CN113444180A - 靶向axl蛋白的抗体及其抗原结合片段、其制备方法和应用 - Google Patents

靶向axl蛋白的抗体及其抗原结合片段、其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113444180A
CN113444180A CN202110665666.9A CN202110665666A CN113444180A CN 113444180 A CN113444180 A CN 113444180A CN 202110665666 A CN202110665666 A CN 202110665666A CN 113444180 A CN113444180 A CN 113444180A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
antibody
antigen
virus
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110665666.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113444180B (zh
Inventor
徐建青
张晓燕
丁相卿
廖启彬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Sinobay Bio Tech Co ltd
Original Assignee
Shanghai Sinobay Bio Tech Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Sinobay Bio Tech Co ltd filed Critical Shanghai Sinobay Bio Tech Co ltd
Priority to CN202110665666.9A priority Critical patent/CN113444180B/zh
Publication of CN113444180A publication Critical patent/CN113444180A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113444180B publication Critical patent/CN113444180B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/10—Protein-tyrosine kinases (2.7.10)
    • C12Y207/10001—Receptor protein-tyrosine kinase (2.7.10.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了一种靶向AXL蛋白的抗体或其抗原结合片段、制备方法和应用。本发明还提供了编码所述靶向AXL蛋白的抗体或其抗原结合片段的分离的多核苷酸，以及包含所述分离的多核苷酸的载体。本发明提供的靶向AXL的抗体能够以高亲和力结合AXL蛋白，可介导ADCC作用杀伤肿瘤，或作为CART细胞的靶点识别域，发挥抗肿瘤作用，用于预防或治疗肿瘤，具有广阔的应用前景。

