CN105504062B - 一种抗CD6单抗T1h的检测性抗体及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物制药技术领域，具体地说是涉及一种抗CD6单抗T1h的检测性抗体的获得方法、制备方法及其检测方法；本发明通过全合成噬菌体抗体库的筛选技术，对抗T1h的单链抗体进行生物淘选、对抗T1h噬菌体单链抗体进行阳性克隆鉴定和梯度稀释phage ELISA比较抗T1h单链抗体的亲和力，再对抗T1h全抗体进行制备，获得了一种新的抗T1h的特异性单克隆抗体，该抗体所述抗体重链可变区包含SEQ.1的氨基酸序列，所述抗体轻链可变区包含SEQ.2的氨基酸序列。本发明所述抗体用于临床试验中血液及其他体液中T1h的浓度检测，能够灵敏快速地检测T1h的血药浓度，为T1h临床试验药理、药代分析提供了可靠的研究方法，同时也可以用于中和T1h抗体。

Description

一种抗CD6单抗T1h的检测性抗体及应用
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，具体地说是涉及抗CD6单抗T1h的检测性抗体的获得、制备及其检测方法。
背景技术
CD6是I型整合膜糖蛋白，是清道夫受体富含半胱氨酸超家族SRCRSF(scavengerreceptor cysteine-rich superfamily)的成员，胞外区有3个富含半胱氨酸的功能区SRCR(scavenger receptor cysteine-rich)，其近膜结构域(SRCR3)含有结合ALCAM的位点。CD6主要通过T细胞表达，与人白细胞活化粘附因子ALCAM(activated leukocyte celladhesion molecule，CD166)相互作用；CD6参与T细胞活化，调节T细胞功能和介导细胞—细胞间的粘附。CD6分子可与TCR/CD3形成复合体，参与免疫突触(immunological synapse，IS)的形成；成熟型免疫突触分为中央超级分子活化簇(central supramolecularactivation clusters,C-SMAC)和周边超级分子活化簇(peripheral supramolecularactivation clusters,P-SMAC)两部分，CD6分子是中央超级分子活化簇的重要组成成分之一；免疫突触(IS)的形成是T细胞识别抗原、增殖和活化的关键步骤，是机体细胞免疫反应和体液免疫反应的重要组成部分。自身性免疫性疾病的发病机制中，T细胞增殖活化和迁移过程起着重要作用。基于CD6分子在淋巴细胞成熟、活化和增殖中的重要作用，阻断CD6分子的功能可为类风湿性关节炎、银屑病等自身免疫的治疗提供新的治疗手段或方法。
抗CD6的人源化单抗Itolizumab(T1h)于2013年8月印度获批上市用于慢性斑块型银屑病，该单抗结合于CD6的SRCR1功能域，而不阻碍CD6分子与其配体ALCAM(activatedleukocyte cell adhesion molecule，CD166)的结合；但T1h与细胞表面CD6分子形成的免疫复合物通过内在化机制进入细胞内，被胞内溶酶体系统消化降解，降低淋巴细胞表面CD6水平，阻碍CD6分子与TCR/CD3形成免疫突触(IS)，表现为STAT3,MAPK,AKT信号传导途径磷酸化水平减低，淋巴细胞活化和增殖受抑，显著降低IFN-γ和TNF-α等炎性细胞因子的表达和分泌，从而达到治疗自身免疫性疾病的目的。
抗体库技术为全人源抗体的筛选提供了良好的技术平台，抗体库技术绕过了以往单抗研制过程中必须的杂交瘤过程，甚至不需要经过免疫过程即可获得各种抗体基因及抗体分子片段。噬菌体抗体库是最早出现也是目前应用最广泛的抗体库，噬菌体抗体库通过噬菌体展示技术将不同特异性的抗体或其功能片段(Fab、Fv、ScFv)表达在噬菌体表面，再用抗原进行筛选；噬菌体抗体库根据抗体基因的来源分为免疫库和非免疫库，非免疫库又包括天然库、半合成库和全合成库；噬菌体抗体库的筛选模拟了抗体亲和力成熟的过程，通常将抗原包被在固相介质上，加入待筛选的噬菌体抗体库，通过数轮“吸附-洗涤-洗脱-扩增”的过程(即淘选)直至筛选到高亲和力、特异性强的抗体。
