CN102766196A - 一组阳离子抗菌肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药领域，具体而言涉及一组具有广谱抗菌活性的阳离子抗菌肽及其制备方法和应用。本发明所涉及的阳离子抗菌肽的氨基酸序列通式为X-(C)_m-(B)_n-His-X。

Description

一组阳离子抗菌肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体而言涉及一组具有广谱抗菌活性的阳离子抗菌肽及其制备方法和应用。

背景技术

自从青霉素发现以来，抗生素一直是人类治疗病原微生物感染的有力武器，但随着传统抗生素的滥用，越来越多的病原菌开始对传统抗生素产生耐药性，所以急需寻找一类全新的抗菌药物来替代抗生素进行使用。

阳离子抗菌肽(cationic antimicrobial peptides)是植物和动物产生的一般由12-50个氨基酸残基组成的阳离子型(富含精氨酸及赖氨酸)多肽，能够保护宿主不受外界病原微生物感染。阳离子抗菌肽的抗菌谱比传统抗生素宽，来自昆虫、猪、蛙以及人的阳离子抗菌肽不仅对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌有抗菌作用，而且还具有抗真菌及抗病毒活性。传统抗生素通过消除微生物生长或生存必不可少的条件，如使酶变性，来达到杀菌的目的，但细菌只要一种基因突变后就可以抵抗此类抗生素的攻击。而阳离子抗菌肽则通过中和电荷的方法与细菌细胞膜相互作用，以此穿透杀死细菌，极大地减少了细菌产生耐药性的可能。但天然的阳离子抗菌肽并非完美无缺，部分抗菌肽对真核生物有一定的毒性，对病原物高杀灭活性的同时往往伴随着对真核生物的溶血作用。因此如何提高其活性并最大程度降低其毒性是目前抗菌肽药物开发的难点和希望所在。目前的研究主要将α-螺旋的两性抗菌肽作为研究对象，围绕阳离子氨基酸以及疏水性氨基酸数量及位置，对抗菌肽进行结构改造，如残基替换、截取天然抗菌肽的部分序列以及增加肽链的正电荷含量等，取得了较大进展。

Yanga等研究了富含精氨酸和脯氨酸的抗菌肽Tritrpticin，他们将抗菌肽氨基酸序列中精氨酸替换为赖氨酸，发现虽然两者的构象没有显著的差别，但替换后的抗菌肽活性提高了2倍而且溶血活性大大降低。Shin等将CecropinA的N端8个残基作头，Magainin2的N端12个残基作尾，合成得到了杂合链CecropinA(1～8)-magainin2(1～12)(缩写CE-MA)，发现其表现出很强的抗细菌活性，且没有溶血性。Fernandez等通过交替D和L型氨基酸，合成了一系列含有偶数残基的短肽。通过抑菌(S.aureus和E.coli)试验，得到仅有8个残基的α螺旋肽链(KQQRWLWLW)具有强抑菌作用。Subbalakshmi等人工合成了Melittin的C端15个氨基酸残基(MCF)，MCF包含了Melittin的大部分两亲片段，而且抗菌活性比Melittin高5～7倍，而溶血活性低300倍。Ahn等截取并不具抗菌活性的Tenecinl的螺旋区域，用Lys替代其中的Asp和His得衍生肽L4，正电荷数由2增至5，使L4展示出很强的抗菌活性，且无溶血性。

美国专利US006040291A设计了序列为(或包含)Lys-Xa1-Phe-Lys-Arg-Ile-Val-Xa2-Phe-Ile-Xaa-Xa2-Phe-Leu-Arg-Xa2-Leu-Val的一系列阳离子抗菌肽，其中Xal代表疏水性氨基酸残基，Xa2代表亲水性氨基酸残基，Xaa代表任意氨基酸残基。体内外试验表明，此系列抗菌肽具有较高的抗菌活性。

美国专利US20050277589A1公布了一组序列为(KLAKLAK)n(βxxβ)m的抗菌肽序列，其中β代表碱性氨基酸残基，x代表任意氨基酸残基，βxxβ为4-15个氨基酸残基组成的带正电荷的序列。m和n代表1-5之间的任一数值。体外实验表明，该系列化合物具有广谱抗菌活性。

中国专利CN 101319007A设计的一条序列为将牛乳铁蛋白LfcinB15中第4位的精氨酸和第10位的甲硫氨酸替换为色氨酸，新抗菌肽对革兰氏阳性菌具有较强的抑制活性。

中国专利CN 1363558A公布了一组蛙皮抗菌肽素的衍生物及其适合于药用的盐，其序列Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Phe-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile-X-Asn-Y-OH，其中，X为选自Met、Ile或Leu的氨基酸残基，Y为选自Ser、Lys、Ile、Arg、Leu的两个氨基酸残基的组合。研究表明，此衍生物和天然蛙皮抗菌肽的活性相当，但安全性更优。

