨가되어 항원의 가시화를 제공한다. 여러 2차 항체가 1차 항체 상의 상이한 에피토프들과 반응할 수 있기 때문에 신호 증폭이 발생한다.
면역조직화학에 사용되는 1차 및/또는 2차 항체는 전형적으로 검출가능한 모이어티로 표지될 것이다. 다수의 표지가 이용가능하고, 이들은 일반적으로 하기의 카테고리로 분류될 수 있다:
상기 논의된 샘플 제조 절차 이외에, IHC 전, 동안 또는 후에 조직 절편의 추가적인 처리가 요구될 수 있다. 예를 들어, 에피토프 복구 방법, 예컨대 시트레이트 완충제에서 조직 샘플을 가열하는 것이 수행될 수 있다 (예를 들어, [Leong et al., Appl. Immunohistochem. 4(3):201 (1996)] 참조).
임의의 차단 단계 후에, 조직 절편은 1차 항체가 조직 샘플 내의 표적 단백질 항원에 결합하도록 적절한 조건 하에 충분한 시간 동안 1차 항체에 노출된다. 이를 달성하기에 적합한 조건은 일상적인 실험에 의해 결정할 수 있다. 항체가 샘플에 결합하는 정도는 상기 논의된 검출가능한 표지 중 임의의 하나를 사용하여 결정된다. 바람직하게는, 표지는 발색성 기질 예컨대 3,3'-디아미노벤지딘 발색원의 화학적 변형을 촉매하는 효소 표지 (예를 들어 HRPO)이다. 바람직하게는, 효소 표지는 1차 항체에 특이적으로 결합하는 항체에 접합된다 (예를 들어 1차 항체는 토끼 폴리클로날 항체이고, 2차 항체는 염소 항-토끼 항체이다).
이렇게 제조된 표본을 마운팅(mounting)하여 커버를 덮을 수 있다. 이어서, 예를 들어 현미경을 사용하여, 슬라이드 평가를 결정하고, 당업계에서 일상적으로 사용되는 염색 강도 기준을 사용할 수 있다. 염색 강도 기준은 하기와 같이 평가될 수 있다.
염색 패턴 점수
세포에서 염색이 관찰되지 않음 0
희미한/거의 감지할 수 없는 염색이 10％를 초과하는 세포에서 검출됨 1+
약한 수준 내지 중등도의 염색이 10％를 초과하는 세포에서 관찰됨 2+
중등도 내지 강한 염색이 10％를 초과하는 세포에서 관찰됨 3+
전형적으로, IHC 분석법에서 약 2+ 이상의 염색 패턴 점수가 진단성 및/또는 예후성이다. 일부 실시양태에서, 약 1+ 이상의 염색 패턴 점수가 진단성 및/또는 예후성이다. 또다른 실시양태에서, 약 3 이상의 염색 패턴 점수가 진단성 및/또는 예후성이다. IHC를 사용하여 종양 또는 결장 샘종으로부터의 세포 및/또는 조직을 시험하는 경우, 일반적으로 염색이 (샘플 내에 존재할 수 있는 간질 조직 또는 주변 조직과 대조적으로) 종양 세포 및/또는 조직 내에서 결정 또는 평가되는 것으로 이해된다.
경쟁 또는 샌드위치 분석법으로 알려진 또다른 분석 방법이 상업적인 진단 산업에서 잘 확립되어 광범위하게 사용된다.
경쟁 분석법은 제한된 수의 항-DLL4 항체 항원-결합 부위에 대해 테스트 샘플 DLL4와 경쟁하는 트레이서 DLL4 유사체의 능력에 의존한다. 일반적으로 항-DLL4 항체를 경쟁 전 또는 후에 불용화시킨 후, 항-DLL4 항체에 결합된 트레이서 및 DLL4를 결합되지 않은 트레이서 및 DLL4로부터 분리시킨다. 이러한 분리는 따라내기 (결합 파트너가 미리 불용화된 경우) 또는 원심분리 (결합 파트너가 경쟁 반응 후에 침전된 경우)에 의해 달성된다. 테스트 샘플 DLL4의 양은 마커 물질의 양에 의해 측정되는 결합된 트레이서의 양에 반비례한다. 기지량의 DLL4로 용량-응답 곡선을 만들고, 이를 테스트 결과와 비교하여, 테스트 샘플 내에 존재하는 DLL4의 양을 정량적으로 결정한다. 검출가능한 마커로서 효소를 사용하는 경우, 이러한 분석법은 ELISA 시스템으로 칭해진다.
"균질" 분석법으로 칭해지는 또다른 종류의 경쟁 분석법은 상 분리를 필요로 하지 않는다. 이러한 분석법에서, 항-DLL4 항체가 DLL4에 결합하는 경우 항-DLL4 항체의 존재가 효소 활성을 변형시키도록 효소와 DLL4의 접합체가 제조되어 사용된다. 이러한 경우, DLL4 또는 이의 면역학적으로 활성인 단편은 2관능성 유기 다리로 과산화효소와 같은 효소에 접합된다. 항-DLL4 항체의 결합이 표지의 효소 활성을 억제하거나 강화하도록, 항-DLL4 항체와의 사용에 대해 접합체가 선택된다. 이러한 방법 자체는 EMIT라는 명칭 하에 광범위하게 실행된다.
입체적 접합체가 균질 분석법을 위한 입체 장애 방법에서 사용된다. 이러한 접합체는 저분자량 합텐을 소형 DLL4 단편에 공유 결합시킴으로써 합성되어, 실질적으로 합텐에 대한 항체가 항-DLL4 항체와 동시에 접합체에 결합할 수 없게 된다. 이러한 분석 절차 하에, 테스트 샘플 내에 존재하는 DLL4가 항-DLL4 항체에 결합함으로써, 항-합텐이 접합체에 결합되도록 하고, 그 결과 접합체 합텐의 특성에서의 변화, 예를 들어, 합텐이 형광단인 경우 형광에서의 변화가 초래된다.
특히 샌드위치 분석법이 DLL4 또는 항-DLL4 항체의 결정에 유용하다. 순차적 샌드위치 분석법에서는, 고정된 항-DLL4 항체를 사용하여 테스트 샘플 DLL4를 흡착시키고, 테스트 샘플을 세척으로 제거하고, 결합된 DLL4를 사용하여 표지된 2차 항-DLL4 항체를 흡착시킨 후, 결합된 물질을 잔류 트레이서로부터 분리한다. 결합된 트레이서의 양은 테스트 샘플 DLL4에 직접적으로 비례한다. "동시" 샌드위치 분석법에서는, 표지된 항-DLL4를 첨가하기 전에 테스트 샘플을 분리하지 않는다. 한 항체로서 항-DLL4 모노클로날 항체를 사용하고 또다른 항체로서 폴리클로날 항-DLL4 항체를 사용하는 순차적 샌드위치 분석법이 DLL4에 대해 샘플을 테스트하는데 유용하다.
상기 기재된 것들은 DLL4에 대한 단지 대표적인 검출 분석법이다. DLL4의 결정을 위해 항-DLL4 항체를 사용하는 현재의 또는 미래에 개발되는 기타 방법이 본원의 범주 내에 포함되고, 여기에는 본원에 기술된 생체분석법이 포함된다.
