CN101058609B - 人源抗体及其表达 - Google Patents

Abstract

本发明提供了全人抗EGFR的scFv抗体片段及完整抗体，包括抗体的重链和轻链可变区的核苷酸和氨基酸分子，以及完整抗体在CHO细胞中高效表达的方法。

Description

人源抗体及其表达 

                    发明领域 

本发明涉及新的抗表皮生长因子受体(EGFR)的人源抗体系列，该类抗体可在较小的剂量下治疗和预防EGFR相关的疾病。本发明还涉及采用基因重组技术在CHO细胞中生产该抗体的方法。 

                    发明背景 

表皮生长因子受体(EGFR)是erbB家族的一个成员，该家族含4个相关的细胞膜受体，包括EGFR(Her 1 or erbB1)，erbB2(Her2)，erbB3(Her3)和erbB4(Her4)。该家族蛋白都为跨膜糖蛋白，含有胞外的配基结合区域和胞内具有信号转导功能的酪氨酸激酶活性区域。EGFR是一个约170kD的跨膜糖蛋白，该蛋白能使许多类型的细胞扩增和分化。已证实EGFR在许多类型的人实体瘤，如肺癌，胸腺瘤，结肠癌，胃癌，脑瘤，膀胱癌，头颈癌，卵巢癌和胰腺癌中过度表达【Mendelsohn et al.，Cancer Cells 1989.7：359】。其配基表皮生长因子(EGF)和转化生长因子(TGF-α)均能与之结合造成EGFR酪氨酸自主磷酸化及下游一些细胞内分子的磷酸化，从而导致癌细胞扩增和肿瘤生长【Modjtahedi et al.Oncology 1994.4：277】，因此抑制EGFR已成为一个新的癌症治疗的方向。研究表明结合于EGFR的配基结合域的单克隆抗体可以阻断EGF和TGF-α与EGFR的结合从而阻断肿瘤细胞生长的信号传递途径。 

EGFR靶向药物主要分两种，一类是作用于其胞内酪氨酸激酶ATP结合区的小分子化合物抑制剂，另一类是作用于EGFR胞外配体结合区的单克隆抗体。前者在体内和体外试验中表现出对多种肿瘤细胞系很高的生长抑制活性，而后者的疗效可能更多地来自于对某些肿瘤进展相关过程的抑制，如肿瘤细胞转移和新生血管生成等，还可能来自于抗体介导的抗体依耐性的细胞毒性效应(ADCC)和补体依耐性的细胞毒性效应(CDCC)。 

抗EGFR特异性抗体可采用传统的杂交瘤技术从免疫动物中分离。但该类抗体由于其为鼠源性抗体导致该类抗体的治疗效果并不理想。当注射携带人肿瘤异植物的小鼠中时，鼠源性抗体只能导致部分肿瘤消退，完全清除肿瘤细胞需化疗剂的共同治疗【Baselga et al.，Pharmac.Therapeut.1994 64：127】。并且鼠源的抗体可能在人体引起强烈的HAMA免疫反应。 

人源抗体和人源化抗体以其特有的优势而越来越成为抗体药物研发的主流趋势。近年来，已建立了噬菌体抗体库技术，其特点是能在原核细胞，如E.coli 中产生功能性的抗体片段，如F_V和Fab，特别是能产生V_L和V_H链相连的scFv【Bird et al.，Science 1988.242：423】。该技术可使随机组合的抗体的重链可变区和轻链可变区基因通过PCR扩增而得到放大，并在噬菌体颗粒表面表达抗体片段。因此该噬菌体抗体库可用于筛选目的抗原所结合的抗体。相对于杂交瘤技术，噬菌体抗体库技术具有极强的筛选能力，能真正做到以任何抗体表达细胞，如人抗体生产细胞，包括脾脏，外周血淋巴细胞等作为起始材料，并能快速的筛选出大量不同的抗体。另外，噬菌体抗体库技术直接获得目的抗体可变区的基因，有利于快速进行下步后续操作，在药物的上游开发工作中能节省大量的时间，在实际操作中更能为广大实验室所接受。在实际科研和生产中已经有大量噬菌体抗体库的成功构建和筛选范例【Bender et al.，Hum.Antibod.Hybridomas1993.4：74；Shenlan Mao et al.，Proc Natl Acid Sci USA 1999 96(12)：6953；VaughanTJ.et al.，Nat Biotechnol 1993 14(3)：309】，因此该技术已广泛用于抗体的筛选。 

目前已研发了多个抗EGFR嵌合、人源化和人源单克隆抗体，包括EMD55900，h-R3，ABX-EGF和C225用于肿瘤疾病的临床研究。其中人—鼠嵌合抗体C225已于2004年2月获得美国FDA的批准用于对依立替康耐药的转移性结肠癌、直肠癌的治疗。但这些抗体的抗肿瘤活性由其结合EGFR的表位决定，如嵌合抗体C225只能在高剂量下才表现出抗肿瘤活性，在临床上需与化疗协同作用。因此寻找剂量更小，抗肿瘤活性更高，不激发免疫反应并可单药应用的人源单克隆抗体是十分必要的。 

