CN111040020A - 一种烯烃硫醚类订书肽及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种烯烃硫醚类订书肽，其特征在于，烯烃硫醚类订书肽结构为式(Ⅰ)，

其中，X为n个天然氨基酸组成的多肽，n为2‑4的整数，m₁和m₂分别为1‑3数值范围内的整数，C为半胱氨酸中的α‑碳原子，Y₁为3‑8个天然氨基酸组成的多肽；优选的，Y₂为2‑5个天然氨基酸组成的多肽或为天然氨基酸中的任意一种。这些订书肽分子在不同的肿瘤细胞中表现出了明显的抗增殖活性，可用于肿瘤疾病的治疗。

Description

一种烯烃硫醚类订书肽及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种烯烃硫醚类订书肽及其制备方法与应用。

技术背景

肽类分子因具有活性高、毒性低、用药剂量低等优点，在药物研发中受到广泛的关注。但是肽类分子能够作为多肽类药物实现上市销售的很少，主要原因是多肽类药物多为线性多肽，因空间构象不固定具有透细胞膜性能差和体内易分解的缺点。

多肽类药物空间构象不固定的原因在于：α-螺旋是蛋白质中最为普遍的二级结构单位，且在蛋白与蛋白、蛋白与DNA的相互作用中发挥极其重要的作用。如果从蛋白质中截取该α-螺旋结构合成得到短肽片段，该短肽片段在水溶液中不能保持稳定的α-螺旋二级结构，从而具有空间构象不固定的缺点。因此人们不断尝试能够保持多肽α-螺旋结构稳定的方法，2000年Verdine等人用碳碳键作为连接桥(订书桥)来稳定多肽中的α-螺旋结构，得到的多肽称为订书肽(stapled peptides)，即：在固相合成多肽链的过程中引入两个α-甲基-α-烯基非天然氨基酸，然后通过烯烃复分解反应实现环合，使得线性多肽的构象得以固定，得到订书肽。与线性肽相比，订书肽因构象固定，与靶标通常具有更好的亲和力，也具有良好的透膜性能、体内稳定性和较长的体内半衰期。

然而，α-甲基-α-烯基氨基酸(如(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊烯酸)是非天然氨基酸，是目前制备订书肽的重要中间体。由于其具有手性中心，需要手性合成或通过拆分制备，且在合成订书肽时需要在氨基酸的α位引入侧链烯烃以形成α位全取代的结构，这就要求该α-甲基-α-烯基氨基酸本身必须具有高的光学纯度，否则合成出来的订书肽会出现非对映异构体的杂质，造成后期分离纯化的困难。目前通过手性合成或拆分的办法制备光学纯度高的α-甲基-α-烯基非天然氨基酸成本很高，也就限制了此类订书肽的推广和应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，第一方面，提供一种烯烃硫醚类订书肽，其结构式见式(Ⅰ)，

其中，X为n个天然氨基酸组成的多肽，n为2-4的整数，m₁和m₂分别为1-3数值范围内的整数，C为半胱氨酸中的α-碳原子，Y₁为3-8个天然氨基酸组成的多肽；优选的，Y₂为2-5个天然氨基酸组成的多肽或为天然氨基酸中的任意一种。

所述天然氨基酸为甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、色氨酸(W)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)、半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)。

Y₁选自亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、谷氨酰胺(Q)、脯氨酸(P)、苏氨酸(T)、苯丙氨酸(F)、丝氨酸(S)、天冬氨酸(D)中的至少三种；

Y₂选自亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、谷氨酰胺(Q)、脯氨酸(P)中的至少两种；

X为赖氨酸(K)、色氨酸(W)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、天冬氨酸(D)、丝氨酸(S)中的一种或多种组成的含有n个氨基酸的多肽。

