CN115073595A - 广谱抗非典、新冠病毒及其突变株的纳米抗体aSA3 - Google Patents
广谱抗非典、新冠病毒及其突变株的纳米抗体aSA3 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种广谱抗非典、新冠病毒及其突变株的纳米抗体aSA3，其包含如SEQ ID NO:2所示的CDR1，如SEQ ID NO:3所示的CDR2，和如SEQ ID NO:4所示的CDR3。该纳米抗体其能够高亲和力结合非典病毒(简称SARS1)和新冠病毒(简称SARS2)的受体结合区(RBD)并强效中和SARS1和SARS2及其突变株。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及用于治疗和诊断用的抗新冠和非典病毒的纳米抗体序列。
背景技术
新冠病毒(SARS-CoV-2，以下简称SARS2)和非典病毒(SARS-CoV，以下简称SARS1)属于沙贝科冠状病毒。SARS2和SARS1均通过其刺突蛋白(spike) 受体结合区域(RBD)与上皮细胞表面的血管紧张素转换酶2(ACE2)结合后进入细胞，完成侵染，靶向RBD的抗体已被证实能够有效中和病毒，但抗体需要克服病毒突变的难题，开发出靶向沙贝病毒保守位点的抗体，将具备抗突变能力。
除了传统抗体外，纳米抗体(又称VHH)在新冠治疗方面也受到广泛关注。由于仅包含重链可变区，纳米抗体的分子量仅13-15kDa，小体积使得它能够识别传统抗体无法靠近的表位，其单域结构也使得其更易进行工程化改造，以进一步提高亲和力和病毒中和能力。此外，纳米抗体还可以雾化后直接进行肺部递送，甚至可以直接通过鼻腔给药，这些给药方式可以缓解医疗资源紧张。目前已经有多个抗新冠的纳米抗体在国内外被报道，但能够结合沙贝病毒保守表位的纳米抗体仅在国外有少量报道，如能够同时结合SARS2和SARS1 RBD的VHH72、Fu2和Nb95，这些纳米抗体结合SARS2和SARS1 RBD的亲和力均不高，且病毒中和活性有限。
本发明为一种高亲和力靶向SARS2和SARS1 RBD纳米抗体，命名为 aSA3，其结合SARS2和SARS1 RBD的亲和力KD值分别为5.19x10-11M 和3.61x10-10M，能够阻断ACE2与SARS2及SARS1 RBD的结合，其 Fc融合蛋白aSA3-Fc能够在体外高效中和SARS1、SARS2及其Beta、Delta 和Omicron BA.1突变株，且能够在仓鼠中起到抗Omicron BA.1的功效。aSA3结合在RBD的核心区，当将aSA3-Fc与另一个靶向RBM表位的纳米抗体aRBD-2融合后形成双表位特异性抗体(aRBD2-aSA3-Fc)，该双表位抗体表现出对Omicron BA.1、BA.2更高的结合亲和力和更强的中和活性，且能在低剂量下通过鼻腔给药预防仓鼠感染Omicron BA.1。
发明内容
本公开提供了能以高亲和力结合SARS2和SARS1 RBD的羊驼源重链抗体可变区序列(VHH)，该可变区序列又称为纳米抗体，其能够用于预防、治疗和/或诊断SARS2和SARS1感染。
发明人采用体外重组表达的SARS2 RBD蛋白对2头小羊驼进行3次免疫，然后分离出外周血淋巴细胞并抽提细胞的总RNA，随后反转录为 cDNA。再以此cDNA为模板，用特异引物扩增出纳米抗体序列并构建噬菌体展示文库，在用SARS1 RBD对文库进行筛选，从而获得多个具备 SARS2 RBD和SARS1 RBD双特异性纳米抗体，其中亲和力最高且 ACE2-RBD阻断能力最强的抗体命名为aSA3，其氨基酸序列如下：
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTSDHYALAWFRQAPGKE REGVSCIDSDGNPFYADSVKGRFTGSRDNAKNTVYLQMNSLKLEDTA VYYCAAGLWYGRSLNSFDYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1)
所述纳米抗体aSA3的3个抗原互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3) 如上划线部分所示，具体地：
CDR1：SGFTSDHYALA(SEQ ID NO:2)
CDR2：EREGVSCIDSDGNPF(SEQ ID NO:3)
CDR3：GLWYGRSLNSFDYD(SEQ ID NO:4)。
