CN113549147A - 抗柯萨奇a6型病毒的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫学领域和分子病毒学领域，特别是柯萨奇A6型病毒的诊断、预防和治疗领域。具体而言，本发明涉及针对柯萨奇A6型病毒的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及包含所述抗体或其抗原结合片段的组合物(例如，诊断剂和治疗剂)。此外，本发明还涉及所述抗体或其抗原结合片段的用途。本发明的抗体或其抗原结合片段可用于诊断、预防和/或治疗柯萨奇A6型病毒的感染和/或由所述感染引起的疾病(例如，手口足病)。

Description

抗柯萨奇A6型病毒的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及免疫学领域和分子病毒学领域，特别是柯萨奇A6型病 毒的诊断、预防和治疗领域。具体而言，本发明涉及柯萨奇A6型病毒 的单克隆抗体，以及包含所述抗体的组合物(例如，诊断剂和治疗剂)。 此外，本发明还涉及所述抗体的用途。本发明的抗体可用于诊断、预防 和/或治疗柯萨奇A6型病毒的感染和/或由所述感染引起的疾病(例如， 手口足病)。
背景技术
手足口病(Hand,Foot,and Mouth Disease，简称HFMD)作为我 国丙类传染病之一，首发表现为发热和手、足、口腔出现皮疹、疱疹和 小溃疡的症状，部分患者会发展成为无菌性的脑炎、脑膜炎等重症表现。 目前，全球大部分地区均有手足口病例的相关报道，而亚太地区作为手 足口病的高发地区，近年来对于手足口病给与了足够的重视。导致 HFMD疫情的肠道病毒有20多种，目前的研究显示，除了肠道病毒71 型(EV71)和柯萨奇A16型病毒(CVA16)，柯萨奇A6型病毒 (CVA6)也已发展成为HFMD的主要病原体。近年来在新加坡、芬兰、 法国、日本等国家或地区发生了CVA6暴发流行。研究显示，CVA6感 染可引起疱疹性咽峡炎、偶发性脑膜炎等症状，也可引发非典型的 HFMD临床症状，可产生较严重的全身性水疱疹或大疱疹，还可引起 侵蚀性的皮疹、湿疹、紫癜损伤和指甲脱落，部分可导致致死性的脑膜 炎、脑炎和心肌炎，具有较严重的危害性。因此，根据获得的HFMD 流行病学和病原学调查数据，目前普遍认为，CVA6应与EV71和 CVA16一样作为优先的HFMD疫苗预防对象，亟需研制有效的预防和 治疗方法。
CVA6是小RNA病毒科肠道病毒属的成员，直径27～30nm，无包 膜病毒，呈二十面体结构。CVA6为单股正链RNA病毒，基因组全长约 7400bp，包含一个开放阅读框，编码多聚蛋白前体，蛋白前体被自身产 生的水解酶切割为结构蛋白P1和非结构蛋白P2和P3。结构蛋白P1主 要编码由VP1、VP0和VP3组成的衣壳蛋白，VP0在病毒成熟过程中水 解为VP2和VP4，其中VP4位于衣壳蛋白内部，VP1、VP2和VP3分 布在衣壳病毒的表面，组成五聚体。开放阅读框编码区两侧分别是5’和 3’非编码区，5’非编码区约由740个核苷酸组成，与病毒基因组的复制 和翻译功能相关，3’非编码区包含Poly A尾，对于病毒的成功感染是必 不可少的。
病毒颗粒的类型和结构特征与其抗原性和免疫原性存在密切联系。 目前认为，肠道病毒在其组装和感染过程中存在多种不同的颗粒类型， 不同型别的肠道病毒可能具有特别的颗粒类型分布特征与结构特征，进 而具有不同的疫苗应用潜能。因此，进一步开展对CVA6病毒颗粒抗原 检测方面的研究是十分必要的。目前还没有关于CVA6病毒颗粒抗原检 测方法的报道。获得可特异结合CVA6病毒颗粒的单克隆抗体并建立 CVA6颗粒抗原相关检测方法，对CVA6疫苗的研发及质控具有非常重 要的意义。
发明内容
申请人经过了深入的研究和创造性的劳动，例如利用不同时间、不 同地点分离到的不同的CVA6代表株免疫小鼠，获得30余株杂交瘤细胞 株，其均能够产生对CVA6有特异性反应的单克隆抗体。申请人通过蔗 糖密度梯度离心纯化方法获得CVA6病毒颗粒，进一步利用ELISA方法 分别检测上述CVA6单克隆抗体与CVA6病毒颗粒的反应性，筛选与 CVA6病毒颗粒具有高结合活性的单克隆抗体。最终获得3株可高效、 特异性结合CVA6病毒颗粒单克隆抗体，以及能够分泌该抗体的单克隆 细胞系，并进一步建立了基于该抗体的特异性检测CVA6病毒颗粒的检 测方法，以及证明该单克隆抗体具有制备抗CVA6药物或疫苗的潜力。
由此提供了下述发明。
本发明的抗体
在一个方面，本发明提供了一种特异性结合柯萨奇A6型病毒 (CVA6)的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含下述根据IMGT编 号系统定义的互补决定区(CDRs)：
(1)氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5-7所示的VH CDR1-3，和/或， 氨基酸序列分别如SEQ ID NO:8-10所示的VL CDR1-3；
(2)氨基酸序列分别如SEQ ID NO:15-17所示的VH CDR1-3，和/ 或，氨基酸序列分别如SEQ ID NO:18-20所示的VL CDR1-3；或者
(3)氨基酸序列分别如SEQ ID NO:25-27所示的VH CDR1-3，和/ 或，氨基酸序列分别如SEQ ID NO:28-30所示的VL CDR1-3。
在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：氨基 酸序列分别如SEQ ID NO:5-7所示的VH CDR1-3，和/或，氨基酸序列 分别如SEQ ID NO:8-10所示的VLCDR1-3。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)如SEQ ID NO:19所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR；和/或，(b)如 SEQ ID NO:20所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。某些实 施方案中，所述重链可变区(VH)中含有的3个CDR和/或所述轻链可 变区(VL)中含有的3个CDR由Kabat、Chothia或IMGT编号系统 定义。在某些示例性实施方案中，所述重链可变区(VH)中含有的3个 CDR和/或所述轻链可变区(VL)中含有的3个CDR由IMGT编号系 统定义。
在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
(i)重链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：19所 示的序列，或与SEQ ID NO：19相比具有至少80％、至少85％、至少 90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少 96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：19相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如 1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
和/或，
(ii)轻链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：20 所示的序列，或与SEQ ID NO：20相比具有至少80％、至少85％、至 少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至 少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：20相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例 如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。
在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：如 SEQ ID NO:19所示的VH和如SEQ ID NO:20所示的VL。
在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段是6C8或其 抗原结合片段、其嵌合抗体、或其人源化抗体，或它们的变体，所述变 体基本保留了其所源自的单克隆抗体或其抗原结合片段的生物学功能。
在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段具备以下生 物学功能中的一项或多项：
(a)特异性结合CVA6病毒或病毒颗粒，例如通过ELISA测定；
(b)检测CVA6病毒(例如病毒颗粒)在样品中的存在或其水平；
(c)诊断受试者是否感染了CVA6病毒；
(d)在体外或受试者(例如人)体内中和CVA6；例如以不低于3000 (例如3000-5000，4000-5000，或4000-4500，例如约4000-4100)的中 和效价在体外中和CVA6，例如通过实施例7所述的中和实验测定；
(e)抑制或阻断CVA6对细胞的感染；
(f)预防和/或治疗CVA6感染或与CVA6病毒感染相关的疾病。
在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：氨基 酸序列分别如SEQ ID NO:7-9所示的VH CDR1-3，和/或，氨基酸序列 分别如SEQ ID NO:10-12所示的VLCDR1-3。
在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：(a) 如SEQ ID NO:21所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR；和/ 或，(b)如SEQ ID NO:22所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。 某些实施方案中，所述重链可变区(VH)中含有的3个CDR和/或所述轻链可变区(VL)中含有的3个CDR由Kabat、Chothia或IMGT编 号系统定义。在某些示例性实施方案中，所述重链可变区(VH)中含 有的3个CDR和/或所述轻链可变区(VL)中含有的3个CDR由IMGT 编号系统定义。
在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
(i)重链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：21所 示的序列，或与SEQ ID NO：21相比具有至少80％、至少85％、至少 90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少 96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：21相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如 1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
和/或，
(ii)轻链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：22 所示的序列，或与SEQ ID NO：22相比具有至少80％、至少85％、至 少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至 少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：22相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例 如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。
在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：如 SEQ ID NO:21所示的VH和如SEQ ID NO:22所示的VL。
在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段是4D6或其 抗原结合片段、其嵌合抗体、或其人源化抗体，或它们的变体，所述变 体基本保留了其所源自的单克隆抗体或其抗原结合片段的生物学功能。
在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段具备以下生 物学功能中的一项或多项：
(a)特异性结合CVA6病毒或病毒颗粒，例如通过ELISA测定；
(b)检测CVA6病毒(例如病毒颗粒)在样品中的存在或其水平；
(c)诊断受试者是否感染了CVA6病毒；
