CN111247162B - 多黏菌素类似物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药领域，涉及具有高抗菌活性的多黏菌素类似物及其制备方法与应用，本发明的多黏菌素类似物对耐药细菌、真菌具有广谱、高效的杀菌效果。

Description

多黏菌素类似物及其制备方法
技术领域
本发明属于医药领域，涉及到抗菌肽及其制备方法与应用，具体而言涉及到一组具有较高抗菌活性的多黏菌素类似物及其合成制备与应用。
背景技术
随着抗生素使用愈加频繁，细菌的耐药性问题也日益凸显，细菌的耐药性正日益成为威胁人类健康的重大问题，尤其是对已有的几乎所有抗生素都存在耐药性的多重耐药菌的出现使这一问题更加突出。然而，现今对新型的能够杀灭多重耐药菌的抗生素的研发仍然没有重大突破。目前抗菌能力最强的多黏菌素被视为抵抗耐药菌的“最后一道防线”，这也使得以多黏菌素作为抗菌剂的治疗方法成为必须。
多黏菌素是1947年发现的一类由多黏芽孢杆菌产生的环肽类抗生素，有多种组分组成，包括多黏菌素A、多黏菌素B、多黏菌素C、多黏菌素D、多黏菌素E，通常它们的抗菌谱窄且仅能对抗革兰氏阴性菌。临床上常用于治疗由革兰氏阴性菌引起的感染。然而由于其存在严重的肾毒性和神经毒性，其逐渐被一些毒副作用低、抗菌效果好的其他抗生素(氨基糖苷类等)取代。直到近20年由于多重耐药菌的出现，多黏菌素作为临床治疗药物再次进入人们的视野。目前已上市的多黏菌素类产品主要是硫酸多黏菌素B、硫酸多黏菌素E和多黏菌素E甲磺酸钠。多黏菌素B和多黏菌素E的抗菌活性稍有不同，一般情况下多黏菌素B的作用强度强于多黏菌素E(陈冠容，多黏菌素临床应用进展及应对超级细菌[J].医药导报，2011，30(2)：135-140)。
天然多黏菌素一般由脂肪酰基链和环状七肽通过线性三肽链接构成，其中4位氨基酸L-Dab(α，γ-二氨基丁酸)与10位氨基酸L-Thr缩合形成七肽环。多黏菌素B和多黏菌素E的结构十分相似，仅在6位氨基酸上存在差异。其中，多黏菌素B的6位氨基酸是D-Phe，多黏菌素E的6位氨基酸是D-Leu(Cui，et.al.Research Development of Polymyxins[J].WorldNotes on Antibiotics，2015，36(5)：205-210)。
然而，多黏菌素肾毒性及神经毒性问题仍然是人们关注的重点。因此，寻找毒性低且具有高效杀菌活性的多黏菌素类似物成为一种迫切的需要。
发明内容
本发明专利申请涉及多肽及其制备合成方法与应用，具体而言涉及到一组具有较高抗菌活性的多黏菌素类似物及其合成制备与应用。
在一个方面，本申请涉及多肽及其药用盐，所述多肽与式I所示的序列具有至少70％的序列同一性。在一些方案中，所述多肽具有如下序列通式：R1-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12(式I)，其中，R1为：脂肪族直链或支链C6-C20的酰基基团或缺失；Xaa1为：Leu，Ala，AEEAc，Phe，IPhe，BrPhe，或3FPhe，或缺失；Xaa2为：Leu，Ala，Arg，或AEEAc，或缺失；Xaa3为：Dab，Ala，Leu，或Orn，或缺失；Xaa4为：Thr，Ala，Dab，或Lys；Xaa5为：Dab，Lys，Orn，或Ala，或缺失；Xaa6为：Lys，Glu，或Dab；Xaa7为：Dab，Ala，Lys，或Orn，或缺失；Xaa8为：D-Leu，D-Phe，Lys，或D-Ala；Xaa9为：Leu，或Ala；Xaa10为：Dab，Leu，Orn，Ala，或D-Leu，或缺失；Xaa11为：Dab，Leu，Orn，Ala，或D-Leu，或缺失；Xaa12为：Glu，Lys，或Asp。
在一些方案中，所述多肽为环肽。在某些方案中，所述多肽由Xaa6与Xaa12的侧链基团脱水缩合成酰胺键而成环，可选地，所述侧链基团包含氨基和/或羧基。可选地，所述多肽由氨基与羧基脱水缩合成酰胺键而成环。
在一些实施方式中，所述R1选自庚酰基、甲基庚酰基、辛酰基、甲基辛酰基、壬酰基、甲基壬酰基、癸酰基、甲基癸酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、17-羧酸-十七烷酰基或缺失，优选为正辛酰基、癸酰基、月桂酰基、棕榈酰基、17-羧酸-十七烷酰基或缺失，更优选为正辛酰基或缺失；Xaa1优选Leu或缺失，Xaa2优选Leu，Xaa3优选Dab，Xaa4优选Thr，Xaa5优选Dab，Xaa6优选Lys或Dab，Xaa7优选Dab，Xaa8优选D-Phe或D-Leu，Xaa9优选Leu，Xaa10优选Dab，Xaa11优选Dab，和/或Xaa12优选Glu。
在一些方案中，所述多肽具有如下通式：
Figure GPA0000288009510000031
其中，R1为：脂肪族直链或支链C6-C20的酰基基团或缺失；Xaa1为：Leu，Ala，AEEAc，Phe，IPhe，BrPhe，3FPhe或缺失；Xaa2为：Leu，Ala，Arg，AEEAc或缺失；Xaa3为：Dab，Ala，Leu，Orn或缺失；Xaa4为：Thr，Ala，Dab或Lys；Xaa5为：Dab，Lys，Orn，Ala或缺失；Xaa6为：Lys或Dab；Xaa7为：Dab，Ala，Lys，Orn或缺失；Xaa8为：D-Leu，D-Phe，Lys或D-Ala；Xaa9为：Leu或Ala；Xaa10为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失；Xaa11为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失。在一些具体实施方式中，所述R1选自庚酰基、甲基庚酰基、辛酰基、甲基辛酰基、壬酰基、甲基壬酰基、癸酰基、甲基癸酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、17-羧酸-十七烷酰基或缺失，优选为正辛酰基、癸酰基、月桂酰基、棕榈酰基、17-羧酸-十七烷酰基或缺失，更优选为正辛酰基或缺失；Xaa1优选Leu或缺失，Xaa2优选Leu，Xaa3优选Dab，Xaa4优选Thr，Xaa5优选Dab，Xaa6优选Lys或Dab，Xaa7优选Dab，Xaa8优选D-Phe或D-Leu，Xaa9优选Leu，Xaa10优选Dab，Xaa11优选Dab。
在一些方案中，所述多肽具有如下通式：
Figure GPA0000288009510000041
其中，R1为：脂肪族直链或支链C6-C20的酰基基团或缺失；Xaa1为：Leu，Ala，AEEAc，Phe，IPhe，BrPhe，3FPhe或缺失；Xaa2为：Leu，Ala，Arg，AEEAc或缺失；Xaa3为：Dab，Ala，Leu，Orn或缺失；Xaa4为：Thr，Ala，Dab，Lys；Xaa5为：Dab，Lys，Orn，Ala或缺失；Xaa7为：Dab，Ala，Lys，Orn或缺失；Xaa8为：D-Leu，D-Phe，Lys，D-Ala；Xaa9为：Leu，Ala；Xaa10为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失；Xaa11为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失；Xaa12为：Glu，Asp。在一些具体实施方案中，所述R1选自庚酰基、甲基庚酰基、辛酰基、甲基辛酰基、壬酰基、甲基壬酰基、癸酰基、甲基癸酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、17-羧酸-十七烷酰基或缺失，优选为正辛酰基、癸酰基、月桂酰基、棕榈酰基、17-羧酸-十七烷酰基或缺失，更优选为正辛酰基或缺失；Xaa1优选Leu或缺失，Xaa2优选Leu，Xaa3优选Dab，Xaa4优选Thr，Xaa5优选Dab，Xaa7优选Dab，Xaa8优选D-Phe或D-Leu，Xaa9优选Leu，Xaa10优选Dab，Xaa11优选Dab，和/或Xaa12优选Glu。
在一些方案中，所述多肽具有如下通式：
Figure GPA0000288009510000042
