CN103787938B

CN103787938B - 化合物及其制备方法和应用

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Publication number: CN103787938B
Application number: CN201410043816.2A
Authority: CN
Inventors: 刘磊; 潘漫; 黄轶超; 李宜明; 李奕潼
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2014-01-29
Filing date: 2014-01-29
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2034-01-29
Also published as: CN103787938A

Abstract

本发明公开了化合物及其制备方法和应用，其中，该化合物具有如式1所示的结构：

Description

化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于多肽合成技术领域，具体地，涉及化合物及其制备方法，以及制备多肽的方法。

背景技术

酸敏性离子通道(Acid sensing ion channels,ASICs)主要分布于中枢和外周神经系统，是一类在痛觉产生过程中起重要作用的PH敏感型离子通道。因此，寻找这种离子通道的抑制剂成为研发新型止痛药的重要方向。黑曼巴毒肽（Mambalgins），被发现可以通过抑制ASICs而发挥镇痛作用(Diochot.Nature,2012)。在Diochot的研究表明，Mambalgins具有与吗啡相似的镇痛作用。但由于该毒肽具有与吗啡完全不同的镇痛机制（吗啡是通过结合于阿片受体而起作用），所以其可耐受吗啡拮抗剂纳洛酮的作用，且不会产生阿片样呼吸抑制作用，也不会像吗啡那样快速产生耐药性和依赖性，因此，Mambalgins具有较好的开发成为新型止痛药的医用前景。

黑曼巴蛇毒肽为含有四对二硫键的57肽，基于第四个氨基酸的不同可以分为两种，即第四个氨基酸为Tyr的mambalgins-1和第四个氨基酸为Phe的mambalgins-2。具体结构如下所示：

虽然黑曼巴蛇毒肽具有强止痛作用，低毒副作用及低成瘾性等种种优点，但是由于其57个氨基酸和四对二硫键的复杂结构，导致不管是使用重组表达或是多肽全合成方法，其正确构型的终产物的获得都是极为困难的。有关曼巴蛇毒肽的制备方法，暂时只有毒液提取来源，无化学合成或生物表达报道出现。

合成蛋白质的常用策略是首先在固相上合成多肽片段，然后在水溶液中实现多肽片段的连接。目前使用最成功的多肽片段连接方法是Stephen Kent教授报道的自然化学连接NCL。自然化学连接策略的基本原理是利用多肽1的C端硫酯单元与多肽2的N端半胱氨酸单元发生化学选择性反应，从而将多肽1和多肽2拼接为一个肽片段。但是，该策略需要用到的C端硫酯单元只能通过Boc固相合成法直接获得。而Boc固相合成法需要使用剧毒试剂氟化氢HF，操作复杂，对环境不友好。

因而，目前关于制备多肽的方法仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够快速有效地制备多肽的手段。

在本发明的一个方面，本发明提出一种化合物。根据本发明的实施例，该化合物具有如式1所示的结构：

发明人发现，利用该化合物能够将多肽N端的氨基转化为叠氮基团，进而在短肽连接制备蛋白时，将用于连接的短肽N端的半胱氨酸氨基掩蔽为叠氮基团，能够实现一次将三个短肽进行连接，即连接两个短肽后不需要立即进行分离纯化处理，在解除掩蔽后可直接进行下一个短肽的连接。

在本发明的另一方面，本发明提出一种制备前面所述化合物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：（1）使叠氮化钠与三氟甲磺酸酐接触，以便获得三氟甲磺酸叠氮；（2）使所述三氟甲磺酸叠氮与S-三苯甲基-L-半胱氨酸（H-Cys(Trt)-OH）反应，以便得到前面所述的化合物。由此，能够快速有效地制备前面所述的化合物，并且步骤简单、操作方便。

根据本发明的实施例，步骤（1）进一步包括：（1-1）将叠氮化钠水溶液与二氯甲苯混合；（1-2）将步骤（1-1）所得到的混合物进行冰浴冷却；（1-3）在冰浴条件下，向步骤（1-2）中所得到的经过冷却的混合物中添加三氟甲磺酸酐；以及（1-4）在室温下，使步骤（1-3）中所得到的混合物反应，以便获得所述三氟甲磺酸叠氮。由此，有利于叠氮化钠与三氟甲磺酸酐进行反应，减少副反应，提高反应效率和三氟甲磺酸叠氮的产率。

