TW202037609A - 抗-vegf/dll4雙重可變區域免疫球蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文揭示多價及多特異性結合蛋白、製備該等結合蛋白之方法，及其在診斷、監測、抑制、預防及/或治療癌症、腫瘤及/或特徵在於異常DLL4及/或VEGF表現或活性之其他血管生成依賴性疾病之用途。

Description

抗-VEGF/DLL4雙重可變區域免疫球蛋白及其用途
本文揭示多價及多特異性結合蛋白、製備該等結合蛋白之方法及其在診斷、抑制、預防及/或治療癌症、腫瘤及/或其他血管生成依賴性疾病中之用途。
業內已知經改造蛋白，例如能夠結合兩種或更多種抗原之多特異性結合蛋白。可使用細胞融合、化學偶聯或重組DNA技術生成該等多特異性結合蛋白。存在各種在業內已知之多特異性結合蛋白結構；然而許多該等結構及方法具有不同缺點。 已使用細胞雜交瘤技術產生雙特異性抗體。然而，存在錯誤配對副產物及使用此技術之產率顯著減小意味著需要複雜之純化程序。亦可藉由兩種不同mAb之化學偶聯來產生雙特異性抗體。然而，此方式不能得到均質製劑。 先前使用之其他方式包含使用異質雙功能交聯劑偶合兩個親代抗體，產生串聯單鏈Fv分子、雙抗體、雙特異性雙抗體、單鏈雙抗體及雙-雙抗體。然而，該等方式中之每一者皆具有缺點。此外，已闡述多價抗體構築體，其在IgG之重鏈中包括兩個Fab重複單元且能夠結合4個抗原分子(參見PCT公開案第WO 0177342號及Miller等人(2003) J. Immunol. 170(9): 4854-61)。 已共演進出配體-受體系統以維持特異性。其相互作用會活化用於特定生物活性之特異性信號傳導。然而，非配體-受體結合蛋白(例如單特異性抗體、雙特異性或多特異性結合蛋白、非競爭性抗體組合或受體之細胞外區域(ECD)之其他受體結合蛋白)可識別不同於受體配體結合位點之表位。結合至受體之ECD上之不同表位可將構形變化轉導至細胞內區域，此可得到新穎之意外信號傳導級聯。 美國專利第7,612,181號(其全部內容以引用方式併入本文中)提供能夠以高親和力結合兩種或更多種抗原之新穎結合蛋白家族，其稱為雙重可變區域結合蛋白(DVD結合蛋白)或雙重可變區域免疫球蛋白(DVD-IgTM )。DVD分子係能夠同時結合相同分子或兩個不同分子上之兩個不同表位之四價雙重特異性Ig樣蛋白。DVD係包括兩個融合至二價抗體之N末端之可變區域之獨特結合蛋白。可變區域可彼此直接融合或經由具有匹配長度及胺基酸組成之合成肽連接體連結。可使用完整功能Fc區域改造DVD，使其調介適當效應子功能。因抗體對選擇靈活性、兩個抗原結合區域之定向及接合其之連接體長度，DVD格式可提供新穎治療方式。 儘管業內提供各種結構且一些結構具有一定之優點及缺點，但需要特定構築體來製備具有特定性質且結合至特定靶之多價結合蛋白。另外，新可變區域序列可進一步改良結合蛋白之性質。具體而言，結合至DLL4及VEGF之經改良DVD可證實較為有益。因此，本文揭示使用在美國專利第7,612,181號(其全部內容以引用方式併入本文中)中揭示之結合蛋白框架且含有特定第一及第二多肽鏈(其各自包括形成用於VEGF及DLL4之功能結合位點之第一及第二可變區域序列(例如彼等列示於表2中者))之雙重可變區域免疫球蛋白。在一些實施例中，第一及第二多肽鏈包括各自含有來自表2中所列示一個序列之三個CDR且形成用於VEGF及DLL4之功能結合位點之第一及第二可變區域序列。 DLL4係涉及經由Notch受體路徑進行細胞至細胞信號傳導之配體。許多生物過程(例如分化、增殖及體內恆定)需要該細胞至細胞傳遞。Notch信號傳導路徑許多真核生物所利用之一種系統。此路徑、尤其Notch受體亦對於功能腫瘤血管生成至關重要。因此，抑制Notch受體功能、阻斷Notch受體及/或阻斷Notch信號傳導路徑係用於抗癌組合物及療法之潛在策略。已證實Notch受體之小分子抑制劑通常有毒，此乃因其阻抑Notch受體在整個機體內之野生型(正常)組織表現。因此，Notch信號傳導路徑之不同成員應視為潛在治療靶。Notch受體之血管配體係δ 4或δ樣4 (DLL4)。DLL4較大程度上表現於血管中，其對於血管發育至關重要(Yan等人，Clin.Cancer Res. , 13(24): 7243-7246 (2007)；Shutter等人，Genes Dev. , 14(11): 1313-1318 (2000)；Gale等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 101(45): 15949-15954 (2004)；Krebs等人，Genes Dev. , 14(11): 1343-1352 (2000))。DLL4雜合小鼠因血管發育之重大缺陷而具有胚胎致死性(Gale等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 101(45): 15949-15954 (2004)；Duarte等人，Genes Dev. , 18(20): 2474-2478 (2004)；Krebs等人，Genes Dev. , 18(20): 2469-2473 (2004))。 可藉由VEGF誘導DLL4之表現(Liu等人，Mol.Cell Biol ., 23(1): 14- 25 (2003)；Lobov等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 104(9): 3219-3224 (2007))。VEGF係藉由涉及血管生成之細胞產生之信號蛋白。另外，DLL4可部分地經由抑制VEGFR2及誘導VEGR1來負性調控VEGF信號傳導(Harrington等人，Microvasc.Res. , 75(2): 144-154 (2008)；Suchting等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 104(9): 3225-3230 (2007))。DLL4與VEGF之間之密切協調對於功能血管生成極為重要，從而使得DLL4及VEGF成為治療性幹預之潛在靶。 除其生理學作用外，DLL4及VEGF亦在腫瘤血管中上調(Gale等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 101(45): 15949-15954 (2004)；Mailhos等人，Differentiation , 69(2-3): 135-144 (2001)；Patel等人，Cancer Res. , 65(19): 8690-8697 (2005)；Patel等人，Clin.Cancer Res. , 12(16): 4836-4844 (2006)；Noguera-Troise等人，Nature , 444(7122): 1032-1037 (2006))。已展示阻斷DLL4會抑制多種模型中之原發性腫瘤生長(Noguera-Troise等人，Nature , 444(7122): 1032-1037 (2006)；Ridgway等人，Nature , 444(7122): 1083-1087 (2006)；Scehnet等人，Blood , 109(11): 4753-4760 (2007))。抑制DLL4甚至有效抵抗可抵抗抗-VEGF療法之腫瘤。因此，DLL4及VEGF之組合抑制可提供增強之抗腫瘤療法。有趣的是，不同於減小腫瘤血管形成之VEGF抑制，DLL4阻斷會增加血管異常、不能支持有效血液傳輸且實際上無功能之腫瘤血管密度。因此，VEGF及DLL4之破壞提供了潛在抗癌治療之不同作用方法。 儘管業內已知抗體及各種結合構築體，但仍需要結合至VEGF及DLL4之較佳靶向及效率以(例如)治療癌症及腫瘤發生。因此，業內需要能夠結合DLL4及VEGF之改良之多價結合蛋白。因此，提供新穎結合蛋白，其中該等結合蛋白能夠結合DLL4及VEGF。在一些實施例中，結合蛋白能夠(例如)以改良之結合親和力及/或中和效力結合至DLL4及VEGF。
提供能夠靶向兩種表位之結合蛋白，其中該等結合蛋白能夠結合DLL4及VEGF。在一實施例中，提供能夠以高親和力結合DLL4及VEGF之表位之結合蛋白。在一實施例中，結合蛋白包括含有表2中所列示CDR及可變區域序列之雙重可變區域結合蛋白框架。在一實施例中，雙重可變區域結合蛋白框架包括在美國專利第7,612,181號(其全部內容以引用方式併入本文中)中揭示之框架。 在一實施例中，提供包括可結合兩種不同蛋白質(VEGF及DLL4)之兩種表位之多肽鏈之結合蛋白，其中多肽鏈包括VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1係第一可變區域，VD2係第二可變區域，C係恆定區域，X1代表胺基酸或多肽，X2代表Fc區且n為0或1。在一些實施例中，結合蛋白中之VD1及VD2係重鏈可變區域。在某些實施例中，VD1及VD2能夠結合DLL4之表位及VEGF之表位。在一些實施例中，C係重鏈恆定區域，例如CH1。在某些實施例中，X1係連接體，前提係X1並非CH1。 在各種實施例中，本文所揭示之結合蛋白包括結合DLL4之表位及VEGF之表位的多肽鏈，其中多肽鏈包括VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1包括第一重鏈可變區域，VD2包括第二重鏈可變區域，C包括重鏈恆定區域，X1包括連接體，且X2包括Fc區。在一實施例中，X1係連接體，前提係其並非CH1。在一實施例中，VD1及VD2重鏈可變區域各自包括三個選自SEQ ID NO: 39、41、43、45、47、49、51或53中之CDR的CDR (亦即來自彼等SEQ ID NO中之一者之CDR 1-3)，其中VD1及/或VD2重鏈中之至少一者可變區域包括SEQ ID NO: 39中之三個CDR。在另一實施例中，結合蛋白能夠結合DLL4及VEGF。在一實施例中，VD1及VD2重鏈可變區域包括SEQ ID NO: 39、41、43、45、47、49、51或53，其中VD1及/或VD2重鏈可變區域中之至少一者包括SEQ ID NO: 39。 在各種實施例中，本文所揭示之結合蛋白包括結合DLL4之表位及VEGF之表位的多肽鏈，其中多肽鏈包括VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1包括第一輕鏈可變區域，VD2包括第二輕鏈可變區域，C包括輕鏈恆定區域，X1包括連接體，且X2不包括Fc區。在一實施例中，X1係接體，前提係其並非CH1或CL。在一實施例中，VD1及VD2輕鏈可變區域各自包括三個選自SEQ ID NO: 40、42、44、46、48、50、52或54中之CDR的CDR (亦即來自彼等SEQ ID NO中之一者之CDR 1-3)，其中VD1及/或VD2輕鏈可變區域中之至少一者包括SEQ ID NO: 40中之三個CDR。在另一實施例中，結合蛋白能夠結合DLL4及VEGF。在一實施例中，VD1及VD2輕鏈可變區域各自包括SEQ ID NO: 40、42、44、46、48、50、52或54，其中VD1及/或VD2輕鏈可變區域中之至少一者包括SEQ ID NO: 40。 在另一實施例中，揭示結合DLL4之表位及VEGF之表位之結合蛋白。在一些實施例中，結合蛋白包括第一及第二多肽鏈，其中第一及第二多肽鏈中之每一者獨立地包括VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1係第一可變區域，VD2係第二可變區域，C係恆定區域，X1係連接體，X2係Fc區，且n為0或1，其中第一及第二多肽鏈上之VD1區域形成第一功能靶結合位點且第一及第二多肽鏈上之VD2區域形成第二功能靶結合位點。在一實施例中，在n=1時X2包括Fc區，且在n=0時X2不包括Fc區。在一些實施例中，第一及第二多肽鏈上之X1序列相同。在其他實施例中，第一及第二多肽鏈上之X1序列不同。在一些實施例中，多肽鏈中之至少一者上之X1並非CH1區域及/或CL區域。在一實施例中，X1序列係短(例如6、5、4、3或2個胺基酸)連接體。在另一實施例中，X1序列係長(例如6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30或更多個胺基酸)連接體。在另一實施例中，兩條多肽鏈中之一者上之X1序列係短連接體且另一多肽鏈上之X1序列係長連接體。在一實施例中，VD1及VD2重鏈可變區域各自包括三個來自SEQ ID NO: 39、41、43、45、47、49、51或53之CDR (亦即來自彼等SEQ ID NO中之一者之CDR 1-3)，其中VD1及/或VD2重鏈可變區域中之至少一者包括SEQ ID NO: 39中之三個CDR；且VD1及VD2輕鏈可變區域包括三個來自SEQ ID NO: 40、42、44、46、48、50、52或54之CDR (亦即來自彼等SEQ ID NO中之一者之CDR 1-3)，其中VD1及/或VD2輕鏈可變區域中之至少一者包括SEQ ID NO: 40中之三個CDR。在另一實施例中，結合蛋白能夠結合DLL4及VEGF。在一實施例中，VD1及VD2重鏈可變區域包括SEQ ID NO: 39、41、43、45、47、49、51或53，其中VD1及/或VD2重鏈可變區域中之至少一者包括SEQ ID NO: 39，且VD1及VD2輕鏈可變區域包括SEQ ID NO: 40、42、44、46、48、50、52或54，其中VD1及/或VD2輕鏈可變區域中之至少一者包括SEQ ID NO: 40。 在各種實施例中，揭示能夠結合VEGF及DLL4之結合蛋白。在一實施例中，形成VEGF功能靶結合位點之可變區域包括三個來自SEQ ID NO: 41之CDR及三個來自SEQ ID NO: 42之CDR (例如存在於單獨鏈上之來自SEQ ID NO: 41之CDR 1-3及來自SEQ ID NO: 42之CDR 1-3，其中每一鏈上之CDR以指定順序配置且藉由適宜框架序列間隔以形成功能結合位點)。在一實施例中，形成DLL4功能靶結合位點之可變區域包括三個來自SEQ ID NO: 39之CDR及三個來自SEQ ID NO: 40之CDR (例如存在於單獨鏈上之來自SEQ ID NO: 39之CDR 1-3及來自SEQ ID NO: 40之CDR 1-3，其中每一鏈上之CDR以指定順序配置且藉由適宜框架序列間隔以形成功能結合位點)。在一實施例中，結合蛋白包括VEGF功能靶結合位點，其包括三個來自SEQ ID NO: 41之CDR及三個來自SEQ ID NO: 42之CDR (例如來自SEQ ID NO: 41之CDR 1-3及來自SEQ ID NO: 42之CDR 1-3)；及DLL4功能靶結合位點，其包括三個來自SEQ ID NO: 39之CDR及三個來自SEQ ID NO: 40之CDR (例如來自SEQ ID NO: 39之CDR 1-3及來自SEQ ID NO: 40之CDR 1-3)。在一實施例中，結合蛋白包括含有SEQ ID NO: 41及SEQ ID NO: 42之VEGF功能靶結合位點及含有SEQ ID NO: 39及SEQ ID NO: 40之DLL4功能靶結合位點。在一實施例中，結合蛋白包括含有SEQ ID NO: 56之第一多肽鏈及含有SEQ ID NO: 64之第二多肽鏈。在一實施例中，結合蛋白包括含有SEQ ID NO: 73之第一多肽鏈及含有SEQ ID NO: 74之第二多肽鏈。 在各種實施例中，與抵抗VEGF或DLL4之抗體相比，本文所揭示之結合蛋白展現對於VEGF及/或DLL4之增加之親和力、阻斷能力及/或中和效力。在一些實施例中，結合蛋白包括VEGF功能靶結合位點(包括三個來自SEQ ID NO: 41之CDR及三個來自SEQ ID NO: 42之CDR)及DLL4功能靶結合位點(包括三個來自SEQ ID NO: 39之CDR及三個來自SEQ ID NO: 40之CDR)；或包括含有SEQ ID NO: 41及SEQ ID NO: 42之VEGF功能靶結合位點及含有SEQ ID NO: 39及SEQ ID NO: 40之DLL4功能靶結合位點；或包括SEQ ID NO: 56及SEQ ID NO: 64；或包括SEQ ID NO: 73及SEQ ID NO: 74。舉例而言，結合蛋白(例如包括SEQ ID NO: 56及SEQ ID NO: 64或包括SEQ ID NO: 73及SEQ ID NO: 74之結合蛋白)可能夠以至多約7.0 × 10-10 M之解離常數(KD )結合至VEGF (如藉由表面電漿共振所量測)，及/或以至多約3.8 nM之IC50阻斷VEGF活性(如在VEGFR1競爭ELISA中所量測)；及/或能夠以至多約1.0 × 10-8 M之解離常數(KD )結合至DLL4 (如藉由表面電漿共振所量測)，及/或以至多約1.09 nM之IC50阻斷DLL4活性(如在Notch競爭ELISA中所量測)。 在一些實施例中，與VEGF及DLL4抗體之混合物(例如用於提供用於結合蛋白之可變區域之親代抗體)相比，結合蛋白(例如包括SEQ ID NO: 56及SEQ ID NO: 64或包括SEQ ID NO: 73及SEQ ID NO: 74之結合蛋白)可展現對於DLL4之增加之親和力及/或中和效力(在亦存在VEGF時)。在一些實施例中，與VEGF及DLL4抗體之混合物(例如用於提供用於結合蛋白之可變區域之親代抗體)相比，結合蛋白可展現對於DLL4之中和效力具有數量級增加(在亦存在VEGF時)。在一些實施例中，與VEGF及DLL4抗體之混合物(例如用於提供用於結合蛋白之可變區域之親代抗體)相比，結合蛋白可展現對於DLL4之中和效力具有數量級增加(在亦存在至少約1.2 nM VEGF (例如至少約1.2 nM、1.5 nM、2 nM、2.5 nM、5 nM、10 nM、50 nM、150 nM或更高)時)。 在各種實施例中，與抗-VEGF或抗-DLL4抗體與一或多種癌症藥劑之組合相比，本文所揭示之結合蛋白與一或多種抗癌劑之組合展現加和及/或超加和效能。在一些實施例中，結合蛋白包括VEGF功能靶結合位點(其包括三個來自SEQ ID NO: 41之CDR及三個來自SEQ ID NO: 42之CDR)及DLL4功能靶結合位點(其包括三個來自SEQ ID NO: 39之CDR及三個來自SEQ ID NO: 40之CDR)；或包括含有SEQ ID NO: 41及SEQ ID NO: 42之VEGF功能靶結合位點及含有SEQ ID NO: 39及SEQ ID NO: 40之DLL4功能靶結合位點；或包括SEQ ID NO: 56及SEQ ID NO: 64；或包括SEQ ID NO: 73及SEQ ID NO: 74。舉例而言，與未治療腫瘤相比，結合蛋白(例如包括SEQ ID NO: 56及SEQ ID NO: 64或包括SEQ ID NO: 73及SEQ ID NO: 74之結合蛋白)可展現至少約50% (例如46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、60%、65%、70%、75%、80%)或更大百分比之腫瘤生長抑制或腫瘤生長延遲。在一些實施例中，與抗-VEGF抗體及一或多種抗癌劑之組合相比，結合蛋白(例如包括SEQ ID NO: 56及SEQ ID NO: 64或包括SEQ ID NO: 73及SEQ ID NO: 74之結合蛋白)在與一或多種抗癌劑組合投與時可展現關於抑制腫瘤生長或延遲腫瘤生長之增加之效能。舉例而言，抗癌劑可為伊立替康(Irinotecan)、福爾菲力(FOLFIRI)、替莫唑胺(Temozolomide)、吉西他濱(Gemcitabine)、太平洋紫杉醇(Paclitaxel)、5-FU及卡培他濱(Capecitabine)中之一或多者。結合蛋白及一或多種抗癌劑可用作醫藥來治療(例如)結腸癌、神經膠質母細胞瘤、胰臟癌或乳癌。 在一實施例中，雙重可變區域(DVD-Ig)結合蛋白包括如先前段落中所闡述之兩條第一多肽鏈及兩條第二多肽鏈(亦即包括四條多肽鏈)，其中多肽鏈中之每一者獨立地包括VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1係第一可變區域，VD2係第二可變區域，C係恆定區域，X1係連接體，X2係Fc區，且n為0或1。在一些實施例中，第一鏈係重鏈且與第二鏈(其係輕鏈)配對。此一DVD-Ig結合蛋白包括4個功能靶結合位點。在一些實施例中，第一及第二多肽鏈上之X1連接體相同或不同。在一些實施例中，DVD-Ig結合蛋白包括至少兩種能夠結合相同或不同蛋白質之兩種或更多種表位(例如兩種、三種或四種)且呈任一定向之可變區域序列(例如VD1及VD2)。在一些實施例中，獨立選擇VD1及VD2。在一實施例中，VD1及VD2重鏈可變區域各自包括三個來自SEQ ID NO: 39、41、43、45、47、49、51或53之CDR，其中VD1及/或VD2重鏈可變區域中之至少一者包括SEQ ID NO: 39中之三個CDR，且VD1及VD2輕鏈可變區域包括三個來自SEQ ID NO: 40、42、44、46、48、50、52或54之CDR，其中VD1及/或VD2輕鏈可變區域中之至少一者包括SEQ ID NO: 40中之三個CDR。在另一實施例中，結合蛋白能夠結合DLL4及VEGF。在一實施例中，VD1及VD2重鏈可變區域各自包括SEQ ID NO: 39、41、43、45、47、49、51或53，其中VD1及/或VD2重鏈可變區域中之至少一者包括SEQ ID NO: 39，且VD1及VD2輕鏈可變區域各自包括SEQ ID NO: 40、42、44、46、48、50、52或54，其中VD1及/或VD2輕鏈可變區域中之至少一者包括SEQ ID NO: 40。 在另一實施例中，雙重可變區域結合蛋白包括如表2中所展示之重鏈及輕鏈序列，其中VD1及/或VD2重鏈可變區域中之至少一者包括SEQ ID NO: 39及/或VD1及/或VD2輕鏈可變區域中之至少一者包括SEQ ID NO: 40。 在另一實施例中，重鏈、輕鏈、兩條鏈或四條鏈實施例中之任一者包含至少一種X1連接體(包括選自SEQ ID NO: 1-38之連接體)。在一實施例中，X2係Fc區。在另一實施例中，X2係變體Fc區。 在再一實施例中，Fc區(若存在於第一多肽中)係天然序列Fc區或變體序列Fc區。在又一實施例中，Fc區係來自IgG1之Fc區、來自IgG2之Fc區、來自IgG3之Fc區、來自IgG4之Fc區、來自IgA之Fc區、來自IgM之Fc區、來自IgE之Fc區或來自IgD之Fc區。在某些實施例中，Fc區係來自人類IgG1 LALA突變體之Fc區，人類IgG1 LALA突變體係提供針對HIV病毒之保護之b12抗體突變體。 提供製備結合兩種不同靶蛋白之結合蛋白之方法。在一實施例中，製備結合蛋白之方法包括以下步驟：a)獲得結合第一表位之第一親代抗體或其抗原結合部分；b)獲得結合第二表位之第二親代抗體或其抗原結合部分；c)製備編碼所本文闡述結合蛋白中之任一者之構築體；及d)表現多肽鏈，從而生成結合第一及第二表位之結合蛋白。 在本文實施例中之任一者中，VD1重鏈可變區域(若存在)及輕鏈可變區域(若存在)可來自第一親代抗體或其抗原結合部分；VD2重鏈可變區域(若存在)及輕鏈可變區域(若存在)可來自第二親代抗體或其抗原結合部分。第一及第二親代抗體可相同或不同。 在一實施例中，第一親代抗體或其抗原結合部分結合第一抗原，且第二親代抗體或其抗原結合部分結合第二抗原。在一實施例中，第一及第二抗原係不同抗原。在另一實施例中，第一親代抗體或其抗原結合部分以不同於第二親代抗體或其抗原結合部分結合第二抗原之效力的效力結合第一抗原。在又一實施例中，第一親代抗體或其抗原結合部分以不同於第二親代抗體或其抗原結合部分結合第二抗原之親和力的親和力結合第一抗原。 在另一實施例中，第一親代抗體或其抗原結合部分及第二親代抗體或其抗原結合部分係人類抗體、CDR移植抗體、人類化抗體及/或親和力成熟抗體。 在另一實施例中，結合蛋白擁有至少一種由第一親代抗體或其抗原結合部分或由第二親代抗體或其抗原結合部分展現之期望性質。另一選擇為，第一親代抗體或其抗原結合部分及第二親代抗體或其抗原結合部分擁有至少一種由結合蛋白展現之期望性質。在一實施例中，期望性質係一或多種抗體參數。在另一實施例中，抗體參數係抗原特異性、抗原親和力、效力、生物功能、表位識別、穩定性、溶解性、產生效率、免疫原性、藥物動力學、生物可用性、組織交叉反應性或同源抗原結合。在一實施例中，結合蛋白係多價。在另一實施例中，結合蛋白係多特異性。本文所闡述之多價及/或多特異性結合蛋白具有尤其來自治療角度之期望性質。舉例而言，多價及/或多特異性結合蛋白可(1)快於二價抗體地藉由表現抗體所結合抗原之細胞內在化(及/或分解代謝)；(2)為激動劑結合蛋白；及/或(3)誘導表現多價結合蛋白能夠結合之抗原之細胞之細胞死亡及/或細胞凋亡。「親代抗體」提供多價及/或多特異性結合蛋白之至少一種抗原結合特異性，其可為藉由表現抗體所結合抗原之細胞內在化(及/或分解代謝)者；及/或可為激動劑、誘導細胞死亡及/或誘導細胞凋亡之抗體，且如本文所闡述之多價及/或多特異性結合蛋白可在該等性質中之一或多者中顯示改良。另外，親代抗體可缺乏該等性質中之任一者或多者，但可在構築為如本文所闡述之多價結合蛋白時獲取其中之一或多者。 在另一實施例中，結合蛋白對於一或多種靶具有以下結合速率常數(K結合 )：至少約102 M-1 s-1 、至少約103 M-1 s-1 、至少約104 M-1 s-1 、至少約105 M-1 s-1 或至少約106 M-1 s-1 ，如藉由表面電漿共振所量測。在一實施例中，結合蛋白對於一或多種靶具有以下結合速率常數(K結合 )：約102 M-1 s-1 至約103 M-1 s-1 、約103 M-1 s-1 至約104 M-1 s-1 、約104 M-1 s-1 至約105 M-1 s-1 或約105 M-1 s-1 至約106 M-1 s-1 ，如藉由表面電漿共振所量測。 在另一實施例中，結合蛋白對於一或多種靶具有以下解離速率常數(K解離 )：至多約10-2 s-1 、至多約10-3 s-1 、至多約10-4 s-1 、至多約10-5 s-1 或至多約10-6 s-1 ，如藉由表面電漿共振所量測。在一實施例中，結合蛋白對於一或多種靶具有以下解離速率常數(K解離 )：約10-2 s- 1 至約10-3 s-1 、約10-3 s-1 至約10-4 s-1 、約10-4 s-1 至約10-5 s-1 或約10-5 s-1 至約10-6 s-1 ，如藉由表面電漿共振所量測。 在另一實施例中，結合蛋白對於一或多種靶具有以下平衡解離常數(KD )：至多約10-7 M、至多約10-8 M、至多約10-9 M、至多約10-10 M、至多約10-11 M或至多約10-12 M。在一實施例中，結合蛋白對於其靶具有以下平衡解離常數(KD )：約10-7 M至約10-8 M、約10-8 M至約10- 9 M、約10-9 M至約10-10 M、約10-10 M至約10-11 M或約10-11 M至約10-12 M。 在一些實施例中，與抗-DLL4或抗-VEGF抗體相比，抗-DLL4/抗-VEGF結合蛋白展現增加之效力(例如增加之干擾、抑制及/或中和DLL4及/或VEGF活性之能力)。在一些實施例中，可用於評估VEGF及/或DLL4活性之任一分析(例如VEGF及/或DLL4結合ELISA分析、BIACORE™分析、DLL4-Notch報告子分析、VEGF刺激內皮細胞增殖/存活分析或熟習此項技術者已知之任一其他分析)中評估結合蛋白之效力。在一些實施例中，結合蛋白在VEGF存在下展現增加之DLL4效力。 在另一實施例中，提供偶聯物，其包括本文所闡述結合蛋白中之任一者且包括另一藥劑。在一實施例中，藥劑係免疫黏著分子、成像劑、治療劑或細胞毒性劑。在一實施例中，成像劑係放射標記、酶、螢光標記、發光標記、生物發光標記、磁性標記或生物素。在另一實施例中，放射標記係3 H、14 C、35 S、90 Y、99 Tc、111 In、125 I、131 I、177 Lu、166 Ho或153 Sm。在又一實施例中，治療劑或細胞毒性劑係抗代謝物、烷基化劑、抗生素、生長因子、細胞因子、抗血管生成劑、抗有絲分裂劑、蒽環素、毒素或細胞凋亡劑。在一些實施例中，藥劑係以下中之一或多者：伊立替康、醛氫葉酸(leucovorin)、5-FU、替莫唑胺、吉西他濱及太平洋紫杉醇。在一實施例中，藥劑係伊立替康。在一實施例中，藥劑係醛氫葉酸。在一實施例中，藥劑係5-FU。在一實施例中，藥劑係伊立替康、醛氫葉酸及5-FU。在一實施例中，藥劑係替莫唑胺。在一實施例中，藥劑係吉西他濱。在一實施例中，藥劑係太平洋紫杉醇。 在另一實施例中，偶聯物包括結合蛋白及藥物。在一實施例中，偶聯物中之結合蛋白包括第一及第二多肽鏈，其中第一及第二多肽鏈中之每一者獨立地包括VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1係第一可變區域，VD2係第二可變區域，C係恆定區域，X1係連接體，且X2係Fc區，其中第一及第二多肽鏈上之VD1區域形成第一功能靶結合位點且第一及第二多肽鏈上之VD2區域形成第二功能靶結合位點，且其中結合蛋白能夠結合VEGF及DLL4。在一些實施例中，VD1及VD2區域包括來自表2中所揭示序列中之任一者之CDR或可變區域序列，其經配對及配置以形成用於VEGF及DLL4之功能結合位點。在一實施例中，偶聯物中之藥物係選自由以下組成之群：有絲分裂抑制劑、抗腫瘤抗生素、免疫調節劑、基因療法載體、烷基化劑、抗血管生成劑、抗代謝物、含硼藥劑、化學保護劑、激素、抗激素劑、皮質類固醇、光活性治療劑、寡核苷酸、放射性核素劑、拓撲異構酶抑制劑、酪胺酸激酶抑制劑及放射敏感劑。在另一實施例中，藥物係選自由以下組成之群：伊沙匹隆(Ixempra)、多拉司他汀10 (dolastatin 10)、多拉司他汀15 (dolastatin 15)、奧裏斯他汀(auristatin) E、奧裏斯他汀PE、單甲基奧裏斯他汀D (MMAD或奧裏斯他汀D衍生物)、單甲基奧裏斯他汀E (MMAE或奧裏斯他汀E衍生物)、單甲基奧裏斯他汀F (MMAF或奧裏斯他汀F衍生物)、奧裏斯他汀F伸苯基二胺(AFP)、奧裏斯他汀EB (AEB)、奧裏斯他汀EFP (AEFP)、5-苯甲醯基戊酸-AE酯(AEVB)、胺甲喋呤(methotrexate)、柔紅黴素(daunorubicin)、長春新鹼(vincristine)、美登素(maytansine)、美登醇(maytansinol)、美登醇之C-3酯、安絲菌素(ansamitocin) P1、安絲菌素P2、安絲菌素P3、安絲菌素P4、多西他賽(docetaxel)、紫杉醇、奈米顆粒紫杉醇、硫酸長春地辛(vindesine sulphate)、長春新鹼、長春花鹼(vinblastine)、長春瑞濱(vinorelbine)、放線菌素(actinomycine)、放線菌素D、安曲黴素(anthramycin)、芝加黴素A (chicamycin A)、DC-18、甲基胺茴黴素(mazethramycin)、新斯拉黴素A (neothramycin A)、新斯拉黴素B (neothramycin B)、普斯卡星B (prothracarcin B)、SG2285、西班米星(sibanomicin)、西伯利亞黴素(sibiromycin)、蒽環素、柔紅黴素、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊達比星(idarubicin)、卡奇黴素(calicheamicin)、γ 1 ’、 α2 ’、α3 ’、N-乙醯基-γ 1 ’、PSAG、θ’ 1 、多卡米星(duocarmycin)、阿多來新(adozelesin)、比折來新(bizelesin)及卡折來新(carzelesin)、博來黴素(bleomycin)、絲裂黴素(mitomycin)、普卡黴素(plicamycin)、卡介菌素(bacillus calmette-guerin) (BCG)、左旋咪唑(levamisole)、癌症疫苗、重組二價人類乳頭狀瘤病毒(HPV)疫苗類型16及18疫苗、重組四價人類乳頭狀瘤病毒(HPV)類型6、11、16及18疫苗、西普魯塞T (sipuleucel-T)、細胞因子、甲狀旁腺激素、甲狀腺素、胰島素、胰島素原、鬆弛素、鬆弛素原、糖蛋白激素(例如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)及促黃體激素(LH))、肝細胞生長因子、成纖維細胞生長因子、催乳素、胎盤催乳激素、腫瘤壞死因子、繆勒管抑制物質、小鼠促性腺激素關聯肽、抑制素、活化素、血管內皮生長因子、整合素、血小板生成素(TPO)、神經生長因子(例如NGF)、血小板生長因子、轉化生長因子(TGF)、胰島素樣生長因子-I及胰島素樣生長因子-II、紅血球生成素(EPO)、骨誘導因子、干擾素(例如干擾素-α、干擾素-β及干擾素-γ)、群落刺激因子(CSF)、粒細胞-巨噬細胞-C-SF (GM-CSF)及粒細胞-CSF (G-CSF)、介白素(IL) (例如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12)、腫瘤壞死因子及其他多肽因子(包含LIF及kit配體(KL))、群落刺激因子、紅血球生成素(erythropoietin、epoetin)、非格司亭(filgrastim)、沙格司亭(sargramostim)、普美嘉亭(promegapoietin)、奧普瑞白介素(Oprelvekin)、免疫調節性基因治療劑、編碼用於代替與癌症有關之突變或另外功能障礙(例如截短)基因之功能性治療基因之核酸、編碼或另外產生治療癌症之治療性蛋白之核酸、磺酸烷基酯、白消安(busulfan)、氮芥(nitrogen mustard)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)及美法侖(melphalan)、亞硝基脲、卡莫司汀(carmustine)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、鏈佐星(streptozocin)、三嗪及肼、達卡巴嗪(dacarbazine)、丙卡巴肼(procarbazine)、替莫唑胺、乙烯亞胺、噻替派(thiotepa)、地吖醌(diaziquone)、絲裂黴素C、甲胺衍生物、環氧化物、六甲蜜胺(altretamine)、環氧乳醇(dianhydrogalactitol)、二溴衛矛醇(dibromodulcitol)、血管抑制素、ABX EFG、C1-1033、PKI-166、EGF疫苗、EKB-569、GW2016、ICR-62、EMD 55900、CP358、PD153035、AG1478、IMC-C225、OSI-774、厄洛替尼(Erlotinib)、血管抑制素、抑制蛋白、內皮抑制素、BAY 12-9566與氟尿嘧啶(fluorouracil)或多柔比星、血管能抑制素、羧胺三唑與紫杉醇、EMD121974、S-24、維他辛(vitaxin)、二甲基𠮿酮乙酸、IM862、介白素-12、介白素-2、NM-3、HuMV833、PTK787、RhuMab、安奇羅然(angiozyme)、IMC-1C11、新伐司他(Neovastat)、馬立馬司他(marimstat)、普啉司他(prinomastat)、BMS-275291、COL-3、MM1270、SU101、SU6668、SU11248、SU5416與紫杉醇、與吉西他濱及順鉑(cisplatin)及與伊立替康及順鉑及與放射、替可加蘭(tecogalan)、替莫唑胺及PEG干擾素α2b、四硫鉬酸鹽、TNP-470、沙利度胺(thalidomide)、CC-5013與泰素帝(taxotere)、腫瘤抑素、2-甲氧基雌二醇、VEGF trap、mTOR抑制劑(地弗羅莫司(deforolimus)、依維莫司(everolimus)及坦羅莫司(temsirolimus))、酪胺酸激酶抑制劑(例如伊馬替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、達沙替尼(dasatinib)、舒尼替尼(sunitinib)、尼羅替尼(nilotinib)、拉帕替尼(lapatinib)、索拉非尼(sorafenib)、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、葉酸拮抗劑、胺甲喋呤、4-胺基-葉酸、洛美曲索(lometrexol)、培美曲塞(pemetrexed)、曲美沙特(trimetrexate)、嘧啶拮抗劑、阿紮胞苷(azacitidine)、卡培他濱、阿糖胞苷(cytarabine)、地西他濱(decitabine)、5-氟尿嘧啶、5’-磷酸5-氟-2’-去氧尿苷、三磷酸5-氟尿苷、吉西他濱、氟尿苷(foxuridine)、嘌呤拮抗劑硫唑嘌呤(azathioprine)、克拉屈濱(cladribine)、巰基嘌呤(mercaptopurine)、氟達拉濱(fludarabine)、噴司他丁(pentostatin)、6-硫鳥嘌呤、腺苷去胺酶抑制劑、克拉屈濱、氟達拉濱、耐拉濱(Nelarabine)、噴司他丁、波羅非辛(borophycin)、硼替佐米(bortezomib)、化學保護劑、胺磷汀(amifostine)、右雷佐生(dexrazoxane)、美司鈉(mesna)、雄激素、雌激素、乙酸甲羥孕酮(medroxyprogesterone acetate)、孕激素、胺魯米特(aminoglutethimide)、阿那曲唑(anastrozole)、比卡魯胺(bicalutamide)、氯烯雌醚(chlorotrianises)、乙酸環丙孕酮(cyproterone acetate)、地加瑞克(degarelix)、依西美坦(exemestane)、氟他胺(flutamide)、氟維司群(fulvestrant)、戈舍瑞林(goserelin)、來曲唑(letrozole)、亮丙瑞林(leuprolide)、利普安(lupron)、乙酸甲羥孕酮、乙酸甲地孕酮(Megestrol acetate)、他莫昔芬(tamoxifen)、曲普瑞林(triptorelin)、天門冬醯胺酶、達卡巴嗪、羥基脲、左旋咪唑、米托坦(mitotane)、普羅巴贊(procarbazane)、維A酸(tretinoin)、糖皮質激素、潑尼松(prednisone)、發色團、染料、反義寡核苷酸(不論天然存在者或使用標準及/或非標準核苷酸合成者，包含RNA干擾(RNAi))、雙鏈RNA (dsRNA)、小干擾RNA (siRNA)、微小RNA (miRNA)、適配體、CpG寡核苷酸、核酶、安奇羅然、111 In、177 Lu、212 Bi、213 Bi、211 At、62 Cu、64 Cu、67 Cu、90 Y、I25 I、I31 I、32 P、33 P、47 Sc、111 Ag、67 Ga、142 Pr、153 Sm、161 Tb、166 Dy、166 Ho、186 Re、188 Re、189 Re、212 Pb、223 Ra、225 Ac、59 Fe、75 Se、77 As、89 Sr、99 Mo、105 Rh、I09 Pd、143 Pr、149 Pm、169 Er、194 Ir、198 Au、199 Au、211 Pb、Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、I-125、Ho-161、Os-189m、Ir-192、Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213、Fm-255、11 C、13 N、15 O、75 Br、198 Au、224 Ac、126 I、133 I、77 Br、113m In、95 Ru、97 Ru、I03 Ru、105 Ru、107 Hg、203 Hg、121m Te、122m Te、125m Te、165 Tm、167 Tm、168 Tm、197 Pt、109 Pd、105 Rh、142 Pr、143 Pr、161 Tb、166 Ho、199 Au、57 Co、58 Co、51 Cr、59 Fe、75 Se、201 Tl、225 Ac、76 Br、I69 Yb、紫杉烷(taxane)、順鉑、甲硝唑(metronidazole)、米索硝唑(misonidazole)、去甲基米索硝唑(desmethylmisonidazole)、哌莫硝唑(pimonidazole)、依他硝唑(etanidazole)、尼莫唑(nimorazole)、絲裂黴素C、RSU 1069、SR 4233、E09、RB 6145、菸醯胺、5-溴去氧尿苷(BUdR)、5-碘去氧尿苷(IUdR)、溴去氧胞苷、氟去氧尿苷(FUdR)、羥基脲、血卟啉衍生物、Photofrin(r)、苯并卟啉衍生物、NPe6、錫初卟啉(SnET2)、脫鎂葉綠甲酯酸-a (pheoborbide a)、細菌葉綠素a、萘酞菁、酞菁、鋅酞菁、喜樹鹼(camptothecin)、伊立替康、拓撲替康(topotecan)、安吖啶(amsacrine)、柔紅黴素、多柔比星、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)、玫瑰樹鹼(ellipticine)、表柔比星、依託泊苷(etoposide)、雷佐生(razoxane)、替尼泊苷(teniposide)、阿昔替尼(Axitinib)、博舒替尼(Bosutinib)、西地尼布(Cediranib)、達沙替尼、厄洛替尼、吉非替尼、伊馬替尼、拉帕替尼、來他替尼(Lestaurtinib)、尼羅替尼、司馬沙尼(Semaxanib)、舒尼替尼、凡德他尼(Vandetanib)、相思豆毒素、相思豆毒素A鏈、α毒素、油桐蛋白(Aleurites fordii protein)、鵝膏毒素(amatoxin)、巴豆毒蛋白(crotin)、瀉果素(curcin)、戴安辛蛋白(dianthin protein)、白喉毒素、白喉毒素A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、去氧核糖核酸酶(Dnase)、白樹毒素(gelonin)、米托潔林(mitogellin)、蒴蓮根毒素A鏈、苦瓜抑制劑(momordica charantia inhibitor)、新黴素(neomycin)、奧克納斯(onconase)、酚黴素(phenomycin)、美洲商陸蛋白(Phytolaca americana protein) (PAPI、PAPII及PAP-S)、美洲商陸抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein)、假單胞桿菌內毒素(Pseudomonas endotoxin)、假單胞桿菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)、來自綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)之外毒素A鏈、侷限毒素(restrictocin)、蓖麻毒素、蓖麻毒素A鏈、核糖核酸酶(Rnase)、蘆荀抑制劑(sapaonaria officinalis inhibitor)、皂草素(saporin)、α-帚麴菌素、葡萄球菌腸毒素-A (Staphylcoccal enterotoxin-A)、破傷風類毒素、順鉑、卡鉑(carboplatin)及奧沙利鉑(oxaliplatin) (樂沙定(Eloxatin)、賽諾菲-安萬特(Sanofi Aventis))、蛋白酶體抑制劑、PS-341、HDAC抑制劑、伏立諾他(vorinostat)、比利諾他(belinostat)、恩替諾他(entinostat)、莫西諾他(mocetinostat)、帕比諾他(panobinostat)、COX-2抑制劑、經取代脲、熱激蛋白質抑制劑、格爾德黴素(Geldanamycin)、腎上腺皮質阻抑劑、單端孢黴烯族毒素類(tricothecene)、A12、19D12、Cp751-871、H7C10、αIR3、ScFV/FC、EM/164、馬妥珠單抗(Matuzumab)、艾比特思(Erbitux)、維克替比(Vectibix)、mAb 806、尼妥珠單抗(Nimotuxumab)、AVEO、AMG102、5D5 (OA-5d5)、H244G11、Ab 14號(MM 121-14)、赫賽汀(Herceptin)、1B4C3、2D1D12、NVP-AEW541-A、BMS-536,924 (1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吡啶-2-酮)、BMS-554,417、環木脂體(Cycloligan)、TAE226、PQ401、易瑞沙(Iressa)、CI-1033 (PD 183805)、拉帕替尼(GW-572016)、提克比(Tykerb)、塔西法(Tarceva)、PKI-166、PD-158780、EKB-569、酪胺酸磷酸化抑制劑AG 1478 (4-(3-氯苯胺基)-6,7-二甲氧基喹唑啉)、PHA665752、ARQ 197、卡培他濱、5-三氟甲基-2’-去氧尿苷、胺甲喋呤鈉、雷替曲塞(Raltitrexed)、培美曲塞、替加氟(Tegafur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(Cytosine Arabinoside) (阿糖胞苷)、5-氮雜胞苷、6-巰基嘌呤(巰基嘌呤、6-MP)、硫唑嘌呤、6-硫鳥嘌呤、噴司他丁、磷酸氟達拉濱(Fludarabine phosphate)、克拉屈濱(2-CdA、2-氯去氧腺苷)、核糖核苷酸還原酶抑制劑、環磷醯胺、環磷醯胺注射劑(Neosar)、異環磷醯胺、噻替派、BCNU→ 1, 3-雙(2-氯乙基)-1-亞硝基脲、CCNU→ 1, -(2-氯乙基)-3-環己基-1-亞硝基脲(甲基CCNU)、六甲基蜜胺(Hexamethylmelamine)、白消安、丙卡巴肼HCL、達卡巴嗪(DTIC)、苯丁酸氮芥、美法侖、卡鉑、奧沙利鉑、多柔比星HCL、檸檬酸柔紅黴素(daunorubicin citrate)、米托蒽醌HCL (mitoxantrone HCL)、放線菌素D、依託泊苷、拓撲替康HCl、替尼泊苷、伊立替康HCL(CPT-II)、長春新鹼、硫酸長春花鹼(vinblastine sulfate)、酒石酸長春瑞濱(vinorelbine tartrate)、硫酸長春地辛、紫杉醇、多西他賽、阿布沙尼(abraxane)、伊沙匹隆(ixabepilone)、甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate)、蘋果酸舒尼替尼(sunitinib malate)、甲苯磺酸索拉非尼(sorafenib toslate)、單水合尼羅替尼鹽酸鹽(nilotinib hydrochloride monohydrate)、L-天門冬醯胺酶、α干擾素、阿伐斯丁(Avastin)、IL-2、阿地白介素(Aldesleukin)、普留淨(Proleukin)、IL-12、檸檬酸托瑞米芬(Toremifene citrate)、氟維司群、雷洛昔芬HCL (raloxifene HCL)、阿那曲唑(anastrazole)、來曲唑、法屈唑(Fadrozole) (CGS 16949A)、依西美坦、乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、利普安、乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、雙羥萘酸曲普瑞林(triptorelin pamoate)、布舍瑞林(buserelin)、那法瑞林(Nafarelin)、西曲瑞克(cetrorelix)、比卡魯胺、尼魯米特(nilutamide)、乙酸甲地孕酮、生長抑素類似物、潑尼松龍(prendinsolone)、地塞米松(dexamethasone)、酮康唑(ketoconazole)、西羅莫司(sirolimus)、坦羅莫司(CCI-779)、地弗羅莫司(AP23573)、伊立替康、醛氫葉酸、福爾菲力、5-FU、依那普利(Enalapril)、硝苯地平(Nifedipine)、可樂定(Clonidine)、替莫唑胺、吉西他濱、卡培他濱、紫杉醇、瑞格菲尼(Regorafenib)、帕妥珠單抗(Pertuzumab)及依維莫司(RAD00I)。 