CN102559636A - 用于白血病和自身免疫疾病的抗体融合蛋白及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用基因工程方法研制的一种用于白血病和自身免疫性疾病的抗体融合蛋白T1h-ONC，编码该融合蛋白的多核苷酸以及制备和纯化该融合蛋白的方法。该融合蛋白是由抗CD6的人源化单克隆抗体与豹蛙酶(ranpirnase)融合而成，在哺乳动物细胞中高效表达，且纯化工艺简短，有利于大规模制备。本发明的T1h-ONC抗体融合蛋白依然保留与CD6分子的结合特性，与CD6结合后，以免疫复合物的形式进入胞内，同时将豹蛙酶带入细胞内，降解tRNA，抑制蛋白质合成进而引起细胞凋亡。用于自身免疫性疾病及CD6阳性的白血病患者。

Description

用于白血病和自身免疫疾病的抗体融合蛋白及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗体融合蛋白及其制备方法，特别是涉及一种重组的用于白血病和自身免疫性疾病的治疗用抗体融合蛋白，编码该抗体融合蛋白的核苷酸序列、载体、宿主细胞、制备方法及应用。属于生物工程技术领域。

背景技术

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性、炎性、系统性的自身免疫性疾病。该病在世界范围内普遍存在，以慢性、对称性、多发性滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现，好发于手、腕、足等小关节，反复发作，呈对称分布。早期有关节红肿热痛和功能障碍，晚期关节可出现不同程度的僵硬畸形，并伴有骨和骨骼肌的萎缩，极易致残，是一种具有多种生理和临床特征的疾病。患病率美国为1％，中国约0.3％～0.5％，男女之比约为1比4。患病高峰年龄30～50岁。RA患者自然病程生命期缩短5～10年，标准死亡率＞1.5(刘嘉玲，中国临床医生，2005，33(5)：6-7.)。

目前，RA的病因及确切的发病机理尚未明了，已有研究表明RA与免疫功能异常、关节滑膜增生、关节软骨及骨组织破坏等密切相关。

银屑病，是一种反复发作的、以表皮增殖和炎症为特征，无传染性的红斑鳞屑性皮肤病俗称“牛皮癣”，是皮肤科常见且易于复发的慢性炎症性疾病。其病因与遗传、感染、变态反应、代谢障碍及自身免疫等有关。该病病程长，外观丑陋，缠绵难愈，病程后期可侵犯多种脏器，给患者身心带来极大伤害而被皮肤科称为“不死的癌症”。临床主要分为4型：寻常型银屑病、关节型银屑病、脓疱型银屑病及红皮病型银屑病。据调查，牛皮癣的发病率占世界人口的0.1％-3％，该病在人群中的发病率白种人明显高于黄种人，黑种人次之。1984年我国银屑病的患病率为0.123％(魏娟，黑龙江医学，2005，29(5)：344-346.)，国外一些地区更多，西北欧成人的患病率大约在1.5％～2.0％之间，日本在0.2％～1.0％之间(Menter A，Gottlieb A，Feldman SR，et al，J Am AcadDermatol.2008 May；58(5)：826-50.)。

银屑病发病机制非常复杂。有多基因遗传背景，涉及到免疫、炎症、细胞增殖与凋亡、神经介质等多方面因素，尤其是作为银屑病皮损部位浸润细胞成分的T淋巴细胞在银屑病的免疫病理机制中扮演了中心角色。

针对上述自身免疫性疾病，临床上已有很多种治疗药物，但或者由于疗效不稳定、副作用过多，或者由于对肝脏、肾脏和骨髓的毒性并具致畸性而在临床应用上受到了极大的限制。因此，研制一种有效治疗类风湿性关节炎和银屑病等自身免疫性疾病的药物显得尤为重要。

抗体药物由于其靶向性强、疗效独特、安全性耐受性好、使用安全、适合长期治疗，在肿瘤和自身免疫性疾病等顽症的治疗方面具有其他药物无可比拟的优势，而成为目前生物药领域的研究热点。

本发明的抗体融合蛋白正是基于白细胞分化抗原CD6分子在淋巴细胞成熟、活化和增殖中的重要作用而设计的，通过阻断CD6分子的功能可为类风湿性关节炎、银屑病等自身免疫性疾病及CD6阳性的白血病的治疗方面提供新的治疗手段和方法。研究表明，与CD6分子表位3(epitope)结合的UMCD6单克隆抗体能够抑制破伤风类毒素(TT)抗原特异的T细胞克隆和药物诱导的自身反应性T细胞克隆的增殖。

