CN116987152B - 一种结合沙贝冠状病毒s蛋白rbd结构域的环肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种结合沙贝冠状病毒S蛋白RBD结构域的环肽及其应用。本发明提供了一种结合沙贝冠状病毒S蛋白RBD结构域的环肽，其结构式如式I所示。本发明对于开发广谱抗新冠病毒药物具有重要意义。式I。

Description

一种结合沙贝冠状病毒S蛋白RBD结构域的环肽及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种结合沙贝冠状病毒S蛋白RBD结构域的环肽及其应用。
背景技术
新型冠状病毒的大流行对全球经济造成了破坏，对人类健康及社会发展造成了严重影响。研发和推广针对新冠病毒的药物和疫苗是应对SARS-CoV-2的关键措施。WHO已经公布了五种值得关注的新型冠状病毒突变株：Alpha、Beta、Gamma、Delta突变株，以及当前正在流行并占主导地位的Omicron突变株。并且，Omicron已经产生了多种亚谱系：BA.2、BA.2.12.1、BA.2.75、BA.3、BA.4、BA.5等等，这些亚谱系也在不断突变继续产生新的子谱系。发生在SARS-CoV-2 S蛋白，尤其是RBD区域的氨基酸突变是导致新冠病毒免疫逃逸的主要原因，多种已上市的疫苗及针对S蛋白的中和抗体对新出现的突变株逐渐失去保护作用。已经获得紧急使用权限的多种中和抗体，包括Sotrovimab、Bebtelovimab、Tixagevimab和Cilgavimab等由于无法应对Omicron突变株都被撤回紧急使用授权。为了应对不断涌现的变异株，寻找广谱抗新冠不同变异株的治疗靶点，开发广谱抗冠状病毒药物将成为遏制新型冠状病毒大流行的关键。
环肽药物具有结构多样性、生物活性强、目标特异性、生物稳定性、抗药性低和可定制性强等优势，因此，利用环肽独特的结构特征发现和开发药物已成为近年来研究的一个重要方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种结合沙贝冠状病毒S蛋白RBD结构域的环肽及其应用。
第一方面，本发明要求保护一种结合沙贝冠状病毒S蛋白RBD结构域的环肽，命名为6L3-3P11R环肽。
本发明所要求保护的6L3-3P11R环肽结构式如下：
。
第二方面，本发明所要求保护前文第一方面中所述的环肽在制备能够抑制沙贝冠状病毒的产品中的应用。
第三方面，本发明所要求保护前文第一方面中所述的环肽在制备用于治疗和/或预防由于沙贝冠状病毒感染所致疾病的产品中的应用。
第四方面，本发明所要求保护前文第一方面中所述的环肽在制备用于改善由于沙贝冠状病毒感染所致症状的产品中的应用。
第五方面，本发明所要求保护前文第一方面中所述的环肽在制备用于诊断或辅助诊断由于沙贝冠状病毒感染所致疾病的产品中的应用。
第六方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的环肽在如下任一中的应用：
（A1）制备能够中和沙贝冠状病毒的产品；
（A2）制备能够结合沙贝冠状病毒S蛋白RBD结构域的产品；
（A3）制备用于检测沙贝冠状病毒的产品。
在上述第二至六方面中，所述沙贝冠状病毒可为SARS-CoV-2或蝙蝠冠状病毒或穿山甲冠状病毒。
进一步地，所述蝙蝠冠状病毒可为蝙蝠冠状病毒RaTG13。所述穿山甲冠状病毒可为穿山甲冠状病毒GD/1/2019。所述SARS-CoV-2可为SARS-CoV-2原型毒株（SARS-CoV-2-PT）或SARS-CoV-2变异毒株。
更进一步地，所述SARS-CoV-2变异毒株可为Alpha（B.1.1.7）株、Beta（B.1.351）株、Gamma（P.1）株、Delta（B.1.617.2）株、Omicron（BA.1）株、Omicron（BA.2）株、Omicron（BA.2.12.1）株、Omicron（BA.2.75）株、Omicron（BA.4/5）株、Omicron（BF.7）株、Omicron（BA.4.6）株、Omicron（BQ.1）株、Omicron（BQ.1.1）株、Omicron（XBB）株、Omicron（CH.1.1）株、Omicron（XBB.1.5）株或Omicron（XBB.1.6）。