经研究发现，欧洲专利EP 2119452 A1--Pharmaceutical composition,comprising an anti-CD6 monoclonal antibody used in the diagnosis andtreatment of rheumatoid arthritis；加拿大专利CA 2716919 C--An anti-CD6monoclonal antibody and use thereof；美国专利US 8993524 B2--Compositions andmethods for targeted immunomodulatory antibodies and fusion proteins、美国专利US 8435521 B2--Pharmaceutical compositions capable of inducing apoptosis intumour cells,useful for diagnosis and treatment of B-chronic lymphocyticleukaemia；中国专利CN 102559636 B--用于白血病和自身免疫疾病的抗体融合蛋白及其制备方法、中国专利CN 104673754 A--重组骨髓瘤细胞克隆的筛选方法及由此获得的抗体分子；上述专利只公开了抗CD6抗体T1h的获得和可能应用，而没有抗T1h的特异性抗体，也没有T1h抗体的检测方案。这对T1h临床试验的药理、药代分析带来了不便；同时也没有T1h的中和抗体，一旦T1h被误用，缺乏其中和抗体。综上，现有技术中没有解决该技术问题的技术方案。
发明内容
本发明通过全合成噬菌体抗体库的筛选技术，获得了一种新的抗T1h的特异性单克隆抗体，该抗体可以特异性结合T1h而用于T1h的检测或中和，解决了T1h抗体浓度检测的技术问题；本发明能够很灵敏快速地检测T1h的血药浓度，为T1h临床试验药理、药代分析提供了可靠的研究方法，可用于临床试验中血清及其他体液中T1h的检测；同时也可以用于中和T1h抗体。
本发明为了解决上述技术问题，所包含的技术方案如下：
一种抗CD6单抗T1h的检测性抗体，包括：所述抗体重链可变区包含如SEQ.1所示的氨基酸序列，所述抗体轻链可变区包含如SEQ.2所示的氨基酸序列。
其中，本发明还提供了一种包含上述轻链可变区或上述重链可变区的抗体、多肽或蛋白。
其中，本发明还提供了一种包含上述轻链或上述重链的多核苷酸序列。
其中，本发明还提供了一种包含上述多核苷酸序列或组合的重组DNA表达载体；所述载体的DNA序列中包含编码抗T1h抗体的所述重链可变区或所述轻链可变区的氨基酸序列，以及如SEQ.3所示的重链恒定区或如SEQ.4所示的轻链恒定区的氨基酸序列。
其中，所述重链恒定区选自人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或鼠的IgG1、IgG2a、IgG2b；所述轻链恒定区选自人或鼠的Cλ；优选地，所述重链恒定区为人的IgG4，所述轻链恒定区为人的Cλ。
其中，本发明还提供了一种转染上述重组DNA表达载体的宿主细胞，所述细胞包含哺乳动物细胞、昆虫细胞、大肠杆菌及酵母，优选哺乳动物细胞；优选地，所述哺乳动物细胞包含HEK293E细胞、CHO细胞或NS0细胞。
其中，所述抗T1h的单克隆抗体包含全长抗体或抗T1h单克隆抗体的片段，所述片段包含但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或ScFv。
其中，本发明中所述抗体用于临床试验中血液及其他体液中T1h的浓度检测，以及中和T1h等其他用途。
其中，所述ScFv为单链抗体(single-chain fragment variable)；所述HEK293E细胞为人胚肾293E细胞(human embryonic kidney 293E cell)；CHO细胞为中国仓鼠卵巢细胞(chinese hamster ovary cell)；NS0细胞为小鼠胸腺瘤细胞。
一种抗CD6单抗T1h的检测性抗体的获得方法，包括：
步骤一、抗T1h的单链抗体的生物淘选