当Y₁为6-8个天然氨基酸组成的多肽时，Y₂为2-4个天然氨基酸组成的多肽或为所述天然氨基酸中的任意一种；

优选的，Y₁的序列结构由HO-向NH₂-顺序为Q-P-T-F-S-D时，Y₂的序列结构由HO-向NH₂-顺序为L-P或为所述天然氨基酸中的任意一种。

当Y₁为3-5个天然氨基酸组成的多肽时，Y₂为2-5个天然氨基酸组成的多肽；

优选的，Y₁的序列结构由HO-向NH₂-顺序为L-K-L时，Y₂的序列结构由HO-向NH₂-顺序为L-Q。

m₁＝1或2，m₂＝1或2。

其结构式为式(1)-式(12)中的一种：

第二方面，本发明提供一种药物组合物，其活性成分为上述烯烃硫醚类订书肽。

第三方面，本发明提供一种制备上述烯烃硫醚类订书肽的方法，，在半胱氨酸的巯基上引入烯烃链得到非天然氨基酸Fmoc-Cys(C₃-C₅-ene)-OH作为订书肽环合关键砌块，通过烯烃复分解反应进行环合。

包括以下步骤：

(1)将半胱氨酸在碱的作用下与卤代烯烃(优选C₃-C₅的卤代烯烃)反应，再经Fmoc保护制得烯烃醚化的非天然氨基酸Fmoc-Cys(C₃-C₅-ene)-OH；

(2)使用Wang树脂通过标准固相多肽合成方法组装线性多肽，且在多肽序列组装过程中在X多肽位置的之前和之后分别加入所述非天然氨基酸Fmoc-Cys(C₃-C₅-ene)-OH；

(3)步骤(2)得到的线性多肽组装完毕后，加入Grubbs催化剂，通过烯烃复分解反应进行环合。

具体的，还可包括常规步骤：反应结束后使用三氟乙酸裂解液切割，得到订书肽粗品；高压制备液相色谱分离纯化，冷冻干燥得到所述烯烃硫醚类订书肽。

第三方面，本发明提供上述烯烃硫醚类订书肽在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤包括但不限于乳腺癌和结肠癌。

本发明提出的烯烃硫醚类订书肽是一种新的订书肽桥连结构，制备时在手性的半胱氨酸的α-碳原子(氨基酸中与羧基相连的C为α-碳原子)的巯基上通过硫醚化，引入烯烃链，再将两个烯烃硫醚化的半胱氨酸插入肽链特定位置中，通过烯烃复分解反应环合得到含有烯烃硫醚链的订书肽。这种订书肽合成方便，且用光学纯度高的烯烃硫醚化半胱氨酸作原料即可；另外由于烯烃连接在半胱氨酸远端的巯基上，对肽链骨架构象的影响较小，不影响肽链本身的功效。

此外，本发明的烯烃硫醚类订书肽因构象能够保持固定，在保留线性肽与靶标具有更好的亲和力、良好的透膜性能、体内稳定性和较长的体内半衰期等优点的前提下，还具有明显的抗肿瘤活性，尤其抗乳腺癌(如人乳腺癌细胞MCF-7)、抗结肠癌(人结肠癌细胞HCT116和SW480)等方面具有显著活性。

附图说明

图1所示为本发明烯烃硫醚类订书肽的分子结构示意图。

具体实施方式

现有文献报道的制备订书肽的方法均是从氨基酸出发，首先进行保护，然后环化、选择性引入烯烃侧链，然后再开环，去掉保护基等，一般需要七八步反应才能制备得到。因其合成路线长、原料昂贵限制了其产品的应用。此外，早期订书肽中的线性多肽是将蛋白中的一段有功能的多肽截取出来，然后利用这段多肽中已有的氨基酸选择订合位点，这样的话可选择的订合位点很受限制，不利于订书桥的形成。

半胱氨酸中含有巯基官能团，该巯基在订书肽的合成中常用作订合位点，但现有方法均将线性多肽中的半胱氨酸通过化学方法直接订合，即：线性多肽中不同位置有两个半胱氨酸，每个半胱氨酸的巯基残基都暴露在外，通过与二溴代烷烃反应，烷烃和巯基可以形成硫醚，从而将两个巯基残基连接起来，形成订书桥。用这种方法合成订书肽时，半胱氨酸上的巯基残基可能被包裹在线性多肽深部，使得反应困难。可见，该方法选择性低、收率不高、实用性差。