第七方面，本发明要求保护一种能够抑制沙贝冠状病毒的药物组合物。
本发明要求保护的能够抑制沙贝冠状病毒的药物组合物，其活性成分为前文第一方面中所述的环肽。
第八方面，本发明要求保护一种用于检测沙贝冠状病毒的检测试剂。
本发明要求保护的用于检测沙贝冠状病毒的检测试剂，其活性成分为前文第一方面中所述的环肽。
在上述第七和八方面中，所述沙贝冠状病毒可为SARS-CoV-2或蝙蝠冠状病毒或穿山甲冠状病毒。
进一步地，所述蝙蝠冠状病毒可为蝙蝠冠状病毒RaTG13。所述穿山甲冠状病毒可为穿山甲冠状病毒GD/1/2019。所述SARS-CoV-2可为SARS-CoV-2原型毒株（SARS-CoV-2-PT）或SARS-CoV-2变异毒株。
更进一步地，所述SARS-CoV-2变异毒株可为Alpha（B.1.1.7）株、Beta（B.1.351）株、Gamma（P.1）株、Delta（B.1.617.2）株、Omicron（BA.1）株、Omicron（BA.2）株、Omicron（BA.2.12.1）株、Omicron（BA.2.75）株、Omicron（BA.4/5）株、Omicron（BF.7）株、Omicron（BA.4.6）株、Omicron（BQ.1）株、Omicron（BQ.1.1）株、Omicron（XBB）株、Omicron（CH.1.1）株、Omicron（XBB.1.5）株或Omicron（XBB.1.6）。
实验证明，本发明所提供的6L3-3P11K环肽对沙贝冠状病毒，主要包括SARS-CoV-2的PT，Alpha、Beta、Gamma、Delta、BA.1、BA.2.12.1、BA.2.75、BA.4/5、BA.4.6、BF.7、BQ.1、BQ.1.1、XBB、XBB.1.5、CH.1.1、XBB.1.16病毒株的假病毒均较好的中和作用，EC50值在4.3nM-6.9μM；并且与SARS-CoV-2各个变异株RBD有很强的亲和力；且对Vero细胞均没有明显的细胞毒性。
本发明对于开发广谱抗沙贝冠状病毒，特别是新冠病毒药物具有重要意义。
附图说明
图1为6L3环肽以及改造所得的6L3-3P环肽、6L3-11K环肽、6L3-2Y3P环肽、6L3-2V3P环肽的色谱和质谱图。
图2为6L3-3P6I7Q环肽、6L3-3P11K环肽、6L3-3P11R环肽和6L3-3P11Q环肽的色谱和质谱图。
图3为不同环肽分子对BA.2假病毒的中和作用。
图4为6L3-3P环肽、6L3-3P11K、6L3-3P11R环肽对不同新冠假病毒的中和作用。
图5为6L3-3P环肽和6L3-3P11K环肽对各沙贝冠状病毒毒株RBD的结合能力。
图6为6L3-3P环肽和6L3-3P11K环肽的细胞毒性。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明利用mRNA展示技术筛选获得了6L3环肽（方法可参照Norman A, Franck C,Christie M, Hawkins PME, Patel K, Ashhurst AS, Aggarwal A, Low JKK, SiddiqueeR, Ashley CL, Steain M, Triccas JA, Turville S, Mackay JP, Passioura T, PayneRJ. Discovery of Cyclic Peptide Ligands to the SARS-CoV-2 Spike Protein UsingmRNA Display. ACS Cent Sci. 2021 Jun 23;7(6):1001-1008. doi: 10.1021/acscentsci.0c01708. Epub 2021 May 27. PMID: 34230894; PMCID: PMC8189037.），6L3环肽对SARS-CoV-2原型毒株和各种突变株具有一定的中和活性，但是效果不是很理想。