CN104744327B

CN104744327B - 一种化合物及其制备方法及利用其制备多肽的方法

Info

Publication number: CN104744327B
Application number: CN201510033192.0A
Authority: CN
Inventors: 郑基深; 唐姗; 司岩岩; 刘磊; 田长麟
Original assignee: Hefei Institutes of Physical Science of CAS
Current assignee: Hefei Institutes of Physical Science of CAS
Priority date: 2015-01-22
Filing date: 2015-01-22
Publication date: 2016-08-24
Anticipated expiration: 2035-01-22
Also published as: CN104744327A

Abstract

本发明公开了一种化合物及其制备方法及利用其制备多肽的方法，其中该化合物具有如下结构：利用该化合物能够将多肽N端的半胱氨酸保护起来，从而掩蔽N端半胱氨酸的活性，进而在多肽片段连接制备蛋白时，能够实现一次将多个（大于等于3个）多肽片段进行连接，即每连接两个多肽片段后不需要进行分离纯化处理，在解除掩蔽后可直接进行与下一个多肽片段的连接。

Description

一种化合物及其制备方法及利用其制备多肽的方法

技术领域

本发明属于多肽合成技术领域，具体地，涉及化合物及其制备方法及利用其制备多肽的方法。

背景技术

趋化因子在维持机体稳态上发挥着重要的作用，尤其是介导免疫器官的形成和对机体免疫的监控，以及帮助免疫细胞正常发育和实现功能。趋化因子介导的淋巴细胞的趋化运动在炎症、肿瘤及AIDS等疾病中均发挥着病理作用。趋化因子相关产品已进入临床应用研究。比如最近发现，趋化因子CCL21通过与T淋巴细胞表面的趋化因子受体CCR7相互作用，诱导T细胞进入中枢神经系统，从而导致了T细胞急性淋巴细胞性白血病（Buonamici.S., Nature, 2009, 459, 1000-1004.）。再比如，固态肿瘤（比如黑色素瘤）会通过分泌CCL21，诱导产生类淋巴网状基质骨架，形成一种异化的细胞因子环境，用来招募调节性淋巴细胞，从而形成肿瘤所在区域的抗免疫微环境，促进肿瘤的生长（J.D.Shields., Science, 2010, 328, 749-752.）。因此，发展一种靶向CCL21的癌症疗法将是治疗癌症的一个新途径。

趋化因子CCL21为含有三对二硫键的111肽，它在一些癌症的形成和生长中起着重要的作用，靶向CCL21可能为癌症疗法提供新的思路，但是由于其111个氨基酸和三对二硫键的复杂结构，导致其重组表达或是通过多肽全合成方法，都较难获得具有正确结构和活性的蛋白质。目前，由生物重组表达趋化因子（比如人源CCL21）价格昂贵（250 ug/7144CNY，Life Technology），且无法做到具有药用价值的修饰（比如特定的标记，PEG化等），因此发展化学方法高效合成趋化因子，及其各种具有药用价值的修饰变体是非常有必要的。

化学合成蛋白质的常用策略是首先利用固相多肽合成技术合成多肽片段，然后在水溶液中实现多肽的片段连接。目前使用最成功的多肽片段连接方法是Stephen Kent教授报道的自然化学连接NCL。自然化学连接策略的基本原理是利用全不保护的多肽片段1的C端硫酯单元与多肽片段2的N端半胱氨酸单元发生化学选择性反应，从而将多肽片段1和多肽片段2拼接为一个更大的多肽片段。传统的多肽片段连接，在每次NCL后就要进行一次分离纯化，该步骤耗时费力，而且会造成产率的较大损失。对合成较大的蛋白质（100-150氨基酸）时，发展多片段的一锅法合成方法对提高蛋白合成效率具有非常重要的意义。

因此，目前关于制备多肽的方法仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够快速有效地化学合成多肽和蛋白的手段。

一种化合物，其特征在于，具有如下结构：

。

所述化合物的制备方法，其特征在于，包括：

（1）使三氟乙酰胺与甲醛反应，获得N-(羟甲基)三氟乙酰胺；

（2）使芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸与三氟乙酸反应，获得Fmoc-L-半胱氨酸；

（3）使所得N-(羟甲基)三氟乙酰胺与Fmoc-L-半胱氨酸反应，即得。

所述一种化合物的制备方法，其特征在于:

步骤（1）包括：

（1-1）称取三氟乙酰胺与碳酸钾放在圆底烧瓶中；

（1-2）量取甲醛水溶液加入到上述圆底烧瓶中；

（1-3）在室温下，步骤（1-2）中所得到的混合物反应后，得N-(羟甲基)三氟乙酰胺;

步骤（2）包括：

（2-1）将三氟乙酸，三异丙基硅烷与二氯甲烷混合，得混合溶液；

（2-2）在室温下，将芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸溶于（2-1）所得混合溶液中反应，得Fmoc-L-半胱氨酸；