根据本发明的实施例，步骤（2）进一步包括：（2-1）将所述三氟甲磺酸叠氮与含有H-Cys(Trt)-OH、碳酸钾、五水硫酸铜和甲醇的溶液混合，以及（2-2）在室温下，将步骤（2-1）所得到的混合物搅拌过夜，以便获得前面所述的化合物。由此，有利于三氟甲磺酸叠氮和H-Cys(Trt)-OH之间的反应，减少副反应，提高反应效率和目标产物的产率。

根据本发明的实施例，本发明的制备前面所述化合物的方法包括：将154mmol叠氮化钠溶于25ml去离子水，向所获得的叠氮化钠水溶液中加入40ml二氯甲烷，以便获得第一混合物；将所述第一混合物进行冰浴冷却10min，以便获得经过冰浴冷却的第一混合物；在冰浴条件下，向所述经过冰浴冷却的第一混合物中添加30mmol三氟甲磺酸酐，以便获得第二混合物；在室温下，使所述第二混合物反应3h，以便获得所述三氟甲磺酸叠氮；将15mmol H-Cys(Trt)-OH、22.5mmol碳酸钾、0.15mmol五水硫酸铜溶于50ml去离子水和100ml甲醇的混合溶液中，向所获得的混合物中加入所述三氟甲磺酸叠氮，以便获得第三混合物；以及在室温下，将所述第三混合物搅拌过夜，将所得到的产物旋干有机相，将所获得的水相稀释至100ml，利用浓盐酸将经过稀释的水相的pH调节至2后，利用乙二酸二乙酯进行萃取，将所获得的有机相通过硅胶柱进行纯化处理，以便获得前面所述的化合物。由此，能够高效地制备前面所述的化合物，且副反应较少，反应效率和产率较高。

在本发明的再一方面，本发明还提出一种制备多肽的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：（a）提供第一短肽和第二短肽，所述第一短肽的C端形成有酰肼基团，所述第二短肽的N端为叠氮半胱氨酸，所述叠氮半胱氨酸是利用前面所述的化合物形成的；（b）将所述第二短肽进行还原处理，以便将所述叠氮半胱氨酸转化为半胱氨酸；以及（c）将所述第一短肽和步骤（b）中所得到的经过还原处理的第二短肽进行连接，以便获得多肽。利用本发明的该方法，能够快速有效地制备多肽。

根据本发明的实施例，利用三（2-羧乙基）膦对所述第二短肽进行所述还原处理。由此，能够有效地将第二短肽的叠氮半胱氨酸还原为半胱氨酸。

根据本发明的实施例，所述还原处理是在6.8-7.2的pH下进行1小时。由此，能够在最适合的条件下进行还原反应，有利于提高反应效率。

根据本发明的实施例，步骤（c）进一步包括：（c-1）将所述第一短肽和亚硝酸钠接触，以便对所述第一短肽的酰肼基团进行氧化处理；（c-2）将步骤（c-1）中所得到的氧化处理产物与4-巯基苯乙酸溶液混合，并将所得到混合物的pH调节至5；以及（c-3）向步骤（c-2）所得到的混合物中添加步骤（b）中所得到的经过还原处理的第二短肽，并在6.2-6.5的pH下进行连接反应。由此，有利于连接反应的进行，从而能够有效提高反应效率和产率。

根据本发明的实施例，进一步包括：（d）将步骤（c）中所得到的多肽与还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽进行混合，并将所得到的混合物搅拌过夜，以便对所得到的多肽进行氧化折叠处理，其中，还原性谷胱甘肽的终浓度为100μM，氧化性谷胱甘肽的终浓度为1mM，所述多肽的终浓度为10μM。

根据本发明的实施例，所述第二短肽是通过以下步骤获得的：（a-1）通过固相多肽合成方法制备第三短肽和第四短肽，所述第三短肽的N端形成有半胱氨酸基团，所述第四短肽的C端形成有酰肼基团；（a-2）将所述第四短肽与前面所述的化合物接触，以便在所述第四短肽的N端形成叠氮半胱氨酸基团；以及（a-3）将N端形成叠氮半胱氨酸基团的第四短肽与所述第三短肽进行连接，以便获得所述第二短肽。