Description

靶向AXL蛋白的抗体及其抗原结合片段、其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物免疫技术领域，具体涉及能特异性结合AXL蛋白的 抗体及其抗原结合片段，本发明还涉及所述抗体及其抗原结合片段的制备 方法和用途。
背景技术
AXL是一种104-140kDa的跨膜蛋白，其属于哺乳动物受体酪氨酸激 酶(RTK)的TAM亚家族，并且具有转化能力(Paccez et al.,2014)。AXL 胞外域由两个膜远端N端免疫球蛋白(Ig)样域(Ig1和Ig2域)和两个 膜近端纤连蛋白III型(FNIII)重复序列(FN1和FN2域)组合组成(Paccez et al.,2014)。AXL蛋白由基因AXL(UFO、ARK、Tyro7或JTK11)编码表 达，受体是酪氨酸激酶的Tyro-3家族成员，结合配体Gas6(与抗凝血因子 蛋白S同源，70-kDa)后，通过PI-3K/Akt、Ras/Erk以及β-联蛋白/TCF等 途径转导信号，参与调控肿瘤细胞存活、增殖、迁移和粘附。AXL是慢性 髓性白血病(CML)中首个被鉴定的转化基因，随后的研究发现，与正常组 织相比，AXL在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、卵巢 癌和肾癌等多种肿瘤组织中呈激活表达状态，尤其是在高侵袭、高转移的基 底样和/或三阴性乳腺癌、转移性肺癌、胰腺癌等肿瘤组织中异常激活表达， 参与调控肿瘤细胞上皮间质转化、血管生成、凋亡和免疫调节等，促进肿瘤 转移、侵袭进而导致预后不良。而在非肿瘤的疾病中却未见显著升高，例如 慢性病毒性肝炎，自身免疫性肝炎，胆汁淤积性肝病或非酒精性脂肪性肝病 等慢性肝病(CLD)患者血清中未见可溶性AXL(sAxl)升高；而在肝细胞 癌(HCC)、或肝癌高度相关的晚期纤维化(F3期)或肝硬化(F4期)患者 血清中sAxl浓度特异性增加。AXL因此也可作为生物标志物进行肿瘤的临 床诊断。
近年来的研究发现，AXL蛋白的高表达也与肿瘤耐药性的形成密切相 关。在化疗和受体酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗耐药的癌细胞中，如EGFR 抑制剂难治性肺癌、PI3K抑制剂耐药性头颈癌、抗HER2抗体耐药性乳腺 癌，舒尼替尼耐药性肾癌和ALK抑制剂耐药性神经母细胞瘤等，AXL表达 显著升高。抑制AXL表达可逆转耐药的肿瘤细胞对细胞毒性药物和靶向抑 制剂的敏感性。因此，AXL激酶抑制剂成为癌症治疗的一个新策略。此外， AXL的唯一配体Gas6也在多种恶性肿瘤中呈高表达，特异性阻断AXL-Gas6 的相互作用可有效地抑制肿瘤细胞的迁移、侵袭以及耐药性。临床研究表明 AVB-500通过抑制AXL/Gas6信号通路，可有效抑制铂耐药性卵巢癌的进展。 目前该研究已在美国完成Ⅰ期临床试验，并即将进入Ⅱ期注册临床研究。
与其他靶点相比，靶向AXL的抗体可被快速大量的内化，有助于结合 到抗原性相关的肿瘤靶细胞表面的数量多，到非靶细胞的数量少，进入靶细 胞内的数量多，进入非靶细胞内的数量少。因此，AXL特异性结合的抗体- 药物偶联物(antibody-drug conjugate，ADC)的开发引起领域关注。由于肿 瘤微环境中糖酵解增强、缺氧以及组织灌注不足等，积聚大量的酸性代谢产 物使肿瘤微环境呈酸性，通常pH值在5.8至7.0范围内，多数在6.4-6.8之 间。这种酸性的肿瘤微环境促进了肿瘤的增殖、侵袭迁移以及免疫逃逸，并 给肿瘤治疗带来挑战。因此，迫切需要研究开发更多特异性强，在酸性肿瘤 微环境的条件下，具有亲和力高、免疫原性低、稳定性好的靶向AXL的抗 体，以提升肿瘤的治疗效果。
有数据显示，利用AXL单克隆抗体和小分子细胞毒药物结合制备成的 抗体-药物偶联物(antibody-drug conjugate，ADC)能增强作用于肿瘤的靶向 性，减少毒副作用。与完全或部分人源化抗体或抗体片段药物相比，ADC 在肿瘤组织内释放高活性的细胞毒药物而有效抑制肿瘤生长和转移。临床研 究表明，源自现有AXL抗体的ADC因其靶向肿瘤抗原的位点单一而易产生 耐药性，且其血液半衰期低而导致毒性增加。因此，有必要进一步研发优化 AXL抗体药物。
发明内容
基于现有技术的不足，本发明的主要目的在于提供一种在酸性条件下亲 和力更高，特异性更强，免疫原性更低、稳定性更好的靶向AXL蛋白的抗 体。本发明还提供了所述抗体的制备方法和用途，本发明的靶向AXL蛋白 的抗体可以用于检测和/或治疗肿瘤。
一方面，本发明提供了一种能够特异性结合AXL蛋白的抗体或其抗原 结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)包含下述3个互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:9，或与其相比具有一 个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、 缺失或添加)的序列，
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:10，或与其相比具有一 个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、 缺失或添加)的序列，和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:11，或与其相比具有 一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置 换、缺失或添加)的序列；
和/或
(b)包含下述3个互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL)：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:12，或与其相比具有一 个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、 缺失或添加)的序列，
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:13，或与其相比具有一 个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、 缺失或添加)的序列，和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:14，或与其相比具有一 个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、 缺失或添加)的序列；
优选地，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ ID NO:9所 示的VH CDR1、如SEQ ID NO:10所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:11所 示的VH CDR3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO: 12所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:13所示的VL CDR2、如SEQ ID NO:14 所示的VL CDR3。
一方面，本发明提供了一种能够特异性结合AXL蛋白的抗体或其抗原 结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)包含下述3个互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:15，或与其相比具有一 个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、 缺失或添加)的序列，
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:16，或与其相比具有一 个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、 缺失或添加)的序列，和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:17，或与其相比具有 一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置 换、缺失或添加)的序列；
和/或
(b)包含下述3个互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL)：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:18，或与其相比具有一 个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、 缺失或添加)的序列，
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:19，或与其相比具有一 个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、 缺失或添加)的序列，和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:20，或与其相比具有一 个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、 缺失或添加)的序列；
优选地，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ ID NO:15所 示的VH CDR1、如SEQ ID NO:16所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:17所 示的VH CDR3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO: 18所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:19所示的VL CDR2、如SEQ ID NO:20 所示的VL CDR3。
一方面，本发明提供了一种能够特异性结合AXL蛋白的抗体或其抗原 结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)包含下述3个互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:21，或与其相比具有一 个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、 缺失或添加)的序列，
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:22，或与其相比具有一 个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、 缺失或添加)的序列，和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:23，或与其相比具有 一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置 换、缺失或添加)的序列；
和/或
(b)包含下述3个互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL)：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:24，或与其相比具有一 个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、 缺失或添加)的序列，
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:25，或与其相比具有一 个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、 缺失或添加)的序列，和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:26，或与其相比具有一 个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、 缺失或添加)的序列；
优选地，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ ID NO:21所 示的VH CDR1、如SEQ ID NO:22所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:23所 示的VH CDR3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO: 24所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:25所示的VL CDR2、如SEQ ID NO:26 所示的VL CDR3。
一方面，本发明提供了一种能够特异性结合AXL蛋白的抗体或其抗原 结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)包含下述3个互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:27，或与其相比具有一 个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、 缺失或添加)的序列，
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:28，或与其相比具有一 个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、 缺失或添加)的序列，和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:29，或与其相比具有 一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置 换、缺失或添加)的序列；
和/或
(b)包含下述3个互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL)：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:30，或与其相比具有一 个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、 缺失或添加)的序列，
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:31，或与其相比具有一 个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、 缺失或添加)的序列，和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:32，或与其相比具有一 个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、 缺失或添加)的序列；
优选地，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ ID NO:27所 示的VH CDR1、如SEQ ID NO:28所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:29所 示的VH CDR3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO: 30所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:31所示的VL CDR2、如SEQ ID NO:32 所示的VL CDR3。
一方面，本发明提供了一种能够特异性结合AXL蛋白的抗体或其抗原 结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，
所述重链可变区包含SEQ ID NO:1、3、5和7中任一项所示的重链可 变区中含有的3个CDR；并且，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:2、4、6 和8中任一项所示的轻链可变区中含有的3个CDR；
优选地，所述重链可变区中含有的3个CDR，和/或所述轻链可变区中 含有的3个CDR，由Kabat、Chothia或IMGT编号系统定义。
根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结 合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:1所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO:1所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺 失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加) 的序列；或
(iii)与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、 至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
和/或，
(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(iv)SEQ ID NO:2所示的序列；
(v)与SEQ ID NO:2所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺 失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加) 的序列；或
(vi)与SEQ ID NO:2所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、 至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
优选地，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:1所示 的序列的VH和具有如SEQ ID NO:2所示的序列的VL。
根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结 合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:3所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO:3所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺 失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加) 的序列；或
(iii)与SEQ ID NO:3所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、 至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
和/或，
(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(iv)SEQ ID NO:4所示的序列；
(v)与SEQ ID NO:4所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺 失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加) 的序列；或
(vi)与SEQ ID NO:4所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、 至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