发明内容

本发明的目的在于提供一组重组人源抗EGFR单克隆抗体。 

该抗体含重链可变区和轻链可变区。其中SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7中所示的为重链可变区氨基酸序列，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8所示的为轻链可变区氨基酸序列。 

本发明的另一目的在于提供编码上述重组人源抗EGFR scFv抗体的DNA分子。 

在一个优选实例中，该单克隆抗体重链的可变区核苷酸序列为SEQ ID NO：9所示的序列，轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：10所示的序列，该抗体能达到的亲和性K_D＝3×10^-10M。 

在一个优选实例中，该单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：11所示的序列，轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：12所示的序列，该抗体能达到的亲和性K_D＝0.5×10^-10M。 

在一个优选实例中，该单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO： 13所示的序列，轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：14所示的序列，其scFv抗体的k_D＝5.8×10^-9M。 

在一个优选实例中，该单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：15所示的序列，轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：16所示的序列，其scFv抗体的k_D＝0.8×10^-9M。 

在一个优选实例中，该单克隆抗体的轻链由轻链可变区和κ恒定区组成，重链由重链可变区和IgG1组成，然而本发明也保护其它抗体的同种型，如IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，IgD，IgE。本发明也保护抗体的抗原结合片段，包括Fab，Fv，scFv和单区抗体。 

本发明的另一个目的在于提供人源抗EGFR单克隆抗体的表达载体，将人源抗EGFR单克隆抗体基因构建进入neo弱化的表达载体中，将neo基因与抗人源EGFR单克隆抗体的重链基因在同一个操纵子中，位于人源抗EGFR单克隆抗体的重链基因的后面，使通过G418的筛选获得neo基因和抗EGFR单克隆抗体的重链基因同时高表达的重组CHO细胞克隆。 

本发明的另一个目的还在于提供了一种制备所述抗EGFR单克隆抗体的方法，该方法包括。 

a)提供所述抗EGFR单克隆抗体的DNA分子； 

b)提供一种表达载体，该载体含有步骤a)中所述的DNA分子及表达该DNA分子的调控序列； 

c)用步骤a)中所述的表达载体转化宿主细胞，特别是哺乳动物细胞，更特别是CHO细胞； 

d)在适合所述单克隆抗体的培养条件下培养步骤b)中所得的宿主细胞；和 

e)分离纯化步骤c)中所表达的所述单克隆抗体。 

                说明书附图 

图1：人抗体噬菌体库的构建方案 

图2：8组抗EGFR scFv抗体对A431细胞的增值抑制活性比较。 

图3：人源抗EGFR单克隆抗体的表达载体结构图。 

图4：13％SDS-PAGE蛋白电泳图，泳道1为蛋白标准品，泳道2为未纯化的细胞上清液样品，泳道3为纯化后的抗体样品。 

图5：N2-1，N5-4，N6-3和N8-3 IgG1完整抗体对A431细胞的增值抑制活性的比较。 

图6a：scFv抗体N5-4的重链可变区序列；图6b：scFv抗体N5-4的重链可变区序列。 

图7a：scFv抗体N6-3的重链可变区序列；图7b：scFv抗体N6-3的重链可变区 序列。 

图8a：scFv抗体N5-7的重链可变区序列；图8b：scFv抗体N5-7的重链可变区序列。 

图9a：scFv抗体N6-9的重链可变区序列；图9b：scFv抗体N6-9的重链可变区序列。 

具体实施方式

实施例一、人源抗体库的构建及抗EGFR scFv抗体的筛选 

(1)人源抗体scFv抗体库的构建 

a)V_H基因、V_L基因和连接肽片段的扩增 

将液氮冻存的人淋巴结、脾脏、外周血淋巴细胞混合物在Trizol(Invitrogen)中研碎，按Trizol说明书上的方法提取总RNA。并按Superscript II反转录酶说明书的方法取3μg总RNA用200U Superscript II反转录酶(Invitrogen)反转录为cDNA第一链，这些方法都是本领域技术人员熟知的方法。 

分子生物学的具体操作均为本领域技术人员熟知的方法(萨幕布鲁克J等，《分子克隆试验指南》，北京科学出版社)。根据抗体重链可变区(V_H)，κ轻链可变区(κV_L)，λ轻链可变区(λV_L)的框架区序列设计PCR引物【Vaughan etal.Nature Biotechnology 1996 14309；沈倍奋等，《重组抗体》科学出版社108；Welschof M.et al.，J immunol Methods 1995 179(2)：203】，其中人的V_H设计了6个上游引物(V_H sense)和4个下游引物(J_H anti-sense)，该6个上游引物和4个下游引物共形成24个引物组合，以cDNA为模板进行PCR扩增，总共24个V_H组合。人的κV_L设计6个上游引物和5个下游引物，该6个上游引物(Vκsense)和5个下游引物(Vκanti-sense)共形成30个引物组合，以cDNA为模板进行PCR扩增，共获得30个κV_L的PCR产物组合。人λV_L设计7个上游引物(Vλsense)和3个下游引物(Vλanti-sense)，该7个上游引物和3个下游引物共形成21个引物组合，以cDNA为模板获得21个λV_L PCR产物组合。使用promega的Wizard SV Gel and PCRclean-up System纯化试剂盒进行纯化，分光光度计下检测OD₂₆₀和OD₂₈₀分析PCR产物的浓度和纯度。 