CD6是I型跨膜糖蛋白，胞外区有3个富含半胱氨酸的功能区重复序列，属于SRCRSF家族，CD6有105/110KD和130KD两种异构型(Alejandro Aruffo，Michael B，Melnick，et al.，J Exp Med，1991，174：949-952.)。CD6分子序列全长668个氨基酸(Robinson WH，Neuman de Vegvar HE，Prohaska SS，et al.，Eur JImmunol，1995，25(10)：2765-2769.)，去除N-末端17个氨基酸信号肽序列后，CD6分子胞外区385个氨基酸，胞外区至少有3个表位：SRCR1、SRCR2和SRCR3。SRCR3是与其配体-激活白细胞粘附分子(ALCAM)结合的部位；SRCR2或柄区具有稳定结合的作用。SRCR1、SRCR3与T细胞活化信号传导有关。跨膜区：由23个疏水氨基酸组成；胞浆区：244个氨基酸，含2个丝氨酸残基。CD6胞浆区长短不一，但至少有一个30KD的胞浆区尾并伴有多重磷酸化位点。在胸腺细胞分化及T细胞活化过程中，CD6表达上调。多种物质能特异地调节CD6表达，如ConA、PHA、PMA、IL-2和抗CD2的单克隆抗体等(Robinson WH，Prohaska SS，Santoro JC，et al.J Immunol，1995，155(10)：4739-4748.)。

古巴分子免疫中心(CIM)开发了抗人T淋巴细胞CD6分子的鼠源性单克隆抗体ior-t1，由Sezary综合症患者外周血单个核细胞免疫的小鼠得到鼠源的单抗ior-t1。临床前研究结果显示其在自身免疫性疾病治疗中有潜在价值和较好的安全性。

CIM于1999年～2003年在古巴进行ior-t1治疗银屑病、类风湿性关节炎的I期、II期临床试验。已有的临床研究结果表明：以CD6分子为靶点治疗T淋巴细胞瘤、银屑病、类风湿性关节炎的有效性较好；由于ior-t1是鼠源性单克隆抗体，在治疗中出现了较多不良反应，产生人抗鼠抗体反应(HAMA)。针对以上问题，CIM对ior-t1抗体进行人源化，以降低其在治疗中的不良反应。

CD6单抗的人源化通过基于T细胞抗原表位预测(detopes)的人源化技术完成，在人源化过程中，鼠源IgG2a免疫蛋白(ior-t1)改造为人源化IgG1(Roque-NavarroL et al..Hybrid Hybridomics.2003 Aug；22(4)：245-57)，根据国际人源化抗体的命名规则该抗体被命名为Itolizumab(也称T1h)。表面等离子共振(surface plasmonresonance SPR)分别检测T1h及其亲本抗体(ior-t1)亲和性，解离常数(Kd)分别是6.84×10^-8M和6.74×10^-8M，人源化抗体保持了与亲本抗体相似的亲和力。人源化抗体T1h及其亲本(ior-t1，T1q)与外周血单个核细胞的识别率，阳性率分别达79.7％和69.9％，T1h抗体保留了与亲本抗体相同的识别特性；比较人源化抗体及其亲本(ior-t1，T1q)在绿猴(Cercopithecus aethiops)体内的免疫原性，人源化抗体T1h的免疫原性明显低于其亲本；在兔子体内进行的药代动力学研究表明，T1h抗体比其鼠源性抗体有更长的半衰期。上述实验表明将ior-t1改造为人源化抗体T1h是成功的。

由于人源化抗CD6单抗(T1h)具有上述特性，T1h单抗已被古巴和印度批准用于自身免疫性疾病如银屑病和类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)的临床研究。人源化T1h单抗于2003年在古巴批准进行RA治疗的I期临床研究，2007年基本完成I期临床研究；2007年在印度批准进行RA(70名患者)及银屑病治疗(40名患者)的I期临床研究，2008年40名患者完成银屑病的I期临床研究。印度Biocon公司2008年启动了T1h单抗银屑病治疗的II期临床研究。

T1h单抗可能的作用机制是：T1h单抗作用于淋巴细胞表面CD6分子，与CD6分子以免疫复合物的形式进入细胞内，降低淋巴细胞表面的CD6水平；T1h单抗阻碍了CD6与TCR/CD3形成中央超级分子活化簇，表现为STAT3、MAPK、AKT信号传导途径磷酸化水平减低，淋巴细胞活化和增殖受到抑制，进而减少IFN-γ和TNF-α等炎性细胞因子的表达和分泌，从而达到治疗类风湿性关节炎(RA)和银屑病等自身免疫性疾病的目的。

