CN115772218B - 两种靶向新冠病毒s蛋白受体结合区的泛变异株广谱中和纳米抗体及其潜在应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了两种靶向新冠病毒S蛋白受体结合区的泛变异株广谱中和纳米抗体及其潜在应用，属于生物医药领域。本发明筛选到了两个靶向SARS‑CoV‑2S‑RBD不同表位的泛变异株广谱中和纳米抗体，对当前流行的SARS‑CoV‑2变异株均具有广泛的结合能力以及中和活性。同时，本发明分别获得了这两个中和纳米抗体与SARS‑CoV‑2S‑RBD蛋白的复合物晶体结构，通过对结构的比对分析，揭示了两种不同的中和机制。本发明依据结构将这两个中和纳米抗体改造为双特异性的异源四聚化抗体(Nb‑X2‑Fc)，改造后抗体对SARS‑CoV‑2的泛变异株广谱中和活性得到大幅度提高，是预防和治疗SARS‑CoV‑2感染的有效药物候选。

Description

两种靶向新冠病毒S蛋白受体结合区的泛变异株广谱中和纳 米抗体及其潜在应用

技术领域

本发明涉及两种靶向新冠病毒S蛋白受体结合区的泛变异株广谱中和纳米抗体及其潜在应用，属于生物医药领域。

背景技术

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2,SARS-CoV-2)与严重急性呼吸综合征冠状病毒(Severe acuterespiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)的基因组具有很高的相似性，继SARS-CoV和中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)之后，成为第三种能够感染人类且引起大流行的冠状病毒。

SARS-CoV-2类属于β冠状病毒属，和其它人畜共患的冠状病毒一样，病毒颗粒呈球状，囊膜表面均匀分布有多个稀疏的棒状突起，称为刺突糖蛋白(spike protein,S)。S蛋白以同源三聚体的形式分布于病毒粒子表面，由S1和S2两个亚基组成，能够与宿主细胞相互作用，完成病毒的吸附与入侵。与SARS-CoV相同，SARS-CoV-2的吸附过程也主要通过S1亚基中的受体结合域(receptor binding domain,RBD)与宿主受体细胞表面的血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)的相互作用来完成。随后，在低pH环境的诱导下，S2亚基中的七肽重复区1(heptad repeat 1，HR1)与七肽重复区2(heptad repeat 2,HR2)发生剧烈的构象变化来介导病毒囊膜与宿主细胞膜的融合，进而完成病毒的入侵。因此，S蛋白是重要的抗病毒药物靶点，也是药物治疗和疫苗研发的关键。而在S蛋白中，其与受体结合的过程可作为干预病毒和宿主细胞之间相互作用、进而阻断病毒侵入的重要靶标，因此，S-RBD则成为了单克隆抗体设计的主要靶向位点，这些抗体可以直接或者间接阻断S-RBD与ACE2受体的相互作用来干扰病毒的入侵过程，从而达到抗病毒的效果。

尽管目前已经开发了多种抗体类药物来对抗COVID-19，然而，随着SARS-CoV-2的不断传播，病毒也在不停的发生变异，其中S蛋白是病毒结构蛋白中最易发生突变的蛋白之一，而位于S-RBD上的突变则会不同程度的影响到与原有中和抗体的特异性结合。因此，这些陆续出现的变异毒株(包括Beta毒株、Gamma毒株、Delta毒株、Omicron毒株等)容易产生免疫逃逸，使得多种抗体类药物的疗效降低甚至完全丧失。特别是当下传播范围最广的Omicron突变株，只有对靶向其S-RBD的CR3022位点或S309位点的抗体还一定程度上保留原有的结合能力，而对靶向RBS-A、RBS-B、RBS-C和RBS-D等位点的抗体则表现出了明显的中和逃逸。因此，开发能够广谱中和包括Omicron在内的现有变异株以及未来可能出现的新的变异株的泛变异株抗病毒中和抗体，仍然是当下的迫切需求。

纳米抗体(又称VHH抗体)是源自于骆驼科或者软骨鱼类的只含有单一重链可变区的抗原结合片段。由于纳米抗体为单域抗体，与传统的两条链抗体相比，纳米抗体具有多个独特的优势，如分子量更小(～15kDa，约为传统抗体的十分之一)、结构简单，均一性好、热稳定性和溶解度更高、组织渗透性更好、能够在多种表达系统中大量表达等。因此，纳米抗体已成为替代传统抗体的最优选择之一。目前，一些靶向SARS-CoV-2S-RBD的中和纳米抗体也已经陆续被鉴定出来，但是随着SARS-CoV-2的不断变异，这些纳米抗体会不同程度的被变异株所逃逸，绝大部分的广谱性欠佳。因此，鉴定新的泛变异株广谱中和纳米抗体，是搭建新冠药物储备库所必需的。

纳米抗体是只含有一个重链可变区的单域抗体，与传统抗体相比具有多个独特的优势，如体积更小、稳定性与抗降解性能更强、组织穿透性更好、表达量高，易于低成本、高效的微生物生产等。纳米抗体由于分子量小且性质稳定，所以更容易通过一些生物工程相关的技术手段进行改造，转化成为双价或者多价形式，以提高其本身的抗病毒特性。此外，纳米抗体凭借其可雾化吸入这一强大的物理化学特性，在阻断呼吸道病毒入侵方面发挥了极大优势。因此，高效抗SARS-CoV-2的纳米抗体的发展可以为多用途、成本效益高的治疗和即时诊断方法提供一种新的备选。