采用基因克隆的方法对载体pcom3载体进行改造，使之用于噬菌体单链抗体库的构建和表达，改造后的载体命名为pScFvDisb-s，并以此载体为基础，构建全合成噬菌体抗体库；
以T1h为抗原包被免疫管，分别封闭免疫管和全合成噬菌体抗体库，封闭后的噬菌体抗体库加入免疫管中进行抗原抗体结合，洗去未结合的噬菌体，中和洗脱下来的噬菌体抗体溶液至PH7.0附近；
将上述中和后的噬菌体感染生长至对数期的TG1菌液，培养箱中静置，取出部分菌液进行梯度稀释，涂布于2YTAG平板上，用于计算噬菌体产出量；剩余的菌液离心弃上清，将菌体沉淀重悬于少量培养基，吸出后涂布于2YTAG大平板，为下一轮筛选做准备；
将上述感染后涂板的菌体从大平板上刮下，接菌至2YTAG液体培养基，摇至对数期后加入M13辅助噬菌体超感染，培养扩增噬菌体，沉降纯化噬菌体用于下一轮筛选；共进行三轮噬菌体库富集筛选；
步骤二、抗T1h噬菌体单链抗体阳性克隆的鉴定
经过三轮筛选后，挑取分隔良好的单克隆菌落，接种于加有2YTAG液体培养基的96孔深孔板，培养至其对数生长期，加入辅助噬菌体M13KO7，静止感染，离心，弃去上清，菌体用2YTAK重悬沉淀，培养；吸取扩增后的噬菌体上清进行ELISA鉴定；筛选得到亲和力较高的单克隆抗体3E7、B10和B2，其中，T1h亲和力较高；对3E7、B10和B2单抗进行基因测序确定为不同序列的抗体；
步骤三、梯度稀释phage ELISA比较抗T1h单链抗体的亲和力
将步骤二中获得的克隆进行单克隆phage的展示和纯化，进行phage梯度稀释ELISA实验鉴定phage-abs的亲和力；
用碳酸盐缓冲液包被T1h，洗涤，封闭，将纯化后的phage梯度稀释，加入稀释后的样品，室温静置，洗涤ELISA板，将稀释后的HRP-anti-M13单克隆抗体加入ELISA板中，室温放置，TMB显色试剂盒室温显色，用2M H2SO4终止显色，结果显示筛选出的3株不同的单链抗体均能与T1h进行结合。
一种抗CD6单抗T1h的检测性抗体的制备方法，包括：
步骤1、抗T1h全抗体的制备
将单克隆抗体3E7、B10和B2的重链VH和轻链Vλ基因分别克隆至装有重链和轻链恒定区基因的载体pTSE，编码人恒定区γ4和λ链的pTSE载体中；瞬时转染HEK293E细胞，进行全抗体表达；用protein A亲和柱纯化获得全抗体蛋白；用生物素标记全抗体后，用BCA试剂盒进行蛋白浓度的测定；
步骤2、全抗体与T1h的结合实验
步骤2.1、全抗体水平上抗T1h单抗的亲和力比较
用碳酸盐缓冲液包被，洗涤，封闭，加入不同稀释度的生物素标记的全抗体；三种全抗体最高浓度是100μg/ml，稀释做梯度，孵育；用PBST洗涤，再加入用milk-PBST稀释的链霉亲和素孵育；用PBST洗涤，TMB显色试剂盒室温显色，然后用2M H2SO4终止显色；结果显示，所有抗体均能很好的与T1h分子结合，其中3E7亲和力相对较高；
步骤2.2、不同T1h包被量时3E7的亲和力比较
用碳酸盐缓冲液包被不同浓度的T1h全抗体，T1h最高浓度为2μg/ml，梯度稀释，包被；用PBST洗涤，再加入milk-PBST封闭；加入不同稀释度的全抗体；生物素标记的3E7全抗体最高浓度是100μg/ml，稀释做梯度，孵育；用PBST洗涤，再加入用milk-PBST稀释的链霉亲和素孵育；用PBST洗涤，TMB显色试剂盒室温显色，然后用2M H2SO4终止显色；结果显示，3E7在较低的T1h浓度时，也有较高的亲和力；
步骤3、全抗体3E7的结合特异性分析
用碳酸盐缓冲液包被T1h、CD6-ECD-his、IgG 1–Fc、IgG1和BSA，包被，用PBST洗涤，再加入milk-PBST封闭，加入生物素标记的3E7全抗体，孵育，用PBST洗涤，再加入用milk-PBST稀释的链霉亲和素孵育，用PBST洗涤，TMB显色试剂盒室温显色，然后用2M H2SO4终止显色；结果显示，3E7与T1h以外的蛋白亲和力都很低，3E7具有很好的结合特异性。