在一些實施例中，揭示包括一或多種如本文所揭示之結合蛋白及一或多種其他藥劑(例如化學治療劑)之組合物。舉例而言，組合物可包括一或多種結合蛋白溶液與一或多種其他藥劑。在一些實施例中，藥劑係以下中之一或多者：伊立替康、醛氫葉酸、5-FU、替莫唑胺、吉西他濱及紫杉醇。在一實施例中，藥劑係伊立替康。在一實施例中，藥劑係醛氫葉酸。在一實施例中，藥劑係5-FU。在一實施例中，藥劑係伊立替康、醛氫葉酸及5-FU。在一實施例中，藥劑係替莫唑胺。在一實施例中，藥劑係吉西他濱。在一實施例中，藥劑係紫杉醇。 在另一實施例中，結合蛋白係結晶之結合蛋白且以晶體形式存在。在一實施例中，晶體係不含載劑之醫藥受控釋放晶體。在另一實施例中，結晶之結合蛋白之活體內半衰期長於結合蛋白之可溶性對等部分。在又一實施例中，結晶之結合蛋白保留生物活性。 在另一實施例中，本文所闡述之結合蛋白係糖基化蛋白。舉例而言，糖基化模式係人類糖基化模式。 亦提供編碼本文所揭示結合蛋白中之任一者之經分離核酸。另一實施例提供包括本文所揭示之經分離核酸之載體，其中載體係pcDNA、pTT (Durocher等人(2002) Nucleic Acids Res. 30(2))、pTT3 (具有額外之多個選殖位點之pTT)、pEFBOS (Mizushima及Nagata (1990) Nucleic Acids Res.18(17))、pBV、pJV、pcDNA3.1 TOPO、pEF6 TOPO、pBOS、pHybE或pBJ。在一實施例中，載體係揭示於美國專利公開案第20090239259號中之載體。 在另一態樣中，使用本文所揭示之載體轉化宿主細胞。在一實施例中，宿主細胞係原核細胞(例如大腸桿菌(E. Coli))。在另一實施例中，宿主細胞係真核細胞(例如原生生物細胞、動物細胞、植物細胞或真菌細胞)。在一實施例中，宿主細胞係哺乳動物細胞(包含但不限於CHO、COS、NS0、SP2、PER.C6)或真菌細胞(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae ))或昆蟲細胞(例如Sf9)。在一實施例中，在單一重組宿主細胞中產生兩種或更多種(例如)具有不同特異性之結合蛋白。舉例而言，抗體混合物之表現已稱為Oligoclonics™ (Merus B. V., The Netherlands)美國專利第7,262,028號及第7,429,486號。 提供產生本文所揭示之結合蛋白之方法，其包括在足以產生結合蛋白之條件下於培養基中培養本文所揭示之宿主細胞中之任一者。在一實施例中，藉由此方法產生之結合蛋白之50%-75%係雙重特異性四價結合蛋白。在另一實施例中，藉由此方法產生之結合蛋白之75%-90%係雙重特異性四價結合蛋白。在另一實施例中，藉由所產生結合蛋白之90%-95%係雙重特異性四價結合蛋白。 一實施例提供用於釋放結合蛋白之組合物，其中組合物包括結晶之結合蛋白、成份及至少一種聚合載劑。在一實施例中，聚合載劑係聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(胺基酸)、聚(酐)、聚(酯肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)或PLGA、聚(b-羥基丁酸酯)、聚(己內酯)、聚(二氧雜環己酮)、聚(乙二醇)、聚((羥丙基)甲基丙烯醯胺、聚[(有機)磷腈]、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯啶酮)、馬來酸酐-烷基乙烯基醚共聚物、普羅尼克多元醇(pluronic polyol)、白蛋白、海藻酸鹽、纖維素、纖維素衍生物、膠原、纖維蛋白、明膠、透明質酸、寡糖、糖胺聚糖、硫酸化多糖或其摻合物及共聚物。在一實施例中，成份係白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明膠、羥丙基-β-環糊精、甲氧基聚乙二醇或聚乙二醇。 另一實施例提供治療哺乳動物之方法，其包括向哺乳動物投與有效量之本文所揭示之組合物之步驟。 提供包括本文所揭示之結合蛋白及醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物。在一些實施例中，醫藥組合物包括至少一種用於治療病症之其他治療劑。舉例而言，其他藥劑可為治療劑、化學治療劑、成像劑、細胞毒性劑、血管生成抑制劑、激酶抑制劑(包含但不限於KDR及TIE-2抑制劑)、共刺激分子調節劑(包含但不限於抗-B7.1、抗-B7.2、CTLA4-Ig、抗-CD20)、黏著分子阻斷劑(包含但不限於抗-LFA-1抗體、抗-E/L選擇素抗體、小分子抑制劑)、抗-細胞因子抗體或其功能片段(包含但不限於抗-IL-18、抗-TNF或抗-IL-6/細胞因子受體抗體)、抗-VEGF mAb、抗-DLL4 mAb、胺甲喋呤、環孢素(cyclosporin)、雷帕黴素(rapamycin)、FK506、可檢測標記或報告子、TNF拮抗劑、抗風濕劑、肌肉鬆弛劑、麻醉藥品(narcotic)、非類固醇抗發炎藥(NSAID)、鎮痛劑、麻醉劑(anesthetic)、鎮靜劑、局部麻醉劑、神經肌肉阻斷劑、抗微生物劑、抗牛皮癬劑、皮質類固醇、同化類固醇、紅血球生成素、免疫、免疫球蛋白、免疫阻抑劑、生長激素、激素代替藥物、放射性藥物、抗抑鬱劑、抗精神病劑、刺激劑、哮喘醫藥、β激動劑、吸入類固醇、腎上腺素或類似物、細胞因子或細胞因子拮抗劑。在一些實施例中，其他治療劑係化學治療劑。在一些實施例中，其他藥劑係以下中之一或多者：伊立替康、醛氫葉酸、5-FU、替莫唑胺、吉西他濱及紫杉醇。在一實施例中，藥劑係伊立替康。在一實施例中，藥劑係醛氫葉酸。在一實施例中，藥劑係5-FU。在一實施例中，藥劑係伊立替康、醛氫葉酸及5-FU。在一實施例中，藥劑係替莫唑胺。在一實施例中，藥劑係吉西他濱。在一實施例中，藥劑係紫杉醇。 在各種實施例中，提供診斷及/或治療患有可藉由靶向VEGF及/或DLL4進行診斷及/或治療之病症(例如任一血管生成病症或任一與VEGF及/或DLL4之異常表現有關之其他病症)之人類個體之方法，其包括向人類個體投與本文所揭示之結合蛋白，從而抑制人類個體中之一或多種靶之活性且緩解一或多種症狀或達成治療。本文所提供之結合蛋白可用於診斷及/或治療患有原發性及轉移性癌症之人類，該等癌症包含乳癌、直腸癌、肺癌、口咽癌、下咽癌、食道癌、胃癌、胰臟癌、肝癌、膽囊癌及膽管癌、小腸癌、泌尿道癌(包含腎癌、膀胱癌及尿道上皮癌)、女性生殖道癌(包含子宮頸癌、子宮癌及卵巢癌以及絨膜癌及妊娠滋養細胞疾病)、男性生殖道癌(包含前列腺癌、精囊癌、睪丸癌及生殖細胞腫瘤)、內分泌腺癌(包含甲狀腺癌、腎上腺癌及腦垂體腺癌)及皮膚癌以及血管瘤、黑素瘤、肉瘤(包含彼等源自骨及軟組織者以及卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma))、腦、神經、眼睛及腦膜之腫瘤(包含星形細胞瘤、神經膠質瘤、神經膠質母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、神經瘤、神經母細胞瘤、神經鞘瘤及腦膜瘤)、源自造血系統惡性腫瘤之腫瘤、急性白血病、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、B細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、慢性骨髓細胞白血病(CML)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、毛細胞白血病、何傑金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)及非何傑金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)、造血系統惡性腫瘤、卡波西氏肉瘤、惡性淋巴瘤、惡性組織細胞增多病、惡性黑素瘤、多發性骨髓瘤、副腫瘤症候群/惡性高鈣血症或實體腫瘤之腫瘤。 在一些實施例中，治療患者之癌症之方法包括投與本文所揭示之結合蛋白中之一或多者或其醫藥組合物。在一實施例中，癌症係結腸癌。在一實施例中，癌症係神經膠質母細胞瘤。在一實施例中，癌症係胰臟癌。在一實施例中，癌症係乳癌。在一些實施例中，治療癌症之方法(包括投與本文所揭示之結合蛋白中之一或多者或其醫藥組合物)會減小腫瘤生長或延遲腫瘤生長且至少約等於抗-VEGF抗體及抗-DLL4抗體之組合之預期加和效應。在一些實施例中，該等方法會減小腫瘤生長或延遲腫瘤生長且大於加和效應(例如減小效應大於自抗-VEGF抗體及抗-DLL4抗體之預測效應之加和所預計)。 在一些實施例中，治療癌症之方法包括投與本文所揭示之結合蛋白中之一或多者或其醫藥組合物與一或多種其他藥劑(例如化學治療劑或生物藥劑)的組合。在一些實施例中，藥劑係以下中之一或多者：瑞格菲尼(STIVAGRA™)、帕妥珠單抗(PERJECTA™)、伊立替康、醛氫葉酸、5-FU、替莫唑胺、吉西他濱及紫杉醇。在一實施例中，藥劑係伊立替康。在一實施例中，藥劑係醛氫葉酸。在一實施例中，藥劑係5-FU。在一實施例中，藥劑係伊立替康、醛氫葉酸及5-FU。在一實施例中，藥劑係替莫唑胺。在一實施例中，藥劑係吉西他濱。在一實施例中，藥劑係紫杉醇。在一些實施例中，治療癌症之方法(包括投與本文所揭示之結合蛋白中之一或多者或其醫藥組合物與一或多種其他藥劑之組合)會減小腫瘤生長或延遲腫瘤生長且至少等於結合蛋白及其他藥劑之組合之預期加和效應。在一些實施例中，該等方法會減小腫瘤生長或延遲腫瘤生長且大於加和效應(例如減小效應大於自結合蛋白及其他藥劑之預測效應之加和所預計)。 在一些實施例中，治療結腸癌之方法包括投與本文所揭示之結合蛋白中之一或多者或其醫藥組合物視情況與伊立替康、醛氫葉酸及5-FU中之一或多者的組合。在一些實施例中，治療神經膠質母細胞瘤之方法包括投與本文所揭示之結合蛋白中之一或多者或其醫藥組合物視情況與替莫唑胺的組合。在一些實施例中，治療胰臟癌之方法包括投與本文所揭示之結合蛋白中之一或多者或其醫藥組合物視情況與吉西他濱的組合。在一些實施例中，治療乳癌之方法包括投與本文所揭示之結合蛋白中之一或多者或其醫藥組合物視情況與紫杉醇的組合。 在各種實施例中，本文所提供之結合蛋白可與一或多種抗高血壓劑組合投與。一或多種抗高血壓劑可選自由以下組成之群：利尿劑、腎上腺素能受體拮抗劑、鈣通道阻斷劑、腎素抑制劑、ACE抑制劑、血管緊張素II受體拮抗劑、血管舒張劑及α-2激動劑。舉例而言，藥劑可為以下中之一或多者：可樂定、依那普利、硝苯地平、甲基多巴(methyldopa)、肼屈嗪(hydralazine)、哌唑嗪(prazosin)、利血平(reserpine)、莫索尼定(moxonidine)、胍法辛(guanfacine)、培哚普利(perindopril)/吲達帕胺(indapamide)、洛非西定(lofexidine)及甲酪胺酸(metirosine)。在一些實施例中，本文所提供之結合蛋白可與一或多種抗凝血劑組合投與。舉例而言，抗凝血劑可為以下中之一或多者：華法林(warfarin)、肝素、低分子量肝素、達肝素鈉(dalteparin sodium)、阿加曲班(argatroban)、比伐盧定(bivalirudin)、來匹盧定(lepirudin)及右旋糖。在一些實施例中，本文所提供之結合蛋白可與一或多種抗高血壓劑及一或多種抗凝血劑組合投與。 在各種實施例中，本文所提供之結合蛋白可用於診斷及/或治療患有黃斑變性(包含濕潤形式)、糖尿病性視網膜病變及/或任一特徵在於血管過度生長或水腫之其他疾病或病症之人類。 在一實施例中，使用結合蛋白或其抗原結合部分來治療癌症或預防或抑制本文所闡述腫瘤之轉移(單獨使用或與放射療法及/或化學治療劑組合使用)。 在一實施例中，可與本文所提供之結合蛋白組合之化學治療劑或生物藥劑包含下列藥劑：13-順式-視黃酸、2-CdA、2-氯去氧腺苷、5-阿紮胞苷、5-氟尿嘧啶、5-FU、6-巰基嘌呤、6-MP、6-TG、6-硫鳥嘌呤、阿布沙尼、Accutane®、放線菌素-D、Adriamycin®、Adrucil®、Afinitor®、Agrylin®、Ala-Cort®、阿地白介素、阿來組單抗(Alemtuzumab)、ALIMTA、阿利維A酸(Alitretinoin)、Alkaban-AQ®、Alkeran®、全反式視黃酸、α干擾素、六甲蜜胺、胺甲喋呤(Amethopterin)、胺磷汀、胺魯米特、阿那格雷(Anagrelide)、Anandron®、阿那曲唑、阿糖胞嘧啶(Arabinosylcytosine)、Ara-C Aranesp®、Aredia®、Arimidex®、Aromasin®、Arranon®、三氧化二砷、Arzerra™、天門冬醯胺酶、ATRA、Avastin®、阿紮胞苷、BCG、BCNU、苯達莫司汀(Bendamustine)、貝伐珠單抗(Bevacizumab)、貝沙羅汀(Bexarotene)、BEXXAR®、比卡魯胺、BiCNU、Blenoxane®、博來黴素、硼替佐米、白消安、Busulfex®、C225、醛氫葉酸鈣、Campath®、Camptosar®、喜樹鹼-11、卡培他濱、Carac™、卡鉑、卡莫司汀、卡莫司汀藥片(Carmustine wafer)、Casodex®、CC-5013、CCI-779、CCNU、CDDP、CeeNU、Cerubidine®、西妥昔單抗(Cetuximab)、苯丁酸氮芥、順鉑、嗜橙菌因子、克拉屈濱、可的松(Cortisone)、Cosmegen®、CPT-11、環磷醯胺、Cytadren®、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂質體、Cytosar-U®、Cytoxan®、達卡巴嗪、達克金(Dacogen)、更生黴素(Dactinomycin)、阿法達貝泊汀(Darbepoetin Alfa)、達沙替尼、道諾黴素(Daunomycin)、柔紅黴素、柔紅黴素鹽酸鹽、柔紅黴素脂質體、DaunoXome®、地卡特隆(Decadron)、地西他濱、Delta-Cortef®、Deltasone®、德尼白介素(Denileukin)、地飛托克(Diftitox)、DepoCyt™、地塞米松、乙酸地塞米松(Dexamethasone Acetate)、地塞米松磷酸鈉(Dexamethasone Sodium Phosphate)、地克薩松(Dexasone)、右雷佐生、DHAD、DIC、迪奧帶斯(Diodex)、多西他賽、Doxil®、多柔比星、多柔比星脂質體、Droxia™、DTIC、DTIC-Dome®、Duralone®、Efudex®、Eligard™、Ellence™、Eloxatin™、Elspar®、Emcyt®、表柔比星、阿法依伯汀(Epoetin Alfa)、艾比特思、厄洛替尼、歐文氏菌屬L-天門冬醯胺酶(Erwinia L-asparaginase)、雌莫司汀、胺磷汀(Ethyol)、Etopophos®、依託泊苷、磷酸依託泊苷、Eulexin®、依維莫司、Evista®、依西美坦、Fareston®、Faslodex®、Femara®、非格司亭、氟尿苷(Floxuridine)、Fludara®、氟達拉濱、Fluoroplex®、氟尿嘧啶、氟尿嘧啶(乳霜)、氟甲睪酮(Fluoxymesterone)、氟他胺、亞葉酸、FUDR®、氟維司群、吉非替尼、吉西他濱、吉妥單抗奧佐米星(Gemtuzumab ozogamicin)、健擇(Gemzar)、Gleevec™、Gliadel®藥片、GM-CSF、戈舍瑞林、粒細胞-群落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞群落刺激因子(G-MCSF)、Halotestin®、Herceptin®、海塞多(Hexadrol)、Hexalen®、六甲基蜜胺、HMM、Hycamtin®、Hydrea®、Hydrocort Acetate®、氫化可的松(Hydrocortisone)、氫化可的松磷酸鈉(Hydrocortisone Sodium Phosphate)、氫化可的松琥珀酸鈉(Hydrocortisone Sodium Succinate)、磷酸氫化可通(Hydrocortone Phosphate)、羥基脲、異貝莫單抗(Ibritumomab)、替伊莫單抗(Ibritumomab Tiuxetan)、Idamycin®、Idarubicin Ifex®、干擾素-α、干擾素-α-2b (PEG偶聯物)、異環磷醯胺、介白素-11 (IL-11)、介白素-2 (IL-2)、甲磺酸伊馬替尼、咪唑羧醯胺(Imidazole Carboxamide)、Intron A®、Iressa®、伊立替康、異維A酸(Isotretinoin)、伊沙匹隆、Ixempra™、KADCYCLA®、天門冬醯胺酶(Kidrolase)(t)、Lanacort®、拉帕替尼、L-天門冬醯胺酶、LCR、來那度胺(Lenalidomide)、來曲唑、醛氫葉酸、瘤可寧(Leukeran)、Leukine™、亮丙瑞林、醛基長春鹼(Leurocristine)、Leustatin™、脂質體Ara-C、Liquid Pred®、洛莫司汀、L-PAM、L-溶肉瘤素、Lupron®、Lupron Depot®、Matulane®、馬克戴斯(Maxidex)、氮芥(Mechlorethamine)、氮芥鹽酸鹽、Medralone®、Medrol®、Megace®、甲地孕酮、乙酸甲地孕酮、美法侖、巰基嘌呤、美司鈉、Mesnex™、胺甲喋呤（Methotrexate）、胺甲喋呤鈉、甲基潑尼松龍(Methylprednisolone)、Meticorten®、絲裂黴素、絲裂黴素-C、米托蒽醌、M-Prednisol®、MTC、MTX、Mustargen®、氮芥(Mustine)、Mutamycin®、Myleran®、Mylocel™、Mylotarg®、Navelbine®、耐拉濱、Neosar®、Neulasta™、Neumega®、Neupogen®、Nexavar®、Nilandron®、尼羅替尼、尼魯米特、Nipent®、氮芥(Nitrogen Mustard)、Novaldex®、Novantrone®、尼普拉特(Nplate)、奧曲肽(Octreotide)、乙酸奧曲肽(Octreotide acetate)、奧法木單抗(Ofatumumab)、Oncospar®、Oncovin®、Ontak®、Onxal™、奧普瑞白介素、Orapred®、Orasone®、奧沙利鉑、紫杉醇、紫杉醇蛋白結合物、帕米膦酸鹽(Pamidronate)、帕尼單抗(Panitumumab)、Panretin®、Paraplatin®、帕唑帕尼(Pazopanib)、Pediapred®、PEG干擾素、培加帕酶(Pegaspargase)、培非司亭(Pegfilgrastim)、PEG-INTRON™、PEG-L-天門冬醯胺酶、培美曲塞、噴司他丁、苯丙胺酸氮芥(Phenylalanine Mustard)、Platinol®、Platinol-AQ®、潑尼松龍、潑尼松、Prelone®、丙卡巴肼、PROCRIT®、Proleukin®、含有卡莫司汀植入物之普羅非泮20 (Prolifeprospan 20)、Purinethol®、雷洛昔芬(Raloxifene)、Revlimid®、Rheumatrex®、Rituxan®、利妥昔單抗(Rituximab)、Roferon-A®、羅米司亭(Romiplostim)、Rubex®、紅比黴素鹽酸鹽(Rubidomycin hydrochloride)、Sandostatin®、Sandostatin LAR®、沙格司亭、Solu-Cortef®、Solu-Medrol®、索拉非尼、SPRYCEL™、STI-571、鏈佐星、SU11248、舒尼替尼、Sutent®、他莫昔芬、Tarceva®、Targretin®、Tasigna®、Taxol®、Taxotere®、Temodar®、替莫唑胺、坦羅莫司、替尼泊苷、TESPA、沙利度胺、Thalomid®、TheraCys®、硫鳥嘌呤、Thioguanine Tabloid®、硫代磷醯胺(Thiophosphoamide)、Thioplex®、噻替派、TICE®、Toposar®、拓撲替康、托瑞米芬、Torisel®、托西莫單抗(Tositumomab)、曲司佐單抗(Trastuzumab)、Treanda®、維A酸、Trexall™、Trisenox®、TSPA、TYKERB®、VCR、Vectibix™、Velban®、Velcade®、VePesid®、Vesanoid®、Viadur™、Vidaza®、長春花鹼、硫酸長春花鹼、Vincasar Pfs®、長春新鹼、長春瑞濱、酒石酸長春瑞濱、VLB、VM-26、伏立諾他、福退癌(Votrient)、VP-16、Vumon®、Xeloda®、Zanosar®、Zevalin™、Zinecard®、Zoladex®、唑來膦酸(Zoledronic acid)、唑林紮(Zolinza)或Zometa®及/或此處並未具體列示之靶向類似路徑之任一其他藥劑。 在另一實施例中，治療患有病症之患者之方法包括以下步驟：單獨投與本文所揭示之結合蛋白中之一或多者，或在投與第二藥劑之前、同時或之後投與結合蛋白。在一特定實施例中，本文所揭示之醫藥組合物係藉由以下投與方式投與患者：經口、非經腸、皮下、肌內、靜脈內、關節內、枝氣管內、腹內、囊內、軟骨內、腔內、體腔內、小腦內、腦室內、結腸內、子宮頸內、胃內、肝內、心肌內、骨內、骨盆內、心包內、腹膜腔內、胸膜內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、脊柱內、滑膜內、胸內、子宮內、膀胱內、濃注(bolus)、陰道、直腸、經頰、舌下、鼻內或經皮。 在各種實施例中，提供測定一或多種抗原或其片段在測試試樣中之存在、量或濃度之方法，其中一或多種抗原或其片段係DLL4及/或VEGF。該方法包括藉由免疫分析來分析測試試樣之抗原或其片段。免疫分析(i)採用至少一種結合蛋白及至少一種可檢測標記，且(ii)包括比較在測試試樣中藉由可檢測標記生成之信號(作為抗原或其片段之存在、量或濃度之直接或間接指示)與在對照或校準品中生成之信號(作為抗原或其片段之存在、量或濃度之直接或間接指示)。校準品視情況係校準品系列之一部分，其中每一校準品與系列中之其他校準品具有不同之抗原或其片段之濃度。該方法可包括(i)使測試試樣與至少一種捕獲劑(其結合至抗原或其片段上之表位)接觸以形成包括捕獲劑及抗原或其片段之複合物，(ii)使包括捕獲劑及抗原或其片段之複合物與至少一種檢測劑(其包括可檢測標記且結合至抗原或其片段上未由捕獲劑結合之表位)接觸以形成檢測複合物，及(iii)基於藉由在(ii)中形成之檢測複合物中之可檢測標記生成之信號，測定抗原或其片段在測試試樣中之存在、量或濃度，其中至少一種捕獲劑及/或至少一種檢測劑係至少一種結合蛋白。 另一選擇為，在一些實施例中，測定一或多種抗原或其片段在測試試樣中之存在、量或濃度之方法可包括：(i)使測試試樣與至少一種捕獲劑(其結合至抗原或其片段上之表位)接觸以形成包括捕獲劑及抗原或其片段之複合物，且同時或依序以任一順序使測試試樣與可檢測標記之抗原或其片段(其可與測試試樣中之任一抗原或其片段競爭結合至至少一種捕獲劑)接觸，其中存在於測試試樣中之任一抗原或其片段及可檢測標記之抗原彼此競爭形成檢測複合物，及(ii)基於藉由在(i)中形成之檢測複合物中之可檢測標記生成之信號，測定抗原或其片段在測試試樣中之存在、量或濃度，其中至少一種捕獲劑係至少一種結合蛋白且其中藉由捕獲檢測複合物中之可檢測標記生成之信號與抗原或其片段在測試試樣中之量或濃度成反比。 在各種實施例中，測試試樣可來自患者，在該情形下，該方法可進一步包括診斷、預測或評估患者之治療性/預防性治療之效能。若該方法進一步包括評估患者之治療性/預防性治療之效能，則該方法視情況進一步包括視需要修改患者之治療性/預防性治療以改良效能。該方法可適用於自動化系統或半自動化系統。因此，本文所闡述之方法亦可用於確定個體是否患有給定疾病、病症或病狀或處於發生給定疾病、病症或病狀之風險下。具體而言，此一方法可包括以下步驟： (a)測定一或多種分析物或其片段在來自個體之測試試樣中之濃度或量(例如使用本文所闡述之方法或業內已知之方法)；及 (b)比較如在步驟(a)中測定之分析物或其片段之濃度或量與預定值，其中若步驟(a)中所測定分析物之濃度或量關於預定值有利，則可確定個體並不患有給定疾病、病症或病狀或處於給定疾病、病症或病狀之風險下。然而，若步驟(a)中所測定分析物之濃度或量關於預定值不利，則可確定個體患有給定疾病、病症或病狀或處於給定疾病、病症或病狀之風險下。 另外，本文提供監測個體中之疾病之進展之方法。在一些實施例中，該等方法包括以下步驟： (a)測定一或多種分析物在來自個體之測試試樣中之濃度或量； (b)測定分析物在來自同一個體之後一測試試樣中之濃度或量；及 (c)比較步驟(b)中所測定分析物之濃度或量與步驟(a)中所測定分析物之濃度或量，其中若在步驟(b)中測定之濃度或量與在步驟(a)中測定之濃度或量相比不變或不利，則可確定個體之疾病繼續發生、進展或惡化。藉由比較，若在步驟(b)中測定之濃度或量與在步驟(a)中測定之濃度或量相比有利，則可確定個體之疾病已停止、消退或改良。 視情況，監測疾病之進展之方法進一步包括比較如在步驟(b)中測定之分析物的濃度或量與(例如)預定值。另外，視情況，若比較展示如在步驟(b)中測定之分析物之濃度或量(例如)關於預定值不利地改變，則該等方法包括使用一或多種醫藥組合物治療個體一定時間段。 亦提供用於分析測試試樣中一或多種抗原或其片段之存在或濃度之套組，其中一或多種抗原係DLL4及/或VEGF。該套組包括至少一種如本文所闡述之結合蛋白(用於分析測試試樣之抗原或其片段)及關於分析測試試樣之抗原或其片段之說明書。在一實施例中，至少一種結合蛋白視情況經可檢測標記。
本申請案根據35 U.S.C. § 119之規定主張2012年11月1日提出申請之美國臨時申請案第61/721,072號及2013年3月15日提出申請之美國臨時申請案第61/787,927號之優先權權益，此二者之全部內容皆以引用方式併入本文中。 提供能夠結合兩種不同蛋白質上之表位之多價及/或多特異性結合蛋白。亦提供雙重可變區域結合蛋白(亦稱為DVD、DVD結合蛋白或雙重可變區域免疫球蛋白(DVD-IgTM ))及其醫藥組合物以及用於製備該等DVD結合蛋白之核酸、重組表現載體及宿主細胞。亦提供使用DVD結合蛋白在活體外或活體內檢測特異性抗原之方法。 除非在本文中另有定義，否則本文所用之科學及技術術語具有彼等熟習此項技術者通常所理解之含義。在任一潛在模糊之情形下，本文所提供之定義優先於任一詞典或非固有定義。除非上下文另外需要，否則單數術語將包含複數形式且複數術語將包含單數。除非另有所述，否則「或(or)」之使用意指「及/或(and/or)」。使用術語「包含(including)」以及其他形式(例如「包含(includes)」及「包含(included)」)不具有限制意義。本文所闡述之任一範圍應理解為包含端點及端點之間之所有值。 本文所用各部分標題僅出於組織目的，而不能揭示為限制所闡述標的物。本申請案中所提及之所有文件或文件部分(包含但不限於專利、專利申請案、文章、書籍及論文)之全部內容出於任何目的明確地以引用方式併入本文中。若以引用方式併入之文件與說明書中所含之揭示內容相衝突，則說明書將替代任一衝突材料。 通常，結合本文所闡述細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白質及核酸化學及雜交使用之命名法係彼等在業內熟知且常用者。除非另外指明，否則本文所提供之方法及技術通常係根據業內熟知之習用方法且如貫穿本說明書引用並論述之各種一般且更具體的參考文獻中所闡述來實施。除非另外指明，否則酶反應及純化技術係根據製造商說明書來實施，或以業內習用方法來實施，或如本文所闡述來實施。除非另外指明，否則結合本文所闡述分析化學、合成有機化學及醫學與醫藥化學使用之命名法及實驗室程序及技術係彼等在業內熟知且常用者。化學合成、化學分析、藥物製備、調配及遞送及患者治療使用標準技術。 因此，揭示內容可更易於理解，所選術語定義於下文中。 術語「抗體」係指免疫球蛋白(Ig)分子，其通常包括四條多肽鏈、兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈或功能片段、突變體、變體或其衍生物，其保留Ig分子之表位結合特徵。業內已知該等片段、突變體、變體或衍生物抗體形式。在全長抗體之一實施例中，每一重鏈包括重鏈可變區(VH)及重鏈恆定區(CH)。CH包括三個區域CH1、CH2及CH3。每一輕鏈包括輕鏈可變區(VL)及輕鏈恆定區(CL)。CL包括單一CL區域。VH及VL可進一步再分成間雜排列之高度可變區(稱為互補決定區(CDR))及較為保守之區(稱為框架區(FR))。通常，每一VH及VL由三個CDR及四個FR構成，其自胺基末端至羧基末端按下列順序配置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。免疫球蛋白分子可為任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG 3、IgG4、IgA1及IgA2)或亞類。 術語「雙特異性抗體」係指在其兩個結合臂中之一者(一對HC/LC)上結合一種抗原(或表位)且在其第二結合臂(不同對HC/LC)上結合不同抗原(或表位)之抗體。雙特異性抗體具有兩個不同抗原結合臂(兩種特異性及CDR序列)，且對於其所結合之每一抗原而言係單價。雙特異性抗體包含彼等藉由以下方式生成者：細胞雜交瘤技術(Milstein及Cuello (1983) Nature 305(5934): 537-40)、兩種不同單株抗體之化學偶聯(Staerz等人(1985) Nature 314(6012): 628-31)或在Fc區中引入突變之隆凸至孔洞(knob-into-hole)或類似方式(Holliger等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(14): 6444-6448)。 「親和力成熟」抗體係在其一或多個CDR中存在一或多個變化之抗體，所闡述變化會使抗體對抗原之親和力相對於不具有彼等變化之親代抗體有所改良。實例性親和力成熟抗體可對靶抗原具有毫微莫耳級或甚至皮莫耳級親和力。藉由業內已知之程序產生親和力成熟抗體。Marks等人(1992) BioTechnology 10:779-783闡述藉由VH及VL區域置換來實施親和力成熟。CDR及/或框架殘基之隨機突變誘發闡述於以下文獻中：Barbas等人(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3809-3813；Schier等人(1995) Gene 169:147-155；Yelton等人(1995) J. Immunol. 155:1994-2004；Jackson等人(1995) J. Immunol. 154(7):3310-9；Hawkins等人(1992) J. Mol. Biol. 226:889-896，且具有活性增強胺基酸殘基之選擇性突變誘發位置、接觸或超突變位置處之突變闡述於美國專利第6,914,128號中。 術語「CDR移植抗體」係指如下包括重鏈及輕鏈可變區序列之抗體：其中VH及/或VL之一或多個CDR區之序列經另一抗體之CDR序列代替。舉例而言，兩種抗體可來自不同物種，例如具有鼠類重鏈及輕鏈可變區之一或多個鼠類CDR經人類CDR序列代替之抗體。 術語「人類化抗體」係指來自非人類物種之經改變以更為「類人類」 (亦即更類似於人類種系序列)之抗體。一類人類化抗體係CDR移植抗體，其中將非人類CDR序列引入人類VH及VL序列中以代替相應人類CDR序列。「人類化抗體」亦係如下抗體或其變體、衍生物、類似物或片段：其包括與人類抗體FR序列之胺基酸序列具有實質一致性(例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性)之框架區(FR)序列及至少一個與非人類CDR之胺基酸序列具有實質一致性(例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性)之CDR。人類化抗體可包括實質上所有至少一個且通常兩個可變區域(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)，其中所有或實質上所有CDR區之序列皆對應於非人類免疫球蛋白(亦即供體抗體)之彼等序列，且所有或實質上所有FR區之序列皆為人類免疫球蛋白之彼等序列。人類化抗體亦可包含來自人類抗體之重鏈之CH1、鉸鏈、CH2、CH3及CH4區。在一實施例中，人類化抗體亦包括人類免疫球蛋白Fc區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體僅含有人類化輕鏈。在一些實施例中，人類化抗體僅含有人類化重鏈。在一些實施例中，人類化抗體僅含有輕鏈之人類化可變區域及/或人類化重鏈之人類化可變區域。在一些實施例中，人類化抗體含有輕鏈以及重鏈之至少可變區域。在一些實施例中，人類化抗體含有重鏈以及輕鏈之至少可變區域。 術語「雙重可變區域結合蛋白」及「雙重可變區域免疫球蛋白」係指其兩個結合臂中之每一者(例如一對HC/LC)中具有兩個各自能夠結合至抗原之可變區域之結合蛋白(參見PCT公開案第WO 02/02773號)。在一實施例中，每一可變區域結合不同抗原或表位。在另一實施例中，每一可變區域結合相同抗原或表位。在另一實施例中，雙重可變區域結合蛋白具有兩個相同抗原結合臂(具有相同特異性及相同CDR序列)，且對於其所結合之每一抗原而言係二價。在一實施例中，DVD結合蛋白可具有單特異性(亦即能夠結合一種抗原)或多特異性(亦即能夠結合兩種或更多種抗原)。包括兩種重鏈DVD多肽及兩種輕鏈DVD多肽之DVD結合蛋白稱為DVD-IgTM 。在一實施例中，4種鏈DVD結合蛋白中之每一半包括重鏈DVD多肽及輕鏈DVD多肽及兩個抗原結合位點。在一實施例中，每一結合位點包括重鏈可變區域及輕鏈可變區域，其中每個抗原結合位點總共有6個CDR參與抗原結合。 術語「抗獨特型抗體」係指產生用於抵抗另一抗體之抗原結合位點之胺基酸序列之抗體。可投與抗獨特型抗體以增強抵抗抗原之免疫反應。 術語「生物活性」係指分子之任一或多種生物性質(不論天然存在(如在活體內所發現)或藉由重組方式提供或獲得)。生物性質包含但不限於結合受體、誘導細胞增殖、抑制細胞生長、誘導其他細胞因子、誘導細胞凋亡及酶活性。 術語「中和」係指在結合蛋白特異性結合至抗原時抵抗抗原之生物活性。在一實施例中，中和性結合蛋白結合至抗原(例如細胞因子)且將其生物活性減小至少約20%、40%、60%、80%、85%或更大。 「特異性」係指結合蛋白選擇性結合抗原之能力。 「親和力」係結合蛋白與抗原之間之相互作用之強度，且藉由結合蛋白之CDR之序列以及藉由抗原性質(例如其大小、形狀及/或電荷)來測定。可選擇結合蛋白以獲得提供期望治療端點同時最小化負面副效應之親和力。可使用熟習此項技術者已知之方法來量測親和力(US 20090311253)。 術語「效力」係指結合蛋白達成期望效應之能力，且可量度其治療效能。可使用熟習此項技術者已知之方法來評估效力(US 20090311253)。 術語「交叉反應性」係指結合蛋白結合針對其所產生靶外之靶之能力。通常，結合蛋白以適當高親和力結合其靶組織/抗原，但對非靶正常組織/抗原顯示適當低親和力。通常選擇個別結合蛋白以符合兩種準則：(1)抗體結合(如使用業內已知之染色方法所觀察)至適用於抗體靶之已知表現之組織，及(2)在來自相同器官之人類及毒性物種(例如小鼠及獼猴)組織之間具有類似染色模式。熟習此項技術者已知評估交叉反應性之該等及其他方法(US 20090311253)。 術語「生物功能」係指結合蛋白之特定活體外或活體內作用。結合蛋白可靶向若干種類抗原且經由多種作用機制達成期望治療結果。結合蛋白可靶向可溶性蛋白、細胞表面抗原及/或細胞外蛋白質沈積物。結合蛋白可激動、拮抗或中和其靶之活性。結合蛋白可有助於清除其結合之靶，或可在結合至細胞時得到細胞毒性。可將兩種或更多種抗體部分納入中多價形式中以在單一結合蛋白分子中達成一種以上不同功能。熟習此項技術者已知用於評估生物功能之活體外分析及活體內模型(US 20090311253)。 「穩定」結合蛋白係在儲存時結合蛋白基本上保留其物理穩定性、化學穩定性及/或生物活性者。在活體外於各種溫度下穩定延長時間段之多價結合蛋白較為期望。熟習此項技術者已知穩定結合蛋白及在各種溫度下評估其穩定性之方法(US 20090311253)。 術語「溶解性」係指蛋白質保持分散於水溶液內之能力。蛋白質在水性調配物中之溶解性取決於疏水性及親水性胺基酸殘基之合理分佈，且由此溶解性可與正確摺疊蛋白之產量相關。熟習此項技術者能夠使用常規HPLC技術及熟習此項技術者已知之方法來檢測結合蛋白之溶解性之增加或降低(US 20090311253)。 結合蛋白可使用各種宿主細胞產生或可在活體外產生，且每次工作之相對產率決定了「產生效率」。影響產生效率之因素包含但不限於宿主細胞類型(原核或真核)、表現載體之選擇、核苷酸序列之選擇及所採用方法。熟習此項技術者已知用於產生結合蛋白之材料及方法以及產生效率之量測(US 20090311253)。 術語「免疫原性」意指物質誘導免疫反應之能力。投與治療性結合蛋白可使得在一定程度上發生免疫反應。可在選擇親代抗體期間分析在多價形式中可誘導免疫原性之潛在要素，且可在將其序列納入多價結合蛋白形式中之前採用減小該風險之步驟以優化親代抗體。熟習此項技術者已知減小抗體及結合蛋白之免疫原性之方法(US 20090311253)。 術語「標記」及「可檢測標記」意指附接至特異性結合對之成員(例如抗體或其分析物)以致使在特異性結合對之成員與可檢測標記之間發生反應(例如結合)的部分。特異性結合對之經標記成員稱為「可檢測標記。」因此，術語「經標記結合蛋白」係指納入鑑別結合蛋白之標記之蛋白質。在一實施例中，標記係可產生可藉由目測或儀器方式檢測之信號之可檢測標記物，例如納入經放射標記之胺基酸或附接至具有可藉由經標記抗生物素蛋白檢測之生物素基部分的多肽(例如含有螢光標記物或具有可藉由光學或比色方法檢測之酶活性的鏈黴抗生物素蛋白)。用於多肽之標記之實例包含但不限於下列物質：放射性同位素或放射性核素(例如3 H、14 C、35 S、90 Y、99 Tc、111 In、125 I、131 I、177 Lu、166 Ho或153 Sm)；色原體、螢光標記(例如FITC、羅丹明(rhodamine)、鑭系元素磷光體)、酶標記(例如辣根過氧化物酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)；化學發光標記物；生物素基團；由二級報告子識別之預定多肽表位(例如亮胺酸拉鏈對序列、二級抗體之結合位點、金屬結合區域、表位標籤)；及磁性劑，例如釓螯合物。通常用於免疫分析之標記之代表性實例包含產生光之部分(例如吖啶鎓化合物)及產生螢光之部分(例如螢光素)。就此而言，部分本身不能可檢測標記但可在與另一部分反應後變為可檢測。 術語「偶聯物」係指化學連接至第二化學部分(例如治療劑或細胞毒性劑)之結合蛋白(例如抗體或DVD-Ig)。術語「試劑」包含自生物材料製得之化學化合物、化學化合物之混合物、生物大分子或萃取物。治療劑或細胞毒性劑之實例包含但不限於紫杉醇(taxol)、細胞鬆弛素B (cytochalasin B)、短桿菌肽D (gramicidin D)、依米丁(emetine)、絲裂黴素、依託泊苷、替尼泊苷、長春新鹼、長春花鹼、多柔比星、柔紅黴素、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光輝黴素(mithramycin)、放線菌素D、1-去氫睾甾酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮質激素、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)及嘌呤黴素(puromycin)及其類似物或同系物。在用於免疫分析背景中時，偶聯物可為用作檢測劑之可檢測標記抗體或DVD-Ig。 術語「晶體」及「結晶」係指以晶體形式存在之結合蛋白(例如抗體)或其抗原結合部分。晶體係物質之一種固態形式，其不同於其他形式(例如非晶型固態或液體結晶態)。晶體係由原子、離子、分子(例如諸如抗體等蛋白質)或分子總成(例如抗原/抗體複合物)之規則重複三維陣列構成。該等三維陣列係根據該領域所充分理解之特定數學關係來配置。晶體中重複之基本單元或結構單元稱為不對稱單元。配置中不對稱單元依從明確定義之給定晶體對稱性之重複產生晶體之「晶胞」。晶胞藉由規則性平移來重複會提供晶體。參見Giege, R.及Ducruix, A. Barrett, CRYSTALLIZATION OF NUCLEIC ACIDS AND PROTEINS, A PRACTICAL APPROACH，2nd ea.，第20 1-16頁，Oxford University Press, New York, New York, (1999)。 術語「載體」係指能夠轉運與其連接之另一核酸之核酸分子。一類載體為「質粒」，其係指其他DNA區段可連接至其中之環形雙鏈DNA環。另一類載體為病毒載體，其中其他DNA區段可連接至病毒基因組中。其他載體包含RNA載體。某些載體能夠在已將其引入其中之宿主細胞中進行自主複製(例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞中時整合至該宿主細胞之基因組中，且由此隨宿主基因組一同複製。某些載體能夠引導與其可操作連接之基因之表現。本文將該等載體稱為「重組表現載體」(或簡稱為「表現載體」)。一般而言，在重組DNA技術中可用之表現載體經常呈質粒形式。在本說明書中，「質粒」與「載體」可互換使用，此乃因質粒係載體之最常用形式。然而，亦包含用於等效功能之表現載體之其他形成，例如病毒載體(例如複製缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。pHybE載體群(美國專利申請案第61/021,282號)可用於親代抗體及DVD結合蛋白選殖。V1 (衍生自pJP183；pHybE-hCg1,z,non-a V2)可用於選殖具有野生型恆定區之抗體及DVD重鏈。V2 (衍生自pJP191；pHybE-hCk V3)可用於選殖具有κ恆定區之抗體及DVD輕鏈。V3 (衍生自pJP192；pHybE-hCl V2)可用於選殖具有λ恆定區之抗體及DVD輕鏈。V4 (使用λ信號肽及κ恆定區構造)可用於選殖具有λ-κ混合V區域之DVD輕鏈。V5 (使用具有κ信號肽及λ恆定區構造)可用於選殖具有κ-λ混合V區域之DVD輕鏈。V7 (衍生自pJP183；pHybE-hCg1,z,non-a V2)可用於選殖具有(234,235 AA)突變體恆定區之抗體及DVD重鏈。 術語「重組宿主細胞」或「宿主細胞」係指向其中引入外源性DNA之細胞。該術語不僅係指特定個體細胞，且係指此一細胞之子代。因突變或環境影響可使後續各代發生某些改變，故該子代實際上可能與母細胞不同但卻仍包含於本文所用術語「宿主細胞」之範圍內。在一實施例中，宿主細胞包含原核細胞及真核細胞。在一實施例中，真核細胞包含原生生物、真菌、植物及動物細胞。在另一實施例中，宿主細胞包含但不限於原核細胞系大腸桿菌；哺乳動物細胞系CHO、HEK 293、COS、NS0、SP2及PER.C6；昆蟲細胞系Sf9；及真菌細胞釀酒酵母。 術語「轉染」涵蓋通常用於將外源性核酸(例如DNA)引入宿主細胞中之各種技術，例如電穿孔、磷酸鈣沈澱、DEAE-右旋糖酐轉染及諸如此類。 術語「細胞因子」係指藉由一種細胞群體釋放之作為細胞間介體作用於另一細胞群體上之蛋白質。術語「細胞因子」包含來自天然來源或來自重組細胞培養物之蛋白質及天然序列細胞因子之生物活性等效部分。 術語「生物試樣」意指一定量來自生物或原生物之物質。該等物質包含但不限於血液(例如全血)、血漿、血清、尿、羊水、滑液、內皮細胞、白血球、單核球、其他細胞、器官、組織、骨髓、淋巴結及脾臟。 術語「組份」係指組合物之要素。就診斷套組而言，舉例而言，組份可為捕獲抗體、檢測或偶聯物抗體、對照、校準品、校準品系列、敏度套組、容器、緩衝劑、稀釋劑、鹽、酶、酶輔因子、檢測試劑、預處理試劑/溶液、基質(例如呈溶液形式)、終止溶液及可包含於套組中用於分析測試試樣之類似物。因此，在一些實施例中，「組份」可包含如上文中固定至固體載體(例如藉由結合至抗分析物(例如抗多肽)抗體)之多肽或其他分析物。在一些實施例中，一或多種組份可呈溶液或凍乾形式。 「對照」係指並不包括分析物(「陰性對照」)或包括分析物(「陽性對照」)之組合物。陽性對照可包括已知濃度之分析物。「對照」、「陽性對照」及「校準品」可在本文中互換使用以係指包括已知濃度之分析物之組合物。「陽性對照」可用於確立分析性能特性且可用於指示試劑(例如分析物)之完整性。 「預定截止值」及「預定值」通常係指用於藉由比較分析結果與預定截止值/預定值來評估診斷/預後/治療效能結果之分析截止值，其中預定截止值/預定值與各種臨床參數(例如疾病嚴重程度、進展/不傳/改良等)相關聯或有關。儘管本揭示內容可提供實例性預定值，但眾所周知，截止值可端視免疫分析之性質(例如所採用抗體等)而有所變化。另外，熟習此項技術者易於將本文之揭示內容適用於其他免疫分析以基於本揭示內容來獲得彼等其他免疫分析之免疫分析特異性截止值。儘管預定截止值/預定值之精確值可在分析之間有所變化，但如本文所闡述之關聯(若存在)通常可適用。 