CN103755843B

CN103755843B - N-9-芴甲氧羰基肼基树脂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103755843B
Application number: CN201310675781.XA
Authority: CN
Inventors: 刘磊; 黄轶超; 高帅
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2013-12-11
Filing date: 2013-12-11
Publication date: 2016-06-01
Anticipated expiration: 2033-12-11
Also published as: CN103755843A

Abstract

本发明提供了N-9-芴甲氧羰基肼基树脂及其制备方法和应用。其中，该N-9-芴甲氧羰基肼基树脂具有如式1所示的结构：

Description

N-9-芴甲氧羰基肼基树脂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于固相多肽合成技术领域，具体地，涉及N-9-芴甲氧羰基肼基树脂及其制备方法，以及制备多肽酰肼的方法。

背景技术

蛋白质的化学全合成能够在原子水平调控蛋白质的组成结构，从而有希望回答有关蛋白质在生命过程中起功能的一系列问题。高效的蛋白质全合成技术特别具有学术价值与商业价值。合成蛋白质的常用策略是首先在固相上合成多肽片段，其次在水溶液中实现多肽片段的连接。目前使用最成功的多肽片段连接方法是StephenKent教授报道的自然化学连接NCL。自然化学连接策略的基本原理是利用多肽1的C端硫酯单元与多肽2的N端半胱氨酸单元发生化学选择性反应，从而将多肽1和多肽2拼接为一个肽片段。不幸的是，该策略需要用到的C端硫酯单元只能通过Boc固相合成法直接获得。而Boc固相合成法需要使用剧毒试剂氟化氢HF，且操作复杂，对环境不友好。最近发现利用Fmoc固相合成法可以得到C端酰肼单元，而酰肼单元可以在水溶液中迅速转化成C端硫酯单元参与自然化学连接NCL，称之为酰肼参与的自然化学连接NCL。随后酰肼参与的自然化学连接NCL被用于多段多肽拼接反应、环蛋白合成等。目前多肽C段酰肼的合成主要通过第一代肼基Wang树脂（Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,7645-7649.;中国专利ZL201110062686.3）和第二代肼基2-Cl-Trityl-Cl树脂（Lett.Pept.Sci.1995,2,315-318;ChemBioChem2012,13,542-546;ActaChim.Sinica2012,70,1471-1476.）。第二代相比第一代树脂制备酰肼的产率和纯度有所提高。但上述两种树脂保存期较短，容易变质。

因而，目前用于固相多肽酰肼合成的树脂仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种合成简便、取代度较高、便于长期保存的固相多肽酰肼合成用树脂。

在本发明的一个方面，本发明提供一种N-9-芴甲氧羰基（Fmoc）肼基树脂。根据本发明的实施例，所述N-9-芴甲氧羰基肼基树脂具有如式1所示的结构：

其中，R₁、R₂各自独立的为H、甲基、甲氧基或卤素，优选R₁和R₂均为H，R₁和R₂分别为H和甲基，R₁和R₂分别为H和甲氧基，或者R₁和R₂分别为Cl和H。发明人发现，本发明的N-9-芴甲氧羰基（Fmoc）肼基树脂，合成简便，能够长期保存而不发生变质，并且能够有效用于制备多肽酰肼，进而能够有效用于酰肼参与的自然化学连接NCL。

在本发明的一个实施例中，所述N-9-芴甲氧羰基肼基树脂，具有如式2所示的结构：

在本发明的另一方面，本发明提供了一种制备N-9-芴甲氧羰基肼基树脂的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将载体树脂在有机溶剂中进行溶胀处理，以便得到经过溶胀的载体树脂；于预定温度条件下，向所述经过溶胀的载体树脂中加入碱和N-9-芴甲氧羰基肼盐酸盐，振荡混合，并反应预定时间，以便得到反应混合物；向所述反应混合物中加入甲醇处理10分钟以上，并将经过甲醇处理的反应混合物抽干，以便得到树脂；将所述树脂依次用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、水、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醚分别洗3次，并抽干，以便得到经过洗涤的树脂；将所述经过洗涤的树脂真空干燥至少2小时，以便得到N-9-芴甲氧羰基肼基树脂。发明人发现，利用该方法，能够有效制备N-9-芴甲氧羰基肼基树脂，且操作简单，对设备无特殊要求，且制备获得的N-9-芴甲氧羰基肼基树脂便于长期保存，不易变质。