另外，最近的研究表明，存在于两栖类蛙卵中的一种的强碱性核糖核酸酶(RNase)具有强大的细胞毒性，能够选择性杀伤恶性肿瘤细胞，已成为一类新型的抗肿瘤药物。

豹蛙酶(Ranpirnase)，商品名为Onconase(以下简称为ONC)，是一种抗肿瘤药物，属于核糖核酸酶A超家族，它的核糖核酸酶活性低，细胞毒性较强，在体内外对多种肿瘤具有显著杀伤作用，是目前全球正在重点研究的100种新药之一。ONC通过胞吞作用进入细胞，在人体或者哺乳动物细胞内，因其对RNA酶抑制剂(RNase inhibitor，RI)有很低的亲和性，使其可以逃避因RI引起的失活，在胞浆内选择性地降解tRNA(Saxena SK et al.，J Biol Chem，2002，277(17)：15142-15146；Wu Y et al.，J Biol Chem，1993，268(14)：10686-10693.)，抑制蛋白质合成进而引起细胞凋亡。

豹蛙酶是首个进入III期临床研究的核糖核酸酶类药物，主要用于治疗恶性间皮瘤，目前治疗非小细胞肺癌的研究也已经进入了临床II期试验阶段。与常用的来源于微生物和植物的一些毒素相比如白喉毒素、绿脓杆菌毒素、破伤风毒素和蓖麻毒素等，豹蛙酶(ranpirnase)具有毒性低，免疫原性弱等特性。目前，豹蛙酶(ranpirnase)已在国外进行用于间皮瘤的临床IIIb的研究(MikulskiM等JClinical Oncology，2002，20(1)：274-281.)。

将抗体药物与豹蛙酶(ranpirnase)偶联用于肿瘤治疗的研究也有相关的报道，如目前美国Immunomedics，Inc公司开发的抗CD74抗体融合豹蛙酶和抗CD22抗体偶联豹蛙酶(Chang CH等Blood.2005，106(13)：4308-14)等。

本发明在现有技术的基础上，根据T1h单抗具有与人淋巴细胞CD6分子结合后以免疫复合物的形式进入细胞内的性质，以及CD6在未成熟胸腺细胞、成熟T淋巴细胞、B1a淋巴细胞、慢性B淋巴细胞白血病细胞等细胞中表达的性质，而裸抗体T1h单抗基本不具补体激活的杀伤活性(CDC)和抗体依赖的细胞毒活性(ADCC)。采用基因工程的方法在真核细胞中表达一种抗CD6人源化抗体Itolizuamb(T1h)与豹蛙酶(ranpirnase)的抗体融合蛋白，通过发挥T1h与CD6结合后的内在化作用，发挥豹蛙酶促细胞凋亡作用，同时保留了T1h的活性。该免疫融合蛋白可用于白血病和自身免疫疾病治疗。

发明内容

本发明通过基因工程的方法将编码人源化抗体T1h序列通过Linker与豹蛙酶的编码基因相连接，并在真核细胞中表达一种分子量较T1h抗体大的免疫融合蛋白T1h-ONC，结构示意图见图1。该免疫融合蛋白在哺乳动物细胞中高效表达，且纯化工艺简短，有利于大规模制备。同时保留有与CD6分子的结合特性，与CD6结合后以免疫复合物的形式进入细胞内，同时将豹蛙酶带入细胞内，通过豹蛙酶核糖核酸酶A活性在胞浆内选择性地降解tRNA，抑制蛋白质合成进而引起细胞凋亡，同时保留了T1h的活性。免疫融合蛋白T1h-ONC一方面用于自身免疫性疾病的治疗，另一方面可用于CD6阳性的白血病患者的治疗。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种抗体融合蛋白，是由抗CD6单克隆抗体通过Linker与豹蛙酶Onconase连接而成。

本发明的抗体融合蛋白中豹蛙酶Onconase通过Linker连接在抗CD6单克隆抗体轻链的N末端；

本发明所述的抗CD6单克隆抗体是人源化的；

所述单克隆抗体的重链恒定区优选为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4及其突变体中的任意一种；更优选为人IgG1及其突变体的任意一种；

所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDIRSYLTWYQQKPGKAPKTLIYYATSLADGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLESDDTATYYCLQHGESPFTLGSGTKLEIKR[SEQ ID NO：8]

所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFKFSRYAMSWVRQAPGKRLEWVATISSGGSYIYYPDSVKGRFTISRDNVKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARRDYDLDYFDSWGQGTLVTVSS[SEQ ID NO：9]

