CN115850461A - 沙贝病毒广谱中和抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及沙贝病毒(sarbecovirus)广谱中和抗体及其应用。本发明的沙贝病毒广谱中和抗体能够广谱结合沙贝病毒S蛋白，包括但不限于SARS‑CoV‑2及其变异毒株、SARS‑CoV、WIV1、GD/1/2019、GX/P2V/2017、RaTG13等，且中和SARS‑CoV‑2及其变异毒株、SARS‑CoV、WIV1、GD/1/2019、GX/P2V/2017、RaTG13等沙贝病毒感染，可用于预防和治疗包括但不限于SARS‑CoV‑2及其变异毒株、SARS‑CoV、WIV1、GD/1/2019、GX/P2V/2017、RaTG13等沙贝病毒感染。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及沙贝病毒(sarbecovirus)广谱中和抗体及其应用。
背景技术
2019年底，由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的新冠肺炎疫情暴发，至今仍在持续传播，对人类健康、经济发展和社会稳定等方面均造成重大影响。因此，亟需开发有效的预防和治疗手段。
抗体因其疗效强、特异性高、副作用低等特点成为传染病防治的有力武器，例如针对埃博拉病毒的三抗鸡尾酒药物Inmazeb于2020年被FDA批准上市，在遏制埃博拉死亡率、提高生存率方面实现了突破。针对新冠肺炎，虽然目前已有多款抗体药物和疫苗被批准紧急使用，但是随着病毒变异株的不断出现，现有抗体疗效下降甚至完全丧失，疫苗突破感染病例不断上升。此外，多个物种中检测到与SARS-CoV-2、SARS-CoV具有相似基因组序列的病毒，即沙贝病毒(sarbecovirus)，如GD/1/2019、GX/P2V/2017、RaTG13等，具有引发疫情甚至是大流行的风险。因此，亟需进一步筛选和设计广谱中和抗体，开发更加高效、广谱的抗体药物，为抗击新冠疫情提供候选广谱抗体，也为其他沙贝病毒可能引发的潜在疫情提供药物储备。
冠状病毒表面S蛋白在介导病毒入侵细胞过程中发挥重要作用，因而成为中和抗体开发和疫苗设计的重要靶点。S蛋白分为S1和S2两个亚基，其中S1负责识别受体，S2介导膜融合。S1又分为N端结构域(NTD)和C端结构域(CTD)，CTD又称RBD，识别受体ACE2，进而促进病毒感染。目前，已报道的新冠病毒中和抗体大多靶向RBD，通过阻断与受体的结合进而抑制病毒感染。但是，随着新冠病毒变异株的不断出现，在RBD区出现系列突变，使得已有抗体的疗效下降。因此，亟需开发靶向S蛋白保守区的抗体，包括RBD、NTD和S2。
本发明的目的是针对SARS-CoV-2及其变异毒株等沙贝病毒筛选和设计具有广谱中和活性的抗体。
发明内容
为了获得具有中和活性的人源单克隆抗体，本发明首先以哺乳动物细胞表达的SARS-CoV-2 RBD作为抗原，通过流式分选，从SARS-CoV-2感染后康复患者的PBMCs中筛选到可以特异结合SARS-CoV-2 RBD蛋白的记忆B细胞，然后对分选的单个B细胞进行反转录PCR和巢式PCR，用特异性引物扩增出抗体的可变区序列，并进一步与抗体恒定区连接至表达载体中。经哺乳动物细胞表达、纯化抗体，进行一系列的功能检测，包括结合SARS-CoV-2等沙贝病毒RBD蛋白的能力，中和SARS-CoV-2等沙贝病毒感染的效果等，获得了广谱中和SARS-CoV-2及其变异毒株、GD/1/2019、RaTG13、SARS-CoV、WIV1等沙贝病毒感染的人源单克隆抗体74。
为了获得具有更高中和活性的广谱抗体，本发明以74抗体为骨架，将本发明人团队前期鉴定的三株纳米抗体R14（专利号：202210759496.5）、R211（专利号：202211433688.3）、S102（专利号：202211433689.8）嵌入74抗体重链，构建形成10种嵌合重链，分别为74-R14、74-R211、74-S102、R14-74、R211-74、S102-74、74-R14-S102、74-S102-R14、74-R211-S102和74-S102-R211，分别与74抗体轻链组合后形成6株双特异抗体和4株三特异抗体。
具体地，本发明通过以下方面实现。
在一个方面，本发明提供沙贝病毒广谱人源中和抗体74或其抗原结合片段，
其重链可变区的三个互补决定区CDR具有选自下组的氨基酸序列：
如SEQ ID NO:1所示的CDR1，
