CN113354731A - 冠状病毒的人源单克隆抗体及其应用 - Google Patents
冠状病毒的人源单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113354731A CN113354731A CN202010400266.0A CN202010400266A CN113354731A CN 113354731 A CN113354731 A CN 113354731A CN 202010400266 A CN202010400266 A CN 202010400266A CN 113354731 A CN113354731 A CN 113354731A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- human monoclonal
- monoclonal antibody
- cov
- sars
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 title abstract description 14
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims abstract description 52
- 108091005634 SARS-CoV-2 receptor-binding domains Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 32
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 29
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 29
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 29
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 19
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 19
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 18
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 8
- 208000037847 SARS-CoV-2-infection Diseases 0.000 claims description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 6
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 108090000975 Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 abstract description 4
- 102000053723 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 abstract 1
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 14
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 5
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 5
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 4
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 4
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 4
- 102100035765 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 description 3
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000127282 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 description 2
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 2
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000001806 memory b lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N pacific blue Chemical compound FC1=C(O)C(F)=C2OC(=O)C(C(=O)O)=CC2=C1 VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102100035716 Glycophorin-A Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101001074244 Homo sapiens Glycophorin-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 101000600434 Homo sapiens Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Proteins 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 102100037401 Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Human genes 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 1
- 241000907316 Zika virus Species 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012826 global research Methods 0.000 description 1
- 239000007902 hard capsule Substances 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 229960000402 palivizumab Drugs 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000007901 soft capsule Substances 0.000 description 1
- 239000006190 sub-lingual tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229940036185 synagis Drugs 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种冠状病毒的人源单克隆抗体及其应用。该抗体能够特异性结合SARS‑CoV‑2 RBD，阻断SARS‑CoV‑2 RBD与ACE2结合，抑制冠状病毒的感染。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种高中和活性的冠状病毒人源单克隆抗体及其应用。
背景技术
新型冠状病毒SARS-CoV-2作为新发的突发传染病病原，目前对于该病毒还没有特效药物。
治疗性抗体药物不但在肿瘤和自身免疫疾病方面占有重要地位，在传染性疾病的治疗中也同样有效。目前已经上市的治疗和预防病毒感染的药物有预防小儿呼吸道合胞病毒(RSV)感染的帕利珠单抗(Synagis)，治疗HIV感染的艾巴利珠单抗(Trogarzo)，以及用于狂犬病毒暴露后预防的 Rabishield。同时还有针对众多病毒的单克隆抗体处于临床研究的不同阶段 (https：//clinicaltrials.gov/)。
SARS-CoV-2属于冠状病毒。同属冠状病毒的重症急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)以及中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)也曾在分别在2002-2003年和2012年引发疫情。2020年1月12日，世界卫生组织正式将SARS-CoV-2命名为“2019新型冠状病毒(2019-nCoV)”，其后在2020年2月11-12日国际病毒分类委员会(International Committee onTaxonomy of Viruses，ICTV)宣布，新型冠状病毒(2019-nCoV)的正式分类名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus2，SARS-CoV-2)，世界卫生组织(WHO)同日在日内瓦举办全球研究和创新论坛上宣布，由这一病毒导致的疾病的正式名称为“COVID-19”。
病毒要感染细胞，首先需要通过囊膜蛋白结合宿主的受体。抗体，尤其是中和活性抗体，通过结合到囊膜蛋白上，阻断病毒与细胞受体的结合，从而阻断病毒感染。同时，抗体结合到囊膜蛋白上，从而对游离的病毒或是被感染的细胞进行标记，通过抗体的Fc区募集巨噬细胞或是补体等免疫细胞和免疫分子，从而清除游离的病毒以及被感染的细胞。因此，靶向受体结合区(RBD)的抗体，不但具有中和病毒感染的活性，还可以通过 Fc区发挥作用，促进病毒以及被感染细胞的清除。
基于对其它冠状病毒，尤其是SARS-CoV和MERS-CoV的研究，与受体结合的重要囊膜蛋白是刺突蛋白(S)。S可进一步分为S1和S2两部分。S2的作用是介导膜融合。S1的N端(NTD)和C端(CTD)都可能是RBD。通过对SARS-CoV-2的研究，团队发现CTD是此冠状病毒的RBD，结合受体ACE2。因此靶向RBD的抗体，并且是阻断S与ACE2结合的抗体，可能成为抑制病毒感染的中和抗体。本发明的目的是针对 SARS-CoV-2，鉴定特异的具有保护效果的人源中和抗体。
发明内容
为了获得具有保护效果的人源中和抗体，本发明首先以昆虫细胞表达的SARS-CoV-2RBD作为抗原，通过流式分选，从SARS-CoV-2RBD感染后痊愈出院人员的PBMCs中筛选到可以特异结合SARS-CoV-2RBD蛋白的记忆B细胞，然后对筛选的单一B细胞进行RT-PCR，获得抗体的可变区序列与片段，并进一步与恒定区连接至表达载体中。经哺乳动物细胞表达、纯化后，进行一系列的功能检测，包括与SARS-CoV-2RBD蛋白的结合能力，阻断SARS-CoV-2RBD与ACE2结合的阻断效果，抑制 SARS-CoV-2感染的中和效果等，获得了中和SARS-CoV-2感染的人源单克隆抗体，命名为GH12。
具体地，本发明通过以下方面实现。
在一个方面，本发明提供人源化单克隆抗体或其抗原结合片段，其特异性结合SARS-CoV-2RBD，
其VH链的互补决定区的CDR具有选自下组的氨基酸序列：
如SEQ ID NO：1所示的CDR1，
如SEQ ID NO：2所示的CDR2，和
如SEQ ID NO：3所示的CDR3；
其VL链的互补决定区的CDR具有选自下组的氨基酸序列：
如SEQ ID NO：4所示的CDR1，
如SEQ ID NO：5所示的CDR2，和
如SEQ ID NO：6所示的CDR3。
在一个实施方案中，所述人源单克隆抗体或其抗原结合片段含有：
如SEQ ID NO：7所示的重链可变区，和
如SEQ ID NO：8所示的轻链可变区。
在一个实施方案中，人源单克隆抗体或其抗原结合片段含有：
如SEQ ID NO：22所示的重链，和