根据本发明的实施例，所述第一短肽具有如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，所述第三短肽具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，所述第四短肽具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明的一个实施例，制备获得的式1所示化合物的质谱图；

图2显示了根据本发明的一个实施例，制备获得的式1所示化合物的核磁谱图，其中，

图2Ⅰ为制备获得的式1所示化合物的¹H NMR谱图，

图2Ⅱ为制备获得的式1所示化合物的¹³C NMR谱图；

图3显示了根据本发明的一个实施例，制备获得的短肽A的质谱图；

图4显示了根据本发明的一个实施例，制备获得的短肽B的质谱图；

图5显示了根据本发明的一个实施例，制备获得的短肽C的质谱图；

图6显示了根据本发明的一个实施例，制备获得的短肽D的质谱图；

图7显示了根据本发明的一个实施例，制备黑曼巴蛇毒肽过程中的色谱示踪图；

图8显示了根据本发明的一个实施例，制备获得的Mambalgins-1的色谱和质谱图；

图9显示了根据本发明的一个实施例，制备获得的Mambalgins-2的色谱和质谱图；

图10显示了根据本发明的一个实施例，0.6μM Mambalgin-1对过表达于CHO细胞的hASIC1a电流的作用图。

具体实施方式

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。

发明人发现，利用该化合物能够将多肽N端的氨基转化为叠氮基团，进而在短肽连接制备蛋白时，将用于连接的短肽N端的半胱氨酸氨基掩蔽为叠氮基团，能够实现一次将三个及三个以上的短肽进行连接，即连接两个短肽后不需要立即进行分离纯化处理，在解除掩蔽后可直接进行下一个短肽的连接。

在本发明的另一方面，本发明提出一种制备前面所述化合物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：

（1）使叠氮化钠与三氟甲磺酸酐反应，以便获得三氟甲磺酸叠氮。

在本发明的一些实施例中，步骤（1）进一步包括：（1-1）将叠氮化钠水溶液与二氯甲苯混合；（1-2）将步骤（1-1）所得到的混合物进行冰浴冷却；（1-3）在冰浴条件下，向步骤（1-2）中所得到的经过冷却的混合物中添加三氟甲磺酸酐；以及（1-4）在室温下，使步骤（1-3）中所得到的混合物反应，以便获得所述三氟甲磺酸叠氮。由此，有利于叠氮化钠与三氟甲磺酸酐进行反应，减少副反应，提高反应效率和三氟甲磺酸叠氮的产率，其中，将步骤（1-1）所得到的混合物进行冰浴冷却，并在冰浴条件下添加三氟甲磺酸酐，能够显著减少副反应的发生。

（2）使所述三氟甲磺酸叠氮与H-Cys(Trt)-OH反应，以便得到前面所述的化合物。由此，能够快速有效地制备前面所述的化合物，并且步骤简单、操作方便。

在本发明的一些实施例中，步骤（2）进一步包括：（2-1）将所述三氟甲磺酸叠氮与含有H-Cys(Trt)-OH、碳酸钾、五水硫酸铜和甲醇的溶液混合，以及（2-2）在室温下，将步骤（2-1）所得到的混合物搅拌过夜，以便获得前面所述的化合物。由此，有利于三氟甲磺酸叠氮和H-Cys(Trt)-OH之间的反应，减少副反应，提高反应效率和目标产物的产率。

根据本发明的一个具体示例，前面所述的化合物是通过以下步骤制备的：将154mmol叠氮化钠溶于25ml去离子水，向所获得的叠氮化钠水溶液中加入40ml二氯甲烷，以便获得第一混合物；将所述第一混合物进行冰浴冷却10min，以便获得经过冰浴冷却的第一混合物；在冰浴条件下，向所述经过冰浴冷却的第一混合物中添加30mmol三氟甲磺酸酐，以便获得第二混合物；在室温下，使所述第二混合物反应3h，以便获得所述三氟甲磺酸叠氮；将15mmol H-Cys(Trt)-OH、22.5mmol碳酸钾、0.15mmol五水硫酸铜溶于50ml去离子水和100ml甲醇的混合溶液中，向所获得的混合物中加入所述三氟甲磺酸叠氮，以便获得第三混合物；以及在室温下，将所述第三混合物搅拌过夜，将所得到的产物旋干有机相，将所获得的水相稀释至100ml，利用浓盐酸将经过稀释的水相的pH调节至2后，利用乙二酸二乙酯进行萃取，将所获得的有机相通过硅胶柱进行纯化处理，以便获得前面所述的化合物。