目前，一些研究小组已经报道了一些靶向SARS-CoV-2S-RBD的中和纳米抗体。总的来讲，首先以SARS-CoV-2S-RBD为抗原免疫羊驼从而获得S-RBD特异性纳米抗体库，其次通过ITC、SPR、BLI、病毒中和实验等一系列生物化学手段筛选和鉴定出具有中和活性的纳米抗体，随后通过结构生物学手段解析其结构，从分子水平上分析该纳米抗体的中和机制。除此之外，也有一部分研究进一步将纳米抗体进行了异源或同源的多聚化改造，以提高其原有纳米抗体的生化特性。然而随着Omicron等变异株的广泛传播，这些被报道的纳米抗体对这些新突变株的中和效力如何则需要进一步评估。

发明内容

如上所述，随着SARS-CoV-2变异株的不断出现，先前所开发的中和抗体或者中和纳米抗体与突变株S-RBD的结合或多或少都会受到影响，有些甚至完全丧失结合能力，这就使得先前的多种抗体类药物的抗病毒效果大打折扣。因此，开发具有广谱中和活性的抗病毒药物，成为了当下持续且迫切的需求。而本发明成功筛选到了两个靶向SARS-CoV-2S-RBD不同表位的泛变异株广谱中和纳米抗体，能够广泛结合突变体S-RBDs且中和SARS-CoV-2突变株的感染。此外通过异源多聚化改造，其泛变异株广谱中和活性得到了大幅度提高，为预防或治疗当下以及未来可能出现的SARS-CoV-2新变种感染的抗体药物制备提供了结构基础和有力备选。

本发明提供了一种抗SARS-CoV-2的纳米抗体，如(a)～(e)任一所示：

(a)Nb-015，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(b)Nb-021，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(c)Nb-015和Nb-021构成的双抗体，利用柔性linker连接Nb-021的C末端与Nb-015的N末端；

(d)含有(a)～(c)任一所示纳米抗体的抗体融合蛋白，所述抗体融合蛋白具有抗SARS-CoV-2活性；

(e)(a)～(c)任一所示纳米抗体的衍生物，所述衍生物包括在(a)～(c)任一所示抗体的基础上经过取代、缺失、添加一个或几个氨基酸或结合小分子药物且具有抗SARS-CoV-2活性的由(a)～(c)任一所示抗体衍生的抗体衍生物。

在一种实施方式中，在(c)中，所述柔性linker为(GGGGS)₄。

在一种实施方式中，在(c)中，Nb-015的C末端通过柔性linker连接Human IgG1 Fctag；所述Human IgG1 Fc tag的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在一种实施方式中，所述Nb-015的C末端通过GGGGS连接Human IgG1 Fc tag。

在一种实施方式中，在(c)中，所述双抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一种实施方式中，在(e)中，所述抗体衍生物包括抗体药物偶联，人源化抗体或抗体融合蛋白。

本发明提供了编码上述纳米抗体的基因。

本发明提供了携带上述基因的载体。

本发明提供了携带上述基因或上述载体的宿主细胞。

本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有上述纳米抗体。

在一种实施方式中，所述药物组合物还含有药学上可接受的赋形剂。

在一种实施方式中，所述赋形剂包括黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂。

本发明提供了所述纳米抗体在制备抗SARS-CoV-2药物中的应用。

在一种实施方式中，所述SARS-CoV-2包括原始毒株和突变毒株。

本发明提供了所述纳米抗体在制备SARS-CoV-2检测试剂盒中的应用。

在一种实施方式中，所述应用不以疾病的诊断或治疗为目的。

在一种实施方式中，所述SARS-CoV-2包括原始毒株和突变毒株。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒中含有所述纳米抗体或上述药物组合物。

有益效果：

1、本发明筛选到了两个靶向SARS-CoV-2S-RBD不同表位的泛变异株广谱中和纳米抗体，能够广泛结合SARS-CoV-2突变体S-RBDs且广谱中和SARS-CoV-2突变体感染，对当前流行的SARS-CoV-2变异株均具有广泛的结合能力以及中和活性。

2、本发明分别获得了这两个中和纳米抗体与SARS-CoV-2S-RBD蛋白的复合物晶体结构，通过对结构的比对分析，揭示了两种不同的中和机制。

3、本发明依据结构将这两个中和纳米抗体改造为双特异性的异源四聚化抗体(Nb-X2-Fc)，改造后抗体对SARS-CoV-2的泛变异株广谱中和活性得到大幅度提高，是预防和治疗SARS-CoV-2感染的有效药物候选。

附图说明

图1：SARS-CoV-2S-RBD蛋白凝胶过滤层析图谱以及SDS-PAGE分析；分子筛图中线为280nm处吸收值，SDS-PAGE表示图谱中的SARS-CoV-2S-RBD蛋白纯度。

图2：纳米抗体的凝胶过滤层析图谱以及SDS-PAGE分析；分子筛图中线为280nm处吸收值，SDS-PAGE分别表示对应图谱中纳米抗体的纯度。

图3：单点浓度Elisa结合实验验证纳米抗体与SARS-CoV-2S-RBD的结合；ACE2蛋白为阳性对照，PBS为阴性对照。

图4：合胞体形成抑制实验；A：Nb-015和Nb-021抑制合胞体形成结果。B：其余16个纳米抗体抑制合胞体形成结果。Mock：HEK293T-S/EGFP细胞与HEK293T-ACE2细胞直接混合形成的合胞体，未加入任何重组蛋白。EGFP：单独的HEK293T-S/EGFP细胞。