제조품
본 발명의 또다른 양상에서, 상기 기술된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조품이 제공된다. 제조품은 용기, 및 용기 상에 있는 또는 용기와 조합된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적절한 용기로는, 예를 들어, 병, 바이알(vial), 주사기 등이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로부터 형성될 수 있다. 용기는 혼자서 또는 또다른 조성물과 조합되었을 때 용태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 조성물을 보유하며, 멸균 접근 포트(port)를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하주사 바늘이 관통가능한 마개가 있는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 1가지 이상의 활성 작용제는 본 발명의 항체이다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 용태 예컨대 암을 치료하는데 사용된다는 것을 가리킨다. 또한, 제조품은 (a) 본 발명의 항체를 포함하는 조성물이 내부에 함유된 제1 용기; 및 (b) 항-VEGF 항체 (예를 들어, 베바시주맵)가 예를 들어 포함되는 화학요법제 또는 항-혈관생성 작용제가 예를 들어 포함되는 추가적인 치료제를 포함하는 조성물이 내부에 함유된 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 실시양태에서의 제조품은 제1 항체 조성물 및 제2 항체 조성물이 특정 용태, 예를 들어 암을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 가리키는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 별법적으로, 또는 추가적으로, 제조품은 제약상 허용가능한 완충제, 예컨대 주사용 정균수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제조품은 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여, 상업용 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 물질을 추가로 포함할 수 있다.
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기 제공된 일반적인 설명 하에 다양한 기타 실시양태들이 실행될 수 있는 것으로 이해된다.
실시예에서 언급된 시판되는 시약은 달리 지시되지 않는 한 제조업자의 지침서에 따라 사용되었다. 하기의 실시예에서, 그리고 명세서 전반에 걸쳐 ATCC® 접속 번호에 의해 확인되는 세포의 공급원은 <American Type Culture Collection (Manassas, VA 20108)>이다. 실시예에서 인용된 참고문헌이 실시예에 이어서 열거된다. 본원에서 인용된 모든 참고문헌은 거명에 의해 본원에 포함된다.
실시예 1: 재료 및 방법
하기의 재료 및 방법이 실시예에서 사용되었다.
HUVEC 피브린 젤 비드 분석법. HUVEC 피브린 젤 비드 분석법의 상세사항이 기술되어 있다 ([Nakatsu, M. N. et al. Microvasc Res 66, 102-12 (2003)]). 간략하게, Cytodex™ 3 비드 (Amersham Pharmacia Biotech)를 비드 당 350-400개의 HUVEC로 코팅하였다. 약 200개의 HUVEC-코팅 비드를 12-웰 조직 배양 플레이트의 한 웰 내의 피브린 응고물 내에 매립하였다. 8×104개의 SF 세포를 응고물의 상부에 플레이팅하였다. 면역염색 및 영상화를 위해 제7일 내지 제9일 사이에 분석법을 종결하였다. 일부 실험에서, 비오틴-항-CD31 (클론 WM59, eBioscience) 및 스트렙티비딘-Cy3으로의 염색에 의해 HUVEC 싹을 가시화하였다. HUVEC 핵 염색을 위해, 피브린 젤을 하룻밤 동안 2％ 파라포름알데히드 (PFA)에서 고정시키고, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI, Sigma)로 염색하였다. Ki67 염색을 위해, 피브린 젤을 10× 트립신-EDTA로 5분 동안 처리하여 최상층 SF를 제거하고, PBS 내의 10％ FBS로 중화하고, 하룻밤 동안 4％ PFA에서 고정시켰다. 그후, 피브린 젤을 PBST 내의 10％ 염소 혈청으로 4시간 동안 차단하고, 하룻밤 동안 토끼 항-마우스 Ki67 (즉석 사용품, 클론 Sp6, LabVision)과 함께 하룻밤 동안 인큐베이션한 후, 항-토끼 IgG-Cy3 (Jackson ImmunoResearch)으로의 2차 검출이 이어졌다. 모든 하룻밤 동안의 인큐베이션은 4℃에서 수행되었다.
신생 마우스 망막 연구. 같은 한배새끼들로부터의 신생 CD1 마우스에게 P1 및 P3에 PBS 또는 YW26.82 (10 ㎎/㎏)를 복강내 주사하였다. P5에 눈을 수집하고, PBS 내의 4％ PFA로 하룻밤 동안 고정시켰다. 절개된 망막을 PBST 내의 10％ 염소 혈청으로 3시간 동안 차단한 후, 하룻밤 동안 1차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 1차 칵테일은 PBLEC (PBS (pH 6.8) 내의 1％ Triton X-100, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM MnCl2) 내의 10％ 혈청과 함께, 비오틴화 이소렉틴 B4 (25 ㎍/㎖, 반데이라에아 심플리시폴리아(Bandeiraea simplicifolia); Sigma), 및 하기의 것들 중 하나를 포함하였다: 토끼 항-마우스 Ki67 (1:1, 즉석 사용품, 클론 Sp6, Lab Vision), 또는 마우스 Cy3-접합 항-알파 SMA (1:2000, Sigma-Aldrich). 그후, 망막을 PBST에서 세정하고, 하룻밤 동안 Alexa Fluor® 488 스트렙타비딘 (1:200; Molecular Probes) 및 Cy3-항-토끼 IgG (1:200; Jackson ImmunoResearch)의 2차 항체 배합물과 함께 인큐베이션하였다. 염색을 완료한 후, 망막을 PBS 내의 4％ PFA로 후-고정시켰다. 모든 하룻밤 동안의 인큐베이션은 4℃에서 수행되었다. 편평하게 마운팅된 망막의 영상을 공초점 형광 현미경검사법에 의해 포착하였다.
종양 모델. 8 내지 10주령의 베이지색 암컷 누드 마우스를 사용하였다. 피하 종양을 수득하기 위해, 마우스에게 50％ 매트리젤(matrigel) (BD Bioscience)을 함유하는 세포 현탁액 0.1 ㎖를 오른쪽 뒤쪽 옆구리 내로 주사하였다. 5×106개 의 인간 결장암 HM7 세포, 10×106개의 인간 결장 암종 Colo205 세포, 10×106개의 인간 폐 암종 Calu6 세포, 10×106개의 인간 폐 암종 MV-522 세포, 10×106개의 마우스 백혈병 WEHI-3 세포, 10×106개의 마우스 림프종 EL4 세포, 10×106개의 인간 난소암 SK-OV-3 X1 세포, 10×106개의 마우스 폐암 LL2 세포, 10×106개의 백혈병/림프종 EL4 세포, 또는 10×106개의 비-소세포 폐암 H1299 세포를 각각의 마우스에게 주사하였다. 인간 흑색종 MDA-MB-435 모델에 대해, 마우스에게 유방 지방 패드 내로 50％ 매트리젤을 함유하는 세포 현탁액 (5×106개) 0.1 ㎖를 주사하였다. 항-DLL4 항체 YW26.82를 복강내 투여하였다 (체중 1 ㎏ 당 10 ㎎, 일주일에 2회). 하기의 종양 모델들에 대해서는, 각각의 테스트 마우스에게 피하 종양 단편 (1 ㎣)을 오른쪽 옆구리에 이식하였다: 비-소세포 폐암 SKMES-1, 인간 유방암 MX-1, 인간 결장직장암 SW620 및 인간 선암종 LS174T. 종양 성장을 캘리퍼스 측정에 의해 정량하였다. 길이 (l) 및 폭 (w)을 측정하고 부피 (V = lw2/2)를 계산함으로써 종양 부피 (㎣)를 결정하였다. 10 내지 15마리의 동물이 각 군에 포함되었다. 치료 군의 통계학적 비교를 양쪽꼬리 스튜던트(Student) t-테스트를 사용하여 수행하였다.