其中，R1为：脂肪族直链或支链C6-C20的酰基基团或缺失；Xaa1为：Leu，Ala，AEEAc，Phe，IPhe，BrPhe，3FPhe或缺失；Xaa2为：Leu，Ala，Arg，AEEAc或缺失；Xaa3为：Dab，Ala，Leu，Orn或缺失；Xaa4为：Thr，Ala，Dab或Lys；Xaa5为：Dab，Lys，Orn，Ala或缺失；Xaa7为：Dab，Ala，Lys，Orn或缺失；Xaa8为：D-Leu，D-Phe，Lys或D-Ala；Xaa9为：Leu或Ala；Xaa10为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失；Xaa11为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失。在一些具体实施方式中，所述R1选自庚酰基、甲基庚酰基、辛酰基、甲基辛酰基、壬酰基、甲基壬酰基、癸酰基、甲基癸酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、17-羧酸-十七烷酰基或缺失，优选为正辛酰基、癸酰基、月桂酰基、棕榈酰基、17-羧酸-十七烷酰基或缺失，更优选为正辛酰基或缺失；Xaa1优选Leu或缺失，Xaa2优选Leu，Xaa3优选Dab，Xaa4优选Thr，Xaa5优选Dab，Xaa7优选Dab，Xaa8优选D-Phe或D-Leu，Xaa9优选Leu，Xaa10优选Dab，Xaa11优选Dab。
在一个实施方式中，多肽是由R1-Leu-Dab-Thr-Dab-Xaa6-Dab-Xaa8-Leu-Dab-Dab-Glu所示的序列组成的肽或环肽，其中R1优选为正辛酰基、癸酰基、月桂酰基、棕榈酰基、17-羧基十七烷酰基或缺失，更优选为正辛酰基或缺失；Xaa6优选Lys或Dab，Xaa8优选D-Phe或D-Leu。在另一个实施方式中，所述多肽是由R1-Dab-Thr-Dab-Xaa6-Dab-Xaa8-Leu-Dab-Dab-Glu所示的序列组成的肽或环肽，其中R1优选为正辛酰基、癸酰基、月桂酰基、棕榈酰基、17-羧酸-十七烷酰基或缺失，更优选为正辛酰基或缺失；Xaa6优选Lys或Dab，Xaa8优选D-Phe或D-Leu。
在一些具体的实施方式中，所述多肽是包含序列H2N-Leu-Dab-Thr-Dab-Lys-Dab-D-Phe-Leu-Dab-Dab-Glu，或者序列H2N-Dab-Thr-Dab-Lys-Dab-D-Phe-Leu-Dab-Dab-Glu的肽或环肽。
在一些实施方式中，本发明的多肽包含与上述多肽具有至少60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％序列同一性的氨基酸序列。在另一些实施方式中，本发明的多肽与上述多肽相比，具有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个氨基酸的添加、替换和/或缺失的氨基酸序列。在另一些实施方式中，本发明的多肽与上述多肽相比，具有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个氨基酸的替换，其中所述取代可以是保守的替换，和/或近似的替换。在另一些实施方式中，本发明的多肽是上述多肽的6个、7个、8个、9个、10个、11个氨基酸长度的连续的氨基酸的截短体。
在一些方案中，本申请提供的多肽是一种低毒性的多肽。
在一个方面，本申请还提供了前述的多肽或其药用盐的用途。本发明所涉及的多肽可以用于抑菌、抗菌或制备抗菌物质。
在一些实例中，所述抗菌物质为抗菌药物或抗菌剂。在一些实例中，所述菌为细菌或真菌。特别令人吃惊的是，本发明的多肽可以用于抗阴性菌或抗耐药菌，或制备抗阴性菌或抗耐药菌药物。在一些实例中，所述细菌、真菌或耐药菌是鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumanii)，耐药鲍曼不动杆菌(drug resistant Acinetobacter baumanii)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，耐药铜绿假单胞菌，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，大肠杆菌(E.coli)，和/或白色念珠菌(candida Albicans)中的一种或几种，更优选地，是铜绿假单胞菌，耐药鲍曼不动杆菌、耐药铜绿假单胞菌。
在另一个方面，本发明涉及抗菌物质。在一些具体实施方式中，所述抗菌物质为抗菌药物或抗菌剂。本发明的抗菌物质或菌剂包括本发明所述的多肽，以及药学上可接受的盐和/或载体、赋形剂中的一种或几种。
在另一个方面，本申请涉及药物组合物，其包含本申请的多肽或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本申请的药物组合物还包括药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
在另一个方面，本申请涉及所述多肽或其药学上可接受的盐在制备预防或者治疗感染性疾病的药物和/或药物组合物中的用途。
在另一个方面，本申请涉及治疗哺乳动物的疾病的方法，包括对需要该治疗的哺乳动物，优选人类，给予治疗有效量的本发明的多肽或其药学上可接受的盐、或其药物组合物。
上述组合疗法可以如下方式给予：(a)单一药物组合物，其包含本申请的多肽、至少一种本文中描述的附加的治疗剂、和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体；或(b)两种单独的药物组合物，其包括(i)包含本申请的多肽及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体的第一组合物，及(ii)包含至少一种附加的治疗剂和药学上可接受的赋形剂、稀释剂、或载体的第二组合物。所述药物组合物可以同时或相继和以任何顺序给予。
在一个方面，本发明涉及到一组多肽或其药用盐，所述多肽氨基酸序列如下：
R1-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12(式I)。
在一些方案中，所述多肽是氨基酸序列如下所示的环肽：
Figure GPA0000288009510000061
其中R1为：脂肪族直链或支链C6-C20的酰基基团或缺失；
Xaa1为：Leu，Ala，AEEAc，Phe，IPhe，BrPhe，3FPhe或缺失；
Xaa2为：Leu，Ala，Arg，AEEAc或缺失；
Xaa3为：Dab，Ala，Leu，Orn或缺失；
Xaa4为：Thr，Ala，Dab，Lys；
Xaa5为：Dab，Lys，Orn，Ala或缺失；
Xaa6为：Lys，Glu，Dab；
Xaa7为：Dab，Ala，Lys，Orn或缺失；
Xaa8为：D-leu，D-Phe，Lys，D-Ala；
Xaa9为：Leu，Ala；
Xaa10为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失；
Xaa11为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失；
Xaa12为：Glu，Lys，Asp；
作为本发明的一种优选方案，所述R1选自庚酰基、甲基庚酰基、辛酰基、甲基辛酰基、壬酰基、甲基壬酰基、癸酰基、甲基癸酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、17-羧酸-十七烷酰基或缺失，Xaa1优选Leu或缺失，Xaa2优选Leu，Xaa3优选Dab，Xaa4优选Thr，Xaa5优选Dab，Xaa6优选Lys或Dab，Xaa7优选Dab，Xaa8优选D-Phe或D-Leu，Xaa9优选Leu，Xaa10优选Dab，Xaa11优选Dab，Xaa12优选Glu。
本发明所涉及的多肽的氨基酸残基包括天然氨基酸和非天然氨基酸，其中涉及的天然氨基酸所对应的三字母代码如表1所示，所涉及到的非天然氨基酸及其所对应的字母代码和结构如表2所示。
本发明所涉及的氨基酸若不特别限定其结构，则默认为L型氨基酸。
在一些实施方式中，本发明所涉及到的多肽为环肽，是由Xaa6与Xaa12侧链的氨基(或羧基)与羧基(或氨基)脱水缩合成酰胺键而成环。
在一些实施方式中，本发明所涉及到的肽其C末端既可以是羧基形式，也可以是酰胺形式，优选为酰胺形式。
表1：天然氨基酸三字母代码表
Figure GPA0000288009510000071
