MX2008015541A - Anticuerpos anti-dll4 y metodos que los usan. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona anticuerpos anti-DLL4, composiciones que comprenden estos anticuerpos y métodos de uso de los mismos.

Description

ANTICUERPOS ANTI-DLL4 Y MÉTODOS QUE LOS USAN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere, de forma general, al campo de la biología molecular. En concreto, la invención se refiere a los anticuerpos anti-DLL4 y a sus usos. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El desarrollo de un medio de aporte vascular es un requisito fundamental para muchos procesos fisiológicos y patológicos. Los tejidos que experimentan un crecimiento activo, como embriones y tumores, necesitan un adecuado aporte sanguíneo. Estos tejidos satisfacen esta necesidad mediante la producción de factores proangiogénicos , que fomentan la formación de nuevos vasos sanguíneos mediante un proceso denominado angiogénesis . La formación de los conductos vasculares es un proceso biológico complejo pero perfectamente ordenado que comprende la totalidad o gran parte de los pasos siguientes: a) las células endoteliales (CE) proliferan a partir de las células endoteliales existentes o se diferencian a partir de las células progenitoras ; b) las células endoteliales migran y se fusionan para formar estructuras en forma de cordón; c) los cordones vasculares experimentan entonces el proceso de tubulogénesis para formar vasos con un lumen central; d) de los cordones o vasos existentes empiezan a salir ramificaciones para formar vasos secundarios; e) el primitivo plexo vascular experimenta un nuevo remodelado; y f) las células periendoteliales son atraídas para revestir a los tubos endoteliales , cumpliendo así funciones moduladoras y de sostén de los vasos. Estas células incluyen pericitos para capilares pequeños, células de músculo liso para vasos de mayor tamaño y miocardiocitos en el corazón. Hanahan, Science 277:48-50 (1997); Hogan & Kolodziej , Wat. Rev. Genet . 3:513-23 (2002); Lubarsky & Krasnow, Cell 112:19-28 (2003). Se ha demostrado ampliamente que la angiogénesis interviene en la patogénesis de diversos trastornos. Estos trastornos incluyen tumores sólidos y metástasis, aterosclerosis , fibroplasia retrolental, hemangiomas, inflamación crónica, enfermedades neovasculares intraoculares , tales como retinopatías proliferativas , como por ejemplo, retinopatía diabética, degeneración macular asociada a la edad (DMAE) , glaucoma neovascular, rechazo inmunológico de tejido corneal trasplantado y de otros tejidos, artritis reumatoide y psoriasis. Folkman et al., J. Biol. Chem. 267:10931-34 (1992); Klagsbrun et al., Annu . Rev. Physiol. 53:217-39 (1991); y Garner A., "Vascular diseases," En: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds . , 2a Edición (Marcel Dekker, NY , 1994), págs 1625-1710. En el caso del crecimiento tumoral, la angiogénesis parece ser fundamental para la transición de la hiperplasia a la neoplasia y para proporcionar el aporte necesario para el crecimiento y la metástasis tumorales. Folkman et al., Nature 339:58 (1989). La neovascularización permite que las células tumorales adquieran una ventaja de crecimiento y una autonomía proliferativa frente a las células normales. Un tumor suele comenzar como una única célula anómala que puede proliferar sólo hasta alcanzar un tamaño de unos pocos milímetros cúbicos debido a la distancia desde los lechos capilares disponibles y puede permanecer "inactiva" sin crecer ni diseminarse durante un período prolongado. Algunas células tumorales cambian posteriormente al fenotipo angiogénico para activar las células endoteliales , que proliferan y maduran hasta convertirse en vasos sanguíneos capilares nuevos. Estos vasos sanguíneos recién formados no sólo permiten el crecimiento continuo del tumor primario, sino también la diseminación y recolonización de células tumorales metastásicas . Por esta razón, se ha observado una correlación entre la densidad de los microvasos en cortes de tumores y la supervivencia de pacientes con cáncer de mama, así como también con otros tipos de tumores. Weidner et al., N. Engl. J. Med. 324:1-6 (1991); Horak et al., Lancet 340:1120-24 (1992); Macchiarini et al., Lancet 340:145-46 (1992). No se conoce bien el mecanismo exacto que controla el cambio angiogénico, pero se cree que la neovasculari zación de la masa tumoral es consecuencia del equilibrio neto de diversos estimuladores e inhibidores de la angiogénesis (Folkman, Wat. Med. 1(1):27-31 (1995)). El proceso de desarrollo vascular está completamente regulado. Hasta la fecha, se ha demostrado que un número significativo de moléculas, en su mayoría secretadas por factores producidos por células circundantes, regula la diferenciación, proliferación y migración de las células endoteliales y su fusión en estructuras semejantes a cordones. Por ejemplo, se ha determinado que el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es el factor clave que interviene en la estimulación de la angiogénesis y en la inducción de la permeabilidad vascular. Ferrara et al., Endocr. Rev. 18:4-25 (1997). El descubrimiento de que la pérdida de un único alelo del VEGF ocasiona letalidad embrionaria indica que este factor desempeña un papel insustituible en el desarrollo y la diferenciación del sistema vascular. Asimismo, se ha demostrado que el VEGF es un mediador clave en la neovascularización asociada a tumores y trastornos intraoculares . Ferrara et al., Endocr . Rev. supra . El ARNm del VEGF está sobreexpresado en la mayoría de los tumores examinados en humanos. Berkman et al., J. Clin. Invest. 91:153-59 (1993); Brown et al., Human Pathol. 26:86- 91 (1995); Brown et al., Cáncer Res. 53:4727-35 (1993); Mattern et al., Brit. J. Cáncer 73:931-34 (1996); Dvorak et al., ñm. J. Pathol. 146:1029-39 (1995) . Asimismo, existe una gran correlación entre los niveles de concentración del VEGF en los líquidos oculares y la presencia de proliferación activa de vasos sanguíneos en pacientes con retinopatía diabética y otras retinopatías asociadas a isquemia. Aiello et al., N. Engl. J. Med. 331:1480-87 (1994). Además, diversos estudios han indicado la localización del VEGF en membranas neovasculares coroideas en pacientes con DMAE. López et al., Invest. Ophthalmol.

Vis. Sci. 37:855-68 (1996). Los anticuerpos neutralizantes anti-VEGF inhiben el crecimiento de diversas líneas de células tumorales humanas en ratones atímicos desnudos (Kim et al., Nature 362:841-44 (1993); Warren et al., J. Clin. Invest. 95:1789-97 (1995); Borgstróm et al., Cáncer Res. 56:4032-39 (1996); Melnyk et al., Cáncer Res. 56:921-24 (1996)) y también inhiben la angiogénesis intraocular en modelos con trastornos retiñíanos isquémicos (Adamis et al., Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996)). Por lo tanto, los anticuerpos monoclonales anti-VEGF u otros inhibidores de la acción del VEGF son prometedores candidatos para el tratamiento de tumores y de diversos trastornos neovasculares intraoculares . Estos anticuerpos se describen, por ejemplo, en la patente europea EP 817.648, publicada el 14 de enero de 1998, y en los documentos WO 98/45331 y WO 98/45332, ambos publicados el 15 de octubre de 1998. Un anticuerpo anti-VEGF, bevacizumab, ha sido aprobado por la FDA para su uso en combinación con quimioterapia para tratar neoplasias malignas concretas y un fragmento de un anticuerpo anti-VEGF, ranibizumab, ha sido aprobado por la FDA para tratar la degeneración macular (de tipo húmedo) asociada a la edad. Los dos fármacos se están estudiando en ensayos clínicos actualmente en curso. Es evidente que sigue existiendo la necesidad de disponer de agentes que presenten características clínicas óptimas para su desarrollo como fármacos. La invención explicada en la presente memoria descriptiva satisface esta necesidad y ofrece otros beneficios.

Todas las referencias citadas en la misma, incluidas las solicitudes de patentes y publicaciones, quedan incorporadas en su totalidad a modo de referencia.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención se basa en parte en la identificación de diversos agentes de unión a DLL4 (como inmunoconj ugados , anticuerpos y fragmentos de anticuerpos). La DLL4 se presenta como una diana terapéutica importante y ventajosa y la invención ofrece composiciones y métodos basados en la unión a DLL . .Los agentes de unión a DLL4 de la invención, descritos en la presente memoria descriptiva, proporcionan importantes agentes diagnósticos y terapéuticos para actuar sobre procesos patológicos asociados a la expresión y/o actividad de las vías del receptor DLL4/Notch. Según esto, la invención proporciona métodos, composiciones, kits y artículos de fabricación asociados a la unión a DLL . La presente invención proporciona anticuerpos que se unen a DLL4 (como los que se unen específicamente) . En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado anti-DLL4, en el que una forma IgG de longitud completa del anticuerpo se une específicamente a la DLL4 humana con una afinidad de unión de 1 nM aproximadamente o superior; es decir, de 500 pM aproximadamente o superior. Como es bien sabido en este campo, la afinidad de unión de un ligando a su receptor se puede determinar utilizando uno de los diversos ensayos existentes y se puede expresar en función de diversos valores cuantitativos. Por ello, en una forma de realización, la afinidad de unión se expresa como valores Kd y refleja una afinidad de unión intrínseca (por ejemplo, con efectos de avidez minimizados). Por lo general y preferiblemente, la afinidad de unión se mide in vitro, ya sea en un entorno sin células o asociado a células. Se puede utilizar cualquiera de los diversos ensayos conocidos en este campo, incluidos los descritos en la presente memoria descriptiva, para obtener mediciones de la afinidad de unión, incluidos, por ejemplo, Biacore®, radioinmunoensayo (RIA) y ELISA. En algunas formas de realización, el anticuerpo aislado anti-DLL4 se une tanto a DLL4 humana como murina con una afinidad similar; es decir, la afinidad de unión por la DLL4 humana no es superior a 100 veces, más o menos, la afinidad de unión por la DLL4 murina. En algunas formas de realización, la afinidad de unión por la DLL4 humana no es superior a 10 veces, más o menos, la afinidad de unión por la DLL4 murina. En algunas formas de realización, el anticuerpo se une específicamente a la DLL4 murina con una afinidad de unión de 1 nM aproximadamente o superior; es decir, de 500 pM aproximadamente o superior. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado anti-DLL4, en el que una forma IgG de longitud completa del anticuerpo se une específicamente a la DLL4 humana con una kon de 2 X 105 o superior, o de 1 X 105 o superior. Como es bien sabido en este campo, la kon de unión de un ligando a su receptor se puede determinar utilizando uno de los diversos ensayos existentes y se puede expresar en función de diversos valores cuantitativos. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado que se une a una región de DLL4 de unión a ligando. En algunas formas de realización, el anticuerpo aislado se une a un polipéptido que comprende el dominio extracelular DLL4, está formado por él o lo contiene esencialmente. En algunas formas de realización, el anticuerpo aislado se une a un polipéptido que comprende los aminoácidos 252-282, 1-252, 1-286, 1-324 y/o 219-286 de DLL4 humana, está formado por ellos o los contiene esencialmente. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado anti-DLL4 que compite con el receptor de Notch por la unión de DLL4.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado anti-DLL4 que inhibe, reduce y/o bloquea la actividad biológica de DLL4. En un aspecto, un anticuerpo anti-DLL4 de la invención comprende : (a) al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de la región hipervariable (HVR) seleccionadas en el grupo formado por: (i) HVR-Ll que comprende la secuencia Al-All, donde AlAll es RASQDVSTAVA ( identificador de secuencia n.°: 10) (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia B1-B7, donde B1-B7 es SASFLYS ( identificador de secuencia n.°: 11) (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia C1-C9, donde C1-C9 es QQSYNGPST ( identificador de secuencia n.°: 15) (iv) HVR-H1 que comprende la secuencia D1-D10, donde Dl- D10 es GFTFTDNWIS ( identificador de secuencia n.°: 1) (v) HVR-H2 que comprende la secuencia E1-E18, donde El-E18 es GVINPNSGATEYADSVKG ( identificador de secuencia n.°: 5) y (vi) HVR-H3 que comprende la secuencia F1-F15, donde F1-F15 es VYYCARDNFGGYFDY ( identificador de secuencia n.°: 9); y (b) al menos una variante de la HVR, donde la secuencia de la variante de la HVR incluye la modificación de al menos un residuo de la secuencia descrita en los identificadores de secuencia núms : 1-18. En un aspecto, un anticuerpo anti-DLL4 de la invención comprende : (a) al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco secuencias de la región hipervariable (HVR) seleccionadas en el grupo formado por: (i) .HVR-Ll que comprende la secuencia Al-All, donde Al- All es RASQDVSTAVA ( identificador de secuencia n.°: 10) (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia B1-B7, donde B1-B7 es SASFLYS ( identificador de secuencia n.°: 11) (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia C1-C9, donde C1-C9 es QQSVNGPAT ( identificador de secuencia n.°: 14) (iv) HVR-H1 que comprende la secuencia D1-D10, donde Dl-D10 es GFSFRDNWIS ( identificador de secuencia n.°: 2); (v) HVR-H2 que comprende la secuencia E1-E18, donde El-E18 es GVINPNSGSTDYADSVKG ( identificador de secuencia n.°: 3 ) ; (vi) HVR-H3 que comprende la secuencia F1-F15, donde F1-F15 es VYYCARDNFGGYFDY ( identificador de secuencia n . ° : 9 ) ; y (b) al menos una variante de la HVR, donde la secuencia de la variante de la HVR incluye la modificación de al menos un residuo de la secuencia descrita en los identificadores de secuencia núms : 1-18. En un aspecto, un anticuerpo anti-DLL4 de la invención comprende : (a) al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco secuencias de la región hipervariable (HVR) seleccionadas en el grupo formado por: (i) HVR-L1 que comprende la secuencia Al-All, donde Al- All es RASQDVSTAVA ( identificador de secuencia n.°: 10) (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia B1-B7, donde B1-B7 es SASFLYS ( identificador de secuencia n.°: 11) (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia C1-C9, donde C1-C9 es QQSYTGTVT ( identificador de secuencia n.°: 18) (iv) HVR-Hl que comprende la secuencia D1-D10, donde Dl-D10 es GFTFTDNWIS ( identificador de secuencia n.°: 1); (v) HVR-H2 que comprende la secuencia E1-E18, donde El-E18 es GYISPNSGFTYYADSVKG ( identificador de secuencia n.°: 8) y (vi) HVR-H3 que comprende la secuencia F1-F15, donde F1-F15 es VYYCARDNFGGYFDY ( identificador de secuencia n.°: 9); y (b) al menos una variante de la HVR, donde la secuencia de la variante de la HVR incluye la modificación de al menos un residuo de la secuencia descrita en los identificadores de secuencia núms : 1-18. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR, donde cada HVR comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia seleccionada entre el grupo formado por los identificadores de secuencia núms: 1-18, y donde el identificador de secuencia n.°: 10 se corresponde con una HVR-Ll; el identificador de secuencia n.°: 11 se corresponde con una HVR-L2; los identificadores.de secuencia n° 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 se corresponden con una HVR-L3; los identificadores de secuencia n.° 1 ó 2 se corresponden con una HVR-H1; los identificadores de secuencia n° 3, 4, 5, 6, 7 u 8 se corresponden con una HVR-H2 ; y el identificador de secuencia n.° 9 se corresponde con una HVR-H3. En una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende HVR-Ll, HVR-L2, HVR-L3, HVR-Hl, HVR-H2 y HVR-H3, donde cada una de ellas, por orden, comprende los identificadores de secuencia núms: 10, 11, 12, 1, 3, 9. En una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende HVR-Ll, HVR-L2, HVR-L3 , HVR-Hl, HVR-H2 y HVR-H3, donde cada una de ellas, por orden, comprende los identificadores de secuencia núms : 10, 11, 13, 1, 4, 9. En una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3 , HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, donde cada una de ellas, por orden, comprende los identificadores de secuencia núms: 10, 11, 14, 2, 3, 9. En una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, donde cada una de ellas, por orden, comprende los identificadores de secuencia núms: 10, 11, 15, 1, 5, 9. En una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, donde cada una de ellas, por orden, comprende los identificadores de secuencia núms: 10, 11, 16, 1, 6, 9. En una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, donde cada una de ellas, por orden, comprende los identificadores de secuencia núms: 10, 11, 17, 1, 7, 9. En una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, donde cada una de ellas, por orden, comprende los identificadores de secuencia núms: 10, 11, 18, 1, 8, 9.

Las variantes de las HVR en un anticuerpo de la invención pueden tener modificaciones en uno o más residuos (como dos, tres, cuatro, cinco o más) dentro de la HVR. En una forma de realización, una variante de la HVR-L3 comprende 1-6 (1, 2, 3, 4, 5 ó 6) sustituciones en cualquier combinación de las posiciones siguientes: 91 (S o W) , 92 (Y o F) , 93 (T, o S ) , 94 (T o G) , 95 (P, Q, A o T) , y/o 96 (P, S, A o V) . En una forma de realización, una variante de la HVR-H2 comprende de 1 a 4 (1, 2, 3 ó 4) sustituciones en cualquier combinación de las posiciones siguientes: 50 (V, L o Y) , 52 (N o S), 52a (P o S) o 53 ( , Q, T o I). La letra o letras entre paréntesis que siguen a cada posición indican un aminoácido utilizado como sustitución (es decir, reemplazo) a modo de ejemplo; como los expertos en la materia saben, la idoneidad de otros aminoácidos para su uso como aminoácidos de sustitución en el contexto expuesto en la presente memoria descriptiva se puede evaluar empleando técnicas conocidas en la materia o descritas en esta memoria.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región HVR-Hl que contiene la secuencia del identificador de secuencia n.°: 1 ó 2. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región HVR-H2 que contiene la secuencia del identificador de secuencia n.°: 3, 4, 5, 6, 7 u 8. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región HVR-H3 que contiene la secuencia del identificador de secuencia n.°: 9. En un forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región HVR-L1 que contiene la secuencia del identificador de secuencia n.°: 10. En un forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región HVR-L2 que contiene la secuencia del identificador de secuencia n.°: 11. En un forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región HVR-L3 que contiene la secuencia del identificador de secuencia n . ° : 12, 13, 14, 15, 16, 17 ó 18.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres siguientes : (i) una secuencia HVR-Hl que comprende la secuencia del identificador de secuencia n.°: 1 ; (ii) una secuencia HVR-H2 que comprende la secuencia del identificador de secuencia n.°: 5; (iii) una secuencia HVR-H3 que comprende la secuencia del identificador de secuencia n.°: 9.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres siguientes : (i) una secuencia HVR-Ll que comprende la secuencia del identificador de secuencia n.°: 10; (ii) una secuencia HVR-L2 que comprende la secuencia del identificador de secuencia n.°: 11; (iii) una secuencia HVR-L3 que comprende la secuencia del identificador de secuencia n.°: 15. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres siguientes: (i) una secuencia HVR-H1 que comprende la secuencia del identificador de secuencia n.°: 1; (ii) una secuencia HVR-H2 que comprende la secuencia del identificador de secuencia n.°: 8; (iii) una secuencia HVR-H3 que comprende la secuencia del identificador de secuencia n.°: 9. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos o las tres siguientes : (i) una secuencia HVR-Ll que comprende la secuencia del identificador de secuencia n.°: 10; (ii) una secuencia HVR-L2 que comprende la secuencia del identificador de secuencia n.°: 11; (iii) una secuencia HVR-L3 que comprende la secuencia del identificador de secuencia n.°: 18. Las secuencias aminoacidicas de los identificadores de secuencia núms 1-18 están numeradas con respecto a HVR individuales (es decir, Hl, H2 o H3), como se indica en las Figuras la y Ib, y la numeración corresponde al sistema de numeración de Kabat descrito más adelante. En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos que comprenden secuencias de la HVR de la cadena pesada, como se muestra en las Figuras la y Ib. En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos que comprenden secuencias de la HVR de la cadena ligera, como se muestra en las Figuras la y Ib. Algunas formas de realización de anticuerpos de la invención comprenden un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo humanizado 4D5 (hu Ab4D5-8 ) (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, California, EE.UU) (al que también se hace referencia en la Patente de EE.UU. n.° 6.407.213 y en Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5) :1073-93) como se muestra en el identificador de secuencia n.°: 52 más adelante. 1 Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 107 ( identificador de secuencia n.°: 52) (los residuos de la HVR aparecen subrayados) En una forma de realización, la secuencia del dominio variable de la cadena ligera de huMAb4D5-8 se modifica en una o más de las posiciones 30, 66 y 91 (Asn, Arg y His, como se ha indicado en negrita/cursiva antes, respectivamente) . En una forma de realización, la secuencia modificada de huMAb4D5-8 comprende Ser en la posición 30, Gly en la posición 66 y/o Ser en la posición 91. Por lo tanto, en una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena ligera que contiene la secuencia mostrada en el identi ficador de secuencia n.°: 53 a continuación : 1 Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 107 ( identificador de secuencia n.°: 53) (los residuos de la HVR aparecen subrayados) Los residuos sustituidos con respecto a huMAb4D5-8 aparecen en negrita/cursiva anteriormente. Los anticuerpos de la invención pueden comprender cualquier secuencia de estructura del dominio variable apropiada, siempre que la actividad de unión a DLL4 se conserve en su mayor parte. Por ejemplo, en algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención comprenden una secuencia de consenso de la estructura de la cadena pesada del subgrupo III humano. En una forma de realización de estos anticuerpos, la secuencia de consenso de la estructura comprende sustitución en las posiciones 71, 73 y/o 78. En algunas formas de realización de estos anticuerpos, la posición 71 es A, la 73 es T y/o la 78 es A. En una forma de realización, estos anticuerpos comprenden secuencias de estructuras de dominio variable de la cadena pesada de huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, California, EE.UU.) (también mencionada en las Patentes de EE.UU. núms. 6.407.213 y 5.821.337 y Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340 (5) : 1073-93) . En una forma de realización, estos anticuerpos comprenden, además, una secuencia de consenso de la estructura de la cadena ligera ?? humana. En una forma de realización, estos anticuerpos comprenden las secuencias de la HVR de la cadena ligera de huMAb4D5-8, como se describe en las Patentes de EE.UU. núms. 6.407.213 y 5.821.337). En una forma de realización, estos anticuerpos comprenden secuencias de dominio variable de la cadena ligera de huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, California, EE.UU.) (también mencionados en las Patentes de EE.UU. núms. 6.407.213 y 5.821.337 y en Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340 (5) : 1073-93) . En una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena pesada, en el que la secuencia de estructura comprende la secuencia de los identificadores de secuencia núms : 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 y/o 37, y las secuencias de HVR Hl, H2 y H3 se corresponden con los identificadores de secuencia núms.: 1, 5 y/o 9, respectivamente. En una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena ligera, en el que la secuencia de estructura comprende la secuencia de los identificadores de secuencia núms: 38, 39, 40 y/o 41, y las secuencias de la HVR Ll, L2 y L3 son los identificadores de secuencia núms: 10, 11 y/o 15, respectivamente . En una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena pesada, en el que la secuencia de estructura comprende la secuencia de los identificadores de secuencia núms: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 y/o 37, y las secuencias de HVR Hl, H2 y H3 se corresponden con los identificadores de secuencia núms.: 2, 3 y/o 9, respectivamente. En una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena ligera, en el que la secuencia de estructura comprende la secuencia de los identificadores de secuencia núms: 38, 39, 40 y/o 41, y las secuencias de la HVR Ll, L2 y L3 son los identificadores de secuencia núms : 10, 11 y/o 14, respectivamente . En una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena pesada, en el que la secuencia de estructura comprende la secuencia de los identificadores de secuencia núms: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 y/o 37, y las secuencias de HVR Hl, H2 y H3 se corresponden con los identificadores de secuencia núms.:l, 8 y/o 9, respectivamente. En una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena ligera, en el que la secuencia de estructura comprende la secuencia de los identificadores de secuencia núms: 38, 39, 40 y/o 41, y las secuencias de la HVR Ll, L2 y L3 son los identificadores de secuencia núms: 10, 11 y/o 18, respectivamente . En una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena pesada, en el que la secuencia de estructura comprende la secuencia de los identificadores de secuencia núms: 46, 47, 48 y/o 49, y las secuencias de la HVR Hl, H2 y H3 corresponden a los identificadores de secuencia núms: 1, 5 y/o 9, respectivamente. En una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena ligera, en el que la secuencia de estructura comprende la secuencia de los identificadores de secuencia núms : 42, 43, 44 y/o 45, y las secuencias de la HVR Ll, L2 y L3 son los identificadores de secuencia núms: 10, 11 y/o 15, respectivamente . En una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena pesada, en el que la secuencia de estructura comprende la secuencia de los identificadores de secuencia núms: 46, 47, 48 y/o 49, y las secuencias de la HVR Hl, H2 y H3 corresponden a los identificadores de secuencia núms: 2, 3 y/o 9, respectivamente. En una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena ligera, en el que la secuencia de estructura comprende la secuencia de los identificadores de secuencia núms: 42, 43, 44 y/o 45, y las secuencias de la HVR Ll, L2 y L3 son los identificadores de secuencia núms: 10, 11 y/o 14, respectivamente . En una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena pesada, en el que la secuencia de estructura comprende la secuencia de los identificadores de secuencia núms : 46, 47, 48 y/o 49, y las secuencias de la HVR Hl, H2 y H3 corresponden a los identificadores de secuencia núms: 1, 8 y/o 9, respectivamente. En una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena ligera, en el que la secuencia de estructura comprende la secuencia de los identificadores de secuencia núms: 42, 43, 44 y/o 45, y las secuencias de la HVR Ll, L2 y L3 son los identificadores de secuencia núms: 10, 11 y/o 18, respectivamente. En una forma de realización, un anticuerpo de la invención tiene maduración de afinidad para obtener la afinidad de unión a la diana deseada. En un ejemplo, un anticuerpo de la invención con maduración de afinidad comprende sustitución en una o más de las posiciones aminoacídicas H28, H30, H31, H32, H33, L91, L92, L93, L94, L95 y/o L96. En un ejemplo, un anticuerpo de la invención con maduración de afinidad comprende una o más de las sustituciones siguientes: (a) en la cadena pesada, V50L, V50Y, N52S, P52aS, N53Q, N53T, N53I, S56A, S56F, T57S, D58E, D58I, D58A, D58Y, o (b) , en la cadena ligera, S91 , Y92F, T93N, T93S, T94G, P95Q, P95A, P95T, P96S, P96A, P96V.

En una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena pesada, que comprende la secuencia del identificador de secuencia n.°: 54. En una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena ligera, que comprende la secuencia del identificador de secuencia n.°: 55. En una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena pesada que contiene la secuencia del identificador de secuencia n.° 54 y un dominio variable de la cadena ligera que contiene la secuencia del identificador de secuencia n.° 55. En una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena pesada que contiene la secuencia del identificador de secuencia n.° 56. En una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena ligera que contiene la secuencia del identificador de secuencia n.° 57. En una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena pesada que contiene la secuencia del identificador de secuencia n.° 56 y un dominio variable de la cadena ligera que contiene la secuencia del identificador de secuencia n.° 57.

En una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena pesada, que comprende la secuencia del identificador de secuencia n.°: 58. En una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena ligera, que comprende la secuencia del identificador de secuencia n.°: 59. En una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena pesada que contiene la secuencia del identificador de secuencia n.° 58 y un dominio variable de la cadena ligera que contiene la secuencia del identificador de secuencia n.° 59. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que compite con cualquiera de los anticuerpos anteriormente mencionados para unirse a DLL4. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que se une al mismo epitopo en DLL4 que cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente.

Como es bien sabido en la materia, y como se describe en mayor detalle más adelante, el limite/la posición de los aminoácidos que delinean una región hipervariable de un anticuerpo puede variar, dependiendo del contexto y de las diversas definiciones conocidas en la materia (como se describe más adelante) . Algunas posiciones dentro de un dominio variable se pueden considerar posiciones hipervariables híbridas, en el sentido de que se puede considerar que estas posiciones están dentro de una región hipervariable según un conjunto de criterios, mientras que se considera que están fuera de una región variable según un conjunto de criterios distintos. Una o más de estas posiciones también se pueden encontrar en regiones hipervariables ampliadas (entendiendo estas como se definen más adelante) . En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. En algunas formas de realización, el anticuerpo se selecciona en el grupo formado por un anticuerpo quimérico, un anticuerpo con maduración de afinidad, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano. En algunas formas de realización, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. En algunas formas de realización, el anticuerpo es un Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab' ) 2 o scFv. En una forma de realización, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, por ejemplo, un anticuerpo que comprende secuencias de unión a antígeno procedentes de un donante no humano trasplantadas a una secuencia heteróloga no humana, humana o humanizada (por ejemplo, secuencias de dominio constante y/o estructura) . En una forma de realización, el donante no humano es un ratón. En una forma de realización, la secuencia de unión a antigeno es sintética, por ejemplo, obtenida mediante mutagenia (por ejemplo, detección de representación en fagos, etc.). En una forma de realización, un anticuerpo quimérico de la invención tiene regiones V murinas y una región C humana. En una forma de realización, la región V murina de la cadena ligera se fusiona con una cadena ligera kappa humana. En una forma de realización, la región V murina de la cadena pesada se fusiona con una región C de IgGl humana. Los anticuerpos humanizados de la invención incluyen aquellos que presentan sustituciones de aminoácidos en las variantes de la FR y con maduración de afinidad con cambios en las CDR trasplantadas. Los aminoácidos sustituidos en la CDR o FR no se limitan a los presentes en el anticuerpo donante o receptor. ^ En otras formas de realización, los anticuerpos de la invención también comprenden cambios en los residuos aminoacidicos de la región Fe, lo que da lugar a una función efectora mejorada que incluye una mejor función de la CDC y/o ADCC y un aumento de la destrucción de linfocitos B. Otros anticuerpos de la invención incluyen aquellos con cambios específicos que mejoran la estabilidad. En otras formas de realización, los anticuerpos de la invención también comprenden cambios en los residuos aminoacidicos de la región Fe que ocasionan una disminución de la función efectora , por ejemplo, una reducción de la función de la CDC y/o ADCC y/o una menor destrucción de linfocitos B. En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se caracterizan por una menor unión (como falta de unión) al factor de complemento humano Clq y/o al receptor Fe humano en las células naturales asesinas (NK) . En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se caracterizan por una reducción de la unión (como la falta de unión) a FcyRI, FcyRIIA, y/o FcyRIIIA humanos. En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención pertenecen a la clase IgG (por ejemplo, IgGl o IgG4) y comprenden al menos una mutación en E233, L234, G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 y/o P329 (numeración según el índice EU) . En algunas formas de realización, los anticuerpos comprenden la mutación L234A/L235A o D265A/N297A. En un aspecto, la invención proporciona polipéptidos anti-DLL4 que comprenden alguna de las secuencias de unión a antígeno proporcionadas en la presente memoria descriptiva, donde los polipéptidos anti-DLL4 se unen específicamente a DL44.

Los anticuerpos de la invención se unen (por ejemplo, se unen específicamente) a DLL4 y, en algunas formas de realización, pueden modular uno o más aspectos de los efectos asociados a DLL4, incluida la reducción o bloqueo de la activación del receptor Notch, la reducción o bloqueo de la señalización molecular después del extremo 3' del receptor Notch, la alteración o bloqueo de la unión a DLL4 del receptor Notch y/o la promoción de células endoteliales y/o la inhibición de la diferenciación de las células endoteliales y/o la inhibición de la diferenciación arterial y/o la inhibición de la perfusión vascular del tumor y/o el tratamiento y/o prevención de un tumor, trastorno de proliferación celular o neoplasia maligna; y/o el tratamiento o prevención de un trastorno asociado a la expresión y/o actividad de DL44 y/o al tratamiento o prevención de un trastorno asociado con la expresión y/o actividad del receptor Notch. En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención se une específicamente a DLL . En algunas formas de realización, el anticuerpo se une específicamente al dominio extracelular (ECD) de DLL . En algunas formas de realización, el anticuerpo se une específicamente a un polipéptido que comprende o contiene esencialmente el dominio extracelular de DLL4. En algunas formas de realización, el anticuerpo se une específicamente a DLL4 con una KD de 1 nM aproximadamente o superior; es decir, de 500 pM aproximadamente o superior. En algunas formas de realización, el anticuerpo se une específicamente a DLL4 humana con una kon de 2 X 105 aproximadamente o superior, o 1 X 105 aproximadamente o superior. En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención reduce, inhibe y/o bloquea la actividad de DLL4 in vivo y/o in vitro. En algunas formas de realización, el anticuerpo compite por la unión con el ligando de DLL4 (reduce y/o bloquea la unión del receptor Notch a DLL4). En un aspecto, la invención proporciona composiciones que comprenden uno o más anticuerpos de la invención y una molécula vehículo. En una forma de realización, la molécula vehículo es farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo anti-DLL4 de la invención. En un aspecto, la invención proporciona vectores que comprenden un ácido nucleico de la invención. En un aspecto, la invención proporciona composiciones que comprenden uno o más ácidos nucleicos de la invención y una molécula vehículo. En una forma de realización, la molécula vehículo es farmacéuticamente aceptable.

En un aspecto, la invención proporciona células huésped que comprenden un ácido nucleico o un vector de la invención. Un vector puede ser de cualquier tipo; por ejemplo, un vector recombinante, como un vector de expresión. Se puede utilizar cualquiera de diversas células huésped o anfitriones celulares. En una forma de realización, una célula huésped es una célula procariótica , por ejemplo, E. coli. En una forma de realización, una célula huésped es una célula eucariótica, por ejemplo, una célula de mamífero, como una célula de ovario de hámster chino (CHO) . En un aspecto, la invención proporciona métodos de elaborar un anticuerpo de la invención. Por ejemplo, la invención proporciona métodos de elaborar un anticuerpo anti-DLL4 (que, según se define en la presente memoria descriptiva, incluye anticuerpos de longitud completa y fragmentos de estos) o inmunoconj ugados y estos métodos comprenden la expresión en una célula huésped idónea de un vector recombinante de la invención que codifique ese anticuerpo (o un fragmento del mismo) y la recuperación del anticuerpo . En un aspecto, la invención proporciona un artículo de fabricación que comprende un envase; y una composición contenida dentro del envase, en el que la composición incluye uno o más anticuerpos anti-DLL4 de la invención. En una forma de realización, la composición comprende además un agente antiangiogénico . En una forma de realización el agente antiangiogénico es un anticuerpo anti-VEGF, por ejemplo, bevacizumab. En una forma de realización, la composición comprende un ácido nucleico de la invención. En una forma de realización, una composición que incluye un anticuerpo comprende, además, una molécula vehículo, que, en algunas formas de realización, es farmacéuticamente aceptable. En una forma de realización, una segunda composición está contenida dentro del envase, donde la segunda composición comprende un agente antiangiogénico. En una forma de realización, el agente antiangiogénico es un anticuerpo anti-VEGF, por ejemplo, bevacizumab En una forma de realización, un artículo de fabricación de la invención comprende también instrucciones para la administración de la(s) composición ( es ) (por ejemplo, el anticuerpo) a un sujeto (como instrucciones para cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria descriptiva) . En un aspecto, la invención proporciona un kit que comprende un primer envase que contiene una composición que incluye uno o más anticuerpos anti-DLL4 de la invención; y un segundo envase que comprende una solución tamponada. En una forma de realización, la solución tamponada es farmacéuticamente aceptable. En una forma de realización, una composición que incluye un anticuerpo comprende, además, una molécula vehículo, que, en algunas formas de realización, es farmacéuticamente aceptable. En una forma de realización, un kit comprende también instrucciones para la administración de la composición (por ejemplo, el anticuerpo) a un sujeto. En un aspecto, la invención permite usar un anticuerpo anti-DLL4 de la invención en la preparación de un fármaco para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un trastorno, como un cáncer, un tumor y/o un trastorno de proliferación celular. En algunas formas de realización, el trastorno es un proceso patológico asociado a angiogénesis . En un aspecto, la invención permite usar un ácido nucleico de la invención en la preparación de un fármaco para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un trastorno, como un cáncer, un tumor y/o un trastorno de proliferación celular. En algunas formas de realización, el trastorno es un proceso patológico asociado a angiogénesis. 'En un aspecto, la invención permite usar un vector de expresión de la invención en la preparación de un fármaco para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un trastorno, como un cáncer, un tumor y/o un trastorno de proliferación celular. En algunas formas de realización, el trastorno es un proceso patológico asociado a angiogénesis . En un aspecto, la invención permite usar una célula huésped de la invención en la preparación de un fármaco para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un trastorno, como un cáncer, un tumor y/o un trastorno de proliferación celular. En algunas formas de realización, el trastorno es un proceso patológico asociado a angiogénesis. En un aspecto, la invención permite usar un articulo de fabricación de la invención en la preparación de un fármaco para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un trastorno, como un cáncer, un tumor y/o un trastorno de proliferación celular. En algunas formas de realización, el trastorno es un proceso patológico asociado a angiogénesis. En un aspecto, la invención permite usar un kit de la invención en la preparación de un fármaco para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un trastorno, como un cáncer, un tumor y/o un trastorno de proliferación celular. En algunas formas de realización, el trastorno es un proceso patológico asociado a angiogénesis. La invención proporciona métodos y composiciones útiles para la modulación de estados de la enfermedad asociados a la expresión y/o actividad de DLL4, como aumento o disminución de la expresión y/o actividad o expresión y/o actividad no deseadas . En un aspecto, la invención proporciona métodos para el tratamiento o prevención de un tumor, un cáncer y/o un trastorno de proliferación celular asociado a un aumento de la expresión y/o actividad de DLL4 ; los métodos incluyen la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-DLL4 a un sujeto que necesite dicho tratamiento. En un aspecto, la invención proporciona métodos para reducir, inhibir, bloquear o prevenir el crecimiento de un tumor o la extensión de un cáncer; estos métodos incluyen la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-DLL4 a un sujeto que necesite ese tratamiento. En un aspecto, la invención proporciona métodos para tratar un tumor, un cáncer y/o un trastorno de proliferación celular y estos métodos incluyen la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-DLL4 a un sujeto que necesite ese tratamiento. En un aspecto, la invención proporciona métodos para inhibir la angiogénesis que comprenden la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-DLL4 a un sujeto que necesite ese tratamiento.

En un aspecto, la invención proporciona métodos para tratar un proceso patológico asociado a angiogénesis que comprenden la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-DLL4 a un sujeto que necesite ese tratamiento. En algunas formas de realización, el proceso patológico asociado a angiogénesis es un tumor, un cáncer y/o un trastorno de proliferación celular. En algunas formas de realización, el proceso patológico asociado a angiogénesis es una enfermedad neovascular intraocular. Los métodos de la invención se pueden usar para influir en cualquier proceso patológico pertinente. En la presente memoria descriptiva se detallan trastornos a modo de ejemplo, entre los que destacan neoplasias malignas seleccionadas entre un grupo formado por cáncer de pulmón de células pequeñas, neuroblastomas , melanoma, cáncer de mama, cáncer de estómago, cáncer colorrectal y carcinoma hepatocelular , incluidas formas metastásicas de estas neoplasias malignas. Los métodos de la invención pueden comprender también pasos adicionales de tratamiento. Por ejemplo, en una forma de realización, un método comprende, además, un paso en el que la célula y/o tejidos considerados diana terapéutica (por ejemplo, para una célula cancerosa) quedan expuestos a radioterapia o a quimioterapia o a un agente antiangiogénico .

