CN107935895B - 化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种化合物。根据本发明的实施例，其为式(I)所示的化合物或式(I)所示化合物的立体异构体、互变异构体、氮氧化物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或它的前药。该化合物可有效实现二、三及以上泛素链以及泛素修饰底物的获取，并且利用该化合物可实现多肽或蛋白侧链修饰亲和标签、荧光基团、PEG或脂肪烃等，该化合物在多肽药物的设计、生化测试以及功能优化等多方面可发挥重要作用。

Description

化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物领域，具体地，本发明涉及化合物及其制备方法和应用，更具体地，本发明涉及化合物、化合物的制备方法以及多肽或蛋白质的制备方法。
背景技术
泛素(Ubiquitin,Ub)是一种包含76个氨基酸的蛋白质，它的C端羧基能够和底物蛋白质赖氨酸(Lysine,Lys)上氨基发生缩合生成异肽键，这个过程称之为泛素化翻译后修饰。泛素化修饰(ubiquitination)参与调控蛋白质降解、自噬、细胞周期、DNA损伤修复及炎症免疫等几乎所有细胞生物过程(Swatek,K.N.；Komander,D.Cell Res.2016)。这种功能的丰富性产生原因是泛素自身具有7个赖氨酸，能够自聚形成8种类型泛素链(Lys6，Lys11，Lys27，Lys29，Lys33，Lys48，Lys63和Met1)，链类型的复杂性决定了功能的丰富性。目前研究表明，8种多聚泛素链修饰各自独立行使不同的功能，例如，Lys48多聚泛素链结合底物蛋白，诱导26S蛋白酶体降解底物蛋白，这一过程的发现和机制阐明获得了2004年的诺贝尔化学奖。Met1和Lys63多聚泛素链在免疫炎症、DNA损伤修复等信号转导中发挥重要作用；Lys11调节细胞周期蛋白降解过程；Lys6泛素链参与线粒体自噬等。因此，理解各种泛素链修饰蛋白质在细胞生物过程的生理功能，发现新的泛素链修饰编码蛋白、识别蛋白和消码蛋白并阐明他们调控泛素过程的分子机制，有利于更深刻地了解泛素参与这些生命过程的分子基础。此外，由于泛素系统在生理过程中的功能十分重要，其编码、识别及解码过程的功能障碍会导致多种重大疾病发生，因此解析它们在泛素密码过程中的生理功能终将为相关疾病诊断和治疗做出重要贡献。
解答上述科学问题关键的一步是获取得到相应泛素链及泛素链修饰的底物。然而，由于泛素链不能依赖常用重组表达方法获取。体外酶法获取分离过程复杂，并且存在Lys27泛素链仍无体外酶法获取方法的报道。目标蛋白获取的困难是目前阻碍泛素系统相关研究的巨大瓶颈之一。利用化学全合成和半合成方法获取多聚泛素链及泛素化修饰底物是一种可行、高效的方案。
蛋白质合成常规策略是利用蛋白质全合成或者蛋白质半合成获取蛋白质或多肽片段，进一步利用多片段连接实现完整蛋白质获取。目前被广泛使用的连接方法是StephenKent教授发明的自然化学连接法。依赖两个多肽片段，一个C端具备硫酯结构，一个N端氨基酸为半胱氨酸，二者能通过发生硫酯交换以及分子内N-S迁移反应实现两个片段的连接。然而，泛素自身就包含76个氨基酸，其多聚泛素链及泛素链修饰底物蛋白这类型大蛋白(大于150个氨基酸)的获取对于蛋白质合成技术本身来说是一个巨大挑战。与此同时，精准实现不同位点特异性链接需要在序列中定点引入高活性反应基团。因此，关于制备多聚泛素链及泛素链修饰底物的蛋白质合成方法的研究仍有待深入。
发明内容
本发明旨在提供一种可用的商业选择，能够更加简便、快速地实现二、三及以上泛素链的获取，在一定程度上解决泛素链及泛素修饰底物获取困难的技术问题。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够快速有效地制备蛋白质或多肽的手段。此外，发明人发现该方法能进一步用于多肽和蛋白侧链修饰亲和标签，荧光基团，PEG，脂肪烃等，可用于多肽药物的设计、生化测试以及功能优化等多种用途。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种化合物。根据本发明的实施例，其为式(I)所示的化合物或式(I)所示化合物的立体异构体、互变异构体、氮氧化物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或它的前药，
式(I)所示化合物可简称为Cl-BCEA-Acm，其中，Acm代表N-甲基N-乙酰胺基部分；BCEA代表N-(2-巯基乙基)-N-乙基胺部分；Cl代表氯原子。发明人发现，所述化合物具备一个活性亲电氯反应基，当反应蛋白片段序列中具备一个半胱氨酸时，利用半胱氨酸的SH具备高亲核能力，能够实现所述化合物1：1定量修饰到蛋白片段上。在解除所述化合物上Acm保护基之后，暴露出的巯基乙胺结构和N端半胱氨酸一样具备自然化学连接活性，能够与另一蛋白片段发生连接。进而可有效实现二、三及以上泛素链以及泛素修饰底物的获取，并且利用该化合物可实现多肽或蛋白侧链修饰亲和标签、荧光基团、PEG或脂肪烃等，该化合物在多肽药物的设计、生化测试以及功能优化等多方面可发挥重要作用。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备前面所述化合物的方法，其特征在于，包括:将第一原料与第二原料进行接触，以便获得所述化合物，其中，所述第一原料为N-羟甲基乙酰胺，所述第二原料为2-氯-N-(2-(三苯甲基硫醚)乙基)乙胺或2-氯-N-叔丁氧羰基-N-(2-(三苯甲基硫醚)乙基)-乙胺。其中，N-羟甲基乙酰胺的结构如式(a)所示，2-氯-N-(2-(三苯甲基硫醚)乙基)乙胺的结构如式(b)所示，2-氯-N-叔丁氧羰基-N-(2-(三苯甲基硫醚)乙基)-乙胺的结构如式(c)所示。
