CN116041492A - 一种抗rbd抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗RBD抗体及其应用。本发明提供的抗RBD抗体能够特异性地与SARS‑CoV‑2的RBD蛋白结合,可有效抑制病毒入侵,与奥密克戎等变异病毒结合活性优异,针对广谱变异病毒均有良好的阻断和中和活性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种抗RBD抗体及其应用。
背景技术
自SARS-CoV-2被发现以来,全世界范围内已有20多个变异株,截至2022年1月7日,WHO定义了5个关切变异株(variant of concern,VOC),即阿尔法(α)、贝塔(β)、伽马(γ)、德尔塔(δ)和奥密克戎(ο)。2022年5月,世卫组织表示,已有128个国家和地区报告发现了奥密克戎变异株。在德尔塔变异毒株中突变的氨基酸残基数量为18个,而在新毒株奥密克戎中则有43个。这些变异多样化,且大部分位于与人体细胞相互作用的区域。由于病毒变异率高,传播范围广,大量的疫苗和药物也在大量研发,疫苗和抗体药物出现耐药以及脱靶风险提高,这也给新型抗体药物以及疫苗研发提出更高要求,也提供了更多机遇。
新冠病毒具有四个结构蛋白,结构蛋白介导病毒粒子的组装与感染。N蛋白组成了基因组外的核衣壳,随后在外层还有膜蛋白(M),刺突蛋白(S),包膜蛋白(E)所组成的病毒囊膜结构。
SARS-CoV-2的S蛋白为病毒表面的一类标志性跨膜蛋白,是由3个相同的亚基通过非共价键的方式结合形成的同源三聚体,其相对分子质量为141178,含有1273个氨基酸。S蛋白主要由信号肽、N端结构域、受体结合结构域(RBD)、融合肽段、七肽重复序列(heptadrepeat,HR)1、HR2、跨膜结构域、胞质结构域等构成,同时具有S1/S2与S2两个切割位点。S蛋白的氨基酸顺序。相关研究显示,HR1和HR2会在S1的RBD与靶细胞的ACE2结合后,形成融合核心(6-HB),提高病毒融合和感染的效率。
SARS-CoV-2的细胞受体血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme2,ACE2)是肾素-血管紧张素系统的主要活性肽。目前认为,在SARS-CoV-2感染中,ACE2为病毒进入细胞的主要受体。ACE2作为含锌羧肽酶的Ⅰ型跨膜蛋白,多表达于肾脏、心脏和男性生殖系统,同时也在肺、小肠和肝脏等组织中表达。刺突蛋白在病毒入侵过程中起着主要的作用,并且S蛋白为主要免疫原。该蛋白会刺激机体产生大量抗体,这些抗体会结合到S蛋白表面,阻断病毒与宿主识别,抑制病毒蛋白剪切变构,从而抑制病毒入侵。
因此开发抑制新型冠状病毒S蛋白识别宿主(阻断RBD与ACE2蛋白结合抗体)可有效抑制病毒入侵。本发明提供了一种全新的抗RBD的抗体,可有效抑制病毒入侵,与病毒结合活性好,针对广谱变异病毒均有良好的阻断和中和活性。
发明内容
为了解决市面上没有针对奥密克戎病毒具有良好阻断活性的抗体,本发明提供了一种抗RBD抗体,可有效抑制病毒入侵,与病毒结合活性好,针对广谱变异病毒均有良好的阻断和中和活性。
本发明提供了分离的单克隆人抗体或其抗原结合部分,其在刺突蛋白或其片段,例如胞外域,或更具体地,刺突蛋白的受体结合结构域处特异性结合冠状病毒如SARS-CoV-2,(i)防止或阻断冠状病毒如SARS-CoV-2进入宿主细胞,和/或(ii)诱导补体介导的冠状病毒如SARS-CoV-2失活和/或吞噬作用。本发明的抗体还可以结合在受感染宿主细胞上展示的冠状病毒如SARS-CoV-2的刺突蛋白,诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、抗体依赖性细胞介导的病毒抑制作用(ADCVI)和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)以消除受感染的细胞。本发明的抗体可包被在冠状病毒如SARS-CoV-2或展示冠状病毒刺突蛋白的感染细胞上形成免疫复合物,该免疫复合物可被抗原呈递细胞如树突状细胞识别,诱导体液和细胞抗病毒免疫反应。
该抗体或其抗原结合部分可用于体外检测冠状病毒如SARS-CoV-2,以及治疗或预防由冠状病毒引起的疾病。
因此,本发明提供了一种抗RBD的单克隆抗体或其抗原结合部分,其特异性结合冠状病毒的刺突蛋白或其片段,所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区,其中
(a)所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3,所述HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列包含至多三个氨基酸突变的变体;所述HCDR2包含SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列包含至多三个氨基酸突变的变体;所述HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列包含至多三个氨基酸突变的变体;和/或
(b)所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3,所述LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列包含至多三个氨基酸突变的变体;所述LCDR2包含SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列包含至多三个氨基酸突变的变体;所述LCDR3包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列包含至多三个氨基酸突变的变体。
在某些实施方案中,HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:1、2、3所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:4、5、6所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体。
在某些实施方案中,所述重链可变区包含与SEQ ID NO:7、13、16所示氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:8、14所示氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中,所述重链可变区和所述轻链可变区具有与SEQ ID NO:7、13、16和SEQ ID NO:8、14所示的氨基酸序列分别包含至少80%同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中,所述单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链恒定区和/或轻链恒定区。
在某些实施方案中,重链恒定区是IgG、IgA、IgD、IgE和IgM恒定区。
在某些实施方案中,重链恒定区是IgG1、IgG2(例如IgG2a)、IgG3或IgG4恒定区。
在某些实施方案中,本发明的抗体或抗原结合部分可以是抗体片段,例如Fab、F(ab')2、Fv、scFv或(scFv)2。
在另一个方面,本发明提供了一种双特异性分子,其可以包含与第二功能部分(例如,第二抗体或其抗原结合部分)连接的本发明的抗体或其抗原结合部分),该第二功能部分具有与本发明的抗体或其抗原结合部分不同的结合特异性,例如结合冠状病毒刺突蛋白的另一个表位。本发明还提供了一种免疫偶联物,例如抗体-药物偶联物,其可以包含与治疗剂如细胞毒素连接的本发明的抗体或其抗原结合部分。在另一个方面,本发明的抗体或其抗原结合部分可以制成嵌合抗原受体(CAR)的一部分。还提供了可以包含抗原嵌合受体的免疫细胞,例如T细胞。
