CN102123726A - 用于治疗与帕金森氏病有关的症状的化合物 - Google Patents

用于治疗与帕金森氏病有关的症状的化合物 Download PDF

Info

Publication number
CN102123726A
CN102123726A CN2009801313674A CN200980131367A CN102123726A CN 102123726 A CN102123726 A CN 102123726A CN 2009801313674 A CN2009801313674 A CN 2009801313674A CN 200980131367 A CN200980131367 A CN 200980131367A CN 102123726 A CN102123726 A CN 102123726A
Authority
CN
China
Prior art keywords
peptide
chemical compound
mimic epitope
preferred
tyrosine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2009801313674A
Other languages
English (en)
Inventor
马库斯·曼德勒
弗兰克·马特纳
沃尔特·施密特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Affiris AG
Original Assignee
Affiris AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AT0095208A external-priority patent/AT506820B1/de
Priority claimed from AT0095108A external-priority patent/AT506819B1/de
Application filed by Affiris AG filed Critical Affiris AG
Publication of CN102123726A publication Critical patent/CN102123726A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及一种包含用于治疗、预防和/或改善帕金森氏病运动症状的肽的化合物，所述肽能结合特异于淀粉样蛋白β肽(Aβ)的表位的抗体。

Description

用于治疗与帕金森氏病有关的症状的化合物
本发明涉及用于预防、改善和治疗与帕金森氏病有关的症状的方法和手段。
阿尔茨海默氏病(AD)和帕金森氏病(PD)是人类中痴呆和运动失调的最常见原因。虽然AD的特征为自淀粉样蛋白前体蛋白(APP)衍生的淀粉样蛋白β蛋白(形成所谓的Aβ斑)的累积，但是PD患者形成α-突触核蛋白(a-Syn，aSyn；形成所谓的Lewy小体)的病理累积。这两种分子都被认为是这些神经变性性病症的主要疾病起因。AD和PD这两种疾病都与神经元和突触连接的变性、特神经递质的缺乏、和错折叠蛋白质(它们的非致病型式蛋白在正常中枢神经系统功能中发挥重要作用)的异常累积有关。
最近，在临床上限定了与运动失调有关但临床症状与AD的不同的一种新型痴呆，即相关性痴呆或特发性帕金森综合征。这种新症状被限定为具有Lewy小体的痴呆或具有痴呆的帕金森氏病(DLB/PDD)。DLB/PDD占所有痴呆病例的多达25％，而且不得不被认为是老年人中痴呆的第二位最突出形式。该疾病的特征为与广泛的淀粉样蛋白沉积有关的分布广泛的Lewy小体病理的形成。分布广泛的Lewy小体的这种存在使DLB/PDD病例与所有其它形式的痴呆以及与其它运动失调区分开。对DLB/PDD的神经学评估显示在注意力方面、在执行功能方面、在记忆以及行为行为和运动改变方面的突出异常。
当前认为aSyn和Aβ对神经系统具有不同的，以及趋同的致病效果。认为突触核蛋白比认知功能更严重地影响运动功能，而淀粉样蛋白β肽被描述为具有相反的影响。另外，通过参与协同神经变性途径，aSYN和Aβ能更直接地相互作用。最近显示了在临床前疾病模型中不同的病理分子(包括Aβ、τ以及aSyn)能互相加剧毒性效果，而且指示Aβ在不同神经变性性状况中的重要功能。在一种最近的转基因动物DLB/PDD模型中，显示了haSYN和hAPP这两种分子在小鼠中的共表达导致认知和运动改变的发生，其伴有胆碱能神经元的损失和突触囊泡的减少，广泛淀粉状蛋白斑(amyloid plaque)的形成，和haSYN免疫反应性神经元内纤丝内含体(inclusion)。所有这些特征也见于DLB/PDD综合征。
帕金森氏病的症状的当前疗法涉及给患有所述疾病的患者施用多巴胺能药。认为多巴胺能药减轻帕金森氏病的症状，因为认为这些症状是由脑中多巴胺的剥夺引起的。脑中多巴胺的不足因此可通过给患者施用多巴胺能药诸如多巴胺激动剂或多巴胺前体例如左旋多巴来补充。帕金森氏病没有已建立的治愈，这意味着症状恶化，迫使随疾病进展而增大药物日剂量。另外，长期使用剂量增大的左旋多巴导致发生运动并发症，诸如疲惫和不随意运动(运动障碍)。
运动功能障碍的症状能通过左旋多巴处理来改善，尤其是与改进其功效的其它化合物组合。
施用多巴胺能药的主要缺点之一在于这些药必须以规则间隔施用。另外，这些药只导致患者中多巴胺能药的升高，不清除帕金森氏病的症状的原因，即a-Syn斑。
本发明的一个目的是，提供通过降低a-Syn沉积物的量来持续治疗帕金森氏病症状的工具(means)。
本发明涉及一种包含用于治疗和/或改善帕金森氏病运动症状的肽的化合物，所述肽能结合特异于淀粉样蛋白β肽(Aβ)的表位的抗体。
令人惊讶地发现能够诱导针对淀粉样蛋白β肽的抗体并因此可用来治疗β-淀粉样变诸如阿尔茨海默氏病的化合物可用于治疗和改善帕金森氏病的症状，特别是帕金森氏病的运动症状。通过施用所述化合物而形成的抗体令人惊讶地降低a-Syn沉积物的量。
如本文中使用的，“运动症状(motor symptoms)”指关于帕金森氏病处理中的医疗产品的临床调查的EMEA指导方针(CPMP/EWP/563/95Rev.1)中描述的那些影响患有所述疾病的患者的运动行为以及影响患者的自主功能的帕金森氏病症状。这些症状包括但不限于核心症状静止性震颤(restingtremor)，运动徐缓(bradykinesia)，强直(rigidity)，体位不稳(postural instability)以及弯腰体位(stooped posture)，张力障碍(dystonia)，疲劳(fatigue)，细微运动灵巧性和运动协调受损impaired fine motor dexterity and motor coordination()，整体运动协调受损(impaired gross motor coordination)，运动缺乏(poverty ofmovement)(摆臂缩小(decreased arm swing))，静坐不能(akathisia)，言语问题(speech problems)，诸如由肌肉控制缺失引起的嗓音柔和(softness of voice)或言语模糊(slurred speech)，面部表情丧失(loss of facial expression)，或“掩蔽(masking)”，写字过小(micrographia)，吞咽困难(difficulty swallowing)，性功能障碍(sexual dysfunction)，流涎(drooling)。
如本文中使用的，术语“表位”指抗原受到特定抗体分子识别的免疫原性区。抗原可拥有一个或多个表位，每一个均能够结合识别该特定表位的抗体。
术语“能结合特异于淀粉样蛋白β肽的表位的抗体的肽”意味着所述肽能结合通过给哺乳动物施用淀粉样蛋白β肽或其片段而生成的淀粉样蛋白β肽特异性抗体。具有所述结合能力的肽能够在哺乳动物中诱导诱导淀粉样蛋白β肽特异性抗体形成。后一类抗体因此结合本发明的化合物以及淀粉样蛋白β肽。
