WO2005078085A1 - コラーゲン様構造を有するポリペプチド - Google Patents
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Classifications
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- C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
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- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0821—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp
- C07K5/0823—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp and Pro-amino acid; Derivatives thereof
Definitions
- the present invention relates to a polypeptide having a collagen-like triple helical structure, a peptide trimer for producing such a polypeptide, and a method for producing a polypeptide and a peptide trimer.
- Collagen is widely used as a base material for pharmaceuticals and cosmetics, a biocompatible material for regenerative medicine and drug delivery systems, a support for tissue culture, and the like.
- the collagen currently in use is a refined version of collagen that has also gained animal power, mainly from pigs and pests.
- the risk of prion infection causing BSE is a problem.
- collagen derived from plants and fish skin has come to be used. Therefore, there is a need for a safe supply of collagen substitutes.
- efforts to construct a recombinant human collagen-producing system using various host organisms have not been realized yet.
- Collagen has a structure in which three polypeptide chains form a long three helix. It is well known that three chemically synthesized peptides having a collagen-like sequence self-assemble to form the same three-helical structure as collagen, and have been used for structural studies of collagen.
- the collagen-like polypeptide include a peptide unit [-(Pro-Y-Gly) n-] a (where Y represents Pro or Hyp, and n represents an integer of 1 to 20) and a peptide unit. [-(Z) r-] b (wherein, Z represents a peptide chain having 1 to 10 amino acid residues, and r represents an integer of 1 to 20).
- Supramolecules that also have the ability to sequence collagen-like peptides include the collagen triblock peptide of Martin et al .: (Glu) (Gly-X-Hyp-Gly-Pro-Hyp)
- An object of the present invention is to provide a polypeptide having a collagen-like triple helical structure and a peptide unit for producing such a polypeptide.
- the present invention provides a compound represented by the formula:
- the present invention provides a peptide trimer in which three peptides having the same chain length and having the same repeating unit as a basic structure are bonded to be shifted from each other in the main chain direction.
- the three peptides are connected to each other by a disulfide bond.
- the present invention provides a method for producing the above-described peptide trimer of the present invention. This method
- a first peptide having one Cys, a second peptide having two Cys, one of which has a protected SH group, and a third peptide having one Cys are provided. Forming a peptide dimer by bonding the peptide of the second peptide and the second peptide by a disulfide bond,
- the present invention provides a molecular assembly having a triple helical structure, comprising the above-described peptide trimer of the present invention as a constituent.
- the present invention further provides a method for producing the molecular assembly of the present invention, wherein the solution of the peptide trimer is left at a temperature in the range of 0 ° C to 40 ° C for 1 hour or more. And provide a method.
- FIG. 1 is a schematic diagram of a peptide trimer of the present invention and a molecular assembly having a collagen-like three helix comprising the same as a constituent unit.
- FIG. 2 shows various structures of the peptide trimer of the present invention.
- FIG. 3 shows an example of the amino acid sequence of a peptide trimer of the present invention and a molecular assembly comprising the same as a constituent unit.
- FIG. 4 shows the results of measuring circular dichroism spectra of molecular assemblies prepared according to the present invention.
- FIG. 5 shows the ultrafiltration membrane permeability of a molecular assembly prepared according to the present invention.
- FIG. 6 shows another embodiment of the peptide trimer of the present invention.
- FIG. 7 shows the particle size distribution of a molecular assembly prepared according to the present invention.
- the present invention provides a peptide trimer unit formed by trimerizing a synthetic peptide having a collagen-like sequence by regioselective crosslinking.
- the present invention also provides a method for preparing a supramolecule having a triple helical structure using the peptide trimer unit as a constituent unit. An overview of the present invention is shown in FIG.
- the peptide trimer unit of the invention has the formula:
- the polypeptide chain that constitutes natural collagen has a repeating unit of-(-Gly-Pro-Pro-)-or-(-Gly-Pro-Hyp-)-as its basic structure, and has a long left-handed spiral.
- the three polypeptide chains can wrap around each other to form a long right-handed helical structure due to hydrogen bonding between the chains.
- leaving a solution of a peptide with a chain length of about 15-30 having repeating units of-(-Gly- Pro- Pro-)-or-(-Gly- Pro- Hyp-)- It is known to have a stable three-helix structure similar to collagen. In the present specification, such a triple helical structure is referred to as “collagen-like structure”.
- the peptide trimer unit of the present invention is composed of three peptides, and each peptide is represented by-(-Gly-XY-)-where X and Y are any amino acid residues ] Represents a repeating unit.
- X and Y are equivalent to natural amino acid residues.
- the amino acid residue may be a modified amino acid residue well known in the art, and may be an L-form or a D-form.
- the peptide trimers of the invention are found in natural collagen
- Peptide ⁇ has a basic structure that also has a-(-Gly-XY-)-repeating unit force '' means that all amino acid sequences of the peptide have-(-Gly-XY-)-repeating units ( That is, it has Gly for every third), which means that it may include a part that does not have such a repeating unit.