一种抗CD6单抗T1h的检测性抗体的检测方法，包括：用碳酸盐缓冲液包被3E7全抗体，用PBST洗涤，再加入milk-PBST封闭，加入用血清稀释的不同浓度T1h全抗体，T1h浓度分别为300ng/ml、200ng/ml、150ng/ml、100ng/ml、75ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、0ng/ml，孵育，用PBST洗涤，再加入稀释的HRP标记的鼠抗人的IgG1的二抗，孵育，用PBST洗八次，荧光底物室温显色，然后用2M H2SO4终止显色，检测，读数，制作标准曲线。
本发明具备有益性技术效果是：本发明通过全合成噬菌体抗体库的筛选技术，获得了一种新的抗T1h的特异性单克隆抗体，该抗体可以特异结合T1h而用于T1h的中和或检测，解决了现有技术的T1h抗体浓度检测的技术问题；本发明能够很灵敏快速地检测T1h的血药浓度，为T1h临床试验药理、药代分析提供了可靠的研究方法，可用于临床试验中血清及其他体液中T1h的检测；一旦T1h被误用，还可以用于中和T1h抗体。
附图说明
图1、pScFvDisb-s质粒图谱；
图2、单克隆phage ELISA鉴定抗T1h单链抗体的亲和力；
图3、梯度稀释phage ELISA比较抗T1h单链抗体的亲和力；
图4、pTSE质粒图谱；
图5、全抗体水平上抗T1h单抗的亲和力比较；
图6、不同T1h包被量3E7亲和力比较；
图7、全抗体3E7的结合特异性分析；
图8、T1h检测的标准曲线。
具体实施方式
本发明详细的实施方法参见实施例，实施例中所述的实验方法和试剂，若无特殊说明均为常规实验方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可由商业途径获得。以下实施例仅用于说明和解释本发明，而不是以任何方式限制本发明。
本发明提供了一种抗T1h的单克隆抗体，包括：所述抗体重链可变区包含如SEQ.1所示的氨基酸序列，所述抗体轻链可变区包含如SEQ.2所示的氨基酸序列。
SEQ.1、重链可变区氨基酸序列
EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIGIGGYYWTWIRQPPGKGLEWIGDIDDSGSSNINPSLESRVTLSVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARLIPRITMVRGGLDVWGKGTTVTVSS
SEQ.2、轻链可变区氨基酸序列
QSVLTQPPSVSVAPGKTATITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYEDSARPSGISERFSGSNSGNTATLTISRVEVGDEADFYCQVWDSRTDHYVFGPGTQLTVL
优选地，本发明还提供了一种包含上述轻链可变区或上述重链可变区的抗体、多肽或蛋白。
更加优选地，本发明还提供了一种包含上述轻链或上述重链的多核苷酸序列。
更加优选地，本发明还提供了一种包含上述多核苷酸序列或组合的重组DNA表达载体；所述载体的DNA序列中包含编码抗T1h抗体的重链可变区及恒定区或轻链可变区及恒定区序列的氨基酸序列。
更加优选地，所述重链恒定区选自人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或鼠的IgG1、IgG2a、IgG2b；所述轻链恒定区选自人或鼠的Cλ；优选所述重链恒定区为人的IgG4，所述轻链恒定区为人的Cλ。
更加优选地，本发明还提供了一种转染上述重组DNA表达载体的宿主细胞，所述细胞包含哺乳动物细胞、昆虫细胞、大肠杆菌及酵母，优选哺乳动物细胞；更加优选所述哺乳动物细胞包含HEK293E细胞、CHO细胞或NS0细胞。
更加优选地，所述抗T1h的单克隆抗体包含全长抗体或抗T1h单克隆抗体的片段，所述片段包含但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或ScFv。
更加优选地，本发明中所述抗体用于临床试验中血液及其他体液中T1h的浓度检测，以及中和T1h等其他用途。
具体实施例1、抗T1h的单链抗体的生物淘选