本发明所述的抗体融合蛋白的轻链序列如SEQ ID NO：

所示；所述抗体融合蛋白的重链序列如SEQ ID NO：

所示；

本发明一方面提供了一种多核苷酸序列，其编码所述的抗体融合蛋白；

本发明提供了包含所述多核苷酸序列的载体，所述载体为真核表达载体；所述载体优选为pT1h-ONC。

本发明提供了一种转染上述载体的宿主细胞，所述的宿主细胞是293F细胞。

本发明提供了所述抗体融合蛋白的制备方法，包括以可检测量表达抗体融合蛋白的条件下转录和翻译所述的多核苷酸，经亲和层析法纯化的步骤。

本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物含有所述抗体融合蛋白及药学上可接受的赋形剂。

所述的药物组合物通过局部给药、气雾剂、注射剂的方式施用；所述的注射剂通过腹膜内注射、皮下注射和静脉注射的方式施用。

本发明提供了所述抗体融合蛋白在制备治疗抗CD6阳性的白血病的药物中的应用。

本发明提供了所述抗体融合蛋白在制备治疗自身免疫性疾病中的应用；所述的自身免疫性疾病是银屑病、类风湿型关节炎中的任意一种。

附图说明

图1为抗体融合蛋白T1h-ONC结构示意图

图2为ONC基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果

图3为T1h轻链基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果

图4为T1h-ONC轻链融合基因的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果

图5为T1h-ONC重链融合基因的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果

图6为PBH-ONC-TL酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果

图7为PBL-TH酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果

图8为pT1h-ONC载体构建示意图

图9为pT1h-ONC酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果

图10为T1h-ONC纯化蛋白的SDS-PAGE分析

图11为CD6分子介导的内在化对HUT-78细胞的生长抑制

图12为T1h-ONC与HEK293/CD6⁺表面CD6的结合分析

图13为T1h-ONC对HUT-78细胞生长的抑制

具体实施方式

本发明的实施方案通过下列实施例举例说明。然而，应当理解，本发明的实施方案不限于这些实施例的特定细节，因为对于本领域的普通技术人员来说，其其他的变化是已知的，或根据直接公开的内容和附属的权利要求是显而易见的。因此，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。本文引用的参考文献以其全文通过引用并入本文。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、免疫融合蛋白T1h-ONC基因的克隆

1、免疫融合蛋白T1h-ONC轻链基因的合成及扩增

1)编码ONC-linker基因序列的合成：

Onconase序列参照US2003/0099629合成，序列如SEQ ID NO：1所示；

QDWLTFQKKHITNTRDVDCDNIMSTNLFHCKDKNTFIYSRPEPVKAICK

GIIASKNVLTTSEFYLSDCNVTSRPCKYKLKKSTNKFCVTCENQAPVHFV

GVGSC[SEQ ID NO：1]

Linker选用GSGGGSGGGGSGGGGS；

ONC-Linker序列委托上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列如SEQ ID NO：2所示：

CAGGACTGGCTGACCTTTCAGAAGAAGCACATCACCAACACCCGCGACG

TGGACTGCGACAACATCATGTCCACCAACCTGTTCCACTGCAAGGACAA

GAACACCTTCATCTACTCCCGGCCTGAGCCTGTGAAGGCTATCTGCAAGG

GAATCATCGCCTCCAAGAACGTGCTGACCACCTCCGAGTTTTACCTGTCC

GACTGCAACGTGACCTCCCGGCCTTGCAAGTACAAGCTGAAGAAGTCCA

CCAACAAGTTCTGCGTGACCTGCGAGAACCAGGCTCCTGTGCACTTCGT

GGGAGTGGGATCCTGCGGCTCCGGAGGCGGATCCGGCGGAGGAGGCTC

TGGAGGCGGCGGATCC[SEQ ID NO：2]

以SEQ ID NO：2的DNA片段为模板，用如下的引物进行PCR扩增：

上游引物：5-TCCCCCGGGGCCACCATGGAGACC-3；

下游引物5-GGAGACTGGGTCATCTGGATGTC-3，

其中上游引物下划线部分为SmaI的酶切位点，由北京英潍捷基技术有限责任公司合成。

PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；以94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，扩增30个循环；再以72℃延伸10min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，如图2所示，得到大约450bp的条带，命名为ONC。然后将目的条带切下，用DNA试剂盒(北京天根生化科技有限公司产品)回收扩增产物。

2)编码T1h轻链基因序列的合成：委托上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列如SEQ ID NO：3所示：

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCGGTGGGAGA

CAGAGTCACTATCACTTGCAAGGCGAGTCGGGACATTAGAAGCTATTTAA

CCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGACCCTGATCTATTAT

GCAACAAGCTTGGCAGATGGGGTCCCGTCGAGATTCAGTGGCAGTGGAT

CTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGTCTGACGATACA

GCAACTTACTACTGTCTACAACATGGTGAGAGTCCATTCACGCTCGGCTC

GGGGACCAAGCTGGAAATCAAACGTACGGTCGCCGCTCCCAGCGTGTTC

ATCTTCCCTCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACCGCCAGCGTGG

TGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAA

GGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGA

GCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTG

AGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACC

CACCAGGGACTGTCTAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGT

GCTAA[SEQ ID NO：3]

T1h轻链基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO：4所示

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDIRSYLTWYQQKPGKAPKTLIYYATS

LADGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLESDDTATYYCLQHGESPFTLGSGTKLEI

KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG

NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF

NRGECZ[SEQ ID NO：4]

以该DNA片段为模板，用如下的引物进行PCR扩增：

上游引物：5-GACATCCAGATGACCCAGTCTCC-3；

下游引物5-CAACCGGGGCGAGTGCTAAGAATTCCGG-3，

其中下游引物下划线部分为EcoRI的酶切位点，由北京英潍捷基技术有限责任公司合成。

PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；以94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，扩增30个循环；再以72℃延伸10min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，如图3所示得到T1h轻链基因，大约700bp的条带，命名为TL。然后将目的条带切下，用DNA试剂盒(北京天根生化科技有限公司产品)回收扩增产物。

3)T1h-ONC轻链融合基因的合成：以回收的ONC-Linker和T1h轻链编码基因作为模板，采用Overlap-PCR的方法获得T1h-ONC轻链的融合基因。

用如下的引物进行PCR扩增：

上游引物：5-TCCCCCGGGGCCACCATGGAGACC-3；

下游引物：5-CAACCGGGGCGAGTGCTAAGAATTCCGG-3；

其中下划线部分分别为SmaI和EcoRI的酶切位点，北京英潍捷基技术有限责任公司合成。

PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；以94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸2min，扩增30个循环；再以72℃延伸10min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，如图4所示，得到大约1100bp的条带，命名为ONC-TL。然后将目的条带切下，用DNA试剂盒(北京天根生化科技有限公司产品)回收扩增产物，获得T1h-ONC轻链的融合基因，如SEQ ID NO：5所示。

CAGGACTGGCTGACCTTTCAGAAGAAGCACATCACCAACACCCGCGACGT

GGACTGCGACAACATCATGTCCACCAACCTGTTCCACTGCAAGGACAAGA

ACACCTTCATCTACTCCCGGCCTGAGCCTGTGAAGGCTATCTGCAAGGGAA

TCATCGCCTCCAAGAACGTGCTGACCACCTCCGAGTTTTACCTGTCCGACT

GCAACGTGACCTCCCGGCCTTGCAAGTACAAGCTGAAGAAGTCCACCAAC

AAGTTCTGCGTGACCTGCGAGAACCAGGCTCCTGTGCACTTCGTGGGAGT

GGGATCCTGCGGCTCCGGAGGCGGATCCGGCGGAGGAGGCTCTGGAGGC

GGCGGATCCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCG

GTGGGAGACAGAGTCACTATCACTTGCAAGGCGAGTCGGGACATTAGAAG

CTATTTAACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGACCCTGAT

CTATTATGCAACAAGCTTGGCAGATGGGGTCCCGTCGAGATTCAGTGGCAG

TGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGTCTGACGA

TACAGCAACTTACTACTGTCTACAACATGGTGAGAGTCCATTCACGCTCGG

CTCGGGGACCAAGCTGGAAATCAAACGTACGGTCGCCGCTCCCAGCGTGT

TCATCTTCCCTCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACCGCCAGCGTG

GTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAA

GGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAG

CAGGACTCCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGA

GCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCA

CCAGGGACTGTCTAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCT

AA[SEQ ID NO：5]

T1h-ONC轻链的融合基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO：6所示：

QDWLTFQKKHITNTRDVDCDNIMSTNLFHCKDKNTFIYSRPEPVKAICKGIIA

SKNVLTTSEFYLSDCNVTSRPCKYKLKKSTNKFCVTCENQAPVHFVGVGSCG

SGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDIRSYLTWYQ

QKPGKAPKTLIYYATSLADGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLESDDTATYYCLQH

GESPFTLGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK

VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV

THQGLSSPVTKSFNRGECZ[SEQ ID NO：6]

2、免疫融合蛋白T1h-ONC重链基因的合成及扩增

委托上海捷瑞生物工程有限公司合成T1h重链DNA序列，如SEQ ID NO：7所示：

GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAG

GGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAAGTTTAGTAGATATG

CCATGTCTTGGGTTCGCCAGGCTCCGGGGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCA

ACCATTAGTAGTGGTGGTAGTTACATCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGT

CGATTCACCATCTCCAGAGACAATGTCAAGAACACCCTGTATCTGCAAATG

AGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGACGAGA

TTACGACCTGGACTACTTTGACTCCTGGGGCCAAGGCACCCTTGTCACCGT

CTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTC

CCGCTCCACCTCCGAGTCCACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACT

ACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCCGGCGCCCTGACCTCC

GGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTG

TCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCTCCCTGGGCACCAAGACCTACACC

TGCAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGCGTGG

AGTCCAAGTACGGCCCTCCTTGCCCTCCTTGCCCTGCCCCTGAGTTCGAGG

GCGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGA

TCTCCCGCACCCCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAG

GACCCTGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAA

CGCCAAGACCAAGCCTCGCGAGGAGCAGTTCAACTCCACCTACCGCGTGG

TGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTAC

AAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTTCCTCCATCGAGAAGACCAT

CTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTC

CTTCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTG

AAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCA

GCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCT

CCTTCTTCCTGTACTCCCGCCTGACCGTGGACAAGTCCCGCTGGCAGGAG

GGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTA

CACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCTGGGCAAGTAA

[SEQ ID NO：7]