종양 혈관 표지 및 면역조직화학. 마우스를 이소플루란으로 마취시켰다. FITC-표지 리코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum) 렉틴 (150 ㎕의 0.9％ NaCl 내의 150 ㎍; Vector Laboratories)을 정맥내 주사하고, 전신 관류 전에 5 분 동안 순환되도록 하였다. 혈관구조에 PBS 내의 1％ PFA를 3분 동안 경심(transcardial) 관류시켰다. 종양을 제거하고, 동일한 고정제에서의 2시간 동안의 함침에 의해 후고정시키고, 이어서 동해방지를 위해 30％ 수크로스에서 하룻밤 동안 인큐베이션한 후, OCT에 매립하였다. 절편 (4 ㎛ 두께)을 항-마우스 CD31 (1:50, BD Pharmingen)에 이어서 Alexa 594 염소 항-래트 IgG (1:800, Molecular Probes)로 염색하였다.
마우스 장의 종양학 및 면역조직화학. 포르말린에 고정되고 파라핀에 매립된 마우스 소장 조직을 3 ㎛ 두께로 절편화하였다. 제조업자 (PolyScientific)가 권고한 바와 같이 알시안(Alcian) 블루로 장 세포 유형을 조직화학적으로 확인하였다. 항-Ki67 염색을 위해, 절편을 Target Retrieval Solution (S1700, DAKO)으로 예비처리하고, 토끼 항-Ki67 (1:200, 클론 SP6, Neomarkers)와 함께 인큐베이션하였다. 7.5 g/㎖의 2차 염소 항-토끼 (Vector labs)를 Vectastain ABC Elite Kit (Vector labs)로 검출하였다. 모든 Ki67로 염색된 절편을 Mayer의 헤마토자일린으로 대조염색하였다. HES-1 염색을 위해, 항-래트 HES-1 (클론 NM1, MBL, International)에 이어서 TSA-HRP를 사용하였다.
RNA 간섭. 인간 DLL4를 표적으로 하는 SMARTpool 소형 간섭 RNA (siRNA) 듀플렉스 및 Si Control Non-Target siRNA #2를 Dharmacon으로부터 구입하였다. OptiMEM-1® 및 Lipfectamine™ 2000 (Invitrogen)을 사용하여 40％ 전면성장에서 HUVEC을 siRNR 듀플렉스 (50 nM)로 형질감염시켰다. FACS 분석을 siRNA 형질감염 48시간 후에 수행하였다. 4가지 항-DLL4 SMART 풀 siRNA는 하기와 같았다:
CAACTGCCCTTATGGCTTTTT (서열 62) (올리고 1, 센스),
AAAGCCATAAGGGCAGTTGTT (서열 63) (올리고 1, 안티센스),
CAACTGCCCTTCAATTTCATT (서열 64) (올리고 2, 센스),
TGAAATTGAAGGGCAGTTGTT (서열 65) (올리고 2, 안티센스),
TGACCAAGATCTCAACTACTT (서열 66) (올리고 3, 센스),
GTAGTTGAGATCTTGGTCATT (서열 67) (올리고 3, 안티센스),
GGCCAACTATGCTTGTGAATT (서열 68) (올리고 4, 센스),
TTCACAAGCATAGTTGGCCTT (서열 69) (올리고 4, 안티센스).
노치 리간드 : 노치 차단 ELISA. 96-웰 미량역가 플레이트를 0.5 ㎍/㎖의 재조합 래트 노치1-Fc (rr노치1-Fc, R＆D Systems)로 코팅하였다. DLL4-AP (인간 태반 알칼리성 포스파타제에 융합된 DLL4의 아미노산 1-404)를 함유하는 조건화 배지를 분석법에서 사용하였다. 조건화 배지를 제조하기 위해, 293 세포를 Fugen6 시약 (Roche Molecular Biochemicals)으로 DLL4-AP를 발현하는 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염 5일 후, 조건화 배지를 수확하고, 여과하여, 4℃에서 보관하였다. 0.15에서 25 ㎍/㎖로 적정된 정제된 항체를 코팅된 rr노치1-Fc에 대한 50％ 최대 달성가능한 결합을 제공하는 희석도의 DLL4-AP 조건화 배지와 함께 1시간 동안 실온에서 예비-인큐베이션하였다. 이어서, 항체/DLL4-AP 혼합물을 rr노치1-Fc가 코팅된 플레이트에 1시간 동안 실온에서 첨가한 후, 플레이트를 PBS에서 여러번 세정하였다. 결합된 DLL4-AP를 기질로서의 1-Step PNPP (Pierce) 및 OD 405 nm 흡광도 측정을 사용하여 검출하였다. 동일한 분석법을 DLL1-AP (인 간 DLL1, 아미노산 1-445)으로 수행하였다. 유사한 분석법을 정제된 DLL4-His (C-말단 His-태그 부착 인간 DLL4, 아미노산 1-404) 및 Jag1-His (R＆ D system)로 수행하였다. 결합된 His-태그 부착 리간드를 마우스 항-His mAb (1 ㎍/㎖, Roche Molecular Biochemicals), 비오틴화 염소-항-마우스 (Jackson ImmunoResearch) 및 스트렙타비딘-AP (Jackson ImmunoResearch)로 검출하였다.
RNA 추출 및 정량적 실시간 RT-PCR. 제조업자의 지침에 따라 RNeasy® Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 2-D 배양물 내의 HUVEC으로부터 전체 RNA를 추출하였다. 피브린 젤에서 성장하고 있는 HUVEC으로부터 전체 RNA를 추출하기 위해, 피브린 젤을 10× 트립신-EDTA (Gibco)로 5분 동안 처리하여 최상층의 섬유모세포를 제거하고, 이어서 PBS 내의 10％ FBS로 중화시켰다. 그후, 젤 응고물을 조직 배양 웰로부터 제거하고, 마이크로튜브에서 원심분리하여 (5분 동안 10K), 과도한 유체를 제거하였다. 생성된 젤 "펠렛"을 용해 완충제 (RNeasy® Mini Kit)로 용해시키고, 2-D 배양물 내의 HUVEC와 같이 추가로 프로세싱하였다. RNA의 품질을 RNA 6000 Nano Chip 및 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies)를 사용하여 평가하였다. 정량적 실시간 RT-PCR 반응을 삼중으로 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems)을 사용하여 수행하였다. 인간 GAPDH를 표준화를 위한 기준 유전자로 사용하였다. 발현 수준은 3회의 별도의 결정으로부터의 대조군에 관한 평균 (±SEM) mRNA 변화 (배수)로 표현된다. VEGFR2, TGFβ2 및 GAPDH에 대한 전방향 및 역방향 프라이머 및 프로브 서열은 하기와 같았다.