在另一个方面,本发明提供了一种编码本发明的抗体或其抗原结合部分的核酸分子,以及可以包含此类核酸分子的表达载体和可以包含所述表达载体的宿主细胞。还提供了一种使用宿主细胞制备本发明的抗体或其抗原结合部分的方法,该方法可以包括以下步骤:(i)在宿主细胞中表达抗体或其抗原结合部分和(ii)从宿主细胞或其细胞培养物中分离抗体或其抗原结合部分。
在另一个方面,本发明提供了一种组合物,该组合物可以包含本发明的抗体或其抗原结合部分、免疫偶联物、双特异性分子、具有CAR的免疫细胞或表达载体,以及药学上可接受的载体。在一些实施方案中,组合物可以包含多于一种本发明的抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中,组合物可以包含表达多于一种本发明的抗体或其抗原结合部分的载体。在一些实施方案中,组合物可以包含用多于一种本发明的抗体或其抗原结合部分产生的免疫偶联物。在一些实施方案中,组合物可以包含具有多于一种本发明的抗体或其抗原结合部分的双特异性分子。在一些实施方案中,组合物可以包含在CAR中具有多于一种本发明内容的抗体或其抗原结合部分的免疫细胞。
在另一个方面,本发明提供了一种在有需要的受试者中治疗由冠状病毒感染引起的疾病的方法,包括向受试者施用治疗有效量的本发明的抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中,施用多于一种抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中,该方法可以包括施用本发明的双特异性分子、免疫偶联物或具有CAR的免疫细胞。冠状病毒可以是SARS-CoV、MERS-CoV或SARS-CoV-2。在一些实施方案中,冠状病毒是SARS-CoV-2。
在另一个方面,本发明提供了一种在有需要的受试者中预防由冠状病毒感染引起的疾病的方法,包括向受试者施用本发明的抗体或其抗原结合部分。冠状病毒可以是SARS-CoV、MERS-CoV或SARS-CoV-2。在一些实施方案中,冠状病毒是SARS-CoV-2。在某些实施方案中,受试者是人。受试者可能是暴露于冠状病毒引起的疾病或暴露于冠状病毒(例如SARS-CoV-2)的,但不能通过疫苗接种得到保护。
具体而言,本发明包括如下技术方案:
1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其特异性结合冠状病毒的刺突蛋白或其片段,所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区,
(a)所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3,
所述HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列包含至多三个氨基酸突变的变体;所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列包含至多三个氨基酸突变的变体;所述HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列包含至多三个氨基酸突变的变体;和/或
(b)所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3,
所述LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列包含至多三个氨基酸突变的变体;所述LCDR2包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列包含至多三个氨基酸突变的变体;所述LCDR3包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列包含至多三个氨基酸突变的变体。
2.根据方案1所述的抗体或其抗原结合部分,其中HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:1、2、3所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:4、5、6所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体。
3.根据方案1或2所述的抗体或其抗原结合部分,其中所述重链可变区包含与SEQID NO:7、13、16所示氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
4.根据方案1或2所述的抗体或其抗原结合部分,其中所述轻链可变区包含与SEQID NO:8、14所示氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
5.根据方案1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合部分,其中所述重链可变区和所述轻链可变区分别包含与SEQ ID NO:7、13、16和SEQ ID NO:8、14所示氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
6.根据方案1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合部分,其包含重链恒定区和/或轻链恒定区。
7.根据方案6所述的抗体或其抗原结合部分,其中所述重链恒定区是IgG、IgA、IgD、IgE和IgM恒定区。
8.根据方案6或7所述的抗体或其抗原结合部分,其中所述重链恒定区是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区。
9.根据方案6所述的抗体或其抗原结合部分,其中所述重链恒定区是具有如SEQID NO:15和17所示的含氨基酸突变的序列
10.根据方案6所述的抗体或其抗原结合部分,其中所述轻链恒定区是κ或λ恒定区。
11.根据方案10所述的抗体或其抗原结合部分,其中所述轻链恒定区是具有SEQID NO:12的氨基酸序列的人κ恒定区。
12.根据方案1-11中任一项所述的抗体或其抗原结合部分,其为人抗体或其抗原结合部分。
13.根据方案1-12中任一项所述的抗体或其抗原结合部分,其为全长IgG抗体或Fab片段。
14.根据方案1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合部分,其与选自SARS-CoV、SARS-CoV-2和MERS-CoV的冠状病毒的刺突蛋白或其片段结合。
15.根据方案1-14中任一项所述的抗体或其抗原结合部分,其与冠状病毒的刺突蛋白的受体结合域或胞外域结合。
16.根据方案1-15中任一项所述的抗体或其抗原结合部分,其(a)与SARS-CoV-2的刺突蛋白或其片段结合,(b)抑制SARS-CoV-2的刺突蛋白或其片段与人ACE2结合,(c)阻止SARS-CoV-2进入宿主细胞,(d)诱导补体介导的SARS-CoV-2失活;(e)诱导SARS-CoV-2的吞噬作用,(f)诱导针对SARS-CoV-2感染细胞的补体依赖性细胞毒性,(g)诱导针对SARS-CoV-2感染细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用,(h)诱导针对SARS-CoV-2感染细胞的抗体依赖性细胞介导的病毒抑制作用,(i)诱导针对SARS-CoV-2感染细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性,和/或(j)诱导体液和细胞抗病毒免疫反应。
17.根据方案16所述的抗体或其抗原结合部分,其与SARS-CoV-2的刺突蛋白的胞外域结合,并阻断SARS-CoV-2刺突蛋白胞外域与人ACE2结合。