表2：非天然氨基酸及脂肪酸代码与结构表
Figure GPA0000288009510000072
Figure GPA0000288009510000081
本发明的一个优选实施方式中公开了一种环肽(ZAMP18)，其氨基酸序列为：
Figure GPA0000288009510000082
本发明的又一个优选实施方式公开了一种带脂肪链的环肽(ZAMP29)，其氨基酸序列为：
Figure GPA0000288009510000083
本发明另一个优选的实施方式中公开了一组环肽CTAMP-41，CTAMP-42，CTAMP-43，CTAMP-44，CTAMP-45，CTAMP-46，CTAMP-47，ZAMP-3，ZAMP-4，ZAMP-5，ZAMP-6，ZAMP-7，ZAMP-8，ZAMP-9，ZAMP-10，ZAMP-11，ZAMP-12，ZAMP-13，ZAMP-14，ZAMP-15，ZAMP-16，ZAMP-17，ZAMP-19，ZAMP-20，ZAMP-21，ZAMP-22，ZAMP-23，ZAMP-24，ZAMP-25，ZAMP-26，ZAMP-27，ZAMP-28，ZAMP-30，ZAMP-31，ZAMP-32，ZAMP-33，ZAMP-34，ZAMP-35，ZAMP-36，ZAMP-37，ZAMP-38，ZAMP-39，ZAMP-40其氨基酸序列分别为：
Figure GPA0000288009510000084
Figure GPA0000288009510000091
Figure GPA0000288009510000101
一方面，本发明的多肽可以是具有线性一级结构的肽，另一方面，本发明的多肽可以是环肽。在一些实施方式中，本发明的多肽包含与以上任意一序列所示的肽或环肽具有至少60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％序列同一性的氨基酸序列。在另一些实施方式中，本发明的多肽包含与以上任意一序列所示的多肽具有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个氨基酸的添加、替换和/或缺失的氨基酸序列。在另一些实施方式中，本发明的多肽包含与以上任意一序列所示的多肽具有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个氨基酸的替换，其中所述取代可以是保守的替换，和/或近似的替换。在另一些实施方式中，本发明的多肽是以上任意一序列所示的多肽的6个、7个、8个、9个、10个、11个氨基酸长度的连续的截短体。
在另一个方面，本发明还提供了一种上述肽或环肽的制备方法。
在一些方案中，所述方法包括：合成所述多肽。
在一些方案中，可采用固相合成技术制备以上多肽，包括：
(1)在树脂上固相合成多肽；
(2)将步骤(1)的产物用强酸进行裂解；加入侧链保护基清除剂，过滤，用5-20倍体积的有机溶剂沉淀多肽，离心，有机溶剂反复洗涤沉淀，干燥，得到粗肽。
任选地，所述步骤(1)包括如下步骤：
(a)浸泡树脂-脱除氨基保护基-洗涤-监测-偶联氨基酸-监测-洗涤-脱除氨基保护基-顺序偶联剩余氨基酸；
(b)树脂肽进一步环化。
其中，氨基保护基是指为保护参与缩合反应的氨基而引入的化学基团。所述的氨基保护基包括但不限于叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Z)或9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)，优选9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)。
固相多肽合成中，对部分氨基酸的侧链可以引入化学基团进行保护，例如Arg可以采用五甲基苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)保护；Dab，Orn可以采用叔丁氧羰基(Boc)保护；Thr可以采用叔丁基(tBu)保护。本发明中，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH具有如下所示的结构：
Figure GPA0000288009510000111
所述保护基包括但不限于此，可根据具体情况进行合理选择。
所述步骤(a)的液相环境所用溶剂选自：二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)，优选DMF。
所述步骤(a)中脱除氨基保护基需要加入氨基保护基的脱除剂，氨基保护基的脱除剂选用哌啶(PIP)溶液，浓度10-40％(PIP/DMF)，脱除时间为20-50min；优选浓度为20-25％(PIP/DMF)，脱除时间25-35min。
所述步骤(a)中氨基酸的偶联需要加入偶联试剂，偶联试剂由：碳二亚胺型试剂或者苯并三氮唑鎓盐型试剂和1-羟基苯并三唑(HOBt)组成。
所述碳二亚胺型试剂包括但不限于二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)或N-二氨基丙基-N-乙基碳二亚胺(EDC)。
所述苯并三氮唑鎓盐型试剂包括但不限于2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、O-苯并三唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷(BOP)或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)。
所述偶联试剂优选二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)，或2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)和1-羟基苯并三唑(HOBt)，进一步优选DIC(二异丙基碳二亚胺)和1-羟基苯并三唑(HOBt)。
所述步骤(a)中的“监测”采用茚三酮检测法监测多肽的缩合反应。
所述步骤(a)中的顺序连接氨基酸是指根据多肽氨基酸序列从C端向N端逐个连接氨基酸。
所述步骤(b)环化氨基酸为Xaa6与Xaa12，通过其侧链氨基与羧基形成酰胺键而成环。
步骤(b)中成环采用的是正交保护策略，成环氨基酸侧链上的氨基保护基为烯丙氧羰基(Alloc)，羧基保护基为烯丙基(OAll)。
步骤(b)中脱去Alloc与OAll需要加入脱除剂，使用的脱除剂为四(三苯基膦)钯((Pd(PPh3)4)。
步骤(b)中使用(Pd(PPh3)4)脱Alloc与OAll需要加入清除剂，清除剂可选用H3N·BH3，Me2NH·BH3或PhSiH3，优选PhSiH3。
步骤(b)中环化反应需要加入偶联试剂，偶联试剂由：碳二亚胺型试剂或叔胺型和苯并三氮唑鎓盐型试剂或吡啶三唑翁盐型组成。
其中，所述碳二亚胺型试剂包括但不限于二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)或N-二氨基丙基-N-乙基碳二亚胺(EDC)。
所述叔胺型试剂包括但不限于N，N-二异丙基乙胺(DIEA)。
所述苯并三氮唑鎓盐型试剂包括但不限于2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、O-苯并三唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷(BOP)或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)。
所述吡啶三唑翁盐型包括但不局限于(3H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基六氟磷酸盐(PyAOP)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、7-氮杂苯并三唑-1-基氧基三(二甲胺基)膦六氟磷酸盐(AOP)。
所述偶联试剂优选二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)，或2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)和1-羟基苯并三唑(HOBt)或N，N-二异丙基乙胺(DIEA)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)。进一步优选N，N-二异丙基乙胺(DIEA)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)。
