CN116284359A - 两种靶向新冠病毒s2亚基茎螺旋表位的广谱中和纳米抗体及其潜在应用 - Google Patents

两种靶向新冠病毒s2亚基茎螺旋表位的广谱中和纳米抗体及其潜在应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了两种靶向新冠病毒S2亚基茎螺旋表位的广谱中和纳米抗体及其潜在应用，属于生物医药领域。本发明公开了两条能够有效抑制SARS‑CoV‑2原始株及其变异株以及沙贝病毒侵入的广谱中和纳米抗体H17和H145，其靶向的抗原表位氨基酸序列D1139PLQPELDSFKEEL1152在变异株及多种沙贝病毒中高度保守，预示其中和效果可能不受病毒突变的影响，且对未来可能出现的沙贝病毒具有较优中和作用。此外，其发挥抑制活性的窗口期明显优于已报导的靶向RBD的中和纳米抗体R150和Nb20，提示其可能具有更优治疗效果。因此，广谱中和纳米抗体H17和H145能够成为检测、预防和治疗SARS‑CoV‑2病毒感染的新型工具。

Description

两种靶向新冠病毒S2亚基茎螺旋表位的广谱中和纳米抗体及 其潜在应用
技术领域
本发明涉及两种靶向新冠病毒S2亚基茎螺旋表位的广谱中和纳米抗体及其潜在应用，属于生物医药领域。
背景技术
2019年底爆发的由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe acute respiratorysyndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2，简称新冠病毒)引起的肺炎(COVID-19)是人类历史上面临的影响范围最广的全球大流行疾病，给人类社会带来了巨大影响。由于病毒的不断进化和突变导致了变异株的快速更新迭代，尤其是最近流行的奥密克戎(Omicron)亚系的毒株，使现有大多数单克隆抗体药物因中和逃逸而失去抗病毒疗效，也造成接种了现有疫苗的接种人群仍频繁出现突破感染，给新冠病毒的预防和治疗带来了新的挑战。因此，开发广谱抗病毒药物或疫苗以应对新冠变异株的流行显得迫在眉睫。
SARS-CoV-2属于β冠状病毒属，是一种由囊膜包裹的单股正链RNA病毒。病毒粒子表面由均匀分布的同源三聚体刺突蛋白(spike,S)组成，其功能是介导病毒侵入宿主细胞，是中和抗体和疫苗设计的主要靶点[1,2]。SARS-CoV-2S蛋白是I型跨膜蛋白，由S1和S2两个亚基组成，分别负责病毒与靶细胞的粘附和融合过程。其中，S1亚基包含受体结合结构域(receptor binding domain,RBD)，其主要功能是负责与宿主细胞表面受体蛋白-血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)的结合，是病毒感染细胞的门户[3,4]。RBD亚基是目前大多数中和抗体和疫苗设计的热门靶点，但由于病毒的进化和变异株的产生，导致RBD区域多个关键位点发生突变，尤其是近期流行的奥密克戎亚系毒株，其与ACE2受体的结合更紧密，从而使病毒更容易感染并侵入人体细胞，而大量RBD区域内的氨基酸突变在奥密克戎亚系毒株中的累积和富集，导致大量靶向RBD的中和抗体免疫逃逸[5-7]。
SARS-CoV-2S2亚基负责介导病毒囊膜与细胞膜的融合过程，故又称融合亚基。当刺突蛋白结合细胞受体ACE2后，诱导S1亚基解离，融合肽暴露并插入靶细胞膜，七肽重复序列1(heptad repeat 1,HR1)形成长中心三螺旋结构，七肽重复序列2(heptad repeat 2,HR2)同样形成螺旋结构并以反向平行方式结合在相邻两个HR1形成的沟槽，形成六螺旋簇融合核心，并最终驱动病毒囊膜与靶细胞膜的融合[8,9]。与SARS-CoV-2病毒的RBD区域在变异株中累积和富集了众多突变的情况形成鲜明对比，SARS-CoV-2病毒的S2融合核心的序列和结构在进化中高度保守，因此，靶向SARS-CoV-2融合核心的中和抗体或抑制性药物，能够实现广谱抗病毒治疗作用，不会被病毒变异株所逃逸。
沙贝病毒(sarbecovirus)是β冠状病毒属的一个亚属，它包含SARS-CoV-2、严重急性呼吸综合征冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)、及与它们具有相似特征从蝙蝠、穿山甲和果子狸等分离出的动物源性冠状病毒如RANG/GD、WIV1和HKU3等，这些病毒也可能造成跨种传播和潜在的疾病大流行[10,11]。幸运的是，SARS-CoV-2与其它沙贝病毒的S2亚基在序列和结构上也是高度保守的，这意味着S2融合亚基是对抗沙贝病毒传播的抗病毒药物研发和疫苗设计的理想靶点。
纳米抗体是在骆驼科或软骨鱼类发现的只含一个重链可变区的单域抗体，又称VHH，是目前已知可结合目标抗原的最小抗体片段[12]。纳米抗体具有重链抗体相当的结构稳定性和抗原结合活性，兼具了传统抗体与小分子药物的双重优势，如分子量小、易穿透血脑屏障、表达量高且成本低、特异性强、亲和力高、免疫原性弱、性质稳定且开发周期短等[13]。已有研究报道靶向SARS-CoV-2RBD的中和纳米抗体R150[14]和Nb20[15]，均通过竞争ACE2与RBD之间的结合而发挥中和活性。但目前还未有报导靶向S2融合亚基的广谱中和纳米抗体，因此现阶段急于开发靶向S2融合亚基的广谱中和纳米抗体，为新冠病毒及其变异株或未来可能出现的沙贝病毒感染的预防或治疗提供新的药物方案。
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发明内容
目前上市的单克隆抗体药物几乎均对现阶段主要流行的Omicron亚系毒株无显著中和作用和抗病毒效果，也无明显预防作用；此外疫苗接种虽然能降低新型冠状病毒引起的肺炎重症的发病率，但在预防病毒感染方面效果并不理想，给新冠病毒的预防和治疗带来了新的挑战。因此，开发广谱抗病毒药物或疫苗以应对新冠变异株的流行显得迫在眉睫。