本文所闡述診斷分析中所用之「預處理試劑」 (例如裂解、沈澱及/或溶解試劑)係裂解存在於測試試樣中之任一細胞及/或溶解任一分析物者。如本文進一步所闡述，所有試樣皆無需預處理。溶解分析物(例如所關注多肽)可能尤其必需自存在於試樣中之內源性結合蛋白釋放分析物。預處理試劑可為均質性(無需分離步驟)或異質性(需要分離步驟)。在一些實施例中，在使用異質預處理試劑時，在進行分析之下一步驟之前，自測試試樣去除沈澱之分析物結合蛋白。 在本文所述之免疫分析及套組中，「品質對照試劑」包含(但不限於)校準品、對照及敏度套組(panels)。通常使用一或多種「校準品」或「標準」以確立校準(標準)曲線，用於內插靶分子(例如抗體或分析物)之濃度。在一些實施例中，可使用接近預定陽性/陰性截止值之單一校準品。或者，在其他實施例中，可使用多種校準品(亦即一種以上校準品或不同量之校準品)來確立「敏度套組」或「敏度梯度」。 術語「特異性結合配偶體」係指特異性結合對之成員。特異性結合對包括兩種經由化學或物理方式彼此特異性結合之不同分子。在各種實施例中，除抗原及抗體特異性結合外，其他特異性結合對可包含生物素及抗生物素蛋白(或鏈黴抗生物素蛋白)、碳水化合物及凝集素、互補核苷酸序列、效應子及受體分子、輔因子及酶、酶抑制劑及酶及諸如此類。另外，在一些實施例中，特異性結合對可包含原始特異性結合成員之類似物之成員，例如分析物類似物。免疫反應性特異性結合成員包含抗原、抗原片段及抗體，包含單株及多株抗體以及其複合物、片段及變體(包含變體片段)，不論經分離或重組產生。 術語「Fc區」定義免疫球蛋白重鏈之C端區，其可藉由完整抗體經木瓜蛋白酶消化生成。Fc區可為天然序列Fc區或變體Fc區。免疫球蛋白之Fc區通常包括兩個恆定區域、CH2區域及CH3區域，且視情況包括CH4區域。替代Fc部分中之胺基酸殘基以改變抗體效應子功能為業內已知(例如美國專利第5,648,260號及第5,624,821號)。Fc區調介若干重要效應子功能，例如細胞因子誘導、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、吞噬作用、補體依賴性細胞毒性(CDC)，及抗體及抗原-抗體複合物之半衰期/清除率。在一些情形下，該等效應子功能為治療性免疫球蛋白所期望，但在其他情形下可能不需要或甚至有害，視治療目標而定。 術語結合蛋白之「抗原結合部分」意指結合蛋白(例如抗體)中保留特異性結合至抗原之能力之一或多個片段。結合蛋白之抗原結合功能可藉由全長抗體以及雙特異性、雙重特異性或多特異性形式之片段來實施。術語結合蛋白之「抗原結合部分」內所涵蓋結合片段之實例包含(i) Fab片段，亦即由VL、VH、CL及CH1區域組成之單價片段；(ii) F(ab')2 片段，亦即包括兩個由鉸鏈區之二硫橋連接之Fab片段的二價片段；(iii)由VH及CH1區域組成之Fd片段；(iv)由抗體單臂之VL及VH區域組成之Fv片段；(v) dAb片段，其包括單一可變區域；及(vi)經分離互補決定區(CDR)。另外，儘管Fv片段之兩個區域VL及VH係藉由單獨基因編碼，但其可使用重組方法藉由合成連接體接合，該合成連接體使其能夠作為VL及VH區配對形成單價分子之蛋白質單鏈(稱為單鏈Fv (scFv))製備。該等單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」內。亦涵蓋單鏈抗體之其他形式，例如雙抗體。此外，單鏈抗體亦包含「線性抗體」，該線性抗體包括與互補輕鏈多肽一起形成抗原結合區對之串聯Fv區段對(VH-CH1-VH-CH1)。 術語「多價結合蛋白」意指包括兩個或更多個抗原結合位點之結合蛋白。在一實施例中，多價結合蛋白經改造具有三個或更多個抗原結合位點，且並非天然存在之抗體。術語「多特異性結合蛋白」係指能夠結合兩種或更多種相關或不相關靶之結合蛋白。在一實施例中，本文所提供之DVD結合蛋白包括兩個或更多個抗原結合位點且係四價或多價結合蛋白。 術語「連接體」意指包括兩種或更多種藉由用於連接兩種多肽(例如兩種VH或兩種VL區域)之肽鍵接合之胺基酸殘基之胺基酸殘基或多肽。該等連接體多肽之實例已為業內熟知(例如參見Holliger等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak等人(1994) Structure 2:1121-1123)。 術語「Kabat編號」、「Kabat定義」及「Kabat標記」在本文中可互換使用。業內識別之該等術語係指編號比抗體或其抗原結合部分之重鏈及輕鏈可變區中之其他胺基酸殘基可變性更大(亦即超變)之胺基酸殘基的系統(Kabat等人(1971) Ann.NY Acad. Sci. 190:382-391及Kabat等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S. Department of Health and Human Services，NIH公開案第91-3242號)。對於重鏈可變區而言，超變區範圍為31至35位胺基酸(CDR1)、50至65位胺基酸(CDR2)及95至102位胺基酸(CDR3)。就輕鏈可變區而言，超變區範圍為24至34位胺基酸(CDR1)、50至56位胺基酸(CDR2)及89至97位胺基酸(CDR3)。 術語「CDR」意指免疫球蛋白可變區序列內之互補決定區。對於重鏈及輕鏈可變區中之每一者而言，在重鏈及輕鏈可變區中之每一者中存在三個CDR，其稱為CDR1、CDR2及CDR3。術語「CDR組」係指存在於能夠結合抗原之單一可變區中之三個CDR之群。已根據不同系統以不同方式界定該等CDR之準確邊界。由Kabat (Kabat等人(1987)及(1991))闡述之系統不僅提供適用於抗體之任一可變區之明確殘基編號系統，且亦提供界定三個CDR之精確殘基邊界。該等CDR可稱為Kabat CDR。Chothia及合作者(Chothia及Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917)；Chothia等人(1989) Nature 342:877-883)發現，Kabat CDR內之某些子部分儘管在胺基酸序列層面上具有較大差異但仍採用幾乎相同肽骨架構形。該等子部分稱為L1、L2及L3或H1、H2及H3，其中「L」及「H」分別指定輕鏈及重鏈區。該等區可稱為Chothia CDR，其具有與Kabat CDR重疊之邊界。其他界定與Kabat CDR重疊之CDR之邊界已由Padlan (1995) FASEB J. 9:133-139及MacCallum (1996) J. Mol. Biol. 262(5):732-45闡述。其他CDR邊界定義並不嚴格遵循本文系統中之一者，但與Kabat CDR重疊，然而，其可根據特定殘基或殘基群或甚至整個CDR並不顯著影響抗原結合之預測或實驗發現而進行縮短或延長。本文所用方法可利用根據該等系統中之任一者界定之CDR，但某些實施例使用Kabat或Chothia界定之CDR。 術語「表位」意指由結合蛋白結合之抗原區，例如能夠特異性結合至免疫球蛋白或T細胞受體之區。在某些實施例中，表位決定簇包含分子之化學活性表面基團(例如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基)，且在某些實施例中可具有特定三維結構特性及/或特定電荷特性。在一實施例中，表位包括已知結合至特異性結合配偶體上之互補位點之抗原區之胺基酸殘基(或其片段)。抗原片段可含有一種以上表位。在某些實施例中，在結合蛋白識別蛋白質及/或大分子之複合混合物中之其靶抗原時，結合蛋白特異性結合抗原。若抗體交叉競爭(例如一種抗體防止另一抗體結合至結合蛋白，或抑制對於另一抗體結合至結合蛋白之調變效應)，則結合蛋白「結合至相同表位」。熟習此項技術者已知觀察及建模表位識別之方法(US 20090311253)。 「藥物動力學」係指藥物由有機體吸收、分佈、代謝及分泌之過程。在一些實施例中，為生成具有期望藥物動力學特徵之多價結合蛋白分子，選擇具有類似期望藥物動力學特徵之親代單株抗體。可(例如)使用齧齒類動物以熟習此項技術者已知之方法來容易地測定所選親代單株抗體之PK特徵(US 20090311253)。 「生物可用性」係指在投與後到達靶之活性藥物量。生物可用性隨若干先前所闡述性質(包含穩定性、溶解性、免疫原性及藥物動力學)而變化，且可使用熟習此項技術者已知之方法進行評估(US 20090311253)。 術語「表面電漿共振」意指使得可藉由使用(例如)BIAcore系統(BIAcore International AB, GE Healthcare公司，Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)檢測生物感測器基質內之蛋白質濃度變化來分析即時生物特異性相互作用之光學現象。關於其他說明，參見Jönsson等人(1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26。術語「K結合 」意指結合蛋白(例如抗體或DVD)締合至抗原以形成結合複合物(例如DVD/抗原複合物)之結合速率常數。術語「K結合 」亦意指「締合速率常數」或「ka」，如在本文中所互換使用。此值指示結合蛋白至其靶抗原之結合速率或結合蛋白(例如抗體)與抗原之間之複合物形成速率。此亦藉由以下方程式來展示： 抗體(「Ab」) +抗原(「Ag」) → Ab-Ag 術語「K解離 」意指結合蛋白(例如抗體或DVD)自結合複合物(例如DVD/抗原複合物)之針對解離之解離速率常數或「解離速率常數」，如業內所習知。此值指示結合蛋白(例如抗體)自其靶抗原之解離速率或Ab-Ag複合物隨時間分離成游離抗體及抗原的速率，如藉由以下方程式所展示： Ab + Ag ←Ab-Ag 術語「KD 」係指「平衡解離常數」且意指於平衡下在滴定量測中獲得之值，或藉由解離速率常數(K解離 )除以締合速率常數(K結合 )獲得的值。使用締合速率常數、解離速率常數及平衡解離常數表示結合蛋白(例如抗體或DVD)與抗原之結合親和力。測定締合及解離速率常數之方法已為業內熟知。使用基於螢光之技術可提供高靈敏度且能夠在平衡下檢驗生理緩衝液中之試樣。可使用其他實驗方式及儀器(例如BIAcore®(生物分子相互作用分析)分析(例如可自BIAcore International AB, a GE Healthcare公司，Uppsala, Sweden獲得之儀器)。另外，亦可使用KinExA®(動態棄除分析(Kinetic Exclusion Assay))分析，其可自Sapidyne Instruments (Boise, Idaho)獲得。 術語「變體」意指與給定多肽在胺基酸序列方面因胺基酸之添加(例如插入)、缺失或保守取代而有所不同但保留給定多肽之生物活性(例如變體VEGF抗體可與抗-VEGF抗體競爭結合至VEGF)之多肽。胺基酸之保守取代(亦即使用具有類似性質(例如親水性及/或帶電區之程度或分佈)之不同胺基酸代替胺基酸)在業內視為通常涉及微小變化。如業內所理解，該等微小變化可部分地藉由考慮胺基酸之親疏水性指數來進行鑑別(例如參見Kyte等人(1982) J. Mol. Biol. 157: 105-132)。在一態樣中，取代親疏水性指數為± 2之胺基酸。亦可使用胺基酸之親水性來揭示得到保留生物功能之蛋白質之取代。考慮肽背景中胺基酸之親水性使得可計算該肽之最大局部平均親水性，此係已報導與抗原性及免疫原性充分相關之有用量度(例如參見美國專利第4,554,101號)。如業內所理解，具有類似親水性值之胺基酸之取代可得到保留生物活性(例如免疫原性)之肽。在一態樣中，使用彼此之親水性值在± 2內之胺基酸來實施取代。胺基酸之疏水性指數及親水性值受該胺基酸之特定側鏈影響。與觀察一致，應理解，與生物功能相容之胺基酸取代取決於胺基酸之相對類似性及尤其彼等胺基酸之側鏈，如藉由疏水性、親水性、電荷、大小及其他性質所揭示。術語「不同」亦包含以不同方式進行處理(例如藉由蛋白水解、磷酸化或其他轉譯後改質)但保留生物活性及/或抗原反應性(例如結合至VEGF及/或DLL4之能力)之多肽或其片段。除非另有定義，否則術語「變體」涵蓋變體片段。變體可與野生型序列99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%或75%一致。I. 結合蛋白之生成 提供能夠結合兩種不同抗原之結合蛋白及其製備方法。可使用各種技術生成結合蛋白。亦提供生成結合蛋白之表現載體、宿主細胞及方法。A. 親代單株抗體之生成 可自親代抗體(Ab) (包含能夠結合所關注抗原之多株Ab及單株Ab (mAb))獲得DVD結合蛋白之可變區域。該等抗體可為天然存在或可藉由重組技術生成。熟習此項技術者熟知許多產生抗體之方法，包含但不限於使用雜交瘤技術、選定淋巴細胞抗體方法(SLAM)、使用噬菌體、酵母、或RNA蛋白融合顯示或其他文庫、對至少包括一些人類免疫球蛋白基因座之非人類動物實施免疫及製備嵌合、CDR移植及人類化抗體。例如參見美國專利公開案第20090311253 A1號。亦可使用親和力成熟技術來製備可變區域。B. 選擇親代單株抗體之準則 提供包括選擇具有DVD結合蛋白分子中之至少一種或多種期望性質之親代抗體之一實施例。在一實施例中，期望性質係一或多種抗體參數，例如抗原特異性、抗原親和力、效力、生物功能、表位識別、穩定性、溶解性、產生效率、免疫原性、藥物動力學、生物可用性、組織交叉反應性或同源抗原結合。例如參見美國專利公開案第20090311253號。C. 結合蛋白分子 在各種實施例中，結合蛋白可經設計以便來自兩種不同親代單株抗體之兩個不同輕鏈可變區域(VL)以串聯方式直接連接或經由連接體藉由重組DNA技術連接，隨後連接輕鏈恆定區域CL。類似地，重鏈依次包括兩個以串聯方式直接連接或經由連接體連接之不同重鏈可變區域(VH)以及恆定區域CH1及Fc區(圖 1 )。 在各種實施例中，可使用重組DNA技術自藉由本文所闡述之任一方法生成之親代抗體來獲得可變區域。在一實施例中，可變區域係鼠類重鏈或輕鏈可變區域。在另一實施例中，可變區域係CDR移植或人類化可變重鏈或輕鏈區域。在一實施例中，可變區域係人類重鏈或輕鏈可變區域。 在各種實施例中，連接體序列可為單一胺基酸或多肽序列。在一實施例中，基於若干Fab分子之晶體結構分析來選擇連接體序列。在Fab或抗體分子結構中之可變區域與CH1/CL恆定區域之間存在天然撓性鏈接。此天然鏈接通常包括大約10-12個胺基酸殘基，該等胺基酸殘基係由來自V區域之C末端之4-6個殘基及來自CL/CH1區域之N末端之4-6個殘基所提供。在一些實施例中，分別使用CL或CH1中N末端之5-6個胺基酸殘基或11-12個胺基酸殘基作為輕鏈及重鏈中之連接體來生成DVD結合蛋白。CL或CH1區域之N末端殘基、尤其前5-6個胺基酸殘基可採用並無強二級結構之環構形，且由此可用作兩個可變區域之間之撓性連接體。CL或CH1區域之N末端殘基係可變區域之天然延伸，此乃因其係Ig序列之一部分，且由此其使用在較大程度上最小化潛在地源於連接體及接點之任一免疫原性。 在各種實施例中，本文所揭示之結合蛋白包含至少一種包括SEQ ID NO: 1-38中之一或多者之連接體(表1)。在一實施例中，X2係Fc區。在另一實施例中，X2係變體Fc區。表 1 ：連接體序列之列表
SEQ ID NO: 序列 SEQ ID NO: 序列
1 ASTKGPSVFPLAP    20 RADAAAAGGPGS
2 ASTKGP    21 RADAAAA
3 GGGGSG    22 SAKTTPKLEEGEFSEARV
4 GGGGSGGGGS    23 ADAAP
5 GGGGSGGGGSGGGG    24 ADAAPTVSIFPP
6 TVAAPSVFIFPP    25 TVAAP
7 TVAAP    26 TVAAPSVFIFPP
8 GGGGSG    27 QPKAAP
9 GGSGGGGSG    28 QPKAAPSVTLFPP
10 GGSGGGGSGGGGS    29 AKTTPP
11 GGSGG    30 AKTTPPSVTPLAP
12 GGSGGGGSGGGS    31 AKTTAP
13 AKTTPKLEEGEFSEAR    32 AKTTAPSVYPLAP
14 AKTTPKLEEGEFSEARV    33 GGGGSGGGGSGGGGS
15 AKTTPKLGG    34 GENKVEYAPALMALS
16 SAKTTPKLGG    35 GPAKELTPLKEAKVS
17 SAKTTP    36 GHEAAAVMQVQYPAS
18 RADAAP    37 TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP
19 RADAAPTVS    38 ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP
其他連接體序列可包含任一衍生自CL/CH1區域之任一長度序列，但並非CL/CH1區域之所有殘基；例如CL/CH1區域之前5-12個胺基酸殘基。在另一實例中，輕鏈連接體可選自Cκ或Cλ；且重鏈連接體可衍生自任一同種型之CH1，包含Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε及Cµ。連接體序列亦可衍生自其他蛋白質，例如Ig樣蛋白(例如TCR、FcR、KIR)；基於G/S之序列(例如G4S重複單元)；衍生自鉸鏈區之序列；及來自其他蛋白質之其他天然序列。其他連接體序列可包含任一包括G/S重複單元之任一長度序列(例如包括GGGS基序之重複單元之序列)或任一其他肽連接體。 在一實施例中，使用重組DNA技術將恆定區域連接至兩個連接可變區域。在一實施例中，將包括連接重鏈可變區域之序列連接至重鏈恆定區域且將包括連接輕鏈可變區域之序列連接至輕鏈恆定區域。在一實施例中，恆定區域分別係人類重鏈恆定區域及人類輕鏈恆定區域。在一實施例中，將DVD重鏈進一步連接至Fc區。Fc區可為天然序列Fc區或變體Fc區。在另一實施例中，Fc區係人類Fc區。在另一實施例中，Fc區包含來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD之Fc區。 在一實施例中，揭示抗體或其功能抗原結合片段，其包括具有用於表2中所列示靶抗原中之一者之功能結合位點之抗體，且包括選自表2中所列示對之配對VH及VL區，或包括彼等VH及VL區之CDR區。舉例而言，抗體可包括來自表2之形成用於DLL4之功能結合位點之VH及VL區。在一實施例中，功能抗原結合片段保留足以結合靶抗原之可變區域區(例如自表2中之配對VH及VL序列獲取之CDR區)。功能抗原結合片段可包含人類化、全人類、駱駝化、單鏈、嵌合、合成、重組、混合、突變、反突變或CDR移植抗體或Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb、VHH (亦稱為奈米抗體)或其他保留抗原結合功能之抗體片段(包含雙特異性或多特異性抗體)。 在一實施例中，揭示包括選自表2中之彼等可變區域之可變區域之結合蛋白。在一實施例中，如上所述，結合蛋白包括第一鏈及第二鏈及兩個功能結合位點，且其中結合蛋白之第一鏈及第二鏈形成兩個用於表2中所列示靶抗原中之一或多者之功能結合位點。在一實施例中，每一功能結合位點包括選自表2中所列示對之配對VH及VL序列(例如形成用於DLL4之結合位點之配對VH及VL序列)，或包括彼等VH及VL區之CDR區。在一些實施例中，第一鏈包括選自表2之第一VH序列及第二VH序列，或含有來自彼等VH序列之CDR序列，且第二鏈包括選自表2之第一VL序列及第二VL序列，或含有之來自彼等VL序列CDR序列。在其他實施例中，第一結合位點或第二結合位點之VH-VL配置跨越兩條鏈，從而每一鏈包括來自一個結合位點之VH區域及來自另一結合位點之VL區域，同時保留兩個功能結合位點。 在一實施例中，兩種重鏈DVD多肽及兩種輕鏈DVD多肽組合形成DVD結合蛋白。表2列示可用於治療疾病之實例性抗體之VH及VL區之胺基酸序列。在一實施例中，提供以任一定向包括表2中所列示VH及/或VL區中之至少兩者之DVD，其中VH及/或VL序列中之至少一者係SEQ ID NO: 39或SEQ ID NO: 40。在一些實施例中，獨立選擇VD1及VD2。下文所提供之VH及VL區域序列包括互補決定區(CDR)及框架序列。在一些實施例中，該等CDR及/或框架序列中之一或多者由其他來自業內已知結合至相同抗原之結合蛋白之CDR及/或框架序列代替且並不損失功能。表 2 ： 用於生成結合蛋白 ( 包含多價結合蛋白 ) 之抗 -DLL4 及抗 -VEGF 抗體之 VH 及 VL 區之胺基酸序列的列表 (CDR 序列呈粗體 )
SEQ ID No. ABT 獨特編號 蛋白質區 序列 1234567890123456789012345678901234567890
39 h1A11.1 DLL4 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFPMA WVRQA PGKGLEWVATISSSDGTTYYRDSVKG RFTISRDNAKNSLY LQMNSLRAEDTAVYYCARGYYNSPFAY WGQGTLVTVSS
40 h1A11.1 DLL4 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLA WYQQKP GKAPKLLIYDTNNLAD GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCQQYNNYPPT FGQGTKLEIKR
41 Av VEGF VH (seq 1) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMN WVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKR RFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDV WGQGTLVTVSS
42 Av VEGF VL (seq 1) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLN WYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPW TFGQGTKVEIKR
43 AB285VH VEGF VH (seq 2) EVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTASGYTFTNYGMNWVRQPPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSQAVLTMTNMDPVDTATYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTTVTVSS
44 AB285VL VEGF VL (seq 2) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCSASQDISNYLNWYQQKPGQAPKVLIYFTSSLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYSTVPWTFGGGTKVEIKR
45 AB288VH VEGF VH (seq 3) EVQLVQSGTEVKKPGESLKISCKASGYTFTNYGMNWVRQMPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRQFTFSLDTSFSTAFLQWSSLKASDTAMYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTMVTVSS
46 AB288VL VEGF VL (seq 3) EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCSASQDISNYLNWYQQKPGQAPRVLIYFTSSLHSDVPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYSTVPWTFGQGTRLEIKR
47 AB305VH VEGF VH (seq 4) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS
48 AB305VL VEGF VL (seq 4) EIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCSASQDISNYLNWYQQKPGQAPRVLIYFTSSLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVFYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR
49 AB308VH VEGF VH (seq 5) EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTAKSSAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS
50 AB308VL VEGF VL (seq 5) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR
51 AB318VH VEGF VH (seq 6) EVQLVESGGGLVQPANSLKLSCAASGYTFTNYGMNWVRQSPKKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTAKSTAYLQMDSLRSEDTATYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGVLVTVSS
52 AB318VL VEGF VL (seq 6) DIRMTQSPASLSASLGETVNIECSASQDISNYLNWYQQKPGKAPQVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQSEDVATYYCQQYSTVPWTFGGGTKLELKR
53 AB333VH VEGF VH (seq 7) QVQLQQSGAELMKPGASVKLSCKATGYTFTNYGMNWVKQRPGHGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRKFTFTLDTSSSTAYIQLISLTTEDSAIYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLLTVSA
54 AB333VL VEGF VL (seq 7) DILMTQSPAILSVSPGERVSFSCSASQDISNYLNWYQQRTNGAPRVLIYFTSSLHSGVPSRFSGGGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQYSTVPWTFGAGTKLELKR
在一些實施例中，提供包括選自SEQ ID NO: 55-63之VH區之DVD結合蛋白。在某些實施例中，DVD結合蛋白包括選自SEQ ID NO: 64-73之VL區。在一些實施例中，DVD結合蛋白包括選自SEQ ID NO: 55-63及74之VH區及選自SEQ ID NO: 64-73之VL區。該等VH及VL區域之胺基酸序列展示於下表3中。表 3 ： 指向 DLL4 及 VEGF 之表位之 DVD 結合蛋白 ( 連接體序列加下劃線 ； CDR 序列呈粗體 )
SEQ ID No. ABT 獨特 編號 蛋白質區 序列 1234567890123456789012345678901234567890
55 h1A11.1-L-Av VH DLL4 VH及 VEGF VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFPMA WVRQA PGKGLEWVATISSSDGTTYYRDSVKG RFTISRDNAKNSLY LQMNSLRAEDTAVYYCARGYYNSPFAY WGQGTLVTVSS AS TKGPSVFPLAP EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTF TNYGMN WVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKR RFT FSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWY FDV WGQGTLVTVSS
56 h1A11.1-S-Av VH DLL4 VH及 VEGF VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFPMA WVRQA PGKGLEWVATISSSDGTTYYRDSVKG RFTISRDNAKNSLY LQMNSLRAEDTAVYYCARGYYNSPFAY WGQGTLVTVSS AS TKGP EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMN W VRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKR RFTFSLDTSK STAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDV WGQG TLVTVSS
57 h1A11.1-GS10-Av VH DLL4 VH及 VEGF VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFPMA WVRQA PGKGLEWVATISSSDGTTYYRDSVKG RFTISRDNAKNSLY LQMNSLRAEDTAVYYCARGYYNSPFAY WGQGTLVTVSS GG GGSGGGGS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNY GMN WVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKR RFTFSL DTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDV WGQGTLVTVSS
58 h1A11.1-GS14-Av VH DLL4 VH及 VEGF VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFPMA WVRQA PGKGLEWVATISSSDGTTYYRDSVKG RFTISRDNAKNSLY LQMNSLRAEDTAVYYCARGYYNSPFAY WGQGTLVTVSS GG GGSGGGGSGGGG EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYT FTNYGMN WVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKR RF TFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHW YFDV WGQGTLVTVSS
59 Av-L-h1A11.1 VH VEGF VH及 DLL4 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMN WVRQA PGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKR RFTFSLDTSKSTAY LQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDV WGQGTLVT VSS ASTKGPSVFPLAP EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA SGFTFSNFPMA WVRQAPGKGLEWVATISSSDGTTYYRDSV KG RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYYNSP FAY WGQGTLVTVSS
60 Av-S-h1A11.1 VH VEGF VH及 DLL4 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMN WVRQA PGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKR RFTFSLDTSKSTAY LQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDV WGQGTLVT VSS ASTKGP EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSN FPMA WVRQAPGKGLEWVATISSSDGTTYYRDSVKG RFTIS RDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYYNSPFAY WGQG TLVTVSS
61 Av-GS6-h1A11.1 VH VEGF VH及 DLL4 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMN WVRQA PGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKR RFTFSLDTSKSTAY LQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDV WGQGTLVT VSS GGGGSG EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSN FPMA WVRQAPGKGLEWVATISSSDGTTYYRDSVKG RFTIS RDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYYNSPFAY WGQG TLVTVSS
62 Av-GS10-h1A11.1 VH VEGF VH及 DLL4 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMN WVRQA PGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKR RFTFSLDTSKSTAY LQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDV WGQGTLVT VSS GGGGSGGGGS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF TFSNFPMA WVRQAPGKGLEWVATISSSDGTTYYRDSVKG R FTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYYNSPFAY WGQGTLVTVSS
63 Av-GS14-h1A11.1 VH VEGF VH及 DLL4 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMN WVRQA PGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKR RFTFSLDTSKSTAY LQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDV WGQGTLVT VSS GGGGSGGGGSGGGG EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFTFSNFPMA WVRQAPGKGLEWVATISSSDGTTYYRDS VKG RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYYNS PFAY WGQGTLVTVSS
64 h1A11.1-L-Av VL DLL4 VL及 VEGF VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLA WYQQKP GKAPKLLIYDTNNLAD GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCQQYNNYPPT FGQGTKLEIKR TVAAPSVFIFPP DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLN WYQQKP GKAPKVLIYFTSSLHS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCQQYSTVPW TFGQGTKVEIKR
65 h1A11.1-S-Av VL DLL4 VL及 VEGF VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLA WYQQKP GKAPKLLIYDTNNLAD GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCQQYNNYPPT FGQGTKLEIKR TVAAP DIQMTQS PSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLN WYQQKPGKAPKVL IYFTSSLHS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYY CQQYSTVPW TFGQGTKVEIKR
66 h1A11.1-GS10-Av VL DLL4 VL及 VEGF VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLA WYQQKP GKAPKLLIYDTNNLAD GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCQQYNNYPPT FGQGTKLEIKR GGSGGGGSG DIQ MTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLN WYQQKPGKA PKVLIYFTSSLHS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQYSTVPW TFGQGTKVEIKR
67 h1A11.1-GS14-Av VL DLL4 VL及 VEGF VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLA WYQQKP GKAPKLLIYDTNNLAD GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCQQYNNYPPT FGQGTKLEIKR GGSGGGGSGGGG S DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLN WYQQK PGKAPKVLIYFTSSLHS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQ PEDFATYYCQQYSTVPW TFGQGTKVEIKR
68 Av-L-h1A11.1 VL VEGF VL及 DLL4 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLN WYQQKP GKAPKVLIYFTSSLHS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE DFATYYCQQYSTVPW TFGQGTKVEIKR TVAAPSVFIFPP D IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLA WYQQKPG KAPKLLIYDTNNLAD GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE DFATYYCQQYNNYPPT FGQGTKLEIKR
69 Av-S-h1A11.1 VL VEGF VL及 DLL4 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLN WYQQKP GKAPKVLIYFTSSLHS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE DFATYYCQQYSTVPW TFGQGTKVEIKR TVAAP DIQMTQSP SSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLA WYQQKPGKAPKLLI YDTNNLAD GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNYPPT FGQGTKLEIKR
70 Av-GS6-h1A11.1 VL VEGF VL及 DLL4 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLN WYQQKP GKAPKVLIYFTSSLHS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE DFATYYCQQYSTVPW TFGQGTKVEIKR GGSGG DIQMTQSP SSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLA WYQQKPGKAPKLLI YDTNNLAD GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNYPPT FGQGTKLEIKR
71 Av-GS10-h1A11.1 VL VEGF VL及 DLL4 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLN WYQQKP GKAPKVLIYFTSSLHS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE DFATYYCQQYSTVPW TFGQGTKVEIKR GGSGGGGSG DIQM TQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLA WYQQKPGKAP KLLIYDTNNLAD GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA TYYCQQYNNYPPT FGQGTKLEIKR
72 Av-GS14-h1A11.1 VL VEGF VL及 DLL4 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLN WYQQKP GKAPKVLIYFTSSLHS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE DFATYYCQQYSTVPW TFGQGTKVEIKR GGSGGGGSGGGS D IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLA WYQQKPG KAPKLLIYDTNNLAD GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE DFATYYCQQYNNYPPT FGQGTKLEIKR
表 3a ： 指向 DLL4 及 VEGF 之表位之全長結合蛋白
73 h1A11.1-SL-Av輕鏈 diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasediysnla wyqqkpgkapklliydtnnlad gvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqynnyppt fgqgtkleikrtvaapsvfifpp diqmtqspsslsasvgdrvtitcsasqdisnyln wyqqkpgkapkvliyftsslhs gvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqystvpw tfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
74 h1A11.1-SL-Av重鏈 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFPMA WVRQAPGKGLEWVATISSSDGTTYYRDSVKG RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYYNSPFAY WGQGTLVTVSSASTKGP EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMN WVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKR RFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDV WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV tvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