任选地，所述步骤(1)还包括：(c)步骤(b)得到的树脂肽连接脂肪酸链，所述脂肪酸链可以是一元、二元或其他多元脂肪酸链。
所述步骤(c)中偶联剂为二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)，反应溶剂为DMF。
步骤(2)所述的侧链保护基清除剂包括但不限于茴香硫醚、三异丙基硅烷、苯酚、水、1，2-乙二硫醇、间甲酚或上述任意两种或者两种以上的组合，并与三氟乙酸或氢氟酸按5-20％(V/V)进行配制得到。优选三氟乙酸(TFA)∶茴香硫醚∶75％苯酚∶水＝85∶5∶5∶5(V/V/V/V)。
本发明所涉及的多肽C末端若为羧酸形式，则步骤(1)采用Wang树脂进行合成；本发明所涉及的多肽C末端若为酰胺形式，则步骤(1)采用Rink Amide MBHA树脂进行合成。
特别有益的是为满足医药用途的质量要求，本发明所提供的多肽制备方法还可以进一步包括纯化步骤。所采用的纯化方法包括但不限于反相色谱法或离子交换色谱法，优选反相色谱法。
本发明所涉及多肽的体外抗菌活性可以通过测定其最低抑菌浓度(MIC)来鉴定。美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐采用微量肉汤稀释法来测定各抗菌肽的最低抑菌浓度(MIC)，培养基采用Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基以及改良型RPMI-1640培养基。以两性霉素B、硫酸多黏菌素E及盐酸万古霉素作为阳性对照。体外活性测定表明，本发明提供的抗菌肽具有更高的抗菌活性，特别抗阴性菌(如铜绿假单胞菌)或抗耐药菌(如耐药鲍曼不动杆菌、耐药铜绿假单胞菌)的活性得到显著改善。
定义
除非另有说明，本申请中所用的下列术语具有下列含义。一个特定的术语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照本领域普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。
术语“脂肪族直链或支链C6-C20的酰基基团”，是指含有羰基基团部分和非羰基基团部分的取代基，所述非羰基基团包括脂肪族直链或支链基团，包括但不限于烷基、环烷基、烯烃基以及炔基等。本发明中包括但不限于已知多粘菌素化合物中发现的酰基基团，其包括，庚酰基、甲基庚酰基(包括(S)-6-甲基庚酰基)、辛酰基、甲基辛酰基(包括(S)-6-甲基辛酰基、(S)-7-甲基辛酰基)、壬酰基、甲基壬酰基(包括(S)-6-甲基壬酰基、(S)-7-甲基壬酰基和(S)-8-甲基壬酰基)和癸酰基。本发明中，还包括月桂酰基、棕榈酰基、肉豆蔻酰基以及17-羧酸-十七烷酰基。所述“月桂酰基”、“棕榈酰基”以及“肉豆蔻酰基”是指月桂酸、棕榈酸以及肉豆蔻酸中羟基被取代。所述17-羧酸-十七烷酰基通常是指：
Figure GPA0000288009510000141
术语“脂肪酸链”是指包含脂肪族直链或支链部分以及一个、两个或多个羧基基团部分的取代基，所述脂肪族直链或支链部分包括但不限于烷基、环烷基、烯烃基以及炔基等，所述一个、两个或多个羧基基团部分是指包含单羧基基团、二羧基基团或更多羧基基团，术语“一元脂肪酸链”是指包含脂肪族直链或支链部分以及一个羧基基团部分的取代基，术语“二元脂肪酸链”是指包含脂肪族直链或支链部分以及两个羧基基团部分的取代基，术语“多元脂肪酸链”是指包含脂肪族直链或支链部分以及多个羧基基团部分的取代基
术语“被取代的”是指特定原子上的任意一个或多个氢原子被取代基取代，只要特定原子的价态是正常的并且取代后的化合物是稳定的。当取代基为酮基(即＝O)时，意味着两个氢原子被取代，酮取代不会发生在芳香基上。
术语“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可以发生或不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。例如，乙基“任选”被卤素取代，指乙基可以是未被取代的(CH2CH3)、单取代的(如CH2CH2F)、多取代的(如CHFCH2F、CH2CHF2等)或完全被取代的(CF2CF3)。本领域技术人员可理解，对于包含一个或多个取代基的任何基团，不会引入任何在空间上不可能存在和/或不能合成的取代或取代模式。
本文所用的Cm-n指该部分中具有m-n个碳原子。例如，“碳3-10环烷基”指该环烷基具有3-10个碳原子。“碳0-6亚烷基”指该亚烷基具有0-6个碳原子，当亚烷基具有0个碳原子时，该基团为键。
本文中的数字范围，是指给定范围中的各个整数。例如“C1-6”是指该基团可具有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子或6个碳原子。
当任何变量(例如R)在化合物的组成或结构中出现一次以上时，其在每一种情况下的定义都是独立的。因此，例如，如果一个基团被2个R所取代，则每个R都有独立的选项。
术语“卤”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘。
术语“酰基”指-CO-基团。
术语“羧基”指-COOH基团。
术语“羟基”指-OH基团。
术语“氰基”指-CN基团。
术语“巯基”指-SH基团。
术语“氨基”指-NH2基团。
术语“硝基”指-NO2基团。
术语“烷基”是指通式为CnH2n+1的烃基。该烷基可以是直链或支链的。例如，术语“烃1-6烷基”指含有1至6个碳原子的单价直链或支链脂肪族基团(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、新戊基、3，3-二甲基丙基、己基、2-甲基戊基等)。类似地，烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基磺酰基和烷硫基的烷基部分(即烷基)具有上述相同定义。
术语“烷氧基”指-O-烷基。
术语“烷硫基”指-S-烷基。
术语“烷基氨基”指-NH(烷基)。
术语“二烷基氨基”指-N(烷基)2。
术语“烯基”是指由碳原子和氢原子组成的直链或支链的具有至少一个双键的不饱和脂肪族烃基。烯基的非限制性实例包括但不限于乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、异丁烯基、1，3-丁二烯基等。
术语“炔基”是指由碳原子和氢原子组成的直链或支链的具有至少一个三键的不饱和脂肪族烃基。炔基的非限制性实例包括但不限于乙炔基(-C由碳原)、1-丙炔基(-C基(原子和3)、2-丙炔基(-CH2-CH(原)、1，3-丁二炔基(-C炔基(子和氢原)等。
术语“环烷基”指完全饱和的并且可以以呈单环、稠环或螺环存在的碳环。除非另有指示，该碳环通常为3至10元环，优选为3至8元环。环烷基非限制性实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、降冰片基(双环[2.2.1]庚基)、双环[2.2.2]辛基、金刚烷基等。
术语“芳基”是指具有共轭的π电子体系的全碳单环或稠合多环的芳香环基团。例如，芳基可以具有6-20个碳原子，6-14个碳原子或6-12个碳原子。芳基的非限制性实例包括但不限于苯基、萘基和蒽基等。
术语“杂芳基”是指单环或稠合多环体系，其中含有至少一个选自N、O、S的环原子，其余环原子为C，并且具有至少一个芳香环。优选的杂芳基具有单个4至8元环，尤其是5至8元环，或包含6至14个，尤其是6至10个环原子的多个稠合环。杂芳基的非限制性实例包括但不限于吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、异喹啉基、四唑基、三唑基、三嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、异吲哚基等。
术语“治疗”意为将本申请所述化合物或制剂进行给药以预防、改善或消除疾病或与所述疾病相关的一个或多个症状，且包括：
(i)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中出现，特别是当这类哺乳动物易患有该疾病状态，但尚未被诊断为已患有该疾病状态时；