连接肽片段(Gly₄Ser)₃DNA序列可通过寡核苷酸链合成的方法获得，并根据4个重链的反向引物设计4个重链正向连接肽引物(J_H linker sense)，根据6个κ链和7个λ链正向引物设计6个κ链的反向连接肽引物和7个λ链反向连接肽引物。将4个重链正向连接肽引物分别与6个κ链的反向连接肽引物(Vκ linkeranti-sense)和7个λ链反向连接肽引物混合(Vλ linker anti-sense)，以连接肽片段(Gly₄Ser)₃DNA为模板PCR扩增获得重链和κ轻链可变区及重链和λ轻链可变区的连接接头。使用纯化试剂盒纯化连接接头，分光光度计下检测OD₂₆₀和OD₂₈₀ 分析PCR产物的浓度和纯度。 

b)人源抗体scFv基因的连接 

将重链V_H分别与κ链Vκ和λ链Vλ进行连接。具体操作为纯化的人V_H片段混合物、Vκ或Vλ片段混合物和相应的κ或λ连接接头混合物，按1μg∶1μg∶250ng混合后进行50μl体系的PCR扩增，再以PCR产物为模板，加入带Sfi酶切位点的6条上游重链可变区引物混合物和带Not I酶切位点的5条κ链下游可变区引物或带Not I酶切位点的3条λ链下游可变区引物混合物，进行进一步PCR扩增，电泳检测获得750bp左右的含重链可变区和κ轻链可变区或含重链可变区和λ轻链可变区的scFv片段。使用纯化试剂盒纯化这些scFv片段，分光光度计下检测OD₂₆₀和OD₂₈₀ 分析PCR产物的浓度和纯度。 

c)人源抗体scFv基因噬菌体库的构建 

纯化的scFv PCR产物按说明书的方法用Sfi I和Not I(TaKaRa)双酶切后用promega的Wizard SV Gel and PCR clean-up System纯化试剂盒进行纯化，用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver.2.1试剂盒将纯化后的scFv片段插入经过相同酶切后的pCANTAB-5E载体(法玛西亚)上，构建成为pCANTAB-5E-scFv的噬菌体表达载体，整个构建过程见图1。该表达载体电转化入40～400μl制备好的TG1电感受态菌，获得的电转化细菌在2×YT-GA(含100mg/L Amp和2％葡萄糖)扩增至OD₆₀₀＝0.5后加入2×10¹⁰M13KO7(法玛西亚)辅助感染，37℃培养1h，4000rpm离心细菌液，重悬沉淀于2×YT-AK(100mg/L Amp，50mg/L Kan)的培养基中，30℃过夜振荡培养，4000rpm离心获得含噬菌体的上清液，经0.45μm的滤膜过滤后4℃下加入20％PEG 8000沉淀上清液45min，10000rpm离心，PBS重悬沉淀获得单链噬菌体抗体库。 

噬菌体抗体库的浓度检测，具体操作为取少量体积原液经极限稀释后电转化TG1菌，涂板检测单菌落个数该单链噬菌体抗体库达到了3×10⁹个克隆。 

(2)EGFR胞外蛋白(EGFR ECD)的表达 

300g离心5min沉淀10⁶个A431细胞(ATCC CRL1555)。按BBI公司的classical total RNA isolation kit说明书的操作方案分别提取细胞的RNA。按BBI公司的MMLV first strand cDNA synthesis kit说明书的操作方案将这些细胞的mRNA反转录为cDNA。 

根据已知的EGFR ECD区域序列(Genbank X00588)设计PCR引物。以反转录的cDNA为模板，PCR扩增获得目的基因。 

合成引物序列： 

EGFR-F/Nhe I：5’AGCGCTAGCGGGAGCAGCGA 3’(SEQ ID No：17) 

EGFR-R/Xho I：5’GGTCAGAGCTCCCTGCCCTAGAATC 3’(SEQ ID No：18) 

将约2.0kb的EGFR ECD序列按相应的酶切位点插入到 pcDNA3.1/myc-His(-)B(invitrogen)表达载体中。 

ECD蛋白表达载体在HEK-293(ATCC CRL1573)细胞中瞬时表达可按技术人员熟知的常用方法进行，可采用Calfection转染方法(Lindell et al.Biochimicaet Biophysica Acta 2004.1676 155)将表达载体质粒转染入HEK-293细胞获得蛋白的瞬时表达。上清液收集后，按Ni-NTA Spin Kit(Qiagen)的说明书操作纯化获得高纯度的EGFR ECD蛋白。 

