CN112300250B

CN112300250B - 阿尼芬净类似物及其制备方法

Info

Publication number: CN112300250B
Application number: CN202010698746.XA
Authority: CN
Inventors: 冯军; 东圆珍; 张喜全; 朱冰; 徐宏江; 李亚楠
Original assignee: Shanghai Duomirui Biological Technology Co ltd; Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: Shanghai Duomirui Biological Technology Co ltd; Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2019-07-31
Filing date: 2020-07-20
Publication date: 2024-03-19
Anticipated expiration: 2040-07-20
Also published as: CN112300250A

Abstract

本发明涉及一种阿尼芬净类似物及其制备方法。具体而言涉及到改善阿尼芬净溶解性，降低阿尼芬净毒性的一系列阿尼芬净类似物，及其合成制备。

Description

阿尼芬净类似物及其制备方法

技术领域

本发明属于化学领域，涉及到阿尼芬净类似物及其制备方法与应用，具体而言涉及到一系列阿尼芬净类似物的合成制备。

背景技术

近些年来由于器官移植手术导致免疫抑制剂的大量使用，广谱抗生素及肾上腺皮质激素使用增加，再加上肿瘤化疗和其他更具侵袭性的医疗方法的应用等多种原因造成免疫低下患者的数量大幅增长，真菌感染发病率显著升高，尤其是深部真菌感染的发病率和病死率逐年增加，已经严重威胁到人类健康。棘白菌素B类是21世纪初开发的新型药物，具有全新的作用机理，抗真菌谱广，无交叉耐药性，无因其本身作用机制而引发的明显不良反应，是迄今为止安全性最高的一种抗真菌药物，是目前用于治疗真菌感染比较理想的药物。

早在1974年人们首次从构巢曲霉菌培养液中分离纯化得到了棘白菌素B(Echinocandin B，ECB)，确定了其是由21元环状六肽母核和一条亚油酰基侧链构成的环状脂肽，并且检测到ECB对部分念珠菌属和曲霉菌属有较强的“杀菌”活性，但同时也存在抗菌谱窄、水溶性差以及溶血毒性等较多缺陷限制了其应用。针对上述不足人们进行了结构改造，通过全合成或者通过对天然产生的前体进行合成修饰得到了许多半合成棘白菌素类化合物。

目前已批准上市的半合成棘白菌素类化合物有三种，分别是卡泊芬净(Caspofungin)、米卡芬净(Micafungin)以及阿尼芬净(Anidulafungin)，其中阿尼芬净是由棘白菌素B通过半合成得到，抗菌谱更宽，毒副作用更低，且半衰期更长。其对白色念珠菌、光滑念珠菌、烟曲霉菌、皮炎芽生茵和荚膜组织胞浆菌等分离株都有效，而且适用于对唑类和两性霉素B耐药的菌株，在2006年被FDA批准上市，用于治疗念珠菌感染(腹腔内脓肿和腹膜炎)和食管念珠菌病。虽然阿尼芬净在临床上效果较好，但是仍存在水溶性较差，生物利用度不高等问题。目前阿尼芬净仅可通过静脉给药，患者顺应性较差，且存在肝功能异常的风险，以及静注过快易引起超敏反应等副作用。

发明内容

本发明涉及阿尼芬净类似物及其制备方法与应用，具体而言涉及到改善阿尼芬净溶解性，降低阿尼芬净毒性，得到的一系列阿尼芬净类似物的合成制备。

在一个方面，本发明提供一种阿尼芬净类似物，具有如下结构通式[I]：

其中：

R₂可以为羟基、N,N,N-三甲基季铵基乙氧基或(2-氨基乙基)氨基，

在本发明的一些方案中，T可表示为通式-CO-Xaa₁-(Xaa₂)_n-R₁，其中Xaa₁为芳香性氨基酸，Xaa₂为极性带正电荷氨基酸，n为0,1,2,3,4中的一个数字，R₁为脂肪酰基侧链。