本发明通过ELISA和流式细胞实验验证纳米抗体与SARS-CoV-2S2(T1076-Q1208)抗原的特异性结合能力，合胞体形成抑制实验筛选出最优抑制作用的纳米抗体H17(氨基酸序列如SEQ ID NO.22，核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示)和H145(氨基酸序列如SEQ IDNO.23，核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示)。然后，通过合胞体形成抑制实验验证H17和H145对SARS-CoV-2原始株S蛋白介导的膜融合作用的抑制活性，通过假病毒中和实验验证H17和H145对SARS-CoV-2原始株和变异株(尤其是奥密克戎亚系)假病毒的抑制活性，证明H17和H145具有泛变异株中和活性。同时，通过WB、ELISA及BLI实验验证了H17和H145结合的抗原表位，其最短表位氨基酸序列均为D1139PLQPELDSFKEEL1152，位于SARS-CoV-2S2亚基的茎螺旋区(stem helix,SH)。序列分析发现D1139PLQPELDSFKEEL1152在沙贝病毒属SARS-CoV-2、SARS-CoV、PANG/GD、WIV1和HKU3中氨基酸序列高度保守，且流式细胞实验及假病毒中和实验验证了H17和H145对上述沙贝病毒具有高亲和力和广谱中和活性。随后，通过BLI技术验证了pH酸化对H17和H145与SARS-CoV-2S蛋白抗原表位的亲和力无明显影响，说明病毒通过内吞体途径感染靶细胞时，纳米抗体H17和H145仍能发挥较好抑制活性。最后，通过流式细胞实验验证了H17和H145高亲和力结合融合前构象的S蛋白；且通过合胞体形成抑制实验证明了H17和H145发挥抑制活性的窗口时间明显优于通过竞争ACE2与RBD结合而发挥抑制活性的抗体，如R150和Nb20，为H17和H145用于预防和治疗SARS-CoV-2病毒感染提供了重要数据。
本发明提供了一种抗沙贝病毒Sarbecoviruses的广谱纳米抗体，所述广谱纳米抗体包括H17或H145；所述H17的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别具有SEQ ID NO:24-26的氨基酸序列；所述H145的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别具有SEQ ID NO:24、25、27的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述广谱纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.22或SEQ IDNO.23所示。
本发明提供了编码上述广谱纳米抗体的基因。
在一种实施方式中，所述编码上述广谱纳米抗体的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.31或SEQ IDNO.32所示。
本发明提供了携带上述基因的载体、宿主细胞。
在一种实施方式中，所述宿主细胞是用于表达外源蛋白的宿主细胞。
在一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有上述广谱纳米抗体。
在一种实施方式中，所述药物组合物还含有药学上可接受的赋形剂。
在一种实施方式中，所述赋形剂包括黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂。
本发明提供了所述广谱纳米抗体在制备治疗、预防、检测或诊断沙贝病毒的产品中的应用。
在一种实施方式中，所述产品包括药物、检测试剂、检测试剂盒或活体成像探针。
在一种实施方式中，所述沙贝病毒包括PANG/GD、SARS-CoV、WIV1、HKU3和SARS-CoV-2。
在一种实施方式中，所述SARS-CoV-2变异毒株包括Omicron(BA.1,BA.2,BA.2.12.1,BA.4/5)、Beta(B.1.351)、Mu(B.1.621)、Kappa(B.1.617.1)、Delta(B.1.617.2)。
在一种实施方式中，所述应用不以疾病的诊断或治疗为目的。
本发明提供了一种SARS-CoV-2S2蛋白表位肽，所述表位肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.28所示。
本发明提供了编码上述SARS-CoV-2S2蛋白表位肽的基因。
在一种实施方式中，所述编码上述SARS-CoV-2S2蛋白表位肽的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示。
本发明提供了含有编码上述SARS-CoV-2S2蛋白表位肽的基因的表达载体或宿主细胞。
本发明提供了一种抗冠状病毒的广谱疫苗，所述疫苗含有上述SARS-CoV-2S2蛋白表位肽、或上述基因、或上述表达载体或上述宿主细胞。
在一种实施方式中，所述广谱疫苗还包括免疫学上可接受的载体或佐剂。
本发明提供了上述SARS-CoV-2S2蛋白表位肽或上述基因或上述表达载体或上述宿主细胞在制备冠状病毒广谱疫苗、抗原检测试剂盒、SARS-CoV-2S2蛋白单克隆抗体或双特异性抗体中的应用。
有益效果：
(1)本发明成功筛选到两个靶向S2的广谱纳米中和抗体，对SARS-CoV-2原始株、SARS-CoV-2变异株及多种沙贝病毒种属均有较强的抑制活性，分别命名为H17和H145，本发明证明了H17和H145能以高亲和力结合病毒融合前构象的S蛋白，且结合亲和力不受内吞体途径pH酸化的影响；也验证了H17和H145在膜融合发生后使用仍能发挥较好的抑制作用。本发明中的纳米抗体H17和H145可用于制备新冠病毒原始株或变异株感染的预防和/或治疗，也可用于制备预防或治疗其他沙贝病毒感染的药物。
(2)本发明还成功鉴定出两个中和纳米抗体在病毒S蛋白上的精确抗原结合表位氨基酸序列，为D1139PLQPELDSFKEEL1152，该序列位于SARS-CoV-2S2亚基的茎螺旋结构中，说明H17和H145能通过抑制膜融合构象变化从而发挥抗病毒中和作用。本发明的抗原结合表位D1139PLQPELDSFKEEL1152可作为广谱中和疫苗的设计靶点，同时也为预防或治疗未来可能出现的新的变异株和沙贝病毒的感染提供预防和/或治疗策略。
附图说明
图1：SARS-CoV-2S2(T1076-Q1208)三聚体蛋白纯化分子筛及和SDS-PAGE图。分子筛图中线为280nm吸收值。图1a：分子筛图为S2”(T1076-Q1208)三聚体蛋白，SDS-PAGE为分子筛出峰位置对应的S2”(T1076-Q1208)蛋白。图1b：为S2”(T1076-Q1208)多聚体蛋白经PSP酶切后的分子筛图，泳道1对应S2(T1076-Q1208)蛋白，泳道2对应GST蛋白。
图2：纳米抗体的凝胶过滤层析图谱以及SDS-PAGE分析。分子筛图中线为280nm吸收值。分子筛图为分子筛峰图为纳米抗体峰，SDS-PAGE分别表示对应图谱中纳米抗体的纯度。
图3：ELISA实验验证纳米抗体与SARS-CoV-2S2’(T1076-Q1208)抗原的结合。红色和蓝色分别代表纳米抗体浓度为200nM和1000nM。纵坐标为450nm处吸光度值(OD450)。