18.根据方案17所述的抗体或其抗原结合部分,其与SARS-CoV-2的刺突蛋白的受体结合域结合,并阻断SARS-CoV-2刺突受体结合域与人ACE2结合。
19.一种双特异性分子、免疫偶联物或嵌合抗原受体,其包含方案1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
20.一种核酸分子,其编码方案1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
21.一种表达载体,其含有方案20所述的核酸分子。
22.一种宿主细胞,其含有方案21所述的表达载体。
23.一种组合物,其包含方案1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合部分,方案19所述的双特异性分子、免疫偶联物或嵌合抗原受体,方案20所述的核酸分子,方案21所述的表达载体,和/或方案22所述的宿主细胞。
24.一种在有需要的受试者中治疗由冠状病毒感染引起的疾病的方法,包括向受试者施用方案23所述的组合物。
25.根据方案24所述的方法,其中所述疾病是由SARS-CoV、MERS-CoV或SARS-CoV-2引起的。
26.根据方案25所述的方法,其中所述疾病是由SARS-CoV-2引起的。
27.根据方案24-26所述的方法,其中所述受试者是人。
28.一种在有需要的受试者中预防由冠状病毒感染引起的疾病的方法,包括向受试者施用方案1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
29.根据方案28所述的方法,用于预防由SARS-CoV、MERS-CoV或SARS-CoV-2引起的疾病。
30.根据方案29所述的方法,用于预防由SARS-CoV-2引起的疾病。
31.根据方案28-30中任一项所述的方法,其中所述受试者是人。
32.根据方案28-31中任一项所述的方法,其中所述受试者不受疫苗接种的保护。
33.一种诊断受试者中冠状病毒感染的方法,包括使方案1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合部分与来自受试者的组织样品接触。
本发明的其他特征和优点将从以下详细描述和不应被解释为限制的示例中显而易见。在整个本申请中引用的所有参考文献、GenBank条目、专利和公开的专利申请的内容通过引用明确并入本文。
术语定义
除非另有定义,本文使用的所有领域术语、符号和其它科学术语旨在具有本发明所属领域技术人员通常理解的含义。在某些情况下,为了清楚起见和/或为了便于参考,本文定义了具有通常理解的含义的术语,并且在此包含此类定义不应被解释为表示与本领域中通常理解的事情的差异。
术语“SARS-CoV-2”是指严重急性呼吸综合征冠状病毒2号,属于冠状病毒科、β冠状病毒属(包括SARS-CoV和MERS-CoV)。
术语“刺突蛋白”是冠状病毒用来侵入宿主细胞的跨膜蛋白。SARS-CoV-2的刺突蛋白含有与宿主细胞受体结合的第一亚基(S1亚基)和用于病毒和细胞膜融合的第二亚基(S2亚基)。S1亚基中有一个受体结合域(RBD),其与宿主细胞受体结合。关于RBD蛋白和SARS-CoV-2突刺蛋白的详细信息可以参考Meng Yuan et al.,2020,A highly conservedcryptic epitope in the receptor binding domains of SARS-CoV-2and SARS-CoV,Science/j
术语“抗体”包含包括通过双硫键相互连接的四条多肽链,二条重(H)链和二条轻(L)链的免疫球蛋白分子以及其多聚体(例如IgM)。每个L链通过一个共价二硫键连接于H链,而两个H链视H链同种型而定通过一个或多个二硫键彼此连接。每个重链在N末端具有可变区,继之以恒定区。各重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区。这一重链恒定区包含三个区(结构域),CH1、CH2和CH3。各轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个区(结构域,CL1)。VH和VL区可进一步细分为高变区,称为互补决定区(CDR),其间散布着较保守性区域,称为框架区(framework region,FR,也称骨架区、构架区)。各VH和VL是由三个CDR和四个FR所组成,以下列顺序由氨基端排列到羧基端:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗体可以是不同亚类(subclass)的抗体。
术语“抗原结合部分”或“抗原结合片段”是指保留特异性结合抗原的能力的抗体的一个或多个片段(例如,SARS-CoV-2刺突蛋白)。已经表明,抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。包含在抗体的术语“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括但不限于(i)Fab片段,由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段;(ii)F(ab')2片段,一种二价片段,包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段;(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段;(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段,(v)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341:544-546),其由VH结构域组成;(vi)分离的互补决定区(CDR);(viii)纳米抗体,重链可变区,包含一个可变结构域和两个恒定结构域。此外,尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码,但可以使用重组方法通过合成接头将它们连接起来,从而使它们成为单个蛋白质链,其中VL和VH区配对形成单价分子。此类单链抗体也意在包含在抗体的术语“抗原结合部分”内。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的,并且以与完整抗体相同的方式筛选片段的用途。
术语“Fc区”是抗体的尾部区域,它与Fc受体和补体系统的一些蛋白质相互作用以激活免疫系统。IgG、IgA和IgG Fc区由来自抗体重链的第二和第三恒定域(CH2和CH3)的两个相同片段组成,而IgM和IgE Fc区含有三个重链恒定域(CH域2-4)。Fc区可与补体成分C1q结合以激活经典的补体级联反应,可与吞噬细胞(即巨噬细胞、粒细胞和树突细胞)上的Fc受体结合以诱导被抗体结合的细胞的吞噬作用,可与免疫效应细胞(主要是自然杀伤细胞)的Fc受体结合以诱导免疫效应细胞释放细胞毒性颗粒,导致抗体包被细胞死亡,并可与抗原呈递细胞如树突状细胞的Fc受体结合以诱导体液和细胞抗病毒免疫反应。
术语“嵌合抗体”是抗体分子(或其抗原结合片段),其中(1)所述恒定区或其部分被改变、置换或更换,使得所述抗原结合位点(可变区)与不同或改变的类型、效应子功能和/或种类的恒定区连接,或者与赋予嵌合抗体新特性的完全不同的分子(例如酶、毒素、激素、生长因素、药物等)连接;或(2)所述可变区或其部分被改变、置换或更换为具有不同或改变的抗原特异性的可变区。例如,可以通过用来自人免疫球蛋白的恒定区替代其恒定区来修饰小鼠抗体。由于被人恒定区置换,所述嵌合抗体可以保留其识别抗原的特异性,同时与原始小鼠抗体相比在人体中具有降低的抗原性。