依照本发明的一个优选实施方案，所述淀粉样蛋白β肽表位选自下组：DAEFRH，EFRHDSGY，pEFRHDSGY，EVHHQKL，HQKLVF和HQKLVFFAED。
特别优选使用能够结合针对/特异于前述天然存在淀粉样蛋白β肽表位的抗体的本发明化合物。因此，依照本发明的化合物可包含具有所述氨基酸序列的肽。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的化合物优选不包含具有氨基酸序列DAEFRH，EFRHDSGY，pEFRHDSGY，EVHHQKL，HQKLVF和HQKLVFFAED的肽，但也结合淀粉样蛋白β特异性抗体。
为了鉴定此类抗体诱导肽，可使用噬菌体文库和肽文库。当然，也有可能通过使用组合化学的手段来鉴定此类肽。所有这些方法都涉及使肽集合的肽接触淀粉样蛋白β肽特异性抗体的步骤。可以分离并测序(如果相应肽的氨基酸序列未知的话)集合中结合所述抗体的肽。
在下文中，列出了能够在哺乳动物中诱导淀粉样蛋白β抗体形成的肽。这些肽也可用于减轻帕金森氏病的症状。
依照本发明的一个优选实施方案，肽包含氨基酸序列
X1X2X3X4X5X6X7，               (式I)
其中X1为G或具有羟基的氨基酸或带负电荷的氨基酸，优选甘氨酸(G)，谷氨酸(E)，酪氨酸(Y)，丝氨酸(S)或天冬氨酸(D)，
X2为疏水性的氨基酸或带正电荷的氨基酸，优选天冬酰胺(N)，异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，缬氨酸(V)，赖氨酸(K)，色氨酸(W)，精氨酸(R)，酪氨酸(Y)，苯丙氨酸(F)或丙氨酸(A)，
X3为带负电荷的氨基酸，优选天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)，
X4为芳香族的氨基酸或疏水性的氨基酸或亮氨酸(L)，优选酪氨酸(Y)，苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)，
X5为组氨酸(H)，赖氨酸(K)，酪氨酸(Y)，苯丙氨酸(F)或精氨酸(R)，优选组氨酸(H)，苯丙氨酸(F)或精氨酸(R)，且
X6不存在或为丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)，天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)，精氨酸(R)，异亮氨酸(I)，赖氨酸(K)，酪氨酸(Y)，或甘氨酸(G)，优选苏氨酸(T)，天冬酰胺(N)，天冬氨酸(D)，精氨酸(R)，异亮氨酸(I)或甘氨酸(G)，
X7不存在或为任何氨基酸，优选脯氨酸(P)，酪氨酸(Y)，苏氨酸(T)，谷氨酰胺(Q)，丙氨酸(A)，组氨酸(H)或丝氨酸(S)，
优选EIDYHR，ELDYHR，EVDYHR，DIDYHR，DLDYHR，DVDYHR，DI-DYRR，DLDYRR，DVDYRR，DKELRI，DWELRI，YREFFI，YREFRI，YAEFRG，EAEFRG，DYEFRG，ELEFRG，DRELRI，DKELKI，DRELKI，GREFRN，EYEFRG，DWEFRDA，SWEFRT，DKELR，SFEFRG，DAEFRWP，DNEFRSP，GSEFRDY，GAEFRFT，SAEFRTQ，SAEFRAT，SWEFRNP，SWEFRLY，SWELRQA，SVEFRYH，SYEFRHH，SQEFRTP，S SEFRVS，DWEFRD，DAELRY，DWELRQ，SLEFRF，GPEFRW，GKEFRT，AYEFRH，DKE(Nle)R，DKE(Nva)R或DKE(Cha)R。
依照本发明的又一个实施方案，所述肽包含氨基酸序列
X1RX2DX3(X4)n(X5)m(X6)o，          (式II)，
其中X1为异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)，
X2为色氨酸(W)或酪氨酸(Y)，
X3为苏氨酸(T)，缬氨酸(V)，丙氨酸(A)，甲硫氨酸(M)，谷氨酰胺(Q)或甘氨酸(G)，
X4为脯氨酸(P)，丙氨酸(A)，酪氨酸(Y)，丝氨酸(S)，半胱氨酸(C)或甘氨酸(G)，
X5为脯氨酸(P)，亮氨酸(L)，甘氨酸(G)或半胱氨酸(C)，
X6为半胱氨酸(C)，
n，m和o独立地为0或1，
优选IRWDTP(C)，VRWDVYP(C)，IRYDAPL(C)，IRYDMAG(C)，IRWDTSL(C)，IRWDQP(C)，IRWDG(C)或IRWDGG(C)。
本发明的化合物的肽可包含氨基酸序列
EX1WHX2X3(X4)n(X5)m                (式III)，
其中X1为缬氨酸(V)，精氨酸(R)或亮氨酸(L)，
X2为精氨酸(R)或谷氨酸(E)，
X3为丙氨酸(A)，组氨酸(H)，赖氨酸(K)，亮氨酸(L)，酪氨酸(Y)或甘氨酸(G)，
X4为脯氨酸(P)，组氨酸(H)，苯丙氨酸(F)或谷氨酰胺(Q)或半胱氨酸
X5为半胱氨酸(C)，
n和m独立地为0或1，
优选EVWHRHQ(C)，ERWHEKH(C)，EVWHRLQ(C)，ELWHRYP(C)，ELWHRAF(C)，ELWHRA(C)，EVWHRG(C)，EVWHRH(C)和ERWHEK(C)，优选EVWHRHQ(C)，ERWHEKH(C)，EVWHRLQ(C)，ELWHRYP(C)或ELWHRAF(C)。
依照本发明的一个特别优选的实施方案，肽包含氨基酸序列QDFRHY(C)，SEFKHG(C)，TSFRHG(C)，TSVFRH(C)，TPFRHT(C)，SQFRHY(C)，LMFRHN(C)，SAFRHH(C)，LPFRHG(C)，SHFRHG(C)，ILFRHG(C)，QFKHDL(C)，NWFPHP(C)，EEFKYS(C)，NELRHST(C)，GEMRHQP(C)，DTYFPRS(C)，VELRHSR(C)，YSMRHDA(C)，AANYFPR(C)，SPNQFRH(C)，SSSFFPR(C)，EDWFFWH(C)，SAGSFRH(C)，QVMRHHA(C)，SEFSHSS(C)，QPNLFYH(C)，ELFKHHL(C)，TLHEFRH(C)，ATFRHSP(C)，APMYFPH(C)，TYFSHSL(C)，HEPLFSH(C)，SLMRHSS(C)，EFLRHTL(C)，ATPLFRH(C)，QELKRYY(C)，THTDFRH(C)，LHIPFRH(C)，NELFKHF(C)，SQYFPRP(C)，DEHPFRH(C)，MLPFRHG(C)，SAMRHSL(C)，TPLMFWH(C)，LQFKHST(C)，ATFRHST(C)，TGLMFKH(C)，AEFSHWH(C)，QSEFKHW(C)，AEFMHSV(C)，ADHDFRH(C)，DGLLFKH(C)，IGFRHDS(C)，SNSEFRR(C)，SELRHST(C)，THMEFRR(C)，EELRHSV(C)，QLFKHSP(C)，YEFRHAQ(C)，SNFRHSV(C)，APIQFRH(C)，AYFPHTS(C)，NSSELRH(C)，TEFRHKA(C)，TSTEMWH(C)，SQSYFKH(C)，(C)SEFKH，SEFKH(C)，(C)HEFRH或HEFRH(C)。
依照本发明的另一个优选实施方案，肽包含氨基酸序列
(X1)mGX2X3X4FX5X6(X7)n              (式IV)，
其中X1为丝氨酸(S)，丙氨酸(A)或半胱氨酸(c)，
X2为丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，谷氨酸(E)，天冬氨酸(D)，谷氨酰胺(Q)或甲硫氨酸(M)，
X3为异亮氨酸(I)，酪氨酸(Y)，甲硫氨酸(M)或亮氨酸(L)，
X4为亮氨酸(L)，精氨酸(R)，谷氨酰胺(Q)，色氨酸(W)，缬氨酸(V)，组氨酸(H)，酪氨酸(Y)，异亮氨酸(I)，赖氨酸(K)甲硫氨酸(M)或苯丙氨酸(F)，