采用一系列基因克隆的方法对载体pcom3载体(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)进行改造，使之用于噬菌体单链抗体库的构建和表达。改造后的载体命名为pScFvDisb-s，其质粒图谱如图1所示，并以此载体为基础，构建全合成噬菌体抗体库。
以T1h为抗原包被免疫管，抗原包被量为5μg/500μl/管，4℃包被过夜。再用4％脱脂奶粉/PBST分别封闭免疫管和全合成噬菌体抗体库，室温封闭1h。封闭后的噬菌体抗体库加入免疫管中进行抗原抗体结合，噬菌体投入量约为109～1012个，室温反应1h。PBST-PBS洗去未结合的噬菌体，0.1M PH2.2的Glycine-HCl洗脱，用1.5M PH8.8的Tris-HCl中和洗脱下来的噬菌体抗体溶液至PH7.0左右。
将上述中和后的噬菌体感染10ml生长至对数期的TG1菌液，37℃培养箱中静置30min，取出部分菌液进行梯度稀释，涂布于2YTAG平板上，用于计算噬菌体产出量。剩余的菌液离心弃上清，将菌体沉淀重悬于少量培养基，吸出后涂布于2YTAG大平板，为下一轮筛选做准备。
将上述感染后涂板的菌体从大平板上刮下，接菌至2YTAG液体培养基，摇至对数期后加入M13辅助噬菌体超感染，28℃培养过夜扩增噬菌体，PEG6000-NaCl沉降纯化噬菌体用于下一轮筛选。共进行三轮噬菌体库富集筛选。
具体实施例2、抗T1h噬菌体单链抗体阳性克隆的鉴定
经过三轮筛选后，挑取分隔良好的单克隆菌落，接种于加有2YTAG液体培养基的96孔深孔板，37℃，220rpm培养至其对数生长期，每孔加入约1010的辅助噬菌体M13KO7，37℃静止感染30min。4000rpm，4℃离心15min，弃去上清，菌体用2YTAK重悬沉淀，28℃，220rpm培养过夜。吸取扩增后的噬菌体上清进行ELISA鉴定。筛选得到亲和力较高的单克隆抗体3E7、B10和B2，如图2所示，3E7的亲和力自左至右依次是IgG1Fc为0.0395、IgG 1为0.035、CD6-ECD为0.0065、T1h为2.0065、BSA为0.011，T1h亲和力较高。3E7、B10和B2单抗经基因测序确定为不同序列的抗体。
具体实施例3、梯度稀释phage ELISA比较抗T1h单链抗体的亲和力
将实施例2中获得的克隆进行单克隆phage的展示和纯化，进行phage梯度稀释ELISA实验鉴定phage-abs的亲和力。
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被T1h，200ng/孔/100μl，4℃包被过夜。PBST洗涤三次，4％milk-PBST 37℃封闭1h。将纯化后的phage用4％milk-PBST五倍梯度稀释，每孔加入100μl稀释后的样品，室温静置1h。用PBST洗涤ELISA板，将4％milk-PBST稀释后的HRP-anti-M13单克隆抗体加入ELISA板中，室温放置1h。TMB显色试剂盒显色，室温显色10min。用2MH2SO4终止显色，50μl/孔。450nm/630nm读数。结果如图3所示，筛选出的3株不同的单链抗体均能与T1h进行结合。
具体实施例4、抗T1h全抗体的制备
将上述3个抗体的重链VH和轻链Vλ基因分别克隆至装有重链和轻链恒定区基因的载体pTSE(图4)，编码人恒定区γ4(见SEQ.3)和λ链(见SEQ.4)的pTSE载体中(pTSE载体结构如图所示，制备过程参见CN103525868A--哺乳动物细胞高效表达载体的构建及应用--说明书第3页第[0019]段)。瞬时转染HEK293E细胞，进行全抗体表达。使用AKTA仪器protein A亲和柱纯化获得全抗体蛋白。用生物素标记全抗体后，使用BCA试剂盒进行蛋白浓度的测定。
SEQ.3、重链恒定区的氨基酸序列
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ.4、λ链恒定区的氨基酸序列
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
具体实施例5、全抗体与T1h的结合实验
5.1、全抗体水平上抗T1h单抗的亲和力比较