表3a提供結合蛋白中指向VEGF及DLL4之全長重鏈及輕鏈序列。連接體序列加下劃線，而CDR及恆定區序列呈粗體。 能夠結合特定靶之特異性DVD結合蛋白及其製備方法之詳細闡述提供於下文實例部分中。D. 結合蛋白之產生 本文所提供之結合蛋白可藉由業內已知多種技術中之任一者產生。舉例而言，在宿主細胞中表現結合蛋白，其中藉由標準技術將編碼DVD重鏈及DVD輕鏈之表現載體轉染至宿主細胞中。在一些實施例中，在原核宿主細胞中表現本文所提供之DVD結合蛋白。在其他實施例中，在真核細胞(例如哺乳動物宿主細胞)中表現DVD結合蛋白。 在重組表現DVD蛋白之實例性系統中，藉由磷酸鈣調介之轉染將編碼DVD重鏈及DVD輕鏈之重組表現載體引入DHFR-CHO細胞中。在重組表現載體內，DVD重鏈及輕鏈基因各自以可操作方式連接至CMV增強子/AdMLP啟動子調控元件以驅動較高程度之基因轉錄。重組表現載體亦攜載DHFR基因，從而使得可對已使用胺甲蝶呤選擇/擴增經載體轉染之CHO細胞進行選擇。對所選宿主細胞進行培養以表現DVD重鏈及輕鏈並自培養基回收完整DVD蛋白。使用標凖分子生物學技術來製備重組表現載體，對宿主細胞實施轉染，選擇轉化體，培養宿主細胞並自培養基回收DVD蛋白。在各種實施例中，本文亦所提供藉由以下方式來合成DVD蛋白之方法：在適宜培養基中培養宿主細胞直至合成DVD蛋白為止。在一些實施例中，該方法可進一步包括自培養基分離DVD蛋白。 DVD結合蛋白之特徵在於可以類似於習用抗體之方式來產生及純化。在一些實施例中，在產生DVD結合蛋白時會得到具有期望雙重特異性活性之均質單一主產物，且無需恆定區之序列改質或化學改質。其他生成「雙特異性」、「多特異性」及「多特異性多價」全長結合蛋白之先前闡述方法可在細胞內或以分泌方式產生組裝惰性、單特異性、多特異性、多價、全長結合蛋白及具有不同結合位點之組合之多價全長結合蛋白的混合物。 在一些實施例中，本文所提供之DVD蛋白設計會得到雙重可變區域輕鏈及雙重可變區域重鏈，其在宿主細胞中表現之後主要組裝成期望「雙重特異性多價全長結合蛋白」。 在一些實施例中，至少50%、至少75%或至少90% (或其間之任一百分比)之表現及組裝之雙重可變區域免疫球蛋白分子係期望雙重特異性四價蛋白，且由此擁有增強之商業用途。因此，在某些實施例中，提供在單一細胞中表現雙重可變區域輕鏈及雙重可變區域重鏈之方法，其得到「雙重特異性四價全長結合蛋白」之單一主要產物。 在各種實施例中，提供在單一細胞中表現雙重可變區域輕鏈及雙重可變區域重鏈之方法，其得到「雙重特異性四價全長結合蛋白」之「主要產物」，其中「主要產物」佔所有組裝蛋白(包括雙重可變區域輕鏈及雙重可變區域重鏈)之大於50%，例如大於75%或大於90% (或其間之任一百分比)。II. 結合蛋白之用途 考慮到能夠結合至一種、兩種或更多種抗原，在某些實施例中，可使用本文所提供之結合蛋白並使用習用免疫分析(例如酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)或組織免疫組織化學)來檢測試樣(例如生物試樣，例如血清或血漿)中之抗原。在一些實施例中，使用可檢測物質直接或間接標記結合蛋白以促進結合或未結合抗體之檢測。適宜可檢測物質包含各種酶、輔基、螢光材料、發光材料及放射性材料。適宜酶之實例包含辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；適宜輔基複合物之實例包含鏈黴抗生物素蛋白/生物素及抗生物素蛋白/生物素；適宜螢光材料之實例包含傘形酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅蛋白。發光材料之實例係魯米諾(luminol)且適宜放射性材料之實例包含3 H、14 C、35 S、90 Y、99 Tc、111 In、125 I、131 I、177 Lu、166 Ho及153 Sm。 在各種實施例中，本文所提供之結合蛋白能夠在活體外及/或活體內中和其抗原靶之活性。因此，在某些實施例中，可使用結合蛋白抑制(例如)含有抗原之細胞培養物、人類個體或其他具有結合蛋白交叉反應之抗原之哺乳動物個體中之抗原活性。在另一實施例中，提供減小患有抗原有害之疾病或病症之人類或非人類動物個體中之抗原活性的方法。在各種實施例中，可將本文所提供之結合蛋白投與人類或非人類動物個體以用於診斷或治療性目的(例如檢測或治療疾病，例如特徵在於異常VEGF及/或DLL4表現之疾病)。 如本文中所使用，術語「抗原活性有害之病症」意欲包含如下疾病及/或其他病症：其中已展示抗原在患有該病症之個體中之存在係或懷疑係造成該病症病理生理學之原因及/或導致該病症惡化之因素。因此，抗原活性有害之病症係預計減小抗原活性可緩解病症之症狀及/或進展的病症。該等病症可展現為(例如)抗原在患有病症之個體之生物流體中之濃度有所增加(例如抗原在個體之血清、血漿、滑液等中之濃度有所增加)。可使用本文所提供結合蛋白治療之病症之非限制性實例包含彼等論述於下文及關於包括結合蛋白之醫藥組合物之部分中的病症。 在各種實施例中，DVD結合蛋白可用作治療劑來增加至有害抗原之結合及/或同時阻斷兩種不同抗原靶(DLL4及/或VEGF)以增強效能/安全性及/或增加患者覆蓋率。 另外，在一些實施例中，本文所提供之DVD結合蛋白可用於組織特異性遞送(例如靶向組織標記物及/或用於增強局部PK之疾病介體，由此提供較高效能及/或較低毒性)，包含細胞內遞送(例如將DVD靶向細胞內分子)。在一些實施例中，DVD結合蛋白亦可用作載體蛋白以經由結合至抗原之非中和表位來將該抗原遞送至特定位置且亦增加抗原之半衰期。另外，在某些實施例中，DVD結合蛋白可經設計以物理方式連接至植入患者中之醫學裝置或靶向該等醫學裝置(參見Burke等人(2006) Advanced Drug Deliv. Rev. 58(3): 437-446；Hildebrand等人(2006) Surface and Coatings Technol.200(22-23): 6318-6324；Drug/ device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis, Wu (2006) Biomaterials 27(11):2450-2467；Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices, Marques (2005) Biodegradable Systems in Tissue Engineer. Regen. Med. 377-397)。A. 結合蛋白在各種疾病中之用途 在各種實施例中，本文所提供之結合蛋白可用作治療分子來治療各種疾病或病症，例如與DLL4及/或VEGF之有害表現或表現程度有關之疾病或病症。在一些實施例中，可投與一或多種結合蛋白以診斷、治療腫瘤或增強抗腫瘤療法及/或可有益於治療原發性及/或轉移性癌症。在各種實施例中，可投與一或多種結合蛋白以診斷、治療腫瘤學病狀或增強該治療。在其他實施例中，可投與一或多種結合蛋白以診斷、治療特徵在於異常血管生成之任一其他疾病或病症(例如一般自體免疫及發炎性病症、傷口癒合)或增強該治療。在各種實施例中，投與一或多種結合蛋白會使得結合至VEGF及/或DLL4，此可中和患有特徵在於過大VEGF及/或DLL4含量之病狀之患者中之VEGF及/或DLL4或另外減小其含量。 在並不限制揭示內容下，提供關於某些疾病病狀之其他資訊。1. 腫瘤學病症 單株抗體療法已展現為用於癌症之重要治療方式(von Mehren等人(2003) Annu. Rev. Med. 54:343-69)。與單特異性療法相比，使用如本文所揭示之雙重特異性抗體(其靶向兩種單獨致癌介體)很可能提供額外益處。 在各種實施例中，可使用本文所提供之組合物及方法診斷及/或治療之腫瘤學疾病包含但不限於原發性或轉移性癌症、乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、腺癌、口咽癌、下咽癌、食道癌、胃癌、胰臟癌、肝癌、膽囊癌、膽管癌、小腸癌、泌尿道癌(包含腎癌、膀胱癌及尿道上皮癌)、女性生殖道癌(包含子宮頸癌、子宮癌及卵巢癌以及絨膜癌及妊娠滋養細胞疾病)、男性生殖道癌(包含前列腺癌、精囊癌、睪丸癌及生殖細胞腫瘤)、內分泌腺癌(包含甲狀腺癌、腎上腺癌及腦垂體腺癌)、皮膚癌、血管瘤、黑素瘤、肉瘤(包含彼等源自骨及軟組織者以及卡波西氏肉瘤)、腦、神經、眼睛及腦膜之腫瘤(包含星形細胞瘤、神經膠質瘤、神經膠質母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、神經瘤、神經母細胞瘤、神經鞘瘤及腦膜瘤)、源自造血系統惡性腫瘤之實體腫瘤(例如白血病及淋巴瘤(何傑金氏淋巴瘤及非何傑金氏淋巴瘤))、胃癌、膀胱癌、前列腺癌、直腸癌、造血系統惡性腫瘤、白血病、淋巴瘤、無β脂蛋白血症、手足發紺、急性及慢性寄生或感染過程、急性白血病、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、B細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、慢性骨髓細胞白血病(CML)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、結腸直腸癌、毛細胞白血病、何傑金氏病、卡波西氏肉瘤、惡性淋巴瘤、惡性組織細胞增多病、惡性黑素瘤、多發性骨髓瘤、非何傑金氏淋巴瘤、胰臟癌、副腫瘤症候群/惡性高鈣血症、肉瘤、實體腫瘤或特徵在於異常DLL4或VEGF活性之任一其他血管生成獨立性或依賴性疾病。 在各種實施例中，在單獨使用或與放射療法及/或其他化學治療劑組合使用時，使用結合DLL4及/或VEG之DVD結合蛋白或其抗原結合部分來診斷及/或治療癌症及/或預防轉移。2. 黃斑變性 在各種實施例中，可使用本文所提供之組合物及方法來治療黃斑變性，包含新生血管性(濕)黃斑變性。黃斑變性係導致在視野中心因視網膜損害而損失視力之醫學病狀。新生血管性(濕)黃斑變性源自異常血液血管生長，異常血液血管生長最終在黃斑下方引起血液及蛋白質洩漏，從而可導致光感受器發生不可逆損害。 在各種實施例中，在單獨使用或與其他治療劑組合使用時，使用結合DLL4及/或VEGF之DVD或其抗原結合部分來診斷及/或治療黃斑變性。3. 糖尿病及糖尿病性視網膜病變 1型糖尿病係源自胰臟中產生胰島素之β細胞之自體免疫破壞之糖尿病形式。胰島素之後續缺乏使得血糖及尿糖有所增加。糖尿病性視網膜病變涉及損害視網膜且呈糖尿病併發症形式。 糖尿病性視網膜病變係視網膜血管系統之較小變化之結果，該等較小變化源於高血糖症誘導之外周細胞死亡及血管壁之弱化。隨著疾病發生進展，嚴重非增殖性糖尿病性視網膜病變進入血管發生增殖之晚期。若不予以治療，則新血管可發生出血，使視力變模糊，且進一步損害視網膜。纖維血管增殖亦可導致視網膜脫離。增殖血管亦可生長至眼睛之前房且導致新生血管性青光眼。 據信，VEGF及DLL4信號傳導在調介糖尿病性內皮功能障礙及血管病變(包含涉及糖尿病性腎病變及視網膜病變之發病機制)中發揮重要作用。J. Exp. Med . 209(5): 1011-28 (2012)；Nephrol. Dial. Transplant . 18 (8): 1427-1430 (2003)；PNAS 109(27): E1868-77 (2012)；美國專利申請案第20110189176號(Skokos等人)。因此，VEGF及DLL4可代表使用本揭示內容之DVD診斷及/或治療糖尿病及/或糖尿病性視網膜病變之潛在靶(例如鑑別患者中之血清含量及/或改變VEGF及/或DLL4之含量)。在各種實施例中，在單獨使用或與其他治療劑組合使用時，使用結合DLL4及/或VEGF之DVD或其抗原結合部分來診斷及/或治療1型糖尿病類及/或糖尿病性視網膜病變。4. 動脈粥樣硬化 據信，VEGF及DLL4涉及動脈粥硬化之進展。Circulation 98(20):2108-16 (1998)；PNAS 109(27): E1868-77 (2012)。特定而言，VEGF表現已展示於人類冠狀動脈中之動脈粥樣硬化病變中，從而表明VEGF在人類冠狀動脈粥硬化之進展以及阻塞性冠狀動脈疾病之再通過程中發揮作用。使用中和性抗-DLL4抗體抑制DLL4信號傳導已展示會減弱動脈粥硬化之發生及減輕斑塊鈣化。因此，VEGF及DLL4含量可代表用於使用本揭示內容之DVD來診斷及/或治療動脈粥硬化之潛在靶(例如鑑別患者中之血清含量及/或改變VEGF及/或DLL4之含量)。在各種實施例中，在單獨使用或與其他治療劑組合使用時，使用結合DLL4及/或VEGF之DVD或其抗原結合部分來診斷及/或治療動脈粥硬化。III. 醫藥組合物 在各種實施例中，本文提供醫藥組合物，其包括一或多種單獨或與預防劑、治療劑及/或醫藥上可接受之載劑組合之結合蛋白。在各種實施例中，本文所揭示醫藥組合物之應用之非限制性實例包含診斷、檢測及/或監測病症，預防、治療、管控及/或改善病症或其一或多種症狀，及/或研究。熟習此項技術者已知醫藥組合物之調配物(單獨或與預防劑、治療劑及/或醫藥上可接受之載劑組合) (美國專利公開案第20090311253 A1號)。 投與本文所提供預防劑或治療劑之方法包含但不限於經口投與、非經腸投與(例如皮內、肌內、腹膜腔內、靜脈內及皮下投與)、硬膜外投與、瘤內投與、黏膜投與(例如鼻內及/經口途徑)及經肺投與(例如使用吸入器或噴霧器投與之氣溶膠化化合物)。熟習此項技術者可獲得及已知用於特定投與途徑之醫藥組合物之調配物及各種投與方法所需之材料及技術(美國專利公開案第20090311253 A1號)。 在各種實施例中，可對劑量方案加以調節以提供最佳期望反應(例如治療或預防反應)。舉例而言，可投與單次濃注劑，可經一段時間投與數個細分劑量或可根據治療狀況緊急程度所指示按比例減小或增加劑量。在一些實施例中，以劑量單位形式調配非經腸組合物以便於投與且使劑量均勻。術語「劑量單位形式」係指適於作為單位劑量供擬治療哺乳動物個體使用之物理離散單位；每一單位含有經計算可產生期望治療效應之預定量活性化合物以及所需醫藥載劑。 本文所提供結合蛋白之治療或預防有效量之實例性非限制性範圍為約0.1-100 mg/kg (例如約0.1-0.5 mg/kg、0.1-1 mg/kg、0.1-10 mg/kg、0.1-20 mg/kg、0.1-50 mg/kg、0.1-75 mg/kg、1-10 mg/kg、1-15 mg/kg、1-7.5 mg/kg、1.25-15 mg/kg、1.25-7.5 mg/kg、2.5-7.5 mg/kg、2.5-15 mg/kg、5-15 mg/kg、5-7.5 mg/kg、1-20 mg/kg、1-50 mg/kg、7-75 mg/kg、1-100 mg/kg、5-10 mg/kg、5-15 mg/kg、5-20 mg/kg、5-25 mg/kg、5-50 mg/kg、5-75 mg/kg、10-20 mg/kg、10-50 mg/kg、10-75 mg/kg或10-100 mg/kg或其間之任一濃度)。在一些實施例中，結合蛋白以治療有效濃度存在於醫藥組合物中，例如濃度為約0.1-100 mg/ml (例如約0.1-0.5 mg/ml、0.1-1 mg/ml、0.1-10 mg/ml、0.1-20 mg/ml、0.1-50 mg/ml、0.1-75 mg/ml、1-10 mg/ml、1-20 mg/ml、1-50 mg/ml、1-75 mg/ml、1-100 mg/ml、5-10 mg/ml、5-15 mg/ml、5-20 mg/ml、5-25 mg/ml、5-50 mg/ml、5-75 mg/ml、10-20 mg/ml、10-50 mg/ml、10-75 mg/ml或10-100 mg/ml或其間之任一濃度)。應注意，劑量值可隨擬緩解病狀之類型及/或嚴重程度而有所變化。應進一步理解：對於任一特定個體而言，可根據個體需要及/或投與組合物或監督組合物投與之個人之專業判斷隨時調節具體劑量方案，且本文所闡述之劑量範圍僅為舉例說明性且並非意欲限制所主張組合物之範圍或實踐。IV. 組合療法 在各種實施例中，本文所提供之結合蛋白亦可單獨投與或與一或多種用於治療疾病或病症(例如與DLL4及/或VEGF之有害表現或表現含量有關之疾病或病症)之其他治療劑組合投與。在一些實施例中，可組合投與一或多種結合蛋白與一或多種治療劑以診斷、治療腫瘤或增強抗腫瘤療法及/或治療原發性及/或轉移性癌症。在各種實施例中，可組合投與一或多種結合蛋白與一或多種治療劑以診斷、治療腫瘤學病狀或增強該治療。在其他實施例中，可組合投與一或多種結合蛋白與一或多種治療劑以診斷、治療特徵在於異常血管生成之任一其他疾病或病症(例如一般自體免疫及發炎性病症、傷口癒合)或增強該治療。在各種實施例中，組合投與一或多種結合蛋白與一或多種治療劑會中和患有特徵在於過大VEGF及/或DLL4含量之病狀之患者中之VEGF及/或DLL4或另外減小VEGF及/或DLL4含量，且藉由投與結合蛋白及/或一或多種治療劑來獲得其他治療性變化。 在各種實施例中，由熟習此項技術者出於其預期目的來選擇一或多種其他藥劑。舉例而言，其他藥劑可為業內識別為可用於治療癌症之治療劑。組合療法亦可包含一種以上其他藥劑，例如兩種、三種、四種、五種或更多種其他藥劑。 在各種實施例中，組合療法藥劑包含但不限於抗血管生成劑、抗腫瘤劑、放射療法、化學療法(例如DNA烷基化劑)、順鉑、卡鉑、抗微管蛋白劑、紫杉醇、多西他賽、紫杉醇、多柔比星、吉西他濱、健擇、蒽環素、阿黴素(adriamycin)、拓撲異構酶I抑制劑、拓撲異構酶II抑制劑、5-氟尿嘧啶(5-FU)、醛氫葉酸、伊立替康、受體酪胺酸激酶抑制劑(例如厄洛替尼、吉非替尼)及siRNA。 本文所提供之結合蛋白可組合之化學治療劑之非限制性實例包含下列物質：13-順式-視黃酸、2-CdA、2-氯去氧腺苷、5-阿紮胞苷、5-氟尿嘧啶、5-FU、6-巰基嘌呤、6-MP、6-TG、6-硫鳥嘌呤、阿布沙尼、Accutane®、放線菌素-D、Adriamycin®、Adrucil®、Afinitor®、Agrylin®、Ala-Cort®、阿地白介素、阿來組單抗、ALIMTA、阿利維A酸、Alkaban-AQ®、Alkeran®、全反式視黃酸、α干擾素、六甲蜜胺、胺甲喋呤(Amethopterin)、胺磷汀、胺魯米特、阿那格雷、Anandron®、阿那曲唑、阿糖胞嘧啶、Ara-C Aranesp®、Aredia®、Arimidex®、Aromasin®、Arranon®、三氧化二砷、Arzerra™、天門冬醯胺酶、ATRA、Avastin®、阿紮胞苷、BCG、BCNU、苯達莫司汀、貝伐珠單抗、貝沙羅汀、BEXXAR®、比卡魯胺、BiCNU、Blenoxane®、博來黴素、硼替佐米、白消安、Busulfex®、C225、醛氫葉酸鈣、Campath®、Camptosar®、喜樹鹼-11、卡培他濱、Carac™、卡鉑、卡莫司汀、卡莫司汀藥片、Casodex®、CC-5013、CCI-779、CCNU、CDDP、CeeNU、Cerubidine®、西妥昔單抗、苯丁酸氮芥、順鉑、嗜橙菌因子、克拉屈濱、可的松、Cosmegen®、CPT-11、環磷醯胺、Cytadren®、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂質體、Cytosar-U®、Cytoxan®、達卡巴嗪、達克金、更生黴素、阿法達貝泊汀、達沙替尼、道諾黴素、柔紅黴素、柔紅黴素鹽酸鹽、柔紅黴素脂質體、DaunoXome®、地卡特隆、地西他濱、Delta-Cortef®、Deltasone®、德尼白介素、地飛托克、DepoCyt™、地塞米松、乙酸地塞米松、地塞米松磷酸鈉、地克薩松、右雷佐生、DHAD、DIC、迪奧帶斯、多西他賽、Doxil®、多柔比星、多柔比星脂質體、Droxia™、DTIC、DTIC-Dome®、Duralone®、Efudex®、Eligard™、Ellence™、Eloxatin™、Elspar®、Emcyt®、表柔比星、阿法依伯汀、艾比特思、厄洛替尼、歐文氏菌屬L-天門冬醯胺酶、雌莫司汀、胺磷汀、Etopophos®、依託泊苷、磷酸依託泊苷、Eulexin®、依維莫司、Evista®、依西美坦、Fareston®、Faslodex®、Femara®、非格司亭、氟尿苷、Fludara®、氟達拉濱、Fluoroplex®、氟尿嘧啶、氟尿嘧啶(乳霜)、氟甲睪酮、氟他胺、亞葉酸、FUDR®、氟維司群、吉非替尼、吉西他濱、吉妥單抗奧佐米星、健擇、Gleevec™、Gliadel®藥片、GM-CSF、戈舍瑞林、粒細胞-群落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞群落刺激因子(G-MCSF)、Halotestin®、Herceptin®、海塞多、Hexalen®、六甲基蜜胺、HMM、Hycamtin®、Hydrea®、Hydrocort Acetate®、氫化可的松、氫化可的松磷酸鈉、氫化可的松琥珀酸鈉、磷酸氫化可通、羥基脲、異貝莫單抗、替伊莫單抗、Idamycin®、Idarubicin Ifex®、干擾素-α、干擾素-α-2b (PEG偶聯物)、異環磷醯胺、介白素-11 (IL-11)、介白素-2 (IL-2)、甲磺酸伊馬替尼、咪唑羧醯胺、Intron A®、Iressa®、伊立替康、異維A酸、伊沙匹隆、Ixempra™、KADCYCLA®、天門冬醯胺酶(t)、Lanacort®、拉帕替尼、L-天門冬醯胺酶、LCR、來那度胺、來曲唑、醛氫葉酸、瘤可寧、Leukine™、亮丙瑞林、醛基長春鹼、Leustatin™、脂質體Ara-C、Liquid Pred®、洛莫司汀、L-PAM、L-溶肉瘤素、Lupron®、Lupron Depot®、Matulane®、馬克戴斯、氮芥(Mechlorethamine)、氮芥鹽酸鹽、Medralone®、Medrol®、Megace®、甲地孕酮、乙酸甲地孕酮、美法侖、巰基嘌呤、美司鈉、Mesnex™、胺甲喋呤（Methotrexate）、胺甲喋呤鈉、甲基潑尼松龍、Meticorten®、絲裂黴素、絲裂黴素-C、米托蒽醌、M-Prednisol®、MTC、MTX、Mustargen®、氮芥、Mutamycin®、Myleran®、Mylocel™、Mylotarg®、Navelbine®、耐拉濱、Neosar®、Neulasta™、Neumega®、Neupogen®、Nexavar®、Nilandron®、尼羅替尼、尼魯米特、Nipent®、氮芥(Nitrogen Mustard)、Novaldex®、Novantrone®、尼普拉特、奧曲肽、乙酸奧曲肽、奧法木單抗、Oncospar®、Oncovin®、Ontak®、Onxal™、奧普瑞白介素、Orapred®、Orasone®、奧沙利鉑、紫杉醇、紫杉醇蛋白結合物、帕米膦酸鹽、帕尼單抗、Panretin®、Paraplatin®、帕唑帕尼、Pediapred®、PEG干擾素、培加帕酶、培非司亭、PEG-INTRON™、PEG-L-天門冬醯胺酶、培美曲塞、噴司他丁、苯丙胺酸氮芥、Platinol®、Platinol-AQ®、潑尼松龍、潑尼松、Prelone®、丙卡巴肼、PROCRIT®、Proleukin®、含有卡莫司汀植入物之普羅非泮20、Purinethol®、雷洛昔芬、Revlimid®、Rheumatrex®、Rituxan®、利妥昔單抗、Roferon-A®、羅米司亭、Rubex®、紅比黴素鹽酸鹽、Sandostatin®、Sandostatin LAR®、沙格司亭、Solu-Cortef®、Solu-Medrol®、索拉非尼、SPRYCEL™、STI-571、鏈佐星、SU11248、舒尼替尼、Sutent®、他莫昔芬、Tarceva®、Targretin®、Tasigna®、Taxol®、Taxotere®、Temodar®、替莫唑胺、坦羅莫司、替尼泊苷、TESPA、沙利度胺、Thalomid®、TheraCys®、硫鳥嘌呤、Thioguanine Tabloid®、硫代磷醯胺、Thioplex®、噻替派、TICE®、Toposar®、拓撲替康、托瑞米芬、Torisel®、托西莫單抗、曲司佐單抗、Treanda®、維A酸、Trexall™、Trisenox®、TSPA、TYKERB®、VCR、Vectibix™、Velban®、Velcade®、VePesid®、Vesanoid®、Viadur™、Vidaza®、長春花鹼、硫酸長春花鹼、Vincasar Pfs®、長春新鹼、長春瑞濱、酒石酸長春瑞濱、VLB、VM-26、伏立諾他、福退癌、VP-16、Vumon®、Xeloda®、Zanosar®、Zevalin™、Zinecard®、Zoladex®、唑來膦酸、唑林紮或Zometa®。 在一實施例中，本文所提供之結合蛋白與以下中之一或多者組合使用：替莫唑胺®、伊立替康、醛氫葉酸、5-FU、吉西他濱及紫杉醇。在一實施例中，結合蛋白h1A11.1-SL-Av以下中之一或多者組合使用：替莫唑胺®、伊立替康、醛氫葉酸、5-FU、吉西他濱及紫杉醇。 在各種實施例中，本文所提供之結合蛋白亦可與諸如以下藥劑組合：胺甲喋呤、6-MP、硫唑嘌呤柳氮磺吡啶(azathioprine sulphasalazine)、美沙拉秦(mesalazine)、奧沙拉秦氯喹(olsalazine chloroquinine)/羥氯喹(hydroxychloroquine)、青黴胺(pencillamine)、金硫代蘋果酸鹽(aurothiomalate)(肌內及經口)、硫唑嘌呤、秋水仙鹼(cochicine)、皮質類固醇(經口、吸入及局部注射)、β-2腎上腺素受體激動劑(沙丁胺醇(salbutamol)、特布他林(terbutaline)、沙美特羅(salmeteral))、黃嘌呤(茶鹼(theophylline)、胺茶鹼(aminophylline))、色甘酸鹽(cromoglycate)、奈多羅米(nedocromil)、酮替芬(ketotifen)、異丙托銨(ipratropium)及氧托品(oxitropium)、環孢素、FK506、雷帕黴素、麥考酚酸嗎乙酯(mycophenolate mofetil)、來氟米特(leflunomide)、NSAID (例如布洛芬(ibuprofen))、皮質類固醇(例如潑尼松龍)、磷酸二酯酶抑制劑、腺苷激動劑、抗血栓形成劑、補體抑制劑、腎上腺素能藥劑、由諸如TNF-α或IL-1等促發炎細胞因子干擾信號傳導之藥劑(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制劑)、IL-1β轉化酶抑制劑、TNF-α轉化酶(TACE)抑制劑、T細胞信號傳導抑制劑(例如激酶抑制劑)、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤、血管緊張素轉化酶抑制劑、可溶性細胞因子受體或其衍生物(例如可溶性p55或p75 TNF受體或衍生物p75TNFRIgG (EnbrelTM )或p55TNFRIgG (來那西普(Lenercept))、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)、抗發炎性細胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-11、IL-13及TGFβ)、塞來考昔(celecoxib)、葉酸、硫酸羥氯喹(hydroxychloroquine sulfate)、羅非考昔(rofecoxib)、依那西普(etanercept)、英夫利昔單抗(infliximab)、萘普生(naproxen)、伐地考昔(valdecoxib)、柳氮磺吡啶、甲基潑尼松龍、美洛昔康(meloxicam)、乙酸甲基潑尼松龍、硫代蘋果酸金鈉、阿司匹林(aspirin)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、萘磺酸丙氧吩(propoxyphene napsylate)/apap、葉酸鹽、萘丁美酮(nabumetone)、雙氯芬酸(diclofenac)、吡羅昔康(piroxicam)、依託度酸(etodolac)、雙氯芬酸鈉、奧沙普秦(oxaprozin)、鹽酸羥可待酮(oxycodone hcl)、重酒石酸二氫可待因酮(hydrocodone bitartrate)/apap、雙氯芬酸鈉/米索前列醇(misoprostol)、芬太尼(fentanyl)、阿那白滯素(anakinra)、人類重組物、鹽酸曲馬多(tramadol hcl)、雙水楊酯(salsalate)、舒林酸(sulindac)、維生素b12 (cyanocobalamin)/fa/吡哆素(pyridoxine)、對乙醯胺基酚(acetaminophen)、阿侖膦酸鈉(alendronate sodium)、潑尼松龍、硫酸嗎啡(morphine sulfate)、利多卡因鹽酸鹽(lidocaine hydrochloride)、吲哚美辛(indomethacin)、硫酸鹽葡糖胺(glucosamine sulf)/軟骨素(chondroitin)、鹽酸阿米替林(amitriptyline hcl)、磺胺嘧啶(sulfadiazine)、鹽酸羥可待酮/對乙醯胺基酚、鹽酸奧洛他定(olopatadine hcl)、米索前列醇(misoprostol)、萘普生鈉、奧美拉唑(omeprazole)、環磷醯胺、利妥昔單抗、IL-1 TRAP、MRA、CTLA4-IG、IL-18 BP、抗-IL-18、抗-IL15、BIRB-796、SCIO-469、VX-702、AMG-548、VX-740、羅氟司特(Roflumilast)、IC-485、CDC-801或美索普拉(Mesopram)。在一些實施例中，組合可包含胺甲喋呤或來氟米特及環孢素。 在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物可包含「治療有效量」或「預防有效量」之本文所提供之結合蛋白。「治療有效量」係指可在所需時間段內以所需劑量有效達成期望治療結果之量。結合蛋白之治療有效量可由熟習此項技術者確定且可隨諸如以下因素變化：疾病狀態、個體年齡、性別及體重以及結合蛋白於該個體中誘發期望反應之能力。治療有效量亦為抗體或抗體結合部分之治療有益效應大於其任何毒性或有害效應之量。「預防有效量」係指在所需時間段內以所需劑量有效達成期望預防結果之量。通常，因預防劑量係在患病之前或患病早期用於個體中，故預防有效量可小於治療有效量。V. 診斷 本文之揭示內容亦提供診斷應用，包含但不限於使用一或多種結合蛋白之診斷分析方法、含有一或多種結合蛋白之診斷套組及用於自動化及/或半自動化系統中之方法及套組。在一些實施例中，該等方法及套組可用於檢測、監測及/或治療個體之疾病或病症。A. 分析方法 在各種實施例中，提供該等方法以用於使用至少一種結合蛋白測定至少一種分析物或其片段在測試試樣中之存在、量及/或濃度。實例性分析包含但不限於免疫分析及/或採用質譜之方法。 舉例而言，本揭示內容所提供之免疫分析尤其可包含夾心式免疫分析、放射性免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、競爭性抑制免疫分析、螢光偏振免疫分析(FPIA)、酶多聯免疫分析技術(EMIT)、生物發光共振能量轉移(BRET)及均質化學發光分析。 在一些實施例中，提供測定一或多種抗原或其片段在測試試樣中之存在、量或濃度之方法，其中一或多種抗原或其片段係DLL4及/或VEGF。該方法包括藉由免疫分析來分析測試試樣之抗原或其片段。免疫分析(i)採用至少一種結合蛋白及至少一種可檢測標記，且(ii)包括比較在測試試樣中藉由可檢測標記生成之信號(作為抗原或其片段之存在、量或濃度之直接或間接指示)與在對照或校準品中生成之信號(作為抗原或其片段之存在、量或濃度之直接或間接指示)。校準品視情況係校準品系列之一部分，其中每一校準品與系列中之其他校準品具有不同之抗原或其片段之濃度。該方法可包括(i)使測試試樣與至少一種捕獲劑(其結合至抗原或其片段上之表位)接觸以形成包括捕獲劑及抗原或其片段之複合物，(ii)使包括捕獲劑及抗原或其片段之複合物與至少一種檢測劑(其包括可檢測標記且結合至抗原或其片段上未由捕獲劑結合之表位)接觸以形成檢測複合物，及(iii)基於藉由在(ii)中形成之檢測複合物中之可檢測標記生成之信號，測定抗原或其片段在測試試樣中之存在、量或濃度，其中至少一種捕獲劑及/或至少一種檢測劑係至少一種結合蛋白。 另一選擇為，在一些實施例中，測定一或多種抗原或其片段在測試試樣中之存在、量或濃度之方法可包括：(i)使測試試樣與至少一種捕獲劑(其結合至抗原或其片段上之表位)接觸以形成包括捕獲劑及抗原或其片段之複合物，且同時或依序以任一順序使測試試樣與可檢測標記之抗原或其片段(其可與測試試樣中之任一抗原或其片段競爭結合至至少一種捕獲劑)接觸，其中存在於測試試樣中之任一抗原或其片段及可檢測標記之抗原彼此競爭形成檢測複合物，及(ii)基於藉由在(i)中形成之檢測複合物中之可檢測標記生成之信號，測定抗原或其片段在測試試樣中之存在、量或濃度，其中至少一種捕獲劑係至少一種結合蛋白且其中藉由捕獲檢測複合物中之可檢測標記生成之信號與抗原或其片段在測試試樣中之量或濃度成反比。 在各種實施例中，測試試樣可來自患者，在該情形下，該方法可進一步包括診斷、預測或評估患者之治療性/預防性治療之效能。若該方法進一步包括評估患者之治療性/預防性治療之效能，則該方法視情況進一步包括視需要修改患者之治療性/預防性治療以改良效能。該方法可適用於自動化系統或半自動化系統。因此，本文所闡述之方法亦可用於確定個體是否患有給定疾病、病症或病狀或處於發生給定疾病、病症或病狀之風險下。具體而言，此一方法可包括以下步驟： (a)測定一或多種分析物或其片段在來自個體之測試試樣中之濃度或量(例如使用本文所闡述之方法或業內已知之方法)；及(b)比較如在步驟(a)中測定之分析物或其片段之濃度或量與預定值，其中若步驟(a)中所測定分析物之濃度或量關於預定值有利，則可確定個體並不患有給定疾病、病症或病狀或處於給定疾病、病症或病狀之風險下。然而，若步驟(a)中所測定分析物之濃度或量關於預定值不利，則可確定個體患有給定疾病、病症或病狀或處於給定疾病、病症或病狀之風險下。 另外，本文提供監測個體中之疾病之進展之方法。在一些實施例中，該等方法包括以下步驟： (a)測定一或多種分析物在來自個體之測試試樣中之濃度或量； (b)測定分析物在來自同一個體之後一測試試樣中之濃度或量；及 (c)比較步驟(b)中所測定分析物之濃度或量與步驟(a)中所測定分析物之濃度或量，其中若在步驟(b)中測定之濃度或量與在步驟(a)中測定之濃度或量相比不變或不利，則可確定個體之疾病繼續發生、進展或惡化。藉由比較，若在步驟(b)中測定之濃度或量與在步驟(a)中測定之濃度或量相比有利，則可確定個體之疾病已停止、消退或改良。 視情況，監測疾病之進展之方法進一步包括比較如在步驟(b)中測定之分析物的濃度或量與(例如)預定值。另外，視情況，若比較展示如在步驟(b)中測定之分析物之濃度或量(例如)關於預定值不利地改變，則該等方法包括使用一或多種醫藥組合物治療個體一定時間段。 在一些實施例中，使用諸如化學發光標記(吖啶鎓化合物)等可檢測標記檢測分析物或其片段在試樣中之存在、量或濃度。在一些實施例中，可使用彼等熟習此項技術者已知之常規技術來檢測所生成之化學發光信號。基於所生成信號之強度，可量化分析物在試樣中之量或濃度。具體而言，在一些實施例中，分析物在試樣中之量可與所生成信號之強度成正比。在某些實施例中，可藉由比較所生成光之量與分析物標準曲線或藉由與參考標準或校準品進行比較來量化所存在分析物之量。可使用已知濃度分析物之連續稀釋液或溶液藉由質譜、重量分析方法及其他業內已知技術來生成標準曲線。 通常可使用任一業內已知形式(例如但不限於夾心式形式)來實施分析物免疫分析。舉例而言，在免疫分析中，可使用一或多種結合蛋白捕獲測試試樣中之分析物(或其片段) (該等結合蛋白通常稱為「捕獲」結合蛋白)，且可使用一或多種結合蛋白與可檢測(亦即可量化)標記結合成夾心結構(該等結合蛋白通常稱為「檢測」結合蛋白、「偶聯物(conjugate)」或「偶聯物(conjugates)」)。因此，在實例性夾心式免疫分析形式之背景中，如本文所闡述之DVD (或其片段、變體或變體片段)可用作捕獲結合蛋白、檢測結合蛋白或用作二者。舉例而言，具有可結合第一分析物上表位之第一區域(或其片段)及可結合第二分析物上表位之第二區域(或其片段)之DVD可用作捕獲及/或檢測結合蛋白來檢測及視情況量化一或多種分析物(例如DLL4及/或VEGF)。在另一實例中，採用在夾心式分析內具有差別親和力之DVD可提供結合性優點。在如本文所闡述免疫分析之背景中，通常可有益地或期望在DVD結構內納入一或多種連接體。在存在時，最佳地，連接體應具有足夠長度及結構撓性以使得能夠藉由內部區域結合表位以及藉由外部區域結合另一表位。就此而言，若DVD可結合兩種不同分析物且一種分析物大於另一分析物，則期望地，藉由外部區域結合較大分析物。 在各種實施例中，可使測試試樣(例如懷疑含有分析物或其片段之試樣)與至少一種捕獲結合蛋白及至少一種檢測結合蛋白同時或依序且以任一順序接觸。舉例而言，可首先使測試試樣與至少一種捕獲結合蛋白接觸且然後(依序)與至少一種檢測結合蛋白接觸。另一選擇為，可首先使測試試樣與至少一種檢測結合蛋白接觸且然後(依序)與至少一種捕獲結合蛋白接觸。在又一替代方式中，可使測試試樣同時與捕獲結合蛋白及檢測結合蛋白接觸。在各種實施例中，可使用包括一或多種本文所揭示DVD之競爭性抑制免疫分析來檢測一或多種分析物或其片段(例如DLL4及/或VEGF)之存在、量或濃度。 在各種實施例中，可使可檢測標記直接或經由偶合劑結合至結合蛋白。可使用之一偶合劑實例係EDAC (1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽)，其購自Sigma-Aldrich, St. Louis, MO。業內已知可使用之其他偶合劑。業內已知使可檢測標記結合至結合蛋白之方法。 在各種實施例中，可使用業內已知之技術來量化檢測分析中結合至包括分析物及DVD之複合物之標記的存在或量。舉例而言，若使用酶標記，則可使經標記複合物與標記基質反應以得到可量化反應(例如顯色)。若標記係放射性標記，則可使用適當方式(例如閃爍計數器)來量化標記。若標記係螢光標記，則可藉由刺激標記且檢測螢光信號來量化標記。若標記係化學發光標記，則可藉由以目測方式或藉由使用發光計、x射線底片、高速照相軟片、CCD照相機等檢測所發射光來量化標記。在一些實施例中，在已量化複合物中之標記量後，可藉由適當方式(例如藉由使用利用已知濃度分析物或其片段之連續稀釋液生成之標準曲線或藉由任一其他校準品)測定測試試樣中之分析物或其片段之濃度。 在一實施例中，使用化學發光微粒免疫分析，特定而言係採用ARCHITECT®自動化分析儀(Abbott實驗室，Abbott Park, IL)者。 在一些實施例中，本揭示內容提供採用質譜之方法且包含但不限於MALDI (基質輔助之雷射解吸/電離)及SELDI (表面增強之雷射解吸/電離)。 熟習此項技術者熟知使用免疫分析及質譜收集、處置、處理及分析生物測試試樣之方法且提供用於實踐本揭示內容(US 2009-0311253 A1)。B. 套組 在各種實施例中，亦提供用於分析測試試樣之至少一種分析物或其片段在測試試樣中之存在、量及/或濃度之套組。在一些實施例中，該套組包括至少一種用於分析測試試樣之分析物或其片段之組份及關於分析測試試樣之抗原或其片段之說明書。至少一種用於分析測試試樣之分析物或其片段之組份可包含含有如本文所揭示結合蛋白及/或其片段、變體或變體片段之組合物。在一些實施例中，視情況將組份固定於固相上。 視情況，在一些實施例中，該套組可包括校準品或對照，其可包括經分離或純化之分析物。在某些實施例中，該套組可包括至少一種用於藉由免疫分析及/或質譜分析測試試樣之分析物之組份。可視情況使用任一業內已知可檢測標記來標記套組組份(包含分析物、結合蛋白及/或抗分析物結合蛋白或其片段)(US 2009-0311253 A1)。C. 自動化 在各種實施例中，測定至少一種分析物在測試試樣中之存在、量及/或濃度之套組(或其組份)及方法可適用於各種自動化及半自動化系統(如(例如)美國專利第5,089,424號及第5,006,309號中所闡述且在商業上(例如)由Abbott實驗室(Abbott Park, IL)以ARCHITECT®形式出售者)。 可與結合蛋白一起使用之其他自動化或半自動化平臺包含但不限於AxSYM®、IMx® (例如參見美國專利第5,294,404號)、PRISM®、EIA (珠粒)及Quantum™ II (皆來自Abbott實驗室)以及其他業內已知平臺。另外，分析、套組及套組組份可以其他形式用於(例如)電化學及/或其他手持式或定點照護分析系統上。舉例而言，本揭示內容適用於實施夾心式免疫分析之商業Abbott Point of Care (i-STAT®, Abbott Laboratories)電化學免疫分析系統。免疫感測器及其在單用測試裝置中之製造及操作方法闡述於(例如)美國專利第5,063,081號、第7,419,821號及第7,682,833號及美國公開案第20040018577號、第20060160164號及第US 20090311253號中。 彼等熟習此項技術者將易於明瞭，本文所闡述方法之其他適宜修改及改變顯而易見且可使用適宜等效形式作出，此並不背離本文所揭示實施例之範圍。現在詳細闡述某些實施例之後，藉由參照下列實例將更明確地理解本發明，該等實例僅出於闡釋目而包含且並不意欲具有限制性。實例 實例 1 ： 抗 -DLL4/ 抗 -VEGF DVD 分子之構築 使用來自人類化抗-DLL4 mAb (h1A11.1)及抗-VEGF mAb (Av)之可變區域序列來設計抗-DLL4/抗-VEGF DVD分子之VH及VL區域。使用兩步驟PCR來合成可變區。使用選殖載體之同源性側翼區及每一DVD可變對之間之連接體區來設計引物。實施細菌轉化以鑑別陽性純系且收穫構築體並純化以用於使用業內已知之標準方案實施哺乳動物轉化。 將重鏈及輕鏈之可變區域分別框架內選殖成突變體人類IgG1 (L234, 235A)重鏈及κ輕鏈恆定區以生成抗-DLL4/抗-VEGF DVD分子(表4)。表 4. 抗 -DLL4/ 抗 -VEGF DVD 構築體
DVD 名稱 重鏈 (HC) 輕鏈 (LC)
h1A11.1-LL-Av h1A11.1-L-Av HC h1A11.1-L-Av LC
h1A11.1-LS-Av h1A11.1-L-Av HC h1A11.1-S-Av LC
h1A11.1-SL-Av h1A11.1-S-Av HC h1A11.1-L-Av LC
h1A11.1-SS-Av h1A11.1-S-Av HC h1A11.1-S-Av LC
h1A11.1-GS10-Av h1A11.1-GS10-Av HC h1A11.1-GS10-Av LC
h1A11.1-GS14-Av h1A11.1-GS14-Av HC h1A11.1-GS14-Av LC
Av-LL-h1A11.1 Av-L-h1A11.1 HC Av-L-h1A11.1 LC
Av-LS-h1A11.1 Av-L-h1A11.1 HC Av-S-h1A11.1 LC
Av-SL-h1A11.1 Av-S-h1A11.1 HC Av-L-h1A11.1 LC
Av-SS-h1A11.1 Av-S-h1A11.1 HC Av-S-h1A11.1 LC
Av-GS6-h1A11.1 Av-GS6-h1A11.1 HC Av-GS6-h1A11.1 LC
Av-GS10-h1A11.1 Av-GS10-h1A11.1 HC Av-GS10-h1A11.1 LC
Av-GS14-h1A11.1 Av-GS14-h1A11.1 HC Av-GS14-h1A11.1 LC
實例 2 ： 抗 -DLL4/ 抗 -VEGF DVD 構築體之親和力測定 使用BIACORE分析(Biacore, Inc, Piscataway, NJ)評估DVDs結合至經純化之重組DLL4細胞外區域(ECD)或VEGF165 ，如在25℃於Biacore 2000、Biacore 3000或Biacore T100 (GE Healthcare, Piscataway, NJ)上基於表面電漿共振之測量所測定。對於DLL4結合動力測量而言，分析緩衝劑係HBS-EPB：10mM Hepes (pH 7.5)、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.005% Tween 20、0.1 mg/ml BSA (Sigma A7906)。對於VEGF結合動力測量而言，分析緩衝劑係HBS-EP+(3N01B)：10 mM Hepes (pH 7.5)、300 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05% Tween 20、0.1 mg/ml BSA (Sigma A7906)。舉例而言，使用標準胺偶合套組根據製造商說明書及程序以25 μg/ml將稀釋於10 mM乙酸鈉(pH 4.5)中之大約9000 RU山羊抗-人類Fc特異性多株抗體(Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL)直接固定於CM5研究級生物感測器晶片上。使用乙醇胺阻斷生物感測器表面上之未反應部分。對於動力分析而言，使用Scrubber 2 (BioLogic軟體)、Biacore Biaevaluation 4.0.1軟體或Biacore T100評估軟體將衍生自1:1 Langmuir結合模型之速率方程式同時擬合至多個抗原注射(使用整體擬合分析)。經純化之抗體稀釋於運行緩衝劑中以捕獲於山羊抗-人類Fc反應表面上。欲捕獲作為配體之抗體(1 ug/ml)以10 ul/min之流速注射於反應基質上。在分析期間，所有測量僅參照捕捉表面(亦即並無捕獲抗體)。在80 ul/min之連續流速下測定締合及解離速率常數K結合 (M-1 s-1 )及K解離 (s-1 )。速率常數係以1.23 – 900 nM範圍之不同抗原濃度以3倍稀釋系列實施動力結合測量來衍生，且包含僅緩衝劑之注射(用於雙重參照)。然後由動力速率常數藉由下式：KD =K解離 /K結合 計算抗體與靶抗原之間反應的平衡解離常數KD (M)。結合係以時間函數記錄，並計算動力速率常數。在此分析中，可測得結合速率快如106 M-1 s-1 且解離速率慢如10-6 s-1 。抗-DLL4/抗-VEGF DVDs之抗原結合親和力匯總於表5及6中。表 5. 抗 -DLL4/ 抗 -VEGF DVD 結合蛋白之 Biacore 動力學
DVD 名稱 BIAcore 人類 DLL4529 BIAcore 人類 VEGF165
K結合 (M-1 s-1 ) K解離 (s-1 ) KD (M) K結合 (M-1 s-1 ) K解離 (s-1 ) KD (M)
Av N/A N/A N/A 1.19E+05 3.47E-05 2.9E-10
h1A11.1 1.60E+05 1.93E-03 1.2E-08 N/A N/A N/A
H1A11.1-LL-Av 2.05E+05 2.63E-03 1.2E-08 5.19E+04 2.44E-05 4.7E-10
H1A11.1-LS-Av 2.15E+05 2.36E-03 1.1E-08 2.26E+04 2.83E-05 1.3E-09
H1A11.1-SL-Av 2.17E+05 2.24E-03 1.0E-08 4.57E+04 3.20E-05 7.0E-10
H1A11.1-SS-Av 1.92E+05 2.25E-03 1.2E-08 7.32E+03 5.42E-05 7.4E-09
H1A11.GS10-Av 2.52E+05 2.33E-03 9.3E-09 1.92E+04 4.26E-05 2.2E-09
H1A11.1-GS14-Av 2.40E+05 2.33E-03 9.7E-09 2.87E+04 3.72E-05 1.3E-09
