BR112015009961B1 - proteína de ligação capaz de se ligar a dll4 e vegf, bem como composição que a compreende como composição que a compreende - Google Patents

Abstract

IMUNOGLOBINAS ANTI-VEGF/DLL4 COM DUPLO DOMÍNIO VARIÁVEL E USO DESTAS A presente invenção provê proteínas de ligação multivalentes e multiespecíficas, métodos para produzir as proteínas de ligação e seus usos no diagnóstico, monitoramento, inibição, prevenção e/ou tratamento de cânceres, tumores e/ou de outras doenças dependentes de angiogênese, caracterizadas pela expressão ou atividade anormal de DLL4 e/ou de VEGF.

Description

[001]Este pedido de patente reivindica o benefício de prioridade deste segundo 35 U.S.C. § 119 ao Pedido de Patente U.S. Provisório N2 61/721 072, depositado em 12 de novembro de 2012, e ao Pedido de Patente U.S. Provisório N2 61/787 927, depositado em 15 de março de 2013, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente.

[002]A presente invenção descreve proteínas de ligação multivalentes e multiespecíficas, métodos para a produção e usos das proteínas de ligação no diagnóstico, na inibição, prevenção e/ou no tratamento de cânceres, tumores e/ou de outras doenças dependentes de angiogênese.

[003]Proteínas construídas, como as proteínas de ligação multiespecíficas capazes de se ligar a dois ou mais antígenos, são conhecidas na técnica. Tais proteínas de ligação multiespecíficas podem ser geradas utilizando técnicas de fusão celular, conjugação química ou do DNA recombinante. Há uma variedade de estruturas de proteínas de ligação multiespecíficas conhecidas na técnica; contudo, muitas de tais estruturas e métodos possuem desvantagens distintas.

[004]Foram produzidos anticorpos biespecíficos utilizando a tecnologia do quadroma. No entanto, a presença de subprodutos mal pareados e produtividade significativamente reduzida obtida com essa tecnologia significam que há necessidade de procedimentos sofisticados de purificação. Anticorpos biespecíficos podem também ser produzidos por conjugação química de dois mAbs diferentes. Contudo, essa abordagem não resulta em preparados homogêneos.

[005]0utras abordagens empregadas previamente incluem o acoplamento de dois anticorpos parentais com um agente de ligação cruzada hetero-bifuncional, a produção de moléculas de Fv de cadeia única tandem, díabodíes, díabodíes biespecíficos, diabodies de cadeia única e de di-diabodies. No entanto, todas essas abordagens possuem desvantagens. Além disso, foi descrita a construção de um anticorpo multivalente compreendendo duas repetições de Fab na cadeia pesada de uma IgG e capaz de se ligar a quatro moléculas de antígenos (ver a Publicação PCT N2 WO 0177342 e Miller et al. (2003) J. Immunol.170(9): 4854-61).

[006]Sistemas de ligante-receptor foram desenvolvidos em conjunto para manter a especificidade. A interação entre os dois ativa uma sinalização específica para uma determinada atividade biológica. Contudo, proteínas de ligação que não são do tipo ligante-receptor, como anticorpos monoespecíficos, proteínas de ligação bi ou multiespecíficas, combinações não competitivas de anticorpos ou outras proteínas receptoras de ligação a um domínio extracelular (ECD) de um receptor podem reconhecer epítopos distintos de um sítio de ligação ao receptor. A ligação a tais epítopo(s) distinto(s) no ECD de um receptor pode transduzir alterações conformacionais ao domínio intracelular, o que pode resultar em uma nova cascata de sinalização inesperada.

[007]A Patente US N2 7 612 181 (cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente) provê uma nova família de proteínas de ligação capazes de se ligar a dois ou mais antígenos com alta afinidade, que são denominadas proteínas de ligação com domínio variável duplo (proteína de ligação DVD) ou imunoglobulinas de domínio variável duplo (DVD-lg™). As moléculas DVDs são proteínas duplo-específicas tetravalentes semelhantes à lg, capazes de se ligarem a dois epítopos distintos na mesma molécula ou em duas moléculas diferentes simultaneamente. As DVDs são proteínas de ligação únicas, compostas por dois domínios variáveis fundidos ao N-terminal de um anticorpo bivalente. Os domínios variáveis podem ser fundidos diretamente um ao outro ou conectados via ligadores peptídicos sintéticos de comprimento e composição de aminoácidos variados. É possível construir DVDs com domínios Fc intactos e funcionais que lhes possibilitam depois mediar funções efetoras apropriadas. O formato de DVD, graças à sua flexibilidade de escolha do par de anticorpos, à orientação de dois domínios de ligação a antígenos e ao comprimento do ligador que os une, pode oferecer novas modalidades terapêuticas.

[008]Embora exista na técnica uma variedade de estruturas, algumas com vantagens e desvantagens, são necessárias construções específicas para preparar proteínas de ligação multivalentes com propriedades específicas e para se ligarem a alvos específicos. Adicionalmente, novas sequências de domínios variáveis podem aperfeiçoar ainda mais as propriedades das proteínas de ligação. Especificamente, DVDs melhorados que se ligam a DLL4 e VEGF poderiam revelar-se benéficos. Consequentemente, a presente invenção provê imunoglobulinas de domínio variável duplo, utilizando a cadeia principal da proteína de ligação descrita na Patente US N2 7 612 181 (cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente) e contendo determinadas primeiras e segundas cadeias polipeptídicas, cada uma compreendendo primeiras e segundas sequências de domínios variáveis (p. ex., aquelas listadas na Tabela 2) que formam sítios de ligação funcionais para VEGF e DLL4. Em algumas modalidades, as primeiras e as segundas cadeias polipeptídicas compreendem primeiras e segundas sequências de domínios variáveis que contêm cada uma as três CDRs de uma das sequências listadas na Tabela 2 e formam sítios de ligação funcionais para VEGF e DLL4.

[009]DLL4 é um ligante envolvido na sinalização de célula a célula através da via do receptor Notch. Tal comunicação de célula a célula é necessária para muitos processos biológicos como diferenciação, proliferação e homeostase. A via de sinalização Notch é um sistema utilizado por uma ampla gama de eucariotos. Essa via, especialmente o receptor Notch, é também fundamental para angiogênese funcional em tumores. Assim, inibir a função do receptor Notch, bloquear o receptor Notch e/ou bloquear a via de sinalização Notch são estratégias potenciais para composições e terapias contra o câncer. Pequenas moléculas inibidoras do receptor Notch muitas vezes demonstraram que são tóxicas por suprimirem a expressão do tipo selvagem (normal) em tecidos de receptores Notch por todo o corpo. Assim, membros diferentes da via de sinalização Notch devem ser considerados alvos potenciais para agentes terapêuticos. Um ligante na vasculatura para o receptor Notch é o Delta 4 ou Delta-like 4 (DLL4). Com grande expressão na vasculatura, DLL4 é essencial para o desenvolvimento vascular (Yan et aí., Clin. Cancer Res., 13(24): 7243-7246 (2007); Shutter et al., Genes Dev.,14(11): 1313-1318 (2000); Gale et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(45): 15949-15954 (2004); Krebs et al., Genes Dev., 14(11): 1343-1352 (2000)). Camundongos heterozigotos para DLL4 são letais embrionariamente em decorrência de defeitos importantes no desenvolvimento vascular (Gale et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(45): 15949-15954 (2004); Duarte et al., Genes Dev., 18(20): 2474-2478 (2004); Krebs et al., Genes Dev., 18(20): 2469-2473 (2004)).

[010]A expressão de DLL4 pode ser induzida por VEGF (Liu et al., Mol. Cell Biol.,23(1): 14-25 (2003); Lobov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104(9): 3219- 3224 (2007)). VEGF é uma proteína de sinalização produzida por células envolvidas na angiogênese. Adicionalmente, DLL4 pode regular negativamente a sinalização de VEGF, em parte pela repressão de VEGFR2 e indução de VEGR1 (Harrington et al., Microvasc. Res., 75(2): 144-154 (2008); Suchting et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104(9): 3225-3230 (2007)). A coordenação perfeita entre DLL4 e VEGF é essencial para a angiogênese funcional, tornando tanto DLL4 e VEGF alvos potenciais para intervenção terapêutica.

[011]Além da sua função fisiológica, DLL4 e VEGF são também regulados positivamente em vasos sanguíneos tumorais (Gale et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(45): 15949-15954 (2004); Mailhos et al., Differentiation,69(2-3): 135-144 (2001); Patel et al., Cancer Res., 65(19): 8690-8697 (2005); Patel et al., Clin. Cancer Res.,12(16): 4836-4844 (2006); Noguera-Troise et al., Nature,444(7122): 1032- 1037 (2006)). O bloqueio de DLL4 demonstrou inibir o crescimento de tumores primários em múltiplos modelos (Noguera-Troise et al., Nature,444(7122): 1032- 1037 (2006); Ridgway et al., Nature,444(7122): 1083-1087 (2006); Scehnet et al., Blood,109(11): 4753-4760 (2007)). A inibição de DLL4 é até mesmo eficaz contra tumores que são resistentes à terapia anti-VEGF. Assim, a inibição combinada de DLL4 e de VEGF poderia proporcionar uma terapia antitumoral incrementada. Curiosamente, ao contrário da inibição de VEGF que reduz a formação de vasos tumorais, o bloqueio de DLL4 aumenta a densidade vascular tumoral, em que os vasos são anormais, não sustentam o transporte sanguíneo eficiente, nem são funcionais efetivamente. Assim, desorganizar a via de VEGF e de DLL4 representam métodos de ação diferentes para o tratamento potencial contra o câncer.

[012]Embora anticorpos e várias construções de ligação sejam conhecidos na técnica, há ainda necessidade de melhorar o direcionamento e a eficiência de ligação a VEGF e DLL4, p. ex., para tratar câncer e tumorigênese. Há, portanto, necessidade na técnica de proteínas de ligação multivalentes melhoradas capazes de se ligar a DLL4 e VEGF. Consequentemente, são novas proteínas de ligação, em que as proteínas de ligação são capazes de se ligar a DLL4 e VEGF. Em algumas modalidades, as proteínas de ligação são capazes de, p. ex., se ligar a DLL4 e VEGF com afinidade de ligação e/ou potência de neutralização melhorada.

[013]São providas proteínas de ligação capazes de ser direcionadas para dois epítopos, em que as proteínas de ligação são capazes de se ligar a DLL4 e VEGF. Em uma modalidade, são providas proteínas de ligação capazes de se ligar a epítopos de DLL4 e VEGF com alta afinidade. Em uma modalidade, as proteínas de ligação compreendem um arcabouço (framework)de proteína de ligação com domínio variável duplo que contém as sequências de CDR e de domínios variáveis listadas na Tabela 2. Em uma modalidade, o arcabouço de proteína de ligação com domínio variável duplo compreende o arcabouço descrito na Patente US N2 7 612 181 (cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente).

[014]Em uma modalidade, são providas proteínas de ligação compreendendo uma cadeia polipeptídica que pode ligar-se a dois epítopos de duas proteínas diferentes (VEGF e DLL4), em que a cadeia polipeptídica compreende VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, em que VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 é um segundo domínio variável, C é um domínio constante, X1 representa um aminoácido ou polipeptídeo, X2 representa uma região Fc e n é 0 ou 1. Em algumas modalidades, o VD1 e o VD2 na proteína de ligação são domínios variáveis de cadeia pesada. Em certas modalidades, VD1 e VD2 são capazes de se ligar a um epítopo de DLL4 e a um epítopo de VEGF. Em algumas modalidades, C é um domínio constante de cadeia pesada, tal como CH1. Em certas modalidades, X1 é um ligador com a condição de que X1 não seja CH1.

[015]Em várias modalidades, a proteína de ligação aqui descrita compreende uma cadeia polipeptídica que se liga a um epítopo de DLL4 e a um epítopo de VEGF, em que a cadeia polipeptídica compreende VD1-(X1)n-VD2-C- (X2)n, em que VD1 compreende um primeiro domínio variável de cadeia pesada, VD2 compreende um segundo domínio variável de cadeia pesada, C compreende um domínio constante de cadeia pesada, X1 compreende um ligador e X2 compreende uma região Fc. Em uma modalidade, X1 é um ligador com a condição de que não seja CH1. Em uma modalidade, os domínios variáveis de cadeia pesada VD1 e VD2 compreendem cada três CDRs escolhidas a partir das CDRs nas SEQ ID NO: 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51 ou 53 (ou seja, CDRs 1-3 de uma daquelas SEQ ID NOs), em que ao menos um dos domínios variáveis de cadeia pesada VD1 e/ou VD2 compreende as três CDRs na SEQ ID NO: 39. Em outra modalidade, a proteína de ligação é capaz de se ligar a DLL4 e VEGF. Em uma modalidade, os domínios variáveis de cadeia pesada VD1 e VD2 compreendem as SEQ ID NO: 39, 41,43, 45, 47, 49, 51 ou 53, em que ao menos um dos domínios variáveis de cadeia pesada VD1 e/ou VD2 compreende a SEQ ID NO: 39.

[016]Em várias modalidades, a proteína de ligação aqui descrita compreende uma cadeia polipeptídica que se liga a um epítopo de DLL4 e a um epítopo de VEGF, em que a cadeia polipeptídica compreende VD1-(X1)n-VD2-C- (X2)n, em que VD1 compreende um primeiro domínio variável de cadeia leve, VD2 compreende um segundo domínio variável de cadeia leve, C compreende um domínio constante de cadeia leve, X1 compreende um ligador e X2 não compreende uma região Fc. Em uma modalidade, X1 é um ligador com a condição de que não seja CH1 ou CL. Em uma modalidade, os domínios variáveis de cadeia leve VD1 e VD2 compreendem cada três CDRs escolhidas a partir de CDRs nas SEQ ID NO: 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52 ou 54 (ou seja, CDRs 1-3 de uma daquelas SEQ ID NOs), em que ao menos um dos domínios variáveis de cadeia leve VD1 e/ou VD2 compreende as três CDRs na SEQ ID NO: 40. Em outra modalidade, a proteína de ligação é capaz de se ligar a DLL4 e VEGF. Em uma modalidade, os domínios variáveis de cadeia leve VD1 e VD2 compreendem cada um as SEQ ID NO: 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52 ou 54, em que ao menos um dos domínios variáveis de cadeia leve VD1 e/ou VD2 compreende a SEQ ID NO: 40.

[017]Em outra modalidade, é descrita uma proteína de ligação que se liga a um epítopo de DLL4 e a um epítopo de VEGF. Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende primeiras e segundas cadeias polipeptídicas, em que cada uma das primeiras e das segundas cadeias polipeptídicas compreende independentemente VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, em que VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 é um segundo domínio variável, C é um domínio constante, X1 é um ligador, X2 é uma região Fc e n é 0 ou 1, em que os domínios VD1 na primeira e na segunda cadeia polipeptídica formam um primeiro sítio de ligação ao alvo funcional e os domínios VD2 na primeira e na segunda cadeia polipeptídica formam um segundo sítio de ligação ao alvo funcional. Em uma modalidade, X2 compreende uma região Fc quando n=1, e X2 não compreende uma região Fc quando n=0. Em algumas modalidades, as sequências de X1 nas primeiras e nas segundas cadeias polipeptídicas são iguais. Em outras modalidades, as sequências de X1 nas primeiras e nas segundas cadeias polipeptídicas são diferentes. Em algumas modalidades X1 em ao menos uma das cadeias polipeptídicas não é um domínio CH1 e/ou um domínio CL. Em uma modalidade, a sequência de X1 é um ligador curto (p. ex., 6, 5, 4, 3 ou 2 aminoácidos). Em outra modalidade, a sequência de X1 é um ligador longo (p. ex., 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 25, 30 ou mais aminoácidos). Em outra modalidade, a sequência de X1 em uma das duas cadeias polipeptídicas é um ligador curto, e a sequência de X1 na outra cadeia polipeptídica é um ligador longo. Em uma modalidade, os domínios variáveis de cadeia pesada VD1 e VD2 compreendem cada três CDRs das SEQ ID NO: 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51 ou 53 (ou seja, CDRs 1-3 de uma daquelas SEQ ID NOs), em que ao menos um dos domínios variáveis de cadeia pesada, VD1 ou VD2, compreende as três CDRs na SEQ ID NO: 39; e os domínios variáveis de cadeia leve VD1 e VD2 compreendem três CDRs das SEQ ID NO: 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52 ou 54 (ou seja, CDRs 1-3 de uma daquelas SEQ ID NOs), em que ao menos um dos domínios variáveis de cadeia leve VD1 e/ou VD2 compreende as três CDRs na SEQ ID NO: 40. Em outra modalidade, a proteína de ligação é capaz de se ligar a DLL4 e VEGF. Em uma modalidade, os domínios variáveis de cadeia pesada VD1 e VD2 compreendem as SEQ ID NO: 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51 ou 53, em que ao menos um dos domínios variáveis de cadeia pesada VD1 e/ou VD2 compreende a SEQ ID NO: 39, e os domínios variáveis de cadeia leve VD1 e VD2 compreendem a SEQ ID NO: 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52 ou 54, em que ao menos um dos domínios variáveis de cadeia leve VD1 e/ou VD2 compreende a SEQ ID NO: 40.

[018]Em várias modalidades, é descrita uma proteína de ligação que é capaz de se ligar a VEGF e DLL4. Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende primeiras e segundas cadeias polipeptídicas, em que cada uma das primeiras e segundas cadeias polipeptídicas compreende independentemente VD1- (X1)n-VD2-C-(X2)n, em que VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 é um segundo domínio variável, C é um domínio constante, X1 é um ligador, X2 é uma região Fc, e n é 0 ou 1, em que os domínios VD1 na primeira e na segunda cadeia polipeptídica formam um primeiro sítio de ligação ao alvo funcional e os domínios VD2 na primeira e na segunda cadeia polipeptídica formam um segundo sítio de ligação ao alvo funcional. Em uma modalidade, os domínios variáveis que formam um sítio de ligação ao alvo funcional para VEGF compreendem três CDRs da SEQ ID NO: 41 e três CDRs da SEQ ID NO: 42 (p. ex., CDRs 1-3 da SEQ ID NO: 41 e CDRs 1-3 da SEQ ID NO: 42 presentes em cadeias separadas, com as CDRs em cada cadeia dispostas na ordem especificada e separadas por sequências de arcabouço adequadas para formar um sítio de ligação funcional). Em uma modalidade, os domínios variáveis que formam um sítio de ligação ao alvo funcional para DLL4 compreendem três CDRs da SEQ ID NO: 39 e três CDRs da SEQ ID NO: 40 (p. ex., CDRs 1-3 da SEQ ID NO: 39 e CDRs 1-3 da SEQ ID NO: 40 presentes em cadeias separadas, com as CDRs em cada cadeia dispostas na ordem especificada e separadas por sequências de arcabouço adequadas para formar um sítio de ligação funcional). Em uma modalidade, a proteína de ligação compreende um sítio de ligação ao alvo funcional para VEGF incluindo três CDRs da SEQ ID NO: 41 e três CDRs da SEQ ID NO: 42 (p. ex., CDRs 1-3 da SEQ ID NO: 41 e CDRs 1-3 da SEQ ID NO: 42), e um sítio de ligação ao alvo funcional para DLL4 incluindo três CDRs da SEQ ID NO: 39 e três CDRs da SEQ ID NO: 40 (p. ex., CDRs 1-3 da SEQ ID NO: 39 e CDRs 1-3 da SEQ ID NO: 40). Em uma modalidade, a proteína de ligação compreende um sítio de ligação ao alvo funcional para VEGF incluindo a SEQ ID NO: 41 e a SEQ ID NO: 42, e um sítio de ligação ao alvo funcional para DLL4 incluindo a SEQ ID NO: 39 e a SEQ ID NO: 40. Em uma modalidade, a proteína de ligação compreende uma primeira cadeia polipeptídica incluindo a SEQ ID NO: 56 e uma segunda cadeia polipeptídica incluindo a SEQ ID NO: 64. Em uma modalidade, a proteína de ligação compreende uma primeira cadeia polipeptídica incluindo a SEQ ID NO: 73 e uma segunda cadeia polipeptídica incluindo a SEQ ID NO: 74. Em algumas modalidades, os domínios variáveis que formam um sítio de ligação para DLL4 compreendem aqueles da Publicação do Pedido de Patente US N2 20110217237, e/ou os domínios variáveis que formam um sítio de ligação para VEGF compreendem aqueles da Publicação do Pedido de Patente US N2 20100076178, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente. Em uma modalidade, a proteína de ligação compreende h1A11,1-SL-Av. Em uma modalidade, a proteína de ligação h1A11.1- SL-Av compreende uma região Fc de um mutante LALA de lgG1 humana.

[019]O desenvolvimento e a produção de uma proteína de ligação adequada ao uso como agente terapêutico humano, p. ex., como agente anticâncer/antitumoral, podem requerer mais do que a identificação de uma proteína de ligação capaz de se ligar a um alvo ou alvos desejados. Por exemplo, um candidato pode ligar-se a seu(s) alvo(s), mas exibir capacidade reduzida para inibir ou neutralizar seu alvo desejado, pode demonstrar ser difícil para formulação estável, pode exibir propriedades farmacocinéticas indesejáveis ou pode demonstrar ser difícil para a produção em um sistema de expressão adequado (p. ex., a expressão em uma célula hospedeira como CHO). Assim, os fatores a considerar no desenvolvimento de um agente terapêutico adequado incluem, entre outros, (a) a cinética de ligação (taxa de associação, taxa de dissociação e afinidade) para domínios de ligação a antígenos internos e externos, (b) potências em vários bioensaios bioquímicos e celulares, (c) eficácias in vivo em modelos tumorais relevantes, (d) propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas, (e) facilidade de fabricação, incluindo nível de expressão proteica em linhagens celulares selecionadas, capacidade para produção em escala, modificação pós-tradução, propriedades físico-químicas como porcentagem de monômeros, solubilidade e estabilidade (intrínseca, congelamento/descongelamento, estabilidade no armazenamento, etc.), (f) propriedades de formulação, (g) risco potencial de imunogenicidade e (h) propriedades toxicológicas de uma molécula. O modo e a valência da ligação podem também ser avaliados, pois estes podem afetar as propriedades de ligação e as potências celulares de uma molécula. Para algumas proteínas de ligação, até mesmo pequenas alterações nas sequências de aminoácidos dos domínios variáveis, dos domínios constantes e/ou dos ligadores podem potencialmente gerar um impacto (positivo ou negativo) sobre um ou mais desses fatores, e, assim, a combinação de fatores pode ser avaliada para a seleção de um candidato de primeira linha. Uma vez identificado um candidato de primeira linha, avaliações posteriores in vivo de propriedades terapêuticas são conduzidas, inclusive a avaliação de segurança, eficácia e potência em animais e seres humanos.

[020]Foi descoberto, inesperadamente, que uma proteína de ligação compreendendo a SEQ ID NO: 56 e a SEQ ID NO: 64, ou compreendendo a SEQ ID NO: 73 e a SEQ ID NO: 74 exibia uma combinação superior de propriedades a esse respeito, tais como cinética de ligação (ou seja, constante de dissociação) ultrapassando um limiar terapeuticamente útil, capacidade aperfeiçoada de neutralização, eficácia in vivo incrementada, capacidade superior de formulação, padrão desejável de glicosilação, perfil farmacocinético favorável e expressão eficiente em células hospedeiras, quando comparada a outras proteínas de ligação avaliadas que compreendiam sequências diferentes de domínios variáveis e/ou de ligadores. As proteínas de ligação comparadas podem incluir aquelas com as mesmas sequências e orientações de domínios variáveis, porém com ligadores diferentes, bem como aquelas com orientações alteradas dos domínios de ligação e/ou outras sequências de domínios variáveis (p. ex., sequências maturadas para afinidade, sequências humanas completas, etc.). Em algumas modalidades, essas propriedades superiores são dependentes da seleção de determinadas sequências de domínios variáveis (p. ex., SEQ ID NOs: 39-42), determinadas orientações dos domínios de ligação a VEGF e DLL4 nas posições internas e externas (p. ex., as orientações fornecidas na SEQ ID NO: 56 e na SEQ ID NO: 64), determinadas sequências de ligadores (p. ex., os domínios variáveis de cadeia pesada e a sequência curta do ligador utilizados na SEQ ID NO: 56 e os domínios variáveis de cadeia leve e a sequência longa do ligador utilizados na SEQ ID NO: 64) e/ou determinadas sequências do domínio constante (p. ex., as sequências do domínio constante utilizadas nas SEQ ID NOs: 73 e 74). Em algumas modalidades, a simples mudança da sequência do ligador pode ter um impacto significativo sobre as propriedades funcionais. Por exemplo, selecionar a sequência do ligador utilizada na SEQ ID NO: 73 e 74 (juntamente com os domínios variáveis e constante incluídos naquelas SEQ ID NOs) pode proporcionar uma melhora inesperada nas propriedades terapêuticas da proteína de ligação. Por exemplo, a Tabela 9 demonstra os efeitos de diferentes sequências de ligadores sobre a eficácia antitumoral in vivo, conforme medida em modelos de xenoenxertos de adenocarcinoma colorretal e glioblastoma. Dessa forma, por exemplo, utilizar as sequências em SEQ ID NOs: 56 e 64, ou em SEQ ID NOs: 73 e 74 (incluindo as sequências do ligador nelas contidas) pode produzir um ganho inesperado na eficácia antitumoral in vivo.

[021]Em várias modalidades, uma proteína de ligação aqui descrita exibe uma desejada afinidade de ligação, capacidade de bloqueio e/ou potência de neutralização para VEGF e/ou DLL4, por exemplo, níveis aproximadamente comparáveis àqueles observados para anticorpos contra VEGF (p. ex., AVASTIN®) ou DLL4 (p. ex., anticorpo h1A11.1). Em algumas modalidades, a proteína de ligação exibe maior afinidade, capacidade de bloqueio e/ou potência de neutralização para VEGF e/ou DLL4, quando comparada a proteínas de ligação DVD-lg compreendendo outras sequências de domínios variáveis ou de ligadores. Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende um sítio de ligação ao alvo funcional para VEGF compreendendo três CDRs da SEQ ID NO: 41 e três CDRs da SEQ ID NO: 42, e um sítio de ligação ao alvo funcional para DLL4 compreendendo três CDRs da SEQ ID NO: 39 e três CDRs da SEQ ID NO: 40; ou compreende um sítio de ligação ao alvo funcional para VEGF compreendendo a SEQ ID NO: 41 e a SEQ ID NO: 42, e um sítio de ligação ao alvo funcional para DLL4 compreendendo a SEQ ID NO: 39 e a SEQ ID NO: 40; ou compreende a SEQ ID NO: 56 e a SEQ ID NO: 64; ou compreende a SEQ ID NO: 73 e a SEQ ID NO: 74. Por exemplo, a proteína de ligação (p. ex., a proteína de ligação compreendendo a SEQ ID NO: 56 e a SEQ ID NO: 64, ou compreendendo a SEQ ID NO: 73 e a SEQ ID NO: 74) pode ser capaz de se ligar a VEGF com uma constante de dissociação (KD) de no máximo aproximadamente 7,0 x 1O’10 M, conforme medido por ressonância plasmônica de superfície, e/ou de bloquear a atividade de VEGF com uma IC50 de no máximo aproximadamente 3,8 nM, conforme medido em um ensaio ELISA de Competição por VEGFR1; e/ou capaz de se ligar a DLL4 com uma constante de dissociação (KD) de no máximo aproximadamente 1,0 x 10‘8 M, conforme medido por ressonância plasmônica de superfície, e/ou de bloquear a atividade de DLL4 com uma IC50 de no máximo aproximadamente 1,09 nM, conforme um ensaio ELISA de Competição por Notch.

[022]Em algumas modalidades, a proteína de ligação (p. ex., a proteína de ligação compreendendo a SEQ ID NO: 56 e a SEQ ID NO: 64, ou compreendendo a SEQ ID NO: 73 e a SEQ ID NO: 74) pode exibir potência de neutralização aumentada para DLL4 quando também na presença de VEGF, em comparação a uma mistura de anticorpos contra VEGF e DLL4 (p. ex., os anticorpos parentais utilizados para prover os domínios variáveis à proteína de ligação). Em algumas modalidades, a proteína de ligação pode exibir uma ordem de magnitude de aumento na potência de neutralização para DLL4 quando também na presença de VEGF, em comparação a uma mistura de anticorpos contra VEGF e DLL4 (p. ex., os anticorpos parentais utilizados para prover os domínios variáveis à proteína de ligação). Por exemplo, a Tabela 24 demonstra que uma proteína de ligação compreendendo a SEQ ID NO: 73 e a SEQ ID NO: 74 pode exibir uma ordem de magnitude de aumento na potência de neutralização para DLL4 quando também na presença de VEGF a pelo menos aproximadamente 1,2 nM (p. ex., pelo menos aproximadamente 1,2; 1,5; 2; 2,5; 5; 10; 50; 150 ou mais), em comparação a uma mistura de anticorpos contra VEGF e DLL4 (p. ex., os anticorpos parentais utilizados para prover os domínios variáveis à proteína de ligação). Essa propriedade de neutralização de DLL4 pode ser benéfica porque, na situação in vivo de tratamento para um tumor, os níveis de VEGF são habitualmente mais altos nas proximidades de um tumor do que na circulação em geral, possibilitando direcionamento melhorado e atividade funcional incrementada de neutralização de DLL4 no sítio tumoral.

[023]Em várias modalidades, uma proteína de ligação (p. ex., a proteína de ligação compreendendo a SEQ ID NO: 56 e a SEQ ID NO: 64, ou compreendendo a SEQ ID NO: 73 e a SEQ ID NO: 74) exibe propriedades melhoradas, p. ex., segurança melhorada, estabilidade aumentada, maior potência, inflamação ou resposta imune reduzida ou outras propriedades terapêuticas humanas in vivo, quando comparada a outros tratamentos para cânceres e/ou tumores vascularizados. Os tratamentos adequados para comparação podem incluir a administração de uma pequena molécula como agente anticâncer ou um anticorpo contra VEGF (p. ex., AVASTIN®) e/ou DLL4 (p. ex., anticorpo h1 A11.1), ou uma proteína de ligação DVD-lg compreendendo outras sequências de domínios variáveis e/ou ligadores. Em algumas modalidades, a proteína de ligação exibe propriedades melhoradas sobre um tratamento atual do padrão de cuidados para câncer e/ou um tumor vascularizado. Por exemplo, a proteína de ligação pode exibir cinética de ligação melhorada, eficácia terapêutica in vivo superior, capacidade de formulação aperfeiçoada (inclusive agregação reduzida e estabilidade melhorada no armazenamento), farmacocinética melhorada, inflamação ou resposta imune reduzida e/ou níveis incrementados de expressão em células hospedeiras.

[024]Em algumas modalidades, uma proteína de ligação (p. ex., a proteína de ligação compreendendo a SEQ ID NO: 56 e a SEQ ID NO: 64, ou compreendendo a SEQ ID NO: 73 e a SEQ ID NO: 74) exibe efeitos superiores (p. ex., aditivos e/ou superaditivos) em combinação com um ou mais agentes anticâncer, quando comparada a um anticorpo anti-VEGF ou um anticorpo anti-DLL4 em combinação com um ou mais agentes anticâncer, ou quando comparada a uma proteína de ligação DVD-lg compreendendo outras sequências de domínios variáveis e/ou ligadores em combinação com uma ou mais agentes anticâncer. Por exemplo, as propriedades superiores de ligação podem ser aquelas identificadas nas Tabelas 27-30 e 34. Por exemplo, a proteína de ligação pode exibir pelo menos aproximadamente 50% ou mais (p. ex., 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150% ou mais) de inibição do crescimento tumoral ou retardo no crescimento tumoral após administração isolada ou em combinação com um ou mais agentes anticâncer, quando comparado a um tumor não tratado. O agente anticâncer pode ser, por exemplo, um ou mais entre Irinotecano, FOLFIRI, Temozolomida, Gencitabina, Paclitaxel, 5-FU e Capecitabina, ou qualquer outra pequena molécula ou agente biológico utilizado no tratamento de um determinado câncer. A proteína de ligação isoladamente ou em combinação com um ou mais agentes anticâncer pode ser utilizada como medicamento para tratar, p. ex., câncer de cólon, glioblastoma, câncer pancreático ou câncer de mama.

[025]Em uma modalidade, uma proteína de ligação com Domínio Variável Duplo (DVD-lg) compreende duas primeiras e duas segundas cadeias polipeptídicas como descrito no parágrafo anterior (ou seja, compreendendo quatro cadeias polipeptídicas), em que cada uma das cadeias polipeptídicas independentemente compreende VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, em que VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 é um segundo domínio variável, C é um domínio constante, X1 é um ligador, X2 é uma região Fc e n é 0 ou 1. Em algumas modalidades, a primeira cadeia é uma cadeia pesada e está pareada com uma segunda cadeia que é uma cadeia leve. Tal proteína de ligação DVD-lg compreende quatro sítios funcionais de ligação ao alvo. Em algumas modalidades, o ligador X1 na primeira e na segunda cadeia polipeptídica são iguais ou diferentes. Em algumas modalidades, as proteínas de ligação DVD-lg compreendem pelo menos duas sequências de domínios variáveis (p. ex., VD1 e VD2) capazes de se ligar a dois ou mais epítopos (p. ex., dois, três ou quatro) da mesma ou de proteínas diferentes, em qualquer orientação. Em algumas modalidades, VD1 e VD2 são escolhidos independentemente. Em uma modalidade, os domínios variáveis de cadeia pesada VD1 e VD2 compreendem cada três CDRs das SEQ ID NO: 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51 ou 53, em que ao menos um dos domínios variáveis de cadeia pesada VD1 e/ou VD2 compreende as três CDRs na SEQ ID NO: 39, e os domínios variáveis de cadeia leve VD1 e VD2 compreendem três CDRs das SEQ ID NO: 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52 ou 54, em que ao menos um dos domínios variáveis de cadeia leve VD1 e/ou VD2 compreende as três CDRs na SEQ ID NO: 40. Em outra modalidade, a proteína de ligação é capaz de se ligar a DLL4 e VEGF. Em uma modalidade, os domínios variáveis de cadeia pesada VD1 e VD2 compreendem cada a SEQ ID NO: 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51 ou 53, em que ao menos um dos domínios variáveis de cadeia pesada VD1 e/ou VD2 compreende a SEQ ID NO: 39, e os domínios variáveis de cadeia leve VD1 e VD2 compreendem cada a SEQ ID NO: 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52 ou 54, em que ao menos um dos domínios variáveis de cadeia leve VD1 e/ou VD2 compreende a SEQ ID NO: 40.