(d)在体外或受试者(例如人)体内中和CVA6；例如以不低于6000 (例如6000-10000，7000-10000，7000-9000，或8000-9000，例如约 8100-8200)的中和效价在体外中和CVA6，例如通过实施例7所述的中 和实验测定；
(e)抑制或阻断CVA6对细胞的感染；
(f)预防和/或治疗CVA6感染或与CVA6病毒感染相关的疾病。
在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：氨基 酸序列分别如SEQ ID NO:13-15所示的VH CDR1-3，和/或，氨基酸序 列分别如SEQ ID NO:16-18所示的VLCDR1-3。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)如SEQ ID NO:23所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR；和/或，(b)如 SEQ ID NO:24所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。某些实 施方案中，所述重链可变区(VH)中含有的3个CDR和/或所述轻链可 变区(VL)中含有的3个CDR由Kabat、Chothia或IMGT编号系统 定义。在某些示例性实施方案中，所述重链可变区(VH)中含有的3个 CDR和/或所述轻链可变区(VL)中含有的3个CDR由IMGT编号系 统定义。
在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
(i)重链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：23所 示的序列，或与SEQ ID NO：23相比具有至少80％、至少85％、至少 90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少 96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：23相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如 1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
和/或，
(ii)轻链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：24 所示的序列，或与SEQ ID NO：24相比具有至少80％、至少85％、至 少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至 少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：24相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例 如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。
在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：如 SEQ ID NO:23所示的VH和如SEQ ID NO:24所示的VL。
在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段是2B5或其 抗原结合片段、其嵌合抗体、或其人源化抗体，或它们的变体，所述变 体基本保留了其所源自的单克隆抗体或其抗原结合片段的生物学功能。
在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段具备以下生 物学功能中的一项或多项：
(a)特异性结合CVA6病毒或病毒颗粒，例如通过ELISA测定；
(b)检测CVA6病毒(例如病毒颗粒)在样品中的存在或其水平；
(c)诊断受试者是否感染了CVA6病毒；
(d)在体外或受试者(例如人)体内中和CVA6；例如以不低于3000 (例如3000-5000，4000-5000，或4000-4500，例如约4000-4100)的中 和效价在体外中和CVA6，例如通过实施例7所述的中和实验测定；
(e)抑制或阻断CVA6对细胞的感染；
(f)预防和/或治疗CVA6感染或与CVA6病毒感染相关的疾病。
在某些实施方案中，上述任一单克隆抗体或其抗原结合片段进一步 包含来源于哺乳动物(例如，鼠或人)免疫球蛋白的恒定区序列或其变 体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置 换、缺失或添加。在某些实施方案中，所述变体与其所源自的野生型序 列相比具有一个或多个氨基酸的保守置换。
在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段的重链包含 鼠免疫球蛋白的重链恒定区(CH)或其变体，所述变体与其所源自的 野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至 多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添 加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)； 和/或，
所述单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链包含鼠免疫球蛋白的轻链 恒定区(CL)或其变体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有 一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、 至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个， 3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)。
在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段的重链包含 人免疫球蛋白的重链恒定区(CH)或其变体，所述变体与其所源自的 野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至 多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添 加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)； 和/或，
所述单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链包含人免疫球蛋白的轻链 恒定区(CL)或其变体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有 一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、 至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个， 3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)。
在某些实施方案中，所述重链恒定区是IgG重链恒定区，例如IgG1、 IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区。在某些实施方案中，所述重链恒定区 是鼠IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区。在某些实施方案中，所 述重链恒定区是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区。
在某些实施方案中，所述轻链恒定区是κ轻链恒定区。在某些实施 方案中，所述轻链恒定区是鼠κ轻链恒定区。在某些实施方案中，所述 轻链恒定区是人κ轻链恒定区。
在某些实施方案中，上述任一单克隆抗体的抗原结合片段选自scFv、 di-scFv、(scFv)2、Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、或二硫键稳定的Fv(dsFv)。
在某些实施方案中，上述任一单克隆抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、 人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
在本申请中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段可以包括这样 的变体，所述变体与其所源自的抗体或其抗原结合片段相比差异仅在于 一个或多个(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨 基酸的保守置换)氨基酸残基的保守置换，或者与其所源自的抗体或其 抗原结合片段具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，且基本保留了其 所源自的抗体或其抗原结合片段的生物学功能。
衍生的抗体
本发明的抗体或其抗原结合片段可进行衍生化，例如被连接至另一 个分子(例如另一个多肽或蛋白)。通常，单克隆抗体或其抗原结合片 段的衍生化(例如，标记)不会不利影响其对CVA6病毒的结合。因此， 本发明的抗体或其抗原结合片段还意欲包括此类衍生化的形式。例如， 可以将本发明的抗体或其抗原结合片段功能性连接(通过化学偶合、基 因融合、非共价连接或其它方式)于一个或多个其它分子基团，例如另 一个抗体(例如，形成双特异性抗体)，检测试剂，药用试剂，和/或能 够介导抗体或抗原结合片段与另一个分子结合的蛋白或多肽(例如，抗 生物素蛋白或多组氨酸标签)。此外，本发明的抗体或其抗原结合片段 还可以用化学基团进行衍生，例如聚乙二醇(PEG)，甲基或乙基，或 者糖基。这些基团可用于改善抗体的生物学特性，例如增加血清半衰期。
在某些实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段带有可 检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光 试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料、放射性核素或生物素。
在本文中，本发明所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、 光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。 这类标记是本领域熟知的，其实例包括但不限于，酶(例如，辣根过氧 化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放 射性核素(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、荧光染料(例如，异硫氰 酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红 蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如 Cy7、Alexa 750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物)、磁珠(例如，
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)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或 塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标 记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。
在某些实施方案中，所述可检测的标记能够适用于免疫学检测(例 如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免 疫测定法等)。
在某些实施方案中，可通过不同长度的接头(linker)将如上所述 的可检测的标记连接至本发明的抗体或其抗原结合片段，以降低潜在的 位阻。
抗体的制备
本发明的抗体可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工 程重组技术来获得。例如，通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明 抗体的重链和轻链基因的DNA分子。将所得DNA分子插入表达载体内， 然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表 达本发明的抗体。