Av-GS6-h1A11.1 1.41E+04 7.03E-04 5.0E-08 1.94E+05 3.72E-05 1.9E-10
Av-GS10-h1A11.1 3.45E+04 1.01E-03 2.9E-08 1.84E+05 3.59E-05 1.9E-10
Av-GS14-h1A11.1 3.97E+04 1.34E-03 3.4E-08 1.82E+05 3.08E-05 1.7E-10
N/A：不適用表 6. h1A11.1-SL-Av DVD 之其他 Biacore 動力學
DVD 名稱 BIAcore 獼猴DLL4529 BIAcore 小鼠 DLL4530
K結合 (M-1 s-1 ) K解離 (s-1 ) KD (M) K結合 (M-1 s-1 ) K解離 (s-1 ) KD (M)
H1A11.1-SL-Av 4.43E+05 2.49E-03 5.6E-09 3.22E+05 7.74E-03 2.4E-08
實例 3 ： 抗 -DLL4/ 抗 -VEGF DVD 分子之活體外表徵 實例 3.1 ： 如藉由流式細胞測量術 (FACS) 所測定之 DLL4 結合活性 自組織培養燒瓶收穫過表現全長DLL4之穩定HEK293G細胞系，洗滌4次且再懸浮於含有1%牛血清白蛋白及1 mM CaCl2 之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS) (FACS緩衝劑)中。將1.5 × 105 個細胞與各種濃度之DVD結合蛋白在冰上於FACS緩衝劑中一起培育60分鐘。將細胞洗滌兩次且添加50 uL R-藻紅蛋白偶聯抗-大鼠IgG F(ab’)2 片段(FACS緩衝劑中之1:200稀釋液) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA,目錄編號：112-116-072)。在冰上培育(4℃，60分鐘)後，將細胞洗滌三次並再懸浮於FACS緩衝劑中。使用Becton Dickinson FACSCalibur-HTS (Becton Dickinson, San Jose, CA)來量測螢光。使用Graphpad Prism軟體來分析數據且將EC50 值報告為達成抗體至DLL4表現細胞之最大結合之50%之抗體濃度。實例 3.2 ： 如藉由 Notch-1 與可溶性 DLL4 細胞外區域之相互作用之抑制所測定之抗 -DLL4/ 抗 -VEGF DVD 蛋白的 DLL4 阻斷活性 使用16 nM人類Notch-1 (R&D Systems 3647-TK號，100 µl/孔，存於D-PBS中)塗覆96孔Nunc-Immuno板(439454號，用於huDLL4 ELISA)及96孔Costar板(9018號，用於muDLL4 ELISA)且在4℃下培育過夜。然後使用洗滌緩衝劑(PBS, 0.05% Tween-20)將板洗滌3次且使用200 µl/孔阻斷緩衝劑(D-PBS, 1% BSA, 1 mM CaCl2 , 0.05% Tween-20)在25℃下阻斷1小時。在阻斷的同時，將生物素標記之DLL4細胞外區域(14 nM)與抗體(30 pM-66 nM，存於阻斷緩衝劑中之3倍連續稀釋液)在25℃及振盪下混合1小時。在阻斷之後分析板洗滌，且與DLL4/抗體混合物一起培育(100 µl/孔，1小時，在25℃及振盪下)。再次洗滌板且經1小時在25℃及振盪下添加100 µl/孔之HRP偶聯鏈黴抗生物素蛋白(Fitzgerald  65R-S104PHRPx號，以1:5,000稀釋於阻斷緩衝劑中)。在最終洗滌之後，使用100 µl/孔基質(TMB Sigma T8665號)使板顯影，且使用100 µl/孔之1 N HCl來停止反應，且在450 nm下讀取吸光度。使用Graphpad Prism軟體來分析數據且將IC50 值報告為達成DLL4至Notch1之結合減小50%所需之抗體濃度。實例 3.3 ： 如藉由 DLL4 依賴性 Notch 活化之抑制使用 Notch 報告子分析所測定之抗 -DLL4/ 抗 -VEGF DVD 蛋白之 DLL4 阻斷活性 使用表現藉由Notch反應性啟動子驅動之螢光素酶之經改造EA.hy926細胞(7,000個細胞/孔)將96孔黑色透明底部組織培養板接種過夜。將自200 nM連續稀釋之抗體與等體積含有表現全長DLL4之HEK293G細胞(5,000個細胞/孔)之溶液混合15分鐘。將293G/DLL4細胞與EA.hy926 Notch報告子細胞在測試抗體存在下一起共培養24 hr。使用Promega基質(Promega E2940號)來分析螢光素酶活性。使用Graphpad Prism軟體來分析數據且將IC50 值報告為達成DLL4誘導之Notch活化減小50%所需之抗體濃度。實例 3.4 ： 如藉由捕獲 ELISA 所測定之抗 -DLL4/ 抗 -VEGF DVD 蛋白之 VEGF 結合活性 將ELISA板(Nunc, MaxiSorp, Rochester, NY)與抗-人類Fc抗體(5 µg/ml，存於PBS中，Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)一起在4℃下培育過夜。將板在洗滌緩衝劑(含有0.05% Tween 20之PBS)中洗滌三次，且在25℃下於阻斷緩衝劑(含有1% BSA之PBS)中阻斷1小時。將孔洗滌三次，且將每一抗體或DVD連續稀釋於含有0.1% BSA之PBS中，然後在25℃下培育1小時。將孔洗滌三次，且將生物素化VEGF (2 nM)添加至板中並在25℃下培育1小時。將孔洗滌三次，且然後在25℃下與鏈黴抗生物素蛋白-HRP (KPL 474-3000號，Gaithersburg, MD)一起培育1小時。將孔洗滌三次，且向各孔中添加100 µl ULTRA-TMB ELISA (Pierce, Rockford, IL)。在顯色後，使用1M HCl停止反應且量測450 nM下之吸光度。實例 3.5 ： 如藉由 VEGF 與 VEGFR1 之相互作用之抑制所測定之抗 -DLL4/ 抗 -VEGF DVD 蛋白的 VEGF 阻斷活性 將ELISA板(Nunc, MaxiSorp, Rochester, NY)與100 µl含有重組VEGFR1細胞外區域-Fc融合蛋白之PBS (5 µg/ml, R&D systems, Minneapolis, MN)一起在4℃下培育過夜。將板在洗滌緩衝劑(含有0.05% Tween 20之PBS)中洗滌三次，且在25℃下於阻斷緩衝劑(含有1% BSA之PBS)中阻斷1小時。將每一抗體及DVD連續稀釋於含有0.1% BSA之PBS中且與50 µl 2 nM生物素化VEGF在25℃下一起培育1小時。然後將抗體及生物素化VEGF或DVD及生物素化VEGF (100 µl)之混合物添加至VEGFR1-Fc塗覆孔中且在25℃下培育10分鐘。將孔洗滌三次，且然後與100 µl鏈黴抗生物素蛋白-HRP (KPL 474-3000號，Gaithersburg, MD)在25℃下一起培育1小時。將孔洗滌三次，且向各孔中添加100 µl ULTRA-TMB ELISA (Pierce, Rockford, IL)。在顯色後，使用1M HCl停止反應且量測450 nM下之吸光度。實例 3.6 ： 如藉由 VEGF 刺激之內皮細胞增殖 / 存活之抑制所測定之抗 -DLL4/ 抗 -VEGF DVD 蛋白的 VEGF 阻斷活性 在平鋪以用於分析之前，將TIME (ATCC)或HUVEC (2-6代)內皮細胞維持於補充有EGM-2 SingleQuots (Lonza-Clonetics, Walkersville, MD, CC-4176號)之EBM-2 (Lonza-Clonetics, Walkersville, MD)中。在不存在生長因子下，以10,000個細胞/孔將細胞平鋪於膠原塗覆之黑色96孔板上之100 µl含有0.1% FBS之EMB-2中。次日，在不存在生長因子下，使用0.1% FBS代替培養基。次日，使用100 µl EMB-2 (不含生長因子或血清)代替培養基且培育4小時，然後添加VEGF及抗體或DVD。將抗-VEGF單株抗體或DVD連續稀釋於含有0.1% BSA之EMB-2中且與重組人類VEGF165 (50 ng/ml) 在25℃下以50 µl一起預培育1小時。然後將抗體及VEGF或DVD及VEGF之混合物添加至細胞(50 µl)中，且將板在37℃下於增濕、5% CO2 氣氛中培育72小時。藉由使用ATPlite套組(Perkin Elmer, Waltham, MA)根據製造商說明書評估ATP含量來間接量測細胞存活/增殖。 如藉由上述分析所表徵之抗-DLL4/抗-VEGF DVD之活體外活性匯總於表7中。表 7. 抗 -DLL4/ 抗 -VEGF DVD 之活體外表徵
DVD 名稱 人類 DLL4 人類 VEGF
結合 功能阻斷 結合 功能阻斷
FACS EC50 (nM) Notch 競爭 ELISA IC50 (nM) Notch 活化 IC50 (nM) ELISA EC50 (nM) VEGFR1 競爭 ELISA IC50 (nM) 內皮細胞增殖 IC50 (nM)
Av-LL-h1A11.1    2.43            
Av-LS-h1A11.1    2.77            
Av-SL-h1A11.1    7.38            
Av-SS-h1A11.1    3503            
h1A11.1-LL-Av 5.04 0.79 4.56 0.12 3.8 0.42
h1A11.1-LS-Av 5 0.76 4.59 0.16 7.7 0.57
h1A11.1-SL-Av 4.35 1.09 5.34 0.55 3.8 0.61
h1A11.1-SS-Av 3.75 0.91 7.47 2.5 26 4.2
h1A11.1-GS10-Av    0.65    0.99 37.2 1.21
h1A11.1-GS14-Av    0.68    0.41 20.2 0.84
Av-GS6-h1A11.1    3.41    0.25 7.44 4.14
Av-GS10-h1A11.1    1.5    0.12 2.01 0.57
Av-GS14-h1A11.1    1.54    0.17 4.69 0.48
實例 4 ： 抗 -DLL4/ 抗 -VEGF DVD 之活體內藥物動力學結果 在獼猴(對於每一劑量組，n=2)及CD1小鼠(對於每一劑量組，n=6)於濃注靜脈內投與後評估h1A11.1-SL-Av DVD之藥物動力學性質。CD1小鼠及獼猴中之h1A11.1-SL-Av DVD藥物動力學特徵係傳統單株抗體之特性(表8)。表 8 ： 在濃注靜脈內投與之後之 h1A11.1-SL-Av DVD 之平均 PK 參數
物種 劑量 AUC Cmax Vss CL T1/2 MRT
小鼠 1 30.4 16.6 56.6 33.6 1.4 1.8
3 203.1 68.9 46.2 14.9 2.3 3.1
10 570.3 187.2 102.8 18.3 4.7 5.9
30 4488.1 496.2 94.4 6.8 9.8 13.7
猴 1 109.7 30.3 35.9 10.5 3.1 3.9
3 403.9 92.8 33.9 7.5 4.3 4.6
10 1957.1 395.1 35.9 5.1 5.0 7.1
30 8626.9 1344.4 27.0 3.7 5.5 7.8
劑量：mg/kg；AUC：自0至無窮大時間之濃度曲線下面積(d*ug/mL)；Cmax：在投藥後之第一觀察濃度(ug/mL)；Vss：分佈體積(mL/kg)；CL：清除率(mL/天/kg)；T1/2：終末半衰期(天)；MRT：自0至無窮大之平均滯留時間(天)。實例 5 ： 抗 -DLL4/ 抗 -VEGF DVD 之活體內抗腫瘤之效能 首先針對雌性無胸腺裸小鼠中之HT-29人類結腸直腸腺癌異種移植物腫瘤評估抗-DLL4/抗-VEGF DVD對於腫瘤生長之效應。簡言之，將2 × 106 個細胞經皮下接種至右後翼中。使腫瘤確立25天，此時使用電子卡尺量測且使用式：L × W2 /2來測定腫瘤體積。將小鼠分配至治療組中(n=10只/組)，從而每一小組在開始療法之前具有214 mm3 之相等平均腫瘤體積。經4週每週經腹膜腔內向動物投藥，且在實驗之持續時間內每週兩次量測腫瘤體積。結果展示於表9中。 隨後針對雌性SCID小鼠中之U87-MG人類神經膠質母細胞瘤異種移植物腫瘤評估抗-DLL4/抗-VEGF DVD對於腫瘤生長之效應。簡言之，將3 × 106 個細胞經皮下接種至右後翼中。使腫瘤確立17天，此時使用電子卡尺量測且使用式：L × W2 /2來測定腫瘤體積。將小鼠分配至治療組中(n=10只/組)，從而每一小組在開始療法之前具有221 mm3 之相等平均腫瘤體積。經4週每週經腹膜腔內向動物投藥，且在實驗之持續時間內每週兩次量測腫瘤體積。結果展示於表9中。表 9. 抗 -DLL4/ 抗 -VEGF DVD 在 HT-29 結腸直腸腺癌及 U87-MG 神經 膠質母細胞瘤異種移植物模型中之效能
HT-29 U87-MG
治療 劑量途徑，方案 TGI%a TGD%b TGI%c TGD%b
h1A11.1-LL-Av 6.7 mg/kg IP, q7d × 4 59** 42*** 74*** 100***
h1A11.1-LS-Av 6.7 mg/kg IP, q7d × 4 59** 42*** 77*** 124***
h1A11.1-SL-Av 6.7 mg/kg IP, q7d × 4 68*** 61*** 81*** 100***
h1A11.1-SS-Av 6.7 mg/kg IP, q7d × 4 47* 49* 64*** 48***
表9注釋：a.  TGI% =腫瘤生長抑制百分比= 100 – (T/C × 100)，其中T =治療組之平均腫瘤體積且C =治療對照組之平均腫瘤體積。基於大小匹配量測之後第29天。P值(如由星號所指示)係衍生自治療組對治療對照組之司徒登氏T測試(Student’s T test)對比。b.  TGD% =腫瘤生長延遲百分比= (T – C)/C × 100，其中T =治療組之中值至端點時間且C=治療對照組之中值至端點時間。基於1000 mm3 之端點。P值(如由星號所指示)係衍生自治療組對治療對照組之卡-梅氏對數秩(Kaplan Meier log-rank)對比。c. TGI% =腫瘤生長抑制百分比= 100 – (T/C × 100)，其中T =治療組之平均腫瘤體積且C =治療對照組之平均腫瘤體積。基於大小匹配量測之後第24天。P值(如由星號所指示)係衍生自治療組對治療對照組之司徒登氏T測試對比(* p ＜ 0.01，** p ＜ 0.001，*** p ＜ 0.0001)實例 6 ： 抗 -DLL4/ 抗 -VEGF DVD 之活體內組合效能 針對雌性SCID小鼠中之U87-MG人類神經膠質母細胞瘤異種移植物腫瘤評估抗-DLL4/抗-VEGF DVD與化學療法之組合對於腫瘤生長之效應。簡言之，將3 × 106 個細胞經皮下接種至右後翼中。使腫瘤確立22天，此時使用電子卡尺量測且使用式：L × W2 /2來測定腫瘤體積。將小鼠分配至治療組中(n=10只/組)，從而每一小組在開始療法之前具有207 mm3 之相等平均腫瘤體積。經腹膜腔內向動物投用單一劑量之替莫唑胺®及/或4個週劑量之抗-DLL4/抗-VEGF DVD，且在實驗之持續時間內每週兩次量測腫瘤體積。結果展示於表10中。表 10. 抗 -DLL4/ 抗 -VEGF DVD 及替莫唑胺在 U87-MG 神經 膠質母細胞瘤異種移植物模型中之組合效能
治療 劑量途徑，方案 %TGIa %TGDb
替莫唑胺 5 mg/kg IP, qdX1 65*** 45***
h1A11.1-SL-Av 6.7 mg/kg IP, q7d × 4 69*** 100***
替莫唑胺+ h1A11.1-SL-Av 5 mg/kg IP, qdX1 + 6.7 mg/kg IP, q7d × 4 78*** 147***
表10注釋：a.  TGI% =腫瘤生長抑制百分比= 100 – (T/C × 100)，其中T =治療組之平均腫瘤體積且C =治療對照組之平均腫瘤體積。基於大小匹配量測之後第19天。P值(如由星號所指示)係衍生自治療組對治療對照組之司徒登氏T測試對比。b.  TGD% =腫瘤生長延遲百分比= (T – C)/C × 100，其中T =治療組之中值至端點時間且C=治療對照組之中值至端點時間。基於1000 mm3 之端點。P值(如由星號所指示)係衍生自治療組對治療對照組之卡-梅氏對數秩對比(* p ＜ 0.01，** p ＜ 0.001，*** p ＜ 0.0001)實例 7 ： 抗 -DLL4/ 抗 -VEGF DVD 之 預調配 表徵 在下文所列示之調配物及蛋白質濃度中評估抗-DLL4/抗-VEGF DVD (h1A11.1-SL-Av)之儲存穩定性(5℃)及加速穩定性(40℃)。藉由尺寸排除層析(SE-HPLC)評估穩定性且量化聚集物%、單體%、片段%及所回收全部物質。總而言之，調配物覆蓋5至7之pH範圍及1.0 mg/ml至118 mg/ml之蛋白質濃度範圍。 在5℃及40℃溫度及50 mg/ml、30 mg/ml及10 mg/ml之蛋白質濃度下，調配物為：15 mM乙酸鹽，pH 5；15 mM磷酸鹽，pH 7；30 mM乙酸鹽，80 mg/ml蔗糖，0.02% Tween 80，pH 5；30 mM組胺酸，80 mg/ml蔗糖，0.02% Tween 80，pH 6；PBS (磷酸鹽緩衝鹽水)。所有調配物皆含有0.02%疊氮化鈉以防止在儲存期間之微生物生長。在5℃及40℃溫度及60 mg/ml、50 mg/ml、30 mg/ml及10 mg/ml之蛋白質濃度下，調配物為15 mM pH 6組胺酸(亦含有0.02%疊氮化鈉以防止在儲存期間之微生物生長)。在5℃及118 mg/ml之蛋白質濃度下，調配物為15 mM pH 6組胺酸(亦含有0.02%疊氮化鈉以防止在儲存期間之微生物生長)。在40℃及1.0 mg/ml之蛋白質濃度下，調配物為10 mM檸檬酸鹽+ 10 mM磷酸鹽(pH 5、pH 6、pH 7)。過濾含有蛋白質之調配物以去除可能之微生物。 藉由使調配物中之蛋白質經受4個冷凍(在-80℃下，至少20小時)及解凍(在30℃水浴中)之循環來實施冷凍-解凍穩定性測試。測試冷凍-解凍穩定性之調配物列示於下文中。藉由SE-HPLC評估穩定性且量化聚集物%、單體%、片段%及所回收全部物質。調配物為15 mM組胺酸(pH 6，在60 mg/ml蛋白質下，亦含有0.02%疊氮化鈉以防止微生物生長)及10 mM檸檬酸鹽+ 10 mM磷酸鹽(在pH 5、pH 6、pH 7及1.0 mg/ml蛋白質下，過濾以去除可能之微生物)。 最後，在10 mM檸檬酸鹽+ 10 mM磷酸鹽緩衝劑中於pH 5、pH 6、pH 7及1.0 mg/ml蛋白質下對蛋白質實施差示掃描熱量測定以量測熱穩定性。量化每一蛋白質區域之展開起始溫度及展開中點溫度(Tm)。表 11 ： h1A11.1-SL-Av 在不同濃度及不同緩衝劑、賦形劑及 pH 下之 40 ℃ 下 加速穩定性
蛋白質濃度(mg/ml) 時間 溫度(℃) 緩衝劑 pH 聚集物% 單體% 片段% 總面積
--- 透析前 --- --- --- 2.71 96.31 0.98 53058
50, 30, 10 T0 --- ace 5 2.89 96.08 1.03 48033
50, 30, 10 T0 --- his 6 2.81 96.23 0.96 46995
50, 30, 10 T0 --- phos 7 2.91 96.09 1.00 52571
50, 30, 10 T0 --- ace-suc-tw 5 2.54 96.50 0.96 50185
50, 30, 10 T0 --- his-suc-tw 6 2.37 96.62 1.01 50771
50, 30, 10 T0 --- PBS 7 2.90 96.08 1.01 49170
50 T7d 40 ace 5 5.19 93.32 1.49 49028
30 T7d 40 ace 5 3.86 94.68 1.47 48171
10 T7d 40 ace 5 2.60 95.97 1.43 48379
50 T7d 40 his 6 5.25 93.46 1.29 47731
30 T7d 40 his 6 4.13 94.58 1.29 46684
10 T7d 40 his 6 2.73 95.84 1.42 46877
50 T7d 40 phos 7 9.02 89.52 1.46 53429
30 T7d 40 phos 7 6.11 92.40 1.49 51923
10 T7d 40 phos 7 3.94 94.57 1.49 53098
50 T7d 40 ace-suc-tw 5 5.42 92.85 1.73 50373
30 T7d 40 ace-suc-tw 5 4.07 94.06 1.87 48768
10 T7d 40 ace-suc-tw 5 2.66 95.20 2.14 49396
50 T7d 40 his-suc-tw 6 3.44 95.02 1.54 50040
30 T7d 40 his-suc-tw 6 4.16 94.14 1.70 48715
10 T7d 40 his-suc-tw 6 2.86 95.24 1.90 49871
50 T7d 40 PBS 7 8.13 90.28 1.60 49207
30 T7d 40 PBS 7 5.82 92.55 1.63 48853
10 T7d 40 PBS 7 3.62 94.82 1.56 48166
50 T21d 40 ace 5 6.65 90.83 2.51 48536
30 T21d 40 ace 5 4.55 92.91 2.54 48520
10 T21d 40 ace 5 2.71 94.70 2.59 48395
50 T21d 40 his 6 7.01 90.71 2.27 46729
30 T21d 40 his 6 4.69 93.10 2.21 46687
10 T21d 40 his 6 2.77 94.93 2.30 46866
50 T21d 40 phos 7 13.39 83.83 2.78 52244
30 T21d 40 phos 7 9.38 87.76 2.86 53556
10 T21d 40 phos 7 4.77 92.32 2.91 52536
50 T21d 40 ace-suc-tw 5 6.37 90.34 3.30 48268
30 T21d 40 ace-suc-tw 5 4.27 91.91 3.82 47211
10 T21d 40 ace-suc-tw 5 2.26 93.02 4.72 46322
50 T21d 40 his-suc-tw 6 6.84 89.82 3.34 47140
30 T21d 40 his-suc-tw 6 4.60 91.90 3.50 47416
10 T21d 40 his-suc-tw 6 2.67 93.66 3.67 48166
50 T21d 40 PBS 7 12.13 84.81 3.06 49845
30 T21d 40 PBS 7 8.09 88.78 3.13 48108
10 T21d 40 PBS 7 4.20 92.63 3.17 48803
緩衝劑注釋(所以緩衝劑皆含有0.02%疊氮化鈉以防止微生物生長)：ace = 15 mM pH 5乙酸鹽；his = 15 mM pH 6組胺酸；phos = 15 mM pH 7磷酸鹽ace-suc-tw = 30 mM乙酸鹽、80 mg/ml蔗糖、0.02% Tw80his-suc-tw = 30 mM組胺酸、80 mg/ml蔗糖、0.02% Tw80PBS =磷酸鹽緩衝鹽水表 12. h1A11.1-SL-Av 在不同濃度及不同緩衝劑、賦形劑及 pH 下之 5 ℃ 下儲存穩定性 ( 緩衝劑注釋與表 11 中相同 )
蛋白質濃度 (mg/ml) 時間 溫度 ( ℃ ) 緩衝劑 pH 聚集物 % 單體 % 片段 % 總面積
--- 透析前 --- --- --- 2.71 96.31 0.98 53058
50, 30, 10 T0 --- ace 5 2.89 96.08 1.03 48033
50, 30, 10 T0 --- his 6 2.81 96.23 0.96 46995
50, 30, 10 T0 --- phos 7 2.91 96.09 1.00 52571
50, 30, 10 T0 --- ace-suc-tw 5 2.54 96.50 0.96 50185
50, 30, 10 T0 --- his-suc-tw 6 2.37 96.62 1.01 50771
50, 30, 10 T0 --- PBS 7 2.90 96.08 1.01 49170
50 T7d 5 ace 5 2.96 95.99 1.05 49118
30 T7d 5 ace 5 2.74 96.21 1.06 48434
10 T7d 5 ace 5 2.62 96.23 1.15 48915
50 T7d 5 his 6 2.93 95.87 1.20 47967
30 T7d 5 his 6 2.75 96.06 1.19 47182
10 T7d 5 his 6 2.55 96.31 1.13 47395
50 T7d 5 phos 7 3.15 95.64 1.21 53843
30 T7d 5 phos 7 3.10 95.76 1.14 53372
10 T7d 5 phos 7 2.91 95.96 1.13 53269
50 T7d 5 ace-suc-tw 5 2.75 96.13 1.12 50236
30 T7d 5 ace-suc-tw 5 2.62 96.11 1.27 50026
10 T7d 5 ace-suc-tw 5 2.56 96.18 1.26 49290
50 T7d 5 his-suc-tw 6 2.84 96.10 1.07 50129
30 T7d 5 his-suc-tw 6 2.58 96.19 1.23 49272
10 T7d 5 his-suc-tw 6 2.64 96.08 1.28 50926
50 T7d 5 PBS 7 3.26 95.59 1.15 49502
30 T7d 5 PBS 7 3.07 95.64 1.29 49724
10 T7d 5 PBS 7 2.83 95.87 1.29 49563
50 T21d 5 ace 5 2.57 95.76 1.67 49722
30 T21d 5 ace 5 2.37 96.03 1.60 48882
10 T21d 5 ace 5 2.22 96.09 1.69 49255
50 T21d 5 his 6 2.63 95.63 1.74 44884
30 T21d 5 his 6 2.42 95.95 1.62 47510
10 T21d 5 his 6 2.19 96.08 1.73 47015
50 T21d 5 phos 7 3.06 94.96 1.98 53449
30 T21d 5 phos 7 2.69 95.46 1.85 52938
10 T21d 5 phos 7 2.35 95.84 1.81 52703
50 T21d 5 ace-suc-tw 5 2.25 95.76 1.99 50960
30 T21d 5 ace-suc-tw 5 2.08 95.90 2.02 49042
10 T21d 5 ace-suc-tw 5 1.97 95.84 2.19 49851
50 T21d 5 his-suc-tw 6 2.24 95.62 2.14 49983
30 T21d 5 his-suc-tw 6 2.09 95.86 2.05 48813
10 T21d 5 his-suc-tw 6 1.97 95.83 2.19 49984
50 T21d 5 PBS 7 2.84 95.07 2.09 50641
30 T21d 5 PBS 7 2.27 95.62 2.12 48441
10 T21d 5 PBS 7 1.99 95.94 2.07 48978
50 T10mo 5 his 6 8.05 91.04 0.91 45552
30 T10mo 5 his 6 5.81 93.29 0.90 46607
10 T10mo 5 his 6 3.62 95.46 0.92 46207
50 T10mo 5 his-suc-tw 6 8.08 90.26 1.67 45430
30 T10mo 5 his-suc-tw 6 5.98 92.43 1.58 42967
10 T10mo 5 his-suc-tw 6 3.95 94.25 1.80 42567
表 13. h1A11.1-SL-Av 在不同濃度及不同緩衝劑及 pH 下之 5 ℃ 下儲存穩定性、 40 ℃ 下加速穩定性及冷凍 - 解凍穩定性
蛋白質濃度 (mg/ml) 時間 /FT 溫度 ( ℃ ) 緩衝劑 pH 聚集物 % 單體 % 片段 % 總面積
1 T0 --- cit-phos 5 7.07 92.14 0.80 46824
1 T8d 40 cit-phos 5 2.23 96.39 1.38 47090
1 T22d 40 cit-phos 5 7.10 89.62 3.28 47956
1 FT2 --- cit-phos 5 7.91 90.75 1.34 46502
1 FT4 --- cit-phos 5 7.41 92.18 0.41 52181
                          
1 T0 --- cit-phos 6 7.17 92.33 0.50 45809
1 T8d 40 cit-phos 6 2.56 96.03 1.42 46783
1 T22d 40 cit-phos 6 5.79 91.73 2.48 47401
1 FT2 --- cit-phos 6 7.14 91.48 1.38 45256
1 FT4 --- cit-phos 6 7.09 92.56 0.34 45004
                          
1 T0 --- cit-phos 7 6.82 92.67 0.51 47025
1 T8d 40 cit-phos 7 2.52 95.95 1.53 48080
1 T22d 40 cit-phos 7 5.52 91.58 2.90 48706
1 FT2 --- cit-phos 7 7.23 91.52 1.25 46732
1 FT4 --- cit-phos 7 7.15 92.49 0.36 46561
                          
60及118 T0 --- his 6 8.03 91.15 0.82 43528
60 T7d 40 his 6 7.17 91.76 1.07 45333
60 T21d 40 his 6 15.77 82.13 2.10 44729
60 T7d 5 his 6 3.83 95.32 0.86 46774
60 T26d 5 his 6 7.14 92.56 0.30 63982
118 T5mo 5 his 6 12.82 86.65 0.53 55869
60 T5mo 5 his 6 9.46 90.03 0.51 64573
60 FT2 --- his 6 6.71 92.59 0.70 42259
60 FT4 --- his 6 6.33 93.62 0.05 41054
注釋：FT =冷凍解凍FT2 =在兩個冷凍及解凍循環之後分析；在-80℃下冷凍且在30℃水浴中解凍FT4 =在4個冷凍及解凍循環之後分析；在-80℃下冷凍且在30℃水浴中解凍cit-phos = 10 mM檸檬酸鹽+ 10 mM磷酸鹽his = 15 mM組胺酸+ 0.02%疊氮化鈉(疊氮化物用於防止微生物生長)表 14. h1A11.1-SL-Av 在 1 mg/ml 下於 10 mM 檸檬酸鹽 + 10 mM 磷酸鹽中在不同 pH 下之差示掃描熱量測定數據
pH 起始(℃) Tm1 (℃) Tm2 (℃) Tm3 (℃) Tm4 (℃)
5 55 68.2 68.86 75.56 81.18
6 58 69.04 70.47 75.24 82.04
7 59 69.52 70.94 74.44 82.06
實例 8 ： 抗 -DLL4/ 抗 -VEGF DVD 之調配物選擇 材料及方法 。在表15中所列示之6種調配物中評估抗-DLL4/抗-VEGF DVD-Ig h1A11.1-SL-Av蛋白之穩定性。所有調配物皆係在15 mM組胺酸緩衝劑中製得。調配物F1至F4下在50 mg/mL蛋白質濃度下製得。在該等調配物中，pH介於5.5至6.0之間，聚山梨醇酯80濃度介於0至0.05% w/v之間，蔗糖濃度介於0至7.5% w/v之間，且精胺酸濃度介於0至1% w/v之間。調配物F4係在15 mM組胺酸緩衝劑中於pH 6.0下在並無任一穩定劑下製得且用作50 mg/mL液體調配物穩定性評估之研究對照。此外，在25 mg/mL蛋白質濃度及pH 6.0下製備兩種調配物(調配物F5及F6)。該兩種調配物中之聚山梨醇酯80及蔗糖之組成略有不同；聚山梨醇酯80之濃度介於0.025% w/v至0.03% w/v之間且蔗糖之濃度介於3.8% w/v至4% w/v之間。調配物F1至F5使用來自早期製備製程之材料，而F6調配物係使用來自較優化製程之材料調配。調配物F5及F6之組成極為類似，但在二者之間觀察到穩定性差異。因組合物係自不同製程製得，故此可為所觀察穩定性差異之原因。表 15. 調配物組成描述
調配物名稱 抗 -DLL4/ 抗 -VEGF DVD 濃度 (mg/mL) 緩衝劑 pH 聚山梨醇酯80 (Tween 80) (% w/v) 蔗糖 (% w/v) 精胺酸 (% w/v)
F1 50 15 mM組胺酸 6.0 0.05 7.5 0
F2 50 15 mM組胺酸 5.5 0.05 7.5 0
F3 50 15 mM組胺酸 6.0 0.05 7.5 1
F4 50 15 mM組胺酸 6.0 0 0 0
F5 25 15 mM組胺酸 6.0 0.025 3.8 0
F6 25 15 mM組胺酸 6.0 0.03 4.0 0
在上述調配物中，選擇15 mM組胺酸緩衝劑，此乃因其提供適當緩衝能力以維持目標調配物pH。針對冷凍-解凍應力(冷凍保護劑)及凍乾製程誘導之應力(凍乾保護劑)來評估作為穩定劑之蔗糖。添加聚山梨醇酯80 (表面活性劑)及精胺酸以潛在地針對聚集物及微粒形成來穩定調配物。 在冷凍/解凍期間且在-80℃、5℃、25℃及40℃下藉由寬範圍之分析型分析來評估液體調配物之穩定性，該等分析型分析包含可見外觀、聚集物% (藉由尺寸排除層析(SE-HPLC))、電荷異質性(藉由陽離子交換層析(CEX-HPLC))、分段(藉由還原性SDS毛細管電泳CE-SDS))及亞可見顆粒(藉由微流成像(MFI))或不透光度(HIAC)。該等結果提供於表16-19中。表 16. -80 ℃ 下之冷凍 - 解凍及液體調配物穩定性結果
調配物名稱 時間 ( 月數 ) 可見外觀 聚集物 % ， SE-HPLC CEX-HPLC 純度 % ( 還原性 CE-SDS) 亞可見 顆粒 計數， MFI/HIAC 結合效力， ELISA
酸性區 % 主峰 % 鹼性區 % ≥2 µm/mL ≥10 µm/mL ≥25 µm/mL DLL4% VEGF%
F1 0 EFVP 1.0 21.6 61.7 16.7 97.7 3333 5 0 93 113
3FT EFVP 1.1 21.5 61.8 16.6 97.7 2388 50 5 NP NP
1 EFVP 1.1 21.0 62.1 16.8 97.8 1364 15 5 NP NP
3 EFVP 1.1 21.0 62.3 16.6 97.6 714 20 0 NP NP
F2 0 EFVP 1.3 21.4 61.8 16.8 97.5 1589 15 0 93 113
3FT EFVP 1.3 21.4 61.8 16.9 97.6 435 5 5 NP NP
1 EFVP 1.4 21.0 62.0 17.0 97.8 315 0 0 NP NP
3 EFVP 1.5 20.9 61.9 17.2 97.7 699 5 0 NP NP
F3 0 EFVP 1.1 21.5 61.7 16.7 97.6 784 0 0 93 113
3FT EFVP 1.1 21.3 61.8 16.9 97.5 490 10 0 NP NP
1 EFVP 1.1 21.0 61.9 17.1 97.9 250 0 0 NP NP
3 EFVP 1.2 21.0 61.8 17.2 97.7 1219 35 0 NP NP
F4 0 EFVP 1.2 21.6 61.8 16.6 97.4 23707 370 5 93 113
3FT TMTC 1.5 21.4 61.8 16.8 97.4 105467 5906 30 NP NP
1 TMTC 1.2 21.1 62.0 16.9 97.8 42024 1329 60 NP NP
3 TMTC 1.5 21.1 61.9 17.0 97.8 40065 3203 625 NP NP
F5 0 EFVP 0.9 21.6 61.6 16.7 97.7 2808 5 5 93 113
3FT EFVP 1.2 21.5 61.8 16.8 97.6 1949 0 0 NP NP
1 EFVP 1.1 21.0 62.2 16.8 97.8 270 5 0 NP NP
3 EFVP 1.1 21.0 62.2 16.8 97.6 759 0 0 NP NP
F6 0 EFVP 1.0 21.6 56.4 22.0 98.1 426 58 1 109 97
3FT EFVP 1.1 21.7 55.9 22.4 98.2 193 24 0 115 100
1 EFVP 1.0 21.6 55.8 22.7 98.2 50 3 0 NP NP
3 EFVP 1.1 22.0 55.9 22.1 98.3 254 31 0 89 96
注釋：EFVP：基本上不含可見顆粒，TMTC：過多以致難以計數，NP：未實施表 17. 5 ℃ 下之液體調配物穩定性結果
調配物名稱 時間 ( 月數 ) 可見外觀 聚集物 % ， SE-HPLC CEX-HPLC 純度 % ( 還原性 CE- SDS) 亞可見顆粒計數， MFI/HIAC 結合效力， ELISA
酸性區 % 主峰 % 鹼性區 % ≥2 µm/mL ≥10 µm/mL ≥25 µm/mL DLL4% VEGF%
F1 0 EFVP 1.0 21.6 61.7 16.7 97.7 3333 5 0 93 113
1 EFVP 2.0 21.2 62.4 16.3 97.8 1064 0 0 NP NP
3 EFVP 3.0 21.6 62.5 15.9 97.6 3452 15 0 NP NP
F2 0 EFVP 1.3 21.4 61.8 16.8 97.5 1589 15 0 93 113
1 EFVP 2.1 20.9 62.3 16.8 97.8 230 5 5 NP NP
3 EFVP 3.0 21.1 62.5 16.3 97.8 1454 0 0 NP NP
F3 0 EFVP 1.1 21.5 61.7 16.7 97.6 784 0 0 93 113
1 EFVP 2.0 20.8 62.0 17.2 97.8 225 5 0 NP NP
3 EFVP 3.2 20.8 61.1 18.1 97.6 1369 5 0 NP NP
F4 0 EFVP 1.2 21.6 61.8 16.6 97.4 23707 370 5 93 113
1 EFVP 2.0 21.3 62.3 16.5 97.8 1189 0 0 NP NP
3 EFVP 3.3 21.6 62.6 15.8 97.8 6046 145 0 NP NP
F5 0 EFVP 0.9 21.6 61.6 16.7 97.7 2808 5 5 93 113
1 EFVP 1.5 21.2 61.9 16.8 97.8 709 10 0 NP NP
3 EFVP 2.2 21.4 62.4 16.1 97.6 3203 50 0 NP NP
F6* 0 EFVP 1.0 21.6 57.0 21.5 98.1 426 58 1 109 97
1 EFVP 1.1 21.6 55.9 22.5 98.1 2458 164 1 116 99
3 EFVP 1.2 22.4 55.9 21.7 98.0 34 1 0 101 100
注釋：EFVP：基本上不含可見顆粒，NP：未實施表 18. 25 ℃ 下之液體調配物穩定性結果
調配物名稱 時間 ( 月數 ) 可見外觀 聚集物 % ， SE-HPLC CEX-HPLC 純度 % ( 還原性 CE-SDS) 亞可見顆粒計數， MFI/HIAC 結合效力， ELISA
酸性區 % 主峰 % 鹼性區 % ≥2 µm/mL ≥10 µm/mL ≥25 µm/mL DLL4% VEGF%
F1 0 EFVP 1.0 21.6 61.7 16.7 97.7 3333 5 0 93 113
1 EFVP 4.3 23.5 62.2 14.2 97.4 1559 5 5 NP NP
3 EFVP 6.7 29.2 57.0 13.9 96.3 9358 964 150 NP NP
F2 0 EFVP 1.3 21.4 61.8 16.8 97.5 1589 15 0 93 113
1 EFVP 4.4 22.8 61.6 15.6 97.4 1149 5 0 NP NP
3 EFVP 7.1 27.2 56.6 16.2 95.4 6170 95 0 NP NP
F3 0 EFVP 1.1 21.5 61.7 16.7 97.6 784 0 0 93 113
1 EFVP 4.9 21.5 58.3 20.2 97.3 834 10 0 NP NP
3 EFVP 9.3 24.7 52.2 23.0 96.4 3677 150 10 NP NP
F4 0 EFVP 1.2 21.6 61.8 16.6 97.4 23707 370 5 93 113
1 EFVP 4.5 23.5 61.8 14.7 97.2 89299 3053 165 NP NP
3 EFVP 7.5 28.6 57.4 14.1 96.6 10527 1279 275 NP NP
F5 0 EFVP 0.9 21.6 61.6 16.7 97.7 2808 5 5 93 113
1 EFVP 2.6 23.5 62.0 14.6 97.2 944 15 0 NP NP
3 EFVP 3.9 29.4 57.7 12.9 96.2 13575 1259 225 NP NP
F6 0 EFVP 1.0 21.6 57.0 21.5 98.1 426 58 1 109 97
1 EFVP 1.2 23.5 54.8 21.7 97.7 386 50 0 100 96
3 EFVP 1.6 28.8 52.5 18.7 96.2 40 1 0 94 100
注釋：EFVP：基本上不含可見顆粒，NP：未實施表 19. 40 ℃ 下之液體調配物穩定性結果
調配物名稱 時間 ( 月數 ) 可見外觀 聚集物 % ， SE-HPLC CEX-HPLC 純度 % ( 還原性 CE-SDS) 亞可見顆粒計數， MFI/HIAC 結合效力， ELISA
酸性區 % 主峰 % 鹼性區 % ≥2 µm/mL ≥10 µm/mL ≥25 µm/mL DLL4% VEGF%
F1 0 EFVP 1.0 21.6 61.7 16.7 97.7 3333 5 0 93 113
1 EFVP 7.2 35.8 43.0 21.2 95.0 1219 15 0 94 104
3 EFVP 12.8 57.0 23.0 20.0 85.9 21464 635 30 73 72
F2 0 EFVP 1.3 21.4 61.8 16.8 97.5 1589 15 0 93 113
1 EFVP 7.9 33.8 40.9 25.3 95.1 655 5 0 95 97
3 EFVP 13.3 52.8 22.7 24.5 86.7 6041 90 0 68 73
F3 0 EFVP 1.1 21.5 61.7 16.7 97.6 784 0 0 93 113
1 EFVP 11.3 32.1 42.3 25.6 95.0 1464 5 0 97 101
3 EFVP 18.1 48.6 25.2 26.2 86.3 9103 165 15 81 72
F4 0 EFVP 1.2 21.6 61.8 16.6 97.4 23707 370 5 93 113
1 EFVP 7.7 34.9 44.2 20.9 94.8 61754 5051 670 101 97
3 EFVP 13.5 52.8 25.9 21.4 86.3 14000 1729 480 73 76
F5 0 EFVP 0.9 21.6 61.6 16.7 97.7 2808 5 5 93 113
1 EFVP 3.9 37.0 44.4 18.6 95.0 974 20 0 92 95
3 EFVP 7.4 59.6 24.5 15.9 87.0 11836 610 55 68 69
F6 0 EFVP 1.0 21.6 56.4 22.0 98.1 426 58 1 109 97
1 EFVP 1.9 35.0 42.8 22.2 94.5 60 0 0 96 95
注釋：EFVP：基本上不含可見顆粒凍乾調配物穩定性測試 。亦在凍乾調配物之後評估含有結合蛋白h1A11.1-SL-Av之所選調配物之穩定性。評估所有含蔗糖調配物(F1、F2、F3、F5及F6)之凍乾藥物產物穩定性。在55℃下儲存2週之後評估穩定性。藉由寬範圍之分析型分析來測試穩定性，該等分析型分析包含可見外觀(在重構之前及之後)、重構時間、聚集物%(藉由尺寸排除層析(SE-HPLC))、電荷異質性(藉由陽離子交換層析(CEX-HPLC))、分段(藉由還原性SDS毛細管電泳(CE-SDS))、亞可見顆粒(藉由微流成像(MFI))或不透光度(HIAC)及水含量(藉由卡爾-費希爾滴定(Karl Fischer titration))。 凍乾調配物穩定性測試結果提供於表20中。所有評估調配物之重構時間大約為1分鐘至2分鐘。所有調配物在55℃受激儲存條件下皆觀察到SEC聚集及CEX鹼性區%略有增加。在所有其他量測產物穩定性屬性中觀察到最小變化。表 20. 55 ℃ 下之凍乾調配物穩定性結果
調配物名稱 時間 ( 月數 ) 可見外觀 聚集物 % ， SE-HPLC CEX-HPLC 純度 % ( 還原性 CE-SDS) 亞可見顆粒計數， MFI/HIAC
在重構 之前 在重構之後 酸性區 % 主峰 % 鹼性區 % ≥2 µm/mL ≥10 µm/mL ≥25 µm/mL