(ii)抑制疾病或疾病状态，即遏制其发展；
(iii)缓解疾病或疾病状态，即使该疾病或疾病状态消退。
术语“治疗有效量”意指(i)治疗或预防特定疾病、病况或障碍，(ii)减轻、改善或消除特定疾病、病况或障碍的一种或多种症状，或(iii)预防或延迟本文中所述的特定疾病、病况或障碍的一种或多种症状发作的本申请化合物的用量。构成“治疗有效量”的本申请化合物的量取决于该化合物、疾病状态及其严重性、给药方式以及待被治疗的哺乳动物的年龄而改变，但可例行性地由本领域技术人员根据其自身的知识及本公开内容而确定。
术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
作为药学上可接受的盐，例如，可以提及金属盐、铵盐、与有机碱形成的盐、与无机酸形成的盐、与有机酸形成的盐、与碱性或者酸性氨基酸形成的盐等。金属盐的非限制性实例包括但不限于碱金属的盐，例如钠盐、钾盐等；碱土金属的盐，例如钙盐、镁盐、钡盐等；铝盐等。与有机碱形成的盐的非限制性实例包括但不限于与三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、2，6-二甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、环己胺、二环己基胺等形成的盐。与无机酸形成的盐的非限制性实例包括但不限于与盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等形成的盐。与有机酸形成的盐的非限制性实例包括但不限于与甲酸、乙酸、三氟乙酸、富马酸、草酸、苹果酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲基苯磺酸等形成的盐。与碱性氨基酸形成的盐的非限制性实例包括但不限于与精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等形成的盐。与酸性氨基酸形成的盐的非限制性实例包括但不限于与天冬氨酸、谷氨酸等形成的盐。
术语“药物组合物”是指一种或多种本申请的化合物或其盐与在本领域中通常接受的用于将生物活性化合物输送至有机体(例如人)的赋形剂、稀释剂、或载体的制剂。药物组合物的目的是有利于对有机体给予本申请的化合物。
术语“药学上可接受的赋形剂、稀释剂、或载体”是指对有机体无明显刺激作用，而且不会损害该活性化合物的生物活性及性能的那些赋形剂、稀释剂、或载体。合适的载体、稀释剂及赋形剂是本领域技术人员熟知的，并且包括诸如碳水化合物、蜡、水溶性和/或水可膨胀的聚合物、亲水性或疏水性材料、明胶、油、溶剂、水等原料。
本申请还包括与本文中记载的那些相同的，但一或多个原子被原子量或质量数不同于自然中通常发现的原子量或质量数不同的原子置换的同位素标记的本申请化合物。可结合到本申请化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、碘和氯的同位素，诸如分别为2H、3H、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、31p、32p、35S、18F、123I、125I和36Cl等。
某些同位素标记的本申请化合物(例如用3H及14C标记的那些)可用于化合物和/或底物组织分布分析中。氚化(即3H)和碳-14(即14C)同位素对于由于它们易于制备和可检测性是尤其优选的。此外，用较重同位素(诸如氘(即2H))取代可以提供某些由更高的代谢稳定性产生的治疗优点(例如增加的体内半衰期或降低的剂量需求)，并且因此在某些情形下可能是优选的。正电子发射同位素，诸如15O、13N、11C和18F可用于正电子发射断层扫描(PET)研究以测定底物占有率。通常可以通过与公开于下文的方案和/或实施例中的那些类似的下列程序，通过同位素标记试剂取代未经同位素标记的试剂来制备同位素标记的本申请化合物。
具体实施方案
本申请的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本申请的实施例。
本申请具体实施方式的化学反应是在合适的溶剂中完成的，所述的溶剂须适合于本申请的化学变化及其所需的试剂和物料。为了获得本申请的化合物，有时需要本领域技术人员在已有实施方式的基础上对合成步骤或者反应流程进行修改或选择。
以下实施例仅代表本发明阐述的一个方面，不是本发明主题的局限。例如，本发明包括但不限于如下各项：
1.多肽或其药用盐，所述多肽与式I所示的序列具有至少70％的序列同一性：
R1-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12(式I)，
其中，R1为：脂肪族直链或支链C6-C20的酰基基团或缺失；
Xaa1为：Leu，Ala，AEEAc，Phe，IPhe，BrPhe，3FPhe或缺失；
Xaa2为：Leu，Ala，Arg，AEEAc或缺失；
Xaa3为：Dab，Ala，Leu，Orn或缺失；
Xaa4为：Thr，Ala，Dab或Lys；
Xaa5为：Dab，Lys，Orn，Ala或缺失；
Xaa6为：Lys，Glu或Dab；
Xaa7为：Dab，Ala，Lys，Orn或缺失；
Xaa8为：D-Leu，D-Phe，Lys或D-Ala；
Xaa9为：Leu或Ala；
Xaa10为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失；
Xaa11为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失；
Xaa12为：Glu，Lys或Asp。
2.如项1所述的多肽或其药用盐，其中所述多肽为环肽。
3.如项1-2任一项所述的多肽或其药用盐，所述多肽由Xaa6与Xaa12的侧链基团脱水缩合成酰胺键而成环，可选地，所述侧链基团含有氨基和/或羧基。
4.如项1-3任一项所述的多肽或其药用盐，所述R1选自庚酰基、甲基庚酰基、辛酰基、甲基辛酰基、壬酰基、甲基壬酰基、癸酰基、甲基癸酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、17-羧酸-十七烷酰基或缺失，优选为正辛酰基、癸酰基、月桂酰基、棕榈酰基、17-羧酸-十七烷酰基或缺失，更优选为正辛酰基或缺失；Xaa1优选Leu或缺失，Xaa2优选Leu，Xaa3优选Dab，Xaa4优选Thr，Xaa5优选Dab，Xaa6优选Lys或Dab，Xaa7优选Dab，Xaa8优选D-Phe或D-Leu，Xaa9优选Leu，Xaa10优选Dab，Xaa11优选Dab，和/或Xaa12优选Glu。
5.如项1-3任一项所述的多肽或其药用盐，所述多肽具有如下通式：
Figure GPA0000288009510000181
其中，R1为：脂肪族直链或支链C6-C20的酰基基团或缺失；
Xaa1为：Leu，Ala，AEEAc，Phe，IPhe，BrPhe，3FPhe或缺失；
Xaa2为：Leu，Ala，Arg，AEEAc或缺失；
Xaa3为：Dab，Ala，Leu，Orn或缺失；
Xaa4为：Thr，Ala，Dab或Lys；
Xaa5为：Dab，Lys，Orn，Ala或缺失；
Xaa6为：Lys或Dab；
Xaa7为：Dab，Ala，Lys，Orn或缺失；
Xaa8为：D-Leu，D-Phe，Lys或D-Ala；
Xaa9为：Leu或Ala；
Xaa10为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失；
Xaa11为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失。
6.如项5所述的多肽或其要药用盐，所述R1选自庚酰基、甲基庚酰基、辛酰基、甲基辛酰基、壬酰基、甲基壬酰基、癸酰基、甲基癸酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、17-羧酸-十七烷酰基或缺失，优选为正辛酰基、癸酰基、月桂酰基、棕榈酰基、17-羧酸-十七烷酰基或缺失，更优选为正辛酰基或缺失；Xaa1优选Leu或缺失，Xaa2优选Leu，Xaa3优选Dab，Xaa4优选Thr，Xaa5优选Dab，Xaa6优选Lys或Dab，Xaa7优选Dab，Xaa8优选D-Phe或D-Leu，Xaa9优选Leu，Xaa10优选Dab，Xaa11优选Dab。