具体地，本发明提供了一种纳米抗体或其抗原结合片段，其具有如 SEQ ID NO:2所示的CDR1，如SEQ ID NO:3所示的CDR2，和如SEQ ID NO:4所示的CDR3。该纳米抗体其能够高亲和力结合非典病毒(简称 SARS1)和新冠病毒(简称SARS2)的受体结合区(RBD)，并能阻断血管紧张素转换酶2(ACE2)与RBD的结合；该纳米抗体与人IgG1 Fc融合后能够高亲和力结合SARS2突变株的RBD，能够在体外高效中和 SARS1、野生型(WT)SARS2以及Beta、Delta、Omicron BA.1和Omicron BA.1.1突变株，且能够在仓鼠体内起到抗Omicron BA.1病毒感染的功效。该纳米抗体结合SARS1的表位主要位于RBD的核心区，结合位点包括 SARS1 RBD的L355、Y356、S358、F361、S362、T363、F364、K365、 C366、V394、R395、I489、G490和Y494残基。将该纳米抗体与人IgG1 Fc的融合蛋白的N端通过(GGGGS)4接头蛋白与另一个靶向受体RBD结合基序(RBM)的纳米抗体C端融合后形成一个双表位抗体，该双表位抗体能够更高亲和力地结合WT SARS2、Omicron BA.1和BA.2突变株 RBD，能够更强的中和WT SARS2、Beta、Delta、Omicron BA.1、Omicron BA.1.1和Omicron BA.2突变株；腹腔注射该双表位抗体也能在仓鼠体内起到抗Omicron BA.1感染的功效；此外，该双表位抗体还能以鼻腔给药的方式高效防护仓鼠对Omicron BA.1的感染。
具体地，本发明提供了以下实施方案：
1.纳米抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:2所示的CDR1，如SEQ ID NO:3所示的CDR2，和如SEQ ID NO:4所示的CDR3。
2.根据项目1所述的纳米抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
3.根据项目1或2所述的纳米抗体或其抗原结合片段，其进一步包含 Fc结构域，优选IgG1 Fc结构域，更优选人IgG1 Fc结构域，其中人IgG1 Fc氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
4.双表位抗体，其(例如以N端到C端的顺序)包括纳米抗体aRBD-2 和项目1-3中任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段，其中所述aRBD-2 的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；
优选地，其中所述纳米抗体aRBD-2和所述项目1-3中任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段之间用接头(例如柔性多肽链，例如GS接头，优选(GGGGS)4接头)连接。
5.多核苷酸，其编码根据项目1-3中任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或项目4所述的双表位抗体。
6.表达载体，其包含根据项目5所述的多核苷酸。
7.宿主细胞，其包含项目6所述的表达载体，所述宿主细胞是用于表达外源蛋白的宿主细胞，例如细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
8.药物组合物，其含有项目1-3中任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或项目4所述的双表位抗体，以及药用载体。
9.项目1-3中任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或项目4所述的双表位抗体在制备用于预防、治疗和/或诊断SARS1和/或SARS2感染的试剂盒或药物中的用途。
10.根据项目9所述的用途，其中所述SARS2包括WT SARS2、Alpha、 Beta、Gamma、Kappa、Lambda、Delta、Delta plus及Omicron突变株。
本公开的优点和积极效果
本公开所述的纳米抗体aSA3能够高亲和力结合WT SARS2和SARS1 RBD，亲和力KD值分别为5.19x10-11M和3.61x10-10M，aSA3能够阻断病毒RBD与ACE2之间的结合。将aSA3融合人IgG1 Fc后能提高对WT SARS2和SARS1 RBD的亲和力，KD值分别为7.64x10-12M和8.54x10-11 M。