针对以上缺陷，发明人在合成肽链时，首先在半胱氨酸的巯基上进行改造，引入烯烃基团，烯烃基团的引入不会改变半胱氨酸的手性和构型；其次，在设计好的位置接入能够形成订书桥的两个砌块(即形成订书桥的两个连接点或订合位点)，肽链合成完毕后，再通过特定反应将两个砌块的末端连接，形成订书桥，从而得到订书肽。本发明还提出了一种新结构的订书肽，该订书肽中具有新的订书桥，即：半胱氨酸先与卤代烯烃进行醚化反应，在半胱氨酸上引入烯烃基团，制备得到烯烃醚化的半胱氨酸，并将其作为订书肽中形成订书桥的关键砌块；在合成线性肽时，将两个烯烃醚化的半胱氨酸引入线性肽链的不同位置，最后通过Grubbs催化剂催化烯烃发生复分解反应，形成订书桥，实现多肽的订合，得到的烯烃硫醚类订书肽，如式(Ⅰ)所示。本发明这种订合方法还未见报道。

式(Ⅰ)中，(X)_n表示含有2-4和天然氨基酸的多肽片段，n为该多肽片段中氨基酸的数量，如2、3、4，(X)_n中的n个氨基酸均为天然氨基酸，可相同，可不同，最好在W、K、L、F、D和S中选择；天然氨基酸有20种，分别为甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、色氨酸(W)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)、半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)；m₁和m₂分别为1-3的整数(如1、2或3)，Y₁为由前述20种天然氨基酸组成的多肽片段，多肽片段中氨基酸数量为3-8(如3、4、5、6、7或8)；Y₂为由前述20种天然氨基酸中的任意一种，或这20种天然氨基酸组成的多肽片段，多肽片段中氨基酸数量为2-5(如2、3、4或5)。

优选的，当Y₁为三肽、四肽或五肽时，Y₂为二肽、三肽、四肽或五肽；如，Y₁是HO-L-K-L-NH₂的序列结构时，Y₂是HO-L-Q-NH₂的序列结构。当Y₁为六肽、七肽或八肽时，Y₂为二肽、三肽或四肽或为20种天然氨基酸中的任意一种；如，Y₁是HO-Q-P-T-F-S-D-NH₂的序列结构时，Y₂是HO-L-P-NH₂的序列结构，或20种天然氨基酸中的任意一种。

本发明使用烯烃醚化的半胱氨酸作为合成订书肽的关键砌块，烯烃醚化的半胱氨酸容易大量合成和制备且价格便宜。最后通过Grubbs催化剂催化烯烃发生复分解反应，形成订书桥，该反应收率较高，且产生的杂质较少。

制备式(Ⅰ)烯烃硫醚类订书肽的方法，具体包括以下步骤：

(1)半胱氨酸在碱的作用下与卤代烯烃(C₃-C₅)发生硫醚化反应，再在半胱氨酸的氨基端连接Fmoc以保护氨基，得到烯烃醚化的非天然氨基酸Fmoc-Cys(C₃-C₅-ene)-OH，作为订书肽环合的关键砌块(即订书肽中形成订书桥的砌块)；

(2)使用Wang树脂通过标准固相多肽合成方法合成得到线性多肽HO-Y₁-烯烃醚化的C-(X)_n-烯烃醚化的C-Y₂-NH₂，完成线性肽链的组装，其中烯烃醚化的C是步骤(1)得到的烯烃醚化的非天然氨基酸Fmoc-Cys(C₃-C₅-ene)-OH；

