CN113292650B - 新型冠状病毒的人源单克隆抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新型冠状病毒的人源单克隆抗体及其应用。该抗体能够特异性结合2019‑nCoV RBD，阻断2019‑nCoV RBD与ACE2结合，抑制2019‑nCoV感染。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种高中和活性的新型冠状病毒 (2019-nCoV)人源单克隆抗体及其应用。
背景技术
新型冠状病毒2019-nCoV作为新发的突发传染病病原，目前还没有针对该病毒的特效药物获批上市。
治疗性抗体药物不但在肿瘤和自身免疫疾病方面占有重要地位，在传染性疾病的治疗中也同样有效。目前已经上市的治疗和预防病毒感染的药物有预防小儿呼吸道合胞病毒(RSV)感染的帕利珠单抗(Synagis)，治疗 HIV感染的艾巴利珠单抗(Trogarzo)，以及用于狂犬病毒暴露后预防的 Rabishield。同时还有针对众多病毒的单克隆抗体处于临床研究的不同阶段 (https：//clinicaltrials.gov/)。
2019-nCoV属于冠状病毒。同属冠状病毒的重症急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)以及中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)也曾在分别在2002-2003年和2012年引发疫情。据世界卫生组织(WHO)统计 SARS-CoV共引发8000人感染，794人死亡(https：//www.who.int/)。自 2012年至今，MERS-CoV感染病毒病例在持续增加，截至2019年底，全球确诊2499例感染病例，861例死亡病例。2020年1月12日，世界卫生组织正式命名了“2019新型冠状病毒(2019-nCoV)”，其后在2020年2 月11-12日国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)宣布，新型冠状病毒(2019-nCoV)的正式分类名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratorysyndrome coronavirus 2， SARS-CoV-2)，世界卫生组织(WHO)同日在日内瓦举办全球研究和创新论坛上宣布，由这一病毒导致的疾病的正式名称为“COVID-19”。
病毒要感染细胞，首先需要通过囊膜蛋白结合宿主的受体。抗体，尤其是中和活性抗体，通过结合到囊膜蛋白上，阻断病毒与细胞受体的结合，从而阻断病毒感染。同时，抗体结合到囊膜蛋白上，从而对游离的病毒或是被感染的细胞进行标记，通过抗体的Fc区募集巨噬细胞或是补体等免疫细胞和免疫分子，从而清除游离的病毒以及被感染的细胞。因此，靶向受体结合区(RBD)的抗体，不但具有中和病毒感染的活性，还可以通过 Fc区发挥作用，促进病毒以及被感染细胞的清除。
基于对其它冠状病毒，尤其是SARS-CoV和MERS-CoV的研究，与受体结合的重要囊膜蛋白是刺突蛋白(S)。S可进一步分为S1和S2两部分。S2的作用是介导膜融合。S1的N端(NTD)和C端(CTD)都可能是RBD。通过对2019-nCoV的研究，团队发现CTD是此冠状病毒的RBD，结合受体ACE2。因此靶向RBD的抗体，并且是阻断S与ACE2结合的抗体，可能成为抑制病毒感染的中和抗体。本发明的目的是针对2019-nCoV，鉴定特异的具有保护效果的人源中和抗体。
发明内容
为了获得具有保护效果的人源中和抗体，本发明首先以昆虫细胞表达的2019-nCoV RBD作为抗原，通过流式分选，从2019-nCoV RBD感染后痊愈出院人员的PBMCs中筛选到可以特异结合2019-nCoV RBD蛋白的记忆B细胞，然后对筛选的单一B细胞进行RT-PCR，获得抗体的可变区序列与片段，并进一步与恒定区连接至表达载体中。经哺乳动物细胞表达、纯化后，进行一系列的功能检测，包括与2019-nCoV RBD蛋白的结合能力，阻断2019-nCoVRBD与ACE2结合的阻断效果，抑制2019-nCoV感染的中和效果等，获得了中和2019-nCoV感染的人源单克隆抗体，命名为 CA1。
具体地，本发明通过以下方面实现。
在一个方面，本发明提供人源化单克隆抗体或其抗原结合片段，其特异性结合2019-nCoV RBD，
其VH链的互补决定区的CDR具有选自下组的氨基酸序列：
如SEQ ID NO：1所示的CDR1，
如SEQ ID NO：2所示的CDR2，和
如SEQ ID NO：3所示的CDR3；
其VL链的互补决定区的CDR具有选自下组的氨基酸序列：
如SEQ ID NO：4所示的CDR1，
如SEQ ID NO：5所示的CDR2，和
如SEQ ID NO：6所示的CDR3。
在一个实施方案中，所述人源单克隆抗体或其抗原结合片段含有：
如SEQ ID NO：7所示的重链可变区，和
如SEQ ID NO：8所示的轻链可变区。
在一个实施方案中，人源单克隆抗体或其抗原结合片段含有：
如SEQ ID NO：22所示的重链，和
如SEQ ID NO：23所示的轻链。
在一个实施方案中，其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab′、Fab′-SH、Fv、scFv、F(ab′)2、双抗体。