图5：梯度浓度Elisa结合实验鉴定Nb-015和Nb-021与SARS-CoV-2S-RBD的结合能力；ACE2蛋白为阳性对照，GST蛋白为阴性对照。

图6：Nb-015和Nb-021结合SARS-CoV-2S-RBD的表面等离子共振动力学曲线。

图7：Nb-015和Nb-021竞争结合SARS-CoV-2S-RBD的SPR动力学曲线。

图8：Nb-015和Nb-021结合SARS-CoV-2突变株S-RBD的表面等离子共振动力学曲线。

图9：Nb-015和Nb-021靶向SARS-CoV-2原始株以及突变株假病毒的中和曲线。

图10：SARS-CoV-2S-RBD蛋白与纳米抗体Nb-015共孵育后的凝胶过滤层析图谱与SDA-PAGE分析；主峰为Nb-015/S-RBD复合物蛋白，SDS-PAGE标示对应标号样品的蛋白纯度。

图11：中和纳米抗体Nb-015与SARS-CoV-2S-RBD的复合物结构。

图12：SARS-CoV-2S-RBD蛋白与纳米抗体Nb-021共孵育后的凝胶过滤层析图谱与SDA-PAGE分析；主峰为Nb-021/S-RBD复合物蛋白，SDS-PAGE标示对应标号样品的蛋白纯度。

图13：中和纳米抗体Nb-021与SARS-CoV-2S-RBD的复合物结构。

图14：Nb-X2-Fc蛋白的凝胶过滤层析图谱以及SDS-PAGE分析。SDS-PAGE标示对应标号样品的蛋白纯度。

图15：Nb-X2-Fc靶向SARS-CoV-2原始株以及突变株假病毒的中和曲线。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1SARS-CoV-2S-RBD的表达及纯化

(1)构建质粒

在SARS-CoV-2S-RBD蛋白编码序列的N端依次引入gp67信号肽(氨基酸序列如SEQIDNO.5所示)、Trx标签、His标签和EK酶酶切位点(两个蛋白标签和EK酶酶切位点的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)编码序列分别用于促进蛋白的分泌，可溶性表达，体外纯化以及标签切除，同时在编码序列C端引入翻译终止密码子。随后将这一编码序列利用BamH I和Hind III酶切位点通过同源重组的方法克隆进pFastBac1载体中，得到重组质粒pFastBac1-SARS-CoV-2S-RBD。重组质粒通过菌液PCR鉴定、双酶切鉴定和基因测序等验证插入的外源片段是否完全正确。

(2)蛋白表达和纯化

通过Bac-to-Bac杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达S-RBD蛋白。

将步骤(1)中构建好的重组质粒pFastBac1-SARS-CoV-2S-RBD转化至DH10Bac感受态细胞中，随后均匀涂布于三抗LB平板(含50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环素以及100μg/mLBluo-gal和40μg/mL IPTG)，37℃培养48h后，进行蓝白斑筛选和PCR鉴定，得到阳性克隆后，将阳性克隆进行扩增培养后，使用异丙醇沉淀法提取阳性重组杆粒Bacmid-SARS-CoV-2S-RBD。

将得到的重组杆粒Bacmid-SARS-CoV-2S-RBD转染sf9细胞，转染72h后获得P1代重组杆状病毒，将P1连续扩增3代后得到高滴度的P4代重组杆状病毒。用P4感染sf9细胞，72h后收取细胞上清，离心过滤后与5-mLHis-Trap预装柱(GE Healthcare)于4℃过夜结合。结合完毕后通过咪唑梯度洗脱尽量去除杂蛋白，最后以洗脱缓冲液(20mM Tris,pH 8.0,150mMNaCl,250mM imidazole)洗脱目的蛋白。收集洗脱后的目的蛋白并加入EK酶过夜酶切以切除重组蛋白N端所带的Trx以及His蛋白标签，随后通过Superdex 200Increase 10/300GL凝胶过滤层析柱(GE Healthcare)对S-RBD蛋白进行精细纯化，并将纯化后的蛋白换液至SEC buffer(10mM HEPES,pH 7.5,150mM NaCl)中。S-RBD蛋白在凝胶过滤层析中的洗脱峰峰形单一，表明其在溶液中均一性良好，且SDS-PAGE鉴定显示S-RBD蛋白纯度可达99％以上，可以用于后续的羊驼免疫和纳米抗体的筛选与鉴定。SARS-CoV-2S-RBD蛋白的凝胶过滤层析图谱以及SDS-PAGE结果如图1所示。

实施例2SARS-CoV-2S-RBD特异性纳米抗体库的构建

(1)免疫动物

将实施例1中构建的SARS-CoV-2S-RBD蛋白作为抗原免疫羊驼。免疫第0天，在弗氏佐剂(CFA)存在的条件下，用0.5mg SARS-CoV-2S-RBD蛋白对羊驼进行皮下免疫，在免疫第21天和42天，分别在弗氏不完全佐剂(IFA)存在的条件下皮下接种0.25mg S-RBD蛋白，在免疫第49天，采集50mL免疫羊驼血液。

(2)纳米抗体噬菌体文库的构建

从免疫后的羊驼血中分离外周血单个核细胞，并从单个核细胞中纯化RNA。将纯化到的RNA反转录为cDNA并通过PCR扩增，随后从扩增产物中纯化VHH片段，构建至pComb3XSS载体中。将重组载体电转至TG1感受态细胞中制备噬菌体文库，随后通过筛选得到单个噬菌体克隆并检测其与S-RBD的初步结合。