(3)线性肽链组装完毕后，在反应体系中加入二氯甲烷和Grubbs催化剂，线性肽链中两个烯烃醚化的非天然氨基酸Fmoc-Cys(C₃-C₅-ene)-OH的烯烃侧链在Grubbs催化剂的催化下通过烯烃复分解反应连接起来，形成环的结构(即进行环合)，当作为原料的线性肽链反应完毕后，反应结束；反应结束后使用三氟乙酸裂解液将订书肽粗品从树脂上切割下来，得到订书肽粗品；高压制备液相色谱分离纯化，冷冻干燥得到烯烃硫醚类订书肽。

以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明进行限制。

以下具体实施例说明本发明化合物的制备及其性质，实施例并非穷举。实施例中使用的试剂均为市场购买，核磁共振谱用日本电子JNM-ECA-400超导核磁仪(400MHz)测定，ESI质谱用美国安捷伦1260-G6230A型质谱仪测定，高分辨率质谱用美国布鲁克9.4T超高性能混合型串联傅里叶变换离子回旋共振质谱Q-FT-ICR-MS测定，MALDI-TOF质谱用德国Bruker UltraflexⅢMALDI-TOF型质谱仪测定。

实施例1：

(XL-1)的合成

(1)烯烃醚化的非天然氨基酸Fmoc-Cys(C₃-C₅-ene)-OH的合成

Fmoc-Cys(Allyl)-OH的合成

L-半胱氨酸2.98g(24.7mmol)置于250mL烧瓶中，加入75mL乙醇，冰浴，将氢氧化钠3.50g(87.5mmol)溶于45mL水中后加入反应体系。室温搅拌10分钟，加入3-溴丙烯3.30g(24.7mmol)，继续搅拌反应3小时。加入冰醋酸至反应体系pH＝5.5，大量的白色固体析出，过滤，真空干燥，得到2.50g固体。将此固体置于100mL单口烧瓶中，加入50mL水，将1.90g碳酸氢钠(22.6mmol)分批加入反应体系内，6.54g 9-芴甲基琥珀酰亚氨基碳酸酯(Fmoc-OSu)(19.4mmol)溶于25mL四氢呋喃中后，加入反应体系内，室温反应2小时。减压浓缩，水相调节pH＝5，以150mL乙酸乙酯萃取水相，有机相以无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸出溶剂后经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1：1)得到2.50g淡黄色固体。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm):12.88(1H,s)，7.90(2H,d,J＝7.6Hz)，7.74(2H,d,J＝7.3Hz)，7.43(2H,t,J＝7.4Hz)，7.33(2H,t,J＝7.4Hz)，5.80(1H,m)，5.07(1H,dd,J＝1.7Hz,J＝17.1Hz)，5.00(1H,d,J＝10.4Hz)，4.34-4.22(3H,m)，4.14(1H,m)，2.93(1H,dd,J＝4.5Hz,J＝13.7Hz)，2.76(1H,dd,J＝9.5Hz,J＝13.7Hz)，2.60(2H,m)，2.27(2H,m)。ESI m/z：[M+H]⁺384.13，[M+Na]⁺406.11，确证该淡黄色固体为Fmoc-Cys(Allyl)-OH。

Fmoc-Cys(Butyl)-OH的合成

将0.56g L半胱氨酸(4.6mmol)置于250mL单口烧瓶中，加入75mL乙醇，冰浴，将0.82g氢氧化钠(20.5mmol)溶于15mL水中后加入反应体系。室温搅拌10min，慢慢加入0.62g4-溴丁烯(4.6mmol)，继续搅拌3h。加入冰醋酸至反应体系至pH＝5.5，大量的白色固体析出，过滤，真空干燥，得到0.80g白色固体。将此固体置于50mL单口烧瓶中，加入10mL水，将0.67g碳酸氢钠(8.0mmol)分批加入反应体系内，1.51g Fmoc-OSu(4.5mmol)溶于6.0mL四氢呋喃后加入反应体系内，室温反应2小时。减压浓缩，调节pH＝5，以150mL乙酸乙酯萃取水相，有机相以无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸出溶剂后经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1：1)得到0.40g淡黄色固体。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm):7.89(2H,d,J＝7.6Hz)，7.72(2H,d,J＝7.3Hz)，7.41(2H,m)，7.32(2H,m)，6.94(1H,s)，5.72(1H,m)，5.09(1H,d,J＝15.4Hz)，5.03(1H,d,J＝9.8Hz)，4.30(1H,d,J＝12.0Hz)，4.23(2H,m)，3.91(1H,s)，3.11(2H,d,J＝7.3Hz)，2.91(1H,m)，2.71(1H,m)。ESI m/z：[M+H]⁺398.13，[M+Na]⁺420.11，[M+K]⁺436.08，确证该淡黄色固体为Fmoc-Cys(Butyl)-OH。