En otro aspecto, la invención proporciona métodos para la detección de DLL4 , los cuales comprenden la detección del complejo formado por DLL4 y anticuerpo anti-DLL4 en la muestra. Por "detección" se entiende en la presente memoria descriptiva la detección cualitativa y/o cuantitativa (niveles de mediciónn) con o sin referencia a un control. En otro aspecto, la invención proporciona métodos para diagnosticar un trastorno asociado a la expresión y/o actividad de DLL4, los cuales incluyen la detección del complejo formado por DLL4 y anticuerpos anti-DLL4 en una muestra biológica procedente de un paciente que tenga o posiblemente tenga el trastorno. En algunas formas de realización, la expresión de DLL4 es una expresión aumentada o anómala. En algunas formas de realización, el trastorno es un tumor, un cáncer y/o un trastorno de proliferación celular . En otro aspecto, la invención proporciona cualquiera de los anticuerpos anti-DLL4 descritos en la presente memoria descriptiva, donde el anticuerpo anti-DLL4 comprende un marcador detectable. En otro aspecto, la invención proporciona un complejo de cualquiera de los anticuerpos anti-DLL4 descritos en la presente memoria descriptiva y DLL4. En algunas formas de realización, el complejo está in vivo o in vitro. En algunas formas de realización, el complejo comprende una célula cancerosa. En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-DLL4 está marcado de forma detectable.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS FIGURA la, b: Secuencias en bucle de la HVR de la cadena ligera y la cadena pesada de anticuerpos anti-DLL4. La figuras muestran las secuencias de la HVR de la cadena pesada, Hl, H2 y H3 y las secuencias de la HVR de la cadena ligera, Ll, L2 y L3. La numeración de las secuencias es la siguiente: clon 152.26 (HVR-H1 es el identificador de secuencia n . ° : 1 ; HVR-H2 es el identificador de secuencia n.°:3; HVR-H3 es el identificador de secuencia n.°:9; HVR-L1 es el identificador de secuencia n.°:10; HVR-L2 es el identificador de secuencia n.°:ll; HVR-L3 es el identificador de secuencia n.°:12); clon 152.26.6 (HVR-Hl es el identificador de secuencia n.°:l; HVR-H2 es el identificador de secuencia n . ° : 4 ; HVR-H3 es el identificador de secuencia n.°:9; HVR-Ll es el identificador de secuencia n.°:10; HVR-L2 es el identificador de secuencia n.°:ll; HVR-L3 es el identificador de secuencia n.°:13); clon 152.26.14 (HVR-Hl es el identificador de secuencia n . ° : 2 ; HVR-H2 es el identificador de secuencia n.°:3; HVR-H3 es el identificador de secuencia n.°:9; HVR-L1 es el identificador de secuencia n.°:10; HVR-L2 es el identificador de secuencia n.°:ll; HVR-L3 es el identificador de secuencia n.°:14); clon 152.26.20 (HVR-H1 es el identificador de secuencia n . ° : 1 ; HVR-H2 es el identificador de secuencia n.°:5; HVR-H3 es el identificador de secuencia n.°:9; HVR-L1 es el identificador de secuencia n.°:10; HVR-L2 es el identificador de secuencia n.°:ll; HVR-L3 es el identificador de secuencia n.°:15); clon 152.26.34 (HVR-H1 es el identificador de secuencia n . ° : 1 ; HVR-H2 es el identificador de secuencia n.°:6; HVR-H3 es el identificador de secuencia n.°:9; HVR-L1 es el identificador de secuencia n.°:10; HVR-L2 es el identificador de secuencia n.°:ll; HVR-L3 es el identificador de secuencia n.°:16); clon 152.26.40 (HVR-H1 es el identificador de secuencia n.°:l; HVR-H2 es el identificador de secuencia n.°:7; HVR-H3 es el identificador de secuencia n.°:9; HVR-Ll es el identificador de secuencia n.°:10; HVR-L2 es el identificador de secuencia n.°:ll; HVR-L3 es el identificador de secuencia n.°:17); y clon 152.26.82 (HVR-H1 es el identificador de secuencia n.°:l; HVR-H2 es el identificador de secuencia n.°:8; HVR-H3 es el identificador de secuencia n.°:9; HVR-Ll es el identificador de secuencia n.°:10; HVR-L2 es el identificador de secuencia n.°:ll; HVR-L3 es el identificador de secuencia n. ° : 18) . Las posiciones aminoacidicas están numeradas según el sistema de numeración de Kabat, como se describe más adelante. FIGURAS 2a, 2b y 3: muestran ejemplos de secuencias de estructura de consenso humanas de aceptor para uso en la aplicación de la invención con identificadores de secuencia, como se indica a continuación: Estructuras de consenso variables de la cadena pesada (VH) (Figuras 2a, b) estructura de consenso del subgrupo I humano de VH menos las CDR de Kabat ( identificador de secuencia n.°: 19) estructura de consenso del subgrupo I humano de VH menos regiones hipervariables extendidas ( identificadores de secuencia núms : 20-22) estructura de consenso del subgrupo II humano de VH menos las CDR de Kabat (identificador de secuencia n.°: 23) estructura de consenso del subgrupo II humano de VH menos regiones hipervariables extendidas ( identificadores de secuencia núms: 24-26) estructura de consenso del subgrupo II humano de VH menos extendida estructura de consenso del subgrupo III humano de VH menos las CDR de Kabat ( identificador de secuencia n.°: 27) estructura de consenso del subgrupo III humano de VH menos regiones hipervariables extendidas ( identificadores de secuencia núms : 28-30) estructura del aceptor humano de VH menos las CDR de Kabat ( identificador de secuencia n . ° : 31) estructura del aceptor humano de VH menos regiones hipervariables extendidas ( identificadores de secuencia núms: 32-33) estructura del aceptor 2 humano de VH menos las CDR de Kabat ( identificador de secuencia n.°: 34) estructura del aceptor 2 humano de VH menos regiones hipervariables extendidas ( identificadores de secuencia núms: 35-37) Estructuras de consenso variables de la cadena ligera (VL) (Figura 3) estructura de consenso del subgrupo I humano kappa de VL ( identificador de secuencia n.°: 38) estructura de consenso del subgrupo II humano kappa de VL ( identificador de secuencia n.°: 39) estructura, de consenso del subgrupo III humano kappa de VL (identificador de secuencia n.°: 40) estructura de consenso del subgrupo IV humano kappa de VL ( identificador de secuencia n.°: 41) FIGURA 4 : muestra las secuencias de la región estructural de las cadenas ligera y pesada de huMAb4D5-8. Los números que aparecen como superindice/en negrita indican posiciones de aminoácidos según Kabat. FIGURA 5: muestra las secuencias modificadas o las variantes de secuencias de la región estructural de las cadenas ligera y pesada de huMAb4D5-8. Los números que aparecen como superindice/en negrita indican posiciones de aminoácidos según Kabat. FIGURA 6: muestra las regiones variables de la cadena pesada y las regiones variables de la cadena ligera de los clones 26.20, 26.14 y 26.82 del anticuerpo. FIGURA 7a - 77h: La señalización de Notch mediada por DLL4 regulaba la proliferación de células endoteliales . a-c, f Ensayos de formación de brotes de HUVEC en geles de fibrina tridimensionales. El anticuerpo anti-DLL4 (Y 26.82) o DBZ promoviá la formación de brotes de células endoteliales humanas derivadas de la vena umbilical (HUVEC) (a) . La tinción con Ki67 puso de manifiesto que el anticuerpo anti-DLL4 o DBZ causaba hiperproliferación de las HUVEC (b) . El anticuerpo anti-DLL4 o DBZ aumentaba la formación de brotes de HUVEC en presencia del medio de cultivo condicionado por SF (c) . d, h, La administración sistémica del anticuerpo anti-DLL4 causaba acumulación masiva de células endoteliales en las retinas de neonatos. Imágenes confocales de escasa (arriba) y elevada (abajo) ampliación de la vasculatura de la retina (tinción con isolectina) (d) . La tinción con Ki67 muestra un aumento de la proliferación de células endoteliales en las retinas de neonatos tratadas con anticuerpo anti-DLL4 (h) . e, La activación de Notch mediante DLL4 inmovilizado inhibía la proliferación de HUVEC. f, El anticuerpo anti-VEGF inhibía la formación de brotes de HUVEC en presencia o ausencia de DBZ . g, Regulación del VEGFR2 mediante Notch. Análisis cuantitativo mediante PCR de la expresión del VEGFR2 en respuesta al bloqueo de Notch en cultivos de gel de fibrina tridimensionales de HUVEC (7 d) por anticuerpo anti-DLL4 o DBZ (izquierda) o activación de Notch en cultivo bidimensional de HUVEC (36 horas) por DLL4 inmovilizado (derecha) . El anticuerpo anti-DLL4 y DBZ se utilizaron a 5 g/ml y 0,08 µ?, respectivamente (a-c, e-g) . FIGURA 8a - 8d La señalización de Notch mediada por DLL4 regulaba la diferenciación de células endoteliales. a, Las estructuras con forma de luz (flechas blancas) formadas por HUVEC cultivadas en geles de fibrina se perdían en presencia del anticuerpo anti-DLL4 o DBZ . En cambio, los brotes estaban repletos de células (flechas negras) . b, Regulación de TGF 2 mediante Notch. Análisis cuantitativo mediante PCR de . la expresión del TGF 2 en respuesta al bloqueo de Notch en cultivos de gel de fibrina tridimensionales de HUVEC (7 d) por anticuerpo anti-DLL4 o DBZ (izquierda) o activación de Notch en cultivo bidimensional de HUVEC (36 horas) por DLL4 inmovilizado (derecha) . c, El anticuerpo anti-DLL4 bloquea el desarrollo arterial. Imágenes confocales de retinas de ratones neonatos sometidas a tinción con actina alfa de músculo liso (ASMA) e isolectina. Se trató a los ratones neonatos como se describe en la Fig. Id. d, Imágenes confocales de retinas de ratón adulto sometidas a tinción con ASMA e isolectina. Se trató a ratones de 8 semanas de vida con PBS o anticuerpo anti-DLL4 (10 mg/kg, dos veces a la semana) durante dos semanas. FIGURA 9a - 9p: El bloqueo selectivo de DLL4 y/o VEGF alteraba la angiogénesis tumoral e inhibe el crecimiento tumoral. a-f, Resultados de modelos de tumor: HM7 (a), Colo205 (b) , Calu6 (c) , MDA-MB-435 (d) , MV-522 (e) y EHI3 (f) . Se presenta la media de los volúmenes tumorales, con su error estándar (EE) . g-h, Estudios histológicos de la vasculatura tumoral. Estudios inmunohistoquimicos del anticuerpo anti-CD31 en cortes del tumor EL4 en comparación con ratones control y ratones tratados con anticuerpo anti-DLL4 y anticuerpo anti-VEGF (g) . Perfusión de lectina y tinción con anti-CD31 en cortes de tumor EL4 (h) . i-p. Resultados de los modelos de tumor SK-0V-3X1 (i), LL2 (j), EL4 (k), H1299 (1), SKMES-1 (m) , MX-1 (n) , S 620 (o) y LS174T (p) · FIGURA 10a - 101: El DLL /Noten no era importante para la homeostasis del intestino de ratón. Estudos inmunohistoquimicos del intestino delgado de ratones control (a, d, g, j), ratones tratados con anticuerpo anti-DLL4 (10 mg/kg, dos veces al semana durante 6 semanas) (b, e, h, k) y ratones tratados con DBZ (30 mol/kg al día durante 5 días) (c, f, i, 1) . Como se observa mediante tinción con hematoxilina y eosina (a, b, c) y tinción con azul alciano (d, e, f ) , DBZ ocasionó la sustitución de la población de células transitorias amplificadoras por células caliciformes. Este cambio no se observó en ningún momento en el tratamiento con anticuerpo anti-DLL4. La tinción con Ki67 (g, h, i) y HES-1 (j, k, 1) confirmó una vez más que el anticuerpo anti-DLL4 no reproducía el efecto de DBZ. FIGURA la - lie: Caracterización del anticuerpo anti-DLL4. a, Mapeo del epítopo del anticuerpo monoclonal (Mab) anti-DLL4 YW26.82. Representación esquemática de un conjunto de mutantes de DLL4 expresados como proteínas de fusión con fosfatase alcalina (AP) placentaria humana en el extremo C terminal. Se llevaron a cabo ensayos de los medios de cultivo condicionados de células 293T que contenían las proteínas de fusión en 96 pocilios de placas de microtitulación recubiertas con anticuerpo anti-DLL4 purificado (YW26.82, 0,5 yg/ml) . La unión DLL4.AP se detectó utilizando PNPP en una sola fase (Pierce) como sustrato y una medición de la absorbancia (OD) a 405 nm. b-d, Unión selectiva de YW26.82 a DLL4. Se revistieron las placas Nunc MaxiSorp™ de 96 pocilios con proteínas recombinantes purificadas como se indica (1 pg/ml). La unión de YW26.82 a las concentraciones indicadas se midió utilizando el ensayo ELISA. Los anticuerpos unidos se detectaron con el conjugado de HRP con anticuerpo antihumano usando TMB como sustrato y una lectura de la absorbancia (OD) a. 450 nm. Como control durante el ensayo se utilizaron ErbB2 -ECD recombinante y anticuerpo anti-HER2 (b) . Análisis- FACS de 293 células transíectadas de forma transitoria con vector, DLL4 de longitud completa, Jagl o DLL1. Sólo se detectó unión significativa de YW26.82 en células transíectadas con DLL4 (panel superior) . La expresión de Jagl y DLL1 se confirmó mediante la unión de Notchl-Fc murino recombinante ( rrNotchl-Fc, panel central) y Notch2-Fc murino recombinante (rrNotch2-Fc, panel inferior) , respectivamente. Se utilizaron YW26.82, rrNotchl-Fc o rrNotch2-Fc (R&D System) a 2 pg/ml, seguido de IgG-PE antihumana de cabra (1:500, Jackson ImmunoResearch) (c) . El anticuerpo anti-DLL4 bloqueó la unión de DLL4-AP, pero no de DLL1-AP, a rNotchl recubierto, con una IC50 calculada de 12 nM aproximadamente (panel izquierdo) . El anticuerpo anti-DLL4 bloqueaba la unión de DLL4-His, pero no de Jagl-His, a rNotchl recubierto, con una IC50 calculada de 8 nM aproximadamente (panel derecho) (d) . e, Unión especifica de YW26.82 a DLL4 expresado de forma endógena. Análisis FACS de HUVEC transfectadas con ARNsi especifico de DLL4 o control. Y 26.82 se utilizó a 2 g/ml, seguido de IgG-PE antihumana de cabra (1:500, Jackson ImmunoResearch) (e) . FIGURA 12: Regulación ascendente de DLL4 mediante activación de Notch. Las HUVEC fueron estimuladas mediante DLL4 humano marcado con His inmovilizado en el extremo C terminal (aminoácidos 1-404) en ausencia o presencia de DBZ (0,08 µ?) . Treinta y seis horas después de la estimulación, se estudió la expresión endógena de DLL4 mediante análisis FACS con anticuerpo anti-DLL4.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención contenida en la presente memoria descriptiva proporciona anticuerpos anti-DLL4, que son útiles, por ejemplo, para el tratamiento o prevención de procesos patológicos asociados a la expresión y/o actividad de DLL4, como aumento de la expresión y/o actividad o expresión y/o actividad no deseadas. En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se utilizan para tratar un tumor, un cáncer y/o un trastorno de proliferación celular. En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se utilizan para tratar un proceso patológico asociado a angiogénesis . En otro aspecto, los anticuerpos anti-DLL4 de la invención tienen utilidad como reactivos para la detección y/o aislamiento de DLL4, como la detección de DLL4 en diversos tejidos y tipos celulares. La invención proporciona, además, métodos de elaboración de anticuerpos anti-DLL4 y polinucleótidos que codifiquen anticuerpos anti-DLL4. Técnicas generales Las técnicas y procedimientos descritos o referenciados en la presente memoria descriptiva se conocen bien, por lo general, y se emplean habitualmente con la metodología tradicional usada por los expertos en la materia, como, por ejemplo, las metodologías ampliamente utilizadas y descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds . , (2003)); la serie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames y G. R. Taylor eds. (1995)), Harlo y Lañe, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, y ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)). Definiciones Un anticuerpo "aislado" es aquél que se ha identificado y separado, y/o recuperado, a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir en el diagnóstico o los usos terapéuticos del anticuerpo, incluyendo enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos y no proteináceos. En las formas de realización preferentes, el anticuerpo se purificará (1) en más del 95% de su peso tal como se determina por el método de Lowry, y más preferentemente, en más del 99% de su peso, (2) en un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia N terminal o interna de aminoácidos mediante un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta alcanzar la homogeneidad mediante SDS-PAGE, en condiciones reductoras o no reductoras, empleando una tinción con .azul de Coomassie™ o, preferentemente, plata. Los anticuerpos aislados incluyen el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes , ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Asimismo, un anticuerpo aislado incluye el anticuerpo en el medio que circunda a las células recombinantes. En cualquier caso, normalmente, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación . Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de, al menos, una molécula contaminante de ácido nucleico con la que se asocia habitualmente en la fuente natural del ácido nucleico del anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislada es distinta de la forma o entorno en los que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico que existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que habitualmente expresan el anticuerpo donde, por ejemplo, la molécula del ácido nucleico está en una posición cromosómica distinta de la que tiene en las células naturales. El término "numeración de residuos del dominio variable como en Kabat" o "numeración de la posición de los aminoácidos como en Kabat", y las variaciones de los mismos, se refiere al sistema de numeración usado para los dominios variables de la cadena pesada o los dominios de la cadena variable de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Utilizando este sistema de numeración, la secuencia lineal real de aminoácidos puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales que correspondan a un acortamiento de una FR o CDR del domino variable o a una inserción en ellas. Por ejemplo, un dominio variable de la cadena pesada puede incluir una única inserción de aminoácidos (residuo 52a según Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b y 82c, etc., según Kabat) después de un residuo 82 de la FR de la cadena pesada. La numeración de Kabat de los residuos puede estar determinada para un anticuerpo dado por una alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia "estándar" numerada según Kabat.

Las frases " sustancialmente similar" o " sustancialmente el/la mismo (a) ", tal y como se usan en la presente memoria descriptiva", denotan un grado suficientemente elevado de similitud entre dos valores numéricos (por lo general, uno asociado a un anticuerpo de la invención y el otro asociado a un anticuerpo de control/referencia) , de forma que alguien experto en la materia consideraría la diferencia entre los dos valores de escasa o ninguna significación estadística y/o biológica dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores Kd) . La diferencia entre estos dos valores es, preferiblemente, inferior al 50% aproximadamente; preferiblemente, inferior al 40% aproximadamente; preferiblemente, inferior al 30% aproximadamente; preferiblemente, inferior al 20% aproximadamente; preferiblemente, inferior al 10% aproximadamente como función del valor para el anticuerpo de control/referencia. Por "afinidad de unión" generalmente se entiende la fuerza de la suma total de las interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su molécula de enlace (por ejemplo, un antígeno) . Salvo indicación en contrario, tal como se usa en la presente memoria descriptiva, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno) . La afinidad de una molécula X por su molécula de enlace Y se puede representar por lo general mediante la constante de disociación (Kd) . La afinidad se puede medir mediante métodos habituales conocidos en la especialidad, incluidos los descritos en la presente memoria descriptiva. Los anticuerpos de baja afinidad se suelen unir al antígeno lentamente y se suelen disociar de inmediato, mientras que los anticuerpos de alta afinidad se unen al antígeno con mayor rapidez, por lo general, y suelen permanecer unidos más tiempo. Existen diversos métodos para medir la afinidad de unión conocidos en la especialidad y todos ellos se pueden utilizar para los fines de la presente invención. A continuación, se describen, a modo de ejemplo, formas de realización específicas. En una forma de realización, la "Kd" o el "valor Kd" según esta invención se mide mediante un ensayo de unión a antígenos radiomarcados (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno, descrito por el siguiente ensayo que mide la afinidad de unión en solución de los Fab a antígenos equilibrando los Fab con una concentración mínima del antígeno marcado con (125I) en presencia de una serie de titulación de antigeno no marcado y, luego, capturando el antigeno unido con una placa con revestimiento de anticuerpos anti-Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Para establecer las condiciones del ensayo, las placas de microtitulación (Dynex) permanecen recubiertas durante toda la noche con 5 yg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en 50 mM de carbonato sódico (pH 9,6) y, a continuación, son bloqueadas con 2% (p/v) de albúmina de suero bovino en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (23 °C aproximadamente) . En una placa no adsorbente (Nunc n.° 269620), 100 pM o 26 pM de antigeno marcado con [125I] se mezclan con diluciones seriadas de un Fab de interés (por ejemplo, que concuerde con la evaluación de un anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., (1997) Cáncer Res. 57:4593-4599). A continuación, el Fab de interés se incuba durante toda la noche; no obstante, la incubación puede continuar durante más tiempo (por ejemplo, 65 horas) para garantizar que se alcanza el equilibrio. Después, las mezclas se transfieren a la placa de captura para su incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora) . Luego, se extrae la solución y se lava la placa ocho veces con Tween®20 al 0,1% en PBS. Una vez secas las placas, se añaden 150 µ?/pocillo de centelleador (MicroScint™-20 ; Packard) y las placas se cuentan en un contador gamma TopCount (Packard) durante diez minutos. Se eligen concentraciones de cada Fab que proporcionan menos del 20% de unión máxima o un 20% para uso en ensayos de unión competitivos. Según otra forma de realización, el Kd o valor Kd se mide utilizando un análisis de resonancia plasmón de superficie que usa BIAcore™-2000 o BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, New Jersey) a 25 °C con chips CM5 de antigeno inmovilizado a -10 unidades de respuesta (RU) . Los biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc) se activan con clorhidrato de N-etil-N' - (3-dimetilaminopropil ) -carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS), según las instrucciones del proveedor. El antigeno se diluye con 10 mM de acetato sódico, pH 4,8, a 5 pg/ml (-0,2 µ?) antes de la inyección a un caudal de 5 µ?/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de la proteina emparejada. Tras la inyección del antigeno, se inyecta 1 M de etanolamina para bloquear grupos no reaccionados. Para mediciones cinéticas, se inyecta el doble de diluciones seriadas de Fab (0,78 nM a 500 mM) en PBS con 0,05% de Tween®20 (PBST) a 25°C a un caudal de 25 l/min aproximadamente. Las tasas de asociación (kon) y las tasas de disociación (koff) se calculan utilizando un sencillo modelo de unión uno a uno de Langmuir (BIAcore Evaluation Software, versión 3.2) al encajar simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calcula como el cociente k0ff/kon. Véase, por ejemplo, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Si la tasa de asociación excede de 106 M-l S-l según el ensayo de resonancia plasmón de superficie mencionado anteriormente, la tasa de asociación se puede determinar utilizando una técnica de absorción fluorescente que mide el aumento o disminución de la intensidad de la emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm de frecuencia) a 25 °C de 20 nM de un anticuerpo anti-antigeno (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones cada vez más elevadas de antigeno según medición en un espectrómetro, como un espectrómetro equipado con módulo "stop-flow" (interruptor de flujo) (Aviv Instruments) o un espectrómetro SLM-Aminco serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta con agitador. Según esta invención, también se puede determinar la "tasa de asociación" o "kon" con la misma técnica de resonancia plasmón de superficie descrita anteriormente utilizando BIAcore™-2000 o BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, New Jersey) a 25 °C con chips CM5 de antigeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (RU) . Los biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc) se activan con clorhidrato de N-etil-N' - ( 3-dimetilaminopropil ) - carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS), según las instrucciones del proveedor. El antigeno se diluye con 10 mM de acetato sódico, pH 4,8, a 5 yg/ml (~0,2 µ?) antes de la inyección a un caudal de 5 µ?/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de la proteina emparejada. Tras la inyección del antigeno, se inyecta 1 M de etanolamina para bloquear grupos no reaccionados. Para mediciones cinéticas, se inyecta el doble de diluciones seriadas de Fab (0,78 nM a 500 mM) en PBS con 0,05% de Tween®20 (PBST) a 25°C a un caudal de 25 l/min aproximadamente. Las tasas de asociación (kon) y las tasas de disociación (kQff) se calculan utilizando un sencillo modelo de unión uno a uno de Langmuir (BIAcore Evaluation Software, versión 3.2) al encajar simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La. constante de disociación de equilibrio (Kd) se calculó como el cociente koff/kon. Véase, por ejemplo, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865- 6 —1 881. Sin embargo, si la tasa de asociación excede de 10 M -i S según el ensayo de resonancia plasmón de superficie mencionado anteriormente, la tasa de asociación se determina, preferentemente, utilizando una técnica de absorción fluorescente que mide el aumento o disminución de la intensidad de la emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm de frecuencia) a 25 °C de 20 nM de un anticuerpo anti-antigeno (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones cada vez más elevadas de antigeno según medición en un espectrómetro, como un espectrómetro equipado con módulo "stop-flow" (interruptor de flujo) (Aviv Instruments) o un espectrómetro SLM-Aminco serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta con agitador. En la presente memoria descriptiva, por "vector" se entiende una molécula de un ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", término que hace referencia a un bucle de ADN circular de doble hebra al que se pueden ligar segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector fágico. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que segmentos adicionales de ADN se pueden ligar al genoma vírico. Algunos vectores tienen capacidad de replicación autónoma en el huésped celular en el que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episomales en mamíferos) . Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales en mamíferos) se puedén integrar en el genoma de un huésped celular al introducirse en el huésped y, de este modo, se replican al mismo tiempo que el genoma del huésped. Asimismo, hay vectores capaces de dirigir la expresión de genes a los que están enlazados por su función. Estos vectores se denominan, en la presente memoria descriptiva, "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente "vectores recombinantes " ) . En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante tienen con frecuencia la forma de plásmidos. En la presente especificación, los términos "plásmido" y "vector" son intercambiables, dado que el plásmido es la forma de vector más frecuentemente usada. En la presente memoria descriptiva, "polinucleótido" , o "ácido nucleico", son términos usados indistintamente y se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluyen ADN y AR . Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos , ribonucleótidos , nucleótidos modificados o bases, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que se pueda incorporar a un polímero mediante ADN o ARN polimerasa o mediante una reacción sintética. Un polinucleótido puede incluir nucleótidos modificados, como nucleótidos metilados y sus análogos. De estar presente, la modificación de la estructura del nucleótido se puede producir antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede verse interrumpida por componentes no nucleótidos. Un polinucleótido puede modificarse nuevamente tras la síntesis, por ejemplo mediante conjugación con un marcador. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "cofias", sustitución de uno o más de los nucleótidos que se producen de forma natural por un análogo; modificaciones de enlaces internucleótidos , como aquellas en las que intervienen enlaces no cargados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres , fosfoamidatos , carbamatos, etc.) y enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos , fosforoditioatos , etc.); las que contienen porciones colgantes, como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, poli-L-lisina, etc.); las que contienen intercaladores (por ejemplo, acridina, psoralen, etc.); las que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidativos, etc.); las que contienen alquilantes; las que contienen enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos anoméricos alfa, etc.), así como formas no modificadas del polinucleótido o polinucleótidos . Asimismo, cualquiera de los grupos hidroxilo presentes, habitualmente en los azúcares puede sustituirse, por ejemplo, por grupos de fosfonatos, grupos fosfatos, protegerse mediante grupos protectores estándar, o activarse para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales, o puede conjugarse a soportes sólidos o semisólidos. El OH de los extremos 5' y 3' terminales puede fosforilarse y sustituirse por aminas o porciones de grupos orgánicos en casquete (capping) de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden derivati zarse a grupos protectores estándar. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares ribosa o desoxirribosa que son generalmente conocidos en la materia, por ejemplo, 2 ' -O-metil-, 2'-0-allil, 2'-fluoro- o 2 ' -azido-ribosa, análogos de azúcares carbociclicos , azúcares alfa-anoméricos , azúcares epiméricos como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares piranosas, azúcares furanosas, sedoheptulosas, análogos aciclicos y análogos nucleósidos básicos como metil ribosida. Uno o más enlaces de fosfodiéster pueden sustituirse por otros grupos de enlace alternativos. Estos grupos alternativos de enlace incluyen formas de realización en las que el fosfato es sustituido por P(0)S ("tioato"), P(S)S ( "ditioato" ) , "(0)NR2 ("amidato"), P(0)R, P(0)OR', CO o CH2 ( "formacetal" ) , donde cada R o R' es independientemente H o alquilo sustituido o no sustituido (1 a 20 C) que contiene opcionalmente un enlace a éter (-0-), aril, alquenil, cicloalquil, cicloalquenil o aradil. No todos los enlaces en un polinucleótido tienen que ser idénticos. La descripción anterior se aplica a todos los polinucleótidos mencionados en la presente memoria descriptiva, incluido el ARN y el ADN . En la presente memoria descriptiva, por "oligonucleótido" se entiende, por lo general, polinucleótidos cortos, habitualmente de hebra única y sintéticos, que suelen tener una longitud inferior a 200 nucleótidos, aunque no necesariamente. Los términos "oligonucleótido" y "poligonucleótido" no se excluyen mutuamente. La descripción anteriormente incluida sobre polinucleótidos es aplicable igualmente y en su integridad a los oligonucleótidos . El "Porcentaje (%) de identificación de la secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia de péptidos o polipéptidos se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en un secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia peptidica o polipeptidica especifica, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identificación de la secuencia y no considerar ninguna sustitución conservadora parte, de la identificación de la secuencia. A efectos de determinar el porcentaje de identificación de la secuencia de aminoácidos, la alineación se puede conseguir de varias formas que son conocidas en este ámbito; por ejemplo, usar software comercializado como BLAST, BLAST-2, ALIGN o MegAlign (DNASTAR) . Los expertos en este campo pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, incluidos los algoritmos necesarios para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, a efectos de la presente memoria descriptiva, los valores porcentuales de identificación de la secuencia de aminoácidos se generan utilizando el software de comparación de secuencias ALIGN-2. Dicho software fue creado por Genentech, Inc. y el código fuente ha sido presentado, junto con la documentación del usuario, en la Oficina de Derechos de Autor de Estados Unidos, Washington D.C., 20559, donde está inscrito con el n.° de Registro de Derechos de Autor de Estados Unidos TXU510087. El programa ALIGN-2 está comercializado por Genentech, Inc., South San Francisco, California. Este programa debe ser compilado para su uso en un sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX V4.0D digital. El programa ALIGN-2 define todos los parámetros de comparación de secuencias, que no varían.

En situaciones en las que se emplea ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de aminoácidos, el porcentaje de identificación de la secuencia de aminoácidos de una determinada secuencia aminoacidica A con respecto a una determinada secuencia aminoacidica B (lo que también se puede expresar diciendo que una determinada secuencia aminoacidica A tiene o contiene un porcentaje concreto de identificación de la secuencia aminoacidica con respecto a una determinada secuencia aminoacidica B) se calcula de la siguiente manera: 100 veces la fracción X/Y en la que X es la cantidad de residuos de aminoácidos establecidos como coincidencia total por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación de A y B por ese programa , y en la que Y es la cantidad total de residuos de aminoácidos en B. Se detectará que, cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no sea igual que la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el porcentaje de identificación de la secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no será igual que el porcentaje de identificación de la secuencia de aminoácidos de B con respecto a A.

Salvo indicación expresa en contrario, todos los valores del porcentaje de la identificación de la secuencia de aminoácidos usados en la presente memoria descriptiva se obtienen como se ha descrito en el párrafo precedente, utilizando el programa informático ALIGN-2. El término "DLL4" (también llamado indistintamente "delta-like 4"), como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere, salvo indicación expresa o salvo que del contexto se desprenda otro sentido, a cualquier polipéptido nativo de DLL4 o a cualquier variante del polipéptido de DLL4 (sea nativo o sintético) . El término "secuencia nativa" engloba específicamente formas segregadas o truncadas que se producen de forma natural (por ejemplo, una secuencia de un dominio extracelular ) , las variantes que se producen de forma natural (por ejemplo, formas alternativas de ayuste) y las variantes alélicas que se producen de forma natural. El término "DLL4 de tipo natural" suele referirse a un polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos de una proteína de DLL4 que se produce naturalmente. El término "secuencia de DLL4 de tipo natural" suele referirse a una secuencia de aminoácidos encontrada en una DLL4 que se produce naturalmente.

El término "Receptor Noten" (también llamado indistintamente "Noten"), como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere, salvo indicación expresa o salvo que del contexto se desprenda otro sentido, a cualquier polipéptido nativo del receptor Notch o a cualquier variante del polipéptido del receptor Notch (sea nativo o sintético). Los humanos tienen cuatro receptores Notch (Notchl, Notch 2, Notch3 y Notch4) . En la presente memoria descriptiva, el término "Receptor Notch" incluye cualquiera de los cuatro receptores Notch humanos o todos ellos. El término "secuencia nativa" engloba específicamente formas segregadas o truncadas que se producen de forma natural (por ejemplo, una secuencia de un dominio extracelular ) , las variantes que se producen de forma natural (por ejemplo, formas alternativas de ayuste) y las variantes alélicas que se producen de forma natural. El término "receptor Notch de tipo natural" suele referirse a un polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos de una proteína del receptor Notch que se produce naturalmente. El término "secuencia del receptor Notch de tipo natural" suele referirse a una secuencia de aminoácidos encontrada en un receptor Notch que se produce naturalmente.

Los términos "anticuerpo" e " inmunoglobulina " se usan indistintamente en el sentido más amplio e incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales intactos o de longitud completa) , anticuerpos policlonales , anticuerpos multivalentes , anticuerpos multiespecificos (por ejemplo, anticuerpos biespecificos en tanto en cuanto presenten la actividad biológica deseada) y también pueden incluir determinados fragmentos de anticuerpos (como se describe con mayor detalle en la presente memoria descriptiva). Un anticuerpo puede ser humano, humanizado y/o con maduración de afinidad. El término "variable" hace referencia al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en sus secuencias de un anticuerpo a otro y se utilizan para la unión y especificidad de cada anticuerpo concreto con respecto a su antigeno. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a través de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones de determinación de complementariedad (CDR) o regiones hipervariables (HVR) de los dominios variables tanto de la cadena ligera como de la pesada. Las porciones más conservadas de los dominios variables se llaman estructura (FR). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativas comprenden cuatro regiones FR que, en su mayor parte, adoptan una configuración de hoja-ß, y están conectadas por tres CDR, que crean bucles que conectan la estructura de la hoja-ß, y en algunos casos forman parte de ella. Las CDR de cada cadena se mantienen unidas y en estrecha proximidad mediante las regiones FR y, junto a las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Los dominios constantes no participan directamente en la unión de un anticuerpo a un antigeno, pero desarrollan diversas funciones efectoras, como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad con mediación celular dependiente de anticuerpos. La digestión con papaina de anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de unión a antigeno, llamados fragmentos "Fab", cada uno de los cuales tiene un solo punto de unión a antigeno, y un fragmento "Fe" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizarse fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación a antigeno y sigue siendo capaz de establecer un enlace cruzado con el antigeno.

El "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de reconocimiento y unión a antígeno. En una especie Fv de dos cadenas, esta región está compuesta por un dímero de un domino variable de la cadena pesada y otro de la cadena ligera en una estrecha asociación no covalente. En una especie Fv de cadena única, un dominio variable de la cadena pesada y otro de la cadena ligera se pueden enlazar covalentemente mediante un enlazador peptídico flexible, de forma que las cadenas pesada y ligera se asocien en una estructura "dimérica" análoga a la presente en una especie Fv de dos cadenas. En esta configuración, las tres regiones CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones CDR confieren al anticuerpo una especificidad de unión a antígeno. No obstante, incluso un dominio variable simple (o la mitad de un Fv que comprenda únicamente tres regiones CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer un antígeno y unirse a él, aunque con una afinidad inferior a la del sitio de unión completo. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' se diferencian de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en el extremo carboxi terminal del dominio CH1 de cadena pesada, incluidas una o más cisteinas de la región bisagra de un anticuerpo. Fab'-SH es la denominación que se da en la presente memoria descriptiva al Fab' en el que el residuo o residuos de cisteina de los dominios constantes presentan un grupo tiol libre. Los fragmentos F(ab')2 de anticuerpos se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' con cisteinas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos. Las "cadenas ligeras" de anticuerpos ( inmunoglobulinas ) de cualquier vertebrado pueden asignarse a una de dos clases claramente diferenciadas, denominadas kappa (?) y lambda (?) , en función de las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes . Según la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a distintas clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de éstas pueden seguir dividiéndose en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las distintas clases de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, ? y µ, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las distintas clases de inmunoglobulinas son muy conocidas. Los "fragmentos de anticuerpos" contienen únicamente una porción de un anticuerpo intacto, en la que la porción conserva al menos una de las funciones normalmente asociadas a esa porción cuando está presente en un anticuerpo intacto, aunque es preferible que conserve la totalidad o la mayoría de estas funciones. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpos están los fragmentos Fab, Fab ' , F(ab')2 y Fv, los diacuerpos, los anticuerpos lineales, las moléculas anticuerpos de cadena única y los anticuerpos multiespecífieos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. En una forma de realización, un fragmento de anticuerpo contiene un sitio de unión a antígeno del anticuerpo intacto y, de este modo, conserva la capacidad para unirse al antígeno. En otra forma de realización, un fragmento de anticuerpo, por ejemplo uno que contiene la región · Fe, conserva al menos una de las funciones biológicas habitualmente asociadas a la región Fe cuando está presente en un anticuerpo intacto, como la unión a FcRn, la modulación de la semivida del anticuerpo, la función de la ADCC y la unión a complemento. En una forma de realización, un fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente que in vivo tiene una semivida sustancialmente similar a la de un anticuerpo intacto. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo de este tipo puede contener un brazo de unión a antigeno enlazado a una secuencia Fe capaz de dar estabilidad in vivo al fragmento.