X5为丙氨酸(A)，苯丙氨酸(F)，组氨酸(H)，天冬酰胺(N)，精氨酸(R)，谷氨酸(E)，异亮氨酸(I)，谷氨酰胺(Q)，天冬氨酸(D)，脯氨酸(P)或色氨酸(W)，甘氨酸(G)
X6为任何氨基酸残基，
X7为半胱氨酸(C)，
m和n独立地为0或1，
优选SGEYVFH(C)，SGQLKFP(C)，SGQIWFR(C)，SGEIHFN(C)，GQIWFIS(C)，GQIIFQS(C)，GQIRFDH(C)，GEMWFAL(C)，GELQFPP(C)，GELWFP(C)，GEMQFFI(C)，GELYFRA(C)，GEIRFAL(C)，GMIVFPH(C)，GEIWFEG(C)，GDLKFPL(C)，GQILFPV(C)，GELFFPK(C)，GQIMFPR(C)，GSLFFWP(C)，GEILFGM(C)，GQLKFPF(C)，GTIFFRD(C)，GQIKFAQ(C)，GTLIFHH(C)，GEIRFGS(C)，GQIQFPL(C)，GEIKFDH(C)，GEIQFGA(C)，GELFFEK(C)，GEIRFEL(C)，GEIYFER(C)，SGEIYFER(C)，AGEIYFER(C)或(C)GEIYFER。
依照本发明的又一个优选实施方案，肽包含氨基酸序列
(X1)mHX2X3X4X5FX6(X7)n              (式V)，
其中X1为丝氨酸(S)，苏氨酸(T)或半胱氨酸(C)，
X2为谷氨酰胺(Q)，苏氨酸(T)或甲硫氨酸(M)，
X3为赖氨酸(K)或精氨酸(R)，
X4为亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，
X5为色氨酸(W)，酪氨酸(Y)，苯丙氨酸(F)或异亮氨酸(I)，
X6为天冬酰胺(N)，谷氨酸(E)，丙氨酸(A)或半胱氨酸(C)，
X7为半胱氨酸(C)，
n和m独立地为0或1，
优选SHTRLYF(C)，HMRLFFN(C)，SHQRLWF(C)，HQKMIFA(C)，HMRMYFE(C)，THQRLWF(C)或HQKMIF(C)。
依照本发明的一个优选实施方案，肽包含氨基酸序列AIPLFVM(C)，KLPLFVM(C)，QLPLFVL(C)或NDAKIVF(C)。
依照本发明的化合物优选为多肽/肽且包含4-30个氨基酸残基，优选5-25个氨基酸残基，更优选5-20个氨基酸残基。
本发明的化合物也可以是包含4-30个氨基酸残基的多肽的一部分。
展现对淀粉样蛋白β抗体的亲和力的肽可被认为是模拟表位。依照本发明，术语“模拟表位(mimotope)”指具有拓扑学与它所模拟的表位等同的构象的分子。模拟表位结合抗体免疫特异性结合期望抗原的相同抗原结合区。模拟表位会在宿主中引发免疫学应答，其能与它所模拟的抗原起反应。模拟表位还可在涉及表位和结合所述表位的抗体的体外抑制测定法(例如ELISA抑制测定法)中起它所模拟的表位的竞争物的作用。然而，本发明的模拟表位可不必在体外抑制测定法中阻止或竞争它所模拟的表位的结合，尽管它能够在给哺乳动物施用时诱导特异性免疫应答。包含此类模拟表位(还有上文列出的那些)的本发明化合物具有避免形成自身反应性T细胞的优点，因为化合物的肽具有与天然存在淀粉样蛋白β肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列。
本发明的模拟表位/肽可以通过本领域公知的化学合成方法来合成生成，或是作为分离的肽或作为另一肽或多肽的一部分。或者，肽模拟表位可以在生成肽模拟表位的微生物中生成，然后分离并(如果想要的话)进一步纯化。肽模拟表位可以在微生物诸如细菌，酵母或真菌中，在真核细胞诸如哺乳动物或昆虫细胞中，或在重组病毒载体诸如腺病毒，痘病毒，疱疹病毒，Simliki森林病毒，杆状病毒，噬菌体，辛德毕斯病毒或仙台病毒中生成。用于生成肽模拟表位的合适细菌包括大肠杆菌(E.coli)，枯草杆菌(B.subtilis)或能够表达肽诸如肽模拟表位的任何其它细菌。用于表达肽模拟表位的合适酵母类型包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)，假丝酵母属(Candida)，巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)或能够表达肽的任何其它酵母。相应的方法是本领域公知的。用于分离和纯化重组生成的肽的方法也是本领域公知的，而且包括例如凝胶过滤，亲和层析，离子交换层析等。
为了便于分离肽模拟表位，可生成融合多肽，其中肽模拟表位翻译融合(共价连接)至能够通过亲和层析来分离的异源多肽。典型的异源多肽为His标签(例如His6；6个组氨酸残基)，GST标签(谷胱甘肽-S-转移酶)等。融合多肽不见便于纯化模拟表位，而且还能防止模拟表位多肽在纯化期间被降解。如果想要在纯化后除去异源多肽，那么融合多肽可在肽模拟表位与异源多肽之间的接合处包含切割位点。切割位点由受到该位点处的氨基酸序列特异性的酶(例如蛋白酶)切割的氨基酸序列组成。
本发明的模拟表位还可在它们的N和/或C端处或附近修饰，使得在所述位置处结合半胱氨酸残基。在一个优选的实施方案中，末端位置(位于肽的N和C端)的半胱氨酸残基用于经二硫键来环化肽。
本发明的模拟表位还可用于各种测定法和试剂盒，特别是免疫学测定法和试剂盒。因此，特别优选的是，模拟表位可以是另一肽或多肽的一部分，特别是在免疫学测定法中用作报告物的酶。此类报告酶包括例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
依照本发明的模拟表位优选是它们的氨基酸序列不同于Aβ或Aβ片段的氨基酸序列的抗原性多肽。在这个方面，本发明的模拟表位可不仅包含一种或多种天然存在氨基酸残基的氨基酸替代，而且还可包含一种或多种非天然氨基酸(即不是来自20种“经典的”氨基酸)的氨基酸替代或者它们可以完全由此类非天然氨基酸装配而成。此外，本发明诱导针对及结合Aβ1-40/42，AβpE3-40/42，Aβ3-40/42，Aβ11-40/42，AβpE11-40/42和Aβ14-40/42(及Aβ自氨基酸位置2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12和13开始的其它N端截短形式)抗体的抗原可以由D-氨基酸或L-氨基酸或DL-氨基酸的组合装配而成，而且任选，它们可以通过进一步修饰，环闭合或衍生化而进行了改变。合适的抗体诱导性抗原可以自商品化肽文库提供。优选的是，这些肽为至少7个氨基酸，且优选的长度可以长达16，优选长达14或20个氨基酸(例如5至16个氨基酸残基)。依照本发明，然而，也可很好地采用更长的肽作为抗体诱导性抗原。另外，本发明的模拟表位也可以是多肽的一部分，并因此在它们的N和/或C端包含至少一个别的氨基酸残基。
为了制备本发明的模拟表位(即本文中公开的抗体诱导性抗原)，当然，噬菌体文库，肽文库也是合适的，例如通过组合化学的手段生成的或通过用于最多变的结构的高通量筛选技术的手段获得的(Display：A LaboratoryManual，Carlos F.Barbas等编；Willats WG，Phage display：practicalities andprospects.Plant Mol.Biol.2002 Dec.；50(6)：837-54)。
另外，依照本发明，也可采用基于核酸的抗Aβ1-40/42，AβpE3-40/42，Aβ3-40/42，Aβ11-40/42，AβpE11-40/42和Aβ14-40/42抗体诱导性抗原(“适体(aptamer)”)，而且这些也可以用最多变的(寡核苷酸)文库(例如具有2-180个核酸残基)(例如Burgstaller et al.，Curr.Opin.Drug Discov.Dev.5(5)(2002)，690-700；Famulok et al.，Acc.Chem.Res.33(2000)，591-599；Mayer et al.，PNAS 98(2001)，4961-4965；等)找到。在基于核酸的抗体诱导性抗原中，核酸主链可例如通过天然磷酸二酯化合物或也通过硫代磷酸酯或组合或化学变异(例如像PNA)来提供，其中依照本发明可主要采用U，T，A，C，G，H和mC作为碱基。可依照本发明使用的核苷酸的2’-残基优选为H，OH，F，Cl，NH2，O-甲基，O-乙基，O-丙基或O-丁基，其中核酸还可别不同的修饰，即例如用保护基团修饰，就像它们通常在寡核苷酸合成中被采用的。如此，基于适体的抗体诱导性抗原也是本发明范围内的优选抗体诱导性抗原。