利用根据本发明实施例的上述方法，可高效获得式I所示化合物，且所获得的式(I)所示化合物无需通过硅胶色谱柱进行分离纯化即满足后续反应的要求，步骤简单，操作方便，收率高。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一
根据本发明的实施例，所述接触是通过如下方式进行的：(1)将第一原料和第二原料进行水溶解处理；(2)将步骤(1)所得混合物进行冰浴冷却处理；(3)在冰浴条件下，将冰浴冷却处理后复合物与切割试剂进行接触，所述切割试剂包括三氟乙酸、三氟甲磺酸和三异丙基硅烷；(4)在室温条件下，将步骤(3)所得混合物进行切割反应，以便获得所述的化合物。由此，有利于减少副反应，提高反应效率。
根据本发明的实施例，所述第一原料、第二原料和水的用量比为5mmol：5mmol：4mL。由此，可有效减少副反应，进一步提高反应效率。
根据本发明的实施例，所述冰浴冷却处理的时间为10min。由此，可有效减少副反应，进一步提高反应效率。
根据本发明的实施例，所述三氟乙酸，三氟甲磺酸，三异丙基硅烷的体积比为92.5：5：2.5。由此，切割反应效率高、副反应少。
根据本发明的实施例，所述切割试剂的体积为24mL。由此，刚好适合中型合成管，反应操作简便、成本较低。
根据本发明的实施例，所述切割反应的时间为4小时。由此，副反应少，且反应充分。
根据本发明的实施例，所述切割反应后进一步包括：将切割反应产物进行N2吹干处理和萃取处理，所述萃取处理是通过将所述产物与水和乙醚进行接触，所述水和乙醚的体积比为1：1；以及将萃取产物进行冻干处理，以便获得所述化合物。由此，能够高效制备前面所述化合物，且副反应较少，无需进一步纯化即可满足后续实验要求。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种制备多肽或蛋白质的方法，其特征在于，包括：(1)将第一蛋白片段进行BCEA-Acm修饰处理，所述第一蛋白片段含有半胱氨酸；(2)将经过BCEA-Acm修饰处理的第一蛋白片段进行Acm脱除处理，以便获得具有BCEA-SH修饰的第一蛋白片段；(3)将所述具有BCEA-SH修饰的第一蛋白片段和第二蛋白片段进行自然化学连接，所述第二蛋白片段的C端具有硫酯基团，以便获得所述多肽或蛋白质，其中，所述BCEA-Acm修饰处理是通过如下方式进行的：将第一蛋白片段与前面所述的化合物进行接触。其中，所述“自然化学连接”是1994年KENT教授发明的蛋白质连接方法，英文名为Nativechemical ligation，具体解释可参见参考文献，文献链接为https://en.wikipedia.org/wiki/Native_chemical_ligation#cite_note-1。利用根据本发明实施例的上述方法，无需蛋白片段N端为裸露半胱氨酸这一化学自然连接必备要求，便能够快速有效制备所需多肽或蛋白质。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，在步骤(2)中，所述Acm脱除处理是在氯化钯存在下进行的。由此，能够使BCEA-Acm修饰处理的第一蛋白片段具备巯基乙胺结构。
根据本发明的实施例，所述氯化钯与所述第一蛋白片段的摩尔比为15：1。由此，进一步提高反应效率。
根据本发明的实施例，所述Acm脱除处理是在室温、pH为7的条件下进行1小时。由此，进一步提高反应效率。
根据本发明的实施例，步骤(3)进一步包括：(3-1)将所述具有BCEA-SH修饰的第一蛋白片段与4-巯基苯乙酸接触，所述接触是在pH为5.2的条件下进行的；以及(3-2)将步骤(3-1)产物与中与所述C端具有硫酯基团的第二蛋白片段在室温及pH 6.4的条件下进行连接反应。由此，有利于连接反应的进行，从而能够有效提高反应效率和产率。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：(4)利用盐酸胍溶液对步骤(3)中所得到的多肽或蛋白质进行溶解处理，并利用pH为8.0的磷酸氢二钠缓冲溶液对所得溶解液进行稀释处理；其中，盐酸胍浓度为6M，pH为8.0；磷酸二氢钠浓度为50mM。由此，所得到的多肽或蛋白正确折叠，恢复活性结构。
根据本发明的实施例，所述第一蛋白片段是通过大肠杆菌重组表达获得的。所述大肠杆菌重组表达方法参见“The missing links to link ubiquitin:Methods for theenzymatic production of polyubiquitin chains，Serena Faggiano,Caterina Alfano,Annalisa Pastore”。
根据本发明的实施例，将所述第一蛋白片段与所述化合物在三-(2-羧乙基)膦存在的条件下进行接触。三-(2-羧乙基)膦作为还原剂，BCEA-Acm修饰处理的效率进一步提高。
根据本发明的实施例，所述三-(2-羧乙基)膦的浓度为5mg/ml。由此，所述BCEA-Acm修饰处理的效率进一步提高。
根据本发明的实施例，所述接触是在室温的条件下进行10～12小时。由此，反应更加充分。
根据本发明的实施例，所述化合物预先溶于二甲基亚砜，所得溶液的浓度为1M。浓度为1M的二甲亚砜为储液，具体使用时便于计算且添加体积小。
根据本发明的实施例，所述化合物与所述第一蛋白片段的摩尔比为15：1。由此，第一蛋白片段进行BCEA-Acm修饰处理的效率进一步提高。