优选地，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:3所示 的序列的VH和具有如SEQ ID NO:4所示的序列的VL。
根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结 合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:5所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO:5所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺 失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加) 的序列；或
(iii)与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、 至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
和/或，
(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(iv)SEQ ID NO:6所示的序列；
(v)与SEQ ID NO:6所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺 失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加) 的序列；或
(vi)与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、 至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
优选地，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:5所示 的序列的VH和具有如SEQ ID NO:6所示的序列的VL。
根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结 合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:7所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO:7所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺 失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加) 的序列；或
(iii)与SEQ ID NO:7所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、 至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
和/或，
(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(iv)SEQ ID NO:8所示的序列；
(v)与SEQ ID NO:8所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺 失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加) 的序列；或
(vi)与SEQ ID NO:8所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、 至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
优选地，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:7所示 的序列的VH和具有如SEQ ID NO:8所示的序列的VL。
根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结 合片段进一步包含：
(a)人免疫球蛋白的重链恒定区(CH)或其变体，所述变体与其所源自 的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、 至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个， 2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；和
(b)人免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)或其变体，所述变体与其所源自 的序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换(例如至多15个、至多10个、 或至多5个氨基酸的保守置换；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的 保守置换)；
优选地，所述重链恒定区是IgG重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3 或IgG4重链恒定区，更优选地，其是人IgG1或人IgG4重链恒定区；
优选地，所述轻链恒定区是κ轻链恒定区。
根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段选 自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体(diabody)和单 域抗体(sdAb)；和/或，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双 特异性抗体或多特异性抗体；更优选地，所述抗体为完全人抗体。
另一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体T细胞，其包含本发明所述 的抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述抗体或抗原结合片段中的重链可变区和轻链可变区为串联 组合或并联组合。
另一方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其编码本发明所述的抗 体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。
另一方面，本发明提供了一种载体，其包含本发明所述的分离的核酸分 子；优选地，所述载体为克隆载体或表达载体；更优选地，所述载体为病毒；
进一步优选地，所述病毒载体的病毒骨架来源于经修饰或经改造的痘苗 病毒天坛株、痘苗病毒纽约株、痘苗病毒哥本哈根株、痘苗病毒金丝雀株、 痘苗病毒安卡拉株、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、水 痘-带状疱疹病毒载体、呼吸道合胞病毒、生里基森林病毒、EB病毒、巨细 胞病毒、人疱疹病毒6型、天花病毒、传染性软疣病毒、羊口疮病毒、呼肠 孤病毒、轮状病毒、肠道病毒、塞内卡病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、鼻病毒、甲型肝炎病毒、口蹄疫病毒、披膜病毒、甲病毒、东部马脑炎病毒、 辛德毕斯病毒、风疹病毒、冠状病毒、黄病毒、丙型肝炎病毒、日本脑炎病 毒、圣路易斯脑炎病毒、墨累谷热病毒、黄热病毒、西尼罗河病毒、寨卡病 毒、登革病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、沙粒病毒、拉沙热病毒、淋巴细 胞性脉络丛脑膜炎病毒、皮钦德病毒、胡宁病毒、马丘波病毒、汉坦病毒、 裂谷热病毒、副粘病毒、人副流感病毒、腮腺炎病毒、猴病毒5、麻疹病毒、 水疱性口炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、正粘病毒、甲型流感病毒、 乙型流感病毒、丙型流感病毒、丁型肝炎病毒、猴免疫缺陷病毒、人免疫缺 陷病毒1型和人免疫缺陷病毒2型、劳氏肉瘤病毒、嗜人T细胞白血病病毒 1型、猴泡沫病毒、乙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人乳头瘤病毒或多瘤病 毒。
更优选地为，所述载体为克隆载体AbVec-hIgKappa(GenBank: FJ475056.1)或者克隆载体AbVec-hIgG1(GenBank:FJ475055.1)。
另一方面，本发明提供了宿主细胞，其包含本发明所述的分离的核酸分 子或载体；
优选地，所述宿主细胞是原核的或真核的，更优选地，所述宿主细胞选 自大肠杆菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或抗原结合片 段、多特异性抗体的其它细胞；进一步优选地，所述宿主细胞是哺乳动物细 胞；更进一步优选地，所述宿主细胞为人、鼠、羊、马、狗或猫的细胞；最 优选地，所述宿主细胞是293细胞或CHO细胞。
再一方面，本发明提供了制备本发明所述的抗体或其抗原结合片段的方 法，其包括在允许本发明所述的抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养 所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合 片段。
再一方面，本发明提供了双特异性或多特异性分子，其包含本发明所述 的抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述双特异性或多特异性分子特异性结合AXL蛋白，并且额 外地特异性结合一个或多个其他靶标；
优选地，所述双特异性或多特异性分子还包含至少一种具有针对第二靶 标的第二结合特异性的分子(例如第二抗体)；
优选地，所述双特异性或多特异性分子还包含其他特异性结合AXL蛋 白表位的抗体或抗原结合片段。
再一方面，本发明提供了一种免疫缀合物，其包含本发明所述的抗体或 其抗原结合片段以及连接于所述抗体或其抗原结合片段的治疗剂；
优选地，所述治疗剂选自细胞毒剂；
优选地，所述治疗剂选自烷化剂、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、抗 代谢物、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、放射性核素剂，及其任意 组合；
优选地，所述免疫缀合物是抗体-药物偶联物(ADC)。
再一方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有本发明所述的抗体或 其抗原结合片段、双特异性或多特异性分子或者免疫缀合物，以及药学上可 接受的载体和/或赋形剂；
优选地，药物组合物还包含另外的药学活性剂；
优选地，所述另外的药学活性剂是具有抗肿瘤活性的药物，例如烷化剂、 有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激 酶抑制剂、放射性核素剂、放射增敏剂、抗血管生成剂、细胞因子、分子靶 向药物、免疫检查点抑制剂或溶瘤病毒；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性分子或免疫 缀合物与所述另外的药学活性剂作为分离的组分或作为同一组合物的组分 提供。
再一方面，本发明提供了一种试剂盒，其含有本发明所述的抗体或其抗 原结合片段；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记，例如酶(例如 辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质) 或生物素；
优选地，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本发明所述的抗体 或其抗原结合片段；
优选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化 物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。
再一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，其包含本发明所述的抗体 或其抗原结合片段的抗原结合结构域；
优选地，所述抗原结合结构域包含本发明所述的抗体或其抗原结合片段 的重链可变区和轻链可变区；
优选地，所述抗原结合结构域是scFv；
优选地，所述抗原结合受体包含本发明所述的抗体的抗原结合片段；
优选地，所述抗原结合受体由免疫效应细胞(例如T细胞)所表达。
再一方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其编码所述的嵌合抗原 受体。
再一方面，本发明提供了一种载体，其包含编码所述的嵌合抗原受体的 分离的核酸分子；优选地，其用于制备嵌合抗原受体T细胞。
再一方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含编码所述的嵌合抗原受 体的分离的核酸分子或载体；
优选地，所述宿主细胞是免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)；
优选地，所述宿主细胞是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)。
本发明还提供了一种抑制肿瘤细胞生长和/或杀伤所述肿瘤细胞的方法， 其包括将所述肿瘤细胞与有效量的本发明所述的抗体或其抗原结合片段， 或双特异性或多特异性分子，或免疫缀合物，或药物组合物，或嵌合抗原 受体，或宿主细胞接触。
本发明还提供了一种用于在受试者(例如人)中预防和/或治疗肿瘤的 方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的本发明所述的抗体或 其抗原结合片段，或双特异性或多特异性分子，或免疫缀合物，或药物组 合物，或嵌合抗原受体，或宿主细胞；
优选地，所述肿瘤选自B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、黑色素瘤、前列 腺癌、肾细胞癌、肉瘤、胶质瘤如高级别胶质瘤、母细胞瘤如神经母细胞瘤、 骨肉瘤、浆细胞瘤、组织细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌诸如小细胞肺癌和 非小细胞肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、大肠癌、造血系统 癌、睾丸癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、鳞状细胞癌、腺癌、AIDS相关淋 巴瘤、膀胱癌、脑癌、神经系统癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌、霍奇金氏 淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或血液致瘤疾病；
优选地，所述受试者为哺乳动物，例如人；
优选地，所述方法还包括施用另外的具有抗肿瘤活性的药物，例如烷化 剂、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、酪氨 酸激酶抑制剂、放射性核素剂、放射增敏剂、抗血管生成剂、细胞因子、分 子靶向药物、免疫检查点抑制剂或溶瘤病毒；
优选地，所述方法还包括施用另外的抗肿瘤疗法，例如手术、化学治疗、 放射治疗、靶向治疗、免疫治疗、激素治疗、基因治疗或姑息治疗。
本发明还提供了本发明所述的抗体或其抗原结合片段，或双特异性或 多特异性分子，或免疫缀合物，或药物组合物，或嵌合抗原受体，或宿主 细胞，在制备药物中的用途，所述药物用于在受试者(例如人)中预防和/ 治疗肿瘤；
优选地，药物还包含另外的药学活性剂；
优选地，所述另外的药学活性剂是具有抗肿瘤活性的药物，例如烷化剂、 有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激 酶抑制剂、放射性核素剂、放射增敏剂、抗血管生成剂、细胞因子、分子靶 向药物、免疫检查点抑制剂或溶瘤病毒；
优选地，所述肿瘤选自B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、黑色素瘤、前列 腺癌、肾细胞癌、肉瘤、胶质瘤如高级别胶质瘤、母细胞瘤如神经母细胞瘤、 骨肉瘤、浆细胞瘤、组织细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌诸如小细胞肺癌和 非小细胞肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、大肠癌、造血系统 癌、睾丸癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、鳞状细胞癌、腺癌、AIDS相关淋 巴瘤、膀胱癌、脑癌、神经系统癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌、霍奇金氏 淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或血液致瘤疾病；
优选地，所述受试者为哺乳动物，例如人。
具体地，本发明提供的靶向AXL蛋白的抗体或其抗原结合的制备方法 包括以下步骤：
1)通过对天然噬菌体抗体库进行筛选获得可表达靶向AXL蛋白的抗体 或其抗原结合的杂交瘤细胞株；
2)在由步骤1)得到的杂交瘤细胞株中克隆表达靶向AXL蛋白的抗体 或其抗原结合的基因；
3)提供表达载体，所述表达载体包含步骤2)所克隆得到的基因以及与 所述基因操作性相连的表达调控序列；
4)用步骤3)所述的表达载体转化宿主细胞；
5)培养步骤4)得到的宿主细胞；
6)分离纯化得到单克隆抗体。
另一方面，本发明提供了用于上述制备方法的杂交瘤细胞株。
本发明利用天然噬菌体抗体库筛选获得了71株靶向AXL的抗体，均可 识别结合人AXL的人源抗体，其中四株靶向AXL抗体(Hu001-5、Hu001-7、 Hu001-11和Hu001-14)特异性识别人源AXL的胞外域(extra-cellular domain, ECD)蛋白，具有阻断AXL-Gas6相互作用的潜能。上述AXL抗体在酸性条 件下亲和力更强，有望发挥更精准有效的杀伤肿瘤作用，同时减少对正常组 织毒性杀伤，可增加抗体药物临床应用的安全性。本发明所述针对AXL的抗体，能够介导ADCC作用，既可单独抗体成药应用，也可用于制备CART 细胞，发挥抗肿瘤作用。
本发明制备了分泌特异性靶向AXL蛋白的抗体的人-鼠杂交瘤，利用分 子生物学技术克隆了该抗体的重链和轻链序列(百分之百人的基因)，构建 了抗AXL蛋白人源单克隆抗体，并由CHO细胞来表达生产抗体。这些抗体 作为药物与现有抗体比较，具有更强的结合能力和特异性。实验结果显示， 本发明的特异性抗体具有良好的生物学效应，能够识别人AXL蛋白，且亲 和力为2.92×10-9M与1.40×10-9M，并且本发明的抗体具有较强的酸性环境的趋化性，可以制备用于靶向AXL高表达疾病的CART或者单克隆抗体等 治疗药物，有非常良好的前景。
附图说明
图1表示通过ELISA筛选克隆上清与抗原hAXL-ECD结合的曲线图。 图1A-图1G分别显示了本申请的71个克隆能够与hAXL-ECD特异性结合； 其中5号、7号、11号和14号克隆亲和力最高，选择5号、7号、11号和 14号克隆进行实验，并命名为Hu001-5、Hu001-7、Hu001-11和Hu001-14。
图2表示本发明使用的抗体构建表达载体图谱AbVec-hIgKappa和 AbVec-hIgG1WT。
图3为流式数据显示本发明的抗AXL抗体Hu001-5、Hu001-7、Hu001-11 和Hu001-14的亲和力的曲线图；其中图3A表示在不同pH下，阳性对照 CCT301-38抗体的亲和力随浓度变化的示意图，图3B-3E表示表示在不同 pH下，抗AXL抗体Hu001-5、Hu001-7、Hu001-11和Hu001-14的亲和力随 浓度变化的示意图，可以显而易见的发现，本发明抗体相对于阳性对照有更 高的亲和力，且在酸性条件下较中性条件有更高的结合能力。