步骤（3）包括：

（3-1）在室温下，将Fmoc-L-半胱氨酸溶于三氟乙酸中；

（3-2）在室温下，将N-(羟甲基)三氟乙酰胺溶于三氟乙酸中；

（3-3）将（3-2）所得的溶液滴加到（3-1）所得的溶液中；

（3-4）在室温下，步骤（3-3）中所得到的混合物反应后，即得所述的化合物。

所述一种化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）称取10 mmol三氟乙酰胺，1 mmol的碳酸钾于25 ml的圆底烧瓶中，加入0.8 ml37%的甲醛水溶液，得第一混合物；

将所述第一混合物在室温下反应6小时，将所得的反应体系直接旋干，得N-(羟甲基)三氟乙酰胺；

（2）将20 ml三氟乙酸，20 ml二氯甲烷，1 ml三苯基硅烷混匀，得第二混合物；

将10 mmol 芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸溶于第二混合物中，在室温下反应1小时。将所得到反应体系旋干，将所得到的混合物中三苯甲烷用石油醚洗去，以便得到Fmoc-L-半胱氨酸；

（3）将10 mmol Fmoc-L-半胱氨酸溶于20 ml三氟乙酸中，向所获得的混合物中加入所述溶于三氟乙酸的N-(羟甲基)三氟乙酰胺溶液5 ml，得第三混合物；

在室温下，将所述第三混合物搅拌过夜，将所得到的反应体系有机相旋干，将所获得固体溶于乙腈中，用高效液相色谱分离纯化，即得权利要求1所述的化合物。

所述的化合物制备多肽的方法，其特征在于，包括：

（a）提供第一多肽片段和第二多肽片段，所述第一多肽片段的C端为酰肼基团，N端为三氟乙酰氨甲基保护的半胱氨酸，所述第二多肽片段的N端为半胱氨酸，所述三氟乙酰胺甲基保护的半胱氨酸是利用所述的化合物，通过Fmoc固相合成技术形成的；

（b）将所述第一多肽片段和第二多肽片段进行多肽片段连接反应，得到多肽片段连接产物第三多肽片段；

（c）将步骤（b）中所得到的连接产物第三多肽片段经过碱性条件处理，将所述三氟乙酰胺甲基保护的半胱氨酸转化为半胱氨酸，得到第四多肽片段，即得。

所述一种利用化合物制备多肽的方法，其特征在于，所述碱性条件处理是在pH为11.5-12.0，37℃下进行40分钟。

所述一种利用化合物制备多肽的方法，其特征在于，步骤（b）包括：

（b-1）将所述第一多肽片段和亚硝酸钠接触，对所述第一多肽片段的酰肼基团进行氧化处理；

（b-2）将步骤（b-1）中所得到的氧化处理产物与4-巯基苯乙酸溶液混合，并将所得到混合物的pH调节至6，生成对应的多肽巯基苯乙酸硫酯；

（b-3）向步骤（b-2）所得到的混合物中添加第二多肽片段，并在pH 6.5的条件下进行连接反应，得连接产物第三多肽片段。

所述一种利用化合物制备多肽的方法，其特征在于，步骤（c）包括：

（c-1）将（b-3）所得的反应液，用10 M 氢氧化钠水溶液调节pH至11.6；

（c-2）将（c-1）所得的反应液，在37℃条件下反应40 分钟；

（c-3）将（c-2）所得的反应液，用12 M 盐酸水溶液调节pH至6.5，得到第四多肽片段，即得。

所述一种利用化合物制备多肽的方法，其特征在于，所述第四多肽片段是通过以下步骤获得的：

（a-1）通过固相多肽合成方法制备第一多肽片段，所述第一多肽片段的C端形成有酰肼基团，N端形成三氟乙酰氨甲基保护的半胱氨酸；

（a-2）将N端半光氨酸被三氟乙酰胺甲基保护的第一多肽片段与所述的第二多肽片段连接，得第三多肽片段；

（a-3）将所得含有第三多肽片段的反应溶液，调节pH至11.6，在37℃下反应40分钟后，再调节pH至6.5，得第四多肽片段。

所述一种利用化合物制备多肽的方法，其特征在于，

所述第一多肽片段具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

所述第二多肽片段具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

所述第三多肽片段具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；

所述第四多肽片段具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

对所得多肽进行应用时本发明还包括步骤（d)

（d）将步骤（c）中所得到的多肽与还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽进行混合，并将所得到的混合物搅拌过夜，以便对所得到的多肽进行氧化折叠处理。其中，还原性谷胱甘肽的终浓度为1 mM，氧化性谷胱甘肽的终浓度为0.1 mM，所述多肽的终浓度为0.5 mg/ml。