在另一个方面，本发明提供一种多肽，其含有选自SEQ ID NO：7、8、 22或23所示的序列。
在另一个方面，本发明提供一种多核苷酸，其编码前述任一项人源单克隆抗体或其抗原结合片段或多肽。
在另一个方面，本发明提供一种表达载体，其包含上述多核苷酸。
在另一个方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含上述表达载体。
在另一个方面，本发明提供一种药物组合物，其含有前述任一项人源单克隆抗体或其抗原结合片段和药用载体。
在另一个方面，本发明提供上述任一项人源单克隆抗体或其抗原结合片段在制备治疗2019-nCoV感染的药物中的用途。
本说明书中提及的所有文献均通过引用以其整体并入本文。
定义
“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体的抗原结合区或可变区，例如一个或多个CDR。抗体的片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。抗原结合片段包括选自Fab、 Fab′、Fab′-SH、Fv、scFv、F(ab′)2、双抗体、包含CDR的肽等。
“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。
“Fc”区含有包含抗体的CH1和CH2结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。
“Fab′片段”含有一条轻链和包含VH结构域和CH1结构域或CH1 和CH2结构域之间区域的一条重链的部分，两个Fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab′)2分子。
“F(ab′)2片段”含有两条轻链和两条包含CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab′)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。
“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。
“单链Fv抗体(scFv抗体)”是指包含抗体的VH和VL结构域的抗原结合片段，这些结构域包含于单个多肽链中。一般而言，scFv多肽在VH 和VL结构域之间包含多肽接头，该接头使得scFv能形成用于抗原结合的所需结构。
“双抗体”为具有两个抗原结合位点的小抗原结合片段。所述片段包含在相同的多肽链中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域 (VH)(VH-VL或VL-VH)。通过使用短至不能在同一链的两个结构域之间配对的接头，使得所述结构域和另一条链的互补结构域配对并形成两个抗原结合位点。
当提及配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时，“特异性”结合是指在蛋白和/或其它生物试剂的异质群体中确定是否存在所述蛋白例如本发明的单克隆抗体与2019-nCoVRBD蛋白的结合反应。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著量与样品中存在的其它蛋白结合。
本发明还提供含有本发明特异性结合2019-nCoV RBD的人源高中和活性的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物。为了制备药物组合物，可以通过使抗体或其抗原结合片段与药用载体或赋形剂混合，制备成各种所需的剂型。作为本发明的医药组合物的剂型的种类，例如可以列举作为口服剂的片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片、膏剂等，作为非口服剂，可以列举注射剂、栓剂、经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂等，本领域的技术人员能够根据给药途径和给药对象等选择适当的剂型。
本发明的药物组合物的有效成分的给药量，根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法等不同而存在差异，可以考虑剂型的种类、给药方法、患者的年龄和体重、患者的症状等，根据医生的判断来确定。
本发明的有益效果：
本发明获得了人源高中和活性的抗体：CA1。该抗体是目前已知的首例具有中和2019-nCoV感染的人源抗体。CA1抗体与2019-nCoV的结合常数分别为2.92E-09M。人源高中和活性的抗体CA1均能有效阻断 2019-nCoV RBD与hACE2结合，抑制2019-nCoV假病毒感染的中和活性好。本发明的CA1有着临床治疗和预防2019-nCoV感染的应用价值。
附图说明
图1：2019-nCoV RBD分子筛层析和SDS-PAGE鉴定；
图2：CA1抗体的分子筛层析和SDS-PAGE鉴定；
图3：CA1抗体结合2019-nCoV RBD的动力学曲线；
图4：CA1抗体阻断2019-nCoV RBD与HEK293T-hACE2结合；
图5：CA1抗体中和VSV-2019-nCoV感染的效果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：2019-nCoV RBD的表达与纯化