(3)含抗EGFR ECD scFv抗体的噬菌体文库的富集筛选 

采用微孔板筛选方法筛选含抗EGFR ECD scFv的噬菌体，该方法为本领域技术人员熟知的方法。用100μl含20μg/ml EGFR ECD重组蛋白的0.1MNa₂CO₃-NaHCO₃包被液4℃过夜包被Nunc培养板，TBS/Tween 20(50mMTris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl，0.5％Tween 20)洗涤三次，3％小牛血清白蛋白(BSA)37℃封闭2h后加入浓缩的噬菌体，37℃温育2h，TBS/Tween 20洗涤液清洗数次除去未结合的噬菌体，加入50μl 0.1M三乙胺室温孵育10min洗脱已黏附在平皿上的噬菌体，然后用6～10μl 1mol/L Tris(pH 7.4)中和洗涤下的噬菌体溶液。将洗脱的噬菌体溶液感染对数生长期的大肠杆菌受体菌TG1，培养扩增使表达抗EGFR ECD重组蛋白的特异性scFv的噬菌粒得到富集，再加入M13KO7辅助感染获得含抗EGFR ECD的scFv的噬菌体，方法同上。继续重复4次上述“黏附、洗脱、扩增”过程。然后用降低浓度至2μg/ml EGFR ECD重组蛋白的包被液包被Nunc培养板，重复上述的筛选步骤，为了去除对BSA吸附的噬菌体，以4％脱脂牛奶代替BSA进行封闭，洗脱捕获的噬菌体。将最后一轮筛选得到的噬菌体转化TG1菌涂板，从中随机挑选165株阳性单克隆菌株进行进一步的免疫筛选。 

(4)噬菌体scFv的融合表达及ELISA筛选 

接种165个单菌落于2×YT-AG培养基中30℃培养至OD₆₀₀＝1左右，2×10¹⁰ M13KO7辅助感染，37℃温育2h后，4000rpm离心去除上清，沉淀继续在2×YT-AG中培养过夜，9000rpm离心获得噬菌体上清液。 

用100μl 30μg/ml EGFR ECD重组蛋白4℃过夜包被96孔板，TBS/Tween洗涤3次后，用4％脱脂牛奶-PBS 37℃封闭1h，每孔100μl scFv单克隆噬菌体上清，洗5次，然后加入1∶5000稀释的HRP-兔抗M13(法玛西亚)，37℃孵育1h，TMB(3，3，5，5，-四甲基联苯胺)为底物显色，获得吸光度值较高的94个阳性抗体克隆。 

(5)噬菌体scFv单链抗体的可溶性表达及ELISA筛选 

收获94个阳性克隆的M13KO7辅助感染后的TG1菌液上清液，取2μl噬菌体 上清液感染400μl琥珀突变非抑制型HB2151菌(Maxim Biotech)，缓慢培养30min，涂布2×YT-AG-N(含萘啶酮酸)平板，30℃过夜培养，挑取单菌落接种2×YT-AG培养液中，1mM IPTG诱导表达获得可溶性scFv上清液。 

将100μl可溶性scFv上清液包被96孔板，TBS/Tween清洗3次，2％BSA封闭，然后加入50μl 2μg/ml EGFR ECD重组蛋白37℃孵育2h，洗涤后用偶联HRP的抗c-myc的单克隆抗体(Chemicon)孵育，TMB显色，450nm检测光吸收，获得80个吸光值较高的阳性克隆。为了筛除抗pcDN3.1/myc-His(-)B载体所引入的myc标签和(His)₆标签蛋白的抗体，我们使用公司之前构建于该载体的NGF重组蛋白结合scFv包被的96孔板，用上述方法检测，筛除结合于myc或(His)₆标签的阳性克隆。最后获得75个只与EGFR ECD结合的阳性抗体克隆。 

(6)阳性克隆株DNA序列测定 

将筛选得到的75个阳性克隆菌株扩增并提取质粒，Sfi I/Not I双酶切鉴定后进行DNA序列测定，使用IgBLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)对所获得的序列进行比对分析，使用DNAstar软件对DNA序列进行聚类分析，并对序列的编码框进行识别和翻译；为便于进一步筛选和鉴定，将这些所获得的克隆划分为8组，见表1。 

        表1 

编号	克隆数	编号	克隆数
				N1	11	N5	9
N2	4	N6	15
				N3	12	N7	8
N4	3	N8	13

(7)带(His)₆标签scFv的构建和产物的纯化 

从8组克隆中分别随机选取1个克隆，扩大培养后提取质粒，PCR扩增获得带5’-Sfi I和3’-Not I酶切位点并在3’端添加(His)₆标签的片段。PCR兼并引物如下： 

V_H/Sfi I：5’TCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGG 3’(SEQ ID No：19) 

Jκ-1/Not I：5’ATGATGATGATGATGACGTTTRATHTCCASYYK KGTCC 3’(SEQ ID No：20) 

Jκ-2/Not I：5’GCGGCGGCCGCATGATGATGATGATGATGACG 3’(SEQ ID No：21) 

分别以8个克隆为模板进行PCR扩增，第一步以噬菌体质粒为模板，以V_H/SfiI和Jκ-1/Not I为引物进行PCR扩增，第二步以第一步的PCR产物为模板，以为V_H/Sfi I和Jκ-2/Not I引物进行PCR扩增。PCR扩增产物经promega的Wizard SV Geland PCR clean-up System纯化试剂盒纯化后，Sfi I和Not I(TaKaRa)酶切克隆入 同样Sfi I和HNot I酶切的pCANTAB-5E载体，重新转化TG1菌，感染获得噬菌体上清液后再转染HB2151菌作可溶性表达，具体方法同上。表达后的上清按照Ni-NTA Spin Kit的说明书进行纯化。 