如SEQ ID NO:2所示的CDR2，和
如SEQ ID NO:3所示的CDR3；
其轻链可变区的三个互补决定区CDR具有选自下组的氨基酸序列：
如SEQ ID NO:4所示的CDR1，
如SEQ ID NO:5所示的CDR2，和
如SEQ ID NO:6所示的CDR3。
在一个实施方案中，所述中和74抗体或其抗原结合片段含有：
如SEQ ID NO:7所示的重链可变区，和
如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区。
在一个实施方案中，中和74抗体或其抗原结合片段含有：
如SEQ ID NO: 9所示的重链，和
如SEQ ID NO: 10所示的轻链。
在另一方面，本发明提供6株沙贝病毒广谱双特异中和抗体，其是将纳米抗体R14、R211、S102嵌入如权利要求1至3任一项所述沙贝病毒广谱中和抗体74或其抗原结合片段的重链而得到，具体的，其是74-R14、74-R211、74-S102、R14-74、R211-74和S102-74，以及4株沙贝病毒广谱三特异中和抗体74-R14-S102、74-S102-R14、74-R211-S102和74-S102-R114，所述抗体或其抗原结合片段含有如SEQ ID NO: 11，12, 13，14，15，16，17，18，19或20所示的重链。
在一个实施方案中，其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、Fab'-SH、Fv、scFv、F(ab')2、双抗体。
在另一个方面，本发明提供一种多肽，其是将纳米抗体R14、R211、S102嵌入所述沙贝病毒广谱中和抗体74或其抗原结合片段的重链而得到，更优选地其含有选自SEQ ID NO:7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20所示的序列。
在另一个方面，本发明提供一种多核苷酸，其编码前述任一项中和抗体或其抗原结合片段或多肽。
在另一个方面，本发明提供一种表达载体，其包含上述多核苷酸。
在另一个方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含上述表达载体。
在另一个方面，本发明提供一种药物组合物，其含有前述任一项中和抗体或其抗原结合片段和药用载体。
在另一个方面，本发明提供上述任一项中和抗体或其抗原结合片段在制备治疗和预防包括但不限于SARS-CoV-2及其变异毒株、SARS-CoV、WIV1、GD/1/2019、GX/P2V/2017、RaTG13等沙贝病毒感染的药物中的用途。
定义
“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体的抗原结合区或可变区，例如一个或多个CDR。抗体的片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。抗原结合片段包括选自Fab、Fab′、Fab′-SH、Fv、scFv、F(ab′)2、双抗体、包含CDR的多肽等。
“Fab”由一条轻链和一条重链的可变区及CH1组成。
“Fab′片段”含有一条轻链和包含可变区及CH1或CH1和CH2结构域之间区域的一条重链的部分，两个Fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab′)2分子。
“F(ab′)2片段”含有两条轻链和两条包含CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab′)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。
“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。
“单链Fv抗体(scFv抗体)”是指包含抗体可变区的抗原结合片段，这些结构域包含于单个多肽链中。一般而言，scFv在重链可变区和轻链可变区之间包含多肽接头，该接头使得scFv能形成用于抗原结合的所需结构。
“双抗体”为具有两个抗原结合位点的小抗原结合片段。所述片段包含在相同的多肽链中与VL连接的VH(VH-VL或VL-VH)。通过使用短至不能在同一链的两个结构域之间配对的接头，使得所述结构域和另一条链的互补结构域配对并形成两个抗原结合位点。