- 80% or more, preferably 90% or more of the amino acid sequences in the peptide trimer molecule have-(-Gly-XY-)-repeating units. It is necessary to be.
- the peptide trimer unit of the present invention has a structure in which three peptides having the same chain length are shifted from each other in the main chain direction and amino acid side chains are bonded to each other.
- “shifted from each other in the main chain direction” means that three peptides are bonded so that they do not completely overlap with each other.
- various types of peptides shown in FIG. Structure is conceivable.
- the single-chain or double-chain portion in the peptide trimer plays a marginal role to stably hold a plurality of peptide trimers by hydrogen bonding. Therefore, in the present invention, among the structures shown in FIG. 2, a structure in which the single-stranded or double-stranded region is long and the triple-stranded region is short is more preferable.
- Each peptide constituting the peptide trimer unit of the present invention has the same chain length. As a result, when the peptide trimers assemble to form a triple helical structure, a stable structure without gaps can be obtained.
- Each peptide can be synthesized by a known peptide synthesis method (liquid phase method or solid phase method). Chain length is 10-60 amino acid residues, preferably Is 15-40 residues, more preferably 20-30 residues. If the chain length is short, the stability of the three-stranded structure formed will be low, and if the chain length is long, the cost of peptide synthesis will increase.
- the amino acid side chains of three peptides are preferably bonded.
- the three peptides have a Cys at the appropriate position and the peptides are linked together by a disulfide bond.
- amino acid side chains may be covalently bonded to each other by an amide bond, a sulfide bond, a Schiff base bond, or the like.
- the peptide trimer unit of the present invention is prepared by a site-specific disulfide bond formation method (Ottl, Jetal, FEBS Lett, 398, 31-36, 1996; Ottl, J. and Moroder, L., J. Am. Chem. Soc. 121, 653-661, 1999; Koide, T. et al. Bioorg Med Chem Lett. 14, 125-128, 2004) to form an interchain disulfide bond.
- a site-specific disulfide bond formation method Ottl, Jetal, FEBS Lett, 398, 31-36, 1996; Ottl, J. and Moroder, L., J. Am. Chem. Soc. 121, 653-661, 1999; Koide, T. et al. Bioorg Med Chem Lett. 14, 125-128, 2004
- the protective group for the SH group any protective group known in the field of peptide synthesis may be used, and for example, acetamidomethyl can be used.
- the first peptide and the second peptide are linked by a disulfide bond to form a peptide dimer.
- Methods for linking the SH groups of Cys via disulfide bonds are generally known in the art, and include, for example, pyridine sulfylation or -tropyridine sulfalelation of the SH group on one peptide chain.
- a peptide dimer in which Cys residues are disulfide bonded to each other can be formed.
- the protected SH of the second peptide of the peptide dimer is activated by conversion of a protecting group, and the peptide dimer and the third peptide are similarly bound by a disulfide bond.
- the peptide trimer of the present invention can be obtained.
- the peptide trimer of the present invention may be purified by column chromatography, HPLC, etc., if necessary. You can do it.
- the collagen-like molecular assembly (supramolecule) of the present invention has a fibrous structure having a triple helical structure similar to collagen using the peptide trimer unit of the present invention as its structural unit (FIGS. 1, 3). .
- a solution of the above-mentioned peptide trimer unit of the present invention is left at a low temperature, complementary self-assembly using the formation of a triple helix as a driving force occurs. That is, the molecular assembly of the present invention is obtained by treating the solution containing the above-mentioned peptide trimer unit of the present invention at 0 ° C to 40 ° C, preferably at 0 ° C at 10 ° C, for 1 hour or more, preferably for 12 hours.
- the film is left standing for 48 hours or more.
- An aqueous solution is preferable as the solution, but an organic solvent can be used because the collagen triple-helical structure does not have a hydrophobic core present in many other proteins.
- the strength of the molecular aggregate having a collagen-like three-helical structure is confirmed by analyzing the structure of the product by measuring circular dichroism spectrum, measuring the molecular weight, and directly observing with an electron microscope. be able to.
- the collagen-like molecular assembly of the present invention can be used in all fields where natural collagen is currently used. For example, it can be used as a cell culture base, a drug delivery system, and other biocompatible materials.
- the collagen-like molecular assembly of the present invention has the advantage that there is no danger of prion infection or gelatin allergy that causes BSE, which is currently a problem in the use of natural collagen.
- the collagen-like molecular assembly of the present invention can be used for functional analysis of collagen and development of functional artificial collagen.
- Collagen-like supramolecules having specific functions binding ability to specific protein binding
- COIDE method Yamamoto method
- PET method Yasui, N. and Koide, T "J. Am. Chem. Soc. 125, 15728-15729, 2003
- PEDF pigment epithelium-derived factor
- Solvent A, 0.05% trifluoroacetic acid Z water
- TrtA-PEG-Resin Wanganabe Chemical Industry
- Fmoc-Hyp (tBu) -OH As a side chain functional group protected amino acid, Fmoc-Hyp (tBu) -OH,
- Fmoc-Cys (Acm) -OH and Fmoc-Cys (Trt) -OH were used (abbreviation: Hyp or 0,4-hydroxyproline; Acm, acetamidomethyl; Trt, trityl).