如SEQ ID NO：23所示的轻链。
在一个实施方案中，其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab′、Fab′-SH、 Fv、scFv、F(ab′)2、双抗体。
在另一个方面，本发明提供一种多肽，其含有选自SEQ ID NO：7、8、 22或23所示的序列，其中所述多肽是特异性结合SARS-CoV-2RBD的人源单克隆抗体一部分，并且
当所述多肽含有SEQ ID NO：7时，所述人源单克隆抗体还包含SEQ ID NO：8所示的多肽；
当所述多肽含有SEQ ID NO：8时，所述人源单克隆抗体还包含SEQ ID NO：7所示的多肽；
当所述多肽含有SEQ ID NO：22时，所述人源单克隆抗体还包含SEQ ID NO：23所示的多肽；或
当所述多肽含有SEQ ID NO：23时，所述人源单克隆抗体还包含SEQ ID NO：22所示的多肽。
在另一个方面，本发明提供一种多核苷酸，其编码前述任一项人源单克隆抗体或其抗原结合片段或多肽。
在另一个方面，本发明提供一种表达载体，其包含上述多核苷酸。
在另一个方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含上述表达载体。
在另一个方面，本发明提供一种药物组合物，其含有前述任一项人源单克隆抗体或其抗原结合片段和药用载体。
在另一个方面，本发明提供上述任一项人源单克隆抗体或其抗原结合片段在制备治疗SARS-CoV-2感染的药物中的用途。
本说明书中提及的所有文献均通过引用以其整体并入本文。
定义
“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体的抗原结合区或可变区，例如一个或多个CDR。抗体的片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。抗原结合片段包括选自Fab、 Fab′、Fab′-SH、Fv、scFv、F(ab′)2、双抗体、包含CDR的肽等。
“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。
“Fc”区含有包含抗体的CH1和CH2结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。
“Fab′片段”含有一条轻链和包含VH结构域和CH1结构域或CH1 和CH2结构域之间区域的一条重链的部分，两个Fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab′)2分子。
“F(ab′)2片段”含有两条轻链和两条包含CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab′)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。
“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。
“单链Fv抗体(scFv抗体)”是指包含抗体的VH和VL结构域的抗原结合片段，这些结构域包含于单个多肽链中。一般而言，scFv多肽在VH 和VL结构域之间包含多肽接头，该接头使得scFv能形成用于抗原结合的所需结构。
“双抗体”为具有两个抗原结合位点的小抗原结合片段。所述片段包含在相同的多肽链中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域 (VH)(VH-VL或VL-VH)。通过使用短至不能在同一链的两个结构域之间配对的接头，使得所述结构域和另一条链的互补结构域配对并形成两个抗原结合位点。
当提及配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时，“特异性”结合是指在蛋白和/或其它生物试剂的异质群体中确定是否存在所述蛋白例如本发明的单克隆抗体与SARS-CoV-2RBD蛋白的结合反应。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著量与样品中存在的其它蛋白结合。
本发明还提供含有本发明的人源高中和活性的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物。为了制备药物组合物，可以通过使抗体或其抗原结合片段与药用载体或赋形剂混合，制备成各种所需的剂型。作为本发明的医药组合物的剂型的种类，例如可以列举作为口服剂的片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片、膏剂等，作为非口服剂，可以列举注射剂、栓剂、经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂等，本领域的技术人员能够根据给药途径和给药对象等选择适当的剂型。
本发明的药物组合物的有效成分的给药量，根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法等不同而存在差异，可以考虑剂型的种类、给药方法、患者的年龄和体重、患者的症状等，根据医生的判断来确定。
本发明的有益效果：
本发明获得了人源高中和活性的抗体：GH12。该抗体是具有中和冠状病毒例如SARS-CoV-2感染的人源抗体。GH12抗体与SARS-CoV-2RBD 的亲和力为5.87nM。人源高中和活性的抗体GH12均能有效阻断冠状病毒例如SARS-CoV-2RBD与hACE2结合，抑制冠状病毒例如SARS-CoV-2 假病毒感染的中和活性好。本发明的GH12有着临床治疗和预防冠状病毒例如SARS-CoV-2感染的应用价值。
附图说明
图1：SARS-CoV-2RBD分子筛层析和SDS-PAGE鉴定；
图2：GH12抗体的分子筛层析和SDS-PAGE鉴定；
图3：GH12抗体结合SARS-CoV-2RBD的动力学曲线；
图4：GHl2抗体阻断SARS-CoV-2RBD与HEK293T-hACE2结合；