为了获得对SARS-CoV-2原型毒株和各种突变株中和活性更强的环肽，本发明对6L3环肽进行了八种改造，分别为6L3-3P环肽、6L3-11K环肽、6L3-2Y3P环肽、6L3-2V3P环肽、6L3-3P6I7Q环肽、6L3-3P11K环肽、6L3-3P11R环肽和6L3-3P11Q环肽。各环肽均由安徽省国平药业有限公司合成并纯化。
6L3为：
其中，Ac与LY上位于N端的氨基相连，多肽链C末端的最后一个氨基酸G上的羧基中的羟基被氨基（-NH2）取代形成酰胺。下同。
6L3-3P为：
6L3-11K为：
6L3-2Y3P为：
6L3-2V3P为：
6L3-3P6I7Q为：
6L3-3P11K为：
6L3-3P11R为：
6L3-3P11Q为：
其中，各环肽的结构式如下：
6L3环肽的结构式如下：
6L3-3P环肽的结构式如下：
6L3-11K环肽的结构式如下：
6L3-2Y3P环肽的结构式如下：
6L3-2V3P环肽的结构式如下：
6L3-3P6I7Q环肽的结构式如下：
6L3-3P11K环肽的结构式如下：
6L3-3P11R环肽的结构式如下：
6L3-3P11Q环肽的结构式如下：
实施例1、各环肽的制备以及鉴定
环肽的合成根据标准的芴甲氧羰基（Fmoc）固相肽合成（SPPS）方案进行，多肽合成从C端到N端依照序列进行合成。
（1）将0.5克的Rink Amide MBHA树脂用含20%哌啶的二甲基甲酰胺（DMF）溶液处理，以去除Fmoc保护基。随后，将10毫升含有0.3毫摩尔的Fmoc-Gly-OH（或Fmoc-Cys(Trt)-OH）、0.3毫摩尔的1-羟基苯并三唑（HOBT）和5%的二异丙基碳二亚胺（DIC）的DMF溶液加入到树脂中，并在氮气鼓泡条件下反应1.5小时。然后使用DMF和二氯甲烷（DCM）分别对树脂进行三次充分清洗，再使用含20%哌啶的DMF溶液去除Fmoc保护基。
（2）为了偶联后续的氨基酸，将树脂与新配制的含0.9毫摩尔Fmoc-AA-OH（后续的氨基酸）、0.9毫摩尔HOBT和9%的DIC的10毫升DMF溶液，在氮气鼓泡条件下进行1小时的偶联反应。重复迭代以上脱Fmoc和偶联步骤，直到合成所需的肽序列和长度为止。
（3）使用溴乙酸与多肽N-末端的游离氨基基团（N末端的酪氨酸）进行偶联获得N端-溴乙酰基团。
（4）随后将多肽从树脂上切下来，所得到的多肽经乙醚（Et2O）沉淀后，重新溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，并在pH8.0的条件下孵育进行硫醚环化反应1小时。最后，加入三氟乙酸（TFA）酸化溶液，并使用反向高效液相（RP-HPLC）进行纯化，流动相为含0.1%三氟乙酸的水溶液和含0.1%三氟乙酸的乙腈（MeCN；流动相B）。通过电喷雾质谱（ESI-MS）对合成的环肽进行质谱检测，并通过分析型HPLC确认其纯度。
6L3环肽以及改造所得的6L3-3P环肽、6L3-11K环肽、6L3-2Y3P环肽、6L3-2V3P环肽、6L3-3P6I7Q环肽、6L3-3P11K环肽、6L3-3P11R环肽和6L3-3P11Q环肽的色谱和质谱图如图1和图2所示。根据制备方法以及色谱和质谱图可确定上述9个环肽的结构式如前所述。
实施例2、环肽6L3-3P、6L3-3P11K和6L3-3P11R与SARS-CoV-2假病毒中和实验
一、实验方法
1、假病毒准备