- M-peptide (Acm, SH form) was dissolved in 50 mM sodium acetate (pH 5.4) [buffer A] containing 2 mM EDTA, and 2,2'-dipyridyl disulphide (49.5 mg, 225 ⁇ mol) was mixed with 2-propanol in a nitrogen atmosphere at room temperature and reacted for 1 hour.
- the produced target product was purified by HPLC and freeze-dried.
- the peptide trimer unit was dissolved in water at a concentration of 10 mg / ml and left at 4 ° C for 14 days (stock solution).
- the stock solution was diluted 5-fold with water at 4 ° C and used for the measurement.
- the measurement conditions are as follows:
- FIG. 4 shows the results.
- the value of the average molar ellipticity of residues ([0] mrw) at 225 nm is equivalent to that of the native collagen and collagen model peptide triple helix. It is suggested that.
- the three-helical structure is changed by heat. And a random coil structure.
- the supramolecular stock solution or the same three-helix (Pro-Hyp-Gly) -amide at 4 ° C as a control was diluted 20-fold with water at 4 ° C.
- H-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Cys (Acm) -Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Cys (SH) -Gly-Pro -Hyp-Gly-Pro-OH (SEQ ID NO: 5)
- a trimer was synthesized in the same manner as in Example 1, and mass spectrometry confirmed that the target compound was synthesized.
- the staggered trimer was supramolecularized at low temperature in the same manner as in Example 2, and the circular dichroism spectrum was measured. As a result, almost the same results as in Example 2 (FIG. 4) were obtained.
- a stock solution of the staggered trimer (10 mg ZmL) was diluted 12-fold with water at 4 ° C, and then the particle size distribution of the sample left at 4 ° C for 1 hour was measured. The measurement was performed using a Shimadzu laser diffraction particle size distribution analyzer (SALD-700) at 4 ° C and a laser wavelength of 405 nm.
- Fig. 7 shows the results. Supramolecular structures with particle sizes of about 0.5 and about 10 microns were detected.
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Abstract
式：
-(-Gly-X-Y-)-
［式中、XおよびYは任意のアミノ酸残基を表す］
の繰り返し単位を基本構造として有する同一鎖長の３個のペプチドが主鎖方向に互いにずれてアミノ酸側鎖どうしがジスルフィド結合などにより結合されているペプチド３量体が開示される。このペプチド３量体は、コラーゲン様の３本らせん構造を有するポリペプチドを形成することができる。また、本発明のペプチド３量体を製造する方法、ならびに本発明のペプチド３量体ユニットを構成単位とする、３本らせん構造を有するコラーゲン様分子集合体も開示される。
Description
明 細 書