[026]Em outra modalidade, uma proteína de ligação com Domínio Variável Duplo compreende uma sequência de cadeia pesada e uma de cadeia leve como mostrada na Tabela 2, em que ao menos um dos domínios variáveis de cadeia pesada VD1 e/ou VD2 compreende a SEQ ID NO: 39 e/ou ao menos um dos domínios variáveis de cadeia leve VD1 e/ou VD2 compreende a SEQ ID NO: 40.

[027]Em uma modalidade adicional, qualquer uma das modalidades de cadeia pesada, cadeia leve, duas cadeias ou quatro cadeias inclui pelo menos um ligador X1 compreendendo os ligadores selecionados a partir de SEQ ID NO: 1-38. Em uma modalidade, X2 é uma região Fc. Em outra modalidade, X2 é uma região Fc variante.

[028]Em ainda outra modalidade, a região Fc, se presente no primeiro polipeptídeo, é uma região Fc de sequência nativa ou uma região Fc de sequência variante. Em ainda outra modalidade, a região Fc é uma região Fc de uma lgG1, uma região Fc de uma lgG2, uma região Fc de uma lgG3, uma região Fc de uma lgG4, uma região Fc de uma IgA, uma região Fc de uma IgM, uma região Fc de uma IgE ou uma região Fc de uma IgD. Em certas modalidades, a região Fc é uma região Fc de um mutante LALA de lgG1 humana, que é um mutante do anticorpo b12 que oferece proteção contra o vírus HIV.

[029]Um método para criar uma proteína de ligação que se liga a duas proteínas-alvo é provido. Em uma modalidade, o método para criar uma proteína de ligação compreende as etapas de a) obter um primeiro anticorpo original (parent),ou sua porção de ligação a antígeno, que se liga a um primeiro epítopo; b) obter um segundo anticorpo original, ou sua porção de ligação a antígeno, que se liga a um segundo epítopo; c) preparar construção(ões) que codificam qualquer uma das proteínas de ligação aqui descritas; e d) expressar as cadeias polipeptídicas, de tal modo que seja gerada uma proteína de ligação se liga ao primeiro e ao segundo epítopo.

[030]Em qualquer um das presentes modalidades, o domínio variável de cadeia pesada VD1, se presente, e o domínio variável de cadeia leve VD1, se presente, pode ser de um primeiro anticorpo original, ou sua porção de ligação a antígeno; o domínio variável de cadeia pesada VD2, se presente, e o domínio variável de cadeia leve VD2, se presente, pode ser de um segundo anticorpo original, ou sua porção de ligação a antígeno. O primeiro e o segundo anticorpo original podem ser iguais ou diferentes.

[031]Em uma modalidade, O primeiro anticorpo original, ou sua porção de ligação a antígeno, liga-se a um primeiro antígeno, e o segundo anticorpo original, ou sua porção de ligação a antígeno, liga-se a um segundo antígeno. Em uma modalidade, o primeiro e o segundo antígeno são antígenos diferentes. Em outra modalidade, o primeiro anticorpo original, ou sua porção de ligação a antígeno, liga- se ao primeiro antígeno com uma potência diferente da potência com que o segundo anticorpo original ou sua porção de ligação a antígeno liga-se ao segundo antígeno. Em ainda outra modalidade, o primeiro anticorpo original ou sua porção de ligação a antígeno liga-se ao primeiro antígeno com uma afinidade diferente da afinidade com que o segundo anticorpo original ou sua porção de ligação a antígeno liga-se ao segundo antígeno.

[032]Em outra modalidade, o primeiro anticorpo original, ou sua porção de ligação a antígeno, e o segundo anticorpo original, ou sua porção de ligação a antígeno, são um anticorpo humano, anticorpo com CDR enxertada, anticorpo humanizado e/ou anticorpo com maturação de afinidade.

[033]Em outra modalidade, a proteína de ligação possui ao menos uma propriedade desejada exibida pelo primeiro anticorpo original ou sua porção de ligação a antígeno, ou pelo segundo anticorpo original ou sua porção de ligação a antígeno. Alternativamente, o primeiro anticorpo original ou sua porção de ligação a antígeno e o segundo anticorpo original ou sua porção de ligação a antígeno possuem ao menos uma propriedade desejada exibida pela proteína de ligação. Em uma modalidade, a propriedade desejada é um ou mais parâmetros de anticorpos. Em outra modalidade, os parâmetros do anticorpo são especificidade pelo antígeno, afinidade para o antígeno, potência, função biológica, reconhecimento de epítopo, estabilidade, solubilidade, eficiência de produção, imunogenicidade, farmacocinética, biodisponibilidade, reatividade cruzada em tecidos, ou ligação a antígeno ortólogo. Em uma modalidade, a proteína de ligação é multivalente. Em outra modalidade, a proteína de ligação é multiespecífica. As proteínas de ligação multivalentes e multiespecíficas aqui descritas são dotadas de propriedades desejáveis especialmente de um ponto de vista terapêutico. Por exemplo, a proteína de ligação multivalente e/ou multiespecífica pode (1) ser internalizada (e/ou catabolizada) mais rápido do que um anticorpo bivalente por uma célula que expressa um antígeno ao qual se ligam os anticorpos; (2) ser uma proteína de ligação agonista; e/ou (3) induzir morte celular e/ou apoptose de uma célula que expressa um antígeno ao qual a proteína de ligação multivalente é capaz de se ligar. O “anticorpo original”, que fornece ao menos uma especificidade de ligação pelo antígeno da proteína de ligação multivalente ou multiespecífica, pode ser aquele que é internalizado (e/ou catabolizada) por uma célula que expressa um antígeno ao qual o anticorpo se liga; e/ou pode ser um anticorpo agonista, indutor de morte celular e/ou indutor de apoptose, e a proteína de ligação multivalente ou multiespecífica como aqui descrita pode exibir melhora(s) em uma ou mais dessas propriedades. Além disso, o anticorpo original pode não dispor de qualquer uma ou mais dessas propriedades, porém pode adquirir uma ou mais destas quando construído como uma proteína de ligação multivalente como aqui descrita.

[034]Em outra modalidade, a proteína de ligação possui uma constante para a taxa de associação (Kon) a um ou mais alvos de pelo menos aproximadamente 102 M’1s’1; pelo menos aproximadamente 103 M’1s’1; pelo menos aproximadamente 104 M'1s'1; pelo menos aproximadamente 105 M’1s’1; ou pelo menos aproximadamente 106 M’1s’1, conforme medido por ressonância plasmônica de superfície. Em uma modalidade, a proteína de ligação possui uma constante para a taxa de associação (Kon) a um ou mais alvos de aproximadamente 102M’1s’1 a aproximadamente 103M’ 1s’1; de aproximadamente 103 M’1s’1 a aproximadamente 104 M’1s’1; de aproximadamente 104M’1s’1 a aproximadamente 105M’1s‘1; ou de aproximadamente 105 M'1s'1 a aproximadamente 106 M-1s‘1, conforme medido por ressonância plasmônica de superfície.

[035]Em outra modalidade, a proteína de ligação possui uma constante para a taxa de dissociação (Koff) de um ou mais alvos de no máximo aproximadamente 10'2s‘1; no máximo aproximadamente 10’3s’1; no máximo aproximadamente 10’4s‘1; no máximo aproximadamente 10-5 s-1; ou no máximo aproximadamente 10'6 s-1, conforme medido por ressonância plasmônica de superfície. Em uma modalidade, a proteína de ligação possui uma constante para a taxa de dissociação (Koff) de um ou mais alvos de aproximadamente 10-2 s-1 a aproximadamente 10‘3s-1; de aproximadamente 10'3s-1 a aproximadamente 10’4s-1; de aproximadamente 10’4s-1 a aproximadamente 10‘5s-1; ou de aproximadamente 10‘5s’1 a aproximadamente 10’6s_ 1, conforme medido por ressonância plasmônica de superfície.

[036]Em outra modalidade, a proteína de ligação possui uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) de um ou mais alvos de no máximo aproximadamente 10‘7M; no máximo aproximadamente 10-8M; no máximo aproximadamente 10-9M; no máximo aproximadamente 10-1°M; no máximo aproximadamente 10-11 M; ou no máximo aproximadamente 10-12 M. Em uma modalidade, a proteína de ligação possui uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) de seus alvos de aproximadamente 10-7M a aproximadamente 10’8M; de aproximadamente 10-8M a aproximadamente 10’9M; de aproximadamente 10'9M a aproximadamente 10’1°M; de aproximadamente 10’1°M a aproximadamente 10’11 M; ou de aproximadamente 10’11 M a aproximadamente 10-12M.

[037]Em algumas modalidades, uma proteína de ligação anti-DLL4/anti- VEGF exibe potência aumentada (p. ex., maior capacidade para interferir, inibir e/ou neutralizar a atividade de DLL4 e/ou VEGF) quando comparada a um anticorpo anti- DLL4 ou anti-VEGF. Em algumas modalidades, a potência da proteína de ligação pode ser avaliada em qualquer ensaio que avalie a atividade de VEGF e/ou DLL4, p. ex., um ensaio ELISA de ligação de VEGF e/ou DLL4, um ensaio BIACORE™, um ensaio repórter de DLL4-Notch, um ensaio de proliferação/sobrevida de células endoteliais estimuladas por VEGF ou qualquer outro ensaio conhecido pelo técnico no assunto. Em algumas modalidades, a proteína de ligação exibe potência aumentada contra DLL4 na presença de VEGF.

[038]Em outra modalidade, é provido um conjugado, compreendendo qualquer uma das proteínas de ligação aqui descritas e compreendendo ainda um agente. Em uma modalidade, o agente é uma molécula de imunoadesão, um agente de imagem, um agente terapêutico ou um agente citotóxico. Em uma modalidade, o agente de imagem é um radiomarcador, uma enzima, um marcador fluorescente, um marcador luminescente, um marcador bioluminescente, um marcador magnético ou biotina. Em outra modalidade, o radiomarcador é 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111 In, 125l, 1311, 177Lu, 166Ho ou 153Sm. Em ainda outra modalidade, o agente terapêutico ou citotóxico é um antimetabólito, um agente alquilante, um antibiótico, um fator de crescimento, uma citocina, um agente antiangiogênico, um agente antimitótico, uma antraciclina, toxina ou um agente apoptótico. Em algumas modalidades, o agente é um ou mais entre: irinotecano, leucovorina, 5-FU, temozolomida, gencitabina e paclitaxel. Em uma modalidade, o agente é irinotecano. Em uma modalidade, o agente é leucovorina. Em uma modalidade, o agente é 5-FU. Em uma modalidade, o agente é irinotecano, leucovorina e 5-FU. Em uma modalidade, o agente é temozolomida. Em uma modalidade, o agente é gencitabina. Em uma modalidade, o agente é paclitaxel.

[039]Em outra modalidade, o conjugado compreende uma proteína de ligação e um fármaco. Em uma modalidade, a proteína de ligação no conjugado compreende primeiras e segundas cadeias polipeptídicas, em que cada uma das primeiras e segundas cadeias polipeptídicas compreende independentemente VD1- (X1)n-VD2-C-(X2)n, em que VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 é um segundo domínio variável, C é um domínio constante, X1 é um ligador e X2 é uma região Fc, em que os domínios VD1 na primeira e na segunda cadeia polipeptídica formam um primeiro sítio de ligação ao alvo funcional e os domínios VD2 na primeira e na segunda cadeia polipeptídica formam um segundo sítio de ligação ao alvo funcional, e em que a proteína de ligação é capaz de se ligar a VEGF e DLL4. Em algumas modalidades, os domínios VD1 e VD2 compreendem CDRs ou sequências de domínios variáveis de qualquer uma das sequências descritas na Tabela 2, pareadas e dispostas para formar sítios de ligação funcionais para VEGF e DLL4. Em uma modalidade, o fármaco no conjugado é selecionado a partir do grupo constituído por um inibidor mitótico, um antibiótico antitumoral, um agente imunomodulador, um vetor para terapia gênica, um agente alquilante, um agente antiangiogênico, um antimetabólitos, um agente contendo boro, um agente quimioprotetor, um hormônio, um agente anti-hormonal, um corticosteroide, um agente terapêutico fotoativo, um oligonucleotídeos, um agente radionuclídeo, um inibidor da topoisomerase, um inibidor de tirosina quinase e um radiossensibilizante. Em outra modalidade, o fármaco é selecionado a partir do grupo constituído por Ixempra, dolastatina 10, dolastatina 15, auristatina E, auristatina PE, monometil auristatina D (MMAD ou derivado da auristatina D), monometil auristatina E (MMAE ou derivado da auristatina E), monometil auristatina F (MMAF ou derivado da auristatina F), auristatina F feπilenodiamina (AFP), auristatina EB (AEB), auristatina EFP (AEFP), ácido 5-benzoilvalérico-AE éster (AEVB), metotrexato, daunorrubiciπa, vincristiπa, maitaπsina, maitansiπol, C-3 ésteres de maitansinol, aπsamitocina P1, aπsamitocina P2, aπsamitocina P3, aπsamitocina P4, docetaxel, paclitaxel, paclitaxel em nanoparticulas, sulfato de vindesina, vincristiπa, vimblastiπa, vinorelbina, actinomicinas, actinomicina D, antramiciπa, chicamicina A, DC-18, mazetramicina, neotram icina A, neotram icina B, protracarcina B, SG2285, sibanom icina, sibiromiciπa, aπtraciclinas, daunorrubiciπa, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, caliqueamicinas, y-i1, N-acetil-y/, PSAG, &i, duocarmicinas, adozelesina, bizelesina e carzelesina, bleom icina, mitom icina, plicam icina, Bacillus Calmette- Guerin (BCG), levamisol, vacinas contra câncer, vacina bivalente recombiπante contra papilomavirus humano (HPV) tipos 16 e 18, vacina quadrivalente recombiπante contra papilomavirus humano (HPV) tipos 6, 11, 16 e 18, sipuleucel-T, citoquinas, hormônio da paratireoide; tiroxiπa; insulina; pró-insulina; relaxina; pró- relaxina; hormônios glicoproteínas como hormônio folículo-estimulante (FSH), hormônio tireoestimulante (TSH) e hormônio luteinizante (LH), fator de crescimento hepático; fator de crescimento de fibroblastos, prolactina, lactogênio placentário, fator de necrose tumoral, substância inibidora mulleriana, peptídeo associado à gonadotrofina de camundongo, inibina, activina, fator de crescimento endotelial vascular, integrina, trombopoietina (TPO), fatores de crescimento neurais como NGF, fator de crescimento plaquetário, fatores transformadores de crescimento (TGFs), fator de crescimento I e II semelhante à insulina, eritropoietina (EPO), fatores osteoiπdutores, interferons como interferon oc, β e y, fatores estimulantes de colônias (CSFs), C-SF de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) e CSF de granulócitos (G-CSF), interleucinas (ILs) como IL-1, IL-1oc, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL- 9, IL-11, IL-12, fator de necrose tumoral e outros fatores polipeptídicos incluindo LIF e ligante kit (KL), fatores estimulantes de colônias, eritropoietina (epoetina), filgrastim, sargramostim, promegapoietina, Oprelvekin, agentes terapêuticos gênicos imunomoduladores, ácido nucleico codificador de um gene terapêutico funcional que é usado para substituir um gene mutante ou de outra forma disfuncional (p. ex., truncado) associado com câncer, ácido nucleico que codifica ou de outra forma provê a produção de uma proteína terapêutica para tratar câncer, alquil sulfonatos, bussulfano, mostardas nitrogenadas, clorambucila, ciclofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina e melfalano, nitrosoureias, carmustina, fotemustina, lomustina, nimustina, estreptozocina, triazinas e hidrazinas, dacarbazina, procarbazina, temozolomida, etileniminas, tiotepa, diaziquona, mitomicina C, derivados de metilaminas, epóxidos, altretamina, dianidrogalactitol, dibromodulcitol, angiostatina, ABX EFG, 01-1033, PKI-166, vacina de EGF, EKB-569, GW2016, ICR- 62, EMD 55900, CP358, PD153035, AG1478, IMC-C225, OSI-774, Erlotinibe, angiostatina, arrestina, endostatina, BAY 12-9566 e com fluorouracila ou doxorrubicina, canstatina, carboxiamidotriozol e com paclitaxel, EMD121974, S-24, vitaxina, ácido dimetilxantonena acético, IM862, lnterleucina-12, lnterleucina-2, NM- 3, HuMV833, PTK787, RhuMab, angiozyme, IMC-1C11, Neovastat, marimastat, prinomastat, BMS-275291, COL-3, MM1270, SU101, SU6668, SU11248, SU5416, com paclitaxel, com gencitabina e cisplatina e com irinotecano e cisplatina e com radiação, tecogalan, temozolomida e PEG-interferon-a2b, tetratiomolibdato, TNP- 470, talidomida, CC-5013 e com taxotere, tunstatina, 2-metoxiestradiol, bloqueador {trap)de VEGF, inibidores de mTOR (deforolimo, everolimo e tensirolimo), inibidores de tirosinaquinase (p. ex., imatinibe, gefitinibe, dasatinibe, sunitinibe, nilotinibe, lapatinibe, sorafenibe, fosfoinositídeo 3-quinases (PI3K), antagonistas do ácido fólico, metotrexato, ácido 4-amino-fólico, lometrexol, pemetrexede, trimetrexato, antagonistas de pirimidinas, citidina, capecitabina, citarabina, decitabina, 5- fluorouracila, 5-fluoro-2’-desoxiuridina 5’-fosfato, 5-fluorouridina trifosfato, gencitabina, foxuridina, um antagonista de purinas azatioprina, cladribina, mercaptopurina, fludarabina, peπtostatiπa, 6-tioguanina, inibidores da adenosina desaminase, Cladribina, Fludarabina, Nelarabina, Pentostatina, boroficina, bortezomibe, agentes quimioprotetores, amifostina, dexrazoxano, mesna, androgênios, estrogênios, acetato de medroxiprogesterona, progestinas, aminoglutetimida, anastrozol, bicalutamida, clorotrianises, acetato de ciproterona, degarelix, exemestano, flutamida, fulvestrant, goserrelina, letrozol, leuprolida, lupron, acetato de medroxiprogesterona, acetato de Megestrol, tamoxifeno, tπptorrehna, asparaginase, dacarbazina, hidroxiureia, levamisol, mitotane, procarbazane, tretinoina, glicocorticoides, prednisona, cromogênios, corantes, oligonucleotídeos antisensenaturais ou sintetizados utilizando nucleotídeos padrão e/ou não padrão (incluindo RNA de interferência (RNAi)), RNA de fita dupla (dsRNA), pequeno RNA interferente (siRNA), microRNA (miRNA), aptâmeros, oligonucleotídeos CpG, ■ ■ min 1771.. 212Rj 213Bi 211At 62Cu 64Cu 67^, 90y, 125^ 1311 ribozimas, angiozima, 111ln, '"Lu, Bi, DI, ML, 32p 3sp «Sc ttiAg 67Ga, ’«Pr, «Sm, -’Tb, ’“Dy, ’“Ho, -Re, ’“Re, -Re, -Pb ∞Ra, «Ac “Fe, 75Se, 77As, “Sr, “Mo, -Rh, '“Pd, ’«Pr, ’«Pm, ’“Er, -Ir, -Au ’“Au, 7”'Pb, Co-58, Ga-67, Br-80m, Tc-99m, Rh-103m, Pt-109, ln-111 1, Sb- 119 1-125 Ho-161 , Os-189m, lr-192, Dy-152. At-211 , Bi-212, Ra-223, Rn-219^°- ;15 Bi-21 1 Ac-225, Fr-221, At-217, Bi-213. Fm-255, ”C, 13N, "0. ' .33, 77gr TOm|n, S3RU, -Ru, '“Ru, ’“Rb. wHg, ∞Hg, ’-Te/-Te, ^Te, s.r ’ssfe 75Se “’TI «Ac, 77Br. ’“Yb, taxano, cisplatina, metron.dazol, misonidazol, desmetilmisonidazol, pimonidazol. etanidazol, nimorazol m^cna , RSU 1069, SR 4233, E09, RB 6145, nicotinamide, 5-bromodesox.un,n <B ■ rfne (IUdR) bromodesoxicitidina, fluorodesox.urid.na (FU ), iododesoxiur.d.na (IUdR), potofrina(r) derivados de derivados de hematoporfinnas, Fototr.nair), hidroxiureia, denvados o feoforbide a, rf- nan NPe6 etioporfirina de estanh ( benzoporfmnas, NP , fta,ocianinas, ftalocianina de zinco, bacterioclorofila a, naftalocan.nas, ftaloctanm camptotecinas, irinotecano, topotecano, ansacrina, daunorrubiciπa, doxorrubiciπa, epipodofilotoxinas, elipticiπas, epirrubicina, etoposido, razoxaπo, teπiposido, Axitinibe, Bosutinibe, Cediranibe, Dasatinibe, Erlotinibe, Gefitiπibe, Imatiπibe, Lapatinibe, Lestaurtinibe, Nilotinibe, Semaxanibe, Sunitinibe, Vaπdetaπibe, abriπa, cadeia A de abrina, alfa toxina, proteínas de Aleurites fordii, amatoxiπa, crotiπa, curcina, proteínas dianthin, toxina diftérica, cadeia A da toxina diftérica, fragmentos ativos não de ligação da toxina diftérica, desoxiribonuclease (Dnase), gelonina, mitogelina, cadeia A de modecina, inibidor derivado de Momordica charantia, neom icina, onconase, fenom icina, proteínas de Phytolaca americana(PAPI, PAPII e PAP-S), proteína antiviral de fitolaca, endotoxina de Pseudomonas,exotoxina de Pseudomonas,cadeia A da exotoxina de Pseudomonas aeruginosa, restrictociπa, ricina, cadeia A de ricina, ribonuclease (Rnase), inibidor derivado de Sapaonaria officinalis,saporina, alfa-sarcina, enterotoxina-A estafilocócica, toxina tetânica, cisplatina, carboplatina e oxaliplatina (Eloxatin, Sanofi Aventis), inibidores do proteassomo, PS-341, inibidores de HDAC, vorinostat, belinostat, entinostat, mocetinostat, panobinostat, inibidores da COX-2, ureias substituídas, inibidores de proteínas do choque térmico, Geldanam icina, supressores adrenocorticais, tricotecenos, A12, 19D12, Cp751-871, H7C10, alphalR3, ScFV/FC, EM/164, Matuzumabe, Erbitux, Vectibix, mAb 806, Nimotuxumabe, AVEO, AMG102, 5D5 (OA-5d5), H244G11, Ab #14 (MM 121-14), Herceptina, 1B4C3; 2D1D12, NVP- AEW541-A, BMS-536,924 (1 H-benzoimidazol-2-il)-1 H-piridin-2-ona), BMS-554,417, Cycloligan, TAE226, PQ401 , Iressa, CI-1033 (PD 183805), Lapatinibe (GW- 572016), Tykerb, Tarceva, PKI-166, PD-158780, EKB-569, Tyrphostin AG 1478 (4- (3-Cloroanilino)-6,7-dimetoxiquinazolina), PHA665752, ARQ 197, Capecitabina, 5- Trifluorometil-2’-desoxiuridina, Metotrexato sódico, Raltitrexede, Pemetrexede, Tegafur, Citosina Arabinosideo (Citarabina), 5-azacitidina, 6-mercaptopurina (Mercaptopurina, 6-MP), Azatioprina, 6-tioguanina, Pentostatina, fosfato de Fludarabina, Cladribiπa (2-CdA, 2-clorodesoxiadenosina), inibidor da ribonucleotideo redutase, Ciclofosfamida, Neosar, ifosfamida, Tiotepa, BCNll^ 1,3-bis(2-cloroetil)-1- nitosoureia, CCNll^ 1, -(2-cloroetil)-3-ciclohexil-1-nitrosoureia (metil CCNU), Hexametilmelamina, bussulfano, Procarbazina HCL, Dacarbazina (DTIC), clorambucila, melfalano, carboplatina, oxaliplatina, doxorrubicina HCL, citrato de daunorrubicina, mitoxantrona HCL, actinomicina D, etoposido, topotecano HCI, teniposido, irinotecano HCL(CPT-II), vincristina, sulfato de vimblastina, tartarato de vinorelbina, sulfato de vindesina, paclitaxel, docetaxel, abraxano, ixabepilona, mesilato de imatinibe, malato de sunitinibe, tosilato de sorafenibe, cloridrato de nilotinibe monoidratado, L-asparaginase, interferon alfa, Avastina, IL-2, Aldesleucina, Proleucina, IL-12, citrato de Toremifeno, Fulvestrant, raloxifeno HCL, anastrazol, letrozol, Fadrozol (CGS 16949A), exemestano, acetato de leuprolida, Lupron, acetato de goserrelina, pamoato de triptorrelina, buserrelina, Nafarelina, cetrorelix, bicalutamida, nilutamida, acetato de megestrol, análogos da somatostatina Anlogs, prednisolona, dexametasona, cetoconazol, sirolimo, tensirolimo (CCI-779), deforolimo (AP23573), Irinotecano; Leucovorina; Folfiri; 5-FU; Enalapril; Nifedipina; Clonidina; Temozolomida; Gencitabina; Capecitabina; Paclitaxel; Regorafenibe; Pertuzumabe e everolimo (RAD00I).

[040]Em algumas modalidades, é descrita uma composição compreendendo uma ou mais proteínas de ligação como aqui descritas e um ou mais agentes adicionais, p. ex., um agente quimioterápico. Por exemplo, a composição pode compreender uma ou mais proteínas de ligação em solução com um ou mais agentes adicionais. Em algumas modalidades, o agente é um ou mais entre: irinotecano, leucovorina, 5-FU, temozolomida, gencitabina e paclitaxel. Em uma modalidade, o agente é irinotecano. Em uma modalidade, o agente é leucovorina. Em uma modalidade, o agente é 5-FU. Em uma modalidade, o agente é irinotecano, leucovorina e 5-FU. Em uma modalidade, o agente é temozolomida. Em uma modalidade, o agente é gencitabina. Em uma modalidade, o agente é paclitaxel.

[041]Em outra modalidade, a proteína de ligação é uma proteína de ligação cristalizada e existe em forma de cristal. Em uma modalidade, o cristal é um cristal farmacêutico de liberação controlada livre de veículo. Em outra modalidade, a proteína de ligação cristalizada tem uma meia-vida maior in vivo do que a correspondente solúvel da proteína de ligação. Em ainda outra modalidade, a proteína de ligação cristalizada retém a atividade biológica.

[042]Em outra modalidade, a proteína de ligação aqui descrita é glicosilada. Por exemplo, o padrão de glicosilação é um padrão de glicosilação humana.

[043]A invenção também provê um ácido nucleico isolado que codifica qualquer uma das proteínas de ligação aqui descritas. Uma modalidade adicional provê um vetor compreendendo o ácido nucleico isolado aqui provido, em que o vetor é pcDNA; pTT (Durocher et al. (2002) Nucleic Acids Res.30(2); pTT3 (pTT com sítio de clonagem múltipla adicional; pEFBOS (Mizushima e Nagata (1990) Nucleic Acids Res. 18(17); pBV; pJV; pcDNA3.1 TOPO; pEF6 TOPO; pBOS; pHybE; ou pBJ. Em uma modalidade, o vetor é um vetor descrito na Publicação da Patente US N2 20090239259.

[044]Em outro aspecto, uma célula hospedeira é transformada com o vetor aqui descrito. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula procariótica, por exemplo, de E. Coli. Em outra modalidade, a célula hospedeira é uma célula eucariótica, por exemplo, célula protista, célula animal, célula vegetal ou célula de fungo. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula de mamífero incluindo, entre outras, CHO, COS, NS0, SP2, PER.C6, ou uma célula de fungos, como de Saccharomyces cerevisiae, ou uma célula de inseto como Sf9. Em uma modalidade, duas ou mais proteínas de ligação, p. ex., com diferentes especificidades, são produzidas em uma célula hospedeira recombinante única. Por exemplo, a expressão de uma mistura de anticorpos foi denominada Oligoclonics™ (Merus B.V., Países Baixos), Patentes US 7 262 028 e 7 429 486.

[045]A presente invenção provê um método para produzir uma proteína de ligação aqui descrita, compreendendo cultivar qualquer uma das células hospedeiras aqui descritas em um meio de cultura e em condições suficientes para produzir a proteína de ligação. Em uma modalidade, 50%-75% da proteína de ligação produzida por esse método é uma proteína de ligação duplo-específica tetravalente. Em outra modalidade, 75%-90% da proteína de ligação produzida por esse método é uma proteína de ligação duplo-específica tetravalente. Em outra modalidade, 90%- 95% da proteína de ligação produzida por esse método é uma proteína de ligação duplo-específica tetravalente.

[046]Uma modalidade provê uma composição para a liberação de uma proteína de ligação, em que a composição compreende uma proteína de ligação cristalizada, um ingrediente ao menos um carreador polimérico. Em uma modalidade, o carreador polimérico é um poli (ácido acrílico), um poli (cianoacrilato), um poli (aminoácido), um poli (anidrido), um poli (depsipeptídeo), um poli (éster), poli (ácido láctico), poli (ácido láctico-co-glicólico) ou PLGA, poli (b-hidroxibutirato), poli (caprolactona), poli (dioxanona), poli (etilenoglicol), poli ((hidroxipropil) metacrilamida, poli [(organo)fosfazeno], um poli (orto éster), poli (álcool vinílico), poli (vinilpirrolidona), um copolímero de anidrido maleico-alquil vinil éter, um poliol plurônico, albumina, alginato, celulose, um derivado de celulose, colágeno, fibrina, gelatina, ácido hialurônico, um oligossacarídeo, um glicaminoglicano, um polissacarídeo sulfatado, ou misturas e copolímeros destes. Em uma modalidade, o ingrediente é albumina, sacarose, trealose, lactitol, gelatina, hidroxipropil-β- ciclodextrina, metoxipolietilenoglicol ou polietilenoglicol.

[047]Outra modalidade provê um método para tratar um mamífero, compreendendo a etapa de administrar ao mamífero uma quantidade eficaz de uma composição aqui descrita.

[048]É provida uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína de ligação aqui descrita e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende ao menos um agente terapêutico adicional para tratar um transtorno. Por exemplo, o agente adicional pode ser um agente terapêutico, um agente quimioterápico; um agente de imagem, um agente citotóxico, um inibidor da angiogênese, um inibidor de quinases (inclusive, entre outros, um inibidor de KDR e um de TIE-2), um modulador de moléculas de co-estimulação (inclusive, entre outros, anti-B7.1, anti-B7.2, CTLA4-lg, anti-CD20), um bloqueador de moléculas de adesão (inclusive, entre outros, um anticorpo anti-LFA-1, um anticorpo anti-E/L selectina, uma pequena molécula inibidora), um anticorpo anti-citocinas, ou seu fragmento funcional (inclusive, entre outros, um anticorpo anti-IL-18, um anti-TNF ou um anti-L-6/ receptor de citocinas), um mAb anti-VEGF; um mAb anti-DLL4; metotrexato, ciclosporina, rapamicina, FK506, um marcador ou repórter detectável, um antagonista de TNF, um antirreumático, um relaxante muscular, um narcótico, um fármaco anti-inflamatório não esteroidal (NSAID), um analgésico, um anestésico, um sedativo, um anestésico local, um bloqueador neuromuscular, um antimicrobiano, um antipsoriático, um corticosteroide, um esteroide anabólico, uma eritropoietina, uma imunização, uma imunoglobulina, um imunossupressor, um hormônio do crescimento, um fármaco de reposição hormonal, um radiofarmacêutico, um antidepressivo, um antipsicótico, um estimulante, um medicamento para asma, um beta agonista, um esteroide inalado, uma epinefrina ou análogo, uma citocina ou um antagonista de citocinas. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um agente quimioterápico. Em algumas modalidades, o agente adicional é um ou mais entre: irinotecano, leucovorina, 5-FU, temozolomida, gencitabina e paclitaxel. Em uma modalidade, o agente é irinotecano. Em uma modalidade, o agente é leucovorina. Em uma modalidade, o agente é 5-FU. Em uma modalidade, o agente é irinotecano, leucovorina e 5-FU. Em uma modalidade, o agente é temozolomida. Em uma modalidade, o agente é gencitabina. Em uma modalidade, o agente é paclitaxel.

[049]Em várias modalidades, é provido um método para diagnosticar e/ou tratar um paciente humano sofrendo de um transtorno que pode ser diagnosticado e/ou tratado pelo direcionamento para VEGF e/ou DLL4 (p. ex., qualquer transtorno de angiogênese ou qualquer outro transtorno associado com expressão anormal de VEGF e/ou DLL4), compreendendo administrar ao paciente humano uma proteína de ligação aqui descrita de tal modo que a atividade do alvo, ou alvos, no paciente humano seja inibida e um ou mais sintomas sejam aliviados ou o tratamento seja alcançado. As proteínas de ligação aqui providas podem ser usadas para diagnosticar e/ou tratar humanos que sofrem de cânceres primários e metastáticos, incluindo carcinomas de mama, cólon, reto, pulmão, orofaringe, hipofaringe, esôfago, estômago, pâncreas, fígado, vesícula biliar e duetos biliares, intestino delgado, trato urinário (incluindo rim, bexiga e urotélio), trato genital feminino (incluindo colo do útero, útero e ovários, bem como coriocarcinoma e doença trofoblástica gestacional), trato genital masculino (incluindo próstata, vesículas seminais, testículos e tumores de células germ inativas), glândulas endócrinas (incluindo as glândulas tireoide, adrenais e hipófise) e de pele, bem como hemangiomas, melanomas, sarcomas (inclusive aqueles com origem óssea e em tecidos moles, assim como sarcoma de Kaposi), tumores do cérebro, de nervos, olhos e meninges (incluindo astrocitomas, gliomas, glioblastomas, retinoblastomas, neuromas, neuroblastomas, Schwannomas e meningiomas), tumores resultantes de malignidades hematopoiéticas, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), linfoma de células B, linfoma de Burkitt, leucemia mielocítica crônica (LMC), leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia de células cabeludas, linfomas de Hodgkin e não Hodgkin, malignidades hematopoiéticas, sarcoma de Kaposi, linfoma maligno, histiocitose maligna, melanoma maligno, mieloma múltiplo, síndrome paraneoplásica/hipercalcemia de malignidade ou tumores sólidos.