根据本发明的实施例，所述第二蛋白片段是通过以下步骤获得的：(a)通过大肠杆菌重组表达(具体方法步骤参考The missing links to link ubiquitin:Methods forthe enzymatic production of polyubiquitin chains，Serena Faggiano,CaterinaAlfano,Annalisa Pastore)和酶解法(具体方法步骤参考Chemoenzymatic Synthesis ofBifunctional Polyubiquitin Substrates for Monitoring Ubiquitin ChainRemodeling，Vivian H.Tranga,Margaret L.Rodgersb,Kevin J.Boylea,AaronA.Hoskinsb,and Eric R.Strietera)获得第三蛋白片段，所述第三蛋白片段的C端具有酰肼基团；(b)对所述第三蛋白片段进行氧化处理，所述氧化处理是通过将所述第三蛋白片段与亚硝酸钠进行接触进行的；(c)将经过氧化处理后的第三蛋白片段与巯基乙基磺酸钠在pH为5的条件下进行接触，以便获得所述第二蛋白片段。所获得的第二蛋白片段的C端具有硫酯基团。
根据本发明的实施例：所述第一蛋白片段具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，
根据本发明的实施例，所述第二蛋白片段具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，
根据本发明的实施例，所述经过BCEA-Acm修饰处理的第一蛋白片段具有如SEQ IDNO：3所示的氨基酸序列，
根据本发明的实施例，所述第三蛋白片段具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列
NH2-MQIFVKTLTGKTI TLEVEPSDTI ENVKAKIQDK EGIPPDQQRL
IFAGKQLEDG RTLSDYNIQK ESTLHLVLRL RGG-CONHNH2
(SEQ ID NO：4)。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明的一个实施例，制备获得的式1所示化合物的质谱图；
图2显示了根据本发明的一个实施例，制备获得的第三蛋白片段的质谱和色谱图；
图3显示了根据本发明的一个实施例，制备获得的第二蛋白片段的质谱和色谱图；
图4显示了根据本发明的一个实施例，制备获得的第一蛋白片段的质谱和色谱图；
图5显示了根据本发明的一个实施例，制备获得的经过BCEA-Acm修饰处理的第一蛋白片段的质谱和色谱图；
图6显示了根据本发明的一个实施例，蛋白片段连接的色谱示踪图；
图7显示了根据本发明的一个实施例，制备获得Lys27 Diub-BCEA-AT2的色谱和质谱图；
图8显示了根据本发明的一个实施例，制备获得Lys27 Diub-BCEA-SH用于交联去泛素化酶OTUD2的反应过程图；
图9显示了根据本发明的一个实施例，制备获得Lys27 Diub-BCEA-SH脱硫后作为不可降解泛素链的示意图；
图10显示了根据本发明的一个实施例，制备获得Lys6 Diub-BCEA-AT2的色谱和质谱图；
图11显示了根据本发明的一个实施例，制备获得Lys11 Diub-BCEA-AT2的色谱和质谱图；
图12显示了根据本发明的一个实施例，制备获得Lys29 Diub-BCEA-AT2的色谱和质谱图；
图13显示了根据本发明的一个实施例，制备获得Lys33 Diub-BCEA-AT2的色谱和质谱图；
图14显示了根据本发明的一个实施例，制备获得Lys48 Diub-BCEA-AT2的色谱和质谱图；
图15显示了根据本发明的一个实施例，制备获得Lys63 Diub-BCEA-AT2的色谱和质谱图；
图16显示了根据本发明的一个可应用方案，制备均一链类型Triub的反应流程图；以及
图17显示了根据本发明的一个可应用方案，制备侧链多种修饰类型蛋白质(荧光、Biotin、PEG、脂肪烃等)。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
化合物
在本发明的第一方面，本发明提出了一种化合物。根据本发明的实施例，其为式(I)所示的化合物或式(I)所示化合物的立体异构体、互变异构体、氮氧化物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或它的前药，
发明人发现，利用该化合物能与多肽或蛋白上半胱氨酸(Cys)的巯基发生亲核取代，再脱除乙酰胺甲基保护，实现多肽和蛋白质侧链Cys自然化学连接(NCL)功能化，因而能够用于和另外一C末端为硫酯片段的多肽或蛋白发生自然化学连接，快速实现蛋白质合成。利用该化合物尤其适用于泛素及泛素化修饰蛋白质的合成，合成产物可用于多种不同类型生化基础研究。此外，利用该化合物能用于多肽和蛋白侧链修饰亲和标签，荧光基团，PEG助溶功能基等，可用于多肽药物的设计和生化测试。
本发明所使用的术语“前药”，代表一个化合物在体内转化为式(I)所示的化合物。这样的转化受前体药物在血液中水解或在血液或组织中经酶转化为母体结构的影响。本发明前体药物类化合物可以是酯，在现有的发明中酯可以作为前体药物的有苯酯类，脂肪族(C1-24)酯类，酰氧基甲基酯类，碳酸酯，氨基甲酸酯类和氨基酸酯类。例如本发明里的一个化合物包含羟基，即可以将其酰化得到前体药物形式的化合物。其他的前体药物形式包括磷酸酯，如这些磷酸酯类化合物是经母体上的羟基磷酸化得到的。关于前体药物完整的讨论可以参考以下文献：T.Higuchi and V.Stella,Pro-drugs as Novel DeliverySystems,Vol.14of the A.C.S.Symposium Series,Edward B.Roche,ed.,BioreversibleCarriers in Drug Design,American Pharmaceutical Association and PergamonPress,1987,J.Rautio et al,Prodrugs:Design and Clinical Applications,NatureReview Drug Discovery,2008,7,255-270,and S.J.Hecker et al,Prodrugs ofPhosphates and Phosphonates,Journal of Medicinal Chemistry,2008,51，2328-2345。