本发明共准备了如下18种假病毒：SARS-CoV-2原型毒株（SARS-CoV-2-PT）及17种变异毒株—Alpha(B.1.1.7)、Beta（B.1.351）、Gamma（P.1）、Delta（B.1.617.2）、Omicron（BA.1）、Omicron（BA.2）、Omicron（BA.2.12.1）、Omicron（BA.2.75）、Omicron（BA.4/5）、Omicron（BF.7）、Omicron（BA.4.6）、Omicron（BQ.1）、Omicron（BQ.1.1）、Omicron（XBB）、Omicron（XBB.1.5）、Omicron（CH.1.1）及Omicron（XBB.1.16）的假病毒。
其中，SARS-CoV-2原型毒株（SARS-CoV-2-PT）及变异毒株B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.617.2的假病毒记载于“Zhao X, Zheng A, Li D, Zhang R, Sun H, Wang Q, GaoGF, Han P, Dai L. Neutralisation of ZF2001-elicited antisera to SARS-CoV-2variants. Lancet Microbe. 2021 Oct;2(10):e494. doi: 10.1016/S2666-5247(21)00217-2. Epub 2021 Aug 20. PMID: 34458880; PMCID: PMC8378832”一文，其中SARS-CoV-2原型毒株在文中称为“SARS-CoV-2 wild type”公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用。
SARS-CoV-2变异毒株BA.1的假病毒记载于“Huang M, Wu L, Zheng A, Xie Y,He Q, Rong X, Han P, Du P, Han P, Zhang Z, Zhao R, Jia Y, Li L, Bai B, Hu Z,Hu S, Niu S, Hu Y, Liu H, Liu B, Cui K, Li W, Zhao X, Liu K, Qi J, Wang Q,Gao GF. Atlas of currently available human neutralizing antibodies againstSARS-CoV-2 and escape by Omicron sub-variants BA.1/BA.1.1/BA.2/BA.3.Immunity. 2022 Aug 9;55(8):1501-1514.e3. doi: 10.1016/j.immuni.2022.06.005.Epub 2022 Jun 15. PMID: 35777362; PMCID: PMC9197780”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用。
SARS-CoV-2变异毒株BA.2、BA.2.12.1、BA.2.75、BA.4/5、BQ.1.1、XBB的假病毒记载于“He Q, Wu L, Xu Z, Wang X, Xie Y, Chai Y, Zheng A, Zhou J, Qiao S, HuangM, Shang G, Zhao X, Feng Y, Qi J, Gao GF, Wang Q. An updated atlas ofantibody evasion by SARS-CoV-2 Omicron sub-variants including BQ.1.1 and XBB.Cell Rep Med. 2023 Apr 18;4(4):100991. doi: 10.1016/j.xcrm.2023.100991. Epub2023 Mar 21. PMID: 37019110; PMCID: PMC10027947”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用。
其余几种SARS-CoV-2变异毒株的假病毒按照如下方法制备得到：