(8)抗EGFR scFv抗体对A431细胞的增值活性检测： 

将100μl DMEM/F12梯度系列稀释亲和纯化后的scFv抗体加入96孔板中，并以一个不相关的IgG1型抗体和无抗体的DMEM/F12+10％FBS培养基为对照。均加入100μl 2×10³个A431细胞的DMEM/F12+10％FBS培养基。37℃培养4天后每孔加入10μl WST-8(南京旋光科技有限公司)，继续培养3h，450nm测定光吸收。结果见图2，显示其中4个克隆(N2-1、N5-4、N6-3、N8-3)的scFv能够明显抑制A431细胞的正常增殖，并诱发细胞的凋亡，其中N6-3、N5-4的效果最明显，见图2。 

(9)scFv的亲和性分析： 

对N2-1、N5-4、N6-3、N8-34个克隆的可溶性scFv进行亲和性分析。我们用竞争ELISA法进行抗体亲和力检测，该技术为本领域专业人员所熟知的方法。具体方法简述如下：100μl 20μg/ml纯化的EGFR ECD重组蛋白4℃过夜包被96孔板，再加入3％脱脂牛奶室温下封闭1h，TBS/Tween洗液清洗三次，在离心管中建立终浓度为0.1nM-1μM的EGFR ECD抗原系列稀释度和终浓度为1nM的scFv，室温下孵育30min后，加入到EGFR ECD重组蛋白包被的96孔板中，室温下竞争性结合5-10min，TBS/Tween洗液充分清洗96孔酶标板，加入1∶2000倍稀释的HRP-兔抗M13抗体室温下结合2h，TMB显色，最强信号的一半的抗原浓度视为抗体的解离常数K_D，结果见表2。 

                 表2 

克隆编号.	scFv KD(M)	完整抗体KD(M)
			N2-1  N5-4  N6-3  N8-3	4×10-9     1×10-9   0.2×10-9     2×10-9	7×10-10     3×10-10   0.5×10-10     6×10-10

实施例二、人源EGFR单克隆完整IgG1型抗体基因的制备 

(1)人kappa轻链恒定区及人IgG1重链恒定区的制备 

收集新鲜人全血5ml，300g离心5min沉淀红细胞和白细胞。按BBI公司的classical total RNA isolation kit说明书的操作方案提取白细胞RNA。按BBI公司的MMLV first strand cDNA synthesis kit说明书的操作方案将白细胞mRNA反转录为cDNA。 

根据已知的人kappa和IgG1序列设计PCR引物。以反转录的cDNA为模板，PCR扩增获得目的基因。 

合成引物序列： 

L-F/BamH I：5’GCGGGATCCCGTACGGTGGCTGCACCATCT 3’(SEQ ID NO：22) 

L-R/Xho I：5’GCGCTCGAGCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC 3’(SEQ IDNO：23) 

H-F/Eco52 I：5’GCGCGGCCGGCTAGCACCAAGGGCCCATCGG 3’(SEQ IDNO：24) 

H-R/Xho I：5’GCGCTCGAGGATCCTCATTTACCCGGAGACAGGGA GAGGC3’(SEQ ID NO：25) 

(2)4个scFv克隆可变区的基因的获得 

N2-1、N5-4、N6-3、N8-34个scFv轻链和重链可变区基因序列可通过DNA拼接的方法在5’端加入信号肽序列获得【Crowe JS.et al.，Clin Exp Immunol 199287(1)：105】，也可采用交给其他公司全基因合成的方法获得(Invitrogen)。为了优化抗体在哺乳动物细胞中的表达，还可进行密码子优化【Koresawa et al.，J.Biochem，2000，127(3)：367；Robinson et al.，Nucleic Acids Res.1984 12：6663】。其中，轻链可变区序列的5’端设计BamH I位点，3’端设计BsiW I位点，重链可变区序列的5’端设计EcoR V位点，3’端设计Nhe I位点。 

(3)人源EGFR单克隆抗体轻链的制备 

κ基因的PCR产物分别用BamH I和Xho I(TaKaRa)双酶切，在30μl体系中加入3μl 10×K buffer，κPCR纯化产物20μl，Xho I 2μl，BamH I 3μl，37℃酶切1h。pcDNA3(Invitrogen)载体也用BamH I和Xho I双酶切，方法同上。用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver.2.1试剂盒将κ序列分别插入到pcDNA3中，构建为pcDNA3-κ。 

N2-1、N5-4、N6-3、N8-3轻链可变区合成基因和pcDNA3-κ分别用Kpn I(TaKaRa)酶切，酶切体系为在50μl体系中加入5μl 10×L buffer，轻链可变区合成基因30μl或pcDNA3-κ10μ，Kpn I 3μl，37℃酶切1h。酶切产物使用promega的Wizard SV Gel and PCR clean-up System纯化试剂盒进行纯化，再分别使用BsiW I(ToYoBo)酶切，酶切体系为在50μl体系中加入5μl 10×H buffer，轻链可变区合成基因Kpn I酶切产物30μl或pcDNA3-κKpn I酶切产物30μl，BsiW I 3μl，37℃酶切1h。胶回收400bp左右的轻链可变区Kpn I和BsiW I酶切产物，并用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver.2.1试剂盒将轻链可变区插入pcDNA3-κ载体，构建为4个pcDNA3-L-N2-1、pcDNA3-L-N5-4、pcDNA3-L-N6-3、 pcDNA3-L-N8-3。 