[050]Em algumas modalidades, um método para tratar câncer em um paciente compreende administrar uma ou mais das proteínas de ligação aqui descritas ou uma composição farmacêutica destas. Em uma modalidade, o câncer é câncer de cólon. Em uma modalidade, o câncer é glioblastoma. Em uma modalidade, o câncer é câncer pancreático. Em uma modalidade, o câncer é câncer de mama. Em algumas modalidades, os métodos para tratar câncer, compreendendo administrar uma ou mais das proteínas de ligação aqui descritas, ou uma composição farmacêutica destas, reduzem o crescimento tumoral ou retardam o crescimento tumoral, em nível pelo menos aproximadamente equivalente aos efeitos aditivos esperados de uma combinação de um anticorpo anti-VEGF e um anticorpo anti-DLL4. Em algumas modalidades, os métodos reduzem o crescimento tumoral ou retardam o crescimento tumoral, em nível acima ao aditivo (p. ex., uma redução maior do que a esperada de se adicionar os efeitos previstos de um anticorpo anti-VEGF e de um anticorpo anti-DLL4).

[051]Em algumas modalidades, um método para tratar um câncer compreende administrar uma ou mais das proteínas de ligação aqui descritas ou uma composição farmacêutica destas, em combinação com um ou mais agentes adicionais, p. ex., um agente quimioterápico ou biológico. Em algumas modalidades, o agente é um ou mais entre: regorafenibe (STIVAGRA™), pertuzumabe (PERJECTA™), irinotecano, leucovorina, 5-FU, temozolomida, gencitabina e paclitaxel. Em uma modalidade, o agente é irinotecano. Em uma modalidade, o agente é leucovorina. Em uma modalidade, o agente é 5-FU. Em uma modalidade, o agente é irinotecano, leucovorina e 5-FU. Em uma modalidade, o agente é temozolomida. Em uma modalidade, o agente é gencitabina. Em uma modalidade, o agente é paclitaxel. Em algumas modalidades, os métodos para tratar câncer, compreendendo administrar uma ou mais das proteínas de ligação aqui descritas ou uma composição farmacêutica destas, em combinação com um ou mais agentes adicionais, reduzem o crescimento tumoral ou retardam o crescimento tumoral, em nível pelo menos equivalente aos efeitos aditivos esperados de uma combinação da proteína de ligação com o agente adicional. Em algumas modalidades, os métodos reduzem o crescimento tumoral ou retardam o crescimento tumoral em nível acima ao aditivo (p. ex., uma redução maior do que a esperada de se adicionar os efeitos previstos da proteína de ligação e do agente adicional).

[052]Em algumas modalidades, um método para tratar câncer de cólon compreende administrar uma ou mais das proteínas de ligação aqui descritas ou uma composição farmacêutica destas, opcionalmente em combinação com um ou mais de irinotecano, leucovorina e 5-FU. Em algumas modalidades, um método para tratar glioblastoma compreende administrar uma ou mais das proteínas de ligação aqui descritas ou uma composição farmacêutica destas, opcionalmente em combinação com temozolomida. Em algumas modalidades, um método para tratar câncer pancreático compreende administrar uma ou mais das proteínas de ligação aqui descritas ou uma composição farmacêutica destas, opcionalmente em combinação com gencitabina. Em algumas modalidades, um método para tratar câncer de mama compreende administrar uma ou mais das proteínas de ligação aqui descritas ou uma composição farmacêutica destas, opcionalmente em combinação com paclitaxel.

[053]Em várias modalidades, as proteínas de ligação aqui providas podem ser administradas em combinação com um ou mais agentes anti-hipertensivos. O um ou mais agentes anti-hipertensivos podem ser selecionados a partir do grupo constituído por um diurético, um antagonista de receptores adrenérgicos, um bloqueador do canal do cálcio, inibidores da renina, inibidores da ACE, antagonistas do receptor de angiotensina II, vasodilatadores e agonistas alfa-2. Por exemplo, o agente pode ser um ou mais entre: clonidina, enalapril; nifedipina; metildopa, hidralazina, prazosina, reserpina, moxonidina, guaπfacina, perindopril/indapamida, lofexidina e metirosina. Em algumas modalidades, as proteínas de ligação aqui providas podem ser administradas em combinação com um ou mais anticoagulantes. Por exemplo, o anticoagulante pode ser um ou mais entre: varfarina, heparina, heparina de baixo peso molecular, dalteparina sódica, argatrobano, bivalirudina, lepirudina e dextrose. Em algumas modalidades, as proteínas de ligação aqui providas podem ser administradas em combinação com um ou mais agentes anti- hipertensivos e um ou mais anticoagulantes.

[054]Em várias modalidades, as proteínas de ligação aqui providas podem ser utilizadas para diagnosticar e/ou tratar humanos que sofrem de degeneração macular (inclusive a forma úmida), retinopatia diabética e/ou qualquer outra doença ou transtorno caracterizado por supercrescimento vascular ou edema.

[055]Em uma modalidade, as proteínas de ligação, ou suas porções de ligação a antígeno, são utilizadas para tratar câncer ou na prevenção ou inibição de metástases provenientes dos tumores aqui descritos, seja quando utilizadas isoladamente ou em combinação com radioterapia e/ou agentes quimioterápicos.

[056]Em uma modalidade, os agentes quimioterápicos ou biológicos com os quais as proteínas de ligação aqui providas podem ser combinadas incluem os seguintes: Ácido 13-cis-Retinoico; 2-CdA; 2-Clorodesoxiadenosina; 5-Citidina; 5- Fluorouracila; 5-FU; 6-Mercaptopurina; 6-MP; 6-TG; 6-Tioguanina; Abraxane; Accutane®; Actinomicina-D; Adriamicina®; Adrucil®; Afinitor®; Agrylin®; Ala-Cort®; Aldesleucina; Alentuzumabe; ALIMTA; Alitretinoína; Alkaban-AQ®; Alkeran®; Ácido All-transretinoico; Interferon alfa; Altretamina; Ametopterina; Amifostina; Aminoglutetimida; Anagrelida; Anandron®; Anastrozol; Arabinosilcitosina; Ara-C Aranesp®; Aredia®; Arimidex®; Aromasin®; Arranon®; Trióxido de Arsênio; Arzerra™; Asparaginase; ATRA; Avastin®; Citidina; BCG; BCNU; Bendamustina; Bevacizumabe; Bexaroteno; BEXXAR®; Bicalutamida; BiCNU; Blenoxane®; Bleomicina; Bortezomibe; Bussulfano; Busulfex®; C225; Leucovorina Cálcica; Campath®; Camptosar®; Camptotecina-11; Capecitabina Carac™; Carboplatina; Carmustina; Carmustina Wafer; Casodex®; CC-5013; CCI-779; CCNU; CDDP; CeeNll; Cerubidine®; Cetuximabe; Clorambucila; Cisplatina; Fator Citrovorunr, Cladribina; Cortisona; Cosmegen®; CPT-11; Ciclofosfamida; Cytadren®; Citarabina; Citarabina Lipossomal; Cytosar-U®; Cytoxan®; Dacarbazina; Dacogen; Dactinomicina; Darbepoetina Alfa; Dasatinibe; Daunomicina; Daunorrubicina; Cloridrato de Daunorrubicina; Daunorrubicina Lipossomal; DaunoXome®; Decadron; Decitabina; Delta-Cortef®; Deltasone®; Denileucina; Diftitox; DepoCyt™; Dexametasona; Acetato de Dexametasona; Fosfato Sódico de Dexametasona; Dexasona; Dexrazoxano; DHAD; DIC; Diodex; Docetaxel; Doxil®; Doxorrubicina; Doxorrubicina Lipossomal; Droxia™; DTIC; DTIC-Dome®; Duralone®; Efudex®; Eligard™; Ellence™; Eloxatin™; Elspar®; Emcyt®; Epirrubicina; Epoetina Alfa; Erbitux; Erlotinibe; L-asparaginase de Erwinia', Estramustina; Ethyol Etopophos®; Etoposido; Fosfato de Etoposido; Eulexin®; Everolimo; Evista®; Exemestano; Fareston®; Faslodex®; Femara®; Filgrastim; Floxuridina; Fludara®; Fludarabina; Fluoroplex®; Fluorouracila; Fluorouracila (creme); Fluoximesterona; Flutamida; Ácido Folinico; FUDR®; Fulvestrant; Gefitinibe; Gencitabina; Gentuzumabe ozogamicina; Gemzar; Gleevec™; Gliadel® Wafer; GM-CSF; Goserrelina; Fator Estimulante de Colônias de Granulócitos (G-CSF); Fator Estimulante de Colônias de Granulócitos e Macrófagos (G-MCSF); Halotestin®; Herceptin®; Hexadrol; Hexalen®; Hexametilmelamina; HMM; Hycamtin®; Hydrea®; Hydrocort Acetate®; Hidrocortisona; Fosfato Sódico de Hidrocortisona; Succinato Sódico de Hidrocortisona; Fosfato de Hidrocortona; Hidroxiureia; Ibritumomabe; Ibritumomabe Tiuxetana; Idamicina®; Idarrubicina Ifex®; Interferon-alfa; lnterferon-alfa-2b (Conjugado PEG); Ifosfamida; lnterleucina-11 (IL-11); lnterleucina-2 (IL-2); mesilato de Imatinibe; Imidazol Carboxamida; Intron A®; Iressa®; Irinotecano; Isotretinoina; Ixabepilona; Ixempra™; KADCYCLA®; Kidrolase (t) Lanacort®; Lapatinibe; L- asparaginase; LCR; Lenalidomida; Letrozol; Leucovorina; Leukeraπ; Leukine™; Leuprolida; Leurocristina; Leustatin™; Ara-C Lipossomal; Liquid Pred®; Lomustina; L-PAM; L-Sarcolisina; Lupron®; Lupron Depot®; Matulane®; Maxidex; Mecloretamina; Cloridrato de Mecloretamina; Medralone®; Medrol®; Megace®; Megestrol; Acetato de Megestrol; Melfalano; Mercaptopurina; Mesna; Mesnex™; Metotrexato; Metotrexato Sódico; Metilprednisolona; Meticorten®; Mitomicina; Mitomicina-C; Mitoxantrona M-Prednisol®; MTC; MTX; Mustargen®; Mustina; Mutamicyn®; Myleran®; Mylocel™; Mylotarg®; Navelbin®; Nelarabina; Neosar®; Neulasta™; Neumega®; Neupogen®; Nexavar®; Nilandron®; Nilotinibe; Nilutamida; Nipent®; Mostarda Nitrogenada Novaldex®; Novantrone®; Nplate; Octreotida; acetato de Octreotida; Ofatumumabe; Oncospar®; Oncovin®; Ontak®; Onxal™; Oprelvekin; Orapred®; Orasone®; Oxaliplatina; Paclitaxel; Paclitaxel ligado a Proteínas; Pamidronato; Panitumumabe; Panretin®; Paraplatin®; Pazopanibe; Pediapred®; PEG Interferon; Pegaspargase; Pegfilgrastim; PEG-INTRON™; PEG-L- asparaginase; PEMETREXEDE; Pentostatina; Fenilalanina Mostarda; Platinol®; Platinol-AQ®; Prednisolona; Prednisona; Prelone®; Procarbazina; PROCRIT®; Proleukin®; Implante de Prolifeprospan 20 com Carmustina; Purinathol®; Raloxifeno; Revlimid®; Rheumatrex®; Rituxan®; Rituximabe; Roferon-A®; Romiplostim; Rubex®; cloridrato de Rubidomicina; Sandostatin®; Sandostatin LAR®; Sargramostim; Solu-Cortef®; Solu-Medrol®; Sorafenibe; SPRYCEL™; STI-571; Estreptozocina; SU11248; Sunitinibe; Sutent®; Tamoxifeno Tarceva®; Targretin®; Tasigna®; Taxol®; Taxotere®; Temodar®; Temozolomida Temsirolimo; Teniposido; TESPA; Talidomida; Thalomid®; TheraCys®; Tioguanina; Tioguanina Tabloid®; Tiofosfoamida; Thioplex®; Tiotepa; TICE®; Toposar®; Topotecano; Toremifeno; Torisel®; Tositumomabe; Trastuzumabe; Treanda®; Tretinoina; Trexall™; Trisenox®; TSPA; TYKERB®; VCR; Vectibix™; Velban®; Velcade®; VePesid®; Vesanoid®; Viadur™; Vidaza®; Vimblastiπa; Sulfato de Vimblastina; Viπcasar Pfs®; Vincristiπa; Vinorelbina; tartarato de Viπorelbina; VLB; VM-26; Vorinostat; Votrient; VP-16; Vumon®; Xeloda®; Zanosar®; Zevaliπ™; Zinecard®; Zoladex®; ácido Zoldrônico; Zolinza; ou Zometa®, e/ou qualquer outro agente não especificamente listado acima direcionado para vias semelhantes.

[057]Em outra modalidade, os métodos para tratar um paciente sofrendo de um transtorno compreendem a etapa de administrar uma ou mais das proteínas de ligação aqui descritas isoladamente ou administrar a(s) proteína(s) de ligação antes, concomitantemente ou depois da administração de um segundo agente. Em uma determinada modalidade, as composições farmacêuticas aqui descritas são administradas a um paciente por administração oral, parenteral, subcutânea, intramuscular, intravenosa, intrarticular, intrabrônquica, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitária, intraceliar, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intra-hepática, intramiocárdica, intraóssea, intrapélvica, intrapericárdica, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarretal, intrarrenal, intrarretiniana, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intrauterina, intravesical, bolus, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal, ou transdérmica.

[058]Em várias modalidades, são providos métodos para determinar a presença, a quantidade ou a concentração de um ou mais antígenos, ou de seus fragmentos, em uma amostra de teste, em que um ou mais antígenos ou seus fragmentos são DLL4 e/ou VEGF. O método compreende analisar a amostra em teste para o antígeno, ou seu fragmento, por um imunoensaio. O imunoensaio (i) emprega pelo menos uma proteína de ligação e pelo menos um marcador detectável e (ii) compreende comparar um sinal gerado pelo marcador detectável como indicação direta ou indireta da presença, da quantidade ou da concentração do antígeno, ou de seu fragmento, na amostra em teste a um sinal gerado como indicação direta ou indireta da presença, da quantidade ou da concentração do antígeno, ou de seu fragmento, em um controle ou calibrador. O calibrador é opcionalmente parte de uma série de calibradores, em que cada um dos calibradores difere dos outros calibradores na série pela concentração do antígeno, ou de seu fragmento. O método pode compreender (i) contatar a amostra em teste com pelo menos um agente de captura, que se liga a um epítopo no antígeno, ou em seu fragmento, de modo a formar um complexo compreendendo o agente de captura e o antígeno ou seu fragmento (ii) contatar o complexo compreendendo o agente de captura e o antígeno ou seu fragmento com pelo menos um agente de detecção, que compreende um marcador detectável e se liga a um epítopo no antígeno, ou em seu fragmento, que não é ligado pelo agente de captura, para formar um complexo de detecção, e (iii) determinar a presença, a quantidade ou a concentração do antígeno, ou de seu fragmento, na amostra em teste com base no sinal gerado pelo marcador detectável presente no complexo de detecção formado (ii), em que pelo menos um agente de captura e/ou pelo menos um agente de detecção é pelo menos uma das proteína de ligação.

[059]Alternativamente, em algumas modalidades, o método para determinar a presença, a quantidade ou a concentração de um ou mais antígenos, ou de seus fragmentos, em uma amostra em teste pode compreender (i) contatar a amostra em teste com pelo menos um agente de captura, que se liga a epítopo no antígeno, ou em seu fragmento, de modo a formar um complexo compreendendo o agente de captura e o antígeno ou seu fragmento e, simultaneamente ou em sequência, em qualquer ordem, contatar a amostra em teste com antígeno marcado de maneira detectável, ou seu fragmento, que pode competir com qualquer antígeno, ou seu fragmento, na amostra em teste pela ligação ao menos um agente de captura, em que qualquer antígeno, ou seu fragmento, presente na amostra em teste e o antígeno marcado de maneira detectável competem um com o outro para formar um complexo de detecção e (ii) determinar a presença, a quantidade ou a concentração do antígeno, ou seu fragmento, na amostra em teste com base no sinal gerado pelo marcador detectável presente no complexo de detecção formado (i), em que pelo menos um agente de captura é pelo menos uma das proteínas de ligação e em que o sinal gerado pelo marcador detectável no complexo de captura/detecção é inversamente proporcional à quantidade ou à concentração de antígeno, ou de seu fragmento, na amostra em teste.

[060]Em várias modalidades, a amostra em teste pode ser de um paciente, em cujo caso o método pode compreender ainda diagnosticar, determinar um prognóstico ou avaliar a eficácia do tratamento terapêutico/profilático do paciente. Se o método compreender ainda avaliar a eficácia do tratamento terapêutico/profilático do paciente, o método compreende ainda opcionalmente modificar o tratamento terapêutico/profilático do paciente conforme necessário para melhorar a eficácia. O método pode ser adaptado para uso em um sistema automático ou um sistema semiautomático. Dessa forma, os métodos aqui descritos também podem ser utilizados para determinar se um indivíduo é portador ou está em risco de desenvolver uma determinada doença, transtorno ou condição. Especificamente, tal método pode compreender as etapas de:

[061](a) determinar a concentração ou quantidade de um ou mais analitos, ou de seus fragmentos, em uma amostra em teste de um indivíduo (p. ex., utilizando os métodos aqui descritos, ou métodos conhecidos na técnica); e

[062](b) comparar a concentração ou quantidade do(s) analito(s), ou de seu(s) fragmento(s), conforme determinada na etapa (a) com um nível predeterminado, em que, se a concentração ou quantidade de analito(s) determinada na etapa (a) é favorável com relação a um nível predeterminado, então é determinada a ausência ou a falta de risco de uma determinada doença, transtorno ou condição para o indivíduo. Contudo, se a concentração ou quantidade de analito(s) determinada na etapa (a) for desfavorável com relação ao nível predeterminado, então é determinada a presença ou o risco de uma determinada doença, transtorno ou condição para o indivíduo.

[063]Adicionalmente, a presente invenção provê métodos para monitorar a progressão de uma doença em um indivíduo. Em algumas modalidades, os métodos compreendem as etapas de:

[064](a) determinar a concentração ou quantidade de um ou mais analito(s) em uma amostra em teste de um indivíduo;

[065](b) determinar a concentração ou quantidade de analito(s) em uma amostra em teste posterior do mesmo indivíduo; e

[066](c) comparar a concentração ou quantidade de analito(s) conforme determinada na etapa (b) com a concentração ou quantidade de analito(s) determinada na etapa (a), em que se a concentração ou quantidade determinada na etapa (b) não se alterou ou é desfavorável quando comparada à concentração ou quantidade determinada na etapa (a), então se determina que, no indivíduo, a doença prosseguiu, progrediu ou agravou. Por comparação, se a concentração ou quantidade conforme determinada na etapa (b) é favorável quando comparada à concentração ou quantidade conforme determinada na etapa (a), então se determina que a doença, no indivíduo, descontinuou, regrediu ou melhorou.

[067]Opcionalmente, os métodos para monitorar a progressão de uma doença compreende ainda comparar a concentração ou quantidade de analito(s) conforme determinada na etapa (b), por exemplo, com um nível predeterminado. Além disso, os métodos compreendem opcionalmente tratar o indivíduo com uma ou mais composições farmacêuticas por um período de tempo, se a comparação mostrar que a concentração ou quantidade de analito(s) conforme determinada na etapa (b), por exemplo, alterou-se desfavoravelmente com relação ao nível predeterminado.

[068]É também provido um kit para avaliar a presença ou concentração de um ou mais antígenos, ou de seus fragmentos, em uma amostra em teste, em que um ou mais dos antígenos são DLL4 e/ou VEGF. O kit compreende pelo menos uma proteína de ligação, como aqui descritos, para analisar a presença de um antígeno, ou de seu fragmento, na amostra em teste. Em uma modalidade, a ao menos uma proteína de ligação está marcada opcionalmente de modo detectável.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

[069]A Figura 1 é uma representação esquemática de construções da proteína de ligação com Domínio Variável Duplo (DVD) e mostra a estratégia para a geração de uma proteína de ligação DVD a partir de dois anticorpos originais.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[070]São providas proteínas de ligação multivalentes e/ou multiespecíficas capazes de se ligar a epítopos em duas proteínas diferentes. São também providas proteínas de ligação com domínio duplo variável (também chamadas de DVDs, proteínas de ligação DVD ou imunoglobulinas de domínio variável duplo (DVD-lg™)), e suas composições farmacêuticas, bem como ácidos nucleicos, vetores de expressão recombinante e células hospedeiras para produzir tais proteínas de ligação DVD. Métodos de uso das proteínas de ligação DVD para detectar antígenos específicos, seja in vitroou in vivo, são também providos.

[071]A menos que definido de outra forma no presente, os termos científicos e técnicos usados neste pedido de patente possuem os significados comumente entendidos pelos técnicos no assunto. Em caso de qualquer ambiguidade latente, as definições aqui fornecidas prevalecem sobre qualquer definição em dicionários ou extrínseca. A menos que exigido pelo contexto, os termos no singular incluirão pluralidades e os termos no plural incluirão o singular. O uso de “ou” significa “e/ou” a menos que indicado de outra forma. O uso do termo “incluindo”, bem como de outras formas, como “inclui” e “incluído”, não é limitante. Qualquer faixa aqui descrita deverá ser entendida no sentido de incluir os pontos finais e todos os valores entre os pontos finais.

[072]Neste relatório descritivo, os títulos de seções são usados para fins de organização somente e não deverão ser interpretados como limitação à matéria descrita em questão. Todos os documentos, ou partes de documentos, citados neste pedido de patente, inclusive, entre outros, patentes, pedidos de patente, artigos, livros e tratados, são aqui expressamente incorporados, em sua totalidade e para qualquer fim, por referência neste pedido de patente. Na medida em que os documentos incorporados por referência contradigam o texto deste relatório descritivo, o relatório descritivo prevalecerá a qualquer material contraditório.

[073]Em geral, as nomenclaturas usadas em conexão com cultura celular e tecidual, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e química de proteínas e ácidos nucleicos e hibridização aqui descritos são aquelas bem conhecidas e comumente utilizadas na técnica. Os métodos e técnicas aqui providos são geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e são como descritos em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas por todo o presente relatório descritivo, a menos que indicado de outra forma. As reações enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, conforme comumente realizado na técnica ou conforme aqui descritas a menos que indicado de outra forma. As nomenclaturas usadas em conexão e os procedimentos laboratoriais e técnicas de química analítica, química orgânica sintética e química médica e farmacêutica, descritos neste relatório descritivo, são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica a menos que indicado de outra forma. Técnicas padrão são utilizadas para sínteses químicas, análises químicas, o preparo, formulação e liberação de agentes farmacêuticos e tratamento de pacientes.

[074]Para que a invenção possa ser entendida mais rapidamente, termos selecionados são definidos abaixo.

[075]O termo “anticorpo” refere-se a uma molécula de imunoglobulina (lg), que é geralmente composta por quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L), ou um fragmento funcional, mutante, variante ou derivado desta, que retém as características de ligação como epítopo de uma molécula de lg. Tais formatos de fragmento, mutante, variante ou derivado de anticorpos são conhecidos na técnica. Em uma modalidade de um anticorpo completo, cada cadeia pesada é composta por uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região constante de cadeia pesada (CH). A CH é composta por três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é composta por uma região variável de cadeia leve (VL) e uma região constante de cadeia leve (CL). A CL é composta por um domínio único CL. A VH e a VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de arcabouço (framework)(FRs). Geralmente, cada VH e cada VL são compostas por três CDRs e quatro FRs, dispostas da terminação amino para a terminação carboxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. As moléculas de imunoglobulina podem ser de qualquer tipo (p. ex., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (p. ex., lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2) ou subclasse.

[076]O termo “anticorpo biespecífico” refere-se a um anticorpo que se liga a um antígeno (ou epítopo) em um de seus dois braços de ligação (um par de HC/LC), e que se liga a um antígeno diferente (ou epítopo) em seu segundo braço de ligação (um par diferente de HC/LC). Um anticorpo biespecífico possui dois braços distintos de ligação a antígeno (tanto em especificidade como em sequências de CDR), e é monovalente para cada antígeno ao qual se liga. Os anticorpos biespecíficos incluem aqueles gerados pela tecnologia do quadroma (Milstein e Cuello (1983) Nature 305(5934): 537-40), por conjugação química de dois anticorpos monoclonais diferentes (Staerz et al. (1985) Nature314(6012): 628-31) ou pela abordagem knob- into-hole ou semelhantes que introduzem mutações na região Fc (Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90(14): 6444-6448).

[077]Um anticorpo “com maturação de afinidade” é um anticorpo com uma ou mais alterações em uma ou mais de suas CDRs que resultam em melhora na afinidade do anticorpo pelo antígeno, quando comparado a um anticorpo original que não possui aquela(s) alteração(ões). Anticorpos exemplares com maturação de afinidade terão afinidades em nível nanomolar ou mesmo picomolar pelo antígeno- alvo. Os anticorpos com maturação de afinidade são produzidos por procedimentos conhecidos na técnica. Marks et al. (1992) BioTechnology10:779-783 descreve a maturação de afinidade por embaralhamento (shuffling)de domínios VH e VL. A mutagênese aleatória de resíduos em CDRs e/ou framework é descrita por Barbas et al. (1994) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 91:3809-3813; Schier et al. (1995) Gene 169:147-155; Yelton et al. (1995) J. Immunol.155:1994-2004; Jackson et al. (1995) J. Immunol.154(7):3310-9; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896 e mutação em posições seletivas de mutagênese, posições de contato ou de hipermutação com um resíduo de aminoácido que reforça uma atividade é descrita na Patente US N26 914 128.

[078]O termo “anticorpo enxertado com CDR” refere-se a um anticorpo que compreende sequências de regiões variáveis da cadeia pesada e da leve em que as sequências de uma ou mais das regiões CDR de VH e/ou VL são substituídas por sequências de CDR de outro anticorpo. Por exemplo, os dois anticorpos podem ser de espécies diferentes, como anticorpos com regiões variáveis da cadeia pesada e da leve nas quais uma ou mais CDRs murinas foram substituídas por sequências de CDRs humanas.

[079]O termo “anticorpo humanizado” refere-se a um anticorpo de uma espécie não humana que foi alterado para se tornar mais “tipo humano”, ou seja, mais semelhante a sequências de linhagens germinativas humanas. Um tipo de anticorpo humanizado é um anticorpo enxertado com CDR, no qual sequências de CDRs não humanas são introduzidas em sequências humanas de VH e VL para substituir as sequências correspondentes de CDRs humanas. Um “anticorpo humanizado” é também um anticorpo ou variante, derivado, análogo ou fragmento deste que compreende sequências da região framework(FR) tendo substancialmente identidade (p. ex., pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade) com a sequência de aminoácidos de sequências FR de um anticorpo humano e ao menos uma CDR com identidade substancial (p. ex., pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade) com a sequência de aminoácidos de uma CDR não humana. Um anticorpo humanizado pode compreender substancialmente todos ou pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis (Fab, Fab’, F(ab’) 2, FabC, Fv) nos quais a sequência de todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana (ou seja, anticorpo doador) e a sequência de todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado pode também incluir as regiões CH1, hinge(articulação), CH2, CH3 e CH4 da cadeia pesada de um anticorpo humano. Em uma modalidade, um anticorpo humanizado também compreende pelo menos uma parte de uma região Fc de imunoglobulina humana. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém somente uma cadeia leve humanizada. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém somente uma cadeia pesada humanizada. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém somente um domínio variável humanizado de uma cadeia leve e/ou um domínio variável humanizado de uma cadeia pesada. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém uma cadeia leve, bem como pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém uma cadeia pesada, bem como ao menos o domínio variável de uma cadeia leve.

[080]Os termos “proteína de ligação com domínio variável duplo” e “imunoglobulina de domínio variável duplo” referem-se a uma proteína de ligação que possui dois domínios variáveis em cada um de seus dois braços de ligação (p. ex., um par de HC/LC) (ver a Publicação PCT N2 WO 02/02773), cada qual capaz de se ligar a um antígeno. Em uma modalidade, cada domínio variável liga-se a antígenos ou epítopos diferentes. Em outra modalidade, cada domínio variável liga- se ao mesmo antígeno ou epítopo. Em outra modalidade, uma proteína de ligação de domínio variável duplo possui dois braços idênticos de ligação a antígeno, com idêntica especificidade e sequências idênticas de CDR, e é bivalente para cada antígeno ao qual se liga. Em uma modalidade, as proteínas de ligação DVD podem ser monoespecíficas, ou seja, capazes de se ligar a um antígeno, ou multiespecíficas, ou seja, capazes de se ligar a dois ou mais antígenos. Proteínas de ligação DVD compreendendo dois polipeptídeos DVD de cadeia pesada e dois polipeptídeos DVD de cadeia leve são chamadas de DVD-lg™. Em uma modalidade, cada metade de uma proteína de ligação DVD de quatro cadeias compreende um polipeptídeo DVD de cadeia pesada e um polipeptídeo DVD de cadeia leve, e dois sítios de ligação a antígeno. Em uma modalidade, cada sítio de ligação compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve com, no total, 6 CDRs envolvidas em ligação a antígeno por sítio de ligação a antígeno.

[081]O termo “anticorpo anti-idiotípico” refere-se a um anticorpo criado contra a sequência de aminoácidos do sítio combinando o antígeno de outro anticorpo. Os anticorpos anti-idiotípicos podem ser administrados para intensificar uma resposta imune contra um antígeno.

[082]O termo “atividade biológica” refere-se a qualquer uma ou mais propriedades biológicas de uma molécula (esteja presente naturalmente como encontrada ín vivo, ou provida ou habilitada por meio recombinante). As propriedades biológicas incluem, entre outras, ligar-se a um receptor, induzir proliferação celular, inibir crescimento celular, induzir outras citocinas, induzir apoptose e atividade enzimática.

[083]O termo “neutralizar” refere-se a contrariar a atividade biológica de um antígeno quando uma proteína de ligação especificamente se liga ao antígeno. Em uma modalidade, uma proteína de ligação neutralizante liga-se a um antígeno (p. ex., uma citocina) e reduz sua atividade biológica em pelo menos cerca de 20%, 40%, 60%, 80%, 85% ou mais.

[084]“Especificidade” refere-se à habilidade de uma proteína de ligação ligar- se seletivamente a um antígeno.

[085]“Afinidade” significa a força da interação entre uma proteína de ligação e um antígeno, e é determinada pela sequência das CDRs da proteína de ligação, bem como pela natureza do antígeno, como seu tamanho, forma e/ou carga. As proteínas de ligação podem ser selecionadas por afinidades que proporcionem os desfechos terapêuticos desejados enquanto minimizando efeitos colaterais negativos. A afinidade pode ser medida utilizando métodos conhecidos pelo técnico no assunto (US 20090311253).

[086]O termo “potência” refere-se à capacidade de uma proteína de ligação para alcançar um efeito desejado, e é uma medida de sua eficácia terapêutica. A potência pode ser avaliada utilizando métodos conhecidos pelo técnico no assunto (US 20090311253).

[087]O termo “reatividade cruzada” refere-se à capacidade de uma proteína de ligação se ligar a um alvo além daquele contra o qual foi criada. Em geral, uma proteína de ligação se ligará a seu(s) tecido(s)/antígeno(s)-alvo com uma afinidade apropriadamente alta, porém exibirá uma afinidade apropriadamente baixa por tecidos/antígenos normais que não são alvos. As proteínas de ligação individuais são geralmente selecionadas para satisfazerem dois critérios: (1) ligação do anticorpo, conforme visualizada utilizando métodos de coloração conhecidos na técnica, ao tecido apropriado em relação à expressão conhecida do alvo do anticorpo e (2) um padrão semelhante de coloração entre tecidos humanos e da espécie tox (p. ex., camundongo e macaco cinomolgo) do mesmo órgão. Esses e outros métodos de avaliação da reatividade cruzada são conhecidos pelo técnico no assunto (US 20090311253).

[088]O termo “função biológica” refere-se às ações específicas in vitroou in vivo de uma proteína de ligação. As proteínas de ligação podem ser direcionadas para diversas classes de antígenos e alcançarem resultados terapêuticos desejados através de múltiplos mecanismos de ação. As proteínas de ligação podem ser direcionadas para proteínas solúveis, antígenos da superfície celular e/ou depósitos proteicos extracelulares. As proteínas de ligação pode exercer ação agonista, antagonista, ou podem neutralizar a atividade de seus alvos. As proteínas de ligação podem auxiliar a depuração dos alvos aos quais se ligam, ou podem resultar em citotoxicidade quando ligadas a células. Partes de dois ou mais anticorpos podem ser incorporados em um formato multivalente para alcançar mais de uma função distinta em uma molécula única de proteína de ligação. Ensaios in vitro e modelos in vivo usados para avaliar a função biológica são conhecidos pelo técnico no assunto (US 20090311253).

[089]Uma proteína de ligação “estável” é aquela em que a proteína de ligação retém essencialmente sua estabilidade física, estabilidade química e/ou atividade biológica quando do armazenamento. É desejável uma proteína de ligação multivalente que seja estável in vitroem várias temperaturas por um período prolongado de tempo. Métodos para estabilizar proteínas de ligação e avaliar a sua estabilidade em várias temperaturas são conhecidos pelo técnico no assunto (US 20090311253).

[090]O termo “solubilidade” refere-se à capacidade de uma proteína permanecer dispersa dentro de uma solução aquosa. A solubilidade de uma proteína em uma formulação aquosa depende da distribuição apropriada de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos e, portanto, a solubilidade pode correlacionar- se com a produção de proteínas dobradas corretamente. O técnico no assunto será capaz de detectar aumento ou diminuição na solubilidade de uma proteína de ligação utilizando técnicas rotineiras de HPLC e métodos conhecidos pelo técnico no assunto (US 20090311253).