コラーゲン様構造を有するポリペプチド
技術分野
[0001] 本発明は、コラーゲン様の 3本らせん構造を有するポリペプチド、このようなポリぺプ チドを製造するためのペプチド 3量体、ならびにポリペプチドおよびペプチド 3量体の 製造方法に関する。
背景技術
[0002] コラーゲンは、医薬品やィ匕粧品の基材、再生医学やドラッグデリバリーシステム用 の生体適合性材料、組織培養用の支持体などとして広く用いられている。現在利用 されているコラーゲンは、主としてブタ、ゥシなどの動物力も得たコラーゲンを精製し たものである。しかし、家畜由来コラーゲンをヒトに利用する場合には、 BSEの原因と なるプリオン感染の危険性が問題となっている。また、植物や魚皮由来コラーゲンも 利用されるようになってきた力 異種コラーゲンの摂取によるゼラチンアレルギーの危 険性が伴う。したがって、安全なコラーゲン代替品の供給が求められている。最近、さ まざまなホスト生物を利用した遺伝子組み換えヒト型コラーゲン産生系の構築が試み られている力 まだ実用化には至っていない。
[0003] コラーゲンは、 3本のポリペプチド鎖が長い 3本らせんを形成している構造を有する 。コラーゲン様配列を有する 3本の化学合成ペプチドが自己集合してコラーゲンと同 じ 3本らせん構造をとることはよく知られており、コラーゲンの構造研究に利用されて いる。コラーゲン様ポリペプチドとしては、例えば、ペプチドユニット [-(Pro- Y-Gly)n-] a (式中、 Yは Proまたは Hypを表し、 nは 1—20の整数を表す）と、ペプチドユニット [- (Z)r- ]b (式中、 Zは 1—10個のアミノ酸残基力もなるペプチド鎖を表し、 rは 1—20の 整数を表す)とを含む繰り返し単位で構成されたポリペプチドが開示されている (特開 2003— 321500)。また、コラーゲン様ペプチド配列力もなる超分子としては、これま でに、 Martinらのコラーゲントリブロックペプチド：（Glu) (Gly- X- Hyp- Gly- Pro- Hyp)
5 6
(Glu) (Martin, R. et al. Biopolymers 70, 435-444, 2003)や、 Fieldsによる" pe
5
ptide-amphiphile" (Fields, GB, Bioorg. Med. Chem. 7, 75-81, 1999)が報告されてい
る。
[0004] しかし、これまでに、分子間での相補的 3本らせん形成により、 3本らせん軸方向に 伸長した超分子を作成した例は報告されて 、な 、。
[0005] 本発明は、コラーゲン様の 3本らせん構造を有するポリペプチドおよびこのようなポ リペプチドを製造するためのペプチドユニットを提供することを目的とする。
発明の開示
[0006] 本発明は、式：
-(-Gly-X-Y-)-
[式中、 Xおよび Yは任意のアミノ酸残基を表す]
の繰り返し単位を基本構造として有する同一鎖長の 3個のペプチドが、主鎖方向に 互いにずれて結合されているペプチド 3量体を提供する。好ましくは、前記 3個のぺ プチドは、ジスルフイド結合により互いに結合されている。
[0007] 別の態様においては、本発明は、上述の本発明のペプチド 3量体を製造する方法 を提供する。この方法は、
1個の Cysを有する第 1のペプチド、 2個の Cysを有し、その一方の SH基が保護され ている第 2のペプチドおよび 1個の Cysを有する第 3のペプチドを用意し、 第 1のペプチドと第 2のペプチドとをジスルフイド結合により結合させてペプチド 2量体 を形成し、
第 2のペプチドの保護された SHを保護基変換により活性ィ匕し、そして
前記ペプチド 2量体と第 3のペプチドとをジスルフイド結合により結合させる、 の各工程を含む。
[0008] また別の態様においては、本発明は、上述の本発明のペプチド 3量体を構成成分 とする 3本らせん構造を有する分子集合体を提供する。本発明はさらに、上述の本発 明の分子集合体を製造する方法であって、ペプチド 3量体の溶液を 0°C— 40°Cの範 囲の温度で 1時間以上放置することを特徴とする方法を提供する。
図面の簡単な説明
[0009] [図 1]図 1は、本発明のペプチド 3量体およびこれを構成単位とするコラーゲン様 3本 らせんを有する分子集合体の概略図である。
[図 2]図 2は、本発明のペプチド 3量体の種々の構造を示す。
[図 3]図 3は、本発明のペプチド 3量体およびこれを構成単位とする分子集合体のアミ ノ酸配列の一例を示す。
[図 4]図 4は、本発明にしたがって作成した分子集合体の円二色性スペクトルの測定 結果を示す。
[図 5]図 5は、本発明にしたがって作成した分子集合体の限外濾過膜透過性を示す。
[図 6]図 6は、本発明のペプチド 3量体の別の態様を示す。
[図 7]図 7は、本発明にしたがって作成した分子集合体の粒度分布を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 本発明は、コラーゲン様配列を有する合成ペプチドを位置選択的架橋形成により 3 量体化させて形成したペプチド 3量体ユニットを提供する。本発明はまた、このぺプ チド 3量体ユニットを構成単位とし、 3本らせん構造を有する超分子を作成する方法を 提供する。本発明の概要は図 1に示される。
[0011] ペプチド 3量体ユニットの構造