发明内容

本发明涉及一组多肽，其氨基酸序列为：X-(C)_m-(B)_n-His-X，其中X为Cys或缺失，当X为Cys时，该肽可以形成环肽；C为Leu、Ile、Nle、Val、Trp、Phe、D-Phe或Thi；B为Lys、D-Lys、Arg、D-Arg或HoR；m与n为6-8中的任一值。

作为本发明的一个优选方案X优选以缺失的形式存在；C优选Phe、Leu或Trp，m＝6；B优选Lys或Arg，n＝7。

作为本发明的另一个优选方案X优选以缺失的形式存在；C选自Phe、Leu或Trp，m为6；(B)_n为Lys-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys。

本发明所涉及的氨基酸残基既包括天然氨基酸，也包括非天然氨基酸。本发明所涉及的天然氨基酸所对应的三字母代码表如表1所示，本发明所涉及的非天然氨基酸所对应的三字母代码表及结构如表2所示。

本发明所涉及的所有氨基酸残基若不特别限定其构型，代表L型氨基酸。

本发明所涉及的多肽为线性肽时，其C末端既可以是羧酸的形式，也可以是酰胺的形式，优选以酰胺的形式存在。

表1：天然氨基酸三字母代码表

表2：非天然氨基酸三字母代码表及结构

本发明优选的一个实施方案中公开了一种线性多肽(AMP-1)，其氨基酸序列为：

Phe-Leu-Phe-Leu-Phe-Leu-Lys-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-His-NH₂(SEQ ID NO：1)

本发明另一个优选的实施方案中公开了一组线性多肽(AMP-2，AMP-3)，其氨基酸序列分别为：

Phe-Leu-Leu-Phe-Leu-Leu-Lys-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-His-NH₂(SEQ ID NO：2)

Trp-Trp-Trp-Phe-Trp-Trp-Lys-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-His-NH₂(SEQ ID NO：3)

本发明还有个目的就是提供上述多肽的制备方法，可以采用本领域技术人员熟悉的固相化学合成技术制备线性肽以及通过双氧水氧化法在线性肽的基础上制备环肽。

固相化学合成技术的制备步骤如下：

(1)在树脂上固相合成多肽；

(2)将步骤(1)的产物在三氟乙酸或氢氟酸中进行裂解，优选三氟乙酸，并加入侧链保护基清除剂，然后用5-20倍体积的冰乙醚沉淀多肽，离心，弃上清，再用冰乙醚反复洗涤沉淀4-5次，真空干燥，得到粗肽；

步骤(1)是在液相环境中进行，具体包括：浸泡树脂-脱除氨基保护基-洗涤-偶联氨基酸-监测-洗涤-脱除氨基保护基(顺序偶联剩余氨基酸)-干燥树脂。

若本发明所涉及的多肽C末端为羧酸形式则步骤(1)采用Wang树脂进行合成；若本发明所涉及的多肽C末端为酰胺形式则步骤(1)采用Rink Amide MBHA树脂进行合成。

其中氨基保护基是指为保护参与缩合反应的氨基而引入的化学基团。所述的氨基保护基选自：叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Z)和9-芴基-甲基羰基(Fmoc)，优选9-芴基-甲基羰基(Fmoc)。

作为固相多肽合成技术的一个优势，对部分氨基酸的侧链可以通过引入化学基团进行保护，例如Arg及HoR可以采用五甲基苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)；Cys及His可以采用三苯甲基(Trt)；Lys及Trp可以采用叔丁氧羰基(Boc)。所述的保护基团不限于此，可以根据本领域常规方案进行合理选择。

步骤(1)的液相环境所用溶剂选自：二甲基甲酰胺(DMF)或二氯甲烷(DCM)，优选DMF。

步骤(1)中脱除氨基保护基需要加入氨基保护基的脱除剂，氨基保护基的脱除剂选用哌啶(PIP)溶液，浓度10-40％(PIP/DMF)，脱除时间为20-50min。优选浓度为20-25％(PIP/DMF)，脱除时间25-35min。

步骤(1)中氨基酸的偶联需要加入偶联试剂，偶联试剂由：碳二亚胺型试剂或者苯并三氮唑鎓盐型试剂与1-羟基苯并三唑(HOBt)组成。

碳二亚胺型试剂包括二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)及N-二氨基丙基-N-乙基碳二亚胺(EDC)。

苯并三氮唑鎓盐型试剂包括2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、O-苯并三唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷(BOP)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)等。