TGFb2
전방향: GTA AAG TCT TGC AAA TGC AGC TA (서열 70)
역방향: CAT CAT CAT TAT CAT CAT CAT TGT C (서열 71)
프로브: AAT TCT TGG AAA AGT GGC AAG ACC AAA AT (서열 72)
VEGFR2
전방향: CTT TCC ACC AGC AGG AAG TAG (서열 73)
역방향: TGC AGT CCG AGG TCC TTT (서열 74)
프로브: CGC ATT TGA TTT TCA TTT CGA CAA CAG A (서열 75)
GAPDH
전방향: GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC (서열 76)
역방향: GAA GGT GAA GGT CGG AGT C (서열 77)
프로브: CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC (서열 78)
실시예 2: 항-DLL4 항체의 생성
중쇄 및 경쇄의 상보성-결정 영역 (CDR) 내에 다양성을 도입함으로써 단일 프레임워크 (인간화 항-ErbB2 항체, 4D5) 상에 합성 파지 항체 라이브러리를 건설하였다 ([Lee, C. V. et al. J Mol Biol 340, 1073-93 (2004)]; [Liang, W. C. et al. J Biol Chem 281, 951-61 (2006)]). MaxiSorp™ 면역플레이트 상에 고정된 His-태그부착 인간 DLL4 (아미노산 1-404)에 대해 나이브 라이브러리로의 플레이트 패닝을 수행하였다. 4 라운드의 강화 후, 클론을 무작위로 집어서, 파지 ELISA를 사용하여 특정 결합제를 확인하였다. 생성된 hDLL4 결합 클론을 His-태그부착 뮤린 DLL4 단백질로 추가로 스크리닝하여 종-교차 클론을 확인하였다. 각각의 양성 파지 클론에 대해, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 전장 IgG 사슬을 발현하도록 조작된 pRK 발현 벡터 내로 서브클로닝하였다. 중쇄 및 경쇄 구축물을 293 또는 CHO 세포 내로 공동-형질감염시키고, 발현된 항체를 무혈청 배지로부터 단백질 A 친화성 컬럼을 사용하여 정제하였다. 정제된 항체를 DLL4와 래트 노치1-Fc 간의 상호작용을 차단하는 것에 대해 ELISA에 의해, 그리고 전장 인간 DLL4 또는 뮤린 DLL4를 발현하는 안정적인 세포주에의 결합에 대해 FACS에 의해 테스트하였다. 친화력 돌연변이를 위해, 당해 초기 클론으로부터 유래된 CDR 루프 (CDR-L3, -H1, 및 -H2)의 3가지 상이한 조합이 있는 파지 라이브러리를 소프트 무작위화 전략에 의해 구축하여, 각각의 선택된 위치가 약 50:50 빈도로 비-야생형 잔기로 돌연변이되거나 야생형으로 유지되도록 하였다 ([Liang et al., 2006, 상기 문헌]). 그후, 엄격도를 점진적으로 증가시키면서 인간 및 뮤린 모두의 His-태그 부착 DLL4 단백질에 대한 4 라운드의 용액 상 패닝을 통해 높은 친화력의 클론을 확인하였다.
실시예 3: 항-DLL4 항체의 특성화
항-DLL4 Mab의 결합 친화력을 결정하기 위해, BIAcore™ 3000을 이용한 표면 플라즈몬 공명 (SRP) 측정을 사용하였다 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ). 간략하게, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIAcore Inc.)을 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 공급자의 지침에 따라 활성화시켰다. 항-DLL4 항체를 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)으로 5 ㎍/㎖로 희석한 후, 5 ㎕/분의 유속으로 주입하여 약 500 응답 단위 (RU)의 커플링된 항체를 달성하였다. 이어서, 1M 에탄올아민을 주 입하여 미반응 기를 차단하였다. 동역학 측정을 위해, 인간 또는 뮤린 DLL4-His 분자의 2배 계단 희석물 (0.7 nM 내지 500 nM)을 25℃에서 25 ㎕/분의 유속으로 0.05％ Tween™ 20 함유 PBS에 주입하였다. 단순 일-대-일 랭뮤어 결합 모델 (BIAcore Evaluation Software 버전 3.2)을 이용하여 회합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 계산하였다. 평형 해리 상수 (Kd)를 koff/kon의 비율로서 계산하였다. 이러한 실험의 결과가 표 3에 제시된다. 항체 YW26.82는 인간 및 뮤린 DLL4에 대해 유사한 Kd 값을 나타내어 (각각 0.15 nM 및 0.09 nM의 Kd), 마우스 모델에서의 평가를 가능하게 하였다.
Figure 112008090840519-PCT00004
실시예 4: 항- DLL4 항체의 추가적인 특성화
항-DLL4 Mab YW26.82의 에피토프 지도작성: 항-DLL4 Mab 26.82는 인간 DLL4 세포외 도메인 (ECD)의 EGF-유사 반복 번호 2 (EGL2)에 존재하는 결합 결정인자를 인식하였다. EGL2는 인간 DLL4 ECD의 아미노산 252-282를 포함한다. 간략하게, DLL4 ECD 돌연변이체가 알칼리성 포스파타제 융합 단백질로서 발현되었고, 항체에 대한 결합이 평가되었다. 도 11a는 C-말단 인간 태반 알칼리성 포스파타제 (AP) 융합 단백질로서 발현된 DLL4 돌연변이체들의 셋트의 개략도를 도시한다. 괄호는 융합 단백질 내에 포함된 DLL4 서열을 가리킨다. 융합 단백질을 함유하는 293T 세포 조건화 배지를 정제된 항-DLL4 Mab (YW26.82, 0.5 ㎍/㎖)로 코팅된 96-웰 미량역가 플레이트 상에서 테스트하였다. 결합된 DLL4.AP를 기질로서의 1-Step PNPP (Pierce) 및 OD 405 nm 흡광도 측정을 사용하여 검출하였다. Mab YW26.82는 DLL4 EGL2 도메인을 포함하는 구축물에 결합하였고, DLL4 EGL2 도메인이 없는 구축물에 결합하지 않았다. 이는 항-DLL4 Mab YW 26.82가 인간 DLL4 ECD의 EGL2 도메인 내의 에피토프를 인식하였다는 것을 증명하였다.
Mab YW26.82는 마우스 및 인간 DLL4에 선택적으로 결합한다. 96-웰 Nunc Maxisorp 플레이트를 지시된 바와 같은 정제된 재조합 단백질 (1 ㎍/㎖)로 코팅하였다. 지시된 농도에서의 YW26.82의 결합을 ELISA 분석법에 의해 측정하였다. 결합된 항체를 기질로서의 TMB 및 OD 450 nm 흡광도 측정을 사용하여 항-인간 항체 HRP 접합체로 검출하였다. 항-HER2 및 재조합 ErbB2-ECD를 분석 대조군으로 사용하였다 (도 11b). 이러한 실험의 결과가 도 11b에 제시된다. Mab YW26.82는 인간 및 마우스 DLL4에 결합하였고, 인간 DLL1 및 인간 JAG1에 검출가능하게 결합하지 않았다. 이러한 결과는 Mab YW26.82가 DLL4에 선택적으로 결합한다는 것을 증명하였다.
벡터, 전장 DLL4, Jag1 또는 DLL1으로 일시적으로 형질감염된 293 세포의 FACS 분석 또한 Mab YW26.82가 DLL4에 선택적으로 결합하였음을 증명하였다. 도 11c에 나타난 바와 같이, YW26.82의 현저한 결합은 DLL4로 형질감염된 세포 (상부 패널)에서만 검출되었다. DLL1 또는 Jag1으로 형질감염된 세포에서는 현저한 결합이 검출되지 않았다. Jag1 및 DLL1의 발현은 각각 재조합 래트 노치1-Fc (rr노치1-Fc, 중간 패널) 및 재조합 래트 노치2-Fc (rr노치2-Fc, 하부 패널)의 결합에 의해 확인되었다. YW26.82, rr노치1-Fc 또는 rr노치2-Fc (R＆ D system)이 2 ㎍/㎖로 사용된 후, 염소 항-인간 IgG-PE (1:500, Jackson ImmunoResearch)가 이어졌다.