在本发明的一个方面，本发明提出一种化合物。根据本发明的实施例，该化合物具有如下结构：

发明人发现，利用该化合物能够将多肽N端的半胱氨酸的巯基进行保护，进而在多肽片段连接时，将用于连接的多肽片段的N端的半胱氨酸的巯基掩蔽起来，能够实现一次将三个或者更多多肽进行连接，即连接两个多肽片段后不需要立即进行分离纯化处理，在解除掩蔽后可直接进行与下一片段进行连接。

在本发明的另一方面，本发明提出一种制备前面所述化合物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：（1）使三氟乙酰胺与甲醛反应，以便获得N-(羟甲基)三氟乙酰胺；（2）使芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸与三氟乙酸反应，以便获得Fmoc-L-半胱氨酸；（3）使所述N-(羟甲基)三氟乙酰胺与Fmoc-L-半胱氨酸反应，以便得到权利要求1所述的化合物。由此，能够快速有效地制备前面所述的化合物，并且步骤简单、操作方便。

根据本发明的实施例，步骤（1）进一步包括：（1-1）称取三氟乙酰胺与碳酸钾放在圆底烧瓶中；（1-2）量取甲醛水溶液加入到上述圆底烧瓶中，以及（1-3）在室温下，使步骤（1-2）中所得到的混合物反应，以便获得N-(羟甲基)三氟乙酰胺。由此，有利于三氟乙酰胺与甲醛的反应，减少副反应，提高反应效率和目标产物的产率。

根据本发明的实施例，步骤（2）进一步包括：（2-1）将三氟乙酸，三异丙基硅烷与二氯甲烷混合，以及（2-2）在室温下，将芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸溶于上述溶液中反应，以便获得Fmoc-L-半胱氨酸。由此，有利于芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸转化为Fmoc-L-半胱氨酸，减少副反应，提高反应效率和目标产物的产率。

据本发明的实施例，步骤（3）进一步包括：（3-1）在室温下，将Fmoc-L-半胱氨酸溶于三氟乙酸中；（3-2）在室温下，将N-(羟甲基)三氟乙酰胺溶于三氟乙酸中；（3-3）将（3-2）所得的溶液滴加到（3-1）所得的溶液中，以及（3-4）在室温下，使步骤（3-3）中所得到的混合物反应，以便获得权利要求1所述的化合物。因此，有利于N-(羟甲基)三氟乙酰胺和Fmoc-L-半胱氨酸之间的反应，减少副反应，提高反应效率和目标产物的产率。

根据本发明的实施例，本发明制备前面所述化合物的方法包括：称取10 mmol三氟乙酰胺，1 mmol的碳酸钾于25 ml的圆底烧瓶中，加入0.8 ml 37%的甲醛水溶液，以便获得第一混合物；将所述第一混合物在室温下反应6小时，将所得的反应体系直接旋干，以便获得N-(羟甲基)三氟乙酰胺；将20 ml三氟乙酸，20 ml二氯甲烷，1 ml三苯基硅烷混匀，以便得到第二混合物；将10 mmol 芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸溶于第二混合物中，在室温下反应1小时。将所得到反应体系旋干，将所得到的混合物中三苯甲烷用石油醚洗去，以便得到Fmoc-L-半胱氨酸；将10 mmol Fmoc-L-半胱氨酸溶于20 ml三氟乙酸中，向所获得的混合物中加入所述溶于三氟乙酸的N-(羟甲基)三氟乙酰胺溶液5 ml，以便获得第三混合物；在室温下，将所述第三混合物搅拌过夜，将所得到的反应体系有机相旋干，将所获得的固体溶于乙腈中，用高效液相色谱分离纯化，以便获得权利要求1所述的化合物。由此，能够高效地制备前面所述的化合物，且副反应较少，反应效率和产率较高。

在本发明的再一方面，本发明还提出一种制备多肽的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：（a）提供第一多肽片段和第二多肽片段，所述第一多肽片段的C端为酰肼基团，N端为三氟乙酰氨甲基保护的半胱氨酸，所述第二多肽片段的N端为半胱氨酸，所述三氟乙酰胺甲基保护的半胱氨酸是利用权利要求1所述的化合物形成的；（b）将所述第一多肽片段和第二多肽片段进行多肽片段连接反应，以便得到多肽片段连接产物第三多肽片段；以及（c）将步骤（b）中所得到的连接产物经过碱性条件处理，以便将所述三氟乙酰胺甲基保护的半胱氨酸转化为半胱氨酸，以便获得第四多肽片段。利用本发明的方法，能够快速有效地制备多肽。

根据本发明的实施例，利用高浓度的氢氧化钠水溶液对含有三氟乙酰氨甲基保护的半光氨酸的多肽进行处理，调节pH大于11。由此，可以有效的将第三多肽片段三氟乙酰氨甲基保护的半胱氨酸转化为半胱氨酸。

根据本发明的实施例，所述碱性条件处理是在pH为11.5-12.0，37℃下进行40分钟。由此，能够在最适合的条件下进行三氟乙酰氨甲基的脱除反应，有利于提高反应效率。