在一些方案中，Xaa₁选自苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、组氨酸(His)、脯氨酸(Pro)、4-氯苯丙氨酸(4-Cl-Phe)、4-氟苯丙氨酸(4-F-Phe)、4-溴苯丙氨酸(4-Br-Phe)、4-碘苯丙氨酸(4-I-Phe)、4-氨基苯丙氨酸(4-NH₂-Phe)、4-硝基苯丙氨酸(4-NO₂-Phe)、4-甲氧基苯丙氨酸(4-MeO-Phe)、4-三氟甲基苯丙氨酸(4-CF₃-Phe)、3,4-二氟苯丙氨酸(Phe(3,4-F₂))、3,4-二氯苯丙氨酸(Phe(3,4-Cl₂))、3,4-二甲氧基苯丙氨酸(Phe(3,4-MeO₂))、4,4'-联苯丙氨酸(BIP)、2,3,4,5,6-五氟苯丙氨酸(Phe(2,3,4,5,6-F₅))、2-噻吩基丙氨酸(Thi)、3-(2-萘基)-丙氨酸(2-Nal)中的一种或缺失。在一些方案中，Xaa₁优选为苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、4-氯苯丙氨酸(4-Cl-Phe)、4-氟苯丙氨酸(4-F-Phe)、4,4'-联苯丙氨酸(BIP)、2,3,4,5,6-五氟苯丙氨酸(Phe(2,3,4,5,6-F₅))或3-(2-萘基)-丙氨酸(2-Nal)中的一种。在一些方案中，Xaa₁更优选为3-(2-萘基)-丙氨酸(2-Nal)。

在一些方案中，Xaa₂选自赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、鸟氨酸(Orn)、2,3-二氨基丙酸(Dap)、2,4-二氨基丁酸(Dab)、2-氨基异丁酸(Aib)中的一种或几种或缺失。在一些方案中，Xaa₂优选为鸟氨酸(Orn)或2,4-二氨基丁酸(Dab)。在一些方案中，Xaa₂更优选为2,4-二氨基丁酸(Dab)。

在一些方案中，n优选为0，1，2中的一个数字，更优选为1。

在一些方案中，R₁选自庚酰基、氨基庚酰基、辛酰基、氨基辛酰基、壬酰基、氨基壬酰基、癸酰基、氨基癸酰基、十一烷酰基、氨基十一烷酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、十八烷酰基、对戊氧基三联苯甲酰基中的一种或几种或缺失。

在另一个方面，本发明提供一种阿尼芬净类似物，具有如下结构通式[I]：

其中，R₂可以为羟基、N,N,N-三甲基季铵基乙氧基或(2-氨基乙基)氨基，T选自以下结构：

1)-CO-2-Nal-Dab-C₁₂；

2)-CO-2-Nal-Dab-Dab-C₁₂；

3)-CO-Dab-对戊氧基三联苯甲酰基；

4)-CO-4-F-Phe-Dab-C₁₂；

5)-CO-Phe(2,3,4,5,6-F₅)-Dab-C₁₂。

本发明所涉及的多肽的氨基酸残基包括天然氨基酸和非天然氨基酸，其中涉及的天然氨基酸所对应的三字母代码如表1所示，所涉及到的非天然氨基酸及其所对应的字母代码和结构如表2所示。

表1：天然氨基酸三字母代码表

表2：非天然氨基酸及脂肪酸代码与结构表

其中，C₇-C₁₈还可以表示为脂肪酸对应的酰基。

本发明的一个方案中，阿尼芬净类似物是在棘白菌素B母核(ECBN)上进行修饰，其结构通式为ECBN-T，其中T又可表示为-CO-Xaa₁-(Xaa₂)_n-R₁，其中Xaa₁优选为苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、4-氯苯丙氨酸(4-Cl-Phe)、4-氟苯丙氨酸(4-F-Phe)、4,4'-联苯丙氨酸(BIP)、2,3,4,5,6-五氟苯丙氨酸(Phe(2,3,4,5,6-F₅))、3-(2-萘基)-丙氨酸(2-Nal)中的一种；Xaa₂优选为鸟氨酸(Orn)或2,4-二氨基丁酸(Dab)，n优选为0,1,2中的一个数字；R₁优选为月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、十八烷酰基、对戊氧基三联苯甲酰基中的一种。

本发明提供一类阿尼芬净类似物，具体结构如下：

1)

2)

3)

4)

5)

本发明专利中，阿尼芬净类似物具有较好的抑菌活性，同时其水溶性也较好。侧链与棘白菌素B母核结构中4，5-二羟基鸟氨酸片段中的氨基以酰胺键的形式进行偶联，该酰胺键不容易被酶水解，在体内较稳定。

本发明的另一方面，提供了一系列具有通式[I]结构的阿尼芬净类似物的制备方法，

其中：

T可表示为通式-CO-Xaa₁-(Xaa₂)_n-R₁，其中Xaa₁为芳香性氨基酸，Xaa₂为极性带正电荷氨基酸，n为0,1,2,3,4中的一个数字，R₁为脂肪酰基侧链，所述方法包括四个步骤：合成所述多肽、多肽活化、阿尼芬净类似物合成、保护基脱除。