本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得(参见 Morimoto etal.,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-117(1992)and Brennan et al.,Science 229:81(1985))。另外，这些抗原结合片段也可以 直接由重组宿主细胞产生(reviewed inHudson,Curr.Opin.Immunol.11: 548-557(1999)；Little et al.,Immunol.Today,21:364-370(2000))。比如， Fab’片段可以直接从宿主细胞中获得；可以将Fab’片段化学偶联形成 F(ab’)2片段(Carter et al.,Bio/Technology,10:163-167(1992))。另外，Fv、 Fab或F(ab’)2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。 本领域的普通技术人员完全知晓制备这些抗原结合片段的其它技术。
因此，在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含 编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变 区的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述分离的核酸分子编码本发明 的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。
在另一个方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载 体)，其包含本发明的分离的核酸分子。在某些实施方案中，本发明的 载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等。
在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含本发明的分 离的核酸分子或本发明的载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细 胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物 细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。在某 些实施方案中，本发明的宿主细胞是哺乳动物细胞，例如CHO(例如 CHO-K1、CHO-S、CHO DG44)。
在另一个方面，提供了制备本发明的抗体或其抗原结合片段的方 法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养 本发明的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其 抗原结合片段。
检测方法和试剂盒
在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的单克隆 抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段带有可检测的 标记。在某些实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别 本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述第二 抗体还包括可检测的标记。
在某些实施方案中，所述试剂盒可以进一步包含用于使相应可检测 的标记被检测到的试剂。例如，当所述可检测的标记为酶时，所述试剂 盒还可以包含相应酶的显色底物，例如用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS或鲁米诺类化合物，或用于碱 性磷酸酶的对硝基苯磷酸酯(p-NPP)或AMPPD。例如当所述可检测 的标记为化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)时，所述试剂盒还可以 包含用于化学发光的预激发液和/或激发液。
在另一个方面，本发明提供了检测CVA6病毒(例如病毒颗粒)在 样品中的存在或其水平的方法，其包括使用本发明的单克隆抗体或其抗 原结合片段。
在某些实施方案中，所述检测是免疫学检测，例如酶免疫测定法 (例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测 定法。
在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括可检测 的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂 (例如吖啶酯类化合物)、荧光染料、放射性核素或生物素。
在某些实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记(例 如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶 酯类化合物)、荧光染料、放射性核素或生物素)的第二抗体来检测所 述单克隆抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，所述方法包括：(1)将所述样品与本发明的单 克隆抗体或其抗原结合片段接触；(2)检测抗原-抗体免疫复合物的形成 或检测所述免疫复合物的量。所述免疫复合物的形成表明存在CVA6病 毒或CVA6病毒颗粒。
在某些实施方案中，所述方法可以用于诊断目的，例如可以根据 CVA6病毒在样品中的存在或其水平来诊断受试者是否感染了CVA6病 毒。在此类实施方案中，所述样品可以为来自受试者(例如哺乳动物， 优选人)的血液样品(例如，全血、血浆或血清)、排泄物、口腔或鼻腔 分泌物、或肺泡灌洗液。
在某些实施方案中，所述方法可以用于非诊断目的，例如所述样品 并非来自受试者的样品，例如溶瘤病毒样品或疫苗样品。
在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。
在另一个方面，提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段在制 备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测CVA6病毒在样品中的存在或 其水平，和/或用于诊断受试者是否感染了CVA6病毒。
在某些实施方案中，所述检测是免疫学测定，例如酶免疫测定法 (例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测 定法。
在某些实施方案中，所述试剂盒通过如上所述的检测方法来检测 CVA6病毒在样品中的存在或其水平，以及任选地根据所述检测结果诊 断受试者是否感染了CVA6病毒。
在某些实施方案中，所述样品为来自受试者(例如哺乳动物，优选 人)的血液样品(例如，全血、血浆或血清)、排泄物、口腔或鼻腔分泌 物、或肺泡灌洗液。
治疗方法和药物组合物
在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有本发明的单 克隆抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物还包含另外的药学活性剂，例 如另外的抗病毒剂。
在某些实施方案中，在所述药物组合物中，本发明的单克隆抗体或 其抗原结合片段与所述另外的药学活性剂作为分离的组分或作为单一组 合物的组分提供。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段与所述另外的 药学活性剂可以同时、分开或相继施用。
在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂 包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性 实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用 水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％ 葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲 溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
在另一个方面，本发明提供了用于中和CVA6病毒的方法，其包括 使用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或药物组合物。所述方法 可用于在体外或受试者(例如人)体内中和CVA6病毒。
在某些实施方案中，所述方法用于中和样品中CVA6的毒力。在某 些实施方案中，所述方法包括：将包含CVA6病毒的样品与本发明的单 克隆抗体或其抗原结合片段或药物组合物接触。
在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段单独使用， 或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂)联合使用。
在另一个方面，本发明提供了用于预防或治疗受试者的CVA6感染 或与CVA6病毒感染相关的疾病(例如手足口病)的方法，其包括：给 有此需要的受试者施用有效量的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段 或药物组合物。
在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段单独使用， 或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂)联合使用。
在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。
在另一个方面，本发明涉及本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段 在制备药物中的用途，所述药物用于：
(1)在体外或受试者(例如人)体内中和CVA6病毒；和/或
(2)用于预防或治疗受试者的CVA6病毒感染或与CVA6病毒感染相 关的疾病(例如手足口病)。
在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段单独使用， 或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂)联合使用。
在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。
本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段、或者本发明的药物组合物 可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳 剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射 剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂 等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的药物组合物 应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。 此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注 射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的重组蛋白，以及任选 地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂， 佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)， 随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如， 通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在 使用前分散于合适的载体中，例如注射用水(WFI)、抑菌性注射用水 (BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％ 葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲 溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段、或药物组合物可以通过本 领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、 眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、 局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用 途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注， 皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或 方式将根据预期目的而发生变化。在一个优选的实施方案中，本发明的 单克隆抗体或其抗原结合片段、或药物组合物通过静脉注射或推注给予。