(4)人源EGFR单克隆抗体重链的制备 

IgG1 Fc基因的PCR产物分别用Eco52 I和Xho I(TaKaRa)酶切，在30μl体系中加入3μl 10×H buffer，IgG1 Fc PCR纯化产物20μl，Xho I 2μl，37℃酶切1h。酶切产物使用promega Wizard SV Gel and PCR clean-up System纯化试剂盒进行纯化，再使用Eco52 I(TaKaRa)酶切，酶切体系为在在30μl体系中加入3μl 10×Basal buffer，IgG1 Fc Xho I酶切产物20μl，0.1％BSA 5μl，Eco52 I 2μl，37℃酶切1h。pcDNA3载体也用Eco52 I和Xho I双酶切，方法同上。用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver.2.1试剂盒将IgG1 Fc插入到pcDNA3中，构建为pcDNA3-IgG1 Fc。 

N2-1、N5-4、N6-3、N8-3重链可变区合成基因和pcDNA3-IgG1 Fc分别用EcoR V(TaKaRa)酶切，酶切体系为在50μl体系中加入5μl 10×H buffer，重链可变区合成基因30μl或pcDNA3-IgG1 Fc 10μ，EcoR V 3μl，37℃酶切1h。酶切产物使用promega的Wizard SV Gel and PCR clean-up System纯化试剂盒进行纯化，再分别使用Nhe I(TaKaRa)酶切，酶切体系为在50μl体系中加入5μl10×K buffer，重链可变区合成基因EcoR V酶切产物30μl或pcDNA3-IgG1 FcEcoR V酶切产物30μl，Nhe I 3μl，37℃酶切1h。胶回收420bp左右的轻链可变区EcoR V和Nhe I酶切产物，并用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver.2.1试剂盒将轻链可变区插入pcDNA3-IgG1 Fc载体，构建为pcDNA3-H-N2-1、pcDNA3-H-N5-4、pcDNA3-H-N6-3、pcDNA3-H-N8-3。 

实施例三、人源EGFR单克隆抗体高效表达载体的构建 

人源抗EGFR单克隆抗体基因可在多个有效的表达载体中表达，这些载体都含有信号序列，复制起点，1个或多个标记基因，增强子序列，启动子和转录终止序列。本发明采用商品化的pIRESneo3(Clontech)为基础，使neo标记基因弱化，从而筛选人源抗EGFR单克隆抗体高表达的细胞克隆。 

采用本领域技术人员熟知的常规分子生物学技术，将N2-1、N5-4、N6-3、N8-3的重链插入到本公司制备的哺乳动物表达载体pIRESneo3d(通过在pIRESneo3中插入dhfr基因表达盒获得)多克隆位点区中。具体操作为pIRESneo3d经EcoR V和BamH I(TaKaRa)双酶切，酶切体系为50μl体系中加入5μl 10×K buffer，pIRESneo3d 15μl，EcoR V 3μl，BamH I 3μl，37℃酶切1h。pcDNA3-H-N2-1、pcDNA3-H-N5-4、pcDNA3-H-N6-3、pcDNA3-H-N8-3载体经EcoR V和BamH I双酶切后胶回收1.4Kb的酶切片段，酶切系统同上。用TaKaRa的DNA Ligation Kit Ver.2.1试剂盒将重链片段与pIRESneo3d载体进行粘端连接。获得的重组表达质粒pIRESneo3d-H转化DH5α细菌后保存。 

再将N2-1、N5-4、N6-3、N8-3的轻链插入到pIRESneo3d-H载体中。具体操作为pIRESneo3d-H载体经Nru I单酶切，酶切体系为在50μl体系中加入5μl10×basal buffer，pIRESneo3d-H 15μl，0.1％BSA 0.5μl，Nru I 3μl，37℃酶切1h。酶切产物使用promega的Wizard SV Gel and PCR clean-up System纯化试剂盒进行纯化，再用CIAP酶(TaKaRa)去磷酸化，在50μl体系中10×AlkalinePhosphatase Buffer 5μl，CIAP 2μl，pIRESneo3d-H Nru I酶切产物43μl，50℃反应30min，65℃加热处理30min以上使CIAP酶失活。pcDNA3-L-N2-1、pcDNA3-L-N5-4、pcDNA3-L-N6-3、pcDNA3-L-N8-3用Nru I和Nae I(TaKaRa)分别酶切，酶切体系为在50μl体系中加入5μl 10×basal buffer，pcDNA3-L 30μl，0.1％BSA 0.5μl，Nru I 3μl，37℃酶切1h。酶切产物使用promega的Wizard SVGel and PCR clean-up System纯化试剂盒进行纯化，再用Nae I进行酶切，酶切体系为50μl体系中加入5μl 10×L buffer，pcDNA3-L-N2-1、pcDNA3-L-N5-4、pcDNA3-L-N6-3、pcDNA3-L-N8-3Nru I酶切产物30μl，Nae I 3μl，37℃酶切1h。胶回收含轻链表达盒的1.8kb的Nru I～Nae I片段，并用TaKaRa的DNALigation Kit Ver.2.1试剂盒将轻链表达盒与pIRESneo3d-H载体进行粘端连接。获得N2-1、N5-4、N6-3、N8-3完整抗体的重组表达质粒pIRESneo3d-anti-EGFR转化DH5α细菌后保存。人源EGFR单克隆抗体的表达载体结构见图3。 