경쟁 실험은 Mab YW26.82가 노치와 DLL4의 상호작용을 효과적으로 및 선택적으로 차단하였지만, 다른 노치 리간드와의 상호작용은 차단하지 않았음을 증명하였다. 도 11d에 나타난 바와 같이, 항-DLL4 Mab는 코팅된 r노치1에 대한 DLL4-AP의 결합을 차단하였지만, DLL1-AP의 결합은 차단하지 않았고, 이때 계산된 IC50은 약 12 nM이었다 (상부 패널). 항-DLL4 Mab는 코팅된 r노치1에 대한 DLL4-His의 결합을 차단하였지만, Jag1-His의 결합은 차단하지 않았고, 이때 계산된 IC50은 약 8 nM이었다 (하부 패널).
항-DLL4 Mab YW26.82는 인간 배꼽 정맥 내피 세포 (HUVEC) 내의 내인성으로 발현된 DLL4에 특이적으로 결합하였다. 대조군 또는 또는 DLL4-특이적 siRNA로 형질감염된 HUVEC의 FACS 분석. YW26.82가 2 ㎍/㎖로 사용된 후, 염소 항-인간 IgG-PE (1:500, Jackson ImmunoResearch)가 이어졌다. 이러한 실험의 결과가 도 11e에 제시된다. 형질감염되지 않은 HUVEC (대조군) 및 대조군 siRNA로 형질감염된 HUVEC에 대한 결합이 관찰되었다. 대조적으로, DLL4 siRNA로 형질감염된 HUVEC에서 결합이 현저하게 감소하였다. 이러한 실험은 항-DLL4 Mab YW26.82가 HUVEC 내의 내인성으로 발현된 DLL4에 특이적으로 결합한다는 것을 증명하였다.
실시예 5: 항-DLL4 항체로의 처리가 시험관 내에서 내피 세포 증식을 증가시켰다
공동 배양된 인간 피부 섬유모세포 (SF)의 존재 하에 피브린 젤에서 성장하고 있는 인간 배꼽 정맥 내피 세포 (HUVEC)는 독특한 관강-유사 구조의 싹을 생성한다 ([Nakatsu, M. N. et al. Microvasc Res 66, 102-12 (2003)]). 항-DLL4 항체 YW26.82의 첨가는 싹의 길이 및 개수를 현저하게 증가시켰다 (도 7a). 단백질 복합체의 γ-분비효소 활성에 의해 촉매되는 노치의 단백질분해성 프로세싱은 노치 활성화 동안 필수적인 단계이다 ([Baron, M. Semin Cell Dev Biol 14, 113-9 (2003). 흥미롭게도, γ-분비효소 억제제 디벤즈아제핀 (DBZ) ([van Es, J. H. et al. Nature 435, 959-63 (2005)]; [Milano, J. et al. Toxicol Sci 82, 341-58 (2004)])은 HUVEC 싹내밀기에 대해 동일한 효과가 있었다. 이러한 2가지 처리의 독특한 메커니즘 하에, 증강된 싹내밀기는 명확하게 노치 신호전달의 감쇠에 기인하였다. Ki67 염색은 증강된 EC 싹내밀기가 상승된 세포 증식으로 인한 것이었음을 드러냈다 (도 7b). 원래의 피브린 젤 분석법에서, HUVEC 싹내밀기 및 이어지는 관강 형성은 공동 배양된 SF 세포에 의해 지지된다. SF 세포를 조건화 배지로 대체함으로써, 항-DLL4 Mab 및 DBZ 모두 여전히 HUVEC 싹내밀기를 증강시킬 수 있었고 (도 7c), 이는 DLL4/Notch 신호전달의 EC 자율 역할을 지지한다. 반대의 실험에서, 고정된 DLL4 단백질에 의한 노치의 활성화로 상당한 성장 억제가 초래되었다 (도 7e). 이러한 발견들은 DLL4/Notch 신호전달의 활성화 상태가 EC 증식과 밀접하게 관련된다는 것을 시사한다.
실시예 6: 항-DLL4 항체로의 처리가 생체 내에서 내피 세포 증식을 증가시켰다
출생직후의 마우스 망막은 잘 규정된 순서의 이벤트로 정형화된 혈관 패턴을 발달시킨다 ([Stone, J. ＆ Dreher, Z. J Comp Neurol 255, 35-49 (1987)]; [Gerhardt, H. et al. J Cell Biol 161, 1163-77 (2003)]; [Fruttiger, M. Invest Ophthalmol Vis Sci 43, 522-7 (2002)]). 신생아 망막 내의 성장 중인 EC에서의 DLL4의 두드러지고 활동적인 발현은 망막 혈관 발달을 조절하는 DLL4의 가능한 역할을 시사한다 ([Claxton, S. ＆ Fruttiger, M. Gene Expr Patterns 5, 123-7 (2004)]). YW26.82의 전신전달은 망막 혈관구조의 깊은 변형을 야기하였다. EC의 과도한 축적이 망막에서 발생하여, 원시 혈관 형태의 시트-유사 구조가 생성되었다 (도 7d). EC에서의 Ki67 표지의 현저한 증가가 관찰되었고, 이는 상승된 EC 증식을 가리킨다 (도 7h). 따라서, 신생 마우스에서의 DLL4 봉쇄 시의 망막 EC의 이러한 과증식성 표현형은 시험관내 발견을 보강하였다.
실시예 7: 상피 세포 증식 조절에서의 DLL4/Notch의 필수적인 역할
VEGF는 EC의 여러 기초적인 양상들을 제어한다 ([Ferrara, N. Exs, 209-31 (2005)]; [Coultas, L. et al. Nature 438, 937-45 (2005)]). 그러나, 어떻게 VEGF 신호전달이 추가적인 고도로 조화를 이루는 신호전달 경로를 명백하게 요구하는 이벤트인 복합적인 혈관 프로세스, 예컨대 동정맥 (AV) 분화 및 계층적 혈관 조직화 내로 통합되는지는 적게 이해된다. 제브라 피시(zebra fish)에서의 유전학적 연구는 VEGF가 동맥 내피 분화 동안 노치 경로의 상류에서 작용한다는 것을 시사한다 ([Lawson, N. D. et al. Development 128, 3675-83 (2001)]). 본 발명가들은 VEGF 자극에 의한 DLL4 mRNA의 상향조절에 대한 최근의 보고([Patel, N. S. et al. Cancer Res 65, 8690-7 (2005)])와 일관되게, HUVEC의 VEGF 자극이 DLL4의 증가된 표면 발현을 야기하였음을 발견하였다 (데이터는 제시되지 않음). 흥미롭게도, DLL4 자체가 노치 활성화 후에 상향조절되고 (도 12), 이는 DLL4가 VEGF 신호전달을 노치 경로에 효과적으로 중계하는 양성-피드백 메커니즘을 시사한다. 간략하게, HUVEC을 DBZ (0.08 μM)의 존재 또는 부재 하에 고정된 C-말단 His-태그 부착 인간 DLL4 (아미노산 1-404)로 자극하였다. 자극 36시간 후, 내인성 DLL4 발현을 항-DLL4 항체로의 FACS 분석에 의해 시험하였다.