依照本发明的一个优选实施方案，化合物偶联至药学可接受载体，优选KLH(匙孔
Figure BDA0000046664870000091
血蓝蛋白)，破伤风类毒素，清蛋白结合蛋白，牛血清清蛋白，树状聚物(MAP；Biol.Chem.358：581)，肽接头(或侧翼区)以及Singh et al.，Nat.Biotech.17(1999)，1075-1081(特别是该文件表1中的那些)，和O′Hagan etal.，Nature Reviews，Drug Discovery 2(9)(2003)，727-735(特别是其中记载的内源免疫强化性化合物和投递系统)中记载的佐剂物质，或其混合物。此语境中的偶联化学(例如经由异双功能化合物，诸如GMBS，当然还有其它的，如“Biocojuugate Techniques”，Greg T.Hermanson中记载的)可选自本领域技术人员已知的反应。此外，疫苗组合物可以与佐剂，优选低溶解度的铝组合物，特别是氢氧化铝一起配制。当然，也可以使用像MF59磷酸铝，磷酸钙，细胞因子(例如IL-2，IL-12，GM-CSF)，皂苷(例如QS21)，MDP衍生物，CpG寡聚物，LPS，MPL，聚磷腈，乳状液(例如弗氏，SAF)，脂质体，病毒体，ISCOM，蜗形物(cochleates)，PLG微粒，Poloxamer颗粒，病毒样颗粒，热不稳定肠毒素(LT)，霍乱毒素(CT)，突变体毒素(例如LTK63和LTR72)，微粒和/或聚合脂质体这些佐剂。
本发明的化合物优选经选自下组的接头结合至载体或佐剂：NHS-聚(氧化乙烯)(PEO)(例如NHS-PEO4-马来酰亚胺)。
包含本发明化合物(模拟表位，肽)和药学可接受载体的疫苗可通过任何合适的应用模式(例如i.d.，i.v，i.p.，i.m.，鼻内，口服，皮下，等)及在任何合适的投递装置中施用(O’Hagan et al.，Nature Reviews，Drug Discovery 2(9)，(2003)，727-735)。本发明的化合物优选为静脉内，皮下，皮内或肌肉内施用而配制(参见例如“Handbook of Pharmaceutical ManufacturingFormulations”，Sarfaraz Niazi，CRC Press Inc，2004)。
依照本发明的药物(疫苗)以0.1ng至10mg，优选10ng至1mg，特别是100ng至100μg，或者例如100fmol至10μmol，优选10pmol至1μmol，特别是100pmol至100nmol的量含有依照本发明的化合物。典型地，疫苗还可含有辅助物质，例如缓冲剂、稳定剂等。
依照本发明的一个优选实施方案，帕金森氏病的运动症状选自下组：静止性震颤，运动徐缓，强直，体位不稳，弯腰体位，张力障碍，疲劳，细微运动灵巧性和运动协调受损，整体运动协调受损，运动缺乏(摆臂缩小)，静坐不能，言语问题，面部表情丧失，写字过小，吞咽困难，性功能障碍和流涎。
本发明的另一个方面涉及依照本发明的化合物在制备用于治疗、预防和/或改善帕金森氏病运动症状的药物中的用途。
本发明的又一个方面涉及一种用于治疗和/或改善帕金森氏病的症状，特别是运动症状的方法。
本发明在下面的附图和实施例中进一步例示，然而，不限于此。
图1显示用于本发明筛选方法的文库4的各肽成员。
图2显示用DAEFRH的模拟表位进行的抑制测定法。
图3显示用DAEFRH的其它表位进行的另一种抑制测定法。
图4和5描述用依照本发明的模拟表位肽实施的抑制测定法的结果。
图6至9显示分别用模拟表位肽4011-4018，4019-4025，4031-4038和4061-4064实施的抑制测定法的结果。
图10显示单克隆抗体MV-001对特定肽和重组蛋白的结合；
图11显示单克隆抗体MV-003对特定肽和重组蛋白的结合；
图12显示单克隆抗体MV-004对特定肽和重组蛋白的结合；
图13显示用β-淀粉样蛋白和N端截短的和/或翻译后修饰的β-淀粉样蛋白片段的模拟表位进行的典型结合测定法；
图14显示用β-淀粉样蛋白和N端截短的和/或翻译后修饰的β-淀粉样蛋白片段的模拟表位进行的典型抑制测定法；
图15显示通过模拟表位免疫接种(注射的肽/无关的肽)引发的免疫应答的体内表征的例子；
图16显示通过针对淀粉样蛋白β片段的模拟表位免疫接种引发的免疫应答的体内表征的例子；
图17显示通过针对全长的模拟表位免疫接种引发的免疫应答的体内表征的例子
图18显示被淀粉状蛋白斑占据的面积。以一个月间隔通过s.c接种给Tg2576注射6次以氢氧化铝(ALUM)作为佐剂的模拟表位疫苗。对照小鼠只接受PBS-ALUM。被淀粉状蛋白斑占据的面积显示为对照组的百分比。Gr1...对照组；Gr2...接受p4381；Gr3...接受p4390；Gr4...接受p4715。
图19显示被淀粉状蛋白斑占据的面积。以一个月间隔通过s.c接种给Tg2576注射6次以氢氧化铝(ALUM)作为佐剂的AFFITOPE疫苗。对照小鼠只接受PBS-ALUM。被淀粉状蛋白斑占据的面积显示为对照组的百分比。Gr1...对照组；Gr2...接受p4395。
图20显示单克隆抗体MV-002对特定肽和重组蛋白的结合。
图21显示用β-淀粉样蛋白和N端截短的和/或翻译后修饰的β-淀粉样蛋白片段的模拟表位进行的典型结合测定法。
图22显示用β-淀粉样蛋白和N端截短的和/或翻译后修饰的β-淀粉样蛋白片段的模拟表位进行的典型抑制测定法。
图23显示通过模拟表位免疫接种(注射的肽/无关的肽)引发的免疫应答的体内表征的例子。
图24显示通过针对淀粉样蛋白β片段和sAPPα的模拟表位免疫接种引发的免疫应答的体内表征的例子。
图25显示通过针对全长Aβ40/42的模拟表位免疫接种引发的免疫应答的体内表征的例子。
图26显示被淀粉状蛋白斑占据的面积。以一个月间隔通过s.c接种给Tg2576注射6次以氢氧化铝(ALUM)作为佐剂的模拟表位疫苗。对照小鼠只接受PBS-ALUM。被淀粉状蛋白斑占据的面积显示为对照组的百分比。Gr1...对照组；Gr2...接受p4675。
图27显示a-突触核蛋白阳性内含体。A.对照处理动物；B.AD模拟表位处理动物；A和B展示对a-突触核蛋白染色的皮质切片。阳性染色显示神经元细胞，包括椎体和非椎体神经元。箭头指示A和B中内含体的两个典型例子。C.皮质和海马(作为皮质指示)中的内含体的数目。
图28显示神经元密度。图片展示对NeuN染色的皮质切片。阳性染色显示神经元细胞，包括椎体和非椎体神经元。A.指示对照处理动物；B.显示AD模拟表位处理动物。C和D.显示皮质和海马中NeuN阳性神经元的数目。
实施例
实施例1：生成单克隆抗体(mAb)，以检测带游离N端(无N端天冬氨酸)的由Aβ42衍生的肽物质
给小鼠免疫接种在CFA(第一次注射)和IFA(强化注射)中乳化的连接至蛋白质牛血清清蛋白BSA(以利用半抗原-载体效应)的6聚物肽DAEFRH(天然N端Aβ42序列)。通过ELISA(经DAEFRH肽包被的ELISA板)来检测DAEFRH肽特异性、抗体生成性杂交瘤。肽SEVKMDAEFRH(天然N端延长序列，APP衍生的，含有Aβ42衍生序列DAEFRH)用作阴性对照肽：排除识别延长肽的杂交瘤，因为它们不区分在N端带游离天冬氨酸的Aβ42衍生肽与不含游离天冬氨酸的APP衍生肽DAEFRH。
实施例2：通过抑制测定法来鉴定模拟表位
3.1.文库
抑制测定法(见下文)中采用的肽文库披露于WO 2004/062556。