根据本发明的实施例，本发明的制备N-9-芴甲氧羰基肼基树脂的方法，还可以具有以下附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述载体树脂为三苯甲基氯树脂（Trityl-Cl树脂）、4-甲基三苯甲基氯树脂（4-Methyltrityl-Cl树脂）、4-甲氧基三苯甲基氯树脂（4-Methoxytrityl-Cl树脂）或2-氯三苯甲基氯树脂（2-Cl-Trityl-Cl树脂）。

根据本发明的实施例，所述载体树脂的取代度为0.3mmol/g～1.4mmol/g，优选0.58mmol/g。由此，制备获得的N-9-芴甲氧羰基肼基树脂具有较高的反应效率的同时，有利于大规模合成。

根据本发明的实施例，所述有机溶剂为选自N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N-甲基吡咯烷酮的至少一种。由此，对载体树脂的溶胀性较好，有利于提高载体树脂的溶胀效率。

根据本发明的实施例，所述溶胀处理是在0摄氏度冰浴条件下进行的。由此，有利于使反应温和平稳地发生。

根据本发明的实施例，所述预定温度为4摄氏度-37摄氏度，优选25摄氏度。由此，能够使得载体树脂和N-9-芴甲氧羰基肼盐酸盐在最适合的温度条件下反应，有利于提高反应效率。

根据本发明的实施例，所述预定时间为6小时-24小时，优选12小时。由此，能够使得载体树脂和N-9-芴甲氧羰基肼盐酸盐充分反应，有利于提高产率。

根据本发明的实施例，振荡混合的方式为水平平摇、垂直翻转或磁子搅拌，优选为磁子搅拌。

根据本发明的实施例，所述N-9-芴甲氧羰基肼盐酸盐的摩尔用量为所述载体树脂取代度的2-6倍，优选4倍。由此，有利于提高产率。

根据本发明的实施例，所述碱为二异丙基乙基胺、三乙胺或吡啶。由此，使得N-9-芴甲氧羰基肼盐酸盐和载体树脂能够在最适合的条件下反应，有利于提高反应效率。

根据本发明的实施例，所述碱的摩尔用量为载体树脂取代度的5-15倍，优选10倍。由此，有利于提高产率。

在本发明的再一方面，本发明还提供了一种制备多肽酰肼的方法，其特征在于，包括：利用前面所述的方法制备N-9-芴甲氧羰基肼基树脂；脱除所述N-9-芴甲氧羰基肼基树脂上的Fmoc保护基团；以及利用脱除Fmoc保护基团的N-9-芴甲氧羰基肼基树脂，通过Fmoc固相多肽合成方法制备多肽酰肼。利用该方法，能够有效制备多肽酰肼。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明的一个实施例，制备N-9-芴甲氧羰基肼基树脂的方法的流程示意图；

图2显示了根据本发明的一个实施例，制备获得的5肽酰肼H-Leu-Tyr-Arg-Ala-Ala-NHNH₂的电喷雾质谱与高效液相色谱的检测谱图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在本发明的一个方面，本发明提供一种N-9-芴甲氧羰基肼基树脂。根据本发明的实施例，所述N-9-芴甲氧羰基肼基树脂具有如式1所示的结构：

其中，R₁、R₂各自独立的为H、甲基、甲氧基或卤素，优选R₁和R₂均为H、R₁和R₂分别为H和甲基、R₁和R₂分别为H和甲氧基，或者R₁和R₂分别为Cl和H。发明人发现，本发明的N-9-芴甲氧羰基（Fmoc）肼基树脂，合成简便，能够长期保存而不发生变质，并且能够有效用于制备多肽酰肼，进而能够有效用于酰肼参与的自然化学连接NCL。