뚜렷하게, 노치 신호전달을 차단하는 것으로부터 초래된 EC의 과증식이 여전히 VEGF에 의존적이었다. 3-D 피브린 젤 배양에서, 항-VEGF Mab로의 처리는 DBZ의 존재 또는 부재 하에 대부분의 EC 싹내밀기를 폐지시켜 (도 7f), 부분적으로 과증식성 거동은 증강된 VEGF 신호전달로 인한 것일 수 있다는 가능성을 제기하였다. 실제로, YW26.82 또는 DBZ에 의한 노치 차단으로 VEGFR2의 상향조절이 초래되었다 (도 7g). 반대로, 고정된 DLL4에 의한 노치의 활성화는 VEGFR2의 발현을 억제하였다 (도 7g). 따라서, VEGF는 DLL4/노치 경로의 상류에서 작용할 수 있는 한편, DLL4/노치는 VEGFR2 발현을 음성적으로 조절하는 것을 통해 응답을 미세조절할 수 있다.
실시예 8: 항-DLL4 항체로의 처리가 내피 세포 분화를 차단하였고, 동맥 발달을 차단하였다
EC 증식에서의 증가 이외에, DLL4/노치의 길항은 피브린 젤에서의 EC 싹의 극적인 형태학적 변화를 야기하였다. 다세포성 관강-유사 구조가 거의 없었고 (도 8a), 이는 결함이 있는 EC 분화를 시사한다. Mab YW26.82-처리 망막에서, 방사상으로 교대되는 동맥 및 정맥의 특징적인 패턴이 심하게 파괴되었다. 망막 동맥과 관련된 항-α 평활근 액틴 (ASMA) 염색이 완전히 없었다 (도 8c). 이러한 관찰은 DLL4+/- 태아에서의 결함이 있는 동맥 발달과 매우 유사하였다. 상이한 각도로부터의 이러한 발견들은 EC 분화에서의 DLL4/노치의 필수적인 역할을 강조하였다.
실시예 9: TFGβ 발현이 노치의 활성화 상태에 연관되었다
노치 경로와 유사하게, TGFβ 신호전달은 정황 의존적이고, 세포 분화, 증식 및 성장 억제에 대한 효과들이 상이하며, 때때로 반대된다. 또한, TGFβ 경로는 혈관 프로세스에 연루된다 ([Urness, L. D. et al, Nat Genet 26, 328-31 (2000)]; [Oshima, M. et al, Dev Biol 179, 297-302 (1996)]; [Larsson, J. et al. Embo J 20, 1663-73 (2001)]). 예를 들어, EC 특이적 제I형 TGFβ 수용체인 액티빈 수용체-유사 키나제 1 (ALK1)의 결핍으로 노치 신호전달에 결함이 있는 마우스들이 공유하는 표현형인, 난황낭에서의 원시 EC 네트워크 및 동정맥 기형 (AVM)이 초래되었다 ([Urness, L. D. et al, Nat Genet 26, 328-31 (2000)]; [Iso, T. et al, Arterioscler Thromb Vasc Biol 23, 543-53 (2003)]). 이는 본 발명가들이 이러한 2개의 경로 간의 가능한 연계를 조사하도록 하였다. 본 발명가들은 TGFβ2의 발현 (도 8b)이 노치의 활성화 상태와 밀접하게 연결된다는 것을 발견하였고, 이는 TGFβ 경로가 노치 경로의 하류에서 작용할 수 있다는 것을 시사한다. 공동으로, 본 발명가의 발견들은 "신호전달 라우터(router)"로 작용하는 DLL4/노치 축이 DLL4 발현 조절을 통해 VEGF 신호전달을 통합하고, TGFβ 경로를 고용하여 EC 분화를 촉진하는 모델을 지지한다.
실시예 10: 항-DLL4 항체로의 처리가 생체 내에서 종양 성장을 억제하였다
종양 혈관생성 동안 DLL4/노치 신호전달의 가능한 역할을 직접적으로 다루기 위해, 본 발명가들은 전임상 종양 모델에서의 종양 성장에 대한 DLL4 차단의 영향을 조사하였다 (도 9a-d). HM7, Colo205 및 Calu6 이종이식 종양 모델 (도 9a-c)에서, 종양 확립 (종양 크기 ≥250 ㎣) 후 YW26.82 처리를 시작하였다. 3개의 모델 모두에서, 대조군과 처리군 간의 성장 속도에서의 분리가 투약 3일 후 명확해졌다. 처리군의 종양 부피는 2주의 처리에 걸쳐 정적으로 유지되었다. 피하 종양에 더하여, 항-DLL4 Mab는 마우스 유방 지방 패드에서 성장하는 종양을 또한 억제하였다. MDA-MB-435 종양 모델에서, 종양 세포를 주입하고 나서 14일 후에 처리를 시작하였다. 대조군과 처리군 간의 종양 성장 곡선에서의 차이가 투약 후 6일 이내에 명확해졌고, 처리가 지속됨에 따라 더욱 더 현저해졌다 (도 9d).
본 발명가들은 전임상 종양 모델에서 수많은 종양 성장에 대한 DLL4 및/또는 VEGF 차단의 영향을 또한 조사하였다 (도 9e-f; i-p). MV-522 및 WEHI3 이종이식 종양 모델에서, 종양 확립 (종양 크기 ≥250 ㎣) 후 YW26.82 처리 및/또는 항-VEGF 처리를 시작하였다. MV-522 모델에서, YW26.82 및 항-VEGF 처리 모두 개별적으로 종양 성장을 억제하였지만, 두 치료의 조합이 가장 효과적이었다. WEHI3 모델에서, 항-VEGF 처리는 종양 성장에 대해 효과를 나타내지 않은 반면, YW26.82로의 처리는 종양 성장의 현저한 억제를 나타냈다. SK-OV-3X1, LL2, EL4, H1299, SKMES-1, MX-1, SW620 및 LS174T 모델에서, YW26.82 처리 (5 ㎎/㎏, IP, 일주일에 2번) 및/또는 항-VEGF 처리 (5 ㎎/㎏, IP, 일주일에 2번)를 종양의 확립 후 투여하였다. 각각의 이러한 모델에서, YW26.82 처리가 단독으로 종양 성장을 억제하였다. 또한, 조합물이 테스트된 모든 이러한 모델에서, YW26.82는 항-VEGF와 조합되어 증강된 효능을 나타냈다.
실시예 11: 항-DLL4 항체로의 처리가 종양 내피 세포 증식을 증가시켰다
종양 억제의 견지에서, 본 발명가들을 EL4 마우스 림프종 종양 모델을 혈관 조직학 연구에 사용하였다. 본 발명가들은 항-DLL4 Mab 처리로 내피 세포 밀도에서의 극적인 증가가 초래되었음을 발견하였다 (도 9g). 대조적으로, 항-VEGF는 효과가 완전히 반대였지만 (도 9g), 양쪽 처리 모두 이러한 모델에서 유사한 효능을 나타냈다.