本公开所述的纳米抗体融合IgG1 Fc后能在体外强效中和SARS1、 SARS2及其突变株。中和SARS1、WT SARS2、Beta、Delta、Omicron BA.1 和BA.1.1突变株的半抑制浓度(IC50)分别是6.78、26.56、40.22、13.32、 127.2和97.87ng/mL。
本公开所述的纳米抗体aSA3融合Fc后以10mg/kg单剂量腹腔给药能够显著降低感染Omicron BA.1突变株的仓鼠气管和肺中的病毒滴度。
本公开所述的纳米抗体aSA3融合Fc后再融合另一个靶向受体RBD 结合基序(RBM)的纳米抗体aRBD-2从而形成双表位抗体aRBD2-aSA3-Fc， aRBD2-aSA3-Fc能够更高亲和力地结合WT SARS2、Omicron BA.1和BA.2 突变株RBD，能够超强中和WT SARS2、Beta、Delta、Omicron BA.1、 Omicron BA.1.1和Omicron BA.2突变株，中和以上病毒的IC50低至个位数纳克每毫升级别；腹腔注射aRBD2-aSA3-Fc也能在仓鼠体内起到抗 Omicron BA.1感染的功效，此外，通过鼻腔低剂量给予aRBD2-aSA3-Fc 即可有效防护仓鼠对Omicron BA.1的感染。
附图说明
图1.本公开所述纳米抗体aSA3的筛选、制备及其阻断ACE2和结合 RBD亲和力的表征结果。(A)单克隆phage ELISA检测所述纳米抗体aSA3 与SARS1和WT SARS2 RBDD的结合(左)和所述纳米抗体aSA3及其 Fc融合蛋白aSA3-Fc的SDS-PAGE电泳结果(右)；(B)ELISA检测aSA3-Fc 与SARS1、WT SARS2及其突变株RBD结合情况；(C)竞争性ELISA 检测aSA3对ACE2结合SARS1和WT SARS2 RBD的阻断情况；(D)和 (E)分别为采用SPR检测aSA3结合WT SARS2和SARS1 RBD的亲和力结果；(F)、(G)、(H)和(I)分别为采用SPR检测aSA3-Fc结合WT SARS2、SARS1、Omicron BA.1和Omicron BA.2RBD的亲和力结果。
图2.aSA3-Fc在体外中和SARS1、SARS2及其突变株病毒的效价。(A)、 (B)、(C)、(D)分别aSA3-Fc对SARS1、BA.1、BA.1.1和BA.2假病毒 (pseudovirus)的中和结果；(E)、(F)、(G)和(H)分别为aSA3-Fc对 WT SARS2、Beta、Delta和Omicron BA.1活病毒(authenticvirus)的中和结果；误差棒表示来自2个独立重复实验的标准差，曲线是采用prism 软件拟合所得。(I)病毒中和IC50值总结。ND表示未检测到中和活性， NT表示未检测。
图3.动物实验检测aSA3-Fc及aRBD2-aSA3-Fc在仓鼠体内的抗 Omicron BA.1功效。(A)实验方案；(B)对照组、预防性腹腔注射给药组及治疗性腹腔注射给药组中仓鼠感染Omicron BA.1 4天后呼吸道和左右肺中病毒RNA拷贝数；(C)不同组中仓鼠感染OmicronBA.1 4天后呼吸道和左右肺中病毒的滴度。*表示显著性差异P小于0.05。
图4.aSA3与SARS1 RBD复合物晶体结构及分析结果。(A)aSA3与 SARS1 RBD复合物结构cartoon展示；(B)aSA3与SARS1 RBD的结合位点展示，圆圈上方的残基为aSA3结合SARS1 RBD的位点。
图5.双表位抗体aRBD2-aSA3-Fc的亲和力表征及病毒中和结果。(A)、 (B)和(C)分别为采用SPR检测aRBD2-aSA3-Fc结合WT SARS2、BA.1 和BA.2RBD的亲和力结果；(D)亲和力KD值总结；(E)aRBD2-aSA3-Fc 中和SARS1、BA.1、BA.1.1和BA.2假病毒的结果；(F)aRBD2-aSA3-Fc 中和WT SARS2、Beta、Delta和BA.1真病毒的结果；(G)病毒中和IC50值总结。
图6.aRBD2-aSA3-Fc通过鼻腔给药对仓鼠感染Omicron BA.1的预防效果。(A)实验设计；(B)仓鼠体重变化情况；(C)对照组和不同剂量鼻腔给药组中仓鼠感染Omicron BA.13天后呼吸道和左右肺中病毒RNA 拷贝数；(D)对照组和不同剂量鼻腔给药组中仓鼠感染Omicron BA.1 3 天后呼吸道和左右肺中病毒滴度。*表示显著性差异P小于0.05，**表示显著性差异P小于0.01，***表示显著性差异P小于0.001。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