本发明还提供含有本发明广谱中和沙贝病毒的中和抗体或其抗原结合片段的药物组合物。为了制备药物组合物，可以通过使抗体或其抗原结合片段与药用载体或赋形剂混合，制备成各种所需的剂型。作为本发明的医药组合物的剂型的种类，例如可以列举作为口服剂的片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片、膏剂等，作为非口服剂，可以列举注射剂、栓剂、经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂等，本领域的技术人员能够根据给药途径和给药对象等选择适当的剂型。
本发明的药物组合物的有效成分的给药量，根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法等不同而存在差异，可以考虑剂型的种类、给药方法、患者的年龄和体重、患者的症状等，根据医生的判断来确定。
本发明的有益效果：
本发明筛选获得了广谱沙贝病毒的人源中和抗体74，设计获得了6株沙贝病毒广谱双特异中和抗体74-R14、74-R211、74-S102、R14-74、R211-74和S102-74，以及4株沙贝病毒广谱三特异中和抗体74-R14-S102、74-S102-R14、74-R211-S102和74-S102-R114。这些中和抗体能够广谱结合沙贝病毒S蛋白，包括但不限于SARS-CoV-2及其变异毒株、SARS-CoV、GD/1/2019、GX/P2V/2017、RaTG13等，且抑制SARS-CoV-2及其变异毒株、SARS-CoV、GD/1/2019、GX/P2V/2017、RaTG13等沙贝病毒感染，具有治疗和预防包括但不限于SARS-CoV-2及其变异毒株、SARS-CoV等沙贝病毒感染的潜能。
附图说明
图1：74及代表性双特异抗体（74-S102）和三特异抗体（74-S102-R14）的分子筛层析和 SDS-PAGE 鉴定；
图2A-图2C：74抗体广谱结合SARS-CoV-2及其变异毒株、SARS-CoV、GD/1/2019、GX/P2V/2017、RaTG13等沙贝病毒RBD的动力学曲线；其中，图2A显示74抗体与SARS-CoV-2的Prototype株（PT）、Alpha、Beta、Delta株，及OmicronBA.1、BA.1.1的结合动力学曲线；图2B显示74抗体与OmicronBA.2、BA.2.75、BA.4/5、GD/1/2019、GX/P2V/2017以及RaTG13的结合动力学曲线；图2C显示74抗体与SARS-CoV和WIV1的结合动力学曲线。
图3A至图3D显示74、74-R14、74-R211、74-S102、R14-74、R211-74、S102-74、74-R14-S102、74-S102-R14、74-R211-S102和74-S102-R114中和不同沙贝病毒假病毒感染的效果。其中图3A显示各抗体广谱中和原型株（PT）、Alpha、Beta、Delta株病毒感染的效果；图3B显示各抗体广谱中和OmicronBA.1、BA.1.1、BA.2病毒感染的效果；图3C显示各抗体广谱中和OmicronBA.2.75、BA.4/5、GD/1/2019、GX/P2V/2017病毒感染的效果；图3D显示各抗体广谱中和RaTG13、SARS-CoV和WIV1病毒感染的效果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：SARS-CoV-2 RBD蛋白特异性记忆B细胞的分离
在SARS-CoV-2感染后康复患者的知情同意下，采集15mL 的血液，采用淋巴细胞分离管（购自达科为）离心分离PBMCs。将分离的PBMCs与 SARS-CoV-2 RBD蛋白（终浓度400nM）冰上孵育30min，然后用PBS洗2次，再与下列抗体（购自BD或Miltenyi）孵育：anti-humanCD3/PE-Cy5，anti-human CD16/PE-Cy5，anti-human CD235a/PE-Cy5，anti-human CD19/APC-Cy7，anti-human CD27/Pacific Blue，anti-human IgG/FITC，以及anti-His/PE。与抗体冰上孵育30min后，用PBS洗2次，转移至流式管中。经FACSAria III分选，收集PE-Cy5- APC-Cy7+ Pacific Blue+ FITC+ PE+的细胞群，即抗原特异性结合的记忆B细胞，直接将其收集到96孔板内，每孔1个细胞。
实施例2：单个记忆B细胞BCR序列扩增及IgG全抗表达载体构建