图5：GH12抗体中和VSV-SARS-CoV-2感染的效果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：SARS-CoV-2RBD的表达与纯化
在SARS-CoV-2RBD蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示)编码区的3’端连上6个组氨酸标签(hexa-His-tag)的编码序列及翻译终止密码子，通过连接EcoRI和XhoI构建入pFastBac1载体(购自Invitrogen)中。再将连接产物转化到DH10Bac感受态细胞(购自Tiangen)中，进行杆状病毒重组。提取重组的杆状病毒，转染至sf9细胞(购自Invitrogen)中进行杆状病毒的包装，再经过病毒的扩增，加入到Hi5细胞(购自Invitrogen)中，进行SARS-CoV-2RBD蛋白的表达。
含有目的蛋白的细胞培养液经镍离子亲和层析(HisTrap TMHP(GE)) 和凝胶过滤层析(SuperoseTM 6Increase 10/300GL(GE))纯化后，可以获得较纯的目的蛋白。SDS-PAGE鉴定大小为30KD，结果如图1。
实施例2：SARS-CoV-2 RBD蛋白特异性记忆B细胞的分离
在SARS-CoV-2RBD感染后痊愈出院人员的知情同意下，采集15mL 的血液，分离PBMCs。将分离的PBMCs以107/mL的密度与终浓度400nM 的SARS-CoV-2RBD蛋白冰上孵育结合半小时，然后用PBS洗2次，再与下列抗体(均购自BD)孵育：anti-human CD3/PE-Cy5，anti-human CD16/PE-Cy5，anti-human CD235a/PE-Cy5，anti-human CD 19/APC-Cy7，anti-human CD27/Pacific Blue，anti-human CD38/APC，anti-human IgG/FITC，以及anti-His/PE。抗体冰上孵育半小时后，用PBS洗PBMCs2次。
PBS洗后的PBMCs经FACSAria III分选，收集PE-Cy5-APC- APC-Cy7+Pacific Blue+FITC+PE+的细胞(即B细胞)，直接将其收集到 96孔板内，1细胞/孔。
实施例3：单一B细胞PCR、序列分析及人源抗体设计
按照Qihui Wang等人于2016年12月在Science Translational Medicine，第8卷，第369期发表的Molecular determinants of human neutralizing antibodies isolatedfrom a patient infected with Zika virus中描述的方法，将实施例2获得的B细胞通过Superscript III reverse transcriptase(Invitrogen) 逆转录，逆转录引物如表1，55℃反应60min。
表1.逆转录反应引物
将此逆转录产物作为模板，用HotStar Tap Plus酶(QIAgen)进行PCR，扩增抗体可变区序列(PCRa)。设计相应的引物，反应条件如下：95℃， 5min；95℃30s，55℃(重链)/50℃(λ链)30s，72℃90s，35个循环； 72℃，7min。将此产物作为模板再进行1轮PCR(PCRb)，条件如下：95℃， 5min；95℃30s，58℃(重链)/64℃(λ链)30s，72℃90s，35个循环； 72℃，7min，得到PCR产物。
用1.2％的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物。条带大小在400-500bp的切胶回收后送测序公司测序。测序结果用IMGT在线软件进行分析。
将分析得到的正确的可变区序列与相应的重链/λ链的恒定区通过搭桥PCR连接，克隆至表达载体pCAGGS(购自Addgene)中。其中重链与λ链以EcoRI和XhoI连接接。B细胞测序及表达质粒构建如下：
人源抗体设计策略如下：
重链：CMV promoter-EcoR I-Leader sequences-重链可变区-CH-Xho I；
轻链(λ)：CMV promoter-EcoR I-Leader sequences-轻链可变区 -CL(λ)-Xho I；
其中，Leader sequence的氨基酸序列如SED ID NO：18所示，CH的氨基酸序列如SED ID NO：19所示，CL的氨基酸序列如SED ID NO：20 所示，通过序列测定，获得一株抗体的序列，将这株抗体命名为GH12。
其中GH12的重链可变区序列如SEQ ID NO：7所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO：8所示，重链序列如SEQ ID NO：22所示，轻链序列如 SEQ ID NO：23所示。
其中GH12抗体与胚系基因的序列一致性比较如下：
表2.GH12抗体重链与胚系基因比较
表3.GH12抗体轻链与胚系基因比较
实施例4：GH12抗体的表达
以含10％FBS的DMEM培养293T细胞。用含有实施例3得到的特定抗体轻、重链编码基因的质粒共转染293T。转染4-6小时后将细胞培养液更换成无血清的DMEM，并且继续培养3天，收集上清后，再补加DMEM，继续培养4天，收集上清。
收集的上清经过5000rpm离心30min后，与含有20mM磷酸钠(pH 8.0) 的缓冲液等体积混合，经过0.22μm滤膜过滤后，与protein A预装柱结合 (5mL，GE Healthcare)。以10mM甘氨酸(pH 3.0)洗脱结合的蛋白。收集此蛋白浓缩后进行分子筛层析。目的峰通过SDS-PAGE(还原性和非还原性)确定，结果如图2。得到纯化的GH12抗体。
实施例5：表面等离子共振技术检测抗体与SARS-CoV-2RBD的结合能力
表面等离子共振分析利用Biacore 8K(Biacore Inc.)进行。具体步骤如下：