F1 0 WTOWC EFVP 1.1 21.3 61.9 16.8 97.6 749 20 10
2週，在55℃下 WTOWC EFVP 1.6 20.6 58.1 21.3 97.5 1639 15 0
F2 0 WTOWC EFVP 1.3 21.2 61.8 17.0 97.6 1254 15 0
2週，在55℃下 WTOWC EFVP 2.0 20.4 57.8 21.8 97.6 1609 10 0
F3 0 WTOWC EFVP 1.1 21.2 61.9 16.9 97.6 719 5 0
2週，在55℃下 WTOWC EFVP 1.4 20.8 59.5 19.8 97.5 475 10 5
F5 0 WTOWC EFVP 1.0 21.3 61.8 16.9 97.5 844 35 5
2週，在55℃下 WTOWC EFVP 1.5 20.5 58.0 21.5 97.7 270 5 0
F6 0 WTOWC EFVP 1.0 21.5 56.5 22.0 98.2 205 7 0
2週，在55℃下 WTOWC EFVP 1.5 21.1 53.4 25.5 98.2 126 5 1
注釋：WTOWC:白色至灰白色濾餅，EFVP：基本上不含可見顆粒 亦在12個月時段內評估調配物F6 (凍乾，200結合蛋白h1A11.1-SL-Av/小瓶)之穩定性。調配物在測試時段內較為穩定。劑量溶液穩定性測試 。以靜脈內投與(IV)方式測試抗-DLL4/抗-VEGF結合蛋白。在投與之前，使用注射用無菌水重構凍乾藥物產物(SWFI)。隨後，在適於IV輸注之溶液中稀釋重構產物。基於所投與之臨床劑量來確定劑量溶液稀釋至之最終濃度。 實施研究以評估經稀釋抗-DLL4/抗-VEGF結合蛋白h1A11.1-SL-Av在處於含有兩種常用IV稀釋劑0.9%鹽水及5%右旋糖(D5W)中之一者之劑量溶液中時之穩定性。所評估之蛋白質濃度為0.5 mg/mL及1 mg/mL。為評估劑量溶液穩定性及與輸注組件之相容性，製備每一測試條件下之劑量溶液且在RT/RL下儲存於IV袋(n=2)中6小時，且隨後，使用常用輸注投與組件(包含在線過濾器)實施模擬輸注研究。在IV袋中製備劑量溶液之後(T0)，自袋直接抽取測試試樣。此外，測試在30分鐘輸注過程結束時收集之試樣。藉由各種分析型分析(包含可見外觀、聚集物%(藉由尺寸排除層析(SE-HPLC))及亞可見顆粒(藉由不透光度(HIAC)))測試試樣。 劑量溶液穩定性研究結果提供於表21中。起始材料中之聚集物含量為0.7%。在鹽水中製備劑量溶液之後，觀察到指示在鹽水中稀釋時(T0)至在輸注結束時聚集物含量有所增加之明顯趨勢。此外，該等試樣中之亞可見顆粒計數較高。與之相比，在5%右旋糖(D5W)中製得之劑量溶液展示始終較低之聚集物含量%及關於微粒之可接受穩定性趨勢。表 21. 臨床使用中穩定性結果
稀釋劑 劑量溶液濃度 (mg/mL) 分析 → 可見外觀 聚集物 % ， SE-HPLC 亞可見顆粒計數， HIAC
時間點 ↓ ≥ 2 μm/mL ≥ 10 μm/mL ≥ 25 μm/mL
0.9%鹽水 0.5 mg/mL (1號袋) T0 EFVP 2.7 2139 86 8
幫浦輸注後 EFVP 4.7 4398 63 1
0.5 mg/mL (2號袋) T0 EFVP 2.7 2729 189 12
幫浦輸注後 EFVP 3.5 1879 31 2
1.0 mg/mL (1號袋) T0 EFVP 2.4 1774 85 3
幫浦輸注後 EFVP 3.0 2300 24 0
1.0 mg/mL (2號袋) T0 EFVP 1.8 914 23 0
幫浦輸注後 EFVP 2.5 3056 42 2
5%右旋糖 0.5 mg/mL (1號袋) T0 EFVP 0.6 1679 31 0
幫浦輸注後 EFVP 0.6 7 0 0
0.5 mg/mL (2號袋) T0 EFVP 0.6 2944 135 0
幫浦輸注後 EFVP 0.6 3 0 0
1 mg/mL (1號袋) T0 EFVP 0.6 1652 23 0
幫浦輸注後 EFVP 0.6 2 0 0
1 mg/mL (2號袋) T0 EFVP 0.6 2105 38 0
幫浦輸注後 EFVP 0.6 6 0 0
EFVP：基本上不含可見顆粒實例 9 ： 延長預調配表徵 對抗-DLL4/抗-VEGF DVD實施延長預調配表徵以探究不同調配物條件如何影響DVD之穩定性。h1A11.1-SL-Av數據呈現於表22及23中。在下文所列示之調配物及蛋白質濃度中評估DVD之儲存穩定性(5℃)及加速穩定性(40℃)。藉由尺寸排除層析(SE-HPLC)評估穩定性且量化聚集物%、單體%、片段%及所回收全部物質。總而言之，調配物覆蓋5至7之pH範圍及10 mg/ml至50 mg/ml之蛋白質濃度範圍。 在5℃及40℃溫度及50 mg/ml、30 mg/ml及10 mg/ml之濃度下，評估下列調配物：15 mM pH 5乙酸鹽、15 mM pH 6組胺酸、15 mM pH 7磷酸鹽、30 mM乙酸鹽、80 mg/ml蔗糖、0.02% pH 5 Tween 80、30 mM組胺酸、80 mg/ml蔗糖、0.02% pH 6 Tween 80及PBS (磷酸鹽緩衝鹽水)。所有調配物皆含有0.02%疊氮化鈉以防止在儲存期間之微生物生長。表 22. h1A11.1-LS-Av 之 40 ℃ 下加速穩定性
蛋白質濃度(mg/ml) 時間 溫度(℃) 緩衝劑 pH 聚集物% 單體% 片段% 總面積
--- 透析前 --- --- --- 0.21 98.42 1.36 56054
50, 30, 10 T0 --- ace 5 0.28 98.41 1.31 56381
50, 30, 10 T0 --- his 6 0.46 98.23 1.31 54316
50, 30, 10 T0 --- phos 7 0.74 97.86 1.40 53212
50, 30, 10 T0 --- ace-suc-tw 5 0.24 98.16 1.60 56244
50, 30, 10 T0 --- his-suc-tw 6 0.30 98.11 1.59 54076
50, 30, 10 T0 --- PBS 7 0.52 98.05 1.43 50085
50 T7d 40 ace 5 1.63 96.74 1.63 55563
30 T7d 40 ace 5 1.13 97.24 1.62 55194
10 T7d 40 ace 5 0.84 97.49 1.67 55029
50 T7d 40 his 6 2.00 96.62 1.38 53566
30 T7d 40 his 6 1.17 97.46 1.38 52443
10 T7d 40 his 6 0.60 98.00 1.40 53812
50 T7d 40 phos 7 4.31 94.02 1.67 52934
30 T7d 40 phos 7 2.85 95.46 1.69 52663
10 T7d 40 phos 7 1.20 97.11 1.69 52411
50 T7d 40 ace-suc-tw 5 1.10 96.23 2.66 54837
30 T7d 40 ace-suc-tw 5 0.77 96.40 2.83 52474
10 T7d 40 ace-suc-tw 5 0.43 96.39 3.17 50855
50 T7d 40 his-suc-tw 6 1.69 96.27 2.05 53017
30 T7d 40 his-suc-tw 6 1.14 96.84 2.02 52153
10 T7d 40 his-suc-tw 6 0.59 97.30 2.11 52208
50 T7d 40 PBS 7 2.77 95.30 1.93 51623
30 T7d 40 PBS 7 1.73 96.28 1.99 49973
10 T7d 40 PBS 7 0.78 97.25 1.97 50851
50 T21d 40 ace 5 3.66 94.30 2.04 55920
30 T21d 40 ace 5 2.56 95.33 2.10 54188
10 T21d 40 ace 5 1.85 96.00 2.15 55213
50 T21d 40 his 6 4.14 94.28 1.58 54807
30 T21d 40 his 6 2.67 95.79 1.54 53071
10 T21d 40 his 6 1.59 96.82 1.58 54053
50 T21d 40 phos 7 8.52 89.32 2.16 53273
30 T21d 40 phos 7 5.58 92.54 1.89 53162
10 T21d 40 phos 7 3.01 94.89 2.10 52747
50 T21d 40 ace-suc-tw 5 4.12 93.78 2.10 56278
30 T21d 40 ace-suc-tw 5 2.93 94.94 2.13 55481
10 T21d 40 ace-suc-tw 5 1.99 95.75 2.26 54696
50 T21d 40 his-suc-tw 6 4.94 93.21 1.85 54034
30 T21d 40 his-suc-tw 6 n/a n/a n/a n/a
10 T21d 40 his-suc-tw 6 2.00 96.30 1.70 52686
50 T21d 40 PBS 7 8.44 89.65 1.90 51697
30 T21d 40 PBS 7 5.54 92.43 2.03 50282
10 T21d 40 PBS 7 2.89 95.05 2.06 51580
緩衝劑注釋：(所有緩衝劑皆含有0.02%疊氮化鈉以防止微生物生長)：ace = 15 mM pH 5乙酸鹽；his = 15 mM pH 6組胺酸；phos = 15 mM pH 7磷酸鹽；ace-suc-tw = 30 mM乙酸鹽、80 mg/ml蔗糖、0.02% Tween 80；his-suc-tw = 30 mM組胺酸、80 mg/ml蔗糖、0.02% Tween 80；PBS =磷酸鹽緩衝鹽水表 23. h1A11.1-LS-Av 之 5 ℃ 下儲存穩定性
蛋白質濃度(mg/ml) 時間 溫度(℃) 緩衝劑 pH 聚集物% 單體% 片段% 總面積
--- 透析前 --- --- --- 0.21 98.42 1.36 56054
50, 30, 10 T0 --- ace 5 0.28 98.41 1.31 56381
50, 30, 10 T0 --- his 6 0.46 98.23 1.31 54316
50, 30, 10 T0 --- phos 7 0.74 97.86 1.40 53212
50, 30, 10 T0 --- ace-suc-tw 5 0.24 98.16 1.60 56244
50, 30, 10 T0 --- his-suc-tw 6 0.30 98.11 1.59 54076
50, 30, 10 T0 --- PBS 7 0.52 98.05 1.43 50085
50 T7d 5 ace 5 0.18 98.17 1.64 57599
30 T7d 5 ace 5 0.16 98.21 1.64 55889
10 T7d 5 ace 5 0.13 98.17 1.70 53289
50 T7d 5 his 6 0.18 98.14 1.68 55742
30 T7d 5 his 6 0.12 98.06 1.82 53603
10 T7d 5 his 6 0.13 98.07 1.80 53505
50 T7d 5 phos 7 0.23 97.72 2.05 54355
30 T7d 5 phos 7 0.18 97.77 2.04 53561
10 T7d 5 phos 7 0.13 97.72 2.15 53151
50 T7d 5 ace-suc-tw 5 0.09 97.40 2.51 57158
30 T7d 5 ace-suc-tw 5 0.08 97.43 2.49 55025
10 T7d 5 ace-suc-tw 5 0.08 97.34 2.58 53882
50 T7d 5 his-suc-tw 6 0.10 97.48 2.43 55272
30 T7d 5 his-suc-tw 6 0.08 97.63 2.29 52763
10 T7d 5 his-suc-tw 6 0.05 97.41 2.53 52903
50 T7d 5 PBS 7 0.12 97.31 2.58 51698
30 T7d 5 PBS 7 0.09 97.24 2.67 50144
10 T7d 5 PBS 7 0.08 97.28 2.64 50428
50 T21d 5 ace 5 0.87 98.45 0.68 57706
30 T21d 5 ace 5 0.80 98.55 0.65 56566
10 T21d 5 ace 5 0.83 98.47 0.70 54226
50 T21d 5 his 6 1.05 98.29 0.66 55911
30 T21d 5 his 6 0.92 98.40 0.68 54225
10 T21d 5 his 6 0.90 98.41 0.70 54128
50 T21d 5 phos 7 1.25 98.09 0.66 54980
30 T21d 5 phos 7 1.20 98.11 0.69 53903
10 T21d 5 phos 7 1.01 98.29 0.69 53271
50 T21d 5 ace-suc-tw 5 0.92 98.36 0.72 61574
30 T21d 5 ace-suc-tw 5 0.89 98.39 0.72 55532
10 T21d 5 ace-suc-tw 5 0.83 98.46 0.71 55841
50 T21d 5 his-suc-tw 6 1.00 98.27 0.73 55484
30 T21d 5 his-suc-tw 6 0.92 98.37 0.70 53335
10 T21d 5 his-suc-tw 6 0.82 98.49 0.69 53736
50 T21d 5 PBS 7 1.49 97.79 0.71 52405
30 T21d 5 PBS 7 1.29 98.02 0.70 51284
10 T21d 5 PBS 7 1.12 98.18 0.70 51377
表23之緩衝劑注釋與表22中相同。實例 10 ： 在 DLL4 細胞分析中 VEGF 對於抗 -DLL4/ 抗 -VEGF DVD 之中和活性之效應 為評估VEGF結合是否影響抗-DLL4/抗-VEGF DVD之DLL4中和效力，在如實例3.3中所闡述之DLL4-Notch報告子分析中包含VEGF。簡言之，將表現人類DLL4之HEK293G細胞與EA.hy926 Notch報告子細胞在h1A11.1-SL-Av DVD或抗-DLL4 mAb (h1A11.1)及抗-VEGF mAb (Av)之混合物(自300 nM連續稀釋)存在下一起共培養24 hr。亦包含重組人類VEGF165 (VEGF之生理學相關人類剪接同種型)或陰性對照蛋白(BSG2)。藉由評估IC50 值(達成DLL4誘導之Notch活化減小50%所需之抗體濃度)來測定DLL4中和效力。如表24中所展示，6 nM或150 nM VEGF之存在大大增加了h1A11.1-SL-Av DVD之DLL4中和效力。此增加之效力對於抗-DLL4/抗-VEGF DVD而言較為獨特，此乃因親代mAb混合物在包含或不包含VEGF下展現類似效力。表 24. VEGF 增強抗 -DLL4/ 抗 -VEGF DVD 之 DLL4 效力但並不增加抗 -DLL4/ 抗 -VEGF 混合物之 DLL4 效力
   IC50 (nM)
   0 nM VEGF 6 nM VEGF 6 nM BSG2
h1A11.1-SL-Av 12.50 0.61 16.76
h1A11.1 + Av 混合物 8.64 9.97 9.55
   IC50 (nM)
   0 nM VEGF 150 nM VEGF 150 nM BSG2
h1A11.1-SL-Av 12.69 0.40 14.11
h1A11.1 + Av 混合物 9.17 10.32 10.93
在另一實驗中，亦在DLL4中和細胞分析中評估h1A11.1-SL-Av DVD之單價Fab片段。與DVD Ig相比，單價DVD Fab具有較弱DLL4中和效力。VEGF之存在改良了DVD-Fab之效力，但其程度不及使用DVD-Ig所看到(表25)。表 25. VEGF 對於抗 -DLL4/ 抗 -VEGF DVD Ig 及 DVD Fab 之 DLL4 中和效力之效應
   IC50 (nM)
   0 nM VEGF 150 nM VEGF 150 nM BSG2
h1A11.1-SL-Av 13.46 0.41 16.55
h1A11.1-SL-Av Fab ＞ 40* 4.56 ＞ 40*
*不能測得精確IC50 ，此乃因不能完全中和DLL4 在另一實驗中，連續滴定VEGF濃度且應用至上述DLL4-Notch報告子分析。如表26中所展示，在低至1.2 nM之濃度下，VEGF可增強h1A11.1-SL-Av DVD之DLL4中和活性。表 26. VEGF 增強抗 -DLL4/ 抗 -VEGF DVD 之 DLL4 中和效力
      h1A11.1-SL-Av
nM IC50 (nM)
BSG2 150 11.0
VEGF 150 0.6
30 0.7
6 0.6
1.2 1.1
0.24 12.7
0.048 12.3
0.0096 11.5
0 11.8
實例 11 ： DLL4-VEGF DVD-Ig 之活體內組合效能 針對雌性SCID小鼠中之SW-48人類結腸異種移植物腫瘤評估抗-DLL4-VEGF DVD-Ig與化學療法之組合對於腫瘤生長之效應。簡言之，將5 × 106 個細胞經皮下接種至右後翼中。使腫瘤確立13天，此時使用電子卡尺量測且使用式：L × W2 /2來測定腫瘤體積。將小鼠分配至治療組中(n=10只/組)，從而每一小組在開始療法之前具有211 mm3 之相等平均腫瘤體積。以表27中之劑量及時間表向動物投用伊立替康、抗-VEGF mAb及/或抗-DLL4-VEGF DVD-Ig。在實驗之持續時間內每週兩次量測腫瘤體積。結果展示於表27中。表 27. 抗 -DLL4-VEGF DVD-Ig 及伊立替康在 SW-48 結腸異種移植物模型中之組合效能
治療 劑量途徑，方案 %TGIa %TGDb
伊立替康 60 mg/kg IP, q3d × 4 77*** 106***
抗-VEGF mAb 10 mg/kg IP, q7d × 4 39* 50*
h1A11.1-SL-Av 13.3 mg/kg IP, q7d × 4 72*** 150***
抗-VEGF mAb +伊立替康 10 mg/kg IP, q7d × 4 + 60 mg/kg IP, q3d × 4 78*** 150***
h1A11.1-SL-Av +伊立替康 13.3 mg/kg IP, q7d × 4 + 60 mg/kg IP, q3d × 4 90*** 228***
表27注釋：a.  TGI% =腫瘤生長抑制百分比= 100 – (T/C × 100)，其中T =治療組之平均腫瘤體積且C =治療對照組之平均腫瘤體積。基於大小匹配量測之後第18天。P值(如由星號所指示)係衍生自治療組對治療對照組之司徒登氏T測試對比。b.  TGD% =腫瘤生長延遲百分比= (T – C)/C × 100，其中T =治療組之中值至端點時間且C=治療對照組之中值至端點時間。基於1000 mm3 之端點。P值(如由星號所指示)係衍生自治療組對治療對照組之卡-梅氏對數秩對比：* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.001，*** p ＜ 0.0001。「q3d × 4」指示在4個循環(亦即4個劑量)中每3天進行投與，而「q7d × 4」指示在4個循環中每7天進行投與。 亦針對雌性SCID小鼠中之HCT-116人類結腸異種移植物腫瘤評估抗-DLL4-VEGF DVD-Ig與化學療法之組合對於腫瘤生長之效應。簡言之，將5 × 106 個細胞經皮下接種至右後翼中。使腫瘤確立14天，此時使用電子卡尺量測且使用式：L × W2 /2來測定腫瘤體積。將小鼠分配至治療組中(n=9只/組)，從而每一小組在開始療法之前具有192 mm3 之相等平均腫瘤體積。以表28中之劑量及時間表向動物投用5-FU、醛氫葉酸、伊立替康、抗-VEGF mAb及/或抗-DLL4-VEGF DVD-Ig。在實驗之持續時間內每週兩次量測腫瘤體積。結果展示於表28中。表 28. 抗 -DLL4-VEGF DVD-Ig 及福爾菲力在 HCT-116 結腸異種移植物模型中之組合效能
治療 劑量途徑，方案 %TGIa
5-FU 醛氫葉酸 伊立替康 (福爾菲力) 50 mg/kg IV, q7d × 3 25 mg/kg PO, q7d × 3 30 mg/kg IV, q7d × 3    63***
抗-VEGF mAb 5 mg/kg IP, q7d × 4 49***
h1A11.1-SL-Av 6.7 mg/kg IP, q7d × 4 67***
抗-VEGF mAb +福爾菲力 5 mg/kg IP, q7d × 4 + (上文) q7d × 3 81***
h1A11.1-SL-Av +福爾菲力 6.7 mg/kg IP, q7d × 4 + (上文) q7d × 3 90***
表28注釋：a.  TGI% =腫瘤生長抑制百分比= 100 – (T/C × 100)，其中T =治療組之平均腫瘤體積且C =治療對照組之平均腫瘤體積。基於大小匹配量測之後第26天。P值(如由星號所指示)係衍生自治療組對治療對照組之司徒登氏T測試對比：* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.001，*** p ＜ 0.0001。       「q7d × 3」指示在3個循環(亦即3個劑量)中每7天進行投與，而「q7d × 4」指示在4個循環中每7天進行投與。 針對雌性SCID小鼠中之HT-29人類結腸異種移植物腫瘤評估抗-DLL4-VEGF DVD-Ig與化學療法之組合對於腫瘤生長之效應。簡言之，將2 × 106 個細胞經皮下接種至右後翼中。使腫瘤確立25天，此時使用電子卡尺量測且使用式：L × W2 /2來測定腫瘤體積。將小鼠分配至治療組中(n=10只/組)，從而每一小組在開始療法之前具有209 mm3 之相等平均腫瘤體積。以表29中之劑量及時間表向動物投用伊立替康及/或抗-DLL4-VEGF DVD-Ig。在實驗之持續時間內每週兩次量測腫瘤體積。結果展示於表29中。表 29. 抗 -DLL4-VEGF DVD-Ig 及伊立替康在 HT-29 結腸異種移植物模型中之組合效能
治療 劑量途徑，方案 %TGIa %TGDb
伊立替康 60 mg/kg IP, q3d × 4 47* 60*
h1A11.1-SL-Av 6.7 mg/kg IP, q7d × 4 42* 45*
h1A11.1-SL-Av +伊立替康 6.7 mg/kg IP, q7d × 4 + 60 mg/kg IP, q3d × 4 74** 76*
表29注釋. a.  TGI% =腫瘤生長抑制百分比= 100 – (T/C × 100)，其中T =治療組之平均腫瘤體積且C =治療對照組之平均腫瘤體積。基於大小匹配量測之後第20天。P值(如由星號所指示)係衍生自治療組對治療對照組之司徒登氏T測試對比。b.  TGD% =腫瘤生長延遲百分比= (T – C)/C × 100，其中T =治療組之中值至端點時間且C=治療對照組之中值至端點時間。基於1000 mm3 之端點。P值(如由星號所指示)係衍生自治療組對治療對照組之卡-梅氏對數秩對比：* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.001，*** p ＜ 0.0001。「q3d × 4」指示在4個循環(亦即4個劑量)中每3天進行投與，而「q7d × 4」指示在4個循環中每7天進行投與。 針對雌性SCID小鼠中之U87-MG人類神經膠質母細胞瘤異種移植物腫瘤評估抗-DLL4-VEGF DVD-Ig與化學療法之組合對於腫瘤生長之效應。簡言之，將3 × 106 個細胞經皮下接種至右後翼中。使腫瘤確立13天，此時使用電子卡尺量測且使用式：L × W2 /2來測定腫瘤體積。將小鼠分配至治療組中(n=10只/組)，從而每一小組在開始療法之前具有207 mm3 之相等平均腫瘤體積。以表30中之劑量及時間表向動物投用替莫唑胺、抗-VEGF mAb及/或抗-DLL4-VEGF DVD-Ig。在實驗之持續時間內每週兩次量測腫瘤體積。結果展示於表30中。表 30. 抗 -DLL4-VEGF DVD-Ig 及替莫唑胺在 U87-MG 神經 膠質母細胞瘤異種移植物模型中之組合效能
治療 劑量途徑，方案 %TGIa %TGDb
替莫唑胺 5 mg/kg IP, qd × 1 65*** 45***
抗-VEGF mAb 5 mg/kg IP, q7d × 4 47** 45**
h1A11.1-SL-Av 6.7 mg/kg IP, q7d × 4 69*** 100***
抗-VEGF mAb +替莫唑胺 5 mg/kg IP, q7d × 4  + 5 mg/kg IP, qd × 1 68*** 89***
h1A11.1-SL-Av +替莫唑胺 6.7 mg/kg IP, q7d × 4 + 5 mg/kg IP, qd × 1 78*** 155***
表30注釋. a.  TGI% =腫瘤生長抑制百分比= 100 – (T/C × 100)，其中T =治療組之平均腫瘤體積且C =治療對照組之平均腫瘤體積。基於大小匹配量測之後第19天。P值(如由星號所指示)係衍生自治療組對治療對照組之司徒登氏T測試對比。b.  TGD% =腫瘤生長延遲百分比= (T – C)/C × 100，其中T =治療組之中值至端點時間且C=治療對照組之中值至端點時間。基於1000 mm3 之端點。P值(如由星號所指示)係衍生自治療組對治療對照組之卡-梅氏對數秩對比：* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.001，*** p ＜ 0.0001。 針對雌性NSG小鼠中之PA0123患者源人類胰臟異種移植物腫瘤評估抗-DLL4-VEGF DVD-Ig與化學療法之組合對於腫瘤生長之效應。簡言之，將冷凍腫瘤片段經皮下移植至右後翼中。使腫瘤確立28天，此時使用電子卡尺量測且使用式：L × W2 /2來測定腫瘤體積。將小鼠分配至治療組中(n=7只/組)，從而每一小組在開始療法之前具有193 mm3 之相等平均腫瘤體積。以表31中之劑量及時間表向動物投用吉西他濱及/或抗-DLL4-VEGF DVD-Ig。在實驗之持續時間內每週兩次量測腫瘤體積。結果展示於表31中。表 31. 抗 -DLL4-VEGF DVD-Ig 及吉西他濱在 PA0123 患者源胰臟異種移植物模型中之組合效能
治療 劑量途徑，方案 %TGIa %TGDb
吉西他濱 100 mg/kg IP, [q3d × 4] × 2 48** 43**
h1A11.1-SL-Av 13.3 mg/kg IP, q7d × 5 54** 75**
h1A11.1-SL-Av +吉西他濱 13.3 mg/kg IP, q7d × 5 + 100 mg/kg IP, [q3d × 4] × 2 75*** 114***
表31注釋. a.  TGI% =腫瘤生長抑制百分比= 100 – (T/C × 100)，其中T =治療組之平均腫瘤體積且C =治療對照組之平均腫瘤體積。基於大小匹配量測之後第38天。P值(如由星號所指示)係衍生自治療組對治療對照組之司徒登氏T測試對比。b.  TGD% =腫瘤生長延遲百分比= (T – C)/C × 100，其中T =治療組之中值至端點時間且C=治療對照組之中值至端點時間。基於1000 mm3 之端點。P值(如由星號所指示)係衍生自治療組對治療對照組之卡-梅氏對數秩對比：* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.001，*** p ＜ 0.0001。 針對雌性SCID小鼠中之MDA-MB-231-luc人類乳房異種移植物腫瘤評估抗-DLL4-VEGF DVD-Ig與化學療法之組合對於腫瘤生長之效應。簡言之，將2 × 106 個細胞移植至乳房脂肪墊中。使腫瘤確立13天，此時使用電子卡尺量測且使用式：L × W2 /2來測定腫瘤體積。將小鼠分配至治療組中(n=10只/組)，從而每一小組在開始療法之前具有150 mm3 之相等平均腫瘤體積。以表32中之劑量及時間表向動物投用紫杉醇及/或抗-DLL4-VEGF DVD-Ig。在實驗之持續時間內每週兩次量測腫瘤體積。另外，獲取生物發光影像以監測及追蹤癌細胞至肺及/或淋巴結之自發性轉移。結果展示於表32中。表 32. 抗 -DLL4-VEGF DVD-Ig 及紫杉醇在 MDA-MB-231-luc 乳房異種移植物模型中之組合效能
治療 劑量途徑，方案 %TGIa %TGDb 轉移發生率 %c
紫杉醇 25 mg/kg IP, q4d × 3 78*** 106*** 40*
h1A11.1-SL-Av 6.7 mg/kg IP, q7d × 4 56*** 85*** 50*
h1A11.1-SL-Av +紫杉醇 6.7 mg/kg IP, q7d × 4 + 25 mg/kg IP, q4d × 3 92*** 179*** 0***
表32注釋. a.  TGI% =腫瘤生長抑制百分比= 100 – (T/C × 100)，其中T =治療組之平均腫瘤體積且C =治療對照組之平均腫瘤體積。 基於大小匹配量測之後第15天。P值(如由星號所指示)係衍生自治療組對治療對照組之司徒登氏T測試對比。b.  TGD% =腫瘤生長延遲百分比= (T – C)/C × 100，其中T =治療組之中值至端點時間且C=治療對照組之中值至端點時間。基於1000 mm3 之端點。P值(如由星號所指示)係衍生自治療組對治療對照組之卡-梅氏對數秩對比。c. 轉移發生率% =基於生物發光成像動物在肺及/或淋巴結中具有可檢測信號之百分比。治療對照組具有100%之轉移發生率。基於第22天之後大小匹配量測。P值(如由星號所指示)係衍生自治療組對治療對照組之司徒登氏T測試對比：* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.001，*** p ＜ 0.0001。 針對雌性SCID小鼠中之SUM149PT人類乳房異種移植物腫瘤評估抗-DLL4-VEGF DVD-Ig與化學療法之組合對於腫瘤生長之效應。簡言之，將1 × 106 個細胞經皮下接種至右後翼中。使腫瘤確立28天，此時使用電子卡尺量測且使用式：L × W2 /2來測定腫瘤體積。將小鼠分配至治療組中(n=9只/組)，從而每一小組在開始療法之前具有183 mm3 之相等平均腫瘤體積。以表33中之劑量及時間表向動物投用紫杉醇及/或抗-DLL4-VEGF DVD-Ig。在實驗之持續時間內每週兩次量測腫瘤體積。結果展示於表33中。表 33 .抗 -DLL4-VEGF DVD-Ig 及紫杉醇在 SUM149PT 乳房異種移植物模型中之組合效能
治療 劑量途徑，方案 %TGIa %TGDb
紫杉醇 25 mg/kg IP, [q4d × 3] × 4 60*** 173***
h1A11.1-SL-Av 6.7 mg/kg IP, q7d × 8 88*** 282***
h1A11.1-SL-Av +紫杉醇 6.7 mg/kg IP, q7d × 8 +   25 mg/kg IP, [q4d × 3] × 4 93*** 459***
表33注釋. a.  TGI% =腫瘤生長抑制百分比= 100 – (T/C × 100)，其中T =治療組之平均腫瘤體積且C =治療對照組之平均腫瘤體積。 基於大小匹配量測之後第22天。P值(如由星號所指示)係衍生自治療組對治療對照組之司徒登氏T測試對比。b.  TGD% =腫瘤生長延遲百分比= (T – C)/C × 100，其中T =治療組之中值至端點時間且C=治療對照組之中值至端點時間。基於1000 mm3 之端點。P值(如由星號所指示)係衍生自治療組對治療對照組之卡-梅氏對數秩對比：* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.001，*** p ＜ 0.0001。 針對雌性SCID小鼠中之SUM149PT人類乳房異種移植物腫瘤評估抗-DLL4-VEGF DVD-Ig與化學療法之組合對於腫瘤生長之效應。簡言之，將1 × 106 個細胞經皮下接種至右後翼中。使腫瘤確立25天，此時使用電子卡尺量測且使用式：L × W2 /2來測定腫瘤體積。將小鼠分配至治療組中(n=10只/組)，從而每一小組在開始療法之前具有228 mm3 之相等平均腫瘤體積。以表 34 中之劑量及時間表向動物投用紫杉醇、抗-VEGF mAb及/或抗-DLL4-VEGF DVD-Ig。在實驗之持續時間內每週兩次量測腫瘤體積。結果展示於表 34 中。表 34. 抗 -DLL4-VEGF DVD-Ig 及紫杉醇在 SUM149PT 乳房異種移植物模型中之組合效能
治療 劑量途徑，方案 %TGIa
紫杉醇 25 mg/kg IP, [q4d × 3] × 4 50*
抗-VEGF mAb 5 mg/kg IP, q7d × 8 54*
h1A11.1-SL-Av 6.7 mg/kg IP, q7d × 8 78**
抗-VEGF mAb +紫杉醇 5 mg/kg IP, q7d × 8  +     25 mg/kg IP, [q4d × 3] × 4 81**
h1A11.1-SL-Av +紫杉醇 6.7 mg/kg IP, q7d × 8 +    25 mg/kg IP, [q4d × 3] × 4 87**
表34注釋：a.  TGI% =腫瘤生長抑制百分比= 100 – (T/C × 100)，其中T =治療組之平均腫瘤體積且C =治療對照組之平均腫瘤體積。基於大小匹配量測之後第18天。  P值(如由星號所指示)係衍生自治療組對治療對照組之司徒登氏T測試對比：* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.001，*** p ＜ 0.0001。 進一步針對雌性SCID小鼠中之HCT-116人類結腸異種移植物腫瘤評估抗-DLL4-VEGF DVD-Ig與化學療法之組合對於腫瘤生長之效應。簡言之，將5 × 106 個細胞經皮下接種至右後翼中。使腫瘤確立16天，此時使用電子卡尺量測且使用式：L × W2 /2來測定腫瘤體積。將小鼠分配至治療組中(n=9只/組)，從而每一小組在開始療法之前具有198 mm3 之相等平均腫瘤體積。以表 35 中之劑量及時間表向動物投用5-FU、卡培他濱及/或抗-DLL4-VEGF DVD-Ig。在實驗之持續時間內每週兩次量測腫瘤體積。結果展示於表 35 中。表 35. 抗 -DLL4-VEGF DVD-Ig 及 5-FU 或抗 -DLL4-VEGF DVD-Ig 及卡培他濱在 HCT-116 結腸異種移植物模型中之組合效能 。
治療 劑量途徑，方案 %TGIa
5-FU 75 mg/kg IV, q7d × 4 50**
卡培他濱 350 mg/kg PO, qd × 14 69***
h1A11.1-SL-Av 6.7 mg/kg IP, q7d × 4 66***
h1A11.1-SL-Av + 5-FU 6.7 mg/kg IP, q7d × 4 + 75 mg/kg IV, q7d × 4 84***
h1A11.1-SL-Av +卡培他濱 6.7 mg/kg IP, q7d × 4 + 350 mg/kg PO, qd × 14 92***
表35注釋：a.  TGI% =腫瘤生長抑制百分比= 100 – (T/C × 100)，其中T =治療組之平均腫瘤體積且C =治療對照組之平均腫瘤體積。基於大小匹配量測之後第21天。P值(如由星號所指示)係衍生自治療組對治療對照組之司徒登氏T測試對比：* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.01，*** p ＜ 0.001。實例 12 ： h1A11.1-SL-Av DVD 之交叉物種細胞效力 在基於細胞之分析中使用固定重組DLL4細胞外區域(ECD)交叉物種比較h1A11.1-SL-Av DVD針對DLL4之交叉物種中和效力。利用此分析來比較h1A11.1-SL-Av DV針對衍生自人類、大鼠、小鼠及獼猴物種之相同濃度DLL4之活性。 使用100 µL/孔稀釋於PBS中之DLL4-ECD (11 nM) (Invitrogen，14190號)或使用100 µL/孔11 nM BSA作為對照(Sigma，A9576號)預塗覆具有透明底部孔之黑色96孔組織培養板(Costar，3904號)。密封分析板且在4℃下培育18小時。次日，將h1A11.1-SL-AV DVD連續稀釋於含有10% FBS之分析培養基DMEM (Invitrogen，11995號)中。使用分析培養基將預塗覆分析板沖洗一次，然後添加50 µL/孔經連續稀釋之h1A11.1-SL-Av DVD溶液。然後將分析板在25℃下培育30分鐘。在此培育期間，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA (Invitrogen，25200號)自培養燒瓶分離表現對照海腎螢光素酶及由Notch反應性啟動子驅動之螢火蟲螢光素酶之EA.hy926細胞，以3 × 105 個細胞/mL再懸浮於分析培養基中，且然後以25 µL細胞/孔直接添加至分析板中。然後將分析板在37℃及5% CO2 下培育24小時。根據供應商方案(Dual-Glo螢光素酶分析系統，Promega，E2940號)實施螢火蟲及海腎螢光素酶分析。在板讀取儀(Victor, Perkin Elmer，1420-051號)上讀取發光，且將所生成數據正規化至海腎螢光素酶發光信號。 如表36中所展示，h1A11.1-SL-Av DVD以同等效力抑制人類及獼猴DLL4活性。h1A11.1-SL-Av DVD亦抑制小鼠DLL4，但其活性約為人類DLL4之1/3。h1A11.1-SL-Av DVD在細胞分析中並不抑制大鼠DLL4活性。 在VEGF刺激之NIH3T3/VEGFR-2細胞增殖及活力分析中評估h1A11.1-SL-AV DVD針對VEGF之交叉物種中和效力。 將經全長人類VEGFR-2之cDNA穩定轉染之NIH3T3細胞用於VEGF刺激之增殖及存活分析。使用0.25%胰蛋白酶-EDTA (Invitrogen，25200號)自培養燒瓶分離NIH3T3/VEGFR-2穩定細胞系之鋪滿培養物，且以1.33 × 105 個細胞/mL再懸浮於分析培養基：含有0.1% BSA (Sigma，A9576號)之DMEM (Invitrogen，11995號)中。以10,000個細胞/孔及75 µL總體積將細胞接種至具有透明底部之黑色96孔組織培養分析板(Costar，3904號)中，且在37℃及5% CO2 下培育24小時。 次日，使用分析培養基稀釋重組VEGF蛋白質及h1A11.1-SL-AV DVD，混合於96孔聚丙烯板中且在25℃下培育30分鐘。然後以25 µL/孔將VEGF及h1A11.1-SL-AV DVD混合劑(4 ×)添加至分析板上之細胞中。然後將含有經處理細胞之分析板在37℃及5% CO2 下培育。72小時後，根據供應商方案(ATPlite 1step, Perkin Elmer，6016739號)實施活力分析。在板讀取儀(Victor, Perkin Elmer，1420-051號)上讀取發光。 如表36中所展示，與人類VEGF相比，h1A11.1-SL-AV DVD以類似效力中和獼猴VEGF活性。h1A11.1-SL-AV DVD在細胞分析中並不抑制小鼠或大鼠VEGF。表 36 ： h1A11.1-SL-AV DVD 之交叉物種細胞效力
效力分析， IC50 (nM)a
人類DLL4 0.22 ± 0.14
獼猴DLL4 0.12 ± 0.08
小鼠DLL4 0.65 ± 0.23
大鼠DLL4 不可檢測
人類VEGF 0.9 ± 0.1
獼猴VEGF 1.1 ± 0.3
小鼠VEGF 不可檢測
大鼠VEGF 不可檢測
表36注釋：a.來自DLL4細胞分析之值係來自4個獨立實驗之平均值±標準偏差。來自VEGF細胞分析之值係來自三個獨立實驗之平均值±標準偏差。 前述實例意欲進行闡釋且決不限制本揭示內容。彼等熟習此項技術者在考量本說明書及實踐本文所揭示之裝置及方法後將明瞭所揭示裝置及方法之其他實施例。 參考文獻之引用 可貫穿本申請案引用之所有引用參考文獻(包含參考文獻、專利、專利申請案及網站)之內容的全部內容出於任一目的皆以引用方式明確地併入本文中，如其中所引用參考文獻一般。除非另外指明，否則揭示內容將採用業內熟知之免疫學、分子生物學及細胞生物學之習用技術。 本揭示內容亦以引用方式併入分子生物及藥物遞送領域中熟知之技術的全文中。該等技術包含但不限於下列出版物中所闡述之技術： Ausubel等人(編輯)，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley &Sons, NY (1993)； Ausubel, F.M.等人編輯，SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (第4版，1999) John Wiley & Sons, NY. (ISBN 0-471-32938-X)； CONTROLLED DRUG BIOAVAILABILITY, DRUG PRODUCT DESIGN AND PERFORMANCE, Smolen及Ball (編輯)，Wiley, New York (1984)； Giege, R.及Ducruix, A. Barrett, CRYSTALLIZATION OF NUCLEIC ACIDS AND PROTEINS, a Practical Approach, 2nd ea.，第20 1-16頁，Oxford University Press, New York, New York, (1999)； Goodson, in MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE，第2卷，第115-138頁(1984)； Hammerling等人，MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)； Harlow等人 , ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, (Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)； Kabat等人，SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987)及(1991)； Kabat, E.A.等人(1991) SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH公開案第91-3242號； Kontermann及Dubel編輯，ANTIBODY ENGINEERING (2001) Springer-Verlag.New York.第790頁(ISBN 3-540-41354-5)； Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)； Lu及Weiner編輯，CLONING AND EXPRESSION VECTORS FOR GENE FUNCTION ANALYSIS (2001) BioTechniques Press. Westborough, MA. 第298頁(ISBN 1-881299-21-X)； MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE, Langer and Wise (編輯)，CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974)； Old, R.W. & S.B. Primrose, PRINCIPLES OF GENE MANIPULATION: AN INTRODUCTION TO GENETIC ENGINEERING (3d Ed. 1985) Blackwell Scientific Publications, Boston. Studies in Microbiology; V.2:第409頁(ISBN 0-632-01318-4)； Sambrook, J.等人編輯，MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2d Ed. 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. 第1-3卷。(ISBN 0-87969-309-6)； SUSTAINED AND CONTROLLED RELEASE DRUG DELIVERY SYSTEMS, J.R. Robinson編輯，Marcel Dekker公司，New York, 1978； Winnacker, E.L. FROM GENES TO CLONES: INTRODUCTION TO GENE TECHNOLOGY (1987) VCH Publishers, NY (translated by Horst Ibelgaufts).第634頁(ISBN 0-89573-614-4)。 等效內容 本揭示內容可以其他具體形式來實施，此並不背離其精神或基本特性。因此，應在所有態樣將前述實施例視為闡釋性而非限制本揭示內容。因此，本揭示內容之範圍係由隨附申請專利範圍而非由前述說明來指示，且因此本發明意欲涵蓋申請專利範圍等效內容之含義及範圍內的所有變化。
圖1係雙重可變區域(DVD)結合蛋白構築體之示意圖示且展示自兩種親代抗體生成DVD結合蛋白之策略。
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Claims (166)

  1. 一種包括多肽鏈之結合蛋白，其中該多肽鏈包括VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1係第一重鏈可變區域； VD2係第二重鏈可變區域； C係重鏈恆定區域； X1係連接體，但其並非CH1； X2係Fc區； n為0或1；且 其中該結合蛋白結合DLL4及VEGF，其中VD1及VD2獨立地包括三個來自SEQ ID NO: 39、41、43、45、47、49、51或53之CDR，且其中VD1及/或VD2中之至少一者包括三個來自SEQ ID NO: 39之CDR。