偶联试剂优选二异丙基碳二亚胺(DIC)与1-羟基苯并三唑(HOBt)、2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)与1-羟基苯并三唑(HOBt)，最优选DIC(二异丙基碳二亚胺)与1-羟基苯并三唑(HOBt)。

步骤(1)中的“监测”采用茚三酮检测法监测多肽的缩合反应。

步骤(1)中的顺序连接氨基酸是指根据多肽氨基酸序列从C端向N端逐个连接氨基酸。

步骤(2)所述的侧链保护基清除剂是选自如茴香硫醚、三异丙基硅烷、苯酚、水、1，2-乙二硫醇、间甲酚等两个或者两个以上的组合并与三氟乙酸或氢氟酸按5-20％(V/V)进行配制得到。优选三氟乙酸(TFA)∶茴香硫醚∶1，2-乙二硫醇∶75％苯酚∶水＝85∶5∶5∶4∶1。

特别有益的是为满足医药用途的质量要求，本发明所提供的多肽制备方法还包括采用常规手段进行纯化。所采用的纯化方法可以为反相色谱法或离子交换色谱法，优选反相色谱法。

半胱氨酸的二硫键在氧化剂(如双氧水)存在的情况下非常不稳定，异交联形成二硫键。若半胱氨酸的二硫键位于多肽的首端和末端，则易形成分子内二硫键，从而形成环肽。可以通过质谱及HPLC监测环肽的形成。

本发明所涉及的多肽的体外抗菌活性可以通过测定其最低抑菌浓度(MIC)来鉴定。美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐采用常量肉汤稀释法来测定各抗菌肽的最低抑菌浓度(MIC)，培养基采用Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基。以两性霉素B、多粘菌素E及万古霉素作为阳性对照。体外活性测定表明，本发明提供的多肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌均具有显著的杀菌效果，对临床上分离的耐药性革兰氏阳性菌、耐药性革兰氏阴性菌及耐药性真菌同样具有显著的杀菌效果，具有广谱、高效的特点。因此本发明所涉及的多肽可以在临床上作为活性成分替代传统抗生素进行治疗。

以下实施例仅代表本发明阐述的一个方面，不是本发明主题的局限。

具体实施方式

实施例1：AMP-1的制备及纯化

序列：Phe-Leu-Phe-Leu-Phe-Leu-Lys-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-His-NH₂(SEQ ID NO：1)

(1)材料及试剂

Rink Amide MBHA树脂，取代值0.41mmol/g。

所需带保护的氨基酸为Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Phe-OH及Fmoc-L-His(Trt)-OH。

试剂：HOBt、DIC、DMF、哌啶。

(2)仪器

PSI300型多肽合成仪、Waters600半制备型高效液相色谱仪、磁力搅拌器。

(3)操作步骤(以0.25mmol为例)

a.固相化学合成多肽

称取Rink Amide MBHA树脂0.61g，置于多肽合成仪的反应器中，加入10mLDMF，浸泡2h，然后加入20％PIP/DMF溶液15mL，混合30min来脱除氨基保护剂，用DMF洗涤树脂7次，然后向反应器中加入619.8mg Fmoc-L-His(Trt)-OH、等摩尔的偶联试剂DIC(0.33mol/L)与HOBt(0.33mol/L)进行反应，反应温度为室温，以茚三酮反应监测反应进程，确保氨基酸偶联到树脂上，用DMF洗涤树脂7次。当第一个氨基酸偶联到树脂上后，即可按照上述方法继续进行下一个氨基酸的偶联反应，如此循环，直至全部氨基酸偶联完成。

b.裂解及沉淀

肽合成结束后，真空干燥树脂，称重。按照1g树脂10mL裂解试剂的比例加入裂解试剂，试剂配比为TFA∶茴香硫醚∶1，2-乙二硫醇∶75％苯酚∶水＝85∶5∶5∶4∶1，室温搅拌反应3小时，抽滤。接着向裂解抽滤液中加入10倍体积的冰乙醚沉淀多肽，离心，弃上清，再用冰乙醚反复洗涤沉淀4～5次，真空干燥，称重粗肽。

c.反相色谱纯化

用制备型HPLC，采用反相色谱法，纯化上述粗肽。

HPLC条件如下：

色谱柱：XBridgeTM Prep C18 5μm OBDTM 19×150mm

流速：10mL/min

检测波长：210nm

流动相：A：含0.1％TFA水溶液

B：含0.1％TFA的乙腈

梯度洗脱程序如表3：

表3梯度洗脱表

收集目标肽纯度大于99％的部分，然后50℃减压浓缩至干。经ESI-MS测定，该肽的分子量为1888.20，理论值为1888.41。

实施例2：AMP-2，AMP-3的制备及纯化

序列：Phe-Leu-Leu-Phe-Leu-Leu-Lys-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-His-NH₂(SEQ ID NO：2)