发明人发现，通过本发明的该方法，能够高效地制备前面所述的化合物，且副反应较少，反应效率和产率较高。

在本发明的再一方面，本发明还提出一种制备多肽的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：

（a）提供第一短肽和第二短肽，所述第一短肽的C端形成有酰肼基团，所述第二短肽的N端形成有叠氮半胱氨酸，所述叠氮半胱氨酸是利用前面所述的化合物形成的。

需要说明的是，本文中使用的术语“短肽”是指通过Fmoc固相合成能一次合成的多肽，即普通序列短肽的氨基酸个数一般不多于50个。

根据本发明的实施例，所述第二短肽是通过以下步骤获得的：（a-1）通过固相多肽合成方法制备第三短肽和第四短肽，所述第三短肽的N端形成有半胱氨酸基团，所述第四短肽的C端形成有酰肼基团；（a-2）将所述第四短肽与前面所述的化合物接触，以便在所述第四短肽的N端形成叠氮半胱氨酸基团；以及（a-3）将N端形成叠氮半胱氨酸基团的第四短肽与所述第三短肽进行连接，以便获得所述第二短肽。其中，将所述第四短肽与前面所述的化合物接触是通过以下步骤进行的：将4倍当量的H-Cys(Trt)-OH，4倍当量的HOBt以及4倍当量的N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）混合活化10min，将所得到的产物加入所合成的第四短肽的已经解除氨基保护的固相树脂中，进行缩合反应7小时，即获得N端形成叠氮半胱氨酸基团的第四短肽。

根据本发明的实施例，将N端形成叠氮半胱氨酸基团的第四短肽与所述第三短肽进行连接是通过以下步骤进行的：于-5摄氏度至-10摄氏度下，将N端形成叠氮半胱氨酸基团的第四短肽与亚硝酸钠接触，以便对N端形成叠氮半胱氨酸基团的第四短肽的酰肼基团进行氧化处理；然后将所得到的氧化处理产物与4-巯基苯乙酸溶液混合，并将所得到混合物的pH调节至5，接着，向pH调节至5的混合物中添加所述第三短肽，并在6.2-6.5的pH下进行连接反应，以便获得所述第二短肽。

（b）将所述第二短肽进行还原处理，以便将所述叠氮半胱氨酸转化为半胱氨酸。根据本发明的实施例，利用三（2-羧乙基）膦对所述第二短肽进行所述还原处理。由此，能够有效地将第二短肽的叠氮半胱氨酸还原为半胱氨酸。根据本发明的具体示例，所述还原处理是在6.8-7.2的pH下进行1小时。由此，能够在最适合的条件下进行还原反应，有利于提高反应效率。

（c）将所述第一短肽和步骤（b）中所得到的经过还原处理的第二短肽进行连接，以便获得多肽。根据本发明的实施例，步骤（c）进一步包括：（c-1）将所述第一短肽和亚硝酸钠接触，以便对所述第一短肽的酰肼基团进行氧化处理；（c-2）将步骤（c-1）中所得到的氧化处理产物与4-巯基苯乙酸溶液混合，并将所得到混合物的pH调节至5；以及（c-3）向步骤（c-2）所得到的混合物中添加步骤（b）中所得到的经过还原处理的第二短肽，并在6.2-6.5的pH下进行连接反应。由此，能够使得所述第一短肽和所述经过还原处理的第二短肽在最适合的条件下进行连接反应，有利于提高产率。

根据本发明的实施例，进一步包括：（d）将步骤（c）中所得到的多肽与还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽进行混合，并将所得到的混合物搅拌过夜，以便对所得到的多肽进行氧化折叠处理，其中，还原性谷胱甘肽的终浓度为1mM，氧化性谷胱甘肽的终浓度为100μM，所述多肽的终浓度为10μM。其中，将所得到的多肽、还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽进行混合是将其配成混合溶液，上述终浓度是指在所得到的多肽、还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的混合溶液中，各组分的浓度。由此，能够使得所得到的多肽上的巯基之间形成二硫键，从而使得所得到的多肽具有一定的构型，进而具有相应的功能。