在2019-nCoV RBD蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示)编码区的3’端连上6个组氨酸标签(hexa-His-tag)的编码序列及翻译终止密码子，通过连接EcoRI和XhoI构建入pFastBac1载体(购自Invitrogen)中。再将连接产物转化到DH10Bac感受态细胞(购自Tiangen)中，进行杆状病毒重组。提取重组的杆状病毒，转染至sf9细胞(购自Invitrogen)中进行杆状病毒的包装，再经过病毒的扩增，加入到Hi5细胞(购自Invitrogen)中，进行2019-nCoV RBD蛋白的表达。
含有目的蛋白的细胞培养液经镍离子亲和层析(HisTrap TMHP(GE)) 和凝胶过滤层析(SuperoseTM 6 Increase 10/300GL(GE))纯化后，可以获得较纯的目的蛋白。SDS-PAGE鉴定大小为30KD，结果如图1。
实施例2：2019-nCoV RBD蛋白特异性记忆B细胞的分离
在2019-nCoV RBD感染后痊愈出院人员的知情同意下，采集15mL的血液，分离PBMCs。将分离的PBMCs以107/mL的密度与终浓度是400nM 的2019-nCoV RBD蛋白冰上孵育结合半小时，然后用PBS洗2次，再与下列抗体(均购自BD)孵育：anti-human CD3/PE-Cy5，anti-human CD16/PE-Cy5，anti-human CD235a/PE-Cy5，anti-human CD19/APC-Cy7，anti-human CD27/Pacific Blue，anti-human CD38/APC，anti-human IgG/FITC，以及anti-His/PE。抗体冰上孵育半小时后，用PBS洗PBMCs2次。
PBS洗后的PBMCs经FACSAria III分选，收集PE-Cy5-APC- APC-Cy7+Pacific Blue+FITC+PE+的细胞(即B细胞)，直接将其收集到 96孔板内，1细胞/孔。
实施例3：单一B细胞PCR、序列分析及人源抗体设计
按照Qihui Wang等人于2016年12月在Science Translational Medicine，第8卷，第369期发表的Molecular determinants of human neutralizing antibodies isolatedfrom a patient infected with Zika virus中描述的方法，将实施例2获得的B细胞通过Superscript III reverse transcriptase(Invitrogen) 逆转录，逆转录引物如表1，55℃反应60min。
表1.逆转录反应引物
将此逆转录产物作为模板，用HotStar Tap Plus酶(QIAgen)进行PCR，扩增抗体可变区序列(PCRa)。设计相应的引物，反应条件如下：95℃， 5min；95℃30s，55℃(重链/κ链)30s，72℃90s，35个循环；72℃， 7min。将此产物作为模板再进行1轮PCR(PCRb)，条件如下：95℃，5min； 95℃30s，58℃(重链)/60℃(κ链)30s，72℃90s，35个循环；72℃， 7min，得到PCR产物。
用1.2％的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物。条带大小在400-500bp的切胶回收后送测序公司测序。测序结果用IMGT在线软件进行分析。
将分析得到的正确的可变区序列与相应的重链/κ链的恒定区通过搭桥PCR连接，克隆至表达载体pCAGGS(购自Addgene)中。其中重链以 EcoRI和XhoI连接，κ链以SacI与XhoI连接。B细胞测序及表达质粒构建如下：
人源抗体设计策略如下：
重链：CMV promoter-EcoR I-Leader sequences-重链可变区-CH-Xho I；
轻链(κ)：CMV promoter-Sac I-Leader sequences-轻链可变区-CL(κ)-Xho I；
其中，Leader sequence的氨基酸序列如SED ID NO：18所示，CH的氨基酸序列如SED ID NO：19所示，CL的氨基酸序列如SED ID NO：20 所示，通过序列测定，获得三株抗体的序列，这三株抗体分别命名为CA1、 CB6以及GH4。
其中CA1的重链可变区序列如SEQ ID NO：7所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO：8所示，重链序列如SEQ ID NO：22所示，轻链序列如SEQ ID NO：23所示。
其中CA1抗体与胚系基因的序列一致性比较如下：
表2.CA1抗体重链与胚系基因比较
实施例4：CA1抗体的表达
以含10％FBS的DMEM培养293T细胞。用含有实施例3得到的特定抗体轻、重链编码基因的质粒共转染293T。转染4-6小时后将细胞培养液更换成无血清的DMEM，并且继续培养3天，收集上清后，再补加DMEM，继续培养4天，收集上清。
收集的上清经过5000rpm离心30min后，与含有20mM磷酸钠(pH 8.0) 的缓冲液等体积混合，经过0.22μm滤膜过滤后，与protein A预装柱结合 (5mL，GE Healthcare)。以10mM甘氨酸(pH 3.0)洗脱结合的蛋白。收集此蛋白浓缩后进行分子筛层析。目的峰通过SDS-PAGE(还原性和非还原性)确定，结果如图2。得到纯化的CA1抗体。
实施例5：表面等离子共振技术检测抗体与2019-nCoV RBD的结合能力