(2)固相合成HO-LKLC(Butyl)KFKC(Allyl)LQ-NH₂序列

称取0.30g Wang树脂(负载率0.63mmol/g，0.19mmol)与201mg Fmoc-Leu-OH(N-芴甲氧羰基-L-亮氨酸，0.57mmol)混合于3mL二氯甲烷(DCM)和2滴N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合溶剂中，加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)69mg(0.57mmol)搅拌使其充分溶解，冰浴下缓缓加入二异丙基碳二亚胺(DIC)71mg(0.57mmol)，反应于冰浴下搅拌30min后于室温搅拌24h，过滤，以1.5mL DMF、1.5mL DCM和1.5mL甲醇(MeOH)依次洗涤后真空干燥，得到0.54g树脂。将树脂混悬于4mL吡啶-醋酸酐-DMF(v/v＝1:1:2)混合溶液于固相合成管里，振摇1h后滤除反应液，树脂以1.5mL DMF洗3次后用于后续反应。

将树脂混悬于3mL 20％(v/v)哌啶/DMF溶液，振摇15min后滤除反应液，树脂以1.5mL DMF洗涤后，依次向树脂中加入267mg Fmoc-Lys(tBu)-OH(N-芴甲氧羰基-N’-叔丁氧羰基-L-赖氨酸，0.57mmol)、182mg O-苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)(0.57mmol)和77mg1-羟基苯并三唑(HOBt)(0.57mmol)，再加入3mL DMF于固相合成管中(其中有树脂)，向体系缓缓滴加57mg N-甲基吗啡啉(NMM)(0.57mmol)，反应振摇45-60min，过滤，树脂依次以1.5mL DMF、1.5mL DCM和1.5mL甲醇洗涤后真空干燥。按照缩合步骤逐一连接各氨基酸后脱除保护。

(3)订书肽XL-1的合成

将负载线性多肽的树脂0.3g与一代Grubbs催化剂(苯亚甲基双(三环己基磷)二氯化钌)8.2mg(0.01mmol)溶解于6mL DCM中，反应振摇24h。过滤，依次以4.5mL DMF、4.5mLDCM和4.5mL甲醇洗涤后真空干燥。加入3mL裂解液，裂解液为三氟乙酸(TFA):水(H₂O):三异丙基硅烷(Tis):间甲酚(m-Cresol):1,2-乙二硫醇(1,2-Ethanedithiol)＝90:2.5:2.5:2.5:2.5(v/v)，反应于室温下反应90min，过滤，滤液50℃减压浓缩，加入乙醚，离心3min，弃去上清液，沉淀以氩气吹干，沉淀即为粗品订书肽。将180mg粗品订书肽以乙腈和水的混合溶液溶解(水中含0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)，乙腈和水的体积比为1:1)，以微孔滤膜(Nylon，0.45μM)过滤。样品溶液用装备C18制备柱的高效液相色谱仪进行分离纯化，流动相为乙腈：水(0.1％TFA溶液)＝35:65。冷冻干燥得到目标订书肽(命名为XL-1)42mg。HR MSm/z：for[M]⁺,calculated 1289.641,found 1289.604.