图4：流式细胞实验验证纳米抗体与细胞表面SARS-CoV-2S蛋白的结合能力。红色和蓝色分别代表纳米抗体浓度为200nM和1000nM。横坐标代表20种纳米抗体。纵坐标是结合纳米抗体的293T-S细胞的百分比。
图5：纳米抗体抑制SARS-CoV-2S蛋白介导的合胞体形成的结果。NC：只有293T-S/EGFP细胞；PC：293T-S/EGFP与293T-ACE2细胞结合，PBS作为纳米抗体对照组。标尺代表100μm。白色箭头代表显著形成的合胞体。
图6：SARS-CoV-2S蛋白介导的合胞体形成抑制实验检测纳米抗体H17和H145的抑制活性。横坐标是纳米抗体浓度，纵坐标是纳米抗体对合胞体形成的抑制活性。
图7：纳米抗体H17和H145对SARS-CoV-2原始株的假病毒中和曲线。横坐标是纳米抗体浓度，纵坐标是中和率，纳米抗体H6作为阴性对照。
图8：纳米抗体H17和H145对SARS-CoV-2变异株假病毒的中和活性。横坐标是纳米抗体浓度，纵坐标是中和率，纳米抗体H6作为阴性对照。
图9：中和纳米抗体H17和H145抗原结合表位的鉴定。图9b,f,j：WB实验鉴定H17和H145的抗原结合表位；图9c,g,k：ELISA实验鉴定H17和H145的抗原结合表位，横坐标为H17和H145抗体浓度，纵坐标为450nm处吸光度值(OD450)。图9d,j,l：BLI实验测定H17或H145与N端带GST标签的不同截短长度的S2(T1076-Q1208)蛋白的结合动力学曲线。横坐标是结合解离时间，单位是秒；纵坐标是探针表面的结合响应强度，单位是nm。图9a,e,i：为上述实验结果汇总，b.代表结合(binding)，n.b.代表不结合(no binding)。
图10：纳米抗体H17和H145抗原结合表位D1139PLQPELDSFKEEL1152在SARS-CoV-2变异株中氨基酸序列比较结果。
图11：纳米抗体H17和H145对沙贝病毒的广谱中和活性检测。图11a：几种代表性沙贝病毒SARS-CoV-2S2(T1076-Q1208)氨基酸序列比较结果。星号标识为H17和H145最短抗原结合表位的氨基酸序列。图11b：流式细胞实验检测H17和H145与细胞表面完整沙贝病毒S蛋白的亲和力。横坐标是纳米抗体浓度，纵坐标是结合纳米抗体的293T-S细胞的百分比。图11c：假病毒中和实验检测H17和H145对沙贝病毒的中和活性。横坐标是纳米抗体浓度，纵坐标是中和率，纳米抗体H6作为阴性对照。
图12：BLI实验测定在pH 7.4、6.0、5.4条件下，H17或H145与S2”(T1076-Q1208)蛋白的结合动力学曲线。横坐标是结合解离时间，单位是秒；纵坐标是探针表面的结合响应强度，单位是nm；曲线代表不同稀释浓度的纳米抗体，单位是nM。
图13：流式细胞实验检测H17和H145与细胞表面野生型S蛋白及融合前构象S蛋白的亲和力。横坐标是纳米抗体浓度，纵坐标是结合纳米抗体的293T-S细胞的百分比。
图14：合胞体形成抑制实验探究不同结合时间纳米抗体的抑制作用。Pre代表纳米抗体与293T-S/EGFP细胞结合1h后加入293T-ACE2细胞；Co代表纳米抗体与293T-S/EGFP细胞结合同时加入293T-ACE2细胞；Post代表293T-S/EGFP细胞与293T-ACE2细胞结合1h后再加入纳米抗体。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
pGEX-6P-1-GST载体：以pGEX-6P-1为载体，载体通过Nde I和Bam H I酶切位点加入编码GST重组蛋白及PSP酶切位点的DNA序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示)。
实施例1SARS-CoV-2S2(T1076-Q1208)的表达及纯化
(1)质粒构建
(a)通过结构分析，为了获得稳定表达的S2(T1076-Q1208)抗原，将编码SARS-CoV-2S蛋白(GenBank编号MN908947.3)的S2(T1076-Q1208)的DNA片段(核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)用Bam H I和Xho I酶切位点连入pGEX-6P-1-GST载体，并在S2(T1076-Q1208)片段后插入foldon标签，用GS linker链接，foldon标签后连接6×His标签及翻译终止密码子。得到一个N-端带有GST标签，C-端带有GS linker连接的folden标签和6×His标签的重组蛋白(氨基酸序列如SEQ IDNO.35所示)，命名为S2”(T1076-Q1208)，并命名重组质粒为GST-S2(T1076-Q1208)-folden-His。S2”(T1076-Q1208)蛋白经PSP酶切去掉GST标签后纯化得到的S2(T1076-Q1208)-folden-His蛋白命名为S2(T1076-Q1208)。
(b)功能实验中，由于不需要folden标签稳定蛋白的三聚体结构，同时排除His标签对实验的干扰，设计一系列不同截短长度的SARS-CoV-2S2(T1076-Q1208)抗原蛋白截短体，并在N端带有GST标签以帮助蛋白表达。首先，将编码S2(T1076-Q1208)的DNA片段连入pGEX-6P-1-GST标签载体，得到一个表达N端连接有GST标签的S2(T1076-Q1208)融合蛋白S2’(T1076-Q1208)的重组质粒，命名为S2’(T1076-Q1208)。同上，分别将编码SARS-CoV-2T1076-I1183、T1076-H1159、T1076-N1135、T1076-E1111、T1100-N1135、G1124-H1159、F1148-I1183及D1168-Q1208的DNA片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.3～SEQID NO.10所示)连入pGEX-6P-1-GST标签载体，得到N端带有GST标签的重组质粒依次命名为S2(T1076-I183)、S2(T1076-H1159)、S2(T1076-N1135)、S2(T1076-E1111)、S2(T1100-N1135)、S2(G1124-H1159)、S2(F1148-I1183)和S2(D1168-Q1208)。