在一些方案中，合成所述阿尼芬净类似物采用固相合成技术，包括：

(1)在树脂上固相合成多肽；

(2)将步骤(1)的产物用弱酸进行裂解，过滤，旋蒸，并用有机试剂溶解多肽，旋蒸，重复3-4次；用5-20倍体积的有机溶剂沉淀多肽，离心，有机溶剂反复洗涤沉淀，干燥，得到粗肽。

任选地，所述步骤(1)包括如下步骤：

(a)浸泡树脂—投料(首个氨基酸及高位阻碱)—测定树脂取代值—脱除氨基保护基—洗涤—监测—偶联氨基酸—监测—洗涤—脱除氨基保护基—顺序偶联剩余氨基酸—直到最后一个氨基酸脱除氨基保护基并洗涤；

(b)最后偶联R₁—监测—洗涤。

其中，步骤(a)中所述氨基保护基是指为保护参与缩合反应的氨基而引入的化学基团。所述的氨基保护基包括但不限于叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Z)或9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)，优选9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)。所述保护基包括但不限于此，可根据具体情况进行合理选择。

本发明所述阿尼芬净类似物合成中，对部分氨基酸的侧链可以引入化学基团进行保护，例如Arg可以采用五甲基苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)保护；Dab、Orn、Dap、Lys可以采用叔丁氧羰基(Boc)、烯丙氧羰基(Alloc)保护。所述保护基包括但不限于此，可根据具体情况进行合理选择。

所述步骤(a)的液相环境所用溶剂选自：二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)，优选DMF及DCM。

所述步骤(a)的测定树脂取代值，即分别取适量的偶联上首个氨基酸的树脂(W)于两个EP管中，干燥，称重，再分别加入适量脱保护基试剂脱除氨基保护基，取适量反应液加入过量有机溶剂中(设定稀释倍数为S)，测定301nm的吸光值A，取代值(SD)公式为：SD_＝A₃₀₁*S/(7800*W_mg)。

所述步骤(a)中脱除氨基保护基需要加入氨基保护基的脱除剂，氨基保护基的脱除剂选用哌啶(PIP)溶液，浓度10-40％(PIP/DMF)，脱除时间为20-50min；优选浓度为20-25％(PIP/DMF)，脱除时间25-35min。

所述步骤(a)中氨基酸的偶联需要加入偶联试剂，偶联试剂由：碳二亚胺型试剂或者苯并三氮唑鎓盐型试剂和1-羟基苯并三唑(HOBt)组成。

所述碳二亚胺型试剂包括但不限于二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)或N-二氨基丙基-N-乙基碳二亚胺(EDC)。

所述苯并三氮唑鎓盐型试剂包括但不限于2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、O-苯并三唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷(BOP)或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)。

所述偶联试剂优选DIC和HOBt，或TBTU和HOBt，进一步优选DIC和HOBt。

所述步骤(a)中的“监测”采用茚三酮检测法监测多肽的缩合反应。

所述步骤(a)中的顺序连接氨基酸是指根据多肽氨基酸序列从C端向N端逐个连接氨基酸。

所述步骤(b)中的偶联R₁是将步骤(a)所得多肽中氨基与脂肪酸羧基形成酰胺键，所述偶联试剂优选DIC和HOBt，或TBTU和HOBt，进一步优选DIC和HOBt。

所述步骤(2)中的弱酸切割包括但不限于三氟乙醇，并与二氯甲烷按1:4(V/V)进行配制所得。

所述步骤(2)中的溶解多肽的有机试剂包括但不限于DCM、乙腈(ACN)、无水乙醇、四氢呋喃(THF)、甲醇、NMP，优选试剂视多肽溶解情况而定。

所述步骤(2)中的沉淀多肽的有机试剂包括但不限于无水乙醚。

在一些方案中，本发明制备方法中所述多肽活化主要为多肽结构中羧基的活化，活化方法可选自碳二亚胺法、混合酸酐法、活化酯法、迭氮物法等，优选为反应条件温和且产物较稳定的活化酯法。

在一些方案中，本发明制备方法中所述多肽活化步骤中，活化酯法所用的活化试剂包括：碳二亚胺型试剂或者苯并三氮唑鎓盐型试剂和HOBt或琥珀酰亚胺(HOSU)。所述碳二亚胺型试剂包括但不限于DCC、DIC或EDC。所述苯并三氮唑鎓盐型试剂包括但不限于TBTU、HBTU、BOP或PyBOP。在一些方案中，活化酯法所用的活化试剂优选DCC和HOSU。