实施例1所述纳米抗体aSA3的筛选、制备、ACE2阻断能力检测及其 RBD结合亲和力表征
1)RBD免疫文库构建
采用HEK293F细胞(ATCC，CBP60437)表达纯化的SARS2 RBD (QKV42562.1，aa 321-591)与弗氏佐剂混匀，以500μg/次的剂量皮下注射免疫羊驼三次，每次间隔2星期，共免疫2头6个月大小的母羊驼。第三次免疫2周后，静脉取血并分离血液中的白细胞。采用omegabiotek公司的RNA抽提试剂盒提取总RNA，同时采用DNA酶除去基因组DNA。采用TAKARA公司的PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit对 RNA进行反转录，将RNA反转录为cDNA。采用羊驼VHH特异性引物，用以上cDNA作为模板进行PCR扩增获得VHH的编码基因片段，采用 Gibson assembly的方法将扩增的VHH序列克隆至噬菌粒pR2(MRC Laboratoryof Molecular Biology)的NcoI和NotI位点中，得到的Gibson assembly产物即为初始纳米抗体噬菌粒文库。采用10％甘油洗涤法制备大肠杆菌TG1(MRC Laboratory of MolecularBiology)感受态细胞，然后将以上Gibson assembly产物电转化至TG1感受态细胞中，涂布5块150mm 的LB(含有2％葡萄糖和100μg/mL氨苄青霉素)平板中以扩增噬菌粒文库。刮板后取适量菌液接种200mL 2TY(含2％葡萄糖和100μg/mL氨苄青霉素)培养至对数生长期，加入1012pfu的KM13辅助噬菌体(MRC Laboratory of Molecular Biology)，37℃侵染45分钟，取100mL菌液离心，菌体用200mL的2TY(含0.1％葡萄糖、100μg/mL氨苄青霉素和50 μg/mL卡那霉素)重悬，25℃培养20小时以扩增展示纳米抗体的噬菌体 (phage)。采用PEG沉淀的方法浓缩phage，最终用PBS重悬，冰面保存。
2)纳米抗体aSA3的筛选
采用HEK293F细胞(ATCC，CBP60437)表达纯化SARS1 RBD (YP_009724390.1，aa308-577)，用PBS稀释至0.1mg/mL，取100μL 加入96孔免疫板(Nunc maxsorp plate)的1个孔，4℃包被过夜，同时设置1个无抗原对照孔。采用PBS洗3次，每孔加入300μL MPBS(含 5％脱脂牛奶的PBS)室温封闭2小时。采用PBS洗3次，每孔加入1x1011 pfu以上制备噬菌体文库phage(溶于100μL MPBS)，80rpm室温孵育1 小时。采用PBST(0.1％Tween 20)洗30次。每孔加入100μL浓度为0.5 mg/mL的胰蛋白酶，室温消化1小时，结合在孔中的phage被洗脱，此为第一轮筛选洗脱的phage。将洗脱的phage侵染3mL对数生长期TG1细菌，37℃水浴45分钟，涂布1块150mm LB平板(含2％葡萄糖和100 μg/mL氨苄青霉素)，37℃过夜培养。加入4mL 2TY至以上150mm平板中，将菌落刮下，将菌液混匀后接种100μL至100mL 2TY(含2％葡萄糖和100μg/mL氨苄青霉素)中，培养至对数生长期后加入KM13侵染以完成第一轮洗脱的phage扩增。随后将SARS1 RBD用PBS稀释至0.02 mg/mL，取100μL加入96孔免疫板的1个孔，4℃包被过夜，同时设置 1个无抗原对照孔。采用PBS洗3次，每孔加入300μL MPBS(含5％脱脂牛奶的PBS)室温封闭2小时。采用PBS洗3次，每孔加入1x109pfu 以上扩增的第一轮洗脱phage(溶于100μL MPBS)，80rpm室温孵育1小时。采用PBST(0.2％Tween 20)洗30次。每孔加入100μL浓度为0.5mg/mL 的胰蛋白酶，室温消化1小时，结合在孔中的phage被洗脱，从而完成第二轮筛选。将洗脱的phage侵染TG1并涂布LB平板(含2％葡萄糖和100 μg/mL氨苄青霉素)，培养12小时后形成克隆。
分别从以上2轮筛选洗脱的phage克隆中随机挑取47个单克隆接种至每孔含有100μL 2TY培养基(含2％葡萄糖和100μg/mL氨苄青霉素) 的96孔细胞培养板中，1个克隆1个孔，37℃、250rpm震荡培养12小时。转移5μL以上菌液至新的每孔含有200μl 2TY培养基(含2％葡萄糖和100μg/mL氨苄青霉素)的96孔板中进行培养(剩余的菌液加入终浓度为15％甘油，-80℃储存)，37℃、250rpm震荡培养1.5小时至OD600 为约0.5，每孔吸除100μL菌液。每孔加入50μL含有4×108pfu KM13 的2TY，混匀，37℃孵育45分钟。3500g离心10分钟，弃上清，沉淀用200μL含有0.1％葡萄糖、100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的2TY重悬，25℃、250rpm震荡培养20小时。3500g离心10分钟，取75μL上清转移至每孔含有225μL MPBS的96孔板的孔中，混匀，4℃暂存备用，至此单克隆噬菌体制备完成。