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被T1h，200ng/孔/100μl，4℃过夜包被。用300μl/孔PBST洗三次，再加入4％milk-PBST在37℃封闭1h。加入不同稀释度的生物素标记的全抗体。三种全抗体最高浓度是100μg/ml，5倍稀释做8个梯度，37℃孵育2-3h。用300μl/孔PBST洗五次，再加入用4％milk-PBST 1:10000稀释的链霉亲和素37℃孵育1h。用300μl/孔PBST洗八次，TMB显色试剂盒显色，100μl/孔，室温显色10min，然后用2M H2SO4终止显色，50μl/孔。450nm/630nm读数。实验结果如图5所示，所有抗体均能很好的与T1h分子结合，其中3E7亲和力相对较高。
5.2、不同T1h包被量时3E7的亲和力比较
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被不同浓度的T1h全抗体，T1h最高浓度为2μg/ml，2倍梯度稀释8个梯度，100μl/孔，4℃过夜包被。用300μl/孔PBST洗三次，再加入4％milk-PBST在37℃封闭1h。加入不同稀释度的全抗体。生物素标记的3E7全抗体最高浓度是100μg/ml，5倍稀释做8个梯度，37℃孵育2-3h。用300μl/孔PBST洗五次，再加入用4％milk-PBST 1:10000稀释的链霉亲和素37℃孵育1h。用300μl/孔PBST洗八次，TMB显色试剂盒显色，100μl/孔，室温显色10min，然后用2M H2SO4终止显色，50μl/孔。450nm/630nm读数。实验结果如图6所示，3E7在较低的T1h浓度时，也有较高的亲和力。
具体实施例6、全抗体3E7的结合特异性分析
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被T1h、CD6-ECD-his、IgG 1–Fc、IgG1和BSA，各200ng/孔/100μl，4℃过夜包被。用300μl/孔PBST洗三次，再加入4％milk-PBST在37℃封闭1h。加入10μg/ml的生物素标记的3E7全抗体，37℃孵育2-3h。用300μl/孔PBST洗五次，再加入用4％milk-PBST 1:10000稀释的链霉亲和素37℃孵育1h。用300μl/孔PBST洗八次，TMB显色试剂盒显色，100μl/孔，室温显色10min，然后用2M H2SO4终止显色，50μl/孔。450nm/630nm读数。实验结果如图7所示，B2的结合特异性自左至右依次是BSA为0.005、IgG1-Fc为0.007、IgG1为0.01、T1h为3.595；B10的结合特异性自左至右依次是BSA为0.004、IgG1-Fc为0.004、IgG1为0.009、T1h为3.806；3E7的结合特异性自左至右依次是BSA为0.01、IgG1-Fc为0.006、IgG1为0.007、T1h为3.898；3E7与T1h以外的蛋白亲和力都很低，说明3E7具有很好的结合特异性。
具体实施例7、T1h的检测是标准曲线建立
用pH 9.6的碳酸盐缓冲液包被3E7全抗体，1μg/孔/100μl，4℃过夜包被。用300μl/孔PBST洗三次，再加入4％milk-PBST在37℃封闭1h。加入用20％血清稀释的不同浓度T1h全抗体。T1h浓度分别为300ng/ml、200ng/ml、150ng/ml、100ng/ml、75ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、0ng/ml，37℃孵育2-3h。用300μl/孔PBST洗五次，再加入用1:900稀释的HRP标记的鼠抗人的IgG1的二抗，37℃孵育1h。用300μl/孔PBST洗八次，荧光底物显色，100μl/孔，室温显色10min，然后用2M H2SO4终止显色，50μl/孔。530nm/595nm读数。如图8所示读数与T1h的浓度呈较好线性关系。
对于本领域的普通技术人员而言，具体实施例只是对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。
<110>百泰生物药业有限公司.
<120>一种抗CD6单抗T1h的检测性抗体的获得方法、制备方法及其药物检测方法.