活化酯法反应所用的溶剂优选有机溶剂，包括但不限于DMF、DCM、NMP、ACN、无水乙醇、THF、甲醇，优选溶剂视反应多肽的溶解情况所定，需将该多肽完全溶解，更优选同所述步骤(2)中的溶解多肽的有机试剂。

所述多肽活化步骤中，反应结束需经过滤、萃取等步骤除去未反应完全的原料，旋蒸后得到多肽活化酯。

在一些方案中，阿尼芬净类似物的合成以多肽活化酯和棘白菌素B母核为原料，在有机溶剂、室温条件下反应1-2h。

所述阿尼芬净类似物的合成中，有机试剂包括但不限于DMF。

所述阿尼芬净类似物的合成中，较优地，加入催化剂量的高位阻碱，有利于反应完全，所述高位阻碱试剂包括但不限于N,N-二异丙基乙胺(DIEA)。

在一些方案中，保护基脱除主要指多肽侧链中氨基保护基的脱除。所述多肽侧链中氨基保护基，包括但不限于叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Z)或9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)、烯丙氧羰基(Alloc)、三苯甲基(Trt)，优选为烯丙氧羰基(Alloc)。

所述脱除氨基保护基烯丙氧羰基(Alloc)中，反应溶剂为有机溶剂，优选为DMF、DCM。

所述脱除氨基保护基烯丙氧羰基(Alloc)中，使用的脱除剂为四(三苯基膦)钯((Pd(PPh ₃)₄)。

所述脱除氨基保护基烯丙氧羰基(Alloc)中，需要加入清除剂，清除剂可选用氨硼烷(H₃N·BH₃)、二甲胺基甲硼烷(Me₂NH·BH₃)或苯硅烷(PhSiH₃)，优选苯硅烷(PhSiH₃)。

特别有益的是为满足医药用途的质量要求，本发明所提供的阿尼芬净类似物的制备方法还可以进一步包括纯化步骤。所采用的纯化方法包括但不限于反相色谱法或离子交换色谱法，优选反相色谱法。

本发明所涉及阿尼芬净类似物的体外抗菌活性可以通过测定其最低抑菌浓度(MIC)来鉴定。美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐采用微量肉汤稀释法来测定各抗菌肽的最低抑菌浓度(MIC)，培养基采用改良型RPMI-1640培养基。以阿尼芬净作为阳性对照，体外活性测定表明，本发明提供的阿尼芬净类似物具有较好的抗白色念珠菌、抗克柔念珠菌活性。

本发明专利中，图一为阿尼芬净的化学结构，此结构中包含了一个21元环状六肽母核和一条对戊氧基三联苯甲酰基侧链构成的环状脂肽，其对白色念珠菌、光滑念珠菌、烟曲霉菌、皮炎芽生茵和荚膜组织胞浆菌等分离株均有显著的抗菌活性，而且适用于对唑类和两性霉素B耐药的菌株，但是仍存在水溶性较差的问题。

本发明专利中，图二为21元环状六肽母核即棘白菌素B母核(ECBN)结构，具体而言是由3-羟基脯氨酸、3，4-二羟基高酪氨酸、3-羟基-4-甲基脯氨酸、4，5-二羟基鸟氨酸以及2个苏氨酸组成。图中红色边框所示氨基即为酰基侧链偶联位置。

本发明专利中，图三为包含T的ECBN-T整体化学结构，红色边框所示部分为母核结构中4，5-二羟基鸟氨酸片段，T通过酰胺键与棘白菌素B母核结构中4，5-二羟基鸟氨酸片段中的氨基进行偶联，该酰胺键不容易被酶水解，在体内较稳定。

本发明专利中，图四为阿尼芬净类似物合成总路线图，以ECBN-Dab-对戊氧基三联苯甲酰基为例进行说明。

定义

除非另有说明，本申请中所用的下列术语具有下列含义。一个特定的术语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照本领域普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。

术语“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可以发生或不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。例如，乙基“任选”被卤素取代，指乙基可以是未被取代的(CH₂CH₃)、单取代的(如CH₂CH₂F)、多取代的(如CHFCH₂F、CH₂CHF₂等)或完全被取代的(CF₂CF₃)。本领域技术人员可理解，对于包含一个或多个取代基的任何基团，不会引入任何在空间上不可能存在和/或不能合成的取代或取代模式。