실시예 12: 항-DLL4 항체로의 처리가 종양 혈관 관류를 억제하였다
DLL4/노치 경로의 시험관내 차단이 EC에 의한 관강-유사 구조의 형성을 손상시켰기 때문에 (도 8a), 항-DLL4 Mab로의 처리가 종양 혈관구조에서 유사한 결함을 야기하였는지 및 효율적인 혈류에 영향을 미쳤는지 여부를 조사하였다. FITC-렉틴으로의 전신 관류는 항-DLL4 Mab 처리로 종양 혈관의 렉틴 표지의 현저한 감소가 초래되었음을 드러냈다 (도 9h). 뚜렷하게, ALK1-결핍 마우스에서의 동정맥 기형이 변칙적인 혈액 순환을 야기하는 것으로 나타났다 ([Urness, L. D. et al, Nat Genet 26, 328-31 (2000)]). 배아 및 출생직후 망막 모두에서의 AV 분화에서의 DLL4/노치 신호전달의 결정적인 역할 하에, 항-DLL4 Mab는 종양 EC의 세포 운명 상세에 영향을 미칠 수 있고, 결함이 있는 지향성 혈류를 야기할 수 있다. 실제로, 항-DLL4 Mab로 처리된 Colo205 종양에서, 높은 EC 밀도가 낮은 생존가능 종양 세포 함량과 관련되는 영역이 있었고, 이는 불량한 혈관 기능을 함축한다. 혈관 영상화 기술을 이용한 추가적인 연구가 정확한 혈관 결함을 간파하기 위해서 필요하다.
실시예 13: DLL4/노치는 마우스 장의 항상성에 비필수적이다
노치의 포괄적인 억제에 관련된 주요 관심사는 이것이, 생후 자가-재생 시스템의 항상성을 조절하는 것에서의 노치 신호전달의 다면발현성 역할을 가정했을 때, 해로울 수 있는지이다. 예를 들어, 노치 신호전달은 장 내의 분화되지 않은 장샘 기원 세포를 유지하는데 요구된다 ([van Es, J. H. et al. Nature 435, 959-63 (2005)]; [Fre, S. et al. Nature 435, 964-8 (2005)]). 실제로, 모든 노치 활성을 무차별적으로 차단하는 γ-분비효소 억제제는 장샘 구획 내의 술잔 세포에서의 과도한 증가로 인해 설치류에서 원치 않는 부작용을 야기한다 ([Milano, J. et al. Toxicol Sci 82, 341-58 (2004)]; [Wong, G. T. et al. J Biol Chem 279, 12876-82 (2004)]). 본 발명가들은 항-DLL4 Mab로 처리된 마우스의 소장을 면역조직화학 분석에 의해 시험하였다. DBZ 처리와 대조적으로, 처리 6주 후에 항-DLL4 Mab와 대조군 간에 상피 장샘 세포 분화 또는 증식 프로파일에서의 차이가 확인되지 않았다 (도 10). 또한, 항-DLL4 Mab은 급속하게 분화하는 이행 증폭 (TA) 집단에서 노치 표적 유전자 HES-1의 발현을 변경시키지 않았다 (도 10). 이러한 결과는 DLL4/노치 신호전달이 혈관계에 주로 제한된다는 견해를 지지한다.
실시예 14: 항-DLL4 항체로의 처리는 성체 망막 혈관구조에 영향을 미치지 않는다
DLL4의 차단이 신생 마우스에서의 망막 혈관 발달에 큰 영향을 주었지만, 항-DLL4 항체의 투여는 성체 망막 혈관구조에 대한 가시적인 영향이 없었다 (도 8d). 따라서, DLL4/노치 신호전달은 활성 혈관 생성 동안은 결정적이지만, 정상적인 혈관 유지에서는 덜 중요한 역할을 한다. 이러한 의견과 일관되게, 항-DLL4 Mab 처리 과정 동안, 8주까지 일주일에 두번 10 ㎎/㎏으로 투약되었을 때 종양이 있는 마우스에서 명백한 체중 손실 또는 동물 사망이 관찰되지 않았다. 종양 모델에서, 항-DLL4 Mab와 항-VEGF는 종양 혈관구조에 대해 상반되는 효과를 나타내는 데, 이는 중첩되지 않는 작용 메커니즘을 시사한다.
상기의 발명이 이해를 명확하게 하려는 목적으로 실례 및 실시예에 의해 일부 상세하게 기술되었지만, 상세한 설명 및 실시예는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
<110> GENENTECH, INC. YAN, Minhong WU, Yan <120> ANTI-DLL4 ANTIBODIES AND METHODS USING SAME <130> P2336R1 <150> US 60/811,349 <151> 2006-06-06 <150> US 60/811,357 <151> 2006-06-06 <150> US 60/866,767 <151> 2006-11-21 <150> US 60/866,772 <151> 2006-11-21 <160> 78 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> antibody sequence <400> 1 Gly Phe Thr Phe Thr Asp Asn Trp Ile Ser 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> antibody sequence <400> 2 Gly Phe Ser Phe Arg Asp Asn Trp Ile Ser 5 10 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> antibody sequence <400> 3 Gly Val Ile Asn Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> antibody sequence <400> 4 Gly Leu Ile Asn Pro Gln Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> antibody sequence <400> 5 Gly Val Ile Asn Pro Asn Ser Gly Ala Thr Glu Tyr 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Arg <210> 56 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> antibody sequence <400> 56 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Arg 20 25 30 Asp Asn Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Val Ile Asn Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asp Tyr 50 55 60 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Phe Gly Gly Tyr Phe 95 100 105 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 110 <210> 57 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> antibody sequence <400> 57 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30 Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Ser Val Asn Gly Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg <210> 58 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> antibody sequence <400> 58 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr 20 25 30 Asp Asn Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Tyr Ile Ser Pro Asn Ser Gly Phe Thr Tyr Tyr 50 55 60 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Phe Gly Gly Tyr Phe 95 100 105 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 110 <210> 59 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 59 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30 Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Ser Tyr Thr Gly Thr Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg <210> 60 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <220> <221> CAAT_signal modified_base <222> 2 <223> base is g, a, t or c <400> 60 cncaat 6 <210> 61 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <220> <221> PolyA_signal <222> full <223> polyadenylation signal <400> 61 aataaa 6 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> siRNA <400> 62 caactgccct tatggctttt t 21 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> siRNA <400> 63 aaagccataa gggcagttgt t 21 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> siRNA <400> 64 caactgccct tcaatttcat t 21 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> siRNA <400> 65 tgaaattgaa gggcagttgt t 21 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> siRNA <400> 66 tgaccaagat ctcaactact t 21 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> siRNA <400> 67 gtagttgaga tcttggtcat t 21 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> siRNA <400> 68 ggccaactat gcttgtgaat t 21 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> siRNA <400> 69 ttcacaagca tagttggcct t 21 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 70 aagtcttgca aatgcagcta 20 <210> 71 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 71 catcatcatt atcatcatca ttgtc 25 <210> 72 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide probe <400> 72 aattcttgga aaagtggcaa gaccaaaat 29 <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 73 ctttccacca gcaggaagta g 21 <210> 74 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 74 tgcagtccga ggtccttt 18 <210> 75 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide probe <400> 75 cgcatttgat tttcatttcg acaacaga 28 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 76 gaagatggtg atgggatttc 20 <210> 77 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 77 gaaggtgaag gtcggagtc 19 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide probe <400> 78 caagcttccc gttctcagcc 20

Claims (43)

  1. (a) (i) RASQDVSTAVA (서열 10)인 서열 A1-A11을 포함하는 HVR-L1
    (ii) SASFLYS (서열 11)인 서열 B1-B7을 포함하는 HVR-L2
    (iii) QQSYTGTVT (서열 18)인 서열 C1-C9를 포함하는 HVR-L3
    (iv) GFTFTDNWIS (서열 1)인 서열 D1-D10을 포함하는 HVR-H1
    (v) GYISPNSGFTYYADSVKG (서열 8)인 서열 E1-E18을 포함하는 HVR-H2 및
    (vi) VYYCARDNFGGYFDY (서열 9)인 서열 F1-F15를 포함하는 HVR-H3
    으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 초가변 영역 (HVR) 서열; 및
    (b) 서열 1-18에 도시된 서열의 하나 이상의 잔기의 변형을 포함하는 하나 이상의 변이체 HVR
    을 포함하는 단리된 항-DLL4 항체.