除非其他方面表明，本发明的化合物的所有互变异构形式都包含在本发明的范围之内。另外，除非其他方面表明，本发明所描述的化合物的结构式包括一个或多个不同的原子的富集同位素。
“代谢产物”是指具体的化合物或其盐在体内通过代谢作用所得到的产物。一个化合物的代谢产物可以通过所属领域公知的技术来进行鉴定，其活性可以通过如本发明所描述的那样采用试验的方法进行表征。这样的产物可以是通过给药化合物经过氧化，还原，水解，酰氨化，脱酰氨作用，酯化，脱脂作用，酶裂解等等方法得到。相应地，本发明包括化合物的代谢产物，包括将本发明的化合物与哺乳动物充分接触一段时间所产生的代谢产物。
本发明中立体化学的定义和惯例的使用通常参考以下文献：S.P.Parker,Ed.,McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company,NewYork；and Eliel,E.and Wilen,S.,"Stereochemistry of Organic Compounds",JohnWiley&Sons,Inc.,New York,1994.本发明的化合物可以包含不对称中心或手性中心，因此存在不同的立体异构体。本发明的化合物所有的立体异构形式，包括但绝不限于，非对映体，对映异构体，阻转异构体，和它们的混合物，如外消旋混合物，组成了本发明的一部分。很多有机化合物都以光学活性形式存在，即它们有能力旋转平面偏振光的平面。在描述光学活性化合物时，前缀D、L或R、S用来表示分子手性中心的绝对构型。前缀d、l或(+)、(-)用来命名化合物平面偏振光旋转的符号，(-)或l是指化合物是左旋的，前缀(+)或d是指化合物是右旋的。这些立体异构体的化学结构是相同的，但是它们的立体结构不一样。特定的立体异构体可以是对映体，异构体的混合物通常称为对映异构体混合物。50：50的对映体混合物被称为外消旋混合物或外消旋体，这可能导致化学反应过程中没有立体选择性或立体定向性。术语“外消旋混合物”和“外消旋体”是指等摩尔的两个对映异构体的混合物，缺乏光学活性。
术语“互变异构体”或“互变异构的形式”是指不同能量的结构的同分异构体可以通过低能垒互相转化。例如质子互变异构体(即质子移变的互变异构体)包括通过质子迁移的互变，如酮式-烯醇式和亚胺-烯胺的同分异构化作用。原子价(化合价)互变异构体包括重组成键电子的互变。
本发明所使用的“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的有机盐和无机盐。药学上可接受的盐在所属领域是为我们所熟知的，如文献：S.M.Berge et al.,describepharmaceutically acceptable salts in detail in J.Pharmaceutical Sciences,66:1-19,1977.所记载的。药学上可接受的无毒的酸形成的盐包括，但并不限于，与氨基基团反应形成的无机酸盐有盐酸盐，氢溴酸盐，磷酸盐，硫酸盐，高氯酸盐，和有机酸盐如乙酸盐，草酸盐，马来酸盐，酒石酸盐，柠檬酸盐，琥珀酸盐，丙二酸盐，或通过书籍文献上所记载的其他方法如离子交换法来得到这些盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐，苹果酸盐，2-羟基丙酸盐，藻酸盐，抗坏血酸盐，天冬氨酸盐，苯磺酸盐，苯甲酸盐，重硫酸盐，硼酸盐，丁酸盐，樟脑酸盐，樟脑磺酸盐，环戊基丙酸盐，二葡萄糖酸盐，十二烷基硫酸盐，乙磺酸盐，甲酸盐，反丁烯二酸盐，葡庚糖酸盐，甘油磷酸盐，葡萄糖酸盐，半硫酸盐，庚酸盐，己酸盐，氢碘酸盐，2-羟基-乙磺酸盐，乳糖醛酸盐，乳酸盐，月桂酸盐，月桂基硫酸盐，苹果酸盐，丙二酸盐，甲磺酸盐，2-萘磺酸盐，烟酸盐，硝酸盐，油酸盐，棕榈酸盐，扑酸盐，果胶酸盐，过硫酸盐，3-苯基丙酸盐，苦味酸盐，特戊酸盐，丙酸盐，硬脂酸盐，硫氰酸盐，对甲苯磺酸盐，十一酸盐，戊酸盐，等等。通过适当的碱得到的盐包括碱金属，碱土金属，铵和N+(C1-4烷基)4的盐。本发明也拟构思了任何所包含N的基团的化合物所形成的季铵盐。水溶性或油溶性或分散产物可以通过季铵化作用得到。碱金属或碱土金属盐包括钠，锂，钾，钙，镁，等等。药学上可接受的盐进一步包括适当的、无毒的铵，季铵盐和抗平衡离子形成的胺阳离子，如卤化物，氢氧化物，羧化物，硫酸化物，磷酸化物，硝酸化物，C1-8磺酸化物和芳香磺酸化物。
本发明的“溶剂化物”是指一个或多个溶剂分子与本发明的化合物所形成的缔合物。形成溶剂化物的溶剂包括，但并不限于，水，异丙醇，乙醇，甲醇，二甲亚砜，乙酸乙酯，乙酸，氨基乙醇。术语“水合物”是指溶剂分子是水所形成的缔合物。
制备化合物的方法
本发明的一方面，提出一种制备前面所述化合物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：
(1)使第一原料N-羟甲基乙酰胺与第二原料2-氯-N-(2-(三苯甲基硫醚)乙基)乙胺或2-氯-N-叔丁氧羰基-N-(2-(三苯甲基硫醚)乙基)-乙胺二者中一种反应，以便获得目标化合物Cl-BCEA-Acm。