根据本发明的实施例，步骤（b）进一步包括：（b-1）将所述第一多肽片段和亚硝酸钠接触，以便对所述第一多肽片段的酰肼基团进行氧化处理；（b-2）将步骤（b-1）中所得到的氧化处理产物与4-巯基苯乙酸溶液混合，并将所得到混合物的pH调节至6；以及（b-3）向步骤（b-2）所得到的混合物中添加第二多肽片段，并在pH 6.5的条件下进行连接反应，以便获得连接产物第三多肽片段。由此，有利于连接反应的进行，从而能够有效提高反应效率和产率。

根据本发明的实施例，进一步包括：将最终所得到的全长多肽与还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽进行混合，并将所得到的混合物搅拌过夜，以便对所得到的多肽进行氧化折叠处理，其中，还原性谷胱甘肽的终浓度为1 mM，氧化性谷胱甘肽的终浓度为0.1 mM，所述全长多肽的终浓度为0.5 mg/ml。其中，将所得到的多肽、还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽进行混合是将其配成混合溶液，上述终浓度是指在所得到的多肽、还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的混合溶液中各组分的浓度。由此，能够使所得到的全长多肽上的巯基之间形成二硫键，从而使所得到的多肽具有三维结构，进而具有相应的生物功能。

根据本发明的实施例，所述第四多肽片段是通过以下步骤获得的：（a-1）通过固相多肽合成方法制备第一多肽片段，所述第一多肽片段的C端形成有酰肼基团，N端形成三氟乙酰氨甲基保护的半胱氨酸；（a-2）将N端半光氨酸被三氟乙酰胺甲基保护的第一多肽片段与所述的第二多肽片段连接，以便获得第三多肽片段；（a-3）将所得含有第三多肽片段的反应溶液，调节pH至11.6，在37℃下反应40分钟后，再调节pH至6.5，以便获得第四多肽片段。

根据本发明的实施例，所述第一多肽片段具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述第二多肽片段具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，所述第三多肽具有如SEQ IDNO：3所示的氨基酸序列，所述第四多肽具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

在本发明的一个方面，本发明提出一种化合物。根据本发明的实施例，该化合物具有如图1所示的结构：

发明人发现，利用该化合物能够将多肽N端的半胱氨酸的巯基进行保护，进而在多肽片段连接制备蛋白时，将用于连接的多肽的N端的半胱氨酸巯基掩蔽起来，能够实现一次将三个或者更多多肽片段进行连接，即连接两个多肽片段后不需要立即进行分离纯化处理，在解除掩蔽后可直接进行与下一片段进行连接。

在本发明的另一方面，本发明提出一种制备前面所述化合物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：

（1）使三氟乙酰胺与甲醛反应，以便获得N-(羟甲基)三氟乙酰胺。

在本发明的一些实施例中，步骤（1）进一步包括：（1-1）称取三氟乙酰胺与碳酸钾放在圆底烧瓶中；（1-2）量取甲醛水溶液加入到上述圆底烧瓶中，以及（1-3）在室温下，使步骤（1-2）中所得到的混合物反应，以便获得N-(羟甲基)三氟乙酰胺。由此，有利于三氟乙酰胺与甲醛的反应，减少副反应，提高反应效率和目标产物的产率。

（2）使芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸与三氟乙酸反应，以便获得Fmoc-L-半胱氨酸。

在本发明的一些实施例中，步骤（2）进一步包括：（2-1）将三氟乙酸，三异丙基硅烷与二氯甲烷混合，以及（2-2）在室温下，将芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸溶于上述溶液中反应，以便获得Fmoc-L-半胱氨酸。其中，（2-1）中三氟乙酸中加入三异丙基硅烷，能够有效捕获三苯甲基正离子，有利于生成Fmoc-L-半胱氨酸，提高反应效率和目标产物的产率。

（3）使所述N-(羟甲基)三氟乙酰胺与Fmoc-L-半胱氨酸反应，以便得到权利要求1所述的化合物。

在本发明的一些实施例中，步骤（3）进一步包括：（3-1）在室温下，将Fmoc-L-半胱氨酸溶于三氟乙酸中；（3-2）在室温下，将N-(羟甲基)三氟乙酰胺溶于三氟乙酸中；（3-3）将（3-2）所得的溶液滴加到（3-1）所得的溶液中，以及（3-4）在室温下，使步骤（3-3）中所得到的混合物反应，以便获得权利要求1所述的化合物。其中，步骤（3-3）中，将（3-2）缓慢滴加到（3-1）中有助于减少Fmoc-L-半胱氨酸的羧基与三氟乙酰胺甲基正离子的反应，减少副反应，提高反应效率和目标产物的产率。