因截短S蛋白C端后18位氨基酸研究发现，VSV-SARS-CoV-2-S del18（C末端截短18个氨基酸的S蛋白）的病毒包装和感染效率远高于VSV-SARS-CoV-2-S。https://www.antpedia.com/ibook42/n/82911-n.html（参考文献：Xiong HL, Wu YT, Cao JL, etal. Robust neutralization assay based on SARS-CoV-2 S-protein-bearingvesicular stomatitis virus (VSV) pseudovirus and ACE2-overexpressing BHK21cells.Emerg Microbes Infect. 2020）。因此本实施例中采用截短的S蛋白表达质粒包装SARS-CoV-2原型毒株及变异毒株假病毒。
将编码变异毒株Omicron（BF.7）、Omicron（BA.4.6）、Omicron（BQ.1）、Omicron（XBB.1.5）、Omicron（CH.1.1）及Omicron（XBB.1.16）的S蛋白后18位氨基酸的核苷酸去掉后，分别得到核苷酸序列BF.7-S-del18（SEQ ID No.1）、BA.4.6-S-del18（SEQ ID No.2）、BQ.1-S-del18（SEQ ID No.3）、XBB.1.5-S-del18（SEQ ID No.4）、CH.1.1-S-del18（SEQ IDNo.5）、XBB.1.16-S-del18（SEQ ID No.6），并由GENEWIZ公司进行合成。
分别将上述获得的各核苷酸序列通过EcoRⅠ和XholⅠ酶切位点克隆到pCAGGS表达载体（由苏州金唯智公司提供）的酶切位点EcoRⅠ和XholⅠ之间，并经测序验证正确后得到重组表达质粒，依据插入序列的不同分别命名为pCAGGS-BF.7-S-del18、pCAGGS-BA.4.6-S-del18、pCAGGS-BQ.1-S-del18、pCAGGS-XBB.1.5-S-del18、pCAGGS-CH.1.1-S-del18、pCAGGS-XBB.1.16-S-del18。
接着，将上述构建好的各个S蛋白的表达质粒30μg转染两个直径为10cm的培养皿培养的293T细胞（来自ATCC细胞库）细胞量80%-90%），4h后换液DMEM（10%FBS），转染后24h，加入VSV-ΔG-GFP假病毒（武汉枢密脑科学技术有限公司，V03001）5ml，2h后换液，加入DMEM（含10%FBS以及VSV-G抗体，1:1000比例稀释，由I1Hybridoma ATCC CRL2700细胞表达，终浓度10μg/ml。加入VSV-G抗体的目的是中和掉原始的VSV假病毒），加入假病毒后20h收上清，3000rpm，10min离心，过0.45μm滤膜。分装冻-80℃。未转染S蛋白表达质粒的细胞，后续同样加入VSV-ΔG-GFP假病毒和抗体的组作为假病毒包装对照。
经过上述步骤，分别得到SARS-CoV-2变异毒株Omicron（BF.7）、Omicron（BA.4.6）、Omicron（BQ.1）、Omicron（XBB.1.5）、Omicron（CH.1.1）及Omicron（XBB.1.16）的假病毒。
然后，按照如下进行假病毒滴度测定：实验前一天，用胰酶消化以收获对数生长期的Vero细胞（来自ATCC细胞库），计数，重新接种于96孔板中，待18-24小时细胞密度达到80-100%时，可用来实验；将假病毒用DMEM（含有10% FBS）倍比稀释100 μl/孔加入96孔板，每个样做三孔平行，15h之后CQ1拍照读数，计算滴度。
2、中和实验
（1）实验前一天，用胰酶消化以收获对数生长期的Vero细胞，计数，重新接种于96孔板中，待18-24小时细胞密度达到80-100%时，可用来实验。
（2）实验当天从-80℃取出步骤1包装的各假病毒，并将假病毒置于冰上融化，然后用完全培养基（DMEM培养基，10% FBS）稀释假病毒到1000TU/50μl/孔。