实施例3SARS-CoV-2S-RBD特异性纳米抗体的筛选与鉴定

(1)构建质粒

从通过羊驼免疫所获得的SARS-CoV-2S-RBD特异性纳米抗体噬菌体文库中随机选择18个纳米抗体(依次命名为Nb-011～Nb-028)，分别在其基因编码序列的C端引入His标签以及翻译终止密码子，随后利用BamH I和Hind III酶切位点通过同源重组的方法将此基因片段克隆至pNCMO2载体中，获得一系列重组质粒pNCMO2-Nb-011～pNCMO2-Nb-028。重组质粒通过菌液PCR鉴定、双酶切鉴定和基因测序等验证插入的外源片段是否完全正确。

(2)蛋白表达和纯化

将构建好的重组质粒分别电转至Brevibacillus choshinensis SP3感受态细胞(阿帕克生物科技有限公司)中，涂布于MTN平板(阿帕克生物科技有限公司)，37℃培养过夜，随后挑取单菌落进行大规模培养，在表达72h后，收取菌液上清。离心过滤后与Ni-TEDNUPharose FF beads(NUPTEC)于4℃结合2h。结合完毕后通过咪唑梯度洗脱尽量去除杂蛋白，最后以洗脱缓冲液(10mM HEPES,pH 7.5,150mM NaCl,250mM imidazole)洗脱目的蛋白。收集洗脱后的目的蛋白通过Superdex^TM 7510/300GL凝胶过滤层析柱(GE Healthcare)进行精细纯化，并将纯化后的纳米抗体换液至SEC buffer(10mM HEPES,pH 7.5,150mMNaCl)中。纳米抗体在凝胶过滤层析中的洗脱峰峰形单一且对称，说明其在溶液中的均一性良好，且SDS-PAGE鉴定显示纳米抗体的纯度可达99％以上。纳米抗体的凝胶过滤层析图谱以及SDS-PAGE结果如图2所示。

(3)ELISA验证纳米抗体与SARS-CoV-2S-RBD的特异性结合

a.将实施例1中制备的SARS-CoV-2S-RBD蛋白稀释至pH 9.6的碳酸盐缓冲液中，以200ng/孔的浓度包被酶标板，4℃包被过夜。

b.第二天，弃去包被液，1×PBST(含0.05％Tween 20的1×PBS溶液)洗涤3次，随后加入封闭液(含有5％脱脂牛奶的1×PBST溶液)于室温封闭1.5h。

c.弃去封闭液，1×PBST洗涤3次后，分别加入2μg/mL的步骤(2)制备的纳米抗体，100μL/孔，37℃孵育1.5h；其中，设置阳性对照(2μg/mL的ACE2蛋白，NCBI编号为BAB40370.1)，设置阴性对照(PBS)。

d.用1×PBST洗涤3次后，加入HRP直联的anti-His抗体(1：5000稀释，Proteintech)，50μL/孔，37℃孵育1h。

e.用1×PBST洗涤3次后，加入TMB(四甲基联苯胺，Beyotime)进行显色，37℃避光反应5min，随后加入0.2M HCl终止反应。

f.最后，用酶标仪检测OD450 nm处的光吸收值。单点浓度Elisa结合实验结果表明：选取的18个纳米抗体均能与SARS-CoV-2S-RBD特异性结合(图3)。

实施例4合胞体形成抑制实验筛选具有中和活性的纳米抗体

将编码SARS-CoV-2S蛋白的重组质粒pCAGGS-SARS-CoV-2S(将S蛋白编码序列利用EcoR I与Bgl II酶切位点构建至pCAGGS载体，S蛋白编码序列的NCBI编号为MN908947.3)以及编码EGFP蛋白的表达质粒pEGFP-N1(购自Invitrogen公司)共转至HEK-293T细胞中，得到HEK293T-S/EGFP细胞。转染40h后，将HEK293T-S/EGFP细胞以2.5×10⁴个细胞/孔的密度接种到96孔细胞培养板中，然后与实施例3中的18个纳米抗体混合均匀并设置阳性对照组(ACE2蛋白)，在37℃孵育1h。随后，将能够稳定表达ACE2受体(NCBI编号：BAB40370.1)的293T细胞(HEK293T-ACE2细胞)以5×10⁴个细胞/孔的密度接种到上述96孔细胞培养板中混匀，在37℃下共孵育4h。实施例3中18个纳米抗体以及阳性对照ACE2蛋白在该孵育体系中的终浓度为10μM或1μM。

最后通过荧光显微镜(Olympus)来观察合胞体的形成。由于定位在HEK293T-S/EGFP细胞表面的SARS-CoV-2S蛋白能够与HEK293T-ACE2细胞表面的ACE2受体特异性结合进而诱导两种细胞进行膜融合从而形成合胞体，而中和抗体或是重组ACE2蛋白的存在则会阻断这一过程因而抑制合胞体的形成。因此，图4的结果可以表明，在这18个纳米抗体中，Nb-015和Nb-021无论在10μM还是在1μM的浓度下都能够明显的抑制SARS-CoV-2S蛋白所介导的细胞融合，呈现出明显的中和活性，为中和纳米抗体(图4A)。而除此之外的16个抗体即便是在10μM的浓度下也未呈现出对合胞体的形成抑制能力，为非中和纳米抗体(图4B)。