图4示出为使用本发明的抗AXL抗体Hu001-11和阳性对照CCT301-38 抗体分别制备的CART细胞，及其在不同条件下气的体外活性测试，从图4 可以毫无疑义地得知，本发明的抗AXL抗体Hu001-11在体外的酸性条件下 活化更强。
图5示出为与阳性对照CCT301-38抗体制备的CART细胞相比，使用 本发明的抗AXL抗体Hu001-11制备的CART细胞在体外可介导高杀伤活 性。
图6示出为与阳性对照CCT301-38抗体相比，使用本发明的抗AXL抗 体Hu001-5、Hu001-7、Hu001-11和Hu001-14在体外可介导较为广谱的抗肿 瘤活性。
图7示出为抗体可变区的排布方式。
具体实施方式
本申请的以下描述只为说明本申请的多种实施方式。因此，此处讨论的 具体修改方式不应理解为对申请范围的限制。本领域的技术人员在不偏离本 申请范围的情况下即可很容易地得出多种等同方式、变化和修改，应理解这 样的等同实施方式包括在本发明范围内。在本申请中引用的所有文献，包括 公开出版物、专利和专利申请都通过引用的方式全文并入。
定义
本发明中的"抗体"一词包括任意可结合某特定抗原的免疫球蛋白、单克 隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体或双特异性(双价)抗体。一个天然的 完整抗体包含两条重链和两条轻链。每条重链由一可变区和第一、第二、第 三恒定区组成；每条轻链由一可变区和一恒定区组成。哺乳动物的重链可分 为α、δ、ε、γ和μ，哺乳动物的轻链可分为λ或κ。抗体呈"Y"型，Y型结 构的颈部由两条重链的第二和第三恒定区组成，其通过二硫键结合。"Y"型 结构的每条臂包括其中一条重链的可变区和第一恒定区，其与一条轻链的可 变区和恒定区结合。轻链和重链的可变区决定抗原的结合。每条链的可变区 均含有三个高变区，称互补决定区(CDR)。轻链(L)的CDR包含VLCDR1、 VLCDR2、VLCDR3，重链(H)的CDR包含VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3。 本发明中公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可通过Kabat，Chothia或Al-Lazikani命名法命名或识别。(AI-Lazikani，B.，Chothia,C.，Lesk，A.M.，J.Mol.Biol.，273(4)：927(1997)；Chothia，C.等，J.Mol.Biol.，186(3)： 651-63(1985)；Chothia，C.and Lesk，A.M.，J.Mol.Biol.，196：901(1987)； Chothia，C.等，Nature，342(6252)：877-83(1989)；Kabat，E.A.等，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。其中，三个CDR由被称为框 架区(FR)的侧面连续部分间隔开，框架区比CDR更加高度保守并形成一 个支架支撑超变环。重链和轻链的恒定区与抗原结合无关，但具有多种效应 功能。抗体依据重链恒定区的氨基酸序列可以分成几类。根据是否含有α、δ、 ε、γ和μ重链，抗体可分别分为五个主要的分类或异构体：IgA、IgD、IgE、 IgG和IgM。几个主要的抗体分类还可分为亚类，如IgG1(γ1重链)、IgG2 (γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2 重链)等。
本申请中的"抗原结合片段"一词，指由含有一个或多个CDR的抗体部分 或者任何其他结合抗原但不具有完整抗体结构的抗体片段所形成的一种抗 体片段。抗原结合片段的例子包括，但不限于，如双功能抗体(diabody)、 Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、 双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(dsdiabody)、单链 抗体分子(scFv)、scFv二聚体(双价的双功能抗体)、双价单链抗体(BsFv)、多特异性抗体、骆驼化单域抗体(camelized single domain antibody)、纳米抗 体、域抗体和双价域抗体。抗原结合片段可以与母体抗体结合相同的抗原。 在某些实施方式中，抗原结合片段可以含有来自某特定人抗体的一个或多个 CDR，移接至来自一个或多个不同人抗体的框架区。
抗体的"Fab"片段是指由一条轻链(包括可变区和恒定区)和一条重链的 可变区和部分恒定区经二硫键结合起来的那部分抗体分子。
"Fab’"片段是指包含了部分绞链区的Fab片段。
"F(ab')2"指的是Fab的二聚体。
抗体的Fc段负责多种不同的效应功能如ADCC和CDC，但不参与抗原 的结合。
抗体的"Fv"段指的是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。Fv片段由 一条轻链的可变区和一条重链的可变区组成。
"单链Fv抗体"或"scFv"是指由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过 一个肽链连接而成的工程抗体(Huston JS等，Proc Natl Acad Sci USA，85： 5879(1988))。
"单链抗体Fv-Fc"或"scFv-Fc"是指由连接到某抗体Fc段的scFv组成的 工程抗体。
"骆驼化单域抗体(Camelized single domain antibody)"，"重链抗体"或 "HCAb(Heavy-chain-only antibodies，HCAb)"都是指含有两个VH域而不 含有轻链的抗体(Riechmann L.和Muyldermans S.，J Immunol Methods.231 (1-2)：25-38(1999)；Muyldermans S.，J Biotechnol.74(4)：277-302(2001)； W094/04678；W094/25591；U.S.Patent No.6,005，079)。重链抗体最初从驼 科(骆驼、单峰驼和美洲驼)衍生得到。虽然缺失轻链，骆驼化抗体(camelized antibodies)有确证的抗原结合全部功能(HamersCasterman C.等，Nature 363 (6428)：446-8(1993)；Nguyen VK.等，"Heavy-chainantibodies in Camelidae： a case of evolutionary innovation，Immunogenetics.54(1)：39-47(2002)； Nguyen VK.等，Immunology.109(1)：93-101(2003))。重链抗体的可变区 (VH域)是己知的最小的获得性免疫产生的抗原结合单位(Koch-Nolte F. 等，FASEBJ.21(13)：3490-8.Epub(2007))。
"纳米抗体"是指一种抗体片段，其由一个来自重链抗体的VH域和两个 恒定区CH2和CH3组成。
"双功能抗体(diabody)"包括带有两个抗原结合位点的小抗体片段，其 中该片段含有在同一条多肽链上相连的VH域和VL域(请参见，Holliger P. 等，Proc Natl Acad SciU S A.90(14)：6444-8(1993)；EP404097； W093/11161)。两个域之间衔接物很短，使同一条链上的两个域不能互相配 对，从而迫使两个域与另一条链的互补域配对，形成两个抗体结合位点。这 两个抗体结合位点可靶向结合相同或不同的抗原(或抗原表位)。
"域抗体"是指仅含有一条重链可变区或一条轻链可变区的抗体片段。在 某些情况下，两个或多个VH域由一个多肽衔接物共价结合并形成双价域抗 体。双价域抗体的两个VH域可靶向作用于相同或不同的抗原。
在某些实施方式中，"(dsFv)2"含有三条肽链：两个VH基因间通过一 条多肽衔接物相连，并通过二硫键与两个VL基团结合。
在某些实施方式中"双特异性ds双功能抗体"含有VL1-VH2(由一个多 肽衔接物相连)和VH1-VL2(也是由一个多肽衔接物相连)，两者在VH1 和VLl间通过二硫键结合。
"双特异性dsFv"或"dsFv-dsFv"含有三条多肽链：VH1-VH2基团，其中 两者的重链通过多肽衔接物(如：长的弹性衔接物)相连，并通过二硫键分 别与VL1和VL2基团结合，每对通过二硫键配对的重链轻链具有不同的抗 原特异性。
在某些实施方式中，"scFv二聚体"是双价双功能抗体或双价单链抗体 (BsFv)，含有二聚化的两个VH-VL(由多肽衔接物连接)基团，其中二个 基团的VH与另一个基团的VL协作形成两个结合位点，这两个结合位点可 靶向结合相同抗原(或抗原表位)或不同抗原(或抗原表位)。在另一些实 施方式中，"scFv二聚体"是双特异性双功能抗体，含有相互连接的VL1-VH2 (由多肽衔接物连接)和VH1-VL2(由多肽衔接物连接)，其中VH1和VL1协 作，VH2和VL2协作，且每个协作的配对具有不同的抗原特异性。
本申请中使用的术语"全人源"当用于抗体或抗原结合片段时，是指所述 抗体或抗原结合片段具有某氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，所述氨基 酸序列对应于由人或人免疫细胞生产的、或从例如利用人源抗体库的转基因 非人动物等非人来源衍生的抗体的氨基酸序列，或者其他编码人源抗体的序 列。在某些实施方式中，全人源抗体不包含来源于非人抗体的氨基酸残基(特 别是抗原结合残基)。
本申请中使用的术语"人源化"当用于抗体或抗原结合片段时，是指包括 来源于非人动物的CDR、来源于人的FR区，以及来源于人的恒定区(当适 用时)的抗体或抗原结合片段。由于人源化的抗体或抗原结合片段具有降低 的免疫原性，其在某些实施方式中可用作人的治疗剂。在一些实施方式中， 所述非人动物是哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠或仓鼠。 在一些实施方式中，所述人源化抗体或抗原结合片段除了CDR序列是非人源的以外，基本上全部由人源序列组成。在一些实施方式中，所述来源于人 的FR区可以包括与其来自的人源抗体相同的氨基酸序列，或其可以包括一 些氨基酸改变，例如，不超过10，9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸 改变。在一些实施方式中，该氨基酸改变可以仅存在于重链FR区、仅存在 于轻链FR区或同时存在于两个链中。在一些优选实施方式中，所述人源化 抗体包括人源FRl-3和人源JH和JK。
本申请中使用的术语"嵌合"是指具有来源于一种物种的重链和/或轻链 的一部分，和所述重链和/或轻链其余部分来源于不同物种的抗体或抗原结合 片段。在一个示例性的例子中，嵌合抗体可以包括来源于人的恒定区和来源 于非人动物例如小鼠的可变区。
本申请中的"特异性结合"或"特异性的结合"是指两分子间的非随机结合 反应，如抗体和抗原间的反应。在某些实施方式中，本申请的抗体或其抗原 结合片段与人和/或猴AXL蛋白特异性结合，并且其结合亲和力(KD)≤10-6M。 本申请中的KD是指解离速度与结合速度的比值(koff/kon)，可通过表面等离 子共振的方法测定，例如使用如Biacore的仪器。
除非特别标明，本发明所述的抗体的重轻链恒定区分别为人IgG1和κ 链。
在本申请中当"保守替代"用于氨基酸序列时，是指将一个氨基酸残基用 另一个具有相似理化性质的侧链的氨基酸残基替代。例如，可以在疏水侧链 氨基酸残基间(例如Met、Ala、VaL、Leu和Ile)、中性亲水侧链残基间(例 如Cys、Ser，Thr、Asn和Gln)、酸性侧链残基间(例如Asp、Glu)、碱性 侧链氨基酸间(例如His、Lys和Arg)或芳香侧链残基间(例如Trp、Tyr 和Phe)进行保守替代。本领域己知保守替代通常不会引起蛋白构象结构的 显著变化，因此能够保留蛋白质的生物活性。
当"百分比序列同一性"用于氨基酸序列(或核酸序列)时，是指在进行 序列比对，并且必要时引入间隔使相同氨基酸(或核酸)数目达到最多后， 在候选序列中，与参比序列相同的氨基酸(或核酸)残基占所述候选序列的 氨基酸(或核酸)残基的百分比。所述氨基酸残基的保守替代可以认为或可 以不认为是相同残基。可以通过本领域公开的工具对序列进行比对以确定氨 基酸(或核酸)序列的百分比序列同一性。本领域技术人员可以使用所述工 具的默认参数或根据比对的需要适当调整参数，例如通过挑选合适的算法。
本申请中使用的“T细胞”包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、T辅助1型T 细胞、T辅助2型T细胞、T辅助17型T细胞和抑制性T细胞。
本申请中使用的"效应功能"是指抗体的Fc区与其效应器例如C1复合物 和Fc受体结合的生物活性。示例性的效应功能包括抗体与C1复合物上的 C1q相互作用诱导的补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体的Fc区与效应细胞 上的Fc受体结合诱导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)以及吞噬。
本申请中的“癌症”或“癌病症”是指任何由肿瘤或恶性细胞生长、增殖或 转移所介导，并引发实体瘤和非实体瘤如白血病的医学状况。本发明中的" 肿瘤"是指肿瘤和/或恶性细胞的实体物质。
对某种状况的"治疗"或"疗法"包括预防或减轻某种状况，降低某种状况 兴起或发展的速度，减少发展出某种状况的风险，预防或延迟与某种状况相 关的症状发展，减少或终止与某种状况相关的症状，产生某种状况的完全或 部分的逆转，治愈某种状况，或以上的组合。对于癌症来说"治疗"或"疗法" 可以指抑制或减缓肿瘤或恶性细胞生长，繁殖，或转移，或以上的某些组合。 对于肿瘤来说"治疗"或"疗法"包括清除全部或部分的肿瘤，抑制或减缓肿瘤 生长和转移，预防或延缓肿瘤的发展，或以上的某些组合。
"被分离"的物质已经经人工由自然状态改变。如果自然界中出现某种" 被分离"的物质或成分，那么其已经被改变或脱离其原始状态，或二者均有 发生。例如，某一活体动物体内天然存在的多核苷酸或多肽是未被分离的， 但如果这些多核苷酸或多肽与之在天然状态下共存的物质足够分离并以足 够纯的状态存在，则可以认为是"被分离"。在某些实施方式中，抗体和抗原 结合片段的纯度为至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％，其由电 泳方法(如SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳)，或色谱法(如离子交换 色谱法或反相HPLC)确定。
本发明中"载体"是指，可将编码某蛋白的多核苷酸操作性地插入其中并 使该蛋白获得表达的一种运载工具。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞， 使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。举例来说，载体包括：质 粒、噬菌粒、柯斯质粒、人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工 染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)、噬菌体如λ噬茵体或M13 噬菌体，以及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录病毒(包括慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状 病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40))。载体可含有多种控制 表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报 告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还可包括协助其进入细胞 的成分，包括但不限于，病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳。
本发明中"宿主细胞"是指导入外源多核苷酸和/或载体的细胞。
关于本发明中的靶向AXL蛋白的抗体
在某些实施方式中，本申请提供了示例性的靶向AXL蛋白的抗体 Hu001-5抗体、Hu001-7抗体、Hu001-11抗体、Hu001-14抗体。
本领域技术人员应理解可以将前述CDR序列进行修饰以包含一个或更 多氨基酸的取代，由此得到提高的生物学活性例如提高的与AXL蛋白的结 合亲和性。例如，可以利用噬菌体展示技术生产并表达抗体变体库(例如 Fab或FcFv变体)，随后筛选与AXL蛋白的有亲和性的抗体。另一个例子 中，可以用计算机软件模拟所述抗体与AXL蛋白的结合并鉴别抗体上形成 结合界面的氨基酸残基。可以避免这些残基的替代以防止结合亲和性降低，或可以靶向这些残基进行替代以形成更强的结合。在某些实施方式中，CDR 序列中的至少一个(或全部)取代是保守替代。
在某些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段包括一个或多个CDR序 列，这些序列具有与SEQ ID NO:9-32的序列至少80％(例如至少85％、88％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列同 一性，并且同时保留了与其亲本抗体相似或甚至高于其的与AXL蛋白的结 合亲和性。所述亲本抗体具有基本相同的序列，但其相应的CDR序列与SEQ ID NO:9-32所列的序列具有100％序列同一性。
在一些实施方式中，本申请所述的抗体或抗原结合片段能够以≤10-7M的 结合亲和性(KD)与AXL蛋白的特异性结合，其通过表面等离子共振法测 量。结合亲和性值可以用KD值表示，其通过当抗原和抗原结合分子的结合 达到平衡时的解离速率与结合速率的比值(koff/kon)计算得到。所述抗原结 合亲和性(例如KD)可以通过本领域己知的适宜方法适宜地确定，例如包 括使用仪器如Biacore的等离子共振结合法。
在某些实施方式中，本申请所述抗体或抗原结合片段与AXL蛋白的以 1ng/mL-10μg/mL的EC50(即半数结合浓度)结合。抗体或抗原结合片段与 AXL蛋白的结合可以通过本领域己知的方法如夹心法如ELISA，Western印 迹，FACS或其他结合试验测定。在示例性的例子中，将待测抗体(即一抗) 与固定化的AXL蛋白的或表达AXL蛋白的细胞结合，随后洗掉未结合抗体， 引入标记的二抗，其能够与一抗结合因此能够检测出结合的二抗。当使用固 定化的AXL蛋白时可在酶标仪板上进行所述检测，或当使用表达AXL蛋白 的细胞时可使用FACS分析进行所述检测。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或抗原结合片段以10ng/mL-10 μg/mL(使用FACS分析测定)的EC50(即50％的有效浓度)与AXL蛋白 的结合。
在一些实施方式中，本申请所述的抗体的优势在于其能与具有免疫原性 的物质联用，如肿瘤细胞、纯化的肿瘤抗原和用编码免疫刺激因子转染的细 胞、肿瘤疫苗。此外，所述靶向AXL蛋白的抗体和其抗原结合片段可以包 括在联用治疗中，包括标准化学疗法和放射疗法、基于靶点的小分子疗法、 其他新兴免疫检查点调节剂疗法。在一些实施方式中，所述抗体和其抗原结 合片段可以用作抗体一药物缀合物、双特异性或多价抗体的基础分子。
在一些实施方式中，本申请所述的抗体和其抗原结合片段是骆驼化单域 抗体(camelized single chain domain antibody)、双功能抗体(diabody)、scFv、 scFv二聚体、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'、F (ab')2、ds双功能抗体(dsdiabody)、纳米抗体、域抗体或双价域抗体。