将实施例2获得的记忆B细胞通过耐热M-MVL逆转录酶（购自北京佳兰）逆转录，同时通过TSO引物进行模板转换加接头，42℃，90 min；然后50℃，2 min，42℃，2 min，10个循环；70℃，15 min；获得cDNA。
将此逆转录产物cDNA作为模板，用HotStar Tap Plus酶（QIAgen）进行dsDNA扩增富集。反应条件如下：95℃，5min；95℃，30s，60℃， 30s，72℃，90s；30个循环；72℃，10min。
以上述PCR产物为模板，进行巢式PCR特异性扩增抗体可变区序列，第一轮PCR（PCRa）反应条件如下：95℃，5min；95℃，30s，55℃（H链/κ链）或50℃（λ链），30s，72℃，90s，35个循环；72℃，7min。将此产物作为模板再进行第二轮PCR（PCRb），反应条件如下：95℃，5min；95℃，30s，58℃（H链）或60℃（κ链）或64℃（λ链），30s，72℃，90s，35个循环；72℃，7min，得到PCR产物。
用1.2%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，条带大小在~400bp的切胶回收后送测序。用IgBlast或IMGT在线网站对测得的序列进行分析。
将分析得到的抗体可变区序列与相应的重链/轻链的恒定区通过同源重组连接，克隆至表达载体pCAGGS (实验室保存)中，获得IgG全抗轻、重链重组表达质粒，全抗设计策略如下：
重链：CMV promoter-EcoRI-信号肽-重链可变区(VH)-CH-Xho I；
轻链：CMV promoter-EcoRI-信号肽-轻链可变区(VL)-CL(λ)-Xho I。
其中，经测序，中和74抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示，和轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示。经分析，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，和轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。经鉴定，其重链可变区的三个互补决定区CDR具有选自下组的氨基酸序列：如SEQ ID NO:1所示的CDR1，如SEQ ID NO:2所示的CDR2，和如SEQ ID NO:3所示的CDR3；其轻链可变区的三个互补决定区CDR具有选自下组的氨基酸序列：如SEQ ID NO:4所示的CDR1，如SEQ ID NO:5所示的CDR2，和如SEQ ID NO:6所示的CDR3。
SEQ ID NO: 1: GYNFSRYW；SEQ ID NO: 2:IYPDDSDT；SEQ ID NO: 3：
ARFGAGMTGMPRYFDTTRWFDP。SEQ ID NO: 4：SSNIGAGYD；SEQ ID NO: 5：
GNS；SEQ ID NO: 6：QSYDNDLSQV。
SEQ ID NO: 7：QVQLVQSGAQLKKPGESLKISCKGSGYNFSRYWIAWVRHMPGKGLEVMGIIYPDDSDTRYSPSVRGQVTISADKSTSIVYLQWSSLKASDTGIYYCARFGAGMTGMPRYFDTTRWFDPWGQGTQVTVSS。
SEQ ID NO: 8：QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCLGGSSNIGAGYDVHWYQHLPGAAPKLLISGNSNRPSGVPARFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDNDLSQVFGGGTKLTVLGQPKA。
SEQ ID NO: 9：METDTLLLWVLLLWVPGSTGDQVQLVQSGAQLKKPGESLKISCKGSGYNFSRYWIAWVRHMPGKGLEVMGIIYPDDSDTRYSPSVRGQVTISADKSTSIVYLQWSSLKASDTGIYYCARFGAGMTGMPRYFDTTRWFDPWGQGTQVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