需要说明的是，当利用本发明的方法通过连接短肽制备多肽时，可以一次将三个短肽进行连接，不需要分次连接，也就是说，完成两个短肽的连接后，不需进行分离纯化处理，即可直接进行下一个短肽的连接。由此，能够快速有效地制备多肽，并且操作步骤简单，能够大大减少时间、人力、物力的消耗。

此外，本发明的制备多肽的方法，比较适合于制备含有半胱氨酸的多肽，发明人经过大量的探索实验和艰苦的劳动，惊喜地发现本发明的制备多肽的方法特别适合制备黑曼巴蛇毒肽。例如，在本发明的一个实施例中，所述第一短肽具有如SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列，所述第三短肽具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，所述第四短肽具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列：

LKCYQHGKVVTCHRDMKF（SEQ ID NO：1）

LKCFQHGKVVTCHRDMKF（SEQ ID NO：2）

CYHNTGMPFRNLKLILQGCSSS（SEQ ID NO：3）

CSETENNKCCSTDRCNK（SEQ ID NO：4）

由此，能够有效地制备两种黑曼巴蛇毒肽，当所述第一短肽具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列时，可制备获得mambalgins-1，当所述第一短肽具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列时，可制备获得mambalgins-2。发明人惊奇地发现，利用本发明的方法制备获得的黑曼巴蛇毒肽抑制酸敏离子通道的作用明显。

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：合成S-三苯甲基-L-叠氮半胱氨酸（N₃-Cys(Trt)-OH，即式1所示化合物）

制备三氟甲磺酸叠氮：将叠氮化钠（10g，154mmol，10eq）溶于25ml去离子水中，加入40ml二氯甲烷（DCM）于冰浴条件下冷却10min，然后将三氟甲磺酸酐（5ml，30mmol，2eq）缓慢滴加到经过冷却的混合溶液中，撤去冰浴室温反应3h，分离出有机相；

制备N₃-Cys(Trt)-OH：将H-Cys(Trt)-OH（5.46g，15mmol，1eq），K₂CO₃（3g，22.5mmol，1.5eq）以及Cu₂SO₄·5H₂O（37.7mg，150μmol）溶于50ml去离子水和100ml甲醇的混合溶液中，将上述获得的有机相缓慢滴加到该混合溶液中，室温搅拌过夜，反应结束后旋干有机相，将水相稀释至100ml，利用浓盐酸调pH至2，以乙酸乙酯（EtOAc）萃取三次并合并有机相，然后通过硅胶柱纯化得到产物3.95g，产率为81.8%，将获得的产物分别经核磁（NMR）和质谱（MS）检测，核磁检测谱图和质谱检测谱图分别见图1和图2，其中，图1为质谱检测谱图，图2Ⅰ为¹H NMR谱图，图2Ⅱ为¹³C NMR谱图。由图1和图2的结果可知，获得的产物结构正确，为目标产物N₃-Cys(Trt)-OH。

实施例2：制备黑曼巴蛇毒肽

1、制备短肽

采用Fmoc固相多肽合成法，制备如下短肽：A：H-LKCYQHGKVVTCHRDMKF-NHNH₂；B：H-LKCFQHGKVVTCHRDMKF-NHNH₂；C：H-(N₃)CYHNTGMPFRNLKLILQGCSSS-NHNH₂（其中，(N₃)C表示叠氮半胱氨酸）；D：H-CSETENNKCCSTDRCNK-OH。具体操作步骤如下：