本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的 本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。“预防有效量”是指，足以预 防，阻止，或延迟疾病的发生的量。“治疗有效量”是指，足以治愈或 至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。本发明的单克 隆抗体或其抗原结合片段的治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治 疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况 例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等 等。
在本发明中，可调整给药方案以获得最佳目的反应(例如治疗或预 防反应)。例如，可以单次给药，可以在一段时间内多次给药，或者可 以随治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。
在本发明中，所述受试者可以为哺乳动物，例如人。
术语定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词 具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培 养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内 广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关 术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“柯萨奇A6型病毒(CVA6)”是指，小 核糖核酸病毒科(Picomaviridae)、肠道病毒属(Enterovirus)、柯萨 奇病毒(Coxsackivirus)A组中的一种。CVA6的基因组序列或cDNA 序列是本领域熟知的，并且可参见各种公共数据库(例如，GenBank 数据库登录号：KR706309)。
如本文中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具 有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链 可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体 的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变 区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约 3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区 (CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链 由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域 CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免 疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q) 的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区 (CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由 按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基 末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变 区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配 遵循Kabat Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and1991))，或Chothia& Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。 例如，其包括，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不 同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)， IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可 变区中负责抗原结合的氨基酸残基。这些氨基酸残基的精确边界可根 据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统 (Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed. Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md., 1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol. 196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)或IMGT编号 系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的 定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所 定义的CDR。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员 熟知的(例如，可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55- 77,2003)。
在本发明中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR可根据 本领域已知的各种编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体 或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过Kabat、Chothia或IMGT 编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段 含有的CDR优选地通过IMGT编号系统确定。
在一些情况下，抗体的抗原结合片段是单链抗体(例如,scFv)，其 中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成 单价分子(参见，例如,Bird等人,Science 242:423 426(1988)和Huston 等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879 5883(1988))。此类scFv分子 可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体 组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用 其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。 可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725- 731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)， Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol. 293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
在一些情况下，抗体的抗原结合片段是双抗体，即，双价抗体， 其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致 不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链 的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,Holliger P. 等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444 6448(1993)，和Poljak R.J. 等人,Structure 2:1121 1123(1994))。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶 促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的单克隆抗体6C8、 4D6和2B5)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与 用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其 不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源 的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即，除可能自发出现 的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位 具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含 至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同 表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得 (Nature,256:495,1975)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见 Journal of virological methods,2009,158(1-2):171-179)。
如本文中所使用的，术语“嵌合抗体(Chimeric antibody)”是指， 这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某 一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，且轻链或/和重链的另一 部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不 同的抗体类或亚类)，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性 (U.S.P4,816,567to Cabilly et al.；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad. Sci.USA,81:68516855(1984))。例如，术语“嵌合抗体”可包括这样 的抗体(例如人鼠嵌合抗体)，其中抗体的重链和轻链可变区来自第一 抗体(例如鼠源抗体)，而抗体的重链和轻链恒定区来自第二抗体(例 如人抗体)。