使用与XL-1相同的制备过程，仅将Fmoc-Cys(Butyl)-OH变成Fmoc-Cys(Allyl)-OH，得到式(2)化合物，且经确证为式(2)化合物。

实施例2：

(XL-2)的合成

按实施例1的方法进行。0.30g Wang树脂(负载率0.63mmol/g，0.19mmol)通过标准固相多肽合成方法进行合成。分离纯化后得到目标订书肽(命名为XL-2)38mg。HR MS m/z：for[M]⁺,calculated 1289.641,found 1289.604。

使用与XL-2相同的制备过程，仅将Fmoc-Cys(Butyl)-OH变成Fmoc-Cys(Allyl)-OH，得到式(4)化合物，且经确证为式(4)化合物。

实施例3：

(XL-3)的合成

按实施例1的方法进行。0.30g Wang树脂(负载率0.63mmol/g，0.19mmol)通过标准固相多肽合成方法进行合成。分离纯化后得到目标订书(命名为XL-3)41mg。MALDI-TOF m/z：[M]⁺1476.0。

使用与XL-3相同的制备过程，仅将一个Fmoc-Cys(Allyl)-OH变成Fmoc-Cys(Butyl)-OH，得到式(5)化合物，经确证为式(5)化合物。

实施例4：

(XL-4)的合成

按实施例1的方法进行。0.30g Wang树脂(负载率0.63mmol/g，0.19mmol)通过标准固相多肽合成方法进行合成。分离纯化后得到目标订书肽(命名为XL-4)36mg。HR MS m/z：for[M+Na-H]⁺,calculated 1498.664,found 1498.830。

使用与XL-4相同的制备过程，仅将一个Fmoc-Cys(Allyl)-OH变成Fmoc-Cys(Butyl)-OH，得到式(7)化合物，且经确证为式(7)化合物。

实施例5：

(XL-5)的合成

按实施例1的方法进行。0.30g Wang树脂(负载率0.63mmol/g，0.19mmol)通过标准固相多肽合成方法进行合成。分离纯化后得到目标订书肽(命名为XL-5)45mg。HR MS m/z：for[M]⁺,calculated 1504.706,found 1504.689。

使用与XL-5相同的制备过程，仅将一个Fmoc-Cys(Allyl)-OH变成Fmoc-Cys(Butyl)-OH，得到式(10)化合物，且经确证为式(10)化合物。

实施例6：

(XL-6)的合成

按实施例1的方法进行。0.30g Wang树脂(负载率0.63mmol/g，0.19mmol)通过标准固相多肽合成方法进行合成。分离纯化后得到目标订书肽(命名为XL-6)39mg。HR MS m/z：for[M]⁺,calculated 1504.706,found 1504.691。

使用与XL-6相同的制备过程，仅将一个Fmoc-Cys(Allyl)-OH变成Fmoc-Cys(Butyl)-OH，得到式(12)化合物，且经确证为式(12)化合物。

实验一：抑制人乳腺癌细胞MCF-7增殖实验

培养基及培养条件：DMEM培养基：胎牛血清(V/V)＝9:1，同时加入1％(V/V)的双抗(即终浓度为100U/mL青霉素和100U/mL的链霉素)，37℃，5％CO₂环境下培养，得到培养基A。

药物溶液配制：精密称定冻干的实施例1-6的订书肽适量，以DMEM完全培养基为稀释液，配制浓度为500μmol/L的含药溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，在无菌条件下分别将上述溶液用培养基A稀释至浓度分别为500、250、125、50、10μmol/L的订书肽溶液，现用现配。

MCF-7细胞MTT实验：取对数生长期的MCF-7细胞，胰蛋白酶消化离心后，加入培养基A混悬细胞，血球计数板计数调节细胞浓度为1×10⁵/mL，接种于96孔板，每孔100μL，周边一圈孔板中加入100μL的PBS(pH＝7.4)保证细胞生长情况的均一。将上述96孔板放入培养箱中37℃，5％CO₂环境培养过夜，弃去旧培养基，将上述配制好的500、250、125、50、10μmol/L的订书肽溶液分别以每孔100μL的体积加入孔中，每个浓度设4个复孔。加药完毕放回培养箱中继续培养24h后,每孔加入20μLMTT(0.5mg/mL)，37℃条件孵育4h，孵育完毕后吸弃上清液，每孔加入150μL的DMSO，将板置于摇床振荡10min，酶标仪于490nm处测定各孔的OD值。每个96孔板均设置对照孔及空白孔，细胞存活率用各孔的OD值比值表示：细胞抑制率(％)＝(OD_对照-OD_实验)/(OD_对照-OD_空白)×100％。