首先，将酰肼树脂（或2-氯三苯甲基树脂）加入多肽合成管，用二甲基甲酰胺（DMF）/DCM（体积比1:1）溶胀0.5小时，接着，将3.6当量（eq）的苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HBTU），4当量羟基苯并三氮唑（HOBt），8当量二异丙基乙胺（DIEA）和4当量保护的目标肽C端第一个氨基酸溶于DMF中，加入到含有经过溶胀的树脂的多肽合成管中反应4小时，将所得到的树脂依次用大量DMF、DCM、DMF洗涤，然后用掩蔽试剂（醋酸酐：DIEA：DMF=1：1：8）浸泡树脂10分钟后，再次依次用大量DMF、DCM、DMF洗涤树脂，接下来，加入20%哌啶的DMF溶液浸泡树脂5分钟和10分钟后，依次用大量DMF、DCM、DMF洗涤树脂，再将现配制的混合液（3.6当量的HBTU，4当量HOBt，8当量DIEA和4当量保护的目标肽C端第二个氨基酸）加入树脂反应60分钟，依次用大量DMF、DCM、DMF洗涤树脂后，用20%哌啶的DMF溶液处理5分钟和10分钟，接下来的氨基酸的缩合重复上面的操作。

其中，酰肼树脂是通过水合肼和2-氯三苯甲基树脂在碱的作用下发生取代反应制备获得的。制备短肽A、B和短肽C时采用酰肼树脂，制备短肽D时，采用2-氯三苯甲基树脂。

另外，合成短肽C进一步包括：预先将4倍当量的H-Cys(Trt)-OH，4倍当量的HOBt以及4倍当量的DIC混合活化10min，然后将所得到的产物加入完成所有氨基酸缩合的短肽C的已经解除氨基保护的固相树脂中，进行缩合反应7小时，即得短肽C。

待目标短肽固相合成结束后，将所得到的树脂分别用大量DMF、DCM洗涤，真空干燥后，外加5-10mL酸性切割试剂（88%三氟乙酸（TFA），5%苯酚，5%茴香硫醚，2.5%1,2-乙二硫醇（EDT），5%水，处理4-8小时。浓缩含有目标多肽的酸性切割试剂，外加20当量的乙醚沉淀，然后离心获得粉末状初肽。利用制备型高效液相色谱（HPLC）对初肽进行分离纯化处理，然后经真空冷冻干燥，获得高纯度的目标短肽，经质谱确定结构正确。制备获得的短肽A-D的质谱检测谱图分别如图3-图6所示。

2、连接处理

将短肽C（25mg，10mmol，1eq）溶于500uL PBS缓冲液，调节pH至3.0后，将反应瓶置于-10℃冰盐浴（氯化钠+冰），待混合溶液冷却后，投入磁子搅拌；然后加入60ul1M的NaNO₂溶液；

分析型RP-HPLC确认酰肼基团氧化完成后，向反应瓶中投入溶于500ul pH=7.4的PBS缓冲液中的4-巯基苯乙酸（MPAA，33.6mg，200mmol，20eq）溶液，调pH至5.0后，投入短肽D（19.5mg，10mmol，1eq），然后用2M NaOH溶液调pH至6.2-6.5，并开始第一次计时，色谱跟踪（色谱示踪图见图7）反应完全后，加入三(2-羧乙基)膦（TCEP，15mg，60mmol，6eq），用6M NaOH溶液调pH至6.8～7.2，反应一小时；

将短肽A（或B）（23.2mg，10.5mmol，1.0eq），溶于500μL PBS缓冲液，调节pH至3.0后，将反应瓶置于-10℃冰盐浴（氯化钠+冰），待混合溶液冷却后，投入磁子搅拌，然后加入60μL1M NaNO₂溶液，分析型RP-HPLC确认酰肼基团氧化完成；

将TCEP（10mg，40mmol，4eq）加入到反应一小时以后所得到的混合物中，然后将获得的混合溶液转移至短肽A（或B）和NaNO₂的混合溶液中，用2M NaOH溶液调pH至6.2-6.5，并开始第二次计时，色谱跟踪（色谱示踪图见图7，其中，C’表示短肽C的分子内硫酯，D表示短肽D，C+D表示短肽C和D连接后生成的多肽，A’表示短肽A的分子内硫酯，A”表示短肽A的硫酯水解产物，A”’表示短肽A的MPAA硫酯，A+C表示短肽A和C连接后生成的多肽，A+C+D表示短肽A、C和D连接后生成的多肽，1th表示第一次计时，2th表示第二次计时）反应完全后，利用半制备HPLC分离纯化得到线性黑曼巴蛇毒肽。