术语“人源化抗体”是指含有源于人抗体序列的氨基酸残基的嵌合抗体。人源化抗体可含有来自非人动物或合成抗体的CDR中的一些或全部,而抗体的框架区和恒定区含有源于人抗体序列的氨基酸残基。可以克服嵌合抗体由于携带大量异源蛋白成分,从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。为避免免疫原性下降的同时,引起的活性下降,可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少的反向突变或回复突变,以保持活性。
术语“单克隆抗体”是指均一的、仅针对某一特定抗原表位的抗体。与典型地包括针对不同抗原决定簇(表位)的不同抗体的普通多克隆抗体制剂相比,每种单克隆抗体针对抗原上的单个抗原决定簇。修饰语“单克隆”表示抗体的均一特征,不解释为需要通过任何特定方法产生的抗体。本发明的单克隆抗体优选通过重组DNA方法产生,或通过本文其它地方描述的筛选方法获得。
术语“分离的单克隆抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如,特异性结合SARS-CoV-2刺突蛋白的分离抗体基本上是不含特异性结合除SARS-CoV-2刺突蛋白以外的抗原的抗体)。然而,特异性结合SARS-CoV-2刺突蛋白的分离抗体可能与其他抗原具有交叉反应性,例如,来自其他病毒(如冠状病毒)的刺突蛋白。此外,分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。
术语“亲和力”是指分子的单个结合位点(例如,MIAC的抗原结合模块)与其结合配偶体(例如,抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。在各抗原位点内,抗体“臂”的可变区通过弱非共价力与抗原在多个氨基酸位点处相互作用;相互作用愈大,亲和力愈强。除非另外指示,否则如本文所用的“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如,抗体与抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其搭配物Y的亲和力一般可由解离常数(Kd)表示。亲和力可通过本领域中已知的常用方法测量,例如通过使用表面等离子体共振(SPR)技术(例如仪器)或生物层干涉测量法(例如,仪器)来测量。
术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指将确定的特异性移植到免疫效应细胞,通常是T细胞上并增强T细胞功能的工程化受体。新一代CAR包括一个胞外结合结构域,包括一个scFv、一个铰链区、一个跨膜结构域和一个胞内信号结构域(主要是CD3-zeta的胞质结构域,它是T细胞激活信号的主要传递器),加上一个或多个共同刺激域)。CARs可能进一步具有增强T细胞扩增、持久性和抗肿瘤活性的因子,例如细胞因子和共刺激配体。
术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的,但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时,核酸是“有效连接的”。
术语“载体”指用于将核苷酸编码信息转移到宿主细胞内的任一种分子(例如,核酸、质粒、或病毒等)。术语“载体”涵盖所有类型的载体,无论它们的功能如何。能够引导它们所操作性地连接的可表达核酸的表达的载体通常被称为“表达载体”。在本说明书中,“质粒”和“载体”可互换使用,因为质粒是最常用的载体形式。
术语“宿主细胞”指已经或者能够用核酸序列转化并从而表达所选的目的基因的细胞。该术语包括亲本细胞的后代,无论该后代与原来的亲本细胞在形态或基因组成上是否相同,只要后代存在所选目的基因即可。常用的宿主细胞包括细菌、酵母、哺乳动物细胞等。
术语“治疗”是指抑制、消除、减少和/或改善与正在治疗的疾病或病症,例如冠状病毒引起的疾病相关的症状、症状严重程度和/或症状频率。
术语“预防”是指为预防特定疾病(例如冠状病毒引起的疾病)而采取的行动。预防可以包括向暴露于疾病或引起疾病的病毒且不能通过疫苗接种保护的对象施用抗体。
术语“施用”是指通过本文描述的方法将治疗或药物组合物递送或导致递送至受试者身体的行为或本领域中已知的。施用治疗或药物组合物包括开具将被递送到患者体内的治疗或药物组合物的处方。示例性的给药形式包括口服剂型,例如片剂、胶囊剂、糖浆剂、混悬剂;可注射剂型,例如静脉内(IV)、肌内(IM)或腹膜内(IP);透皮剂型,包括霜剂、果冻剂、粉剂或贴剂;口腔剂型;吸入粉剂、喷雾剂、混悬剂和直肠栓剂。
术语“有效量”是指获得任一种或多种有益的或所需的治疗结果所必需的药物、化合物或药物组合物的量。对于预防用途,有益的或所需的结果包括消除或降低风险、减轻严重性或延迟病症的发作,包括病症、其并发症和在病症的发展过程中呈现的中间病理表型的生物化学、组织学和/或行为症状。对于治疗应用,有益的或所需的结果包括临床结果,诸如减少各种本发明靶抗原相关病症的发病率或改善所述病症的一个或多个症状,减少治疗病症所需的其它药剂的剂量,增强另一种药剂的疗效,和/或延缓患者的本发明靶抗原相关病症的进展。
术语“药学上可接受的载体”包括与药物施用相容的任何或所有溶剂、分散剂、包被物、抗细菌和抗真菌药剂、等渗和缓释剂,及其类似物。包括各种赋形剂、稀释剂和缓冲剂等,这些物质适合于人和/或动物施用而无过度的不良副反应,同时适合于维持位于其中的药物或活性剂的活力。合适的载体在Remington’s Pharmaceutical Sciences最新版中的标准参考文件中有所叙述,其通过在此引述而全部合并于本文。合适的载体或稀释剂例子包括但不局限于水、盐溶液、Ringer’s液、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。也可以使用脂质体和疏水介质如不挥发油。药物活性物质的介质和药剂的使用在本领域中是熟知的。除了那些对于活性成分不相容的常规介质或试剂以外,其在成分中的使用都可以达到预期效果。
术语“同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后,候选序列中与对照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行,例如使用公众可得到的计算机软件,诸如BLAST软件或FASTA程序包。术语“至少80%同一性”是指候选序列中与对照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率为80%以上,包括80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%。
术语“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指抗体介导的免疫机制,其中抗体与补体成分C1q结合并激活经典的补体级联反应,导致在细胞表面形成膜攻击复合物(MAC)和随后的细胞裂解。
术语“抗体依赖性细胞吞噬作用”或“ADCP”是指细胞介导的免疫机制,其中抗体的Fc部分与吞噬细胞(即巨噬细胞、粒细胞和树突细胞)上的Fc受体结合以诱导被抗体结合的细胞的吞噬作用。
术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞介导的免疫机制,其中抗体的Fc部分与免疫效应细胞(主要是自然杀伤细胞)的Fc受体结合,导致免疫效应细胞释放细胞毒性颗粒,导致抗体包被细胞死亡。
本发明的抗体或其抗原结合部分特异性结合冠状病毒例如SARS-CoV-2的刺突蛋白或其片段,更具体地结合刺突蛋白的受体结合结构域,并抑制结合刺突蛋白到其进入受体ACE2。本公开的抗体或其抗原结合部分还可以结合于病毒感染的宿主细胞上展示的刺突蛋白或其片段,例如受体结合结构域。