以实施例1和2为例，实验结果见表1，表1中XL-1U和XL-2U分别为与XL-1和XL-2序列相同但未经环合形成订书桥的线性多肽。同时还以结构式为式A的化合物(L-029)作为阳性对照，L-029是具有抗肿瘤活性的小分子化合物，其制备方法及用途见公开号为CN103183665A的专利申请，其浓度为100、50、25、1、0.1μmol/L时，细胞抑制率分别为25.1％、8.5％、6.1％、5.0％、0，IC₅₀为＞100μM。

表1订书肽XL-1和XL-2对MCF-7细胞的抑制作用

	XL-1	XL-1U	XL-2	XL-2U
					500μM	63.7％	62.0％	81.6％	66.6％
250μM	64.0％	55.4％	83.2％	64.9％
					125μM	56.2％	51.7％	76.1％	50.5％
50μM	54.7％	25.7％	75.9％	41.2％
					10μM	17.8％	17.8％	67.4％	23.6％
IC<sub>50</sub>(μM)	44.6	120	<10.0	119

此实验表明，本发明的订书肽对MCF-7细胞有显著的抑制作用。此外，与没有订书桥但序列相同的线性多肽相比，采用本发明订合位点形成的订书肽对MCF-7细胞的抑制作用显著提高；并且跟阳性对照(L-029)相比，本发明的订书肽对MCF-7细胞的抑制作用也显著提高，说明本发明订书肽在抗乳腺癌方面具有较好的应用前景。

实验二：抑制人结肠癌细胞HCT116增殖实验

培养基及培养条件：同实验一。

药物溶液配制：同实验一。

HCT116细胞MTT实验：同实验一，仅是将实验一的MCF-7细胞换成HCT116细胞。

以实施例3和4为例，实验结果见表2，表2中XL-3U为与XL-3序列相似但未经环合形成订书桥的线性多肽，XL-3U的序列为HO-QPTFSDLWKLLP-NH₂；XL-4U为与XL-4序列相同但未经环合形成订书桥的线性多肽。同时还以结构式为式A的化合物(L-029)作为阳性对照，得出其IC₅₀为96μM。

表2订书肽XL-3和XL-4对HCT116细胞的抑制作用

此实验表明，本发明的订书肽对HCT116细胞有显著的抑制作用。此外，与没有订书桥的序列相同或相似的线性多肽相比，采用本发明订合位点形成的订书肽对HCT116细胞的抑制作用显著提高；并且跟阳性对照(L-029)相比，本发明的订书肽对HCT116细胞的抑制作用也显著提高，说明本发明订书肽在抗结肠癌方面具有较好的应用前景。

实验三：抑制人结肠癌细胞SW480增殖实验

培养基及培养条件：同实验一。

药物溶液配制：同实验一。

SW480细胞MTT实验：同实验一，仅是将实验一的MCF-7细胞换成SW480细胞。

以实施例3和4为例，实验结果见表3，表3中XL-3U为与XL-3序列相似但未经环合形成订书桥的线性多肽，XL-3U的序列为HO-QPTFSDLWKLLP-NH₂；XL-4U为与XL-4序列相同但未经环合形成订书桥的线性多肽。同时还以结构式为式A的化合物(L-029)作为阳性对照，得出其IC₅₀为76μM。

表3订书肽XL-3和XL-4对SW480细胞的抑制作用

	XL-3	XL-3U	XL-4	XL-4U
					500μM	80.0％	58.9％	88.4％	41.8％
250μM	77.9％	56.4％	86.0％	15.7％
					125μM	72.3％	45.7％	72.5％	15.0％
50μM	68.6％	45.6％	61.3％	14.3％
					10μM	66.9％	19.2％	95.1％	17.2％
IC<sub>50</sub>(μM)	<10.0	172	43	＞500