3.2.抑制测定法
图2和3描述用5个文库(如WO 2004/062556中记载的)中包括的及自其获得的模拟表位肽实施的抑制测定法的结果。模拟表位肽与初始表位竞争单克隆抗体的识别。初始表位和模拟表位肽在C端含有一个额外的C供偶联至蛋白质载体(如果想要的话)。
使用下面的肽：
肽    1737    DAEFRH
肽    3001    DKELRI
肽    3002    DWELRI
肽    3003    YREFFI
肽    3004    YREFRI
肽    3005    YAEFRG
肽    3006    EAEFRG
肽    3007    DYEFRG
肽    3008    ELEFRG
肽    3009    SFEFRG
肽    3010    DISFRG
肽    3011    DIGWRG
操作过程：
将ELISA板(Nunc Maxisorp)用初始肽表位DAEFRH(C端用C延长并偶联至牛血清清蛋白BSA)以0.1μg/ml肽-BSA的浓度包被(100μl/孔，12h，4℃)。用PBS/BSA 1％封闭后(200μl/孔，12h，4℃)，将板用PBS/Tween清洗3次。然后，于37℃添加生物素化的单克隆抗体(1∶2000，50μl/孔)和肽(50μl/孔)以50，5，0.5，0.05，0.005，和0.0005μg/ml，放置20分钟。将板用PBS/Tween清洗3次，并与辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲合素一起温育(100μl/孔，30min，RT)。将板用PBS/Tween清洗5次，并与ABTS+H2O2一起温育(0.1％w/v，10-45min)，并用柠檬酸终止反应，接着进行光度法评估(波长405nm)。
正如预期的及在图2中看到的，肽1737DAEFRH能与板结合型BSA偶联肽DAEFRH竞争，并因此抑制单克隆抗体的识别。另外，显示了肽3003不能抑制单克隆抗体结合初始表位。相反，肽3001，3002，3004，3005，3006，和3007(不同程度地)阻断表位识别。虽然肽3004只在高浓度(50μg/ml)时是抑制性的，但是肽3001，3006，和3007是强抑制性的，IC50小于0.5μg/ml。肽3002和3005是“中等”抑制剂，IC50大于0.5μg/ml。
正如预期的及在图3中看到的，肽1737DAEFRH在另外实施的独立实验中能成功地与板结合型BSA偶联肽DAEFRH竞争单克隆抗体识别。另外，显示了肽3010和3011在所测试的浓度不是抑制性的，而肽3008和3009是(相对)弱抑制剂，IC50小于5μg/ml。
表1简要地总结了文库(如记载的)中包括的及自其获得的模拟表位的抑制能力：
表1：模拟表位的抑制能力：
肽    3001    DKELRI    强
肽    3002    DWELRI    中等
肽    3003    YREFFI    无
肽    3004    YREFRI    弱
肽    3005    YAEFRG    中等
肽    3006    EAEFRG    强
肽    3007    DYEFRG    强
肽    3008    ELEFRG    弱
肽    3009    SFEFRG    弱
肽    3010    DISFRG    无
肽    3011    DIGWRG    无
实施例3：本发明筛选的其它模拟表位的抑制测定法
抑制测定法
图4和5描述用如WO 2004/062556中记载的5个文库中包括的及自其获得的模拟表位肽实施的抑制测定法的结果。模拟表位肽与初始表位竞争单克隆抗体的识别。初始表位和模拟表位肽在C端(位置7)含有一个额外的C供偶联至蛋白质载体(如果想要的话)。
使用下面的肽：
肽    1737    DAEFRH(初始表位+C)
肽    1234    KKELRI
肽    1235    DRELRI
肽    1236    DKELKI
肽    1237    DRELKI
肽    1238    DKELR
肽    1239    EYEFRG
肽    1241    DWEFRDA
肽    4002    SWEFRT
肽    4003    GREFRN
肽    4004    WHWSWR
操作过程：
将ELISA板(Nunc Maxisorp)用初始肽表位DAEFRH(C端用C延长并偶联至牛血清清蛋白BSA)以0.1μg/ml肽-BSA的浓度包被(100μl/孔，12h，4℃)。用PBS/BSA 1％封闭后(200μl/孔，12h，4℃)，将板用PBS/Tween清洗3次。然后，生物素化的单克隆抗体(1∶2000，50μl/孔)和肽(50μl/孔)以不同浓度于37℃添加，放置20分钟。将板用PBS/Tween清洗3次，并与辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲合素一起温育(100μl/孔，30min，RT)。将板用PBS/Tween清洗5次，并与ABTS+H2O2一起温育(0.1％w/v，10-45min)，并用柠檬酸终止反应，接着进行光度法评估(波长405nm)。
正如预期的及在图4中看到的，肽1737DAEFRH能与板结合型BSA偶联肽DAEFRH竞争，并因此抑制单克隆抗体的识别。另外，显示了肽4004不能抑制单克隆抗体结合初始表位。相反，肽4002和4003(不同程度地)阻断表位识别。虽然肽4003只在相对较高浓度(10μg/ml)时是抑制性的，但是肽4002是强抑制性的，IC50小于0.4μg/ml。
正如预期的及在图5中看到的，肽1737DAEFRH在另外实施的独立实验中能成功地与板结合型BSA偶联肽DAEFRH竞争单克隆抗体的识别。另外，显示了肽1234在所测试的浓度是强抑制性的，而肽1235，1236，1237，1238，1239和1241(不同程度地)阻断表位识别。肽1235，1238和1241是强抑制剂，IC50小于0.5μg/ml，而肽1236和1237是(相对)较弱抑制剂，IC50大于5μg/ml。肽1239是中等抑制剂，IC50大于0.5μg/ml。
表2简要地总结了文库(如记载的)中包括的及自其获得的模拟表位的抑制能力：
表2：模拟表位的抑制能力：
肽    1234    KKELRI    无
肽    1235    DRELRI    强
肽    1236    DKELKI    弱
肽    1237    DRELKI    弱
肽    1238    DKELR     强
肽    1239    EYEFRG    中等
肽    1241    DWEFRDA   强
肽    4002    SWEFRT    强
肽    4003    GREFRN    弱
肽    4004    WHWSWR    无
图4和5中呈现的结果显示，除了各种6聚物肽(如这里和之前显示的)之外，5聚物肽(即肽1238DKELR)和7聚物肽(即肽1241DWEFRDA)可用作基于模拟表位的阿尔茨海默氏病疫苗中的表位。
实施例4：本发明的和WO 2006/005707中披露的模拟表位的抑制测定法
文库：
如WO 2006/005707中所述获得模拟表位。
下面的测定法使用下面的肽：
肽    1737     DAEFRH    初始表位
肽    4011D    AEFRWP    7聚物    s
肽    4012D    NEFRSP    7聚物    s
肽    4013G    SEFRDY    7聚物    m
肽    4014G    AEFRFT    7聚物    m
肽    4015S    AEFRTQ    7聚物    s
肽    4016S    AEFRAT    7聚物    s
肽    4017S    WEFRNP    7聚物    s
肽    4018S    WEFRLY    7聚物    s