在一些实施方式中，本申请所述的抗体包括免疫球蛋白恒定区。在一些 实施方式中，免疫球蛋白恒定区包括重链和/或轻链恒定区。所述重链恒定区 包括CH1、CH1-CH2或CH1-CH3区。在一些实施方式中，免疫球蛋白恒定 区可以进一步包括一个或多个修饰以获得所需的性质。例如，可以将所述恒 定区修饰以降低的或消除一种或多种效应功能以增强FcRn受体结合或引入 一个或多个半胱氨酸残基。
在某些实施方式中，所述抗体及其抗原结合片段进一步包含缀合物。可 以设想，本发明中的抗体或其抗原结合片段可与多种缀合物连接(见例如 "Conjugate Vaccines"、Contributions to Microbiology and Immunology、J.M. Cruse and R.E.Lewis、Jr.(eds.)、Carger Press、New York(1989))。这些 缀合物可以通过共价结合、亲和结合、嵌入、同等结合(coordinate binding)、 络合、结合、混合或加入等其他方式与所述抗体或抗原结合物连接。在某些 实施方式中，本发明公开的抗体和抗原结合片段可以通过工程的方法使其含 有表位结合部分以外的特定位点，这些位点可用来结合一种或多种缀合物。 例如，这样的位点可包含一种或多种反应性氨基酸残基，例如半胱氨酸残基 和组氨酸残基，用于协助与结合物的共价连接。在某些实施方式中，抗体可 间接连于缀合物，或通过另一个缀合物相连。例如，所述抗体或其抗原结合 片段可结合生物素，然后间接结合第二个缀合物，其与亲和素相连。所述缀 合物可以是可检测的标记、药代动力学修饰部分、纯化部分或细胞毒性部分。 可检测的标记的例子可以包括荧光标记(例如荧光素、罗丹明、丹酰、藻红 蛋白或德克萨斯红)、酶底物标记物(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、 荧光素酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-D半乳糖昔酶)、稳定同位 素或者放射性同位素、发色团部分、地高辛、生物素/亲和素、DNA分子或 金以进行检测。在某些实施方式中，所述缀合物可以是药代动力学修饰部分 如PEG，其帮助延长抗体的半衰期。其他适宜的聚合物包括例如竣甲基纤维 素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇/丙二醇共聚物等。在某些 实施方式中，所述缀合物可以是纯化部分例如磁珠。"细胞毒性部分"可以是 对细胞有害的或可能损坏或杀死细胞的任何试剂。细胞毒性部分的示例包 括，但不限于，紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙绽、吐根碱、 丝裂霉素、依托泊昔、替尼泊甘、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、 柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、l-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普茶洛尔、嘌呤霉素 及其类似物、抗代谢物(例如，甲氨喋呤、6-巯基嘌呤、6-巯鸟瞟岭、阿糖 胞苷、5氟尿嘧啶达卡巴)、烷化剂(例如氮芥、塞替派苯丁酸氮芥、美法仑、 卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、 链脲霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(例 如柔红霉素(以前的道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素(以前 称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茵霉素(AMC))以及抗有丝分裂 剂(例如长春新碱和长春碱)。
多核苷酸和重组方法
使用本领域公知的遗传工程学技术，可以将本申请所述抗体及其抗原结 合片段的氨基酸序列转换成相应的DNA编码序列。由于遗传密码的简并性， 转换所得的DNA序列可以完全一致，而编码的蛋白序列保持不变。
使用本领域公知的重组技术，可以将包括编码所述抗体及其抗原结合片 段的多核苷酸的载体引入宿主细胞用于克隆(扩增DNA)或基因表达。在 另一实施方式中，所述抗体及其抗原结合片段可通过本领域公知的同源重组 的方法制得。多种载体可供选择。载体组分通常包括，但不限于，以下的二 种或多种：信号序列、复制起始点、一种或多种标记基因、增强序列、启动 子(例如：SV40、CMV、EF-1a)和转录终止序列。
在一些实施方式中，所述载体系统包括哺乳动物、细菌、酵母系统等， 并将包括质粒例如但不限于pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、 pELpGEMEX、pGEX、pCLpCMV、pEGFP、pEGFT，pSV2、pFUSE、pVITRO， pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、 pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS420、pLexA、pACT2等其他 可从实验室获得或市售的载体。适宜的载体可以包括质粒或病毒载体(例如 复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
可以将包括编码所述抗体及其抗原结合片段的多核苷酸的载体引入宿 主细胞用于克隆或基因表达。本发明中适用于克隆或表达所述载体中的 DNA的宿主细胞为原核细胞、酵母或上述高级真核细胞。适用于本发明用 途的原核细胞包括真细菌，如革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌，例如肠杆菌科 (如大肠杆菌)，肠杆菌属，欧文氏菌属，克雷白氏杆菌属，变形杆菌属， 沙门氏菌属，如，鼠伤寒沙门(氏)杆菌，沙雷氏菌属，如粘质沙雷氏菌， 以及志贺氏菌属，及杆菌属如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，假单胞菌如绿 肽杆菌和链霉菌。
除了原核细胞以外，真核微生物如丝状真菌或酵母也可作宿主细胞克隆 或表达编码抗体的载体。酿酒酵母，或面包酵母是最常用的低等真核宿主微 生物。但是，许多其他属、种和株都比较常用且在本发明中适用，如粟酒裂 殖酵母；克鲁维酵母属宿主如，乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母 (ATCC12424)、保加利亚克鲁维酵母(ATCC16045)、魏氏克鲁维酵母 (ATCC24178)、克鲁雄酵母(ATCC56500)、果蝇克鲁维酵母(ATCC36906)、 耐热克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母：解脂耶氏酵母(EP402226)；巴斯德 毕赤酵母(EP183070)；假丝酵母：里氏木霉(EP244234)；链孢霉；西方许 旺酵母，如：西方许旺酵母；和丝状真菌，如：脉孢菌、青霉菌、弯颈霉和 曲霉菌，如：钩巢曲霉和黑曲霉。
本发明中提供的适用于表达糖基化抗体或其抗原结合片段的宿主细胞 由多细胞生物衍生得到。无脊椎细胞的实例包括植物和昆虫细胞。己发现多 种杆状病毒株(baculoviral strains)及其变体以及对应的许可性昆虫宿主细 胞(permissive insecthost cells)，来自于诸如以下的宿主：草地夜蛾(毛虫)、 埃及斑蚊(蚊子)、白纹伊蚊(蚊子)、黑腹果蝇(果蝇)及家蚕。多种用于 转染的病毒株为公众可得，例如苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒和家蚕核型多 角体病毒的Bm-5变种，这些病毒都可在本发明中使用，特别是用于转染草 地夜蛾细胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牵牛花、西红柿和烟草的植物细 胞培养也可用作宿主。
但是，最感兴趣的是脊椎细胞，且脊椎细胞的培养(组织培养)己经成 为常规操作。可用的哺乳动物宿主细胞实例有，SV40转化的猴肾细胞CV1 系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚胎肾细胞系(293或悬浮培养的293细 胞亚克隆，Graham et al.,].GenVirol.36：59(1977))；幼地鼠肾细胞(B血， ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub et al.，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠睾丸支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿 猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2,HB 8065)； 小鼠乳腺瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，AnnalsN. Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；及人肝癌细胞系 HepG2)。在某些优选的实施方式中，所述宿主细胞是293F细胞。
用上述的可产生所述抗体及其抗原结合片段的表达或克隆载体转化宿 主细胞，并将其在常规的营养培养基中培养，所述营养培养基经修饰后适宜 于诱导启动子、选择转化细胞或扩增编码目的序列的基因。
本发明中用于产生所述抗体及其抗原结合片段的宿主细胞可在多种本 领域公知的培养基中培养。所述培养基还可含有本领域公知的适当浓度的任 何其他必要的添加剂。所述培养基的条件，如温度、pH值等类似条件，为 选择用于表达的宿主细胞此前所使用的条件，为普通技术人员所熟知。
在使用重组技术时，所述抗体可在胞内、壁膜空间生成，或直接分泌到 培养基中。如果所述抗体在胞内生成，首先除去宿主细胞或裂解片断的颗粒 残骸，例如，可通过离心或超声的方法。Carter et al.,Bio/Technology 10： 163-167(1992)描述了将分泌到大肠杆菌壁膜空间的抗体分离的方法。简要 地说，在醋酸铀(pH 3.5)、EDTA和苯甲磺酣氟(PMSF)存在的条件下化 开细胞糊(cell paste)约30分钟以上。离心除去细胞碎片。如所述抗体分泌 到培养基中，则通常首先使用市售的蛋白浓度过滤器，如lAmicon或MilliporePellicon ultrafiltration unit，浓缩该表达系统的上清液。在任何前述的步骤中 都可加入蛋白酶抑制剂如PMSF以抑制蛋白降解，以及抗生素以防止偶然污 染物的生长。
从所述细胞中制得的抗体可采用纯化方法进行纯化，例如羟磷灰石色 谱、凝胶电泳、透析、DEAE一纤维素离子交换色谱柱、硫酸铵沉淀、盐析 以及亲和色谱，其中亲和色谱为优选的纯化技术。所述抗体的种类以及所述 抗体中存在任何免疫球蛋白的Fc结构域决定了蛋白A作为亲和配体是否适 合。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark et al.，J. lmmunol.Meth.62：13(1983))。蛋白G适用于所有鼠源异构体和人γ3(Guss et al.,EMBO J.5：1567 1575(1986))。琼脂糖是最常用的亲和配体附着基质， 但也可选用其他基质。机械力稳定的基质如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯)苯 与用琼脂糖相比可实现更快的流速和更短的处理时间。如该抗体含有CH3 结构域，则可用BakerbondABX.TM树脂进行纯化(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)。也可根据需要获得的抗体确定其他蛋白纯化的技术，如离子交换柱中 的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱、基于阴离子或阳离子交换树脂 的肝素琼脂糖凝胶色谱(如聚天冬氨酸柱)、层析聚焦、SDS-PAGE、以及硫 酸铵沉淀。
在任意初步纯化步骤之后，可用低pH疏水相互作用色谱的方法处理含 有感兴趣的抗体和杂质的混合物，用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选地在 低盐浓度下进行(例如，从约0到0.25M盐浓度)。
试剂盒
本申请提供了包括所述抗体或其抗原结合片段的试剂盒。在一些实施方 式中，所述试剂盒用于检测在生物样品中的AXL蛋白的存在情况或水平。 所述生物样品可以包括细胞或组织。
在一些实施方式中，所述试剂盒包括与可检测标记缀合的抗体或其抗原 结合片段。在一些实施方式中，所述试剂盒包括未标记的抗体，并进一步包 括能够与未标记的抗体结合标记的二抗。所述试剂盒可以进一步包括使用说 明和在试剂盒中将每个组件分隔开的包装。
在一些实施方式中，所述抗体与底物或仪器连接用于夹心测定如ELISA 或免疫色谱测定。适用的底物或仪器可以是例如微孔板和试纸。
药物组合物和治疗方法
本申请进一步提供了包括所述抗体的药物组合物和一个或多个药学上 可接受的载体。
用在本申请公开的药物组合物中的药用可接受载剂可包括，例如，药用 可接受的液体、凝胶或固体载剂、水相介质、非水相介质、抗微生物物质、 等渗物质、缓冲液、抗氧剂、麻醉剂、悬浮剂/分散剂、整合剂、稀释剂、佐 剂、辅料或无毒辅助物质，其他本领域公知的组分或以上的多种组合。
适用的组分可包括，例如，抗氧剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲液、 防腐剂、润滑剂、矫味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂例如糖和环糊 精。适用的抗氧剂可包括，例如，甲硫氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸 纳、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、巯基甘油、巯基乙酸、巯基山梨 醇、丁基甲基茴香醚、丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯。在一种含有本发 明公开的抗体的组合物中包括一种或多种抗氧剂如甲硫氨酸，可将降低所述 抗体的氧化。对氧化作用的减少可防止或减少结合亲和力的降低，从而提高 抗体稳定性并延长保质期。
进一步的说，药用可接受的载剂可包括，例如，水相介质如氯化钠注射 液、林格氏液注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液、或葡萄糖和乳酸 林格注射液、非水介质例如：植物来源的不挥发性油、棉花子油、玉米油、 芝麻油、或者花生油、细菌抑制或真菌抑制浓度下的抗菌物质、等渗剂如氯 化钠或葡萄糖、缓冲液如磷酸盐或枸橼酸盐缓冲液，抗氧化剂如硫酸氢钠， 局部麻醉剂如盐酸普鲁卡因，助悬剂和分散剂如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲 基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮，乳化剂如聚山梨醇酯80(吐温-80)、整合试剂 如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇双(2一氨基乙基醚)四乙酸)、 乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。作为载剂的抗 菌剂可加入多次剂量容器中的药物组合物中，其包括酚类或甲酚、汞制剂、 苯甲醇、氯代丁醇、甲基和丙基对羟基苯甲酸酯、噻汞撒、氯苯甲烷铵和氯 苯乙铵。适用的辅料可包括，例如，水、盐、葡萄糖、甘油或乙醇。适用的 无毒辅助物质可包括，例如，乳化剂、pH值缓冲剂、稳定剂、增溶剂，或 者醋酸钠、去水山梨糖醇月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或者环糊精之类的物质。
所述药物组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳剂、丸剂、胶囊、片剂、 持续释放制剂或粉末。口服制剂可以包括标准载体如药物级的甘露醇、乳糖、 淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
在某些实施方式中，所述药物组合物被制剂成可注射的组合物。可注射 的药物组合物可以任何常规的形式制备，例如，液体溶剂、悬浮剂、乳化剂 或适用于产生液体溶剂、悬浮剂或乳化剂的固体形式。注射制剂可包括现用 的无菌和/或无热原溶液、使用前现与溶剂结合的无菌干燥的可溶物，如冻干 粉，包括皮下片、注射即用的无菌悬浮剂、使用前现与介质结合的无菌干燥 不溶产品，和无菌和/或无热原的乳剂。溶剂可以为水相或非水相。
在某些实施方式中，单位剂量的注射制剂包装在一个安瓿、一支管或一 支带有针的针筒中。本领域悉知，所有注射给药的制剂应为无菌无热原。
在某些实施方式中，通过将本申请公开的抗体或其抗原结合片段溶解于 某适当的溶剂中可制备无菌冻干的粉末。所述溶剂可含有一种可提高粉或由 粉末制得的重组溶液的稳定性，或改善粉末或重组溶液的其他药理组分。适 用的辅料包括，但不限于，水、葡萄糖、三梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖 醇、甘油、葡萄糖、黑糖或其他适用的物质。溶剂可含有缓冲液，如枸橼酸 缓冲液、磷酸钠或磷酸钾缓冲液或其他本技术熟练人员公知的缓冲液，在一 种实施方式中，缓冲液的pH为中性。在本领域公知的标准条件下进行对所 述溶液进行随后的过滤除菌，然后冻干制得理想的制剂。在一种实施方式中， 将所得的溶剂分装至小管中冻干。每支小管可容纳单次剂量或多次剂量的所 述靶向AXL蛋白的抗体或其抗原结合片段或其组合物。每支小管中的装入 量可略微高于每次剂量所需或多次剂量所需(例如10％过量)，从而保证取 样精确和给药精确。冻干粉可在适当的条件下储存，如在约4℃到室温范围。
用注射用水将冻干粉重溶得到用于注射给药的制剂。在一种实施方式 中，可将冻干粉加至无菌无热原水或其他适用的液体载剂中重溶。精确的量 由选择的疗法决定，可根据经验值决定。
还提供了治疗方法，包括将治疗有效量的本申请所述的抗体施用给需要 其的受试者。
本申请中提供的抗体的治疗有效剂量依赖于本领域公知的多种因素，例 如体重、年龄、过往病史、现用治疗、对象的健康状况和交叉感染的潜力、 过敏、超敏和副作用，以及给药途径和肿瘤发展的程度。本领域熟练人员(例 如医生或兽医)可根据这些或其它条件或要求按比例降低或升高剂量。
在某些实施方式中，本发明提供的抗体可在治疗有效剂量约0.0lmg/kg 到约100mg/kg之间给药。在某些实施方式中，所述抗体以约50mg/kg或更 少的剂量给药，在某些实施方式中，给药剂量为10mg/kg或更少、5mg/kg 或更少、1mg/kg或更少、0.5mg/kg或更少或0.1mg/kg或更少。某特定剂量 可在多个间隔给药，例如每天一次、每天两次或更多、每月两次或更多、每 周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次或每两月或更多月一次。在某些实施方式中，给药剂量可随治疗进程变化。例如，在某些实施方式中，初 始给药剂量可比后续给药剂量高。在某些实施方式中，给药剂量在治疗进程 中根据给药对象的反应进行调整。
给药方案可通过调整达到最优反应(如治疗反应)。例如，可进行单剂 量给药或在一段时间分多个分隔的剂量给药。
本发明中公开的抗体可通过本领域公知的给药方式给药，例如注射给药 (如，皮下注射、腹腔注射、静脉注射，包括静脉滴注，肌肉注射或皮内注 射)或非注射给药(如，口服给药、鼻腔给药、舌下给药、直肠给药或外用 给药)。
在某些实施方式中，所述抗体可用于治疗与其分子机制相关的病症，包 括肿瘤和癌症，例选自B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、黑色素瘤、前列腺癌、 肾细胞癌、肉瘤、胶质瘤如高级别胶质瘤、母细胞瘤如神经母细胞瘤、骨肉 瘤、浆细胞瘤、组织细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌诸如小细胞肺癌和非小 细胞肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、大肠癌、造血系统癌、 睾丸癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、鳞状细胞癌、腺癌、AIDS相关淋巴瘤、 膀胱癌、脑癌、神经系统癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌、霍奇金氏淋巴瘤、 非霍奇金氏淋巴瘤或血液致瘤疾病。