En la presente memoria descriptiva, por "región hipervariable" , "HVR" o "HV" se entienden las regiones de un dominio variable de un anticuerpo que son hipervariables en su secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos. Por lo general, los anticuerpos contienen seis regiones hipervariables: tres en la VH (Hl, H2, H3) y tres en la VL (Ll, L2, L3) . En la presente memoria descriptiva se usan y engloban diversas delineaciones de regiones hipervariables. Las regiones de determinación de complementariedad (CDR) de Kabat están basadas en la variabilidad de las secuencias y son las más frecuentemente usadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, D. (1991)). Chothia, en cambio, se refiere a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol . 196:901-917 (1987)). Las regiones hipervariables de un anticuerpo monoclonal (AbM) representan una solución intermedia entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia y son las utilizadas en el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Las regiones hipervariables "de contacto" se basan en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. A continuación, se indican los residuos procedentes de cada una de estas regiones hipervariables . Bucle Kabat AbM Chothia Contacto Ll L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30- L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46- L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 Hl H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Numeración de Kabat) Hl H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Numeración de Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101 Las regiones hipervariables pueden comprender "regiones hipervariables ampliadas" como se indica a continuación: 24-36 ó 24-34 (Ll), 46-56 ó 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en la VL y 26-35 (Hl), 50-65 ó 49-65 (H2) y 93-102, 94-102 ó 95-102 (H3) en la VH. Los residuos del dominio variable están numerados según Kabal et al., como se ha indicado anteriormente para cada una de estas definiciones. Los residuos de una "estructura" o "FR" son aquellos residuos de un dominio variable distintos a los de una región hipervariable , tal como se define en la presente memoria descriptiva. El término "anticuerpo monoclonal", en el contexto de la presente memoria descriptiva, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos y/o se unen al mismo o a los mismos epitopos, excepto en el caso de posibles variantes que pudiesen surgir durante la producción del anticuerpo monoclonal, las cuales, por lo general, estarían presentes en cantidades insignificantes. Generalmente, dicho anticuerpo monoclonal incluye un anticuerpo que comprende una secuencia de polipéptidos que se une a una diana, donde dicha secuencia de polipéptidos unida a una diana se obtiene mediante un proceso que incluye la selección de una secuencia de polipéptidos única unida a una diana a partir de una gran variedad de secuencias de polipéptidos. Por ejemplo, el proceso de selección puede consistir en la selección de un único clon a partir de una gran variedad de clones, como un conjunto de clones de hibridoma, clones de fago o clones del ADN recombinante . Deberla entenderse que la secuencia seleccionada de unión a una diana puede sufrir más alteraciones; por ejemplo, para mejorar la afinidad con la diana, humanizar la secuencia de unión a la diana, mejorar su producción en cultivo celular, reducir su inmunogenicidad in vivo, crear un anticuerpo multiespecifico, etc., y que un anticuerpo que comprende la secuencia alterada de unión a una diana es también un anticuerpo monoclonal de esta invención. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales , que generalmente incluyen distintos anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos) , cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales actúa contra un único determinante en un antigeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpos monoclonales tienen la ventaja de que no suelen estar contaminadas por otras inmunoglobulinas . El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo del que se ha obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no debe interpretarse que sea necesario producir el anticuerpo utilizando un método concreto. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se utilicen de conformidad con la presente invención pueden obtenerse a partir de diversas técnicas, incluido, por ejemplo, el método del hibridoma (p.ej., Kohler et al., A/ature, 256:495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed . 1988); Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos del ADN recombinante (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. n.° 4.816.567), tecnología de representación en fagos (véase, por ejemplo, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338 (2) :299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5) :1073-1093 (2004); Fellouse, Proc . Nat. Acad. Sci . USA 101 (34) : 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284 (1-2) : 119-132 (2004), y tecnologías para producir anticuerpos humanos o semejantes a los humanos en animales que tienen partes o la totalidad de los loci inmunoglobulínicos humanos o genes que codifican secuencias de la inmunoglobulina humana (véanse, por ejemplo, el documento WO 1998/24893; el documento O 1996/34096; el documento WO 1996/33735; el documento WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); las Patentes de EE.UU. núms. 5.545.806, 5.569.825, 5.591.669 (todas de GenPharm) y 5.545.807; el documento WO 1997/17852; las patentes de EE.UU. núms. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; y 5.661.016; Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995). Las formas "humanizadas" de los anticuerpos no humanos (por ejemplo, los murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región hipervariable del receptor son sustituidos por los residuos de la región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), como el ratón, la rata, el conejo o los primates no humanos, que tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de estructura (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por sus correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentren en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se llevan a cabo para refinar aún más el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos los dominios variables (o al menos uno, y típicamente dos) en los que todos, o sustancialmente todos, los bucles hipervariables correspondan a los de una inmunoglobulina no humana y todas, o sustancialmente todas, las FR sean las de una secuencia de inmunoglobulina humana. Opcionalmente , el anticuerpo humanizado también comprenderá al menos una porción de una región constante (Fe) de inmunoglobulina, habitualmente de una inmunoglobulina humana. Para más información, véase Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol . 2:593-596 (1992) . Véanse también los siguientes artículos y referencias citadas en los mismos: Vaswani y Hamilton, Ann . Allergy, Asthma & Immunol . 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactíons 23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994). Los anticuerpos ( inmunoglobulinas ) "quiméricos" tienen una porción de la cadena pesada y/o ligera idéntica u homologa a las secuencias correspondientes de anticuerpos obtenidos de una especie en particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpos en particular, mientras que las demás cadenas son idénticas u homologas a las secuencias correspondientes de anticuerpos obtenidos de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, asi como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (patente de EE.UU. n.° 4.816.567 y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Por "anticuerpo humanizado" como se emplea en la presente memoria descriptiva se entiende un subconjunto de anticuerpos quiméricos. Los fragmentos "Fv de cadena simple" o "scFv" de un anticuerpo comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo y estos dominios están presentes en una cadena única de polipéptidos . Por lo general, el polipéptido scFv comprende también un enlazador de polipéptidos entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión a antigeno. Para una revisión de los scFv, véase Pluckthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, New York, págs . 269-315 (1994) . Un "antigeno" es un antigeno predeterminado al que un anticuerpo se puede unir selectivamente. El antigeno diana puede ser un polipéptido, un carbohidrato, un ácido nucleico, un lípido, un hapteno o un compuesto de ellos, sintético o que se produzca naturalmente. El antigeno diana es, preferiblemente, un polipéptido. El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antigeno que comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptidos (VH - VL) . Mediante el uso de un enlazador que sea demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, estos dominios se ven obligados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antigeno. Los diacuerpos se describen con más detalle en, por ejemplo, la patente europea EP 404.097, el documento O 93/11161 y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993). Un "anticuerpo humano" es aquel que contiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano y/o que se ha producido utilizando cualquiera de las técnicas para producción de anticuerpos humanos expuestas en la presente memoria descriptiva. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que contenga residuos de unión a antigeno no humanos. Un anticuerpo con "maduración de afinidad" es aquél con una o más alteraciones en una o más CDR del mismo que dan lugar a una mejora de la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con un anticuerpo padre que no incluye dichas alteraciones. Los anticuerpos con maduración de afinidad preferentes tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antígeno diana. Los anticuerpos con maduración de afinidad se producen mediante procedimientos bien conocidos en la materia. En Marks et al., Bio/'Technology, 10:779-783 (1992), se describe la maduración de afinidad a través de la transposición de los dominios VH y VL . La mutagénesis aleatoria de la CDR y/o los residuos estructurales se describen en: Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al., Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154 (7 ): 3310-9 (1995); y Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992). Las "funciones efectoras" de un anticuerpo hacen referencia a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fe (una región Fe de una secuencia nativa o la región Fe variable de una secuencia aminoacídica) de un anticuerpo, y puede variar con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de un anticuerpo incluyen: La unión de Clq y la citotoxicidad dependiente de complemento, la unión a receptores de Fe, la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC) , la fagocitosis, la regulación a la baja de los receptores en la superficie celular (por ejemplo, el receptor de células B) y la activación de las células B. La "citotoxicidad dependiente de anticuerpos" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la cual una Ig secretada y unida a los receptores Fe (FcRs) presentes en determinadas células citotóxicas (por ejemplo, células asesinas naturales (NK) , neutrófilos y macrófagos) posibilita que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana que porte un antígeno y, posteriormente, destruyan dicha célula diana con citotoxinas. Los anticuerpos "arman" a las células citotóxicas y son absolutamente necesarios para dicha destrucción. Las células primarias para mediar en la ADCC, las células NK, expresan sólo FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión del FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu . Rev. Immunol, 9:457-92 (1991). A fin de evaluar la actividad de la ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo de ADCC in vitro, como el que se describe en las patentes de EE.UU. núms . 5.500.362 ó 5.821.337 o se puede realizar el ensayo de Presta que se describe en la patente de Estados Unidos 6.737.056. Entre las células efectoras útiles para estos ensayos se encuentran las células mononucleares de la circulación periférica (PBMC) y las células asesinas naturales (NK) . Como alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal como el que se describe en Clynes et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA), 95:652-656 (1998). Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. Preferentemente, las células expresan al menos el FcyRIII y realizan la función efectora de la ADCC. Entre los ejemplos de leucocitos humanos que median en la ADCC están las células mononucleares déla circulación periférica (PBMC) , las células asesinas naturales (NK) , los monocitos, las células T citotóxicas y los neutrófilos, siendo las PBMC y las NK las células preferentes. Las células efectoras se pueden aislar de una fuente nativa, por ejemplo, de la sangre. Los términos "receptor de Fe" o "FcR" describen un receptor que se une a la región Fe de un anticuerpo. El FcR preferente es un FcR humano con secuencia nativa. Además, un FcR preferente es aquél que se une a un anticuerpo anti-IgG (un receptor gamma) e incluye las subclases de receptores FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluyendo las variantes alélicas y las formas de ayuste alternativo de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen el FcyRIIA (un "receptor activador") y el FcyRIIB (un "receptor inhibidor"), los cuales tienen secuencias aminoacidicas similares que difieren principalmente en sus dominios citoplasmáticos . El receptor activador FcyRIIA contiene en su dominio citoplasmático un motivo activador inmunorreceptor basado en la tirosina (ITA ) . El receptor inhibidor FcyRIIB contiene en su dominio citoplasmático un motivo inhibidor inmunorreceptor basado en la tirosina (ITIM) . (véase reseña M. en Daéron, Annu . Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). En Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol, 9:457-92 (1991), Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994) y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. , 126:330-41 (1995) también se revisan los FcR. Otros FcR, incluidos aquellos que se identifiquen en el futuro, se engloban en el térrmino "FcR" empleado en la presente memoria descriptiva. Este término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es el responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol . 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) y regula la homeostasis de las inmunoglobulinas . El documento WO00/42072 (Presta) describe variantes de anticuerpos con capacidad de unión mejorada o disminuida a los FcR. El contenido de esta publicación de patente se incorpora específicamente a la presente memoria descriptiva a modo de referencia. Véase, además, Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)". Se conocen los métodos de medición de la unión al FcRn (véase, por ejemplo, Ghetie 1997, Hinton 2004) . La unión al FcRn humano In vivo y la semivida sérica de los polipéptidos de unión al FcRn humano de alta afinidad pueden analizarse, por ejemplo, en ratones transgénicos o líneas celulares humanas transfectadas que expresan el FcRn humano, o en primates a los que se administran polipéptidos de variante Fe. La "citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula diana en presencia del complemento. La vía clásica de activación del complemento se inicia por la unión del primer componente del sistema del complemento (Clq) a los anticuerpos (de la subclase apropiada) que están unidos a su antígeno cognado. A fin de evaluar la activación del complemento, se puede efectuar ún ensayo de CDC, como, por ejemplo, el que se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996) .

Las variantes polipeptidicas con secuencias aminoacidicas de la región Fe alteradas y capacidad aumentada o disminuida de unión a Cql se describen en la Patente de EE.UU. n.° 6.194.551B1 y el documento W099/51642. El contenido de dichas publicaciones de patentes se incorpora específicamente a la presente memoria descriptiva a modo de •referencia. Véase, además, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000) . Por "polipéptido que comprende una región Fe" se entiende un polipéptido, como un anticuerpo o una inmunoadhesina (véase la definición más adelante) , que comprende una región Fe. La lisina en el extremo C terminal (residuo 447 según el sistema de numeración de EU) de la región Fe puede ser eliminada, por ejemplo, durante la purificación del polipéptido, o recombinando el ácido nucleico que codifica al polipéptido. Por lo tanto, una composición que contenga un polipéptido con una región Fe según esta invención puede comprender polipéptidos con el K447, con todos los K447 eliminados, o una mezcla de polipéptidos con y sin el residuo K447.

Un anticuerpo "de bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es aquel que inhibe o reduce la actividad biológica del antigeno al que se une. Los anticuerpos de bloqueo o anticuerpos antagonistas preferentes inhiben sustancial o completamente la actividad biológica del antigeno.

En la presente memoria descriptiva, un "anticuerpo agonista" es un anticuerpo que imita al menos una de las actividades funcionales de un polipéptido de interés.

A efectos de la presente memoria descriptiva, una "estructura humana del aceptor" es una estructura que comprende la secuencia aminoacídica de una estructura de VL o VH derivada de una estructura de inmunoglobulinas humanas, o de una estructura de consenso humana. Una estructura humana del aceptor "derivada de" una estructura de inmunoglobulinas humanas o una estructura de consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de estas o puede contener cambios preexistentes en la secuencia de aminoácidos. En el caso de que estén presentes cambios en la secuencia de aminoácidos, habrá preferentemente un máximo de 5 y, preferentemente, 4 o menos, o 3 o menos cambios preexistentes de aminoácidos. En el caso de que haya cambios preexistentes de aminoácidos en una VH, estos cambios, preferentemente, están solo en tres, dos o una de las posiciones 71H, 73H y 78H; por ejemplo, los residuos de aminoácidos en estas posiciones pueden ser 71A, 73T y/o 78A. En una forma de realización, la estructura humana del VL del aceptor tiene una secuencia idéntica a la de la estructura del VL de la inmunoglobulina humana o a la estructura de consenso humana.

Una "estructura de consenso humana" es una estructura que representa el residuo de aminoácidos más frecuente en una selección de secuencias de estructura del VL o VH de inmunoglobulina humana. Por lo general, la selección de secuencias del VL o VH de inmunoglobulina humana se realiza en un subgrupo de secuencias de dominio variable. El subgrupo de secuencias suele ser un subgrupo como en Kabat et al. En una forma de representación, para VL, el subgrupo es un subgrupo kappa I como en Kabat et al. En una forma de representación, para VH, el subgrupo es un subgrupo III como en Kabat et al.

Una "estructura de consenso del subgrupo III del VH" comprende la secuencia de consenso obtenida de las secuencias de aminoácidos en el subgrupo III variable pesado de Kabat et al. En una forma de realización, la secuencia de aminoácidos de la estructura de consenso del subgrupo III VH comprende al menos una parte, o la totalidad, de las siguientes secuencias: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (identificador de secuencia n.°: 42 ) -Hl- VRQAPGKGLE V ( identificador de secuencia n.°: 43 ) -H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (identificador de secuencia n.°: 4 ) -H3-WGQGTLVTVSS ( identificador de secuencia n.°: 45). Una "estructura de consenso del subgrupo I del VL" comprende la secuencia de consenso obtenida de las secuencias de aminoácidos en el subgrupo I kappa variable ligero de Kabat et al. En una forma de realización, la secuencia de aminoácidos de la estructura de consenso del subgrupo I VH comprende al menos una parte, o la totalidad, de las siguientes secuencias: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC ( identificador de secuencia n.°: 46)-Ll-WYQQKPGKAPKLLIY ( identificador de secuencia n.°: 47)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC ( identificador de secuencia n.°: 48) -L3-FGQGTKVEIK ( identificador de secuencia n.°: 49).

Un "trastorno" o "enfermedad" es un proceso que se beneficiaría del tratamiento con una sustancia/molécula o método de la invención. Incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas, comprendidos los procesos patológicos que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Ejemplos de trastornos que se tratarán según lo establecido en la presente memoria descriptiva son tumores malignos y benignos, carcinoma, blastoma y sarcoma. Los términos "trastorno de la proliferación celular" y "trastorno de la proliferación" se refieren a trastornos asociados a algún grado de proliferación celular anómala. En una forma de realización, el trastorno de la proliferación celular es un cáncer. En la presente memoria descriptiva, por "tumor" se entiende todo crecimiento y proliferación celular neoplásica, tanto benigna como maligna, así como todas las células y tejidos cancerosos y precancerosos . Tal y como se usan en la presente memoria descriptiva, los términos "cáncer", "canceroso", "trastorno de proliferación celular", "trastorno de proliferación" y "tumor" no se excluyen mutuamente. Los términos "cáncer y "canceroso" describen o se refieren al estado fisiológico de los mamíferos típicamente caracterizado por un crecimiento/proliferación celular no regulado. Entre los ejemplos de cáncer están carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más concretos de estas clases de cáncer son el cáncer de células escamosas, el cáncer de células pulmonares pequeñas, el adenocarcinoma pulmonar, el carcinoma pulmonar escamoso, el cáncer de peritoneo, el cáncer hepatocelular , el cáncer gastrointestinal, el cáncer pancreático, el glioblastoma , el cáncer de cuello uterino, el cáncer de ovario, el cáncer de hígado, el cáncer de vejiga, el hepatoma, el cáncer de mama, el cáncer de colon, el cáncer colorrectal, el carcinoma endometrial o uterino, el carcinoma de las glándulas salivales, el cáncer de riñon, el cáncer de hígado, el cáncer de próstata, el cáncer vulval, el cáncer de tiroides, el carcinoma hepático, el cáncer de estómago, el melanoma y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello. La desregulación de la angiogénesis puede ocasionar muchos trastornos que se pueden tratar mediante las composiciones y métodos de la invención. Estos trastornos incluyen procesos neoplásicos y no neoplásicos. Los procesos neoplásicos incluyen los descritos anteriormente. Entre los procesos no neoplásicos se encuentran, entre otros, la hipertrofia aberrante o no deseada, artritis, artritis reumatoide (AR) , psoriasis, placas psoriáticas, sarcoidosis, ateroesclerosis , placas ateroescleróticas , retinopatia diabética y otras retinopatias proliferativas , incluida retinopatia de premadurez , fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degeneración macular asociada a la edad, edema macular diabético, neovascularización corneal, neovascularización de trasplante de córnea, rechazo de trasplante de córnea, neovascularización retiniana/del coroides, neovascularización del ángulo (rubeosis), enfermedad neovascular ocular, reestenosis vascular, malformaciones arterivenosas (MAV) , meningioma, hemangioma, angiofibroma, hiperplasias de tiroides (incluida enfermedad de Grave), trasplante de córnea y otros tejidos, inflamación crónica, inflamación pulmonar, lesión pulmonar aguda/síndrome de distrés respiratorio del adulto, sepsis, hipertensión pulmonar primaria, efusiones pulmonares malignas, edema cerebral (por ejemplo, asociado a infarto cerebral/traumatismo craneal cerrado/traumatismo) , inflamación sinovial, formación de paño en AR, miositis osificante, formación ósea hipertrófica, osteoartritis (OA) , ascitis refractaria, enfermedad de ovario poliquistico, endometriosis , enfermedades en el tercer espacio de fluido (pancreatitis, síndrome compartimental , quemaduras, enfermedad intestinal) , fibroides uterinos, parto prematuro, inflamación crónica como enfermedad intestinal inflamatoria (enfermedad de Crohn et alitis ulcerosa), rechazo de trasplante renal, enfermedad intestinal inflamatoria, síndrome nefrítico, crecimiento de masa tisular anómala o no deseada (no cáncer), articulaciones hemofílicas, cicatrices hipertróficas, inhibición del crecimiento del cabello, síndrome de Osler-Weber, granuloma piogénico, fibroplasias retrolentales , escleroderma , tracoma, adhesiones vasculares, sinovitis, dermatitis, preclampsia, ascitis, efusión pericárdica (como la asociada a pericarditis) y efusión pleural. En la presente memoria descriptiva, por "tratamiento" se entiende una intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural del individuo o célula tratada y se puede realizar como prevención o durante la evolución de la enfermedad. Son efectos deseables del tratamiento la prevención de la enfermedad o de su recidiva, el alivio de los síntomas, la disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, la prevención de la metástasis, la disminución del ritmo de progresión de la enfermedad, la mejora o los cuidados paliativos del estado de la enfermedad y la remisión o un pronóstico de mejoría. En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o trastorno. Por "sujeto" se entiende un vertebrado, preferiblemente un mamífero y, especialmente, un humano. Los mamíferos incluyen animales de granja (como vacas), animales utilizados en actividades deportivas, animales de compañía (como gatos, perros y caballos), primates, ratones y ratas. A efectos de tratamiento, por "mamífero" se entiende cualquier animal clasificado como mamífero, incluidos humanos, animales domésticos y de granja, animales de compañía, utilizados en actividades deportivas, o en zoos, como perros, caballos, gatos', vacas, etc. Preferiblemente, el mamífero es un humano. Una "cantidad eficaz" es una cantidad eficaz, a las dosis y durante el tiempo necesarios, para lograr el efecto terapéutico o profiláctico deseado. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de una sustancia/molécula de la invención, agonista o antagonista, puede variar según factores como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo y la capacidad de la sustancia/molécula, agonista o antagonista, para dar lugar a una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también aquella a la que los efectos tóxicos o perjudiciales de la sustancia/molécula, agonista o antagonista se ven contrarrestados por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una "cantidad eficaz desde el punto de vista profiláctico" es una cantidad eficaz, a las dosis y durante el tiempo necesarios, para lograr el efecto terapéutico o profiláctico deseado. Habitualmente , aunque no necesariamente, dado que una dosis profiláctica se utiliza en sujetos antes de la enfermedad o en una etapa temprana, la cantidad profilácticamente eficaz será inferior a la cantidad terapéuticamente eficaz. El término "agente citotóxico" en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere a una sustancia que inhibe o impide la función de las células y/o causa la destrucción de las mismas. El término pretende incluir isótopos radioactivos (por ejemplo, At.211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, e isótopos radiactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca ( vincristina, vinblastina, etoposido) , doxorrubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucil, daunorrubicina u otros agentes intercaladores , enzimas y fragmentos de estas como nucleoliticenzimas , antibióticos y toxinas como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluidos fragmentos y/o variantes de estos y los diversos agentes antineoplásicos o antitumorales que se describen más adelante. Otros agentes citotóxicos se describen más adelante. Un agente tumoricida ocasiona la destrucción de las células tumorales. Un "agente quimoterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos serían los agentes alquilantes como la tiotepa y la ciclofosfamida (CYTOXAN®)'; los sulfonatos de alquilo como el busulfán, el improsulfán y el piposulfán; las aziridinas como la benzodopa, la carboquona, la meturedopa y la uredopa; las etiloniminas y metilamelaminas incluyendo la altretamina, la trietilenomelamina , la trietilenofosforamida, la trietilenotiofosforamida y la trimetilolomelamina ; los acetogeninos (en especial, el bullatacín y la bullatacinona ) ; el delta-9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL®) ; la beta-lapachona ; el lapachol; las colchicinas ; el ácido betulínico, una camptotecina (incluyendo el topotecán análogo sintético (HYCAMTIN®) , el CPT-11 (irinotecán, CAMPTOSAR®) , la acetilcamptotecina, la escopolectina y la 9-aminocamptotecina) ; la briostatina ; la callistatina ; el CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adocelesina, carcelesina y bicelesina) ; la podofilotoxina; el ácido podofilínico; la teniposida; las criptoficinas (particularmente la criptoficina 1 y la 8); la dolastatina ; la duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos KW-2189 y CB1-TM1); la eleuterobina ; la pancratistatina ; una sarcodictina ; la espongistatina ; los gases nitrógeno como el clorambucil, la clornafacina , la colofosfamida , la estramustina , la ifosfamida, la mecloretamina , el clorhidrato de óxido de mecloretamina, el melfalán, la novembichina , la fenesterina, la prednimustina , la trofosfamida y la uramustina; las nitrosureas como la carmustina, la clorozotocina, la fotemustina, la lomustina, la nimustina y la ranimustina; los antibióticos como los de enedina (por ejemplo, la calicheamicina , especialmente la calicheamicina gamma II y la omega II (véase, por ejemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); la dinemicina, incluyendo la dinemicina A; una esperamicina; el cromóforo de neocarcinostatina y los cromóforos de antibióticos de enedina cromoproteina relacionados (las aclacinomisinas , la actinomicina , la autramicina, la azaserina, las bleomicinas, la cactinomicina, la carabicina, la carminomicina , la carcinofilina , las cromomicinas , la dactinomicina, la daunorrubicina, la detorrubicina , la 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, la doxorrubicina (incluyendo ADRIAMYCIN®, la morfolino-doxorrubicina , la cianomorfolino-doxorrubicina , la 2-pirrolino-doxorrubicina y la desoxidoxorrubicina ) , la epirrubicina , la esorrubicina , la idarrubicina , la marcelomicina , las mitomicinas como la mitomicina C, el ácido micofenólico, la nogalamicina , las olivomicinas , la peplomicina, la potfiromicina , la puromicina, la quelamicina, la rodorrubicina, la estreptonigrina, la estreptozocina , la tubercidina, el ubenimex, la cinostatina y la zorrubicina) ; los antimetabolitos como el metotrexato y el 5-fluorouracilo (5-FU); los análogos del ácido fólico como la denopterina, el metotrexato, la teropterina y el trimetrexato; los análogos de la purina como la fludarabina, la 6-mercaptopurina, la tiamiprina y la tioguanina; los análogos de la pirimidina como la ancitabina, la azacitidina, la ß-azauridina, el carmofur, la citarabina, la didesoxiuridina , la doxifluridina, la enocitabina y la floxuridina ; los andrógenos como la calusterona, el propionato de dromostanolona , el epitiostanol , el mepitiiostano, la testolactona los antiadrenérgicos como la aminoglutetimida , el mitotano y el trilostano; un reabastecedor del ácido fólico como el ácido folinico; la aceglatona; el glucósido aldofosfamida; el ácido aminolevulinico; el eniluracilo; la amsacrina; el bestrabucil ; el bisantreno; el edatraxato; la defofamina; la demecolcina ; la diaziquona; la elfornitina; el acetato de eliptinio; una epotilona; el etoglúcido; el nitrato de galio; la hidroxiurea ; el lentinán; la lonidainina; los maitansinoides como la maitansina y las ansamitocinas ; la mitoguazona ; la mitoxantrona ; el mopidanmol; la nitraerina; el pentostatin; el fenamet; la pirarrubicina ; la losoxantrona ; la 2-etilhidracida ; la procarbacina; el complejo polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; el razoxano; la rizoxina; el sizofirán; el espirogermanio ; el ácido tenuazónico; la triaciquona; la 2, 21 , 2"-triclorotrietilamina; los tricotecenos (especialmente la toxina T-2, el verracurin A, el roridin A y la anguidina) ; el uretano; la vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) ; la dacarbacina; la manomust ina ; el mitobronitol ; el mitolactol; el pipobromán; la gacitosina; la arabinosida ("Ara-C"); la tiotepa; los taxoides, por ejemplo, el paclitaxel (TAXOL®) (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)> la formulación de nanoparticulas de paclitaxel mediante ingeniería de albúmina libre de Cremofor (ABRAXANE™) (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) y el doxetaxel (TAXOTERE®) (Rhóne-Poulenc Rorer, Antony, Francia) ; el clorambucil ; la gemcitabina (GEMZAR®) ; la 6-tioguanina ; la mercaptopurina; el metatrexato; los análogos de platino o los basados en platino como el cisplatino y el carboplatino ; la vinblastina (VELBAN®) ; el platino; el etopósido (VP-16) ; la ifosfamida ; la mitoxantrona ; la vincristina (ONCOVIN®) ; el oxaliplatino ; la leucovovina; la vinorrelbina (NAVELBINE®) ; la novantrona; el edatrexato; la daunomicina; la aminopterina ; el ibandronato ; el inhibidor RFS 2000 de la topoisomerasa ; la difluorometilornit ina (DMFO) ; los retinoides como el ácido retinoico; capecitabina (XELODA®) ; las sales, los ácidos o los derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de las sustancias anteriores, asi como las combinaciones de una o más de las sustancias anteriores como la CHOP, la abreviatura de una terapia combinada de ciclofosfamida , doxorrubicina , vincristina y prednisolona , y la FOLFOX, la abreviatura de un régimen de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovovina. También se incluyen en esta definición los agentes antihormonales que regulan, reducen, bloquean o inhiben los efectos de las hormonas que pueden promover el crecimiento del cáncer y se presentan a menudo en la forma de un tratamiento sistémico, es decir, que afecta a todo el organismo. Estos agentes pueden ser hormonas. Como ejemplos tendríamos los antiestrógenos y los moduladores selectivos de receptores de estrógenos (SERM), incluyendo, por ejemplo, el tamoxifeno (también el tamoxifeno NOLVADEX®) , el raloxifeno (EVISTA®) , el droloxifeno, el 4-hidroxitamoxifeno, el trioxifeno, el keoxifeno, el LY117018, la onapristona y el toremifeno ( FARESTON®) ; las antiprogesteronas ; los reguladores a la baja de los receptores de estrógenos (ERD) ; los agentes que oprimen o cierran los ovarios, por ejemplo, los agonistas de la hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH) como el acetato de leuprolida (LUPRON® y ELIGARD®) , el acetato de goserelina, el acetato de buserelina y la tripterelina ; otros antiandrógenos como la flutamida, la nilutamida y la bicalutamida y los inhibidores de la aromatasa que inhiben el enzima aromatasa, encargado de regular la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales, como, por ejemplo, las 4 ( 5 ) -imidazolas , la aminoglutetimida , el acetato de megestrol (MEGASE®) , el exemestano (AROMASIN®) , la formestania, la fadrozola, la vorozola (RIVISOR®) , el letrozol (FEMARA®) y la anastrozola (ARIMIDEX®) . Además, esta definición de los agentes quimioterapéuticos incluye los bisfosfonatos como el clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®) , el etidronato (DIDROCAL®), el NE-58095, el ácido zoledrónico/zoledronato (ZOMETA®), el alendronato (FOSAMAX®), el pamidronato (AREDIA®) , el tiludronato (SKELID®) o el risedronato (ACTONEL®) , así como la troxacitabina (un análogo de la citosina nucleósida 1 , 3-dioxolano) ; los oligonucleótidos antisentido, en particular los que inhiben la expresión génica en las rutas de señalización implicadas en la proliferación celular aberrante, como, por ejemplo, el PKC-alfa, el Raf, el H-Ras y el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) ; las vacunas como THERATOPE® y las que se aplican para terapias génicas, por ejemplo, la ALLOVECTIN®, la LEUVECTIN® y la VAXID®; el inhibidor de la topoisomerasa 1 LURTOTECAN®; el rmRH ABARELIX®; el ditosilato de lapatinib (un inhibidor de molécula pequeña doble tirosincinasa del ErbB-2 y el EGFR conocido también como GW572016) y las sales, los ácidos o los derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de las sustancias anteriores . Por "agente inhibidor del crecimiento" se entiende, en el contexto de la presente memoria descriptiva, un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula (como una célula que exprese DLL4) tanto in vitro como in vivo. Así, el agente inhibidor del crecimiento puede ser un agente que reduzca significativamente el porcentaje de células (como una célula que exprese DLL4) en la fase S. Ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento serian los agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un punto distinto de la fase S), como los agentes que inducen la detención de la Gl y la fase M. Entre los bloqueadores clásicos de la fase M se incluyen las vincas (vincristina y vinblastina) , los taxanos y los inhibidores de la topoisomerasa II como la doxorrubicina , la epirrubicina , la daunorrubicina , el etopósido y la bleomicina. Esos agentes que detienen la Gl también se desbordan en la detención de la fase S, por ejemplo, los agentes de alquilación del ADN como el tamoxifeno, la prednisona, la dacarbacina, la mecloretamina, el cisplatino, el metotrexato, el 5-fluorouracilo y la ara-C. Puede encontrarse más información al respecto en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn y Israel, eds . , capitulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" ["Regulación del anillo celular, oncogenes y fármacos antineoplásicos " ] por Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente en la pág. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son antineoplásicos derivados ambos del tejo del Pacifico. El docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer) se deriva del tejo europeo y es un análogo semisintético del paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb) . El paclitaxel y el docetaxel promueven la unión de microtúbulos a partir de dimeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos al prevenir la despolimerización, que ocasiona la inhibición de la mitosis en células. La "doxorrubicina " es un antibiótico antraciclina . La denominación química completa de la doxorrubicina es (8S-cis) -10- [ (3-amino-2, 3, ß-trideoxi-a-L-lixo-hexapiranosil ) oxi] -7,8,9, 10-tetrahidro-6, 8, ll-trihidroxi-8- (hidroxiacetil ) -1-metoxi-5, 12-naftacenediona . Por "composición antineoplásica" se entiende una composición útil en el tratamiento del cáncer que comprende al menos un agente terapéutico activo, por ejemplo, "agente antineoplásico" . Ejemplos de agentes terapéuticos (agentes anticancerosos, también denominados "agentes antineoplásicos " en la presente memoria descriptiva) son agentes quimioterapéuticos, agentes inhibidores del crecimiento, agentes citotóxicos, agentes usados en radioterapia, agentes antiangiogénicos , agentes apoptóticos, agentes antitubulina , toxinas y otros agentes para tratar el cáncer, por ejemplo, anticuerpo neutralizador anti-VEGF, antagonista de VEGF, anti-HER-2, anti-CD20, un antagonista del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (por ejemplo, un inhibidor de la tirosincinasa ) , inhibidor de HER1/EGFR, erlotinib, un inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib) , interferones , citocinas, antagonistas (por ejemplos, anticuerpos neutralizadores ) que se une a uno o más de los receptores de ErbB2, ErbB3, ErbB4 o VEGF, inhibidores para tirosincinasas de receptores para factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) y/o factor de células madre (SCF) (por ejemplo, imatinib, mesilate (Gleevec ® Novartis ) ) , TRAIL/Apo2L y otros agentes bioactivos y químicos orgánicos, etc . El término "profármaco", tal como se usa en esta solicitud, se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para células tumorales que el fármaco parental y es capaz de activarse enzimáticamente o convertirse en la forma parental más activa. Véase, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cáncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions , 14, págs . 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) y Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, " Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), págs. 247-267, Humana Press (1985). Los profármacos de esta invención incluyen, entre otros, profármacos con fosfato, profármacos con tiofosfato, profármacos con sulfato, profármacos con péptidos, profármacos modificados con D-aminoácido, profármacos glicosilados , profármacos que contienen beta-lactam, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, profármacos 5-fluorocitosina y otros profármacos 5-fluorouridina que pueden transformarse en el fármaco más activo no citotóxico. Ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden ser derivatizados para obtener un profármaco para su uso en esta invención son los agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente. Un "agente antiangiogénico" o "inhibidor angiogénico" es una sustancia de bajo peso molecular, un polinucleótido (incluyendo, por ejemplo, un ARN inhibidor (ARNi o siARN) ) , un polipéptido, una proteina aislada, una proteina recombinante , un anticuerpo, o conjugados o proteínas de fusión de los mismos, que inhiben la angiogénesis , la vasculogénesis o la permeabilidad vascular no deseada, bien directa bien indirectamente. Por ejemplo, un agente antiangiogénico es un anticuerpo u otro antagonista a un agente angiogéncio tal como se define anteriormente, por ejemplo, anticuerpos anti-VEGF, anticuerpos contra receptores del VEGF, fragmentos solubles del receptor del VEGF o pequeñas moléculas que bloquean la señalización de los receptores del VEGF (por ejemplo, PTK787/ZK228 , SU6668, SUTENT®/SU11248 (sunitinib raalato) , AMG706, o las descritas en, por ejemplo, la solicitud de patente internacional WO 2004/113304). Los agentes antiangiogénicos también incluyen inhibidores nativos de la angiogénesis , por ejemplo, angiostatina , endostatina, etc. Véase, por ejemplo, Klagsbrun y D'Amore, Annu . Rev. Physiol., 53:217-39 (1991); Streit y Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003) (por ejemplo, la Tabla 3, 'que enumera los tratamientos antiangiogénicos en el melanoma maligno); Ferrara y Alitalo, Nature Medicine 5 (12) : 1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (por ejemplo, la Tabla 2, que enumera factores antiangiogénicos); y Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003) (por ejemplo, la Tabla 1, que enumera antiangiogénicos usados en ensayos clínicos).

Composiciones de la invención y métodos para su elaboración Esta invención engloba composiciones, incluidas composiciones farmacéuticas, que comprenden un anticuerpo anti-DLL4 , y polinucleótidos , que incluyen secuencias que codifican un anticuerpo anti-DLL . Como se usa en la presente memoria descriptiva, las composiciones comprenden uno o más anticuerpos que se unen a DLL4 y/o uno o más polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican uno o más anticuerpos que se unen a DLL4. Estas composiciones pueden contener, además, vehículos aptos, como excipientes farmacéuticamente aceptables que incluyan soluciones tamponadas, que son bien conocidas en la materia. La invención también engloba formas de realización de polinucleótidos y anticuerpos aislados. La invención también engloba formas de realización de polinucleótidos y anticuerpos sustancialmente puros. Los anticuerpos anti-DLL4 de la invención son preferiblemente monoclonales. También se incluyen dentro del ámbito de la invención fragmentos de anticuerpos como los fragmentos Fab, Fab ' , Fab'-SH y F(ab' ) 2 de los anticuerpos anti-DLL4 proporcionados en la presente memoria descriptiva. Estos fragmentos de anticuerpos se pueden crear por medios tradicionales, como digestión enzimática, o se pueden generar mediante técnicas recombinantes . Estos fragmentos de anticuerpos pueden ser quiméricos o humanizados. Estos fragmentos son útiles para los fines diagnósticos y terapéuticos que se exponen a continuación. Los anticuerpos monoclonales se obtienen a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que forman la población son idénticos, excepto en posibles mutaciones de formación natural que pueden estar presentes en cantidades insignificantes. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo, que no es una mezcla de anticuerpos discretos. Pueden conseguirse los anticuerpos monoclonales anti-DLL4 de la invención por el método del hibridoma, descrito por primera vez en Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o con el método del ADN recombinante (Patente de Estados Unidos n. ° 4.816.567) . En el método del hibridoma, se inmuniza a un ratón u otro animal huésped apropiado, como un hámster, para obtener linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Los anticuerpos anti-DLL4 se producen generalmente en animales mediante varias inyecciones subcutáneas (se) o intraperitonal es (ip) de DLL4 y un adyuvante. La DLL4 se puede preparar usando métodos bien conocidos en este ámbito, algunos de los cuales se describen con más detalle en la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, la producción recombinante de DLL4 se describe más adelante. En una forma de realización, se inmuniza a los animales con un derivado de DLL4 que contiene el dominio extracelular (ECD) de DLL4 fusionado a la porción Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina . En una forma de realización preferida, se inmuniza a los animales con una proteina de fusión DLL4-IgGl. Los animales suelen ser inmunizados contra conjugados inmunogénicos o derivados de DLL4, con monofosforil lipido A (MPL) /dicrinomicolato de trehalosa (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT) y la solución se inyecta intradérmicamente en múltiples puntos. Dos semanas más tarde, los animales reciben una dosis de recuerdo. Entre 7 y 14 días más tarde se extrae sangre a los animales y el suero se analiza para titular los anticuerpos anti-DLL . Los animales reciben dosis de recuerdo hasta que se alcancen los niveles adecuados de titulació . De manera alternativa, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro. Después, los linfocitos se fusionan con las células de mieloma utilizando un agente fusionante adecuado, como por ejemplo polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986) ) . Por lo tanto, las células de hibridoma preparadas se siembran y crecen en un medio de cultivo adecuado que preferentemente contenga una o más sustancias que inhiban el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parentales no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales no contienen la enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas generalmente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT) , que contienen sustancias que previenen el crecimiento de células deficitarias en HGPRT. Las células de mieloma preferentes son aquellas que se fusionan eficazmente, soportan altos niveles estables de producción de anticuerpos por parte de las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio como el HAT. Entre éstas, las lineas celulares de mieloma preferidas son las lineas de mieloma murino. como las derivadas de los tumores de ratones MOPC-21 y MPC-11, disponibles en Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EE.UU., y las células SP-2 o X63-Ag8-653, disponibles en American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EE.UU. También se han descrito las lineas celulares de mieloma humano y heteromieloma murino-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 13ß:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)) . Se analiza el medio de cultivo en el cual crecen las células de hibridoma para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos directamente contra DLL4. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma está determinada por la inmunoprecipitación o por un ensayo de unión, como el radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) . La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980). Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos con la especificidad, afinidad y/o actividad deseada, los clones se pueden subclonar limitando los procedimientos de dilución y se pueden obtener mediante métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden crecer in vivo en un animal como tumores con ascitis .