肽    4019S    WFRNP     6聚物    -
肽    4020S    WELRQA    7聚物    s
肽    4021S    VEFRYH    7聚物    s
肽    4022S    YEFRHH    7聚物    s
肽    4023S    QEFRTP    7聚物    s
肽    4024S    SEFRVS    7聚物    s
肽    4025D    WEFRD     6聚物    s
肽    4031D    AELRY     6聚物    s
肽    4032D    WELRQ     6聚物    s
肽    4033S    LEFRF     6聚物    s
肽    4034G    PEFRW     6聚物    s
肽    4035G    KEFRT     6聚物    s
肽    4036    AYEFRH        6聚物    m
肽    4037    VPTSALA       7聚物    -
肽    4038    ATYAYWN       7聚物    -
另外，抑制测定法使用下面的5聚物肽(具有非天然氨基酸)：
肽    4061    DKE(tBuGly)R  5聚物    -
肽    4062    DKE(Nle)R     5聚物    m
肽    4063    DKE(Nva)R     5聚物    m
肽    4064    DKE((Cha)R    5聚物    m
(s：强抑制，m：中等抑制；-：无抑制)
操作过程：
将ELISA板(Nunc Maxisorp)用初始肽表位DAEFRH(C端用C延长并偶联至牛血清清蛋白BSA)以0.1μg/ml肽-BSA的浓度包被(100μl/孔，12h，4℃)。用PBS/BSA 1％封闭后(200μl/孔，12h，4℃)，将板用PBS/Tween清洗3次。然后，生物素化的单克隆抗体(1∶2000，50μl/孔)和肽(50μl/孔)以不同浓度于37℃添加，放置20分钟。将板用PBS/Tween清洗3次，并与辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲合素一起温育(100μl/孔，30min，RT)。将板用PBS/Tween清洗5次，并与ABTS+H2O2一起温育(0.1％w/v，10-45min)，并用柠檬酸终止反应，接着进行光度法评估(波长405nm)。
正如预期的及在图6(显示肽4011-4018)中看到的，肽1737DAEFRH能与板结合型BSA偶联肽DAEFRH竞争，并因此抑制单克隆抗体的识别。另外，显示了肽4012DNEFRSP，4013GSEFRDY，和4014GAEFRFT能中等抑制单克隆抗体结合初始表位。相反，肽4011DAEFRWP，4015SAEFRTQ，4016SAEFRAT，4017SWEFRNP，和4018SWEFRLY(不同程度地)强烈阻断表位识别。
正如预期的及在图7(显示肽4019-4025)中呈现的，肽1737DAEFRH在另外实施的独立实验中能成功地与板结合型BSA偶联肽DAEFRH竞争单克隆抗体的识别。另外，显示了肽4019SWFRNP在所测试的浓度不是抑制性的，而肽4020SWELRQA，4021SVEFRYH，4022SYEFRHH，4023SQEFRTP，4024SSERFVS和4025DWEFRD(不同程度地)阻断表位识别。肽4021，4022，4023，4024和4025是强抑制剂，IC50小于0.5μg/ml，而肽4020是中等抑制剂，IC50大于0.5μg/ml。
正如预期的及在图8(肽4031-4038)中看到的，肽1737DAEFRH在第三个独立的实验中能成功地与板结合型BSA偶联肽DAEFRH竞争单克隆抗体识别。另外，显示了肽4037VPTSALA和4038ATYAYWN在所测试的浓度不是抑制性的，而肽4031DAELRY，4032DWELRQ，4033SLEFRF，4034GPEFRW，4035GKEFRT和4036AYEFRH(不同程度地)阻断表位识别。肽4031，4032，4033，4034和4035是相对较强抑制剂，IC50小于0.5μg/ml，而肽4036是(相对)较弱抑制剂，IC50大于0.5μg/ml。
在下面的表中，描述了通过使用AD模拟表位引发的免疫应答的其它例子。表1中列出的所有肽都引起针对全长Aβ和/或其片段的特异性免疫反应。
  内部肽编号  Aβ的检测
  p1122  +
  p1123  +
  p1125  +
  p1238  +
  p1239  +
  p1252  +
  p1283  +
  p3005  +
  p3006  +
  p3007  +
  p3008  +
  p4003  +
  p4020  +
  p4023  +
  p4033  +
  p4034  +
  p4035  +
实施例5：用指定的5聚物肽：非天然氨基酸进行的抑制测定法
先前已经显示了5聚物肽1238DKELR可用作基于模拟表位的阿尔茨海默氏病疫苗中的表位(参见PCT/EP04/00162)。在下文中，将初始5聚物表位的氨基酸用非天然氨基酸替换：L用非天然氨基酸tBuGly，Nle，Nva，或Cha替换。
正如预期的及图9(肽4061-4064DKELR变体)中呈现的，肽1737DAEFRH在第4个独立的实验中能成功地与板结合型BSA偶联肽DAEFRH竞争单克隆抗体识别。另外，显示了肽4061DKE(tBuGly)R在所测试的浓度不是抑制性的。有趣的是，肽4062DKE(Nle)R，4063DKE((Nva)R，和4064DKE(Cha)R(不同程度地)阻断表位识别。肽4062，4063，和4064是相对较弱抑制剂，IC50大于0.5μg/ml。
实施例6：生成单克隆抗体，以特异性检测β-淀粉样蛋白和N端截短的和/或翻译后修饰的β-淀粉样蛋白片段
方法
用于依照下面的实施例的模拟表位鉴定的抗体检测自人Aβ衍生的氨基酸序列但不结合全长人APP。所检测的序列包括EFRHDS(＝Aβ初始表位aa3-8)，p(E)FRHDS(＝经修饰的Aβ初始表位aa3-8)，EVHHQK(＝Aβ初始表位aa11-16)。抗体可以是单克隆或多克隆抗体制备物或其任何抗体部分或衍生物，唯一的先决条件在于抗体分子特异性识别至少一种上文所述(自人Aβ衍生的)表位，但不结合全长人APP。
用此类单克隆抗体和肽文库鉴定并进一步表征模拟表位。
实施例6a：单克隆抗体MV-001的生成
生成了自实验Alz-5的融合物衍生的单克隆抗体。在实验Alz-5中，给C57/B16小鼠重复免疫接种偶联至KLH(匙孔
Figure BDA0000046664870000191
血蓝蛋白)和作为佐剂的Alum(氢氧化铝)的初始Aβ表位DAEFRHDSGYC。通过ELISA(经p1253和p4371肽包被的ELISA板)来检测p4371肽特异性的抗体生成型杂交瘤。人Aβ40/42(重组蛋白)用作阳性对照肽：包括识别在ELISA板上固定化的重组蛋白的杂交瘤，因为它们特异性结合肽和全长Aβ二者。P1454(人Aβ33-40)用作阴性对照肽。另外，针对p4373测试杂交瘤。只有没有p4373结合或具有有限p4373结合的杂交瘤用于进一步的抗体开发。
纯化将杂交瘤克隆(MV-001(内部名称824；IgG1)并分别分析对p1253，p4371，p4373，p1454和Aβ的特异性检测。MV-001在ELISA中识别注射的表位(p1253)以及特定表位(p4371)和全长Aβ蛋白(重组蛋白；得自Bachem AG，Bubendorf，Switzerland)。然而，它在ELISA中不检测p1454。另外，MV-001抗体基本上不能检测编码Aβ3-10的焦谷氨酸型式的肽p4373(滴度比初始表位低30倍)。
实施例6b：单克隆抗体MV-003的生成