<210>
1：3E7重链可变区
重链可变区核苷酸序列
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC GGGCCCAGGA CTGGTGAAGC CTTCGGAGACCCTGTCCCTC
61 ACGTGCACTG TCTCTGGTGG CTCAATCGGC ATTGGTGGTT ACTACTGGACCTGGATCCGC
121 CAGCCCCCTG GGAAGGGGCT GGAGTGGATT GGAGACATCG ATGATAGTGGAAGTTCCAAC
181 ATTAACCCGT CCCTCGAGAG TCGAGTCACC TTATCAGTTG ACACGTCCAAGAACCAGTTC
241 TCCCTGAGGC TGAGCTCTGT GACCGCCGCA GACACGGCTG TATATTACTGTGCGAGACTG
301 ATCCCACGTA TCACTATGGT TCGGGGAGGC TTGGACGTCT GGGGCAAAGGGACCACGGTC
361 ACCGTCTCTT CA
重链可变区氨基酸序列
1 EVQLLESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSIG IGGYYWTWIR QPPGKGLEWIGDIDDSGSSN
61 INPSLESRVT LSVDTSKNQF SLRLSSVTAA DTAVYYCARL IPRITMVRGGLDVWGKGTTV
121 TVSS
2：3E7轻链可变区
轻链可变区核苷酸序列
1 CAGTCTGTGC TGACGCAGCC ACCCTCGGTG TCAGTGGCCC CAGGAAAGACGGCCACGATT
61 ACCTGTGGGG GAAACAACAT TGGAAGTAAA AGTGTGCACT GGTACCAGCAGAAGCCAGGC
121 CAGGCCCCCG TTCTGGTCGT CTATGAAGAT AGCGCCCGGC CCTCAGGGATCTCTGAGCGA
181 TTCTCTGGCT CCAACTCTGG GAACACGGCC ACCCTGACCA TCAGCAGGGTCGAAGTCGGG
241 GATGAGGCCG ACTTTTACTG TCAGGTGTGG GATAGTCGTA CTGATCACTATGTCTTCGGA
301 CCTGGGACCC AGCTCACCGT TTTA
轻链可变区氨基酸序列
1 QSVLTQPPSV SVAPGKTATI TCGGNNIGSK SVHWYQQKPG QAPVLVVYEDSARPSGISER
61 FSGSNSGNTA TLTISRVEVG DEADFYCQVW DSRTDHYVFG PGTQLTVL
3：CH(γ4的恒定区
重链恒定区的核苷酸序列
1 GCCTCCACCA AGGGCCCTTC CGTGTTCCCT CTGGCCCCTT GCTCCCGCTCCACCTCCGAG
61 TCCACCGCCG CCCTGGGCTG CCTGGTGAAG GACTACTTCC CTGAGCCTGTGACCGTGTCC
121 TGGAACTCCG GCGCCCTGAC CTCCGGCGTG CACACCTTCC CTGCCGTGCTGCAGTCCTCC
181 GGCCTGTACT CCCTGTCCTC CGTGGTGACC GTGCCTTCCT CCTCCCTGGGCACCAAGACC
241 TACACCTGCA ACGTGGACCA CAAGCCTTCC AACACCAAGG TGGACAAGCGCGTGGAGTCC
301 AAGTACGGCC CTCCTTGCCC TCCTTGCCCT GCCCCTGAGT TCCTGGGCGGCCCTTCCGTG
361 TTCCTGTTCC CTCCTAAGCC TAAGGACACC CTGATGATCT CCCGCACCCCTGAGGTGACC
421 TGCGTGGTGG TGGACGTGTC CCAGGAGGAC CCTGAGGTGC AGTTCAACTGGTACGTGGAC
481 GGCGTGGAGG TGCACAACGC CAAGACCAAG CCTCGCGAGG AGCAGTTCAACTCCACCTAC
541 CGCGTGGTGT CCGTGCTGAC CGTGCTGCAC CAGGACTGGC TGAACGGCAAGGAGTACAAG
601 TGCAAGGTGT CCAACAAGGG CCTGCCTTCC TCCATCGAGA AGACCATCTCCAAGGCCAAG
661 GGCCAGCCTC GCGAGCCTCA GGTGTACACC CTGCCTCCTT CCCAGGAGGAGATGACCAAG
721 AACCAGGTGT CCCTGACCTG CCTGGTGAAG GGCTTCTACC CTTCCGACATCGCCGTGGAG
781 TGGGAGTCCA ACGGCCAGCC TGAGAACAAC TACAAGACCA CCCCTCCTGTGCTGGACTCC
841 GACGGCTCCT TCTTCCTGTA CTCCCGCCTG ACCGTGGACA AGTCCCGCTGGCAGGAGGGC