3、氧化折叠处理

将上述步骤获得的线性黑曼巴蛇毒肽、还原性谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽配成混合溶液，以便对线性黑曼巴蛇毒肽进行氧化折叠处理，在线性黑曼巴蛇毒肽、还原性谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽配成的混合溶液中，线性黑曼巴蛇毒肽的浓度为10μM，还原型谷胱甘肽的浓度为100μM，氧化型谷胱甘肽的浓度为100μM，分析型RP-HPLC确认氧化折叠得到Mambalgins-1和Mambalgins-2，其色谱质谱检测谱图分别见图8和图9，其中，质谱检测是利用色谱图中右侧单峰对应的产物（即停留时间为17min左右的产物）进行的，上述获得的Mambalgins-1和Mambalgins-2经半制备HPLC分离纯化处理，获得纯化的Mambalgins-1和Mambalgins-2。

分别完成Mambalgins-1和Mambalgins-2的化学全合成，多肽连接分离产率为35-40%，折叠产率为60%，总产率为21-24%，纯度大于99%。

实施例3：膜片钳实验

将实施例2中制备获得的Mambalgins-1和Mambalgins-2进行膜片钳实验验证其酸敏离子通道抑制生物活性，具体如下：

运用全细胞膜片钳技术及Y管给药系统将不同浓度的Mambalgin-1和Mambalgins-2作用于过量表达了人源ASIC1a同聚物的中华仓鼠卵巢细胞（CHO）上，观察到Mambalgin-1和Mambalgins-2对hASIC1a的电流有明显的抑制作用，并在一定范围内具有浓度依赖性。

其中，图10为0.6μL M Mambalgin-1对过表达于CHO细胞的hASIC1a电流的作用图，由图10可以看到，在pH为7.4的条件下预给药0.6uM Mambalgin-130s后，再于pH为6.0条件下给药0.6uM Mambalgin-1时，hASIC1a的电流（图10中右图所示）明显小于仅于pH为6.0条件下、不给药Mambalgin-1时的电流（图10中左图所示）。说明Mambalgin-1具有有效的生物学功能，和文献（Diochot S,Baron A,Salinas M,et al.Black mamba venom peptidestarget acid-sensing ion channels to abolish pain[J].Nature,2012.，通过参照将其全文并入本文）报导相符。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种制备多肽的方法，其特征在于，包括：

(a)提供第一短肽和第二短肽，所述第一短肽的C端形成有酰肼基团，所述第二短肽的N端为叠氮半胱氨酸，所述叠氮半胱氨酸是利用式1所示的化合物形成的；

(b)将所述第二短肽进行还原处理，以便将所述叠氮半胱氨酸转化为半胱氨酸；以及

(c)将所述第一短肽和步骤(b)中所得到的经过还原处理的第二短肽进行连接，以便获得所述多肽，

其中，利用三(2-羧乙基)膦对所述第二短肽进行所述还原处理，

所述还原处理是在6.8-7.2的pH下进行1小时，

步骤(c)进一步包括：

(c-1)将所述第一短肽和亚硝酸钠接触，以便对所述第一短肽的酰肼基团进行氧化处理；

(c-2)将步骤(c-1)中所得到的氧化处理产物与4-巯基苯乙酸溶液混合，并将所得到混合物的pH调节至5；以及

(c-3)向步骤(c-2)所得到的混合物中添加步骤(b)中所得到的经过还原处理的第二短肽，并在6.2-6.5的pH下进行连接反应，

所述第二短肽是通过以下步骤获得的：

(a-1)通过固相多肽合成方法制备第三短肽和第四短肽，所述第三短肽的N端形成有半胱氨酸基团，所述第四短肽的C端形成有酰肼基团；

(a-2)将所述第四短肽与式1所示的化合物接触，以便在所述第四短肽的N端形成叠氮半胱氨酸基团；以及

(a-3)将N端形成叠氮半胱氨酸基团的第四短肽与所述第三短肽进行连接，以便获得所述第二短肽，

所述第一短肽具有如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，

所述第三短肽具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，

所述第四短肽具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：

(d)将步骤(c)中所得到的多肽与还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽进行混合，并将所得到的混合物搅拌过夜，以便对所得到的多肽进行氧化折叠处理，

其中，

氧化型谷胱甘肽的终浓度为100μM，还原型谷胱甘肽的终浓度为1mM，所述多肽的终浓度为10μM。