Trp-Trp-Trp-Phe-Trp-Trp-Lys-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-His-NH₂(SEQ ID NO：3)

(1)材料及试剂

Rink Amide MBHA树脂，取代值0.41mmol/g。

所需带保护的氨基酸Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Trp(Boc)-OH及Fmoc-L-His(Trt)-OH。

试剂：HOBt、DIC、DMF、哌啶。

(2)仪器

PSI300型多肽合成仪、Waters600半制备型高效液相色谱仪、磁力搅拌器。

(3)操作步骤(以0.25mmol为例)

以类似实施例1中操作步骤a-c的方法制备及纯化AMP-2及AMP-3，收集纯度大于99％的部分，然后50℃减压浓缩至干。经ESI-MS测定，AMP-2的分子量为1854.24，理论值为1854.39。

AMP-3的分子量为2185.24，理论值为2185.21。

实施例3：表2中阳离子抗菌肽的制备及纯化

以类似实施例1中的方法制备及纯化表4中的阳离子抗菌肽，但本发明所涉及的阳离子抗菌肽并不限于此。

表4阳离子抗菌肽

实施例4：体外抗菌活性测定

根据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的常量肉汤稀释法测定各抗菌肽的最低抑菌浓度(MIC)，培养基采用Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基。

具体步骤为：

(1)抗菌药物贮存液制备：

精确配制浓度为1280μg/mL的上述阳离子抗菌肽AMP 1～3和阳性对照品两性霉素B、多粘菌素E及万古霉素。配制好的各贮存液置于-20℃环境中保存备用。

(2)培养基的配制：

称取MH肉汤培养基21g，溶于蒸馏水中并定容至1L，121℃高温灭菌30min。

(3)接种物的制备：

用接种环挑取形态相似待检菌落3～5个，接种于4～5mL的MH肉汤中，35℃孵育2～6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1～2×10⁸CFU/mL。用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后备用。

(4)稀释抗菌药物的制备及菌液接种：

取无菌试管(13×100mm)13支，排成一排，第1管中加入1.6mL MH肉汤，第2-13管中各加入1mL MH肉汤，然后向第1管加入抗菌药物原液(1280μg/mL)0.4mL，混匀，接着吸取1mL至第2管，混匀后再从第2管中吸取1mL至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1mL弃去，，然后向第1-11管及第13管中加入上述制备好的接种物各1mL，使每管最终菌液浓度约为5×10⁵CFU/mL。第1-11管药物浓度分别为128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL，第12管为不含抗菌药物及接种物的空白对照，第13管为不含抗菌药物的阴性对照。

(5)孵育：将接种好的稀释管塞好塞子，置35℃普通空气孵箱中孵育16～20h。

(6)结果：以肉眼观察，无细菌生长的最低药物浓度即为该样品的最低抑菌浓度(MIC)。各抗菌肽的MIC测定结果如表5所示。

表5阳离子抗菌肽的MIC测定结果

Claims (10)

1.多肽或其药用盐，所述多肽通式为：X-(C)_m-(B)_n-His-X其中X为Cys或缺失；

C为Leu、Ile、Nle、Val、Trp、Phe、D-Phe或Thi；

B为Lys、D-Lys、Arg、D-Arg或HoR；

m与n为6-8中的任一值。

2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于多肽为线性肽或环肽。

3.根据权利要求2所述的线性肽，其特征在于多肽C末端为羧酸的形式或酰胺的形式。

4.根据权利要求2所述的环肽，其特征在于X为Cys且形成分子间二硫键。

5.权利要求3所述线性肽的制备方法，步骤为：

(1)在树脂上固相合成多肽；

(2)将步骤(1)的产物在三氟乙酸或氢氟酸中进行裂解，加入侧链保护基清除剂；并与5-20倍体积比的冰乙醚混合，沉淀多肽，离心，干燥得到粗肽。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤(1)是在液相环境中进行，具体包括：浸泡树脂-脱除氨基保护基-洗涤-偶联氨基酸-监测-洗涤-脱除氨基保护基(顺序连接其余氨基酸)-干燥树脂。

7.权利要求3所述线性肽的纯化方法，其特征在于采用反相色谱法或离子交换色谱法。

8.权利要求4所述环肽的制备方法，步骤为：

(1)制备线性肽；

(2)双氧水氧化法在线性肽的基础上制备环肽。

9.权利要求4所述环肽的纯化方法，其特征在于采用反相色谱法或离子交换色谱法。

10.权利要求1-4所述的多肽在制备抗细菌及抗真菌药物中的应用。