（3）稀释环肽（初始浓度为100μM，2个重复，6L3、6L3-11K、6L3-3P6I7Q三种环肽2倍比稀释，8个梯度；6L3-3P、6L3-3P11K两种环肽3倍比稀释，14个梯度；6L3-2Y3P、6L3-2V3P、6L3-3P11Q三种环肽4倍比稀释，11个梯度；6L3-3P11R环肽4倍比稀释，14个梯度）。
（4）将稀释好的各假病毒分别倒入10cm细胞培养皿，加入96孔板（与环肽体积1:1，即1个重复孔60μl稀释好的环肽+60μl假病毒），吹打混匀1次。将96孔板放入37℃孵育1h；孵育时间至40-50min，取出培养箱中事先准备好的vero细胞，弃掉细胞上清，加入环肽与病毒的混合液100μl。37℃孵育15h后，用CQ1显微镜读数法检测绿色荧光并拍照、计数。
分别设置只加培养基的空白对照，以及不含有环肽含有等量假病毒的攻毒对照。
（5）数据分析，通过GraphPad计算出各环肽的EC50（半数最大效应浓度，即药效实验中能引起50%最大效应时的受试物浓度）。计算方法为抑制率=1-（实验组荧光数-空白对照组荧光数）/（攻毒对照组荧光数-空白对照组荧光数）*100（%）。
二、结果与分析
实验结果如图3所示，环肽6L3对BA.2的中和作用较差，改造后的6L3-3P6I7Q对BA.2假病毒的抑制活性较差，后续未继续针对6L3-3P6I7Q进行研究。6L3-11K对BA.2假病毒中和作用有较大的提升，EC50为1.03μM，改造后的6L3-3P、6L3-3P11K和对BA.2假病毒的抑制活性有更大的提升，EC50分别为8.5nM和12.11nM。
此外，如图4所示，环肽6L3对PT、Delta、BA.1、BA.2.12.1、BA.2.75、BA.4/5、BA.4.6、BQ.1、BQ.1.1、XBB的中和作用均较差，但改造后的6L3-3P，6L3-3P11K以及6L3-3P11R对PT，Alpha、Beta、Gamma、Delta、BA.1、BA.2.12.1、BA.2.75、BA.4/5、BA.4.6、BF.7、BQ.1、BQ.1.1、XBB、XBB.1.5、CH.1.1、XBB.1.16病毒株的假病毒均较好的中和作用，EC50值在2.7nM-6.9μM。
实施例3、环肽6L3-3P、6L3-3P11K和6L3-3P11R与RBD的亲和力测定
利用表面等离子共振现象检测分子间相互作用，在GE Healthcare集团生产的生物大分子相互作用分析系统Biacore 8K上完成。使用protein A芯片（Cytiva，29127555）捕获表达的RBD上清（含有表达的RBD-Fc蛋白）作为固定相，流动相为需要检测的环肽，之后通过BIA evaluation软件分析动力学参数并作图。分析在恒温25℃进行。
实验步骤：
（1）病毒RBD-Fc蛋白的表达及芯片的固定
本发明要表达的病毒RBD-Fc蛋白涉及如下几种来源：Omicron BA.2 RBD、RaTG13RBD、GD/1/2019 RBD、BF.7/BA.4.6、BQ.1.1、XBB、XBB.1.5。
其中，用于表达Omicron BA.2 RBD、RaTG13 RBD、GD/1/2019 RBD和Fc融合蛋白的表达质粒及其构建方法具体参见“Liu H, Wu L, Liu B, Xu K, Lei W, Deng J, Rong X,Du P, Wang L, Wang D, Zhang X, Su C, Bi Y, Chen H, Liu WJ, Qi J, Cui Q, Qi S,Fan R, Jiang J, Wu G, Gao GF, Wang Q. Two pan-SARS-CoV-2 nanobodies and theirmultivalent derivatives effectively prevent Omicron infections in mice. CellRep Med. 2023 Feb 21;4(2):100918. doi: 10.1016/j.xcrm.2023.100918. Epub 2023Jan 12. PMID: 36702124; PMCID: PMC9834170.”一文。用于表达其余病毒RBD-Fc蛋白的表达质粒参照同样的方法进行，差别仅在于将其中的病毒RBD序列进行替换，BF.7/BA.4.6RBD序列如SEQ ID No.7所示，BQ.1.1 RBD序列如SEQ ID No.8所示，XBB RBD序列如SEQ IDNo.9所示，XBB.1.5 RBD序列如SEQ ID No.10所示。