生成了自实验Alz-16的融合物衍生的单克隆抗体。在实验Alz-16中，给BalbC小鼠重复免疫接种偶联至KLH(匙孔血蓝蛋白)和作为佐剂的Alum(氢氧化铝)的表位p(E)FRHDSC(p4373)。通过ELISA(经p4373肽包被的ELISA板)来检测p4373肽特异性的抗体生成型杂交瘤。p1253，p1454和Aβ40/42用作阴性对照肽。另外，针对p4371测试杂交瘤。只有没有p4371结合或具有有限p4371结合的杂交瘤用于进一步的抗体开发以保证焦谷氨酸特异性。
纯化杂交瘤克隆(MV-003(内部名称D129；IgG1)并分别分析对p1253，p4371，p4373，p1454和Aβ的特异性检测。MV-003在ELISA中识别注射的表位(p4373)但不能检测p1454，p1253或全长Aβ蛋白(重组蛋白；得自BachemAG，Bubendorf，Switzerland)。另外，MV-003抗体不能检测编码Aβ3-10的正常型式的肽p4371(滴度比初始表位低15倍)。
实施例6c：单克隆抗体MV-004的生成
生成了自实验Alz-15的融合物衍生的单克隆抗体。在实验Alz-15中，给BalbC小鼠重复免疫接种偶联至KLH(匙孔血蓝蛋白)和作为佐剂的Alum(氢氧化铝)的表位EVHHQKC(p4372)。通过ELISA(经p4372肽包被的ELISA板)来检测p4372肽特异性的抗体生成型杂交瘤。P4376，p4378，p1454和Aβ40/42用作阴性对照肽。只有没有p4376和p4378结合或具有有限p4376和p4378结合的杂交瘤用于进一步的抗体开发以保证针对位置aa11处游离N末端的特异性。
纯化杂交瘤克隆(MV-004(内部名称B204；IgG1)并分别分析对p4372，p4376，p4378，p1454和Aβ的特异性检测。MV-004在ELISA中识别注射的表位(p4372)但不能检测p1454，p4376和p4378以及全长Aβ蛋白(重组蛋白；得自Bachem AG，Bubendorf，Switzerland)。不能检测p4376，p4378证明了对截短的Aβ中位置aa11处游离N末端的特异性。
实施例6d：生成单克隆抗体MV-002，以特异性检测β-淀粉样蛋白和N端截短的和/或翻译后修饰的β-淀粉样蛋白片段
方法
依照本发明鉴定模拟表位时所用的抗体检测到自人Aβ衍生的氨基酸序列但不结合全长人APP。所检测的序列包括EVHHQKLVFFAED(＝Aβ初始表位aa11-24)和p(E)VHHQKLVF(p4374＝在N端具有焦谷氨酸修饰的Aβ初始表位aa11-19)。抗体可以是单克隆或多克隆抗体制备物或其任何抗体部分或衍生物，唯一的先决条件在于抗体分子特异性识别至少一种上文所述(自人Aβ衍生的)表位，但不结合全长人APP。
用此类单克隆抗体和肽文库鉴定并进一步表征模拟表位。
生成了自实验Alz-9的融合物衍生的单克隆抗体。给C57/B16小鼠重复免疫接种偶联至KLH(匙孔
Figure BDA0000046664870000211
血蓝蛋白)和作为佐剂的Alum(氢氧化铝)的初始Aβ表位HQKLVFC。通过ELISA(经p4377肽包被的ELISA板)来检测p4377肽特异性的抗体生成型杂交瘤。人Aβ40/42(重组蛋白)用作阳性对照肽：包括识别在ELISA板上固定化的重组蛋白的杂交瘤，因为它们特异性结合肽和全长Aβ二者。P1454(人Aβ33-40)用作阴性对照肽。另外，针对p4374，p1323和sAPPα测试杂交瘤。只有具有较好p4374和p1323结合且没有sAPPα结合的杂交瘤用于进一步的抗体开发。
纯化杂交瘤克隆MV-002(内部名称A115；IgG2b)并分别分析对p1323，p4374，p4377，p1454，Aβ和sAPPα的特异性检测。MV-002在ELISA中识别表位p1323以及p4377和全长Aβ蛋白(重组蛋白；得自Bachem AG，Bubendorf，Switzerland)。然而，它在ELISA中不检测p1454。另外，MV-002抗体不能检测sAPPα但特异性结合编码Aβ11-19的焦谷氨酸型式的肽p4374。
实施例7：噬菌体展示，体外结合和抑制ELISA
此实施例中使用的噬菌体展示文库为Ph.D.7：New England BioLabsE8102L(线性7聚物文库)。依照制造商的方案(www.neb.com)进行噬菌体展示。
2或3个后续轮次的淘选后，挑取单个噬菌体克隆，在包被了淘选过程所用抗体的板上对噬菌体上清液进行ELISA。对在此ELISA中呈阳性(对靶物的信号强，但对非特异性对照无信号)的噬菌体克隆测序。根据DNA序列，推导肽序列。合成这些肽并在结合和抑制ELISA中表征。另外，将所述筛选中鉴定出的模拟表位的序列信息组合，创建了一些新模拟表位，以便鉴定用于模拟表位免疫接种的共有序列。
1.体外结合测定法(ELISA)
将自噬菌体展示衍生的肽及其变体偶联至BSA并结合至ELISA板(1μM；如各图中指示的)并随后与用于筛选过程的单克隆抗体一起温育以分析所鉴定的肽的结合能力。
2.体外抑制测定法(ELISA)
将不同量的自噬菌体展示衍生的肽(浓度范围10μg至0.08μg；连续稀释；对于MV-002：浓度范围5μg至0.03μg；连续稀释)与用于筛选过程的单克隆抗体一起温育。降低后续的抗体对ELISA板上包被的初始表位的结合的肽被认为是在此测定法中是抑制性的。
实施例8：体内测试模拟表位：分析免疫原性和交叉反应性
1.体内测试模拟表位
将抑制性以及非抑制性肽偶联至KLH并与适宜的佐剂(氢氧化铝)一起注射入小鼠(野生型C57/B16小鼠；皮下注射入体侧)。以两周间隔给动物免疫接种3-6次并两周一次采集血清。用每一份血清测定对注射的肽以及对无关肽的滴度。另外，分别测定针对重组人Aβ蛋白和针对初始肽的滴度。一般而言，通过针对在ELISA板上固定化的肽(偶联至牛血清清蛋白(BSA))和重组全长蛋白的反应来分析血清。使用抗小鼠IgG特异性抗体来测定滴度。关于详细的结果，分别见图15，16和17及图23，24和25。
2.MV-001，MV-003和MV-004的结果
2.1.鉴定针对N端截短型和修饰型Aβ的特异性单克隆抗体(mAB)：
图10描绘自实验Alz-5衍生的单克隆抗体MV-001(内部名称824；IgG1)的表征，证明了对全长Aβ和在位置E3处截短的Aβ的特异性。
图11描绘自实验Alz-16衍生的单克隆抗体MV-003(内部名称D129；IgG1)的表征，证明了对在位置p(E)3处截短和翻译后修饰的Aβ的特异性。
图12描绘自实验Alz-15衍生的单克隆抗体MV-004(内部名称B204；IgG1)的表征，证明了对在位置E11处截短的Aβ的特异性。
2.2.针对N端截短型和修饰型Aβ的特异性mAB的筛选：
2.2.1.噬菌体展示文库Ph.D.7
2.2.1.1.筛选针对p4373的单克隆抗体
在此筛选中通过筛选PhD 7噬菌体展示文库鉴定了8种序列。表1A总结了所鉴定的肽及其与初始表位相比的结合能力。
2.2.1.2.筛选针对p4372的单克隆抗体
在此筛选中通过筛选PhD 7噬菌体展示文库鉴定了9种序列。表1B总结了所鉴定的肽及其与初始表位相比的结合能力。
2.2.1.3.筛选针对p4371的单克隆抗体
在此筛选中通过筛选PhD 7和PhD12噬菌体展示文库鉴定了71种序列。表1C总结了所鉴定的肽及其与初始表位相比的结合能力。
表1A：结合亲本抗体MV-003的模拟表位
  内部肽编号   序列   结合能力
  p4395   IRWDTPC   2
  p4396   VRWDVYPC   1
  p4397   IRYDAPLC   1
  p4399   IRYDMAGC   1
  p4728   IRWDTSLC   3
  p4756   IRWDQPC   3
  p4792   IRWDGC   1
  p4793   IRWDGGC   2
对表1A的说明：结合能力用下面的结合代码编码：1:X描述亲本AB的稀释因子。
  结合代码   OD半最大1:X
  0   无结合   :0