将SARS2 RBD蛋白(QKV42562.1，aa 321-591)和SARS1 RBD蛋白(YP_009724390.1，aa 308-577)用PBS稀释至1μg/mL，分别取100μL/ 孔对96孔免疫板进行包被，另外设置空白对照(PBS孔)，4℃包被过夜。用PBS洗3次，每孔加入300μL MPBS，室温封闭2小时。每孔加入以上制备phage MPBS混合液100μL，室温孵育1小时。采用PBST洗板4 次。采用MPBS适度稀释HRP-anti M13抗体(义翘神州)，分别加100μL 至以上免疫板的各孔中，室温孵育1小时。采用PBST洗板4次。每孔加入100μL TMB显色底物(碧云天)，用铝箔纸包好避光，室温反应5分钟。每孔加入50μL的1M H2SO4终止反应，测量OD450nm值。将所有 OD450nm值大于1的阳性克隆送公司进行测序，分析比对测序结果，获得 aSA3序列，其单克隆phage ELISA结果如图1A(左)所示。
3)纳米抗体aSA3及其Fc融合蛋白的制备
设计引物，将所述纳米抗体aSA3的基因序列N端融合IFNα蛋白信号肽以引导分泌表达，C末端融合人IgG1 Fc，同时在它们之间引入一个 TEV酶切位点或(GGGGS)3接头，随后克隆至哺乳动物表达载体pTT5 (NRC Biotechnology Research Institute)中。将构建的载体分别用PEI瞬时转染哺乳动物细胞HEK293F(ATCC)中，培养3天后收集上清，采用Protein A柱子对上清中的融合蛋白进行纯化，进行SDS-PAGE电泳，结果如图1A(右)所示，从上清中，我们获得了高纯度的aSA3-Fc融合蛋白。采用TEV酶切(带有6His标签)带有TEV位点的aSA3-Fc融合蛋白，随后将酶切产物分别流过Protein A和镍柱，从而分别除去未酶切完全的蛋白、Fc和TEV酶，收集流穿，浓缩后进行SDS-PAGE电泳，结果如图1A(右) 所示，从流穿中，我们获得了高纯度的aSA3纳米抗体蛋白。
采用非竞争性ELISA初步表征所述纳米抗体aSA3的Fc融合蛋白与 SARS2及SARS1RBD的结合情况：将SARS2及SARS1 RBD用PBS稀释至2μg/mL，每个孔分别加100μL用于包被，经过常规洗涤和封闭后，依次添加1:4梯度稀释的aSA3-Fc融合蛋白和ACE2-Fc蛋白(将人ACE2 的aa 19-615段融合人IgG1 Fc后采用HEK293F细胞进行分泌性表达，随后采用Protein A纯化)溶液，在室温下孵育1小时。洗涤后，加入HRP 偶联的抗IgG1 Fc抗体(北京义翘神州)检测结合的aSA3-Fc和ACE2-Fc，结果如图1C所示，aSA3-Fc与SARS2及SARS1 RBD亲和力均高于 ACE2-Fc，aSA3-Fc与SARS2及SARS1 RBD结合的EC50分别是0.69和 2.24nM。
4)纳米抗体aSA3及其Fc融合蛋白的阻断功能和结合表征
采用ELISA表征所述纳米抗体aSA3的Fc融合蛋白与不同SARS1、 SARS2及其突变株RBD的结合情况：将SARS1、SARS2及突变株的RBD (北京义翘神州)蛋白用PBS稀释至2μg/mL，每个孔100μL加入免疫板中进行包被，经过洗涤和封闭后，加入1:3梯度稀释的aSA3-Fc融合蛋白溶液，在室温下孵育1小时。洗涤后，加入HRP偶联的抗人IgG1 Fc 的二抗(北京义翘神州)。孵育1小时，洗涤后加入TMB显色，并加入硫酸终止，检测OD450值，对OD450值和浓度进行拟合分析，结果如图1B 所示，aSA3-Fc能够高亲和力结合SARS1 RBD和WT SARS2 RBD，结合 EC50值分别为0.870和0.618nM；aSA3-Fc对Alpha、Beta、Gamma、Kappa、 Lambda、Delta和Delta plus突变株RBD的结合EC50值与其对WT RBD 的结合EC50值接近，但对Omicron BA.1突变株RBD的结合EC50升高至 1.312nM，表明aSA3对RBD的结合位点可能位于Omicron BA.1的突变位点中。