表面等离子共振分析利用Biacore 8K(Biacore Inc.)进行。具体步骤如下：
选用protein A芯片(购自GE Healthcare)，通过protein A与抗体Fc 的亲和力将实施例4得到的纯化的抗体固定在芯片上，抗体固定量约为 5000RU，用10mM HEPES，150mMNaCl，pH 7.4溶液倍比稀释2019-nCoV RBD蛋白，从低浓度到高浓度逐一上样。抗体结合2019-nCoV RBD的动力学曲线如图3所示。抗体结合2019-nCoV RBD的动力学常数如表4所示。结合动力学常数的计算是利用BIAevaluation software 8K(Biacore，Inc.) 软件进行。可见CA1抗体能够和2019-nCoV RBD以较高的亲和力结合。
表4抗体与2019-nCoV RBD蛋白结合的动力学常数
实施例6：CA1阻断2019-nCoV RBD与ACE2结合的检测
将hACE2(氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示)的编码基因通过XhoI 和BamHI构建入pEGFP-N1载体(购自Addgene)中，并且与GFP融合表达，形成pEGFP-hACE2质粒。将质粒pEGFP-hACE2转染HEK293T细胞，24h 可在荧光显微镜下观察到GFP表达。收集HEK293T-hACE2细胞，2x105为一个反应，与2019-nCoV RBD(200ng/mL)在室温条件下孵育30min。500xg离心5min后，去掉上清，加入PBS洗2次。与anti-His/APC在室温下孵育30min，再经过PBS洗2次后，用BD FACSCanto检测细胞表面的荧光情况。
为了检测CA1的阻断效果，将实施例4得到的纯化的CA1抗体与 200ng/mL的2019-nCoV RBD按摩尔比10∶1的条件下在室温下孵育1h，再与HEK293T-hACE2细胞孵育。其余步骤与上面相同，用anti-His/APC 检测蛋白与细胞的结合情况。CA1抗体阻断2019-nCoV RBD与HEK293T-hACE2细胞的结合情况如图4所示。可见，CA1抗体均能阻断 2019-nCoV RBD与HEK293T-hACE2细胞的结合。
实施例7：CA1中和2019-nCoV假病毒感染的检测
将实施例4得到的纯化的CA1抗体从50μg/mL开始3倍倍比稀释至第10个梯度(2.5ng/mL)与1.6x104 TCID50 VSV-2019-nCoV假病毒混合在37℃混合孵育1h，然后加入到预先接种Huh7细胞(购自协和医科大学基础医学细胞中心)的96孔板中。孵育4小时后，弃掉培养液与病毒液，加入含有10％FBS的DMEM培养液中，继续培养48小时。弃掉培养液，PBS洗一次后，加入1x裂解液(Promega，Luciferase Assay System) 裂解细胞后，取10μL裂解液加入50μL反应底物，通过 PromegaLuminometers检测。根据不同浓度下荧光素酶的活性，计算抗体对VSV-2019-nCoV假病毒的中和能力，结果如图5所示，结果统计如表5。
表5 CA1抗体对不同来源病毒中和效果
a半抑制浓度
可见CA1抗体能以高中和活性中和2019-nCoV假病毒。
综上，CA1抗体能够作为高中和活性的新型冠状病毒(2019-nCoV) 人源单克隆抗体。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.人源单克隆抗体或其抗原结合片段，其特异性结合2019-nCoV RBD，
其VH链具有：
如SEQ ID NO:1所示的CDR1，
如SEQ ID NO:2所示的CDR2，和
如SEQ ID NO:3所示的CDR3；并且
其VL链具有：
如SEQ ID NO:4所示的CDR1，
如SEQ ID NO:5所示的CDR2，和
如SEQ ID NO:6所示的CDR3。
2.权利要求1所示的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，其含有：
如SEQ ID NO:7所示的重链可变区，和
如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区。
3.如权利要求1或2所示的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，和其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。
4.权利要求1-2中任一项所示的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、Fab'-SH、Fv、scFv、F(ab')2、双抗体。
5.多肽，其含有如SEQ ID NO:7和8所示的序列，或者含有如SEQ ID NO:22和23所示的序列。
6.多核苷酸，其编码权利要求1-4中任一项所述的人源单克隆抗体或其抗原结合片段或权利要求5所述的多肽。
7.表达载体，其包含权利要求6所述的多核苷酸。
8.宿主细胞，其包含权利要求7所述的表达载体。
9.药物组合物，其含有权利要求1-4中任一项所述的人源单克隆抗体或其抗原结合片段和药用载体。
10.权利要求1-4中任一项所述的人源单克隆抗体或其抗原结合片段在制备治疗2019-nCoV感染的药物中的用途。
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