本発明のペプチド 3量体ユニットは、式：
-(-Gly-X-Y-)-
[式中、 Xおよび Yは任意のアミノ酸残基を表す]
の繰り返し単位を基本構造として有する。天然のコラーゲンを構成するポリペプチド 鎖は、 - (-Gly-Pro-Pro-)-または- (-Gly-Pro-Hyp-)-の繰り返し単位をその基本構造 として有しており、長い左巻きらせんを形成する。 3本のポリペプチド鎖は互いに巻き 合って、鎖間の水素結合により長く伸びた右巻きらせん構造を形成することができる 。また、 - (- Gly- Pro- Pro- )-または- (- Gly- Pro- Hyp- )-の繰り返し単位を有する鎖長 1 5— 30程度のペプチドの溶液を放置しておくと、天然のコラーゲンと同様の安定な 3 本らせん構造をとることが知られている。本明細書においては、このような 3本らせん 構造を「コラーゲン様構造」と称する。
[0012] 本発明のペプチド 3量体ユニットは、 3個のペプチドから構成され、それぞれのぺプ チドは、 -(-Gly-X-Y-)- [式中、 Xおよび Yは任意のアミノ酸残基を表す]の繰り返し単 位カゝらなる基本構造を有する。ここで、 Xおよび Yは、天然のアミノ酸残基でもよぐ当
該技術分野にぉ 、てよく知られる修飾アミノ酸残基でもよく、 L体でも D体でもよ 、。 好ましくは、本発明のペプチド 3量体は、天然のコラーゲンに見いだされる
- (- Gly- Pro- Pro- )-または- (- Gly- Pro- Hyp- )-の繰り返し単位を多く含み、例えば、ぺ プチド 3量体分子全体で、 Xの 30%以上が Proであり、 Yの 30%以上が Proまたは Hyp である。しかし、（Gly— Glu— Arg) n (Mechling, DE. et al, J. Biol. Chem. 275,
14352-14356, 2000)、（Gly- Pro- Nleu)n (Nleu = N-イソブチルグリシン； Goodman, M. et al, J. Am. Chem. Soc. 118, 10928-10929, 1996)なども安定な 3本らせん構造を形 成することが知られており、本発明のペプチド 3量体はこのような繰り返し単位を有し ていてもよい。ペプチドが、「- (-Gly- X-Y-)-の繰り返し単位力もなる基本構造を有す る」とは、ペプチドのすべてのアミノ酸配列が- (-Gly-X-Y-)-の繰り返し単位を有する (すなわち 3番目ごとに Glyを有する）必要はなぐこのような繰り返し単位を有しない 部分を含んでいてもよいことを意味する。ただし、安定な 3本らせん構造をとるために は、ペプチド 3量体分子中の 80%以上、好ましくは 90%以上のアミノ酸配列が -(-Gly-X-Y-)-の繰り返し単位を有していることが必要である。
[0013] 本発明のペプチド 3量体ユニットは、同一鎖長の 3個のペプチドが主鎖方向に互い にずれてアミノ酸側鎖どうしが結合されている構造を有する。ここで、「主鎖方向に互 いにずれて」 、るとは、 3個のペプチドが完全に重なり合わな 、ように結合されて 、る ことを意味し、例えば図 2に示される種々の構造が考えられる。 3個のペプチドを主鎖 方向に互いにずれるように結合させることにより、 3個のペプチドどうしが短 、安定な 3 本らせん構造をとることを防止し、ペプチド 3量体をユニットとする長 、3本らせん構造 を形成させることができる。このとき、ペプチド 3量体中の 1本鎖または 2本鎖の部分は 、複数のペプチド 3量体を水素結合により安定に保持するのりしろの役割をはたす。 したがって、本発明においては、図 2に示される構造のうち、 1本鎖または 2本鎖の領 域が長ぐ 3本鎖の領域が短い構造がより好ましい。
[0014] 本発明のペプチド 3量体ユニットを構成する各ペプチドは同一の鎖長を有する。こ のことにより、ペプチド 3量体が集合して 3本らせん構造を形成するときに、ギャップの ない安定な構造をとることができる。各ペプチドは、公知のペプチド合成法 (液相法あ るいは固相法）によって合成することができる。鎖長は 10— 60アミノ酸残基、好ましく
は 15 - 40残基、より好ましくは 20 - 30残基である。鎖長が短いと形成される 3本らせ ん構造の安定性が低くなり、鎖長が長いとペプチド合成のコストが高くなる。
[0015] 本発明のペプチド 3量体ユニットにおいては、好ましくは 3個のペプチドのアミノ酸 側鎖どうしが結合されている。好ましくは、 3個のペプチドは適切な位置に Cysを有し ており、これらのペプチドはジスルフイド結合により互いに結合されている。あるいは、 アミド結合、スルフイド結合、シッフ塩基結合などによりアミノ酸側鎖どうしを共有結合 により結合させてもよい。
[0016] ペプチド 3量体ユニットの合成法
本発明のペプチド 3量体ユニットは、部位特異的ジスルフイド結合形成法 (Ottl, J etal, FEBS Lett, 398, 31-36, 1996; Ottl, J. and Moroder, L. , J. Am. Chem. Soc. 121, 653-661, 1999; Koide, T. et al. Bioorg Med Chem Lett. 14, 125-128, 2004)に より鎖間ジスルフイド結合を形成させることにより製造することができる。簡単には、ぺ プチド 3量体を構成する 3個のペプチド鎖のうち、 2個は 1残基の Cys残基を、 1個は 2 残基の Cys残基を有するように設計し、 Cys側鎖をジスルフイド結合によって他の鎖の Cysと結合させる。