实施例5中和纳米抗体的功能鉴定

(1)Elisa检测中和纳米抗体与SARS-CoV-2S-RBD的结合能力

a.将实施例1中制备的SARS-CoV-2S-RBD蛋白稀释至pH 9.6的碳酸盐缓冲液中，以200ng/孔的浓度包被酶标板，4℃包被过夜。

b.第二天，弃去包被液，1×PBST洗涤3次，随后加入封闭液于室温封闭1.5h。

c.弃去封闭液，1×PBST洗涤3次后，分别加入以3倍梯度稀释的浓度(0.33μM～0.0056nM)的实施例4筛选到的纳米抗体Nb-015或Nb-021，100μL/孔，37℃孵育1.5h，设置阳性对照(ACE2蛋白)，设置阴性对照(GST蛋白，NCBI编号为LC520255.1)。

d.用1×PBST洗涤3次后，加入HRP直联的anti-His抗体(1：5000稀释)，50μL/孔，37℃孵育1h。

e.用1×PBST洗涤3次后，加入TMB进行显色，37℃避光反应5min，随后加入0.2MHCl终止反应。

f.最后，用酶标仪检测OD450 nm处的光吸收值。梯度浓度Elisa结合实验结果表明：Nb-015和Nb-021与SARS-CoV-2S-RBD的结合能力均优于ACE2(图5)。

(2)表面等离子共振(SPR)实验测定中和纳米抗体与SARS-CoV-2S-RBD的亲和力

将实施例1中制备的SARS-CoV-2S-RBD蛋白作为固定相，通过氨基偶联试剂盒(GEHealthcare)偶联在CM5芯片(GE Healthcare)上。随后，将实施例4筛选到的纳米抗体Nb-015或Nb-021作为流动相，分别以2倍梯度稀释的浓度(10nM～0.313nM)从低到高依次注入芯片，流速为30μL/min，每个循环过后，使用pH 2.0的Glycine溶液对芯片表面的固定相蛋白进行再生(30μL/min处理30s)。该实验在恒温25℃进行，SPR缓冲液为HEPES-Tween缓冲液(10mM HEPES,pH 7.5,150mM NaCl,0.05％Tween-20)。结合曲线如图6所示，结果表明，纳米抗体Nb-015和Nb-021均能以高亲和力结合SARS-CoV-2S-RBD，解离平衡常数(K_D)分别为1.38×10^-9M与2.13×10^-10M，均优于ACE2与S-RBD的亲和力(9.00×10^-8M)，这一结果也与步骤(1)中的结果相一致。

(3)SPR竞争实验初步探究Nb-015和Nb-021的中和表位特征

将实施例1中制备的SARS-CoV-2S-RBD蛋白作为固定相通过氨基偶联试剂盒固定在CM5芯片上。将实施例4筛选到的纳米抗体Nb-015和Nb-021作为流动相，按照分组(第一组：Nb-015+Nb-021；第二组：Nb-021+Nb-015；第三组：buffer+Nb-015；第四组：buffer+Nb-021)依次注入芯片，第一针抗体以饱和浓度上样150s后立即上样第二针抗体，同样上样150s，流速均为30μL/min，每个循环过后，使用pH 1.5的Glycine溶液对芯片表面的固定相蛋白进行再生(30μL/min处理30s)。该实验在恒温25℃进行，SPR缓冲液为HEPES-Tween缓冲液(10mM HEPES,pH 7.5,150mM NaCl,0.05％Tween-20)。图7的结果表明，纳米抗体Nb-015和Nb-021可以同时结合SARS-CoV-2S-RBD，分别靶向S-RBD上不重叠的两个中和表位。

(4)SPR实验测定中和纳米抗体与SARS-CoV-2突变株S-RBD的亲和力

本发明进一步鉴定两个靶向不同中和表位的纳米抗体Nb-015和Nb-021与一些流行性较广的突变株[包括Alpha(B.1.1.7),Beta(B.1.351),Gamma(P.1),Delta(B.1.617.2),Kappa(B.1.617.1),Lambda(C.37),Mu(B.1.621),Omicron(BA.2),Omicron(BA.4),Omicron(BA.5)突变株]的结合能力。

首先，制备SARS-CoV-2突变株[包括Alpha(B.1.1.7),Beta(B.1.351),Gamma(P.1),Delta(B.1.617.2),Kappa(B.1.617.1),Lambda(C.37),Mu(B.1.621),Omicron(BA.2),Omicron(BA.4),Omicron(BA.5)突变株]的S-RBD蛋白，制备方法同实施例1。分别通过氨基偶联试剂盒固定在CM5芯片上。随后，将实施例4筛选到的纳米抗体Nb-015或Nb-021作为流动相，分别以2倍梯度稀释的浓度[Nb-015结合Alpha、Beta、Delta、Kappa、Lambda、Mu突变株S-RBD的浓度梯度：10nM～0.313nM；Nb-015结合Gamma突变株S-RBD的浓度梯度：500nM～15.6nM；Nb-015结合Omicron(BA.2)、Omicron(BA.4/5)突变株S-RBD的浓度梯度：20nM～0.625nM；Nb-021结合Alpha、Beta、Gamma、Delta、Kappa、Lambda、Mu突变株S-RBD的浓度梯度：10nM～0.313nM；Nb-021结合Omicron(BA.2)、Omicron(BA.4/5)突变株S-RBD的浓度梯度：625nM～19.5nM]从低到高依次注入芯片，流速为30μL/min，每个循环过后，使用pH2.0的Glycine溶液对芯片表面的固定相S-RBD突变体蛋白进行再生(30μL/min处理30s)。该实验在恒温25℃进行，SPR缓冲液为HEPES-Tween缓冲液(10mM HEPES,pH 7.5,150mM NaCl,0.05％Tween-20)。