7.如项1-3任一项所述的多肽或其药用盐，所述多肽具有如下通式：
Figure GPA0000288009510000191
其中，R1为：脂肪族直链或支链C6-C20的酰基基团或缺失；
Xaa1为：Leu，Ala，AEEAc，Phe，IPhe，BrPhe，3FPhe或缺失；
Xaa2为：Leu，Ala，Arg，AEEAc或缺失；
Xaa3为：Dab，Ala，Leu，Orn或缺失；
Xaa4为：Thr，Ala，Dab或Lys；
Xaa5为：Dab，Lys，Orn，Ala或缺失；
Xaa7为：Dab，Ala，Lys，Orn或缺失；
Xaa8为：D-Leu，D-Phe，Lys或D-Ala；
Xaa9为：Leu或Ala；
Xaa10为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失；
Xaa11为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失；
Xaa12为：Glu或Asp。
8.如项7所述的多肽或其药用盐，所述R1选自庚酰基、甲基庚酰基、辛酰基、甲基辛酰基、壬酰基、甲基壬酰基、癸酰基、甲基癸酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、17-羧酸-十七烷酰基或缺失，优选为正辛酰基、癸酰基、月桂酰基、棕榈酰基、17-羧酸-十七烷酰基或缺失，更优选为正辛酰基或缺失；Xaa1优选Leu或缺失，Xaa2优选Leu，Xaa3优选Dab，Xaa4优选Thr，Xaa5优选Dab，Xaa7优选Dab，Xaa8优选D-Phe或D-Leu，Xaa9优选Leu，Xaa10优选Dab，Xaa11优选Dab，和/或Xaa12优选Glu。
9.如项1-3任一项所述的多肽或其药用盐，所述多肽具有如下通式：
Figure GPA0000288009510000192
其中，R1为：脂肪族直链或支链C6-C20的酰基基团或缺失；
Xaa1为：Leu，Ala，AEEAc，Phe，IPhe，BrPhe，3FPhe或缺失；
Xaa2为：Leu，Ala，Arg，AEEAc或缺失；
Xaa3为：Dab，Ala，Leu，Orn或缺失；
Xaa4为：Thr，Ala，Dab或Lys；
Xaa5为：Dab，Lys，Orn，Ala或缺失；
Xaa7为：Dab，Ala，Lys，Orn或缺失；
Xaa8为：D-Leu，D-Phe，Lys或D-Ala；
Xaa9为：Leu或Ala；
Xaa10为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失；
Xaa11为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失。
10.如项9所述的多肽或其药用盐，所述R1选自庚酰基、甲基庚酰基、辛酰基、甲基辛酰基、壬酰基、甲基壬酰基、癸酰基、甲基癸酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、17-羧酸-十七烷酰基或缺失，优选为正辛酰基、癸酰基、月桂酰基、棕榈酰基、17-羧酸-十七烷酰基或缺失，更优选为正辛酰基或缺失；Xaa1优选Leu或缺失，Xaa2优选Leu，Xaa3优选Dab，Xaa4优选Thr，Xaa5优选Dab，Xaa7优选Dab，Xaa8优选D-Phe或D-Leu，Xaa9优选Leu，Xaa10优选Dab，Xaa11优选Dab。
11.如项1-4任一项所述的多肽或其药用盐，所述多肽是由R1-Leu-Dab-Thr-Dab-Xaa6-Dab-Xaa8-Leu-Dab-Dab-Glu所示的序列组成的肽或环肽，其中R1优选为正辛酰基、癸酰基、月桂酰基、棕榈酰基、17-羧酸-十七烷酰基或缺失，更优选为正辛酰基或缺失；Xaa6优选Lys或Dab，Xaa8优选D-Phe或D-Leu。
12.如项11所述的多肽或其药用盐，所述多肽是由H2N-Leu-Dab-Thr-Dab-Lys-Dab-D-Phe-Leu-Dab-Dab-Glu组成的肽或环肽。
13.如项12所述的多肽或其药用盐，所述多肽氨基酸序列如下：
Figure GPA0000288009510000201
14.如项1-4任一项所述的多肽或其药用盐，所述多肽是由R1-Dab-Thr-Dab-Xaa6-Dab-Xaa8-Leu-Dab-Dab-Glu所示的序列组成的肽或环肽，其中R1优选为正辛酰基、癸酰基、月桂酰基、棕榈酰基、17-羧酸-十七烷酰基或缺失，更优选为正辛酰基或缺失；Xaa6优选Lys或Dab，Xaa8优选D-Phe或D-Leu。
15.如项14所述的多肽或其药用盐，所述多肽是由正辛酰基-Dab-Thr-Dab-Lys-Dab-D-Phe-Leu-Dab-Dab-Glu组成的肽或环肽。
16.如项15所述的多肽或其药用盐，所述多肽氨基酸序列如下：
Figure GPA0000288009510000211
17.如项1-3所述的多肽或其药用盐，所述多肽的氨基酸序列与如下序列之一具有至少70％的序列同一性：
Figure GPA0000288009510000212
Figure GPA0000288009510000221
Figure GPA0000288009510000231
18.1-17任一项所述多肽或其药用盐的制备方法，包括：合成所述多肽。
19.如项18所述的方法，包括：
(1)在树脂上固相合成多肽；
(2)将步骤(1)的产物用强酸进行裂解；加入侧链保护基清除剂，过滤，用5-20倍体积的有机溶剂沉淀多肽，离心，有机溶剂洗涤沉淀，干燥，得到粗肽。
20.如项19所述的方法，所述步骤(1)是在液相环境中进行的，具体包括：
(a)浸泡树脂-脱除氨基保护基-洗涤-监测-偶联氨基酸-监测-洗涤-脱除氨基保护基-顺序偶联剩余氨基酸；
(b)树脂肽进一步环化。
21.如项20所述的方法，所述步骤(a)的液相环境所用溶剂选自：二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)，优选DMF；所述氨基保护基选自叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Z)或9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)，优选9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)。
22.如项20-21任一项所述的方法，所述步骤(a)中氨基酸的偶联需要加入偶联试剂，所述偶联试剂由：碳二亚胺型试剂或者苯并三氮唑鎓盐型试剂和1-羟基苯并三唑(HOBt)组成；优选为二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)，或2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)和1-羟基苯并三唑(HOBt)，进一步优选DIC(二异丙基碳二亚胺)和1-羟基苯并三唑(HOBt)。
23.如项20-22任一项所述的方法，所述步骤(b)环化氨基酸为Xaa6与Xaa12，通过其侧链氨基与羧基形成酰胺键而成环。
24.如项20-23任一项所述的方法，所述步骤(b)中成环采用的是正交保护策略，成环氨基酸侧链上的氨基保护基为烯丙氧羰基(Alloc)，羧基保护基为烯丙基(OAll)。
25.如项24所述的方法，所述步骤(b)包括脱氨基保护，脱去Alloc与OAll需要加入脱除剂，所述脱除剂为四(三苯基膦)钯(Pd(PPh3)4)。
26.如项25所述的方法，所述步骤(b)中还需要加入清除剂，清除剂选自H3N·BH3，Me2NH·BH3或PhSiH3，优选PhSiH3。
27.如项20-26任一项所述的方法，所述步骤(b)中环化反应需要加入偶联试剂，所述偶联试剂由碳二亚胺型试剂或叔胺型和苯并三氮唑鎓盐型试剂或吡啶三唑翁盐型组成；优选二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)，或2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)和1-羟基苯并三唑(HOBt)或N，N-二异丙基乙胺(DIEA)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)；进一步优选N，N-二异丙基乙胺(DIEA)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)。