在得到各用于表达病毒RBD-Fc蛋白的表达质粒后，按照如下进行蛋白表达及芯片固定：将用于表达病毒RBD-Fc蛋白的表达质粒与PEI按照1：3比例混合后转染293T细胞，2天后收上清，过滤后按照预置捕获程序将其固定在Protein A芯片（Cytiva，29127555），缓冲液使用PBST溶液（PBS缓冲液含0.05%的吐温20，体积百分含量）。
（2）用DMSO溶解环肽6L3-3P、6L3-3P11K，并配制成10mM母液，参照GE HealthcareLife Science Procedure 29264621AA方法，使用1.05×PBST（1.05×PBS缓冲液含0.05%的吐温20，体积百分含量）和5%DMSO PBST溶液（1×PBS缓冲液含0.05%的吐温20，5% DMSO体积百分含量）逐级稀释多肽，每个浓度体积为100μl。
（3）采用Single-cycle kinetics方法，按照预制程序显示样品位置，将样品加入96孔板，待测溶液依次流过芯片，记录实时响应值。数据经BIAevaluation Version 4.1（GEHealthcare）软件处理，计算得到环肽6L3-3P，6L3-3P11K，6L3-3P11R与RBD-Fc蛋白的亲和力。
表面等离子共振实验检测其结合亲和力的结果如图5所示。
环肽6L3-3P和SARS-CoV-2 BA.2 RBD蛋白的亲和力常数为4.31nM，环肽6L3-3P和SARS-CoV-2 BF.7/BA.4.6 RBD蛋白的亲和力常数为3.41nM；环肽6L3-3P和SARS-CoV-2BQ.1.1 RBD蛋白的亲和力常数为3.69nM，环肽6L3-3P和SARS-CoV-2 XBB RBD蛋白的亲和力常数为3.66nM；环肽6L3-3P和SARS-CoV-2 XBB.1.5 RBD蛋白的亲和力常数为3.58nM，环肽6L3-3P和蝙蝠冠状病毒RaTG13 RBD蛋白的亲和力常数为29800nM，环肽6L3-3P和穿山甲冠状病毒GD/1/2019 RBD蛋白的亲和力常数为19500nM。
环肽6L3-3P11K和SARS-CoV-2 BA.2 RBD蛋白的亲和力常数为21.3nM，环肽6L3-3P11K和SARS-CoV-2 BF.7/BA.4.6 RBD蛋白的亲和力常数为8.85nM；环肽6L3-3P11K和SARS-CoV-2 BQ.1.1 RBD蛋白的亲和力常数为8.85nM，环肽6L3-3P11K和SARS-CoV-2 XBBRBD蛋白的亲和力常数为15.8nM；环肽6L3-3P11K和SARS-CoV-2 XBB.1.5 RBD蛋白的亲和力常数为13.1nM，环肽6L3-3P11K和蝙蝠冠状病毒RaTG13 RBD蛋白的亲和力常数为95900nM，环肽6L3-3P11K和穿山甲冠状病毒GD/1/2019 RBD蛋白的亲和力常数为62600nM。
环肽6L3-3P11R和SARS-CoV-2 BA.2 RBD蛋白的亲和力常数为6.55nM，环肽6L3-3P11R和SARS-CoV-2 BF.7/BA.4.6 RBD蛋白的亲和力常数为5.17nM；环肽6L3-3P11R和SARS-CoV-2 BQ.1.1 RBD蛋白的亲和力常数为8.92nM环肽6L3-3P11R和SARS-CoV-2 XBBRBD蛋白的亲和力常数为6.73nM；环肽6L3-3P11R和SARS-CoV-2 XBB.1.5 RBD蛋白的亲和力常数为6.47nM，环肽6L3-3P11R和蝙蝠冠状病毒RaTG13 RBD蛋白的亲和力常数为70100nM，环肽6L3-3P11R和穿山甲冠状病毒GD/1/2019 RBD蛋白的亲和力常数为42100nM。