采用竞争性ELISA的方法对筛选所得的纳米抗体阻断功能进行表征。分别将串联重复的SARS2 RBD(即，SARS2 RBD-tr2)和串联重复的SARS1 RBD(即，SARS1 RBD-tr2)(安徽智飞生物)用PBS稀释至1μg/mL，每个孔加100μL用于包被，经过常规洗涤和封闭。将ACE2-Fc稀释至10nM，然后用该ACE2-Fc溶液去依次1:4梯度稀释纳米抗体aSA3的Fc融合蛋白，每个梯度的混合物取100μL分别加入包被抗原的孔中，室温孵育1 小时。洗涤4次后加入HRP偶联的抗IgG1 Fc抗体(北京义翘神州)检测结合的ACE2-Fc，结果如图1C所示，aSA3能有效阻断ACE2-Fc与SARS2 和SARS1 RBD的结合，IC50分别是2.567和0.433nM。
采用SPR表征所述纳米抗体aSA3及其Fc融合蛋白与SARS2及 SARS1 RBD之间的亲和力：分别将SARS2及SARS1 RBD蛋白溶于pH 4.5 的醋酸钠，偶联至CM5芯片的一个通道上，同时设置一个不偶联蛋白的对照通道，随后采用乙醇胺封闭。将所述纳米抗体及其Fc融合蛋白按1:1 用PBS稀释，随后分别以30μL/分钟的速度流过以上2个通道，同时检测信号值(RU)。在一个循环完成后，采用50mM的NaOH洗掉结合的抗体以再生芯片。所有操作均在Biacore系统上完成，采用Biacore evaluation 程序对结果进行分析。如图1D-I所示，aSA3与SARS2及SARS1 RBD结合的亲和力KD值分别为51.9和361pM；aSA3的Fc融合蛋白与SARS2及SARS1 RBD结合的亲和力KD值分别为7.64和85.4pM；与ELISA结果一致，aSA3-Fc对Omicron BA.1RBD的亲和力下降至KD值为1.88nM，对Omicron BA.2RBD的亲和力下降至KD值为5.52nM。
实施例2表征所述纳米抗体aSA3的Fc融合蛋白体外中和SARS1、SARS2 及突变株的效力
采用假病毒中和实验检测aSA3-Fc及对照抗体Sotrovimab(葛兰素史克公司生产，获自北京生物工程研究所)和Nb21-Fc(将纳米抗体Nb21 与人IgG1 Fc串联表达，Nb21抗体序列参见已发表论文：Science.2020 Dec 18；370(6523):1479-1484.)对SARS1的中和效力。ACE2-293T细胞(义翘神州)按每孔2x104接种在96孔板中过夜培养。aSA3-Fc用含有10％FBS 的DMEM连续梯度稀释，随后加入等体积的含有SARS1假病毒(获自北京生物工程研究所，加入的病毒量为1500000RLU)的溶液，37℃下孵育1小时，去除细胞培养基上清，加入假病毒-抗体混合物100μL，随后培养3天。裂解细胞并加入发光液，用酶标仪检测萤火虫荧光的强度，计算抑制率，用prism软件对结果进行拟合，获得IC50值。结果如图2A和I 所示，aSA3-Fc能强效中和SARS1假病毒，IC50值为6.78ng/mL，其中和效力是对照抗体Sotrovimab的3.9倍。不能结合SARS1 RBD的Nb21-Fc 未显示中和作用。采用类似的方法显示，aSA3-Fc能强效中和Omicron BA.1 及BA.1.1假病毒(获自北京生物工程研究所)，IC50分别为127.2和97.87 ng/mL。aSA3-Fc中和BA.1的效价与Sotrovimab的相当，其中和BA.1.1 的效价与比Sotrovimab高约2倍；但aSA3-Fc对BA.2假病毒的中和活性较低，IC50为约5.7μg/mL，中和活性比Sotrovimab低7.7倍；Nb21-Fc失去了对Omicron突变株的中和活性(图2B-D和I)。
采用成斑减少中和实验检测aSA3-Fc及对照抗体Nb21-Fc对SARS2 及其Beta、Delta及Omicron BA.1变异株活病毒的中和效力。本实验在生物安全3级实验室中进行，将Vero E6细胞(ATCC)以每孔1.5x105个接种在24孔培养板中过夜培养。aSA3-Fc用含有2.5％FBS的DMEM 连续梯度稀释。随后加入等体积的600PFU/ml SARS2及其变异株(中国科学院武汉病毒研究所)，将抗体和病毒混合物在37℃下孵育1小时。然后，将混合物加入到Vero细胞表面。只加病毒不加抗体的细胞为阴性对照。在37℃下孵育1小时后，去除抗体-病毒混合物，并加入含有2.5％ FBS和0.9％羧甲基纤维素的DMEM。培养3天后，平板用8％多聚甲醛固定，用0.5％结晶紫染色，检测成斑数量，计算抑制率并对结果进行拟合，获得IC50值。结果如图2E-I所示，aSA3-Fc中和原始SARS2、Beta、 Delta及Omicron BA.1突变株活病毒的IC50分别是26.56、40.22、13.32和 32.44ng/mL；尽管对照抗体Nb21-Fc中和WT SARS2和Delta的效力比 aSA3-Fc分别强5.9和5.4倍，但其不能中和Beta及Omicron BA.1突变株。