  2. 如請求項1之結合蛋白，其中VD1及VD2獨立地包括SEQ ID NO: 39、41、43、45、47、49、51或53，且其中VD1及/或VD2中之至少一者包括SEQ ID NO: 39。
  3. 一種包括多肽鏈之結合蛋白，其中該多肽鏈包括VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1係第一輕鏈可變區域； VD2係第二輕鏈可變區域； C係輕鏈恆定區域； X1係連接體，但其並非CH1或CL； X2不包括Fc區； n為0或1；且 其中該結合蛋白結合DLL4及VEGF，其中VD1及VD2獨立地包括三個來自SEQ ID NO: 40、42、44、46、48、50、52或54之CDR，且其中VD1及/或VD2中之至少一者包括三個來自SEQ ID NO: 40之CDR。
  4. 如請求項3之結合蛋白，其中該VD1及VD2獨立地包括SEQ ID NO: 40、42、44、46、48、50、52或54，且其中VD1及/或VD2中之至少一者包括SEQ ID NO: 40。
  5. 如請求項1或3之結合蛋白，其中該重鏈及/或輕鏈上之(X1)n係(X1)0及/或該重鏈及/或輕鏈上之(X2)n係(X2)0。
  6. 一種包括第一及第二多肽鏈之結合蛋白，其中該第一多肽鏈包括第一VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1係第一重鏈可變區域； VD2係第二重鏈可變區域； C係重鏈恆定區域； X1係連接體，但其並非CH2； X2係Fc區； n為0或1；且 其中該第二多肽鏈包括第二VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1係第一輕鏈可變區域； VD2係第二輕鏈可變區域； C係輕鏈恆定區域； X1係連接體，但其並非CH1或CL； X2不包括Fc區； n為0或1；且 其中該結合蛋白結合DLL4及VEGF，其中該等VD1及VD2重鏈可變區域獨立地包括三個來自SEQ ID NO: 39、41、43、45、47、49、51或53之CDR，其中該等VD1及/或VD2重鏈可變區域中之至少一者包括三個來自SEQ ID NO: 39之CDR；且其中該等VD1及VD2輕鏈可變區域獨立地包括三個來自SEQ ID NO: 40、42、44、46、48、50、52或54之CDR，其中該等VD1及/或VD2輕鏈可變區域中之至少一者包括三個來自SEQ ID NO: 40之CDR。
  7. 如請求項6之結合蛋白，其中該等VD1及VD2重鏈可變區域獨立地包括SEQ ID NO: 39、41、43、45、47、49、51或53，其中該等VD1及/或VD2重鏈可變區域中之至少一者包括SEQ ID NO: 39；且其中該等VD1及VD2輕鏈可變區域獨立地包括SEQ ID NO: 40、42、44、46、48、50、52或54，其中該等VD1及/或VD2輕鏈可變區域中之至少一者包括SEQ ID NO: 40。
  8. 3或6之結合蛋白，其中X1包括SEQ ID NO: 1至38中之任一者或基於G/S之序列。
  9. 如請求項6之結合蛋白，其中該結合蛋白包括兩條第一多肽鏈及兩條第二多肽鏈。
  10. 3或6之結合蛋白，其中該Fc區係變體序列Fc區。
  11. 3或6之結合蛋白，其中該Fc區係來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD之Fc區。
  12. 如請求項6之結合蛋白，其中該第一多肽鏈之VD1及該第二多肽鏈之VD1分別來自不同之第一及第二親代抗體或其結合部分。
  13. 如請求項6之結合蛋白，其中該第一多肽鏈之VD2及該第二多肽鏈之VD2分別來自不同之第一及第二親代抗體或其結合部分。
  14. 如請求項12或13之結合蛋白，其中該等第一及第二親代抗體結合相同靶或不同靶上之不同表位(epitopes)。
  15. 如請求項12或13之結合蛋白，其中該第一親代抗體或其結合部分結合第一靶之效力與該第二親代抗體或其結合部分結合第二靶之效力不同。
  16. 如請求項12或13之結合蛋白，其中該第一親代抗體或其結合部分結合第一靶之親和力與該第二親代抗體或其結合部分結合第二靶之親和力不同。
  17. 一種包括四條多肽鏈之結合蛋白，其中兩條多肽鏈包括VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1係第一重鏈可變區域； VD2係第二重鏈可變區域； C係重鏈恆定區域； X1係連接體，但其並非CH1； X2係Fc區； n為0或1；且 其中兩條多肽鏈包括VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1係第一輕鏈可變區域； VD2係第二輕鏈可變區域； C係輕鏈恆定區域； X1係連接體，但其並非CH1或CL； X2不包括Fc區； n為0或1；且 其中該結合蛋白結合DLL4及VEGF，其中該等VD1及VD2重鏈可變區域獨立地包括三個來自SEQ ID NO: 39、41、43、45、47、49、51或53之CDR，其中該等VD1及/或VD2重鏈可變區域中之至少一者包括三個來自SEQ ID NO: 39之CDR；且其中該等VD1及VD2輕鏈可變區域獨立地包括三個來自SEQ ID NO: 40、42、44、46、48、50、52或54之CDR，其中該等VD1及/或VD2輕鏈可變區域中之至少一者包括三個來自SEQ ID NO: 40之CDR。
  18. 如請求項17之結合蛋白，其中該等VD1及VD2重鏈可變區域獨立地包括SEQ ID NO: 39、41、43、45、47、49、51或53，其中該等VD1及/或VD2重鏈可變區域中之至少一者包括SEQ ID NO: 39；且其中該等VD1及VD2輕鏈可變區域獨立地包括SEQ ID NO: 40、42、44、46、48、50、52或54，其中該等VD1及/或VD2輕鏈可變區域中之至少一者包括SEQ ID NO: 40。
  19. 3、6或17之結合蛋白，其中該結合蛋白對VEGF及/或DLL4具有至少約102 M-1 s-1 、至少約103 M-1 s1 、至少約104 M-1 s- 1 、至少約105 M-1 s-1 或至少約106 M-1 s-1 之結合速率常數(K結合 )，如藉由表面電漿共振所量測。
  20. 3、6或17之結合蛋白，其中該結合蛋白對VEGF及/或DLL4具有至多約10-2 s-1 、至多約10-3 s-1 、至多約10-4 s-1 、至多約10-5 s-1 或至多約10-6 s-1 之解離速率常數(K解離 )，如藉由表面電漿共振所量測。
  21. 3、6或17之結合蛋白，其中該結合蛋白對VEGF及/或DLL4具有至多約10-7 M、至多約10-8 M、至多約10-9 M、至多約10-10 M、至多約10-11 M或至多約10-12 M之平衡解離常數(KD )，如藉由表面電漿共振所量測。
  22. 一種結合蛋白偶聯物(conjugate)，其包括如請求項1、3、6或17之結合蛋白，該結合蛋白偶聯物進一步包括藥劑，其中該藥劑係免疫黏著分子、成像劑、治療劑或細胞毒性劑。
  23. 如請求項22之結合蛋白偶聯物，其中該成像劑係放射標記、酶、螢光標記、發光標記、生物發光標記、磁性標記或生物素。
  24. 3、6或17之結合蛋白，其中該結合蛋白係結晶之結合蛋白。
  25. 一種經分離之核酸，其編碼如請求項1、3、6、17或22之結合蛋白胺基酸序列。
  26. 一種載體，其包括如請求項25之經分離之核酸。
  27. 如請求項26之載體，其中該載體係pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、pcDNA3.1 TOPO、pEF6 TOPO、pHybE、pBOS或pBJ。
  28. 一種宿主細胞，其包括如請求項26之載體。
  29. 如請求項28之宿主細胞，其中該宿主細胞係原核細胞。
  30. 如請求項28之宿主細胞，其中該宿主細胞係真核細胞。
  31. 如請求項30之宿主細胞，其中該真核細胞係原生生物細胞、動物細胞、植物細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、禽類細胞、昆蟲細胞或真菌細胞。
  32. 一種產生結合蛋白之方法，其包括如請求項28至31中任一項之宿主細胞在培養基中於足以產生該結合蛋白之條件下培養。
  33. 一種蛋白質，其係由如請求項32之方法產生。
  34. 一種醫藥組合物，其包括如請求項1、3、6、17、22或33中任一項之結合蛋白及醫藥上可接受之載劑。
  35. 如請求項34之醫藥組合物，其進一步包括至少一種其他劑。
  36. 如請求項35之醫藥組合物，其中該其他劑包括以下中之至少一者：免疫黏著分子、成像劑、治療劑、細胞毒性劑、放射標記、酶、螢光標記、發光標記、生物發光標記、磁性標記、生物素、抗代謝物、烷基化劑、抗生素、生長因子、細胞因子、抗血管生成劑、抗有絲分裂劑、蒽環素、毒素或細胞凋亡劑、化學治療劑、成像劑、血管生成抑制劑、激酶抑制劑(包含(但不限於)KDR及TIE-2抑制劑)、共刺激分子調節劑(包含(但不限於)抗-B7.1、抗-B7.2、CTLA4-Ig、抗-CD20)、黏著分子阻斷劑(包含(但不限於)抗-LFA-1抗體、抗-E/L選擇素抗體、小分子抑制劑)、抗-VEGF mAb、抗-DLL4 mAb、抗-細胞因子抗體或其功能片段(包含(但不限於)抗-IL-18、抗-TNF或抗-IL-6/細胞因子受體抗體)、胺甲喋呤(methotrexate)、環孢素(cyclosporin)、雷帕黴素(rapamycin)、FK506、可檢測標記或報告子、TNF拮抗劑、抗風濕劑、肌肉鬆弛劑、麻醉藥品、非類固醇抗發炎藥(NSAID)、鎮痛劑、麻醉劑、鎮靜劑、局部麻醉劑、神經肌肉阻斷劑、抗微生物劑、抗牛皮癬劑、皮質類固醇、同化類固醇、紅血球生成素、免疫、免疫球蛋白、免疫阻抑劑、生長激素、激素代替藥物、放射性藥物、抗抑鬱劑、抗精神病劑、刺激劑、哮喘藥、β激動劑、吸入類固醇、腎上腺素或類似物、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗高血壓劑、利尿劑、腎上腺素能受體拮抗劑、鈣通道阻斷劑、腎素抑制劑、ACE抑制劑、血管緊張素II受體拮抗劑、血管舒張劑、α-2激動劑、可樂定(clonidine)、甲基多巴(methyldopa)、肼屈嗪(hydralazine)、哌唑嗪(prazosin)、利血平(reserpine)、莫索尼定(moxonidine)、胍法辛(guanfacine)、培哚普利(perindopril)/吲達帕胺(indapamide)、洛非西定(lofexidine)、甲酪胺酸(metirosine)、抗凝血劑、華法林(warfarin)、肝素、低分子量肝素、達肝素(dalteparin)、阿加曲班(argatroban)、比伐盧定(bivalirudin)、來匹盧定(lepirudin)及右旋糖。
  37. 如請求項35或36之醫藥組合物，其中該其他劑包括以下中之至少一者：13-順式-視黃酸、2-CdA、2-氯去氧腺苷、5-阿紮胞苷(5-Azacitidine)、5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil)、5-FU、6-巰基嘌呤、6-MP、6-TG、6-硫鳥嘌呤、阿布沙尼(Abraxane)、抗-VEGF mAb、抗-DLL4 mAb、Accutane®、放線菌素-D (Actinomycin-D)、Adriamycin®、Adrucil®、Afinitor®、Agrylin®、Ala-Cort®、阿地白介素(Aldesleukin)、阿來組單抗(Alemtuzumab)、ALIMTA、阿利維A酸(Alitretinoin)、Alkaban-AQ®、Alkeran®、全反式視黃酸、α干擾素、六甲蜜胺(Altretamine)、胺甲喋呤(Amethopterin)、胺磷汀(Amifostine)、胺魯米特(Aminoglutethimide)、阿那格雷(Anagrelide)、Anandron®、阿那曲唑(Anastrozole)、阿糖胞嘧啶(Arabinosylcytosine)、Ara-C Aranesp®、Aredia®、Arimidex®、Aromasin®、Arranon®、三氧化二砷、Arzerra™、天門冬醯胺酶、ATRA、Avastin®、阿紮胞苷(Azacitidine)、BCG、BCNU、苯達莫司汀(Bendamustine)、貝伐珠單抗(Bevacizumab)、貝沙羅汀(Bexarotene)、BEXXAR®、比卡魯胺(Bicalutamide)、BiCNU、Blenoxane®、博來黴素(Bleomycin)、硼替佐米(Bortezomib)、白消安(Busulfan)、Busulfex®、C225、醛氫葉酸鈣(Calcium Leucovorin)、Campath®、Camptosar®、喜樹鹼-11 (Camptothecin-11)、卡培他濱(Capecitabine)、Carac™、卡鉑(Carboplatin)、卡莫司汀(Carmustine)、卡莫司汀藥片(Carmustine Wafer)、Casodex®、CC-5013、CCI-779、CCNU、CDDP、CeeNU、Cerubidine®、西妥昔單抗(Cetuximab)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、順鉑(Cisplatin)、嗜橙菌因子(Citrovorum Factor)、克拉屈濱(Cladribine)、可的松(Cortisone)、Cosmegen®、CPT-11、環磷醯胺(Cyclophosphamide)、Cytadren®、阿糖胞苷(Cytarabine)、阿糖胞苷脂質體、Cytosar-U®、Cytoxan®、達卡巴嗪(Dacarbazine)、達克金(Dacogen)、更生黴素(Dactinomycin)、阿法達貝泊汀(Darbepoetin Alfa)、達沙替尼(Dasatinib)、道諾黴素(Daunomycin)、柔紅黴素(Daunorubicin)、柔紅黴素鹽酸鹽、柔紅黴素脂質體、DaunoXome®、地卡特隆(Decadron)、地西他濱(Decitabine)、Delta-Cortef®、Deltasone®、德尼白介素(Denileukin)、地飛托克(Diftitox)、DepoCyt™、地塞米松(Dexamethasone)、乙酸地塞米松(Dexamethasone Acetate)、地塞米松磷酸鈉(Dexamethasone Sodium Phosphate)、地克薩松(Dexasone)、右雷佐生(Dexrazoxane)、DHAD、DIC、迪奧帶斯(Diodex)、多西他賽(Docetaxel)、Doxil®、多柔比星(Doxorubicin)、多柔比星脂質體、Droxia™、DTIC、DTIC-Dome®、Duralone®、Efudex®、Eligard™、Ellence™、Eloxatin™、Elspar®、Emcyt®、依那普利(Enalapril)、表柔比星(Epirubicin)、阿法依伯汀(Epoetin Alfa)、艾比特思(Erbitux)、厄洛替尼(Erlotinib)、歐文氏菌屬L-天門冬醯胺酶(Erwinia L-asparaginase)、雌莫司汀(Estramustine)、胺磷汀(Ethyol)、Etopophos®、依託泊苷(Etoposide)、磷酸依託泊苷(Etoposide Phosphate)、Eulexin®、依維莫司(Everolimus)、Evista®、依西美坦(Exemestane)、Fareston®、Faslodex®、Femara®、非格司亭(Filgrastim)、氟尿苷(Floxuridine)、Fludara®、氟達拉濱(Fludarabine)、Fluoroplex®、氟尿嘧啶(Fluorouracil)、氟尿嘧啶(乳霜)、氟甲睪酮(Fluoxymesterone)、氟他胺(Flutamide)、亞葉酸、FUDR®、氟維司群(Fulvestrant)、吉非替尼(Gefitinib)、吉西他濱(Gemcitabine)、吉妥單抗奧佐米星(Gemtuzumab ozogamicin)、健擇(Gemzar)、Gleevec™、Gliadel®藥片、GM-CSF、戈舍瑞林(Goserelin)、粒細胞-群落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞群落刺激因子(G-MCSF)、Halotestin®、Herceptin®、海塞多(Hexadrol)、Hexalen®、六甲基蜜胺(Hexamethylmelamine)、HMM、Hycamtin®、Hydrea®、Hydrocort Acetate®、氫化可的松(Hydrocortisone)、氫化可的松磷酸鈉(Hydrocortisone Sodium Phosphate)、氫化可的松琥珀酸鈉(Hydrocortisone Sodium Succinate)、磷酸氫化可通(Hydrocortone Phosphate)、羥基脲、異貝莫單抗(Ibritumomab)、替伊莫單抗(Ibritumomab Tiuxetan)、Idamycin®、Idarubicin Ifex®、干擾素-α、干擾素-α-2b (PEG偶聯物)、異環磷醯胺(Ifosfamide)、介白素-11 (IL-11)、介白素-2 (IL-2)、甲磺酸伊馬替尼(Imatinib mesylate)、咪唑羧醯胺(Imidazole Carboxamide)、Intron A®、Iressa®、伊立替康(Irinotecan)、異維A酸(Isotretinoin)、伊沙匹隆(Ixabepilone)、Ixempra™、KADCYCLA®、天門冬醯胺酶(Kidrolase) (t)、Lanacort®、拉帕替尼(Lapatinib)、L-天門冬醯胺酶、LCR、來那度胺(Lenalidomide)、來曲唑(Letrozole)、醛氫葉酸(Leucovorin)、瘤可寧(Leukeran)、Leukine™、亮丙瑞林(Leuprolide)、醛基長春鹼(Leurocristine)、Leustatin™、脂質體Ara-C、Liquid Pred®、洛莫司汀(Lomustine)、L-PAM、L-溶肉瘤素、Lupron®、Lupron Depot®、Matulane®、馬克戴斯(Maxidex)、氮芥(Mechlorethamine)、氮芥鹽酸鹽、Medralone®、Medrol®、Megace®、甲地孕酮(Megestrol)、乙酸甲地孕酮(Megestrol Acetate)、美法侖(Melphalan)、巰基嘌呤、美司鈉(Mesna)、Mesnex™、胺甲喋呤(Methotrexate)、胺甲喋呤鈉、甲基潑尼松龍(Methylprednisolone)、Meticorten®、絲裂黴素(Mitomycin)、絲裂黴素-C (Mitomycin-C)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、M-Prednisol®、MTC、MTX、Mustargen®、氮芥(Mustine)、Mutamycin®、Myleran®、Mylocel™、Mylotarg®、Navelbine®、耐拉濱(Nelarabine)、Neosar®、Neulasta™、Neumega®、Neupogen®、Nexavar®、硝苯地平(Nifedipine)、Nilandron®、尼羅替尼(Nilotinib)、尼魯米特(Nilutamide)、Nipent®、氮芥(Nitrogen Mustard)、Novaldex®、Novantrone®、尼普拉特(Nplate)、奧曲肽(Octreotide)、乙酸奧曲肽(Octreotide acetate)、奧法木單抗(Ofatumumab)、Oncospar®、Oncovin®、Ontak®、Onxal™、奧普瑞白介素(Oprelvekin)、Orapred®、Orasone®、奧沙利鉑(Oxaliplatin)、太平洋紫杉醇(Paclitaxel)、太平洋紫杉醇蛋白結合物、帕米膦酸鹽(Pamidronate)、帕尼單抗(Panitumumab)、Panretin®、Paraplatin®、帕唑帕尼(Pazopanib)、Pediapred®、PEG干擾素、培加帕酶(Pegaspargase)、培非司亭(Pegfilgrastim)、PEG-INTRON™、PEG-L-天門冬醯胺酶、培美曲塞(PEMETREXED)、噴司他丁(Pentostatin)、苯丙胺酸氮芥(Phenylalanine Mustard)、Platinol®、Platinol-AQ®、潑尼松龍(Prednisolone)、潑尼松(Prednisone)、Prelone®、丙卡巴肼(Procarbazine)、PROCRIT®、Proleukin®、含有卡莫司汀植入物之普羅非泮20 (Prolifeprospan 20)、Purinethol®、雷洛昔芬(Raloxifene)、Revlimid®、Rheumatrex®、Rituxan®、利妥昔單抗(Rituximab)、Roferon-A®、羅米司亭(Romiplostim)、Rubex®、紅比黴素鹽酸鹽(Rubidomycin hydrochloride)、Sandostatin®、Sandostatin LAR®、沙格司亭(Sargramostim)、Solu-Cortef®、Solu-Medrol®、索拉非尼(Sorafenib)、SPRYCEL™、STI-571、鏈佐星(Streptozocin)、SU11248、舒尼替尼(Sunitinib)、Sutent®、他莫昔芬(Tamoxifen)、Tarceva®、Targretin®、Tasigna®、Taxol®、Taxotere®、Temodar®、替莫唑胺(Temozolomide)、坦羅莫司(Temsirolimus)、替尼泊苷(Teniposide)、TESPA、沙利度胺(Thalidomide)、Thalomid®、TheraCys®、硫鳥嘌呤、Thioguanine Tabloid®、硫代磷醯胺(Thiophosphoamide)、Thioplex®、噻替派(Thiotepa)、TICE®、Toposar®、拓撲替康(Topotecan)、托瑞米芬(Toremifene)、Torisel®、托西莫單抗(Tositumomab)、曲司佐單抗(Trastuzumab)、Treanda®、維A酸(Tretinoin)、Trexall™、Trisenox®、TSPA、TYKERB®、VCR、Vectibix™、Velban®、Velcade®、VePesid®、Vesanoid®、Viadur™、Vidaza®、長春花鹼(Vinblastine)、硫酸長春花鹼(Vinblastine Sulfate)、Vincasar Pfs®、長春新鹼(Vincristine)、長春瑞濱(Vinorelbine)、酒石酸長春瑞濱(Vinorelbine tartrate)、VLB、VM-26、伏立諾他(Vorinostat)、福退癌(Votrient)、VP-16、Vumon®、Xeloda®、Zanosar®、Zevalin™、Zinecard®、Zoladex®、唑來膦酸(Zoledronic acid)、唑林紮(Zolinza)、Zometa®、醛氫葉酸、5-FU、替莫唑胺、吉西他濱、太平洋紫杉醇、瑞格菲尼(Regorafenib)及帕妥珠單抗(Pertuzumab)。
  38. 一種如請求項1、3、6、17、22或33之結合蛋白之用途，其用以製備用於治療個體之疾病或病症之藥物。
  39. 如請求項38之用途，其中該疾病或病症係原發性或轉移性癌症、乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、腺癌、口咽癌、下咽癌、食道癌、胃癌、胰臟癌、肝癌、膽囊癌、膽管癌、小腸癌、泌尿道癌、腎癌、膀胱癌、尿道上皮癌、女性生殖道癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、絨膜癌、妊娠滋養細胞疾病、男性生殖道癌、前列腺癌、精囊癌、睪丸癌、生殖細胞腫瘤、內分泌腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、腦垂體癌、皮膚癌、血管瘤、黑素瘤、肉瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、腦腫瘤、神經腫瘤、眼睛腫瘤、腦膜腫瘤、星形細胞瘤、神經膠質瘤、神經膠質母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、神經瘤、神經母細胞瘤、神經鞘瘤及腦膜瘤、源自造血系統惡性病之實體腫瘤、白血病、淋巴瘤、何傑金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)、非何傑金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)、胃癌、膀胱癌、前列腺癌、直腸癌、造血系統惡性病、無β脂蛋白血症、手足發紺、急性白血病、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、B細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、慢性骨髓細胞白血病(CML)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、結腸直腸癌、毛細胞白血病、惡性淋巴瘤、惡性組織細胞增多病、惡性黑素瘤、多發性骨髓瘤、胰臟癌、副腫瘤症候群、惡性高鈣血症、肉瘤、實體腫瘤、黃斑變性、1型糖尿病、糖尿病性視網膜病變、動脈粥樣硬化，或特徵在於血管過度生長、水腫或異常DLL4或VEGF活性之任何其他血管生成依賴性或非依賴性疾病。
  40. 如請求項38之用途，其中投與該個體係非經腸、皮下、肌內、靜脈內、眼內、關節內、枝氣管內、腹內、囊內、軟骨內、腔內、體腔內、小腦內、腦室內、結腸內、子宮頸內、胃內、肝內、心肌內、骨內、骨盆內、心包內、腹膜腔內、胸膜內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、脊柱內、滑膜內、胸內、子宮內、膀胱內、濃注(bolus)、陰道、直腸、經頰、舌下、鼻內或經皮。
  41. 一種產生能夠結合VEGF及DLL4之結合蛋白或其片段之方法，該方法包括以下步驟： a)獲得編碼第一親代抗體或其結合部分之核酸，該第一親代抗體或其結合部分能夠結合選自VEGF及DLL4之第一靶； b)獲得編碼第二親代抗體或其結合部分之核酸，該第二親代抗體或其結合部分能夠結合選自VEGF及DLL4之第二靶； c)使用步驟(a)及(b)之核酸製備編碼如請求項1、3、6、17、22或33中任一項之多肽鏈之核酸構築體； d)該多肽鏈在經分離之宿主細胞中表現， 從而產生能夠結合VEGF及DLL4之結合蛋白。
  42. 如請求項41之方法，其中該方法產生如請求項1、3、6、17、22或33中任一項之結合蛋白。
  43. 如請求項41之方法，其中該Fc區係變體序列Fc區。
  44. 如請求項41之方法，其中該Fc區係來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD之Fc區。
  45. 如請求項41之方法，其中該第一親代抗體或其結合部分結合該第一靶之親和力及/或效力與該第二親代抗體或其結合部分結合該第二靶之親和力及/或效力不同。
  46. 一種藉由免疫分析檢測VEGF或DLL4中之至少一者或其片段存在測試試樣中之方法， 其中該免疫分析包括使該測試試樣與至少一種結合蛋白及至少一種可檢測標記接觸，其中該至少一種結合蛋白包括如請求項1、3、6、17、22或33中任一項之結合蛋白。
  47. 如請求項46之方法，其中該至少一種可檢測標記包括放射標記、酶、螢光標記、發光標記、生物發光標記、磁性標記或生物素。
  48. 如請求項46之方法，其中該至少一種可檢測標記位於該至少一種結合蛋白上。
  49. 如請求項46之方法，其進一步包括： (i)使該測試試樣與該至少一種結合蛋白接觸，其中該結合蛋白結合至該測試試樣中VEGF或DLL4或其片段上之表位以形成第一複合物； (ii)使該第一複合物與至少一種可檢測標記接觸以形成第二複合物，其中該可檢測標記結合至該結合蛋白或結合至該測試試樣中VEGF或DLL4或其片段上未由該結合蛋白結合之表位；及 (iii)基於該第二複合物中之可檢測標記產生之信號檢測該測試試樣中VEGF或DLL4或其片段之存在，其中該VEGF或DLL4或其片段之存在與該可檢測標記產生之信號直接相關。
  50. 如請求項46之方法，其進一步包括： (i)使該測試試樣與該至少一種結合蛋白接觸，其中該結合蛋白結合至該測試試樣中VEGF或DLL4或其片段上之表位以形成第一複合物； (ii)使該第一複合物與至少一種可檢測標記接觸以形成第二複合物，其中該可檢測標記與該測試試樣中之VEGF或DLL4或其片段競爭結合至該結合蛋白；及 (iii)基於該第二複合物中之可檢測標記產生之信號檢測該測試試樣中VEGF或DLL4或其片段之存在，其中該VEGF或DLL4或其片段之存在與該可檢測標記產生之信號間接相關。
  51. 如請求項46至50中任一項之方法，其中該測試試樣係來自患者，且該方法進一步包括診斷、預測或評估該患者之治療性或預防性治療之效能，且 其中若該方法進一步包括評估該患者之治療性或預防性治療之效能，則該方法視情況進一步包括視需要修改該患者之治療性/預防性治療以改良效能。
  52. 如請求項46至50中任一項之方法，其中該方法適用於自動化系統或半自動化系統。
  53. 如請求項46至50中任一項之方法，其中該方法檢測DLL4及VEGF二者在試樣中之存在。
  54. 一種藉由免疫分析測定VEGF或DLL4或其片段在測試試樣中之量或濃度之方法，其中該免疫分析包括： (a)使該測試試樣與至少一種結合蛋白及至少一種可檢測標記接觸；及 (b)比較由該可檢測標記產生之信號與由對照或校準品產生之信號，該對照或校準品包括已知量或濃度之VEGF或DLL4或其片段且已與該至少一種結合蛋白及該至少一種可檢測標記接觸， 其中該校準品視情況係如下校準品系列之一部分：其中各校準品與該系列中之其他校準品不同之處在於具有不同量或濃度之VEGF或DLL4或其片段，且 其中該至少一種結合蛋白包括如請求項1、3、6、17、22或33中任一項之結合蛋白。
  55. 如請求項54之方法，其中該至少一種可檢測標記包括放射標記、酶、螢光標記、發光標記、生物發光標記、磁性標記或生物素。
  56. 如請求項54之方法，其中該至少一種可檢測標記位於該至少一種結合蛋白上。
  57. 如請求項54之方法，其進一步包括： (i)使該測試試樣與至少一種結合蛋白接觸，其中該結合蛋白結合至該測試試樣中VEGF或DLL4或其片段上之表位以形成第一複合物； (ii)使該第一複合物與至少一種可檢測標記接觸以形成第二複合物，其中該可檢測標記結合至該測試試樣中VEGF或DLL4或其片段上未由該結合蛋白結合之表位；及 (iii)基於該第二複合物中之該可檢測標記產生之信號測定VEGF或DLL4或其片段在該測試試樣中之量或濃度， 其中該VEGF或DLL4或其片段在該測試試樣中之量或濃度與該可檢測標記產生之信號成正比。
  58. 如請求項54之方法，其進一步包括： (i)使該測試試樣與至少一種結合蛋白接觸，其中該結合蛋白結合至該測試試樣中VEGF或DLL4或其片段上之表位以形成第一複合物； (ii)使該第一複合物與至少一種可檢測標記接觸以形成第二複合物，其中該可檢測標記與該測試試樣中之VEGF或DLL4或其片段競爭結合至該結合蛋白；及 (iii)基於該第二複合物中之該可檢測標記產生之信號測定VEGF或DLL4或其片段在該測試試樣中之量或濃度， 其中該VEGF或DLL4或其片段在該測試試樣中之存在與該可檢測標記產生之信號成反比。
  59. 如請求項54至58中任一項之方法，其中該測試試樣係來自患者，且該方法進一步包括診斷、預測或評估該患者之治療性或預防性治療之效能，且 其中若該方法進一步包括評估該患者之治療性或預防性治療之效能，則該方法視情況進一步包括視需要修改該患者之該治療性/預防性治療以改良效能。
  60. 如請求項54至58中任一項之方法，其中該方法適用於自動化系統或半自動化系統。
  61. 如請求項54至58中任一項之方法，其中該方法測定DLL4及VEGF在該試樣中之量或濃度。
  62. 一種套組，其用於分析測試試樣中DLL4、VEGF或二者之存在、量或濃度，該套組包括 (a)用於分析該測試試樣中VEGF及/或DLL4或其片段之說明書；及 (b)至少一種結合蛋白，其包括如請求項1、3、6、17、22或33中任一項之結合蛋白。
  63. 一種結合蛋白，其包括選自SEQ ID NO: 55至63及74之VH序列。
  64. 一種結合蛋白，其包括選自SEQ ID NO: 64至73之VL序列。
  65. 一種結合蛋白，其包括選自SEQ ID NO: 55至63及74之VH序列及選自SEQ ID NO: 64至73之VL序列。
  66. 一種包括多肽鏈之結合蛋白，其中該多肽鏈包括VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1係第一重鏈可變區域； VD2係第二重鏈可變區域； C係重鏈恆定區域； X1係連接體，但其並非CH1； X2係Fc區； n為0或1；且 其中該結合蛋白結合VEGF及DLL4，且另外其中該結合蛋白結合： (a) VEGF，其中解離速率常數(K解離 )為至多約5.42 × 10-5 s-1 及/或解離常數(KD )為至多約7.40 × 10-9 M，如藉由表面電漿共振所測定；或 (b) DLL4，其中解離速率常數(K解離 )為至多約2.63 × 10-3 s-1 及/或解離常數(KD )為至多約3.40 × 10-8 M或5.00 × 10-8 M，如藉由表面電漿共振所測定。
  67. 一種包括多肽鏈之結合蛋白，其中該多肽鏈包括VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1係第一輕鏈可變區域； VD2係第二輕鏈可變區域； C係輕鏈恆定區域； X1係連接體，但其並非CH1； X2不包括Fc區； n為0或1；且 其中該結合蛋白結合VEGF及DLL4，且另外其中該結合蛋白結合： (a) VEGF，其中解離速率常數(K解離 )為至多約5.42 × 10-5 s-1 及/或解離常數(KD )為至多約7.40 × 10-9 M，如藉由表面電漿共振所測定；或 (b) DLL4，其中解離速率常數(K解離 )為至多約2.63 × 10-3 s-1 及/或解離常數(KD )為至多約3.40 × 10-8 M或5.00 × 10-8 M，如藉由表面電漿共振所測定。
  68. 一種包括第一及第二多肽鏈之結合蛋白，其中該第一多肽鏈包括VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1係第一重鏈可變區域； VD2係第二重鏈可變區域； C係重鏈恆定區域； X1係連接體，但其並非CH1；且 X2係Fc區； n為0或1；且 其中該第二多肽鏈包括VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1係第一輕鏈可變區域； VD2係第二輕鏈可變區域； C係輕鏈恆定區域； X1係連接體，但其並非CH1； X2不包括Fc區； 且n為0或1；且 其中該結合蛋白結合VEGF及DLL4，且另外其中該結合蛋白結合： (a) VEGF，其中解離速率常數(K解離 )為至多約5.42 × 10-5 s-1 及/或解離常數(KD )為至多約7.40 × 10-9 M，如藉由表面電漿共振所測定；或 (b) DLL4，其中解離速率常數(K解離 )為至多約2.63 × 10-3 s-1 及/或解離常數(KD )為至多約3.40 × 10-8 M或5.00 × 10-8 M，如藉由表面電漿共振所測定。
  69. 一種包括四條多肽鏈之結合蛋白，其中兩條多肽鏈包括VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1係第一重鏈可變區域； VD2係第二重鏈可變區域； C係重鏈恆定區域； X1係連接體，但其並非CH1； X2係Fc區； n為0或1；且 其中兩條多肽鏈包括VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1係第一輕鏈可變區域； VD2係第二輕鏈可變區域； C係輕鏈恆定區域； X1係連接體，但其並非CH1； X2不包括Fc區； n為0或1；且 其中該結合蛋白結合VEGF及DLL4，且另外其中該結合蛋白結合： (a) VEGF，其中解離速率常數(K解離 )為至多約5.42 × 10-5 s-1 及/或解離常數(KD )為至多約7.40 × 10-9 M，如藉由表面電漿共振所測定；或 (b) DLL4，其中解離速率常數(K解離 )為至多約2.63 × 10-3 s-1 及/或解離常數(KD )為至多約3.40 × 10-8 M或5.00 × 10-8 M，如藉由表面電漿共振所測定。
  70. 一種包括四條多肽鏈之結合蛋白，其中兩條多肽鏈包括VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1係第一重鏈可變區域； VD2係第二重鏈可變區域； C係重鏈恆定區域； X1係連接體，但其並非CH1； X2係Fc區； n為0或1；且 其中兩條多肽鏈包括VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1係第一輕鏈可變區域； VD2係第二輕鏈可變區域； C係輕鏈恆定區域； X1係連接體，但其並非CH1； X2不包括Fc區； 且n為0或1；且 其中 (i)該結合蛋白結合VEGF及DLL4； (ii)該等VD1及VD2重鏈可變區域獨立地包括三個來自SEQ ID NO: 39、41、43、45、47、49、51或53之CDR，其中該等VD1及/或VD2重鏈可變區域中之至少一者包括三個來自SEQ ID NO: 39之CDR；及/或其中該等VD1及VD2輕鏈可變區域獨立地包括三個來自SEQ ID NO: 40、42、44、46、48、50、52或54之CDR，其中該等VD1及/或VD2輕鏈可變區域中之至少一者包括三個來自SEQ ID NO: 40之CDR；且 (iii)該結合蛋白結合： (a) VEGF，其中解離速率常數(K解離 )為至多約5.42 × 10-5 s-1 及/或解離常數(KD )為至多約7.40 × 10-9 M，如藉由表面電漿共振所測定；或 (b) DLL4，其中解離速率常數(K解離 )為至多約2.63 × 10-3 s-1 及/或解離常數(KD )為至多約3.40 × 10-8 M或5.00 × 10-8 M，如藉由表面電漿共振所測定。
  71. 如請求項66至70之結合蛋白，其中該結合蛋白結合VEGF及DLL4，且其中該重鏈可變區域包括SEQ ID NO: 55至63及74。
  72. 如請求項66至70之結合蛋白，其中該結合蛋白結合VEGF及DLL4，且其中該輕鏈可變區域包括SEQ ID NO: 64至73。
  73. 如請求項66至70之結合蛋白，其中該結合蛋白結合VEGF及DLL4，其中該重鏈可變區域包括SEQ ID NO: 55至63及74，且其中該輕鏈可變區域包括SEQ ID NO: 64至73。
  74. 3、6、17、33及66至70中任一項之結合蛋白，其中(X1)n係選自SEQ ID NO: 1至38。
  75. 3、6、17、33及66至70中任一項之結合蛋白，其中該等VD1重鏈及VD1輕鏈可變區域(若存在)及/或VD2重鏈及VD2輕鏈可變區域(若存在)分別包括三個來自SEQ ID NO: 39及40之CDR。
  76. 3、6、17、33及66至70中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白係：h1A11.1-L-AV (包括SEQ ID NO: 55及64)、h1A11.1-S-AV (包括SEQ ID NO: 56及65)、h1A11.1-GS10-AV (包括SEQ ID NO: 57及66)、h1A11.1-GS14-AV (包括SEQ ID NO: 58及67)、AV-L-h1A11.1 (包括SEQ ID NO: 59及68)、AV-S-h1A11.1 (包括SEQ ID NO: 60及69)、AV-GS6-h1A11.1 (包括SEQ ID NO: 61及70)、AV-GS10-h1A11.1 (包括SEQ ID NO: 62及71)、AV-GS14-h1A11.1 (包括SEQ ID NO: 63及72)或h1A11.1-SL-Av (包括SEQ ID NO: 73及74)。
  77. 3、6、17、33及66至70中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白在流式細胞測量術(FACS)分析中以至多約5.04 nM之EC50 結合至表現DLL4之細胞。
  78. 3、6、17、33及66至70中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白在Notch競爭ELISA分析或競爭FACS分析中以至多約3503 nM之IC50干擾DLL4與Notch1結合。
  79. 3、6、17、33及66至70中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白在Notch報告子分析中以至多約7.47 nM之IC50防止Notch1活化。
  80. 3、6、17、33及66至70中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白在捕獲ELISA分析中以至多約2.50 nM之EC50結合至VEGF。
  81. 3、6、17、33及66至70中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白在VEGF競爭ELISA分析中以至多約37.2 nM之IC50干擾細胞存活/增殖。
  82. 3、6、17、33及66至70中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白在內皮細胞增殖分析中以至多約4.2 nM之IC50干擾VEGF與VEGFR結合。
  83. 3、6、17、33及66至70中任一項之結合蛋白，其中與未使用該結合蛋白治療之小鼠相比，該結合蛋白將雌性小鼠中之HT-29人類結腸直腸腺癌腫瘤異種移植物之大小減小至少約47%且將腫瘤生長延遲至少約42%。
  84. 3、6、17、33及66至70中任一項之結合蛋白，其中與未使用該結合蛋白治療之小鼠相比，該結合蛋白將雌性小鼠中之U87-MG神經膠質母細胞瘤腫瘤異種移植物之大小減小至少約64%且將腫瘤生長延遲至少約48%。
  85. 3、6、17、33及66至70中任一項之結合蛋白，其中與未使用該結合蛋白治療之小鼠相比，該結合蛋白與替莫唑胺組合將雌性小鼠中之U87-MG神經膠質母細胞瘤腫瘤異種移植物之大小減小至少約65%且將腫瘤生長延遲至少約45%。
  86. 一種結合蛋白，其包括SEQ ID NO: 73及74。
  87. 3及6之結合蛋白，其中該Fc區係來自人類IgG1 LALA突變體之Fc區。
  88. 一種醫藥組合物，其包括： 一或多種胺基酸， 一或多種多糖及/或聚山梨醇酯，及 結合蛋白，其濃度約為0.1 mg/ml至100 mg/ml， 其中該醫藥組合物在約5.0至7.0之pH，且 其中該結合蛋白包括第一及第二多肽鏈，各獨立地包括VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1係第一可變區域； VD2係第二可變區域； C係恆定區域； X1係連接體； X2係Fc區； n為0或1， 其中該等第一及第二多肽鏈上之VD1區域形成第一功能靶結合位點且該等第一及第二多肽鏈上之VD2區域形成第二功能靶結合位點，且其中該結合蛋白能夠結合DLL4及VEGF。
  89. 如請求項88之醫藥組合物，其中至少一種胺基酸係組胺酸且以約10 mM至20 mM或約15 mM之濃度存在。
  90. 如請求項88或89之醫藥組合物，其中該組合物之pH為約5.5至6.0、或約5.5、或約6.0。
  91. 如請求項88或89之醫藥組合物，其中至少一種多糖係蔗糖且以約0至8.0%重量/體積(w/v)之濃度存在。
  92. 如請求項88或89之醫藥組合物，其中該聚山梨醇酯係聚山梨醇酯80且濃度約為0至0.06% w/v。
  93. 如請求項88或89之醫藥組合物，其中至少一種胺基酸係精胺酸且以約0至1.5% w/v之濃度存在。
  94. 如請求項88或89之醫藥組合物，其中該結合蛋白以下列濃度存在：約1 mg/ml至100 mg/ml、或約1 mg/ml至15 mg/ml、或約1 mg/ml至7.5 mg/ml、或約2.5 mg/ml至7.5 mg/ml、或約5 mg/ml至7.5 mg/ml、或約25 mg/ml至100 mg/ml、或約20 mg/ml至60 mg/ml、或約25 mg/ml至50 mg/ml、或約25 mg/ml、或約50 mg/ml。
  95. 如請求項88或89之醫藥組合物，其中該結合蛋白之濃度為約0.1 mg/ml至60 mg/ml、或約0.1 mg/ml至25 mg/ml、或約1.0 mg/ml至60 mg/ml、或約0.5 mg/ml至60 mg/ml、或約0.1 mg/ml至2.0 mg/ml、或約0.5 mg/ml至2.0 mg/ml、或約1 mg/ml至5 mg/ml、或約1 mg/ml至7.5 mg/ml、或約1 mg/ml至15 mg/ml、或約0.5 mg/ml、或約1.0 mg/ml。
  96. 如請求項88或89之醫藥組合物，其中該醫藥組合物係凍乾。
  97. 如請求項88或89之醫藥組合物，其中該醫藥組合物係水合或已凍乾及再水合。
  98. 如請求項97之醫藥組合物，其中該醫藥組合物係呈包括右旋糖及/或鹽水之水合溶液。
  99. 如請求項98之醫藥組合物，其中該右旋糖之濃度約為5% w/v及/或該鹽水之濃度約為0.9% w/v
  100. 如請求項88或89之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包括約15 mM組胺酸、約0.03% (w/v)聚山梨醇酯80、約4.0% (w/v)蔗糖及約25 mg/ml該結合蛋白或約1 mg/ml至15 mg/ml該結合蛋白，且pH約為6.0，其中該結合蛋白包括SEQ ID NO: 73及SEQ ID NO: 74。