[0017] この方法では、まず、 1個の Cysを有する第 1のペプチド、 2個の Cysを有し、その一 方の SH基が保護されている第 2のペプチドおよび 1個の Cysを有する第 3のペプチド を合成する。 SH基の保護基としては、ペプチド合成の分野において知られる保護基 のいずれを用いてもよいが、例えば、ァセトアミドメチルを用いることができる。次に、 第 1のペプチドと第 2のペプチドとをジスルフイド結合により結合させてペプチド 2量体 を形成する。 Cysの SH基どうしをジスルフイド結合により結合させる方法は当該技術 分野において一般に知られており、例えば、一方のペプチド鎖上の SH基をピリジン スルフエ-ル化または-トロピリジンスルフエ-ル化した後に、両方のペプチドを反応 させることにより、 Cys残基が互いにジスルフイド結合したペプチド 2量体を形成するこ とができる。次に、ペプチド 2量体の第 2のペプチドの保護された SHを保護基変換に より活性ィ匕し、そして前記ペプチド 2量体と第 3のペプチドとを同様にしてジスルフイド 結合により結合させることにより、本発明のペプチド 3量体を得ることができる。本発明 のペプチド 3量体は、必要に応じて、カラムクロマトグラフィー、 HPLC等により精製す
ることがでさる。
[0018] コラーゲン様分子奪合体の構诰および牛.成
本発明のコラーゲン様分子集合体 (超分子）は、本発明のペプチド 3量体ユニットを その構造単位とし、コラーゲンと同様の 3本らせん構造を有する線維状の構造を持つ (図 1、 3)。上述の本発明のペプチド 3量体ユニットの溶液を低温で放置すると、 3本 らせん形成を駆動力とする相補的自己集合がおこる。すなわち、本発明の分子集合 体は、上述の本発明のペプチド 3量体ユニットを含む溶液を 0°C— 40°C、好ましくは 0 °C 10°Cで、 1時間以上、好ましくは 12時間以上、さらに好ましくは 48時間以上放置 すること〖こより形成することができる。溶液としては水溶液が好ましいが、コラーゲン 3 本らせん構造には他の多くのタンパク質に存在する疎水的コアが存在しないため、 有機溶媒の使用も可能である。
[0019] コラーゲン様 3本らせん構造を有する分子集合体が生じている力否かは、円二色性 スペクトル測定による生成物の構造解析、分子量の測定、電子顕微鏡による直接観 察などにより確認することができる。
[0020] 本発明のコラーゲン様分子集合体は、現在天然コラーゲンが利用されているあらゆ る分野において利用することができる。例えば、細胞培養基剤、ドラッグデリバリーシ ステム、その他の生体適合性材料として使用することができる。本発明のコラーゲン 様分子集合体は、現在天然コラーゲンの使用において問題となっている、 BSEの原 因となるプリオン感染の危険やゼラチンアレルギーの危険がな ヽと 、う利点を有する
[0021] さらに、本発明のペプチド 3量体を適切に設計することにより、天然のコラーゲンに 存在する特定の機能性配列を本発明のコラーゲン様分子集合体中に容易に人工的 に組み込むことができる。このため、本発明のコラーゲン様分子集合体は、コラーゲ ンの機能解析や、機能性人工コラーゲンの開発に利用することができる。また、特定 の機能 (特定のタンパク質結合に対する結合能)を有するコラーゲン様超分子、例え ば、 COIDE法（Yasui, N. and Koide, T" J. Am. Chem. Soc. 125, 15728-15729, 2003 )によって同定される色素上皮由来因子 (PEDF)結合配列をもつコラーゲン様超分子 などの作成が可能である。
[0022] 以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によ り限定されるものではない。
[0023] 以下の実施例においては、アミノ酸は全て L-体を使用した。最終生成物および合 成中間体の精製には、全て高速液体クロマトグラフィーを用いた。条件は以下の通り である：
カラム： Cosmosil 5C18-AR
溶媒: A, 0.05%トリフルォロ酢酸 Z水
B, 0.05%トリフルォロ酢酸 Zァセトニトリル
温度： 42°C
溶出は Aから Bへの直線グラジェントによりおこなった。また、最終生成物および合成 中間体は MALDI- TOF MSにより同定した。
実施例 1
[0024] Pro-HvD- Glv繰り返しを某本配列とするペプチドユニットの合成（図 3)
1)ペプチド鎖の構築
N-ペプチド（SH体）：
H— Gly— Pro— Hyp— tjly— Pro— Hyp— Giy— Pro— Hyp— Gly— Pro— Hyp— tjly— Pro— Hyp— Gly— Pro -Hyp- Gly- Pro- Hyp- Gly- Pro- Cys(SH)- OH (配列番号 1)
M-ペプチド（Acm, SH体）：
H- Hyp- Gly- Pro- Hyp- Gly- Pro- Hyp- Gly- Pro- Hyp- Gly- Cys(Acm)- Cys(SH)- Gly- Pr o- Hyp- Gly- Pro- Hyp- Gly- Pro- Hyp- Gly- Pro- OH (配列番号 2)