需要说明的是，本文中的式1和式2中的结构表示树脂基本骨架。根据本发明的实施例，所述树脂基本骨架不受特别限制。在本发明的一个实施例中，所述树脂基本骨架为聚苯乙烯骨架。

在本发明的另一方面，本发明提供了一种制备N-9-芴甲氧羰基肼基树脂的方法。根据本发明的实施例，参照图1，该方法包括以下步骤：

S100：溶胀处理

首先，将载体树脂在有机溶剂中进行溶胀处理，以便得到经过溶胀的载体树脂。根据本发明的实施例，所述载体树脂的种类不受特别限制，本领域技术人员可以根据实际情况灵活选择。根据本发明的一些具体示例，所述载体树脂为Trityl-Cl树脂、4-Methyltrityl-Cl树脂、4-Methoxytrityl-Cl树脂或2-Cl-Trityl-Cl树脂。根据本发明的实施例，所述载体树脂的取代度不受特别限制。在本发明的一些实施例中，所述载体树脂的取代度为0.3mmol/g～1.4mmol/g，在本发明的一个优选实施例中，所述载体树脂的取代度为0.58mmol/g。由此，制备获得的N-9-芴甲氧羰基肼基树脂具有较高的反应效率的同时，有利于大规模合成。根据本发明的实施例，所述有机溶剂的种类不受特别限制。在本发明的一些实施例中，所述有机溶剂为选自N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N-甲基吡咯烷酮的至少一种。由此，对载体树脂的溶胀性较好，有利于提高载体树脂的溶胀效率。在本发明的一个实施例中，所述溶胀处理是在0摄氏度冰浴条件下进行的。由此，有利于使反应温和平稳地发生。

需要说明的是，在本文中使用的术语“取代度”是指每克树脂中肼基的含量，取代度的单位是mmol/g，即毫摩尔/克，表示每克树脂含有肼基的物质的量。

S200：载体树脂与N-9-芴甲氧羰基肼盐酸盐反应

接着，于预定温度条件下，向所述经过溶胀的载体树脂中加入碱和N-9-芴甲氧羰基肼盐酸盐，振荡混合，并反应预定时间，以便得到反应混合物。

其中，根据本发明的实施例，所述碱的种类和用量不受特别限制，只要有利于载体树脂和N-9-芴甲氧羰基肼盐酸盐之间进行反应，本领域技术人员可以根据具体情况灵活选择。在本发明的一些实施例中，所述碱为二异丙基乙基胺、三乙胺或吡啶，所述碱的摩尔用量为载体树脂取代度的5-15倍，在本发明的一个优选实施例中，所述碱的摩尔用量为载体树脂取代度的10倍。

根据本发明的实施例，所述N-9-芴甲氧羰基肼盐酸盐的用量不受特别限制。在本发明的一些实施例中，所述N-9-芴甲氧羰基肼盐酸盐的摩尔用量为所述载体树脂取代度的2-6倍，在本发明的一个优选实施例中，所述N-9-芴甲氧羰基肼盐酸盐的摩尔用量为所述载体树脂取代度的4倍。

根据本发明的实施例，所述预定温度为4摄氏度-37摄氏度，在本发明的一个优选实施例中，所述预定温度为25摄氏度。由此，能够使得载体树脂和N-9-芴甲氧羰基肼盐酸盐在最适合的温度条件下反应，有利于提高反应效率。

根据本发明的实施例，振荡混合的方式不受特别限制，只要能够有效将反应物混匀即可。根据本发明的一些实施例，振荡混合的方式为水平平摇、垂直翻转或磁子搅拌，在本发明的一个优选实施例中，振荡混合的方式为磁子搅拌。

根据本发明的实施例，反应的时间不受特别限制。根据本发明的一些实施例，所述预定时间为6小时-24小时，在本发明的一个优选实施例中，所述预定时间为12小时。由此，能够使得载体树脂和N-9-芴甲氧羰基肼盐酸盐充分反应，有利于提高产率。