实施例3在体内表征所述纳米抗体aSA3的Fc融合蛋白对仓鼠感染 Omicron突变株时的预防和治疗效果
此实验在生物安全三级实验室(简称P3实验室)开展，评估抗体在叙利亚黄金地鼠体内对新冠感染的预防和治疗效果(操作步骤参见图3A)。为评估预防效果，先将抗体(10mg/kg剂量，合计体积100μL)注射到仓鼠 (武汉生物制品所)腹腔中，24小时后将仓鼠麻醉，通过鼻腔感染1x104 PFU Omicron BA.1活病毒，然后连续饲养4天，将仓鼠安乐死并剖杀，取气管组织和左右肺组织并检测其中的病毒RNA拷贝数和活病毒滴度含量。给药组每组包含5只仓鼠，未给药的对照组包含6只仓鼠。
病毒RNA拷贝数检测采用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen)试剂盒，按说明书检测。病毒滴度采用成斑实验(plaque assay)检测，将动物组织研磨后离心的上清用含2.5％FBS的DMEM连续10倍稀释，加入培养有1.5x105/孔Vero E6细胞(ATCC)的24孔板中，在37℃孵育1 小时后吸除上清，更换含有2.5％FBS和0.9％羧甲基纤维素的DMEM培养3天。用8％多聚甲醛固定细胞，用0.5％结晶紫染色，计数成斑数量来计算病毒滴度。结果如图3B和图3C所示，结果显示，预防性和治疗性给予10mg/kg的aSA3-Fc(单剂量腹腔注射)能够有效降低感染Omicron BA.1 四天后仓鼠的呼吸道和肺组织中的病毒RNA拷贝数；更重要的是，在给药组中，这些组织中已无法检测到活病毒，而未给药的对照组依然存在大量的活病毒。
实施例4所述纳米抗体aSA3与SARS1 RBD的复合物结构解析
将aSA3与SARS1 RBD-tr2(即，串联重复的SARS1 RBD)孵育(摩尔比1.2:1)制备复合物，采用superdex200分子筛纯化复合物，采用超滤管将复合物浓缩至20mg/mL。随后利用晶体筛选机器人用坐滴法大规模筛选结晶条件，利用蒸汽扩散悬滴法以获得高质量单晶，最终的结晶溶液为0.2M Li acetate,cacodylate pH 6.5,20％PEG6000。将晶体捞出至防冻液，液氮冻存，在上海光源同步辐射加速器对复合物晶体进行衍射，收集数据，利用XDS、HKL2000处理数据，以相似序列的已发表的RBD及纳米抗体结构作为模板，在CCP4程序中用分子置换法解析相位，随后用WinCoot 及phenix refine完成复合物结构的修正。根据结构模型，分析结合界面，揭示互作位点。结果如图4A和B所示，aSA3主要结合在SARS1 RBD的核心区域，SARS1 RBD与其相互作的位点为L355、Y356、S358、F361、 S362、T363、F364、K365、C366、V394、R395、I489、G490和Y494。
实施例5表征双表位抗体aRBD2-aSA3-Fc的亲和力及体外中和病毒效价
根据结构信息，我们将aSA3-Fc的N端通过(GGGGS)4接头与另外一个靶向不同表位的纳米抗体aRBD-2的C端融合，形成双表位抗体 aRBD2-aSA3-Fc，接头的长度允许aSA3和aRBD-2同时结合在一个RBD 上。采用pTT5载体(NRC Biotechnology Research Institute)进行表达，并用Protein A进行纯化。随后我们再次采用SPR检测了aRBD2-aSA3-Fc 与WTSARS2的结合亲和力，结果如图5A-D所示，aRBD2-aSA3-Fc与 WT SARS2 RBD的亲和力KD值为0.358pM，比aSA3-Fc的高21.3倍； aRBD2-aSA3-Fc与Omicron BA.1和BA.2的亲和力KD值分别为306pM 和894pM，分别比aSA3-Fc的高6.1和6.2倍。
我们同样采用假病毒和真病毒检测了aRBD2-aSA3-Fc对SARS1及 SARS2及其突变株的中和活性，如图5E和G所示，aRBD2-aSA3-Fc中和 Omicron BA.1、BA.1.1和BA.2假病毒IC50分别为4.00、3.16和7.17ng/mL，分别比aSA3-Fc强31.8、31.0和793.3倍。如图5F和G所示，aRBD2-aSA3-Fc 中和WT SARS2、Beta、Delta和Omicron BA.1真病毒IC50分别为10.08、4.59、2.57和5.32ng/mL，分别比aSA3-Fc强2.6、8.8、5.2和6.1倍。