  2. (a) (i) RASQDVSTAVA (서열 10)인 서열 A1-A11을 포함하는 HVR-L1
    (ii) SASFLYS (서열 11)인 서열 B1-B7을 포함하는 HVR-L2
    (iii) QQSYNGPST (서열 15)인 서열 C1-C9를 포함하는 HVR-L3
    (iv) GFTFTDNWIS (서열 1)인 서열 D1-D10을 포함하는 HVR-H1
    (v) GVINPNSGATEYADSVKG (서열 5)인 서열 E1-E18을 포함하는 HVR-H2 및
    (vi) VYYCARDNFGGYFDY (서열 9)인 서열 F1-F15를 포함하는 HVR-H3
    으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 초가변 영역 (HVR) 서열; 및
    (b) 서열 1-18에 도시된 서열의 하나 이상의 잔기의 변형을 포함하는 하나 이상의 변이체 HVR
    을 포함하는 단리된 항-DLL4 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, HVR-L3 변이체가 위치 91 (S 또는 W), 92 (Y 또는 F), 93 (T, N 또는 S), 94 (T 또는 G), 95 (P, Q, A 또는 T), 및/또는 96 (P, S, A, 또는 V)의 임의의 조합으로의 1-6개 (1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개)의 치환을 포함하는 항체.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, HVR-H2 변이체가 위치 50 (V, L 또는 Y), 52 (N 또는 S), 52a (P 또는 S), 또는 53 (N, Q, T, 또는 I)의 임의의 조합으로의 1-4개 (1개, 2개, 3개, 또는 4개)의 치환을 포함하는 항체.
  5. 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 HVR을 포함하고, 이때 각각의 HVR은 서열 1-18로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 구성되거나 또는 본질적으로 이러한 서열로 구성되며, 서열 10은 HVR-L1에 상응하고, 서열 11은 HVR-L2에 상응하고, 서열 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18은 HVR-L3에 상응하고, 서열 1 또는 2는 HVR-H1에 상응하고, 서열 3, 4, 5, 6, 7 또는 8은 HVR-H2에 상응하며, 서열 9는 HVR-H3에 상응하는, 단리된 항-DLL4 항체.
  6. 제5항에 있어서, 항체가 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함하고, 이때 각각은 순서대로 서열 10, 11, 14, 2, 3, 및 9를 포함하는 항체.
  7. 제5항에 있어서, 항체가 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함하고, 이때 각각은 순서대로 서열 10, 11, 15, 1, 5, 및 9를 포함하는 항체.
  8. 제5항에 있어서, 항체가 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함하고, 이때 각각은 순서대로 서열 10, 11, 16, 1, 6, 및 9를 포함하는 항체.
  9. 제5항에 있어서, 항체가 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함하고, 이때 각각은 순서대로 서열 10, 11, 17, 1, 7, 및 9를 포함하는 항체.
  10. 제5항에 있어서, 항체가 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함하고, 이때 각각은 순서대로 서열 10, 11, 18, 1, 8, 및 9를 포함하는 항 체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 프레임워크(framework) 서열의 적어도 일부분이 인간 컨센서스(consensus) 프레임워크 서열인 항체.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 변형이 치환, 삽입 또는 결실인 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 κ 서브그룹(subgroup) 컨센서스 프레임워크 서열을 포함하는 항체.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 중쇄 인간 서브그룹 III 컨센서스 프레임워크 서열을 포함하는 항체.
  15. 제14항에 있어서, 항체가 위치 71, 73 또는 78 중 하나 이상에서의 치환을 포함하는 항체.
  16. 제15항에 있어서, 치환이 R71A, N73T, 또는 N78A 중 하나 이상인 항체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  18. 제17항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  19. 제18항에 있어서, 벡터가 발현 벡터인 벡터.
  20. 제18항 또는 제19항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  21. 제20항에 있어서, 숙주 세포가 원핵생물 세포인 숙주 세포.
  22. 제20항에 있어서, 숙주 세포가 진핵생물 세포인 숙주 세포.
  23. 제20항에 있어서, 숙주 세포가 포유류 세포인 숙주 세포.
  24. (a) 제19항의 벡터를 적절한 숙주 세포에서 발현시키는 단계, 및 (b) 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항-DLL4 항체의 제조 방법.
  25. (a) 제19항의 벡터를 적절한 숙주 세포에서 발현시키는 단계, 및 (b) 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항-DLL4 면역접합체의 제조 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 숙주 세포가 원핵생물 세포인 방법.
  27. 제24항 또는 제25항에 있어서, 숙주 세포가 진핵생물 세포인 방법.
  28. 생물학적 샘플 내의 DLL4-항-DLL4 항체 복합체를 검출하는 것을 포함하는 DLL4의 검출 방법.
  29. DLL4 발현과 관련된 장애가 있거나 이러한 장애가 있는 것으로 추측되는 환자로부터의 생물학적 샘플 내의 DLL4-항-DLL4 항체 복합체를 검출하는 것을 포함하는, DLL4 발현과 관련된 장애를 진단하는 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 항-DLL4 항체가 검출가능하게 표지된 방법.
  31. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항-DLL4 항체를 포함하는 조성물.
  32. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 조성물이 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  34. 유효량의 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체를 종양, 암 또는 세포 증식성 장애를 치료하는 것을 필요로 하는 대상에게 투여함으로써 종양, 암 또는 세포 증식성 장애가 치료되는 것을 포함하는, 종양, 암 또는 세포 증식성 장애를 치 료하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 종양, 암 또는 세포 증식성 장애가 결장암, 폐암 또는 유방암인 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 유효량의 항-혈관생성 작용제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 항-혈관생성 작용제가 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 길항제인 방법.
  38. 제37항에 있어서, VEGF 길항제가 항-VEGF 항체인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 항-VEGF 항체가 베바시주맵(bevacizumab)인 방법.
  40. 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 화학요법제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  41. 유효량의 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체를 항-혈관생성 작용제에 더하여 대상에게 투여함으로써 상기 항-혈관생성 작용제의 효능을 증강시키는 것을 포함하는, 혈관생성과 관련된 병리학적 용태가 있는 대상에서 항-혈관생성 작용제의 효능을 증강시키는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 혈관생성과 관련된 병리학적 용태가 종양, 암 및/또는 세포 증식성 장애인 방법.
  43. 제41항에 있어서, 혈관생성과 관련된 병리학적 용태가 안내 신생혈관 질환인 방법.
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