在本发明的一些实施例中，步骤(1)进一步包括(1-1)将反应第一原料水溶液与反应第二原料水溶液混合；(1-2)将步骤(1-1)所得混合物进行冰浴冷却；(1-3)在冰浴条件下，向步骤(1-2)中经过冷却的复合物添加切割试剂；以及(1-4)室温下使步骤(1-3)所得到的混合物反应，以便获得权利要求1所述的化合物。由此，有利于减少副反应，提高反应效率。
根据本发明的一个具体示例，前面所述的化合物是通过以下步骤制备的：将5mmol反应第一原料和5mmol第二原料溶解在4ml去离子水中，以便获得第一混合物；将第一混合物进行冰浴冷却10min，以获得冰浴冷却的第一混合物；向冰浴冷却的第一混合物滴加24ml具有三氟乙酸，三氟甲磺酸，三异丙基硅烷体积比为92.5:5:2.5的切割试剂，以获得第二混合物；在室温下，是所述第二混合物室温反应4小时，以便获得第三混合物；将第三混合物用N2吹干；以及加入80ml等体积水和乙醚萃取三次，合并水相，待乙醚挥发后冻干以便获得前面所述的化合物。
发明人发现，通过本发明的方法，能够高效制备前面所述化合物，且副反应较少，无需进一步纯化即可满足后续实验要求。
制备多肽或蛋白质的方法
在本发明的另一方面，本发明还提出一种制备多肽的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：
(1)将第一蛋白片段进行BCEA-Acm修饰处理，所述第一蛋白片段含有半胱氨酸；
根据本发明的实施例，所述BCEA-Acm修饰处理是通过如下方式进行的：(1-1)通过大肠杆菌重组表达法表达第一蛋白片段，所述第一蛋白片段含有半胱氨酸；以及所述第一蛋白片段也可通过固相多肽合成方法制备；(1-2)将1当量的第一蛋白片段与15倍当量的前面所述化合物混合，在5mg/ml三(2-羧乙基)膦还原剂条件下，室温反应过夜，以便获得经过BCEA-Acm修饰处理的第一蛋白片段。
(2)将经过BCEA-Acm修饰处理的第一蛋白片段进行Acm脱除处理，以便获得具有BCEA-SH修饰的第一蛋白片段；
将经过BCEA-Acm修饰处理的第一蛋白片段进行Acm脱除处理，得到BCEA结构修饰的第一蛋白片段，以便使第一蛋白片段具备氨基乙硫醇结构；根据本发明实施例，利用氯化钯对所述经过BCEA-Acm修饰处理的第一蛋白片段进行Acm脱除处理。根据本发明的具体示例，所述脱除Acm处理是在pH 7.0下和15倍当量氯化钯条件下室温反应1小时。由此，能够在最适pH条件发生脱除反应，有利于提高反应效率。
(3)将所述具有BCEA-SH修饰的第一蛋白片段和第二蛋白片段进行化学连接，所述第二蛋白片段的C端具有硫酯基团，以便获得所述多肽或蛋白质；
根据本发明实施例，所述第二蛋白片段是通过以下步骤获得的：(a)通过大肠杆菌重组表达加酶解法获取制备第三蛋白片段，所述第三蛋白片段的C端形成有酰肼基团；(b)在冰盐浴条件下(-5摄氏度至-10摄氏度)将所述第三蛋白片段与亚硝酸钠接触，以便对所述第三蛋白片段的酰肼基团进行氧化处理。(c)将进行氧化处理后的第三蛋白片段加入巯基乙基磺酸钠混合，调节pH至5。以便获得所述第二蛋白片段。
根据本发明实施例，步骤(3)进一步包括：(3-1)将所述具有BCEA-SH修饰的第一蛋白片段与4-巯基苯乙酸接触，并调节所得到的混合溶液pH至5.2；以及(3-2)向步骤(3-1)所得到的混合物中添加C端具有硫酯基团的第二蛋白片段，并在pH 6.4的条件下进行连接反应。由此，有利于连接反应的进行，从而能够有效提高反应效率和产率。
根据本发明实施例，进一步包括：(4)将步骤(3)中所得到的多肽用盐酸胍溶解，加入pH 8.0的磷酸氢二钠缓冲溶液缓慢稀释，以便对所得到的多肽或蛋白正确折叠复性恢复活性结构。
本发明的制备多肽方法，具备半胱氨酸部分蛋白片段可利用重组表达制备，简单方便。此外，发明人经过大量实验摸索发现，该方法特别适合多泛素链及泛素链修饰底物蛋白质的制备。例如，在本发明的第一个实施例中，所述第一蛋白片段具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述第二蛋白片段具有如SEQ ID NO:2序列，所述经过BCEA-Acm修饰处理的第一蛋白片段具有如SEQ ID NO:3序列，所述第三蛋白片段具有如SEQ ID NO:4序列：由此，能够有效制备Lys27 Diub-BCEA-SH。发明人惊喜地发现，利用该方法制备的Lys27二泛素具备多种应用价值。
本发明展示了一个研究实例，可用于捕获特异性水解Lys27泛素链的去泛素化酶OTUD2。本发明的另一个研究实例展示了该二泛素可进一步脱硫制备成不可降解泛素链，能够非共价结合Lys27泛素链特异性识别蛋白UCHL3，用于阐明Lys27泛素链被特异性识别的分子机制。
此外，本发明提供了一个可快速制备均一链类型的高级泛素链(大于二泛素)的方法。
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：合成Cl-BCEA-Acm，即式1所示化合物
将第一原料N-羟甲基乙酰胺(0.45g,5mmol,1eq)和第二原料2-氯-N-(2-(三苯甲基硫醚)乙基)乙胺(1.9g,5mmol,1eq)或2-氯-N-叔丁氧羰基-N-(2-(三苯甲基硫醚)乙基)-乙胺(2.0g,5mmol,1eq)二者中一种混合，溶于4ml去离子水中，在冰浴条件瞎冷却10min，然后向冰浴冷却的混合液中缓慢滴加三氟乙酸，三氟甲磺酸，三异丙基硅烷体积比为92.5:5:2.5的切割试剂(24ml)，撤去冰浴室温反应4hr。加入等体积80ml水和乙醚萃取三次，合并水相，待乙醚挥发后冻干以便获得产物约1g，产率50％。由于副产物不影响后续和蛋白片段的连接，故无需分离。将获得的产物经质谱(MS)检测，由图1的结果可知，主产物为目标产物Cl-BCEA-Acm。