同样，将编码SARS-CoV-2V1133-S1147、T1136-E1150、D1139-D1153、Q1142-F1156、L1145-H1159、P1140-D1153、D1139-L1152、P1140-L152、L1141-L1152、D1139-E1151及D1139-E1150的DNA片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.21所示)连入pGEX-6P-1-GST载体，得到N端带有GST标签的重组质粒依次命名为S2(V1133-S1147)、S2(T1136-E1150)、S2(D1139-D1153)、S2(Q1142-F1156)、S2(L1145-H1159)、S2(P1140-D1153)、S2(D1139-L1152)、S2(P1140-L152)、S2(L1141-L1152)、S2(D1139-E1151)和S2(D1139-E1150)。
将编码SARS-CoV-2，PANG/GD，SARS-CoV，WIV1，HKU3的S蛋白的基因序列，分别对应GenBank编号MN908947.3，QLR06867.1，AY278554.2，AGZ48828.1，QND76034.1，密码子优化为哺乳动物细胞密码子，并通过EcoRI和BglⅡ限制性酶切位点克隆至pCAGGS载体中，得到重组质粒pCAGGS-SARS-CoV-2S、pCAGGS-PANG/GD S、pCAGGS-SARS-CoV S、pCAGGS-WIV1 S、pCAGGS-HKU3 S。重组质粒通过菌液PCR鉴定、双酶切鉴定和质粒基因测序等验证插入的外源片段是否完全正确。
(2)SARS-CoV-2S2(T1076-Q1208)蛋白表达与纯化
将构建好的重组质粒GST-S2(T1076-Q1208)-folden-His转化E.coli BL21感受态细胞，涂布LB固体平板(氨苄抗性)，培养箱倒置37℃过夜培养，挑取单克隆于LB培养基(氨苄抗性)37℃扩增培养约2.5h至OD600为0.6～0.8。降温至16℃后添加0.2mM IPTG诱导培养16h，收集菌液高压破菌，超速离心取上清，将上清与蛋白缓冲液(20mM Tris,pH 8.0,150mMNaCl)平衡后的GST标签纯化树脂于4℃结合2h。结束后用蛋白缓冲液洗杂蛋白，洗脱缓冲液(20mM Tris,150mM NaCl，20mM GSH，pH 8.0)洗脱目的蛋白。收集洗脱后的目的蛋白，通过Superdex 200Increase 10/300GL凝胶过滤层析柱(GE Healthcare)进行精细纯化，结果分析可知得到的为S2”(T1076-Q1208)重组蛋白的多聚体形式(图1a)。
向上述目的蛋白中加入PSP蛋白酶酶切重组蛋白N端GST标签，并通过多次反挂去除GST标签蛋白，最后使用蛋白缓冲液(10mM HEPES、pH 7.5、150mM NaCl)通过Superdex200Increase 10/300GL分离纯化，得到均一性良好且SDS-PAGE鉴定纯度达95％的S2(T1076-Q1208)三聚体蛋白。浓缩峰1中均一性良好的SARS-CoV-2S2(T1076-Q1208)三聚体蛋白作为免疫羊驼的抗原。
采用上述蛋白表达和纯化方法制备得到N-端带有GST标签的S2’(T1076-Q1208)蛋白和一系列不同长度的SARS-CoV-2S2(T1076-Q1208)蛋白截短体：S2(T1076-I183)、S2(T1076-H1159)、S2(T1076-N1135)、S2(T1076-E1111)、S2(T1100-N1135)、S2(G1124-H1159)、S2(F1148-I1183)、S2(D1168-Q1208)、S2(V1133-S1147)、S2(T1136-E1150)、S2(D1139-D1153)、S2(Q1142-F1156)、S2(L1145-H1159)、S2(P1140-D1153)、S2(D1139-L1152)、S2(P1140-L152)、S2(L1141-L1152)、S2(D1139-E1151)和S2(D1139-E1150)。
实施例2SARS-CoV-2S2(T1076-Q1208)特异性纳米抗体库的构建
(1)免疫动物
将实施例1中纯化得到的SARS-CoV-2S2(T1076-Q1208)三聚体蛋白作为抗原免疫羊驼。免疫第0天，在弗氏佐剂(CFA)存在的条件下，用0.5mg SARS-CoV-2S2(T1076-Q1208)三聚体蛋白对羊驼进行皮下免疫，在免疫第21天和42天，分别在弗氏不完全佐剂(IFA)存在的条件下皮下接种0.25mgSARS-CoV-2S2(T1076-Q1208)三聚体蛋白，在免疫第49天，采集50mL免疫羊驼血液。
(2)特异性纳米抗体库的构建
从免疫后的羊驼血中分离外周血单个核细胞，并从单个核细胞中纯化RNA。将纯化到的RNA反转录为cDNA并通过PCR扩增，随后从扩增产物中纯化VHH片段，构建至商品化pComb3XSS载体中。将重组载体电转至TG1感受态细胞中制备噬菌体文库，随后通过筛选得到单个噬菌体克隆并检测其与SARS-CoV-2S2(T1076-Q1208)抗原的初步结合能力。
(3)质粒构建
通过羊驼免疫所获得的SARS-CoV-2S2(T1076-Q1208)特异性纳米抗体库中挑选合成20个纳米抗体(H6、H8、H15、H17、H23、H27、H36、H49、H58、H68、H84、H85、H88、H93、H102、H145、H147、H177、H180、H184)，分别在纳米抗体的编码基因序列的C端引入His标签及翻译终止密码子，随后利用BamH I和Hind III酶切位点通过同源重组的方法将编码纳米抗体的基因片段克隆至商品化pNCMO2载体中，获得20个重组质粒。重组质粒通过菌液PCR鉴定、双酶切鉴定和质粒基因测序等验证插入的外源片段是否完全正确。
(4)纳米抗体表达与纯化
将步骤(3)中构建好的20个纳米抗体重组质粒分别电转至Brevibacilluschoshinensis SP3感受态细胞中，涂布LB固体培养基(硫酸新霉素抗性)于培养箱37℃培养过夜，随后挑取单菌落进行扩增培养，表达4d后，收取菌液，离心，取上清与Ni-TEDNUPharose FF beads(NUPTEC)于4℃结合2h，结束后用低浓度咪唑缓冲液(10mM HEPES、pH7.5、150mM NaCl、10mM imidazole)洗脱杂蛋白，高浓度咪唑洗脱液(10mM HEPES、pH 7.5、150mM NaCl、200mM imidazole)洗脱目的蛋白。收集洗脱后的目的蛋白通过SuperdexTM 7510/300GL凝胶过滤层析柱(GE Healthcare)进行精细纯化。如图2所示，纳米抗体在凝胶过滤层析中洗脱峰单一且对称，说明其在溶液中的均一性良好，且SDS-PAGE鉴定显示20个纳米抗体的纯度达99％以上。
实施例3中和纳米抗体筛选与鉴定
(1)ELISA验证实施例2中的20个纳米抗体与SARS-CoV-2S2(T1076-Q1208)抗原的结合能力
