CN113773370B - 一种抗病毒的多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗病毒的多肽及其应用，属于多肽技术领域。为了提供一种抗新型冠状病毒的多肽。本发明提供了氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的多肽，大小为4210Da，该多肽在15μg/mL就可以起效，SEQ ID NO:1所示的多肽具有抗新型冠状病毒的功效。

Description

一种抗病毒的多肽及其应用
技术领域
本发明属于多肽技术领域，具体涉及一种抗病毒的多肽及其应用。
背景技术
自1929年英国细菌学家弗莱明发现抗生素至今，青霉素等药物仍是全世界抗细菌主要用药。为了避免青霉素等药物的耐药性、抗药性问题抗菌肽应运而生。直接用于外伤、皮肤、黏膜消毒多肽喷剂体现了相对于青霉素等药物的优越性。
用于喷涂外表皮(尤其是手部)、嘴、需要消毒的物品等部位的产品，不仅需要抗菌，更需要有效抗新冠病毒。所以，本发明所述，抗菌、抗新冠功效同时存在的喷剂是目前抗疫非常需要的。尤其多肽产品功效明确、药效强力、无耐药机制、几乎没有副作用，可以长时间多次使用。
抗生素等化学类抗菌药物应用至今仍是抗菌主要用药，但抗生素也存在很多弊端。例如：过敏反应、毒性反应、特异质反应、二重感染、抗生素的滥用导致的“超级耐药菌”等问题都是非常严重不可避免的。这些问题抗菌肽都可以避免。并且多次使用也不会影响药物的药效减退、发生副作用等问题。多肽在人体环境可自然降解为氨基酸，几乎没有副作用。目前市场还没有发现功效明确可以抗新冠病毒的喷剂产品。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种抗病毒的多肽。
本发明提供了一种抗病毒的多肽，所述多肽的序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步地限定，所述SEQ ID NO:1所示多肽的浓度不低于15ug/mL
上述多肽在制备抑制新冠病毒的药物中的应用。
本发明还提供了一种编码上述的抗病毒的多肽的基因。
本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体携带上述的编码基因。
本发明还提供了一种重组微生物细胞所述重组细胞携带上述的编码基因或者表达上述的抗细菌多肽。
进一步地限定，所述微生物细胞为原核生物或者真核生物。
上述的基因、上述的载体或上述的重组微生物细胞在制备抑制新冠病毒的药物中的应用。
有益效果：本发明提供了氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的多肽，大小为4210Da，该多肽在15μg/mL就可以起效，具有抗新型冠状病毒的功效。
附图说明
图1为JX0020抗病毒结果图，其中，横坐标是给药浓度，1stock是0.25mg/ml，纵坐标是代表感染病毒细胞数量。
具体实施例
pLVX-puro、psPAX2、pCDNA3.1-Spike(SARS-Cov-2)购买自武汉淼灵生物科技有限公司，pGL3-Basic够买自Promega。
新型冠状病毒假病毒制备方法：
材料：pCDA3.1-spike、pLvx-puro、psPAX2、pGL-Basic、HEK293T
1.设计引物从pGL-Basic质粒上扩增luciferiase基因；Luc-F:AGCGCTACCGGACTCAGATCTCGAGATGGAAGACGCCAAAAAC(SEQ ID NO:2)
Luc-R:CGCGGTACCGTCGACTGCAGAATTCTTACACGGCGATCTTTCC(SEQ ID NO:3)
2.使用无缝克隆方法将luciferiase基因克隆至pLvx-puro载体上获得pLvx-luciferiase-puro重组质粒；
3.经测序无误后提取pLvx-luciferiase-puro重组质粒，同时提取pCDA3.1-spike、psPAX2质粒；(pLvx-luciferiase-puro重组质粒是包含慢病毒骨架的载体主要提供病毒的核心部分，pCDA3.1-spike是新冠的S蛋白(NCBI Reference Sequence:NC_045512.2)用于假病毒的外膜，psPAX2是包装质粒，提供慢病毒包装所用的组件。)
4.转染之前将HEK293T细胞铺于6孔板中(可根据需要选用不同规格细胞板)使在转染时到达70-90％的融合；
5.转染前将DMEM+10％FBS、Opti-
Figure GDA0003339714810000021
预热至室温，取两只无菌的1.5mlEP管，在管1中加入：pCDA3.1-spike:3μg、psPAX2:3μg、pLvx-luciferiase-puro:4μg、Opti-
Figure GDA0003339714810000022
100μL；在管2中加入：Opti-
Figure GDA0003339714810000023
100μL、Lipfectamine2000 20μL；
6.将上述两只管在室温孵育5min，随后将其混合并在室温孵育20min；
7.去掉HEK293T细胞上清，加入新鲜的Opti-
Figure GDA0003339714810000024
培养基，并将上述混合物逐滴加入至细胞板中，转移至37℃5％CO2培养箱中；
8.转染6小时后，去掉转染上清，换用新鲜的DMEM+10％FBS，继续培养；
9.转染48小时后，收取细胞上清，在1000×g离心5min，将上清分装至无菌的EP管中，在-80℃保存，此上清即包含假病毒。
实施例1.一种抗病毒多肽的合成方法
1.以FMOC合成法为基础，采用固相合成法，以酰胺类树脂为固相载体(交联度11％，0.97mmol/g)，FMOC保护的特殊氨基酸，HOBT/DIC偶联剂、10％哌啶/DMF(体积分数)有机碱，按照3倍合成规模的氨基酸投料，按照序列依次连接DISGIEKSVKKIQKEIKKLNEEAKKLNEELIDLQEE。
2.以苯酚：TA:EDT:水:TIS:三氟乙酸＝5:5:5:4:1:80(体积比)为剪切剂，搅拌避光反应。反应结束后抽滤，滤液沉淀，再次抽滤，滤饼为目的肽。
3.合成的多肽粗产物通过制备型反相高效液相色谱(50mm内径制备柱)进行分离纯化，填料采用C18，5μm粒径、
Figure GDA0003339714810000031
孔径型号，A流动相使用乙腈，B流动相使用1‰TFA水，梯度洗脱，由A:B-5％：95％变为A:B-50％：50％，运行时间90分钟。
4.分段收集最高峰顶处流出液，标准为液相纯度90％以上，合格收集液合并，减压蒸馏，最终浓度为5mg/ml，最终制得冻干粉为抗细菌肽化合物。其氨基酸序列为KKVVF-鸟氨酸-VKFK--NH2(SEQ ID NO.2)，DISGIEKSVKKIQKEIKKLNEEAKKLNEELIDLQEE(SEQ ID NO:1)，经质谱检测线性肽分子多肽的大小为4210Da。
利用以下实验验证实验效果：
1.SEQ ID NO:1(JX0020)所示多肽溶解成0.013mg/mL-0.125mg/mL不同梯度的的溶液
2.将稀释的不同浓度的多肽溶液与新型冠状病毒培育24小时后，接入细胞培养液中12小时，进行Luciferase检测。
细胞系：MRC-5(人胚肺成纤维细胞)，稀释溶剂：磷酸盐缓冲液pH7.4，如图1所示15μg/ml就可以起效，是抗新型冠状病毒的多肽。
SEQUENCE LISTING
<110> 哈尔滨吉象隆生物技术有限公司
<120> 一种抗病毒的多肽及其应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Asp Ile Ser Gly Ile Glu Lys Ser Val Lys Lys Ile Gln Lys Glu Ile
1 5 10 15
Lys Lys Leu Asn Glu Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Glu Leu Ile Asp
20 25 30
Leu Gln Glu Glu
35
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
agcgctaccg gactcagatc tcgagatgga agacgccaaa aac 43
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
cgcggtaccg tcgactgcag aattcttaca cggcgatctt tcc 43

Claims (7)

1.一种抗病毒的多肽，其特征在于，所述多肽的序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述的多肽在制备抑制新冠病毒的药物中的应用。
3.编码权利要求1所述的抗病毒的多肽的基因。
4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体携带权利要求3所述的编码基因。
5.一种重组微生物细胞，其特征在于，所述重组微生物细胞表达权利要求1所述的抗病毒多肽。
6.根据权利要求5所述的重组微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞为原核细胞或者真核细胞。
7.权利要求3所述的基因、权利要求4所述的重组载体或权利要求5所述的重组微生物细胞在制备抑制新冠病毒的药物中的应用。
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Fusion mechanism of 2019-nCoV and fusion inhibitors targeting HR1 domain in spike protein;Shuai Xia et al;《 Cellular & Molecular Immunology》;20200211;第17卷;第767页左栏第1-4段，图1c,图1J *

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