结合曲线和亲和力分别如图8和表1所示。纳米抗体Nb-015与Alpha、Beta、Gamma、Delta、Kappa、Lambda、Mu、Omicron(BA.2)、Omicron(BA.4/5)突变株S-RBD结合的K_D值分别为2.03×10^-9M、2.98×10^-9M、2.18×10^-7M、3.78×10^-9M、1.54×10^-9M、2.62×10^-9M、1.91×10^-9M、5.10×10^-9M、1.29×10^-9M；纳米抗体Nb-021与Alpha、Beta、Gamma、Delta、Kappa、Lambda、Mu、Omicron(BA.2)、Omicron(BA.4/5)突变株S-RBD结合的K_D值分别为4.64×10^{- 10}M、2.86×10^-10M、5.16×10^-10M、3.59×10^-10M、2.55×10^-10M、5.87×10^-10M、4.06×10^-10M、6.45×10^-7M、6.76×10^-7M。由此结果可以表明，纳米抗体Nb-015除了对突变株Gamma S-RBD的亲和力有略微下降以外，对其他几种突变株[Alpha,Beta,Delta,Kappa,Lambda,Mu,Omicron(BA.2),Omicron(BA.4/BA.5)]S-RBD仍保持了与原始株S-RBD同等水平的亲和力；而纳米抗体Nb-021则是与Omicron突变株[包括Omicron(BA.2),Omicron(BA.4/BA.5)亚突变株]S-RBD的结合能力有明显下降，除此之外，与其他突变株(Alpha,Beta,Gamma,Delta,Kappa,Lambda,Mu)S-RBD均能以高亲和力结合，并与原始株S-RBD的亲和力保持在同一水平。整体而言，尽管纳米抗体Nb-015或Nb-021与个别突变株的亲和力相较于原始株而言有所降低，但是其仍然维持了较强的结合能力，故而可以得出，这两个纳米抗体Nb-015和Nb-021均具有与突变株S-RBD的广泛结合能力。

表1纳米抗体Nb-015和Nb-021结合SARS-CoV-2S-RBD(原始株和突变株)的K_D值

(5)假病毒中和实验探究中和纳米抗体的泛变异株广谱中和能力

将HEK293T-ACE2细胞接种于96孔细胞培养板(corning)，接种密度为1×10⁴细胞/孔，置于37℃培养。将3倍浓度梯度稀释的纳米抗体Nb-015和Nb-021[Nb-015中和原始型假病毒的浓度梯度：9.86μM～0.00448μM；Nb-015中和突变株假病毒的浓度梯度：10.5μM～0.00480μM；Nb-021中和原始型以及Alpha、Beta、Gamma、Delta、Kappa、Lambda、Mu突变株假病毒的浓度梯度：3.88μM～0.00177μM；Nb-021中和Omicron(BA.2)假病毒的浓度梯度：93.0μM～0.383μM；Nb-021中和Omicron(BA.4/5)假病毒的浓度梯度：116μM～0.479μM]分别与等滴度的SARS-CoV-2假病毒(包括原始株与突变株，均购自Genomeditech公司)混合后在37℃孵育1h。随后，将纳米抗体/假病毒混合物加入HEK293T-ACE2细胞中，感染24h后更换新鲜的完全培养基[DMEM培养基(Gibco)加入0.1μg/mL链霉素(Thermo),0.06μg/mL青霉素(Thermo),10％w/v胎牛血清(ExCell Bio)]。在37℃下孵育48h后，使用One-LumiTM II萤火虫荧光素酶测定试剂盒(Beyotime)，测定HEK293T-ACE2细胞内的荧光素酶活性。最后通过GraphPad Prism 6绘制中和曲线并计算半数抑制浓度(IC₅₀)值。

最终绘制的中和曲线与计算得到的IC₅₀值分别如图9和表2所示。纳米抗体Nb-015中和原始株以及Alpha、Beta、Gamma、Delta、Kappa、Lambda、Mu、Omicron(BA.2)、Omicron(BA.4/5)突变株假病毒的IC₅₀值分别为0.164μM、0.096μM、0.301μM、1.26μM、0.130μM、0.079μM、0.066μM、0.079μM、0.697μM、0.135μM；纳米抗体Nb-021中和原始株以及Alpha、Beta、Gamma、Delta、Kappa、Lambda、Mu、Omicron(BA.2)、Omicron(BA.4/5)突变株假病毒的IC₅₀值分别为0.061μM、0.034μM、0.050μM、0.038μM、0.017μM、0.031μM、0.020μM、0.022μM、19.1μM、17.8μM。这一结果表明：纳米抗体Nb-015与Nb-021均可有效中和SARS-CoV-2原始株与突变株假病毒。此外，尽管Nb-021中和Omicron突变株[包括Omicron(BA.2),Omicron(BA.4/BA.5)亚突变株]假病毒的IC₅₀明显降低，但其依然保持了有效的中和能力。因此可以得出结论，靶向SARS-CoV-2S-RBD中不同表位的Nb-015与Nb-021是两个具有泛变异株广谱中和活性的纳米抗体(图9)。

表2纳米抗体Nb-015与Nb-021中和SARS-CoV-2假病毒(原始株和突变株)的IC₅₀值

实施例6中和纳米抗体与SARS-CoV-2S-RBD的复合物结构解析

对Nb-015和Nb-021的泛变异株广谱中和活性有所了解后，本发明通过结构生物学的方法分别解析了这两个纳米抗体与SARS-CoV-2S-RBD的复合物结构，通过结构分析进一步揭示这两个纳米抗体的中和机制。