如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造 的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源 性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体 (供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留了供体 抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性、提 高免疫细胞活性的能力、增强免疫应答的能力等。供体抗体可以是有 预期性质(例如，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力和/或增强免疫应答的能力)的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动 物(例如，食蟹猴)抗体。
本发明的嵌合抗体或人源化抗体可以根据上述制备的鼠单克隆抗 体的序列进行制备。编码重链和轻链的DNA可以从目标鼠杂交瘤中获 得，并且使用标准分子生物学技术进行工程改造以包含非鼠(例如人) 免疫球蛋白序列。
为制备嵌合抗体，可使用本领域已知的方法将鼠免疫球蛋白可变 区连接至人免疫球蛋白恒定区(参见例如Cabilly等人的美国专利No.4,816,567)。例如，将编码VH的DNA可操作的连接至编码重链恒 定区的另一DNA分子以获得全长重链基因。人重链恒定区基因的序列 是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242)，包含这些 区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、 IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是通常优选为IgG1或IgG4恒定区。例如，将编码VL的DNA可操作的连接至编 码轻链恒定区CL的另一DNA分子以获得全长轻链基因(以及Fab轻 链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat， E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest， Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIHPublication No.91-3242)，包含这些区的DNA片段可以通过标准PCR 扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但通常优选为κ恒定区。
为制备人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入 人源框架序列(参见Winter的美国专利No.5,225,539；Queen等人的 美国专利Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370；以及Lo, Benny,K.C.,editor,in Antibody Engineering:Methods and Protocols, volume 248,Humana Press,New Jersey,2004)。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插 入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白 获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染 导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载 体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；人工染 色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源 的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。 可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、 腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病 毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多 种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增 强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细 胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等的原核细胞，如 酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞， 或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞， BHK细胞，HEK293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中使用的，术语“特异结合”是指，两分子间的非随机的结 合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中， 特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体 以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或 10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。
如本文中所使用的，术语“中和活性”是指抗体或抗体片段具有与 病毒上的抗原蛋白相结合，从而阻止病毒感染细胞和/或病毒子代的成 熟和/或病毒子代的释放的功能活性，具有中和活性的抗体或抗体片段 可以阻止病毒的扩增，从而抑制或消除病毒的感染。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个 核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被 相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个 中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都 被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的 “百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较 的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹 配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和 CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常， 在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过 使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地 进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。 还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller (Comput.Appl Biosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定 两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软 件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch (J MoI Biol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250 矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、 4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改 变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通 过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守 置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸 残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例 如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的 能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基 酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和 组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例 如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨 酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、 脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、 异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸) 的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代 相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的 (参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)； Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc. Natl Acad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如， Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren, Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式 并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含 义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是 指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂， 其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂， 离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防 腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括 但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。 离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细 菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨 酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸 收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水， 水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限 于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯 甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员 通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但 不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉， 蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋 白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水 解物)等。