选用protein A芯片(购自GE Healthcare)，通过protein A与抗体Fc 的亲和力将实施例4得到的纯化的抗体固定在芯片上，抗体固定量约为 5000RU，用10mM HEPES，150mMNaCl，pH 7.4溶液倍比稀释 SARS-CoV-2RBD蛋白，从低浓度到高浓度逐一上样。抗体结合 SARS-CoV-2RBD的动力学曲线如图3所示。抗体结合SARS-CoV-2RBD 的动力学常数如表4所示。结合动力学常数的计算是利用BIAevaluation software 8K(Biacore，Inc.)软件进行。可见GH12抗体能够和SARS-CoV-2 RBD以较高的亲和力结合。
表4 GH12抗体与SARS-CoV-2RBD蛋白结合的动力学常数
实施例6：GH12阻断SARS-CoV-2RBD与ACE2结合的检测
将hACE2(氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示)的编码基因通过XhoI 和BamHI构建入pEGFP-N1载体(购自Addgene)中，并且与GFP融合表达，形成pEGFP-hACE2质粒。将质粒pEGFP-hACE2转染HEK293T细胞，24h 可在荧光显微镜下观察到GFP表达。收集HEK293T-hACE2细胞，2x105 为一个反应，与SARS-CoV-2RBD(200ng/mL)在室温条件下孵育30min。500xg离心5min后，去掉上清，加入PBS洗2次。与anti-His/APC在室温下孵育30min，再经过PBS洗2次后，用BD FACSCanto检测细胞表面的荧光情况。
为了检测GH12的阻断效果，将实施例4得到的纯化的GH12抗体与 200ng/mL的SARS-CoV-2RBD按摩尔比10：1的条件下在室温下孵育1h，再与HEK293T-hACE2细胞孵育。其余步骤与上面相同，用anti-His/APC 检测蛋白与细胞的结合情况。GH12抗体阻断SARS-CoV-2RBD与 HEK293T-hACE2细胞的结合情况如图4所示。可见，GH12抗体均能阻断SARS-CoV-2RBD与HEK293T-hACE2细胞的结合。
实施例7：GH12中和SARS-CoV-2假病毒感染的检测
将实施例4得到的纯化的GH12抗体从50μg/mL开始3倍倍比稀释至第10个梯度(2.5ng/mL)与1.6x104 TCID50 VSV-SARS-CoV-2假病毒混合在37℃混合孵育1h，然后加入到预先接种Huh7细胞(购自协和医科大学基础医学细胞中心)的96孔板中。孵育4小时后，弃掉培养液与病毒液，加入含有10％FBS的DMEM培养液中，继续培养48小时。弃掉培养液，PBS洗一次后，加入1x裂解液(Promega，Luciferase Assay System) 裂解细胞后，取10μL裂解液加入50μL反应底物，通过 PromegaLuminometers检测。根据不同浓度下荧光素酶的活性，计算抗体对VSV-SARS-CoV-2假病毒的中和能力，结果如图5所示，结果统计如表 5。
表5 GH12抗体对SARS-CoV-2假病毒中和效果
a半抑制浓度
可见GH12抗体能以高中和活性中和SARS-CoV-2假病毒。
综上，GH12抗体能够作为高中和活性的新型冠状病毒(SARS-CoV-2) 人源单克隆抗体。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.人源单克隆抗体或其抗原结合片段，其特异性结合SARS-CoV-2RBD，
其VH链的互补决定区的CDR具有选自下组的氨基酸序列：
如SEQ ID NO：1所示的CDR1，
如SEQ ID NO：2所示的CDR2，和
如SEQ ID NO：3所示的CDR3；
其VL链的互补决定区的CDR具有选自下组的氨基酸序列：
如SEQ ID NO：4所示的CDR1，
如SEQ ID NO：5所示的CDR2，和
如SEQ ID NO：6所示的CDR3。
2.权利要求1所示的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，其含有：
如SEQ ID NO：7所示的重链可变区，和
如SEQ ID NO：8所示的轻链可变区。
3.如权利要求1或2所示的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，其含有：
如SEQ ID NO：22所示的重链，和
如SEQ ID NO：23所示的轻链。
4.权利要求1-3中任一项所示的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab′、Fab′-SH、Fv、scFv、F(ab′)2、双抗体。
5.多肽，其含有选自SEQ ID NO：7、8、22或23所示的序列，其中所述多肽是特异性结合SARS-CoV-2RBD的人源单克隆抗体一部分，并且
当所述多肽含有SEQ ID NO：7时，所述人源单克隆抗体还包含SEQ ID NO：8所示的多肽；
当所述多肽含有SEQ ID NO：8时，所述人源单克隆抗体还包含SEQ ID NO：7所示的多肽；
当所述多肽含有SEQ ID NO：22时，所述人源单克隆抗体还包含SEQ ID NO：23所示的多肽；或
当所述多肽含有SEQ ID NO：23时，所述人源单克隆抗体还包含SEQ ID NO：22所示的多肽。
6.多核苷酸，其编码权利要求1-4中任一项所述的人源单克隆抗体或其抗原结合片段或权利要求5所述的多肽。
7.表达载体，其包含权利要求6所述的多核苷酸。
8.宿主细胞，其包含权利要求7所述的表达载体。
9.药物组合物，其含有权利要求1-4中任一项所述的人源单克隆抗体或其抗原结合片段和药用载体。
10.权利要求1-4中任一项所述的人源单克隆抗体或其抗原结合片段在制备治疗SARS-CoV-2感染的药物中的用途。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010137486 | 2020-03-02 | ||
| CN2020101374869 | 2020-03-02 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113354731A true CN113354731A (zh) | 2021-09-07 |