SEQ ID NO: 10：METDTLLLWVLLLWVPGSTGDQSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCLGGSSNIGAGYDVHWYQHLPGAAPKLLISGNSNRPSGVPARFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDNDLSQVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS。
实施例3：74抗体的表达和纯化
用含有实施例2得到的抗体轻、重链重组表达质粒共转染293F细胞，继续培养3-5天，收集上清；收集的上清经过8000rpm离心30min后，经过0.22 μm滤膜过滤，与protein A预装柱结合（5mL，GE Healthcare）。用100mMGly-HCl(pH 3.0)洗脱结合的抗体蛋白，收集目的蛋白，浓缩后进行分子筛层析。抗体蛋白通过SDS-PAGE (还原性和非还原性)确定，结果如图1，得到纯度较高的74抗体蛋白。
实施例4：表面等离子共振技术检测抗体结合抗原的能力
表面等离子共振分析利用Biacore 8K（GE Healthcare）进行。具体步骤如下：
选用protein A芯片（GE Healthcare），通过protein A与抗体Fc结合，将实施例3得到的纯化的74抗体固定在芯片上，抗体固定量约为500RU，用含有10 mM HEPES和150mMNaCl的溶液（pH 7.4）倍比稀释SARS-CoV-2及其变异毒株等沙贝病毒RBD蛋白，上样流过芯片表面，响应值的变化被记录下来。利用BIAevaluation software 8K (GE Healthcare)软件进行抗体结合RBD的动力学曲线分析，如图2A至图2C所示，抗体结合RBD的动力学常数如下表1所示。结果显示74抗体与RBD具有较高的亲和力。
表1、74抗体与SARS-CoV-2等沙贝病毒RBD蛋白结合的动力学常数
| 沙贝病毒 | ka (1/Ms) | kd (1/s) | KD (M) |
| Prototype | 6.40e+5 | 9.52e-8 | <1.56e-11 |
| Alpha | 1.03e+6 | 2.98e-8 | <9.71e-12 |
| Beta | 1.49e+6 | 1.08e-8 | <6.71e-12 |
| Delta | 1.24e+6 | 1.58e-8 | <8.06e-12 |
| BA.1 | 2.21e+6 | 4.25e-8 | <4.52e-12 |
| BA.1.1 | 7.12e+6 | 7.25e-8 | <1.40e-12 |
| BA.2 | 8.81e+6 | 5.09e-9 | <1.14e-12 |
| BA.2.75 | 1.05e+6 | 4.12e-7 | <9.52e-12 |
| BA.4/5 | 3.12e+6 | 1.31e-7 | <3.21e-12 |
| GD/1/2019 | 7.02e+5 | 2.70e-7 | <1.42e-11 |
| GX/P2V/2017 | 4.40e+5 | 9.83e-7 | <2.27e-11 |
| RaTG13 | 1.03e+6 | 1.26e-5 | 1.23e-11 |
| SARS-CoV | 1.65e+6 | 6.47e-6 | <6.06e-12 |
| WIV1 | 1.92e+6 | 2.49e-8 | <5.21e-12 |
实施例5：74抗体对SARS-CoV-2等沙贝病毒假病毒的中和效果检测
将实施例3得到的纯化的74抗体从200μg/mL开始3倍倍比稀释，共稀释10个梯度，分别与等体积的含有约1000TU荧光值的新冠病毒等沙贝病毒假病毒在 37℃混合孵育1h，然后加入到预先铺有Vero E6细胞的96孔板中，继续培养约20 h。读值及数据分析：用 CQ1激光共聚焦高内涵细胞分析仪（Yokogawa）读取荧光值，用 GraphPad Prism8 软件分析数据，计算抗体的IC50（半数抑制浓度）值，进而分析其中和效果。结果如图3A至图3D所示，结果统计如表2。
表2、74及双/三特异抗体对SARS-CoV-2等沙贝病毒假病毒的中和效果
| IC<sub>50</sub> (μg/mL) | 74 | 74-R14 | R14-74 | 74-R211 | R211-74 | 74-S102 | S102-74 | 74-R14-S102 | 74-S102-R14 | 74-R211-S102 | 74-S102-R211 |