[091]As proteínas de ligação podem ser produzidas utilizando uma variedade de células hospedeiras ou podem ser produzidas in vitro,e o rendimento relativo por esforço determina a “eficiência de produção”. Os fatores que influenciam a eficiência de produção incluem, entre outros, tipo de célula hospedeira (procariótica ou eucariótica), escolha do vetor de expressão, escolha da sequência de nucleotídeos e métodos empregados. Os materiais e métodos usados na produção de proteínas de ligação, bem como a aferição da eficiência de produção são conhecidos pelo técnico no assunto (US 20090311253).

[092]O termo “imunogenicidade” significa a capacidade de uma substância induzir uma resposta imune. A administração de uma proteína de ligação terapêutica pode resultar em certa incidência de resposta imune. Os elementos potenciais que poderiam induzir imunogenicidade em um formato multivalente podem ser analisados durante a seleção dos anticorpos parentais, e medidas para reduzir tal risco podem ser tomadas visando aperfeiçoar os anticorpos parentais antes de incorporar suas sequências em uma proteína de ligação com formato de multivalente. Os métodos para reduzir a imunogenicidade de anticorpos e proteínas de ligação são conhecidos pelo técnico no assunto (US 20090311253).

[093]Os termos “marcador” e “marcador detectável” significa uma porção anexada a um membro de um par específico de ligação, tal como um anticorpo ou seu analito, para tornar detectável uma reação (p. ex., uma ligação) entre os membros do par específico. O membro marcado do par específico de ligação é designado “marcado de maneira detectável”. Assim, o termo “proteína de ligação marcada” refere-se a uma proteína com um marcador incorporado que permite a identificação da proteína de ligação. Em uma modalidade, o marcador é um marcador detectável que pode produzir um sinal que é detectável por meio visual ou instrumental, p. ex., incorporação de um aminoácido radiomarcado ou ligação a um polipeptídeo de porções de biotinila que podem ser detectadas por avidina marcada (p. ex., estreptavidina contendo um marcador fluorescente, ou atividade enzimática que pode ser detectada por métodos ópticos ou colorimétricos). Exemplos de marcadores para polipeptídeos incluem, entre outros, os seguintes radioisótopos ou radionuclídeos (p. ex., 3H, 14C, 35S, 90Y, "Tc, 111 In, 125l, 1311, 177Lu, 166Ho ou 153Sm); cromogênios, marcadores fluorescentes (p. ex., FITC, rodamina, fósforos de lantanídeos), marcadores enzimáticos (p. ex., peroxidase de rábano, luciferase, fosfatase alcalina); marcadores quimioluminescentes; grupos de biotinila; epítopos predeterminados em polipeptídeos reconhecidos por um repórter secundário (p. ex., sequências de pares de zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação a metais, tags(etiquetas) de epítopos); e agentes magnéticos, como quelatos de gadolínio. Exemplos representativos de marcadores comumente empregados para imunoensaios incluem porções que produzem luz, p. ex., compostos de acridínio, e porções que produzem fluorescência, p. ex., fluoresceína. Nesse contexto, a própria porção pode não ser marcada de maneira detectável, mas pode tornar-se detectável quando da reação com ainda outra porção.

[094]O termo “conjugado” refere-se a uma proteína de ligação, tal como um anticorpo ou DVD-lg, que é ligado quimicamente a uma segunda porção química, como um agente terapêutico ou citotóxico. O termo “agente” inclui um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica ou um extrato feito de materiais orgânicos. Os exemplos de agentes terapêuticos ou citotóxicos incluem, entre outros, taxol, citocalasina B, gramicidina D, emetina, mitomicina, etoposido, teniposido, vincristiπa, vimblastina, doxorrubicina, daunorrubiciπa, dihidroxi-antracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1- dehidrotestosterona, glicocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, metoprolol, atenolol, bisoprolol e puromicina e seus análogos ou homólogos. Quando empregado no contexto de um imunoensaio, o conjugado pode ser um anticorpo marcado de maneira detectável ou DVD-lg marcado de maneira detectável usado como o agente de detecção.

[095]Os termos “cristal” e “cristalizado” referem-se a uma proteína de ligação (p. ex., um anticorpo), ou sua porção de ligação a antígeno, que existe na forma de um cristal. Os cristais são uma forma do estado sólido da matéria, que é distinto de outras formas como o estado sólido amorfo ou o estado cristalino líquido. Os cristais são compostos por arranjos tridimensionais regulares, repetidos de átomos, íons, moléculas (p. ex., proteínas como anticorpos) ou montagens moleculares (p. ex., complexos antígeno/anticorpo). Esses arranjos tridimensionais são organizados de acordo com relações matemáticas específicas que são bem entendidas no campo. A unidade fundamental, ou bloco de construção, a qual se repete em um cristal é denominada a unidade assimétrica. A repetição da unidade assimétrica em um arranjo que se conforma uma dada simetria cristalográfica bem definida fornece a “célula unitária” do cristal. A repetição da célula unitária por translações regulares em todas as três dimensões fornece o cristal. Ver Giege, R. e Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2- ed., p. 20 1-16, Oxford University Press, Nova York, Nova York, (1999).

[096]O termo “vetor” refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligado. Um tipo de vetor é um “plasmideo”, que se refere a uma alça circular de DNA de fita dupla, à qual podem ser ligados segmentos adicionais de DNA. Outro tipo de vetor é um vetor virai, em que segmentos adicionais de DNA podem ser ligados no genoma virai. Outros vetores incluem vetores de RNA. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (p. ex., vetores bacterianos com origem de replicação bacteriana e vetores mamíferos epissomais). Outros vetores (p. ex., vetores mamíferos não epissomais) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira quando da introdução na célula hospedeira, e assim são replicados juntamente com o genoma do hospedeiro. Certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais estão operativamente ligados. Tais vetores são designados, neste relatório descritivo, “vetores de expressão recombinante” (ou simplesmente, “vetores de expressão”). Em geral, os vetores de expressão com utilidade em técnicas do DNA recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos. Neste relatório descritivo, “plasmideo” e “vetor” podem ser usados alternadamente, pois o plasm ideo é a forma mais comumente usada de vetor. No entanto, outras formas de vetores de expressão estão também incluídas, como os vetores virais (p. ex., retrovirus com replicação defeituosa, adenovirus e vírus adenoassociados), que servem funções equivalentes. Um grupo de vetores pHybE (Pedido de Patente US Série N2 61/021 282) pode ser usado para clonagem do anticorpo parental e proteína de ligação DVD. V1, derivado de pJP183; pHybE-hCg1,z,non-a V2 não a, pode ser usado para clonagem do anticorpo e de cadeias pesadas DVD com uma região constante do tipo selvagem. V2, derivado de pJP191; pHybE-hCk V3, pode ser usado para clonagem do anticorpo e cadeias leves DVD com uma região constante kappa. V3, derivado de pJP192; pHybE-hCI V2, pode ser usado para clonagem do anticorpo e cadeias leves DVD com uma região constante lambda. V4, construído com um peptídeo de sinalização lambda e uma região constante kappa, pode ser usado para clonagem do anticorpo e cadeias leves DVD com um domínio V híbrido lambda-kappa. V5, construído com um peptídeo de sinalização kappa e uma região constante lambda, pode ser usado para clonagem do anticorpo e cadeias leves DVD com um domínio V híbrido kappa-lambda. V7, derivado de pJP183; pHybE-hCg1 ,z,non-a V2, pode ser usado para clonagem do anticorpo e cadeias pesadas DVD com uma região constante mutante (234,235 AA).

[097]Os termos “célula hospedeira recombinante” ou “célula hospedeira” referem-se a uma célula na qual DNA exógeno foi introduzido. Tais termos referem- se não só à célula específica em questão, mas também à progénie de tal célula. Pelo fato de certas modificações poderem ocorrer em gerações sucessivas em decorrência de mutação ou influências ambientais, tal progénie pode, de fato, não ser idêntica à célula original, porém são ainda assim abrangidas pelo âmbito do termo “célula hospedeira” neste relatório descritivo. Em uma modalidade, as células hospedeiras incluem células procarióticas e células eucarióticas. Em uma modalidade, as células eucarióticas incluem células de protistas, fungos, vegetais e de animais. Em outra modalidade, as células hospedeiras incluem, entre outras, a linhagem de células procarióticas de E.Colr, as linhagem de células mamíferas CHO, HEK293, COS, NSO, SP2 e PER.C6; a linhagem de células de inseto Sf9; e a célula do fungo Saccharomyces cerevisiae.

[098]O termo “transfecção” abrange uma variedade de técnicas comumente empregadas para a introdução de ácido nucleico exógeno (p. ex., DNA) em uma célula hospedeira, p. ex., eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção via DEAE-dextrana e as semelhantes.

[099]O termo “citocina” refere-se a uma proteína liberada por uma população celular que atua sobre outra população celular como um mediador intercelular. O termo “citocina” inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de células recombinantes e equivalentes biologicamente ativos das citocinas de sequências nativas.

[0100]O termo “amostra biológica” significa uma quantidade de uma substância de um ser vivo ou de um antigo ser vivo. Tais substâncias incluem, entre outros, sangue (p. ex., sangue total), plasma, soro, urina, líquido amniótico, líquido sinovial, células endoteliais, leucócitos, monócitos, outras células, órgãos, tecidos, medula óssea, linfonodos e baço.

[0101]O termo “componente” refere-se a um elemento de uma composição. Em relação a um kit diagnóstico, por exemplo, um componente pode ser um anticorpo de captura, um anticorpo de detecção ou conjugado, um controle, um calibrador, uma série de calibradores, um painel de sensibilidade, um recipiente, um tampão, um diluente, um sal, uma enzima, um cofator para uma enzima, um reagente de detecção, um reagente/solução pré-tratamento, um substrato (p. ex., como uma solução), uma solução de parada e os semelhantes que podem ser incluídos em um kit para o ensaio de uma amostra em teste. Assim, um “componente” pode incluir, em algumas modalidades, um polipeptídeo ou outro analito como acima que está imobilizado em um suporte sólido, tal como por ligação a um anticorpo anti-analito (p. ex., anti-polipeptídeo). Em algumas modalidades, um ou mais componentes podem estar em solução ou liofilizados.

[0102]“Controle” refere-se a uma composição que não compreende um analito (“controle negativo”) ou que compreende o analito (“controle positivo”). Um controle positivo pode compreender uma concentração conhecida do analito. “Controle”, “controle positivo” e “calibrador” podem ser usados alternadamente neste relatório descritivo para se referir a uma composição compreendendo uma concentração conhecida do analito. Um “controle positivo” pode ser utilizado para estabelecer características de desempenho do ensaio e é um indicador útil da integridade de reagentes (p. ex., analitos).

[0103]“Corte predeterminado” e “nível predeterminado” refere-se geralmente a um valor de corte para o ensaio que é usado para avaliar resultados de eficácia em diagnóstico/prognóstico/terapêutica ao comparar resultados do ensaio contra o corte/nível predeterminado que já foi vinculado ou associado com vários parâmetros clínicos (p. ex., gravidade de doença, progressão/não progressão/melhora, etc.). Embora a presente invenção possa fornecer níveis predeterminados exemplares, é bem conhecido que valores de corte podem variar dependendo da natureza do imunoensaio (p. ex., anticorpos empregados, etc.). Está ainda bem ao alcance de qualquer técnico no assunto adaptar a presente invenção para outros imunoensaios e obter valores de corte específicos do imunoensaio para aqueles outros imunoensaios com base nesta invenção. Enquanto o valor preciso do corte/nível predeterminado possa variar entre os ensaios, as correlações como aqui descritas (se houver) podem em geral ser aplicáveis.

[0104]Um “reagente pré-tratamento”, p. ex., um reagente de lise, precipitação e/ou solubilização, como usado em um ensaio diagnóstico aqui descrito, é aquele que provoca a lise de quaisquer células e/ou solubiliza qualquer analito que está/estão presentes em uma amostra em teste. O pré-tratamento não é necessário para todas as amostras, conforme descrito detalhadamente mais adiante. Entre outros, solubilizar o analito (p. ex., polipeptídeo de interesse) pode implicar na liberação do analito de proteínas de ligação endógenas presentes na amostra. Um reagente pré-tratamento pode ser homogêneo (não requerer uma etapa de separação) ou heterogêneo (requerer uma etapa de separação). Em algumas modalidades, quando se usa um reagente pré-tratamento heterogêneo, analito- proteínas de ligação precipitados são removidos da amostra em teste antes de prosseguir para a etapa seguinte do ensaio.

[0105]“Reagentes de controle de qualidade” no contexto de imunoensaios e kits aqui descritos, incluem, entre outros, calibradores, controles e painéis de sensibilidade. Um ou mais “calibradores” ou “padrões” são tipicamente usados a fim de serem estabelecidas curvas de calibração (padrão) para interpolação da concentração de uma molécula-alvo, como um anticorpo ou um analito. Em algumas modalidades, um calibrador único, que está próximo de um corte positivo/negativo predeterminado, pode ser usado. Alternativamente, em outras modalidades, múltiplos calibradores (ou seja, mais de um calibrador ou uma quantidade variada de calibrador(es)) podem ser utilizadas para estabelecer um “painel de sensibilidade” ou um “gradiente de sensibilidade”

[0106]O termo “parceiro de ligação específica” refere-se a um membro de um par específico de ligação. Um par específico de ligação compreende duas moléculas diferentes que se ligam especificamente uma à outra por meios químicos ou físicos. Em várias modalidades, além de ligação específica de anticorpo a antígeno, outros pares de ligação específica podem incluir biotina e avidina (ou estreptavidina), carboidratos e lectinas, sequências complementares de nucleotídeos, moléculas efetoras e receptoras, cofatores e enzimas, inibidores de enzimas e enzimas e os semelhantes. Além do mais, os pares específicos de ligação podem incluir, em algumas modalidades, membros que análogos dos membros originais da ligação específica, por exemplo, um análogo do analito. Os membros imunorreativos da ligação específica incluem antígenos, fragmentos antigênicos e anticorpos, incluindo anticorpos monoclonais e policlonais, bem como complexos, fragmentos e variantes (inclusive fragmentos de variantes) destes, quer isolados ou produzidos por recombinação.

[0107]O termo “região Fc” define a região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina, que pode ser gerada com digestão por papaína de anticorpo intacto. A região Fc pode ser uma região Fc de sequência nativa ou uma região Fc variante. A região Fc de uma imunoglobulina geralmente compreende dois domínios constantes, um domínio CH2 e um domínio CH3 e, opcionalmente, compreende um domínio CH4. Substituições de resíduos de aminoácidos na porção Fc para alterar a função efetora do anticorpo são conhecidas na técnica (p. ex., Patentes US N— 5 648 260 e 5 624 821). A região Fc medeia diversas funções efetoras importantes, p. ex., indução de citocinas, citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose, citotoxicidade dependente do complemento (CDC) e a taxa de meia- vida/depuração de anticorpos e complexos antígeno-anticorpo. Em alguns casos, essas funções efetoras são desejáveis para uma imunoglobulina terapêutica, porém, em outros casos, poderiam ser desnecessárias ou até prejudiciais, dependendo dos objetivos terapêuticos.

[0108]O termo “porção de ligação a antígeno” de uma proteína de ligação significa um ou mais fragmentos de uma proteína de ligação (p. ex., um anticorpo) que retêm a capacidade para se ligar especificamente a um antígeno. A função de ligação a antígeno de uma proteína de ligação pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo completo, bem como em formatos de biespecífico, duplo específico ou multiespecífico. Os exemplos de fragmentos de ligação abrangidos dentro do termo “porção de ligação a antígeno” de uma proteína de ligação incluem (i) fragmento Fab, um fragmento monovalente constituído pelos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) fragmento F(ab’)2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de articulação; (iii) fragmento Fd constituído pelos domínios VH e CH1; (iv) fragmento Fv constituído pelos domínios VL e VH de um braço único de um anticorpo, (v) fragmento dAb, que compreende um domínio variável único; e (vi) uma região determinante de complementaridade (CDR) isolada. Além disso, embora sejam codificados por genes separados, os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, podem ser unidos, utilizando métodos recombinantes, por um ligador sintético que lhes possibilita formar uma cadeia proteica única na qual as regiões VL e VH pareiam para formar moléculas monovalentes (conhecido como Fv de cadeia única (scFv). Tais anticorpos de cadeia única também se destinam a ser abrangidos pelo termo “porção de ligação a antígeno” de um anticorpo. Outras formas de anticorpos de cadeia única, como os díabodíes, são abrangidos também. Além disso, anticorpos de cadeia única também incluem “anticorpos lineares” compreendendo um par de segmentos Fv tandem (VH- CH1-VH-CH1) que, juntamente com polipeptídeos complementares da cadeia leve, formam um par de regiões de ligação a antígeno.

[0109]O termo “proteína de ligação multivalente” significa uma proteína de ligação compreendendo dois ou mais sítios de ligação a antígeno. Em uma modalidade, a proteína de ligação multivalente é construída para ter três ou mais sítios de ligação a antígeno, e não é um anticorpo natural. O termo “proteína de ligação multiespecífica” refere-se a uma proteína de ligação capaz de se ligar a dois ou mais alvos relacionados ou não. Em uma modalidade, as proteínas de ligação DVD aqui providas compreendem dois ou mais sítios de ligação a antígeno e são proteínas de ligação tetravalentes ou multivalentes.

[0110]O termo “ligador” significa um resíduo de aminoácido ou um polipeptídeo compreendendo dois ou mais resíduos de aminoácidos unidos por ligações peptídicas e são utilizados para ligar dois polipeptídeos (p. ex., dois domínios VH ou dois VL). Exemplos de tais polipeptídeos ligadores são bem conhecidos na técnica (ver, p. ex., Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448; Poljakefa/. (1994) Structure2:1121-1123).

[0111]Os termos “numeração de Kabat”, “definições de Kabat” e “rotulagem de Kabat” são usados alternadamente neste relatório descritivo. Esses termos, que são reconhecidos na técnica, referem-se a um sistema de numeração de resíduos de aminoácidos que são mais variáveis (ou seja, hipervariáveis) do que outros resíduos de aminoácidos nas regiões variáveis da cadeia pesada e da leve de um anticorpo, ou de sua porção de ligação a antígeno (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391 e Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication N2 91-3242). Para a região variável da cadeia pesada, a região hipervariável varia das posições 31 a 35 de aminoácidos para CDR1, posições 50 a 65 de aminoácidos para CDR2 e posições 95 a 102 de aminoácidos para CDR3. Para a região variável da cadeia leve, a região hipervariável varia das posições 24 a 34 de aminoácidos para CDR1, posições 50 a 56 de aminoácidos para CDR2 e posições 89 a 97 de aminoácidos para CDR3.

[0112]O termo “CDR” significa uma região determinante de complementaridade dentro da sequência de regiões variáveis de uma imunoglobulina. Há três CDRs em cada uma das regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve, que são designadas CDR1, CDR2 e CDR3, para cada uma das regiões variáveis da cadeia pesada e da leve. O termo “conjunto de CDR” refere-se a um grupo de três CDRs que ocorrem em uma única região variável capaz de se ligar ao antígeno. Os limites exatos dessas CDRs foram definidos de modo diferente de acordo com sistemas distintos. O sistema descrito por Kabat (Kabat et al. (1987) e (1991)) não só provê um sistema inequívoco de numeração de resíduos que pode ser aplicado a qualquer região variável de um anticorpo, mas também fornece limites precisos dos resíduos que definem as três CDRs. Essas CDRs podem ser designadas CDRs de Kabat. Chothia e colegas (Chothia e Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al. (1989) Nature342:877-883) descobriram que certas subporções dentro das CDRs de Kabat adotam conformações do esqueleto peptídico quase idênticas, apesar de terem grande diversidade em nível da sequência de aminoácidos. Essas subporções foram designadas L1, L2 e L3 ou H1, H2 e H3 onde o “L” e o “H” designam as regiões da cadeia leve e as da cadeia pesada, respectivamente. Essas regiões podem ser denominadas de CDRs de Chothia, que possuem limites que se sobrepõem às CDRs de Kabat. Outros limites definindo CDRs que se sobrepõem às CDRs de Kabat foram descritos por Padlan (1995) FASEB J. 9:133-139 e MacCalIum (1996) J. Mol. Biol. 262(5)732-45). Ainda outras definições para limites de CDR podem não seguir rigorosamente um dos sistemas no presente, porém, ainda assim se sobreporão às CDRs de Kabat, embora possam ser encurtados ou encompridados à luz da predição ou dos achados experimentais de que determinados resíduos ou grupos de resíduos ou mesmo CDRs inteiras não afetam significativamente a ligação com antígenos. Os métodos aqui empregados podem utilizar CDRs definidas de acordo com qualquer um desses sistemas, embora certas modalidades usem as CDRS definidas por Kabat ou Chothia.

[0113]O termo “epítopo” significa uma região de um antígeno que é ligada por uma proteína de ligação, p. ex., uma região capaz de se ligar especificamente a um imunoglobulina ou receptor de células T. Em certas modalidades, os determinantes do epítopo incluem agrupamentos de moléculas com superfície quimicamente ativa, como aminoácidos, cadeias laterais de açúcares, fosforila ou sulfonila e, em certas modalidades, podem ter características estruturais tridimensionais específicas e/ou características específicas de carga. Em uma modalidade, um epítopo compreende os resíduos de aminoácidos de uma região de um antígeno (ou seu fragmento) conhecido por se ligar ao sítio de complementaridade no parceiro de ligação específica. Um fragmento antigênico pode conter mais de uma epítopo. Em certas modalidades, uma proteína de ligação liga-se especificamente a um antígeno quando reconhece seu antígeno-alvo em uma mistura complexa de proteínas e/ou macromoléculas. As proteínas de ligação “ligam-se ao mesmo epítopo” se os anticorpos competirem entre si (p. ex., um impede que o outro se ligue à proteína de ligação, ou inibe o efeito modulador sobre o outro resultante da ligação à proteína de ligação). Os métodos para visualizar e para modelar o reconhecimento de epítopos são conhecidos pelo técnico no assunto (US 20090311253).

[0114]“Farmacocinética” refere-se ao processo pelo qual um fármaco é absorvido, distribuído, metabolizado e excretado por um organismo. Em algumas modalidades, para gerar uma molécula de proteína de ligação multivalente com um perfil farmacocinético desejado, anticorpos monoclonais originais com perfis farmacocinéticos igualmente desejados são selecionados. Os perfis PK dos anticorpos monoclonais parentais selecionados podem ser facilmente determinados, utilizando roedores em métodos conhecidos pelo técnico no assunto (US 20090311253).

[0115]“Biodisponibilidade” refere-se à quantidade de fármaco ativo que atinge seu alvo após a administração. A biodisponibilidade é função de diversas das propriedades previamente descritas, inclusive estabilidade, solubilidade, imunogenicidade e farmacocinética, e pode ser avaliada utilizando métodos conhecidos pelo técnico no assunto (US 20090311253).

[0116]O termo “ressonância plasmônica de superfície” significa um fenômeno óptico que permite a análise de interações bioespecíficas em tempo real pela detecção de alterações em concentrações proteicas dentro de uma matriz biossensora, utilizando o sistema BIAcore® (BIAcore International AB, a empresa da GE Healthcare Co., Uppsala, Suécia e Piscataway, NJ). Para descrições adicionais, ver Jõnsson et al. (1993) Ann. Biol. Clin.51:19-26. O termo “Kon” significa a constante para a taxa de associação de uma proteína de ligação (p. ex., um anticorpo ou DVD) ao antígeno para formar um complexo ligado (p. ex., um complexo DVD/antígeno). O termo “Kon” também significa “constante da taxa de associação”, ou “ka”, conforme usado alternadamente neste relatório descritivo. Esse valor indicando a taxa de ligação de uma proteína de ligação a seu alvo antigênico ou a taxa de formação e complexo entre proteína de ligação, (p. ex., um anticorpo) e antígeno. O valor é também mostrado pela equação abaixo: Anticorpo (“Ab”) + Antígeno (“Ag”)^Ab-Ag

[0117]O termo “Koff” significa a constante para a taxa de dissociação, ou “constante da taxa de dissociação", de uma proteína de ligação (p. ex., um anticorpo ou DVD) de um complexo ligado (p. ex., um complexo DVD/antígeno), como é conhecida na técnica. Esse valor indica a taxa de dissociação de uma proteína de ligação (p. ex., um anticorpo) de seu alvo antigênico ou a separação de um complexo Ab-Ag ao longo do tempo em anticorpo e antígeno livres, conforme mostrado pela equação abaixo: Ab + Ag^Ab-Ag

[0118]Os termos “KD” e “constante de dissociação de equilíbrio” significa o valor obtido em uma medição da titulação no equilíbrio, ou dividindo a constante para a taxa de dissociação (Koff) pela constante para a taxa de associação (Kon). A constante para a taxa de associação, a constante para a taxa de dissociação e a constante de dissociação de equilíbrio são utilizadas para representar a afinidade de ligação de uma proteína de ligação (p. ex., um anticorpo ou DVD) a um antígeno. Métodos para determinar as constantes para a taxa de associação e de dissociação são bem conhecidos na técnica. O uso de técnicas à base de fluorescência oferece alta sensibilidade e a capacidade para examinar amostras em tampões fisiológicos no equilíbrio. Outras abordagens experimentais e instrumentos como um ensaio BIAcore® (análise da interação biomolecular) podem ser utilizados (p. ex., instrumento disponibilizado pela BIAcore International AB, uma empresa da GE Healthcare, Uppsala, Suécia). Adicionalmente, um ensaio KinExA® (Ensaio de Exclusão Cinética), disponibilizado pela Sapidyne Instruments (Boise, Idaho), pode também ser utilizado.

[0119]O termo “variante” significa um polipeptídeo que difere de um determinado polipeptídeo na sequência de aminoácidos pela adição (p. ex., inserção), deleção ou substituição conservadora de aminoácidos, mas que retém a atividade biológica do determinado polipeptídeo (p. ex., um anticorpo variante contra VEGF pode competir com um anticorpo anti-VEGF pela ligação ao VEGF). Uma substituição conservadora de um aminoácido, ou seja, substituir um aminoácido por um aminoácido diferente com propriedades semelhantes (p. ex., hidrofilicidade e/ou grau ou distribuição de regiões com carga) é reconhecida na técnica por envolver tipicamente uma alteração mínima. Essas alterações mínimas podem ser identificadas, em parte, considerando o índice hidropático dos aminoácidos, como entendido na técnica (ver, p. ex., Kyte et al. (1982) J. Mol. Biol. 157: 105-132). Em um aspecto, aminoácidos com índices hidropáticos de ± 2 são substituídos. A hidrofilicidade dos aminoácidos também pode ser usada para revelar substituições que resultariam em proteínas que retêm a função biológica. Uma consideração da hidrofilicidade de aminoácidos no contexto de um peptídeo permite calcular a maior hidrofilicidade média local daquele peptídeo, uma medida útil que, segundo relatado, correlaciona-se bem com antigenicidade e imunogenicidade (ver, p. ex., a Patente US N2 4 554 101). A substituição de aminoácidos com valores semelhantes de hidrofilicidade pode resultar em peptídeos que retêm a atividade biológica, por exemplo, imunogenicidade, como entendido na técnica. Em um aspecto, as substituições são realizadas com aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade estão dentro de ± 2 um do outro. O índice de hidrofobicidade e o valor de hidrofilicidade de aminoácidos são influenciados pela cadeia lateral específica daquele aminoácido. Coerentemente com essa observação, entende-se que as substituições de aminoácidos que são compatíveis com função biológica dependem da similaridade relativa dos aminoácidos e, especialmente, das cadeias laterais daqueles aminoácidos, como revelado pela hidrofobicidade, carga, tamanho e outras propriedades. O termo “variante” também inclui polipeptídeos ou seus fragmentos que foram processados de modo diferente, como por proteólise, fosforilação ou outra modificação pós-tradução, mas que, não obstante, retêm atividade biológica e/ou reatividade ao antígeno, p. ex., a capacidade de se ligar a VEGF e/ou DLL4. O termo “variante” abrange fragmentos de uma variante a menos que definido de outra forma. Uma variante pode ser 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%,85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76% ou 75% idêntica à sequência do tipo selvagem. I. Geração de proteínas de ligação

[0120]São providas proteínas de ligação capazes de se ligar a dois antígenos diferentes, além de métodos para criar as proteínas. A proteína de ligação pode ser gerada utilizando várias técnicas. Vetores de expressão, célula hospedeira e métodos para gerar a proteína de ligação são também providos. A. Geração de anticorpos monoclonais parentais

[0121]Os domínios variáveis da proteína de ligação DVD podem ser obtidos de anticorpos originais (Abs), incluindo Abs policlonais e Abs monoclonais (mAbs) capazes de se ligar aos antígenos de interesse. Esses anticorpos podem ser naturais ou ser gerados por tecnologia recombiπante. O técnico no assunto está bastante familiarizado com muitos métodos para produzir anticorpos, inclusive, entre outros, utilizando técnicas do hibridoma, método de anticorpo por linfócitos selecionados (SLAM), uso de expressão (display)em fago, levedura ou fusão de RNA-proteína ou em outra biblioteca, imunizar um animal não humano compreendendo ao menos alguns dos locide imunoglobulinas humanas e preparar anticorpos quiméricos, enxertados com CDR e humanizados. Ver, p. ex., a Publicação da Patente US N2 20090311253 A1. Domínios variáveis podem também ser preparados utilizando técnicas de maturação de afinidade. B. Critérios para selecionar anticorpos monoclonais parentais

[0122]Uma modalidade provê selecionar anticorpos originais com pelo menos uma ou mais propriedades desejadas na molécula da proteína de ligação DVD. Em uma modalidade, a propriedade desejada representa um ou mais parâmetros de anticorpos como, por exemplo, especificidade por antígeno, afinidade a antígeno, potência, função biológica, reconhecimento de epítopo, estabilidade, solubilidade, eficiência de produção, imunogenicidade, farmacocinética, biodisponibilidade, reatividade cruzada em tecidos ou ligação a antígeno ortólogo. Ver, p. ex., a Publicação da Patente US N2 20090311253. C. Moléculas de proteínas de ligação

[0123]Em várias modalidades, a proteína de ligação pode ser projetada de tal modo que dois domínios variáveis diferentes de cadeia leve (VL) dos dois anticorpos monoclonais originais diferentes sejam ligados em tandem diretamente ou via um ligador por técnicas do DNA recombinante, seguidos pelo domínio constante de cadeia leve CL. Do mesmo modo, a cadeia pesada compreende dois domínios variáveis diferentes de cadeia pesada (VH) ligados em tandem, diretamente ou via um ligador, seguidos pelo domínio constante CH1 e região Fc (Figura 1).

[0124]Em várias modalidades, os domínios variáveis podem ser obtidos utilizando técnicas do DNA recombinante de anticorpos originais gerados por qualquer dos métodos aqui descritos. Em uma modalidade, o domínio variável é um domínio variável murinho de cadeia pesada ou de leve. Em outra modalidade, o domínio variável é uma CDR enxertada ou um domínio variável humanizado de cadeia pesada ou de leve. Em uma modalidade, o domínio variável é um domínio variável humano de cadeia pesada ou de leve.

[0125]Em várias modalidades, a sequência do ligador pode ser um aminoácido único ou uma sequência polipeptídica. Em uma modalidade, a escolha de sequências do ligador tem como base a análise da estrutura cristalina de diversas moléculas de Fab. Há uma ligação flexível natural entre o domínio variável e o domínio constante CH1/CL na estrutura molecular de Fab ou do anticorpo. Essa ligação natural compreende em geral aproximadamente 10-12 resíduos de aminoácidos, contribuídos por 4-6 resíduos da terminação C de um domínio V e 4-6 resíduos da terminação N de um domínio CL/CH1. Em algumas modalidades, são geradas proteínas de ligação DVD utilizando 5-6 resíduos de aminoácidos ou 11-12 resíduos de aminoácidos N-terminais de um CL ou CH1 como ligador na cadeia leve e nas cadeias pesadas, respectivamente. Os resíduos no N-terminal de um domínio CL ou domínios CH1, especialmente os primeiros 5-6 resíduos de aminoácidos, pode adotar uma conformação em alça sem estruturas secundárias fortes e, portanto, podem agir como ligadores flexíveis entre os dois domínios variáveis. Os resíduos no N-terminal de um domínio CL ou domínios CH1 são uma extensão natural dos domínios variáveis, pois integram as sequências de lg e, por conseguinte, seu uso minimiza em grande medida qualquer imunogenicidade potencialmente provocada pelos ligadores e junções.

[0126]Em várias modalidades, as proteínas de ligação aqui descritas incluem ao menos um ligador compreendendo uma ou mais das SEQ ID NO: 1-38 (Tabela 1). Em uma modalidade, X2 é uma região Fc. Em outra modalidade, X2 é uma região Fc variante. Tabela 1: Lista de sequências de ligadores

[0127]Outras sequências do ligador podem incluir qualquer sequência de qualquer comprimento derivada de um domínio CL/CH1, mas nem todos os resíduos de um domínio CL/CH1; por exemplo, os primeiros 5-12 resíduos de aminoácidos de um domínio CL/CH1. Em outro exemplo, os ligadores da cadeia leve podem ser selecionados a partir de CK OU CÀ; e os ligadores da cadeia pesada podem ser derivados de CH1 de qualquer isotipo, incluindo Cy1, Cy2, CY3, Cy4, Cα1, Cα2, Cδ, Cε e Cp. As sequências do ligador podem também ser derivadas de outras proteínas como de proteínas semelhantes à lg (p. ex., TCR, FcR, KIR); sequências com base em G/S (p. ex., repetições G4S); sequências derivadas da região de articulação; e outras sequências naturais de outras proteínas. Outras sequências do ligador podem incluir qualquer sequência de qualquer comprimento compreendendo repetições G/S (p. ex., uma sequência compreendendo repetições de um motivo GGGS) ou quaisquer outros ligadores peptídicos.

[0128]Em uma modalidade, um domínio constante é unido aos dois domínios variáveis ligados utilizando técnicas do DNA recombiπante. Em uma modalidade, uma sequência compreendendo domínios variáveis ligados de cadeia pesada é ligada a um domínio constante de cadeia pesada e uma sequência compreendendo domínios variáveis ligados de cadeia leve é ligada a um domínio constante de cadeia leve. Em uma modalidade, os domínios constantes são domínios constantes humanos de cadeia pesada e domínios constantes humanos de cadeia leve respectivamente. Em uma modalidade, a cadeia pesada DVD é ainda ligada a uma região Fc. A região Fc pode ser uma região Fc de sequência nativa ou uma região Fc variante. Em outra modalidade, a região Fc é uma região Fc humana. Em outra modalidade, a região Fc inclui a região Fc de lgG1, lgG2, lgG3, lgG-4, IgA, IgM, IgE ou IgD.