根据本发明的一个具体示例，前面所述的化合物是通过以下步骤制备的：称取10mmol三氟乙酰胺，1 mmol的碳酸钾于25 ml的圆底烧瓶中，加入0.8 ml 37%的甲醛水溶液，以便获得第一混合物；将所述第一混合物在室温下反应6小时，将所得的反应体系直接旋干，以便获得N-(羟甲基)三氟乙酰胺；将20 ml三氟乙酸，20 ml二氯甲烷，1 ml三苯基硅烷混匀，以便得到第二混合物；将10 mmol 芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸溶于第二混合物中，在室温下反应1 小时。将所得到反应体系旋干，将所得到的混合物中三苯甲烷用石油醚洗去，以便得到Fmoc-L-半胱氨酸；将10 mmol Fmoc-L-半胱氨酸溶于20 ml三氟乙酸中，向所获得的混合物中加入所述溶于三氟乙酸的N-(羟甲基)三氟乙酰胺溶液5 ml，以便获得第三混合物；在室温下，将所述第三混合物搅拌过夜，将所得到的反应体系有机相旋干，将所获得固体溶于乙腈中，用高效液相色谱分离纯化，以便获得权利要求1所述的化合物。

发明人发现，通过本发明的该方法，能够高效地制备前面所述的化合物，且副反应较少，反应效率和产率较高。

在本发明的再一方面，本发明还提出一种制备多肽的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：

（a）提供第一多肽片段和第二多肽片段，所述第一多肽片段的C端为酰肼基团，N端为三氟乙酰氨甲基保护的半胱氨酸，所述第二多肽片段的N端为半胱氨酸，所述三氟乙酰胺甲基保护的半胱氨酸是利用权利要求1所述的化合物形成的。

需要说明的是，本文中使用的术语“多肽片段”是指通过Fmoc固相合成能一次合成的多肽，即多肽片段的氨基酸个数一般不多于50个。

根据本发明的实施例，所述第四多肽片段是通过以下步骤获得的：（a-1）通过固相多肽合成方法制备第一多肽片段，所述第一多肽片段的C端形成有酰肼基团，N端形成三氟乙酰氨甲基保护的半胱氨酸；（a-2）将N端半光氨酸被三氟乙酰胺甲基保护的第一多肽片段与所述的第二多肽片段连接，以便获得第三多肽片段；（a-3）将所得含有第三多肽片段的反应溶液，调节pH至11.6，在37℃下反应40分钟后，再调节pH至6.5，以便获得第四多肽片段。其中，利用固相多肽合成技术合成第一多肽片段通过以下步骤进行的：在固相合成到只剩下N-（9-芴甲氧羰基）-S-三氟乙酰氨甲基-L-半胱氨酸时，脱除9-芴甲氧羰基保护基，将2倍当量的图1所述的化合物，4倍当量的HOBt以及4倍当量的N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）混合活化10min，将所得到的产物加入所合成的已经解除氨基保护上述固相树脂中，进行缩合反应过夜，即获得N端被三氟乙酰氨甲基保护的半胱氨酸的第一多肽片段。

根据本发明的实施例，将N端被三氟乙酰氨甲基保护的半胱氨酸的第一多肽片段与所述第二多肽片段进行连接是通过以下步骤进行的：（a）于-15℃，将N端被三氟乙酰氨甲基保护的半胱氨酸的第一多肽片段与亚硝酸钠接触，以便对N端被三氟乙酰氨甲基保护的半胱氨酸的第一多肽片段的酰肼基团进行氧化处理；然后将所得到的氧化处理产物与4-巯基苯乙酸溶液混合，并将所得到混合物的pH调节至6，然后向所得的混合物中添加所述第二多肽片段，并在6.5的pH下进行连接反应，以便获得所述第三多肽片段。

（b）将所述第三多肽片段的三氟乙酰氨甲基进行脱除处理，以便将所述被掩蔽的半胱氨酸转化为半胱氨酸。根据本发明的具体示例，在pH为11.5-12.0，37℃下处理反应体系40分钟，能有效的脱除三氟乙酰氨甲基，获得所述第四多肽片段。由此，能够在最适合的条件下进行保护基脱除反应，有利于提高反应效率。

根据本发明的实施例，进一步包括：将最终所得到的全长多肽与还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽进行混合，并将所得到的混合物搅拌过夜，以便对所得到的全长多肽进行氧化折叠处理，其中，还原性谷胱甘肽的终浓度为1 mM，氧化性谷胱甘肽的终浓度为0.1mM，所述多肽的终浓度为0.5 mg/ml。其中，将所得到的多肽、还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽进行混合是将其配成混合溶液，上述终浓度是指在所得到的多肽、还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的混合溶液中各组分的浓度。由此，能够使所得到的多肽上的巯基之间形成二硫键，从而使所得到的多肽具有三维结构，进而具有相应的生物功能。

需要说明的是，当利用本发明的方法通过连接多肽片段制备更长的多肽时，可以一次将三个或多个多肽片段进行连接，不需要分次连接，也就是说，完成两个多肽的连接后，不需进行分离纯化处理，即可直接进行与下一个多肽片段的连接。由此，能够快速有效地制备多肽，并且操作步骤简单，能够大大减少时间、人力、物力的消耗。