S300：甲醇处理

然后，向所述反应混合物中加入甲醇处理10分钟以上，并将经过甲醇处理的反应混合物抽干，以便得到树脂。由此，能够有效地封闭活性氯。

S400：洗涤

接下来，将上述获得的树脂依次用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、水、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醚分别洗3次，并抽干，以便得到经过洗涤的树脂。由此，能够有效地将附着在树脂表面的未反应的物质去除。

S500：真空干燥

最后，将所述经过洗涤的树脂真空干燥至少2小时，以便得到N-9-芴甲氧羰基肼基树脂。

发明人发现，利用该方法，能够有效制备N-9-芴甲氧羰基肼基树脂，且操作简单，对设备无特殊要求，且制备获得的N-9-芴甲氧羰基肼基树脂便于长期保存，不易变质。

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：N-9-芴甲氧羰基肼基树脂的制备

按照以下步骤制备N-9-芴甲氧羰基肼基树脂：

1）称取2g2-Cl-Trityl-Cl树脂（取代度0.58mmol/g），然后于0摄氏度冰浴并搅拌条件下，将其在16mL二氯甲烷中溶胀15分钟，得到经过溶胀的树脂；

2）将1.16gN-9-芴甲氧羰基肼盐酸盐（4倍当量）、2.02mL二异丙基乙基胺（10倍当量）、4mL二氯甲烷和20mLN,N-二甲基甲酰胺混合均匀，然后加入步骤1）中获得的经过溶胀的树脂中，温度由0摄氏度度缓慢升至室温（25摄氏度），过夜反应12小时，获得反应混合物；

3）向步骤2）中获得的反应混合物中加入0.32mL甲醇，继续搅拌10分钟后，抽滤，得到树脂；

4）将步骤3）中获得的树脂依次用5mL二氯甲烷、5mLN,N-二甲基甲酰胺、5mL水、5mLN,N-二甲基甲酰胺、5mL甲醇，5mL乙醚分别洗涤三次，然后抽干，获得经过洗涤的树脂；

5）将步骤4）中获得的经过洗涤的树脂真空干燥2小时，经过洗涤的树脂呈粉末状，然后于4摄氏度保存，由此获得N-9-芴甲氧羰基肼基树脂。

测定制备获得的N-9-芴甲氧羰基肼基树脂在20%哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液中的301nm波长处的吸光度：A301=0.507（测量值0.509,0.506,0.507取平均），计算得N-9-芴甲氧羰基肼基树脂的实际取代度是0.39mmol/g。其中，取代度=A301/ε*k*v/w，其中ε=7800（Fmoc哌啶加成产物在301nm处的吸光系数），k=100（稀释倍数），v=12mL（哌解液体积），w=0.2g（树脂重量）。

实施例2：多肽酰肼的制备

利用实施例1中制备获得的N-9-芴甲氧羰基肼基树脂，按照以下步骤制备5肽酰肼H-Leu-Tyr-Arg-Ala-Ala-NHNH₂：

1）称取300mgFmoc肼基树脂（取代度0.39mmol/g）转移到多肽合成管中，将树脂溶胀在8mL二氯甲烷中，静置10分钟后抽干；

2）加入3mL20%哌啶/N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液，反应2min后抽干，脱除Fmoc保护基，然重复一遍脱保护10min，抽干；

3）DMF3X5mL（即洗涤三次，每次5ml）、二氯甲烷3X5mL、DMF3X5mL，洗涤树脂，抽干；

4）称取146mgFmoc保护的丙氨酸（Fmoc-Ala-OH，4倍当量），160mg缩合剂（即苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，3.6倍当量），溶于3mLDMF中，再加入碱，即二异丙基乙基胺（8倍当量），然后向此溶液加入步骤3）中抽干获得的树脂，室温振荡反应1小时后抽干；

5）DMF3X5mL、二氯甲烷3X5mL、DMF3X5mL，洗涤步骤4）中获得的产物；

6）重复步骤2）-5），步骤4使用的氨基酸分别是Fmoc保护的丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸，即Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH；