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, los fluidos asciticos o el suero mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas , como por ejemplo, la proteina A-sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. Los anticuerpos anti-DLL4 de la invención se pueden obtener utilizando librerías combinatorias para detectar clones de anticuerpos sintéticos con la actividad o actividades deseadas. En principio, los clones de anticuerpos sintéticos se seleccionan mediante la detección de bibliotecas de fagos que contienen fagos que representan diversos fragmentos de la región variable (Fv) de los anticuerpos fusionados a la proteína de la cápside del fago. Estas bibliotecas de fagos se criban mediante cromatografía de afinidad para detectar el antígeno deseado. Los clones que expresan fragmentos Fv capaces de unirse al antígeno deseado son adsorbidos al antígeno y, de este modo, separados de los clones de la biblioteca que no tienen capacidad de unión. Los clones con capacidad de unión se eluyen entonces del antígeno y pueden enriquecerse aún más mediante ciclos adicionales de adsorción/elución de antigenos. Cualquiera de los anticuerpos anti-DLL4 de la invención se puede obtener diseñando un procedimiento apropiado de detección de antigenos para seleccionar el clon del fago de interés, seguido por la construcción de un clon del anticuerpo anti-DLL4 de longitud completa utilizando las secuencias de Fv del clon del fago de interés y secuencias de la región constante (Fe) convenientes, descritas en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest , Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. El dominio de unión a antigeno de un anticuerpo está formado a partir de dos regiones variables (V) de unos 110 aminoácidos, una correspondiente a la cadena ligera (VL) y otra correspondiente a la cadena pesada (VH) , que presentan en ambos casos tres bucles hipervariables o regiones de determinación de complementariedad (CDR) . Los dominios variables se pueden representar funcionalmente en el fago, bien como fragmentos de Fv de cadena única (scFv), en los que VH y VL estén covalentemente enlazados por medio de un péptido corto y flexible, o como fragmentos Fab, en los que estén fusionados a un dominio constante e interactúan no covalentemente, como se describe en Winter et al., Ann . Rev. Immunol . , 12: 433-455 (1994). Como se usa en la presente memoria descriptiva, los clones de fagos que codifican scFv y los clones de fagos que codifican Fab se denominan colectivamente "clones de fagos Fv" o "clones Fv" . Los repertorios de genes de VH y VL se pueden clonar por separado mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y recombinar aleatoriamente en librerías de fagos, en las que se puede buscar por clones de unión a antígeno, como se describe en Winter et al., Ann . Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994) . Las bibliotecas procedentes de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad al inmunógeno sin necesidad de construir hibridomas. Alternativamente, el repertorio virgen se puede clonar para proporcionar una única fuente de anticuerpos humanos a una gran variedad de antígenos extraños y también de autoantígenos sin ninguna inmunización como se describe en Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993) . Por último, las librerías vírgenes también se pueden producir sintéticamente mediante la clonación de segmentos de genes V no reorganizados procedentes de células madre y utilizando cebadores de la PCR que contenga secuencias aleatorias para codificar las regiones CDR3 muy variables y para conseguir la reorganización ín vitro como se describe en Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992) .

El fago filamentoso se utiliza para representar fragmentos de anticuerpos mediante fusión a la proteina de la cápside menor pIII. Los fragmentos de anticuerpos se pueden representar como fragmentos Fv de cadena única, en los que los dominios de VH y VL están conectados a la misma cadena polipeptidica mediante un separador de polipéptidos flexible, como se describe en Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), o como fragmentos Fab, en los que una cadena se fusiona a pIII y la otras se segregan en el periplasma del anfitrión celular bacteriano donde el ensamblaje de una estructura proteinica de la cápside de Fab se representa en la superficie del fago mediante el desplazamiento de las proteínas de la cápside de tipo natural, por ejemplo, como se describe en Hoogenboom et al., Nucí. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991) . En general, los ácidos nucleicos que codifican fragmentos de genes de anticuerpos se obtienen a partir de inmunocitos recolectados de humanos o animales. Si se desea una librería que presente un sesgo a favor de clones anti-DLL4, el sujeto es inmunizado con DLL4 para generar una respuesta a anticuerpos y las células esplénicas y/o los linfocitos B circulantes u otros linfocitos de la circulación periférica se recuperan para la construcción de la librería.

En una forma de realización preferente, una librería de fragmentos de genes de anticuerpos humanos sesgada a favor de clones de anti-DLL4 humana se obtiene generando una respuesta a un anticuerpo anti-DLL4 en ratones transgénicos portadores de una matriz de genes humanos funcionales de la inmunoglobulina (y carentes de un sistema funcional de producción de anticuerpos endógenos) , de forma que la inmunización con DLL4 da lugar a linfocitos B productores de anticuerpos humanos anti-DLL4. La generación de ratones transgénicos productores de anticuerpos humanos se describe más adelante. El enriquecimiento adicional de poblaciones celulares reactivas anti-DLL4 se puede obtener mediante un procedimiento de detección adecuado para aislar linfocitos B que expresen un anticuerpo unido a membrana específico de DLL4, por ejemplo, mediante separación celular con cromatografía de afinidad a DLL4 o adsorción de células a DLL4 marcada con flurocromo seguida por separación de células activadas por fluorescencia (FACS) . Alternativamente, el uso de células esplénicas y/o linfocitos B u otros PBL procedentes de un donante no inmunizado ofrece una mejor representación del posible repertorio de anticuerpos y también permite la construcción de una librería de anticuerpos usando cualquier especie animal (humana o no humana) en la que DLL4 no es antigénica. En el caso de bibliotecas que incorporen construcción de genes de anticuerpos in vitro, las células madre se recolectan del sujeto para proporcionar ácidos nucleicos que codifiquen segmentos de genes de anticuerpos no organizados. Los inmunocitos de interés se pueden obtener de diversas especies animales, como humanos, ratón, rata, lagomorfa, luprina, canina, felina, porcina, bovina, equina y especies aviares, etc. Los segmentos de regiones variables de genes de anticuerpos que codifican ácidos nucleicos (incluidos los segmentos VH y VL) se recuperan a partir de las células de interés y se amplifican. En el caso de librerías de genes de VH y VL reorganizadas, el ADN deseado se puede obtener aislando el ADN o el ARNm genómico de los linfocitos, seguido por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores que se acoplen a los extremos 5' y 3' de los genes de la VH y la VL reorganizados, como se describe en Orlandi et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989), lo que permite obtener diversos repertorios de genes V para su expresión. Los genes V se pueden amplificar a partir del ADNc y del ADN genómico con cebadores reversos en el extremo 5' del exon que codifica el dominio V maduro y cebadores anversos dentro del segmento J como se describe en Orlandi et al. (1989) y en ard et al., Nature, 341: 544-546 (1989). Sin embargo, para amplificar a partir del ADNc, los cebadores reversos también se pueden situar en el exon líder, como se describe en Jones et al., Biotechnol . , 9: 88-89 (1991), y los cebadores anversos dentro de la región constante, como se describe en Sastry et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989). Para maximizar la complementariedad, se puede incorporar la degeneración en los cebadores como se describe en Orlandi et al. (1989) o Sastry et al. (1989) . Preferiblemente, la diversidad de las librerías se maximiza utilizando cebadores de la PCR dirigidos a cada familia de genes V para amplificar todas las organizaciones disponibles de VH y VL presentes en la muestra de ácidos nucleicos de inmunocitos, por ejemplo, como se describe en el método de Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) o como se describe en el método de Orum et al., Nucleíc Acids Res., 21: 4491-4498 (1993) . Para la clonación del ADN amplificado en vectores de expresión, se pueden introducir sitios de restricción poco habituales dentro del cebador de la PCR como una marca en un extremo, según se describe en Orlandi et al. (1989), o mediante una nueva amplificación de la PCR con un cebador marcado, como se describe en Clackson et al., Nature, 352 : 624-628 (1991) . A partir de segmentos de genes V in vitro se pueden derivar repertorios de genes V sintéticamente reorganizados. La mayoría de los segmentos de genes VH humanos se han clonado y secuenciado (según Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)), y mapeados (explicados en Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993); estos segmentos clonados (incluidos todas las principales conformaciones del bucle Hl y H2) se pueden utilizar para generar diversos repertorios de genes VH con cebadores de la PCR que codifican bucles de H3 de secuencia y longitud diversas, como se describe en Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Los repertorios de VH también se pueden preparar con toda la diversidad de secuencias centrada en un bucle de H3 largo de una única longitud, como se describe en Barbas et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992). Los segmentos de VK y VA humanos se han clonado y secuenciado (explicado en Williams y Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)) y se pueden utilizar para preparar repertorios sintéticos de la cadena ligera. Los repertorios de genes V sintéticos, basados en una gran variedad de dominios de VH y VL, y longitudes de L3 y H3, codificarán anticuerpos de considerable diversidad estructural. Tras la amplificación de los ADN codificadores de genes V, los segmentos de genes V de linea germinal se pueden reorganizar in vitro según los métodos de Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol . , 227: 381-388 (1992) . Se pueden construir repertorios de fragmentos de anticuerpos mediante combinación de repertorios de genes de VH y VL juntos de varias formas. Cada repertorio se puede crear en vectores diferentes y los vectores se pueden recombinar in vitro, por ejemplo, como se describe en Hogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993), o in vivo mediante infección combinatoria, por ejemplo, el sistema loxP descrito en Waterhouse et al., Nucí. Acids Bes., 21: 2265-2266 (1993). El procedimiento de la recombinación in vivo se aprovecha de las dos cadenas de los fragmentos Fab para superar el limite en el tamaño de la biblioteca impuesto por la eficacia de transformación de E. coli. Los repertorios de VH y VL vírgenes se clonan por separado, uno en un fagémido y el otro en un vector fágico. A continuación, se combinan las dos bibliotecas mediante infección fágica de bacterias que contienen fagémidos, de forma que cada célula contiene una combinación distinta y el tamaño de la biblioteca sólo está limitado por el número de células presente (unos 1012 clones) .

Los dos vectores contienen señales de recombinación in vivo, por lo que los genes VH y VL se recombinan en un único replicón y se introducen en viriones fágicos. Estas enormes librerías proporcionan gran número de diversos anticuerpos con buena afinidad (Kcf1 de aproximadamente 10~8 M) . Alternativamente, los repertorios se pueden clonar secuencialmente en el mismo vector, por ejemplo, como se describe en Barbas et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991), o ensamblar juntos mediante PCR y, luego, clonarlos, como se describe en Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) . El ensamblaje de la PCR también se puede utilizar para unir los ADN de VH y VL con ADN que codifica un espaciador peptídico flexible para formar repertorios de Fv de cadena única (scFv) . En otra técnica, "el ensamblaje de la PCR en el interior de la célula" se usa para combinar genes VH y VL dentro de linfocitos mediante PCR y, luego, clonar repertorios de genes enlazados, como se describe en Embleton et al., Nucí. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992). Los anticuerpos producidos por librerías vírgenes (bien naturales bien sintéticas) pueden ser de afinidad moderada ( (Kcf1 de aproximadamente 106 a 107 M"1) , pero la maduración de la afinidad también se puede imitar in vitro mediante construcción y reselección a partir de librerías secundarias, como se describe en Winter et al. (1994), citado anteriormente. Por ejemplo, la mutación se puede introducir aleatoriamente in vitro utilizando polimerasa con tendencia al error (explicado en Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)) en el método de Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992) o en el método de Gram et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992) . Asimismo, la maduración de la afinidad se puede realizar mediante mutación aleatorizada de una o más CDR, por ejemplo, utilizando PCR con cebadores de secuencia aleatoria que abarquen la CDR de interés, en clones de Fv individuales seleccionados, y detecten clones de afinidad más alta. El documento WO 9607754 (publicado el 14 de marzo de 1996) describía un procedimiento para inducir la mutagenia en una región de determinación de complementariedad de una cadena ligera de inmunoglobulinas para crear una librería de genes de la cadena ligera. Otro método eficaz consiste en recombinar los dominios de VH o VL seleccionados por representación en fagos con repertorios de variantes de domino V que se producen naturalmente obtenidos a partir de donantes no inmunizados y detectar los de mayor afinidad en varias series de nueva transposición de cadenas, como se describe en arks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992). Esta técnica permite la producción de anticuerpos y de fragmentos de anticuerpos con afinidades del orden de 10"9 M. Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de DLL4 son bien conocidos en el sector. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica la DLL4 se puede diseñar usando la secuencia de aminoácidos de la región deseada de DLL4. Alternativamente, se puede utilizar la secuencia de ADNc (o fragmentos de estas) de GenBank Accession Núms . NM_019074. DLL4 es una proteina transmembrana. La región extracelular contiene 8 repeticiones del gen EGF-like, asi como un dominio DSL que se conserva entre todos los ligandos de Notch y es necesario para la unión al receptor. La proteina prevista también contiene una región transmembrana y una cola citoplásmica que carece de motivos catalíticos. La proteína DLL4 humana es una proteína de 685 aminoácidos que contiene las regiones siguientes: péptido de señal (aminoácidos 1-25); MNNL (aminoácidos 26-92); DSL (aminoácidos 155-217); EGF-Like (aminoácidos 221-251); EGF-Like (aminoácidos 252-282); EGF-Like (aminoácidos 284-322); EGF-Like (aminoácidos 324-360); EGF-Like (aminoácidos 366-400) ; EGF-Like (aminoácidos 402-438); EGF-Like (aminoácidos 440-476); EGF-Like (aminoácidos 480-518); transmembrana (aminoácidos 529-551); dominio citoplásmico (aminoácidos 552-685) . El número de entrada de la DLL4 humana es NM_019074 y el número de entrada de la DLL4 murina es NM_019454. Los ADN que codifican la DLL4 se pueden preparar mediante diversos métodos conocidos en el sector. Estos métodos incluyen la síntesis química mediante cualquiera de los métodos descritos en Engels et al., Agnew. Chem . Int. Ed. Engl . , 28: 716-734 (1989), como los métodos de triéster, fosfito, fosforamidita y H-fosfonato. En una forma de realización, los codones preferidos por la expresión de células huésped se usan en el diseño de la DLL4 que codifica ADN. Otra alternativa es aislar el ADN que codifica la DLL4 a partir de una librería de ADNc o genómica. Tras la construcción de la molécula de ADN que codifica la DLL4, la molécula de ADN se enlaza funcionalmente a una secuencia de control de la expresión en un vector de expresión, como un plásmido, en la que la secuencia de control es reconocida por una célula huésped transformada con el vector. En general, los vectores plásmidos contienen secuencias de control y replicación que se derivan de especies compatibles con la célula huésped. Por lo general, el vector lleva un sitio de replicación, así como secuencias que codifican proteínas que son capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas. Los vectores aptos para la expresión en células huésped procarióticas y eucarióticas son bien conocidos en la materia y algunos se describen con mayor detalle en la presente memoria descriptiva. Se pueden usar organismos eucarióticos , como las levaduras, o células derivadas de organismos pluricelulares, como mamíferos. Opcionalmente, el ADN que codifica la DLL4 se enlaza funcionalmente a una secuencia líder secretora, lo que origina la secreción del producto de expresión por la célula huésped en el medio de cultivo. Ejemplos de secuencias líder secretoras son stll, ecotina, lamB, herpes GD, lpp, fosfatasa alcalina, invertasa y factor alfa. También es apta para su uso en la presente memoria descriptiva la secuencia líder de 36 aminoácidos de la proteína A (Abrahmsen et al., EMBO J. , 4: 3901 (1985) ) . Las células huésped son transíectadas y preferiblemente transformadas con los vectores de expresión o clonación de esta invención y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados como es adecuado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Por transfección se entiende la captación de un vector de expresión por una célula huésped, con independencia de que estén expresadas realmente secuencias de codificación. Normalmente, los expertos conocen numerosos métodos de transfección, como por ejemplo, precipitación y electroporacion de CaP04. Por lo general, se reconoce que se ha logrado la transfección cuando se produce una indicación del funcionamiento de este vector dentro de la célula huésped. Los métodos de transfección son bien conocidos en la materia y algunos se describen con mayor detalle en la presente memoria descriptiva. La transformación supone introducir ADN en un organismo de forma que el ADN sea replicable, ya sea como elemento extracromosómico o como integrante cromosómico. En función de la célula huésped que se utilice, la transformación se realiza empleando técnicas estándar apropiadas para dichas células. Los métodos de transformación son bien conocidos en la materia y algunos se describen con mayor detalle en la presente memoria descriptiva. Las células huésped procarióticas usadas para producir la DLL4 se pueden cultivar como se describe en términos generales en Sambrook et al., como se indica anteriormente. Las células huésped en mamíferos usadas para producir la DLL4 se pueden cultivar en diversos medios, que son bien conocidos en el sector y algunos de los cuales se describen en la presente memoria descriptiva. Las células huésped mencionadas en esta memoria engloban células en cultivo in vitro, asi como células que están dentro de un animal huésped. La purificación de DLL4 se puede lograr utilizando métodos reconocidos en este ámbito, algunos de los cuales se describen en esta memoria descriptiva. La DLL4 purificada se puede unir a una matriz adecuada como partículas de agarosa, partículas de acrilamida, partículas de vidrio, celulosa, diversos copolímeros acrílicos, geles de metacrilato de hidróxilo, copolímeros poliacrílieos y polimetacrílieos , nailon, moléculas vehículo neutras e iónicas y similares, para uso en la separación mediante cromatografía de afinidad de clones de representación en fagos. La unión de la proteína DLL4 a la matriz se puede conseguir mediante los métodos descritos en Methods in Enzymology, vol. 44 (1976). Una técnica comúnmente empleada para unir ligandos de proteínas a matrices de polisacáridos, por ejemplo, agarosa, dextrano o celulosa, supone la activación de la molécula vehículo con halidos cianógenos y el acoplamiento subsiguiente de las aminas primarias alifáticas o aromáticas del ligando peptidico a la matriz activada. Alternativamente, la DLL4 se puede utilizar para revestir los pocilios de placas de adsorción, expresada en anfitriones celulares en placas de adsorción o utilizada en separación celular, o conjugada con biotonina para captura con partículas revestidas de estreptavidina , o utilizadas en cualquier otro procedimiento conocido en el sector para detectar librerías de representación en fagos. Las muestras de librerías de fagos están en contacto con DLL4 inmovilizada en condiciones aptas para la unión de al menos una porción de partículas de fago con el adsorbente. Normalmente, las condiciones, incluido el pH, la concentración iónica, la temperatura y similares, se seleccionan de forma que imiten condiciones fisiológicas. Los fagos unidos a la fase sólida se lavan y, luego, se eluyen mediante ácido, por ejemplo, como se describe en Barbas et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991), o mediante álcali, por ejemplo como se describe en Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), o mediante competición antigénica con DLL4, por ejemplo, en un procedimiento similar al procedimiento de competición antigénica de Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991).

Los fagos se pueden enriquecer de 20 a 1.000 veces en una única serie de selección. Además, los fagos enriquecidos se pueden cultivar en cultivos bacterianos y estar sometidos a nuevas series de selección. La eficacia de la selección depende de muchos factores, incluida la cinética de la disociación durante el lavado y si múltiples fragmentos de anticuerpos de un único fago se pueden unir simultáneamente a antigeno. Los anticuerpos con rápida cinética de disociación (y . afinidades de unión débiles), se pueden conservar mediante el uso de lavados cortos, representación en fagos multivalentes y densidad de revestimiento alta del antigeno en fase sólida. La densidad elevada no sólo estabiliza al fago durante las interacciones multivalentes, sino que, además, favorece que se vuelva a producir la unión del fago disociado. La selección de anticuerpos con cinética lenta de disociación (y buenas afinidades de unión) se puede promover mediante el uso de largos lavados y representación en fagos monovalentes, como se describe en Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990) y en el documento WO 92/09690, y una baja densidad de revestimiento del antigeno como se describe en Marks et al., Biotechnol. , 10: 779-783 (1992).

Es posible seleccionar entre anticuerpos de fagos de distintas afinidades, incluso con afinidades que difirieren ligeramente, para DLL . Sin embargo, la mutación aleatoria de un anticuerpo seleccionado (por ejemplo, como la realizada en algunas de las técnicas de maduración de la afinidad descritas anteriormente) es probable que ocasione muchos mutantes, la mayoría de unión a antígeno, y unos cuantos con afinidad más alta. Con una DLL4 limitada, es raro que se pudieran completar fagos de alta afinidad. Para conservar todos los mutantes de afinidad más alta, los fagos se pueden incubar con una cantidad mayor de DLL4 biotinilada, pero con la DLL4 biotinilada a una concentración de molaridad inferior a la constante de afinidad molar diana para DLL4. Los fagos con afinidad de unión más alta pueden, entonces, ser capturados por ' partículas paramagnéticas revestidas de estreptavidina . Esta "captura en equilibrio" permite seleccionar los anticuerpos según sus afinidades de unión, con una sensibilidad que permita aislar clones mutantes con una afinidad tan solo dos veces más elevada que la enorme cantidad de fagos con afinidad menor. Las condiciones usadas en el lavado de fagos unidos a una fase sólida también se pueden manipular para distinguirlos en función de la cinética de disociación.

Los clones anti-DLL4 se pueden seleccionar por actividad. En una forma de realización, la invención proporciona anticuerpos anti-DLL4 que bloquean la unión entre un receptor Notch (como Notchl, Notch 2, Notch 3 y/o Notch 4) y DLL4 , pero no bloquean la unión entre un receptor Notch y una segunda proteina. Los clones de Fv que corresponden a estos anticuerpos anti-DLL4 se pueden seleccionar (1) aislando clones anti-DLL4 de una librería de fagos como se ha descrito antes y, opcionalmente, amplificando la población aislada de clones de fagos cultivando la población en un anfitrión bacteriano apropiado; (2) seleccionando DLL4 y una segunda proteína contra la que se desea una actividad bloqueante y no bloqueante, respectivamente; (3) adsorbiendo los clones de fagos anti-DLL4 a DLL4 inmovilizada; (4) usando una mayor cantidad de la segunda proteína para eluir los clones no deseados que reconocen los determinantes de unión a DLL4 que se solapan o son compartidos con los determinantes de unión de la segunda proteína; y (5) elución de los clones que no se han adsorbido aún tras el paso (4) . Opcionalmente, los clones con las propiedades bloqueantes/no bloqueantes deseadas se pueden enriquecer también mediante repetición de los procedimientos de selección descritos en la presente memoria descriptiva una o más veces.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales derivados de hibridoma o los clones de Fv de la invención es rápidamente aislado y secuenciado utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando cebadores oligonucleóticos diseñados para amplificar específicamente las regiones que codifican las cadenas ligera y pesada de interés de plantillas de ADN de fagos o hibridoma). Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que después se transfectan en células anfitrión, como por ejemplo las células E. coli, las células COS de monos, las células de ovario de hámster chino (CHO) o las células de mieloma que, de otro modo, no producen la proteína de la inmunoglobulina , para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales deseados en las células anfitrión recombinantes . Los artículos de revisión sobre expresión recombinante en bacterias del ADN que codifican el anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opinión in Immunol., 5: 256 (1993) y Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992). El ADN que codifica los clones de Fv de la invención se pueden combinar con secuencias de ADN conocidas que codifican las regiones constantes de la cadena ligera y/o la cadena pesada (por ejemplo, las secuencias de ADN apropiadas se pueden obtener según Kabat et al . , como se ha descrito anteriormente) para formar clones que codifiquen cadenas ligeras y/o pesadas de longitud total o parcial. Se tendrá en cuenta que las regiones constantes de cualquier isotipo se pueden utilizar para este fin, incluidas las regiones constantes IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, y que dichas regiones constantes se pueden obtener de cualquier especie animal o humana. Un clon de Fv se deriva del ADN del dominio variable de una especie animal (por ejemplo, un humano) y, luego, se fusiona al ADN de la región constante de otra especie animal para formar una o más secuencias de codificación, puesto que una cadena ligera y/o pesada de longitud completa e "híbrida" está incluida en la definición de anticuerpo "híbrido" y "quimérico" como se usa en la presente memoria descriptiva. En una forma de realización preferente, un clon de Fv derivado de ADN variable humano se fusiona con ADN de región constante humano para formar una o más secuencias de codificación para todas las cadenas ligeras y/o pesadas de longitud parcial o completa y humanas. El ADN que codifica un anticuerpo anti-DLL4 derivado de un hibridoma de la invención también se puede modificar, por ejemplo, mediante sustitución de las secuencias murinas homologas derivadas del clon de hibridoma por la secuencia de codificación para los dominios constantes de la cadena ligera y pesada humanas (por ejemplo, como en el método de orrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 81: 6851-6855 (1984)) . El ADN que codifica un anticuerpo o fragmento derivado del clon de Fv o un hibridoma se puede modificar a su vez mediante la unión covalente a la secuencia de codificación de la inmunoglobulina de la totalidad o parte de la secuencia de codificación de un polipéptido que no sea inmunoglobulina. De este modo, se preparan anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" que tiene la especificidad de unión de los anticuerpos de la invención derivados del clon de hibridoma o del clon de Fv. Fragmentos de anticuerpos La presente invención engloba fragmentos de anticuerpos. En determinadas circunstancias, existen ventajas en el uso de fragmentos de anticuerpos, en vez de anticuerpos completos. El menor tamaño de los fragmentos permite una rápida eliminación y puede llevar a un mejor acceso a tumores sólidos . Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se obtenían mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora se pueden producir directamente mediante células huésped recombinantes . Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y ScFv pueden expresarse todos en E. coli y secretarse a partir de E. coli, lo que permite la fácil producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpos se pueden aislar de las bibliotecas de fagos descritas anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH se puede recuperar directamente de E. coli y se pueden unir químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/'Technology 10:163-167 (1992)). Según otro método, los fragmentos F(ab')2 se pueden aislar directamente de cultivos de células huésped recombinantes. El fragmento Fab y F(ab')2 con mayor semivida in vivo que comprende residuos de un epítopo de unión a un receptor de rescate se describe en la Patente de Estados Unidos n.° 5.869.046. Los expertos en este campo conocerán otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. En otras formas de realización, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena simple (scFv) . Véase el documento WO 93/16185; la patente de EE.UU. n.° 5.571.894 y la patente de EE.UU. n.° 5.587.458. Fv y sFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos que están privados de regiones constantes; por ello, son aptos para una unión no especifica reducida durante el uso in vivo. Se pueden construir proteínas de fusión sFv para obtener la fusión de una proteína efectora en el extremo carboxi terminal o amino terminal de un sFv. Véase Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, citado anteriormente. El fragmento de anticuerpo puede ser también un "anticuerpo lineal", por ejemplo, tal y como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 5.641.870. Estos fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecífieos o biespecí fieos . Anticuemos humanizados La presente invención engloba anticuerpos humanizados. En el sector se conocen diversos procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado puede tener uno o más residuos de aminoácidos introducidos en el mismo desde una fuente que es no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se conocen a menudo como residuos "importados", que generalmente se toman de un dominio variable de "importación". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el método de Winter y sus colaboradores (Jones et al., (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al., (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al., (1988) Science 239:1534-1536), sustituyendo las secuencias de la región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de EE.UU. n.° 4.816.567) donde se ha sustituido sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de especies no humanas. En la práctica, los anticuerpos humanizados son generalmente anticuerpos humanos en los que los residuos de la región hipervariable y posiblemente algunos residuos FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores . La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que se utilizarán para obtener los anticuerpos humanizados es muy importante para disminuir la antigenicidad . De acuerdo con el llamado método del "más apto", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de un roedor se compara con toda la biblioteca conocida de secuencias de dominio variable de humanos. La secuencia humana que se parece más a la del roedor se acepta, entonces, como la estructura humana para el anticuerpo humanizado (Sims et al., (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901. Otro procedimiento utiliza una estructura concreta derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo en particular de las cadenas ligera o pesada. Esta misma estructura se puede usar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta et al., (1993) J. Immunol . , 151:2623.

Además, es importante que los anticuerpos se humanicen con retención de la afinidad alta para el antigeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, siguiendo uno de los métodos, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de ¦ las secuencias parentales y varios productos humanizados conceptuales que utilizan modelos tridimensionales de las secuencias parentales y las humanizadas. Generalmente se dispone de modelos de inmunoglobina tridimensional conocidos por los expertos en la materia. Existen programas informáticos que ilustran y muestran estructuras conformacionales tridimensionales .probables de secuencias de inmunoglobulina candidata. La inspección de estas visualizaciones permite analizar el papel que es probable que desempeñen los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antigeno. De esta manera, los residuos FR se pueden seleccionar y combinar a partir de las secuencias receptoras y de importación para lograr la característica deseada del anticuerpo, como por ejemplo una mayor afinidad por el antígeno o antígenos diana. En general, los residuos de la región hipervariable intervienen de forma más directa y sustancial en la influencia sobre la unión al antígeno. Anticuerpos humanos Los anticuerpos humanos anti-DLL4 de la invención se pueden construir combinando una o más secuencias del dominio variable Fv de clones seleccionadas de librerías de representación en fagos derivados de humanos con una o más secuencias del domino constante humanas, como se ha descrito anteriormente. Alternativamente, los anticuerpos humanos monoclonales anti-DLL4 de la invención se pueden producir por el método del hibridoma. Las estirpes celulares del mieloma humano y del heteromieloma humano-murino para la producción de anticuerpos monoclonales humanos se han descrito, por ejemplo, en Kozbor J. Immunol . , 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); y Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991). Actualmente es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que sean capaces, una vez inmunizados, de generar un repertorio completo de anticuerpos humanos cuando no se produzca inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigótica del gen de la cadena pesada del anticuerpo que se une a la región del gen (JH) en ratones quiméricos y en lineas germinales de ratones mutantes ocasiona la inhibición total de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la matriz de genes humanos de la inmunoglobulina de linea germinal en uno de estos ratones mutantes de linea germinal ocasionará la producción de anticuerpos humanos al actuar sobre el antigeno. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc . Nati. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7: 33 (1993) . También se puede utilizar la transposición de genes para derivar anticuerpos humanos de no humanos, por ejemplo, anticuerpos de roedores, en los que el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares al anticuerpo no humano de inicio. Según este método, que también se denomina "impronta de epitopos", la región variable de la cadena pesada o ligera de un fragmento de anticuerpo no humano obtenido mediante técnicas de representación en fagos como las descritas anteriormente se sustituye por un repertorio de genes de dominio V humanos, lo que crea una población de quimeras Fab o scFv de cadena humana/cadena no humana. La selección con el antigeno da lugar al aislamiento de un Fab o scFV quimérico de cadena humana/cadena no humana, en el que la cadena humana restaura el sitio de unión a antigeno destruido al eliminar la cadena no humana correspondiente del clon primario de la representación en fagos; es decir, el epitopo rige (sella) la elección de la molécula de la cadena humana. Cuando se repite el proceso para sustituir la cadena no humana restante, se obtiene un anticuerpo humano (véase PCT WO 93/06213 publicado el 1 de abril de 1993) . A diferencia de la tradicional humanización de anticuerpos no humanos mediante transplante de CDR, esta técnica proporciona anticuerpos completamente humanos que no tienen residuos FR o CDR de origen no humano. Anticuerpos biespecíficos Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales , preferiblemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión con al menos dos antígenos diferentes. En el caso que nos ocupa, una de las especificidades de unión corresponde a DLL4 y la otra, a cualquier otro antígeno. Los anticuerpos biespecíficos ejemplares se pueden unir a dos epítopos diferentes de la proteina DLL4. Los anticuerpos biespecífieos también se pueden utilizar para localizar agentes citotóxicos de las células que expresan DLL4. Estos anticuerpos tienen un brazo de unión a DLL4 y un brazo que se une al agente citotóxico (por ej . , saporin, anti-interferón-a, alcaloide de la vinca, cadena de ricina A, metotrexato o hapteno con un isótopo radiactivo) . Los anticuerpos biespecificos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecificos F(ab' )2) . Los métodos para preparar anticuerpos biespecificos son conocidos en la materia. La producción recombinante tradicional de anticuerpos biespecificos se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina , donde las dos cadenas tienen distintas especificidades (Milstein y Cuello, Nature, 305: 537 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una posible mezcla de 10 moléculas diferentes de anticuerpos, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecifica correcta. La purificación de la molécula correcta, que generalmente se realiza mediante etapas de cromatografía de afinidad, es bastante complicada, y la cantidad de producto que se obtiene es baja. Se' describen procedimientos similares en el documento O 93/08829, publicado el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J. , 10: 3655 (1991) . Según una técnica distinta y que se suele preferir, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antigeno) se fusionan a las secuencias de domino constante de la inmunoglobulina . La fusión es preferentemente con un dominio constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Es preferible tener la primera región constante de la cadena pesada (CH1), que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, de la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se co-transfectan a un organismo huésped adecuado. Esto permite una gran flexibilidad al ajusfar las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptidicos en formas de realización cuando las proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptidos utilizados en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación de dos o de las tres cadenas de polipéptidos en un vector de expresión cuando la expresión de, al menos, dos cadenas de polipéptidos en proporciones iguales da lugar a rendimientos altos o cuando las proporciones no tienen particular importancia. En una forma de realización preferente de este método, los anticuerpos biespecificos se componen de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se descubrió que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una de las mitades de la molécula biespecífica proporciona una forma sencilla de separación. Este método se describe en el documento WO 94/04690. Para obtener más información sobre la generación de anticuerpos biespecificos , véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986) .

Según otro método, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpos se puede modificar para maximizar el porcentaje de heterodimeros que se recuperan de un cultivo celular recombinante . La interfaz preferente comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante del anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales cortas de aminoácidos de la interfaz de la primera molécula del anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más largas (por ejemplo, tirosina o triptofano) . Las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la cadena o cadenas laterales largas se crean en la interfaz de la segunda molécula del anticuerpo al reemplazar las cadenas laterales largas de aminoácidos por cadenas más cortas (por ejemplo, alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar la producción del heterodimero con respecto a otros productos finales no deseados como los homodimeros . Los anticuerpos biespecificos incluyen anticuerpos reticulantes o "heteroconjugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconj ugado se puede unir a la avidina y el otro a la biotina. Estos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para conseguir que las células del sistema inmunitario actúen sobre células no deseadas (patente de EE.UU. n.° 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por VIH (documentos WO 91/00360 y WO 92/00373 y la patente europea EP 03089). Los anticuerpos heteroconj ugados se pueden obtener utilizando cualquier método de reticulación adecuado. Los agentes reticulantes adecuados se conocen bien en la materia y se describen en la patente de EE.UU. n.° 4.675.980, junto con una serie de técnicas de reticulación. Las técnicas para generar anticuerpos biespecificos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han descrito en la bibliografía. Por ejemplo, los anticuerpos biespecificos se pueden preparar mediante un enlace químico. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describe un procedimiento en el que los anticuerpos intactos se separan proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2- Estos fragmentos se reducen en presencia de arsenito de sodio del agente que forma complejos con el ditiol para estabilizar los ditioles vecinales y evitar la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados se convierten entonces en derivados del tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados del Fab' -TNB se reconvierte entonces en Fab'-tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar de otro derivado del Fab' -TNB para formar el anticuerpo biespecifico . Los anticuerpos biespecificos producidos se pueden utilizar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. Descubrimientos actuales han facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH de E. coli, que se pueden unir químicamente para formar anticuerpos biespecificos . Shalaby et al., J. Exp. Med. , 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de anticuerpo biespecifica F(ab')2 completamente humanizado. Cada uno de los fragmentos Fab' se secretó por separado a partir de E. coli y se sometió a la unión química dirigida in vitro para formar el anticuerpo biespecifico . Por lo tanto, el anticuerpo biespecífico formado era capaz de unirse a células que sobreexpresaban el receptor HER2 y las células T humanas normales, así como de desencadenar la . actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumor de mama humano. También se han descrito varias técnicas para preparar y aislar fragmentos, de anticuerpos biespecificos directamente de cultivos celulares recombinantes . Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecificos utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al. -, J. Immunol . , 148 (5) : 1547-1553 (1992). Los péptidos con cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros del anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y, después, se reoxidaron para formar los heterodimeros del anticuerpo. Este método también se puede utilizar para producir los homodimeros del anticuerpo. La tecnología "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpos biespecí fieos . Los fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VL) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios de la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento tienen que aparearse con los dominios complementarios VL y VH de otro fragmento, formando, por lo tanto, dos sitios de unión a antígeno. También se ha informado de otra estrategia para producir fragmentos de anticuerpos biespecífieos mediante el uso de dímeros Fv de cadena única (sFv) . Véase Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994). También se contemplan los anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos . Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991). Anticuerpos multivalentes Un anticuerpo raultivalente puede internalizarse (y/o catabolizarse) con mayor rapidez que un anticuerpo bivalente por una célula que exprese un antigeno al que se unen los anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos multivalentes (que son los que no pertenecen a la clase IgM) con tres o más sitios de unión al antigeno (por ejemplo, anticuerpos tetravalentes), que pueden producirse fácilmente mediante expresión recombinante del ácido nucleico que codifica las cadenas de polipéptidos del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de unión al antigeno. El dominio preferente de dimerización comprende una región Fe o una región bisagra o está formado por ellas. En esta situación, el anticuerpo comprenderá una región Fe y tres o más sitios de unión al antigeno amino-terminal a la región Fe. El anticuerpo multivalente preferente en la presente memoria descriptiva comprende entre tres y ocho sitios de unión al antigeno aproximadamente, aunque preferentemente cuatro, o está formado por esos sitios. El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena de polipéptidos (y preferentemente dos cadenas de polipéptidos) , en el cual la cadena o cadenas de polipéptidos comprenden dos o más dominios variables. Por ejemplo, la cadena o cadenas de polipéptidos pueden comprender VD1- (XI) n-VD2- (X2 ) n-Fc, donde VD1 es un primer dominio de variable, VD2 es un segundo dominio de variable, Fe es una cadena de polipéptidos de una región Fe, XI y X2 representan una aminoácido o polipéptido y n es 0 ó 1. Por ejemplo, la cadena o cadenas de polipéptidos pueden comprender: VH-CHl-enlazador flexible-VH-CH1- cadena de la región Fe o VH-CH1-VH-CHl-cadena de la región Fe. El anticuerpo multivalente de la presente memoria descriptiva comprende, además, preferentemente, al menos dos (y preferiblemente cuatro) polipéptidos de dominio variable de la cadena ligera. El anticuerpo multivalente de la presente memoria descriptiva, por ejemplo, puede comprender entre dos y cuatro polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de cadena ligera considerados en esta memoria descriptiva comprenden un dominio variable de cadena ligera y, opcionalmente, un dominio CL. Variantes de anticuerpos En algunas formas de realización se contemplan la(s) modificación (es) de la secuencia de aminoácidos descritas en la presente memoria. Por ejemplo, puede desearse mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se pueden preparar al introducir cambios nucleótidos adecuados en el ácido nucleico del anticuerpo, o mediante síntesis del péptido. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, eliminaciones de las secuencias del aminoácido del anticuerpo y/o inserciones y/o sustituciones de residuos dentro de las mismas. Cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución se realiza para llegar al constructo final, siempre que dicho constructo tenga las características deseadas. Las alteraciones aminoacídicas pueden introducirse en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo del sujeto en el momento en que se prepara la secuencia . Un método útil para la identificación de determinados residuos o regiones del anticuerpo que son ubicaciones preferidas para la mutagenia se denomina "mutagenia de barrido de alanina", tal como se describe en Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En la presente memoria descriptiva, se identifica un residuo o grupo de residuos de dianas (por ejemplo, residuos cargados como arg, asp, his, lys y glu) y se sustituyen por un aminoácido con carga negativa o neutra (preferentemente, alanina o polialanina) para influir en la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Estas localizaciones de los aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan al introducir más u otras variantes en los sitios de sustitución. Por tanto, a pesar de que el sitio donde introducir una variación de una secuencia de aminoácidos está predeterminado, no es necesario que la naturaleza de la mutación per se tenga un carácter predeterminado. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un lugar dado, se realiza el barrido de alanina o mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y las inmunoglobulinas expresadas se monitorizan para detectar la actividad deseada.

Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones en los extremos amino y/o carboxi terminal que abarcan desde un residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, asi como inserciones dentro de la secuencia de uno o múltiples residuos de aminoácidos. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo metionil en el extremo N terminal o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula del anticuerpo incluyen la fusión del extremo N o C terminal del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumente la semivida sérica del anticuerpo.

La glicosilación de los polipéptidos se realiza generalmente por enlace N u 0. Por enlace tipo N se entiende el anclaje del residuo glucidico en la cadena lateral de un residuo de asparragina. Las secuencias de tripéptidos asparragina-X-serina y asparragina-X-treonina , en donde X es cualquier aminoácido excepto la prolina, son las secuencias de reconocimiento para los anclajes enzimáticos del residuo glucidico a la cadena lateral de asparragina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un lugar de glicosilación potencial. La glicosilación por enlace tipo 0 se refiere al anclaje de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, a pesar de que también se puede utilizar 5-hidroxiprolina y 5-hidroxilisina . La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se logra convenientemente al alterar la secuencia del aminoácido para que contenga una o más de las secuencias de tripéptidos descrita (s) anteriormente (para lugares de glicosilación unidos por enlace tipo N) . La alteración también se puede realizar mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para lugares de glicosilación unidos por enlace tipo 0) . Donde el anticuerpo comprende una región Fe, se puede alterar el carbohidrato unido al mismo. Por ejemplo, los anticuerpos con una estructura de carbohidratos madura que carece de fucosa unida a una región Fe del anticuerpo se describen en la Solicitud de patente de EE.UU. n.° 2003/0157108 (Presta, L.). Véase también US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) . Los anticuerpos con una N-acetilglucosamina (GlcNAc) bisectriz en el carbohidrato unido a una región Fe del anticuerpo se describen en el documento WO 2003/011878, Jean-Mairet et al., y en la Patente de Estados Unidos n.° 6.602.684, Umana et al. Los anticuerpos con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a una región Fe del anticuerpo se describen en el documento WO 1997/30087, Patel et al. Véanse también los documentos WO 1998/58964 (Raju, S.) y WO 1999/22764 (Raju, S.) con respecto a los anticuerpos con carbohidratos alterados unidos a la región Fe de los mismos. Véase también US 2005/0123546 (Umana et al.) sobre moléculas de unión a antigeno con glicosilación modificada. En la presente memoria descriptiva, la variante de glicosilación preferente comprende una región Fe, en la que una estructura de carbohidratos anexa a la región Fe carece de fucosa. Estas variantes han mejorado la función de la ADCC. Opcionalmente , la región Fe también comprende una o más sustituciones de aminoácidos en la zona que mejora aún más la ADCC; por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fe (numeración Eu de residuos) . Entre las publicaciones relacionadas con los anticuerpos "defucosilados" o "con déficit de fucosa" podríamos citar: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Entre los ejemplos de líneas celulares que producen anticuerpos defucosilados encontraríamos las células Lecl3 CHO con déficit de fucosilación de proteínas (Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys . 249:533-545 (1986); la Solicitud de Patente de EE.UU. n.° US 2003/0157108 Al, Presta, L y el documento WO 2004/056312 Al, Adams et al., especialmente el ejemplo 11) y las líneas celulares bloqueadas, como el gen alfa-1, 6-fucosiltransferasa, el FUT8 y células CHO bloqueadas (Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)).

Otro tipo de variante es una variante de sustitución aminoacidica . Estas variantes reemplazan al menos un residuo de aminoácidos en la molécula del anticuerpo por un residuo diferente. Los lugares de mayor interés para la mutagénesis por sustitución incluyen las regiones hipervariables , pero las alteraciones FR también se contemplan. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1, en la columna "sustituciones preferentes". Si dichas sustituciones ocasionan un cambio en la actividad biológica, entonces los productos se pueden examinar y se pueden introducir cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 1, o como se describe con más detalle a continuación con referencia a las clases de aminoácidos.

Tabla 1 Residuo Sustituciones Sustitución original ejemplares es preferentes Ala (A) Val; Leu; lie Val Arg (R) Lis; Gln; Asn Lis Asn (N) Gln; His; Asp, Lis; Arg Gln Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gln Asp Gli (G) Ala Ala His (H) Asn; Gln; Lis; Arg Arg He (I) Leu; Val; Met; Ala; Leu Fe; Norleucina Leu (L) Norleucina; lie; Val; lie Met; Ala; Fe Lis (K) Arg; Gln; Asn Arg Met (M) Leu; Fe; lie Leu Fe (F) Trp; Leu; Val; lie; Ala; Tir Tir Pro (P) Ala Ala Ser (S) Tr Tr Tr (T) Val; Ser Ser Trp (W) Tir; Fe Tir Tir (Y) Trp; Fe; Tr; Ser Fe Val (V) lie; Leu; Met; Fe; Leu Ala; Norleucina Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se logran seleccionando sustituciones que difieran significativamente en su efecto de mantener (a) la estructura de la base del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación plana o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el lugar diana, o (c) el residuo de la cadena lateral. Los residuos que aparecen de forma natural se dividen en grupos sobre la base de las propiedades comunes de sus cadenas laterales: (1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile ; (2) hidrófilos neutrales: Cis, Ser, Tr, Asn, Gln; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: his, lys, arg; (5) residuos que tiene influencia en la orientación de la cadena: gly, pro; y (6) aromáticos: trp, tyr, phe .

Las sustituciones no conservadoras supondrán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase .

Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano) . Generalmente, la variante o variantes resultantes seleccionadas para mayor desarrollo tendrán propiedades biológicas mejoradas con respecto al anticuerpo parental desde el cual se generaron. Una manera conveniente de generar dichas variantes de sustitución implica la maduración de afinidad utilizando una presentación en fagos. De manera resumida, varios sitios de regiones hipervariables (por ejemplo, 6-7 sitios) se mutan para generar todas las sustituciones posibles de aminoácidos en cada sitio. Los anticuerpos generados de esta manera se representan a partir de partículas de fagos filamentosas como fusiones al producto del gen III de MI3 dentro de cada partícula. Las variantes presentadas en fagos se monitorizan para detectar su actividad biológica (por ejemplo afinidad de unión) como se describe en esta memoria descriptiva. Para identificar los lugares de la región hipervariable candidatos para la modificación, se pueden realizar barridos de alanina para identificar residuos de la región hipervariable que contribuyan significativamente a la unión del antígeno. Como alternativa, o adicionalmente , puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antigeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antigeno. Dichos residuos de contacto y los residuos adyacentes son candidatos a la sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en la presente memoria descriptiva. Una vez que se generan dichas variantes, el panel de variantes está sujeto a monitorización, tal como se describe en la presente memoria descriptiva y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes se pueden seleccionar para mayor desarrollo. Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan mediante varios métodos conocidos en la materia. Estos métodos incluyen, entre otros, aislamiento desde una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos presentes en la naturaleza) o preparación mediante mutagénesis con mediación oligonucleótida (o controlada in situ) , mutagénesis PCR, y mutagénesis de módulo de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo. Puede ser deseable introducir una o más modificaciones en los aminoácidos en la región Fe de polipéptidos de inmunoglobulina de la invención, lo que genera una variante de la región Fe. La variante de la región Fe puede comprender una secuencia de la región Fe humana (por ejemplo, una región Fe de IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas) que contenga una modificación de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos, incluida la de la cisteina bisagra. Según esta descripción y los conocimientos del sector, se contempla que en algunas realizaciones un anticuerpo usado en los métodos de la invención pueda comprender una o más alteraciones, frente a su anticuerpo homólogo de tipo natural, por ejemplo, en la región Fe. No obstante, estos anticuerpos conservarán las mismas características necesarias para uso terapéutico, frente a su homólogo de tipo natural. Por ejemplo, se cree que se pueden realizar algunas alteraciones en la región Fe que daría como resultado la unión Clq alterada y/o en Citotoxicidad Dependiente de Complementos (CDC) , por ejemplo, como se describe en W099/51642. Véase también Duncan & inter Nature 322:738-40 (1988); Patente de EE.UU. n.° 5.648.260; Patente de EE.UU. n.° 5.624.821; y W094/29351 que tratan otro ejemplos de variantes de regiones Fe. Los documentos WO00/42072 (Presta) y WO 2004/056312 (Lowman) describen variantes de anticuerpos con capacidad de unión a los FcR mejoradas o disminuidas. El contenido de estas publicaciones de patentes se incorpora específicamente a la presente memoria descriptiva a modo de referencia. Véase, además, Shields et al., J. Biol. Chem . 9(2): 6591-6604 (2001). Los anticuerpos con un aumento de su semivida y una unión mejorada al receptor neonatal Fe (FcRn), que es responsable de la transmisión de las IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol . 24:249 (1994)), se describen en US2005/0014934A1 (Hinton et al.) . Estos anticuerpos comprenden una región Fe con una o más sustituciones en la zona que mejoran la unión de la región Fe al FcRn. Las variantes polipeptídicas con secuencias aminoacídicas de la región Fe alteradas y capacidad aumentada o disminuida de unión a Clq se describen en la Patente de EE.UU. n.° 6.194.551B1 y el documento 099/51642. El contenido de dichas publicaciones de patentes se incorpora específicamente a la presente memoria descriptiva a modo de referencia. Véase, además, Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000). Derivados del anticuerpo Los anticuerpos de la presente invención pueden modificarse aún más a fin de que contengan fracciones no proteicas adicionales que son conocidas en la materia y se encuentran disponibles. Preferiblemente, las fracciones adecuadas para la derivati zación del anticuerpo son polímeros solubles en agua. Ejemplos no limitantes de los polímeros solubles en agua incluyen los siguientes componentes: polietilenglicol (PEG), copolímero de etilenglicol / propilenglicol , carboximetilcelulosa , dextrano, alcohol polivinilo, polivinilpirrolidona, poli-1 , 3-dioxolano, poli-1 , 3 , ß-trioxano, copolímero anhídrido etileno/maleico, poliaminoácidos (ya sean homopolímeros o copolímeros aleatorios), y dextrano o poli (n-vinilpirrolidona ) polietilenglicol , homopolímeros de propropilenglicol , óxido de prolipropileno / copolímeros de óxido de etileno, polialcoholes polioxietilados (por ejemplo glicerol), alcohol polivinilo, y mezclas de los mismos. Es posible que el polietilenglicol propionaldehído ofrezca ventajas en la elaboración, dada su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no. La cantidad de polímetros adheridos al anticuerpo puede variar y, si se une más de un polímero, los polímeros pueden ser las mismas o diferentes moléculas. Generalmente, la cantidad y/o tipo de polímeros utilizados para la derivatización pueden determinarse en función de ciertas consideraciones, como las propiedades o funciones particulares del anticuerpo a mejorar, si el anticuerpo derivatizado será utilizado en un tratamiento en condiciones definidas, etc. Detección de anticuerpos con las propiedades deseadas Los anticuerpos de la presente invención se pueden caracterizar por sus propiedades fisico-quimicas y por sus funciones biológicas mediante varios ensayos conocidos en el sector. En algunas formas de realización, los anticuerpos están caracterizados por uno o más sitios de unión a DLL4; y/o reducción o bloqueo de la activación del receptor Noten; y/o reducción o bloqueo de la señalización molecular en el extremo 3' del receptor Noten; y/o alteración o bloqueo de la unión del receptor Notch a DLL4 ; y/o promoción de la proliferación de células endoteliales ; y/o inhibición de la diferenciación de células endoteliales; y/o inhibición de la diferenciación arterial; y/o inhibición de la perfusión vascular de tumores; y/o tratamiento y/o prevención de un tumor, trastorno de la proliferación celular o cáncer; y/o tratamiento o prevención de un trastorno asociado a la expresión y/o actividad de DLL4 ; y/o tratamiento o prevención de un trastorno asociado a la expresión y/o actividad del receptor Notch. Asimismo, los anticuerpos purificados se pueden caracterizar mediante una serie de ensayos que incluyen la secuenciación del extremo N-terminal, el análisis de aminoácidos, la cromatografía líquida de alta resolución no desnaturalizante de exclusión por tamaño (HPLC) , espectrometría de masas, cromatografía de intercambio iónico y digestión con papaína. En ciertas formas de realización de la invención se analiza la actividad biológica de los anticuerpos producidos en la misma. En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se prueban por su actividad de unión al antígeno. Los ensayos de unión al antígeno que se conocen en la especialidad y pueden ser usados en la presente memoria descriptiva incluyen ensayos de unión competitiva o directa que usan técnicas como western blots, radioinmunoensayos , ELISA (ensayo de inmunoadsorción enzimática) , inmunoanálisis de doble anticuerpo (tipo "sandwich"), ensayos de inmunoprecipitación, inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos de proteína A. Los ensayos de unión a antígeno ilustrativos se incluyen más adelante en la sección Ejemplos. En otra forma de realización, la invención proporciona anticuerpos monoclonales anti-DLL4 que compiten con anticuerpo 26.6, 26.14, 26.20, 26.34 y/o 26.82 para unión a DLL4. Estos anticuerpos competidores incluyen anticuerpos que reconocen un epítopo de DLL4 que es el mismo o se superpone con el epítopo de DLL4 reconocido por el anticuerpo 26.6, 26.14, 26.20, 26.34 y/o 26.82. Estos anticuerpos competidores se pueden obtener mediante detección de sobrenadantes de hibridoma anti-DLL4 para unión a DLL4 inmovilizada en competencia con anticuerpo marcado 26.6, 26.14, 26.20, 26.34 y/o 26.82. Un sobrenadante de hibridoma que contenga un anticuerpo competidor reducirá la cantidad de anticuerpo marcado unido detectado en la mezcla de unión de competición en el sujeto, frente a la cantidad de anticuerpo marcado unido detectada en una mezcla de unión a control que contenga un anticuerpo no pertinente (o ningún anticuerpo) . Cualquiera de los ensayos de unión por competición descritos en la presente memoria descriptiva es apto para uso en el procedimiento siguiente. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti-DLL4 que comprende una o más HVR (como 2, 3, 4, 5 y/o 6) de un anticuerpo 26.6, 26.14, 26.20, 26.34 y/o 26.82. Un anticuerpo monoclonal anti-DLL4 que comprende una o más HVR de 26.6, 26.14, 26.20, 26.34 y/o 26.82 se puede construir mediante trasplante de una o más HVR de26.6, 26.14, 26.20, 26.34 y/o 26.82 en una secuencia de anticuerpos plantilla, por ejemplo, una secuencia de anticuerpos humanos que está próxima a la secuencia murina correspondiente del anticuerpo parenteral, o una secuencia de consenso de todos los anticuerpos humano sen el subgrupo concreto de la cadena pesada o ligera del anticuerpo parental y que exprese la o las secuencias de la región variable de la cadena pesada y/o ligera quimérica, con o sin secuencia o secuencias de la región constante, en células huésped recombinantes , como se describe en la presente memoria descriptiva. Los anticuerpos anti-DLL4 de la invención que tengan las propiedades únicas descritas en esta memoria descriptiva se pueden obtener mediante detección de clones de hibridoma anti-DLL4 para las propiedades deseadas mediante un método cómodo. Por ejemplo, si se desea un anticuerpo monoclonal anti-DLL4 que bloquee o no bloquee la unión de receptores Notch a DLL4, el anticuerpo candidato se puede probar en un ensayo de competición de unión, como un ensayo ELISA de unión competitiva, donde los pocilios de las placas están revestidos con DLL4, y una solución de anticuerpo en un exceso del receptor Notch de interés se deposita en las placas revestidas, y el anticuerpo unido se detecta enzimáticamente, por ejemplo, mediante contacto del anticuerpo unido al anticuerpo anti-Ig conjugado con HRP o anticuerpo anti-Ig biotinilado y desarrollo de reacción de coloración de HRP, por ejemplo, mediante desarrollo de placas con HRP de estreptavidina y/o peróxido de hidrógeno y detección de la reacción de coloración de HRP mediante espectrometría a 490 nm con un lector de placas ELISA. En una forma de realización, la invención contempla un anticuerpo alterado que tiene algunas, pero no la totalidad, de las funciones efectoras, lo que le convierte en un candidato deseable para muchas aplicaciones en las que la semivida del anticuerpo in vivo es importante, pero determinadas funciones efectoras (como complemento y ADCC) son innecesarias o dañinas. En algunas formas de realización, se miden las actividades Fe de la inmunoglobulina producida para garantizar que sólo se mantienen las propiedades deseadas. Se pueden llevar a cabo ensayos de citotoxicidad in vitro o in vivo para confirmar la reducción/depleción de actividades de CDC y/o ADCC. Por ejemplo, los ensayos de unión del receptor Fe (FcR) pueden ser realizados para asegurar que el anticuerpo carece de unión a FcyR (por eso es probable que carezca de actividad ADCC), pero conserva la capacidad de unión a FcRn . Las células primarias para mediar en la ADCC, las células NK, expresan sólo Fc(RIII, mientras que los monocitos expresan Fc(RI, Fc(RII y Fc(RIII. La expresión del FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol, 9:457-92 (1991). En las patentes de EE.UU. N° 5.500.362 ó 5.821.337 se describe un ejemplo de un ensayo in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés. Entre las células efectoras útiles para estos ensayos se encuentran las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) y las células asesinas (NK) . Como alternativa, o adicionalmente , la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal como el que se describe en Clynes et al., Proc. Nati. Acad. Sci.ñ, 95:652-656 (1998) . También se pueden llevar a cabo los ensayos de unión Clq para confirmar que el anticuerpo no puede unirse al Clq y por ello carece de actividad CDC. A fin de evaluar la activación del complemento, se puede efectuar un ensayo de CDC, como, por ejemplo, el que se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996). También se pueden realizar la unión de FcRn y eliminación in vi o/determinaciones de semivida con el uso de métodos conocidos en este ámbito; por ejemplo, los descritos en la sección Ejemplos.

Vectores , células huésped y métodos recombinantes Para la producción recombinante de un anticuerpo de la invención, el ácido nucleico que lo codifica se aisla e inserta en un vector replicable para la clonación subsiguiente (amplificación del ADN) o para expresión. El ADN que codifica el anticuerpo se aisla fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleótidas capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo). Hay muchos vectores disponibles. La elección del vector depende en parte del huésped celular que se utilice. Por lo general, las células huésped preferidas son de origen procariótico o eucariótico (en general, de mamíferos) . Se tendrá en cuenta que las regiones constantes de cualquier isotipo se pueden utilizar para este fin, incluidas las regiones constantes IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, y que dichas regiones constantes se pueden obtener de cualquier especie animal o humana. a. Generación de anticuerpos usando células huésped eucarióticas i. Construcción de vectores Las secuencias de polinucleótidos que codifiquen componentes de polipéptidos del anticuerpo de la invención se pueden obtener utilizando técnicas recombinantes estándar. Las secuencias deseadas de polinucleótidos se pueden aislar y secuenciar a partir de anticuerpos que producen células, como por ejemplo células de hibridoma. Alternativamente, los polinucleótidos se pueden sintetizar usando técnicas de PCR o sintetizador de nucleótidos. Una vez obtenidas, las secuencias que codifican los polipéptidos se insertan en un vector recombinante capaz de replicar y expresar polinucleótidos heterólogos en los huéspedes procarióticos . Muchos vectores que están disponibles y son conocidos en la materia se pueden utilizar para el fin de la presente invención. La selección de un vector apropiado dependerá principalmente del tamaño de los ácidos nucleicos que se van a insertar en el vector y de la célula huésped concreta que se transformará con el vector. Cada vector contiene diversos componentes, dependiendo de su función (amplificación o expresión de polinucleóido heterólogo o ambas) y su compatibilidad con la célula huésped concreta en la que resida. Los componentes del vector incluyen, por lo general: un origen de replicación, un gen marcador de la selección, un promotor, un sitio de unión a ribosoma (RBS) , una secuencia de señal, la inserción del ácido nucleico heterólogo y una secuencia de terminación de la transcripción.

En general, los vectores plásmidos que contienen secuencias de control y replicón que se derivan de especies compatibles con la célula huésped se usan en conexión con estos huéspedes. Por lo general, el vector lleva un sitio de replicación, asi como secuencias de marcado, que son capaces de proporcionar selección fenotipica en células transformadas. Por ejemplo, E. coli se transforma habitualmente usando pBR322, un plásmido derivado de una especie E. coli. El pBR322 contiene genes que codifican la resistencia a ampicilina (Amp) y tetraciclina (Tet) y, de este modo, proporcionan una forma fácil de identificar células transformadas. El pBR322, sus derivados, u otros plásmidos microbianos o bacteriófagos pueden contener también, o ser modificados para que contengan, promotores que pueden ser utilizados por el organismo microbiano para la expresión de proteínas endógenas. Ejemplos de derivados del pBR322 usados para la expresión de anticuerpos concretos se describen en detalle en Cárter et al., Patente de EE.UU. n.° 5.648.237. Además, los vectores fágicos que contienen secuencias de control y replicón que son compatibles con los microorganismos huésped se pueden usar como vectores de transformación en relación con estos huéspedes. Por ejemplo, un bacteriófago como AGEM™-11 se puede utilizar para marcar un vector recombinante que se pueda utilizar para transformar células huésped susceptibles como E. coli LE392. El vector de expresión de la invención puede comprender dos o más pares de promotores de cistrón, que codifiquen cada uno de los componentes polipeptidicos . Un promotor es una secuencia reguladora no traducida situada antes del extremo 5' del promotor en un cistrón que modula su expresión. Los promotores procarióticos suelen pertenecer a dos clases: inducibles y constitutivos. El promotor inducible es aquel que inicia un aumento de los niveles de transcripción del cistrón bajo su control en respuesta a cambios en las condiciones del cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio de temperatura. Se conoce un gran número de promotores reconocidos por diversas células huésped posibles. El promotor seleccionado puede ser funcionalmente enlazado al ADN del cistrón que codifica la cadena pesada o ligera mediante eliminación del promotor del ADN fuente a través de digestión enzimática mediante restricción e inserción de la secuencia aislada del promotor en el vector de la invención. Tanto la secuencia nativa del promotor como muchos promotores heterólogos se pueden utilizar para dirigir la amplificación y/o expresión de los genes diana. En algunas realizaciones, se utilizan promotores heterólogos, puesto que por lo general permiten una mayor transcripción y una mayor producción del gen diana expresado, frente al promotor polipeptidico diana nativo. Los promotores aptos para su uso con huéspedes procarióticos incluyen el promotor PhoA, los sistemas promotores de lactosa y ß-galactamasa , un sistema promotor a base de triptofano (trp) y promotores híbridos como el promotor tac o el trc. Sin embargo, también son aptos otros promotores que son funcionales en bacterias (como otros promotores de fagos o bacterianos conocidos) . Se han publicado sus secuencias de nucleótidos, lo que permite que un experto pueda ligarlas a cistrones que codifiquen las cadenas pesada y ligera dianas (Siebenlist et al., (1980) Cell 20: 269) usando enlazadores o adaptadores que proporcionen sitios de restricción necesarios. En un aspecto de la invención, cada cistrón dentro del vector recombinante comprende un componente de la secuencia de señal de la secreción que dirige la translocación de los polipéptidos expresados en una membrana. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser parte del ADN del polipéptido diana que se inserta en el vector. La secuencia de señal seleccionada a efectos de esta invención es aquella que la célula huésped reconoce y procesa (es decir, escindida por una peptidasa de señal) . Para las células huésped procarióticas que no reconocen ni procesan las secuencias de señal nativas a los polipéptidos heterólogos, la secuencia de señal es sustituida por una secuencia de señal procariótica seleccionada, por ejemplo, entre un grupo formado por fosfatasa alcalina, penicilasa, Ipp o líderes de enterotoxina II termoestable (STII), LamB, PhoE, PelB, OmpA y MBP. En una realización de la invención, las secuencias de señal usadas en los dos cistrones del sistema de expresión son secuencias de señal STII o variantes de ellas. En otro aspecto, la producción de las inmunoglobulinas según la invención puede tener lugar en el citoplasma de la célula huésped y, por lo tanto, no requiere la presencia de secuencias de señal de secreción dentro de cada cistrón. A este respecto, las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina se expresan, multiplican y ensamblan para formar inmunoglobulinas funcionales dentro del citoplasma. Determinadas cepas de huéspedes (por ejemplo, las cepas de E. coli trxB) ofrecen condiciones citoplasmáticas que son favorables a la formación de uniones de disulfuros, lo que permite una multiplicación y ensamblaje correctos de las subunidades de las proteínas expresadas. Proba y Pluckthun Gene, 159:203 (1995) . Las células huésped procarióticas aptas para la expresión de anticuerpos de la invención incluyen Archaebacteria y Eubacteria, como microorganismos grampos.itivos o gramnegativos . Entre los ejemplos de bacterias útiles se incluyen Escherichia (por ejemplo, E. coli) , Bacilli (por ejemplo, B. subtilis) , Enterobacteria, las especies Pseudomonas (por ejemplo, P. aeruginosa) , Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla o Paracoccus . En una forma de realización, se utilizan células gramnegativas . En una forma de realización, se utilizan células E. coli como huéspedes para la invención. Entre los ejemplos de cepas E. coli están 3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), págs. 1190-1219; ATCC® Depósito. N.° 27,325) y derivados de las mismas, que comprenden la cepa 33D3 con el genotipo W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompTñ(nmpc-fepE) degP41 kanR (Patente de EE.UU. n.°. 5.639.635). Otras cepas y derivados de las mismas, como E. coli 294 (ATCC 31.446), E. coli B, E. coliX 1776 (ATCC 31.537) y E. coli RV308 (ATCC 31.608) también están indicados. Estos ejemplos tienen un carácter ilustrativo y no limitador. Los métodos para construcción de derivados de cualquiera de las bacterias antes mencionadas con genotipos definidos son conocidos en el sector y se describen, por ejemplo, en Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990). Por lo general, es necesario seleccionar las bacterias apropiadas teniendo en cuenta la replicabilidad del replicón en las células de una bacteria. Por ejemplo, las especies E. coli, Serratia o Salmonella se pueden usar bien como huésped cuando plásmidos bien conocidos como pBR322, pBR325, pACYC177 o pKN410 se utilizan para suministrar al replicón. Normalmente, en caso de que la célula huésped deba secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas puede resultar conveniente incorporar al cultivo celular inhibidores adicionales de la proteasa. ii. Producción de anticuerpos Las células huésped se transforman con los vectores de expresión descritos anteriormente y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados como es adecuado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Transformación significa introducir ADN en el huésped procariótico de forma que el ADN sea replicable, ya sea como elemento extracromosómico o como integrante cromosómico. En función de la célula huésped que se utilice, la transformación se realiza empleando técnicas estándar apropiadas para dichas células. El tratamiento con calcio que emplea cloruro de calcio se usa por lo general para células bacterianas que contienen barreras sustanciales en la pared celular. Otro método de transformación emplea /polietilenglicol/DMSO. Otra técnica utilizada es la electroporación . Las células procarióticas usadas para producir los polipéptidos de la invención se cultivan en medios conocidos en el sector y aptos para el cultivo de células huésped seleccionadas. Ejemplos de medios apropiados son caldo de luria (LB) más nutrientes suplementarios necesarios. En algunas realizaciones, los medios también contienen un agente de selección, elegido en función de la construcción del vector de expresión, para permitir el crecimiento selectivo de células procarióticas que contengan el vector de expresión. Por ejemplo, se añade ampicilina a los medios de cultivo para el crecimiento de células que expresan un gen resistente a ampicilina. Los anticuerpos necesarios aparte de carbono, nitrógeno y fuentes inorgánicas de fosfato también se pueden incluir a concentraciones apropiadas introducidas solas en una mezcla con otro suplemento o medio de cultivo como una fuente de nitrógeno compleja. Opcionalmente , el medio de cultivo puede contener uno o más agentes reductores seleccionados a partir del grupo formado por glutationa, cisteina, cistamina, tioglicolato, ditioeritriol y ditiotreitol . Las células huésped procarióticas se cultivan a temperaturas apropiadas. El crecimiento de E. coli, por ejemplo, se produce a un rango de temperaturas comprendido entre unos 20 °C y unos 39 °C; mejor aún, entre unos 25 °C y unos 37 °C; y, aún mejor, a unos 30 °C. El pH del medio de cultivo puede ser cualquiera comprendido entre · 5 y 9 aproximadamente, dependiendo sobre todo del microorganismo huésped. El pH para E. coli oscila, preferiblemente entre 6,8 y 7,4 aproximadamente, y mejor aún si es de 7,0. Si un promotor inducible se utiliza en el vector de expresión de la invención, la expresión de la proteina se induce en condiciones aptas para la activación del promotor. En un aspecto de la invención, los promotores PhoA se utilizan para controlar la transcripción de los polipéptidos. Según esto, las células huésped transformadas se cultivan en un medio limitador de fosfato para la inducción. Preferiblemente, el medio de cultivo limitador de fosfato es el C.R.A.P (véase, por ejemplo, Simmons et al., J. Immunol .