本发明的抗体或其抗原结合部分可以诱导(i)补体介导的冠状病毒例如SARS-CoV-2的失活,(ii)冠状病毒的吞噬作用,(iii)针对冠状病毒感染的宿主细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC),(iv)针对感染的宿主细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP),(v)针对冠状病毒感染的宿主细胞的抗体依赖性细胞介导的病毒抑制作用(ADCVI),(vi)针对冠状病毒感染的宿主细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC),和/或(vii)体液和细胞抗病毒免疫反应。
本发明的抗体或其抗原结合部分的重/轻链CDR和可变区的氨基酸序列和ID号列于下表1中。重链可变区CDR和轻链可变区CDR已由Kabat编号系统定义。然而,如本领域公知的,CDR区也可以基于重链/轻链可变区序列通过其他系统例如Chothia、AbM或Contact编号系统/方法来确定。
本发明的抗体可以含有重链恒定区,例如具有在例如SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列的人IgGl重链恒定区,和/或具有在例如SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列的轻链恒定区例如人κ恒定区。本发明的抗体还可以含有其他合适的重链恒定区和/或轻链恒定区。
表1.本发明的抗体的重/轻链的氨基酸或核苷酸序列
附图说明
图1为本发明的鼠源抗体与奥密克戎RBD结合活性。
图2为本发明的鼠源抗体与多种突变毒株病毒RBD结合活性。
图3为本发明的鼠源抗体与多种突变毒株病毒RBD结合实验。
图4为本发明的鼠源抗体单点阻断奥密克戎RBD与hACE2结合。
图5为本发明的鼠源抗体多点阻断奥密克戎RBD与hACE2结合。
图6为本发明的鼠源抗体与奥密克戎假病毒多点中和。
图7为本发明的人源化抗体与奥密克戎RBD结合实验。
图8为本发明的人源化抗体(含Fc突变和FR回复突变)与奥密克戎RBD结合实验。
图9为本发明的人源化抗体、人源化抗体(含Fc突变和FR回复突变)的阻断实验。
图10为本发明的人源化抗体、人源化抗体(含Fc突变和FR回复突变)假病毒中和实验。
图11为本发明的人源化抗体(含Fc突变)阻断实验。
图12为本发明的人源化抗体(含Fc突变)假病毒中和实验。
图13为本发明的人源化抗体(含Fc突变和FR回复突变)假病毒广谱中和实验。
图14为本发明的人源化抗体结合奥密克戎RBD的结合解离曲线。
图15为本发明的人源化抗体(含Fc突变)结合奥密克戎RBD的结合解离曲线。
图16为本发明的人源化抗体(含Fc突变和FR回复突变)结合奥密克戎RBD的结合解离曲线。
具体实施方式
以下结合附图对本发明技术方案进行详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。本申请的范围并不受这些实施方式的限定,以申请专利的范围为准。
实施例1小鼠免疫
取3-5只6周龄雌性Balb/c小鼠,SARS-COV-2Spike S1(Acro:S1N-C52Hu)作为免疫原进行腹腔注射。提前3天采取阴性血清,首次免疫,注射50μg经弗氏完全佐剂充分乳化的免疫原,第14天、第35天腹腔注射25μg经弗氏不完全佐剂充分乳化的免疫原进行第二次、三次免疫。7天后,尾部采血,滴度稀释血清,用ELISA法检测血清效价。用SARS-COV-2SpikeRBD,His Tag(B.1.1.529/奥密克戎)(Acro:SPD-C522E)蛋白包被ELISA板过夜,弃包被液,2%BSA进行封闭,封闭完成后,加入血清稀释液,进行反应,反应完毕后用PBST清洗,加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗,PBST洗板。加入TMB显色液显色,1M盐酸终止反应,于450nm下测光密度。当效价结果满足要求时,可收获小鼠脾脏和淋巴结,进行细胞融合。
实施例2杂交瘤细胞融合
将小鼠处死取出脾脏和淋巴结,将细胞研磨过细胞筛网,得到淋巴细胞。计算总细胞数,将获得的淋巴细胞与骨髓瘤细胞SP2/0细胞量按2:1混合,细胞悬液1000rpm,8min,离心,并将细胞用电融合液清洗两次后,用电融合液按总细胞密度为1×107/mL重悬细胞,将细胞悬液置于融合池中,按常规电转方法进行细胞融合。将融合体在含有饲养细胞及HAT的DMEM完全培养基中,5%CO2,37℃培养。融合体选择培养中所用的饲养细胞取自未经免疫的动物腹腔中的巨噬细胞,以辅助新的杂种B淋巴细胞杂交瘤生长。
实施例3本发明的阳性克隆筛选
采用ELISA方法筛选出与SARS-COV-2Spike RBD,His Tag(B.1.1.529/奥密克戎)(Acro:SPD-C522E),SARS-COV-2Spike RBD(L4S2R T478K),His Tag(Acro:SPD-C52Hh),SARS-COV-2S1 Protein RBD,His Tag(MALS verifiled)(Acro:SPD-C52H3)均结合的克隆。上述蛋白均来自于市售。
将目的蛋白包被到酶标板上,4℃,过夜,2%BSA进行封闭,37℃,1h;将杂交瘤细胞培养上清加入ELISA板中,以SP2/0细胞上清作为阴性对照,融合前小鼠血清稀释100倍作为阳性对照,100μL/孔,37℃,1h;PBST洗涤3次,加入HRP标记的羊抗鼠IgG-Fc抗体,100μL/孔,37℃,45min;洗涤后,TMB显色10min,1M盐酸终止反应;酶标仪测定OD450读数。OD450>1.0,阴性对照<0.1,为阳性克隆。将阳性克隆孔吹起对细胞进行计数,将细胞按1个/孔,铺进96孔培养板中,5%CO2,37℃7-10天后,取上清进行ELISA检测,本发明的单克隆抗体可结合三种病毒毒株RBD,可作为候选分子。
实施例4本发明的鼠源抗体生产
获得稳定的本发明筛选出的杂交瘤细胞系后,采用体外培养法获取单克隆抗体。将细胞株扩增至在T75培养瓶内,培养至细胞覆盖率为40-50%,将细胞上清弃去,加入50mL杂交瘤-SFM培养基,37℃,5%CO2培养。培养6-7天,待细胞存活率低于20%,低速离心后收集培养上清,用ProteinA亲和层析柱进行纯化,获得纯化的本发明的鼠源抗体。
实施例5本发明的鼠源抗体可变区序列的获得
用基于简并引物PCR的方法,测定由本发明的鼠源抗体可变区的DNA序列。将杂交瘤细胞株分别扩大培养,1000rpm离心收集细胞,并以Trizol提取总RNA。以此为模板,合成第一链cDNA后,以第一链cDNA为后续模板PCR扩增对应的可变区DNA序列,回收PCR产物进行TA克隆及测序,得到候选杂交瘤重链可变区和轻链可变区序列,重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。
实施例6本发明的鼠源抗体与奥密克戎RBD结合活性
将SARS-CoV-2Spike RBD,His Tag(B.1.1.529/奥密克戎)(厂家:Acro,Cat:SPD-C522e,Lot:5716-21CCF2-11B)稀释为1μg/mL,包被到96孔酶标板中,100μL/孔,4℃过夜。倒掉包被液,1×PBST洗板每孔300μL,用洗板机洗涤3次,并在无尘纸上拍干。配置3%脱脂奶粉,300μL/孔,37℃孵育1h,倒掉封闭液,1×PBST洗板每孔300μL,洗板机洗涤3次,无尘纸上拍干,将蛋白封闭。将本发明抗体用3%脱脂奶粉稀释为20μg/mL,以此为初始浓度进行3倍稀释,共稀释11个梯度,另设1个空白孔,只加稀释液。100μL/孔,37℃孵育1h。弃去孔中液体,1×PBST洗板每孔300μL,洗板机洗涤3次,无尘纸上拍干。用3%脱脂奶粉将山羊抗小鼠IgG Fc(HRP)(abcam,Cat#ab97265)按1:10000稀释,100μL/孔,37℃孵育45min。倒掉二抗液体,1×PBST洗板每孔300μL洗板机洗涤6次,无尘纸上拍干。加入单组分TMB显色混合液(厂家:索莱宝,CAT:PR1200),100μL/孔,37℃避光显色7min。加入终止液1M HCl(83mL 37%浓盐酸+917mL纯水)终止显色反应,100μL/孔。在酶标仪上450nm处读数。获得本发明的鼠源抗体与奥密克戎RBD结合曲线,其EC50值为0.057μg/mL,如图1所示。