使用方法
本申请进一步提供了使用所述抗体的方法。
在一些实施方式中，本申请提供了在个体中治疗与所述抗体机制相关的 状况或病症的方法，包括施用治疗有效量的本申请所述的抗体。
本发明公开的抗体可单独给药或与一种或多种其他治疗手段或物质联 合给药。例如，本发明公开的抗体可与化疗、放疗、癌症治疗手术(如肿瘤 切除术)、抗病毒药物、一种或多种抗呕吐药或其他化疗导致的并发症的疗 法、或任何其他用于癌症或病毒的治疗物质进行联用。在某些这样的实施方 式中，本发明公开的抗体与一种或多种治疗物质联用时，可与所述的一种或 多种治疗物质同时给药，在某些这样的实施方式中，所述的抗体可作为同一 个药物组合物的一部分同时给药。但是，与其他治疗物质"联用"的抗体不需 要同时给药或与该治疗物质在同一组合物中给药。本发明中"联用"的含义还 包括在另一个治疗物质之前或之后给药的抗体也被认为是与该治疗物质"联 用"，即使所述抗体与第二种物质通过不同给药方式给药。在可能的情况下， 与本发明公开的抗体联用的其他治疗物质可参照该其他治疗物质的产品说 明书的方法用药，或参照、外科医生的案头参考书2003(Physicians'Desk Reference，57th Ed；Medical Economics Company；ISBN：1563634457；第 57版(2002年11月))，或参照其他本领域公知的方法。
在某些实施方式中，所述治疗物质能够诱导或增强针对癌症的免疫反 应。例如，肿瘤疫苗可以用于诱导对某些肿瘤或癌症的免疫应答。细胞因子 治疗可以用于提高将肿瘤抗原向免疫系统的递呈。细胞因子治疗的示例包括 但不限于干扰素如干扰素α、β和γ，集落剌激因子如巨噬细胞CSF、粒细胞 巨噬细胞CSF和粒细胞CSF，白介素如1L-L、1L-1a、1L-2、1L 3、1L-4、 1L-5、1L-6、1L-7，1L-8、1L-9、1L-10、1L-ll和1L-12，肿瘤坏死因子如TNF-α和TNF-β。还可以使用灭活免疫抑制目标的试剂，如PD-1抗体、TGF-β 抑制剂、IL-10抑制剂和Fas配体抑制剂。另一组试剂包括激活针对肿瘤或 癌细胞的免疫响应的那些试剂，例如，提高T细胞激活(如T细胞共剌激信 号通路如CTLA-4、ICOS、OX40、4-1BB等通路)的那些，以及提高树突细 胞功能和抗原递呈的那些。
以下实施例旨在更好地说明本发明，且不应理解为限制本发明的范围。 所有下述的特定组合物、材料和方法，其整体或部分都在本发明的范围内。 这些特定的组合物、材料和方法不是为了限制本发明，而只是为说明在本发 明的范围内的特定的实施方式。本领域熟练技术人员可不添加创造性及不偏 离本发明范围而开发出等同的组合物、材料和方法。应理解，在对本发明的 方法作出的多种改动可以仍然包括在本发明范围内。发明人意在将这样的变 动包括在本发明的范围内。
实施例1：天然的人抗体噬菌体展示文库的构建和筛选
AXL抗原制备：人重组AXL蛋白购自novoprotein，货号：C02B。
AXL全人源抗体筛选委托三优生物医药(上海)有限公司委托完成。共进 行四轮筛选，选择第四轮所得的克隆进行ELISA的阳性克隆ELISA筛选。 最终，在2304个克隆中共筛选出71个能够与hAXL-ECD蛋白结合的阳性 克隆。经测序分析、ELISA结合后，最终选取了4个克隆的序列构建全长抗 体以进行进一步的实验。具体实施方法如下：
1.1阳性克隆测序与分析
在完成初筛工作后，对71个能够与hAXL-ECD蛋白结合的阳性克隆进 行编号，吸取2μL菌液到2mL的2YT培养基中，37℃，220rpm培养过夜， 提取质粒进行二代测序。测序结果通过SeqMan将原始的AB1文件整合、比 对、去掉非抗体基因序列，生成抗体基因整合版的fasta文件。随后将DNA 序列通过MEGA6翻译为氨基酸序列，并通过氨基酸序列找出含有终止子、 非常规序列等，导出氨基酸序列的fasta文件，得到阳性抗体克隆的抗体轻 链与重链序列，经过分析比对，序列为全新的抗体序列。
1.2ELISA筛选克隆上清与抗原hAXL-ECD结合的亲和力
首先挑取第三轮筛选的克隆于含有300μL 2-YT培养基的96孔深孔板 中，37℃培养过夜，上清即含有表达的Fab，取上清，梯度稀释后加入到包 被2μg/mL hAXL-ECD的ELISA板中，然后用HRP标记的山羊抗人Fab作 为第二抗体(山羊抗人-HRP,ThermoFisher,31482,1:6000稀释)进行检测， 信号值越高，表明亲和力越强。结果如图1A-G所示，图1A-图1G分别显 示了本申请的71个克隆能够与hAXL-ECD特异性结合；其中5号、7号、 11号和14号克隆亲和力最高，选择5号、7号、11号和14号克隆进行实验， 并命名为Hu001-5、Hu001-7、Hu001-11和Hu001-14。在ELISA测定法中， 4个抗体(Hu001-5抗体、Hu001-7抗体、Hu001-11抗体、Hu001-14抗体)的 Fab均表现出了较好的亲和活性。
经测序获得其分泌抗体对应的重链可变区cDNA序列和轻链可变区 cDNA序列。对应的抗体CDR序列如下表1所示。
表1本发明的抗体及其CDR序列
Figure BDA0003117276170000301
Figure BDA0003117276170000311
实施例2全长抗体的构建、表达和纯化
在本实施例中，将实施例1中获得的2个对结合hAXL-ECD阻断活性 较好的Fab抗体构建为人IgG1亚型，其中轻链均为κ型，抗体类型为全人 抗体。
2.1质粒构建
从筛选获得的含有抗体的菌株中，PCR扩增获取抗体轻、重链可变区片 段，通过同源重组方法，分别构建至含有轻、重链恒定区片段的真核表达载 体质粒AbVec-hIgKappa或者AbVec-hIgG1 WT(图2)，组成完整的抗体轻、 重链全长基因，编码SEQ ID NO1-8所示的抗体重链和轻链氨基酸序列。
将构建好的含抗体轻重链全长基因的载体分别转化到大肠杆菌TOP10 (唯地，DL1010S)中37℃过夜培养，利用无内毒素质粒提取试剂盒 (OMEGA，D6950-01)提取抗体轻重链质粒供真核表达使用。
2.2抗体的表达纯化
通过Expi293瞬转表达系统(Thermo Fisher公司，货号A1435101)表达候 选抗体Hu001-5、Hu001-11、Hu001-7、Hu001-14及对照抗体CCT301-38(参 见US10066238)，具体方法如下：在250mL培养摇瓶中培养Expi293细胞 转染当天，确认细胞密度为7×106个活细胞/mL左右，细胞存活率>98％，采 用37℃预温的Expi293表达培养基将细胞调整到终浓度为6×106个细胞/mL (终体积75mL)。取4℃预冷的1mL Expi293TM表达培养基稀释目的质粒(50 μg)，同时，用1mL Expi293TM表达培养基稀释转染试剂75μL FectoPro (Polyplus公司,货号PT-116-001)，再将两者1mL等体积混合并轻轻混匀 制备成Expi293TM表达培养基/质粒DNA混合液，室温孵育15min，缓慢加 入到准备好的细胞悬液中，置于细胞培养摇床中，在37℃，5％CO2条件下 培养。在转染后24h，添加FectoPRO booster至培养体系内(终浓度为0.6μL/mL)，继续置于37℃摇床和5％CO2条件下培养。在转染后的第5天， 缓慢添加相同体积的Expi293TM表达培养基至培养体系内，在转染10天后 收集细胞培养上清于4000g离心10分钟后，用Protein G琼脂糖柱子(GE 公司,货号28903134)进行亲和纯化，用100mM乙酸钠(pH3.0)洗脱目的蛋 白，用1M Tris-HCl中和后，通过30kD的超滤浓缩管(Millipore公司，货号 UFC901096)将所得蛋白置换至PBS缓冲液中。
四个候选抗体Hu001-5、Hu001-7、Hu001-11、Hu001-14及对照抗体 CCT301-38的相对分子量150kD，纯度均大于90％。用超微量分光光度计(Thermo Fisher公司，型号NanoDrop One C)测定纯化抗体的蛋白浓度，将经 测定的A280数值除以抗体理论消光系数后的数值作为抗体浓度值，分装并 保存于-80℃。
实施例3候选抗体与hAXL-ECD特异性结合的亲和力测试
候选抗体与hAXL-ECD特异性结合的亲和力采用流式检测。分别在酸 性(PH＝6.0)和中性(PH＝7.4)两种条件下检测Hu001-5、Hu001-7、Hu001-11 和Hu001-14共计4个克隆。
在细胞培养瓶中培养CHO-AXL细胞(上海鑫湾生物科技有限公司构建) 培养基为DMEM/F-12培养基(10％FBS,1％青霉素/链霉素)，于37℃，5％CO2培养箱中培养48小时后弃上清，采用0.25％胰蛋白酶消化收集细胞后将细胞 于800g条件下离心3分钟。弃上清，用2％FBS洗涤缓冲液重悬细胞 (106/mL)。调节缓冲液pH并将细胞分为pH6.0与pH7.4组，每组分别加入 一抗(Hu001-5抗体、Hu001-7抗体、Hu001-11抗体、Hu001-14抗体和阳性 对照抗体CCT301-38)，室温下孵育15分钟。弃上清，再加入荧光标记二抗 IgG-Fc-PE(BioLegend公司，货号号409304)，继续在室温下避光孵育15 分钟后，上机检测。若信号值越高，则表明亲和力越强。
结果如图3所示，其为流式数据显示本发明的抗AXL抗体Hu001-5、 Hu001-7、Hu001-11和Hu001-14的亲和力的曲线图；其中图3A表示在不同 pH下，阳性对照CCT301-38抗体的亲和力随浓度变化的示意图，图3B-3E 表示表示在不同pH下，抗AXL抗体Hu001-5、Hu001-7、Hu001-11和 Hu001-14的亲和力随浓度变化的示意图，可以显而易见的发现，本发明抗 体相对于阳性对照有更高的亲和力，且在酸性条件下较中性条件有更高的结 合能力。从图中可以得知，Hu001-5抗体实验组与Hu001-11抗体实验组的 平均荧光强度在酸性条件下和中性条件下均大约为阳性对照组的4倍。 Hu001-5抗体实验组和Hu001-11抗体实验组在酸性条件下的平均荧光强度 均高于中性条件下的强度值，大约为后者的1.5倍。由此可得，Hu001-5和 Hu001-11相比于阳性对照对AXL有更高的亲和力，且在酸性条件下较中性 条件有更高的结合能力。
实施例4酸敏感抗体Hu001-11制备的CART细胞体外活性测试
Hu001-11和阳性对照的CART细胞嵌合抗原受体结构如图4A。
Hu001-11-CART细胞和阳性对照CCT301-38-CART细胞均由上海鑫湾 生物有限公司制备。采用流式细胞术测定其CAR表达阳性率与平均荧光强 度。如图4B显示，对照抗体CCT301-38阳性率37.4％，平均荧光强度(MFI) 为7350。Hu001-11-CAR细胞阳性率46.9％，平均荧光强度(MFI)为19571， Hu001-11-CART细胞的体外转导效率远高于对照CART细胞。
在96孔板中加入CHO-AXL细胞为靶细胞(104细胞/孔)，所制备的 Hu001-11-CART细胞为效应细胞，靶细胞数目为效靶比为2:1。对照效应细 胞包括未经转导的T细胞(阴性对照)以及CCT301-38-CART细胞(阳性 对照)。细胞培养分为pH6.8组与pH7.4组。在37℃，5％CO2培养箱中共培 养24小时后，采用ELISA方法检测IL-2，IFN-γ的含量，来确定CART细胞体外活化的程度。
采用Elisa检测培养细胞上清中IL-2(Abclonal公司，货号RK00002) 和IFN-γ(Abclonal公司，货号RK00015)的蛋白浓度。结果如图4C所示， 在CHO-AXL体外共培养的状态下，Hu001-11-CART细胞分泌IL-2和IFN-γ 水平高于阳性对照CCT301-38-CART细胞，且在酸性条件分泌水平更高。提 示Hu001-11-CART细胞在体外酸性条件下被更强活化，具有良好的酸性环 境趋化性。
实施例5Hu001-11抗体介导的体外胶质瘤细胞杀伤实验
本实验中靶细胞为人胶质瘤细胞U251细胞。效应细胞为CD16-CART 细胞(CD16-T细胞，上海鑫湾科技有限公司制备)。在37℃，5％CO2培养 箱中以DMEM培养基(10％FBS,1％青霉素/链霉素)培养U251细胞系，以 105/mL的细胞浓度将细胞置于8孔培养小室中。12小时后分别加入Hu001-11 抗体和CD16-T细胞，效靶比均为2:1。另外分别加入未经转导的T细胞为 阴性对照，CCT301-38抗体和CD16-T细胞为阳性对照。使用xCELLigence RTCA S16仪实时检测细胞指数(cell index)，它与活细胞数目正相关。该数 值越高则表明杀伤活性越低。反之则表明杀伤活性越高。
结果如图5所示，Hu001-11和CD16-T联合组在12小时出现明显的对 U251细胞杀伤，20小时几乎完全杀伤靶细胞。而阳性抗体对照组则在24 小时才显示完全杀伤效果。说明Hu001-11介导了对人胶质瘤U251细胞更好 的杀伤活性。
实施例6本发明的抗体介导的体外广谱抗肿瘤活性实验
本发明的抗AXL抗体Hu001-5、Hu001-7、Hu001-11和Hu001-14介导 CD16-T细胞体外对其他实体瘤细胞(人卵巢腺瘤细胞SK-OV3和人肺癌细 胞NCI-H292肿瘤，均携带编码荧光素酶的报告基因)杀伤实验也进行了验 证。
所用试剂与仪器如无特别说明均购于Promega公司。具体如下：将肿 瘤细胞铺于96孔板中(104/孔)，在37℃，5％CO2培养24小时后除去培养 基加入本发明的抗AXL抗体Hu001-5、Hu001-7、Hu001-11和Hu001-14并 将细胞分为十组：即阳性对照抗体CCT301-38组、Hu001-5抗体组、Hu001-7 抗体组、Hu001-11抗体组、Hu001-14抗体组、Hu001-5抗体和CD16-T细胞 联合组、Hu001-7抗体和CD16-T细胞联合组、Hu001-11抗体和CD16-T细 胞联合组、Hu001-14抗体和CD16-T细胞联合组、CCT301-38和CD16-T细 胞联合组；CD16-T细胞与靶细胞的比例为2：1。继续在37℃培养24小时 后除去上清，每孔加入50μL 1x细胞裂解液(货号E1531)室温震荡孵育 30分钟后，每孔加入30μL荧光素酶分析底物(货号E151A)显色30秒并 上机检测荧光值(
Figure BDA0003117276170000351
Navigator Microplate Luminometer)。
结果如图6所示，针对这两种肿瘤细胞系，使用本发明的抗AXL抗体 Hu001-5、Hu001-7、Hu001-11和Hu001-14在体外介导杀伤的效率均有阳性 对照抗体CCT301-38的1.5倍以上，有明显的杀伤提升作用，说明本发明的 抗AXL抗体在体外可介导较为广谱的抗肿瘤活性。
图7示出为抗体可变区的排布方式。
尽管已经对本发明的具体实施方式进行了详细说明和描述，但应当认 识到，本发明不受所述具体实施方式的限制。在不脱离本发明主旨和范围 的情况下，可以对本发明做出各种改进、修饰和变化，而这些改进、修饰 和变化均在本发明的范围之内。
序列表
<110> 上海鑫湾生物科技有限公司
<120> 靶向AXL蛋白的抗体及其抗原结合片段、其制备方法和应用
<130> DIC21110022
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gln Val Leu Ala Pro Val Gly Gly Gly Leu Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala
115 120
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Ser Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Ile Val Ser Arg Val Arg Gly Glu Leu Val Gly Gly Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Phe Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ala Ala
130
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asn Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Gly Ser Ser Gly Pro Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala
115 120
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg
100 105
<210> 7
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala Ala
115
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Ser Tyr Gly Met His
1 5
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 11
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Asp Gln Val Leu Ala Pro Val Gly Gly Gly Leu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Ala Ala Ser Ser Leu Ala Ser
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg Thr
1 5
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 16
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly Arg
<210> 17
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Asp Ile Val Ser Arg Val Arg Gly Glu Leu Val Gly Gly Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
Phe Gly Leu Asp Val
20
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg Thr
1 5
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg Thr
1 5
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Ser Tyr Gly Met His
1 5
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 23
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Tyr Gly Ser Ser Gly Pro Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg Thr
1 5
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Ser Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 29
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Asp Trp Tyr Phe Asp Val
1 5
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Phe
1 5