[0129]Em uma modalidade, um anticorpo ou seu fragmento funcional de ligação a antígeno é descrito, compreendendo um anticorpo com um sítio de ligação funcional para um dos alvos antigênicos listados na Tabela 2 e compreendendo uma região VH e VL pareadas selecionadas a partir dos pares listados na Tabela 2, ou compreendendo regiões CDR daquelas regiões VH e VL. Por exemplo, o anticorpo pode compreender regiões VH e VL da Tabela 2 que formam um sítio de ligação funcional para DLL4. Em uma modalidade, um fragmento funcional de ligação a antígeno retém regiões do domínio variável (p. ex., as regiões CDR retiradas das sequências pareadas de VH e VL na Tabela 2) suficientes para ligar o alvo antigênico. Um fragmento funcional de ligação a antígeno pode incluir um fragmento de anticorpo humanizado, inteiramente humano, camelizado, de cadeia única, quimérico, sintético, recombinante, híbrido, mudado por mutação, restaurado ao estado original por mutação de volta ou enxertado com CDR, ou um fragmento Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, VHH (também designado nanobody) ou outro de anticorpo que retenha a função de ligação ao antígeno, incluindo anticorpos biespecíficos ou multiespecíficos.

[0130]Em uma modalidade, uma proteína de ligação é descrita e compreende domínios variáveis selecionados a partir daqueles na Tabela 2. Em uma modalidade, uma proteína de ligação compreende uma primeira cadeia e uma segunda cadeia e dois sítios funcionais de ligação, como descritos acima, e em que a primeira e a segunda cadeia da proteína de ligação formam dois sítios de ligação funcionais para um ou mais dos alvos antigênicos listados na Tabela 2. Em uma modalidade, cada sítio funcional de ligação compreende sequências pareadas de VH e VL selecionadas a partir dos pares listados na Tabela 2 (p. ex., as sequências pareadas de VH e VL que formam um sítio de ligação para DLL4), ou compreendendo as regiões CDR daquelas regiões VH e VL. Em algumas modalidades, a primeira cadeia compreende uma primeira sequência de VH e uma segunda sequência de VH selecionadas a partir da Tabela 2, ou contém as sequências de CDRs daquelas sequências de VH, e uma segunda cadeia compreendendo uma primeira sequência de VL e uma segunda sequência de VL selecionadas a partir da Tabela 2, ou contém as sequências de CDRs daquelas sequências de VL. Em outras modalidades, o arranjo VH-VL do primeiro ou do segundo sítio de ligação é invertido ao longo das duas cadeias, de tal modo que cada cadeia compreende um domínio VH de um sítio de ligação e um domínio VL do outro sítio de ligação, enquanto retendo dois sítios funcionais de ligação.

[0131]Em uma modalidade, dois polipeptídeos DVD de cadeia pesada e dois polipeptídeos DVD de cadeia leve são combinados para formar uma proteína de ligação DVD. A Tabela 2 lista sequências de aminoácidos de regiões VH e VL de anticorpos exemplares úteis para tratar doença. Em uma modalidade, é provido um DVD compreendendo pelo menos duas das regiões VH e/ou VL listadas na Tabela 2, em qualquer orientação, em que pelo menos uma das sequências de VH e/ou VL é SEQ ID NO: 39 ou SEQ ID NO: 40. Em algumas modalidades, VD1 e VD2 são escolhidos independentemente. As sequências dos domínios VH e VL fornecidas abaixo compreendem regiões determinantes de complementaridade (CDRs) e sequências de arcabouço (framework).Em algumas modalidades, uma ou mais dessas CDRs e/ou sequências de arcabouço são substituídas, sem perda de função, por outras CDRs e/ou sequências de arcabouço de proteínas de ligação que são conhecidas na técnica por se ligarem ao mesmo antígeno. Tabela 2: Lista de sequências de aminoácidos de regiões VH e VL de anticorpos anti-DLL4 e anti-VEGF para geração de proteínas de ligação, incluindo proteínas de ligação multivalentes (sequências de CDR em negrito)

[0132]Em algumas modalidades, são providas proteínas de ligação DVD, compreendendo uma região VH selecionada a partir de SEQ ID NO: 55-63. Em certas modalidades, uma proteína de ligação DVD compreende uma região VL selecionada a partir de SEQ ID NO: 64-73. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação DVD compreende uma região VH selecionada a partir de SEQ ID NO: 55- 63 e 74 e uma região VL selecionada a partir de SEQ ID NO: 64-73. As sequências de aminoácidos para esses domínios VH e VL são mostradas na Tabela 3. Tabela 3: Proteínas de ligação DVD direcionadas contra epítopos de DLL4 e VEGF (Sequência do ligante sublinhada; sequências de CDRs em negrito)

Tabela 3a: Proteínas de ligação completas direcionadas contra epítopos de DLL4 e VEGF

[0133]A Tabela 3a fornece as sequências completes da cadeia pesada e da leve para proteínas de ligação direcionadas contra VEGF e DLL4. As sequências do ligador estão sublinhadas, enquanto as CDRs e as sequências de regiões constantes estão em negrito.

[0134]Descrições detalhadas de proteínas de ligação DVD específicas capazes de se ligar a métodos específicos e de métodos para criar as proteínas são fornecidos na seção de Exemplos abaixo. D. Produção de proteínas de ligação

[0135]As proteínas de ligação aqui providas podem ser produzidas por qualquer uma de uma série de técnicas conhecidas no assunto. Por exemplo, as proteínas de ligação podem ser expressas em células hospedeiras, em que o(s) vetor(es) de expressão que codifica(m) as cadeias pesada DVD e leve DVD é (são) transfectado(s) em uma célula hospedeira por técnicas padrão. Em algumas modalidades, as proteínas de ligação DVD aqui providas são expressas em células hospedeiras procarióticas. Em outras modalidades, as proteínas de ligação DVD são expressas em células eucarióticas, por exemplo, células hospedeiras de mamíferos.

[0136]Em um sistema exemplar para expressão recombinante de proteínas DVD, um vetor de expressão recombinante codificador da cadeia pesada DVD e da cadeia leve DVD é introduzido em células DHFR-CHO por transfecção mediada por fosfato de cálcio. Dentro do vetor de expressão recombinante, os genes da cadeia pesada e leve DVD são cada um ligados operativamente a elementos reguladores: intensificador CMV/promotor AdMLP para direcionar altos níveis de transcrição dos genes. O vetor de expressão recombinante também carrega um gene DHFR, que permite a seleção de células CHO que foram transfectadas com o vetor utilizando seleção/amplificação por metotrexato. As células hospedeiras selecionadas são cultivadas para permitir a expressão das cadeias pesadas e leves DVD e a proteína DVD intacta é recuperada do meio de cultura. Técnicas padrão da biologia molecular são utilizadas para preparar o vetor de expressão recombinante, transfectar as células hospedeiras, selecionar transformantes, cultivar as células hospedeiras e recuperar a proteína DVD do meio de cultura. Em várias modalidades, a presente invenção também provê um método de síntese de uma proteína DVD, em que uma célula hospedeira é cultivada em um meio de cultura adequado até que uma proteína DVD seja sintetizada. Em algumas modalidades, o método pode compreender ainda isolar a proteína DVD do meio de cultura.

[0137]Um aspecto de uma proteína de ligação DVD é que esta pode ser produzida e purificada de maneira semelhante a um anticorpo convencional. Em algumas modalidades, a produção de uma proteína de ligação DVD resulta em um produto principal único homogêneo com atividade duplo-específica desejada, sem a necessidade de modificar a sequência da região constante ou de modificações químicas. Outros métodos previamente descritos para gerar proteínas de ligação completas “biespecíficas”, “multiespecíficas” e “multivalentes multiespecíficas” podem levar à produção intracelular ou secretada de uma mistura de proteínas de ligação completas montadas inativas, monoespecíficas, multiespecíficas, multivalentes e de proteínas de ligação completas com uma combinação de diferentes sítios de ligação.

[0138]Em algumas modalidades, o desenho das proteínas DVD aqui providas leva a uma cadeia leve com domínio variável duplo e a uma cadeia pesada com domínio variável duplo que se montam primariamente e formam as “proteínas de completas duplo-específicas multivalentes” desejadas depois da expressão em células hospedeiras.

[0139]Em algumas modalidades, pelo menos 50%, pelo menos 75% ou pelo menos 90% (ou qualquer porcentagem intermediária) das moléculas expressas e montadas de imunoglobulinas de domínio variável duplo são da proteína tetravalente duplo-específica desejada e, portanto, possuem utilidade comercial reforçada. Assim, em certas modalidades, é provido um método para expressar uma cadeia leve com domínio variável duplo e uma cadeia pesada com domínio variável duplo em uma única célula, levando a um produto primário único de uma “proteína de ligação completa duplo-específica tetravalente”.

[0140]Em várias modalidades, são providos métodos para expressar uma cadeia leve com domínio variável duplo e uma cadeia pesada com domínio variável duplo em uma única célula, levando a um “produto primário” de “proteína de ligação completa duplo-específica tetravalente”, em que o “produto primário” constitui mais de 50%, tal como mais de 75% ou mais de 90% (ou qualquer porcentagem intermediária) de toda a proteína montada, compreendendo uma cadeia leve com domínio variável duplo e uma cadeia pesada com domínio variável duplo. II. Usos de proteínas de ligação

[0141]Dado à sua capacidade para se ligar a um, dois ou mais antígenos, as proteínas de ligação aqui providas podem ser utilizadas, em certas modalidades, para detectar o(s) antígeno(s) em uma amostra (p. ex., uma amostra biológica, como soro ou plasma), por meio de um imunoensaio convencional, como ensaios imunoenzimáticos (ELISA), radioimunoensaio (RIA) ou de imunohistoquímica em tecidos. Em algumas modalidades, a proteína de ligação é marcada direta ou indiretamente com uma substância detectável para facilitar a detecção do anticorpo ligado ou não ligado. As substâncias detectáveis adequadas incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes e materiais radioativos. Os exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, β-galactosidase ou acetilcolinesterase; os exemplos de complexos de grupos prostéticos incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; os exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila ou ficoeritrina. Um exemplo de material luminescente é luminol e exemplos de materiais radioativos adequados incluem 3H, 14C, 35S, 90Y, "Tc, 111ln, 125l, 131l, 177Lu, 166Ho e 153Sm.

[0142]Em várias modalidades, as proteínas de ligação aqui providas são capazes de neutralizar a atividade de seus alvos antigênicos in vitroe/ou in vivo. Consequentemente, em certas modalidades as proteínas de ligação podem ser utilizadas para inibir a atividade antigênica, p. ex., em uma cultura celular contendo os antígenos, em humanos ou em outros mamíferos que são portadores dos antígenos com os quais uma proteína de ligação reaja de modo cruzado. Em outra modalidade, é provido um método para reduzir a atividade antigênica em um humano ou animal não humano que sofre de uma doença ou transtorno no qual o antígeno é prejudicial. Em várias modalidades, uma proteína de ligação aqui provida pode ser administrada a um humano ou um animal não humano para fins diagnósticos ou terapêuticos (p. ex., detectar ou tratar uma doença, tal qual uma doença caracterizada por expressão anormal de VEGF e/ou DLL4).

[0143]Neste relatório descritivo, a expressão “transtorno no qual a atividade antigênica é prejudicial” destina-se a incluir doenças e/ou outros transtornos nos quais a presença do antígeno em uma pessoa sofrendo do transtorno demonstrou ser ou há suspeita de que seja responsável pela fisiopatologia do transtorno e/ou um fator que contribui para o agravamento do transtorno. Dessa forma, um transtorno no qual a atividade antigênica é prejudicial é um transtorno no qual se prevê que a redução da atividade antigênica alivie os sintomas e/ou a progressão do transtorno. Tais transtornos podem ser evidenciados, por exemplo, por um aumento na concentração do antígeno em um líquido biológico de uma pessoa que sofre do transtorno (p. ex., um aumento da concentração de antígeno no soro, plasma, líquido sinovial, etc., da pessoa). Exemplos não limitantes de transtornos que podem ser tratados com as proteínas de ligação aqui providas incluem aqueles transtornos discutidos abaixo e na seção pertencente a composições farmacêuticas compreendendo as proteínas de ligação.

[0144]Em várias modalidades, as proteínas de ligação DVD são úteis como agentes terapêuticos para aumentar a ligação a um antígeno prejudicial e/ou bloquear simultaneamente dois alvos antigênicos diferentes (DLL4 e/ou VEGF) visando intensificar a eficácia/segurança e/ou ampliar a cobertura ao paciente.

[0145]Adicionalmente, em algumas modalidades, as proteínas de ligação DVD aqui providas podem ser empregadas para liberação específica a tecidos (p. ex., direcionar um marcador tecidual e/ou mediador de doença para reforçar a PK local, assim permitindo elevar a eficácia e/ou reduzir a toxicidade), incluindo liberação intracelular (p. ex., direcionamento de um DVD para uma molécula intracelular). Em algumas modalidades, as proteínas de ligação DVD podem também servir como proteínas transportadoras para liberar antígenos em um local específico por intermédio da ligação a um epítopo não neutralizante daquele antígeno e também aumentar a meia-vida do antígeno. Além do mais, uma proteína de ligação DVD pode ser criada, em certas modalidades, para se ligar fisicamente a dispositivos médicos implantados em pacientes ou para direcionar esses dispositivos médicos (ver Burke et al. (2006) Advanced Drug Deliv. Rev. 58(3): 437-446; Hildebrand et al. (2006) Surface and Coatings Techno/. 200(22-23): 6318-6324; Drug/device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis, Wu (2006) Biomaterials 27(11):2450-2467; Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices, Marques (2005) Biodegradable Systems in Tissue Engineer. Regen. Med. 377-397). A. Uso de proteínas de ligação em várias doenças

[0146]Em várias modalidades, as proteínas de ligação aqui providas são úteis como moléculas terapêuticas para tratar várias doenças ou transtornos, p. ex., doenças ou transtornos associados com a expressão ou níveis de expressão prejudiciais de DLL4 e/ou VEGF. Em algumas modalidades, uma ou mais proteínas de ligação podem ser administradas para diagnosticar, tratar ou reforçar terapias antitumorais e/ou podem ser benéficas no tratamento de cânceres primários e/ou metastáticos. Em várias modalidades, uma ou mais proteínas de ligação podem ser administradas para diagnosticar, tratar ou reforçar o tratamento de uma condição oncológica. Em outras modalidades, uma ou mais proteínas de ligação podem ser administradas para diagnosticar, tratar ou reforçar o tratamento de qualquer outra doença ou transtorno caracterizado por angiogênese anormal (p. ex., transtornos autoimunes ou inflamatórios em geral, cicatrização de feridas). Em várias modalidades, a administração de uma ou mais proteínas de ligação leva à ligação com VEGF e/ou DLL4, o que pode neutralizar ou de outra forma reduzir os níveis de VEGF e/ou DLL4 em um paciente sofrendo de uma condição caracterizada por níveis excessivos de VEGF e/ou DLL4.

[0147]Sem limitar a invenção, são fornecidas informações adicionais sobre certas condições de doença. 1. Transtornos oncológicos

[0148]A terapia com anticorpos monoclonais surgiu como uma importante modalidade terapêutica para o câncer (von Mehren et al. (2003) Annu. Rev. Med. 54:343-69). O uso de um anticorpo duplo-específico, como aqui descrito, que é direcionado para dois mediadores oncogênicos separados, provavelmente oferecerá benefício adicional quando comparado a uma terapia monoespecífica.

[0149]Em várias modalidades, as doenças oncológicas que podem ser diagnosticadas e/ou tratadas com as composições e métodos aqui providos incluem, entre outros, câncer primário ou metastático, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de reto, câncer de pulmão, câncer pulmonar de células não pequenas, adenocarcinoma, câncer de orofaringe, câncer de hipofaringe, câncer esofágico, câncer de estômago, câncer pancreático, câncer de fígado, câncer de vesícula biliar, câncer de duetos biliares, câncer do intestino delgado, câncer do trato urinário, (incluindo rim, bexiga e urotélio), câncer do trato genital feminino (incluindo colo do útero, útero e ovários, bem como coriocarcinoma e doença trofoblástica gestacional), câncer do trato genital masculino (incluindo próstata, vesículas seminais, testículos e tumores de células germ inativas), câncer de glândulas endócrinas (incluindo a tireoide, glândulas adrenais e hipófise), câncer de pele, hemangiomas, melanomas, sarcomas (incluindo aqueles de origem óssea e em tecidos moles, bem como sarcoma de Kaposi), tumores do cérebro, nervos, olhos e meninges (incluindo astrocitomas, gliomas, glioblastomas, retinoblastomas, neuromas, neuroblastomas, Schwannomas e meningiomas), tumores sólidos resultantes de malignidades hematopoiéticas como leucemias e linfomas (linfoma de Hodgkin e de não Hodgkin), câncer do estômago, câncer da bexiga, câncer de próstata, câncer retal, malignidades hematopoiéticas, leucemia, linfoma, Abetalipoprotemia, acrocianose, processos parasitários ou infecciosos agudos e crônicos, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), linfoma de células B, linfoma de Burkitt, leucemia mielocítica crônica (LMC), leucemia linfocítica crônica (LLC), carcinoma colorretal, leucemia de células cabeludas, doença de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, linfoma maligno, histiocitose maligna, melanoma maligno, mieloma múltiplo, linfoma não Hodgkin, carcinoma pancreático, síndrome para neoplásica/hipercalcemia de malignidade, sarcomas, tumores sólidos ou quaisquer outras doenças independentes ou dependentes de angiogênese, caracterizadas por atividade anormal de DLL4 ou VEGF.

[0150]Em várias modalidades, as proteínas de ligação DVD que ligam DLL4 e/ou VEGF, ou suas porções de ligação a antígeno, são utilizadas para diagnosticar e/ou tratar câncer e/ou para prevenir metástase, seja quando usadas isoladamente ou em combinação com radioterapia e/ou outros agentes quimioterápicos. 2. Degeneração macular

[0151]Em várias modalidades, as composições e métodos aqui providos podem ser utilizados para tratar degeneração macular, incluindo degeneração macular neovascular (úmida). A degeneração macular é uma condição médica que resulta em perda da visão no centro do campo visual em decorrência de danos à retina. A degeneração macular neovascular (úmida) resulta do crescimento anormal de vasos sanguíneos, levando no final ao extravasamento de sangue e proteínas abaixo da mácula que podem causar danos irreversíveis aos fotorreceptores.

[0152]Em várias modalidades, são utilizados DVDs que ligam DLL4 e/ou VEGF, ou suas porções de ligação a antígeno, para diagnosticar e/ou tratar degeneração macular, seja quando usados isoladamente ou em combinação com outros agentes terapêuticos. 3. Diabetes e retinopatia diabética

[0153]O diabetes mellitus tipo 1 é uma forma de diabetes mellitus que resulta da destruição autoimune de células beta produtoras de insulina no pâncreas. A falta subsequente insulina leva a níveis aumentos de glicose no sangue e na urina. A retinopatia diabética envolve dano à retina como complicação do diabetes.

[0154]A retinopatia diabética é o resultado de pequenas alterações no sistema vascular da retina que decorrem da morte dos pericítos induzida por hiperglicemia e do enfraquecimento das paredes vasculares. À medida que a doença progride, a retinopatia diabética não proliferativa grave entra em estágio avançado no qual há proliferação de vasos sanguíneos. Sem tratamento, os novos vasos sanguíneos podem sangrar, provocando mais danos à retina. A proliferação fibrovascular pode também causar deslocamento da retina. Os vasos sanguíneos em proliferação podem crescer também em direção à câmara anterior do olho e causar glaucoma neovascular.

[0155]Acredita-se que a sinalização de VEGF e DLL4 desempenhe importantes papéis na mediação de disfunção endotelial e vasculopatia diabética, incluindo envolvimento na patogênese da nefropatia e da retinopatia diabética. J. Exp. Med. 209(5): 1011-28 (2012); Nephrol. Dial. Transplant.18(8): 1427-1430 (2003); PNAS 109(27): E1868-77 (2012); Pedido de Patente US l\P 20110189176 (Skokos et al). Dessa forma, VEGF e DLL4 podem representar alvos potenciais para o diagnóstico e/ou terapia do diabetes e/ou da retinopatia diabética utilizando um DVD da presente invenção (p. ex., para identificar níveis séricos e/ou alterar níveis de VEGF e/ou DLL4 em um paciente). Em várias modalidades, DVDs que ligam DLL4 e/ou VEGF, ou suas porções de ligação a antígeno, são utilizados para diagnosticar e/ou tratar diabetes mellitus tipo 1 e/ou retinopatia diabética, seja quando usados isoladamente ou em combinação com outros agentes terapêuticos. 4. Aterosclerose

[0156]Acredita-se que VEGF e DLL4 estejam envolvidos na progressão da aterosclerose. Circulation98(20):2108-16 (1998); PNAS 109(27): E1868-77 (2012). Especificamente, a expressão de VEGF foi demonstrada em lesões ateroscleróticas de artérias coronárias humanas, sugerindo uma função para o VEGF na progressão da aterosclerose coronária humana, bem como em processos de recanalização em doenças coronárias obstrutivas. Do mesmo modo, a inibição da via de sinalização de DLL4 usando um anticorpo neutralizante anti-DLL4 demonstrou atenuar o desenvolvimento da aterosclerose e diminuir a calcificação de placas. Assim, os níveis de VEGF e DLL4 podem representar alvos potenciais para o diagnóstico e/ou terapia da aterosclerose utilizando um DVD da presente invenção (p. ex., para identificar níveis séricos e/ou alterar níveis de VEGF e/ou DLL4 em um paciente). Em várias modalidades, DVDs que ligam DLL4 e/ou VEGF, ou suas porções de ligação a antígeno, são utilizados para diagnosticar e/ou tratar aterosclerose, seja quando usados isoladamente ou em combinação com outros agentes terapêuticos. III. Composições farmacêuticas

[0157]Em várias modalidades, a presente invenção provê composições farmacêuticas compreendendo uma ou mais proteínas de ligação, seja isoladamente ou em combinação com agentes profiláticos, agentes terapêuticos e/ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Em várias modalidades, exemplos não limitantes dos usos das composições farmacêuticas aqui descritas incluem diagnosticar, detectar e/ou monitorar um transtorno, prevenir, tratar, controlar e/ou melhorar um transtorno ou um ou mais de seus sintomas e/ou em pesquisa. A formulação de composições farmacêuticas, isoladamente ou em combinação com agentes profiláticos, agentes terapêuticos e/ou veículos farmaceuticamente aceitáveis, é conhecida pelo técnico no assunto (Publicação de Patente US N2 20090311253 A1).

[0158]Em várias modalidades, uma formulação farmacêutica compreende um ou mais aminoácidos, um ou mais polissacarídeos e/ou polissorbato e uma proteína de ligação presente a uma concentração entre aproximadamente 0,1 e 100 mg/mL, inclusive os pontos finais (p. ex., 0.1-10, 1-10, .01-50, 1-50, 1-100, 10-100, 25-100, 25-50 ou 50-100 mg/mL), em que a formulação está a um pH entre aproximadamente 5,0 e 7,0, inclusive os pontos finais (p. ex., um pH de aproximadamente 5,0-6,0, 5,5-6,0, 5,0-6,5, 5,5-6,5 ou 6,0-7,0). Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende primeiras e segundas cadeias polipeptídicas, em que cada uma das primeiras e segundas cadeias polipeptídicas compreende independentemente VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, em que VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 é um segundo domínio variável, C é um domínio constante, X1 é um ligador, X2 é uma região Fc e n é 0 ou 1, em que os domínios VD1 na primeira e na segunda cadeia polipeptídica formam um primeiro sítio de ligação ao alvo funcional e os domínios VD2 na primeira e na segunda cadeia polipeptídica formam um segundo sítio de ligação ao alvo funcional. Em uma modalidade, a proteína de ligação compreende uma primeira cadeia polipeptídica incluindo a SEQ ID NO: 56 e uma segunda cadeia polipeptídica incluindo a SEQ ID NO: 64. Em uma modalidade, a proteína de ligação compreende uma primeira cadeia polipeptídica incluindo a SEQ ID NO: 73 e uma segunda cadeia polipeptídica incluindo a SEQ ID NO: 74. Em uma modalidade, pelo menos um aminoácido na formulação é histidina e está presente a uma concentração de aproximadamente 10- 20 mM, 10-15mM, 15-20mM ou de aproximadamente 15mM. Em uma modalidade, pelo menos um polissacarídeo na formulação é sacarose e está presente a uma concentração de aproximadamente 0-8,0% peso/volume (p/v). Em uma modalidade, o polissorbato na formulação é polissorbato 80 e está a uma concentração de aproximadamente 0-0,06% p/v. Em uma modalidade, pelo menos um aminoácido na formulação é arginina e está presente a uma concentração de aproximadamente 0- 1,5% p/v (p. ex., 0,5-1,5, 1,0-1,5 ou 0,5-1,0 p/v). Em uma modalidade, a proteína de ligação está presente na formulação a uma concentração de aproximadamente 0,1 - 100 mg/mL, (p. ex., aproximadamente 1-100 mg/mL, aproximadamente 1-15 mg/mL, aproximadamente 1-7,5 mg/mL, aproximadamente 2,5-7,5 mg/mL, aproximadamente 5-7,5 mg/mL, aproximadamente 25-100 mg/mL, aproximadamente 20-60 mg/mL, aproximadamente 25-50 mg/mL, aproximadamente 25 mg/mL, aproximadamente 50 mg/mL, aproximadamente 0,1-60 mg/mL, aproximadamente 0,1-25 mg/mL, aproximadamente 1,0-60 mg/mL, aproximadamente 0,5-60 mg/mL, aproximadamente 0,1-2,0 mg/mL, aproximadamente 0,5-2,0 mg/mL, aproximadamente 1-5 mg/mL, aproximadamente 1-7,5 mg/mL, aproximadamente 1- 15 mg/mL, aproximadamente 0,5 mg/mL ou aproximadamente 1,0 mg/mL).

[0159]Em várias modalidades, a formulação farmacêutica é uma formulação aquosa, uma formulação liofilizada ou uma formulação liofilizada e reidratada. Em uma modalidade, a solução hidratante é dextrose e/ou solução salina (p. ex., dextrose a uma concentração de aproximadamente 5% p/v e/ou a solução salina a uma concentração de aproximadamente 0,9% p/v). Em uma modalidade, a formulação farmacêutica compreende histidina a aproximadamente 15 mM, polissorbato 80 a aproximadamente 0,03% (p/v), sacarose a aproximadamente 4% (p/v) e aproximadamente 0,1-25 mg/mL da proteína de ligação ou aproximadamente 1-15 mg/mL da proteína de ligação, e está a um pH a aproximadamente 6, em que a proteína de ligação compreende a SEQ ID NO: 56 e a SEQ ID NO: 64 ou a SEQ ID NO: 73 e a SEQ ID NO: 74. Em uma modalidade, a proteína de ligação compreende h1A11.1-SL-Av. Em uma modalidade, a proteína de ligação h1A11.1-SL-Av compreende uma região Fc de um mutante LALA de lgG1 humana. Em uma modalidade, a formulação compreende ainda pelo menos um agente adicional.

[0160]Em várias modalidades, é usada uma formulação contendo proteína de ligação a aproximadamente 25 mg/mL (p. ex., uma proteína de ligação compreendendo a SEQ ID NO: 56 e a SEQ ID NO: 64 ou a SEQ ID NO: 73 e a SEQ ID NO: 74), histidina a aproximadamente 15 mM, polissorbato 80 0,03% (peso/volume, p/v), sacarose 4,0% (p/v) e pH de aproximadamente 6,0. Em algumas modalidades, a formulação não compreende arginina. Em algumas modalidades, a formulação exibe estabilidade no congelamento/descongelamento, estabilidade de formulação líquida e/ou estabilidade de formulação liofilizada inesperadamente melhorada, quando comparada a outras formulações compreendendo outros componentes ou concentrações.

[0161]Em algumas modalidades, as formulações discutidas acima e contendo uma proteína de ligação compreendendo a SEQ ID NO: 56 e a SEQ ID NO: 64, ou a compreendendo a SEQ ID NO: 73 e a SEQ ID NO: 74 exibem melhoras inesperadas na capacidade de formulação. Por exemplo, as formulações evitam gelificação indesejável ou a formação de altos níveis de agregados quando armazenadas a 5 °C. Em algumas modalidades, as formulações são estáveis em condições de armazenamento (5 °C) e aceleradas (40 °C).

[0162]Os métodos para administrar um agente profilático ou terapêutico aqui provido incluem, entre outros, administração oral, administração parenteral (p. ex., intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa e subcutânea), administração epidural, administração intratumoral, administração na mucosa (p. ex., via intranasal e oral) e administração pulmonar (p. ex., compostos aerossolizados administrados com inalador ou nebulizador). A formulação de composições farmacêuticas para vias de administração específicas e os materiais e técnicas necessários para os vários métodos de administração estão disponíveis e são conhecidos pelo técnico no assunto (Publicação da Patente US N2 20090311253 A1).

[0163]Em várias modalidades, os esquemas posológicos podem ser ajustados para proporcionar uma resposta ótima desejada (p. ex., uma resposta terapêutica ou profilática). Por exemplo, um bolus único pode ser administrado, diversas doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. Em algumas modalidades, composições parenterais são formuladas em forma de dose unitária para facilidade de administração e uniformidade da dose. O termo “forma de dose unitária” refere-se unidades fisicamente distintas adequadas com doses unitárias para os mamíferos a serem tratados, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de composto ativo, calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico necessário.

[0164]Uma faixa exemplar não limitante para uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de uma proteína de ligação aqui provida é de aproximadamente 0,1-100 mg/kg, (p. ex., aproximadamente 0,1-0,5, 0,1-1, 0,1-10, 0,1-20, 0,1-50, 0,1-75, 1-10, 1-15, 1-7,5, 1,25-15, 1,25-7,5, 2,5-7,5, 2,5-15, 5-15, 5- 7,5,1-20, 1-50, 7-75, 1-100, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-50, 5-75, 10-20, 10-50, 10-75 ou 10-100 mg/kg, ou qualquer concentração intermediária). Em algumas modalidades, a proteína de ligação está presente em uma composição farmacêutica a uma concentração terapeuticamente eficaz, p. ex., uma concentração de aproximadamente 0,1-100 mg/mL (p. ex., aproximadamente 0,1-0,5, 0,1-1, 0,1-10, 0,1-20, 0,1-50, 0,1-75, 1-10, 1-20, 1-50, 1-75, 1-100, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-50, 5- 75, 10-20, 10-50, 10-75 ou 10-100 mg/mL, ou qualquer concentração intermediária). Observar que os valores da dose podem variar com o tipo e/ou a gravidade da condição a ser aliviada. Deverá ser ainda entendido que para qualquer pessoa em particular, esquemas posológicos específicos podem ser ajustados de acordo com a necessidade individual e/ou o juízo profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições, e que as faixas posológicas aqui apresentadas são exemplares somente e não têm como intenção limitar o âmbito ou a prática da composição reivindicada. IV. Terapia combinada

[0165]Em várias modalidades, uma proteína de ligação aqui provida pode também ser administrada isoladamente ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais usados para tratar uma doença ou transtorno, p. ex., uma doença ou transtorno associado com a expressão ou níveis de expressão prejudiciais de DLL4 e/ou VEGF. Em algumas modalidades, uma ou mais das proteínas de ligação podem ser administradas em combinação com um ou mais agentes terapêuticos para diagnosticar, tratar ou reforçar terapias antitumorais e/ou para tratar cânceres primários e/ou metastáticos. Em várias modalidades, uma ou mais proteínas de ligação podem ser administradas em combinação com um ou mais agentes terapêuticos para diagnosticar, tratar ou reforçar o tratamento de uma condição oncológica. Em outras modalidades, uma ou mais proteínas de ligação podem ser administradas em combinação com um ou mais agentes terapêuticos para diagnosticar, tratar ou reforçar o tratamento de qualquer outra doença ou transtorno caracterizado por angiogênese anormal (p. ex., transtornos autoimunes e inflamatórios em geral, cicatrização de fendas). Em várias modalidades, a administração de uma ou mais proteínas de ligação em combinação com um ou mais agentes terapêuticos leva a uma neutralização ou outra redução nos níveis de VEGF e/ou DLL4 em um paciente sofrendo de uma condição caracterizada por níveis excessivos de VEGF e/ou DLL4, bem como outras alterações terapêuticas resultante da administração das proteínas de ligação e/ou um ou mais agentes terapêuticos.

[0166]Em várias modalidades, um ou mais dos agentes adicionais são selecionados pelo técnico no assunto para a finalidade pretendida. Por exemplo, o agente adicional pode ser um agente terapêutico reconhecido na técnica como útil para tratar câncer. A terapia combinada pode incluir também mais de um agente adicional, p. ex., dois, três, quatro, cinco ou mais agentes adicionais.

[0167]Em várias modalidades, os agentes da terapia combinada incluem, entre outros, agentes antiangiogênicos, agentes antineoplásicos, radioterapia, quimioterapia como agentes alquilantes do DNA, cisplatina, carboplatina, agentes anti-tubulina, paclitaxel, docetaxel, taxol, doxorrubicina, gencitabina, gemzar, antraciclinas, adriamicina, inibidores da topoisomerase I, inibidores da topoisomerase II, 5-fluorouracila (5-FU), leucovorina, irinotecano, inibidores do receptor de tirosinaquinase (p. ex., erlotinibe, gefitinibe) e siRNAs.