(1)Nb-015与SARS-CoV-2S-RBD的复合物结构解析

将实施例1制备的SARS-CoV-2S-RBD蛋白(原始株)与纳米抗体Nb-015以摩尔比1：1.2的比例混合，冰上孵育2h后，通过Superdex 200Increase 10/300GL凝胶过滤层析柱去除未与S-RBD结合的纳米抗体，并将Nb-015/S-RBD复合物蛋白换液至SEC buffer(20mMTris,pH 8.0,150mM NaCl)中，收取Nb-015/S-RBD复合物蛋白，并通过SDS-PAGE鉴定纯度。结果表明，该复合物的纯度在99％以上，可以用于结晶条件筛选。Nb-015/S-RBD复合物蛋白的凝胶过滤层析图谱和SDS-PAGE分析见图10：

将高纯度Nb-015/S-RBD复合物蛋白浓缩至10mg/mL进行结晶条件的筛选。本发明采用气相扩散坐滴法，利用商品化的晶体筛选试剂盒(Hampton Research和MolecularDimensions)，在18℃条件下进行复合物蛋白的晶体筛选，最终在Hampton Research的试剂盒中的PEG/Ion HR2-126 kit#No.21(0.2M Sodium formate,pH 7.2and 20％w/vPolyethylene glycol 3350)条件下获得了质量较好，可用于衍射的Nb-015/S-RBD复合物蛋白晶体。

晶体衍射与数据采集于上海同步辐射光源BL19U1线站完成。衍射数据通过HKL3000进行处理。结构解析首先利用分子置换法获得原始的结构模型，然后通过Coot和Phenix.refine对结构模型进行精修，得到最终的复合物晶体结构(图11)。

Nb-015/S-RBD复合物结构表明Nb-015的结合表位位于S-RBD“椅背区”的凹侧面，可分为两部分，一部分分布于S-RBD的核心亚结构域，另一部分位于外部亚结构域。Nb-015主要通过CDR3以及一小段骨架区序列与S-RBD相互作用，CDR1和CDR2只提供了极少的互作。Nb-015的结合位点与受体ACE2的结合位点存在部分重叠，因此Nb-015会与受体ACE2竞争与S-RBD的结合。这也揭示了Nb-015的中和机制，即通过竞争S-RBD蛋白表面的受体结合位点而发挥中和活性。

(2)Nb-021与SARS-CoV-2S-RBD的复合物结构解析

Nb-021/S-RBD的复合物蛋白制备与Nb-015/S-RBD复合物蛋白的制备步骤相同。将实施例1制备的SARS-CoV-2S-RBD蛋白(原始株)与纳米抗体Nb-021以摩尔比1：1.2的比例混合，冰上孵育2h后通过Superdex 200Increase 10/300GL凝胶过滤层析柱去除未与S-RBD结合的纳米抗体，并将Nb-021/S-RBD复合物蛋白换液至SEC buffer(20mM Tris,pH 8.0,150mM NaCl)中。收取Nb-021/S-RBD复合物蛋白样品，并通过SDS-PAGE鉴定纯度。结果表明，该复合物的纯度在99％以上，可以用于结晶条件筛选。Nb-021/S-RBD复合物蛋白的凝胶过滤层析图谱和SDS-PAGE分析见图12：

将高纯度Nb-021/S-RBD复合物蛋白浓缩至10mg/mL进行结晶条件的筛选。同样采用气相扩散坐滴法，利用商品化的晶体筛选试剂盒(Hampton Research和MolecularDimensions)，在18℃条件下进行复合物蛋白的晶体筛选，最终在Hampton Research的试剂盒中的PEG/Rx HR2-082 kit#No.46(0.1M Sodium citrate tribasic dihydrate,pH5.0and 18％w/v Polyethylene glycol 20000)条件下获得了可用于衍射的Nb-021/S-RBD复合物蛋白晶体。

于上海同步辐射光源BL19U1线站采集晶体衍射数据并通过HKL2000进行数据处理。利用分子置换法进行结构解析，随后通过Coot和Phenix.refine对初步解析的结构模型进行修正，得到最终的复合物晶体结构(图13)。

Nb-021/S-RBD复合物结构表明Nb-021结合于S-RBD的核心结构域一段保守的表位，主要通过骨架区与S-RBD相互作用。与骨架区相比，Nb-021的三个CDR与S-RBD的相互作用较为有限。Nb-021的结合位点远离RBM，因此该抗体不会直接阻断S-RBD与受体ACE2的结合。经过结构比对，发现该抗体表位与CR3022位点广泛重叠，因此可以推断，Nb-021的中和机制应该与CR3022抗体一致，通过破坏S蛋白三聚体的融合前构象从而达到中和病毒感染的目的。

实施例7中和纳米的改造

(1)中和纳米抗体的改造策略

为了增加抗体的中和效力以抵抗病毒逃逸，一种策略是联合使用两种或两种以上靶向不同的表位的抗体，另一种方法则是改造双特异性抗体。本发明根据两个nanobody/S-RBD的复合物结构，对Nb-015与Nb-021进行双特异性改造，使其能同时结合S-RBD上的两个中和表位。

首先，将Nb-021的C末端与Nb-015的N末端用一段柔性(GGGGS)₄linker串联，命名为Nb-X2。此外，为了进一步增强抗体的综合效能，在Nb-015的C末端通过柔性GGGGS linker连接一个Human IgG1 Fc标签(人源二聚化标签)，将其进一步改造成为一个双特异性的异源四聚化抗体，命名为Nb-X2-Fc(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)。

(2)Nb-X2-Fc的表达与纯化

同样采用Bac-to-Bac杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达Nb-X2-Fc蛋白。

将步骤(1)中编码Nb-X2-Fc蛋白的基因序列N段引入gp67信号肽编码序列、C段引入翻译终止密码子序列并利用BamH I和Hind III酶切位点克隆进pFastBac1载体中，得到重组质粒pFastBac1-Nb-X2-Fc。