以该DNA片段为模板，用如下的引物进行PCR扩增：

上游引物：5-TCCCCCGGGGCCACCATGGACTTTTCGCTC-3；

下游引物5-CCGGAATTCTTACTTGCCCAGGGACAG-3，

其中下划线部分分别为是SmaI和EcoRI的酶切位点，由北京英潍捷基技术有限责任公司合成。

PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；以94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸2min，扩增30个循环；再以72℃延伸10min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，如图5所示，得到大约1500bp的条带，命名为TH。然后将目的条带切下，用DNA试剂盒(北京天根生化科技有限公司产品)回收扩增产物。

T1h-ONC重链基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO：8所示：

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFKFSRYAMSWVRQAPGKRLEWVATIS

SGGSYIYYPDSVKGRFTISRDNVKNTLYLQMS SLRSEDTAMYYCARRDYDLD

YFDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVT

VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSN

TKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD

VSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLN

GKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCL

VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEG

NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKZ[SEQ ID NO：8]

3、重组载体的构建

纯化的PCR产物ONC-TL和表达载体PBH(购自军事医学科学院细胞库)，TH和表达载体PBL(购自军事医学科学院细胞库)分别用SmaI和EcoRI双酶切后，用DNA试剂盒回收纯化酶切产物，在T₄DNA连接酶作用下16℃连接过夜，将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细菌中，在LB(氨苄酶素抗性)培养基中筛选培养，挑取阳性克隆，培养后提取质粒，采用SmaI和EcoRI双酶切鉴定，结果见图6和7，切出预期大小的片段所示。鉴定正确后送北京英潍捷基技术有限责任公司测序，将测序结果正确的重组载体分别命名为PBH-ONC-TL和PBL-TH。

将测序正确的PBH-ONC-TL和PBL-TH用SalI和NotI双酶切后，分别用DNA试剂盒回收纯化酶切产物，在T₄DNA连接酶作用下16℃连接过夜，载体构建示意图见图8。

将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细菌中，在LB(氨苄酶素抗性)培养基中筛选培养，挑取阳性克隆，培养后提取质粒，分别采用SmaI和EcoRI，SalI和NotI双酶切鉴定，切出预期大小的片段，结果见图9。鉴定正确后送北京英潍捷基技术有限责任公司测序，将测序结果正确的重组载体命名为pT1h-ONC。

实施例2、免疫融合蛋自T1h-ONC的表达及纯化

293F细胞(购自Invitrogen公司，Cat No.11625-019)悬浮培养于无血清CD293培养液(购自Invitrogen公司，Cat No.11913-019)中，转染前离心更换新鲜培养基，细胞浓度调整为1×10⁶细胞/ml。以100ml细胞为例，分别将DNA(pT1h-ONC)250ug和PEI(聚乙烯亚胺)500ug(购自Sigma公司，Cat.No：408727)加入1ml 293培养液中混匀，静置5min。室温放置8min。将PEI/DNA混悬液逐滴加入摇瓶中，轻轻混匀，置于5％CO₂、37℃摇床培养(115rpm)5天后收集培养上清。

转染细胞5天后，收集上清做纯化。用pH 7.4的PBS溶液平衡，通过亲和层析方法，采用HiTrap MabSelect SuRe 1ml柱(GE Healthcare Life Sciences产品，Cat.No：11-0034-93)10个床体积，流速为0.5ml/min；将经转染得到的60ml上清液用0.45μm滤膜过滤上样。流速为0.5ml/min；用pH 7.4的PBS溶液再洗5-10个床体积，流速为0.5ml/min；用100mM柠檬酸缓冲液(pH 4.0)洗脱，流速为0.5ml/min，收集洗脱峰。

结果见图10，T1h-ONC纯化蛋白的纯度达到95％以上，T1h-ONC的分子量大约170kDa较T1h的150kDa有一定程度增加，与理论预期一致。

实施例3、单克隆抗体T1h参与CD6分子内化的研究

Hum-zap为连接有saporin毒素的抗人IgG，能够与人源抗体分子IgG或Fab特异性结合。如果Hum-zap被具有内化特性的抗体分子通过内化机制带入细胞内，免疫复合物被胞内溶酶体水解，释放出saporin毒素，抑制核糖体的活性，从而抑制细胞蛋白质合成，最终导致细胞死亡。