  101. 如請求項88或89之醫藥組合物，其中該結合蛋白包括： (i)形成DLL4功能靶結合位點之可變區域，其包括： 三個來自SEQ ID NO: 39之CDR及三個來自SEQ ID NO: 40之CDR，及 (ii)形成VEGF功能靶結合位點之可變區域，其包括： 三個來自SEQ ID NO: 41之CDR及三個來自SEQ ID NO: 42之CDR， 三個來自SEQ ID NO: 43之CDR及三個來自SEQ ID NO: 44之CDR， 三個來自SEQ ID NO: 45之CDR及三個來自SEQ ID NO: 46之CDR， 三個來自SEQ ID NO: 47之CDR及三個來自SEQ ID NO: 48之CDR， 三個來自SEQ ID NO: 49之CDR及三個來自SEQ ID NO: 50之CDR， 三個來自SEQ ID NO: 51之CDR及三個來自SEQ ID NO: 52之CDR，或 三個來自SEQ ID NO: 53之CDR及三個來自SEQ ID NO: 54之CDR。
  102. 如請求項88或89之醫藥組合物，其中該結合蛋白包括： (i)形成DLL4功能靶結合位點之可變區域，其包括： SEQ ID NO: 39及/或SEQ ID NO: 40，及 (ii)形成VEGF功能靶結合位點之可變區域，其包括： 選自由SEQ ID NO: 41至54組成之群之序列。
  103. 如請求項88或89之醫藥組合物，其中該結合蛋白包括第一多肽鏈，該第一多肽鏈包括第一VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1係第一重鏈可變區域； VD2係第二重鏈可變區域； C係重鏈恆定區域； X1係連接體； X2係Fc區； n為0或1，且 其中該結合蛋白包括第二多肽鏈，該第二多肽鏈包括第二VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1係第一輕鏈可變區域； VD2係第二輕鏈可變區域； C係輕鏈恆定區域； X1係連接體； 對於(X1)n而言，n為0或1； 對於(X2)n而言，n為0， 其中該等第一及第二多肽鏈上之VD1區域形成第一功能靶結合位點且該等第一及第二多肽鏈上之VD2區域形成第二功能靶結合位點。
  104. 如請求項88或89之醫藥組合物，其中該結合蛋白包括： (i)形成DLL4功能靶結合位點之可變區域，其包括： SEQ ID NO: 39及SEQ ID NO: 40，及 (ii)形成VEGF功能靶結合位點之可變區域，其包括： SEQ ID NO: 41及SEQ ID NO: 42， SEQ ID NO: 43及SEQ ID NO: 44， SEQ ID NO: 45及SEQ ID NO: 46， SEQ ID NO: 47及SEQ ID NO: 48， SEQ ID NO: 49及SEQ ID NO: 50， SEQ ID NO: 51及SEQ ID NO: 52，或 SEQ ID NO: 53及SEQ ID NO: 54。
  105. 如請求項88或89之醫藥組合物，其中該結合蛋白包括兩條第一多肽鏈及兩條第二多肽鏈，形成四個功能靶結合位點。
  106. 如請求項88或89之醫藥組合物，其中該結合蛋白能夠結合： (a) VEGF，其中解離常數(KD )為至多約7.40 × 10-9 M，如藉由表面電漿共振所量測；及/或 (b) DLL4，其中解離常數(KD )為至多約3.40 × 10-8 M或5.00 × 10-8 M，如藉由表面電漿共振所量測。
  107. 如請求項88或89之醫藥組合物，其中 (a)該結合蛋白中之連接體X1包括SEQ ID NO 1至38中之任一者或基於G/S之序列， (b)該結合蛋白中之連接體X1並非CL， (c)該結合蛋白之Fc區係變體序列Fc區， (d)該Fc區係來自人類IgG1 LALA突變體之Fc區， (e)該結合蛋白之Fc區係來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD或其變體之Fc區，及/或 (f)該結合蛋白係結晶之結合蛋白。
  108. 如請求項88或89之醫藥組合物，其中該結合蛋白包括： SEQ ID NO: 55及SEQ ID NO: 56， SEQ ID NO: 57及SEQ ID NO: 58， SEQ ID NO: 59及SEQ ID NO: 60， SEQ ID NO: 61及SEQ ID NO: 62， SEQ ID NO: 63及SEQ ID NO: 64， SEQ ID NO: 65及SEQ ID NO: 66， SEQ ID NO: 67及SEQ ID NO: 68， SEQ ID NO: 69及SEQ ID NO: 70， SEQ ID NO: 71及SEQ ID NO: 72，或 SEQ ID NO: 73及SEQ ID NO: 74。
  109. 如請求項88或89之醫藥組合物，其中該結合蛋白包括： (i)形成DLL4功能靶結合位點之可變區域，其包括： 三個來自SEQ ID NO: 39之CDR及三個來自SEQ ID NO: 40之CDR，及 (ii)形成VEGF功能靶結合位點之可變區域，其包括： 三個來自SEQ ID NO: 41之CDR及三個來自SEQ ID NO: 42之CDR。
  110. 如請求項88或89之醫藥組合物，其中該結合蛋白包括： (i)形成DLL4功能靶結合位點之可變區域，其包括： SEQ ID NO: 39及SEQ ID NO: 40，及 (ii)形成VEGF功能靶結合位點之可變區域，其包括： SEQ ID NO: 41及SEQ ID NO: 42。
  111. 如請求項88或89之醫藥組合物，其中該結合蛋白包括h1A11.1-SL-Av (包括SEQ ID NO: 73及74)。
  112. 如請求項88或89之醫藥組合物，其中該Fc區係來自人類IgG1 LALA突變體之Fc區。
  113. 如請求項88或89之醫藥組合物，其進一步包括至少一種其他劑。
  114. 如請求項113之醫藥組合物，其中該至少一種其他劑包括以下中之至少一者：免疫黏著分子、成像劑、治療劑、細胞毒性劑、放射標記、酶、螢光標記、發光標記、生物發光標記、磁性標記、生物素、抗代謝物、烷基化劑、抗生素、生長因子、細胞因子、抗血管生成劑、抗有絲分裂劑、蒽環素、毒素或細胞凋亡劑、化學治療劑、成像劑、血管生成抑制劑、激酶抑制劑(包含(但不限於)KDR及TIE-2抑制劑)、共刺激分子調節劑(包含(但不限於)抗-B7.1、抗-B7.2、CTLA4-Ig、抗-CD20)、黏著分子阻斷劑(包含(但不限於)抗-LFA-1抗體、抗-E/L選擇素抗體、抗-VEGF mAb、抗-DLL4 mAb、小分子抑制劑)、抗-細胞因子抗體或其功能片段(包含(但不限於)抗-IL-18、抗-TNF或抗-IL-6/細胞因子受體抗體)、胺甲喋呤、環孢素、雷帕黴素、FK506、可檢測標記或報告子、TNF拮抗劑、抗風濕劑、肌肉鬆弛劑、麻醉藥品、非類固醇抗發炎藥(NSAID)、鎮痛劑、麻醉劑、鎮靜劑、局部麻醉劑、神經肌肉阻斷劑、抗微生物劑、抗牛皮癬劑、皮質類固醇、同化類固醇、紅血球生成素、免疫、免疫球蛋白、免疫阻抑劑、生長激素、激素代替藥物、放射性藥物、抗抑鬱劑、抗精神病劑、刺激劑、哮喘藥、β激動劑、吸入類固醇、腎上腺素或類似物、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗高血壓劑、利尿劑、腎上腺素能受體拮抗劑、鈣通道阻斷劑、腎素抑制劑、ACE抑制劑、血管緊張素II受體拮抗劑、血管舒張劑、α-2激動劑、可樂定、甲基多巴、肼屈嗪、哌唑嗪、利血平、莫索尼定、胍法辛、培哚普利/吲達帕胺、洛非西定、甲酪胺酸、抗凝血劑、華法林、肝素、低分子量肝素、達肝素、阿加曲班、比伐盧定、來匹盧定及右旋糖。
  115. 如請求項113之醫藥組合物，其中該至少一種其他劑包括以下中之至少一者：13-順式-視黃酸、2-CdA、2-氯去氧腺苷、5-阿紮胞苷、5-氟尿嘧啶、抗-VEGF mAb、抗-DLL4 mAb、5-FU、6-巰基嘌呤、6-MP、6-TG、6-硫鳥嘌呤、阿布沙尼、Accutane®、放線菌素-D、Adriamycin®、Adrucil®、Afinitor®、Agrylin®、Ala-Cort®、阿地白介素、阿來組單抗、ALIMTA、阿利維A酸、Alkaban-AQ®、Alkeran®、全反式視黃酸、α干擾素、六甲蜜胺、胺甲喋呤(Amethopterin)、胺磷汀、胺魯米特、阿那格雷、Anandron®、阿那曲唑、阿糖胞嘧啶、Ara-C Aranesp®、Aredia®、Arimidex®、Aromasin®、Arranon®、三氧化二砷、Arzerra™、天門冬醯胺酶、ATRA、Avastin®、阿紮胞苷、BCG、BCNU、苯達莫司汀、貝伐珠單抗、貝沙羅汀、BEXXAR®、比卡魯胺、BiCNU、Blenoxane®、博來黴素、硼替佐米、白消安、Busulfex®、C225、醛氫葉酸鈣、Campath®、Camptosar®、喜樹鹼-11、卡培他濱、Carac™、卡鉑、卡莫司汀、卡莫司汀藥片、Casodex®、CC-5013、CCI-779、CCNU、CDDP、CeeNU、Cerubidine®、西妥昔單抗、苯丁酸氮芥、順鉑、嗜橙菌因子、克拉屈濱、可的松、Cosmegen®、CPT-11、環磷醯胺、Cytadren®、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂質體、Cytosar-U®、Cytoxan®、達卡巴嗪、達克金、更生黴素、阿法達貝泊汀、達沙替尼、道諾黴素、柔紅黴素、柔紅黴素鹽酸鹽、柔紅黴素脂質體、DaunoXome®、地卡特隆、地西他濱、Delta-Cortef®、Deltasone®、德尼白介素、地飛托克、DepoCyt™、地塞米松、乙酸地塞米松、地塞米松磷酸鈉、地克薩松、右雷佐生、DHAD、DIC、迪奧帶斯、多西他賽、Doxil®、多柔比星、多柔比星脂質體、Droxia™、DTIC、DTIC-Dome®、Duralone®、Efudex®、Eligard™、Ellence™、Eloxatin™、Elspar®、Emcyt®、依那普利、表柔比星、阿法依伯汀、艾比特思、厄洛替尼、歐文氏菌屬L-天門冬醯胺酶、雌莫司汀、胺磷汀、Etopophos®、依託泊苷、磷酸依託泊苷、Eulexin®、依維莫司、Evista®、依西美坦、Fareston®、Faslodex®、Femara®、非格司亭、氟尿苷、Fludara®、氟達拉濱、Fluoroplex®、氟尿嘧啶、氟尿嘧啶(乳霜)、氟甲睪酮、氟他胺、亞葉酸、FUDR®、氟維司群、吉非替尼、吉西他濱、吉妥單抗奧佐米星、健擇、Gleevec™、Gliadel®藥片、GM-CSF、戈舍瑞林、粒細胞-群落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞群落刺激因子(G-MCSF)、Halotestin®、Herceptin®、海塞多、Hexalen®、六甲基蜜胺、HMM、Hycamtin®、Hydrea®、Hydrocort Acetate®、氫化可的松、氫化可的松磷酸鈉、氫化可的松琥珀酸鈉、磷酸氫化可通、羥基脲、異貝莫單抗、替伊莫單抗、Idamycin®、Idarubicin Ifex®、干擾素-α、干擾素-α-2b (PEG偶聯物)、異環磷醯胺、介白素-11 (IL-11)、介白素-2 (IL-2)、甲磺酸伊馬替尼、咪唑羧醯胺、Intron A®、Iressa®、伊立替康、異維A酸、伊沙匹隆、Ixempra™、KADCYCLA®、天門冬醯胺酶(t)、Lanacort®、拉帕替尼、L-天門冬醯胺酶、LCR、來那度胺、來曲唑、醛氫葉酸、瘤可寧、Leukine™、亮丙瑞林、醛基長春鹼、Leustatin™、脂質體Ara-C、Liquid Pred®、洛莫司汀、L-PAM、L-溶肉瘤素、Lupron®、Lupron Depot®、Matulane®、馬克戴斯、氮芥(Mechlorethamine)、氮芥鹽酸鹽、Medralone®、Medrol®、Megace®、甲地孕酮、乙酸甲地孕酮、美法侖、巰基嘌呤、美司鈉、Mesnex™、胺甲喋呤(Methotrexate)、胺甲喋呤鈉、甲基潑尼松龍、Meticorten®、絲裂黴素、絲裂黴素-C、米托蒽醌、M-Prednisol®、MTC、MTX、Mustargen®、氮芥、Mutamycin®、Myleran®、Mylocel™、Mylotarg®、Navelbine®、耐拉濱、Neosar®、Neulasta™、Neumega®、Neupogen®、Nexavar®、硝苯地平、Nilandron®、尼羅替尼、尼魯米特、Nipent®、氮芥(Nitrogen Mustard)、Novaldex®、Novantrone®、尼普拉特、奧曲肽、乙酸奧曲肽、奧法木單抗、Oncospar®、Oncovin®、Ontak®、Onxal™、奧普瑞白介素、Orapred®、Orasone®、奧沙利鉑、太平洋紫杉醇、太平洋紫杉醇蛋白結合物、帕米膦酸鹽、帕尼單抗、Panretin®、Paraplatin®、帕唑帕尼、Pediapred®、PEG干擾素、培加帕酶、培非司亭、PEG-INTRON™、PEG-L-天門冬醯胺酶、培美曲塞(PEMETREXED)、噴司他丁、苯丙胺酸氮芥、Platinol®、Platinol-AQ®、潑尼松龍、潑尼松、Prelone®、丙卡巴肼、PROCRIT®、Proleukin®、含有卡莫司汀植入物之普羅非泮20、Purinethol®、雷洛昔芬、Revlimid®、Rheumatrex®、Rituxan®、利妥昔單抗、Roferon-A®、羅米司亭、Rubex®、紅比黴素鹽酸鹽、Sandostatin®、Sandostatin LAR®、沙格司亭、Solu-Cortef®、Solu-Medrol®、索拉非尼、SPRYCEL™、STI-571、鏈佐星、SU11248、舒尼替尼、Sutent®、他莫昔芬、Tarceva®、Targretin®、Tasigna®、Taxol®、Taxotere®、Temodar®、替莫唑胺、坦羅莫司、替尼泊苷、TESPA、沙利度胺、Thalomid®、TheraCys®、硫鳥嘌呤、Thioguanine Tabloid®、硫代磷醯胺、Thioplex®、噻替派、TICE®、Toposar®、拓撲替康、托瑞米芬、Torisel®、托西莫單抗、曲司佐單抗、Treanda®、維A酸、Trexall™、Trisenox®、TSPA、TYKERB®、VCR、Vectibix™、Velban®、Velcade®、VePesid®、Vesanoid®、Viadur™、Vidaza®、長春花鹼、硫酸長春花鹼、Vincasar Pfs®、長春新鹼、長春瑞濱、酒石酸長春瑞濱、VLB、VM-26、伏立諾他、福退癌、VP-16、Vumon®、Xeloda®、Zanosar®、Zevalin™、Zinecard®、Zoladex®、唑來膦酸、唑林紮、Zometa®、醛氫葉酸、5-FU、替莫唑胺、吉西他濱、太平洋紫杉醇、瑞格菲尼及帕妥珠單抗。
  116. 如請求項113之醫藥組合物，其中該至少一種其他劑包括以下中之至少一者：伊立替康、醛氫葉酸、5-FU、福爾菲力(Folfiri)、依那普利、硝苯地平、可樂定、替莫唑胺、吉西他濱、太平洋紫杉醇、瑞格菲尼、卡培他濱及帕妥珠單抗。
  117. 如請求項88或89之醫藥組合物，其用於治療個體之疾病或病症。
  118. 如請求項117之醫藥組合物，其中該疾病或病症係原發性或轉移性癌症、乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、腺癌、口咽癌、下咽癌、食道癌、胃癌、胰臟癌、肝癌、膽囊癌、膽管癌、小腸癌、泌尿道癌、腎癌、膀胱癌、尿道上皮癌、女性生殖道癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、絨膜癌、妊娠滋養細胞疾病、男性生殖道癌、前列腺癌、精囊癌、睪丸癌、生殖細胞腫瘤、內分泌腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、腦垂體癌、皮膚癌、血管瘤、黑素瘤、肉瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤、卡波西氏肉瘤、腦腫瘤、神經腫瘤、眼睛腫瘤、腦膜腫瘤、星形細胞瘤、神經膠質瘤、神經膠質母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、神經瘤、神經母細胞瘤、神經鞘瘤及腦膜瘤、源自造血系統惡性病之實體腫瘤、白血病、淋巴瘤、何傑金氏淋巴瘤、非何傑金氏淋巴瘤、胃癌、膀胱癌、前列腺癌、直腸癌、造血系統惡性病、無β脂蛋白血症、手足發紺、急性白血病、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、B細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、慢性骨髓細胞白血病(CML)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、結腸直腸癌、毛細胞白血病、惡性淋巴瘤、惡性組織細胞增多病、惡性黑素瘤、多發性骨髓瘤、胰臟癌、副腫瘤症候群、惡性高鈣血症、肉瘤、實體腫瘤、黃斑變性、1型糖尿病、糖尿病性視網膜病變、動脈粥樣硬化，或特徵在於血管過度生長、水腫或異常DLL4或VEGF活性之任何其他血管生成依賴性或非依賴性疾病。
  119. 如請求項117之醫藥組合物，其中該醫藥組合物經調配用於皮下、肌內、靜脈內、眼內、關節內、枝氣管內、腹內、囊內、軟骨內、腔內、體腔內、小腦內、腦室內、結腸內、子宮頸內、胃內、肝內、心肌內、骨內、骨盆內、心包內、腹膜腔內、胸膜內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、脊柱內、滑膜內、胸內、子宮內、膀胱內、濃注、陰道、直腸、經頰、舌下、鼻內或經皮投與。
  120. 一種治療方法，其包括向有需要之個體投與如請求項88至119中任一項之醫藥組合物。
  121. 如請求項120之方法，其中投與該醫藥組合物以治療原發性或轉移性癌症、乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、腺癌、口咽癌、下咽癌、食道癌、胃癌、胰臟癌、肝癌、膽囊癌、膽管癌、小腸癌、泌尿道癌、腎癌、膀胱癌、尿道上皮癌、女性生殖道癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、絨膜癌、妊娠滋養細胞疾病、男性生殖道癌、前列腺癌、精囊癌、睪丸癌、生殖細胞腫瘤、內分泌腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、腦垂體癌、皮膚癌、血管瘤、黑素瘤、肉瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤、卡波西氏肉瘤、腦腫瘤、神經腫瘤、眼睛腫瘤、腦膜腫瘤、星形細胞瘤、神經膠質瘤、神經膠質母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、神經瘤、神經母細胞瘤、神經鞘瘤及腦膜瘤、源自造血系統惡性病之實體腫瘤、白血病、淋巴瘤、何傑金氏淋巴瘤、非何傑金氏淋巴瘤、胃癌、膀胱癌、前列腺癌、直腸癌、造血系統惡性病、無β脂蛋白血症、手足發紺、急性白血病、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、B細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、慢性骨髓細胞白血病(CML)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、結腸直腸癌、毛細胞白血病、惡性淋巴瘤、惡性組織細胞增多病、惡性黑素瘤、多發性骨髓瘤、胰臟癌、副腫瘤症候群、惡性高鈣血症、肉瘤、實體腫瘤、黃斑變性、1型糖尿病、糖尿病性視網膜病變、動脈粥樣硬化，或特徵在於血管過度生長、水腫或異常DLL4或VEGF活性之任何其他血管生成依賴性或非依賴性疾病。
  122. 如請求項120或121之方法，其中投與該醫藥組合物視情況與伊立替康、醛氫葉酸、替莫唑胺、吉西他濱、太平洋紫杉醇、卡培他濱及5-FU中之一或多者組合以治療結腸癌。
  123. 如請求項120或121之方法，其中投與該醫藥組合物視情況與替莫唑胺組合以治療神經膠質母細胞瘤。
  124. 如請求項120或121之方法，其中投與該醫藥組合物視情況與吉西他濱組合以治療胰臟癌。
  125. 如請求項120或121之方法，其中投與該醫藥組合物視情況與太平洋紫杉醇組合以治療乳癌。
  126. 一種包括第一及第二多肽鏈之結合蛋白，該等第一及第二多肽鏈各獨立地包括VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1係第一可變區域； VD2係第二可變區域； C係恆定區域； X1係連接體； X2係Fc區； n為0或1， 其中該等第一及第二多肽鏈上之VD1區域形成第一功能靶結合位點且該等第一及第二多肽鏈上之VD2區域形成第二功能靶結合位點，且其中該結合蛋白能夠結合DLL4及VEGF，其中： (i)形成DLL4功能靶結合位點之可變區域包括： 來自SEQ ID NO: 39之CDR 1至3及來自SEQ ID NO: 40之CDR 1至3，且 (ii)形成VEGF功能靶結合位點之可變區域包括： 來自SEQ ID NO: 41之CDR 1至3及來自SEQ ID NO: 42之CDR 1至3， 來自SEQ ID NO: 43之CDR 1至3及來自SEQ ID NO: 44之CDR 1至3， 來自SEQ ID NO: 45之CDR 1至3及來自SEQ ID NO: 46之CDR 1至3， 來自SEQ ID NO: 47之CDR 1至3及來自SEQ ID NO: 48之CDR 1至3， 來自SEQ ID NO: 49之CDR 1至3及來自SEQ ID NO: 50之CDR 1至3， 來自SEQ ID NO: 51之CDR 1至3及來自SEQ ID NO: 52之CDR 1至3，或 來自SEQ ID NO: 53之CDR 1至3及來自SEQ ID NO: 54之CDR 1至3。
  127. 如請求項126之結合蛋白，其中該結合蛋白包括： (i)形成DLL4功能靶結合位點之可變區域，其包括： SEQ ID NO: 39及/或SEQ ID NO: 40，及 (ii)形成VEGF功能靶結合位點之可變區域，其包括： 選自由SEQ ID NO: 41至54組成之群之序列。
  128. 如請求項126或127之結合蛋白，其中該結合蛋白包括第一多肽鏈，該第一多肽鏈包括第一VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1係第一重鏈可變區域； VD2係第二重鏈可變區域； C係重鏈恆定區域； X1係連接體； X2係Fc區； n為0或1，且 其中該結合蛋白包括第二多肽鏈，該第二多肽鏈包括第二VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1係第一輕鏈可變區域； VD2係第二輕鏈可變區域； C係輕鏈恆定區域； X1係連接體； 對於(X1)n而言，n為0或1； 對於(X2)n而言，n為0， 其中該等第一及第二多肽鏈上之VD1區域形成第一功能靶結合位點且該等第一及第二多肽鏈上之VD2區域形成第二功能靶結合位點。
  129. 如請求項126或127之結合蛋白，其中該結合蛋白包括： (i)形成DLL4功能靶結合位點之可變區域，其包括： SEQ ID NO: 39及SEQ ID NO: 40，及 (ii)形成VEGF功能靶結合位點之可變區域，其包括： SEQ ID NO: 41及SEQ ID NO: 42， SEQ ID NO: 43及SEQ ID NO: 44， SEQ ID NO: 45及SEQ ID NO: 46， SEQ ID NO: 47及SEQ ID NO: 48， SEQ ID NO: 49及SEQ ID NO: 50， SEQ ID NO: 51及SEQ ID NO: 52，或 SEQ ID NO: 53及SEQ ID NO: 54。
  130. 如請求項126或127之結合蛋白，其中該結合蛋白包括兩條第一多肽鏈及兩條第二多肽鏈，形成四個功能靶結合位點。
  131. 如請求項126或127之結合蛋白，其中該結合蛋白能夠結合： (a) VEGF，其中解離常數(KD )為至多約7.40 x 10-9 M，如藉由表面電漿共振所量測；及/或 (b) DLL4，其中解離常數(KD )為至多約3.40 × 10-8 M或5.00 × 10-8 M，如藉由表面電漿共振所量測。
  132. 如請求項126或127之結合蛋白，其中 (a)該結合蛋白中之連接體X1包括SEQ ID NO 1至38中之任一者或基於G/S之序列， (b)該結合蛋白中之連接體X1並非CH1或CL， (c)該結合蛋白之Fc區係變體序列Fc區， (d)該Fc區係來自人類IgG1 LALA突變體之Fc區， (e)該結合蛋白之Fc區係來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD或其變體之Fc區，及/或 (f)該結合蛋白係結晶之結合蛋白。
  133. 如請求項126或127之結合蛋白，其中該結合蛋白包括： SEQ ID NO: 55及SEQ ID NO: 56， SEQ ID NO: 57及SEQ ID NO: 58， SEQ ID NO: 59及SEQ ID NO: 60， SEQ ID NO: 61及SEQ ID NO: 62， SEQ ID NO: 63及SEQ ID NO: 64， SEQ ID NO: 65及SEQ ID NO: 66， SEQ ID NO: 67及SEQ ID NO: 68， SEQ ID NO: 69及SEQ ID NO: 70， SEQ ID NO: 71及SEQ ID NO: 72，或 SEQ ID NO: 73及SEQ ID NO: 74。
  134. 如請求項126或127之結合蛋白，其中該結合蛋白包括 (i)形成DLL4功能靶結合位點之可變區域，其包括： 來自SEQ ID NO: 39之CDR 1至3及來自SEQ ID NO: 40之CDR 1至3，及 (ii)形成VEGF功能靶結合位點之可變區域，其包括： 來自SEQ ID NO: 41之CDR 1至3及來自SEQ ID NO: 42之CDR 1至3。
  135. 如請求項126或127之結合蛋白，其中該結合蛋白包括 (i)形成DLL4功能靶結合位點之可變區域，其包括： SEQ ID NO: 39及SEQ ID NO: 40，及 (ii)形成VEGF功能靶結合位點之可變區域，其包括： SEQ ID NO: 41及SEQ ID NO: 42。
  136. 如請求項126或127之結合蛋白，其中該結合蛋白包括h1A11.1-SL-Av (包括SEQ ID NO: 73及74)。
  137. 如請求項126或127之結合蛋白，其中該Fc區係來自人類IgG1 LALA突變體之Fc區。
  138. 一種醫藥調配物，其包括： 一或多種胺基酸， 一或多種多糖及/或聚山梨醇酯，及 結合蛋白，其濃度約為0.1 mg/ml至100 mg/ml， 其中該醫藥調配物在約5.0至7.0之pH，且 其中該結合蛋白包括第一及第二多肽鏈，其各獨立地包括VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1係第一可變區域； VD2係第二可變區域； C係恆定區域； X1係連接體； X2係Fc區； n為0或1， 其中該等第一及第二多肽鏈上之VD1區域形成第一功能靶結合位點且該等第一及第二多肽鏈上之VD2區域形成第二功能靶結合位點，且其中該結合蛋白能夠結合DLL4及VEGF。
  139. 如請求項138之醫藥調配物，其中至少一種胺基酸係組胺酸且以約10 mM至20 mM或約15 mM之濃度存在。
  140. 如請求項138或139之醫藥調配物，其中該調配物之pH為約5.5至6.0、或約5.5、或約6.0。
  141. 如請求項138或139之醫藥調配物，其中至少一種多糖係蔗糖且以約0至8.0%重量/體積(w/v)之濃度存在。
  142. 如請求項138或139之醫藥調配物，其中該聚山梨醇酯係聚山梨醇酯80且濃度約為0至0.06% w/v。
  143. 如請求項138或139之醫藥調配物，其中至少一種胺基酸係精胺酸且以約0至1.5% w/v之濃度存在。
  144. 如請求項138或139之醫藥調配物，其中該結合蛋白以下列濃度存在：約1 mg/ml至100 mg/ml、或約1 mg/ml至15 mg/ml、或約1 mg/ml至7.5 mg/ml、或約2.5 mg/ml至7.5 mg/ml、或約5 mg/ml至7.5 mg/ml、或約25 mg/ml至100 mg/ml、或約20 mg/ml至60 mg/ml、或約25 mg/ml至50 mg/ml、或約25 mg/ml、或約50 mg/ml、或約0.1 mg/ml至60 mg/ml、或約0.1 mg/ml至25 mg/ml、或約1.0 mg/ml至60 mg/ml、或約0.5 mg/ml至60 mg/ml、或約0.1 mg/ml至2.0 mg/ml、或約0.5 mg/ml至2.0 mg/ml、或約1 mg/ml至5 mg/ml、或約1 mg/ml至7.5 mg/ml、或約1 mg/ml至15 mg/ml、或約0.5 mg/ml、或約1.0 mg/ml。
  145. 如請求項138或139之醫藥調配物，其中該醫藥調配物係凍乾。
  146. 如請求項138或139之醫藥調配物，其中該醫藥調配物係水合或已凍乾及再水合。
  147. 如請求項146之醫藥調配物，其中該醫藥調配物係呈包括右旋糖及/或鹽水之水合溶液。
  148. 如請求項147之醫藥調配物，其中該右旋糖之濃度約為5% w/v及/或該鹽水之濃度約為0.9% w/v
  149. 如請求項138或139之醫藥調配物，其中該醫藥調配物包括約15 mM組胺酸、約0.03% (w/v)聚山梨醇酯80、約4% (w/v)蔗糖及約0.1 mg/ml至25 mg/ml該結合蛋白或約1 mg/ml至15 mg/ml該結合蛋白，且pH約為6，其中該結合蛋白包括 (i)形成DLL4功能靶結合位點之可變區域，其包括： SEQ ID NO: 39及SEQ ID NO: 40，及 (ii)形成VEGF功能靶結合位點之可變區域，其包括： SEQ ID NO: 41及SEQ ID NO: 42。
  150. 如請求項138或139之醫藥調配物，其中該結合蛋白包括： (i)形成DLL4功能靶結合位點之可變區域，且該等可變區域包括： 來自SEQ ID NO: 39之CDR 1至3及來自SEQ ID NO: 40之CDR 1至3，及 (ii)形成VEGF功能靶結合位點之可變區域，且該等可變區域包括： 來自SEQ ID NO: 41之CDR 1至3及來自SEQ ID NO: 42之CDR 1至3， 來自SEQ ID NO: 43之CDR 1至3及來自SEQ ID NO: 44之CDR 1至3， 來自SEQ ID NO: 45之CDR 1至3及來自SEQ ID NO: 46之CDR 1至3， 來自SEQ ID NO: 47之CDR 1至3及來自SEQ ID NO: 48之CDR 1至3， 來自SEQ ID NO: 49之CDR 1至3及來自SEQ ID NO: 50之CDR 1至3， 來自SEQ ID NO: 51之CDR 1至3及來自SEQ ID NO: 52之CDR 1至3，或 來自SEQ ID NO: 53之CDR 1至3及來自SEQ ID NO: 54之CDR 1至3。
  151. 如請求項138或139之醫藥調配物，其中該結合蛋白包括： (i)形成DLL4功能靶結合位點之可變區域，且該等可變區域包括： SEQ ID NO: 39及/或SEQ ID NO: 40，及 (ii)形成VEGF功能靶結合位點之可變區域，且該等可變區域包括： 選自由SEQ ID NO: 41至54組成之群之序列。
  152. 如請求項138或139之醫藥調配物，其中該結合蛋白包括第一多肽鏈，該第一多肽鏈包括第一VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1係第一重鏈可變區域； VD2係第二重鏈可變區域； C係重鏈恆定區域； X1係連接體； X2係Fc區； n為0或1，且 其中該結合蛋白包括第二多肽鏈，該第二多肽鏈包括第二VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1係第一輕鏈可變區域； VD2係第二輕鏈可變區域； C係輕鏈恆定區域； X1係連接體； 對於(X1)n而言，n為0或1； 對於(X2)n而言，n為0， 其中該等第一及第二多肽鏈上之VD1區域形成第一功能靶結合位點且該等第一及第二多肽鏈上之VD2區域形成第二功能靶結合位點。
  153. 如請求項138或139之醫藥調配物，其中該結合蛋白包括： (i)形成DLL4功能靶結合位點之可變區域，其包括： SEQ ID NO: 39及SEQ ID NO: 40，及 (ii)形成VEGF功能靶結合位點之可變區域，其包括： SEQ ID NO: 41及SEQ ID NO: 42， SEQ ID NO: 43及SEQ ID NO: 44， SEQ ID NO: 45及SEQ ID NO: 46， SEQ ID NO: 47及SEQ ID NO: 48， SEQ ID NO: 49及SEQ ID NO: 50， SEQ ID NO: 51及SEQ ID NO: 52，或 SEQ ID NO: 53及SEQ ID NO: 54。
  154. 如請求項138或139之醫藥調配物，其中該結合蛋白包括兩條第一多肽鏈及兩條第二多肽鏈，形成四個功能靶結合位點。
  155. 如請求項138或139之醫藥調配物，其中該結合蛋白能夠結合： (a) VEGF，其中解離常數(KD )為至多約7.40 × 10-9 M，如藉由表面電漿共振所量測；及/或 (b) DLL4，其中解離常數(KD )為至多約3.40 × 10-8 M或5.00 × 10-8 M，如藉由表面電漿共振所量測。
  156. 如請求項138或139之醫藥調配物，其中 (a)該結合蛋白中之連接體X1包括SEQ ID NO 1至38中之任一者或基於G/S之序列， (b)該結合蛋白中之連接體X1並非CH1或CL， (c)該結合蛋白之Fc區係變體序列Fc區， (d)該Fc區係來自人類IgG1 LALA突變體之Fc區， (e)該結合蛋白之Fc區係來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD或其變體之Fc區，及/或 (f)該結合蛋白係結晶之結合蛋白。
  157. 如請求項138或139之醫藥調配物，其中該結合蛋白包括： SEQ ID NO: 55及SEQ ID NO: 56， SEQ ID NO: 57及SEQ ID NO: 58， SEQ ID NO: 59及SEQ ID NO: 60， SEQ ID NO: 61及SEQ ID NO: 62， SEQ ID NO: 63及SEQ ID NO: 64， SEQ ID NO: 65及SEQ ID NO: 66， SEQ ID NO: 67及SEQ ID NO: 68， SEQ ID NO: 69及SEQ ID NO: 70， SEQ ID NO: 71及SEQ ID NO: 72，或 SEQ ID NO: 73及SEQ ID NO: 74。
  158. 如請求項138或139之醫藥調配物，其中該結合蛋白包括 (i)形成DLL4功能靶結合位點之可變區域，其包括： 來自SEQ ID NO: 39之CDR 1至3及來自SEQ ID NO: 40之CDR 1至3，及 (ii)形成VEGF功能靶結合位點之可變區域，其包括： 來自SEQ ID NO: 41之CDR 1至3及來自SEQ ID NO: 42之CDR 1至3。
  159. 如請求項138或139之醫藥調配物，其中該結合蛋白包括 (i)形成DLL4功能靶結合位點之可變區域，其包括： SEQ ID NO: 39及SEQ ID NO: 40，及 (ii)形成VEGF功能靶結合位點之可變區域，其包括： SEQ ID NO: 41及SEQ ID NO: 42。
  160. 如請求項138或139之醫藥調配物，其中該結合蛋白包括h1A11.1-SL-Av (包括SEQ ID NO: 73及74)。
  161. 如請求項138或139之醫藥調配物，其中該Fc區係來自人類IgG1 LALA突變體之Fc區。
  162. 如請求項138或139之醫藥調配物，其進一步包括至少一種其他劑。
  163. 如請求項162之醫藥調配物，其中該至少一種其他劑包括以下中之至少一者：免疫黏著分子、成像劑、治療劑、細胞毒性劑、放射標記、酶、螢光標記、發光標記、生物發光標記、磁性標記、生物素、抗代謝物、烷基化劑、抗生素、生長因子、細胞因子、抗血管生成劑、抗有絲分裂劑、蒽環素、毒素或細胞凋亡劑、化學治療劑、成像劑、血管生成抑制劑、激酶抑制劑(包含(但不限於)KDR及TIE-2抑制劑)、共刺激分子調節劑(包含(但不限於)抗-B7.1、抗-B7.2、CTLA4-Ig、抗-CD20)、黏著分子阻斷劑(包含(但不限於)抗-LFA-1抗體、抗-E/L選擇素抗體、抗-VEGF mAb、抗-DLL4 mAb、小分子抑制劑)、抗-細胞因子抗體或其功能片段(包含(但不限於)抗-IL-18、抗-TNF或抗-IL-6/細胞因子受體抗體)、胺甲喋呤、環孢素、雷帕黴素、FK506、可檢測標記或報告子、TNF拮抗劑、抗風濕劑、肌肉鬆弛劑、麻醉藥品、非類固醇抗發炎藥(NSAID)、鎮痛劑、麻醉劑、鎮靜劑、局部麻醉劑、神經肌肉阻斷劑、抗微生物劑、抗牛皮癬劑、皮質類固醇、同化類固醇、紅血球生成素、免疫、免疫球蛋白、免疫阻抑劑、生長激素、激素代替藥物、放射性藥物、抗抑鬱劑、抗精神病劑、刺激劑、哮喘藥、β激動劑、吸入類固醇、腎上腺素或類似物、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗高血壓劑、利尿劑、腎上腺素能受體拮抗劑、鈣通道阻斷劑、腎素抑制劑、ACE抑制劑、血管緊張素II受體拮抗劑、血管舒張劑、α-2激動劑、可樂定、甲基多巴、肼屈嗪、哌唑嗪、利血平、莫索尼定、胍法辛、培哚普利/吲達帕胺、洛非西定、甲酪胺酸、抗凝血劑、華法林、肝素、低分子量肝素、達肝素、阿加曲班、比伐盧定、來匹盧定及右旋糖。
  164. 如請求項162之醫藥調配物，其中該至少一種其他劑包括以下中之至少一者：13-順式-視黃酸、2-CdA、2-氯去氧腺苷、5-阿紮胞苷、5-氟尿嘧啶、抗-VEGF mAb、抗-DLL4 mAb、5-FU、6-巰基嘌呤、6-MP、6-TG、6-硫鳥嘌呤、阿布沙尼、Accutane®、放線菌素-D、Adriamycin®、Adrucil®、Afinitor®、Agrylin®、Ala-Cort®、阿地白介素、阿來組單抗、ALIMTA、阿利維A酸、Alkaban-AQ®、Alkeran®、全反式視黃酸、α干擾素、六甲蜜胺、胺甲喋呤(Amethopterin)、胺磷汀、胺魯米特、阿那格雷、Anandron®、阿那曲唑、阿糖胞嘧啶、Ara-C Aranesp®、Aredia®、Arimidex®、Aromasin®、Arranon®、三氧化二砷、Arzerra™、天門冬醯胺酶、ATRA、Avastin®、阿紮胞苷、BCG、BCNU、苯達莫司汀、貝伐珠單抗、貝沙羅汀、BEXXAR®、比卡魯胺、BiCNU、Blenoxane®、博來黴素、硼替佐米、白消安、Busulfex®、C225、醛氫葉酸鈣、Campath®、Camptosar®、喜樹鹼-11、卡培他濱、Carac™、卡鉑、卡莫司汀、卡莫司汀藥片、Casodex®、CC-5013、CCI-779、CCNU、CDDP、CeeNU、Cerubidine®、西妥昔單抗、苯丁酸氮芥、順鉑、嗜橙菌因子、克拉屈濱、可的松、Cosmegen®、CPT-11、環磷醯胺、Cytadren®、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂質體、Cytosar-U®、Cytoxan®、達卡巴嗪、達克金、更生黴素、阿法達貝泊汀、達沙替尼、道諾黴素、柔紅黴素、柔紅黴素鹽酸鹽、柔紅黴素脂質體、DaunoXome®、地卡特隆、地西他濱、Delta-Cortef®、Deltasone®、德尼白介素、地飛托克、DepoCyt™、地塞米松、乙酸地塞米松、地塞米松磷酸鈉、地克薩松、右雷佐生、DHAD、DIC、迪奧帶斯、多西他賽、Doxil®、多柔比星、多柔比星脂質體、Droxia™、DTIC、DTIC-Dome®、Duralone®、Efudex®、Eligard™、Ellence™、Eloxatin™、Elspar®、Emcyt®、依那普利、表柔比星、阿法依伯汀、艾比特思、厄洛替尼、歐文氏菌屬L-天門冬醯胺酶、雌莫司汀、胺磷汀、Etopophos®、依託泊苷、磷酸依託泊苷、Eulexin®、依維莫司、Evista®、依西美坦、Fareston®、Faslodex®、Femara®、非格司亭、氟尿苷、Fludara®、氟達拉濱、Fluoroplex®、氟尿嘧啶、氟尿嘧啶(乳霜)、氟甲睪酮、氟他胺、亞葉酸、FUDR®、氟維司群、吉非替尼、吉西他濱、吉妥單抗奧佐米星、健擇、Gleevec™、Gliadel®藥片、GM-CSF、戈舍瑞林、粒細胞-群落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞群落刺激因子(G-MCSF)、Halotestin®、Herceptin®、海塞多、Hexalen®、六甲基蜜胺、HMM、Hycamtin®、Hydrea®、Hydrocort Acetate®、氫化可的松、氫化可的松磷酸鈉、氫化可的松琥珀酸鈉、磷酸氫化可通、羥基脲、異貝莫單抗、替伊莫單抗、Idamycin®、Idarubicin Ifex®、干擾素-α、干擾素-α-2b (PEG偶聯物)、異環磷醯胺、介白素-11 (IL-11)、介白素-2 (IL-2)、甲磺酸伊馬替尼、咪唑羧醯胺、Intron A®、Iressa®、伊立替康、異維A酸、伊沙匹隆、Ixempra™、KADCYCLA®、天門冬醯胺酶(t)、Lanacort®、拉帕替尼、L-天門冬醯胺酶、LCR、來那度胺、來曲唑、醛氫葉酸、瘤可寧、Leukine™、亮丙瑞林、醛基長春鹼、Leustatin™、脂質體Ara-C、Liquid Pred®、洛莫司汀、L-PAM、L-溶肉瘤素、Lupron®、Lupron Depot®、Matulane®、馬克戴斯、氮芥(Mechlorethamine)、氮芥鹽酸鹽、Medralone®、Medrol®、Megace®、甲地孕酮、乙酸甲地孕酮、美法侖、巰基嘌呤、美司鈉、Mesnex™、胺甲喋呤(Methotrexate)、胺甲喋呤鈉、甲基潑尼松龍、Meticorten®、絲裂黴素、絲裂黴素-C、米托蒽醌、M-Prednisol®、MTC、MTX、Mustargen®、氮芥、Mutamycin®、Myleran®、Mylocel™、Mylotarg®、Navelbine®、耐拉濱、Neosar®、Neulasta™、Neumega®、Neupogen®、Nexavar®、硝苯地平、Nilandron®、尼羅替尼、尼魯米特、Nipent®、氮芥(Nitrogen Mustard)、Novaldex®、Novantrone®、尼普拉特、奧曲肽、乙酸奧曲肽、奧法木單抗、Oncospar®、Oncovin®、Ontak®、Onxal™、奧普瑞白介素、Orapred®、Orasone®、奧沙利鉑、太平洋紫杉醇、太平洋紫杉醇蛋白結合物、帕米膦酸鹽、帕尼單抗、Panretin®、Paraplatin®、帕唑帕尼、Pediapred®、PEG干擾素、培加帕酶、培非司亭、PEG-INTRON™、PEG-L-天門冬醯胺酶、培美曲塞、噴司他丁、苯丙胺酸氮芥、Platinol®、Platinol-AQ®、潑尼松龍、潑尼松、Prelone®、丙卡巴肼、PROCRIT®、Proleukin®、含有卡莫司汀植入物之普羅非泮20、Purinethol®、雷洛昔芬、Revlimid®、Rheumatrex®、Rituxan®、利妥昔單抗、Roferon-A®、羅米司亭、Rubex®、紅比黴素鹽酸鹽、Sandostatin®、Sandostatin LAR®、沙格司亭、Solu-Cortef®、Solu-Medrol®、索拉非尼、SPRYCEL™、STI-571、鏈佐星、SU11248、舒尼替尼、Sutent®、他莫昔芬、Tarceva®、Targretin®、Tasigna®、Taxol®、Taxotere®、Temodar®、替莫唑胺、坦羅莫司、替尼泊苷、TESPA、沙利度胺、Thalomid®、TheraCys®、硫鳥嘌呤、Thioguanine Tabloid®、硫代磷醯胺、Thioplex®、噻替派、TICE®、Toposar®、拓撲替康、托瑞米芬、Torisel®、托西莫單抗、曲司佐單抗、Treanda®、維A酸、Trexall™、Trisenox®、TSPA、TYKERB®、VCR、Vectibix™、Velban®、Velcade®、VePesid®、Vesanoid®、Viadur™、Vidaza®、長春花鹼、硫酸長春花鹼、Vincasar Pfs®、長春新鹼、長春瑞濱、酒石酸長春瑞濱、VLB、VM-26、伏立諾他、福退癌、VP-16、Vumon®、Xeloda®、Zanosar®、Zevalin™、Zinecard®、Zoladex®、唑來膦酸、唑林紮、Zometa®、伊立替康、醛氫葉酸、5-FU、替莫唑胺、吉西他濱、太平洋紫杉醇、瑞格菲尼及帕妥珠單抗。
  165. 如請求項162之醫藥調配物，其中該至少一種其他劑包括以下中之至少一者：伊立替康、醛氫葉酸、福爾菲力、5-FU、依那普利、硝苯地平、可樂定、替莫唑胺、吉西他濱、卡培他濱、太平洋紫杉醇、瑞格菲尼及帕妥珠單抗。
  166. 如請求項136之結合蛋白或如請求項160之醫藥調配物，其中該結合蛋白能夠： (a)以至多約7.0 × 10-10 M之解離常數(KD )結合至VEGF，如藉由表面電漿共振所量測，及/或以至多約3.8 nM之IC50阻斷VEGF活性，如在VEGFR1競爭ELISA中所量測；及/或 (b)以至多約1.0 × 10-8 M之解離常數(KD )結合至DLL4，如藉由表面電漿共振所量測，及/或以至多約1.09 nM之IC50阻斷DLL4活性，如在Notch競爭ELISA中所量測。
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