Methods (2002), 263:133-147). Se pueden utilizar otros inductores diversos, según el constructo de vector empleado, como se sabe en el sector. En una realización, los polipéptidos expresados de la presente invención se secretan en el periplasma de las células huésped y se recuperan allí. La recuperación de las proteínas supone la ruptura de los microorganismos, por lo general mediante choque osmótico, sonicación o lisis. Una vez producida la ruptura de las células, los desechos celulares o células enteras se pueden eliminar mediante centrifugación o filtración. Las proteínas pueden purificarse más, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad con resina. De manera alternativa, pueden transportarse proteínas dentro del medio de cultivo y aislarse en él. Las células pueden retirarse del cultivo, y el sobrenadante del cultivo puede filtrarse y concentrarse para proceder a la posterior purificación de las proteínas producidas. Los polipéptidos expresados pueden volver a aislarse e identificarse mediante métodos comunes conocidos, como la electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) y ensayos Western blot. En uno de los aspectos de la invención, la producción de anticuerpos se realiza en gran cantidad mediante proceso de fermentación. Existen varios procesos disponibles de fermentación de lotes alimentados a gran escala para la producción de proteínas recombinantes . Las fermentaciones a gran escala se realizan en dispositivos de al menos 1000 litros de capacidad, preferiblemente, entre 1.000 y 100.000 litros de capacidad. Estos fermentadores utilizan agitadores de hélice para distribuir oxígeno y nutrientes, especialmente glucosa (la fuente preferente de carbono/energía). La fermentación a pequeña escala hace referencia generalmente a la fermentación en termentadores de aproximadamente no más de 100 litros de capacidad volumétrica, y pueden variar de 1 a 100 litros aproximadamente. En un proceso de fermentación, la inducción de expresión proteica se inicia típicamente después de que las células hayan crecido en condiciones adecuadas hasta alcanzar la densidad deseada, por ejemplo una OD550 de entre 180-220, momento en el cual las células se encuentran en la fase estacionaria temprana. Pueden usarse distintos inductores, de acuerdo con el constructo del vector utilizado, tal y como se conoce en la materia y como se ha descrito anteriormente. Las células pueden hacerse crecer durante períodos más cortos antes de la inducción. Las células se inducen normalmente durante unas 12-50 horas, aunque es posible utilizar tiempos de inducción más cortos o más prolongados. Pueden modificarse distintas condiciones de fermentación para mejorar el rendimiento de producción y la calidad de los polipéptidos de la invención. Por ejemplo, para mejorar el ensamblaje adecuado y el plegamiento de los polipéptidos de anticuerpos secretados, pueden utilizarse vectores adicionales que sobreexpresan la proteina chaperona, tales como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD y/o DsbG) o FkpA (una peptidil-propil cis, trans-isomerasa con actividad chaperona) para co-transformar las células huésped procarióticas . Se ha demostrado que las proteínas chaperonas facilitan la solubilidad y el plegamiento adecuado de las proteínas heterólogas producidas en células bacteriales huésped. Chen et al. (1999) J Bio Chem 274:19601-19605; Georgiou et al., Patente de EE.UU. n.° 6,083,715; Georgiou et al., Patente de EE.UU.. n.°. 6, 027, 888; Bothmann y Pluckthun ' (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm y Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie et al., (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210. Pueden utilizarse ciertas cepas huésped con deficiencia de enzimas proteolíticas para minimizar la proteolisis de proteínas heterólogas (especialmente las que son sensibles desde el punto de vista proteolítico) . Por ejemplo, las cepas de células huésped pueden modificarse para efectuar mutaciones genéticas relativas a los genes que codifican proteasas bacteriales conocidas, como la Proteasa III, OmpT, DegP, Tsp, Proteasa I, Proteasa Mi, Proteasa V, Proteasa VI y combinaciones de éstas. Algunas cepas de E. coli con deficiencia de proteasas están disponibles, y descritas, por ejemplo en Joly et al., (1998), citado anteriormente; Georgiou et al., Patente de EE.UU. n.° 5.264.365; Georgiou et al., Patente de EE.UU. n.° 5.508.192; Hará et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996). En una forma de realización, en el sistema de expresión de la invención se utilizan como células huésped cepas de E. coli con deficiencia de enzimas proteoliticas transformadas con plásmidos que sobreexpresan una o más proteínas chaperonas . iii. Purificación de anticuerpos Pueden emplearse métodos estándar conocidas en la materia para la purificación de proteínas. Los siguientes procedimientos tienen carácter ejemplar en lo que se refiere a procedimientos de purificación adecuados: fraccionamiento en columnas de intercambio iónico o de inmunoafinidad, precipitación en etanol, HPLC de fase reversa, cromatografía en anhídrido silícico o en una resina de intercambio catiónico tal como DEAE, cromatoisoenfoque , SDS-PAGE, precipitación en sulfato de amonio y filtrado en gel mediante, por ejemplo, Sephadex G-75. En un aspecto, se utiliza Proteína A inmovilizada en una fase sólida para purificación por inmunoafinidad de los productos de anticuerpos de longitud completa de la invención. La proteína A es una proteína de pared celular de 41kD del Staphylococcus áureas que se une con gran afinidad por la región Fe de los anticuerpos. Lindmark et al., (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13. La fase sólida a la que se fija la Proteína A es preferiblemente una columna que contenga una superficie de vidrio o anhídrido silícico, o, aún mejor, una columna de ácido silícico o de vidrio poroso controlado. En algunas aplicaciones, la columna ha sido recubierta con un reactivo, como el glicerol, para evitar una posible adherencia inespecífica de contaminantes. Como primer paso de purificación, la preparación derivada del cultivo celular, según lo descrito anteriormente, se aplica a la fase sólida de Proteína A inmovilizada para permitir la unión específica del anticuerpo de interés a la Proteína A. A continuación, se procede a lavar la fase sólida para eliminar los contaminantes unidos inespecí ficamente a ella. Finalmente, el anticuerpo de interés se recupera de la fase sólida mediante elución. b. Generación de anticuerpos usando células huésped eucarióticas Los componentes del vector suelen incluir, entre otros, uno o más de los siguientes elementos: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un potenciador, un promotor y una secuencia de finalización de la transcripción. (i) Componente de secuencia de la señal Un vector para uso en una célula huésped eucariótica puede contener también una secuencia de señal u otro polipéptido con una escisión especifica en el término N de la proteina madura o polipéptido. La secuencia de señal heteróloga seleccionada preferiblemente es aquella que la célula huésped reconoce y procesa (es decir, escindida por una peptidasa de señal) . En la expresión celular de los mamíferos, están disponibles las secuencias de señal de los mamíferos así como los líderes secretores víricos, por ejemplo, la señal del herpes simplex gD. El ADN para la región de dicho precursor está ligado en la estructura' de lectura al ADN que codifica el anticuerpo. (ii) Origen de la replicación Por lo general, no es necesario un componente origen de la replicación para los vectores de expresión en mamíferos. Por ejemplo, el origen SV40 se puede utilizar habitualmente sólo porque contiene el promotor precoz. (iii) Componente gen de selección Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado marcador seleccionable . Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) otorgan resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina , (b) complementan las deficiencias auxotróficas, si procede o (c) suministran nutrientes básicos no disponibles a partir de medios complejos. Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Estas células que se transforman con éxito con un gen heterólogo producen una proteína que otorga resistencia al fármaco y, así, sobrevive a la estrategia de selección. Ejemplos de esta selección dominante utilizan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina. Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamíferos son los que permiten la identificación de las células encargadas de absorber el ácido nucleico del anticuerpo, como DHFR, timidina cinasa, metalotioneina I y II, preferiblemente, genes de metalotioneina en primates, adenosina deaminasa, ornitina decarboxilasa , etc. Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican primero a través del cultivo de todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx) , un antagonista competitivo del DHFR. Una célula huésped adecuada cuando se utiliza el DHFR de tipo natural es la linea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad del DHFR (por ejemplo, ATCC CRL-9096) . Alternativamente, las células huésped (en especial los huéspedes naturales que contienen DHFR endógeno) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican un anticuerpo, la proteina DHFR natural y otro marcador seleccionable como la aminoglicosida 3'-fosfotransferasa (APH) pueden seleccionarse mediante crecimiento celular en un medio que contenga un agente de selección para el marcador seleccionable, como un antibiótico aminoglicosidico, por ejemplo, canamicina, neomicina o G418. Véase la patente de EE.UU. N° 4.965.199. (iv) Componente promotor Los vectores de expresión y clonación suelen contener un promotor que es reconocido por el organismo huésped y está funcionalmente enlazado al ácido nucleico del polipéptido del anticuerpo. Se conocen las secuencias de promotores para eucariotas. Prácticamente todos los genes alecucarióticos tienen una región rica en AT situada aproximadamente entre las bases 25 y 30 antes del extremo 5' del promotor desde el sitio donde se inicia la trascripción. Otra secuencia encontrada entre las bases 70 y 80 antes del extremo 5' del promotor desde el inicio de la transcripción de muchos genes es la región CNCAAT en la que N puede ser cualquier nucleótido ( identificador de secuencia n.°: 60) . En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucarióticos hay una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola de poli (A) al extremo 3' de la secuencia de codificación ( identificador de secuencia n.°: 61). Todas estas secuencias se insertan bien en los vectores de expresión eucariótica. La transcripción de], polipéptido de anticuerpos a partir de los vectores en células huésped de mamíferos está controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos a partir de los genomas de virus como el poliomavirus , el virus de la viruela de las aves de corral, el adenovirus (como el Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviario, el citomegalovirus , un retrovirus, el virus de la hepatitis B y el Simian Virus 40 (SV40) , a partir de promotores heterologos de mamíferos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina , o a partir de promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de las células huésped. Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen fácilmente como un fragmento de restricción del SV40, que también contiene el origen viral de replicación del SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene fácilmente como un fragmento de restricción HindIII E. Un sistema para la expresión del ADN en huéspedes de mamíferos utilizando el virus del papiloma bovino como vector se da a conocer en la patente de EE.UU n.° 4.419.446. Una modificación de este sistema se describe en la patente de EE.UU. n.° 4.601.978. Alternativamente, la repetición del terminal largo del virus del sarcoma de Rous se puede utilizar como promotor. (v) Componente elemento potenciador La trascripción de ADN que codifique el polipéptido del anticuerpo de esta invención a través de eucariotas más altas se aumenta con frecuencia al insertar la secuencia de un potenciador en el vector. Se conocen ya muchas secuencias de potenciadores de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, fetoproteína alfa e insulina) . No obstante, lo habitual es que se utilice un potenciador procedente de un virus de células eucarióticas . Entre los ejemplos destacan el potenciador SV40 en el lado tardío del origen de la replicación (bp 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus , el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de la replicación y los potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) para elementos de potenciación para la activación de los promotores eucarióticos . El potenciador puede empalmarse en el vector en una posición 5' o 3' a la secuencia de codificación del polipéptido del anticuerpo, pero está situado preferiblemente en un sitio 5' desde el promotor. (vi) Componente finalización de la transcripción Los vectores de expresión utilizados en células huésped eucarióticas contendrán también, por lo general, secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm. Estas secuencias están habitualmente disponibles desde las regiones no traducidas del extremo 5' , y ocasionalmente el 3' , de los ADN o ADNc virales o eucarióticos . Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica un anticuerpo. Un componente de finalización de la transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Véase el documento WO94/11026 y el vector de expresión que se da a conocer en el mismo. (vii) Selección y transformación de células huésped Entre las células huésped apropiadas para clonación o expresión del ADN en los vectores de la presente memoria descriptiva figuran las células eucariotas más altas, incluidas las células huésped de vertebrados. La propagación de células de vertebrados en cultivos (cultivo tisular) se ha convertido en un procedimiento habitual. Ejemplos de lineas celulares útiles de mamíferos son la línea CV1 de riñon del mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñon embrionario humano (293 ó 293 células subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñon de crías de hámster (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 77:4216 (1980)) ; células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)) ; células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587) ; células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células caninas de riñon (MDCK, ATCC CCL 34); células de riñon de ratas búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano ( 138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor de mama de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., ñnnals N.Y. ñcad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una linea de hepatoma humano (Hep G2 ) . Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para la producción del anticuerpo y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados como es adecuado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. (viii) Cultivo de las células huésped Las células huésped utilizadas para producir un anticuerpo de esta invención se pueden cultivar en diversos medios. Medios comercialmente disponibles como Ham's FIO (Sigma) , Mínima 1 Essential Médium ( (MEM) , (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) y Dulbecco's Modified Eagle ' s Médium ( ( DMEM) , Sigma) son aptos para el cultivo de células huésped. Además, cualquiera de los medios de cultivo descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), Patentes de EE.UU. n.° 4.767.704, 4.657.866, 4.927.762, 4.560.655 ó 5.122.469; el documento WO 90/03430; el documento WO 87/00195; o la patente de EE.UU. Ref. 30.985 se pueden utilizar como medios de cultivo para células huésped. Cualquiera de estos medios se puede suplementar cuando sea necesario con hormonas y otros factores de crecimiento (como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico) , sales (como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato) , tampones (como HEPES) , nucleótidos (como adenosina y timidina) , antibióticos (como el fármaco GENTAMYCIN™) , elementos de traza (definidos como compuestos inorgánicos presentes por lo habitual en las concentraciones finales en el rango micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Se pueden incluir también otros suplementos necesarios a concentraciones adecuadas que serán conocidas por aquellos con conocimientos en la materia. Las condiciones del cultivo, como temperatura o pH entre otras, son las utilizadas anteriormente con la célula huésped seleccionada para expresión y serán conocidas por los expertos en la materia. (ix) Purificación del anticuerpo Al utilizar técnicas recombinantes , se puede producir el anticuerpo intracelularmente o directamente secretado en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como primer paso, los residuos de partículas, ya sean células huésped o fragmentos Usados, se eliminan, por ejemplo, mediante centrifugación o ult rafiltración . Cuando el anticuerpo es secretado en el medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión se concentran primero, por lo general, utilizando un filtro para concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon®. Se puede incluir un inhibidor de la proteasa como PMSF en cualquiera de las fases anteriores para inhibir la proteolisis y se pueden incluir antibióticos para impedir el crecimiento de contaminantes accidentales. La composición del anticuerpo preparado a partir de las células se puede purificar utilizando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita , electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad. Esta última es la técnica de purificación preferida. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de las especies y del isotipo de cualquier domino Fe de la inmunoglobulina que está presente en el anticuerpo. La proteína A se puede utilizar para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas humanas ??, ?2, o ?4 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para la ?3 humana (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la que el ligando de afinidad se une es con frecuencia la más agarosa, pero también están disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables, como vidrio poroso controlado o poli (estirenodivinil ) benceno, permiten tasas de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden lograr con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, New Jersey) es útil para la purificación. También están disponibles, dependiendo del anticuerpo que quiera recuperarse, otras técnicas para la purificación de las proteínas, como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación en etanol, HPLC de fase reversa, cromatografía en anhídrido silícico, cromatografía en heparina SEPHAROSE™, cromatografía en una resina de intercambio iónico o catiónico (como una columna de ácido poliaspártico) , cromatoisoenfoque, SDS-PAGE y precipitación en sulfato de amonio. Siguiendo cualquiera de las fases preliminares de purificación, la mezcla que contiene el anticuerpo de interés y los contaminantes puede estar sujeta a cromatografía de interacción hidrófoba con pH bajo utilizando una solución de elución a un pH entre 2,5 y 4,5, preferiblemente a concentraciones bajas en sal (por ejemplo, entre 0-0,25 M aproximadamente) . Inmunoconjugados La invención también proporciona inmunoconj ugados (también denominados "conjugados de anticuerpos con fármacos" o "ADC"), que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-DLL4 descritos en la presente memoria descriptiva conjugado a un agente citotóxico como por ejemplo un agente quimioterapéutico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, animal o vegetal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconj ugado) . El uso de conjugados de anticuerpos con fármacos para la administración local de agentes citotóxicos o citostáticos , es decir, los fármacos que se utilizan para matar o inhibir células tumorales en el tratamiento del cáncer (Syrigos y Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz y Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26: 151-172; patente de EE . UU . n.° 4.975.278), permite la administración del grupo de fármacos a tumores y una acumulación intracelular en éstos, donde la administración sistemática de estos agentes farmacológicos no conjugados puede resultar en niveles inaceptables de toxicidad tanto para las células normales como para las células tumorales que se intentan eliminar (Baldwin et al., (1986) Lancet págs . (Mar. 15, 1986) : 603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review, " en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al., (eds), págs. 475-506). Se busca entonces la máxima eficacia con la mínima toxicidad. Tanto los anticuerpos monoclonales como los policlonales se han descrito como útiles en estas estrategias (Rowland et al., (1986) Cáncer Immunol. Immunother., 21:183-87). Los medicamentos empleados en estos métodos incluyen a la daunomicina, la doxorrubicina , el metotrexato y la vindesina (Rowland et al., (1986) mencionado anteriormente) . Entre las toxinas empleadas en los conjugados de anticuerpos con toxinas se encuentran toxinas bacterianas como la toxina .de la difteria, toxinas vegetales como la ricina, toxinas de molécula pequeña como la geldanamicina (Mandler et al., (2000) Jour. of the Nat. Cáncer Inst. 92 ( 19) : 1573-1581; Mandler et al., (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al., (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinoides (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:8618-8623) y caliqueamicina (Lode et al. (1998) Cáncer Res. 58:2928; Hinman et al., (1993) Cáncer Res. 53:3336-3342) . Las toxinas pueden producir sus efectos citotóxicos y citostáticos mediante mecanismos que incluyen la unión de tubulina, la unión de ADN o la inhibición de la topoisomerasa . Algunos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan con grandes anticuerpos o ligandos receptores de proteínas. ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/Idec) es un anticuerpo conjugado con un radioisótopo compuesto de un anticuerpo monoclonal kappa IgGl murino dirigido contra el antígeno CD20 que se encuentra en la superficie de los linfocitos B cancerosos y normales, y contra el radioisótopo ^u I ri o 90Y unido por un quelante enlazador de tiourea ( iseman et al., (2000) Eur. Jour. Nucí. Med. 27 ( 7 ) : 766-77 ; Wiseman et al., (2002) Blood 99 ( 12 ): 4336-42 ; Wit'zig et al., (2002) J. Clin. Oncol. 20 (10) : 2453-63; Witzig et al., (2002) J. Clin. Oncol. 20 (15) : 3262-69) . A pesar de que el ZEVALIN presenta actividad contra las células B del linfoma no Hodgkin (NHL) , su administración provoca citopenias graves y prolongadas en la mayoría de los pacientes. MYLOTARG™ (Gentuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals ) , un conjugado de anticuerpo con un fármaco, compuesto de un anticuerpo huCD33 enlazado a caliqueamicina , se aprobó en 2000 para el tratamiento de leucemia mieloide aguda por inyección {Drugs of the Future (2000) 25(7) : 686; patentes de EE.UU. n.° 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). Cantuzumab mertansina (Inmugen, Inc.), un conjugado de anticuerpo con fármaco compuesto por el anticuerpo huC242 enlazado al grupo de fármacos de los maitansinoides , DM1, por medio de un enlazador de disulfuro SPP, está bien avanzado en ensayos clínicos de Fase II para el tratamiento de cánceres que expresan CanAg, como los de colon, páncreas, gástricos y otros. MLN-2704 (Millennium Pharm. , BZL Biologics, Immunogen Inc.), un conjugado de anticuerpo con un fármaco, compuesto por el anticuerpo monoclonal del antígeno de membrana antiprostático (PSMA) enlazado al grupo de los maitansinoides, DM1, está en fase de desarrollo para el tratamiento potencial de los tumores de próstata. Los péptidos auriestatinos , la auristatina E (AE) y la monometilauristatina (MMAE) , análogos sintéticos de la dolastatina, se conjugaron a anticuerpos monoclonales quiméricos cBR96 (específicos para Lewis Y en carcinomas) y cAClO (específicos para CD30 en tumores hematológicos ) (Doronina et al., (2003) Nature Biotechnology 21 (7 ): 778-78 ) y se encuentran en desarrollo terapéutico.

Los agentes quimioterapéut icos útiles en la generación de inmunoconj ugados se describen en la presente memoria (por ejemplo, los descritos anteriormente). Las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de las mismas que se pueden utilizar incluyen la cadena de difteria A, los fragmentos activos sin unión de la toxina de la difteria, la cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , la cadena de ricina A, la cadena de abrina A, la cadena de modecina A, la alfa-sarcina, las proteínas de Aleurites fordii, las proteínas de diantina, las proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), el inhibidor de la Momordica charantia, la curcina, la crotina, el inhibidor de la Saponaria officinalis, la gelonina, la mitogelina, la restrictocina , la fenomicina, la enomicina y el tricotecenos . Véase, por ejemplo, el documento WO 93/21232, publicado el 28 de octubre de 1993. Se dispone de diversos radionúclidos para la producción de anticuerpos radioconj ugados . Entre los ejemplos se incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y y 186Re. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se pueden realizar utilizando una variedad de agentes de unión a proteína bifuncionales , como por ejemplo N-succinimidil-3- ( 2-piridilditio) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (como el dimetiladipimidato HC1), ásteres activos (por ejemplo, disuccinimidil suberato) , aldehidos (por ejemplo, glutaraldehidos ) , compuestos bis-azido (como bis (p-azidobenzoil ) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilenodiamina) , diisocianatos (por ejemplo, 2 , 6-diisocianato de tolueno) y compuestos bis-activos de fluoruro (como 1 , 5-difluoruro-2 , 4 -dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina se puede preparar tal y como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido triaminopentaacético 1-isotiocianatobencil-3-metildietileno marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de un radionucleótido a un anticuerpo. Véase el documento WO94/11026. También se contemplan en la presente memoria descriptiva los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, como una calicheamicina , maitansinoides , dolastatinas, aurostatinas , un tricoteceno y un CC1065, y los derivados de estas toxinas que tengan una actividad tóxica. i. Maitansina y maitansinoides En algunas realizaciones, el inmunoconj ugado comprende un anticuerpo de la invención (longitud completa o fragmentos) conjugado con una o más moléculas de maitansinoides .

Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan inhibiendo la polimerización de la tubulina. La maitansina se aisló por primera vez a partir del arbusto de África oriental Maytenus serrata (patente de EE.UU. n.° 3.896.111). Posteriormente, se descubrió que determinados microbios también producían maitansinoides, como el maitansinol y los ésteres de C-3 maitansinol (patente de Estados Unidos n.° 4.151.042). El maitansinol sintético y sus derivados y análogos se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. n.° 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663 y .371.533. Las porciones de fármacos maitansinoides son porciones de fármacos que resultan atractivas para la elaboración de conjugados de anticuerpos con fármacos por sus siguientes características: (i) son relativamente accesibles en lo que se refiere a su preparación mediante fermentación, modificación química o derivación de productos de fermentación, (ii) son fáciles de someter a derivación, con grupos funcionales adecuados para conjugación a través de los enlazadores no disulfuro con anticuerpos, (iii) estabilidad en plasma y (iv) resultan efectivos frente a distintas lineas celulares tumorales. Los inmunoconj ugados que contienen maitansinoides , los métodos para elaborarlos y su uso terapéutico se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU n.°° 5.208.020 y 5.416.064, y en la Patente Europea 0 425 235 Bl, y los descubrimientos de las mismas se incorporan expresamente a la presente memoria descriptiva a modo de referencia. Liu et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) describe los inmunoconj ugados que comprenden un maitansinoide denominado DM1 enlazado al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra el cáncer colorrectal humano. Se descubrió que el conjugado era altamente citotóxico para las células del cáncer de colon en cultivo y demostró actividad antineoplásica en 1 ensayos de crecimiento tumoral in vivo. Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992) describen inmunoconjugados en los que un maitansinoide se conjugaba por medio de un enlazado de disulfuro al anticuerpo murino A7 que se une a un antigeno en las lineas celulares de cáncer de colon humanas, o a otro anticuerpo monoclonal murino TA.l que se une al oncogen HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado TA .1-maitansinoide se probó in vitro en la linea celular de cáncer de mama SK-BR-3, que expresa 3 x 105 antigenos de superficie HER-2 por célula. El conjugado de fármaco consiguió un alto grado de citotoxicidad similar al fármaco maitansinoide libre, que podría ser mayor si se aumentase el número de moléculas maitansinoides por cada molécula de anticuerpo. El conjugado A7-maitansinoide mostró una citotoxicidad sistémica baja en ratones. Los conjugados de anticuerpo-maitansinoide se preparan mediante enlace químico de un anticuerpo a una molécula de maitansinoide sin hacer que disminuya significativamente la actividad biológica de ambos elementos del conjugado. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. n.° 5.208.020 (cuyos descubrimientos se incorporan expresamente a la presente memoria descriptiva a modo de referencia) . Una media de 3-4 moléculas maitansinoides conjugadas por anticuerpo ha mostrado eficacia en la mejora de la citotoxicidad de las células diana sin afectar negativamente a la función o solubilidad del anticuerpo, a pesar de que podría esperarse que incluso una molécula toxina/anticuerpo mejore la citotoxicidad en relación con el uso del anticuerpo desnudo. Los maitansinoides son muy conocidos en la materia y pueden sintetizarse mediante técnicas conocidas o aislarse de fuentes naturales. En la patente de EE.UU. n.° 5.208.020 y en otras patentes y publicaciones no patentadas a las que anteriormente se ha hecho referencia, por ejemplo, se describen maitansinoides adecuados. Los maitansinoides preferidos son el maitansinol y análogos modificados del maitansinol, en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula de maitansinol, como distintos ésteres del maitansinol . Se conocen muchos grupos de enlace en la materia para producir conjugados anticuerpo-maitansinoide , incluidos, por ejemplo, los revelados en la Patente de Estados Unidos n.° 5.208.020 o en la Patente Europea 0 425 235 Bl, and Chari et al. Cáncer Research 52:127-131 (1992), y la Solicitud de patente EE.UU. n.° 10/960.602, presentada el 8 de oct . 2004, (cuyos descubrimientos se incorporan expresamente en la presente memoria descriptiva a modo de referencia). Los conjugados anticuerpo-maitansinoide que incluyen el componente enlazador SMCC pueden prepararse se la manera que se describe en la Solicitud de Patente de EE.UU n.° 10/960.602, presentada el 8 de octubre de 2004. Los grupos enlazantes incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles al ácido, grupos fotolábiles, grupos lábiles a la peptidasa o grupos lábiles a la estearasa, como se revela en las patentes anteriormente identificadas, y se prefieren grupos de disulfuro y tioéter. En la presente memoria descriptiva se dan ejemplos y se describen grupos enlazantes adicionales . Los conjugados del anticuerpo y el maitansinoide se pueden realizar utilizando una variedad de agentes de unión a proteina bifuncionales , como por ejemplo N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil ) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) , iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (como el dimetiladipimidato HCI), ésteres activos (por ejemplo, disuccinimidil suberato) , aldehidos (por ejemplo, glutaraldehidos ) , compuestos bis-azido (como bis (p-azidobenzoil ) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (como bis- (p-diazoniobenzoil ) -etilenodiamina ) , di isocianatos (por ejemplo, 2 , 6-diisocianato de tolueno), y compuestos bis-activos de fluoruro (como 1 , 5-difluoruro-2 , 4-dinitrobenceno) . Los agentes de unión que se prefieren sobre todo son N-sucinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)) y N-sucinimidil-4- (2-piridilditio) pentanoato (SPP) para proporcionar un enlace de disulfuro . El enlazador se puede unir a la molécula de maitansinoide en varias posiciones, dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, un enlace con éster se puede formar mediante reacción con un grupo hidroxilo que utilice técnicas de unión convencionales. La reacción puede producirse en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una forma de realización preferente, el enlace se forma en la posición C-3 del maitansinol o un análogo del maitansinol . ii. Auristatinas y dolastatinas En algunas formas de realización, el inmunoconj ugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado con dolastatinas o análogos peptidicos a la dolastatina y derivados, las auristatinas (patentes de EE.UU. n.° 5635483; 5780588). Se ha establecido que las dolastatinas y las auristatinas interfieren con la dinámica de microtúbulos , la hidrólisis GTP, y la división nuclear y celular (Woyke et al., (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12) :3580-3584) y tienen actividad ant icancerigena (U.S. 5663149) y antifúngica (Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). La porción del fármaco auristatina o dolastatina puede estar unida al anticuerpo a través de los extremos terminales N (amino) ó C (carboxil) de la porción peptidica del fármaco (WO 02/088172) .

Ejemplos de realizaciones de auristatina incluyen las porciones DE y DF enlazadas a monometilauristatina por el extremo terminal N, como se revela en "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", Ser. EE.UU n.° 10/983.340, presentada el 5 de noviembre de 2004, cuyo contenido se incorpora expresamente en su totalidad a modo de referencia . Por lo general, las porciones de fármacos basadas en péptidos pueden prepararse formando un enlace peptidico entre uno o más aminoácidos y/o fragmentos de péptidos. Estos enlaces peptidicos pueden prepararse, por ejemplo, de acuerdo con el método de síntesis de fase líquida (véase E. Schróder y K. Lübke, "The Peptides", volume 1, págs 76-136, 1965, Academic Press) que es bien conocido en el campo de la química de péptidos. Las porciones de fármacos auristatina/dolastatina pueden prepararse de acuerdo con los métodos siguientes: EE.UU. 5635483; EE.UU. 5780588; Pettit et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al., (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et al., Synthesis, 1996, 719-725; y Pettit et al., (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863. Véase también Doronina (2003) Nat Biotechnol 21 ( 7 ) : 778-784 ; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", U.S. Ser. n.° 10/983,340, presentada el 5 de noviembre de 2004, incorporados en la presente memoria descriptiva a modo de referencia en su totalidad (que revela, p.ej., enlazadores y métodos de preparación de compuestos de monometilvalina tales como conjugados MMAE/MMAF a enlazadores) . iii. Caliqueamicina En otras realizaciones, el inmunocon ugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado con una o más moléculas de calicheamicina . La familia de antibióticos de la calicheamicina es capaz de producir la ruptura del ADN de hebra doble en concentraciones por debajo de picomolar. Para la preparación de conjugados de la familia de la caliqueamicina, véanse las patentes de EE.UU. n.° 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001 y 5.877.296 (todas para American Cyanamid Company). Entre los análogos estructurales de la calicheamicina que se pueden utilizar están ??1, CX21, c^1, N-acetil-??1 , PSAG y T1! (Hinman et al., Cáncer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cáncer Research 58:2925-2928 (1998) y las Patentes de EE.UU. anteriormente mencionadas para American Cyanamid). Otro fármaco antitumoral al que es posible conjugar el anticuerpo es QFA, que es un antifolato. Tanto la caliqueamicina como el QFA tienen sitios intracelulares de acción y no atraviesan fácilmente la membrana plasmática. Por ello, la absorción celular de estos agentes a través de la internalización mediada por el anticuerpo potencia enormemente sus efectos citotóxicos. iv. Otros agentes citotóxicos Otros agentes antitumorales que se pueden conjugar con los anticuerpos de la invención incluyen BCNU, estreptozoicina , vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocidos colectivamente como complejo LL-E33288 descrito en las patentes de EE.UU. n.° 5.053.394, 5.770.710, asi como las esperamicinas (patente de EE.UU. n.° 5.877.296).

Las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de las mismas que se pueden utilizar incluyen cadena de difteria A, fragmentos activos sin unión de la toxina de la difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de la Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de la Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y el tricotecenos . Véase, por ejemplo, el documento WO 93/21232 publicado el 28 de octubre de 1993.

Esta invención también contempla un inmunoconj ugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolitica (por ejemplo, una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN como por ejemplo la desoxirribonucleasa; ADNasa) . Para la destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radioactivo. Se dispone de una variedad de isótopos radiactivos para la producción de anticuerpos radioconj ugados . Entre los ejemplos se incluye At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu. Cuando el conjugado se utiliza para la detección, puede comprender un átomo radioactivo para gammagrafia, por ejemplo tc 9m o I123, un marcador giratorio para resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como diagnóstico por imágenes obtenidas mediante resonancia magnética), como yodo-123 nuevamente, yodo-131, indio-111, fluorina-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxigeno-17, gadolinio, manganeso o hierro. Pueden incorporarse marcadores radiactivas o de otro tipo al conjugado utilizando las formas conocidas. Por ejemplo, el péptido se puede biosinteti zar o sintetizar mediante síntesis química de aminoácidos utilizando precursores adecuados de aminoácidos que contengan, por ejemplo, fluorina-19 en vez de hidrógeno. Los marcadores como tc99m o I123, .Re186, Re188 y In111 se pueden unir a través de un residuo de cisteina en el péptido. El itrio-90 puede unirse a través de un residuo de lisina. El método IODOGEN (Fraker et al., (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57) se puede utilizar para incorporar yodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) describe otros métodos detalladamente. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se pueden realizar utilizando una variedad de agentes de unión a proteina bifuncionales como por ejemplo N-succinimidil-3- ( 2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4- (N-maleimidometil ) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) , iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (como el dimetiladipimidato HCI), ésteres activos (por ejemplo, disuccinimidil suberato) , aldehidos (por ejemplo, glutaraldehidos ) , compuestos bis-azido (como bis (p-azidobenzoil ) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (como bis- (p-diazoniobenzoil ) -etilenodiamina) , diisocianatos (por ejemplo, 2 , ß-diisocianato de tolueno), y compuestos bis-activos de fluoruro (como 1 , 5-difluoruro-2 , 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina se puede preparar tal y como se describe en Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987). El ácido triaminopentaacético 1-isotiocianatobencil-3-metildietileno marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de un radionucleótido a un anticuerpo. Consultar el documento WO94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilita la liberación de la droga citotóxica en la célula. Por ejemplo, puede utilizarse un enlazador acidolábil, un enlazador sensible a la peptidasa, un enlazador fotolábil, un enlazador de dimetilo o un enlazador que contenga disulfuro (Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992); patente de EE.UU. n.° 5.208.020). Los compuestos de la invención contemplan expresamente el ADC preparado con reactivos reticulares: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB y SVSB ( sucinimidil- ( 4 -vinilsulfona) benzoato) que se comercializan (por ejemplo, por Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EE.UU). Véanse las páginas 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog. v. Preparación de conjugados de anticuerpos con fármacos En los conjugados de anticuerpos con fármacos (ADC) de la invención, un anticuerpo (Ab) se conjuga a una o más porciones de un fármaco (D), por ejemplo, porciones de fármaco de 1 a 20 aproximadamente por anticuerpo, a través de un enlazador (L) . Los ADC de la formula I se pueden preparar por varios medios, empleando reacciones químicas orgánicas, condiciones y reactivos conocidos por los expertos, como: (1) una reacción de un grupo nucleofílico de un anticuerpo con un agente enlazador bivalente, para formar un Ab-L, mediante una unión bivalente, seguida de la reacción con una fracción del fármaco D; y (2) una reacción de un grupo nucleofílico de una fracción del fármaco con un reactivo enlazador bivalente, para formar D-L, mediante un enlace covalente, seguido de la reacción con el grupo nucleofílico del anticuerpo. En la presente memoria descriptiva, se describen los métodos adicionales para la preparación del ADC.

Ab-(L-D)p I El enlazador puede estar formado por uno o más componentes enlazadores. Los componentes de enlace ejemplares incluyen: 6-maleimidocaproilo ("MC"), maleimidopropanoilo ("MP"), valina-citrulina ("val-cit"), alanina-fenilalanina ("ala-phe"), p-aminobensiloxicarbonil ("PAB"), N-Succinimidil 4- (2-piridiltio) pentanoato ("SPP") , N-Succinimidil 4 - (N-maleimidometil ) ciclohexano-1 carboxilato ("S CC ) , y N-Succinimidil ( 4 -yodo-acetil ) aminobenzoato ("SIAB"). Los componentes enlazadores adicionales son conocidos en la materia y algunos se describen en la presente memoria descriptiva. Véase también "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", EE.UU. n.° de serie 10/983.340, presentada el 5 de noviembre de 2004, cuyo contenido está incorporado integramente en la presente memoria descriptiva a modo de referencia. En ciertas formas de realización, el enlazador puede comprender residuos de aminoácidos. Los componentes enlazadores ejemplares de aminoácidos incluyen un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido o un pentapéptido . Los dipéptidos ejemplares incluyen: valina-citrulina (ve o val-cit), alanina-fenilalanina (af o ala-phe) . Los tripéptidos ejemplares incluyen: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit ) y glicina-glicina-glicina ( gly-gly-gly) . Los residuos de aminoácidos que comprenden un componente enlazador de aminoácidos incluyen aquellos que se producen de forma natural, tales como los aminoácidos menores y los análogos de aminoácidos que no se producen de forma natural, como la citrulina. Los componentes enlazadores pueden designarse y optimizarse en su selectividad para la escisión mediante una enzima especifica, por ejemplo, una proteasa asociada a un tumor, catepsina B, C y D, o una proteasa plasmina.

Los grupos nucleofí lieos en los anticuerpos incluyen, aunque sin limitarse a ellos: (i) grupos amino N-terminal, (ii) grupos amino de la cadena lateral, por ejemplo lisina, (iii) grupos tiol de la cadena lateral, por ejemplo cisteina, y (iv) grupos amino o hidroxilo de azúcares donde el anticuerpo es glicosilado. Los grupos amino, tiol e hidroxilo son nucleofilicos y son capaces de reaccionar para formar uniones covalentes con grupos electrofilicos en las porciones del enlazador y los reactivos enlazadores, que incluyen: (i) ásteres activos como los ásteres NHS, los ásteres HOBt, haloformos y haluro de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo como las haloacetamidas ; (iii) aldehidos, cetonas, carboxilo y grupos maleimidos. Ciertos anticuerpos contienen bisulfuros de intercadena reducible, es decir, puentes de cisteina. Los anticuerpos pueden convertirse en reactivos mediante conjugación con reactivos enlazadores mediante el tratamiento con un agente reductor como el DTT (ditiotreitol ) . Por lo tanto, cada puente de cisteina formará, en teoría, dos nucleofilos tiol reactivos. Los grupos nucleofilicos adicionales pueden introducirse en los anticuerpos a través de la reacción de las Usinas con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) , lo que da lugar a la conversión de una amina en un tiol. Los grupos tiol reactivos pueden ser introducidos en un anticuerpo (o un fragmento del mismo) mediante la introducción de uno, dos, tres, cuatro o más residuos de cisteina (por ejemplo preparando anticuerpos mutantes que comprendan uno o más residuos de aminoácidos de cisteinas no nativas). Los conjugados de anticuerpos de la invención con fármacos también pueden producirse mediante la modificación del anticuerpo para introducir porciones electrofilicas, las cuales pueden reaccionar con sustituyentes nucleofilicos en el reactivo enlazador o el fármaco. Las azúcares de los anticuerpos glicosilados pueden oxidarse, por ejemplo con reactivos oxidantes de periodato, a fin de formar grupos cetonas o aldehidos, los cuales pueden reaccionar con el grupo amina de los reactivos enlazadores o las fracciones del fármaco. Los grupos resultantes de amina base de Schiff pueden formar un enlace estable, o pueden reducirse, por ejemplo mediante los reactivos de hidruro de boro para formar enlaces amina estables. En una forma de realización, la reacción de la porción carbohidratada de un anticuerpo glicosilado, ya sea con galactosa oxidasa o con metaperiodato de sodio, puede producir grupos de carbonilo (aldehidos y cetonas) en la proteina que pueden reaccionar con los grupos apropiados en el fármaco (técnicas de bioconjugado de Hermanson, Bioconjugate Techniques). En otra forma de realización, las proteínas que contienen residuos de serina o treonina N-terminal pueden reaccionar con metaperiodato de sodio, lo que da lugar a la producción de un aldehido en lugar del primer aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem . 3:138-146; US 5362852). Puede hacerse que este aldehido reaccione con un fragmento de fármaco o un nucleófilo enlazador. Del mismo modo, los grupos nucleofílieos en una fracción del fármaco incluyen los siguientes compuestos: los grupos amino, tiol, hidroxilo, hidracida, oxima, hidracina, tiosemicarbazona , carboxilato de hidracina y aril-hidracida , capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofi lieos en las fracciones enlazadoras y reactivos enlazadores, que incluyen: (i) ésteres activos como los ésteres NHS, los ésteres HOBt, haloformos y haluro de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo como las haloacetamidas ; (iii) aldehidos, cetonas, carboxilo y grupos maleimidos . Alternativamente, es posible realizar una fusión de proteínas que contengan el anticuerpo y el agente citotoxico, por ejemplo mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptidos . La longitud del ADN puede incluir regiones respectivas que codifiquen las dos porciones del conjugado, ya sea adyacentes entre si o separados por una región que codifica un péptido de enlace, el cual no destruye las propiedades deseadas del conjugado. En otra forma de realización, el anticuerpo puede conjugarse con un "receptor" (como la estreptavidina ) y actuar previamente contra el tumor, donde se administra al paciente el conjugado receptor del anticuerpo, luego, se elimina de la circulación el conjugado no unido, utilizando un agente de eliminación, y posteriormente se administra un "ligando" (por ej . , la avidina) que se conjuga con un agente citotóxico (por ej . un radionucleótido) . Formulaciones farmacéuticas Las formulaciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo de la invención se preparan para su conservación mediante la mezcla de anticuerpos con el grado deseado de pureza con moléculas vehículo, excipientes o estabilizantes opcionales fisiológicamente aceptables (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)), en forma de soluciones acuosas, liofilizadas u otras formulaciones liofilizadas. Los vehículos, excipientes, o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en todas las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen soluciones tamponadas tales como fosfato, citrato, histidina y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y raetionina; conservantes (como por ejemplo, cloruro amonio de octadecildimetilbencilo; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; alcohol bencilo, fenol o butilo benzil alcohol; alquil parabeno como el metal o propel parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol); bajo peso molecular (menos de 10 residuos) polipéptidos ; proteínas, como cera albúmina, gelatina, o inmunoglobulinas ; polímetros hidroilicos como la polivinilpirrolidone ; aminoácidos como glicerina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacaridos , disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes como la EDTA; azúcares como sucrosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contra-iones de formación salina como el sodio; complejos metálicos (por ej . complejos Zn-proteína) ; y/o tensoactivos no surfactantes como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG) . La formulación de la presente memoria descriptiva también contiene más de un compuesto activo tal y como sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellas con actividades complementarias que no se afectan de manera adversa entre sí. Dichas moléculas están presentes en combinación en cantidades que sean eficaces para el fin que se pretende. Los principios activos también se pueden atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y poli-(metilmetacrilato ) , respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanopartículas y nanocápsulas) , o en macroemulsiones . Estas técnicas se divulgan en Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000) . Las formulaciones para administrar in vivo deben ser estériles. Esto se logra mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles. Se pueden elaborar preparaciones de liberación controlada. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación controlada incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen la inmunoglobulina de la invención, cuyas matrices están en forma de elementos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación controlada incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli- (2-hidroxietil-metacrilato) , o poli- ( inilalcohol ) ) , poliláctidos (Patente de EE.UU. n.° 3.773.919), copolimeros de ácido L-glutámico ? etil-L-glutamato, acetato de etilenvinilo no degradable, copolimeros degradables de ácido glicólico-ácido láctico como por ejemplo LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas por copolimeros de ácido glicólico-ácido láctico y acetato de leuprolida) , y ácido poli-D- ( - ) -3-hidroxibutírico . Mientras que los polímeros como el acetato de etilenvinilo y el ácido glicólico-ácido láctico permiten la liberación de moléculas por un período de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo menores. Cuando las inmunoglobulinas encapsuladas permanecen en el organismo por un largo periodo de tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a humedad a 37 °C, lo que ocasiona una pérdida de la actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad . Es posible concebir estrategias racionales para su estabilización dependiendo del mecanismo que intervenga. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es de formación de uniones intermoleculares S-S mediante el intercambio tio-disulfuro, se puede lograr la estabilización mediante la modificación de los residuos sulfhidrilos , liofilizando soluciones ácidas, controlando la humedad, utilizando aditivos adecuados y desarrollando composiciones de matrices de polímeros especificas . Usos Los anticuerpos de la presente invención se pueden usar, por ejemplo, en métodos terapéuticos in vi tro, ex vivo e in vivo. En un aspecto, la invención proporciona métodos para el tratamiento o prevención de un tumor, un cáncer y/o un trastorno de proliferación celular asociado a un aumento de la expresión y/o actividad de DLL4 ; los métodos incluyen la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-DLL4 a un sujeto que necesite dicho tratamiento. En un aspecto, la invención proporciona métodos para reducir, inhibir, bloquear o prevenir el crecimiento de un tumor o la extensión de un cáncer; estos métodos incluyen la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-DLL4 a un sujeto que necesite ese tratamiento. En un aspecto, la invención proporciona métodos para tratar un tumor, un cáncer y/o un trastorno de proliferación celular y estos métodos incluyen la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-DLL4 a un sujeto que necesite ese tratamiento.

En un aspecto, la invención proporciona métodos para inhibir la angiogénesis que comprenden la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-DLL4 a un sujeto que necesite ese tratamiento. En un aspecto, la invención proporciona métodos para tratar un proceso patológico asociado a angiogénesis que comprenden la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-DLL4 a un sujeto que necesite ese tratamiento. En algunas formas de realización, el proceso patológico asociado a angiogénesis es un tumor, un cáncer y/o un trastorno de proliferación celular. En algunas formas de realización, el proceso patológico asociado a angiogénesis es una enfermedad neovascular infraocular. Además, al menos algunos de los anticuerpos de la invención se pueden unir al antigeno de otras especies. Por consiguiente, los anticuerpos de la invención pueden usarse para unirse a la actividad de un antigeno especifico, por ejemplo, en un cultivo celular que contenga el antigeno, en humanos o en otros mamíferos que tengan el antígeno con el que un anticuerpo de la invención reaccione (por ejemplo chimpancé, babuino, tití, macaco de Java y macaco de la India, cerdo o ratón) . En una forma de realización, el anticuerpo de la invención se puede usar para inhibir las actividades del antigeno mediante el contacto del anticuerpo con el antigeno de tal manera que la actividad del antigeno quede inhibida. Preferiblemente, el antigeno es una molécula proteinica humana. En una forma de realización, un anticuerpo de la invención se puede usar en un método para unir a un antigeno en un sujeto que sufre un trastorno asociado a un aumento de la expresión del antigeno y/o actividad, que comprende administrar al sujeto un anticuerpo de la invención de tal manera que se una el antigeno en el sujeto. Preferiblemente, el antigeno es una molécula proteinica humana. De manera alternativa, el sujeto puede ser un mamífero que expresa el antígeno con el que se une un anticuerpo de la invención. Además, el sujeto puede ser un mamífero al que se le ha introducido el antígeno (por ejemplo, mediante la administración del antígeno o mediante la expresión de un trasgén del antígeno) . Un anticuerpo de la invención puede administrarse a un sujeto humano para fines terapéuticos. Además, un anticuerpo de la invención se puede administrar a mamíferos no humanos que expresan un antígeno con el que la inmunoglobulina reaccione (por ejemplo, primate, cerdo o ratón) para fines veterinarios o como modelo animal de una enfermedad humana. Sobre esto último, dichos modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de los anticuerpos de la invención (por ejemplo, pruebas de dosis y períodos de administración) . Los anticuerpos de la invención se pueden usar para tratar, inhibir, retrasar la progresión, prevenir/retrasar la recidiva, mejorar o prevenir enfermedades, trastornos o procesos asociados a la expresión y/o actividad de una o más moléculas antigénicas. Entre los trastornos están carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o neoplasias linfoides. Ejemplos más concretos de estas clases de cáncer serían el cáncer de células escamosas (por ejemplo, el cáncer de células escamosas epiteliales), el cáncer de pulmón (incluyendo el cáncer de células pulmonares pequeñas, el cáncer de células pulmonares no pequeñas, el adenocarninoma pulmonar y el carcinoma pulmonar escamoso) , el cáncer de peritoneo, el cáncer hepatocelular , el cáncer gástrico o estomacal (incluyendo el cáncer gastrointestinal), el cáncer pancreático, el glioblastoma, el cáncer cervical, el cáncer de ovario, el cáncer de riñon, el cáncer de vejiga, el cáncer de las vías urinarias, el hepatoma, el cáncer de mama, el cáncer de colon, el cáncer rectal, el cáncer colorrectal, el carcinoma endometrial o uterino, el carcinoma de las glándulas salivares, el cáncer de hígado o renal, el cáncer de próstata, el cáncer vulval, el cáncer de tiroides, el carcinoma hepático, el carcinoma anal, el carcinoma de pene, el melanoma, el mieloma múltiple y el linfoma de células B, el cáncer de cerebro, así como el de cabeza y cuello, y metástasis asociadas. En algunas formas de realización, el cáncer se selecciona entre el grupo formado por cáncer de pulmón de células pequeñas, neuroblastomas , melanoma, cáncer de mama, cáncer de estómago, cáncer colorrectal y carcinoma hepatocelular . En algunas formas de realización, el cáncer se selecciona entre el grupo formado por cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer colorrectal y carcinoma de mama, incluidas las formas metastásicas de estos tipos de cáncer. En algunas formas de realización, se administra al paciente el inmunoconj ugado que comprende un anticuerpo conjugado con uno o más agentes citotóxicos. En algunas formas de realización, el inmunoconj ugado y/o el antígeno al que va unido es internalizado por la célula, lo que ocasiona una mayor eficacia terapéutica del inmunoconj ugado para inactivar la célula diana a la que se une. En una forma de realización, el agente citotóxico actúa o interfiere con el ácido nucleico en la célula diana. En una forma de realización, el agente citotóxico actúa o interfiere con la polimerización de microtúbulos . Como ejemplos de los citados agentes citotóxicos se incluyen cualquiera de los agentes quimioterapéuticos citados en la presente memoria descriptiva (por ejemplo, un maitansinoide , una auristatina, una dolastatina o una caliqueamicina ) , un isótopo radioactivo, una ribonucleasa o una ADN endonucleasa . Los anticuerpos de la invención se pueden usar solos o junto con otras composiciones en un tratamiento. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención se puede administrar conjuntamente con otro anticuerpo, agente o agentes quimioterapéuticos (incluidos cócteles de agentes quimioterapéuticos ) , otro agente o agentes citotóxicos, agente o agentes angiogénicos , citocinas y/o agentes inhibodres del crecimiento. Cuando un anticuerpo de la invención inhibe el crecimiento tumoral, puede ser especialmente deseable combinarlo con uno o más agentes terapéuticos que también inhiban el crecimiento tumoral, por ejemplo, agentes anti-VEGF, incluidos anticuerpos anti-VEGF. Alternativamente, o adicionalmente, el paciente puede recibir radioterapia combinada (por ejemplo, irradiación con haces externos o tratamiento con un agente marcado radioactivo, como un anticuerpo) . Las terapias combinadas descritas anteriormente incluyen administración combinada (en la que los dos o más agentes se incluyen en la misma formulación o en formulaciones separadas), y administración separada, en cuyo caso la administración del anticuerpo de la invención puede producirse antes, y/o después, de la administración de la terapia o terapias asociadas. Terapias combinada Como se ha indicado anteriormente, la invención proporciona tratamientos combinados en los que un anticuerpo anti-DLL4 se administra con otro tratamiento. Por ejemplo, anticuerpos anti-DLL4 se usan en combinación con antineoplásicos o tratamientos antineovasculari zantes para tratar diversos procesos neoplásicos o no. En una forma de realización, el proceso neoplásico o no neoplásico se caracteriza por un proceso patológico asociado a angiogénesis anómala o no deseada. El anticuerpo anti-DLL4 se puede administrar en serie o en combinación con el otro agente terapéutico que es eficaz para estos fines, bien en la misma composición o en otra. Alternativamente, o adicionalmente, se pueden administrar diversos inhibidores de la DLL4. La administración del anticuerpo anti-DLL4 se puede efectuar simultáneamente, por ejemplo, en composición única o como dos o más composiciones distintas, utilizando la misma via de administración o vías de administración diferentes.