Claims (25)

1.能够特异性结合AXL蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)包含下述3个互补决定区的重链可变区：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:9，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:10，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:11，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
和/或
(b)包含下述3个互补决定区的轻链可变区：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:12，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:13，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:14，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
优选地，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ ID NO:9所示的VH CDR1、如SEQID NO:10所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:11所示的VH CDR3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:12所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:13所示的VL CDR2、如SEQ IDNO:14所示的VL CDR3。
2.能够特异性结合AXL蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)包含下述3个互补决定区的重链可变区：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:15，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:16，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:17，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
和/或
(b)包含下述3个互补决定区的轻链可变区：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:18，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:19，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:20，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
优选地，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ ID NO:15所示的VH CDR1、如SEQID NO:16所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:17所示的VH CDR3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:18所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:19所示的VL CDR2、如SEQ IDNO:20所示的VL CDR3。
3.能够特异性结合AXL蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)包含下述3个互补决定区的重链可变区：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:21，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:22，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:23，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
和/或
(b)包含下述3个互补决定区的轻链可变区：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:24，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:25，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:26，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
优选地，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ ID NO:21所示的VH CDR1、如SEQID NO:22所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:23所示的VH CDR3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:24所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:25所示的VL CDR2、如SEQ IDNO:26所示的VL CDR3。
4.能够特异性结合AXL蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)包含下述3个互补决定区的重链可变区：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:27，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:28，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:29，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
和/或
(b)包含下述3个互补决定区的轻链可变区：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:30，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:31，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:32，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
优选地，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ ID NO:27所示的VH CDR1、如SEQID NO:28所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:29所示的VH CDR3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:30所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:31所示的VL CDR2、如SEQ IDNO:32所示的VL CDR3。
5.能够特异性结合AXL蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，
所述重链可变区包含SEQ ID NO:1、3、5和7中任一项所示的重链可变区中含有的3个CDR；并且，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:2、4、6和8中任一项所示的轻链可变区中含有的3个CDR；
优选地，所述重链可变区中含有的3个CDR，和/或所述轻链可变区中含有的3个CDR，由Kabat、Chothia或IMGT编号系统定义。
6.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:1所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO:1所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；或
(iii)与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
和/或，
(b)轻链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：
(iv)SEQ ID NO:2所示的序列；
(v)与SEQ ID NO:2所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；或
(vi)与SEQ ID NO:2所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
优选地，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:1所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:2所示的序列的VL。
7.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:3所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO:3所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；或
(iii)与SEQ ID NO:3所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
和/或，
(b)轻链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：
(iv)SEQ ID NO:4所示的序列；
(v)与SEQ ID NO:4所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；或
(vi)与SEQ ID NO:4所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
优选地，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:3所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:4所示的序列的VL。
8.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:5所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO:5所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；或
(iii)与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
和/或，
(b)轻链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：
(iv)SEQ ID NO:6所示的序列；
(v)与SEQ ID NO:6所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；或
(vi)与SEQ ID NO:6所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
优选地，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:5所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:6所示的序列的VL。
9.权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:7所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO:7所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；或
(iii)与SEQ ID NO:7所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
和/或，
(b)轻链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：
(iv)SEQ ID NO:8所示的序列；
(v)与SEQ ID NO:8所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；或
(vi)与SEQ ID NO:8所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
优选地，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:7所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:8所示的序列的VL。
10.权利要求1-9任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包含：
(a)人免疫球蛋白的重链恒定区或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加；和
(b)人免疫球蛋白的轻链恒定区或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换；
优选地，所述重链恒定区是IgG重链恒定区，更优选为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区，进一步优选地，其是人IgG1或人IgG4重链恒定区；
优选地，所述轻链恒定区是κ轻链恒定区。
11.权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体和单域抗体；和/或，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体；更优选地，所述抗体为完全人抗体。
12.一种嵌合抗原受体T细胞，其包含如权利要求1-11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述抗体或抗原结合片段中的重链可变区和轻链可变区为串联组合或并联组合。
13.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-11任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。
14.一种载体，其包含权利要求13所述的分离的核酸分子；
优选地，所述载体为克隆载体或表达载体；
更优选地，所述载体为病毒；
进一步优选地，所述病毒载体的病毒骨架来源于经修饰或经改造的痘苗病毒天坛株、痘苗病毒纽约株、痘苗病毒哥本哈根株、痘苗病毒金丝雀株、痘苗病毒安卡拉株、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、水痘-带状疱疹病毒载体、呼吸道合胞病毒、生里基森林病毒、EB病毒、巨细胞病毒、人疱疹病毒6型、天花病毒、传染性软疣病毒、羊口疮病毒、呼肠孤病毒、轮状病毒、肠道病毒、塞内卡病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、鼻病毒、甲型肝炎病毒、口蹄疫病毒、披膜病毒、甲病毒、东部马脑炎病毒、辛德毕斯病毒、风疹病毒、冠状病毒、黄病毒、丙型肝炎病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、墨累谷热病毒、黄热病毒、西尼罗河病毒、寨卡病毒、登革病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、沙粒病毒、拉沙热病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、皮钦德病毒、胡宁病毒、马丘波病毒、汉坦病毒、裂谷热病毒、副粘病毒、人副流感病毒、腮腺炎病毒、猴病毒5、麻疹病毒、水疱性口炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、正粘病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、丁型肝炎病毒、猴免疫缺陷病毒、人免疫缺陷病毒1型和人免疫缺陷病毒2型、劳氏肉瘤病毒、嗜人T细胞白血病病毒1型、猴泡沫病毒、乙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人乳头瘤病毒或多瘤病毒；
更优选地为，所述载体为克隆载体AbVec-hIgKappa或者克隆载体AbVec-hIgG1。
15.宿主细胞，其包含权利要求13所述的分离的核酸分子或权利要求14所述的载体；
优选地，所述宿主细胞是原核的或真核的；更优选地，所述宿主细胞选自大肠杆菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或抗原结合片段、多特异性抗体的其它细胞；进一步优选地，所述宿主细胞是哺乳动物细胞；更进一步优选地，所述宿主细胞为人、鼠、羊、马、狗或猫的细胞；最优选地，所述宿主细胞是293细胞或CHO细胞。
16.制备权利要求1-11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在允许权利要求1-11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养权利要求15所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
17.双特异性或多特异性分子，其包含权利要求1-11任一项所述的抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述双特异性或多特异性分子特异性结合AXL蛋白，并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标；
优选地，所述双特异性或多特异性分子还包含至少一种具有针对第二靶标的第二结合特异性的分子，优选第二抗体；
优选地，所述双特异性或多特异性分子还包含其他特异性结合AXL蛋白表位的抗体或抗原结合片段。
18.免疫缀合物，其包含权利要求1-11任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及连接于所述抗体或其抗原结合片段的治疗剂；
优选地，所述治疗剂选自细胞毒剂；
优选地，所述治疗剂选自烷化剂、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、放射性核素剂，及其任意组合；
优选地，所述免疫缀合物是抗体-药物偶联物。
19.药物组合物，其含有权利要求1-11任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求17所述的双特异性或多特异性分子或者权利要求18所述的免疫缀合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂；
优选地，药物组合物还包含另外的药学活性剂；
优选地，所述另外的药学活性剂是具有抗肿瘤活性的药物；更优选地所述药学活性剂为烷化剂、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、放射性核素剂、放射增敏剂、抗血管生成剂、细胞因子、分子靶向药物、免疫检查点抑制剂或溶瘤病毒；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性分子或免疫缀合物与所述另外的药学活性剂作为分离的组分或作为同一组合物的组分提供。
20.试剂盒，其含有权利要求1-11任一项所述的抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记、放射性核素、荧光染料、发光物质或生物素；更优选地，所述可检测的标记为酶，进一步优选为辣根过氧化物酶；更优选地，所述发光物质为化学发光物质；
优选地，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别权利要求1-11任一项所述的抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述第二抗体还包括可检测的标记、放射性核素、荧光染料、发光物质或生物素；更优选地，所述可检测的标记为酶，进一步优选为辣根过氧化物酶；更优选地，所述发光物质为化学发光物质。
21.嵌合抗原受体，其包含权利要求1-11任一项所述的抗体或其抗原结合片段的抗原结合结构域；
优选地，所述抗原结合结构域包含权利要求1-11任一项所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区；
优选地，所述抗原结合结构域是scFv；
优选地，所述抗原结合受体包含权利要求1-11任一项所述的抗体的抗原结合片段；
优选地，所述抗原结合受体由免疫效应细胞)所表达；
更优选地，所述免疫效应细胞为T细胞。
22.分离的核酸分子，其编码权利要求21所述的嵌合抗原受体。
23.载体，其包含权利要求22所述的分离的核酸分子；优选地，其用于制备嵌合抗原受体T细胞。
24.宿主细胞，其包含权利要求22所述的分离的核酸分子或权利要求23所述的载体；
优选地，所述宿主细胞是免疫效应细胞；更优选地，所述免疫效应细胞为T细胞或NK细胞；
优选地，所述宿主细胞是嵌合抗原受体T细胞。
25.权利要求1-11任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求17所述的双特异性或多特异性分子，或权利要求18所述的免疫缀合物，或权利要求19所述的药物组合物，或权利要求21所述的嵌合抗原受体，或权利要求24所述的宿主细胞，在制备药物中的用途，所述药物用于在受试者中预防和/治疗肿瘤；
优选地，所述受试者为人；
优选地，药物还包含另外的药学活性剂；
优选地，所述另外的药学活性剂是具有抗肿瘤活性的药物；更优选地所述药学活性剂为烷化剂、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、放射性核素剂、放射增敏剂、抗血管生成剂、细胞因子、分子靶向药物、免疫检查点抑制剂或溶瘤病毒；
优选地，所述肿瘤选自B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、黑色素瘤、前列腺癌、肾细胞癌、肉瘤、胶质瘤优选高级别胶质瘤、母细胞瘤优选神经母细胞瘤、骨肉瘤、浆细胞瘤、组织细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌优选小细胞肺癌和非小细胞肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、大肠癌、造血系统癌、睾丸癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、鳞状细胞癌、腺癌、AIDS相关淋巴瘤、膀胱癌、脑癌、神经系统癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或血液致瘤疾病；
优选地，所述受试者为哺乳动物，更优选为人。
CN202110665666.9A 2021-06-16 2021-06-16 靶向axl蛋白的抗体及其抗原结合片段、其制备方法和应用 Active CN113444180B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110665666.9A CN113444180B (zh) 2021-06-16 2021-06-16 靶向axl蛋白的抗体及其抗原结合片段、其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110665666.9A CN113444180B (zh) 2021-06-16 2021-06-16 靶向axl蛋白的抗体及其抗原结合片段、其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113444180A true CN113444180A (zh) 2021-09-28
CN113444180B CN113444180B (zh) 2023-03-31