901 AACGTGTTCT CCTGCTCCGT GATGCACGAG GCCCTGCACA ACCACTACACCCAGAAGTCC
961 CTGTCCCTGT CCCTGGGCAA GTAG
重链恒定区的氨基酸序列
1 ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSS
61 GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCPAPEFLGGPSV
121 FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTY
181 RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSQEEMTK
241 NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRLTVDKSRWQEG
301 NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK
4：Cλ(λ链的恒定区)
λ链的恒定区核苷酸序列
1 GGTCAGCCCA AGGCTGCCCC CTCGGTCACT CTGTTCCCGC CCTCCTCTGAGGAGCTTCAA
61 GCCAACAAGG CCACACTGGT GTGTCTCATA AGTGACTTCT ACCCGGGAGCCGTGACAGTG
121 GCCTGGAAGG CAGATAGCAG CCCCGTCAAG GCGGGAGTGG AGACCACCACACCCTCCAAA
181 CAAAGCAACA ACAAGTACGC GGCCAGCAGC TATCTGAGCC TGACGCCTGAGCAGTGGAAG
241 TCCCACAGAA GCTACAGCTG CCAGGTCACG CATGAAGGGA GCACCGTGGAGAAGACAGTG
301 GCCCCTACAG AATGTTCATA G
λ链恒定区的氨基酸序列
1 GQPKAAPSVT LFPPSSEELQ ANKATLVCLI SDFYPGAVTV AWKADSSPVKAGVETTTPSK
61 QSNNKYAASS YLSLTPEQWK SHRSYSCQVT HEGSTVEKTV APTECS

Claims (11)

1.一种抗CD6单抗T1h的检测性抗体，其特征在于：所述抗体重链可变区包含如SEQ IDNO: 1所示的氨基酸序列，所述抗体轻链可变区包含如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。
2.一种多肽或蛋白，其特征在于：所述多肽或蛋白包含权利要求1所述的抗CD6单抗T1h的检测性抗体。
3.一种多核苷酸序列或组合，其特征在于：所述多核苷酸序列或组合包含编码权利要求1所述的抗CD6单抗T1h的检测性抗体。
4.一种重组DNA表达载体，其特征在于：所述重组DNA表达载体包含编码权利要求1所述的抗CD6单抗T1h的检测性抗体的多核苷酸序列，其中，所述抗体还包含如SEQ ID NO: 3所示的重链恒定区的氨基酸序列和如SEQ ID NO: 4所示的轻链恒定区的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的重组DNA表达载体，其特征在于：所述重链恒定区选自人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或鼠的IgG1、IgG2a、IgG2b；所述轻链恒定区选自人或鼠的Cλ。
6.根据权利要求5所述的重组DNA表达载体，其特征在于：所述重链恒定区为人的IgG4，所述轻链恒定区为人的Cλ。
7.一种转染如权利要求4所述的重组DNA表达载体的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞包含哺乳动物细胞、昆虫细胞、大肠杆菌及酵母。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于：所述哺乳动物细胞包含HEK293E细胞、CHO细胞或NS0细胞。
10.根据权利要求1所述的抗CD6单抗T1h的检测性抗体，其特征在于：所述抗体包含全长抗体或单克隆抗体的片段，所述片段包含但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或ScFv。
11.一种抗CD6单抗T1h的检测性抗体的检测方法，其特征在于：包括；用碳酸盐缓冲液包被权利要求1所述的抗CD6单抗T1h的检测性抗体的全抗体，用PBST洗涤，再加入milk-PBST封闭，加入用血清稀释的不同浓度T1h全抗体，T1h浓度分别为300ng/ml、200ng/ml、150ng/ml、100ng/ml、75ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、0ng/ml，孵育，用PBST洗涤，再加入稀释的HRP标记的鼠抗人的IgG1的二抗，孵育，用PBST洗八次，荧光底物室温显色，然后用2MH2SO4终止显色，检测，读数，制作标准曲线。
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