Otra posibilidad, que se puede combinar con lo anterior, es la administración secuencial, en cualquier orden. En determinadas formas de realización, pueden transcurrir intervalos de tiempo que oscilen de minutos a días, semanas o meses entre la administración de las dos o más composiciones. Por ejemplo, el agente antineoplásico se puede administrar primero, seguido por el inhibidor de la DLL4. Sin embargo, la administración simultánea o la administración en primer lugar del anticuerpo .anti-DLL4 también está prevista. Las cantidades eficaces de agentes terapéuticos administrados en combinación con un anticuerpo anti-DLL4 serán fijadas por el médico o veterinario, según su criterio. La administración y el ajuste de la dosis se realiza para lograr el máximo control de los procesos que se van a tratar. La dosis dependerá, además, de factores como el tipo de agente terapéutico que se vaya a utilizar y el paciente especifico que vaya a tratarse. Las dosis adecuadas para cualquiera de los antineoplásicos son aquellas que se utilizan actualmente y se pueden disminuir debido a la acción combinada (sinergia) del antineoplásico y el anticuerpo anti-DLL4. En determinadas formas de realización, la combinación de los inhibidores potencia la eficacia de un único inhibidor. El termino "potenciar" se refiere a una mejora de la eficacia de un agente terapéutico en su dosis habitual o aprobada. Véase también el apartado Composiciones farmacéuticas de la presente memoria descriptiva. Típicamente, los anticuerpos anti-DLL4 y antineoplásicos son aptos para las mismas enfermedades o enfermedades similares para bloquear o reducir un trastorno patológico como crecimiento tumoral o crecimiento de una célula cancerosa. En una forma de realización, el antineoplásico en un antiangiogénico . El tratamiento antiangiogénico en relación con el cáncer es una estrategia de tratamiento para el cáncer destinada a inhibir el desarrollo de vasos sanguíneos tumorales necesario para proporcionar nutrientes que promuevan el crecimiento tumoral. Debido a que la angiogénesis interviene tanto en el crecimiento del tumor primario como en la metástasis, el tratamiento angiogénico proporcionado por la invención es capaz de inhibir el crecimiento neoplásico del tumor en el sitio primario, así como prevenir la metástasis de tumores en sitios secundarios, lo que permite atacar a los tumores con otros agentes terapéuticos. Se han identificado muchos otros agentes antiangiogénicos y son bien conocidos en el sector, incluidos los enumerados en la presente memoria descriptiva, por ejemplo, enumerados en Definiciones y, por ejemplo, por Carmeliet and Jain, Nature 407:249-257 (2000); Ferrara et al., Nature Reviews : Drug Discovery, 3:391-400 (2004); y Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003) . Véase también la solicitud de patente de Estados Unidos US20030055006. En una forma de realización, un anticuerpo anti-DLL4 se utiliza en combinación con un anticuerpo neutralizador del anti-VEGF (o de un fragmento del mismo) y/u otro antagonista de VEGF o un antagonista del receptor de VEGF, incluidos, por ejemplo, fragmentos del receptor soluble de VEGF (por ejemplo, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, neuropilinas (por ejemplo, NRP1, NRP2 ) ) , aptameros capaces de bloquear el VEGF o el VEGFR, neutralizar anticuerpos anti-VEGFR, inhibidores de bajo peso molecular de tirosincinasas (RTK) del VEGFR, estrategias antisentido para el VEGF, ribozimas frente al VEGF o receptores del VEGF, variantes antagonistas del VEGF y cualquier combinación de todos ellos. Alternativamente, o adicionalmente, dos o más inhibidores de la angiogénesis pueden ser opcionalmente administrados conjuntamente al paciente, además del antagonista del VEGF u otro agente. En alguna forma de realización, uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, antineoplásicos , se pueden administrar en combinación con anticuerpo anti-DLL4, el antagonista del VEGF y un agente antiangiogénico . En determinados aspectos de la invención, otros agentes terapéuticos útiles para tratamiento neoplásico combinado con un anticuerpo anti-DLL4 incluyen otros tratamientos contra el cáncer (por ejemplo, tratamiento quirúrgico, radioterapia (por ejemplo, con irradiación o administración de sustancias radiactivas), quimioterapia, tratamiento con antineoplásicos enumerados en la presente memoria descriptiva y conocidos en el sector, o combinaciones de ellos). De manera alternativa o adicional, dos o más anticuerpos que se unen al mismo antigeno o a dos o más antigenos distintos divulgados en la presente memoria descriptiva se pueden administrar conjuntamente al paciente. En ocasiones, puede ser beneficioso administrar también una o más citoquinas al paciente . Agentes quimioterapéuticas En determinados aspectos, la invención proporciona un método de bloquear o reducir el tratamiento tumoral o el crecimiento de una célula cancerosa, mediante la administración de cantidades eficaces de un antagonista de la DLL4 y/o uno o más inhibidores de la angiogénesis y uno o más agentes quimioterapéuticos a un paciente propenso al cáncer o al que se le ha diagnosticado cáncer. Se pueden usar diversos agentes quimioterapéuticos en los métodos de tratamiento combinado de la invención. Una lista no exhaustiva y que puede servir como ejemplo de antineoplásicos se incluye en la presente memoria descriptiva en "Definiciones" . Como comprenderán los expertos en la materia, las dosis apropiadas de agentes quimioterapéuticos estarán en torno a las aquellas ya empleadas en tratamientos clínicos en los que los agentes quimioterapéuticos se administran solos o en combinación con otros quimioterapéuticos. Es probable que la dosis varíe en función del proceso que se esté tratando. El médico que administre el tratamiento será capaz de determinar la dosis apropiada para el sujeto. La invención también proporciona métodos y composiciones para inhibir o prevenir el crecimiento tumoral recidivante o la proliferación recidivante de células cancerígenas. El término "crecimiento tumoral recidivante" o "proliferación recidivante de células tumorales" se utiliza para describir un proceso en el que los pacientes sometidos o tratados con un o más de los tratamientos actualmente disponibles (por ejemplo, tratamientos para el cáncer, como quimioterapia, radioterapia, tratamiento quirúrgico, tratamiento hormonal y/o tratamiento biológico/inmunoterapia , tratamientos con anticuerpos anti-VEGF, especialmente un tratamiento estándar para el cáncer de que se trate) no es clínicamente adecuado para tratar a los pacientes o los pacientes ,ya no están experimentando efecto beneficioso alguno con el tratamiento y necesitan otro tratamiento adicional eficaz. Como se usa en la presente memoria descriptiva, la frase también se puede referir a un proceso de un paciente "refractario/que no responde al tratamiento", por ejemplo, que describa pacientes que responden a tratamiento pero sufran efectos secundarios, desarrollen resistencia, no respondan al tratamiento, no respondan satisfactoriamente al tratamiento, etc. En diversas formas de realización, un cáncer es un crecimiento tumoral recidivante o una proliferación recidivante de células cancerosas en los que el número de células cáncerosas no se ha .reducido aún significativamente, o ha aumentado, o el tamaño del tumor no se ha reducido significativamente, o ha aumentado, o no sigue reduciéndose su tamaño o el número de células cancerosas. Se puede determinar si las células cancerosas constituyen un crecimiento tumoral recidivante o una proliferación recidivante de células tumorales bien in vivo bien in vitro mediante cualquier método conocido en el sector para analizar la eficacia del tratamiento en células cancerosas, utilizando los sentidos aceptados en el sector de "recidivante" o "refractario" o "que no responde al tratamiento" en este contexto. Un tumor resistente a un tratamiento anti-VEGF es un ejemplo de un crecimiento tumoral recidivante . La presente invención proporciona métodos de bloquear o reducir el crecimiento tumoral recidivante o la proliferación recidivante de células cancerosas en un sujeto, mediante la administración de uno o más anticuerpos anti-DLL4 para bloquear o reducir el crecimiento tumoral recidivante o la proliferación recidivante de células cancerosas en el sujeto. En determinadas formas de realización, el antagonista se puede administrar después del tratamiento para el cáncer. En ciertas formas de realización, los anticuerpos anti-DLL4 se administran simultáneamente con tratamiento para el cáncer. Alternativamente, o adicionalmente , el tratamiento con anticuerpos anti-DLL4 alterna con otro tratamiento para el cáncer, en cualquier orden. La invención también engloba métodos de administración de uno o más anticuerpos inhibidores para prevenir el inicio o la recurrencia del cáncer en pacientes predispuestos a sufrir cáncer. Por lo general, el sujeto estaba o está recibiendo simultáneamente tratamiento para el cáncer. En una forma de realización, el tratamiento para el cáncer es un tratamiento con un antiangiogénico, por ejemplo, un antagonista del VEGF. El agente antiangiogénico incluye aquellos conocidos en la materia y aquellos encontrados en Definiciones en la presente memoria descriptiva. En una forma de realización, el antiangiogénico es un anticuerpo neutrali zador anti-VEGF o fragmento del mismo (por ejemplo A4.6.1 humanizado, AVASTIN® (Genentech, South San Francisco, CA) o LUCENTIS® (Genentech, South San Francisco, CA) ) , Y0317, M4 , G6, B20, 2C3, etc.). Veánse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU n.° 6.582.959, 6.884.879, 6.703.020; el documento 098/45332; el documento WO 96/30046; el documento O94/10202; EP 0666868B1; las Solicitudes de Patentes de EE.UU. 20030206899, 20030190317, 20030203409 y 20050112126; Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004); y, el documento WO2005012359. Otros agentes se pueden administrar en combinación con antagonistas del VEGF y un anticuerpo anti-DLL4 para bloquear o reducir el crecimiento tumoral recidivante o la proliferación recidivante de células tumorales, por ejemplo, véase la sección Terapia de combinación en la presente memoria descriptiva. El anticuerpo de la invención (y el agente terapéutico asociado) se administra (n) por cualquier medio apto, incluyendo las vías parenteral, subcutánea, intraperitoneal , intrapulmonar e intranasal y, si se desea para tratamiento local, la vía intralesional o intravitrea. Las infusiones parentales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial , intraperitoneal y subcutánea. Además, el anticuerpo se administra correctamente mediante infusión de efecto rápido con dosis del anticuerpo cada vez menores. La dosificación puede realizarse mediante cualquier vía adecuada, por ejemplo, mediante inyecciones vía intravenosa o subcutánea, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. La composición del anticuerpo de la invención debe formularse, dosificarse y administrarse de una manera consistente empleando una práctica médica adecuada. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno especifico sometido a tratamiento, el mamífero específico sometido a tratamiento, el estado clínico del paciente, la causa del trastorno, la localización de la administración del agente, el método de administración, la regulación de la administración y otros factores conocidos por los facultativos. El anticuerpo puede formularse opcionalmente con uno o más agentes utilizados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de dichos agentes depende de la cantidad de anticuerpos de la invención, el tipo de enfermedad o trastorno o tratamiento, y otros factores ya abordados con anterioridad. Estos son generalmente usados en las mismas dosis y con las mismas vías de administración descritas en la presente memoria descriptiva o aproximadamente entre 1% y 99% de las dosis empleadas hasta este momento. Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis adecuada de un anticuerpo de la invención (cuando se utiliza aislado o en combinación con otros agentes como los quimioterapéuticos ) dependerá del tipo de enfermedad que se tratará, el tipo de anticuerpo, la gravedad y el curso de la enfermedad, de si el anticuerpo se administra para fines preventivos o terapéuticos, la terapia anterior, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo y la discreción del médico tratante. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente una vez o en una serie de tratamientos. Según el tipo y la gravedad de la enfermedad, una dosis inicial candidata para la administración a un paciente es de aproximadamente 1 pg/kg a 15 mg/kg (por ej . , 0,1 mg/kg-10 mg/kg) de anticuerpo, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante una infusión continua. Una dosis diaria normal puede oscilar entre aproximadamente 1 g/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores anteriormente mencionados. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la enfermedad, el tratamiento se mantiene hasta que se produzca la supresión deseada de los síntomas de la misma. Un ejemplo de dosis del anticuerpo se situaría en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg. Por lo tanto, se puede administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis se pueden administrar de manera intermitente, por ejemplo, una vez por semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente reciba desde aproximadamente dos a aproximadamente veinte, por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo) . Se puede administrar una mayor carga de dosis inicial seguida de una o más dosis menores. Un ejemplo de pauta posológica comprende la administración de una dosis inicial aproximada de 4 mg/kg, seguida de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo. No obstante, también pueden ser útiles otras pautas posológicas. El progreso de este tratamiento se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.

Los anticuerpos anti-DLL4 de la invención son útiles en ensayos que detectan la expresión de DLL4 (como ensayos diagnósticos o pronósticos) en células o tejidos específicos en los que los anticuerpos están marcados como se describe más adelante y/o están inmovilizados en una matriz insoluble.

En otro aspecto, la invención proporciona métodos para la detección de DLL4, los cuales comprenden la detección del complejo formado por DLL4 y anticuerpo anti-DLL4 en la muestra. Por "detección" se entiende en la presente memoria descriptiva la detección cualitativa y/o cuantitativa (niveles de mediciónn) con o sin referencia a un control. En otro aspecto, la invención proporciona métodos para diagnosticar un trastorno asociado a la expresión y/o actividad de DLL4, los cuales incluyen la detección del complejo formado por DLL4 y anticuerpos anti-DLL4 en una muestra biológica procedente de un paciente que tenga o posiblemente tenga el trastorno. En algunas formas de realización, la expresión de DLL4 es una expresión aumentada o anómala (no deseada) . En algunas formas de realización, el trastorno es un tumor, un cáncer y/o un trastorno de proliferación celular. En otro aspecto, la invención proporciona cualquiera de los anticuerpos anti-DLL4 descritos en la presente memoria descriptiva, donde el anticuerpo anti-DLL4 comprende un marcador detectable. En otro aspecto, la invención proporciona un complejo de cualquiera de los anticuerpos anti-DLL4 descritos en la presente memoria descriptiva y DLL4. En algunas formas de realización, el complejo está in vivo o in vitro. En algunas formas de realización, el complejo comprende una célula cancerosa. En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-DLL4 está marcado de forma detectable. Los anticuerpos anti-DLL4 se pueden usar para la detección de DLL4 en cualquiera de diversos métods de detección bien conocidos. Por ejemplo, se puede realizar un análisis de una muestra biológica para DLL4 mediante la obtención de la muestra de un fuente deseada, añadiendo y mezclando la muestra con anticuerpo anti-DLL4 para permitir al anticuerpo formar el complejo anticuerpo/DLL4 con cualquier DLL4 presente en la mezcla, y la detección de cualquier complejo anticuerpo/DLL4 presente en la mezcla. La muestra biológica puede ser preparada para su análisis mediante métodos conocidos en el sector que son aptos para la muestra concreta. Los métodos de añadir y mezclar la muestra con anticuerpos y los métodos de detección del complejo anticuerpo/DLL4 se eligen según el tipo de ensayo utilizado.

Estos ensayos incluyen ensayos inmuhistoquímicos , ensayos competitivos, inmunoanálisis de doble anticuerpo (tipo á€cesándwichá€D) y ensayos de inhibición de ésteres. Todos los métodos analíticos para detección de DLL4 usan uno o más de los reactivos siguientes: análogo DLL4 marcado, análogo DLL4 inmovilizado, anticuerpo anti-DLL4 marcado, anticuerpo anti-DLL4 inmovilizado y conjugados de ésteres. Los reactivos marcados también se conocen como "trazadores".

El marcador usado es cualquier funcionalidad detectable que no interfiera con la unión de DLL4 y anticuerpo anti-DLL4 Se conocen numerosos marcadores para uso en inmunoensayos y entre los ejemplos figuran las porciones que se pueden detectar directamente, como marcadores radioactivos, quimioluminescentes o fluorocromo, así como porciones, como enzimas, que se deben hacer reaccionar o derivar para que sea posible detectarlas. Ejemplos de estos marcadores son: El marcador usado es cualquier funcionalidad detectable que no interfiera con la unión de DLL4 y anticuerpo anti-DLL4 . Se conocen numerosos marcadores para uso en inmunoensayos y entre los ejemplos figuran las porciones que se pueden detectar directamente, como marcadores radioactivos, quimioluminescentes o fluorocromo, así como porciones, como enzimas, que se deben hacer reaccionar o derivar para que sea posible detectarlas. Ejemplos de estos marcadores son los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H y 131I, fluoroforos como algunos quelantes térreos raros o fluoresceina y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansil, umbeliferon, luceriferasas (por ejemplo, luciferasa de la luciérnaga y luciferasa bacteriana (Patente de EE.UU. n.° 4.737.456), luciferina, 2 , 3-dihidroftalazinadionas , peroxidasa de rábano picante (HPR) , fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa , glucoamilasa , lisozima, oxidasas sacáridas, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterociclicas como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte como HRP, lactoperoxidasa , o microperoxidasa , biotina/avidina, marcadores rotatorios, marcadores bacteriófagos, radicales libres estables y similares . Se dispone de métodos convencionales para unir estos marcadores covalentemente a proteínas o polipéptidos . Por ejemplo, se pueden usar agentes de unión como dialdehídos, carbodiimidas , dimaleimidas , bis-imidatos , benzidina bis-diazotidazada y similares para marcar los anticuerpos con los marcadores enzimáticos, fluorescentes y quimioluminiscentes antes descritos. Véanse, por ejemplo, Patentes de EE.UU. n.° 3.940.475 (fluorimetria) y 3.645.090 (enzimas); Hunter et al., Nature, 144: 945 (1962); David et al., Biochemistry, 13: 1014-1021 (1974); Pain et al., J. Immunol . Methods, 40: 219-230 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407-412 (1982) . Los marcadores preferentes en la presente memoria descriptiva son enzimas como peroxidasa de rábano picante y fosfatasa alcalina. La conjugación de este marcador, incluidas las enzimas, con el anticuerpo es un procedimiento de manipulación estándar para cualquier experto en técnicas de inmunoensayo . Véase, por ejemplo, O'Sullivan et al., "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay, " en Methods in Enzymology, ed. J.J. Langone and H. Van Vunakis, Vol . 73 (Academic Press, New York, New York, 1981), págs . 147-166. Para ciertos métodos de ensayo es necesaria la inmovilización de reactivos. La inmovilización supone separar el anticuerpo anti-DLL4 de cualquier DLL4 que permanezca libre en solución. Tradicionalmente, esto se consigue bien insolubilizando el anticuerpo anti-DLL4 o el análogo de DLL4 antes del procedimiento de ensayo, como mediante adsorción en una superficie o matriz insoluble a agua (Bennich et al.., EE.UU. 3.720.760), mediante acoplamiento covalente (por ejemplo, usando reticulación con glutaraldehído) , o mediante insolubilización del anticuerpo anti-DLL4 o del análogo de DLL4 después, por ejemplo, mediante inmunoprecipitación . La expresión de proteínas en una muestra se puede examinar usando protocolos de tinción e inmunihistoquímica . La tinción inmunohistoquímica de cortes tisulares ha demostrado ser un método fiable de evaluar o detectar la presencia de proteínas en una muestra. Las técnicas de inmunohistoquímica ("IHC") utilizan un anticuerpo para detectar y visualizar antígenos celulares in situ, por lo general mediante métodos cromogénicos o fluorescentes. Para la preparación de la muestra, se puede utilizar una muestra celular o de tejido procedente de un mamífero (normalmente, un paciente humano) . Entre los ejemplos de muestras están células cancerosas como células de cáncer de colon, mama, próstata, ovario, pulmón, estómago, páncreas, linfoma y leucemia. Las muestras se pueden obtener mediante diversos procedimientos conocidos en el sector, incluidas, aunque sin limitarse a ellas, extirpación quirúrgica, aspiración o biopsia. El tejido puede ser fresco o congelado. En una forma de realización, la muestra se fija y embebe en parafina o similares. La muestra de tejido se puede fijar (es decir, preservar) mediante métodos convencionales. Cualquier experto en la materia sabrá que la elección de un fijador depende del fin para el cual se procederá a marcar histológicamente a la muestra o del método de análisis que se utilice. Cualquier experto en la materia también sabrá que la duración de la fijación depende del tamaño de la muestra de tejido y del fijador utilizado. La IHC se puede realizar en combinación con otras técnicas, como tinción morfológica y/o hibridización in situ fluorescente. Se dispone de dos métodos generales de IHC: ensayos directos e indirectos. Según el primer ensayo, la unión del anticuerpo al antigeno diana (por ejemplo, DLL4) está determinada directamente. Este ensayo directo usa un reactivo marcado, como un marcador fluorescente o un anticuerpo primario marcado con una enzima, el cual se puede visualizar sin mayor interacción con el anticuerpo. En un ensayo indirecto típico, el anticuerpo primario no conjugado se une al antígeno y, luego, un anticuerpo secundario marcado se une al anticuerpo primario. Si el anticuerpo secundario se conjuga a un marcador enzimático, se añade un sustrato cromogénico o fluorogénico para permitir la visualización del antígeno. La amplificación de la señal se produce porque varios anticuerpos secundarios pueden reaccionar con distintos epítopos en el anticuerpo primario.

El anticuerpo primario y/o secundario utilizado para inmunohistoquímica estará marcado habitualmente con una porción detectable. Se dispone de numerosas marcas que pueden agruparse, por lo general, en las siguientes categorías : Aparte de los procedimientos de preparación de la muestra tratados anteriormente, tal vez se requiera un nuevo tratamiento del corte histológico antes o después de aplicar la IHC, o durante su aplicación. Por ejemplo, se pueden realizar métodos de recuperación de epítopos, como calentamiento de la muestra tisular en solución tamponada con citrato (véase, por ejemplo, Leong et al., Appl . Immunohistochem. 4(3):201 (1996)). Después de un paso opcional de bloqueo, el corte histológico queda expuesto al anticuerpo primario durante un tiempo suficiente y en condiciones idóneas para que el anticuerpo primario se una al antígeno de la proteína diana en la muestra de tejido. Las condiciones idóneas para lograr esto se pueden determinar mediante experimentos habituales. El alcance de la unión del anticuerpo a la muestra se determina mediante el uso de uno de los marcadores detectables mencionados anteriormente. Preferiblemente, el marcador es un marcador enzimático (por ejemplo, HRPO) que cataliza una alteración química del sustrato cromogénico como cromogén de 3 , 3 ' -diaminobenzidina . Preferiblemente, el marcador enzimático se conjuga al anticuerpo que se une específicamente al anticuerpo primario (por ejemplo, el anticuerpo primario es anticuerpo policlonal de ratón y el anticuerpo secundario es anticuerpo anticonejo de cabra). Las muestras así preparadas se pueden montar y cubrir en la placa. A continuación, se determina la evaluación de la muestra, por ejemplo, usando un microscopio, y se pueden emplear criterios de intensidad de la tinción usados habitualmente en el sector. Los criterios de intensidad de la muestra se pueden evaluar del siguiente modo: TABLA 2 Por lo general, una puntuación en el modelo de tinción de 2+ o superior en un ensayo IHC tiene valor pronóstico y/o diagnóstico. En algunas formas de realización, una puntuación en el modelo de tinción de 1+ o superior tiene valor diagnóstico y/o pronóstico. En otras formas de realización, una puntuación en el modelo de tinción de 3+ o superior tiene valor diagnóstico y/o pronóstico. Se entiende que, cuando las células y/o tejidos de "'un tumor o adenoma de colon se examinan mediante IHC, la tinción se suele determinar o evaluar en la célula y/o tejido tumoral (frente al tejido circundante o estroma que puede estar presente en la muestra) . Otros métodos de ensayo, conocidos como ensayos competitivos o de inmunoanálisis de doble anticuerpo (tipo "sándwich"), son bien conocidos y ampliamente usados en el sector diagnóstico comercial. Los ensayos competitivos dependen de la capacidad de un análogo de DLL4 del trazador para competir con la muestra de prueba de DLL4 en un número limitado de sitios de unión a antigeno del anticuerpo anti-DLL . Por lo general, el anticuerpo anti-DLL4 se insolubiliza antes o después de la competición y, luego, el trazador y DLL4 unidos al anticuerpo anti-DLL4 se separan del trazador y de DLL4 no unidos. Esta separación se logra decantando (donde la molécula de enlace estaba preinsolubilizada) o centrifugando (donde la molécula de enlace se había precipitado tras la reacción competitiva) . La cantidad de DLL4 de la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de trazador unida según medición de la cantidad de sustancia marcadora. Las curvas dosis-respuesta con cantidades conocidas de DLL4 se preparan y comparan con el resultado de la prueba para determinar cuantitativamente la cantidad de DLL4 presente en la muestra de prueba. Estos ensayos se denominan sistemas ELISA cuando las enzimas se usan como marcadores detectables. Otra especie de ensayo competitivo, denominado un ensayo "homogéneo", no exige fase de separación. En este caso, se prepara y utiliza un conjugado de una enzima con DLL4 , de forma que, cuando el anticuerpo anti-DLL4 se une a DLL4 , la presencia del anticuerpo anti-DLL4 modifica la actividad enzimática. En este caso, el DLL4 o sus fragmentos inmunológicamente activos se conjugan con un puente orgánico bifuncional a una enzima como peroxidasa . Los conjugados se seleccionan para uso con anticuerpos anti-DLL4 , de forma que la unión al anticuerpo anti-DLL4 inhibe o potencia la actividad enzimática del marcador. Este método se aplica ampliamente con el nombre de EMIT. Se usan conjugados de ásteres en métodos de obstaculización de ésteres para ensayos homogéneos. Estos conjugados se sintetizan mediante enlace covalente de un hapteno de bajo peso molecular a un fragmento de DLL4 pequeño, de forma que el anticuerpo anti-hapteno no pueda unirse al conjugado al mismo tiempo que el anticuerpo anti-DLL4 . Con este procedimiento, el DLL4 presente en la muestra de prueba se unirá al anticuerpo anti-DLL4 , lo que permitirá al antihapteno unirse al conjugado y esto, a su vez, ocasiona un cambio en el carácter del hapteno conjugado, por ejemplo, un cambio en fluorescencia cuando el hapteno es un fluoroforo. Los ensayos tipo "sandwich" son especialmente útiles para la determinación del DLL4 y los anticuerpos anti-DLL4 . En ensayos secuenciales tipo "sandwich", se usa un anticuerpo anti-DLL4 inmovilizado para adsorber el DLL4 de la muestra de prueba, se retira la muestra de prueba mediante lavado, el DLL4 unido se utiliza para adsorber un segundo anticuerpo anti-DLL4 marcado y el material unido se separa luego del trazador residual. La cantidad de trazador unido es directamente proporcional a la ' DLL4 de la muestra de prueba. En ensayos "sandwich simultáneos" la muestra de prueba no se separa antes de añadir el anticuerpo anti-DLL4marcado . Un ensayo secuencial tipo "sandwich" que utilice un anticuerpo monoclonal anti-DLL4 como un anticuerpo y un anticuerpo policlonal anti-DLL4 como otro de los anticuerpos es útiles en muestras de prueba para detección de DLL4. Lo anterior no son más que ejemplos de ensayos de detección de DLL . Otros métodos desarrollados ahora o en el futuro que utilicen anticuerpo anti-DLL4 para la determinación de DLL4 están incluidos en el ámbito de la presente memoria descriptiva, incluidos los bioensayos descritos en la misma. Artículos de fabricación En otro aspecto de la invención, se propone un articulo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los desórdenes descritos anteriormente. El elemento de fabricación comprende un envase y una etiqueta o prospecto en el envase o asociado a él. Entre los envases adecuados se encuentran, por ejemplo, botes, viales, jeringas, etc. Los envases pueden estar hechos de diversos materiales, como vidrio o plástico. El envase tiene una composición que, por si sola o combinada con otra u otras composiciones, es eficaz en el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de la enfermedad y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa para solución intravenosa o un vial con un tapón perforable por una aguja hipodérmica) . Al menos un agente activo de la composición es un anticuerpo de la invención. La etiqueta o prospecto indica que la composición se ha utilizado para el tratamiento de la afección concreta, como cáncer. Además, el articulo de fabricación puede comprender (a) un primer envase con una composición contenida en él, donde la composición comprenda un anticuerpo de la invención; y (b) un segundo envase con una composición contenida en él, donde la composición comprenda otro agente terapéutico, incluyendo, por ejemplo, un agente quimioterapéutico o un agente antiangiogénico, incluyendo, por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF (por ejemplo, bevacizumab) . El articulo de fabricación de esta forma de realización de la invención puede comprender también un prospecto que indique que la composición del primer y del segundo anticuerpos se puede usar para tratar un proceso concreto, por ejemplo, cáncer. De modo alternativo, o adicional, el elemento de fabricación puede comprender un segundo (o tercer) envase que contiene una solución farmacéuticamente aceptable, como agua bacteriostática para inyección (BWFI), una solución salina fosfatada, una solución de Ringer y una solución de dextrosa. También puede incluir otros materiales deseables desde el punto dé vista comercial y del usuario, incluidas otras soluciones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas. A continuación se incluyen ejemplos de los métodos y composiciones de la invención. . A partir de la descripción general proporcionada anteriormente, se entiende que se pueden dar varias formas de realización.

EJEMPLOS Los reactivos disponibles comercialmente mencionados en los Ejemplos se utilizan de acuerdo con las instrucciones del fabricante, a menos que se indique lo contrario. La fuente de estas células identificadas en los Ejemplos siguientes y en toda la especificación, mediante los números de entrada ATCC® es American Type Culture Collection, Manassas, VA 20108. Las referencias citadas en los Ejemplos se enumeran tras los ejemplos. Todas las referencias citadas en la presente memoria descriptiva se incorporan a la misma a modo de referencia. Ejemplo 1 : Materiales y métodos En los Ejemplos se utilizaron los materiales y métodos que se indican a continuación. Ensayos de partículas en gel de fibrina con HUVEC. Se ha proporcionado información exhaustiva del ensayo de partículas en gel de fibrina con HUVEC (Nakatsu, M. N. et al., Microvasc Res 66, 102-12 (2003)). Tres partículas Cytodex™ (Amersham Pharmacia Biotech) fueron recubiertas con 350 a 400 HUVEC por partícula. Unas 200 partículas recubiertas con HUVEC se introdujeron en coágulo de fibrina en un pocilio de una placa para cultivo tisular de 12 pocilios. Encima del coágulo se colocaron 8 X 104 células SF. Los análisis concluyeron entre el dia 7 y el día 9 para procesarlos para inmunotinción y resonancia magnética nuclear. En algunos experimentos, se visualizaron brotes de HUVEC mediante tinción con anti-CD31 biotinilado (clon M59, eBioscience) y estrepavidina-Cy3. Para la tinción de los núcleos de las HUVEC, los geles de fibrina permanecieron fijados durante toda una noche en paraformaldehido (PFA) al 2% y se procedió a su tinción con 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Sigma) . Para la tinción de Ki67, los geles de fibrina fueron tratados con 10X tripsina-EDTA durante 5 minutos para eliminar las SF de la capa superior; luego, se procedió a neutralizarlos con FBS al 10% en PBS y a fijarlos y mantenerlos asi durante toda una noche en PFA al 4%. Luego, se bloquearon los geles de fibrina con 10% de suero de cabra en PBSET durante 4 horas; se incubaron durante toda la noche con Ki67 anti-ratón de conejo (formulación lista para su uso, clon Sp6, Lab Vision), tras lo cual se procedió a detección secundaria con IgG-Cy3 anticonejo (Jackson ImmunoResearch). Las incubaciones que se mantuvieron durante toda una noche se realizaron a 4 °C. Estudio de la retina neonatal de ratón. A ratones CD1 neonatos procedentes de la misma carnada se les inyectó por vía i.p. PBS o YW26.82 (10 mg/kg) en Pl y P3. Se extrajeron los ojos en P5 y se fijaron con PFA al 4% en PBS durante una noche. Las retinas diseccionados se bloquearon con 10% de suero de cabra en PBST durante 3 horas; luego, se incubaron toda una noche con anticuerpos primarios. El cóctel primario incluía isolectina B4 biotinilada (25 yg/ml, Bandeiraea ' simplicifolia ; Sigma) y uno de los compuestos siguientes: Ki67 anti-ratón de conejo (1:1, lista para su uso, clon Sp6, Lab Vision) o SMA antialfa conjugada con Cy3 de ratón (1:2000, Sigma-Aldrich), con 10% de suero en PBLEC (1% Tritón X-100, 0,1 mM CaCl2, 0,1 m MgCl2, 0,1 mM MnCl2, en PBS pH 6,8) . Luego, se lavaron las retinas en PBST y se incubaron toda la noche con una combinación con anticuerpos secundarios de estreptavidina Alexa Fluor® 488 (1:200; Molecular Probes) e IgG anti-ratón conjugada con Cy3 (1:200; Jackson ImmunoResearch) . Una vez finalizada la tinción, se procedió a una nueva fijación con PFA al 4% en PBS. Todas las incubaciones de una noche de duración se efectuaron a 4 °C. Se obtuvieron imágenes de las retinas montadas de plano mediante microscopio fluorescente confocal. Modelos de tumor. Se utilizaron ratones hembra atípicos de color beis de 8 a 10 semanas de vida. Para obtener tumores subcutáneos, se inyectó a los ratones una suspensión de 0,1 mi de células que contenía un 50% de matrigel (BD Bioscience) en el flanco posterior derecho. En cada ratón se inyectaron 5X106 células HM7 de cáncer de colon humanas, 10X106 células Colo205 humanas de carcinoma de colon, 10X106 células Calu6 humanas de carcinoma de pulmón, 10X106 células MV-522 humanas de carcinoma de pulmón, 10X106 células WEHI-3 murinas de leucemia, 10X106 células EL4 murinas de linfoma, 10X106 células SK-OV-3 XI humanas de cáncer de ovario, 10X106 de células LL2 murinas de cáncer de pulmón, 10X106 células EL4 de linforna/leucemia o 10X106 células H1299 de cáncer de pulmón de células pequeñas. Para el modelo MDA-MB-435 de melanoma humano, se inyectó a los ratones en los panículos adiposos mamarios una suspensión de 0,1 mi de células (5X106) que contenía 50% de matrigel. El anticuerpo anti-DLL4 Y 26.82 se administró por vía i.p. (10 mg/kg de peso corporal, dos veces por semana) . Para los modelos tumorales siguientes, a cada ratón del ensayo se le implantó subcutáneamente, en el flanco derecho, un fragmento tumoral (1 mm3) : SKMES-1 de cáncer de pulmón de células no pequeñas, MX-1 de cáncer de mama humano, SW620 de cáncer colorrectal humano y LS174T de adenocarcinoma humano. El crecimiento tumoral se cuantificó mediante mediciones con un calibrador. El volumen del tumor (mm3) se determinó midiendo su longitud (1) y anchura (a) y calculando el volumen (V = la2/2) . En cada grupo se incluyó de 10 a 15 animales. La comparación estadística de los grupos de tratamiento se realizó utilizando la prueba de la t de Student de dos colas. Ensayo inmunohistoquimico y marcación vascular de tumores. Se anestesió a los ratones con isoflurano. Se inyectó por vía intravenosa Lectina Lycopersicon esculentum marcada con FITC (150 pg en 150 µ? de NaCl al 0,9%; Vector Laboratories) y se dejó que circulara por el torrente sanguíneo 5 minutos antes de proceder a la perfusión sistémica. La vasculatura fue perfundida de forma transcardiaca con PFA al 1% en PBS durante 3 minutos. Se extrajeron los tumores y se fijaron por inmersión en el mismo fijador durante 2 horas y, después, se procedió a su incubación durante toda la noche en sacarosa al 30% para crioprotección y, luego, se embebieron en OCT . Se procedió a la tinción de los cortes (de 4 µp? de grosor) con CD31 antiratón (1:50, BD Pharmingen) y, después, por IgG anti-ratón de cabra Alexa 594 (1:800, Molecular Probes) . Estudio histológico e inmunohistoquimico de intestinos de ratón. Se obtuvieron cortes de 3 µp\ de grosor de tejidos del intestino delgado de ratón fijados en formol y embebidos en parafina. La identificación histoquímica de los tipos celulares del intestino se realizó mediante tinción con azul alciano, siguiendo las instrucciones del fabricante ( PolyScientific) . Para la tinción con anti-Ki67, se pretrataron los cortes con la solución Target Retrieval Solution (S1700, DAKO) y se incubaron con anti-Ki67 de ratón (1:200, clon SP6, Neomarkers) . Se detectaron anticuerpos secundarios anti-ratón de cabra a 7,5 g/ml con el kit Vectastain ABC Elite Kit (Vector labs) . Se procedió a tinción de contraste con hematoxilina de Mayer de todos los cortes sometidos previamente a tinción con Ki67. Para tinción con HES-1, se utilizó HES-1 anti-ratón (clon NM1 , MBL, International), seguida por TSA-HRP. Interferencia del AR . Se adquirieron a Dharmacon dupléx de ARN de escasa interferencia SMARTpool (ARNsi) que ¦ actuaban sobre DLL4 humana y Si Control Non-Target siRNA n.° 2. Se realizó la transfección de los dúplex de ARNsi (50 nM) con células HUVEC a una confjuencia del 40% utilizando OptiMEM-1® y Lipfectamine™ 2000 (Invitrogen) . El análisis FACS se llevó a cabo 48 horas después de la transfección del ARNsi. Las secuencias de los 4 ARNsi anti-DLL4 de SMART Pool eran las siguientes: CAACTGCCCTTATGGCTTTTT ( identificador de secuencia n.°: 62) (Oligo 1, sentido), AAAGCCATAAGGGCAGTTGTT ( identificador de secuencia n . ° : 63) (Oligo 1, antisentido), CAACTGCCCTTCAATTTCATT ( identificador de secuencia: 64) (Oligo 2, sentido) , TGAAATTGAAGGGCAGTTGTT ( identificador de secuencia n.°: 65) (Oligo 2, antisentido), TGACCAAGATCTCAACTACTT ( identificador de secuencia n.°: 66) (Oligo 3, sentido), GTAGTTGAGATCTTGGTCATT ( identificador de secuencia n.°: 67) (Oligo 3, antisentido), GGCCAACTATGCTTGTGAATT ( identificador de secuencia n.°: 68 ) (Oligo 4 , sentido) , TTCACAAGCATAGTTGGCCTT ( identificador de secuencia n.°: 69) (Oligo 4, antisentido). Ligando Noten: ELISA con bloqueo de Notch . Se revistieron placas de microtitulación de 96 pocilios con Notchl-Fc recombinante de rata ( rrNotchl-Fc, R&D Systems) a 0,5 µg/ml. En el ensayo se utilizó medio de cultivo condicionado que contenia DLL4-AP (aminoácidos 1-404 de DLL4 fusionado a fosfatasa alcalina de placenta humana) . Para preparar el medio de cultivo condicionado, se transfectaron provisionalmente 293 células con plásmido que expresaba DLL4-AP con el reactivo Fugen6 (Roche Molecular Biochemicals ) .

Cinco días después de la transfección, el medio condicionado se recolectó, filtró y almacenó a 4 °C. Los anticuerpos purificados titulados de 0,15 a 25 g/ml se preincubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con medio condicionado con DLL4-AP a una dilución que permitía una unión máxima posible del 50% al rrNotchl-Fc recubierto. Luego, se añadió la mezcla anticuerpo/DLL4-AP a la placa recubierta con rrNotchl-Fc durante 1 hora a temperatura ambiente, tras lo cual se lavaron las placas varias veces en PBS . La DLL4-AP unida se detectó utilizando PNPP en una sola fase (Pierce) como sustrato y una medición de la absorbancia (OD) a 405 nm. Se realizó un ensayo idéntico con DLL1-AP (DLL1 humana, aminoácido 1-445). Se llevaron a cabo ensayos similares con DLL4-His purificada (DLL4 humana marcada con His en el extremo C terminal, aminoácido 1-404) y Jagl-His (R& D system) . Los ligandos unidos marcados con His se detectaron con anticuerpo monoclonal (mAb) anti-His de ratón (1 yg/ml, Roche Molecular Biochemicals ) , anti-ratón de cabra biotinilado (Jackson ImmunoResearch) y estreptavidina-AP (Jackson ImmunoResearch) . Extracción de ARN y RT-PCR cuantitaviva en tiempo real . La extracción del ARN total de las células HUVEC en cultivo bidimensional se llevó a cabo utilizando el Mini Kit RNeasy® (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para extraer el ARN total de las células HUVEC cultivadas en geles de fibrina, se tratron los geles de fibrina con OX tripsina-EDTA (Gibco) durante 5 minutos para extraer los fibroblastos de la capa superior y, después, se procedió a neutralización con FBS al 10% en PBS. Los coágulos de gel se extrajeron, seguidamente, de los pocilios con cultivo tisular y se sometieron a centrifugación (10K durante 5 minutos) en microtubos para eliminar el exceso de fluido. Los "pelletes" de gel resultantes fueron sometidos a lisis con solución tamponada de lisis (Mini Kit RNeasy®) y, luego, fueron procesados con las células HUVEC en cultivo bidimensional . La calidad del ARN se evaluó utilizando RNA 6000 Nano Chips y el bionanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies) . Las reacciones de RT-PCR cuantitativa en tiempo real se realizaron por triplicado utilizando 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems) . Se utilizó GAPDH humano como gen de referencia para normalización. Los niveles de expresión se expresan como la media (±SEM) del número de cambios en el ARNm con respecto al control a partir de 3 valoraciones distintas. Las secuencias de las sondas y cebadores anversos y reversos para VEGFR2, ???ß2 y GAPDH fueron las siguientes: TGFb2 Anverso: GTA AAG TCT TGC AAA TGC AGC TA ( identificador de secuencia n.°: 70) Reverso: CAT CAT CAT TAT CAT CAT CAT TGT C ( identificador de secuencia n.°: 71) Sonda: AAT TCT TGG AAA AGT GGC AAG ACC AAA AT ( identificador de secuencia: 72) VEGFR2 Anverso: CTT TCC ACC AGC AGG AAG TAG ( identificador de secuencia n.°: 73) Reverso: TGC AGT CCG AGG TCC TTT ( identificador de secuencia n . ° : 74 ) Sonda: CGC ATT TGA TTT TCA TTT CGA CAA CAG A ( identificador de secuencia n.°: 75) GAPDH Anverso: GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC ( ident ificador de secuencia n . ° : 76) Reverso: GAA GGT GAA GGT CGG AGT C ( identificador de secuencia n.°: 77) Sonda: CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC ( identificador de secuenica n.°: 78) Ejemplo 2 : Generación de anticuerpos anti-DLL4 en fagos Las librerías de representación en imágenes de anticuerpos de fagos sintéticos se construyeron en una estructura única (anticuerpo anti-ErbB2 humanizado) mediante introducción de diversidad dentro de regiones de determinación de complementariedad (CDR) de las cadenas ligera y pesada (Lee, C. V. et al., J Mol Biol 340, 1073-93 (2004); Liang, W. C. et al., J Biol Chem 281, 951-61 (2006)). Se realizó detección de placas con librerías nativas contrastándolas con DLL4 humana marcada con His (aminoácido 1-404) inmovilizada en inmunoplacas Maxisorp™. Tras cuatro series de enriquecimiento, se eligieron clones de forma aleatoria y se identificaron agentes de unión específicos mediante ELISA en fagos. Los clones resultantes de unión a hDLL4 se sometieron a un nuevo proceso de detección con proteína DLL4 murina marcada con His para identificar clones de distintas especies. Para cada clon de fago positivo, se subclonaron regiones variables de las cadenas ligera y pesada en vectores de expresión pRK que fueron diseñados para expresar cadenas de IgG de longitud completa. Los constructos de la cadena ligera y de la cadena pesada fueron cotransfectados en células CHO o 293 y los anticuerpos expresados fueron purificados del medio de cultivo sin suero utilizando columna de afinidad de proteínas A. Los anticuerpos purificados fueron sometidos al ensayo ELISA para bloquar la interacción entre DLL4 y Notchl-Fc de rata y al ensayo FACS para unir las líneas celulares estables que expresaban DLL4 murina o DLL4 humana de longitud completa. Para la maduración de afinidad, se construyeron librerías de fagos con tres combinaciones diferentes de bucles de CDR (CDR-L3, -Hl y -H2) derivadas del clon inicial de interés mediante una estrategia de aleatorización flexible, de forma que cada posición seleccionada era mutada a un residuo de tipo no natural o se mantenía como tipo natural en una frecuencia de 50:50 aproximadamente (Liang et al., 2006, above) . A continuación, se identificaron los clones de alta afinidad mediante cuatro series de detección en fase de solución frente a proteínas DLL4 marcadas con His, tanto murinas como humanas, en unas condiciones cada vez más o restrictivas. Ejemplo 3: Caracterización de anticuerpos anti-DLL4 Para determinar la afinidad de unión de los anticuerpos monoclonales anti-DLL4, se utilizó la medición mediante resonancia plasmón de superficie (SRP) con BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) . Los biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc) se activaron con clorhidrato de N-etil-N'- ( 3-dimetilaminopropil ) -carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) , por un corto espacio de tiempo, según las instrucciones del proveedor. Un anticuerpo anti-DLL4 se diluyó con 10 mM de acetato sódico, pH 4,8, a 5 pg/ml antes de la inyección a un caudal de 5 µ?/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) del anticuerpo emparejado. A continuación, se inyectó 1M etanolamina para bloquear grupos no reaccionados. Para mediciones cinéticas, se inyectó el doble de diluciones seriadas de moléculas DLL4-His humanas o murina (de 0,7 nM a 500 nM) en PBS con 0,05% Tween 20 a 25 °C a un caudal de 25 µ?/min. Las tasas de asociación (kon) y las tasas de disociación (koff) se calcularon usando un sencillo modelo de unión uno a uno de Langmur (BIAcore Evaluation Software versión 3.2). La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calculó como el cociente koff/kon. Los resultados de este experimento se muestran en la Tabla 3. El anticuerpo YW26.81 presentaba valores Kd similares a DLL4 humano y murino (valores Kd de 0,1 nM5 y 0,09 nM, respectivamente), lo que permitía su evaluación en modelos de ratón. TABLA 3: Afinidad de unión y cinética de anticuerpos anti-DLL4 a DLL4 humana y murina. "ND" significa que la medición no se ha realizado. Clon Delta 4 murino (ECD 5,5) Delta 4 humano (ECD 5,5) kon/10 koff10~4 Kd kon/10 koff/10"1 Kd (nM) (nM) YW26 0, 57 16 28 0,3 7,4 25 YW26.6 4,1 0, 61 0,15 2 0,49 0,25 YW26.14 3,3 0,73 0, 22 1,8 0, 66 0, 37 YW26.20 3, 3 1 0,3 1,7 0,79 0,46 YW26.34 3, 6 0, 65 0,18 1, 9 0, 67 0, 35 YW26.82 5,4 0,46 0,09 2,4 0, 37 0, 15 Ejemplo 4: Caracterización posterior del anticuerpo anti-DLL4 Mapeo del epitopo del Mab anti-DLL4 YW26.82: El Mab anti-DLL4 26.82 reconoció un determinante de unión presente en la repetición número 2 de EGF-like (EGL2) del dominio extracelular (ECD) de la DLL4 humana. EGL2 comprende los aminoácidos 252-282 del ECD de la DLL4 humana. Los mutantes del ECD de DLL4 se expresaban como proteínas de fusión con fosfatasa alcalina y se unían al anticuerpo como se indicaba. La Figura lia muestra una representación esquemática de un conjunto de mutantes de DLL4 expresados como proteínas de fusión con fosfatasa alcalina (AP) placentaria humana. Los paréntesis indican secuencias de DLL4 incluidas en las proteínas de fusión. Se llevaron a ' cabo ensayos de los medios de cultivo condicionados de células 293T que contenían las proteínas de fusión en 96 pocilios de placas de microtitulación recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-DLL4 purificado (YW26.82, 0,5 yg/ml). La DLL4.AP unida se detectó utilizando PNPP en una sola fase (Pierce) como sustrato y una medición de la absorbancia (OD) a 405 nm. El Mab YW26.82 unía constructos que comprendían el dominio EGL2 de DLL4 y no unía un constructo que no tuviera el dominio EGL2 de DLL . Esto demostraba que el anticuerpo monoclonal anti-DLL4 YW 26.82 reconocía un epítopo en el dominio EGL2 del ECD de DLL4 humana. El anticuerpo monoclonal Y 26.82 se une selectivamente a DLL4 humana y murina. Se revistieron las placas Nunc MaxiSorp de 96 pocilios con proteínas recombinantes purificadas como se indica (1 yg/ml) . La unión de YW26.82 a las concentraciones indicadas se midió utilizando el ensayo ELISA. Los anticuerpos unidos se detectaron con el conjugado de HRP con anticuerpo antihumano usando TMB como sustrato y una lectura de la absorbancia (OD) a 450 nm. Como control durante el ensayo se utilizaron ErbB2-ECD recombinante y anticuerpo anti-HER2 (Figura 11b) . Los resultados de este experimento se muestran en la Tabla 11b. El anticuerpo monoclonal Y 26.82 se unía a DLL4 humana y murina y no se unía de forma detectable a DLL1 humana ni a JAG1 humana. Estos resultados demostraban que el anticuerpo monoclonal YW26.82 se une selectivamente a DLL4. El análisis FACS de 293 células transfectadas provisionalmente con el vector, DLL4 de longitud completa, Jagl o DLL1 también demostraba que el anticuerpo monoclonal YW26.82 se unía selectivamente a DLL4. Cómo se muestra en la Figura 11c, sólo se detectó unión significativa de YW26.82 en células transfectadas con DLL4 (panel superior) . No se detectó unión significativa en células transfectadas con Jagl o DLL1. La expresión de Jagl y DLLl se confirmó mediante la unión de Notchl-Fc murino recombinante (rrNotchl-Fc, panel central) y Notch2-Fc murino recombinante ( rrNotch2-Fc, panel inferior), respectivamente. Se utilizaron YW26.82, rrNotchl-Fc o rrNotch2-Fc (R&D System) a 2 yg/ml, seguido de IgG-PE antihumana de cabra (1:500, Jackson ImmunoResearch) . Los experimentos de competición demostraron que el anticuerpo monoclonal YW26.82 bloqueaba de forma eficaz y selectiva la interacción de Notch con DLL4, pero no de otros ligandos Notch. Como se muestra en la Figura lid, el anticuerpo monoclonal anti-DLL4 bloqueaba la unión de DLL4-AP, pero no de DLL1-AP, a rNotchl recubierto, con una IC50 calculada de 12 nM aproximadamente (panel izquierdo) . El anticuerpo monoclonal anti-DLL4 bloqueaba la unión de DLL4-His, pero no de Jagl-His, a rNotchl recubierto, con una IC50 calculada de 8 nM aproximadamente (panel derecho) . El anticuerpo monoclonal anti-DLL4 YW26.82 se unía específicamente a DLL4 expresado endógenamente en células endoteliales humanas derivadas de la vena umbilical (HUVEC) . Análisis FACS de HUVEC transíectadas con ARNsi específico de DLL4 o control. El YW26.82 se utilizó a 2 pg/ml, seguido de IgG-PE antihumana de cabra (1:500, Jackson ImmunoResearch ) . Los resultados de este experimento se muestran en la Tabla lie. Se observó unión a HUVEC no transfectadas (control) y a HUVEC transfectadas con ARNsi de un control. En cambio, la unión se reducía significaativamente en HUVEC transfectadas con ARNsi de DLL4. Estos experimentos demostraron que el anticuerpo monoclonal anti-DLL4 YW26.92 se une específicamente a DLL4 expresado endógenamente en HUVEC. Ejemplo 5: El tratamiento con anticuerpo anti-DLL4 aumentaba la proliferación de células endoteliales in vitro Las células endoteliales humanas derivadas de la vena umbilical (HUVEC) cultivadas en geles de fibrina en presencia de células fibroblásticas cutáneas (SF) humanas cocultivadas generan brotes con una distintiva estructura similar al lumen (Nakatsu, M. N. et al., Microvasc Res 66, 102-12 (2003)). La adición de anticuerpo anti-DLL4 YW26.92 aumentaba acusadamente la longitud y el número de brotes (Figura 7a) . El procesamiento proteolitico de Notch, catalizado por la actividad de la ?-secretasa de un complejo proteinico, es un paso esencial durante la activación de Notch (Barón, M., Semin Cell Dev Biol 14, 113-9 (2003)). Conviene señalar que el inhibidor de la ?-secretasa dibenzazepina (DBZ) (van Es, J. H. et al., Nature 435, 959-63 (2005); Milano, J. et al., Toxicol Sci 82, 341-58 (2004)) tenia el mismo efecto en la formación de brotes de HUVEC . Teniendo en cuenta los mecanismos distintivos de estos dos tratamientos, la mayor formación de brotes se podía atribuir claramente a la atenuación de la señalización de Notch. La tinción con Ki67 reveló que el aumento de la formación de brotes de células endoteliales se debía a la elevada proliferación celular (Fig. 7b) . En el ensayo original en gel de fibrina, la formación de brotes de HUVEC y la subsiguiente formación de lumen están favorecidas por células SF cocultivadas . Al sustituir las células SF por medio de cultivo condicionado, tanto el anticuerpo monoclonal anti-DLL4 como DBZ aún podían aumentar la formación de brotes de HUVEC (Fig. le) , lo que favorecía el papel autónomo de las células endoteliales de la señalización de Notch/DLL . En el experimento inverso, la activación de Notch por la proteina DLL4 inmovilizada ocasionó una inhibición significativa del crecimiento (Fig. 7e) . Estos datos indican que el estado de activación de la señalización de Notch/DLL4 está estrechamente asociado a la proliferación de células endoteliales. Ejemplo 6: El tratamiento con anticuerpo anti-DLL4 aumentaba la proliferación de células endoteliales In vivo La retina postnatal temprana de ratones desarrolla un patrón vascular estereotípico en una secuencia de acontecimientos perfectamente definida (Stone, J. & Dreher, Z., J Comp Neurol 255, 35-49 (1987); Gerhardt, H. et al., J Cell Biol 161, 1163-77 (2003); Fruttiger, M . , Invest Ophthalmol Vis Sci 43, 522-7 (2002)). La expresión prominente y dinámica de DLL4 en células endoteliales en crecimiento en las retinas neonatales indican una posible función de la DLL4 en la regulación del desarrollo vascular retiniano (Claxton, S. & Fruttiger, M. , Gene Expr Patterns 5, 123-7 (2004)). La administración sistémica de Y 26.82 causaba una profunda alteración de la vasculatura retiniana. Se producía en la retina una acumulación masiva de células endoteliales, lo que generaba una estructura en forma de hoja con una morfología vascular primitiva (Fig. 7d) . Se observó un aumento significativo de la marcación con Ki67 en células endoteliales , lo que indicaba una proliferación elevada de células endoteliales (Fig. 7h) . Por lo tanto, este fenotipo hiperproliferativo de las células endoteliales retinianas sobre el bloqueo, de DLL4 en ratones neonatales corroboraba los datos obtenidos in vitro. Ejemplo 7: Papel esencial de DLL4/Notch en la regulación de la proliferación de células epiteliales El VEGF controla varios aspectos fundamentales de las células endoteliales (Ferrara, N. Exs, 209-31 (2005); Coultas, L. et al., Nature 438, 937-45 (2005)). Sin embargo, se sabe menos acerca del modo en que la señalización del VEGF se integra en los complejos procesos vasculares, com la diferenciación arteriovenosa (AV) y la organización vascular jerárquica, que evidentemente exigen vías de señalización adicionales muy coordinadas. Los estudios genéticos en el pez cebra indican que el VEGF actúa antes del extremo 5' de la vía del Notch durante la diferenciación endotelial arterial (Lawson, N. D. et al., Development 128, 3675-83 (2001)). Observamos que la estimulación de las HUVEC mediante el VEGF ocasionamba un aumento de la expresión de DLL4 en la superficie (datos no incluidos), lo que se correspondía con un informe reciente sobre la regulación ascendente del ARNm de DLL4 mediante la estimulación del VEGF (Patel, N. S. et al., Cáncer Res 65, 8690-7 (2005)). Curiosamente, DLL4 se regula de forma ascendente tras la activación de Notch (Figura 12), lo que indica un mecanismo de retroalimentación positiva mediante el cual DLL4 transmite eficazmente la señalización del VEGF a la vía de Notch. Las HUVEC fueron estimuladas mediante DLL4 humano marcado con His inmovilizado en el extremo C terminal (aminoácidos 1-404) en ausencia o presencia de DBZ (0,08 µ?) . Treinta y seis horas después de la estimulación, se estudió la expresión endógena de DLL4 mediante análisis FACS con anticuerpo anti-DLL4. Es de destacar que la hiperproliferación de células endoteliales producida por bloqueo de la señalización de Notch seguía dependiendo del VEGF. En el cultivo tridimensional en gel de fibrina, el tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-VEGF eliminaba la mayor parte de la formación de brotes de células endoteliales, bien en presencia bien en ausencia de DBZ (Fig. 7f ) , lo que aumenta la posibilidad de que el comportamiento hiperproliferativo pudiera deberse en parte a una mayor señalización del VEGF. De hecho, el bloqueo de Notch por YW26.82 o DBZ ocasionaba la regulación ascendente del VEGFR2 (Fig. 7g) . En cambio, la activación de Notch por DLL4 inmovilizada suprimía la expresión del VEGFR2 (Fig. 7g) . Por lo tanto, aunque el VEGF puede actuar antes del extremo 5' de la vía del Notch/DLL4, el Notch/DLL4 puede afinar la respuesta mediante regulación negativa de la expresión del VEGFR2. Ejemplo 8: El tratamiento con anticuerpo anti-DLL4 bloqueaba la diferenciación de células endoteliales y bloqueaba el desarrollo arterial Además del aumento de la proliferación de células endoteliales, la actuación de Notch/DLL4 como antagonistas causaba un cambio morfológico drástico de los brotes de células endoteliales en gel de fibrina. Las estructuras multicelulares semajantes a lumen estaban, en su mayor parte, ausentes (Fig. 8a), lo que indicaba una diferenciación defectuosa de las células endoteliales. En las retinas tratadas con anticuerpo monoclonal YW26.82, el patrón característico de arterias y venas que se alternaban radialmente se vió alterado gravemente. La tinción con actina anti-a de músculo liso (ASMA) , que se asocia a las arterias de la retina, no se detectaba en absoluto (Fig. 8c) . Esta observación fue sorprendentemente similar al desarrollo arterial defectuoso en embriones DLL4+/-. Estos datos, desde distintos ángulos, resaltan el papel esencial de DLL4/Notch en la regulación de la diferenciación de células endoteliales .

Ejemplo 9: La expresión de TFG|3 estaba asociada al estado de activación del Notch De forma similar a la vía del Notch, la señalización del GF depende del contexto y tiene efectos diversos y con frecuencia opuestos sobre la diferenciación, proliferación e inhibición del crecimiento celular. Además, la vía del TGF interviene en procesos vasculares (Urness, L. D. et al., Nat Genet 26, 328-31 (2000); Oshima, M. et al., Dev Biol 179, 297-302 (1996); Larsson, J. et al., Embo J 20, 1663-73 (2001) ) . Por ejemplo, la deficiencia de la quinasa 1 similar al receptor de la activina (ALK1), un receptor de tipo I del TGF específico de células endoteliales , ocasionaba una red primitiva de células endoteliales en los sacos endodérmicos y disfunción arteriovenosa (AVM) , un fenotipo compartido por ratones con señalización Notch defectuosa (Urness, L. D. et al., Nat Genet 26, 328-31 (2000); Iso, T. et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol 23, 543-53 (2003)). Esto nos llevó a investigar la posible relación entre estas dos vías. Observamos que la expresión del GF\s2 (Fig. 8b) estaba estrechamente asociada al estado de activación de Notch, lo que indica que la vía del TGF podía actuar después del extremo 3' de la vía del Notch. Juntos, nuestros datos soportan un modelo donde el eje de Notch/DLL4 , que sirven como "vías de señalización", integran la señalización del VEGF mediante regulación de la expresión de DLL4 y hacen que la vía del TGF fomente la diferenciación de las células endoteliales . Ejemplo 10 : El tratamiento con anticuerpo anti-DLL4 inhibía el crecimiento tumoral In vivo Para abordar directamente el posible papel de la señalización de Notch/DLL4 durante la angiogénesis tumoral, investigamos el impacto del bloqueo de DLL4 sobre el crecimiento tumoral en modelos tumorales preclínicos (Figuras 9a-d) . En modelos tumorales xenotrasplantados Calue6, Colo205 y HM7 (Figuras 9a-c) , el tratamiento con YW26.82 se inició tras la determinación del tumor (>250 mm3 de tamaño tumoral) . En los tres modelos, se hizo evidente una distinción en la tasa de crecimiento entre los grupos de tratamiento y de control al cabo de tres días de administración. El volumen tumoral del grupo de tratamiento se mantuvo sin cambios durante dos semanas de tratamiento. Además de tumores subcutáneos, el anticuerpo monoclonal anti-DLL4 también inhibía el crecimiento de tumores en los panículos adiposos mamarios de ratones. En el modelo tumoral MDA-MB-435, el tratamiento se inició 14 días después de la inyección del tumor. A los 6 días de la administración se hizo evidente una diferencia en las curvas de crecimiento tumoral entre los grupos de tratamiento y de control y se hizo más significativa a medida que avanzaba el tratamiento (Fig. 9d) .

También investigamos el impacto del bloqueo de DLL4 y/o VEGF en el crecimiento de numerosos tumores en modelos tumorales preclinicos (Figuras 9e-f; i-p) . En los modelos de tumores xenotrasplantados MV-522 y WEHI3, el tratamiento con YW26.82 y/o el tratamiento con anticuerpo anti-VEGF se inició tras el establecimiento del tumor (>250 mm3 de tamaño tumoral) . En el modelo MV-522, tanto el tratamiento con YW26.82 como el tratamiento con anticuerpo anti-VEGF inhibían el crecimiento tumoral individualmente, pero la combinación de ambos tratamientos era más eficaz. En el modelo WEHI3, el tratamiento con anticuerpo anti-VEGF no mostraba efecto alguno sobre el crecimiento tumoral, mientras que el tratamiento con YW26.82 mostraba una inhibición significativa del crecimiento tumoral. En los modelos SK-0V-3X1, LL2, EL4, H1299, SKMES-1, MX-1, S 620 y LS174T, el tratamiento con Y 26.82 ((5 mg/kg, i.p., dos veces por semana) y/o el tratamiento con anticuerpo anti-VEGF (5 mg/kg, i.p., dos veces por semana) se administraban tras el establecimiento de los tumores. En cada uno de estos modelos, el tratamiento con YW26.82 inhibía sólo el crecimiento tumoral. Además, en todos estos modelos en los que se probó la combinación, YW26.82 presentaba una mayor eficacia en combinación con anticuerpo anti-VEGF. Ejemplo 11 : El tratamiento con anticuerpo anti-DLL4 aumentaba la proliferación de células endoteliales tumorales A la luz de la inhibición del crecimiento tumoral, utilizamos el modelo tumoral de linfoma de ratón E14 para estudios de histología vascular. Observamos que el tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-DLL4 ocasionaba un aumento espectacular de la densidad de células endoteliales (Fig. 9g) . En cambio, el anticuerpo anti-VEGF tenía un efecto completamente opuesto (Fig. 9g) , aunque los dos tratamientos presentaban una eficacia similar en este modelo. Ejemplo 12 : El tratamiento con anticuerpo anti-DLL4 inhibía la perfusión vascular tumoral Como . el bloqueo in vitro de la vía del Notch/DLL4 obstaculizaba la formación de una estructura similar al lumen por las células endoteliales (Fig. 8a), se investigó si el tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-DLL4 ocasionaba un defecto similar en la vasculatura tumoral y afectaba al flujo sanguíneo correcto. La perfusión sistémica con FITC-letina reveló que el tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-DLL4 ocasionaba una acusada reducción del marcado con lectina de los vasos del tumor (Fig. 9h) . Cabe destacar que se ha demostrado que la disfunción arteriovenosa en ratones con déficit de ALK1 causa una circulación sanguínea anómala (Urness, L. D. et al., Nat Genet 26, 328-31 (2000)). Dado el papel esencial de la señalización de Notch/DLL4 en la diferenciación AV, tanto en embriones como las retinas postnatales, el anticuerpo monoclonal anti-DLL4 podría influir la especificación celular de Jas células endoteliales tumorales y originar un flujo sanguíneo direccional defectuoso. De hecho, en tumores Colo205 tratados con anticuerpo monoclonal anti-DLL4, había regiones donde una densidad elevada de células endoteliales se asociaba a un bajo contenido de células tumorales viables, lo que supone una mala función vascular. Es preciso realizar otros estudios que utilicen técnicas para captación de imágenes vasculares para averiguar los defectos vasculares con precisión. Ejemplo 13: El DLL4/Notch no es importante para la homeostasis del intestino de ratón. Una gran preocupación sobre la inhibición global del Notch es que puede ser nociva, dadas las funciones pleiotrópicas de la señalización de Notch en la regulación de la homeostasis de sistemas de autorenovación posnatales. Por ejemplo, la señalización del Notch es necesaria para mantener células progenitoras en las criptas no diferenciadas en los intestinos (van Es, J. H. et al., Nature 435, 959-63 (2005); Fre, S. et al., Nature 435, 964-8 (2005)) . De hecho, los inhibidores de la ?-secretasa, que bloquearían indiscriminadamente todas las actividades Notch, causan efectos secundarios no deseados debido a un aumento masivo de las células calciformes dentro del compartimento de las criptas (Milano, J. et al., Toxicol Sci 82, 341-58 (2004); Wong, G. T. et al., J Biol Chem 279, 12876-82 (2004)) . "Examinamos los intestinos delgados de ratones tratados con anticuerpo monoclonal anti-DLL4 mediante análisis inmunohistoquímico . A diferencia del tratamiento con DBZ, no se observaron diferencias en los perfiles de proliferación o diferenciación celular de las criptas epiteliales entre los grupos de control y de tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-DLL4 tras seis semanas de tratamiento (Fig. 10). Además, el anticuerpo monoclonal anti-DLL4 no alteraba la expresión del gen diana del Notch HES-1 en la población de amplificación del tránsito (TA) que se dividía rápidamente (Fig. 10). Estos resultados apoyan la idea de que la señalización de Notch/DLL4 está limitada en gran parte al sistema vascular.

Ejemplo 14: El tratamiento con anticuerpo anti-DLL4 no influye en la vasculatura de la retina adulta Aunque el bloqueo de DLL4 tenía un profundo impacto en el desarrollo vascular de la retina del ratón neonato, la administración de anticuerpo anti-DLL4 no tenía impacto visible en la vasculatura de la retina adulta (Fig. 8d) . Por ello, la señalización de Notch/DLL4 es esencial durante la angiogénesis activa, pero desempeña un papel de menor importancia en el mantenimiento normal de los vasos. Según esto, durante el tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-DLL , no se observó pérdida de peso visible o muerte de animales en ratones portadores de tumores cuando se les administraban 10 mg/kg dos veces por semana durante un máximo de 8 semanas. En modelos tumorales, el anticuerpo monoclonal anti-DLL4 y el anticuerpo anti-VEGF muestran efectos contrarios sobre la vasculatura del tumor, lo que indica la existencia de mecanismos de acción que no se solapan. Aunque la anterior invención se ha descrito en detalle a modo de ejemplo a efectos de claridad y comprensión, las descripciones y ejemplos no se deben interpretar de forma que limiten el ámbito de la invención.

Claims (43)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-DLL4 aislado que comprende: (a) al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco secuencias de la región hipervariable (HVR) seleccionadas en el grupo formado por: (i) HVR-L1 que comprende la secuencia Al-All, donde Al-All es RASQDVSTAVA ( identificador de secuencia n.°: 10) (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia B1-B7, donde B1-B7 es SASFLYS ( identificador de secuencia n.°: 11) (iü) HVR-L3 que comprende la secuencia C1-C9, donde C1-C9 es QQSYTGTVT ( identificador de secuencia n.°: 18) (iv) HVR-Hl que comprende la secuencia D1-D10, donde Dl-D10 es GFTFTDNWIS ( identificador de secuencia n.°: 1); (v) HVR-H2 que comprende la secuencia E1-E18, donde El-E18 es GYISPNSGFTYYADSVKG ( identificador de secuencia n.°: 8) y (vi) HVR-H3 que comprende la secuencia F1-F15, donde F1-F15 es VYYCARDNFGGYFDY ( identificador de secuencia n . ° : 9 ) ; y (b) al menos una variante de la HVR, donde la secuencia de la variante de la HVR incluye la modificación de al menos un residuo de la secuencia descrita en los identificadores de secuencia n.°: 1-18.

2. Un anticuerpo anti-DLL4 aislado que comprende: (a) al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco secuencias de la región hipervariable (HVR) seleccionadas en el grupo formado por: (i) HVR-Ll que comprende la secuencia Al-All, donde Al-All es RASQDVSTAVA ( identificador de secuencia n.°: 10) (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia B1-B7, donde B1-B7 es SASFLYS ( identificador de secuencia n.°: 11) (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia C1-C9, donde C1-C9 es QQSYNGPST ( identificador de secuencia n.°: 15) (iv) HVR-H1 que comprende la secuencia D1-D10, donde Dl-D10 es GFTFTDNWIS ( identificador de secuencia n.°: 1) (v) HVR-H2 que comprende la secuencia E1-E18, donde El-E18 es GVINPNSGATEYADSVKG ( identi ficador de secuencia n.°: 5) y (vi) HVR-H3 que comprende la secuencia F1-F15, donde F1-F15 es VYYCARDNFGGYFDY ( identificador de secuencia n.°: 9); y (b) al menos una variante de la HVR, donde la secuencia de la variante de la HVR incluye la modificación de al menos un residuo de la secuencia descrita en los identificadores de secuencia n.°: 1-18.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2, donde una variante de la HVR-L3 comprende de 1 a 6 (1, 2, 3, 4, 5 ó 6) sustituciones en cualquier combinación de las posiciones siguientes: 91 (S o W) , 92 (Y o F) , 93 (T, N o S), 94 (T o G), 95 (P, Q, A o T), y/o 96 (P, S, A o V) .

4. El anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2, donde una variante de la HVR-H2 comprende de l a 4 (1, 2, 3 ó 4) sustituciones en cualquier combinación de las posiciones siguientes: 50 (V, L o Y) , 52 (N o S) , 52a (P o S) o 53 (N, Q, T o I) .

5. Un anticuerpo anti-DLL4 aislado que comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR, donde cada HVR comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia seleccionada entre el grupo formado por los identificadores de secuencia núms : 1-18, y donde el identificador de secuencia n.°: 10 se corresponde con una HVR-L1; el identificador de secuencia n.°: 11 se corresponde con una HVR-L2; los identificadores de secuencia n.° 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 se corresponden con una HVR-L3; los identificadores de secuencia n.° 1 ó 2 se corresponden con una HVR-H1; los identificadores de secuencia n° 3, 4, 5, 6, 7 u 8 se corresponden con una HVR-H2; y el identificador de secuencia n.° 9 se corresponde con una HVR-H3.

6. El anticuerpo de la reivindicación 5, donde el anticuerpo de la invención comprende HVR-Ll, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3 , donde cada una de ellas, por orden, comprende los identificadores de secuencia n.°: 10, 11, 14, 2, 3, 9.

7. El anticuerpo de la reivindicación 5, donde el anticuerpo de la invención comprende HVR-Ll, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, donde cada una de ellas, por orden, comprende los identificadores de secuencia n.°: 10, 11, 15, 1, 5, 9.

8. El anticuerpo de la reivindicación 5, donde el anticuerpo de la invención comprende HVR-Ll, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, donde cada una de ellas, por orden, comprende los identificadores de secuencia n.°: 10, 11, 16, 1, 6, 9.

9. El anticuerpo de la reivindicación 5, donde el anticuerpo de la invención comprende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, donde cada una de ellas, por orden, comprende los identificadores de secuencia n.°: 10, 11, 17, 1, 7, 9.

10. El anticuerpo de la reivindicación 5, donde el anticuerpo de la invención comprende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, donde cada una de ellas, por orden, comprende los identificadores de secuencia n.°: 10, 11, 18, 1, 8 y 9.

11. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde al menos una porción de la secuencia de estructura es una secuencia de estructura de consenso humana.

12. El anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2, donde la modificación es sustitución, inserción o eliminación.

13. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, donde el anticuerpo comprende una secuencia de estructura de consenso del subgrupo ? humano.

14. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, donde el anticuerpo comprende una secuencia de estructura de consenso del subgrupo III humano de la cadena pesada .

15. El anticuerpo de la reivindicación 14, donde el anticuerpo comprende una sustitución de una o más de las posiciones 71, 73 ó 78.

16. El anticuerpo de la reivindación 15, donde la sustitución es una o más de R71A, N73T o N78A.

17. Un polinucleótido que codifique un anticuerpo de cualquiera de las reivindaciones 1-16.

18. Un vector que comprenda el polinucleótido de la reivindicación 17.

19. El vector de la reivindicación 18, donde el vector es un vector de expresión.

20. Una célula huésped que comprende un vector de la reivindicación 18 ó 19.

21. La célula huésped de la reivindicación 20, donde la célula huésped es procariótica .

22. La célula huésped de la reivindicación 20, donde la célula huésped es eucariótica.

23. La célula huésped de la reivindicación 20, donde la célula huésped es de mamífero.

24. Un método para elaborar un anticuerpo anti-DLL4, que comprenda (a) la expresión de un vector de la reivindicación 19 en una célula huésped apta y (b) la recuperación del anticuerpo.

25. Un método para elaborar un inmunoconj ugado anti-DLL4, que comprenda (a) la expresión de un vector de la reivindicación 19 en una célula huésped apta y (b) la recuperación del anticuerpo.

26. El método de la reivindicación 24 ó 25, donde la célula huésped es procariótica.

27. El método de la reivindicación 24 ó 25, donde la célula huésped es eucariótica.

28. Un método para la detección de DLL4, que comprenda la detección del complejo DLL4- anticuerpo anti-DLL4 en una muestra biológica.

29. Un método para diagnosticar un trastorno asociado a la expresión de DLL4, que incluya la detección del complejo formado por DLL4 y anticuerpos anti-DLL4 en una muestra biológica procedente de un paciente que tenga o posiblemente tenga el trastorno.

30. El método de cualquiera de las reivindicaciones 28-29, donde el anticuerpo anti-DLL4 se detecta mediante marcado .

31. Una composición que comprende un anticuerpo anti-DLL4 de cualquiera de las reivindaciones 1-16.

32. Una composición que comprende un polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 17-19.

33. La composición de la reivindicación 31 ó 32, donde la composición comprende además una molécula vehículo .

34. Un método para el tratamiento de un tumor, un cáncer o un trastorno de proliferación celular que comprenda la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 a un sujeto que necesite dicho tratamiento, mediante el cual se trata el tumor, el cáncer o el trastorno de proliferación celular.

35. El método de la reivindicación 34, donde el tumor, cáncer o trastorno de proliferación celular es cáncer de colon, cáncer de pulmón o cáncer de mama.

36. El método de la reivindicación 34 ó 35, que comprende, además, la administración de una cantidad eficaz de un agente antiangiogénico .

37. El método de la reivindicación 36, donde el agente antiangiogénico es un antagonista del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) .

38. El método de la reivindicación 37, donde el antagonista del VEGF es un anticuerpo anti-VEGF.

39. El método de la reivindicación 38, donde el anticuerpo anti-VEGF es bevacizumab.

40. El método de cualquiera de las reivindicaciones 34- 39, que supone administrar también una cantidad eficaz de un agente quimioterapéutico .

41. Un método para mejorar la eficacia de un agente ' antiangiogénico en un sujeto con un proceso patológico asociado a angiogénesis , que supone la administración al sujeto de una cantidad eficaz de un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 además del agente antiantigénico, lo que aumenta la eficacia de dicho agente antiangiogénico.

42. El método de la reivindicación 41, en la que el proceso patológico asociado a angiogenia es un tumor, un cáncer y/o un trastorno de proliferación celular.

43. El método de la reivindicación 41, donde el proceso patológico asociado a angiogénesis es una enfermedad neovascular intraocular.