Family

ID=77811530

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110665666.9A Active CN113444180B (zh) 2021-06-16 2021-06-16 靶向axl蛋白的抗体及其抗原结合片段、其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113444180B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114591431A (zh) * 2022-05-11 2022-06-07 迈威(上海)生物科技股份有限公司 抗人gas6抗体或其抗原结合片段及其应用
CN116102658A (zh) * 2021-11-09 2023-05-12 四川大学华西医院 基于gas6构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用
CN116333118A (zh) * 2021-12-16 2023-06-27 徕特康(苏州)生物制药有限公司 抗表皮生长因子受体抗体及其制备方法和用途

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2589609A1 (en) * 2011-11-03 2013-05-08 Pierre Fabre Medicament Antigen binding protein and its use as addressing product for the treatment of cancer
CN106573980A (zh) * 2014-06-18 2017-04-19 卑尔根生物股份公司 抗axl抗体
WO2019218944A2 (zh) * 2018-05-15 2019-11-21 复旦大学 靶向axl的抗体及抗体-药物偶联物及其制备方法和用途
CN110540592A (zh) * 2018-05-29 2019-12-06 杭州尚健生物技术有限公司 结合axl蛋白的抗体及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2589609A1 (en) * 2011-11-03 2013-05-08 Pierre Fabre Medicament Antigen binding protein and its use as addressing product for the treatment of cancer
CN106573980A (zh) * 2014-06-18 2017-04-19 卑尔根生物股份公司 抗axl抗体
WO2019218944A2 (zh) * 2018-05-15 2019-11-21 复旦大学 靶向axl的抗体及抗体-药物偶联物及其制备方法和用途
CN110483639A (zh) * 2018-05-15 2019-11-22 复旦大学 靶向axl的抗体及抗体-药物偶联物及其制备方法和用途
CN110770256A (zh) * 2018-05-15 2020-02-07 复旦大学 靶向axl的抗体及抗体-药物偶联物及其制备方法和用途
CN110540592A (zh) * 2018-05-29 2019-12-06 杭州尚健生物技术有限公司 结合axl蛋白的抗体及其应用
CN112204051A (zh) * 2018-05-29 2021-01-08 杭州尚健生物技术有限公司 结合axl蛋白的抗体及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHENJING ZHU: "AXL receptor tyrosine kinase as a promising anti-cancer approach: functions, molecular mechanisms and clinical applications", 《MOL CANCER》 *
查俐 等: "受体酪氨酸激酶AXL与肿瘤免疫治疗", 《中国肿瘤生物治疗杂志》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116102658A (zh) * 2021-11-09 2023-05-12 四川大学华西医院 基于gas6构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用
CN116333118A (zh) * 2021-12-16 2023-06-27 徕特康(苏州)生物制药有限公司 抗表皮生长因子受体抗体及其制备方法和用途
CN116333118B (zh) * 2021-12-16 2024-04-19 徕特康(苏州)生物制药有限公司 抗表皮生长因子受体抗体及其制备方法和用途
CN114591431A (zh) * 2022-05-11 2022-06-07 迈威(上海)生物科技股份有限公司 抗人gas6抗体或其抗原结合片段及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113444180B (zh) 2023-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114292336B (zh) 结合dll3和cd3的双特异性抗体构建体
CN113015749B (zh) 靶向cd3的抗体、双特异性抗体及其用途
CN113444180B (zh) 靶向axl蛋白的抗体及其抗原结合片段、其制备方法和应用
US20180162944A1 (en) Novel anti-pd-l1 antibodies
EP3875484A1 (en) Cll1-targeting antibody and application thereof
CN111630067B (zh) 针对muc17和cd3的双特异性抗体构建体
CN112714768A (zh) 新型抗cd39抗体
CN106243225B (zh) 新型抗-pd-l1抗体
TWI844684B (zh) 一種抗ceacam5的單殖株抗體及其製備方法和用途
CN111315780A (zh) 双特异性抗体产品的连续制造工艺
KR20220137723A (ko) 항-cd3 및 항-cd123 이중 특이성 항체 및 이의 용도
WO2022261846A1 (zh) 靶向axl蛋白的抗体及其抗原结合片段、其制备方法和应用
TW202136292A (zh) 抗ＰＤ—Ｌ１和ＴＧＦβ的雙功能抗體
CN114981301A (zh) Pd1和vegfr2双结合剂
WO2020048454A1 (zh) 融合蛋白及其在制备用于治疗肿瘤和/或病毒感染的药物中的应用
CN116589584A (zh) 靶向人Nectin4蛋白的抗体或其片段和应用
WO2022116079A1 (zh) 一种抗ceacam5的人源化抗体及其制备方法和用途
CN116323671A (zh) 具有增加的选择性的多靶向性双特异性抗原结合分子
CN112789058A (zh) 双特异性抗体构建体的下游加工
WO2021197393A1 (zh) 一种抗人cd47抗体及其抗原结合片段、制备方法和应用
CN114634577A (zh) 融合蛋白及其制备用于治疗肿瘤和病毒感染的药物的应用
WO2024173565A2 (en) Human synthetic antibodies targeting human epidermal growth factor receptor 2 (her2) mutants
CN117279947A (zh) 用于在增殖性疾病中使用的靶向cd20和cd22的抗原结合分子
CN116635421A (zh) 与cd3结合的多肽构建体
CN117915950A (zh) 一种多特异性抗体及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right

Denomination of invention: Antibodies targeting AXL protein and their antigen binding fragments, preparation methods and applications thereof

Effective date of registration: 20231212

Granted publication date: 20230331

Pledgee: Shanghai Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pudong branch

Pledgor: SHANGHAI SINOBAY BIO-TECH Co.,Ltd.

Registration number: Y2023310000840