实施例2：制备Lys27 Diub-BCEA-SH
1.制备第三蛋白片段
利用大肠杆菌重组表达Ub77D，菌液沉淀加入50mM Tris,pH 7.50,超声破碎，离心，上清加入1％HClO4。12000rpm离心1h。取上清过滤，3.5K透析袋透析(透析液5-10mMTris)两次。浓缩Ub77D至终浓度20-30mg/ml。加入含10％水合肼的100mM Tris pH 8.0溶液，与Ub77D蛋白溶液1比1混合(ub77d终浓度10-15mg/ml，水合肼终浓度5％)，混合溶液冰浴预冷10min。加入1uM(终浓度)的YUH1，上下颠倒后冰浴静置反应，RP-HPLC色谱实时监控，待原料转化完全(30分钟)，用TFA调pH至2-3出现白色沉淀YUH1离心取上清。用色谱分离上清。纯化后第三蛋白片段质谱和色谱结果如图2所示。
2.制备第二蛋白片段
将第三蛋白片段(25mg,3umol,1eq)加入HCl·Gn PBS缓冲液，pH 2.3，冰盐浴搅拌降温至-10℃。加入30ul 1M NaNO2水溶液，冰上低温搅拌30min。加入MESNa(50mg,0.3mmol,100eq)，调节至pH 4.8，离心静置过夜反应，分析型RP-HPLC确认酰肼基团氧化完成，半制备色谱分离冻干，纯化后第二蛋白片段质谱和色谱结果如图3所示。
3.制备第一蛋白片段
利用大肠杆菌重组表达UbK27C，菌液沉淀加入50mM Tris,pH 7.50,，超声破碎，离心，上清加入1％HClO4。12000rpm离心1h。取上清过滤，3.5K透析袋透析(透析液0.1％TFA,ddH2O)两次，冻干。第一蛋白片段质谱和色谱图结果如图4所示。
4.制备经过BCEA-Acm修饰处理的第一蛋白片段
第一蛋白片段(90mg，10umol，1eq)溶于5ml 6M Gn·HCl 200mM HEPES(pH＝9.0)溶液中，加入TCEP(5mg/mL)，随后加140ul 1M Cl-BCEA-Acm(化合物I)溶液，调节pH至8.5，室温过夜后利用分析型RP-HPLC确认反应完成，再利用半制备反向色谱分离纯化，经过BCEA-Acm修饰处理的第一蛋白片段的质谱和色谱图结果如图5所示。
5.连接处理
将经过BCEA-Acm修饰处理的第一蛋白片段(30mg，3.4umol，1eq)溶于3.4ml 200mMPBS，6MGn·HCl缓冲溶液中(pH7.4)加入15mg TCEP(5mg/mL)，离心待用。向蛋白溶液中加入510ul 100mM PdCl2水溶液，室温反应1hr。利用分析型RP-HPLC监控反应进程，监控进色谱柱时1:1加入1M DTT溶液络合Pd。确认反应完成后，向反应混合液中加入蛋白片段1(29mg,3.7umol,1.1eq)以及4-巯基苯乙酸(缩写MPAA,86mg,0.51mmol,150eq)，调节pH 5.0，离心放置3min。随后调节pH至6.4离心，30℃过夜反应，分析型RP-HPLC监控反应进程确认完成后，半制备分离冻干。蛋白片段连接反应过程如图6所示，制备获得的Lys27 Diub-BCEA-SH纯品经过二硫二吡啶活化既可作为探针用于下一步交联。Lys27Diub-BCEA-AT2的色谱和质谱图结果如图7所示。
6.折叠复性处理
蛋白连接产物Lys27 Diub-BCEA-SH(5mg,0.3umol)用200ul 100mM PBS,，6M Gn·HCl缓冲溶液(pH 7.4)溶解，冰上放置。缓慢滴加50mM Tris，150mM NaCl，pH 8.0缓冲溶液至2ml。14000rpm离心10min后，用SD75蛋白排阻色谱分离，获得复性后产物。
实施例3 Lys27 Diub-BCEA-SH用于共价交联去泛素化酶OTUD2
将实施例2制备的Lys27 Diub-BCEA-SH用二硫吡啶活化后，用于共价交联其特异性去泛素化酶。去泛素化酶水解泛素链依赖于酶活中心半胱氨酸，一旦去泛素化酶靠近二硫键活化后二泛素，利用酶活特性，半胱氨酸和二泛素发生二硫键交换，获得去泛素化酶和二泛素复合物。具体如下：
Lys27 Diub-BCEA-SH(5mg,0.3umol)3ul 500mM二硫二吡啶溶液，冰上反应1hr后利用除盐柱除去多余二硫二吡啶。体外重组表达活性特异水解K27泛素链的去泛素化酶OTUD2，在50mM Tris，100mM NaCl，pH8.0的交联缓冲液中，加入5uM Lys27Diub-BCEA-AT2，2uM OTUD2，隔时段取样跑胶监测反应进度。实验设计及反应过程如图8所示。
说明该法合成的二泛素能够作为探针用于捕获其特异性识别和活性蛋白，未来可用于组学和基础生化研究。
实施例4：Lys27 Diub-BCEA-SH脱硫后作为不可降解泛素链。
将实施例2制备的Lys27 Diub-BCEA-SH脱除SH后形成的Lys27 Diub衍生物由于在异肽键识别区域多出了一个乙基，阻碍了识别位点，成为不可降解泛素链。不可降解泛素链可用于研究与其特异性识别蛋白相互作用的分子机制。具体如下：
Lys27 Diub-BCEA-SH(5mg,0.3umol)溶解在脱硫缓冲溶液中(6M Gn·HCl，0.1MNa2HPO4，pH7.4)加入还原试剂TCEP至终浓度500mM,调节反应pH至6.9。最终控制反应体积为0.5ml，使蛋白含硫浓度为0.6umol/ml。加入tBuSH(106ul/umol S)，加入VA-044引发剂(34mg/umol S 0.1eq tBuSH)，37℃搅拌过夜反应。利用分析型RP-HPLC监控反应。利用半制备HPLC分离，质谱鉴定产物纯度。
体外重组表达活性特异水解K27泛素链的去泛素化酶OTUD2，在50mM Tris，100mMNaCl，10mM DTT，pH7.5的缓冲液中，加入5uM Lys27 Diub-BCEA，1uM OTUD2，隔时段取样跑胶监测反应进度。实验设计及反应过程如图9所示。