(1)利用pH 9.6碳酸盐缓冲液稀释实施例1构建的重组蛋白S2’(T1076-Q1208)至终浓度2μg/mL，96孔板中100μL/孔，于4℃过夜包被；(2)去包被液后用1×PBST(1×PBS溶液中加0.05％Tween 20)洗3次；(3)每孔加入100μL含5％脱脂牛奶的封闭液(1×PBST溶液配制)室温封闭1.5h；(4)去封闭液后用1×PBST洗3次；(5)纳米抗体室温结合1.5h：浓度为200nM和1000nM，100μL/孔，设3个副孔，PBS组为空白对照不加纳米抗体；(6)去上清，1×PBST洗3次；(7)加HRP直联anti-His抗体(Proteintech)，室温结合1h；(8)去上清，1×PBST洗3次；(9)TMB(四甲基联苯胺，Beyotime)显色，50μL/孔；(10)待颜色明显变化后(3-5min)，加入50μl/孔0.2M HCl终止显色反应；(11)酶标仪检测OD450 nm光吸收值；(12)计算样本吸光度值＝样本OD值-空白对照OD平均值。
结果分析：ELISA实验中包被S2’(T1076-Q1208)抗原C端无His标签，而纳米抗体C端有His标签，故OD值的强弱代表纳米抗体结合S2’(T1076-Q1208)抗原的能力，OD值越高，代表纳米抗体与S2’(T1076-Q1208)抗原结合能力越强。如图3说明，有13个纳米抗体，如H8、H17、H23、H49、H58、H68、H84、H85、H88、H93、H145、H177和H180，在1000nM浓度下能较强结合S2’(T1076-Q1208)抗原。
(2)流式细胞术验证20个纳米抗体与细胞表面SARS-CoV-2S蛋白的特异性结合能力
为了进一步验证纳米抗体与完整三聚体S蛋白的结合能力，通过流式细胞实验检测了纳米抗体与细胞表面完整S蛋白的结合情况。
HEK-293T细胞培养及质粒转染：(1)HEK-293T细胞用完全培养基(10％FBS+双抗+DMEM基础培养基)培养，待细胞密度达80％(～18h)；(2)细胞转染：根据转染试剂说明书提供的方法，利用lipo8000(碧云天)转染试剂将编码SARS-CoV-2S蛋白的质粒pCAGGS-SARS-CoV-2S转染至293T细胞。
流式细胞实验具体操作步骤如下：(1)转染2天后收集膜表面表达S蛋白的293T细胞(简称293T-S)；(2)每4×105个293T-S与纳米抗体室温结合1.5h，纳米抗体终浓度为200nM或1000nM，设PBS阴性对照组；(3)1×PBS缓冲液(含0.5％FBS)离心去除非特异结合纳米抗体；(4)加入anti-His-PE(Miltenyi)流式抗体4℃孵育15min，目的是标记带有His标签的纳米抗体；(5)加入1×PBS缓冲液(含0.5％FBS)离心去非特异结合的流式抗体；(6)流式细胞仪检测PE通道阳性细胞比例。PE阳性细胞百分比代表结合了纳米抗体的293T-S细胞的百分比。
结果如图4所示，有8种纳米抗体(H17、H49、H58、H68、H93、H145、H177和H180)在1000nM浓度下特异结合293T-S细胞，且这8种纳米抗体在ELISA实验中均能与S2’(T1076-Q1208)抗原结合；其中纳米抗体H17、H58、H93和H145在200nM和1000nM浓度下结合293T-S细胞的百分比无明显差异，为强结合纳米抗体，而H49、H68、H177和H180在200nM浓度下结合293T-S细胞的百分比明显低于1000nM浓度，为弱结合纳米抗体，而其余12种抗体为非结合纳米抗体。
(3)合胞体形成抑制实验筛选获得纳米抗体H17和H145
为了进一步验证20个纳米抗体的中和活性，进行了新冠病毒S蛋白介导的合胞体形成抑制实验。
合胞体形成抑制实验方案具体如下：(1)HEK-293T细胞用完全培养基(10％FBS+双抗+DMEM基础培养基)培养，待细胞密度达80％(～18h)，根据转染试剂说明书提供的方法，将编码SARS-CoV-2S蛋白pCAGGS-SARS-CoV-2S和编码EGFP蛋白的表达质粒pEGFP-N1(购自Invitrogen公司)通过Lipo8000共转至HEK-293T细胞(简称293T-S/EGFP)；(2)转染40h后，消化离心收集293T-S/EGFP细胞，再以2.5×104个/孔的细胞密度接种于96孔板；(3)每孔加入纳米抗体混合均匀后于37℃孵育30min，以利于纳米抗体与细胞表面S蛋白结合；(4)每孔加入5×104个/孔的稳定表达ACE2受体(NCBI编号：BAB40370.1)的HEK-293T细胞(简称293T-ACE2)作为受体细胞，充分混匀以便两种细胞均匀融合；(5)37℃孵箱培养6h后，通过荧光显微镜(Olympus)观察绿色荧光的面积。该体系中每孔总体积为150μL，293T-S/EGFP细胞、纳米抗体以及293T-ACE2细胞等体积添加，纳米抗体终浓度为666nM，每个设置3个副孔。设置阴性对照组(只有293T-S/EGFP细胞，简称NC组)和阳性对照组(有293T-S/EGFP和293T-ACE2细胞，为PBS对照组，简称PC)。
实验原理：293T-S/EGFP供体细胞表面表达S蛋白能特异性结合表达ACE2受体的细胞，从而介导两者的融合，形成融合细胞面积增大称之为合胞体，而EGFP也从293T-S/EGFP供体细胞到融合细胞中，显微镜观察到绿色荧光面积增加。若抗体结合S蛋白后能阻断S蛋白介导的膜融合过程，表现出合胞体形成受到抑制，即绿色融合荧光面积少。如图5所示，在本实验浓度下，非结合抗体和大多弱结合抗体几乎不能抑制SARS-CoV-2S蛋白介导的合胞体的形成；其中结合抗体H49、H58和H93具有轻微合胞体形成抑制的能力，所有仍有较多合胞体形；而纳米抗体H17和H145具有较强抑制合胞体形成的能力，几乎没有融合合胞体的形成，故H17和H145为较强中和纳米抗体。
实施例4体外试验验证H17和H145对SARS-CoV-2及其变异株的中和活性
(1)H17和H145抑制SARS-CoV-2S蛋白介导的膜融合作用
采用与实施例3合胞体形成抑制实验相同的实验方法，进一步探究倍比稀释浓度的纳米抗体H17及H145对SARS-CoV-2S蛋白介导膜融合过程的抑制作用。
如图6所示，随着H17和H145纳米抗体浓度的增加，其合胞体形成抑制能力逐渐增强直到饱和。通过Graphpad 8.0软件计算H17和H145的半抑制浓度IC50，分别为12.8nM和21.7nM，说明H17和H145能通过抑制SARS-CoV-2S蛋白介导的膜融合过程而发挥抗病毒中和活性的作用，且具有较强抑制膜融合作用。
(2)假病毒中和实验检测H17和H145对SARS-CoV-2原始株的抑制活性
随后，通过假病毒中和实验探究了纳米抗体H17和H145对SARS-CoV-2原始株的中和活性。