实施例7本发明的鼠源抗体与RBD亲和力检测
将HISIK Biosensors(厂家:ForteBio.Inc.,Cat:18-5120)使用PBST缓冲液预湿20min,加入到用PBST稀释至20μg/ml的奥密克戎RBD(厂家:Acro,Cat:SPD-C522e)蛋白中,使靶点蛋白加载厚度达到1.5nm。将本发明鼠源抗体蛋白使用PBST稀释成72.85μg/mL(终浓度500nM),倍比稀释7个梯度,加入到上述传感器中,结合120s,解离120s。如图2和表2所示,获得拟合出本发明的鼠源抗体结合奥密克戎RBD的结合解离曲线,计算其亲和力<1.0E-12M。
表2
实施例8本发明的鼠源抗体与多种突变毒株病毒RBD结合实验
将SARS-CoV-2Spike RBD,His tag.(BA.1/奥密克戎)(厂家:Acro,Cat:SPD-c522e,Lot:5716-21CCF2-Z4)、SARS-CoV-2Spike RBD,His tag.(BA.1.1/奥密克戎)(厂家:Acro,Cat:SPD-c522j,Lot:6159-2248F1-12M)、SARS-CoV-2Spike RBD,His tag.(BA.2/奥密克戎)(厂家:Acro,Cat:SPD-c522g,Lot:5911-223BF1-11Z)、SARS-CoV-2Spike RBD,Histag.(德尔塔)(厂家:Acro)、SARS-CoV-2Spike RBD,His tag.(野生型)(厂家:Acro)稀释为0.8μg/mL,包被到96孔酶标板中,100μL/孔,4℃过夜。倒掉包被液,1×PBST洗板每孔300μL,用洗板机洗涤3次,并在平板纸上拍干。用3%脱脂奶粉封闭,300μL/孔,37℃孵育1h20min,倒掉封闭液,1×PBST洗板每孔300μL,洗板机洗涤3次,无尘纸上拍干。将本发明的鼠源抗体用3%脱脂奶粉稀释为10μg/mL,100μL/孔,37℃孵育1h。弃去孔中液体,洗板机洗涤3次,平板纸上拍干。用3%脱脂奶粉将Goat pAb to Ms IgG(HRP)(厂家:abcam,Lot:GR3393964-2)按1:10000稀释,100μL/孔,37℃孵育45min。弃去孔中液体,1×PBST洗板每孔300μL,洗板机洗涤6次,无尘纸上拍干。加入单组分TMB显色混合液,100μL/孔,并用铝箔纸包好,37℃避光显色3min。加入终止液1M HCl(83mL 37%浓盐酸+917mL纯水)终止显色反应,100μL/孔。在酶标仪上450nm处读数。如图3所示,本发明的鼠源抗体均可以与SARS-CoV-2野生型、德尔塔、奥密克戎病毒株BA1、奥密克戎病毒株BA1.1、奥密克戎病毒株BA2交叉结合。
实施例9本发明的鼠源抗体单点阻断奥密克戎RBD与hACE2结合
用稀释液(PBS+2%FBS)将稀释SARS-CoV-2Spike RBD,his tag(厂家:Acro,Cat:SPD-C522e)(BA.1/奥密克戎)蛋白至100nM(终浓度50nM),并且将本发明的鼠源抗体、无关抗体(阴性对照)稀释至2000nM(终浓度1000nM)。将HEK293-人ACE2细胞(厂家:Acro)清洗2遍,分组,1×105/孔,清洗2遍,离心去上清。50μL/孔加入蛋白和抗体,总体积100μL,室温孵育1h。清洗细胞后,按照1:500加入二抗Anti-6X-his tag antibody-FITC(厂家:Abcam,Cat:Ab1206),室温避光孵育0.5h。后用流式上机检测FITC荧光读值。如图4所示,本发明的鼠源抗体可以明显的抑制ACE2细胞系与SARS-CoV-2奥密克戎RBD的结合。
实施例10本发明的鼠源抗体多点阻断奥密克戎RBD与hACE2结合
用稀释液(PBS+2%FBS)稀释SARS-CoV-2Spike RBD,his tag(厂家:Acro,Cat:SPD-C522e)(BA.1/奥密克戎)至100nM(终浓度50nM),并且将阳性对照抗体Anti-SARS-Cov2RBD antibody(厂家:Acro,Cat:SPD-M305)、本发明的鼠源抗体、无关抗体(阴性对照)稀释至2000nM(终浓度1000nM),首列加入抗体稀释液100μL,取30μL至60μL稀释液中进行3倍稀释,以此类推,共5梯度。将HEK293-Hu ACE2细胞清洗2遍,分组,1×105/孔,清洗2遍,离心去上清。50μL/孔加入蛋白和抗体,总体积100μL,室温孵育1h。清洗细胞后,按照1:500加入二抗Anti-6X-his tag antibody-FITC(厂家:Abcam,Cat:Ab1206),室温避光孵育0.5h。后用流式上机检测FITC荧光读值。如图5所示,本发明的鼠源抗体可以完全抑制ACE2细胞系与SARS-CoV-2奥密克戎RBD的结合。
实施例11本发明的鼠源抗体与奥密克戎假病毒单点中和
将本发明的鼠源抗体于4℃融化,用DMEM完全培养基稀释成13.3μg/mL(终浓度10μg/mL)。稀释好的抗体以75μL/孔加入96孔白板中。将假病毒SARS-Cov-2spike(奥密克戎)Fluc-GFP Pseudovirus(厂家:Acro,Cat:PSSO-HLGB003)于室温复溶,按照假病毒:稀释液=1:125稀释。稀释好的病毒以25μL/孔加入96孔白板中,和抗体稀释液一起室温孵育1h。将HEK293-ACE2 hu细胞以5×104个/100μL/孔加入培养板中,培养箱中培养48h后。提前取出荧光酶显色液和96孔白板平衡至室温,弃去样品孔100μL培养基,立即加入100μL荧光酶显色液,室温孵育3-5min,酶标仪读取化学荧光信号。本发明的鼠源抗体与奥密克戎假病毒单点中和试验结果见表3,本发明的鼠源抗体对于奥密克戎假病毒具有99.8%以上的抑制活性。
表3
实施例12本发明的鼠源抗体与奥密克戎假病毒多点中和
将本发明的鼠源抗体、无关抗体(阴性对照)于4℃融化,用DMEM完全培养基稀释成13.3μg/mL(终浓度10μg/mL)。首列抗体稀释液200μL,取30μL至150μL稀释液中进行6倍稀释,以此类推,共7梯度。稀释好的抗体以75μL/孔加入96孔白板中。将假病毒SARS-Cov-2spike(奥密克戎)Fluc-GFP Pseudovirus(厂家:Acro,Cat:PSSO-HLGB003)于室温复溶,按照假病毒:稀释液=1:125稀释。稀释好的病毒以25μL/孔加入96孔白板中,和抗体稀释液一起室温孵育1h。将HEK293-ACE2 hu细胞以5×104个/100μL/孔加入培养板中,培养箱中培养48h。提前取出荧光酶显色液和96孔白板平衡至室温,弃去样品孔100μL培养基,立即加入100μL荧光酶显色液,室温孵育3-5min,酶标仪读取化学荧光信号。如图6所示,本发明的鼠源抗体对于奥密克戎假病毒有明显中和活性,IC50值为0.0032μg/mL。
实施例13本发明的鼠源抗体与奥密克戎活病毒中和
依据江苏省疾病预防控制中心BSL-3实验室新型冠状病毒中和试验(SOP-MEM/SZ/GF34-V00)操作规程及与送检方商定的试验方案,对送检单克隆抗体进行抗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)中和抗体活性检测。检测方法采用基于细胞病变的微量中和(MN)测定法进行中和抗体活性验证。使用固定病毒(SARS-CoV-2)与不同稀释度的等量抗体混合后,感染长成单层的Vero-E6细胞,每个抗体稀释度做复孔检测。实验同时设正常细胞对照、病毒对照、阳性抗体对照及病毒滴度的回滴。接种后3-5天,观察细胞有无CPE(病毒致细胞病变效应)变化。送检本发明的鼠源抗体,原始浓度为0.5mg/mL。用DMEM稀释至50.00μg/mL后,再以1:2二倍系列稀释12个浓度梯度,与100TCID50 SARS-CoV-2病毒(江苏省新冠病毒感染临床病例分离病毒株,为新冠病毒变异株奥密克戎毒株,已测序鉴定)混合感染细胞,每个稀释浓度做复孔检测。经检测本发明的鼠源抗体抗新型冠状病毒变异株(奥密克戎毒株)的中和活性浓度(IC50)为6.25μg/mL。