此外，本发明的制备多肽的方法，比较适合于制备含有多个半胱氨酸的多肽，发明人经过大量的探索实验和艰苦的劳动，惊喜地发现本发明的制备多肽的方法特别适合制备各种趋化因子蛋白。例如，在本发明的一个实施例中，所述第一多肽片段具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述第二多肽片段具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，所述第三多肽片段具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，所述第四多肽片段具有如SEQ ID NO：4：

C(Tfacm)ADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQG（SEQ ID NO：1）

CRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTERSQTPKGP（SEQ ID NO：2）

C(Tfacm)ADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQGCRKDRGASKTGKKGKGSKGC KRTERSQTPKGP（SEQ ID NO：3）

CADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQGCRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTERSQTPKGP（SEQ IDNO：4）

由此，利用所述的方法，能够有效地制备人源趋化因子CCL21。发明人惊奇地发现，利用本发明的方法制备获得的趋化因子CCL21，对T淋巴细胞的趋化作用明显。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

利用该化合物能够将多肽N端的半胱氨酸保护起来，从而掩蔽N端半胱氨酸的活性，进而在多肽片段连接制备蛋白时，能够实现一次将多个（大于等于3个）多肽片段进行连接，即每连接两个多肽片段后不需要进行分离纯化处理，在解除掩蔽后可直接进行与下一个多肽片段的连接。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点将结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1本发明化合物的结构式；

图2显示了根据本发明的一个实施例，制备获得的图1所示化合物的质谱图；

图3显示了根据本发明的一个实施例，制备获得的图1所示化合物的核磁谱图，

其中，

图3Ⅰ为制备获得的图1所示化合物的¹H NMR谱图，

图3Ⅱ为制备获得的图1所示化合物的¹³C NMR谱图；

图4显示了根据本发明的一个实施例，制备获得的多肽片段A的色谱和质谱图；

图5显示了根据本发明的一个实施例，制备获得的多肽片段B的色谱和质谱图；

图6显示了根据本发明的一个实施例，制备获得的多肽片段C（即所述第一多肽片段）的色谱和质谱图；

图7显示了根据本发明的一个实施例，制备获得的多肽片段D（即所述第二多肽片段）的色谱和质谱图；

图8显示了根据本发明的一个实施例，制备获得的第三多肽片段的色谱和质谱图；

图9显示了根据本发明的一个实施例，制备获得的第四多肽片段的色谱和质谱图；

图10显示了根据本发明的一个实施例，制备全长CCL21过程中的色谱示踪图；

图11显示了根据本发明的一个实施例，制备获得的趋化因子CCL21的色谱和质谱图；

图12显示了根据本发明的一个实施例，趋化因子CCL21对T淋巴细胞的趋化作用图。

具体实施方式

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例：

步骤1、合成N-（9-芴甲氧羰基）-S-三氟乙酰氨甲基-L-半胱氨酸（Fmoc-Cys(Tfacm)-OH，即图1所示化合物）

1.1、制备N-(羟甲基)三氟乙酰胺：

将三氟乙酰胺（1.13 g，10 mmol，1 eq），碳酸钾（138 mg， 1 mmol， 0.1 eq）置于25 ml的圆底烧瓶中，加入0.8 ml 37%的甲醛水溶液，室温反应6小时，旋干待用；

1.2、制备Fmoc-L-半胱氨酸：

将芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸（5.85 g, 10 mmol, 1 eq）置于500 ml的圆底烧瓶中，加入20 ml 三氟乙酸，20 ml 二氯甲烷，1 ml三苯基硅烷混匀的溶液，在室温下反应1小时，旋干后用石油醚洗涤去除三苯甲烷，将剩下的白色固体旋干收集待用；

1.3、制备N-（9-芴甲氧羰基）-S-三氟乙酰氨甲基-L-半胱氨酸：

将上述旋干的含有N-(羟甲基)三氟乙酰胺（1.43 g， 10 mmol， 1eq）的固体溶于5ml三氟乙酸中，缓慢加入溶有Fmoc-L-半胱氨酸（3.43 g，10 mmol，1 eq）的20 ml三氟乙酸溶液中，室温搅拌过夜，反应结束后旋干有机相，将所得的白色固体溶于乙腈，用高效液相色谱分离纯化，得到产物1.4 g，产率为30%。将获得的产物分别经核磁（NMR）和质谱（MS）检测，核磁检测谱图和质谱检测谱图分别见图2和图3，其中，图2为质谱检测谱图，图3Ⅰ为¹HNMR谱图，图3Ⅱ为¹³C NMR谱图。由图2和图3的结果可知，获得的产物结构正确，为目标产物Fmoc-Cys(Tfacm)-OH。