术语“被取代的”是指特定原子上的任意一个或多个氢原子被取代基取代，只要特定原子的价态是正常的并且取代后的化合物是稳定的。当取代基为酮基(即＝O)时，意味着两个氢原子被取代，酮取代不会发生在芳香基上。

本文中的数字范围，是指给定范围中的各个整数。例如“C_1-6”是指该基团可具有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子或6个碳原子。

本申请还包括与本文中记载的那些相同的，但一或多个原子被原子量或质量数不同于自然中通常发现的原子量或质量数不同的原子置换的同位素标记的本申请化合物。可结合到本申请化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、碘和氯的同位素，诸如分别为²H、³H、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹³N、¹⁵N、¹⁵O、¹⁷O、¹⁸O、³¹P、³²P、³⁵S、¹⁸F、¹²³I、¹²⁵I和³⁶Cl等。

某些同位素标记的本申请化合物(例如用³H及¹⁴C标记的那些)可用于化合物和/或底物组织分布分析中。氚化(即3H)和碳-14(即14C)同位素对于由于它们易于制备和可检测性是尤其优选的。此外，用较重同位素(诸如氘(即2H))取代可以提供某些由更高的代谢稳定性产生的治疗优点(例如增加的体内半衰期或降低的剂量需求)，并且因此在某些情形下可能是优选的。正电子发射同位素，诸如15O、13N、11C和18F可用于正电子发射断层扫描(PET)研究以测定底物占有率。通常可以通过与公开于下文的方案和/或实施例中的那些类似的下列程序，通过同位素标记试剂取代未经同位素标记的试剂来制备同位素标记的本申请化合物。

本申请的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本申请的实施例。

本申请具体实施方式的化学反应是在合适的溶剂中完成的，所述的溶剂须适合于本申请的化学变化及其所需的试剂和物料。为了获得本申请的化合物，有时需要本领域技术人员在已有实施方式的基础上对合成步骤或者反应流程进行修改或选择。

附图说明

附图1：阿尼芬净结构

附图2：棘白菌素B母核结构(ECBN)

附图3：阿尼芬净类似物结构通式(ECBN-T)

附图4：反应路线图(以ECBN-Dab-对戊氧基三联苯甲酰基为例)

具体实施方案

以下实施例仅代表本发明阐述的一个方面，不是本发明主题的局限。

实施例一：ECB084的制备与纯化

侧链T结构：-CO-2-Nal-Dab-C₁₂

ECB084结构：

(1)材料及试剂

2-CTC树脂，取代值1.08mmol/g。

氨基酸为：Fmoc-2-Nal-OH、Fmoc-Dab(Alloc)-OH，月桂酸

合成试剂：HOBt，DIC，DMF，DCM，哌啶，TFE，HATU，DIEA，四(三苯基膦)钯，苯硅烷。

(2)仪器

CS-BIO型多肽合成仪、Waters600半制备型高效液相色谱仪、Beckman离心机、Buchi旋蒸仪。

(3)操作步骤(以0.4mmol为例)

a.固相化学合成多肽

称取2-CTC树脂0.37g，置于多肽合成仪反应器中，加入10ml DCM，浸泡1h；称取2-3倍量的Fmoc-2-Nal-OH及吸取4-6倍量的DIEA，加入10ml DCM溶解后，投入反应器中进行反应，反应温度为室温，反应时间2小时，此时即第一个氨基酸偶联到树脂上，然后用DCM洗涤树脂6次，测定此时树脂的取代值(SD)；随后加入20％PIP/DMF溶液10ml，混合30min脱除氨基保护基，DCM洗涤树脂6次，此时茚三酮检测为蓝紫色；偶联第二个氨基酸，称取3倍量的Fmoc-Dab(Alloc)-OH、HOBt及吸取3倍量的DIC，加入10ml DMF/DCM(1:1)混合溶剂溶解后，进行反应，反应温度为室温，以茚三酮反应监测反应进程，监测无色则为反应完成，用DCM洗涤树脂6次。随后称取3倍量的月桂酸、HOBt及DIC，加入10ml DMF/DCM(1:1)混合溶剂并投入反应器中进行反应，反应温度为室温，以茚三酮反应监测反应进程，监测无色则为反应完成，最后用DCM洗涤树脂6次。