| Prototype | 0.95 | 0.040 | 0.025 | 1.68 | 0.11 | 0.021 | 0.050 | 0.022 | 0.029 | 0.014 | 0.058 |
| Alpha | 0.76 | 0.047 | 0.032 | 3.95 | 0.11 | 0.042 | 0.16 | 0.13 | 0.14 | 0.058 | 0.56 |
| Beta | 1.62 | 0.050 | 0.061 | >10 | 0.11 | 0.031 | 0.063 | 0.14 | 0.089 | 0.11 | 0.23 |
| Delta | 1.70 | 0.081 | 0.057 | 1.53 | 0.11 | 0.081 | 0.48 | 0.14 | 0.086 | 0.047 | 0.38 |
| BA.1 | 0.91 | 0.16 | 0.18 | 1.95 | 0.22 | 0.30 | 1.66 | 0.073 | 0.042 | 0.063 | 0.38 |
| BA.1.1 | 0.20 | 0.054 | 0.12 | 3.03 | 0.20 | 0.065 | 0.32 | 0.087 | 0.039 | 0.055 | 0.35 |
| BA.2 | 3.49 | 0.049 | 0.056 | >10 | 1.25 | 0.061 | 1.90 | 0.017 | 0.011 | 0.019 | 0.098 |
| BA.2.75 | 1.70 | 0.092 | 0.039 | 7.60 | 1.26 | 0.25 | 3.31 | 0.054 | 0.032 | 0.099 | 0.63 |
| BA.4/5 | 2.81 | 0.69 | 0.94 | 4.07 | 0.73 | 0.018 | 0.082 | 0.052 | 0.028 | 0.021 | 0.12 |
| GD/1/2019 | 0.0028 | 0.0023 | 0.0029 | 0.0013 | 0.00031 | 0.0019 | 0.0016 | 0.0069 | 0.0053 | 0.0033 | 0.0048 |
| GX/P2V/2017 | 0.39 | 0.94 | 1.58 | 0.65 | 0.038 | 0.65 | 0.63 | 1.17 | 0.80 | 0.041 | 0.42 |
| RaTG13 | >100 | >10 | >10 | 0.060 | 0.019 | 0.044 | 0.035 | 1.67 | 0.025 | 0.0034 | 0.0073 |
| SARS-CoV | 0.041 | 0.15 | 0.25 | 0.14 | 0.021 | 0.031 | 0.059 | 0.0038 | 0.065 | 0.015 | 0.074 |
| WIV1 | 0.14 | 0.55 | 0.33 | 0.030 | 0.093 | 0.053 | 0.042 | 0.40 | 0.64 | 0.020 | 0.049 |
可见74抗体能够广谱中和包括但不限于SARS-CoV-2及其变异毒株、SARS-CoV、GD/1/2019、GX/P2V/2017、RaTG13、WIV1等沙贝病毒感染。
实施例6沙贝病毒广谱双/三特异中和抗体设计
为了获得具有更高中和活性的广谱抗体，本发明以74抗体为骨架，将本实验室前期鉴定的三株纳米抗体R14、R211、S102中的一株插入74抗体重链VH和CH1之间或CH3后，例如将纳米抗体R14的序列通过同源重组的方法插入74抗体重链VH和CH1之间，形成双特异抗体R14-74(氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示)；若将R14的序列通过同源重组的方法连在74抗体重链CH3之后，则形成74-R14(氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示)，以此类推形成R211-74(氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示)、74-R211(氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示)、S102-74(氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示)和74-S102(氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示)。