实施例6表征双表位抗体aRBD2-aSA3-Fc在仓鼠体内的抗病毒活性
我们首先评估了aRBD2-aSA3-Fc通过腹腔注射途径给药时对仓鼠感染OmicronBA.1的预防和治疗性保护效果，结果如图3B和C所示，腹腔注射10mg/kg剂量aRBD2-aSA3-Fc能够有效防护和治疗感染BA.1的仓鼠，在感染四天后，给药组仓鼠的呼吸道和肺组织中的病毒RNA拷贝数降低，且这些组织中已无法检测到活病毒，而未给药的对照组依然存在大量的活病毒。同时我们检测了通过鼻腔途径给药时aRBD2-aSA3-Fc对仓鼠感染 Omicron BA.1的预防效果。为评估预防效果，将4个不同剂量的抗体(5、 2、1和0.5mg/kg，体积50μL)分别注射到麻醉仓鼠(武汉生物制品所) 鼻腔中，3h后通过鼻腔感染1x104PFU Omicron BA.1活病毒，分别在感染后24和48小时各给药一次，感染3天后将仓鼠安乐死并剖杀，取气管组织和左右肺组织并检测其中的病毒RNA拷贝数和活病毒滴度含量(图 6A)。每个剂量组及对照组分别包含5只仓鼠。结果显示，4个剂量的给药组仓鼠生长速度均显著比对照组快(图6B)，且4个剂量的给药组仓鼠呼吸道和肺组织中的病毒RNA水平均显著低于对照组(图6C)，且4个剂量的给药组仓鼠呼吸道和肺组织中均未检测到活病毒(图6D)。这说明，即使在0.5mg/kg剂量下，通过鼻腔给药3次，能保护仓鼠对Omicron BA.1 的感染。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.纳米抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:2所示的CDR1，如SEQ ID NO:3所示的CDR2，和如SEQ ID NO:4所示的CDR3。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的纳米抗体或其抗原结合片段，其进一步包含Fc结构域，优选IgG1 Fc结构域，更优选人IgG1 Fc结构域，其中人IgG1 Fc氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
4.双表位抗体，其(例如以N端到C端的顺序)包括纳米抗体aRBD-2和权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段，其中所述aRBD-2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；
优选地，其中所述纳米抗体aRBD-2和所述权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段之间用接头(例如柔性多肽链，例如GS接头，优选(GGGGS)4接头)连接。
5.多核苷酸，其编码根据权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求4所述的双表位抗体。
6.表达载体，其包含根据权利要求5所述的多核苷酸。
7.宿主细胞，其包含权利要求6所述的表达载体，所述宿主细胞是用于表达外源蛋白的宿主细胞，例如细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
8.药物组合物，其含有权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求4所述的双表位抗体，以及药用载体。
9.权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求4所述的双表位抗体在制备用于预防、治疗和/或诊断SARS1和/或SARS2感染的试剂盒或药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述SARS2包括WT SARS2、Alpha、Beta、Gamma、Kappa、Lambda、Delta、Delta plus及Omicron突变株。
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|---|---|---|---|---|
| CN116284359A (zh) * | 2023-02-11 | 2023-06-23 | 四川大学 | 两种靶向新冠病毒s2亚基茎螺旋表位的广谱中和纳米抗体及其潜在应用 |
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