上述数据表明：环肽6L3-3P、环肽6L3-3P11K以及6L3-3P11R与SARS-CoV-2各个变异株RBD有很强的亲和力。同时环肽对蝙蝠冠状病毒和穿山甲冠状病毒具有结合能力。
实施例4、环肽对细胞毒性评价实验
实验步骤：
1、将环肽6L3-3P、环肽6L3-3P11K和环肽6L3-3P11R用100%DMSO溶解配制成10mM的母液，再用含双抗（青霉素和链霉素）的DMEM培养液4倍梯度稀释为不同终浓度（100μM、25μM、6.25μM、1.56μM、0.39μM、0.098μM、0.024μM、0.006μM）的待测溶液，待测溶液中DMSO的终浓度为1%（体积百分含量）。
2、将Vero细胞（来自ATCC）接种于96孔板中，置于37℃，5%CO2培养箱孵育过夜24h，待其长至70%-90%密度时，弃掉培养上清，PBS清洗2遍。
3、配制反应体系：在100μl DMEM培养液中加入不同浓度的待测溶液，每个浓度设置3个复孔。同时设置采用1%DMSO作为替代待测溶液的阴性对照组，设置采用DMEM培养液替代待测溶液的空白对照组。
4、取步骤2的96孔板，将步骤3配制的体系加至孔内，置于37℃，5%CO2培养箱孵育24后，弃掉培养上清，使用PBS洗2遍，每孔加入100μl DMEM培养液和10μl CCK-8试剂（日本同仁公司），置于37℃，5%CO2培养箱里孵育2-4h，取受试样品，在Multiskan FC型酶标仪上检测，读取OD450读数。数据用GraphPad Prism5软件进行处理，绘制出药物对Vero细胞的细胞活力评价曲线，并计算出抑制剂的CC50（半数细胞毒性浓度，即在细胞毒性实验中导致50%的细胞发生病变时的受试物浓度，数值越大说明毒性越小）。
细胞毒性实验结果如图6所示，环肽6L3-3P、6L3-3P11K及6L3-3P11R对Vero细胞均没有明显的细胞毒性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (8)

1.一种结合沙贝冠状病毒S蛋白RBD结构域的环肽，其特征在于：所述环肽的结构式如下：
。
2.权利要求1所述的环肽在制备能够抑制沙贝冠状病毒的产品中的应用。
3.权利要求1所述的环肽在制备用于治疗和/或预防由于沙贝冠状病毒感染所致疾病的产品中的应用。
4.权利要求1所述的环肽在制备用于改善由于沙贝冠状病毒感染所致症状的产品中的应用。
5.权利要求1所述的环肽在如下任一中的应用：
（A1）制备能够中和沙贝冠状病毒的产品；
（A2）制备能够结合沙贝冠状病毒S蛋白RBD结构域的产品。
6.根据权利要求2-5中任一所述的应用，其特征在于：所述沙贝冠状病毒为SARS-CoV-2或蝙蝠冠状病毒或穿山甲冠状病毒；
所述SARS-CoV-2为SARS-CoV-2原型毒株或SARS-CoV-2变异毒株。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述蝙蝠冠状病毒为蝙蝠冠状病毒RaTG13；
所述穿山甲冠状病毒为穿山甲冠状病毒GD/1/2019；
所述SARS-CoV-2变异毒株为Alpha株、Beta株、Gamma株、Delta株、Omicron BA.1株、Omicron BA.2株、Omicron BA.2.12.1株、Omicron BA.2.75株、Omicron BA.4/5株、OmicronBF.7、Omicron BA.4.6株、Omicron BQ.1株、Omicron BQ.1.1株、Omicron XBB株、OmicronXBB.1.5株、Omicron CH.1.1株或Omicron XBB.1.16株。
8.一种能够抑制沙贝冠状病毒的药物组合物，其活性成分为权利要求1所述的环肽。
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