b.裂解及沉淀

多肽合成结束后，真空干燥树脂，称重。按照10ml裂解试剂/1g树脂的比例加入裂解试剂，试剂配比为TFE:DCM＝1:4(V:V)，室温搅拌反应1.5小时，抽滤，滤液旋蒸至干，向旋蒸瓶中加入10ml DCM，再次旋蒸至干，反复进行2-3次，最后加入3ml DCM溶解多肽，转移至离心管中加入30ml冰乙醚，-20℃环境放置30min，离心，弃去上清后，以冰乙醚反复洗涤沉淀3～4次，真空干燥，称重粗肽。

c.液相反应制备阿尼芬净类似物

称取干燥后的粗肽0.1mmol、HOSU 0.12mmol、DCC0.12mmol，加入4ml DCM，室温下反应2h，过滤除去部分副产物DCU，旋蒸除去DCM，向旋蒸瓶加入20ml乙酸乙酯洗涤并过滤，滤液旋蒸至干，用3ml DCM溶解活化酯，加入30ml冰乙醚，-20℃环境放置30min，离心，弃去上清后，以冰乙醚反复洗涤沉淀3～4次，真空干燥得到固体并进行称重。用少量DMF进行溶解，得到侧链活化酯溶液。

按照活化酯：ECBN：DIEA＝1:1:1的比例投料，反应体系为DMF，反应时间为1h，反应结束后加入10倍量冰乙醚沉淀，离心，并以冰乙醚反复洗涤沉淀3～4次，真空干燥得到固体并进行称重。

分别称取ECB反应物、四(三苯基膦)钯、苯硅烷，并以摩尔比1:0.1:10的比例投料，以少量DMF为溶剂，室温避光反应1h后加入10倍量冰乙醚沉淀，离心后继续以冰乙醚反复洗涤沉淀3～4次，真空干燥得到最终产物固体，称重。

d.分离纯化

用半制备型RP-HPLC，对粗肽进行纯化。

1.纯化

色谱柱：Galaksil C18制备柱(10mm×250mm,10μm)

流速：5ml/min

检测波长：215nm、280nm

流动相：A相：1％HAC/水

B相：1％HAC/乙腈

梯度洗脱程序如表3:

表3梯度洗脱表

2.分析

用Thermo U3000型HPLC，对收集产物进行分析

色谱柱：Kromasil C18分析柱(4.6mm×250mm,5μm)

流速：1ml/min

检测波长：210nm

流动相：A相：0.1％TFA/水

B相：0.1％TFA/乙腈

梯度洗脱程序如表4:

表4梯度洗脱表

收集纯度大于90％的目标组分，旋蒸除去乙腈，真空冷冻干燥。经ESI-MS进行分子量确证，M/Z＝1277.68(M+H)⁺与理论分子量相符。

实施例二：ECB076的制备与纯化

侧链T结构：-CO-2-Nal-Dab-Dab-C₁₂

ECB076结构：

/>

(1)材料及试剂

2-CTC树脂，取代值1.08mmol/g。

氨基酸为：Fmoc-2-Nal-OH、Fmoc-Dab(Alloc)-OH，月桂酸

(2)仪器

(3)操作步骤(以0.4mmol为例)

a.固相化学合成多肽

称取2-CTC树脂0.37g，置于多肽合成仪反应器中，加入10ml DCM，浸泡1h；称取2-3倍量的Fmoc-2-Nal-OH及吸取4-6倍量的DIEA，加入10ml DCM溶解后，投入反应器中进行反应，反应温度为室温，反应时间2小时，此时即第一个氨基酸偶联到树脂上，然后用DCM洗涤树脂6次，测定此时树脂的取代值(SD)；随后加入20％PIP/DMF溶液10ml，混合30min脱除氨基保护基，DCM洗涤树脂6次，此时茚三酮检测为蓝紫色；偶联第二个氨基酸，称取3倍量的Fmoc-Dab(Alloc)-OH、HOBt及吸取3倍量的DIC，加入10ml DMF/DCM(1:1)混合溶剂溶解后，进行反应，反应温度为室温，以茚三酮反应监测反应进程，监测无色则为反应完成，用DCM洗涤树脂6次。而后，即可按照上述偶联第二个氨基酸的方法继续进行下一个氨基酸的偶联反应。随后称取3倍量的月桂酸、HOBt及DIC，加入10ml DMF/DCM(1:1)混合溶剂并投入反应器中进行反应，反应温度为室温，以茚三酮反应监测反应进程，监测无色则为反应完成，最后用DCM洗涤树脂6次。