假病毒中和实验具体方案如下：(1)将0.1mg/ml L-多聚赖氨酸包被96孔细胞培养板，过夜包被后，ddH2O洗板1次；(2)将293T-ACE2细胞以1×104个/孔的密度接种于96孔板，于37℃细胞培养箱贴壁生长6h；(3)利用DMEM基础培养基分别稀释纳米抗体和SARS-CoV-2原始株假病毒(购自Genomeditech)，将稀释后的纳米抗体与SARS-CoV-2原始株假病毒等体积混匀后于37℃培养箱孵育1h，使纳米抗体与假病毒表面SARS-CoV-2S蛋白充分结合，获得假病毒/纳米抗体混合物；(4)弃去293T-ACE2细胞的培养基，加入假病毒/纳米抗体混合物，模拟病毒的感染过程，设置PC组无纳米抗体组；(5)感染24h后更换含新鲜完全培养基(10％FBS+双抗+DMEM基础培养基)；(6)继续感染48h后使用One-LumiTM II萤火虫荧光素酶测定试剂盒(Beyotime)，测定293T-ACE2细胞内的荧光素酶活性，荧光素酶读值越高代表病毒感染值越多。(7)计算假病毒中和活性＝(PC值-实验组值)/PC值，其中PC孔代表未加入纳米抗体的假病毒感染值，中和活性值越大代表纳米抗体抑制假病毒感染的能力越强；(9)通过GraphPad Prism 8绘制中和活性曲线并计算半数抑制浓度(IC50)值。
结果如图7所示：非中和纳米抗体H6(氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示)无抑制活性，中和纳米抗体H17和H145的IC50值分别为58.8nM和70.8nM，提示H17和H145针对SARS-CoV-2原始株具有较强抑制活性。
(3)假病毒中和实验检测H17和H145对SARS-CoV-2变异株的抑制活性
通过假病毒中和实验验证了H17和H145对SARS-CoV-2变异株Omicron(BA.1,BA.2,BA.2.12.1,BA.4/5)、Beta(B.1.351)、Mu(B.1.621)、Kappa(B.1.617.1)、Delta(B.1.617.2)假病毒(购自Genomeditech公司)的中和活性。假病毒中和实验方案同步骤(2)。
结果如图8所示，结果提示纳米抗体H17和H145均可有效中和SARS-CoV-2变异株假病毒，尤其是针对Omicron变异株，均表现出比其它变异株更强的抑制活性。此外，H17和H145均对目前主要流行的Omicron亚系变异株表现出比原始株更优的抑制活性。由此可知，纳米抗体H17和H145针对SARS-CoV-2变异株具有广谱中和活性。
表1H17和H145中和SARS-CoV-2变异株假病毒的IC50值
Figure SMS_1
实施例5纳米抗体H17和H145抗原结合表位的鉴定及在不同变异株中的保守性分析
(1)纳米抗体H17和H145抗原结合表位的鉴定
为了鉴定纳米抗体H17和H145的抗原结合表位，利用实施例1中构建的S2(T1076-Q1208)蛋白及其一系列截短体蛋白S2(T1076-I183)、S2(T1076-H1159)、S2(T1076-N1135)、S2(T1076-E1111)、S2(T1100-N1135)、S2(G1124-H1159)、S2(F1148-I1183)、S2(D1168-Q1208)，通过WB，ELISA和生物膜层干涉技术(BLI)实验筛选鉴定H17和H145的抗原结合表位。
WB实验操作步骤如下：(1)15％SDS-PAGE胶上样0.1ug/孔，样本分别为一系列不同截短长度的SARS-CoV-2S2(T1076-Q1208)抗原蛋白截短体；(2)电泳：先90mAu×20min后调整为160mAu×30min左右；(3)转膜：400mAu×90min；(4)含5％脱脂奶粉的TBST溶液常温封闭1.5h；(5)1×PBST洗3次；(6)一抗孵育：纳米抗体H17或H145(1μg/ml)常温孵育1h；(7)1×PBST洗3次，去非特异结合抗体；(8)二抗孵育：HRP直联anti-His抗体(Proteintech)常温孵育1h；(9)1×PBST洗3次；(10)ECL发光液作用后曝光。若纳米抗体(有His标签)与抗原样本(无His标签)结合，则WB检测的曝光强弱代表His标签纳米抗体结合抗原的情况。ELISA实验操作方案同上，包被液含N端带GST标签的不同截短长度的S2(无His标签)蛋白，一抗仍为纳米抗体H17或H145。BLI实验操作步骤如下：(1)将纳米抗体H17和H145分别与生物素化试剂按1:1摩尔比混匀室温结合40min，使用平衡后的脱盐柱收集生物素化的目的蛋白H17和H145；(2)将生物素化的目的蛋白H17和H145固定在SA传感器(赛多利斯公司)，固化高度为2nm；(3)将一系列不同截短长度的SARS-CoV-2S2(T1076-Q1208)抗原蛋白截短体(200nM)分别与SA传感器上固化物反应，设置结合90s，解离180s，频率为2HZ；(4)通过ForteBioDataAnalysis 12.0program软件分析动力学参数，并用GraphPad Prism 8.0作图。WB实验用于检测H17和H145是否结合抗原线性表位，ELISA实验进一步验证H17和H145是否结合抗原表位，BLI实验更高灵敏度验证抗原是否与H17或H145结合。
如图9a-d，WB、ELISA及BLI实验结果具有一致性，均说明H17和H145能与S2’(T1076-Q1208)、S2(T1076-I183)、S2(T1076-H1159)和S2(G1124-H1159)抗原特异性结合，根据抗原表位氨基酸长度分析，说明H17和H145可能结合抗原表位S2(V1133-H1159)。
因此，通过表位重叠对S2(V1133-H1159)抗原表位设计了5个不同的SARS-CoV-2S2(T1076-Q1208)抗原蛋白截短体S2(V1133-S1147)、S2(T1136-E1150)、S2(D1139-D1153)、S2(Q1142-F1156)、S2(L1145-H1159)，如图9e-h所示，WB、ELISA及BLI实验结果具有一致性，结果提示H17和H145均能结合S2(D1139-D1153)抗原的线性表位。