[0168]Exemplos não limitantes de agentes quimioterápicos com os quais as proteínas de ligação aqui providas podem ser combinadas incluem os seguintes: Ácido 3-cis-Retinoico; 2-CdA; 2-Clorodesoxiadenosina; 5-Citidina; 5-Fluorouracila; 5- FU; 6-Mercaptopurina; 6-MP; 6-TG; 6-Tioguanina; Abraxane; Accutane®; Actinomicina-D; Adriamicina®; Adrucil®; Afinitor®; Agrylin®; Ala-Cort®; Aldesleucina; Alentuzumabe; ALIMTA; Alitretinoína; Alkaban-AQ®; Alkeran®; Ácido All-transretinoico; Interferon Alfa; Altretamina; Ametopterina; Amifostina; Aminoglutetimida; Anagrelida; Anandron®; Anastrozol; Arabinosilcitosina; Ara-C Aranesp®; Aredia®; Arimidex®; Aromasin®; Arranon®; Trióxido de Arsênio; Arzerra™; Asparaginase; ATRA; Avastin®; Citidina; BCG; BCNU; Bendamustina; Bevacizumabe; Bexaroteno; BEXXAR®; Bicalutamida; BiCNU; Blenoxane®; Bleomicina; Bortezomibe; Bussulfano; Busulfex®; C225; Leucovorina Cálcica; Campath®; Camptosar®; Camptotecina-11; Capecitabina; Carac™; Carboplatina; Carmustina; Carmustina Wafer; Casodex®; CC-5013; CCI-779; CCNU; CDDP; CeeNU; Cerubidine®; Cetuximabe; Clorambucila; Cisplatina; Fator Citrovorunr, Cladribina; Cortisona; Cosmegen®; CPT-11; Ciclofosfamida; Cytadren®; Citarabina; Citarabina Lipossomal; Cytosar-U®; Cytoxan®; Dacarbazina; Dacogen; Dactinomicina; Darbepoetina Alfa; Dasatinibe; Daunomicina; Daunorrubicina; Cloridrato de Daunorrubicina; Daunorrubicina Lipossomal; DaunoXome®; Decadron; Decitabina; Delta-Cortef®; Deltasone®; Denileucina; Diftitox; DepoCyt™; Dexametasona; Acetato de Dexametasona; Fosfato Sódico de Dexametasona; Dexasona; Dexrazoxano; DHAD; DIC; Diodex; Docetaxel; Doxil®; Doxorrubicina; Doxorrubicina Lipossomal; Droxia™; DTIC; DTIC-Dome®; Duralone®; Efudex®; Eligard™; Ellence™; Eloxatin™; Elspar®; Emcyt®; Epirrubicina; Epoetina Alfa; Erbitux; Erlotinibe; L-asparaginase de Erwinia', Estramustina; Ethyo;l Etopophos®; Etoposido; Fosfato de Etoposido; Eulexin®; Everolimo; Evista®; Exemestano; Fareston®; Faslodex®; Femara®; Filgrastim; Floxuridina; Fludara®; Fludarabina; Fluoroplex®; Fluorouracila; Fluorouracila (creme); Fluoximesterona; Flutamida; Ácido Folinico; FUDR®; Fulvestrant; Gefitinibe; Gencitabina; Gemtuzumabe ozogamicina; Gemzar; Gleevec™; Gliadel® Wafer; GM-CSF; Goserrelina; Fator Estimulante de Colônias de Granulócitos (G-CSF); Fator Estimulante de Colônias de Granulócitos e Macrófagos (G-MCSF); Halotestin®; Herceptin®; Hexadrol; Hexalen®; Hexametilmelamina; HMM; Hycamtin®; Hydrea®; Hydrocort Acetate®; Hidrocortisona; Fosfato Sódico de Hidrocortisona; Succinato Sódico de Hidrocortisona; Fosfato de Hidrocortona; Hidroxiureia; Ibritumomabe; Ibritumomabe Tiuxetana; Idamicina®; Idarrubicina Ifex®; Interferon-alfa; lnterferon-alfa-2b (Conjugado PEG); Ifosfamida; lnterleucina-11 (IL-11); lnterleucina-2 (IL-2); mesilato de Imatinibe; Imidazol Carboxamida; Intron A®; Iressa®; Irinotecano; Isotretinoina; Ixabepilona; Ixempra™; KADCYCLA®; Kidrolase (t) Lanacort®; Lapatinibe; L- asparaginase; LCR; Lenalidomida; Letrozol; Leucovorina; Leukeran; Leukine™; Leuprolida; Leurocristina; Leustatin™; Ara-C Lipossomal; Liquid Pred®; Lomustina; L-PAM; L-Sarcolisina; Lupron®; Lupron Depot®; Matulane®; Maxidex; Mecloretamina; Cloridrato de Mecloretamina; Medralone®; Medrol®; Megace®; Megestrol; Acetato de Megestrol; Melfalano; Mercaptopurina; Mesna; Mesnex™; Metotrexato; Metotrexato Sódico; Metilprednisolona; Meticorten®; Mitomicina; Mitomicina-C; Mitoxaπtrone M-Prednisol®; MTC; MTX; Mustargen®; Mustina; Mutamicina®; Myleraπ®; Mylocel™; Mylotarg®; Navelbina®; Nelarabina; Neosar®; Neulasta™; Neumega®; Neupogen®; Nexavar®; Nilandron®; Nilotinib; Nilutamide; Nipent®; Mostarda Nitrogenada Novaldex®; Novantrone®; Nplate; Octreotida; acetato de Octreotida; Ofatumumabe; Oncospar®; Oncovin®; Ontak®; Onxal™; Oprelvekin; Orapred®; Orasone®; Oxaliplatina; Paclitaxel; Paclitaxel ligado à Proteína; Pamidronato; Panitumumabe; Panretin®; Paraplatin®; Pazopanibe; Pediapred®; PEG Interferon; Pegaspargase; Pegfilgrastim; PEG-INTRON™; PEG-L- asparaginase; PEMETREXEDE; Pentostatina; Fenilalanina Mostarda; Platinol®; Platinol-AQ®; Prednisolona; Prednisona; Prelone®; Procarbazina; PROCRIT®; Proleukin®; Implante de Prolifeprospan 20 com Carmustina; Purinathol®; Raloxifeno; Revlimid®; Rheumatrex®; Rituxan®; Rituximabe; Roferon-A®; Romiplostim; Rubex®; cloridrato de Rubidom icina; Sandostatin®; Sandostatin LAR®; Sargramostim; Solu-Cortef®; Solu-Medrol®; Sorafenibe; SPRYCEL™; STI-571; Estreptozocina; SU11248; Sunitinibe; Sutent®; Tamoxifeno Tarceva®; Targretin®; Tasigna®; Taxol®; Taxotere®; Temodar®; Temozolomida Temsirolimo; Teniposido; TESPA; Talidomida; Thalomid®; TheraCys®; Tioguanina; Tioguanina Tabloid®; Tiofosfoamida; Thioplex®; Tiotepa; TICE®; Toposar®; Topotecano; Toremifeno; Torisel®; Tositumomabe; Trastuzumabe; Treanda®; Tretinoina; Trexall™; Trisenox®; TSPA; TYKERB®; VCR; Vectibix™; Velban®; Velcade®; VePesid®; Vesanoid®; Viadur™; Vidaza®; Vimblastina; Sulfato de Vimblastina; Vincasar Pfs®; Vincristiπa; Vinorelbina; tartarato de Vinorelbina; VLB; VM-26; Vorinostat; Votrient; VP-16; Vumon®; Xeloda®; Zanosar®; Zevalin™; Zinecard®; Zoladex®; ácido Zoldrônico; Zolinza; ou Zometa®.

[0169]Em uma modalidade, as proteínas de ligação aqui providas são utilizadas em combinação com um ou mais entre: Temozolomida®, irinotecano, leucovorina, 5-FU, gencitabina e paclitaxel. Em uma modalidade, a proteína de ligação h1A11,1-SL-Av é usada em combinação com um ou mais entre: Temozolomida®, irinotecano, leucovorina, 5-FU, gencitabina e paclitaxel.

[0170]Em várias modalidades, as proteínas de ligação aqui providas podem também ser combinadas com um agente, tal como metotrexato, 6-MP, azatioprina sulfassalazina, mesalazina, olsalazina cloroquinina/hidroxicloroquina, pencilamina, aurotiomalato (intramuscular e oral), azatioprina, cochicina, um corticosteroide (oral, inalado e via injeção local), um agonista beta-2 adrenoreceptor (salbutamol, terbutalina, salmeteral), uma xantina (teofilina, aminofilina), cromoglicato, nedocromil, cetotifeno, ipratrópio, oxitrópio, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato mofetil, leflunomida, um NSAID, por exemplo, ibuprofeno, um corticosteroide como prednisolona, um inibidor de fosfodiesterase, um agonista de adenosina, um agente antitrombótico, um inibidor do complemento, um agente adrenérgico, um agente que interfere com a sinalização de citocinas pró- inflamatórias como TNF-a ou IL-1 (p. ex., IRAK, NIK, IKK, p38 ou um inibidor de MAP quinase), um inibidor da enzima conversora de IL-1 β, um inibidor da enzima conversora de TNFa (TACE), um inibidor da sinalização de células T como um inibidor de quinases, um inibidor de metaloproteinases, sulfassalazina, azatioprina, 6-mercaptopurina, um inibidor da enzima conversora de angiotensina, um receptor solúvel de citocinas ou seu derivado (p. ex., um receptor solúvel p55 ou p75 TNF ou o derivado p75TNFRIgG (Enbrel™) ou p55TNFRIgG (Lenercept), slL-1 RI, slL-1 RH, slL-6R), uma citocina anti-inflamatória (p. ex., IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 e TGFβ), celecoxibe, ácido fólico, sulfato de hidroxicloroquina, rofecoxibe, etanercepte, infliximabe, naproxeno, valdecoxibe, sulfassalazina, metilprednisolona, meloxicam, acetato de metilprednisolona, tiomalato sódico de ouro, aspirina, triancinolona acetonida, napsilato de propoxifeno/apap, folato, nabumetona, diclofenaco, piroxicam, etodolaco, diclofenaco sódico, oxaprozina, oxicodona hcl, bitartarato de hidrocodona/apap, diclofenaco sódico/misoprostol, fentanil, anakinra, recombinante humano, tramadol hcl, salsalato, sulindaco, cianocobalamina/fa/piridoxina, acetaminofeno, alendronato sódico, prednisolona, sulfato de morfina, cloridrato de lidocaina, indometacina, glicosamina sulf/condroitina, amitriptilina hcl, sulfadiazina, oxicodona hcl/acetaminofeno, olopatadina hcl, misoprostol, naproxeno sódico, omeprazol, ciclofosfamida, rituximabe, IL-1 TRAP, MRA, CTLA4-IG, IL-18 BP, anti- IL-18, Anti-IL15, BIRB-796, SCIO-469, VX-702, AMG-548, VX-740, Roflumilast, IC- 485, CDC-801 ou Mesopram. Em algumas modalidades, as combinações podem incluir metotrexato ou leflunomida e ciclosporina.

[0171]Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas aqui providas podem incluir uma “quantidade terapeuticamente eficaz” ou uma “quantidade profilaticamente eficaz” de uma proteína de ligação aqui provida. Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” refere-se a uma quantidade eficaz, em doses e por períodos de tempo necessários para alcançar o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação pode ser determinada por um técnico no assunto e pode variar de acordo com fatores como o estado de doença, a idade, o sexo e o peso individual e a capacidade da proteína de ligação de suscitar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também aquela na qual quaisquer efeitos tóxicos ou desfavoráveis do anticorpo, ou da porção de ligação do anticorpo, são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma “quantidade profilaticamente eficaz” refere-se a uma quantidade eficaz, em doses e por períodos de tempo necessários para alcançar o resultado profilático desejado. Tipicamente, pelo fato de uma dose profilática ser usada em pessoas antes e em um estágio mais precoce da doença, quantidade profilaticamente eficaz será menor do que a quantidade terapeuticamente eficaz. V. Diagnóstico

[0172]A presente invenção também provê aplicações diagnósticas, inclusive, entre outros, métodos de ensaios diagnósticos utilizando uma ou mais proteínas de ligação, kits diagnósticos contendo uma ou mais proteínas de ligação e métodos e kits para uso em sistemas automáticos e/ou semiautomáticos. Em algumas modalidades, os métodos e kits podem ser empregados na detecção, no monitoramento e/ou no tratamento de uma doença ou transtorno em um indivíduo. A. Método de ensaio

[0173]Em várias modalidades, são providos métodos para determinar a presença, quantidade e/ou concentração de ao menos um analito, ou seu fragmento, em uma amostra em teste utilizando pelo menos uma proteína de ligação. Os ensaios exemplares incluem, entre outros, imunoensaios e/ou métodos empregando espectrometria de massa.

[0174]Por exemplo, os imunoensaios providos pela presente invenção podem incluir imunoensaios do tipo sanduíche, radioimunoensaios (RIA), imunoensaios enzimáticos (EIA), ensaios imunoenzimáticos (ELISA), imunoensaios de competição-inibição, imunoensaios de fluorescência por polarização (FPIA), técnicas de imunoensaios enzimáticos multiplicados (EMIT), transferência de energia por ressonância de bioluminescência (BRET) e ensaios quimioluminescentes homogêneos, entre outros.

[0175]Em algumas modalidades, é provido um método para determinar a presença, a quantidade ou a concentração de um ou mais antígenos, ou de seus fragmentos, em uma amostra em teste, em que um ou mais dos antígenos ou de seus fragmentos são DLL4 e/ou VEGF. O método compreende analisar a amostra em teste para o antígeno, ou seu fragmento, por um imunoensaio. O imunoensaio (i) emprega pelo menos uma proteína de ligação e pelo menos um marcador detectável e (ii) compreende comparar um sinal gerado pelo marcador detectável, como indicação direta ou indireta da presença, da quantidade ou da concentração do antígeno, ou de seu fragmento, na amostra em teste a um sinal gerado, como indicação direta ou indireta da presença, da quantidade ou da concentração do antígeno, ou de seu fragmento, em um controle ou calibrador. O calibrador integra opcionalmente uma série de calibradores, em que cada um dos calibradores difere dos outros calibradores na série pela concentração do antígeno, ou de seu fragmento. O método pode compreender (i) contatar a amostra em teste com pelo menos um agente de captura, que se liga a um epítopo no antígeno, ou em seu fragmento, de modo a formar um complexo compreendendo o agente de captura e o antígeno ou seu fragmento (ii) contatar o complexo compreendendo o agente de captura e o antígeno ou seu fragmento com pelo menos um agente de detecção, que compreende um marcador detectável e se liga a um epítopo no antígeno, ou em seu fragmento, que não está ligado pelo agente de captura, para formar um complexo de detecção e (iii) determinar a presença, a quantidade ou a concentração do antígeno, ou de seu fragmento, na amostra em teste com base no sinal gerado pelo marcador detectável dentro do complexo de detecção formado (ii), em que pelo menos um agente de captura e/ou pelo menos um agente de detecção é pelo menos uma proteína de ligação.

[0176]Alternativamente, em algumas modalidades, o método para determinar a presença, a quantidade ou a concentração de um ou mais antígenos, ou de seus fragmentos, em uma amostra em teste pode compreender (i) contatar a amostra em teste com pelo menos um agente de captura, que se liga a um epítopo no antígeno, ou em seu fragmento, de modo a formar um complexo compreendendo o agente de captura e o antígeno ou seu fragmento e, simultaneamente ou em sequência, em qualquer ordem, contatar a amostra em teste com um antígeno marcado de modo detectável, ou seu fragmento, que pode competir com qualquer antígeno, ou seu fragmento, na amostra em teste pela ligação a ao menos um agente de captura, em que qualquer antígeno, ou seu fragmento, presente na amostra em teste e o antígeno marcado de modo detectável competem um com o outro para formar um complexo de detecção e (ii) determinar a presença, a quantidade ou a concentração do antígeno, ou de seu fragmento, na amostra em teste com base no sinal gerado pelo marcador detectável dentro do complexo de detecção formado (i), em que pelo menos um agente de captura é pelo menos uma proteína de ligação e em que o sinal gerado pelo marcador detectável no complexo de captura-detecção é inversamente proporcional à quantidade ou à concentração de antígeno ou de seu fragmento, na amostra em teste.

[0177]Em várias modalidades, a amostra em teste pode ser de um paciente, em cujo caso o método pode compreender ainda diagnosticar, determinar um prognóstico ou avaliar a eficácia do tratamento terapêutico/profilático do paciente. Se o método compreender ainda avaliar a eficácia do tratamento terapêutico/profilático do paciente, o método compreende ainda opcionalmente modificar o tratamento terapêutico/profilático do paciente conforme necessário para melhorar a eficácia. O método pode ser adaptado para uso em um sistema automático ou um sistema semiautomático. Dessa forma, os métodos aqui descritos também podem ser utilizados para determinar se um indivíduo é portador ou está em risco de desenvolver determinada doença, transtorno ou condição. Especificamente, tal método pode compreender as etapas de:

[0178](a) determinar a concentração ou quantidade de um ou mais analitos, ou de seus fragmentos, em uma amostra em teste de um indivíduo (p. ex., utilizando os métodos aqui descritos ou métodos conhecidos na técnica); e (b) comparar a concentração ou quantidade do(s) analito(s), ou de seu(s) fragmento(s), conforme determinada na etapa (a) com um nível predeterminado, em que, se a concentração ou quantidade de analito(s) determinada na etapa (a) é favorável com relação a um nível predeterminado, então é determinada a ausência ou a falta de risco de concentração ou quantidade de analito(s) determinada na etapa (a) é desfavorável com relação ao nível predeterminado, então é determinada a presença ou o risco de uma determinada doença, transtorno ou condição para o indivíduo.

[0179]Adicionalmente, a presente invenção provê métodos para monitorar a progressão de uma doença em um indivíduo. Em algumas modalidades, os métodos compreendem as etapas de: (a) determinar a concentração ou quantidade de um ou mais analitos em uma amostra em teste de um indivíduo; (b) determinar a concentração ou quantidade de analito(s) em uma amostra posterior do mesmo indivíduo; e (c) comparar a concentração ou quantidade de analito(s) conforme determinada na etapa (b) com a concentração ou quantidade de analito(s) determinada na etapa (a), em que se a concentração ou quantidade determinada na etapa (b) não se alterou ou é desfavorável quando comparada à concentração ou quantidade determinada na etapa (a), então se determina que, no indivíduo, a doença prosseguiu, progrediu ou agravou. Por comparação, se a concentração ou quantidade conforme determinada na etapa (b) é favorável quando comparada à concentração ou quantidade conforme determinada na etapa (a), então se determina que, no indivíduo, a doença descontinuou, regrediu ou melhorou.

[0180]Opcionalmente, os métodos para monitorar a progressão de uma doença compreendem ainda comparar a concentração ou quantidade de analito(s) conforme determinada na etapa (b), por exemplo, com um nível predeterminado. Além disso, os métodos compreendem opcionalmente tratar o indivíduo com uma ou mais composições farmacêuticas por um período de tempo se a comparação mostrar que a concentração ou quantidade de analito(s) conforme determinada na etapa (b), por exemplo, alterou-se desfavoravelmente com relação ao nível predeterminado.

[0181]Em algumas modalidades, a presença, a quantidade ou a concentração de um analito ou de seu fragmento é detectada em uma amostra utilizando um marcador detectável, como um marcador quimioluminescente (composto de acridínio). Em algumas modalidades, o sinal quimioluminescente que é gerado pode ser detectado utilizando técnicas rotineiras conhecidas pelos técnicos no assunto. Com base na intensidade do sinal gerado, a quantidade ou concentração de analito na amostra pode ser quantificada. Especificamente, em algumas modalidades, a quantidade de analito na amostra pode ser proporcional à intensidade do sinal gerado. Em certas modalidades, a quantidade de analito presente pode ser quantificada comparando-se uma quantidade de luz gerada a uma curva padrão para o analito, ou por comparação a um padrão de referência ou calibrador. A curva padrão pode ser gerada utilizando diluições seriadas ou soluções de concentrações conhecidas do analito por espectroscopia de massa, métodos gravimétricos ou outras técnicas conhecidas no assunto.

[0182]Os imunoensaios do analito podem em geral ser conduzidos utilizando qualquer formato conhecido na técnica, tais como, entre outros, formato sanduíche. Por exemplo, nos imunoensaios, uma ou mais proteínas de ligação podem ser utilizadas para capturar o analito (ou seu fragmento) na amostra em teste (essas proteínas de ligação são frequentemente designadas de proteínas de ligação de “captura”) e uma ou mais proteínas de ligação podem ser utilizadas para ligar um marcador detectável (a saber, quantificável) ao sanduíche (essas proteínas de ligação são frequentemente designadas de proteínas de ligação de “detecção”, o “conjugado” ou os “conjugados”). Assim, no contexto de um formato exemplar de imunoensaio tipo sanduíche, um DVD (ou seu fragmento, variante ou um fragmento de sua variante) como aqui descrito pode ser usado como uma proteína de ligação de captura, uma proteína de ligação de detecção, ou ambos. Por exemplo, um DVD com um primeiro domínio que pode se ligar a um epítopo em um primeiro analito (ou seu fragmento) e um segundo domínio que pode se ligar a um epítopo em um epítopo em um segundo analito (ou seu fragmento) pode ser usado como proteína de ligação de captura e/ou detecção para detectar e, opcionalmente, quantificar um ou mais analitos (p. ex., DLL4 e/ou VEGF). Em mais um exemplo, empregar DVD com afinidades diferenciadas dentro de um ensaio tipo sanduíche pode oferecer uma vantagem de avidez. No contexto de imunoensaios como aqui descritos, pode geralmente ser útil ou desejado incorporar um ou mais ligadores dentro da estrutura de um DVD. Quando presente, de modo ideal, o ligador deve ser de suficiente comprimento e flexibilidade estrutural que possibilite a ligação de um epítopo pelos domínios internos, bem como a ligação de outro epítopo pelos domínios externos. A esse respeito, se um DVD puder se ligar a dois analitos diferentes e um analito é maior do que o outro, de modo desejável, o analito maior é ligado pelos domínios externos.

[0183]Em várias modalidades, a amostra em teste (p. ex., uma amostra com suspeita de conter o analito ou seu fragmento) pode ser colocada em contato com pelo menos uma proteína de ligação de contato e com pelo menos uma proteína de ligação de detecção, simultaneamente ou em sequência e em qualquer ordem. Por exemplo, a amostra em teste pode ser colocada em contato primeiramente com pelo menos uma proteína de ligação de captura e depois (sequencialmente) com pelo menos uma proteína de ligação de detecção. Alternativamente, a amostra em teste pode ser colocada em contato primeiramente com pelo menos uma proteína de ligação de detecção e depois (sequencialmente) com pelo menos uma proteína de ligação de captura. Ainda em alternativa, a amostra em teste pode ser colocada em contato simultaneamente com uma proteína de ligação de captura e uma proteína de ligação de detecção. Em várias modalidades, imunoensaios competitivos de inibição, compreendendo um ou mais DVD aqui descritos, podem ser utilizados para detectar a presença, a quantidade ou a concentração de um ou mais analitos ou de seus fragmentos (p. ex., DLL4 e/ou VEGF).

[0184]Em várias modalidades, o marcador detectável pode ser ligado às proteínas de ligação diretamente ou através de um agente de acoplamento. Um exemplo de agente de acoplamento que pode ser usado é EDAC (1 -etil-3-(3- dimetilaminopropil) carbodiimida, cloridrato), que é disponibilizado comercialmente pela Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. Outros agentes de acoplamento que podem ser usados são conhecidos na técnica. Métodos para ligar um marcador detectável a uma proteína de ligação são conhecidos na técnica.

[0185]Em várias modalidades, a presença ou quantidade de marcador ligado a um complexo compreendendo analito e DVD em um ensaio de detecção pode ser quantificada utilizando técnicas conhecidas sobre o assunto. Por exemplo, se um marcador enzimático for usado, o complexo marcado pode ser reagido com um substrato para o marcador que fornece uma reação quantificável tal como o desenvolvimento de cor. Se for radioativo, o marcador pode ser quantificado utilizando meios apropriados, como um contador de cintilação. Se for fluorescente, o marcador pode ser quantificado estimulando o marcador e detectando um sinal fluorescente. Se for quimioluminescente, o marcador pode ser quantificado detectando a luz emitida seja visualmente ou por meio de luminômetros, filme de raios-x, filme de alta velocidade, câmara de CCD, etc. Em algumas modalidades, uma vez a quantidade do marcador no complexo tenha sido quantificada, a concentração de analito ou de seu fragmento na amostra em teste pode ser determinada por meios apropriados, como pelo uso de uma curva padrão que tenha sido gerada utilizando diluições seriadas do analito ou de seu fragmento com concentração conhecida ou por outro calibrador.

[0186]Em uma modalidade, é utilizado um imunoensaio com micropartículas quimioluminescentes, especialmente um empregando o analisador automático ARCHITECT® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL).

[0187]Em algumas modalidades, a presente invenção provê métodos que empregam espectrometria de massa, incluindo, entre outros, MALDI (ionização/dessorção a laser assistida por matriz) e SELDI (ionização/dessorção a laser realçado de superfície).

[0188]Métodos para coletar, manusear, processor e analisar amostras de teste biológico, empregando imunoensaios e espectrometria de massa, são bem conhecidos pelo técnico no assunto e permitem a prática da presente invenção (US 2009-0311253 A1). B. Kit

[0189]Em várias modalidades, um kit para analisar uma amostra em teste quanto à presença, quantidade e/ou concentração de pelo menos um analito, ou de seu fragmento, em uma amostra em teste é também provido. Em algumas modalidades, o kit compreende pelo menos um componente para analisar a amostra em teste quanto ao analito, ou a seu fragmento, e instruções para analisar a amostra em teste quanto ao analito, ou a seu fragmento. Ao menos um dos componentes para analisar a amostra em teste quanto ao analito, ou a seu fragmento, pode incluir uma composição contendo uma proteína de ligação, como aqui descrita, e/ou seu fragmento, variante ou um fragmento de sua variante. Em algumas modalidades, o componente está opcionalmente imobilizado em uma fase sólida.

[0190]Opcionalmente, em algumas modalidades, o kit pode compreender um calibrador ou controle, que pode incluir um analito isolado ou purificado. Em certas modalidades, o kit pode compreender pelo menos um componente para analisar a amostra em teste quanto a um analito por imunoensaio e/ou espectrometria de massa. Os componentes do kit, incluindo o analito, proteína de ligação e/ou proteína de ligação anti-analito, ou seus fragmentos, podem ser opcionalmente marcados usando qualquer marcador detectável conhecido na técnica (US 2009-0311253 A1). C. Automatização

[0191]Em várias modalidades, os kits (ou seus componentes) e os métodos para determinar a presença, quantidade e/ou concentração de pelo menos um analito em uma amostra em teste podem ser adaptados para uso em uma variedade de sistemas automáticos e semiautomáticos, como descritos, por exemplo, nas Patentes US N— 5 089 424 e 5 006 309, e como comercializados, por exemplo, pela Abbott Laboratories (Abbott Park, IL) como ARCHITECT®.

[0192]Outras plataformas automáticas ou semiautomáticas que poderiam ser usadas com as proteínas de ligação incluem, entre outras, AxSYM®, IMx® (ver, por exemplo, a Patente US N2 5 294 404, PRISM®, EIA (esfera) e Quantum™ II (todos da Abbott Laboratories), bem como outras plataformas conhecidas na técnica. Adicionalmente, os ensaios, kits e componentes do kit podem ser empregados em outros formatos, por exemplo, em sistemas eletromecânicos e/ou outros manuais ou point of care(junto ao local de atendimento) para os ensaios. A presente invenção pode aplicar-se, por exemplo, ao sistema eletromecânico comercial de imunoensaios Abbott Point of Care (i-STAT®, Abbott Laboratories), que realiza imunoensaios tipo sanduíche. Imunosensores e seus métodos de fabricação e operação em dispositivos de teste de uso único estão descritos, por exemplo, nas Patentes US N2 5 063 081, 7 419 821 e 7 682 833; e nas Publicações US N22 20040018577, 20060160164 e US 20090311253.

[0193]Será rapidamente evidente para os técnicos no assunto que outras modificações e adaptações adequadas dos métodos aqui descritos são óbvias e podem ser efetuadas utilizando equivalentes adequados sem que, contudo, se afastem do âmbito das modalidades aqui descritas. Já sido descritas detalhadamente, certas modalidades serão mais claramente entendidas por referência aos exemplos a seguir, os quais estão incluídos para fins de ilustração somente e sem a intenção de servirem de limitações.

EXEMPLOS Exemplo 1: Construção de moléculas DVD anti-DLL4/anti-VEGF

[0194]As sequências do domínio variável de um mAb anti-DLL4 (h1A11.1) e um mAb anti-VEGF (Av) humanizados foram usadas para desenhar os domínios VH e VL de moléculas DVD anti-DLL4/anti-VEGF. As regiões variáveis foram sintetizadas utilizando PCR em duas etapas. Primers(iniciadores) foram criados com regiões flanqueadoras homólogas ao vetor de clonagem e a região ligadora entre cada par de DVD variável. A transformação bacteriana foi realizada para identificar clones positivos, e as construções foram colhidas e purificadas para uso em transformação de mamífero utilizando protocolos padrão conhecidos na técnica.

[0195]Os domínios variáveis da cadeia pesada e da leve foram clonados nas posições corretas de leitura (in frame)nas regiões constantes da cadeia pesada e da cadeia leve kappa da lgG1 mutante humana (L234, 235A), respectivamente, para gerar moléculas DVD anti-DLL4/anti-VEGF (Tabela 4). Tabela 4. Construções DVD anti-DLL4/anti-VEGF

Exemplo 2: Determinação da afinidade de construções DVD anti-DLL4/anti- VEGF

[0196]Um ensaio BIACORE (Biacore, Inc, Piscataway, NJ) foi usado para avaliar a ligação de DVDs a um domínio extracelular (ECD) recombinante purificado de DLL4 ou ao VEGF-IΘS,conforme determinada com base em aferições por ressonância plasmônica em um Biacore 2000, Biacore 3000 ou Biacore T100 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) a 25 °C. Para aferições da cinética de ligação a DLL4, o tampão de ensaio foi HBS-EPB: Hepes 10 mM, p H7,5, NaCI 150 mM, EDTA 3 mM, Tween 20 0,005%, BSA 0,1 mg/mL (Sigma A7906). Para aferições da cinética de ligação a VEGF, o tampão de ensaio foi HBS-EP+(3N01 B): Hepes 10 mM, pH 7,5, NaCI 300 mM, EDTA 3 mM, Tween 20 0,05%, BSA 0,1 mg/mL (Sigma A7906). Por exemplo, aproximadamente 9000 RU de anticorpo policlonal de cabra específico anti-Fc humana (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL) diluídos em acetato de sódio 10 mM (pH 4,5) são imobilizados diretamente em urn chip biossensor CM5 grau de pesquisa, utilizando um kit padrão de acoplamento de amina de acordo com as instruções do fabricante e procedimentos a 25 pg/mL. As porções não reagidas na superfície do biossensor são bloqueadas com etanolamina. Para análise cinética, equações da taxa derivadas a partir de um modelo de ligação 1:1 de Langmuir são ajustadas simultaneamente a múltiplas injeções de antígeno (usando análise de ajuste global) como uso do softwareScrubber 2 (BioLogic Software), Biacore Biaevaluation 4.0.1 ou software Biacore T100 Evaluation. Anticorpos purificados são diluídos em tampão de corrida para captura nas superfícies de reação com anti-Fc humana de cabra. Anticorpos a serem capturados como ligante (1 pg/mL) são injetados nas matrizes de reação a uma vazão de 10 pL/min. Durante o ensaio, todas as aferições são comparadas contra a superfície de captura apenas como referência (ou seja, sem anticorpo capturado). As constantes para a taxa de associação e de dissociação, Kon (M‘1s-1) e Koff (s-1) são determinadas sob uma vazão contínua de 80 pL/min. As constantes para as taxas são derivadas por aferições da cinética de ligação em diferentes concentrações do antígeno, variando de 1,23 - 900 nM, em uma série de diluições de 3 vezes e incluíram injeções de tampão somente (a serem usadas como referência dupla). A constante de dissociação de equilíbrio KD (M) da reação entre anticorpos e o antígeno-alvo é depois calculada a partir das constantes para as taxas cinéticas pela seguinte fórmula: KD = Koff/Kon. A ligação é registrada em função do tempo e as constantes para as taxas cinéticas são calculadas. Nesse ensaio, taxas de associação tão rápidas como 106 M’1s’1 e taxas de dissociação tão lentas como 10’6 s-1 podem ser medidas. As afinidade de ligação ao antígeno dos DVDs anti-DLL4/anti-VEGF estão resumidas na Tabela 5 e 6. Tabela 5. Cinética Biacore de proteínas de ligação anti-DLL4/anti-VEGF

Tabela 6. Cinética Biacore adicional de h1A11.1-SL-Av DVD

Exemplo 3: Caracterização in vitrodas moléculas DVD anti-DLL4/anti-VEGF Exemplo 3.1: Atividade de ligação a DLL4 determinada por citometria de fluxo (FACS)

[0197]Linhagens estáveis de células HEK293G com superexpressão de DLL4 completa foram colhidas de frascos de cultura de tecido, lavadas quatro vezes e ressuspensas em solução salina com tampão fosfato (PBS) contendo albumina sérica bovina 1% e CaCl2 1 mM (tampão de FACS). 1,5 x105 células foram incubadas com proteínas de ligação DVD a várias concentrações em tampão de FACS por 60 minutos em gelo. As células foram lavadas duas vezes e 50 pL de fragmento F(ab’)2 de anti-lgG de rato conjugado a R-ficoeritrina (diluição 1:200 em tampão de FACS) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, Cat. n2 112-116- 072) foram adicionados. Após incubação em gelo (4 °C, 60 minutos), as células foram lavadas três vezes e ressuspensas em tampão de FACS. A fluorescência foi medida utilizando um Becton Dickinson FACSCalibur-HTS (Becton Dickinson, San Jose, CA). Os dados foram analisados utilizando o softwareGraphpad Prism e os valore de ECso foram relatados como a concentração de anticorpo a alcançar 50% da ligação máxima de anticorpos a células expressando DLL4. Exemplo 3.2: Atividade de bloqueio de DLL4 das proteínas DVD anti- DLL4/anti-VEGF conforme determinada por inibição da interação de Notch-1 com domínio extracelular de DLL4 solúvel