说明去泛素化酶不再具备水解Lys27 Diub-BCEA-SH脱硫后产物。Lys27Diub-BCEA-SH脱硫后形成的二泛素衍生物未来可用于基础生化研究。
实施例5：制备其他连接类型Lysn-Diub-BCEA-AT2探针。
泛素具备7个赖氨酸位点，能形成7种异肽键连接的二泛素。实施例2证明本方法能用于合成Lys27-Diub-BCEA-SH。本实施例证明该方法能用于合成其它6种连接类型的Lysn-Diub-BCEA-SH产物，并最终可用于制备成交联型探针。具体如下。
反应过程步骤参考实施例2。其中，针对每种链接类型二泛素制备，即将原料蛋白片段3对应改换为该链接位点的UbKnC突变体。例如，制备Lys6-Diub-BCEA-SH，蛋白片段3的序列替换为UbK6C。其余反应步骤不变。
制备获得的Lys6 Diub-BCEA-AT2的色谱和质谱结果如图10所示。
制备获得的Lys11 Diub-BCEA-AT2的色谱和质谱结果如图11所示。
制备获得的Lys29 Diub-BCEA-AT2的色谱和质谱结果如图12所示。
制备获得的Lys33 Diub-BCEA-AT2的色谱和质谱结果如图13所示。
制备获得的Lys48 Diub-BCEA-AT2的色谱和质谱结果如图14所示。
制备获得的Lys63 Diub-BCEA-AT2的色谱和质谱结果如图15所示。
说明该方法能够用于制备所有异肽键连接类型的二泛素，是一种高效、通用的泛素蛋白合成方法。
实施例6：更高级长链泛素制备
本发明还可以用于合成二泛素以上的长泛素链，如图16所示。说明本发明具备广泛多样的研究应用价值。
实施例7：蛋白侧链进行荧光标记
本发明可在目标蛋白半胱氨酸上完成BCEA-Acm结构修饰，脱除保护基后使得侧链半胱氨酸位点具备NCL反应性，能用于和多种末端硫酯结构的标记分子连接。包括荧光分子标记、侧链biotin修饰、脂肪烃修饰、PEG修饰等。具体方法流程如图17所示。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 清华大学
<120> 化合物及其制备方法和应用
<130> PIDC3174482
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 76
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 第一蛋白片段的氨基酸序列
<400> 1
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Cys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly
65 70 75
<210> 2
<211> 76
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 第二蛋白片段的氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (76)..(76)
<223> 具有硫酯基团
<400> 2
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly
65 70 75
<210> 3
<211> 76
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 经过BCEA-Acm修饰处理的第一蛋白片段
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> 具有BCEA-Acm修饰
<400> 3
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Cys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly
65 70 75
<210> 4
<211> 76
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 第三蛋白片段的氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (76)..(76)
<223> 具有酰肼基团
<400> 4
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly
65 70 75

Claims (26)

1.一种化合物，其为式(I)所示的化合物或式(I)所示化合物的药学上可接受的盐，
2.一种制备权利要求1所述化合物的方法，其特征在于，包括:将第一原料与第二原料进行接触，以便获得所述化合物，
其中，所述第一原料为N-羟甲基乙酰胺，所述第二原料为2-氯-N-(2-(三苯甲基硫醚)乙基)乙胺或2-氯-N-叔丁氧羰基-N-(2-(三苯甲基硫醚)乙基)-乙胺。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述接触是通过如下方式进行的：
(1)将第一原料和第二原料进行水溶解处理；
(2)将步骤(1)所得混合物进行冰浴冷却处理；
(3)在冰浴条件下，将冰浴冷却处理后复合物与切割试剂进行接触，所述切割试剂包括三氟乙酸、三氟甲磺酸和三异丙基硅烷；