在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋 形剂包括无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示 例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液 (例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、 pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或 病症或症状在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的， 术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为 了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状、 缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾 病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)， 无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存 活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获 得期望的效果的量。例如，预防疾病有效量是指，足以预防，阻止， 或延迟疾病的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分 阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完 全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量 将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、 患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时 施用的其他治疗等等。
发明的有益效果
本申请的单克隆抗体(例如6C8、4D6和2B5抗体)能够特异性结 合CVA6病毒，并且对CVA6病毒具有很强的中和活性。因此，本申请 的单克隆抗体(例如6C8、4D6和2B5抗体)具有预防和治疗CVA6病 毒感染(例如，手足口病)的临床应用价值。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是 本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是 对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本 发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得可实施。
附图说明
图1显示了透射电镜下分离的CVA6病毒颗粒。
图2显示了不同单克隆抗体与CVA6病毒颗粒抗原的结合活性。
图3显示了单克隆抗体6C8、4D6和2B5分别与CVA6病毒颗粒抗 原特异性结合的ELISA检测结果。
图4显示了单克隆抗体6C8、4D6和2B5分别检测CVA6病毒感染 的细胞的免疫荧光图。
图5显示了单克隆抗体6C8、4D6和2B5在体内预防小鼠被CVA6 感染的实验结果。
图6显示了单克隆抗体6C8、4D6和2B5在体内治疗小鼠被CVA6 感染的实验结果。
序列信息
本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。
表1：序列的描述
Figure BDA0002468382590000251
Figure BDA0002468382590000261
Figure BDA0002468382590000271
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描 述本发明。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检 测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2 版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子 生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方 法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技 术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所 要求保护的范围。
实施例1：CVA6病毒颗粒的制备
病毒的培养：本发明所用的CVA6毒株为TW-2007-00141 (GenBank No.KR706309)，培养病毒的细胞为人横纹肌瘤细胞RD
Figure BDA0002468382590000272
首先将RD细胞培养于10cm培养皿(NEST) 中，培养基为含10％胎牛血清(PAA)的MEM培养基(GIBCO)。 细胞汇合率达到80％时，换成无血清MEM培养基，按MOI＝0.1的量 来接种病毒。37℃培养，3天后待细胞完全病变，收获病毒。病毒收获 方法为：将细胞刮下后冻融3次，离心去除细胞碎片，取细胞裂解上 清，经0.22μm滤膜过滤后获得病毒原液，-80℃冻存备用。
蔗糖密度梯度离心分离获得不同性质的病毒颗粒：
通过PEG8000对上述获得的病毒原液进行浓缩沉淀，沉淀条件为 8％PEG8000，0.5mol/L NaCl，4℃沉淀过夜。再经10000g离心取沉 淀，沉淀用PBS重悬。以参考相关文献(Xu,et al.，Nature Communications，2017，8(1)：505)的方法进行蔗糖梯度离心，蔗 糖梯度为10％-45％，SW41 Ti转头103614g离心3h，分别取样进行 电镜负染观察，结果(图1)显示蔗糖梯度离心可有效分离获得CVA6 病毒颗粒抗原。
实施例2：单克隆抗体的制备
取实施例1制备的CVA6病毒原液与弗氏完全佐剂混合乳化均匀， 对6-8周龄BALB/c雌鼠进行多点注射，包括背部皮下注射、腹股沟皮 下注射、足垫注射、四肢肌肉注射等途径注射免疫原，注射剂量为 500μL/只次。后每隔2周加强一次，以相同方式进行加强免疫，免疫 原为实施例1制备的CVA6病毒原液与弗氏非完全佐剂的混合物，每 次免疫前采集20μL尾静脉血或200μL眼球静脉血以备滴度测定。用 间接ELISA测定血清滴度，当小鼠血清滴度达到平台期后，小鼠停止 免疫并休息两个月后进行融合。融合前72h，直接向小鼠脾脏注射 100μL CVA6病毒原液(不加佐剂)，进行免疫加强。72h后，处死小 鼠收集小鼠抗血清(小鼠多抗血清)，同时取小鼠脾脏制成细胞悬液 (悬于RPMI 1640培养基中)，细胞计数板计数。按1/6于脾细胞的数 量与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0混合，随后使用50％聚乙二醇(PEG)进行细胞融合。将细胞悬液与等体积的饲养细胞(BALB/c小鼠巨噬细胞 及胸腺细胞)混合后，置入96孔细胞培养板中(200μL/孔)，5％CO2， 37℃。3天后，用含次黄嘌呤、氨基蝶呤与胸腺嘧啶核苷的1640培养 基半换液。七天后，用CVA6病毒原液包被ELISA板，用间接ELISA 方法检测杂交瘤细胞培养上清。对于ELISA阳性的细胞孔，利用有限 稀释法进行克隆化。
单克隆抗体的纯化：取10周龄的健康BALB/c小鼠，腹腔注射石 蜡油，每只0.5mL。2-7天后，收集克隆化的杂交瘤细胞，离心去上清， 加入不含血清的1640HT培养基，调节细胞密度至2×105-2×106个 /mL，每只小鼠注射0.5mL。7-10天后小鼠腹部增大，开始收集腹水。 3000rpm离心15min，吸取中间澄清的液体，-20℃保存。腹水采集完 毕后进行抗体纯化。将腹水用0.02mol/L、pH7.4的PBS对倍稀释，搅 拌下缓慢加入等体积的饱和硫酸铵，4℃过夜。4℃，12000rpm离心 15min，弃上清。将沉淀溶于适量的PBS中，装入透析袋中，放入50-100倍体积的0.02mol/L PB(pH7.4)中，4℃下搅拌脱盐12h左右， 期间更换3次透析液。将透析过得抗体用Protein A柱(GE)在AKTA 纯化系统下纯化，0.02mol/L PB(pH7.4)条件下亲和挂柱，用0.1M 的柠檬酸洗脱，洗脱液即为纯化的抗体。将洗脱液透析至0.02mol/L PB(pH7.4)中，-20℃保存。
实施例3：可特异结合CVA6病毒颗粒抗原的抗体的筛选
ELISA实验(间接法)：将实施例1制备的CVA6病毒颗粒抗原用 20mM PB7.4稀释100倍，包被96孔酶标板，100μL/孔，37℃包被2h， 用PBST洗板1次，用相关封闭液(20mM PB7.4含150mM NaCl， 0.5％酪蛋白，0.002％明胶)封闭非特异性结合位点，200μL/孔，4℃ 封闭过夜。将实施例2制备的待测单克隆抗体样品(1mg/mL)稀释 200倍(稀释液配方同封闭液)，取100μL加入酶标板，37℃孵育1h。 PBST洗板5次，加入GAM-HRP(辣根过氧化酶标记的羊抗鼠抗体， 购自美国bio-rad公司，稀释液配方同封闭液)，37℃孵育30min。 PBST洗板5次，加入TMB显色液显色15min，终止液终止，酶标仪 (TECAN sunrise)读值。最终从30余株单克隆抗体中筛选获得3株 可特异性结合CVA6病毒颗粒抗原的单抗6C8、4D6和2B5(图2)。
进一步对单抗6C8、4D6和2B5进行可变区序列分析，其VH和VL 序列如下表所示。进一步，基于IMGT数据库 (http://www.imgt.org/IMGT_vquest/analysis)确定了三株单抗的CDR 序列。
表2：单抗可变区序列
Figure BDA0002468382590000301
实施例4：单克隆抗体6C8、4D6和2B5分别可特异性结合CVA6 病毒颗粒抗原
抗体标记辣根过氧化酶(HRP)：
取HRP、NaIO4各1mg，加超纯水溶解；然后向HRP溶液中逐滴 加入NaIO4溶液，边加边摇晃混匀，并将混好的溶液置于4℃，避光 30min；取1μL乙二醇溶于超纯水中，逐滴加入，边加边摇晃混匀， 室温避光静置30min，至此酶氧化过程完成。在氧化HRP的过程中， 用pH9.6的50mM CB缓冲液透析纯化的抗体。HRP氧化完后，将透 析好的抗体与HRP按所需比例混合，于50mM CB缓冲液中透析6h以 上；然后用新鲜配制的NaBH4溶液终止，NaBH4量为0.2mg；摇匀， 4℃静置2h。然后用pH7.2的10mM PBS透析过夜。
ELISA实验(直接法)：
将实施例1制备的CVA6病毒颗粒抗原用20mM PB7.4稀释100 倍，包被96孔酶标板，100μL/孔，37℃包被2h，用PBST洗板1次， 用相关封闭液(20mM PB7.4含150mM NaCL,0.5％酪蛋白，0.002％ 明胶)封闭非特异性结合位点，200μL/孔，4℃封闭过夜。取标记辣根 过氧化酶的单抗稀释2000倍，取100μL加入酶标板，37℃孵育30min。 PBST洗板5次，加入TMB显色液显色15min，终止液终止，酶标仪 (TECAN sunrise)读值。结果显示在直接ELISA体系中，单抗6C8、 4D6和2B5均可特异性结合CVA6病毒颗粒抗原(图3)。
实施例5：抗体亚型的鉴定
将实施例1制备的CVA6病毒实心颗粒抗原用20mM PB7.4稀释 100倍，包被96孔酶标板，100μL/孔，37℃包被2h，用PBST洗板1 次，用相关封闭液(20mM PB7.4含150mM NaCl，0.5％酪蛋白， 0.002％明胶)封闭非特异性结合位点，200μL/孔，4℃封闭过夜。取 稀释500倍的单抗100μL加入酶标板，37℃孵育1h。PBST洗板5次， 分别加入标记HRP的抗IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3和IgM的羊抗 鼠二抗(Thermo)。37℃孵育30min。PBST洗板5次，加入TMB显 色液显色15min，终止液终止，酶标仪(TECAN sunrise)读值。结 果显示，单抗6C8、4D6和2B5均为IgG1亚型。
实施例6：单克隆抗体6C8、4D6和2B5可分别用于在免疫荧光实 验中检测CVA6感染的细胞