实施例四、人源EGFR单克隆抗体重组CHO细胞的高水平表达 

表达糖基化的抗CD20单克隆抗体的宿主细胞可来源于多种组织，但优选脊椎动物细胞。可用的细胞系有SV40转化的猴肾CV1细胞系(ATCC CRL 1651)，人胚胎肾细胞(293或悬浮培养的293)【Graham et al.，J.Gen Virol.1977 36：59】，婴幼仓鼠肾细胞(BHK-21 ATCC CCL 10)，中国仓鼠卵巢细胞(CHO/dhfr^-ATCCCRL 9096)，猴肾细胞(CV1 ATCC CRL90)，非洲绿猴肾细胞(VERO-76 ATCCCRL 1587)，人子宫癌细胞(HELA ATCC CCL 2)，犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)，人肺细胞(W138，ATCC CCL95)，人肝细胞(Hep G2，HB 8065)等。优选表达抗CD20单克隆抗体的宿主细胞为CHO/dhfr^-和HEK-293细胞。 

本发明中，产生抗CD20单克隆抗体的细胞，如CHO细胞可培养于多种培养基中。商业化的培养基如DMEM，MEM，Ham’s F12，RPMI-1640(Gibco)都可用于宿主细胞的培养。此外，Ham et al.，Meth.Enz.1979 58：44；Barnes et al.，Anal.Biochem.1980 102：255；U.S.Pat.Nos.4,767,707；4,657,866；4,927,762中的培养基均可用于培养宿主细胞。宿主细胞的培养条件，如温度，pH值等也是本领域技术人员熟知的常规条件。 

人源EGFR单克隆抗体转染哺乳动物宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主细胞为CHO/dhfr^-细胞时，可选用如下的DNA转染方法有磷酸钙共沉淀法【Jordan et al.，Nucleic Acids Res.1996 24：4】，脂质体包装法(如 lipofectamine 2000)【Audouy S.et al.，Mol Membr Biol.2001 18(2)：129】，电穿孔法和显微注射法【Morrison et al.，Science 1985 229：1202】。我们采用lipofectamine2000(invitrogen)转染法，按其使用说明，4种N2-1、N5-4、N6-3、N8-3完整抗体序列的表达载体pIRESneo3d-anti-EGFR各制备1.5μg质粒和4.5μllipofectamine 2000的混合物，共转染6孔板的一个孔中6×10⁵个细胞，过夜转染后，将细胞平均分配到1块96孔板中。 

4种N2-1、N5-4、N6-3、N8-3完整抗体转染的CHO细胞在DMEM+5％dFBS+1.0mg/ml G418下进行筛选，每2-3天更换筛选培养基，培养2-3周各获得20多个筛选细胞克隆。将细胞按相同的密度传至24孔板中，在0.5ml DMEM+5％dFBS培养基中培养5天，ELISA检测培养基上清液中人源EGFR单克隆抗体的表达量，各种抗体细胞最高表达株的结果见表3。 

                        表3 

转染克隆编号	G418筛选下的表达量   mg/L	MTX筛选下的表达量   mg/L
			N2-1-E1	16.0	78.4
N5-4-D1	14.3	69.1
			N6-3-H2	12.2	50.7
N8-3-H3	11.1	90.3

为了使G418筛选的人源EGFR单克隆抗体细胞更高效的表达，4种抗体各选最高表达细胞进行MTX扩增表达。具体操作为，重组CHO细胞在DMEM+5％dFBS培养基中培养，并在培养过程中加入逐步增加的MTX浓度，培养过程中持续监测抗体的表达水平，当MTX浓度增加到细胞生长无法耐受时停止增加MTX浓度，在T25培养瓶中培养五天后ELISA检测培养基清液中人源EGFR单克隆抗体的表达量，结果见表3。 

实施例五、人源抗EGFR单克隆抗体的活性分析 

(1)人源EGFR单克隆抗体的ELISA定量检测 

采用夹心法进行ELISA检测。包被液为50μl的1μg/ml的山羊抗人IgG(Fc)多克隆抗体(KPL)，封闭液为2％BSA，室温下封闭3h，标准品为Human IgG1，KAPPA(Sigma)，室温放置4h，第二抗体为50μl 1∶2000稀释的辣根酶标记山羊抗人IgG(H+L)(北京中杉金桥有限公司)，37℃下温育2h，TMB显色。OD450下读值。 

(2)人源EGFR单克隆抗体的纯化及SDS-PAGE分析 

细胞培养上清液经过Prostak切向流系统0.45μm过滤。澄清的培养液上样Protein A Sepharose FF.柱进行亲和纯化【Lindmark et al.，J.Immunol.Meth.1983 62：1】，用0.1M pH2.7柠檬酸缓冲液洗脱。亲和层析洗脱峰用1M Tris pH9.0调pH3.5，室温孵育1h后再将样品用1M Tris pH9.0调pH为7.8，上样DEAESepharose FF柱分离，用20mM Na₃PO₄/150mM NaCl pH 7.4液洗脱。AIEX洗脱峰中加入固体NaCl至终浓度1.2M，0.45μm滤膜过滤后进Butyl Sepharose HS分离，20mM Na₃PO₄，5％glycerol，pH 7.4洗脱液洗脱。最终产品0.22μm滤膜过滤后冻干保存。终产品经HP-SEC检测纯度97％以上，13％SDS-PAGE电泳可见清晰的重链和轻链条带(图4)。 