步骤2、制备人源趋化因子CCL21

2.1、制备多肽片段

采用Fmoc固相多肽合成法，制备如下多肽片段：A：H-SDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLG-NHNH₂；B：H-C(Tfacm)SIPAILFLPRKRSQAEL-NHNH₂（其中，C(Tfacm)表示被三氟乙酰氨甲基保护的半胱氨酸）；C：H-C(Tfacm)ADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQG-NHNH₂; D：H-CRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTERSQTPKGP-OH。具体操作步骤如下：

首先，将酰肼树脂（或2-氯三苯甲基树脂）加入多肽合成管，用二甲基甲酰胺（DMF）/二氯甲烷（DCM）（体积比1:1）溶胀30分钟，接着，将3.6当量的苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HBTU），4当量的羟基苯并三氮唑（HOBt），8当量的二异丙基乙胺（DIEA）和4当量Fmoc保护的目标肽C端第一个氨基酸溶于DMF中，加入到含有经过溶胀的树脂的多肽合成管中反应4小时，将所得到的树脂依次用DMF、DCM、DMF各洗涤三次，然后用掩蔽试剂（醋酸酐：DIEA：DMF=1：1：8）浸泡树脂10分钟后，再依次用DMF、DCM、DMF各洗涤树脂三次，接下来，加入20%哌啶的DMF溶液处理树脂5分钟和10分钟后，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤树脂三次，再将现配制的混合液（3.6当量的HBTU，4当量HOBt，8当量DIEA和4当量Fmoc保护的目标肽C端第二个氨基酸）加入树脂反应60分钟，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤树脂三次后，用20%哌啶的DMF溶液处理5分钟和10分钟，接下来的氨基酸的缩合重复上面的操作。

其中，酰肼树脂是通过5%水合肼的DMF溶液直接与2-氯三苯甲基树脂发生取代反应制备获得的。制备多肽A、B和 C时采用酰肼树脂，制备多肽D时，采用2-氯三苯甲基树脂。而且，偶联多肽D的C端的第一个氨基酸采用的操作包括：将4倍当量的Fmoc保护的氨基酸，8当量的DIEA溶于二氯甲烷溶液中，加入到含有经过溶胀的树脂的多肽合成管中反应8小时，将所得到的树脂依次用DMF、DCM、DMF各洗涤三次，然后用掩蔽试剂（醋酸酐：DIEA：DMF=1：1：8）浸泡树脂10分钟后，再依次用DMF、DCM、DMF各洗涤树脂三次。

另外，合成多肽B和C进一步包括：预先将2当量的前面所述的化合物，4当量的HOBt以及4当量的N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）混合活化10min，将所得到的产物加入所合成的已经解除氨基保护的固相树脂中，进行缩合反应过夜，即获得N端被三氟乙酰氨甲基保护的半胱氨酸的多肽片段B和C。

待目标多肽固相合成结束后，将所得到的树脂分别用大量DMF、DCM洗涤，真空干燥后，外加10 ml酸性切割试剂（88%三氟乙酸，5%苯酚，5%水，2%三苯基硅烷，5%水，处理2-4小时。浓缩含有目标多肽的酸性切割试剂，外加8当量的冰冻乙醚沉淀，然后离心获得粉末状粗肽。利用制备型高效液相色谱（HPLC）对粗肽进行分离纯化处理，然后经真空冷冻干燥，获得高纯度的目标多肽片段，经质谱确定结构正确。制备获得的多肽片段A-D的质谱和色谱图分别如图4-图7所示。

2.2、连接处理

将多肽片段C（3.3 mg，1 μmol，1 eq）溶于100 ul 含有4 M尿素和3 M盐酸胍的磷酸盐缓冲液，调节pH至3.0后，将反应瓶置于-15℃冰盐浴（氯化钠+冰）中，待混合溶液冷却后，然后加入1 ul 1M的NaNO₂溶液；氧化20 分钟后，向反应瓶中加入溶于100 ul pH为6.5的含有4 M尿素和3 M盐酸胍的磷酸盐缓冲液中的4-巯基苯乙酸（MPAA，16.4 mg，100 μmol，100 eq）溶液，将反应体系恢复室温，投入多肽片段D（3.4 mg，1 μmol，1 eq），然后用2 MNaOH溶液调pH至6.5，于37℃下反应2 h后，反应完全。相应的连接产物C+D（第三多肽片段）的色谱及质谱图见图8。加入三(2-羧乙基)膦（TCEP，28 mg，100 μmol）后，用 10 M的NaOH将反应体系的pH调至11.6，在37℃下反应40分钟，待三氟乙酰氨甲基被脱除完全后，再将pH调至6.5，得到相应保护被脱除的（C+D）’（第四多肽片段），用于与下一段多肽的连接。第四多肽片段的色谱及质谱图见图9。然后对多肽片段B进行与多肽片段C相同的操作，待加入MPAA反应1小时后，加入到含（C+D）’多肽片段的反应体系中，于37℃下反应2 h后，得到连接产物B+C+D。然后将反应体系的pH调至11.6，在37℃下反应40分钟，待三氟乙酰氨甲基被脱除完全后，再将pH调至6.5，得到相应保护被脱除的（B+C+D）’。最后，对多肽片段A进行与多肽片段C相同的操作，待加入MPAA反应1小时后，加入到含（B+C+D）’多肽片段的反应体系中，于37℃下反应2 h后，得到连接产物A+B+C+D，即全长的CCL21。反应过程的色谱监测图见图10。经半制备HPLC分离纯化处理，获得纯化后的全长的线性的CCL21。