此实验表明，本发明的订书肽对SW480细胞有显著的抑制作用。此外，与没有订书桥的序列相同或相似的线性多肽相比，采用本发明订合位点形成的订书肽对SW480细胞的抑制作用显著提高；并且跟阳性对照(L-029)相比，本发明的订书肽对SW480细胞的抑制作用也显著提高，说明本发明订书肽在抗结肠癌方面具有较好的应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的内容。

Claims (10)

1.一种烯烃硫醚类订书肽，其特征在于，其结构式见式(Ⅰ)，

其中，X为n个天然氨基酸组成的多肽，n为2-4的整数，m₁和m₂分别为1-3数值范围内的整数，C为半胱氨酸中的α-碳原子，Y₁为3-8个天然氨基酸组成的多肽；优选的，Y₂为2-5个天然氨基酸组成的多肽或为天然氨基酸中的任意一种。

2.如权利要求1所述的烯烃硫醚类订书肽，其特征在于，所述天然氨基酸为甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、色氨酸(W)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)、半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)。

3.如权利要求1或2所述的烯烃硫醚类订书肽，其特征在于，Y₁选自亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、谷氨酰胺(Q)、脯氨酸(P)、苏氨酸(T)、苯丙氨酸(F)、丝氨酸(S)、天冬氨酸(D)中的至少三种；

Y₂选自亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、谷氨酰胺(Q)、脯氨酸(P)中的至少两种；

X为赖氨酸(K)、色氨酸(W)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、天冬氨酸(D)、丝氨酸(S)中的一种或多种组成的含有n个氨基酸的多肽。

4.如权利要求3所述的烯烃硫醚类订书肽，其特征在于，当Y₁为6-8个天然氨基酸组成的多肽时，Y₂为2-4个天然氨基酸组成的多肽或为所述天然氨基酸中的任意一种；

优选的，Y₁的序列结构由HO-向NH₂-顺序为Q-P-T-F-S-D时，Y₂的序列结构由HO-向NH₂-顺序为L-P或为所述天然氨基酸中的任意一种。

当Y₁为3-5个天然氨基酸组成的多肽时，Y₂为2-5个天然氨基酸组成的多肽；

优选的，Y₁的序列结构由HO-向NH₂-顺序为L-K-L时，Y₂的序列结构由HO-向NH₂-顺序为L-Q。

5.如权利要求1-4任一所述的烯烃硫醚类订书肽，其特征在于，m₁＝1或2，m₂＝1或2。

6.如权利要求1-4任一所述的烯烃硫醚类订书肽，其特征在于，其结构式为式(1)-式(12)中的一种：

7.一种药物组合物，其特征在于，其活性成分为权利要求1-6任一所述烯烃硫醚类订书肽。

8.一种制备权利要求1-6任一所述烯烃硫醚类订书肽的方法，其特征在于，在半胱氨酸的巯基上引入烯烃链得到非天然氨基酸Fmoc-Cys(C₃-C₅-ene)-OH作为订书肽环合关键砌块，通过烯烃复分解反应进行环合。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将半胱氨酸在碱的作用下与卤代烯烃(优选C₃-C₅的卤代烯烃)反应，再经Fmoc保护制得烯烃醚化的非天然氨基酸Fmoc-Cys(C₃-C₅-ene)-OH；

(2)使用Wang树脂通过标准固相多肽合成方法组装线性多肽，且在多肽序列组装过程中在X多肽位置的之前和之后分别加入所述非天然氨基酸Fmoc-Cys(C₃-C₅-ene)-OH；

(3)步骤(2)得到的线性多肽组装完毕后，加入Grubbs催化剂，通过烯烃复分解反应进行环合。

10.如权利要求1至6任一所述的烯烃硫醚类订书肽在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤包括但不限于乳腺癌和结肠癌。

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