若将三株纳米抗体R14、R211、S102中的两株插入74抗体重链VH和CH1之间或CH3后，例如将纳米抗体R14的序列通过同源重组的方法插入74抗体重链VH和CH1之间，同时将纳米抗体S102序列连在74抗体重链CH3之后，形成三特异抗体嵌合重链74-R14-S102(氨基酸序列如SEQ ID NO: 17所示)，当R14与S102位置互换时，形成74-S102-R14(氨基酸序列如SEQ IDNO: 18所示)，以此类推形成74-R211-S102(氨基酸序列如SEQ ID NO: 19所示)和74-S102-R211(氨基酸序列如SEQ ID NO: 20所示)，共10种嵌合重链。它们分别与74抗体轻链组合后，形成6株双特异抗体和4株三特异抗体。
实施例7双/三特异抗体表达和纯化
双特异抗体和三特异抗体表达和纯化与74抗体类似，见实施例3，蛋白纯化结果见图1。
实施例8双/三特异抗体对SARS-CoV-2等沙贝病毒假病毒的中和效果检测
双/三特异抗体对SARS-CoV-2等沙贝病毒假病毒的中和效果评价与74抗体类似（见实施例5），其结果见表2。
综上，74、74-R14、74-R211、74-S102、R14-74、R211-74、S102-74、74-R14-S102、74-S102-R14、74-R211-S102和74-S102-R114能够作为广谱中和新冠病毒及其变异毒株等沙贝病毒的单克隆抗体。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.沙贝病毒广谱中和抗体74或其抗原结合片段，其特征在于，其重链可变区的三个互补决定区CDR具有如下氨基酸序列：
SEQ ID NO: 1所示的CDR1，
SEQ ID NO: 2所示的CDR2，和
SEQ ID NO: 3所示的CDR3；
其轻链可变区的三个互补决定区CDR具有如下氨基酸序列：
SEQ ID NO: 4所示的CDR1，
SEQ ID NO: 5所示的CDR2，和
SEQ ID NO: 6所示的CDR3。
2. 权利要求1所述的沙贝病毒广谱中和抗体74或其抗原结合片段，其特征在于，其含有：
如SEQ ID NO: 7所示的重链可变区，和
如SEQ ID NO: 8所示的轻链可变区。
3. 如权利要求1或2所示的沙贝病毒广谱中和抗体74或其抗原结合片段，其特征在于，其含有：
如SEQ ID NO: 9所示的重链，和
如SEQ ID NO: 10所示的轻链。
4. 一种含有嵌合重链的沙贝病毒广谱中和抗体或其抗原结合片段，其特征在于，是将纳米抗体R14、R211、S102嵌入如权利要求1至3任一项所述沙贝病毒广谱中和抗体74或其抗原结合片段的重链而得到；优选地，所述嵌合重链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11，12，13，14，15，16，17，18，19或20所示，所述沙贝病毒广谱中和抗体的轻链氨基酸序列如SEQ IDNO: 10所示；更优选地，所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、Fab'-SH、Fv、scFv、F(ab')2、双抗体。
5. 一种抗体重链多肽，其特征在于，是将纳米抗体R14、R211、S102嵌入如权利要求1至3任一项所述沙贝病毒广谱中和抗体74或其抗原结合片段的重链而得到；优选地，其氨基酸序列选自SEQ ID NO: 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20所示。
6.一种多核苷酸，其编码权利要求1-4任一项所述的中和抗体或其抗原结合片段或权利要求5所述的抗体重链多肽。
7.一种表达载体，其包含权利要求6所述的多核苷酸。
8.一种宿主细胞，其包含权利要求7所述的表达载体。
9.一种药物组合物，其含有权利要求1-4中任一项所述的中和抗体或其抗原结合片段，任选地还包括药用载体。
10.权利要求1-4中任一项所述的中和抗体或其抗原结合片段在制备治疗和预防病毒感染的药物中的应用，其中所述病毒为沙贝病毒，进一步所述沙贝病毒选自SARS-CoV-2（包括原型株或其变异毒株）、SARS-CoV、WIV1、GD/1/2019、GX/P2V/2017、RaTG13。
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