随后裂解沉淀、液相反应制备、分离纯化具体操作同实施例一。经ESI-MS进行分子量确证，M/Z＝1377.84(M+H)⁺与理论分子量相符。

实施例三：ECB071的制备与纯化

侧链T结构：-CO-Dab-对戊氧基三联苯甲酰基

ECB071结构：

制备过程如实施例1中所述的方法，经ESI-MS进行分子量确证，M/Z＝1240.68【M+H】⁺与理论分子量为相符。

实施例四：ECB093的制备与纯化

侧链T结构：-CO-4-F-Phe-Dab-C₁₂

ECB093结构：

制备过程如实施例1中所述的方法，经ESI-MS进行分子量确证，M/Z＝1245.60【M+H】⁺与理论分子量为相符。

实施例五：ECB094的制备与纯化

侧链T结构：-CO-Phe(2,3,4,5,6-F₅)-Dab-C₁₂

ECB094结构：

制备过程如实施例1中所述的方法，经ESI-MS进行分子量确证，M/Z＝1332.76【M+H】⁺与理论分子量为相符。

实施例六：体外抗菌活性测定

根据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的微量肉汤稀释法测定各抗菌肽的最低抑菌浓度(MIC)，细菌培养基采用Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基，所测菌株为白色念珠菌(Candida albicans，ATCC10231，中国药品生物制品检定所)、克柔念珠菌(Candidakrusei,ATCC6258，南京便诊生物科技有限公司)，其培养基均采用Hyclone改良型RPMI-1640培养基。

(1)抗菌药物贮存液制备：

分别精确配制浓度为320μg/ml的阿尼芬净类似物和阳性对照品阿尼芬净，配制好的各贮存液置于－20℃环境中保存备用。

(2)培养基的配制：

真菌生长培养基采用改良马丁培养基，具体配制方法如下：1L培养基中含有2％葡萄糖、0.2％酵母浸出粉、0.5％鱼粉蛋白胨、0.05％硫酸镁、0.1％磷酸氢二钾，按上述比例称取相应量的各物质，溶解于一定量纯净水之后，定容至1L，调pH至7.2，加入2％琼脂，121℃高温灭菌30min。

真菌MIC测试采用Hyclone改良型RPMI-1640培养基，具体配制方法如下：称取18.00g葡萄糖溶于一定量纯净水中，定容到500ml，115℃高温灭菌15min。在无菌环境中，向已灭菌的葡萄糖溶液中加入500ml RPMI-1640培养基，混合后4℃贮存备用。

(3)接种物的制备：

挑取在平板上生长48h的真菌单菌落，转接到改良型马丁培养基的斜面培养基上，28℃孵育24h，增菌后处于对数生长期的菌液用Hyclone改良型RPMI-1640液体培养基调整其浊度达到0.5麦氏标准，相当于每毫升含1×10⁶～5×10⁶CFU(colony-forming unit)，取此菌悬液用Hyclone改良型RPMI-1640液体培养基进行1：20稀释后，再进行1：50稀释作为待接种物，菌悬液浓度相当于1×10³～5×10³CFU/ml。

(4)稀释抗菌药物的制备及菌液接种：

取一块96孔板，在第1孔中加入160μl RPMI-1640液体培养基，第2-12孔中各加入100μl RPMI-1640液体培养基，然后向第1孔加入抗菌药物原液(320μg/ml)40μl，混匀，接着吸取100μl至第2孔，混匀后再从第2孔中吸取100μl至第3孔，如此连续倍比稀释至第10孔，并从第10孔中吸取100μl弃去，然后向第1-10孔及第12孔中加入上述制备好的接种物各100μl，使每孔最终菌液浓度约为2.5×10³CFU/ml。第1-10孔药物浓度分别为32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml，第11孔为不含抗菌药物及接种物的空白对照，第12孔为不含抗菌药物的阴性对照。