为了进一步缩短结合表位氨基酸的长度，针对S2(D1139-D1153)抗原又设计了一系列SARS-CoV-2S2(T1076-Q1208)抗原蛋白截短体S2(P1140-D1153)、S2(D1139-L1152)、S2(P1140-L152)、S2(L1141-L1152)、S2(D1139-E1151)和S2(D1139-E1150)，如图9i-l所示，WB、ELISA及BLI实验结果也具有一致性，结果说明H17和H145结合的最短抗原表位氨基酸序列一样，均为S2(D1139-L1152)。虽然WB结果均提示H17和H145能结合抗原线性表位S2(D1139-E1151)，但是结合能力较S2(D1139-L1152)明显下降。且ELISA结果说明H17不能结合S2(D1139-E1151)，虽然H145与S2(D1139-E1151)具有一定的结合能力，但是ELISA结果提示其结合S2(D1139-L1152)的EC50数值较S2(D1139-E1151)明显增加100倍，说明抗原表位L1152氨基酸在与H17或H145的结合中发挥重要作用。由此可知，纳米抗体H17和H145的最短抗原结合表位均为SARS-CoV-2D1139PLQPELDSFKEEL1152，通过氨基酸序列分析得知，氨基酸D1139-L1152位于SARS-CoV-2S蛋白的茎螺旋区(stem helix，SH)。
(2)纳米抗体H17和H145抗原结合表位在不同变异株中的保守性分析
确定纳米抗体H17和H145抗原结合表位后，为了从序列和结构角度分析H17和H145泛变异株广谱中和活性的原因，通过序列比较分析了SARS-CoV-2主要变异株在抗原结合表位的氨基酸序列。如图10序列比较结果提示，纳米抗体H17和H145在茎螺旋结构的抗原结合表位D1139PLQPELDSFKEEL1152在WHO命名的所有SARS-CoV-2变异株中氨基酸序列均高度保守，因此从序列和结构角度验证了纳米抗体H17和H145泛变异株广谱中和活性的原因。
实施例6H17和H145广谱中和活性的鉴定
(1)H17和H145抗原表位在沙贝病毒中具有高度保守性
为了探究进一步探究H17和H145的广谱中和活性，首先比较了沙贝病毒如SARS-CoV(具有高度传染性和致病性)、PANG/GD、WIV1和HKU3(能引起人畜共患疾病)中抗原结合表位氨基酸序列的差异。如图11a，序列比较提示，纳米抗体H17和H145的茎螺旋区的抗原结合表位D1139PLQPELDSFKEEL1152氨基酸序列在沙贝病毒如SARS-CoV-2、PANG/GD、SARS-CoV、WIV1、HKU3中高度保守，提示H17和H145能通过结合沙贝病毒茎螺旋抗原表位而发挥广谱中和活性的作用。
(2)验证H17和H145与细胞表面完整沙贝病毒S蛋白的结合能力
为了验证上述猜想，通过流式细胞实验检测了纳米抗体H17和H145与细胞表面完整沙贝病毒S蛋白的结合能力。流式细胞实验检测细胞表面S蛋白与纳米抗体的结合亲和力的实验方案同实施例3，将携带编码S蛋白的质粒调整为pCAGGS-SARS-CoV S、pCAGGS-PANG/GD S、pCAGGS-WIV1 S或pCAGGS-HKU3 S。
如图11b，结果提示：H17和H145与PANG/GD、SARS-CoV、WIV1和HKU3细胞表面S蛋白结合亲和力均为纳摩尔级别，H17结合EC50分别为1.23nM、1.86nM、3.08nM和1.70nM，H145结合EC50值分别为0.77nM、1.32nM、2.62nM和1.28nM。由此可知，H17和H145和沙贝病毒S蛋白具有高亲和力，且结合亲和力同SARS-CoV-2S蛋白的结合亲和力值无明显差异。
(3)假病毒中和实验验证H17和H145对沙贝病毒的中和活性
进一步通过假病毒中和实验验证了H17和H145对沙贝病毒PANG/GD、SARS-CoV、WIV1和HKU3(购自Genomeditech公司)的中和活性，假病毒中和试验参考实施例4。如图11c-d所示，对于PANG/GD、SARS-CoV、WIV1和HKU3假病毒，H17和H145均具有较优假病毒中和活性，H17的IC50值分别为：0.65nM、27.67nM、13.75nM和7.73nM；H145的IC50值分别为：2.65nM、21.64nM、16.57nM和7.75nM，结果说明纳米抗体H17和H145具有广谱沙贝病毒中和活性，且中和活性明显优于其对SARS-CoV-2的中和活性。
实施例7中和纳米抗体H17和H145与抗原表位的结合不受酸性pH的影响
SARS-CoV-2主要通过两种途径进入宿主细胞：病毒与细胞表面膜融合或内吞体途径。内吞体途径融合过程中，病毒会经历pH降低的微环境变化，从胞质中性环境(pH 7.4)到内吞体的酸性环境(pH 5.4)。为了探究pH变化是否影响纳米抗体H17和H145与SARS-CoV-2S蛋白抗原表位的结合能力，通过BLI实验探究了H17和H145与S2”(T1076-Q1208)蛋白的亲和力。BLI实验步骤参考实施例5，本发明分别测定了pH在7.4(HEPES 10mM,NaCl 150mM,Tween20 0.05％V/V，pH 7.4)、6.0(MES 10mM,NaCl 150mM,Tween 20 0.05％V/V,pH 6.0)及5.4(MES 10mM,NaCl 150mM,Tween 20 0.05％V/V，pH 5.4)蛋白缓冲液条件下的亲和力。如图12所示，pH在7.4、6.0及5.4条件下，纳米抗体H17和H145均能高亲和力结合S2”(T1076-Q1208)抗原。其中，H17的结合亲和力值分别为0.330nM、0.351nM和0.607nM，H145的结合亲和力值分别为0.223nM、0.229nM和0.314nM。
结果说明，在pH 6.0-7.4范围内，H17和H145与抗原表位的结合无明显变化；而亲和力值分别在pH 7.4是pH 5.4值的1.83倍和1.40倍。由此可知，纳米抗体H17和H145与抗原表位的结合几乎不受pH降低(从7.4到5.4)的影响。目前，已报道的靶向茎螺旋表位的中和抗体S2P6与抗原表位的结合呈现pH依赖性，其抗体的Fab及IgG形式与SARS-CoV-2 pre-S的亲和力值在pH 7.4是pH 5.4的6.47倍和5.75倍。因此，病毒通过内吞体途径感染细胞时，H17和H145更不易受pH降低的影响，提示纳米抗体在此条件下相对于S2P6抗体可能具有更优的作用效果。
实施例8流式细胞实验验证H17和H145结合融合前构象的S蛋白
以实施例1构建的重组质粒pCAGGS-SARS-CoV-2 S为模板，通过突变位点设计引物，将SARS-CoV-2 S蛋白进行了4个氨基酸位点K986P、V987P、S383C及D985C的突变，目的是将S蛋白稳定在融合前构象，得到突变质粒pCAGGS-SARS-CoV-2 pre-fusion S。首先以SARS-CoV-2S基因为模板，利用突变引物F1/R1、F2/R2、F3/R3分别扩增出三个DNA片段，第1到第389位氨基酸为第一个片段；第377到962位氨基酸为第二个片段；第950位到最后一位氨基酸为第三个片段(其中重叠部分为同源臂)。将回收后的三段DNA片段通过同源重组的方式重组到pCAGGS载体中。重组质粒通过菌液PCR鉴定、质粒基因测序等验证插入的外源片段是否完全正确。