[0198]Placas Nunc-lmmuno de 96 cavidades (n2 439454 para ELISA de huDLL4) e placas Costar de 96 cavidades (n2 9018 para ELISA de muDLL4) foram recobertas com Notch-1 humano 16 nM (R&D Systems n23647-TK, 100 pL/cavidade em D-PBS) e incubadas durante a noite a 4 °C. As placas foram depois lavadas 3X com tampão de lavagem (PBS, Tween-20 0,05%) e bloqueadas com tampão de bloqueio 200 pL/cavidade (D-PBS, BSA 1%, CaCl2 1 mM, Tween-20 0,05%) por 1 hora a 25 °C. Durante o bloqueio, o domínio extracelular de DLL4 marcado com biotina (14 nM) foi misturado com anticorpo (30 pM-66 nM, diluição seriada de 3 vezes em tampão de bloqueio) por 1 hora a 25 °C com agitação. As placas de ensaio foram lavadas depois do bloqueio e incubadas com misturas de DLL4Z anticorpo (100 pL/cavidade, 1 hora a 25 °C com agitação). As placas foram lavadas novamente e estreptavidina conjugada com HRP 100 pL/cavidade (Fitzgerald n2 65R-S104PHRPx, diluída 1:5.000 in tampão de bloqueio) foi adicionada por 1 hora a 25 °C com agitação. Depois de uma lavagem final, as placas foram desenvolvidas utilizando substrato 100 pL/cavidade (TMB Sigma n2 T8665), a reação foi interrompida com HCI 1 N 100 pL/cavidade e a absorbância foi lida a 450 nm. Os dados foram analisados utilizando o softwareGraphpad Prism e os valores de ICso foram relatados como a concentração de anticorpo necessária para 50% de redução da ligação de DLL4 a Notchl. Exemplo 3.3: Atividade de bloqueio de DLL4 das proteínas DVD anti- DLL4/anti-VEGF conforme determinada por inibição da ativação de Notch dependente de DLL4 utilizando um ensaio repórter de Notch

[0199]Placas de cultura de tecido de fundo transparente com 96 cavidades foram semeadas durante a noite com células EA.hy926 construídas para a expressão de luciferase impulsionada por um promotor sensível a Notch (7.000 células/cavidade). Anticorpos diluídos em série a partir de 200 nM foram misturados por 15 minutos com volume igual de solução contendo células HEK293G expressando DLL4 completa (5.000 células/cavidade). As células 293G/DLL4 foram co-cultivadas com células EA.hy926 repórter de Notch por 24 horas na presença de anticorpos em teste. A atividade de luciferase foi analisada utilizando o substrato da Promega (Promega n2 E2940). Os dados foram analisados pelo softwareGraphpad Prism e os valores de ICso foram relatados como a concentração de anticorpo necessária para alcançar 50% de redução de ativação de Notch induzida por DLL4. Exemplo 3.4: Atividade de ligação de VEGF de proteínas DVD anti- DLL4/anti-VEGF conforme determinada por ELISA de captura

[0200]Placas de ELISA (Nunc, MaxiSorp, Rochester, NY) foram incubadas durante a noite a 4°C com anticorpo anti-Fc humana (5 pg/mL em PBS, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA). As placas foram lavadas três vezes em tampão de lavagem (PBS contendo Tween 20 0,05%) e bloqueadas por 1 hora a 25 °C in tampão de bloqueio (PBS contendo BSA 1%). As cavidades foram lavadas três vezes, e cada anticorpo ou DVD foi diluído em série em PBS contendo BSA 0,1% antes da incubação a 25 °C for 1 hora. As cavidades foram lavadas três vezes, e VEGF biotinilado (2 nM) foi adicionado às placas que foram incubadas por 1 hora a 25 °C. As cavidades foram lavadas três vezes e depois incubadas por 1 hora a 25 °C com estreptavidina-HRP (KPL n2 474-3000, Gaithersburg, MD). As cavidades foram lavadas três vezes, e adicionou-se 100 pL de ULTRA-TMB ELISA (Pierce, Rockford, IL) por cavidade. Após o desenvolvimento de cor, a reação foi interrompida com HCI 1M e a absorbância foi medida a 450 nM. Exemplo 3.5: Atividade de bloqueio de VEGF de proteínas DVD anti- DLL4/anti-VEGF conforme determinada por inibição da interação de VEGF com VEGFR1

[0201]Placas de ELISA (Nunc, MaxiSorp, Rochester, NY) foram incubadas durante a noite a 4 °C com 100 pL de PBS contendo proteína de fusão domínio extracelular-Fc de VEGFR1 recombiπante (5 pg/mL, R&D systems, Minneapolis, MN). As placas foram lavadas três vezes em tampão de lavagem (PBS contendo Tween 20 0,05%) e bloqueadas por 1 hora a 25 °C em tampão de bloqueio (PBS contendo BSA 1%). Cada anticorpo e DVD foi diluído em série em PBS contendo BSA 0,1% e incubados com 50 pL de VEGF biotinilado 2 nM por 1 hora a 25 °C. As misturas de anticorpo e VEGF biotinilado ou DVD e VEGF biotinilado (100 pL) foram depois adicionadas às cavidades recobertas com VEGFR1-Fc e incubadas a 25 °C por 10 minutos. As cavidades foram lavadas três vezes e depois incubadas por 1 hora a 25 °C com 100 pL de estreptavidina-HRP (KPL n2 474-3000, Gaithersburg, MD). As cavidades foram lavadas três vezes, e adicionou-se 100 pL de ULTRA-TMB ELISA (Pierce, Rockford, IL) por cavidade. Após o desenvolvimento de cor, a reação foi interrompida com HCI 1M HCI e a absorbância foi medida a 450 nM. Exemplo 3.6: Atividade de bloqueio de VEGF de proteína DVD anti- DLL4/anti-VEGF conforme determinada por inibição da proliferação/sobrevida de células endoteliais estimulada por VEGF

[0202]Antes da semeadura para o ensaio, células endoteliais TIME (ATCC) ou HUVEC (passagem 2-6) foram mantidas em EBM-2 (Lonza-Clonetics, Walkersville, MD) suplementado com EGM-2 SingleQuots (Lonza-Clonetics, Walkersville, MD, n2 CC-4176). As células foram semeadas a uma densidade de 10.000 células/cavidade em placas pretas recobertas com colágeno de 96 cavidades em 100 pL de EMB-2 com FBS 0,1% na ausência de fatores de crescimento. No dia seguinte, o meio foi substituído por FBS 0,1% na ausência de fatores de crescimento. No dia seguinte, o meio foi substituído por 100 pL de EMB-2 (sem fatores de crescimento ou soro) e incubadas por quatro horas antes da adição de VEGF e anticorpos ou DVDs. Anticorpos monoclonais ou DVDs anti-VEGF foram diluídos em série em EMB-2 com BSA 0,1% e foram previamente incubados com VEGF-I65 humano recombinante (50 ng/mL) por 1 hora a 25°C em 50 pL. Misturas de anticorpo e VEGF ou DVD e VEGF foram depois adicionadas às células (50 pL), e as placas foram incubadas a 37°C em atmosfera umidificada de CO2 5% por 72 horas. A sobrevida/proliferação celular foi medida indiretamente pelos níveis de ATP avaliados utilizando um kit ATPIite (Perkin Elmer, Waltham, MA) de acordo com as instruções do fabricante.

[0203]As atividades in vitro dos DVDs anti-DLL4/anti-VEGF, conforme caracterizadas pelos ensaios mencionados acima, estão resumidas na Tabela 7. Tabela 7. Caracterização in vitro de DVDs anti-DLL4/anti-VEGF

Exemplo 4: Resultados farmacocinéticos in vivo de DVD anti-DLL4/anti- VEGF

[0204]As propriedades farmacocinéticas de h1A11,1-SL-Av DVD foram avaliadas em macacos cinomolgos (n=2 para cada grupo de dose) e camundongos CD1 (n=6 para cada grupo de dose) após administração de bolus intravenoso. O perfil farmacocinético de h1A11,1-SL-Av DVD em camundongos CD1 e em macacos cinomolgos foi característico de um anticorpo monoclonal tradicional (Tabela 8). Table 8: Parâmetros PK médios de h1A11.1-SL-Av DVD após administração de bolus Intravenoso

Dose: mg/kg; AUC: Área abaixo da curva de concentração do tempo 0 ao infinito (d*pg/ml_); Cmax: Primeira concentração observada após a administração (pg/mL); Vss: volume de distribuição (mL/kg); CL: depuração (mL/dia/kg); T1/2: meia-vida terminal (dias); MRT: tempo de permanência médio do tempo 0 ao infinito (dias). Exemplo 5: Eficácia antitumoral in vivo de DVDs anti-DLL4/anti-VEGF

[0205]O efeito de DVDs anti-DLL4/anti-VEGF sobre o crescimento tumoral foi avaliado inicialmente em tumores do xenoenxerto HT-29 de adenocarcinoma colorretal humano em camundongos nude atímicos fêmeas. Resumidamente, 2x106 células foram inoculadas por via subcutânea no flanco traseiro direito. Foi permitido aos tumores se estabelecerem por 25 dias, em cujo ponto, foi determinado o volume tumoral medido com compasso eletrônico utilizando a fórmula: L x W2^. Os camundongos foram alocados em grupos de tratamento (n=10 por grupo) de modo que, em cada coorte, o volume tumoral médio equivalesse a 214 mm3 antes do início da terapia. Os animais receberam a dose por via intraperitoneal, semanalmente por quatro semanas, e o volume tumoral foi medido duas vezes por semana pela duração do experimento. Os resultados são mostrados na Tabela 9.

[0206]O efeito de DVDs anti-DLL4/anti-VEGF sobre o crescimento tumoral foi subsequentemente avaliado em tumores do xenoenxerto U87-MG de glioblastoma humano em camundongos SCID fêmeas. Resumidamente, 3x106 células foram inoculadas por via subcutânea no flanco traseiro direito. Foi permitido aos tumores se estabelecerem por 17 dias, em cujo ponto, foi determinado o volume tumoral medido com compasso eletrônico utilizando a fórmula: L x W2^. Os camundongos foram alocados em grupos de tratamento (n=10 por grupo) de modo que, em cada coorte, o volume tumoral médio equivalesse a 221 mm3 antes do início da terapia. Os animais receberam a dose por via intraperitoneal, semanalmente por quatro semanas, e o volume tumoral foi medido duas vezes por semana pela duração do experimento. Os resultados são mostrados na Tabela 9. Tabela 9. Eficácia de DVDs anti-DLL4/anti-VEGF nos modelos de xenoenxertos HT-29 de adenocarcinoma colorretal e U87-MG de glioblastoma

Legenda da Tabela 9: a. %TGI = Percentual de inibição do crescimento tumoral = 100 - (T/C x 100), onde T = volume tumoral médio do grupo de tratamento e C = volume tumoral médio do grupo de tratamento controle. Com base medições de tamanhos correspondentes após 29 dias. Os valores P (indicados por asteriscos) são derivados da comparação por teste T de Student de grupo de tratamento versus grupo de tratamento controle, b. %TGD = Retardo percentual do crescimento tumoral = (T - C)/C x 100, onde T = mediana do tempo até o desfecho do grupo de tratamento e C = mediana do tempo até o desfecho do grupo de tratamento controle. Com base em um desfecho de 1000 mm3. Valores P (indicados por asteriscos) derivados da comparação pelo teste de log-rank de Kaplan-Meier de grupo de tratamento versus grupo de tratamento controle, c. %TGI = Percentual de inibição do crescimento tumoral = 100 - (T/C x 100), onde T = volume tumoral médio do grupo de tratamento e C = volume tumoral médio do grupo de tratamento controle. Com base medições de tamanhos correspondentes após 24 dias. Os valores P (indicados por asteriscos) são derivados da comparação pelo teste T de Student de grupo de tratamento versusgrupo de tratamento controle (* p < 0,01, ** p < 0,001, *** p < 0,0001) Exemplo 6: Eficácia da combinação in vivo de DVDs anti-DLL4/anti-VEGF

[0207]O efeito de DVDs anti-DLL4/anti-VEGF em combinação com quimioterapia sobre o crescimento tumoral foi avaliada em tumores do xenoenxerto U87-MG de glioblastoma humano em camundongos SCID fêmeas. Resumidamente, 3x106 células foram inoculadas por via subcutânea no flanco traseiro direito. Foi permitido aos tumores se estabelecerem por 22 dias, em cujo ponto, foi determinado o volume tumoral medido com compasso eletrônico utilizando a fórmula: L x W2^. Os camundongos foram alocados em grupos de tratamento (n=10 por grupo) de modo que, em cada coorte, o volume tumoral médio equivalesse a 207 mm3 antes do início da terapia. Os animais receberam semanalmente uma dose única intraperitoneal de temozolomida® e/ou quatro doses de DVD anti-DLL4 / anti-VEGF DVD, com o volume tumoral medido duas vezes por semana pela duração do experimento. Os resultados são mostrados na Tabela 10. Tabela 10. Eficácia da combinação de DVD anti-DLL4/anti-VEGF Temozolomida no modelo de xenoenxerto U87-MG de glioblastoma

Legenda da Tabela 10: a. %TGI = Percentual de inibição do crescimento tumoral = 100 - (T/C x 100), onde T = volume tumoral médio do grupo de tratamento e C = volume tumoral médio do grupo de tratamento controle. Com base Com base medições de tamanhos correspondentes após 19 dias. Os valores P (indicados por asteriscos) são derivados da comparação pelo teste T de Student de grupo de tratamento versusgrupo de tratamento controle, b. %TGD = Retardo percentual do crescimento tumoral = (T - C)/C x 100, onde T = mediana do tempo até o desfecho do grupo de tratamento e C = mediana do tempo até o desfecho do grupo de tratamento controle. Com base em um desfecho de 1000 mm3. Valores P (indicados por asteriscos) derivados da comparação pelo teste log-rank de Kaplan-Meier de grupo de tratamento versusgrupo de tratamento controle (* p < 0,01, ** p < 0,001, ***p< 0,0001). Exemplo 7: Caracterização pré-formulação de DVDs anti-DLL4/anti-VEGF

[0208]A estabilidade no armazenamento (5 °C) e a estabilidade em condições aceleradas (40 °C) de um DVD anti-DLL4/anti-VEGF (h1A11.1-SL-Av) foram avaliadas nas formulações e concentrações proteicas listadas abaixo. A estabilidade foi avaliada por cromatografia de exclusão por tamanho (SE-HPLC), e % de agregado, % de monômero, % de fragmento e espécies totais recuperadas foram quantificados. No geral, as formulações abrangem uma faixa de pH de 5 a 7 e uma faixa de concentração proteica de 1,0 a 118 mg/mL.

[0209]Em temperaturas de 5 °C e 40 °C e concentrações proteicas de 50, 30 e 10 mg/mL, as formulações eram: acetato 15 mM, pH 5; fosfato 15 mM, pH 7; acetato 30 mM, sacarose 80 mg/mL, Tween 80 0,02% em pH 5; histidina 30 mM, sacarose 80 mg/mL, Tween 80 0,02% em pH 6; PBS (solução salina com tampão fosfato). Todas as formulações continham azida sódica 0,02% para prevenir o crescimento microbiano durante o armazenamento. Em temperaturas de 5 °C e 40 °C e concentrações proteicas de 60, 50, 30 e 10 mg/mL, a formulação era histidina 15 mM, pH 6 (também continha azida sódica 0,02% para prevenir o crescimento microbiano durante o armazenamento). A 5 °C e a uma concentração proteica de 118 mg/mL, a formulação era histidina 15 mM, pH 6 (também continha azida sódica 0,02% para prevenir o crescimento microbiano durante o armazenamento). A 40 °C e a uma concentração proteica de 1,0 mg/mL, as formulações eram citrato 10 mM + fosfato 10 mM em pHs 5, 6, 7. As formulações com proteína foram filtradas para remover possíveis micróbios.

[0210]A estabilidade no congelamento/descongelamento foi realizada submetendo a proteína na formulação a quatro ciclos de congelamento a -80 °C por pelo menos 20 horas e descongelamento em banho-maria a 30 °C. As formulações que foram testadas quanto à estabilidade no congelamento/descongelamento estão listadas abaixo. A estabilidade foi avaliada por SE-HPLC, e % de agregado, % de monômero, % de fragmento e espécies totais recuperadas foram quantificados. As formulações eram histidina 15 mM, pH 6 e proteína 60 mg/mL (também continham azida sódica 0,02% para prevenir o crescimento microbiano durante o armazenamento) e citrato 10 mM + fosfato 10 mM em pHs 5, 6, 7 e proteína 1,0 mg/mL (filtradas para remover possíveis micróbios).

[0211]Finalmente, foi realizada calorimetria diferencial de varredura para medir a estabilidade térmica na proteína em tampão citrato 10 mM + fosfato 10 mM em pHs 5, 6, 7 e proteína 1,0 mg/mL. A temperatura de surgimento de desdobramento e as temperaturas no ponto médio de desdobramento (Tm) de cada domínio da proteína foram quantificadas.

[0212]Com base nos dados das Tabelas 11 e 12, h1A11.1-SL-Av satisfez os critérios de pré-formulação para estabilidade de DVD-lg. Tabela 11: Estabilidade em condições aceleradas a 40 °C de h1A11.1-SL-Av em diferentes concentrações e em diferentes tampões, excipientes e pHs

Legenda de tampões (todos os tampões contêm azida sódica 0,02% para prevenir o crescimento microbiano): ace = acetato 15 mM, pH 5; his = histidina 15 mM, pH 6; phos = fosfato 15 mM, pH 7 ace-suc-tw = acetato 30 mM, sacarose 80 mg/mL, Tw80 0,02% his-suc-tw = histidina 30 mM, sacarose 80 mg/mL, Tw80 0,02% PBS = solução salina com tampão fosfato Tabela 12. Estabilidade no armazenamento a 5°C de h1 A11,1-SL-Av em diferentes concentrações e em diferentes tampões, excipientes e pHs (Legenda de tampões igual à Tabela 11)

Tabela 13. Estabilidade no armazenamento a 5°C, estabilidade em condições aceleradas a 40°C e estabilidade no congelamento/descongelamento de h1Al 1.1-SL-Av em diferentes concentrações e em diferentes tampões e pHs

Legenda: FT = congelamento-descongelamento FT2 = análise após dois ciclos de congelamento e descongelamento, congelamento a -80 °C e descongelamento em banho-maria a 30°C FT4 = análise após quatro ciclos de congelamento e descongelamento, congelamento a -80 °C e descongelamento em banho-maria a 30 °C cit-phos = citrato 10 mM + fosfato 10 mM his = histidina 15 mM + azida sódica 0,02% (azida para prevenir crescimento microbiano) Tabela 14. Dados de calorimetria diferencial de varredura de h1A11,1-SL-Av a 1 mg/mL em citrato 10 mM + fosfato 10 mM em diferentes pHs

[0213]Materiais e métodos. A estabilidade da proteína h1A11,1-SL-Av DVD- lg anti-DLL4/anti-VEGF foi avaliada nas seis formulações listadas na Tabela 15. Todas as formulações foram preparadas em tampão de histidina 15 mM. As Formulações F1 a F4 foram preparadas em concentração proteica de 50 mg/mL. Nessas formulações, o pH variou de 5,5 a 6,0, a concentração de polissorbato 80 variou de 0 a 0,05% p/v, a concentração de sacarose variou de 0 a 7,5% p/v e a concentração de arginina variou de 0 a 1% p/v. A Formulação F4 foi preparada em tampão de histidina 15 mM em pH 6,0 sem estabilizantes e serviu como controle do estudo para a avaliação de estabilidade da formulação líquida de 50 mg/mL. Adicionalmente, duas formulações foram preparadas a uma concentração proteica de 25 mg/mL e pH 6,0 (Formulações F5 e F6). A composição de polissorbato 80 e de sacarose foi ligeiramente diferente nessas duas formulações; a concentração de polissorbato 80 variou de 0,025% p/v a 0,03% p/v e a concentração de sacarose variou de 3,8% p/v a 4% p/v. As Formulações F1 a F5 usaram material de um processo anterior de preparo enquanto a Formulação F6 foi preparada com material de um processo mais aperfeiçoado. As composições das Formulações F5 e F6 são muito semelhantes, porém foram observadas diferenças na estabilidade entre as duas. As composições foram preparadas a partir de processos diferentes, portanto, esta pode ser a causa das diferenças observadas. Tabela 15. Descrição da formulação e composição

[0214]Nas formulações acima, o tampão de histidina 15 mM foi selecionado por proporcionar capacidade de tamponamento adequada para manter o pH alvo da formulação. A sacarose foi avaliada como estabilizante contra o estresse do congelamento-descongelamento (crioprotetor) e o estresse induzido pelo processo de liofiização (lioprotetor). O polissorbato 80 (tensoativo) e a arginina foram adicionados para estabilizar potencialmente a formulação contra a formação de agregados e particulados.

[0215]A estabilidade das formulações líquidas foi avaliada durante Congelamento/descongelamento e a -80, 5, 25 e 40 °C por um amplo painel de ensaios analíticos, incluindo aspecto visual, % de agregados por cromatografia de exclusão por tamanho (SE-HPLC), heterogeneidade de carga por cromatografia de troca catiônica (CEX-HPLC), fragmentação por eletroforese capilar-SDS (CE-SDS) em condições redutoras e partículas subvisíveis por imagem de micro-fluxo (MFI) ou extinção de luz (HIAC). Esses resultados são fornecidos nas Tabelas 16-19. Tabela 16. Resultados de estabilidade no congelamento-descongelamento e da formulação líquida a -80 °C

Legenda: EFVP: Essencialmente livre de partículas visíveis, TMTC: Demais para contar, NP: Não realizado Tabela 17. Resultados de estabilidade da formulação líquida a 5 °C

Legenda: EFVP: Essencialmente livre de partículas visíveis, NP: Não realizado Tabela 18. Resultados de estabilidade da formulação líquida a 25 °C

 Legenda: EFVP: Essencialmente livre de partículas visíveis, NP: Não realizado Tabela 19. Resultados de estabilidade da formulação líquida a 40 C

Legenda: EFVP: Essencialmente livre de partículas visíveis

[0216]Testes de estabilidade da formulação liofilizada. A estabilidade de formulações selecionadas contendo a proteína de ligação h1A11,1-SL-Av foi também avaliada depois que as formulações foram liofilizadas. A estabilidade do medicamento liofilizado foi avaliada para todas as formulações contendo sacarose (F1, F2, F3, F5 and F6). A estabilidade foi avaliada depois do armazenamento por 2 semanas a 55 °C. A estabilidade foi testada por um amplo painel de ensaios analíticos, incluindo aspecto visual (antes e depois da reconstituição), tempo de reconstituição, % de agregados por cromatografia de exclusão por tamanho (SE- HPLC), heterogeneidade de carga por cromatografia de troca catiônica (CEX-HPLC), fragmentação por SDS-Eletroforese capilar (CE-SDS) em condições redutoras, partículas subvisíveis por imagem de micro-fluxo (MFI) ou extinção de luz (HIAC) e teor de água por titulação de Karl Fischer.

[0217]Os resultados dos testes de estabilidade da formulação liofilizada são fornecidos na Tabela 20. O tempo de reconstituição para todas as formulações avaliadas foi de aproximadamente 1 a 2 minutos. Um leve aumento na agregação por SEC e no % de região básica por CEX foi observado para todas as formulações na condição de armazenamento com estresse de 55 °C. Alterações mínimas foram observadas em todos os outros atributos de estabilidade medidos no produto. Tabela 20. Resultados de estabilidade da formulação liofi izada a 55 °C

Legenda: WTOWC: Bolo branco a esbranquiçado, EFVP: Essencialmente livre de partículas visíveis

[0218]A estabilidade da formulação F6 (liofilizada, proteína de ligação h1A11.1-SL-Av, 200 por frasco) foi também avaliada ao longo de um período de 12 meses. A formulação ficou estável durante o período testado.

[0219]Testes de estabilidade da dose em solução. A proteína de ligação anti- DLL4/anti-VEGF é testada para administração intravenosa (IV). Antes da administração, o medicamento liofilizado é reconstituído com água estéril para injetáveis (SWFI). Subsequentemente, o produto reconstituído é diluído em uma solução que é adequada para infusão IV. A concentração final à qual a solução é diluída é determinada com base na dose clínica administrada.

[0220]Foi conduzido um estudo para avaliar a estabilidade da proteína de ligação h1A11,1-SL-Av anti-DLL4/anti-VEGF diluída quando em soluções contendo um ou mais diluentes IV comumente usados, solução salina 0,9% e dextrose 5% (D5W). As concentrações proteicas avaliadas foram 0,5 e 1 mg/mL. Para avaliar a estabilidade da solução e a compatibilidade com os componentes da infusão, soluções contendo a dose por condições de teste foram preparadas e armazenadas em bolsas IV (n=2) por 6 horas a RT/RL e, subsequentemente, um estudo com infusão simulada foi realizado utilizando os componentes comumente usados para administração por infusão, incluindo um filtro em linha. Amostras em teste foram retiradas diretamente da bolsa depois de terem sido preparadas soluções com a dose em bolsas IV (T0). Além disso, foram testadas amostras coletadas no final do processo de infusão de 30 minutos. As amostras foram testadas por um painel de ensaios analíticos, incluindo aspecto visual, % de agregados por cromatografia de exclusão por tamanho (SE-HPLC) e partículas subvisíveis por extinção de luz (HIAC).

[0221]Os resultados dos estudos de estabilidade das soluções contendo a dose são fornecidos na Tabela 21. O nível de agregado no material de partida era 0,7%. Depois que as soluções com a dose foram preparadas em solução salina, uma tendência clara indicando aumento em nível de agregados foi observada quando da diluição em solução salina (TO) e no final da infusão. Além disso, as contagens de partículas subvisíveis nessas amostras foram altas. Em comparação, as soluções contendo a dose preparadas em dextrose 5% (D5W) mostraram % consistentemente menores de níveis de agregados com tendências aceitáveis da estabilidade com respeito a particulados. Tabela 21. Resultados da estabilidade em uso clínico

EFVP: Essencialmente livre de partículas visíveis Exemplo 9: Caracterização pré-formulação ampliada

[0222]A caracterização pré-formulação ampliada em DVDs anti-DLL4Z- antiVEGF foi realizada para explorar o impacto que condições diferentes de formulação exerceriam sobre a estabilidade dos DVDs. Os dados para h1A11.1-LS- Av são apresentados na Tabelas 22 and 23. A estabilidade no armazenamento (5 °C) e a estabilidade em condições aceleradas (40 °C) do DVD foram avaliadas nas formulações e concentrações proteicas listadas abaixo. A estabilidade foi avaliada por cromatografia de exclusão por tamanho (SE-HPLC), e % de agregado, % de monômero, % de fragmento e espécies totais recuperadas foram quantificados. No geral, as formulações abrangem uma faixa de pH de 5 e 7 e uma faixa de concentração proteica de 10 a 50 mg/mL.

[0223]Em temperaturas de 5 °C e 40 °C e em concentrações de 50, 30 e 10 mg/mL, as seguintes formulações foram avaliadas: acetato 15 mM, pH 5, Histidina 15 mM, pH 6, fosfato 15 mM, pH 7, acetato 30 mM, sacarose 80 mg/mL, Tween 80 0,02% Tween 80 em pH 5, histidina 30 mM, sacarose 80 mg/mL, Tween 80 0,02% em pH 6 e PBS (solução salina com tampão fosfato). Todas as formulações continham azida sódica 0,02% para prevenir o crescimento microbiano durante o armazenamento.

[0224]Com base nos dados das Tabelas 22 e 23, h1A11.1-LS-Av satisfez os critérios de pré-formulação para estabilidade de DVD-lg. Tabela 22. Estabilidade em condições aceleradas a 40 °C de h1A11.1-LS- AV

A legenda para tampões na Tabela 23 é igual à Tabela 22. Exemplo 10: Efeito de VEGF sobre a atividade de neutralização de DVD anti-DLL4/anti-VEGF em ensaio celular de DLL4

[0225]Para avaliar se a ligação de VEGF afetará a potência de neutralização sobre DLL4 de DVDs anti-DLL4/anti-VEGF, VEGF foi incluído no ensaio repórter de DLL4-Notch, descrito no Exemplo 3.3. Resumidamente, as células HEK293G expressando DLL4 humano foram co-cultivadas com células EA.hy926 repórter de Notch por 24 horas na presença de h1A11,1-SL-Av DVD ou da mistura de mAb anti- DLL4 (h1A11.1) e mAb anti-VEGF (Av) diluídos em série a partir de 300 nM. VEGF-I65 humano recombinante (uma isoforma humana fisiologicamente relevante de VEGF resultante de splicing)ou uma proteína como controle negativo (BSG2) foram também incluídos. A potência de neutralização sobre DLL4 foi determinada avaliando os valores de ICso, a concentração de anticorpo necessária para alcançar 50% de redução de ativação de Notch induzida por DLL4. Conforme mostrado na Tabela 24, a presença de VEGF 6 ou 150 nM aumentou em grande medida a potência de neutralização sobre DLL4 de h1A11.1-SL-Av DVD. Essa potência aumentada é exclusiva para o DVD anti-DLL4/anti-VEGF, pois a potência exibida pela mistura de mAbs parenterais foi semelhante com ou sem VEGF incluído. Tabela 24. VEGF realça a potência sobre DLL4 de DVD anti-DLL4/anti- VEGF, mas não da mistura de anti-DLL4/anti-VEGF

[0226]Em outro experimento, o fragmento Fab monovalente de h1A11.1-SL- Av DVD foi também avaliado no ensaio celular de neutralização de DLL4. Ao contrário da lg DVD, o Fab DVD monovalente possui potência mais fraca de neutralização de DLL4. A presença de VEGF melhorou a potência do DVD-Fab, mas não até o grau visto com a DVD-lg (Tabela 25). Tabela 25. Efeito de VEGF sobre a potência de neutralização de DLL4 de lg DVD anti-DLL4/anti-VEGF e DVD Fab

* A IC50 precisa não pôde ser determinada devido à incapacidade de neutralizar DLL4 completamente

[0227]Em outro experimento, concentrações de VEGF foram diluídas em série e aplicadas ao ensaio repórter de DLL4-Notch descrito acima. Como mostrado na Tabela 26, VEGF pode realçar a atividade de neutralização de DLL4 de h1A11.1- SL-Av DVD a uma concentração já de 1,2 nM. Tabela 26. VEGF realça a potência de neutralização de DLL4 de DVD anti- DLL4/anti-VEGF

Exemplo 11: Eficácia in vivo da combinação de Igs DVD DLL4-VEGF

[0228]O efeito de Igs DVD anti-DLL4-VEGF em combinação com quimioterapia sobre o crescimento tumoral foi avaliado em tumores do xenoenxerto SW-48 de cólon humano em camundongos SCID fêmeas. Resumidamente, 5x106 células foram inoculadas por via subcutânea no flanco traseiro direito. Foi permitido aos tumores se estabelecerem por 13 dias, em cujo ponto, foi determinado o volume tumoral medido com compasso eletrônico utilizando a fórmula: L x W2^. Os camundongos foram alocados em grupos de tratamento (n=10 por grupo) de modo que, em cada coorte, o volume tumoral médio equivalesse a 211 mm3 antes do início da terapia. Os animais receberam irinotecano, mAb anti-VEGF e/ou DVD-lg anti- DLL4-VEGF na dose e no esquema da Tabela 27. O volume tumoral foi medido duas vezes por semana pela duração do experimento. Os resultados são mostrados na Tabela 27. Tabela 27. Eficácia da combinação de DVD-lg anti-DLL4-VEGF e irinotecano no modelo de xenoenxerto SW-48 de cólon

Legenda da Tabela 27: a. %TGI = Percentual de inibição do crescimento tumoral = 100 - (T/C x 100), onde T = volume tumoral médio do grupo de tratamento e C = volume tumoral médio do grupo de tratamento controle. Com base medições de tamanhos correspondentes após 18 dias. Os valores P (indicados por asteriscos) são derivados da comparação pelo teste T de Student de grupo de tratamento versusgrupo de tratamento controle, b. %TGD = Retardo percentual do crescimento tumoral = (T - C)/C x 100, onde T = mediana do tempo até o desfecho of grupo de tratamento e C = mediana do tempo até o desfecho of grupo de tratamento controle. Com base em um desfecho de 1000 mm3 Valores P (indicados por asteriscos) derivados da comparação pelo teste log-rank de Kaplan-Meier de grupo de tratamento versusgrupo de tratamento controle: * p < 0,05; ** p < 0,001; *** p < 0,0001. “q3dx4” indica administração a cada três dias por quatro ciclos (ou seja, 4 doses), enquanto “q7dX4” indica administração a cada sete dias por quatro ciclos.

[0229]O efeito de Igs DVD anti-DLL4-VEGF em combinação com quimioterapia sobre o crescimento tumoral foi também avaliado em tumores do xenoenxerto HCT-116 de cólon humano em camundongos SCID fêmeas. Resumidamente, 5x106 células foram inoculadas por via subcutânea no flanco traseiro direito. Foi permitido aos tumores se estabelecerem por 14 dias, em cujo ponto, foi determinado o volume tumoral medido com compasso eletrônico utilizando a fórmula: L x W2^. Os camundongos foram alocados em grupos de tratamento (n=9 por grupo) de modo que, em cada coorte, o volume tumoral médio equivalesse a 192 mm3 antes do início da terapia. Os animais receberam 5-FU, leucovorina, irinotecano, mAb anti-VEGF e/ou lg DVD anti-DLL4-VEGF na dose e no esquema da Tabela 28. O volume tumoral foi medido duas vezes por semana pela duração do experimento. Os resultados são mostrados na Tabela 28. Tabela 28. Eficácia da combinação de lg DVD anti-DLL4-VEGF e FOLFIRI in no modelo de xenoenxerto HCT-116 de cólon

Legenda da Tabela 28: a. %TGI = Percentual de inibição do crescimento tumoral = 100 - (T/C x 100), onde T = volume tumoral médio do grupo de tratamento e C = volume tumoral médio of grupo de tratamento controle. Com base em medições de tamanhos correspondentes após 26 dias. Os valores P (indicados por asteriscos) são derivados da comparação pelo teste T de Student de grupo de tratamento versusgrupo de tratamento controle:* p < 0,05; ** p < 0,001; *** p < 0,0001. “q7dX3” indica administração a cada sete dias por três ciclos (ou seja, 3 doses), enquanto “q7dX4” indica administração a cada sete dias por quatro ciclos.