7）最后一个氨基酸反应完之后重复步骤2-3，最后用二氯甲烷3X5mL再次洗涤经以上步骤获得的产物；

8）加入5mL切割试剂（体积比87.5%三氟乙酸、5%苯酚、5%水、2.5%三异丙基硅烷）处理树脂4小时，使多肽酰肼转移至切割试剂中，然后浓缩切割试剂，加入20倍体积的0度乙醚沉淀离心，得到粉末状多肽酰肼粗品。使用电喷雾质谱（ESI-MS）与高效液相色谱（HPLC）对制备获得的多肽酰肼进行表征，结果见图2，其中，左侧为电喷雾质谱图，其中质量电荷比为607.3处的信号为制备获得的5肽酰肼的质谱信号；右侧为高效液相色谱图，其中最强的吸收峰为制备获得的5肽酰肼的色谱吸收峰。

根据图2中的电喷雾质谱（ESI-MS）的分子量比对与高效液相色谱（HPLC）的峰形，能够判断合成的多肽酰肼是目标产物。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种N-9-芴甲氧羰基肼基树脂，其特征在于，具有如式1所示的结构：

其中，R₁、R₂各自独立的为H、甲基、甲氧基或卤素。

2.根据权利要求1所述的N-9-芴甲氧羰基肼基树脂，其特征在于，R₁和R₂均为H，R₁和R₂分别为H和甲基，R₁和R₂分别为H和甲氧基，或者R₁和R₂分别为Cl和H。

3.根据权利要求1所述的N-9-芴甲氧羰基肼基树脂，其特征在于，具有如式2所示的结构：

4.一种制备N-9-芴甲氧羰基肼基树脂的方法，其特征在于，包括：

将载体树脂在有机溶剂中进行溶胀处理，以便得到经过溶胀的载体树脂；

于预定温度条件下，向所述经过溶胀的载体树脂中加入碱和N-9-芴甲氧羰基肼盐酸盐，振荡混合，并反应预定时间，以便得到反应混合物；

向所述反应混合物中加入甲醇处理10分钟以上，并将经过甲醇处理的反应混合物抽干，以便得到树脂；

将所述树脂依次用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、水、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醚分别洗3次，并抽干，以便得到经过洗涤的树脂；

将所述经过洗涤的树脂真空干燥至少2小时，以便得到N-9-芴甲氧羰基肼基树脂。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述载体树脂为三苯甲基氯树脂、4-甲基三苯甲基氯树脂、4-甲氧基三苯甲基氯树脂或2-氯三苯甲基氯树脂。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述载体树脂的取代度为0.3mmol/g～1.4mmol/g。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述载体树脂的取代度为0.58mmol/g。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为选自N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N-甲基吡咯烷酮的至少一种。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述溶胀是在0摄氏度冰浴条件下进行的。

10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述预定温度为4摄氏度-37摄氏度。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述预定温度为25摄氏度。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述预定时间为6小时-24小时。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述预定时间为12小时。

14.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，振荡混合的方式为水平平摇、垂直翻转或磁子搅拌。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，振荡混合的方式为磁子搅拌。

16.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述N-9-芴甲氧羰基肼盐酸盐的摩尔用量为所述载体树脂取代度的2-6倍。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述N-9-芴甲氧羰基肼盐酸盐的摩尔用量为所述载体树脂取代度的4倍。

18.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述碱为二异丙基乙基胺、三乙胺或吡啶。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述碱的摩尔用量为所述载体树脂取代度的5-15倍。

20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述碱的摩尔用量为所述载体树脂取代度的10倍。

21.一种制备多肽酰肼的方法，其特征在于，包括：

利用权利要求4-20任意一项所述的方法制备N-9-芴甲氧羰基肼基树脂；

脱除所述N-9-芴甲氧羰基肼基树脂上的Fmoc保护基团；

利用脱除Fmoc保护基团的N-9-芴甲氧羰基肼基树脂，通过Fmoc固相多肽合成方法制备多肽酰肼。