Family
ID=77524440
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010400266.0A Pending CN113354731A (zh) | 2020-03-02 | 2020-05-12 | 冠状病毒的人源单克隆抗体及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113354731A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11732030B2 (en) | 2020-04-02 | 2023-08-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-SARS-CoV-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments |
| US11999777B2 (en) | 2021-06-02 | 2024-06-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating or preventing SARS-CoV-2 infections and COVID-19 with anti-SARS-CoV-2 spike glycoprotein antibodies |
-
2020
- 2020-05-12 CN CN202010400266.0A patent/CN113354731A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11732030B2 (en) | 2020-04-02 | 2023-08-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-SARS-CoV-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments |
| US11999777B2 (en) | 2021-06-02 | 2024-06-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating or preventing SARS-CoV-2 infections and COVID-19 with anti-SARS-CoV-2 spike glycoprotein antibodies |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113292649B (zh) | 新型冠状病毒的人源单克隆抗体及其应用 | |
| CN113444169B (zh) | 新型冠状病毒的人源单克隆抗体及其应用 | |
| CN115710311A (zh) | 冠状病毒的抗体或其抗原结合片段 | |
| KR20100091195A (ko) | 항ｒｓｖ ｇ 단백질 항체 | |
| WO2022143816A1 (zh) | 针对SARS-CoV-2和SARS-CoV的全人广谱交叉中和抗体及其应用 | |
| US9725519B2 (en) | Antibody against transporter and use thereof | |
| CN115850461A (zh) | 沙贝病毒广谱中和抗体及其应用 | |
| CN113354730B (zh) | 一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体及其应用 | |
| CN117466994A (zh) | 猴痘病毒单克隆中和抗体及其应用 | |
| WO2020186687A1 (zh) | 一种特异性结合四种血清型登革病毒的人源抗体 | |
| EP4206224A1 (en) | Human antibody or antigen-binding fragment thereof against coronavirus spike protein | |
| WO2021228092A1 (en) | Novel monoclonal antibodies against sars-cov-2 and uses thereof | |
| CN113292650B (zh) | 新型冠状病毒的人源单克隆抗体及其应用 | |
| JP2006501283A (ja) | ＬＦＡ−１αサブユニット抗体と利用方法 | |
| CN113444180A (zh) | 靶向axl蛋白的抗体及其抗原结合片段、其制备方法和应用 | |
| CN113354731A (zh) | 冠状病毒的人源单克隆抗体及其应用 | |
| CN114736291B (zh) | 特异性结合发热伴血小板减少综合征病毒的囊膜蛋白Gn的人源单克隆抗体及其用途 | |
| CN113698487B (zh) | 抗人ace2单克隆抗体及其应用 | |
| WO2022127739A1 (zh) | 特异性结合SARS-CoV-2的抗原结合蛋白 | |
| WO2022150740A1 (en) | Cross-reactive antibodies recognizing the coronavirus spike s2 domain | |
| CN114805570B (zh) | 一种抗人ace2单克隆抗体及其应用 | |
| WO2022143815A1 (zh) | 抗新冠病毒受体结合区域表位中和抗体及其应用 | |
| WO2022161491A1 (zh) | 一种针对SARS-CoV-2病毒的中和性抗体 | |
| WO2024053719A1 (ja) | コロナウイルス変異株に対するヒト抗体またはその抗原結合断片 | |
| WO2023030312A1 (zh) | 一种用于艾滋病病毒感染基因治疗的基因序列构建体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |