一组阳离子抗菌肽及其制备方法
技术领域
本发明属于医药领域,具体而言涉及具有较高抗菌活性的阳离子抗菌肽的制备方法和应用。
背景技术
抗菌肽(antimicrobial peptide,AMP)是一种广泛存在于昆虫、微生物、植物、动物以及人类的一种多肽,是机体内在防御机制的一部分,具有广谱抗菌活性,能够抗革兰氏阳性菌和阴性菌,同时具有抗真菌、寄生虫、病毒和癌症的能力。大多数AMP以细胞膜为靶点,少数作用于细胞内分子,AMP通常带有正电荷,通过静电相互作用与细胞膜上的阴离子成分(如脂多糖和磷壁酸)结合,之后折叠成两亲性构象,其疏水面与磷脂头部相互作用而造成膜结构的紊乱或破坏,进而造成细胞内容物的流出和细菌死亡。
富组蛋白(histidine rich protein,HRPs或histatins)是一类存在于灵长类动物腮腺和颌下腺分泌物中富含组氨酸的阳离子多肽。现已分离出至少12种人HRPs(HRP1-12),其中HRP1、HRP3及HRP5是主要富组蛋白,占总HRPs的85%-90%。其中HRP5含有24个氨基酸残基,分子量为3037D,其氨基酸序列为:
Asp-Ser-His-Ala-Lys-Arg-His-His-Gly-Tyr-Lys-Arg-Lys-Phe-His-Glu-Lys-His-His-Ser-His-Arg-Gly-Tyr。
路建光等(中国医药工业杂志Chinese Journal of Pharmaceuticals 2013,44(12))合成了一组HRP5类似物,其中pep-05的氨基酸序列如下所示:Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe(SEQ ID NO:1)。
本发明在此基础之上,经过进一步的改进得到了一系列HRP5类似物。
发明内容
本发明提供了一种多肽或其药学上可接受的盐,所述多肽具有如下氨基酸序列:
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Leu-Xaa12-Xaa13-Xaa14(SEQ ID NO:2);
其中Xaa1为Lys、Gly、Dap、Dab或缺失;
Xaa2为Arg、hArg、Phe或缺失;
Xaa3为Leu、Phe、Arg或缺失;
Xaa4为Phe、Thi、Cpa或Phe(4-F);
Xaa5为Lys、Dap、Dab或Dap(Cap);
Xaa6为Lys、Dap、Dab、Asp、Ser或Thr;
Xaa7为Leu或Trp;
Xaa8为Leu或Arg;
Xaa9为Lys、Dab或Dap(Cap);
Xaa10为Tyr、Leu、Trp、Lys或Arg;
Xaa12为Arg或hArg;
Xaa13为Lys、Dab或Dap(Cap);
Xaa14为Phe、Thi或Phe(4-F)。
上述多肽或其药学上可接受的盐中,其中Xaa1优选Dab或缺失;Xaa6优选Lys、Dab或Ser;Xaa7优选Leu;Xaa10优选Tyr、Lys或Arg;Xaa14优选Phe或Phe(4-F)。
在某些特定的实施方式中,上述多肽或其药学上可接受的盐中,其中Xaa8为Leu;Xaa10为Tyr。
更进一步,在某些典型的实施方式中,其中Xaa8为Leu;Xaa10为Tyr;Xaa1为Dab或缺失;Xaa6为Lys、Dab或Ser;Xaa7为Leu;Xaa14为Phe或Phe(4-F)。
在某些特定的实施方式中,上述多肽或其药学上可接受的盐中,其中Xaa3为Leu;Xaa7为Leu;Xaa8为Leu;Xaa10为Tyr。
更进一步,在某些典型的实施方式中,其中Xaa3为Leu;Xaa7为Leu;Xaa8为Leu;Xaa10为Tyr;Xaa1为Dab或缺失;Xaa6为Lys、Dab或Ser;Xaa14为Phe或Phe(4-F)。
在某些特定的实施方式中,上述多肽或其药学上可接受的盐中,其中Xaa1、Xaa2和Xaa3缺失;Xaa4为Phe;Xaa6为Lys;Xaa7为Leu;Xaa12为Arg;Xaa14为Phe。
更进一步,在某些典型的实施方式中,其中Xaa1、Xaa2和Xaa3缺失;Xaa4为Phe;Xaa6为Lys;Xaa7为Leu;Xaa12为Arg;Xaa14为Phe;Xaa10为Tyr、Lys或Arg。
在某些特定的实施方式中,上述多肽或其药学上可接受的盐中,其中Xaa1、Xaa2和Xaa3缺失;Xaa5为Lys;Xaa6为Ser;Xaa7为Leu;Xaa8为Leu;Xaa9为Lys;Xaa12为Arg;Xaa13为Lys。
更进一步,在某些典型的实施方式中,其中Xaa1、Xaa2和Xaa3缺失;Xaa5为Lys;Xaa6为Ser;Xaa7为Leu;Xaa8为Leu;Xaa9为Lys;Xaa12为Arg;Xaa13为Lys;Xaa10为Tyr、Lys或Arg;Xaa14为Phe或Phe(4-F)。
本发明所涉及的氨基酸残基包括天然氨基酸,也包括非天然氨基酸。本发明所涉及的天然氨基酸所对应的三字母代码表如表1所示,本发明所涉及的非天然氨基酸所对应的代码表及结构如表2所示。
本发明所涉及的所有氨基酸均为L型氨基酸。
本发明所涉及的多肽为线性肽时,其C末端既可以是羧酸的形式,也可以是酰胺的形式,优选以酰胺形式存在。
表1:天然氨基酸三字母代码表
表2:非天然氨基酸和脂肪酸的代码表及结构
本发明优选的一个实施方式中公开了一种线性多肽(CAMP-1),其氨基酸序列为Dap-hArg-Leu-Phe-Dap-Dap-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Thi-NH2(SEQ ID NO:3)
本发明的又一个优选实施方式公开了一种带脂肪链的多肽(CAMP-28),其氨基酸序列为:Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Dap(Cap)-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:4)
本发明另一个优选的实施方式中公开了一组线性多肽(CAMP-2,CAMP-3,CAMP-4,CAMP-5,CAMP-6,CAMP-7,CAMP-8,CAMP-9,CAMP-10,CAMP-11,CAMP-12,CAMP-13,CAMP-14,CAMP-15,CAMP-16,CAMP-17,CAMP-18,CAMP-19,CAMP-20,CAMP-21,CAMP-22,CAMP-23,CAMP-24,CAMP-25,CAMP-26,CAMP-27,CAMP-29,CAMP-30,CAMP-31,CAMP-32,CAMP-33)其氨基酸序列分别为:
Dab-hArg-Leu-Phe-Dab-Dab-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-Arg-Dab-Phe-NH2(SEQ IDNO:5)
Dab-hArg-Leu-Phe-Dab-Dab-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH2(SEQ IDNO:6)
Dap-hArg-Leu-Phe-Dap-Dap-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH2(SEQ IDNO:7)
Dab-Arg-Leu-Thi-Dap-Dab-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH2(SEQ IDNO:8)
Arg-Leu-Phe-Lys-Asp-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:9)
Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Asp-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQID NO:10)
Gly-Arg-Leu-Phe-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ IDNO:11)
Phe-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:12)
Phe-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe(4-F)-NH2(SEQ ID NO:13)
Cpa-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe(4-F)-NH2(SEQ ID NO:14)
Thi-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe(4-F)-NH2(SEQ ID NO:15)
Phe(4-F)-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe(4-F)-NH2(SEQ ID NO:16)
Phe-Dab-Ser-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH2(SEQ ID NO:17)
Phe-Phe-Phe-Dab-Ser-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH2(SEQ ID NO:18)
Phe-Dab-Thr-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH2(SEQ ID NO:19)
Thi-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Thi-NH2(SEQ ID NO:20)
Thi-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Arg-Lys-Thi-NH2(SEQ ID NO:21)
Thi-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Trp-Leu-Arg-Lys-Thi-NH2(SEQ ID NO:22)
Thi-Dab-Ser-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Thi-NH2(SEQ ID NO:23)
Thi-Dab-Ser-Trp-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Thi-NH2(SEQ ID NO:24)
Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:25)
Phe-Dab-Dab-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Thi-NH2(SEQ ID NO:26)
Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:27)
Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Arg-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:28)
Phe-Lys-Lys-Leu-Arg-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:29)
Arg-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:30)
Phe-Dap(Cap)-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:31)
Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Dap(Cap)-Phe-NH2(SEQ ID NO:32)
Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Dap(Cap)-Lys-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:33)
Phe-Dap(Cap)-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:34)
Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Arg-Dap(Cap)-Phe-NH2(SEQ ID NO:35)
本发明还提供了上述线性多肽或其药学上可接受的盐在制备抗大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念球菌、耐药鲍曼不动杆菌和耐药铜绿假单胞菌的药物中的应用。
本发明还提供了上述线性多肽的制备方法,可以采用固相化学合成技术制备线性肽,制备步骤如下:
(1)在树脂上固相合成多肽;
(2)将步骤(1)的产物在三氟乙酸或氢氟酸中进行裂解,优选三氟乙酸;并加入侧链保护基清除剂,然后用5-20倍体积的冰乙醚沉淀多肽,离心,弃上清,再用冰乙醚反复洗涤沉淀4-5次,真空干燥,得到粗肽。
本发明所涉及的多肽C末端若为羧酸形式,则步骤(1)采用Wang树脂进行合成;本发明所涉及的多肽C末端若为酰胺形式,则步骤(1)采用Rink Amide MBHA树脂进行合成。
步骤(1)是在液相环境中进行,具体包括:浸泡树脂—脱除氨基保护基—洗涤—监测—偶联氨基酸—监测—洗涤—脱除氨基保护基(顺序偶联剩余氨基酸)—干燥树脂。
其中氨基保护基是指为保护参与缩合反应的氨基而引入的化学基团。所述的氨基保护基包括但不限于叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Z)或9-芴基-甲基羰基(Fmoc),优选9-芴基-甲基羰基(Fmoc)。
固相多肽合成中,对部分氨基酸的侧链可以引入化学基团进行保护,例如Arg或hArg可以采用五甲基苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)保护;Lys及Trp可以采用叔丁氧羰基(Boc)保护;Tyr可以采用叔丁基(tBu)保护;Dap可以采用Mtt或BOC保护;Dab可以采用BOC保护;本发明中,Fmoc-L-Dap(Mtt)-OH具有如下所示的结构:
所述的保护基团不限于此,可以根据本领域常规方案进行合理选择。
步骤(1)的液相环境所用溶剂选自:二甲基甲酰胺(DMF)或二氯甲烷(DCM),优选DMF。
步骤(1)中脱除氨基保护基需要加入氨基保护基的脱除剂,氨基保护基的脱除剂选用哌啶(PIP)的二甲基甲酰胺溶液,浓度为10-40%(PIP体积/DMF体积),脱除时间为20-50min;优选浓度为20-25%(PIP体积/DMF体积),脱除时间25-35min。
步骤(1)中氨基酸的偶联需要加入偶联试剂,偶联试剂由:碳二亚胺型试剂或者苯并三氮唑鎓盐型试剂和1-羟基苯并三唑(HOBt)组成。
碳二亚胺型试剂包括但不限于二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)或N-二氨基丙基-N-乙基碳二亚胺(EDC)。
苯并三氮唑鎓盐型试剂包括但不限于2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、O-苯并三唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷(BOP)或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)。
偶联试剂优选二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基苯并三唑(HOBt),或2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)和1-羟基苯并三唑(HOBt),进一步优选DIC(二异丙基碳二亚胺)和1-羟基苯并三唑(HOBt)。
步骤(1)中的“监测”采用茚三酮检测法监测多肽的缩合反应。
步骤(1)中的顺序连接氨基酸是指根据多肽氨基酸序列从C端向N端逐个连接氨基酸。
步骤(2)所述的侧链保护基清除剂包括但不限于茴香硫醚、三异丙基硅烷、苯酚、水、1,2-乙二硫醇、间甲酚或上述任意两种或者两种以上的组合,并与三氟乙酸或氢氟酸按5-20%(V/V)进行配制得到。优选三氟乙酸(TFA):茴香硫醚:75%苯酚:水=85:5:5:5。
本发明的制备方法中,可以进一步包含正辛酸的偶联。具体而言,若制备的多肽为带脂肪链的多肽,则当偶联到带脂肪链氨基酸位置时,先偶联相应的不带脂肪链的氨基酸,再加入正辛酸和偶联剂,监测至反应完成时,再偶联下一个氨基酸。
特别有益的是为满足医药用途的质量要求,本发明所提供的多肽制备方法还可以进一步包括纯化步骤。所采用的纯化方法包括但不限于反相色谱法或离子交换色谱法,优选反相色谱法。
本发明所涉及多肽的体外抗菌活性可以通过测定其最低抑菌浓度(MIC)来鉴定。美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐采用微量肉汤稀释法来测定各抗菌肽的最低抑菌浓度(MIC),培养基采用Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基以及改良型RPMI-1640培养基。以两性霉素B、硫酸多黏菌素E及盐酸万古霉素作为阳性对照。体外活性测定表明,本发明提供的抗菌肽具有更高的抗菌活性,特别抗阴性菌(如铜绿假单胞菌)或抗耐药菌(如耐药鲍曼不动杆菌、耐药铜绿假单胞菌)的活性得到显著改善。
以下实施例仅代表本发明阐述的一个方面,不是本发明主题的局限。
具体实施方式
实施例1:CAMP-1的制备及纯化
氨基酸序列:Dap-hArg-Leu-Phe-Dap-Dap-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Thi-NH2((SEQ ID NO:3)
(1)材料及试剂
Rink Amide MBHA树脂,取代值0.65mmol/g。
氨基酸为:Fmoc-L-3-(2-Thienyl)L-alanine-OH、Fmoc-L-Dab(Boc)-OH、Fmoc-L-hArg(pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Dap(Boc)-OH。
试剂:HOBt、DIC、DMF、哌啶。
(2)仪器
PSI300型多肽合成仪、Waters600半制备型高效液相色谱仪、磁力搅拌器。
(3)操作步骤(以0.15mmol为例)
a.固相化学合成多肽
称取Rink Amide MBHA树脂0.23g,置于多肽合成仪反应器中,加入10mLDMF,浸泡2h,然后加入20%PIP/DMF溶液10mL,混合30min脱除氨基保护基,DMF洗涤树脂7次,然后向反应器中加入177mg Fmoc-L-3-(2-Thienyl)L-alanine-OH、等摩尔的偶联试剂DIC(0.3mol/L)和HOBt(0.3mol/L)进行反应,反应温度为室温,以茚三酮反应监测反应进程,监测无色则为反应完成,用DMF洗涤树脂5次。当第一个氨基酸偶联到树脂上后,即可按照上述方法继续进行下一个氨基酸的偶联反应,如此循环,直至全部氨基酸偶联完成。
b.裂解及沉淀
肽合成结束后,真空干燥树脂,称重。按照1mL裂解试剂/100mg树脂的比例加入裂解试剂,试剂配比为TFA:茴香硫醚:75%苯酚:水=85:5:5:5,室温搅拌反应3小时,抽滤。之后向裂解抽滤液中加入10倍体积的冰乙醚沉淀多肽,离心,弃上清,再用冰乙醚反复洗涤沉淀4~5次,真空干燥,称重粗肽。
c.反相色谱纯化
用制备型HPLC,采用反相色谱法,纯化上述粗肽。
1制备
色谱柱:YMC-pack ODS-AQ C18制备柱(10mm×250mm,10μm)
流速:5mL/min
检测波长:215nm
流动相:A:含0.1%TFA水溶液
B:含0.1%TFA的乙腈
梯度洗脱程序如表3:
表3梯度洗脱表
2分析
色谱柱:YMC-pack ODS-AQ C18分析柱(4.6mm×250mm,5μm)
流速:1mL/min
检测波长:215nm
流动相:A:含0.05%TFA水溶液
B:含0.05%TFA的乙腈
梯度洗脱程序如表4:
表4梯度洗脱表
收集目标肽纯度大于95%的部分,然后38℃减压浓缩至干。经ESI-MS测定,该肽的分子量为1730,理论值为1732.6。
实施例2:带脂肪链多肽CAMP-28的制备及纯化
氨基酸序列:Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Dap(Cap)-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQID NO:4)
(1)材料及试剂
Rink Amide MBHA树脂,取代值0.65mmol/g。
氨基酸为:Fmoc-L-Dap(Mtt)-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH。
试剂:HOBt、DIC、DMF、哌啶、正辛酸。
(2)仪器
PSI300型多肽合成仪、Waters600半制备型高效液相色谱仪、磁力搅拌器。
(3)操作步骤(以0.15mmol为例)
按照实施例1中的操作步骤a合成序列Tyr(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Phe-Rink Amide MBHA,然后加入20%PIP/DMF溶液10mL,混合30min脱除氨基保护基,用DMF洗涤树脂7次,加入262mg Fmoc-L-Dap(Mtt)-OH、等摩尔偶联试剂DIC(0.3mol/L)和HOBt(0.3mol/L),反应3h,再双缩3h(因为此步反应无法用茚三酮监测,显色结果始终为紫红色)。用DMF洗涤5次,再用DCM洗涤5次,真空干燥之后称重,按照100mg树脂加入1ml2%TFA/DCM,搅拌反应1h。用DMF洗涤7次,加入65mg正辛酸,以及等摩尔的偶联试剂DIC(0.3mol/L)和HOBt(0.3mol/L)反应,以茚三酮反应监测反应进程,监测为无色即可偶联下一个氨基酸,之后的氨基酸偶联反应按照实施例1中的操作步骤a进行。之后按照实施例1中操作步骤b-c进行裂解和纯化,收集纯度大于95%的部分,然后38℃减压浓缩至干。该肽的分子量为1565,理论值为1566.41。
实施例3:表5中其余CAMP系列抗菌肽的制备及纯化
(1)材料及试剂
Rink Amide MBHA树脂,取代值0.65mmol/g。
氨基酸为:Fmoc-L-3-(2-Thienyl)L-alanine-OH、Fmoc-L-Dab(Boc)-OH、Fmoc-L-hArg(pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Dap(Boc)-OH、Fmoc-L-Dap(Mtt)-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Phe(4-cl)-OH、Fmoc-L-Phe(4-F)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Asp(otBu)-OH。
试剂:HOBt、DIC、DMF、哌啶、正辛酸。
(2)仪器
PSI300型多肽合成仪、Waters600半制备型高效液相色谱仪、磁力搅拌器。
(3)操作步骤(以0.15mmol为例)
以类似实施例1中操作步骤a-c的方法制备及纯化表5中的多肽,若为带脂肪链多肽则按照实施例2中的操作步骤a进行制备,收集纯度大于95%的部分,然后38℃减压浓缩至干。ESI-MS测定值如表5所示。
表5CAMP系列抗菌肽
实施例4:体外抗菌活性测定
根据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的微量肉汤稀释法测定各抗菌肽的最低抑菌浓度(MIC),细菌培养基采用Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基,白色念球菌培养基采用Hyclone改良型RPMI-1640培养基。
具体步骤为:
(1)抗菌药物贮存液制备:
按照路建光等(中国医药工业杂志Chinese Journal of Pharmaceuticals 2013,44(12))文献所述的方法制备线性多肽pep-05,精确配制浓度为320μg/mL的上述pep-05、CAMP 1~33和80μg/mL阳性对照品两性霉素B、硫酸多黏菌素E及盐酸万古霉素。配制好的各贮存液置于-20℃环境中保存备用。
(2)培养基的配制:
称取MH肉汤培养基21g,溶于蒸馏水中并定容至1L,121℃高温灭菌30min。
(3)接种物的制备:
用接种环挑取形态相似待检菌落3~5个,接种于4~5mL的MH肉汤中,35℃孵育12~16h。处于对数生长期得到菌液用MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准,约含1~2×108CFU/mL。用MH肉汤将上述菌悬液进行1:1000稀释后备用。
(4)稀释抗菌药物的制备及菌液接种:
取一块96孔板,在第1孔中加入160μL MH肉汤,第2-12孔中各加入100μL MH肉汤,然后向第1孔加入抗菌药物原液(320μg/mL)40μL,混匀,接着吸取100μL至第2孔,混匀后再从第2孔中吸取100μL至第3孔,如此连续倍比稀释至第10孔,并从第10孔中吸取100μL弃去,然后向第1-10孔及第12孔中加入上述制备好的接种物各100μL,使每孔最终菌液浓度约为0.5×105CFU/mL。第1-10孔药物浓度分别为32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL、0.0625μg/mL,第11孔为不含抗菌药物及接种物的空白对照,第12孔为不含抗菌药物的阴性对照。
(5)孵育
接种细菌的96孔板置于35℃普通空气孵箱中孵育16~20h,接种真菌的96孔板置于28℃空气孵箱中孵育40~50h。
(6)结果
以肉眼观察,无细菌生长的最低药物浓度即为该样品的最低抑菌浓度(MIC)。各抗菌肽的MIC测定结果如表6所示。
表6CAMP系列抗菌肽的MIC测试结果