28.如项20-27任一项所述的方法，所述步骤(1)还包括：(c)将步骤(b)得到的树脂肽连接脂肪酸链或多元脂肪酸链。
29.如项28所述的方法，所述步骤(c)在DMF溶剂中偶联剂作用下发生连接反应，所述偶联剂为二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)。
30.前述任一项权利要求所述的多肽或其药用盐的用途，其特征在于，用于抑菌、抗菌或制备抑菌、抗菌物质。
31.如项30所述的用途，所述抗菌物质为抗菌药物或抗菌剂。
32.如项31所述的用途，所述菌为细菌或真菌。
33.如项32所述的用途，所述细菌或真菌是鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumanii)，耐药鲍曼不动杆菌(drug resistant Acinetobacter baumanii)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，耐药铜绿假单胞菌(drug resistant Pseudomonasaeruginosa)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，大肠杆菌(E.coli)，和/或白色念珠菌(candida Albicans)中的一种或几种。
实施例一：Z18的制备与纯化
氨基酸序列：
Figure GPA0000288009510000241
(1)材料及试剂
Rink Amide MBHA树脂，取代值0.65mmol/g。
氨基酸为：Fmoc-Glu(OAll)-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH，Fmoc-D-Phe-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-D-Leu-OH，Fmoc-Lys(Alloc)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH
合成试剂：HOBt，DIC，DMF，DCM，哌啶，四(三苯基膦)钯，苯硅烷，二乙基二硫代氨基甲酸钠。
(2)仪器
PSI300型多肽合成仪、Waters600半制备型高效液相色谱仪、离心机。
(3)操作步骤(以0.15mmol为例)
a.固相化学合成多肽
称取Rink Amide MBHA树脂0.23g，置于多肽合成仪反应器中，加入10mlDMF，浸泡2h，加入20％PIP/DMF溶液10ml，混合30min脱除氨基保护基，DMF洗涤树脂7次；称取三倍量的Fmoc-Glu(OAll)-OH，DIC，HOBT加入10mlDMF溶解后，进行反应，反应温度为室温，以茚三酮反应监测反应进程，监测无色则为反应完成，用DMF洗涤树脂5次。当第一个氨基酸偶联到树脂上后，即可按照上述方法继续进行下一个氨基酸的偶联反应，如此循环，直至全部氨基酸偶联完成。向反应器中加入四(三苯基膦)钯与苯硅烷，其与树脂摩尔量之比为1∶0.1∶10，加入10mlDCM溶解后，在避光、N2保护条件下反应，温度为室温，以茚三酮反应进行检测，黑紫色视为反应完成，用DCM洗涤树脂5次，再以二乙基二氨基甲酸钠/DMF洗涤树脂3次，DMF洗涤5次，向反应器中加入以10ml DMF溶解的3倍量的HATU及6倍量DIEA进行反应，反应温度为室温，以茚三酮反应监测反应进程，监测无色则视为反应完成，用DMF洗涤树脂5次。最后加入20％PIP/DMF溶液10ml，混合30min脱除最后一个氨基酸末端Fmoc保护基。
b.裂解及沉淀
肽合成结束后，真空干燥树脂，称重。按照1ml裂解试剂/100mg树脂的比例加入裂解试剂，试剂配比为TFA∶茴香硫醚∶75％苯酚∶水＝85∶5∶5∶5(V∶V∶V∶V)，室温搅拌反应3小时，抽滤。向裂解抽滤液中加入10倍体积的冰乙醚沉淀多肽，离心，弃上清后，以冰乙醚反复洗涤沉淀4～5次，真空干燥，称重粗肽。
c.分离纯化
用半制备型RP-HPLC，对粗肽进行纯化。
1.纯化
色谱柱：YMC-pack ODS-AQ C18制备柱(10mm×250mm，10μm)
流速：5ml/min
检测波长：215nm
流动相：A相：0.1％TFA/水溶液
B相：0.1％TFA/乙腈
梯度洗脱程序如表3：
表3 梯度洗脱表
Figure GPA0000288009510000251
2.分析方法
色谱柱：YMC-pack ODS-AQ C18分析柱(4.6mm×250mm，5μm)
流速：1ml/min
检测波长：215nm
流动相：A相：0.05％TFA/水
B相：0.05％TFA/乙腈
梯度洗脱程序如表4：
表4 梯度洗脱表
Figure GPA0000288009510000261
收集纯度大于95％的目标组分，低压旋蒸，冷冻干燥。经ESI-MS进行分子量确证，m/z＝1232.05(M+H)+与理论分子量为1231.32相符。
实施例二：Z29的制备与纯化
氨基酸序列：
Figure GPA0000288009510000262
(1)材料及试剂
Rink Amide MBHA树脂，取代值0.65mmol/g。
氨基酸为：Fmoc-Glu(OAll)-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH，Fmoc-D-Phe-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-D-Leu-OH，Fmoc-Lys(Alloc)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH
合成试剂：HOBt，DIC，DMF，DCM，哌啶，四(三苯基膦)钯，苯硅烷，二乙基二硫代氨基甲酸钠，正辛酸。
(2)仪器
PSI300型多肽合成仪、Waters600半制备型高效液相色谱仪、离心机。
(3)操作步骤(以0.15mmol为例)
a.固相化学合成多肽
称取Rink Amide MBHA树脂0.23g，置于多肽合成仪反应器中，加入10mlDMF，浸泡2h，加入20％PIP/DMF溶液10ml，混合30min脱除氨基保护基，DMF洗涤树脂7次；称取三倍量的Fmoc-Glu(OAll)-OH，DIC，HOBT加入10mlDMF溶解后，进行反应，反应温度为室温，以茚三酮反应监测反应进程，监测无色则为反应完成，用DMF洗涤树脂5次。当第一个氨基酸偶联到树脂上后，即可按照上述方法继续进行下一个氨基酸的偶联反应，如此循环，直至全部氨基酸偶联完成。向反应器中加入四(三苯基膦)钯与苯硅烷，其与树脂摩尔量之比为1∶0.1∶10，加入10ml DCM溶解后，在避光，N2保护条件下反应，温度为室温，以茚三酮反应进行检测，黑紫色视为反应完成，用DCM洗涤树脂5次，再以二乙基二氨基甲酸钠/DMF洗涤树脂3次，DMF洗涤5次，向反应器中加入以10ml DMF溶解的3倍量的HATU及6倍量DIEA进行反应，反应温度为室温，以茚三酮反应监测反应进程，监测无色则视为反应完成，用DMF洗涤树脂5次。最后加入20％PIP/DMF溶液10ml，混合30min脱除最后一个氨基酸末端Fmoc保护基。称取三倍量的正辛酸，DIC，HOBT加入10mlDMF溶解后，进行反应，反应温度为室温，以茚三酮反应监测反应进程，监测无色则为反应完成，用DMF洗涤树脂5次。
b.裂解及沉淀
肽合成结束后，真空干燥树脂，称重。按照1ml裂解试剂/100mg树脂的比例加入裂解试剂，试剂配比为TFA∶茴香硫醚∶75％苯酚∶水＝85∶5∶5∶5(V∶V∶V∶V)，室温搅拌反应3小时，抽滤。向裂解抽滤液中加入10倍体积的冰乙醚沉淀多肽，离心，弃上清后，以冰乙醚反复洗涤沉淀4～5次，真空干燥，称重粗肽。
c.分离纯化
用半制备型RP-HPLC，对粗肽进行纯化。
1.纯化
色谱柱：YMC-pack ODS-AQ C18制备柱(10mm×250mm，10μm)
流速：5ml/min
检测波长：215nm
流动相：A相：0.1％TFA/水溶液
B相：0.1％TFA/乙腈
梯度洗脱程序如表5：
表5 梯度洗脱表
Figure GPA0000288009510000271
Figure GPA0000288009510000281