将RD细胞铺于24孔细胞培养板中(500μL，5×104/孔)，孔内预 先铺上圆形盖玻片。待细胞贴壁后，接种CVA6病毒，5000TCID50/孔， 同时设置细胞空白对照。12h后，用枪尖吸去上清，用PBS洗液洗一 次，1mL/孔。吸去PBS，加4％多聚甲醛，1mL/孔，常温避光固定15min。加入0.5％TritonX-100(PBS配制)通透，1mL/孔，室温， 10min。PBS洗三次，每次3min。把一张封口膜拉平固定在24孔细胞 培养板板盖上，在封口膜上对应每孔滴加50μL山羊血清。加好后，用 弯针头将铺有细胞的盖玻片掀起，镊子夹住边缘，细胞面朝下盖在膜上，放入湿盒，37℃，1h。将盖玻片按原孔放回24孔板中，细胞面朝 上，PBS洗三次，每次3min。取抗体(1mg/mL)用2％BSA稀释200倍， 加至细胞上(操作方法同封闭过程)，37℃封闭1h。将盖玻片按原孔 放回24孔板中，细胞面朝上，PBS洗三次，每次3min。用2％BSA稀 释二抗GAM-FITC(Sigma)，1:500倍稀释，湿盒避光37℃孵育 30min(操作方法同封闭过程)。将盖玻片按原孔放回24孔板中，细胞 面朝上，PBS洗三次，每次3min。用PBS按1:2000比例稀释DAPI (Invitrogen)，加至细胞上(操作方法同封闭过程)，室温避光5min。 将盖玻片按原孔放回24孔板中，细胞面朝上，PBS洗三次，每次3min。 避光。在干净载玻片上做好标记，将封片剂(70％甘油，2.5％防促灭 剂)30μL左右滴于擦净的载玻片上盖上有细胞的盖玻片，指甲油封边 缘，避光晾干。荧光显微镜下观察并拍照。结果显示被CVA6病毒感 染的细胞有绿色荧光，而空白对照无绿色荧光(图4)。说明单抗6C8、 4D6和2B5均可用于检测CVA6感染的细胞。
实施例7：单克隆抗体6C8、4D6和2B5的中和效价
中和实验：用传统中和实验方法鉴定杂交瘤细胞培养上清或粗纯 抗体的中和活性。将人横纹肌肉瘤细胞(RD)铺于96孔细胞培养板 中(5×103/孔)。10h后将待测样品用无血清MEM培养基进行倍比稀 释(以8倍稀释为起点，进行2倍比稀释，稀释10个梯度)，每份样品 至少重复4孔。用无血清MEM将CVA6-TW-2007-00141病毒稀释至 100TCID50/50μL的浓度，取50μL加入上述已梯度稀释的单抗样品孔 中。37℃孵育1h后，将单抗与病毒混合液100μL加入预铺有RD细胞 的96孔细胞培养板中。37℃，5％CO2培养，连续观察7天并记录细 胞病变。可以抑制50％以上细胞孔病变的最大稀释倍数作为该样品的 中和效价。结果显示单抗6C8、4D6和2B5均具有较高的体外中和活 性，中和效价分别为4096、8192和4096。
实施例8：单克隆抗体6C8、4D6和2B5的体内预防CVA6病毒实 验
实验新生鼠分组如下：选用一日龄BALB/c小鼠，设置抗体预防 组和PBS对照组，每组15只。新生鼠饥饿4h后，对其腹腔注射单抗， 剂量为10μg/只；PBS对照组腹腔注射同体积的PBS。4h后，对抗体 预防组和PBS对照组的新生鼠腹腔注射感染CVA6病毒，攻毒剂量为1.0×106TCID50。以上动物均连续观察20天。
实验结果显示(图5)PBS对照组小鼠在攻毒后7天大部分死亡。 单体6C8、4D6和2B5预防组体症均正常，未见异常。说明单抗6C8、4D6和2B5均有预防CVA6感染的作用。
实施例9：单克隆抗体6C8、4D6和2B5的体内治疗CVA6病毒实 验
所述的单抗6C8、4D6和2B5对CVA6病毒均具有较高的中和活 性，将其用于单抗治疗CVA6感染动物模型试验中可以保护CVA6感 染鼠免于发病。
实验新生鼠分组如下：选用一日龄BALB/c小鼠，设置抗体保护 组和PBS对照组，每组15只。新生鼠饥饿4h后，对抗体保护组和 PBS对照组的新生鼠腹腔注射感染CVA6病毒，攻毒剂量为1.0×106 TCID50。抗体保护组在攻毒后24h，对其腹腔注射单抗，剂量为10μg/ 只；PBS对照组腹腔注射同体积的PBS。以上动物均连续观察20天。
实验结果见图6，PBS对照组小鼠，出现消瘦症状，攻毒后5天出 现后肢瘫痪症状，攻毒后7天大部分小鼠死亡。单抗6C8、4D6和2B5 保护组体症均正常，未见异常。说明单抗6C8、4D6和2B5均可有效 治疗被CVA6感染的小鼠。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人 员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动， 并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权 利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 北京万泰生物药业股份有限公司；厦门大学
<120> 抗柯萨奇A6型病毒的单克隆抗体及其应用
<130> IDC200066
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 1
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Tyr
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
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1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
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<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 4
Gln Glu Ile Gly Ala Phe
1 5
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<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus
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Ala Ala Ser
1
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<211> 9
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<213> Mus musculus
<400> 6
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1 5
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<213> Mus musculus
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<212> PRT
<213> Mus musculus
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<213> Mus musculus
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Ala Val Ser
1
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<211> 9
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<213> Mus musculus
<400> 13
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<210> 14
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1 5
<210> 15
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<211> 9
<212> PRT
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<400> 19
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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<213> Mus musculus
<400> 20
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20 25 30
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50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
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115
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Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
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<400> 23
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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
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Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Asn His Leu Lys Ser Leu Thr Trp Val
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Gly Arg Ile Asn Pro His Asn Gly Val Ala Asp Tyr Asp Gln Ile Leu
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Leu Glu Phe His Ser Leu Thr Tyr Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
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Thr Val Ser
115
<210> 24
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<213> Mus musculus
<400> 24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
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Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Arg Ser Phe
20 25 30
Leu Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Val Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly
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Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<212> DNA
<213> Mus musculus
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tcctgcaagg cttcaggtta ttcttttact ggctactaca tgcactgggt gaagcaaagc 120
catgtaaaga gtcttgagtg gattggacgt atcaatcctc acaatggtgt tccgaactac 180
aaccagaatt tcaaggacaa ggccaccttg actgtagata agtcctccac cacagcctac 240
atggagctcc acagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgt aagtggaagt 300
agcgactttg actattgggg ccgaggcgcc actctcacag tctcc 345