实施例14本发明的人源化抗体与奥密克戎RBD结合实验
将SARS-CoV-2Spike RBD,His Tag(B.1.1.529/奥密克戎)(厂家:Acro,Cat:SPD-C522e Lot:5716-21CCF2-11B)稀释为1μg/mL,包被到96孔酶标板中,100μL/孔,4℃过夜。倒掉包被液,1×PBST洗板每孔300μL,用洗板机洗涤3次,并在无尘纸上拍干。配置3%脱脂奶粉,300μL/孔,37℃孵育1h,倒掉封闭液,1×PBST洗板每孔300μL,洗板机洗涤3次,无尘纸上拍干,将蛋白封闭。将本发明的嵌合抗体、本发明的人源化抗体用3%脱脂奶粉稀释为20μg/mL,以此为初始浓度进行3倍稀释,共稀释11个梯度,另设1个空白孔,只加稀释液。100μl/孔,37℃孵育1h。弃去孔中液体,1×PBST洗板每孔300μL,洗板机洗涤3次,无尘纸上拍干。用3%脱脂奶粉将山羊抗小鼠IgG Fc(HRP)(abcam,Cat#ab97265)按1:10000稀释,100μL/孔,37℃孵育45min。倒掉二抗液体,1×PBST洗板每孔300μL洗板机洗涤6次,无尘纸上拍干。加入单组分TMB显色混合液(厂家:索莱宝,CAT:PR1200),100μL/孔,37℃避光显色7min。加入终止液1M HCl(83mL37%浓盐酸+917mL纯水)终止显色反应,100μL/孔。在酶标仪上450nm处读数。如图7所示,本发明的嵌合抗体、本发明的人源化抗体与奥密克戎RBD结合曲线,其EC50值分别为0.019和0.013μg/mL。
实施例15本发明的人源化抗体(含Fc突变和FR回复突变)与奥密克戎RBD的结合实验
将SARS-CoV-2Spike RBD,His Tag(B.1.1.529/奥密克戎)(厂家:Acro,Cat:SPD-C522e Lot:5716-21CCF2-11B)稀释为1μg/mL,包被到96孔酶标板中,100μl/孔,4℃过夜。倒掉包被液,1×PBST洗板每孔300μL,用洗板机洗涤3次,并在无尘纸上拍干。配置3%脱脂奶粉,300μL/孔,37℃孵育1h,倒掉封闭液,1×PBST洗板每孔300μL,洗板机洗涤3次,无尘纸上拍干,将蛋白封闭。将本发明的嵌合抗体和本发明的人源化抗体(含Fc突变和FR回复突变)用3%脱脂奶粉稀释为20μg/mL,以此为初始浓度进行3倍稀释,共稀释11个梯度,另设1个空白孔,只加稀释液。100μL/孔,37℃孵育1h。弃去孔中液体,1×PBST洗板每孔300μL,洗板机洗涤3次,无尘纸上拍干。用3%脱脂奶粉将山羊抗小鼠IgG Fc(HRP)(abcam,Cat#ab97265)按1:10000稀释,100μL/孔,37℃孵育45min。倒掉二抗液体,1×PBST洗板每孔300μL洗板机洗涤6次,无尘纸上拍干。加入单组分TMB显色混合液(厂家:索莱宝,CAT:PR1200),100μL/孔,37℃避光显色7min。加入终止液1M HCl(83mL 37%浓盐酸+917mL纯水)终止显色反应,100μL/孔。在酶标仪上450nm处读数。如图8所示,本发明的嵌合抗体和本发明的人源化抗体(含Fc突变和FR回复突变)与奥密克戎RBD结合曲线,其EC50值分别为0.029和0.063μg/mL。
实施例16本发明的人源化抗体、人源化抗体(含Fc突变和FR回复突变)的阻断实验
用稀释液(PBS+2%FBS)稀释SARS-CoV-2Spike RBD,his tag(厂家:Acro,Cat:SPD-C522e)至100nM(终浓度50nM),并且将本发明的嵌合抗体(阳性对照)、本发明的人源化抗体、本发明的人源化抗体(含Fc突变和FR回复突变)、无关抗体(阴性对照)稀释至2000nM(终浓度1000nM),首列加入抗体稀释液100μL,取30μL至60μL稀释液中进行3倍稀释,以此类推,共5梯度。将HEK293-Hu ACE2细胞清洗2遍,分组,1×105/孔,清洗2遍,离心去上清。50μL/孔加入蛋白和抗体,总体积100μL,室温孵育1h。清洗细胞后,按照1:500加入二抗Anti-6X-his tag antibody-FITC(厂家:Abcam,Cat:Ab1206),室温避光孵育0.5h。后用流式上机检测FITC荧光读值。如图9所示,本发明的人源化抗体、本发明的人源化抗体(含Fc突变和FR回复突变)可以完全抑制ACE2细胞系与SARS-CoV-2奥密克戎RBD的结合。其阻断活性IC50值分别为4.449μg/mL和4.271μg/mL。
实施例17本发明的人源化抗体、本发明的人源化抗体(含Fc突变和FR回复突变)假病毒中和实验
将本发明的鼠源抗体(阳性对照)、本发明的人源化抗体、本发明的人源化抗体(含Fc突变和FR回复突变)、无关抗体(阴性对照)于4℃融化,用DMEM完全培养基稀释成13.3μg/mL(终浓度10μg/mL)。首列抗体稀释液200μL,取30μL至150μL稀释液中进行6倍稀释,以此类推,共7梯度。稀释好的抗体以75μL/孔加入96孔白板中。将假病毒SARS-Cov-2spike(奥密克戎)Fluc-GFP Pseudovirus(厂家:Acro,Cat:PSSO-HLGB003)于室温复溶,按照假病毒:稀释液=1:125稀释。稀释好的病毒以25μL/孔加入96孔白板中,和抗体稀释液一起室温孵育1h。将HEK293-ACE2 hu细胞以5×104个/100μL/孔加入培养板中,培养箱中培养48h。提前取出荧光酶显色液和96孔白板平衡至室温,弃去样品孔100μL培养基,立即加入100μL荧光酶显色液,室温孵育3-5min,酶标仪读取化学荧光信号。如图10所示,本发明的人源化抗体、本发明的人源化抗体(含Fc突变和FR回复突变)对于奥密克戎假病毒有明显中和活性,IC50值分别为0.010μg/mL和0.012μg/mL。
实施例18本发明的人源化抗体(含Fc突变)阻断实验
用稀释液(PBS+2%FBS)稀释SARS-CoV-2Spike RBD,his tag(厂家:Acro,Cat:SPD-C522e)至100nM(终浓度50nM),并且将本发明的嵌合抗体(阳性对照)、本发明的人源化抗体(含Fc突变)稀释至2000nM(终浓度1000nM),首列加入抗体稀释液100μL,取30μL至60μL稀释液中进行3倍稀释,以此类推,共5梯度。将HEK293-Hu ACE2细胞清洗2遍,分组,1×105/孔,清洗2遍,离心去上清。50μL/孔加入蛋白和抗体,总体积100μL,室温孵育1h。清洗细胞后,按照1:500加入二抗Anti-6X-his tag antibody-FITC(厂家:Abcam,Cat:Ab1206),室温避光孵育0.5h。后用流式上机检测FITC荧光读值。如图11所示,可以完全抑制ACE2细胞系与SARS-CoV-2奥密克戎RBD的结合,其阻断活性IC50值为0.34nM。
实施例19本发明的人源化抗体(含Fc突变)假病毒中和实验
将本发明的嵌合抗体(阳性对照)、本发明的人源化抗体、本发明的人源化抗体(含Fc突变和FR回复突变)、本发明的人源化抗体(含Fc突变)、无关抗体(阴性对照)于4℃融化,用DMEM完全培养基稀释成1.33μg/mL终浓度10nM)。首列抗体稀释液200μL,取30μL至150μL稀释液中进行6倍稀释,以此类推,共7梯度。稀释好的抗体以75μL/孔加入96孔白板中。将假病毒SARS-Cov-2spike(奥密克戎)Fluc-GFP Pseudovirus(厂家:Acro,Cat:PSSO-HLGB003)于室温复溶,按照假病毒:稀释液=1:125稀释。稀释好的病毒以25μL/孔加入96孔白板中,和抗体稀释液一起室温孵育1h。将HEK293-ACE2 hu细胞以5×104个/100μL/孔加入培养板中,培养箱中培养48h。提前取出荧光酶显色液和96孔白板平衡至室温,弃去样品孔100μL培养基,立即加入100μL荧光酶显色液,室温孵育3-5min,酶标仪读取化学荧光信号。如图12所示,本发明的人源化抗体(含Fc突变)对于奥密克戎假病毒有明显中和活性,IC50值为0.08nM。本发明的人源化抗体、本发明的人源化抗体(含Fc突变和FR回复突变)、本发明的人源化抗体(含Fc突变)这三株抗体中和活性差异不大。