(3)人源抗EGFR型抗体的A431细胞增值活性检测及亲和力分析 

将100μl DMEM/F12梯度系列稀释亲和纯化后的Ab-N2-1、Ab-N5-4、Ab-N6-3、Ab-N8-3抗体加入96孔板中，并以本公司表达的SCT400IgG1型抗体和无抗体的DMEM/F12+10％FBS培养基为对照。均加入100μl 2×10³个A431细胞的DMEM/F12+10％FBS培养基。37℃培养4天后每孔加入10μl WST-8(南京旋光科技有限公司)，继续培养3h，450nm测定光吸收。结果发现在的4个IgG1抗体中，Ab-N5-4(图6a和6b)、Ab-N6-3(图7a和7b)的抗A431细胞的增殖效果较Ab-N2-1和Ab-N8-3的明显，能够明显抑制A431细胞的正常增殖，并诱发细胞的凋亡，结果见图5。 

对Ab-N2-1、Ab-N5-4、Ab-N6-3、Ab-N8-34个克隆的完整IgG1型抗体进行亲和性分析。我们用竞争ELISA法进行抗体亲和力检测，该技术为本领域专业人员所熟知的方法。100μl 20μg/ml纯化的EGFR ECD重组蛋白4℃过夜包被96孔板，再加入3％脱脂牛奶室温下封闭1h，TBS/Tween洗液清洗三次，在离心管中建立终浓度为0.1nM-1μM的EGFR ECD抗原系列稀释度和终浓度为1nM的完整IgG1抗体，室温下孵育30min后，加入到EGFR ECD重组蛋白包被的96孔板中，室温下竞争性结合5-10min，TBS/Tween洗液充分清洗96孔酶标板，加入1∶2000倍稀释的HRP-兔抗M13(法玛西亚)室温下结合2h，TMB显色，最强信号的一半的抗原浓度视为抗体的解离常数K_D，结果见表2。 

实施例六、N5和N6组scFv的进一步分析 

scFv的亲和性和活性分析结果和重构后的Ab-N5-4、Ab-N6-3的证明，来自N5(9个相似克隆)和N6组(13个相似克隆)的克隆具有较好的潜在筛选价值，序列的相似性也说明这些克隆针对的可能是相似的抗原决定簇，筛选的参数仅限于抗体亲和力。因此我们又针对N5组剩余的8个克隆和N6组的12个克隆进行了抗体亲和力的筛选，可溶性的scFv经过表达，进行竞争性ELISA检测，方法同上面的亲和力测定。结果发现N5-7(图8a和8b)k_D＝0.6×10^-9和N6-9(图9a和9b)k_D＝0.8×10^-9，该两个克隆对EGFR ECD具有很高的亲和性。 

                    序列表 

Claims (7)

1.一种抗EGFR的全人单链抗体，其特征在于：

a)包含SEQ ID NO：1所示的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：2所示的κ轻链可变区氨基酸序列；

b)包含SEQ ID NO：3所示的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：4所示的κ轻链可变区氨基酸序列；

c)包含SEQ ID NO：5所示的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：6所示的κ轻链可变区氨基酸序列；或

d)包含SEQ ID NO：7所示的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：8所示的κ轻链可变区氨基酸序列。

2.一种抗EGFR的全人抗体，其特征在于：

a)包含SEQ ID NO：1所示的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：2所示的κ轻链可变区氨基酸序列；

b)包含SEQ ID NO：3所示的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：4所示的κ轻链可变区氨基酸序列；

c)包含SEQ ID NO：5所示的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：6所示的κ轻链可变区氨基酸序列；或

d)包含SEQ ID NO：7所示的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：8所示的κ轻链可变区氨基酸序列。

3.权利要求2所述的一种全人抗体，其特征在于抗体的轻链恒定区为κ型，重链恒定区为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，IgD或IgE型。

4.权利要求2所述的一种全人抗体，其特征在于抗体的轻链恒定区为κ型，重链恒定区为IgG1型。

5.权利要求2所述的一种全人抗体，编码所述全人抗体的DNA分子特征在于：

a)重链可变区的DNA序列为SEQ ID NO：9，轻链可变区的DNA序列为SEQ ID NO：10；

b)重链可变区的DNA序列为SEQ ID NO：11，轻链可变区的DNA序列为SEQ ID NO：12；

c)重链可变区的DNA序列为SEQ ID NO：13，轻链可变区的DNA序列为SEQ ID NO：14；或

d)重链可变区的DNA序列为SEQ ID NO：15，轻链可变区的DNA序列为SEQ ID NO：16。

6.一种抗体蛋白表达载体，其特征在于，它包含权利要求5中所述的DNA分子。

7.一种抗体表达方法，其特征在于用权利要求6所述的表达载体在中国仓鼠卵巢细胞CHO中表达抗体蛋白。

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