C-ペプチド（SH体）：
H-Cys(SH)- Hyp- Gly- Pro- Hyp- Gly- Pro- Hyp- Gly- Pro- Hyp- Gly- Pro- Hyp- Gly- Pro
-Hyp- Gly- Pro- Hyp- Gly- Pro- Hyp- Gly- OH (配列番号 3)
[0025] 上記 3種のペプチド鎖は、 TrtA-PEG-榭脂（渡辺化学工業）上、通常の Fmoc型固 相合成法により構築した。側鎖官能基保護アミノ酸として、 Fmoc-Hyp(tBu)-OH,
Fmoc- Cys(Acm)- OHおよび Fmoc- Cys(Trt)- OHを使用した（略号： Hypまたは 0, 4-ヒ ドロキシプロリン； Acm,ァセトアミドメチル； Trt,トリチル）。
[0026] 2)ペプチドの榭脂からの切り出しと脱保護
それぞれのペプチド-榭脂（約 O.lmmol)を、氷冷下、水、 m-クレゾール，チオア-ソ ール（各 0.25 ml) , 1,2-エタンジチオール（0.125 ml) ,トリフルォロ酢酸（4.125 ml)と 混合し、室温で 1時間撹拌した。切り出されたペプチドは、約 5倍容のエーテルを加え ることにより沈澱した。凍結乾燥したペプチドは、 0.05%トリフルォロ酢酸 Z水に溶解 し、高速液体クロマトグラフィー (HPLC)によって精製し、凍結乾燥した。
実施例 2
[0027] 撰択的ジスルフイド架橋によるペプチド 3量体ユニットの合成
1) M-ペプチドのピリジンスルフエ-ル化： M-ペプチド（Acm, SPy体）の合成
M-ペプチド（Acm, SH体） 25mg (11.2 μ mol)を 2 mM EDTAを含む 50 mM酢酸ナトリ ゥム (pH 5.4) [バッファー A]に溶解し、 2,2'-ジピリジルジスルフイド (49.5 mg, 225 μ mol)を溶解した 2-プロパノールと窒素雰囲気下、室温で混合し、 1時間反応させた。 生成した目的物は、 HPLCにて精製し、凍結乾燥した。
[0028] 2) M-ペプチド (Acm, SPy体）と C-ペプチド（SH体）とのへテロ 2量体化による M-Cダイ マー（Acm, SS体）の合成
13.2 mg (5.66 μ mol)の Μ-ペプチド（Acm, SPy体）を 0.66 mlのバッファー Aに溶解 し、これを 14.7 mg (6.79 mol)の C-ペプチド（SH体）を溶解した 0.735 mlのバッファ 一 Aに室温、窒素雰囲気下で滴下した。反応液は遮光し、 80分撹拌した。生成した 目的物は、 HPLCにて精製し、凍結乾燥した。
[0029] 3) M- Cダイマー（Acm, SS体）の選択的 S-二トロピリジンスルフエ-ル化： M- Cダイマ 一（Npys, SS体）の合成
10.3 mg (2.35 mol)の M- Cダイマー（Acm, SS体）を 0.412 mlのトリフルォロ酢酸 Z 酢酸 (1:2, v/v)に溶解する。 3--トロ- 2-ピリジンスルフヱ-ルクロリド (1.1 mg, 5.87 μ mol)も同様に 0.6 mlのトリフルォロ酢酸 Z酢酸 (1:2, v/v)に溶解し、ペプチド溶液に室 温、窒素雰囲気下滴下した。反応液は遮光し、 45分間撹拌した。生成した目的物は 、 HPLCにて精製し、凍結乾燥した。
[0030] 4) M- Cダイマー（Npys, SS体）と N-ペプチド（SH体）間での選択的ジスルフイド架橋形 成による、ペプチド 3量体ユニットの合成
3.9 mg (1.81 μ mol)の Ν-ペプチド（SH体）を 0.39 mlの Buffer Aに溶解し、これを 8.1
mg (1.81 μ mol)の M— Cダイマー（Npys, SS体）を溶解した 0.81 mlの Buffer Aに室温、 窒素雰囲気下で滴下した。反応液は遮光し、 90分撹拌した。生成した目的物は、 HPLC (4.6 id X 250 mm)にて精製し、凍結乾燥した。合成したペプチド 3量体ユニット は MALDI-TOF MSにより目的物であることを確認した。実測値 (M+H)+ 6458,理論値 (M+H)+ 6458。
実施例 3
[0031] 自 P虐合による招分早形成
ペプチド 3量体ユニットを 10 mg/mlの濃度で水に溶解し、 4°Cにて 14日間放置した（ ストック溶液)。
1)円二色性スペクトル測定による構造解析
上記ストック溶液を、 4°Cにて水で 5倍に希釈し、測定に用いた。
測定条件は以下の通りである：
装置: JASCO J-820装置に PTC-423L温度制御装置を装着して使用
セル長： 0.5 mm
測定波長： 210-260 nm
データ取り込み： 0.2 nm毎
ス3 rヤン速度： 50 nm/min
レスポンス： 2禾少
データ積算: 3回
感度： 100 mdeg
測定温度、 4、 30、 40、 50、 60、 70°C
[0032] 結果を図 4に示す。超分子の低温におけるスペクトルは、 225 nmに正のシグナルを もち、典型的なコラーゲン 3本らせん構造のスペクトルパターンを示した。ペプチドュ ニットのデザイン上、ユニット単分子では、 3本らせん構造を取り得ないため、この結 果は、ユニット分子間での 3本らせん形成 (=超分子形成）が起こって 、ると解釈され る。また、 225 nmにおける残基平均モル楕円率 ([0]mrw)の値力 天然のコラーゲン およびコラーゲンモデルペプチド 3本らせんのそれと同等であることから、超分子中の 3本らせん含有率は極めて高 、ことが示唆される。この 3本らせん構造は熱により変