实施例20本发明的人源化抗体(含Fc突变和FR回复突变)假病毒广谱中和实验
将本发明的人源化抗体(含Fc突变和FR回复突变)、无关抗体(阴性对照)于4℃融化,用DMEM完全培养基稀释成1.5μg/ml(终浓度10nM)。首列抗体稀释液200μL,取30μL至150μl稀释液中进行6倍稀释,以此类推,共7梯度。稀释好的抗体以75μL/孔加入96孔白板中。将假病毒SARS-Cov-2spike(奥密克戎)Fluc-GFP Pseudovirus(厂家:Acro,Cat:PSSO-HLGB003)、SARS-CoV-2Spike(Delta)Fluc-GFP Pseudovirus(厂家:Acro,Cat:PSSD-HLGB002)、SARS-CoV-2Spike(奥密克戎BA.2)Fluc-GFP Pseudovirus(厂家:Acro,Cat:PSSO-HLGB011)于室温复溶,按照假病毒:稀释液=1:125稀释。稀释好的病毒以25μL/孔加入96孔白板中,和抗体稀释液一起室温孵育1h。将HEK293-ACE2 hu细胞以5×104个/100μL/孔加入培养板中,培养箱中培养48h。提前取出荧光酶显色液和96孔白板平衡至室温,弃去样品孔100μL培养基,立即加入100μL荧光酶显色液,室温孵育3-5min,酶标仪读取化学荧光信号。如图13所示,本发明的人源化抗体(含Fc突变和FR回复突变)对于新冠假病毒有明显广谱中和活性,对于德尔塔(delta)、BA1、BA2毒株IC50值分别为0.17nM、0.12nM和0.14nM。
实施例21本发明的人源化抗体、本发明的人源化抗体(含Fc突变)、本发明的人源化抗体(含Fc突变和FR回复突变)与奥密克戎RBD的亲和力检测
将HISIK Biosensors(厂家:ForteBio.Inc.,Cat:18-5120)使用PBST缓冲液预湿20min,加入到用PBST稀释至20μg/mL的奥密克戎RBD(厂家:Acro,Cat:SPD-C522e)蛋白中,使靶点蛋白加载厚度达到1.5nm。将本发明的人源化抗体、本发明的人源化抗体(含Fc突变)、本发明的人源化抗体(含Fc突变和FR回复突变)蛋白使用PBST稀释成30μg/mL(终浓度200nM),倍比稀释7个梯度,加入到上述传感器中,结合120s,解离120s。获得结果拟合出本发明的人源化抗体、本发明的人源化抗体(含Fc突变)、本发明的人源化抗体(含Fc突变和FR回复突变)结合奥密克戎RBD的结合解离曲线,分别如图14-16所示,计算获得三株抗体其亲和力均<1.0E-12M,如表4所示。
表4
供试品 | <![CDATA[K<sub>D</sub>(M)]]> | <![CDATA[R<sub>Max</sub>]]> | R^2 |
本发明的人源化抗体 | <1.0E-12 | 1.5335 | 0.9969 |
本发明的人源化抗体(含Fc突变) | <1.0E-12 | 1.6527 | 0.9969 |
本发明的人源化抗体(含Fc突变和FR回复突变) | <1.0E-12 | 1.4031 | 0.9958 |
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下,本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中,并且以所附的权利要求为保护范围。
Claims (10)
1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其特异性结合冠状病毒的刺突蛋白或其片段,所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区,其特征在于,
(a)所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3,所述HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列包含至多三个氨基酸突变的变体;所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列包含至多三个氨基酸突变的变体;所述HCDR3包含SEQID NO:3所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列包含至多三个氨基酸突变的变体;和/或
(b)所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3,所述LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列包含至多三个氨基酸突变的变体;所述LCDR2包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列包含至多三个氨基酸突变的变体;所述LCDR3包含SEQID NO:6所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列包含至多三个氨基酸突变的变体。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分,其中HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:1、2、3所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:4、5、6所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合部分,其中所述重链可变区包含与SEQID NO:7、13、16所示氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合部分,其中所述轻链可变区包含与SEQID NO:8、14所示氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合部分,其中所述重链可变区和所述轻链可变区分别包含与SEQ ID NO:7、13、16和SEQ ID NO:8、14所示氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合部分,其包含重链恒定区和/或轻链恒定区。
7.根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合部分,其中所述重链恒定区是IgG、IgA、IgD、IgE和IgM恒定区。
8.根据权利要求6或7所述的抗体或其抗原结合部分,其中所述重链恒定区是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区。
9.根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合部分,其中所述重链恒定区是具有如SEQID NO:15和17所示的含氨基酸突变的序列。
10.根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合部分,其中所述轻链恒定区是κ或λ恒定区。
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CN202210892796.0A CN116041492A (zh) | 2022-07-27 | 2022-07-27 | 一种抗rbd抗体及其应用 |
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