将构建好的重组质粒pFastBac1-Nb-X2-Fc转化至DH10Bac感受态细胞中，随后均匀涂布于三抗LB平板(含50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环素以及100μg/mLBluo-gal和40μg/mL IPTG)，37℃培养48h后，通过蓝白斑筛选和PCR鉴定，得到阳性克隆后，扩增培养，使用异丙醇沉淀法提取阳性重组杆粒Bacmid-Nb-X2-Fc并转染至sf9细胞中，转染72h后获得P1代重组杆状病毒，连续扩增3代后得到高滴度的P4代重组杆状病毒。用P4感染sf9细胞，72h后离心收取细胞上清，过滤后与HiTrap rProteinAFF亲和层析预装柱(GEHealthcare)于4℃过夜结合。结合完毕后使用0.1M Glycine(pH 3.0)溶液进行洗脱，洗脱后的目的蛋白通过Superdex 200Increase 10/300GL凝胶过滤层析柱进行精细纯化，并将纯化后的蛋白换液至SEC buffer(10mM HEPES,pH 7.5,150mM NaCl)中。Nb-X2-Fc蛋白在凝胶过滤层析中的洗脱峰峰形单一对称，出峰位置与分子量相对应，表明其在溶液中均一性良好，且SDS-PAGE鉴定显示蛋白纯度可达98％以上，可用于后续的功能实验。Nb-X2-Fc蛋白的凝胶过滤层析图谱以及SDS-PAGE结果如图14所示。

实施例8Nb-X2-Fc中和活性检测

将HEK293T-ACE2细胞接种于96孔细胞培养板，接种密度为1×10⁴细胞/孔，置于37℃培养。将3倍浓度梯度稀释的实施例7中的Nb-X2-Fc蛋白[Nb-X2-Fc中和原始型以及Beta、Delta、Omicron(BA.2)突变株假病毒的浓度梯度：317nM～0.145nM；Nb-X2-Fc中和Gamma、Omicron(BA.4/5)突变株假病毒的浓度梯度：481nM～0.220nM]分别与等滴度SARS-CoV-2假病毒混匀后在37℃孵育1h。随后，将蛋白/假病毒混合物加入HEK293T-ACE2细胞中，感染24h后更换新鲜的完全培养基。在37℃下孵育48h后，使用One-LumiTM II萤火虫荧光素酶测定试剂盒测定HEK293T-ACE2细胞内的荧光素酶活性。最后通过GraphPad Prism 6绘制中和曲线并计算IC₅₀值。

最终绘制的中和曲线与计算得到的IC₅₀值分别如图15和表3所示。改造后抗体Nb-X2-Fc中和原始株以及Beta、Gamma、Delta、Omicron(BA.2)、Omicron(BA.4/5)突变株假病毒的IC₅₀值分别为1.89nM、0.727nM、1.44nM、5.08nM、2.28nM、2.14nM。这一结果表明：Nb-X2-Fc对SARS-CoV-2原始株与突变株假病毒的中和效力明显增强，尤其是对Gamma突变株和Omicron突变株[包括Omicron(BA.2),Omicron(BA.4/BA.5)亚突变株]呈现大幅度提高，均上升至纳摩尔级。具体来讲，Nb-X2-Fc对原始型以及Beta、Gamma、Delta、Omicron(BA.2)、Omicron(BA.4/5)突变株假病毒中和能力与单独的Nb-015纳米抗体相比分别提高了87、414、875、26、306、63倍，与单独的Nb-021纳米抗体相比分别提高了32、69、26、3、8377、8318倍，这说明了Nb-X2-Fc相较于单独的纳米抗体(Nb-015或Nb-021)对SARS-CoV-2突变株具有明显增强的泛变异株广谱中和活性(图15)。

表3 Nb-X2-Fc中和SARS-CoV-2假病毒(原始株和突变株)的IC₅₀值

SARS-CoV-2pseudovirus	IC50(nM)
		Original strain	1.89
Beta(B.1.351)	0.727
		Gamma(P.1)	1.44
Delta(B.1.617.2)	5.08
		Omicron(BA.2)	2.28
Omicron(BA.4/BA.5)	2.14

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种抗SARS-CoV-2的纳米抗体，其特征在于，如（a）~（c）任一所示：

（a）Nb-015，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

（b）Nb-021，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

（c）（a）的Nb-015和（b）的Nb-021构成的双抗体，利用柔性linker连接Nb-021的C末端与Nb-015的N末端。

2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，在（c）中，Nb-015的C末端通过GGGGS连接Human IgG1 Fc tag；所述Human IgG1 Fc tag的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求1或2所述的纳米抗体，其特征在于，所述双抗体的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。

4.编码权利要求1~3任一所述纳米抗体的基因。

5.携带权利要求4所述基因的载体。

6.携带权利要求4所述基因或权利要求5所述载体的宿主细胞。

7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1~3任一所述纳米抗体。

8.权利要求1~3任一所述纳米抗体在制备抗SARS-CoV-2药物中的应用；所述SARS-CoV-2包括原始毒株和突变毒株Alpha、Beta、Gamma、Delta、Kappa、Lambda、Mu、Omicron BA.2、Omicron BA.4/5 。

9.权利要求1~3任一所述纳米抗体在制备SARS-CoV-2检测试剂盒中的应用；所述SARS-CoV-2包括原始毒株和突变毒株Alpha、Beta、Gamma、Delta、Kappa、Lambda、Mu、OmicronBA.2、Omicron BA.4/5。

10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1~3任一所述纳米抗体或权利要求7所述药物组合物。