性し、ランダムコイル構造となる。
[0033] 2)限外濾過による超分子の解析
超分子ストック溶液あるいは、コントロールとして同様に 4°Cにて 3本らせん形成させ た (Pro- Hyp- Gly) -アミドを 4°Cにて水で 20倍に希釈した。これらを Microcon YM- 100
8
(分子量 100,000カット）を用いて 4°Cにて限外濾過をおこなった。濾液を HPLCで分 祈し、そのピーク面積より限外濾過膜透過率をもとめた。また、同じ溶液を 95°C、 5分 間処理することにより 3本らせんを熱変性させた直後のサンプルについても、同様に 透過率を求めた。結果を図 5に示す。
[0034] 超分子形成させたペプチドのほとんど (6%)は限外濾過膜を通過しな力 た。一方 同じペプチド鎖長とほぼ同様のアミノ酸構成力もなる、 (Pro-Hyp-Gly) -アミドはその
8
56%が膜を通過した。また、超分子溶液を熱変性することにより、 91%が膜を通過で きるようになった。このことから、超分子溶液中では、分子間の相互作用（3本らせん 形成）による大きな構造体が生じていると解釈される。
実施例 4
[0035] スタガー 3量体の合成および特性決定
実施例 1のペプチド 3量体ュ-ットと同じ Pro- Hyp- Gly繰り返しを基本配列とする分子 デザインであって、ただしジスルフイド架橋の位置が異なるペプチド 3量体 (スタガー 3 量体)を合成した。図 6にその構造を示す。
[0036] ペプチド単量体として、以下の 3種類のペプチドを用いた：
H— Hyp— tjly— Pro— Hyp— Giy— Pro— Hyp— Gly— Pro— Hyp— tjly— Pro— Hyp— Gly— Pro— Hyp— 1 y- Pro- Cys(SH)- Gly- Pro- Hyp- Gly- Pro- OH (配列番号 4)
H- Hyp- Gly- Pro- Hyp- Gly- Cys(Acm)- Hyp- Gly- Pro- Hyp- Gly- Pro- Hyp- Gly- Pro- H yp- Gly- Pro- Cys(SH)- Gly- Pro- Hyp- Gly- Pro- OH (配列番号 5)
H- Hyp- Gly- Pro- Hyp- Gly- Cys(SH)- Hyp- Gly- Pro- Hyp- Gly- Pro- Hyp- Gly- Pro- Hy p- Gly- Pro- Hyp- Gly- Pro- Hyp- Gly- Pro- OH (配列番号 6)
[0037] 実施例 1と同じ方法により 3量体を合成し、質量分析により目的物が合成されたこと を確認した。このスタガー 3量体を実施例 2と同様に低温下で超分子化し、円二色性 スペクトルを測定したところ、実施例 2 (図 4)とほぼ同じ結果が得られた。
次に、スタガー 3量体のストック水溶液（lOmgZmL)を 4°Cの水で 12倍に希釈した のち、 4°Cで 1時間放置したサンプルについて、粒度分布を測定した。測定は、島津 レーザ回折式粒度分布測定装置（SALD— 700)を用い、 4°Cでレーザ波長 405nm で行った。結果を図 7に示す。約 0. 5および約 10ミクロンの粒径をあたえる超分子構 造体が検出された。
Claims
[1] 式：
-(-Gly-X-Y-)-
[式中、 Xおよび Yは任意のアミノ酸残基を表す]
の繰り返し単位を基本構造として有する同一鎖長の 3個のペプチドが、主鎖方向に 互 ヽにずれて結合されて 、るペプチド 3量体。
[2] 前記 3個のペプチドがジスルフイド結合により互いに結合されている、請求項 1記載の ペプチド 3量体。
[3] 前記 3個のペプチドのうち、 2個がそれぞれ 1つの Cys残基を有し、他の 1個が 2つの Cys残基を有する、請求項 1または 2に記載のペプチド 3量体。
[4] 前記ペプチド 3量体分子全体で、 Xの 30%以上が Proであり、 Yの 30%以上が Proま たは Hypである、請求項 1—3の!、ずれかに記載のペプチド 3量体。
[5] 請求項 1記載のペプチド 3量体を製造する方法であって、
1個の Cysを有する第 1のペプチド、 2個の Cysを有し、その一方の SH基が保護され ている第 2のペプチドおよび 1個の Cysを有する第 3のペプチドを用意し、
第 1のペプチドと第 2のペプチドとをジスルフイド結合により結合させてペプチド 2量体 を形成し、
第 2のペプチドの保護されて 、る SHを保護基変換により活性ィ匕し、そして 前記ペプチド 2量体と第 3のペプチドとをジスルフイド結合により結合させる、 の各工程を含む方法。
[6] 請求項 1 4のいずれかに記載のペプチド 3量体を構成成分とし、 3本らせん構造を 有する分子集合体。
[7] 請求項 6に記載の分子集合体を製造する方法であって、請求項 1 4のいずれかに 記載のペプチド 3量体の溶液を 0°C— 40°Cの温度で 1時間以上放置することを特徴と する方法。
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