2.分析方法
色谱柱：YMC-pack ODS-AQ C18分析柱(4.6mm×250mm，5μm)
流速：1ml/min
检测波长：215nm
流动相：A相：0.05％TFA/水
B相：0.05％TFA/乙腈
梯度洗脱程序如表6：
表6 梯度洗脱表
Figure GPA0000288009510000282
收集纯度大于95％的目标组分，低压旋蒸，冷冻干燥。经ESI-MS进行分子量确证，m/z＝606.25(M+2H)2+与理论分子量1210.34相符。
实施例三：表7中其余CAMP系列抗菌肽的制备及纯化
(1)材料及试剂
Rink Amide MBHA树脂，取代值0.65mmol/g。
氨基酸为：Fmoc-Glu(OAll)-OH，Fmoc-Asp(OAll)-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-D-Leu-OH，Fmoc-D-Phe-OH，Fmoc-Lys(Alloc)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Orn(Boc)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Phe(4-CF3)-OH，Fmoc-Phe(4-Br)-OH，Fmoc-Phe(4-I)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-D-Ala-OH，Fmoc-AEEA-OH，
试剂：HOBt，DIC，DMF，哌啶，正辛酸，癸酸，月桂酸，棕榈酸，十八烷二酸叔丁基单酯。
(2)仪器
PSI300型多肽合成仪、Waters600半制备型高效液相色谱仪、Q-Tof MicroYA019型质谱仪，磁力搅拌器。
(3)操作步骤(以0.15mmol为例)
以类似实施例1中操作步骤a-c的方法制备及纯化表7中的多肽，若为带脂肪链多肽则按照实施例2中的操作步骤a-c进行制备，收集纯度大于95％的部分，旋蒸，冷冻干燥。ESI-MS测定值如表7所示。
表7 多黏菌素类似物及其分子量
Figure GPA0000288009510000291
Figure GPA0000288009510000301
实施例四：体外抗菌活性测定
根据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的微量肉汤稀释法测定各抗菌肽的最低抑菌浓度(MIC)，细菌培养基采用Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基，白色念球菌培养基采用Hyclone改良型RPMI-1640培养基。
具体步骤为：
(1)抗菌药物贮存液制备：
精确配制浓度为320μg/ml的上述抗菌肽和80μg/ml阳性对照品两性霉素B、硫酸多黏菌素E及盐酸万古霉素。配制好的各贮存液置于-20℃环境中保存备用。
(2)培养基的配制：
称取MH肉汤培养基21g，溶于蒸馏水中并定容至1L，121℃高温灭菌30min。
(3)接种物的制备：
用接种环挑取形态相似待检菌落3～5个，接种于4～5ml的MH肉汤中，35℃孵育12～16h。处于对数生长期得到菌液用MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1～2×108CFU/ml。用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶1000稀释后备用。
(4)稀释抗菌药物的制备及菌液接种：
取一块96孔板，在第1孔中加入160μL MH肉汤，第2-12孔中各加入100μL MH肉汤，然后向第1孔加入抗菌药物原液(320μg/ml)40μL，混匀，接着吸取100μL至第2孔，混匀后再从第2孔中吸取100μL至第3孔，如此连续倍比稀释至第10孔，并从第10孔中吸取100μL弃去，然后向第1-10孔及第12孔中加入上述制备好的接种物各100μL，使每孔最终菌液浓度约为0.5×105CFU/ml。第1-10孔药物浓度分别为32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml，第11孔为不含抗菌药物及接种物的空白对照，第12孔为不含抗菌药物的阴性对照。
(5)孵育
接种细菌的96孔板置于35℃普通空气孵箱中孵育16～20h，接种真菌的96孔板置于28℃空气孵箱中孵育40～50h。
(6)结果
以肉眼观察，无细菌生长的最低药物浓度即为该样品的最低抑菌浓度(MIC)。各抗菌肽的MIC测定结果如表8所示。
根据本发明所公开的内容，在此所公开并要求保护的所有组合物和/或方法均无需进行过多实验即可进行制备和实施。虽然根据优选实施方案对本发明的组合物和方法进行了描述，但对本领域技术人员而言，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可对在此所述的组合物和/或方法以及所述方法的步骤或步骤的顺序进行改变。
本文所引用的所有文献的公开内容通过引用结合于此，引用程度为，他们提供示例性的、程序上和其他的细节补充本文所述内容。
表8 多黏菌素类似物MIC结果
Figure GPA0000288009510000311
Figure GPA0000288009510000321
实施例五：半数致死量测定
半数致死量(Median Lethal Dose)，简称LD50，是指能杀死一半试验对象的有害物质或辐射的接触剂量，是描述有害物质或辐射的毒性的常用参数。LD50通常以有害物质的质量和试验生物体重之比表征，可以用来比较不同物质的相对毒性。
具体步骤为：
(1)实验动物选择与培养
ICR小鼠，雄性，体重20-22g，来自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。小鼠分笼饲养于20±2℃明暗各12小时的动物实验室内，实验动物自由饮水和进食。按体重随机分组。
(2)受试物的制备
准确称量CTAMP43、ZAMP18及多黏菌素E，加氯化钠注射液配制成含样品10mg/ml的溶液，-20℃冷藏备用。
(3)给药途径及给药容积
按照受试药物推荐的临床研究的给药途径，采用静脉给药，给药体积10ml/kg。
(4)实验方法
实验前先用少量小鼠进行预实验，测出该受试物引起0％和100％死亡率的致死剂量范围后，再进行正式试验。正式试验组数为5个剂量组，每组动物数10只。
(5)预实验
取一只小鼠，静脉注射给予受试样品5mg/kg(给药体积0.2ml)。20s左右完成注射，若动物没有死亡，则另取一只小鼠，给予更高剂量。若动物死亡或出现濒死状态另取一只，给予更低剂量。动物存活的剂量将数量补足至3只，观察动物的存活状态。找到0％和100％死亡剂量。
(6)正式试验
在0％及100％致死剂量范围内，设定组间剂量比，组数为5组，每组动物数为10只。观察并记录给药后动物的即时反应。监测体重变化，记录给药后动物状态。若出现动物死亡，应进行记录，至给药后7天结束实验，并处死所有动物。根据实验结果，求出LD50。
(7)结果
本试验对活性较强的CTAMP43、ZAMP18的LD50进行测定，并与硫酸多黏菌素E对比，试验结果如下表9。结果显示CTAMP43与ZAMP18的LD50分别为34.6mg/kg、35.0mg/kg，而硫酸多黏菌素E的LD50为9.3-10mg/ml，这说明CTAMP43与ZAMP18的毒性比多黏菌素E低3-4倍。
表9 半数致死量测定结果
Figure GPA0000288009510000331
根据本发明所公开的内容，虽然根据优选实施方案对本发明的组合物和方法进行了描述，但对本领域技术人员而言，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可对在此所述的组合物和/或方法以及所述方法的步骤或步骤的顺序进行改变。
本文所引用的所有文献的公开内容通过引用结合于此，引用程度为，他们提供示例性的、程序上和其他的细节补充本文所述内容。

Claims (2)

1.一种多肽或其药用盐，所述多肽为下式所示的序列：
Figure FDA0003415713430000011
2.权利要求1所述的多肽或其药用盐在制备抗革兰氏阴性菌或抗耐药菌的物质中的用途。
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