本研究拟将不同浓度T1h加入含一定量的Hum-zap的HUT-78(CD6分子阳性，购自中国科学院细胞库)细胞培养基中，若CD6分子有内在化(Internalization)特性则会通过T1h将Hum-zap带入细胞导致细胞死亡，抑制细胞的生长。

试剂：

Hum-zap试剂盒：购自Advanced Targeting System(SanDiego，CA)，Cat：kit-22-25。

细胞增殖/细胞毒性检测试剂盒CCK-8：购自日本同仁化学研究所，Cat：CK04

T1h单抗：自产，批号为0220090705。

HUT-78：CD6阳性细胞，购自中国科学院细胞库，Cat：TCHu 27

方法：

(1)HUT-78悬浮培养于含10％胎牛血清PRMI 1640培养基中，37℃，5％CO₂。

(2)试验前用胎盼蓝检测细胞活力，活细胞比率数大于95％时进行下面的试验。

(3)计数细胞，96孔培养板中加入HUT-78细胞50μl，1×10⁵个/孔。

(4)96孔板每孔加入含100ng/mL Hum-zap和T1h单抗的培养基200μl：首先用10％胎牛血清PRMI 1640配制Hum-zap使其浓度为100ng/mL(5×10^-4μM)；再用含100ng/mL的Hum-zap培养基1∶10稀释配制T1h单抗，最终抗体浓度为0.8、8×10^-2、8×10^-3、8×10^-4、8×10^-5、8×10^-6、8×10^-7和8×10^-8μM。每一浓度设置3个复孔，同时设置对照孔C(HUT-78培养基含100ng/mL saporin标记的抗人IgG抗体)。

(5)37℃，5％CO₂孵箱中培养72h。

(6)结束前4h，加入20μL CCK-8。37℃5％CO₂孵育3h。用酶标仪在450nm处测定吸光度，630nm作为参考波长。

(7)计算：细胞生长抑制率＝(对照孔C_OD450-试验孔_OD450)/对照孔C_OD450×100％。

(8)统计学处理：方差分析，统计软件为SPSS16.0软件。

结果：在保持Hum-zap的浓度为100ng/mL(5×10^-4μM)的条件下，T1h单抗浓度在8×10^-2μM、8×10^-3μM和8×10^-4μM时，HUT-78的生长受到明显的抑制，细胞生长抑制率达到65％以上，与对照组相比较有显著的统计学差异(P＜0.001)。T1h单抗浓度在8×10^-5、8×10^-6、8×10^-7和8×10^-8μM时，细胞生长抑制率在10％以下与仅加入Hum-zap的对照组抑制率一致，表现为Hum-zap试剂所具有的背景毒性，且与对照组相比较无统计学差异(P＞0.05)。但T1h单抗浓度在高浓度(0.8μM)时的HUT-78生长抑制率仅为11.41％，分析其原因是在此抗体浓度下，培养体系内存在大量的游离T1h单抗，阻碍了与Hum-ZAP结合的T1h单抗进入细胞，结果在此浓度下HUT-78的生长未受到明显抑制，且与对照组相比较无统计学差异(P＝0.4232＞0.05)，结果如图11所示。

该研究证实，CD6、Hum-zap和T1h能以免疫复合物的形式进入细胞内，所形成的免疫复合物在胞内被溶酶体系统降解，zap毒素释放至细胞质内，从而对细胞产生毒性作用。T1h单抗参与淋巴细胞表面CD6分子的内在化过程，干扰CD6分子在细胞膜和质膜间的正常循环，有可能促进细胞表面的CD6表达下降。

实施例4、免疫融合蛋白T1h-ONC的功能分析

1、T1h-ONC单抗与CD6分子的生物学结合活性

使用流式细胞术技术在过度表达CD6分子的HEK293/CD6⁺(购自Invitrogen公司)细胞检测T1h-ONC与CD6分子的生物学结合活性。该方法是一个间接免疫荧光法，HEK293/CD6⁺细胞上的CD6分子和T1h-ONC结合，再使用一个偶联了荧光素标记的异硫氰酸的抗人F(ab′)₂片段的鼠源二抗(抗人FITC，DAKOF0056)。荧光强度的高低反应了T1h-ONC与CD6分子的结合的量。

试剂：

细胞：HEK 293/CD6⁺细胞，来自古巴分子免疫学中心

检测抗体：FITC-抗人F(ab′)₂(DAKO公司，货号F0056)

流式细胞仪：Guava Easycyte Mini Flow Cytometer流式细胞仪；CytoSoft 4.1软件中的Guava ExpressPlus程序。

试验步骤：

1)取10×10⁶HEK 293-CD6细胞，4℃、1100rpm下离心5min。倒掉上清液，加入10mL PBS重悬细胞。重复操作两次。HEK 293/CD6+的细胞悬液浓度为1.5×10⁷个/mL，使最终体积约为750μL。