[0230]O efeito de Igs DVD anti-DLL4-VEGF em combinação com quimioterapia sobre o crescimento tumoral foi avaliado em tumores do xenoenxerto HT-29 de cólon humano em camundongos SCID fêmeas. Resumidamente, 2x106 células foram inoculadas por via subcutânea no flanco traseiro direito. Foi permitido aos tumores se estabelecerem por 25 dias, em cujo ponto, foi determinado o volume tumoral medido com compasso eletrônico utilizando a fórmula: L x W2^. Os camundongos foram alocados em grupos de tratamento (n=10 por grupo) de modo que, em cada coorte, o volume tumoral médio equivalesse a 209 mm3 antes do início da terapia. Os animais receberam irinotecano e/ou lg DVD anti-DLL4-VEGF, na dose e no esquema da Tabela 29. O volume tumoral foi medido duas vezes por semana pela duração do experimento. Os resultados são mostrados na Tabela 29. Tabela 29. Eficácia da combinação de Ig-DVD anti-DLL4-VEGF e irinotecano no modelo de xenoenxerto HT-29 de cólon

Legenda da Tabela 29. a. %TGI = Percentual de inibição do crescimento tumoral = 100 - (T/C x 100), onde T = volume tumoral médio do grupo de tratamento e C = volume tumoral médio do grupo de tratamento controle. Com base em medições de tamanhos correspondentes após 20 dias. Os valores P (indicados por asteriscos) são derivados da comparação pelo teste T de Student de grupo de tratamento versus grupo de tratamento controle, b. %TGD = Retardo percentual do crescimento tumoral = (T - C)/C x 100, onde T = mediana do tempo até o desfecho of grupo de tratamento and C = mediana do tempo até o desfecho of grupo de tratamento controle. Com base em um desfecho de 1000 mm3. Valores P (indicados por asteriscos) derivados da comparação pelo teste log-rankde Kaplan-Meier de grupo de tratamento versusgrupo de tratamento controle: * p < 0,05; ** p < 0,001; *** p < 0,0001. “q3dx4” indica administração a cada três dias por quatro ciclos (ou seja, 4 doses), enquanto “q7dX4” indica administração a cada sete dias por quatro ciclos.

[0231]O efeito de Igs DVD anti-DLL4-VEGF em combinação com quimioterapia sobre o crescimento tumoral foi avaliado em tumores do xenoenxerto U87-MG de glioblastoma humano em camundongos SCID fêmeas. Resumidamente, 3x106 células foram inoculadas por via subcutânea no flanco traseiro direito. Foi permitido aos tumores se estabelecerem por 13 dias, em cujo ponto, foi determinado o volume tumoral medido com compasso eletrônico utilizando a fórmula: L x W2^. Os camundongos foram alocados em grupos de tratamento (n=10 por grupo) de modo que, em cada coorte, o volume tumoral médio equivalesse a 207 mm3 antes do início da terapia. Os animais receberam temozolomida, mAb anti-VEGF e/ou lg DVD anti-DLL4-VEGF na dose e no esquema da Tabela 30. O volume tumoral foi medido duas vezes por semana pela duração do experimento. Os resultados são mostrados na Tabela 30. Tabela 30. Eficácia da combinação de Ig-DVD anti-DLL4-VEGF e temozolomida no modelo de xenoenxerto U87-MG de glioblastoma

Legenda da Tabela 30. a. %TGI = Percentual de inibição do crescimento tumoral = 100 - (T/C x 100), onde T = volume tumoral médio do grupo de tratamento e C = volume tumoral médio do grupo de tratamento controle. Com base em medições de tamanhos correspondentes após 19 dias. Os valores P (indicados por asteriscos) são derivados da comparação pelo teste T de Student de grupo de tratamento versusgrupo de tratamento controle, b. %TGD = Retardo percentual do crescimento tumoral = (T - C)/C x 100, onde T = mediana do tempo até o desfecho do grupo de tratamento e C = mediana do tempo até o desfecho do grupo de tratamento controle. Com base em um desfecho de 1000 mm3. Valores P (indicados por asteriscos) derivados da comparação pelo teste log-rank de Kaplan-Meier de grupo de tratamento versusgrupo de tratamento controle: * p < 0,05; ** p < 0,001; *** p < 0,0001.

[0232]O efeito de Igs DVD anti-DLL4-VEGF em combinação com quimioterapia on crescimento tumoral foi avaliado em tumores do xenoenxerto PA0123 pancreático humano derivado de pacientes em camundongos NSG fêmeas. Resumidamente, fragmentos tumorais congelados foram implantados por via subcutânea no flanco traseiro direito. Foi permitido aos tumores se estabelecerem por 28 dias, em cujo ponto, foi determinado o volume tumoral medido com compasso eletrônico utilizando a fórmula: L x W2^. Os camundongos foram alocados em grupos de tratamento (n=7 por grupo) de modo que, em cada coorte, o volume tumoral médio equivalesse a 193 mm3 antes do início da terapia. Os animais receberam gencitabina e/ou lg DVD anti-DLL4-VEGF, na dose e no esquema da Tabela 31. O volume tumoral foi medido duas vezes por semana pela duração do experimento. Os resultados são mostrados na Tabela 31. Tabela 31. Eficácia da combinação de lg DVD anti-DLL4-VEGF e gencitabina no modelo de xenoenxerto PA0123 pancreático derivado de paciente

Legenda da Tabela 31. a. %TGI = Percentual de inibição do crescimento tumoral = 100 - (T/C x 100), onde T = volume tumoral médio do grupo de tratamento e C = volume tumoral médio do grupo de tratamento controle. Com base em medições de tamanhos correspondentes após 28 dias. Os valores P (indicados por asteriscos) são derivados da comparação pelo teste T de Student de grupo de tratamento versusgrupo de tratamento controle, b. %TGD = Retardo percentual do crescimento tumoral = (T - C)/C x 100, onde T = mediana do tempo até o desfecho do grupo de tratamento e C = mediana do tempo até o desfecho do grupo de tratamento controle. Com base em um desfecho de 1000 mm3. Valores P (indicados por asteriscos) derivados da comparação pelo teste log-rank de Kaplan-Meier de grupo de tratamento versusgrupo de tratamento controle: * p < 0,05; ** p < 0,001; *** p < 0,0001.

[0233]O efeito de Igs DVD anti-DLL4-VEGF em combinação com quimioterapia sobre o crescimento tumoral foi avaliado em tumores do xenoenxerto MDA-MB-231-luc de mama humana em camundongos SCID fêmeas. Resumidamente, 2x106 células foram implantadas no coxim de gordura mamária. Foi permitido aos tumores se estabelecerem por 13 dias, em cujo ponto, foi determinado o volume tumoral medido com compasso eletrônico utilizando a fórmula: L x W2^. Os camundongos foram alocados em grupos de tratamento (n=10 por grupo) de modo que, em cada coorte, o volume tumoral médio equivalesse a 150 mm3 antes do início da terapia. Os animais receberam paclitaxel e/ou lg DVD anti-DLL4-VEGF, na dose e no esquema da Tabela 32. 0 volume tumoral foi medido duas vezes por semana pela duração do experimento. Adicionalmente, imagens bioluminescentes foram adquiridas para monitorar e rastrear metástase espontânea de células cancerosas para o pulmão e/ou linfonodos. Os resultados são mostrados na Tabela 32. Tabela 32. Eficácia da combinação de lg DVD anti-DLL4-VEGF e paclitaxel no modelo de xenoenxerto MDA-MB-231-luc de mama

Legenda da Tabela 32. a. %TGI = Percentual de inibição do crescimento tumoral = 100 - (T/C x 100), onde T = volume tumoral médio do grupo de tratamento e C = volume tumoral médio do grupo de tratamento controle. Com base em medições de tamanhos correspondentes após 15 dias. Os valores P (indicados por asteriscos) são derivados da comparação pelo teste T de Student de grupo de tratamento versus grupo de tratamento controle, b. %TGD = Retardo percentual do crescimento tumoral = (T - C)/C x 100, onde T = mediana do tempo até o desfecho do grupo de tratamento e C = mediana do tempo até o desfecho do grupo de tratamento controle. Com base em um desfecho de 1000 mm3. Valores P (indicados por asteriscos) derivados da comparação pelo teste log-rank de Kaplan-Meier de grupo de tratamento versusgrupo de tratamento controle, c.% de incidência de metástase = Percentual de animais com sinal detectável no pulmão e/ou linfonodos com base em imagens bioluminescentes. Percentual do grupo de tratamento controle igual a 100%. Com base em medições de tamanhos correspondentes após 22 dias. Os valores P (indicados por asteriscos) são derivados da comparação pelo teste T de Student de grupo de tratamento versusgrupo de tratamento controle: * p < 0,05; ** p < 0,001; *** p < 0,0001.

[0234]O efeito de Igs DVD anti-DLL4-VEGF em combinação com quimioterapia sobre o crescimento tumoral foi avaliado em tumores do xenoenxerto SUM149PT de mama humana em camundongos SCID fêmeas. Resumidamente, 1x106 células foram inoculadas por via subcutânea no flanco traseiro direito. Foi permitido aos tumores se estabelecerem por 28 dias, em cujo ponto, foi determinado o volume tumoral medido com compasso eletrônico utilizando a fórmula: L x W2^. Os camundongos foram alocados em grupos de tratamento (n=9 por grupo) de modo que, em cada coorte, o volume tumoral médio equivalesse a 183 mm3 antes do início da terapia. Os animais receberam paclitaxel e/ou lg DVD anti-DLL4-VEGF, na dose e no esquema da Tabela 33. O volume tumoral foi medido duas vezes por semana pela duração do experimento. Os resultados são mostrados na Tabela 33. Tabela 33. Eficácia da combinação de lg DVD anti-DLL4-VEGF e paclitaxel no modelo de xenoenxerto SUM149PT de mama

Legenda da Tabela 33. a. %TGI = Percentual de inibição do crescimento tumoral = 100 - (T/C x 100), onde T = volume tumoral médio do grupo de tratamento e C = volume tumoral médio do grupo de tratamento controle. Com base em medições de tamanhos correspondentes após 22 dias. Os valores P (indicados por asteriscos) são derivados da comparação pelo teste T de Student de grupo de tratamento versus grupo de tratamento controle, b. %TGD = Retardo percentual do crescimento tumoral = (T - C)/C x 100, onde T = mediana do tempo até o desfecho do grupo de tratamento e C = mediana do tempo até o desfecho do grupo de tratamento controle. Com base em um desfecho de 1000 mm3. Valores P (indicados por asteriscos) derivados da comparação pelo teste log-rank de Kaplan-Meier de grupo de tratamento versus grupo de tratamento controle: * p < 0,05; ** p < 0,001; *** p < 0,0001.

[0235]O efeito de Igs DVD anti-DLL4-VEGF em combinação com quimioterapia sobre o crescimento tumoral foi avaliado em tumores do xenoenxerto SUM149PT de mama humana em camundongos SCID fêmeas. Resumidamente, 1x106 células foram inoculadas por via subcutânea no flanco traseiro direito. Foi permitido aos tumores se estabelecerem por 25 dias, em cujo ponto, foi determinado o volume tumoral medido com compasso eletrônico utilizando a fórmula: L x W2^. Os camundongos foram alocados em grupos de tratamento (n=10 por grupo) de modo que, em cada coorte, o volume tumoral médio equivalesse a 228 mm3 antes do início da terapia. Os animais receberam paclitaxel, mAb anti-VEGF e/ou lg DVD anti- DLL4-VEGF, na dose e no esquema da Tabela 34. O volume tumoral foi medido duas vezes por semana pela duração do experimento. Os resultados são mostrados na Tabela 34. Tabela 34. Eficácia da combinação de lg DVD anti-DLL4-VEGF e paclitaxel no modelo de xenoenxerto SUM149PT de mama

Legenda da Tabela 34: a. %TGI = Percentual de inibição do crescimento tumoral = 100 - (T/C x 100), onde T = volume tumoral médio do grupo de tratamento e C = volume tumoral médio do grupo de tratamento controle. Com base em medições de tamanhos correspondentes após 18 dias. Os valores P (indicados por asteriscos) são derivados da comparação pelo teste T de Student de grupo de tratamento versusgrupo de tratamento controle: * p < 0,05; ** p < 0,001; *** p < 0,0001.

[0236]O efeito de Igs DVD anti-DLL4-VEGF em combinação com quimioterapia sobre o crescimento tumoral foi avaliado ainda em tumores do xenoenxerto HCT-116 de cólon humano em camundongos SCID fêmeas. Resumidamente, 5x106 células foram inoculadas por via subcutânea no flanco traseiro direito. Foi permitido aos tumores se estabelecerem por 16 dias, em cujo ponto, foi determinado o volume tumoral medido com compasso eletrônico utilizando a fórmula: L x W2^. Os camundongos foram alocados em grupos de tratamento (n=9 por grupo) de modo que, em cada coorte, o volume tumoral médio equivalesse a 198 mm3 antes do início da terapia. Os animais receberam 5-FU, capecitabina e/ou lg DVD anti-DLL4-VEGF na dose e no esquema da Tabela 35. O volume tumoral foi medido duas vezes por semana pela duração do experimento. Os resultados são mostrados na Tabela 35. Tabela 35. Eficácia da combinação de lg DVD anti-DLL4-VEGF e 5-FU ou lg DVD anti-DLL4-VEGF e capecitabina no modelo de xenoenxerto HCT-116 de cólon

Legenda da Tabela 35: a. %TGI = Percentual de inibição do crescimento tumoral = 100 - (T/C x 100), onde T = volume tumoral médio do grupo de tratamento e C = volume tumoral médio do grupo de tratamento controle. Com base em medições de tamanhos correspondentes após 21 dias. Os valores P (indicados por asteriscos) são derivados da comparação pelo teste T de Student de grupo de tratamento versusgrupo de tratamento controle. * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001 Exemplo 12: Potência celular cruzada entre espécies de h1A11,1-SL-Av DVD

[0237]A potência neutralizante cruzada entre espécies de h1A11.1-SL-Av DVD contra DLL4 foi comparada em um ensaio celular nas espécies, utilizando o domínio extracelular (ECD) imobilizado de DLL4 recombinante. Esse ensaio foi utilizado para comparar a atividade de h1A11.1-SL-Av DVD contra a mesma concentração de DLL4 derivada da espécie humana, de rato, camundongo e de macaco cinomolgo.

[0238]Placas pretas de cultura de tecido com 96 cavidades de fundo transparente (Costar, n2 3904) foram previamente recobertas com DLL4-ECD 100 pL/cavidade of (11 nM) diluído em PBS (Invitrogen, n2 14190), ou BSA 11 nM 100 pL/cavidade como controle (Sigma, n2 A9576). As placas do ensaio foram fechadas com vedação e incubadas a 4 °C por 18 horas. No dia seguinte, h1A11,1-SL-AV DVD foi diluído em série em meio do ensaio DMEM (Invitrogen, n2 11995) contendo FBS 10%. As placas previamente recobertas do ensaio foram enxaguadas mais uma vez meio de ensaio antes de se adicionar 50 pL/cavidade da solução diluída em série de h1A11.1-SL-Av DVD. As placas do ensaio foram depois incubadas a 25 °C por 30 minutos. Durante essa incubação, células EA.hy926 expressando luciferase de Renílla controle e luciferase de vagalume impulsionadas por um promotor sensível a Notch foram desprendidas do frasco de cultura utilizando Tripsina-EDTA 0,25% (Invitrogen, n2 25200), ressuspensas para 3x105 células/mL em meio de ensaio e depois adicionadas diretamente às placas de ensaio a 25 pL células/cavidade. As placas de ensaio foram depois incubadas a 37°C com CO2 5% por 24 horas. Os ensaios de luciferase de vagalume de Renilla foram realizados de acordo com o protocolo do fornecedor (Dual-Glo Luciferase Assay System, Promega, n2 E2940). A luminescência foi lida em um leitor de placas (Victor, Perkin Elmer, n2 1420-051), e os dados gerados foram normalizados para o sinal de luminescência da luciferase de Renílla.

[0239]Como mostrado na Tabela 36, h1A11,1-SL-Av DVD inibe a atividade de DLL4 humano e do macaco cinomolgo com potências comparáveis. h1A11.1-SL- Av DVD também inibe DLL4 de camundongo, embora com atividade aproximadamente 3 vezes menor, quando comparado ao DLL4 humano. h1A11.1- SL-Av DVD não inibe a atividade de DLL4 de rato nos ensaios celulares.

[0240]A potência neutralizante cruzada entre espécies de h1A11,1-SL-AV DVD contra VEGF foi avaliada em um ensaio de proliferação e viabilidade de células NIH3T3/VEGFR-2 estimulada por VEGF.

[0241]Células NIH3T3 transfectadas estavelmente com o cDNA para VEGFR-2 humano completo foram utilizadas para os ensaios de proliferação e sobrevida estimuladas por VEGF. Uma cultura confluente da linhagem celular NIH3T3/VEGFR-2 estável foi desprendida do frasco de cultura com Tripsina-EDTA 0,25% (Invitrogen, n2 25200) e ressuspensa para 1,33x105 células/mL com meio de ensaio: DMEM (Invitrogen, n2 11995) contendo BSA 0,1% (Sigma, n2 A9576). As células foram semeadas a 10.000 células/cavidade em volume total de 75 pL nas placas pretas de ensaio de 96 cavidades com fundos transparentes para cultura de tecido (Costar, n2 3904), e incubadas por 24 horas a 37 °C com CO2 5%. No dia seguinte, a proteína VEGF recombiπante e h1A11,1-SL-AV DVD foram diluídas com meio de ensaio, misturadas em uma placa de polipropileno com 96 cavidades e incubadas a 25 °C por 30 minutos. Os coquetéis de VEGF e h1A11,1-SL-AV DVD (4X) foram depois adicionados às células em uma placa de ensaio a 25 pL/cavidade. As placas de ensaio contendo as células tratadas foram depois incubadas a 37 °C com CO2 5%. Setenta e duas horas mais tarde, um ensaio de viabilidade foi realizado de acordo com o protocolo do fornecedor (ATPlite 1step, Perkin Elmer, n2 6016739). A luminescência foi lida em um leitor de placas (Victor, Perkin Elmer, n2 1420-051).

[0242]Como mostrado na Tabela 36, h1A11,1-SL-AV DVD neutralizou a atividade do VEGF de macaco cinomolgo com potência semelhante ao VEGF humano. h1A11,1-SL-AV DVD não inibe o VEGF de camundongo ou rato em ensaio celular. Tabela 36: Potência celular cruzada entre espécies de h1A11.1-SL-AV DVD

Legenda da Tabela 36: a. Os valores do ensaio celular para DLL4 são médias ± desvios padrão de quatro experimentos independentes. Os valores do ensaio celular para VEGF são médias ± desvios padrão de três experimentos independentes. Exemplo 13: Funil de rastreamento e seleção de candidato de primeira linha

[0243]A seleção de um candidato de primeira linha para lg DVD pode exigir diversos ciclos de engenharia molecular, gerar centenas de moléculas candidatas potenciais, seguido por testes em um funil de rastreamento que pode incluir uma bateria de ensaios para identificar uma molécula de lg DVD com as propriedades necessárias para um agente terapêutico, tudo sem orientação referente às sequências do domínio variável ou a outras estruturas que proporcionarão propriedades funcionais ideais. Tipicamente, essas propriedades incluem, entre outras, uma avaliação de: (a) a cinética de ligação (taxa de associação, taxa de dissociação e afinidade) tanto para os domínios internos como para os externos de ligação a antígeno, (b) potências em vários bioensaios bioquímicos e celulares, (c) eficácias in vivo em modelos de tumores relevantes, (d) propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas, (e) facilidade de fabricação, incluindo nível de expressão proteica em linhagens celulares selecionadas, capacidade para produção em escala, modificação pós-tradução, propriedades físico-químicas como porcentagem de monômeros, solubilidade e estabilidade (intrínseca, congelamento/descongelamento, estabilidade no armazenamento, etc.), (f) propriedades de formulação, (g) risco potencial de imunogenicidade e (h) propriedades toxicológicas de uma molécula. O modo de ligação e a valência podem também ser avaliados, pois estes podem afetar as propriedades de ligação e as potências celulares de uma molécula. Níveis limiares foram estabelecidos para cada parâmetro avaliado, e as proteínas de ligação exibindo níveis superiores para cada parâmetro são anotadas. A partir do rastreamento inicial de centenas de moléculas, muitas vezes somente uma ou nenhuma surge com propriedades que satisfaçam todos os parâmetros listados, entre outros fatores levados em consideração na identificação de um candidato de primeira linha para avaliação mais profunda. Uma vez identificado um candidato de primeira linha, é realizada uma avaliação in vivo adicional das propriedades terapêuticas, que são examinadas e incluíram segurança, eficácia e potência em animais e humanos. Exemplo 14: Seleção de candidato de primeira linha para lg DVD anti-DLL4 / anti-VEGF

[0244]Os inventores construíram e avaliaram aproximadamente 100 moléculas de lg DVD anti-DLL4/anti-VEGF, incluindo construções utilizando as sequências de VEGF e DLL4 listadas na Tabela 2, bem como versões enxertadas com CDR e obtidas por maturação de afinidade daqueles domínios variáveis e de sequências adicionais de domínios variáveis humanizados e inteiramente humanos. mAbs parentais inteiramente humanos anti-DLL4 foram derivados pela tecnologia PROfusion de expressão de mRNa, seguido por maturação de afinidade utilizando a tecnologia de expressão em leveduras. Anticorpos parentais novamente enxertados com CDR basearam-se no mAb E9.71 anti-DLL4. Diversos mAbs humanizados anti- DLL4 foram preparados com base em h1 A11.1 e h38H12.11, e diversos anticorpos h1A11 com maturação de afinidade foram também produzidos. Os inventores também avaliaram inúmeras sequências diferentes de ligadores nas proteínas de ligação lg DVD. O uso de ligadores diferentes resultou em propriedades que diferiam bastante, mesmo entre proteínas de ligação com as mesmas sequências de domínio variável.

[0245]Das aproximadamente 100 moléculas de lg DVD geradas, 10 destas foram excluídas por não terem atingido um nível desejado de expressão em células HEK293 por transfecção transitória, 22 não exibiram um nível limiar desejado de ligação a DLL4, 19 o exibiram um nível limiar desejado de ligação ao VEGF, várias exibiram modificação pós-tradução abaixo da ideal, incluindo glicosilação O-ligada. Diversas Igs DVD foram excluídas por exibirem afinidade de ligação abaixo de um limiar definido. Domínios de ligação a antígeno na posição interna de uma lg DVD podem exibir nível reduzido de afinidade de ligação ao antígeno e de potência. Por exemplo, todas as moléculas de lg DVD da série h1A11/Av onde o domínio de ligação ao VEGF está situado na posição externa e o domínio de ligação ao DLL4 na posição interna exibiram afinidade de ligação reduzida por DLL4 Essas Igs DVD não foram, portanto, selecionadas para estudo mais detalhado. Na orientação oposta (ou seja, domínio de ligação ao VEGF na posição interna e domínio de ligação ao DLL4 na posição externa), a afinidade de ligação ao VEGF de h1A11,1-SL-Av demonstrou ser inesperadamente superior, mesmo para proteínas de ligação utilizando os mesmos domínios variáveis e orientações, mas com outras sequências de ligadores, como h1A11.1-SS-Av (ligadores curtos entre os domínios VD1 e VD2 na cadeia pesada e na leve).

[0246]Adicionalmente, foi conduzida maturação de afinidade em h1A11 para gerar anticorpos parentais anti-DLL4 com afinidades e estabilidades muito altas quando em forma de anticorpo monoclonal, porém, em forma de lg DVD, essas construções não exibiram o nível de estabilidade observada para h1A11,1-SL-Av, independentemente dos ligadores usados ou das orientações dos domínios de ligação. Do mesmo modo, a maturação de afinidade de domínios variáveis Av (anti- VEGF) mais uma vez gerou anticorpos monoclonais parentais estáveis exibindo níveis reduzidos de estabilidade, independentemente de manipulação do ligador e da orientação. Além disso, a maturação de afinidade, mesmo quando produz cinética de ligação superior para anticorpos monoclonais, pode não predizer a atividade da lg DVD subsequente. Por exemplo, quando h1 A11.1 foi substituído por suas variantes de afinidade maturada, essas novas moléculas de lg DVD exibiram estabilidade reduzida, meia-vida ín vivomais curta e atividades antitumorais diminuídas em modelos de tumores. Adicionalmente, moléculas de lg DVD contendo domínios variáveis h1A11 de afinidade maturada e/ou Av também exibiram maior tendência para gelificar ou formar altos níveis de agregados durante o armazenamento a 5 °C. Essa gelificação e agregação indesejável não foram observadas para moléculas de lg DVD compreendendo os domínios variáveis originais dos anticorpos parentais (ou seja, domínios variáveis de anticorpos sem maturação de afinidade) quando armazenadas em condições similares, especialmente para DVD-lg h1A11.1-SL-Av.

[0247]lsso indica que a afinidade de ligação ao antígeno apenas não é o único fator a considerar na seleção de um candidato clínico e, de fato, a afinidade de ligação pode não predizer outras propriedades da proteína de ligação, como estabilidade, capacidade de formulação, propriedades físico-químicas, potência antitumoral in vivo e/ou propriedades farmacocinéticas, que são sensíveis até mesmo a ligeiras modificações estruturais. Por exemplo, as potências de neutralização de VEGF e DLL4 das moléculas de lg DVD h1A11,1-LS-Av, h1 A11.1 - LL-Av e h1A11.1-SL-Av foram amplamente comparáveis (Tabela 7), mas h1A11,1- SL-Av exibiu o nível mais alto de potência inibitória do crescimento tumoral (Tabela 9). Adicionalmente, para as moléculas de lg DVD que retinham afinidades de ligação e potências celulares, algumas destas exibiam propriedades físico-químicas menos favoráveis. Por exemplo, embora h1A11.1-LL-Av seja muito semelhante ao agente terapêutico de primeira linha h1A11.1-SL-Av, a diferença entre os ligadores que conectam os dois domínios variáveis nas duas construções resulta em propriedades físico-químicas menos favoráveis para h1A11.1-LL-Av. Isso demonstra que mesmo pequenas mudanças, p. ex., ao ligador entre os dois domínios variáveis em uma lg DVD podem ter um impacto significativo nas propriedades terapêuticas avaliadas.

[0248]Com base na presença de certas características desejáveis, conforme medidas nos ensaios descritos acima, 17 das aproximadamente 100 ou mais moléculas de lg DVD foram ainda testadas em modelos de camundongos para atividade antitumoral e propriedades farmacocinéticas. DVD-lg h1A11.1-SL-Av exibiu inesperadamente potência inibitória sobre o tumor e propriedades farmacocinéticas superiores quando comparada às outras proteínas de ligação testadas. Assim, avaliando os critérios de exclusão usados no funil de rastreamento, DVD-lg h1A11,1- SL-Av emergiu no final como uma proteína de ligação exibindo propriedades favoráveis (ou seja, acima do limiar) em cada um dos parâmetros medidos. A proteína de ligação foi, portanto, selecionada, para avaliação e estudo posterior. Exemplo 15: Comparação a Igs DVD VEGF/DLL4 anteriores

[0249]Embora h1A11,1-SL-Av não tenha sido diretamente comparada às 96 moléculas anteriores de lg DVD VEGF/DLL4, reveladas na Publicação de Pedido de Patente US No 20100076178 (ver a Tabela 5 naquele pedido de patente), uma comparação indireta pode ser efetuada. Por exemplo, h1A11,1-SL-Av exibiu atividade de ligação a VEGF comparável àquela do mAb Av anti-VEGF de referência (ver a Tabela 5). Em contraste, pelo menos dois terços das 96 moléculas de lg DVD VEGF/DLL4 testadas na Publicação de Pedido de Patente US No 20100076178 apresentavam atividade de ligação ao VEGF mais fraca do que o mAb AB014 anti- VEGF de referência (AB014 contém as mesmas sequências de domínio variável que no anticorpo Av). Dessa forma, h1A11,1-SL-Av parece exibir cinética de ligação melhorada sobre uma maioria das construções de lg DVD testadas no pedido de patente anterior.

[0250]Os exemplos precedentes destinam-se a ilustrar e de maneira alguma limitar a presente invenção. Outras modalidades dos dispositivos e métodos revelados serão evidentes para os técnicos no assunto ao considerarem o relatório descritivo e a prática dos dispositivos e métodos descritos neste pedido de patente. Incorporação por referência

[0251]Os conteúdos de todas as referências mencionadas (inclusive referências na literatura, patentes, pedidos de patente e sites da Internet), talvez citadas por todo este pedido de patente, são aqui expressamente incorporados, em sua totalidade e para todos os fins, por referência neste pedido de patente, do mesmo modo que as referências ali citadas. A invenção empregará, a menos que indicado de outra forma, técnicas convencionais de imunologia, biologia molecular e biologia celular, as quais são bem conhecidas na técnica.

[0252]A presente invenção também incorpora por referência, em sua totalidade, técnicas bem conhecidas no campo da biologia molecular e da liberação de fármacos. Essas técnicas incluem, entre outras, aquelas descritas nas seguintes publicações: Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993); Ausubel, F.M. et al. eds., Short Protocols In Molecular Biology (4th Ed. 1999) John Wiley & Sons, NY (ISBN 0-471-32938-X); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York, (1999); Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138 (1984); Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563- 681 (Elsevier, N.Y., 1981; Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991); Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); Lu and Weiner eds., Cloning and Expression Vectors for Gene Function Analysis (2001) BioTechniques Press. Westborough, MA. 298 pp. (ISBN 1-881299- 21-X); Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Old, R.W. & S.B. Primrose, Principles of Gene Manipulation: An Introduction To Genetic Engineering (3d Ed. 1985) Blackwell Scientific Publications, Boston. Studies in Microbiology; V.2:409 pp. (ISBN 0-632-01318-4); Sambrook, J. et al. eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d Ed. 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. Vols. 1-3. (ISBN 0-87969-309-6); Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978; Winnacker, E.L. From Genes To Clones: Introduction To Gene Technology (1987) VCH Publishers, NY (translated by Horst Ibelgaufts). 634 pp. (ISBN 0-89573- 614-4).

Equivalentes

[0253]A invenção pode ser concretizada em outras formas específicas sem que, porém, se afastar do espírito ou de suas características essenciais. As modalidades precedentes deverão, portanto, ser consideradas em todos os aspectos ilustrativas em vez de limitação à invenção. O âmbito da invenção é assim indicado pelas reivindicações anexadas, mais do que pela descrição precedente, e todas as alterações que se enquadrarem dentro do significado e gama de equivalência das reivindicações destinam-se, por conseguinte, a serem abrangidas pela invenção.

Claims (11)

1. Proteína de ligação CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma primeira e uma segunda cadeia polipeptídica, cada uma compreendendo independentemente VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, em que: VD1 é um primeiro domínio variável; VD2 é um segundo domínio variável; C é um domínio constante; X1 é um ligador; X2 é uma região Fc; n é 0 ou 1, em que os domínios VD1 na primeira e na segunda cadeias polipeptídicas formam um primeiro sítio funcional de ligação ao alvo e os domínios VD2 na primeira e na segunda cadeias polipeptídicas formam um segundo sítio funcional de ligação ao alvo, e em que a proteína de ligação é capaz de se ligar a DLL4 e VEGF, em que: a primeira cadeia polipeptídica da proteína de ligação compreende SEQ ID NO: 56 e a segunda cadeia polipeptídica da proteína de ligação compreende SEQ ID NO: 64.

2. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de ligação compreende uma primeira cadeia polipeptídica incluindo um primeiro VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, em que: V D1 é um primeiro domínio variável da cadeia pesada; V D2 é um segundo domínio variável da cadeia pesada; C é um domínio constante da cadeia pesada; X1 é um ligador; X2 é uma região Fc; n é 0 ou 1, e em que a proteína de ligação compreende uma segunda cadeia polipeptídica incluindo um segundo VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, em que: V D1 é um primeiro domínio variável da cadeia leve; V D2 é um segundo domínio variável da cadeia leve; C é um segundo domínio constante da cadeia leve; X1 é um ligador; n é 0 ou 1 para (X1)n; n é 0 para (X2)n, em que os domínios VD1 na primeira e na segunda cadeias polipeptídicas formam um primeiro sítio funcional de ligação ao alvo e os domínios VD2 na primeira e na segunda cadeias polipeptídicas formam um segundo sítio funcional de ligação ao alvo.

3. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de ligação compreende duas primeiras e duas segundas cadeias polipeptídicas e quatro sítios funcionais de ligação ao alvo.

4. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de ligação é capaz de se ligar a: (a) VEGF com uma constante de dissociação (KD) de no máximo cerca de 7,40 x 10-9 M, conforme medido por ressonância plasmônica de superfície; e/ou (b) DLL4 com uma constante de dissociação (KD) de no máximo cerca de 3,40 x 10-8 M ou 5,00 x io-8M, conforme medido por ressonância plasmônica de superfície.

5. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a região Fc da proteína de ligação é uma região Fc de uma lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgM, IgE ou IgD, ou uma variante desta.

6. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a região Fc da proteína de ligação é uma região Fc de sequência variante.

7. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de ligação compreende as sequências da região constante de SEQ ID NO: 73 e/ou SEQ ID NO: 74.

8. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a primeira e a segunda cadeias polipeptídicas da proteína de ligação compreendem as SEQ ID NOs: 74 e 73.

9. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de ligação é capaz de: (a) ligar-se a VEGF com uma constante de dissociação (KD) de no máximo aproximadamente 7,0 x 10-10 M, conforme medido por ressonância plasmônica de superfície, e/ou bloquear a atividade de VEGF com IC50 de no máximo aproximadamente 3,8 nM, conforme medido em um ensaio ELISA de competição por VEGFR1; e/ou (b) ligar-se a DLL4 com uma constante de dissociação (KD) de no máximo aproximadamente 1,0 x 10’8 M, conforme medido por ressonância plasmônica de superfície, e/ou bloqueara atividade de DLL4 com IC50 de no máximo aproximadamente 1,09 nM, conforme medido em um ensaio ELISA de competição por Notch.

10. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a proteína de ligação, como definida na reivindicação 1 e ao menos um agente adicional.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que o agente adicional compreende um ou mais de um agente citotóxico, um agente quimioterápico, um agente antiangiogênico, um anticorpo anti-CTLA4, um blo- queador do canal de cálcio, um inibidor da ACE, FOLFIRI, paclitaxel, carboplatina, doxil, topotecano e cisplatina..

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