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<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 26
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctctgggaga aagagtcact 60
ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattggt gctttcttag gctggcttca gcagaaacca 120
gatggaatta ttaaacgcct aatctacgcc gcatccgttt tagattctgg tgtcccaaaa 180
aggttcagtg gcagtaggtc tgggtcagat tattctctca ccatcagcag tcttgagtct 240
gaggattttg cagactatta ctgtctacaa tatgttagtt ttcctcggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
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<211> 345
<212> DNA
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gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgcaagg cttcgggtta ttcatttact ggctattaca tgcactgggt gaaacaaagc 120
catgaaaaga gtcttgagtg ggttggacgt attaaccctc acaatggtgt tgccgactac 180
aaccagattt tgaagggcaa ggccgccttg actgtagata aatcttccac cacagcctac 240
atggagttcc acagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgt aagtggaagt 300
agcgactttg actactgggg ccaaggcacc cctctcacag tctct 345
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<212> DNA
<213> Mus musculus
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gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctctgggaga aagagtcagt 60
ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagg agtttcttag gctggcttca gcagaaacca 120
gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc gtatccaatt tagactctgg tgtcccaaaa 180
aggttcagtg gcagtaggtc tgggtcagat tattctctca ccatcagcag ccttgagtct 240
gaagattttg cagactatta ctgtctacaa tatattagtt ttcctcggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
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<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 29
gaggtccact tacaacagtc tggacctgaa ctggtgaagc ctgggtcttc agtgaagata 60
tcctgcaagg cttctggtta ttcatttact ggctattaca tacactgggt gaaacaaaac 120
catctaaaga gtcttacgtg ggttggacgt attaaccctc acaatggtgt tgccgactat 180
gatcagattt tgaggggcag ggccgccttg actgtggata aatcttccac cacagcctac 240
ctggagttcc acagcctgac atatgaggac tctgcagtct atttctgtgt aagtggaagt 300
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<212> DNA
<213> Mus musculus
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gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc gtttccaatt tagactctgg tgtcccaaaa 180
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gaagattttg cagactatta ctgtctacaa tatattagtt ttcctcggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321

Claims (15)

1.一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
(1)氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示的VH CDR1-3，和/或，氨基酸序列分别如SEQID NO:4-6所示的VL CDR1-3；
(2)氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7-9所示的VH CDR1-3，和/或，氨基酸序列分别如SEQID NO:10-12所示的VL CDR1-3；或者
(3)氨基酸序列分别如SEQ ID NO:13-15所示的VH CDR1-3，和/或，氨基酸序列分别如SEQ ID NO:16-18所示的VL CDR1-3。
2.权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
(1)重链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：19所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的序列；和/或，轻链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：20所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的序列；
或，
(2)重链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：21所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的序列；和/或，轻链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：22所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的序列；
或，
(3)重链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：23所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的序列；和/或，轻链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：24所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的序列。
3.权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体选自鼠源抗体、嵌合抗体(例如，人鼠嵌合抗体)、人源化抗体或多特异抗体；和/或，所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段或单链抗体(例如，scFv)。
4.权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体为IgG抗体(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体)。
5.权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料、放射性核素或生物素。
6.分离的核酸分子，其编码权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。
7.载体，其包含权利要求6所述的核酸分子；优选地，所述载体为克隆载体或表达载体。
8.宿主细胞，其包含权利要求6所述的核酸分子或权利要求7所述的载体。
9.制备权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述单克隆抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养权利要求8所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述单克隆抗体或其抗原结合片段。
10.试剂盒，其包括权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；
例如，所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料、放射性核素或生物素；
例如，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述单克隆抗体或其抗原结合片段；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料、放射性核素或生物素。
11.用于检测柯萨奇A6型病毒在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述检测是免疫学检测，例如酶免疫测定法(例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法；
例如，所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料、放射性核素或生物素；
例如，所述方法还包括，使用携带可检测的标记(例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料、放射性核素或生物素)的第二抗体来检测所述单克隆抗体或其抗原结合片段。
12.权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测柯萨奇A6型病毒在样品中的存在或其水平，和/或用于诊断受试者是否感染了柯萨奇A6型病毒；
优选地，所述试剂盒通过权利要求11所述的方法来检测柯萨奇A6型病毒在样品中的存在或其水平；
优选地，所述样品为来自受试者(例如哺乳动物，优选人)的血液样品(例如，全血、血浆或血清)、排泄物、口腔或鼻腔分泌物、或肺泡灌洗液。
13.药物组合物，其包含权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂；
优选地，所述药物组合物还包含另外的药学活性剂，例如另外的抗病毒剂。
14.用于中和样品中柯萨奇A6型病毒的毒力的方法，其包括，将包含柯萨奇A6病毒的样品与权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段接触。
15.权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段用于制备药物的用途，所述药物用于中和样品中柯萨奇A6型病毒的毒力，或用于预防或治疗受试者的柯萨奇A6型病毒感染或与柯萨奇A6型病毒感染相关的疾病(例如手足口病)；
优选地，所述受试者是哺乳动物，例如人；
优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段单独使用，或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂)联合使用。
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