(4)在室温条件下，将步骤(3)所得混合物进行切割反应，以便获得所述的化合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一原料、第二原料和水的用量比为5mmol：5mmol：4mL。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述冰浴冷却处理的时间为10min。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述三氟乙酸，三氟甲磺酸，三异丙基硅烷的体积比为92.5：5：2.5。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述切割试剂的体积为24mL。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述切割反应的时间为4小时。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述切割反应后进一步包括：
将切割反应产物进行N2吹干处理和萃取处理，所述萃取处理是通过将所述产物与水和乙醚进行接触，所述水和乙醚的体积比为1：1；以及
将萃取产物进行冻干处理，以便获得所述化合物。
10.一种制备多肽或蛋白质的方法，其特征在于，包括：
(1)将第一蛋白片段进行BCEA-Acm修饰处理，所述第一蛋白片段含有半胱氨酸；
(2)将经过BCEA-Acm修饰处理的第一蛋白片段进行Acm脱除处理，以便获得具有BCEA-SH修饰的第一蛋白片段；
(3)将所述具有BCEA-SH修饰的第一蛋白片段和第二蛋白片段进行自然化学连接，所述第二蛋白片段的C端具有硫酯基团，以便获得所述多肽或蛋白质，
其中，所述BCEA-Acm修饰处理是通过如下方式进行的：
将第一蛋白片段与权利要求1所述的化合物进行接触。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述Acm脱除处理是在氯化钯存在下进行的。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述氯化钯与所述第一蛋白片段的摩尔比为15：1。
13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述Acm脱除处理是在室温、pH为7的条件下进行1小时。
14.根据权利要求10所述的方法，步骤(3)进一步包括：
(3-1)将所述具有BCEA-SH修饰的第一蛋白片段与4-巯基苯乙酸接触，所述接触是在pH为5.2的条件下进行的；以及
(3-2)将步骤(3-1)产物与所述C端具有硫酯基团的第二蛋白片段在室温及pH6.4的条件下进行连接反应。
15.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，进一步包括：
(4)利用盐酸胍溶液对步骤(3)中所得到的多肽或蛋白质进行溶解处理，并利用pH为8.0的磷酸氢二钠缓冲溶液对所得溶解液进行稀释处理；
其中，盐酸胍浓度为6M，pH为8.0；磷酸二氢钠浓度为50mM。
16.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述第一蛋白片段是通过大肠杆菌重组表达获得的。
17.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，将所述第一蛋白片段与所述化合物在三-(2-羧乙基)膦存在的条件下进行接触。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述三-(2-羧乙基)膦的浓度为5mg/ml。
19.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述接触是在室温的条件下进行10～12小时。
20.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述化合物预先溶于二甲基亚砜，所得溶液的浓度为1M。
21.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述化合物与所述第一蛋白片段的摩尔比为15：1。
22.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述第二蛋白片段是通过以下步骤获得的：
(a)通过大肠杆菌重组表达和酶解法获得第三蛋白片段，所述第三蛋白片段的C端具有有酰肼基团；
(b)对所述第三蛋白片段进行氧化处理，所述氧化处理是通过将所述第三蛋白片段与亚硝酸钠进行接触进行的；
(c)将经过氧化处理后的第三蛋白片段与巯基乙基磺酸钠在pH为5的条件下进行接触，以便获得所述第二蛋白片段。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述第一蛋白片段具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
24.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述第二蛋白片段具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
25.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述经过BCEA-Acm修饰处理的第一蛋白片段具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
26.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述第三蛋白片段具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
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