2)向离心管中加入20μL T1h-ONC，使终浓度为1、2、4、8、16μg/mL，然后加入25μL之前先混匀的细胞悬液，混匀。4℃下孵育30min。

3)每个离心管中加入700μL PBS，混匀。4℃、1100rpm下离心5min。

4)小心去除上清液，将细胞轻轻弹起，每个浓度管中分别加入饱和浓度20μL抗人F(ab′)2-FITC(DAKO F0056)，4℃下避光孵育30min。

5)每个离心管中加入700μL PBS，混匀。4℃、1100rpm下离心5min。

6)小心去除上清液，将细胞轻轻弹起，向每个离心管中加入500μL 1％多聚甲醛PBS。上机检测荧光强度。

结果见图12，免疫融合蛋白T1h-ONC仍保留了与CD6结合的特性，融合蛋白与抗原CD6结合量随T1h-ONC加入量的增加而显著提高。

2、细胞毒性试验

WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。该方法的产物是可溶性的，与普通的MTT法相比较影响因数较少。本研究采用该方法考察T1h单抗加入淋巴细胞后，对淋巴细胞增殖的影响。

将培养到对数生长期的HUT-78细胞1100rpm离心5min，计数并检测细胞活性(细胞活率95％以上进行下面的实验)。加入适当体积的HUT-78细胞使细胞数为1×10⁴个/孔，T1h-ONC实验组加入T1h-ONC使其终浓度分别为20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL，对照孔加入等浓度T1h，最终体积为200μl，设5个复孔。于37℃，5％CO₂孵箱中培养。3天后加入20μl/孔CCK8(购自日本同仁化学研究所，Cat：CK04)，37℃5％CO₂孵箱中，孵育4h。用酶标仪在450nm处测定吸光度，630nm作为参考波长。

结果如图13，在加入T1h-ONC融合蛋白后，T1h-ONC通过细胞表面CD6内化作用将核糖核酸酶A带入细胞内，发挥ONC核糖核酸酶活性，抑制细胞蛋白的合成，从而抑制肿瘤细胞的生长，其抑制效应与加入T1h-ONC的量呈正相关，对肿瘤细胞的生长抑制作用远远高于其亲本抗体T1h。说明该融合蛋白具有用于CD6表达阳性的白血病和自身免疫性疾病治疗的潜在价值。

Claims (14)

1.一种抗体融合蛋白，其特征在于，所述的抗体融合蛋白是由抗CD6单克隆抗体通过Linker与豹蛙酶Onconase连接而成。

2.根据权利要求1所述的抗体融合蛋白，其特征在于，所述的抗体融合蛋白中豹蛙酶Onconase通过Linker连接在抗CD6单克隆抗体轻链的N末端；

所述的豹蛙酶Onconase的序列如SEQ ID NO：1所示；

所述的Linker序列为GSGGGSGGGGSGGGGS。

3.根据权利要求2所述的抗体融合蛋白，其特征在于，所述的抗CD6单克隆抗体是人源化的；

所述抗CD6单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。

所述抗CD6单克隆抗体的重链恒定区优选为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4及其突变体中的任意一种；更优选为人IgG1及其突变体的任意一种；

所述的抗CD6单克隆抗体命名为T1h，所述T1h的轻链序列如SEQ ID NO：4所示；所述T1h的重链链序列如SEQ ID NO：8所示。

4.根据权利要求1所述的抗体融合蛋白，其特征在于，所述抗体融合蛋白的轻链序列如SEQ ID NO：6所示；所述抗体融合蛋白的重链序列如SEQ ID NO：8所示。

5.多核苷酸序列，其编码权利要求1-4中任一项所述的抗体融合蛋白。

6.一种载体，其包含权利要求5所述的多核苷酸序列。

7.根据权利要求6所述的载体，其特征在于，所述载体为真核表达载体；所述的载体为pT1h-ONC。

8.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞经权利要求6所述的载体转染。

9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为293F细胞。

10.根据权利要求1所述的抗体融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以可检测量表达融合蛋白的条件下，转录和翻译权利要求5的多核苷酸，培养权利要求8所述的宿主细胞，经亲和层析法纯化的步骤。

11.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有权利要求1-4中任一项所述的抗体融合蛋白及药学上可接受的赋形剂。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物通过局部给药、气雾剂、注射剂的方式施用；所述的注射剂通过腹膜内注射、皮下注射和静脉注射的方式施用。 

13.根据权利要求1-4，11中任一项所述的一种抗体融合蛋白在制备治疗抗CD6阳性的白血病的药物中的应用。

14.根据权利要求1-4，11中任一项所述的一种抗体融合蛋白在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。 

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