表2突变引物
名称 引物序列(5’-3’)
F1 TTCAAGTGTTACGGCGTGTGCCCCACCAAGCTGAACGACC
R1 GGTCGTTCAGCTTGGTGGGGCACACGCCGTAACACTTGAA
F2 ACACAGACAAACTCCCCCAGCGGAGCCGGATCCGTGGCCTCCCAGTCC
R2 GGACTGGGAGGCCACGGATCCGGCTCCGCTGGGGGAGTTTGTCTGTGT
F3 GATATCCTGAGCCGGCTGTGCCCACCAGAGGCTGAAGTGCAGATT
R3 AATCTGCACTTCAGCCTCTGGTGGGCACAGCCGGCTCAGG ATATC
通过结构分析可知，H17和H145抗原结合表位茎螺旋区在SARS-CoV-2融合前结构暴露，因而通过流式细胞实验检测了H17和H145纳米抗体与表达在细胞表面的野生型S蛋白及固定融合前构象的S蛋白的结合，流式细胞实验的步骤参考实施例3，细胞转染中将质粒pCAGGS-SARS-CoV-2S调整为突变质粒pCAGGS-SARS-CoV-2 pre-fusion S。
结果如图13所示，结果提示H17和H145均能高亲和力结合野生型S蛋白(EC50值分别为：1.23nM和0.77nM)或融合前构象的S蛋白(EC50值分别为：0.97nM和1.37nM)，且结合亲和力无明显差异，均为纳摩尔级。
实施例9纳米抗体H17和H145发挥膜融合抑制作用的窗口期分析
Nb20和R150是已报导靶向RBD区域的中和纳米抗体，表面等离子体共振实验测得其与RBD的结合亲和力分别约为67pM和10pM，且均能与ACE2竞争结合RBD表位[14,15]。鉴于H17和H145抗原结合表位茎螺旋区位于S2亚基，不与ACE2竞争结合RBD，因此，在本发明中通过SARS-CoV-2S蛋白介导的合胞体形成抑制实验探究纳米抗体在不同膜融合阶段抑制合胞体形成的能力是否有差异，亦即发挥抑制活性的窗口期的头对头比较研究。
合胞体形成抑制实验整体方案同实施例3，只是将添加纳米抗体的时间调整为三个不同的时间点：时间点1—纳米抗体与293T-S/EGFP细胞预先结合1h后，再与293T-ACE2细胞混合、孵育，图中标识为Pre，用以类比游离病毒黏附到靶细胞表面之前，抗体发挥抑制活性的窗口模式；时间点2—293T-S/EGFP细胞与纳米抗体混合孵育的同时加入293T-ACE2细胞，图中标识为Co，用以类比病毒黏附到靶细胞表面的同时，抗体发挥抑制活性的窗口模式；时间点3—293T-S/EGFP细胞与293T-ACE2细胞混合孵育1h后，再加入纳米抗体，图中标识为Post，用以类比病毒黏附到靶细胞表面以后，抗体发挥抑制活性的窗口模式。本实验中所用纳米抗体在细胞体系的终浓度均为1μM。
如图14所示，非中和纳米抗体H6在Pre、Co及Post三种窗口模式下均不能抑制合胞体的形成，符合预期；中和纳米抗体H17、H145、R150及Nb20在Pre窗口模式下均能显著抑制合胞体的形成，其抑制率均接近100％；而在Co共孵育的窗口模式下，H17和H145的抑制能力与Pre模式下无显著差异，但R150和Nb20抑制合胞体形成的能力已出现下降，抑制率平均值分别下降到82.0％和89.5％；而在Post窗口模式下，H17和H145抑制合胞体形成的能力虽然也有降低，但其抑制率仍然维持在80.1％和76.9％的水平，而R150和Nb20抑制合胞体形成的能力则发生显著降低，抑制率平均值分别下降到27.5％和42.2％。上述结果表明，虽然纳米抗体H17和H145与SARS-CoV-2S蛋白的亲和力比Nb20和R150纳米抗体低，但在SARS-CoV-2黏附于靶细胞表面的同时或黏附于靶细胞表面之后，靶向膜融合亚基茎螺旋表位的纳米抗体H17和H145，其抑制活性均优于靶向RBD的纳米抗体R150和Nb20，尤其是在病毒黏附于靶细胞表面之后，这种差异更加明显。由此可知，靶向SARS-CoV-2茎螺旋表位的纳米抗体H17和H145抑制合胞体形成的有效窗口期明显优于与竞争ACE2结合RBD表位的纳米抗体R150和Nb20，说明H17和H145这种靶向膜融合亚基的中和纳米抗体在治疗新冠感染过程中可能发挥更好的作用。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (12)

1.一种抗沙贝病毒Sarbecoviruses的广谱纳米抗体，其特征在于，所述广谱纳米抗体包括H17或H145；所述H17的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别具有SEQ ID NO:24-26的氨基酸序列；所述H145重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别具有SEQ ID NO:24、25、27的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的广谱纳米抗体，其特征在于，所述广谱纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO.22或SEQ ID NO.23所示。
3.编码权利要求1或2所述广谱纳米抗体的基因。
4.携带权利要求3所述基因的载体、宿主细胞。
5.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1或2所述广谱纳米抗体。
6.权利要求1或2所述的广谱纳米抗体在制备治疗、预防、检测或诊断沙贝病毒的产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产品包括药物、检测试剂、检测试剂盒或活体成像探针。
8.一种SARS-CoV-2S2蛋白表位肽，其特征在于，所述表位肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.28所示。
9.编码权利要求8所述SARS-CoV-2S2蛋白表位肽的基因。
10.含有编码权利要求8所述SARS-CoV-2S2蛋白表位肽的基因的表达载体、宿主细胞。
11.一种抗冠状病毒的广谱疫苗，其特征在于，所述疫苗含有权利要求8所述的SARS-CoV-2S2蛋白表位肽或权利要求9所述基因或权利要求10所述表达载体、宿主细胞。
12.权利要求8所述的SARS-CoV-2S2蛋白表位肽或权利要求9所述基因或权利要求10所述表达载体、宿主细胞在制备冠状病毒广谱疫苗、抗原检测试剂盒、SARS-CoV-2S2蛋白单克隆抗体或双特异性抗体中的应用。
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