2.3、氧化折叠处理

将上述步骤获得的线性CCL21、还原性谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽配成混合溶液，以便对线性CCL21进行氧化折叠处理。在线性CCL21、还原性谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽配成的混合溶液中，线性CCL21的浓度为0.5 mg/ml，还原型谷胱甘肽的浓度为1 mM，氧化型谷胱甘肽的浓度为0.1 mM，分析型RP-HPLC确认氧化折叠得到的CCL21。对应的色谱和质谱图见图11。上述获得折叠好的CCL21经半制备HPLC分离纯化处理，获得纯化的折叠后的CCL21。

至此，完成了趋化因子CCL21的化学全合成，多肽连接分离产率为33%，折叠产率为70%，总分离产率为21%，纯度大于99%。

步骤3、趋化实验

将步骤2中制备获得的复性后的CCL21进行趋化实验测试，具体如下：

将穿井（transwell）小室放入培养板中，上室放入从老鼠淋巴结及脾脏中分离纯化出来新鲜的CD8⁺T细胞，在下室中放入不同浓度的上述合成的人源CCL21（sCCL21）及购买所得的人源CCL21（cCCL21，重组表达所得）。上室细胞在下室趋化因子的诱导下，会穿过聚碳酸酯膜进入下室，通过对进入下室细胞量的统计就可以反映出下室趋化因子对上室细胞的趋化能力。结果如图11所示。当在培养基中加入低浓度（100 ng/ml）的sCCL21，cCCL21时，对上室中CD8⁺T细胞，并没有明显的趋化作用。但是，当在培养基中加入高浓度（500 ng/ml）的sCCL21，cCCL21时，对上室中CD8⁺T细胞的趋化作用明显。由此可见，化学合成的人源CCL21具有与重组表达的人源CCL21相同对免疫细胞的趋化能力，具有正确的生物功能。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQ ID NO：1：C(Tfacm)ADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQG

SEQ ID NO：2：CRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTERSQTPKGP

SEQ ID NO：3：C(Tfacm)ADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQGCRKDRGASKT

GKKGKGSKGC KRTERSQTPKGP

SEQ ID NO：4：CADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQGCRKDRGASKTGKKGK

GSKGCKRTERSQTPKGP

Claims

1.一种化合物，其特征在于，具有如下结构：

。

2.一如权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，包括：

3.根据权利要求2所述一种化合物的制备方法，其特征在于:

步骤（1）包括：

（1-1）称取三氟乙酰胺与碳酸钾放在圆底烧瓶中；

（1-2）量取甲醛水溶液加入到上述圆底烧瓶中；

步骤（2）包括：

步骤（3）包括：

（3-1）在室温下，将Fmoc-L-半胱氨酸溶于三氟乙酸中；

（3-2）在室温下，将N-(羟甲基)三氟乙酰胺溶于三氟乙酸中；

（3-3）将（3-2）所得的溶液滴加到（3-1）所得的溶液中；

4.根据权利要求2所述一种化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）称取10 mmol三氟乙酰胺，1 mmol的碳酸钾于25 ml的圆底烧瓶中，加入0.8 ml 37%的甲醛水溶液，得第一混合物；

将10 mmol 芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸溶于第二混合物中，在室温下反应1小时，将所得到反应体系旋干，将所得到的混合物中三苯甲烷用石油醚洗去，以便得到Fmoc-L-半胱氨酸；

5.一种利用权利要求1所述的化合物制备多肽的方法，其特征在于，包括：

6.根据权利要求5所述一种利用化合物制备多肽的方法，其特征在于，所述碱性条件处理是在pH为11.5-12.0，37℃下进行40分钟。

7.根据权利要求5所述一种利用化合物制备多肽的方法，其特征在于，步骤（b）包括：

8.根据权利要求7所述一种利用化合物制备多肽的方法，其特征在于，步骤（c）包括：

（c-2）将（c-1）所得的反应液，在37℃条件下反应40 分钟；

9.根据权利要求5所述一种利用化合物制备多肽的方法，其特征在于，所述第四多肽片段是通过以下步骤获得的：

10.根据权利要求5所述一种利用化合物制备多肽的方法，其特征在于，

所述第一多肽片段具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

所述第二多肽片段具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

所述第三多肽片段具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；

所述第四多肽片段具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。