(5)孵育

接种真菌的96孔板置于28℃空气孵箱中孵育24h。

(6)结果

以肉眼观察，无真菌生长的最低药物浓度即为该样品的最低抑菌浓度(MIC)。

本发明对合成各类似物分别进行了白色念珠菌、克柔念珠菌的抗菌活性测定，各类似物的MIC测定结果如表5所示。

表5阿尼芬净及其类似物MIC结果

实施例七：阿尼芬净类似物溶解性的测定

本发明专利中，采用纯净水对阿尼芬净及阿尼芬净类似物的溶解性进行了测定，结果如表6：

表6阿尼芬净及其类似物溶解性结果

由表6可知，阿尼芬净溶解度极差，几乎不溶于水；在侧链结构中引入极性带正电荷氨基酸如Dab后，溶解度得到明显改善，同时也保留了化合物的抑菌活性。

实施例八：阿尼芬净类似物体外溶血活性测定

1.材料及试剂

无菌脱纤维羊血，NaH₂PO₄·2H₂O，Na₂HPO₄·12H₂O，NaCl，吐温80

2.仪器设备

Allegra X-22R型低温高速离心机，电子天平，微量移液器，SHP-150型生化培养箱，96well，酶标仪

3.实验方法

(1)PBS(磷酸缓冲盐生理盐水)缓冲液的配制

0.2mol/L NaH₂PO₄·2H₂O母液配制：准确称取NaH₂PO₄·2H₂O 3.12g，加纯净水搅拌溶解后，定容至100ml.

0.2mol/L Na₂HPO₄·12H₂O母液配制：准确称取Na₂HPO₄·12H₂O 14.32g，加纯净水搅拌溶解后，定容至200ml.

0.01mol/L pH7.4的PBS缓冲液：取100ml 0.2mol/L Na₂HPO₄·12H2O母液，用0.2mol/L NaH₂PO₄·2H₂O母液将其pH值调至7.4，量取50ml上述缓冲液用纯净水稀释20倍，再称取9.00g NaCl加入其中。

(2)受试物的制备

准确称量待检测的阿尼芬净及类似物样品，用0.5％吐温80-pH 7.4PBS缓冲液配制成浓度为1.28mg/ml的待测液，置于-20℃冷藏备用。准确称取阿尼芬净，首先用DMSO配置成5.12mg/ml，然后用pH 7.4的PBS缓冲液稀释成12.8μg/ml的待测液。

(3)羊血红细胞的处理

取无菌脱纤维羊血数毫升，加入约10倍量的pH 7.4的PBS缓冲液，摇匀，1500r/min离心15分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用pH 7.4的PBS缓冲液按照上述方法洗涤2-3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用pH 7.4的PBS缓冲液配成2％的混悬液，供试验用。

(4)溶血毒性测定步骤

取一块96孔板，在第2-10孔中加入100μl pH 7.4的PBS缓冲液，第11孔加入100μl0.5％吐温80-pH 7.4PBS缓冲液，在12孔加入100μl双蒸水。然后向第1孔加入抗菌药物原液(1.28mg/ml)100μl，混匀，接着吸取100μl至第2孔，混匀后再从第2孔中吸取100μl至第3孔，如此连续倍比稀释至第10孔，并从第10孔中吸取100μl弃去。然后向第1-10孔及第11孔中加入上述制备好的接种物各100μl 2％的红细胞混悬液，使每孔最终红细胞浓度约为1×10⁸CFU/ml。第1-10孔药物浓度分别为640μg/ml、320μg/ml、160μg/ml、80μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml，第11孔为含2％的红细胞混悬液的阴性对照，第12孔为含2％的红细胞混悬液的阳性对照。最后置于37℃的恒温箱中温育1h。

(5)孵育

温育1h后，取出96well，1500r/min离心15分钟，取上清用酶标仪测定540nm处的吸光值。按照下列公式计算溶血率，其中阴性对照为0.5％吐温80-pH 7.4PBS缓冲液，阳性对照为双蒸水。溶血率＝(试品OD-阴性OD)/(阳性OD-阴性OD)

(6)结果

阿尼芬净及其类似物的体外溶血毒性结果见表7，其中MLC表示测试化合物的最小溶解浓度。

表7阿尼芬净及其类似物体外溶血毒性结果

由表7内容可得，阿尼芬净与ECB-Dab-对戊氧基三联苯甲酰基均可产生不同程度的溶血，且ECB-Dab-对戊氧基三联苯甲酰基相对阿尼芬净毒性较小。其他化合物均未出现溶血现象，证明其毒性远远低于阿尼芬净。

根据本发明所公开的内容，在此所公开并要求保护的所有组合物和/或方法均无需进行过多实验即可进行制备和实施。虽然根据优选实施方案对本发明的组合物和方法进行了描述，但对本领域技术人员而言，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可对在此所述的组合物和/或方法以及所述方法的步骤或步骤的顺序进行改变。

本文所引用的所有文献的公开内容通过引用结合于此，引用程度为，他们提供示例性的、程序上和其他的细节补充本文所述内容。

Claims

1.阿尼芬净类似物，结构如下：

1)或

2)或

3)或

4)或

5)