  1   弱结合   :＜16000
  2   中等结合   :16-60000
  3   强结合   :＞60000
表1B：结合亲本抗体MV-004的模拟表位
  内部肽编号   序列   结合能力
  p4417   EVWHRHQC   2
  p4418   ER WHEKHC   3
  p4419   EVWHRLQC   3
  p4420   ELWHRYPC   2
  p4665   ELWHRAFC   2
  p4786   ELWHRAC   1
  p4788   EVWHRGC   1
  p4789   EVWHRHC   1
  p4790   ERWHEKC   1
对表1B的说明：结合能力用下面的结合代码编码：1:X描述亲本AB的稀释因子。
  结合代码   OD半最大1:X
  0   无结合   :0
  1   弱结合   :＜24000
  2   中等结合   :24-96000
  3   强结合   :＞96000
表1C：结合亲本抗体MV-001的模拟表位
  内部肽编号   序列   结合能力
  p4380   QDFRHYC   2
  p4381   SEFKHGC   3
  p4382   TSFRHGC   2
  p4383   TSVFRHC   3
  p4384   TPFRHTC   2
  p4385   SQFRHYC   2
  p4386   LMFRHNC   3
  p4387   SAFRHHC   2
  p4388   LPFRHGC   2
  p4389   SHFRHGC   2
  p4390   ILFRHGC   3
  p4391   QFKHDLC   2
  p4392   NWFPHPC   1
  p4393   EEFKYSC   2
  p4701   NELRHSTC   3
  p4702   GEMRHQPC   3
  p4703   DTYFPRSC   2
  p4704   VELRHSRC   2
  p4705   YSMRHDAC   2
  p4706   AANYFPRC   2
  p4707   SPNQFRHC   3
  p4708   SSSFFPRC   2
  p4709   EDWFFWHC   1
  p4710   SAGSFRHC   3
  p4711   QVMRHHAC   2
  p4712   SEFSHSSC   3
  p4713   QPNLFYHC   1
  p4714   ELFKHHLC   3
  p4715   TLHEFRHC   3
  p4716   ATFRHSPC   2
  p4717   APMYFPHC   2
  p4718   TYFSHSLC   2
  p4719   HEPLFSHC   1
  p4721   SLMRHS SC   2
  p4722   EFLRHTLC   3
  p4723   ATPLFRHC   3
  p4724   QELKRYYC   1
  p4725   THTDFRHC   3
  p4726   LHIPFRHC   3
  p4727   NELFKHFC   2
  p4729   SQYFPRPC   2
  p4730   DEHPFRHC   3
  p4731   MLPFRHGC   2
  p4732   SAMRHSLC   2
  p4733   TPLMFWHC   1
  p4734   LQFKHSTC   2
  p4735   ATFRHSTC   2
  p4736   TGLMFKHC   2
  p4737   AEFSHWHC   2
  p4738   QSEFKHWC   3
  p4739   AEFMHSVC   2
  p4740   ADHDFRHC   3
  p4741   DGLLFKHC   3
  p4742   IGFRHDSC   2
  p4743   SNSEFRRC   3
  p4744   SELRHSTC   3
  p4745   THMEFRRC   3
  p4746   EELRHSVC   3
  p4747   QLFKHSPC   3
  p4748   YEFRHAQC   3
  p4749   SNFRHSVC   3
  p4750   APIQFRHC   3
  p4751   AYFPHTSC   2
  p4752   NSSELRHC   3
  p4753   TEFRHKAC   3
  p4754   TSTEMWHC   1
  p4755   SQSYFKHC   3
  p4800   CSEFKH   3
  p4801   SEFKHC   3
  p4802   CHEFRH   3
  p4803   HEFRHC   3
对表1C的说明：结合能力用下面的结合代码编码：1:X描述亲本AB的稀释因子。
  结合代码   OD半最大1:X
  0   无结合   :0
  1   弱结合   :＜4000
  2   中等结合   :4000-20000
  3   强结合   :＞20000
2.3.体外表征模拟表位，所述表位是在用针对N端截短型和修饰型Aβ的单克隆抗体筛选噬菌体展示文库时鉴定出的：
图13和14显示用于在体外表征模拟表位的结合测定法和抑制测定法的代表性例子。获得的数据分别总结于表1和2。
MV-003模拟表位：在所呈现的8种序列中，6种序列在体外竞争实验中抑制p(E)3-7Aβ特异性单克隆抗体的结合。另2种序列被鉴定为在体外竞争实验中不抑制单克隆抗体的结合但仍保留对亲本抗体的结合能力(表2A)。
MV-004模拟表位：所有所呈现的9种序列在体外竞争实验中都抑制特异性结合在位置E11处截短的Aβ的游离N末端的单克隆抗体的结合(表2B)。
MV-001模拟表位：在所呈现的71种序列中，27种序列在体外竞争实验中抑制特异性针对在位置E3处截短的Aβ的单克隆抗体的结合。另44种序列被鉴定为在体外竞争实验中不抑制单克隆抗体的结合但仍保留对亲本抗体的结合能力(表2C)。
表2：在本发明中鉴定的，在抑制测定法中给出阳性结果的模拟表位
表2A：MV-003模拟表位
  内部肽编号   序列   抑制能力
  p4395   IRWDTPC   1
  p4397   IRYDAPLC   1
  p4728   IRWDTSLC   2
  p4756   IRWDQPC   1
  p4792   IRWDGC   1
  p4793   IRWDGGC   1
对表2A的说明：抑制能力用下面的代码编码：
弱抑制意味着降低AB结合需要比初始表位要多的肽；强抑制意味着降低AB结合需要的模拟表位和初始表位的肽量相似。将模拟表位与作为标准的初始肽比较。使用测定法中10ug肽时的OD来计算与初始肽相比的竞争能力。
  竞争代码
  0  无抑制(10ug肽的OD高于初始肽12倍)
  1  比初始表位要弱(10ug肽的OD低于初始肽12倍)
  2  强抑制(像初始表位一样；10ug肽的OD低于初始肽的5倍)
表2B：MV-004模拟表位
  内部肽编号   序列   抑制能力
  p4417   EVWHRHQC   1
  p4418   ERWHEKHC   2
  p4419   EVWHRLQC   2
  p4420   ELWHRYPC   1
  p4665   ELWHRAFC   2
  p4786   ELWHRAC   1
  p4788   EVWHRGC   1
  p4789   EVWHRHC   1
  p4790   ERWHEKC   2
对表2B的说明：抑制能力用下面的代码编码：
弱抑制意味着降低AB结合需要比初始表位要多的肽；强抑制意味着降低AB结合需要的模拟表位和初始表位的肽量相似。将模拟表位与作为标准的初始肽比较。使用测定法中10ug肽时的OD来计算与初始肽相比的竞争能力。
  竞争代码
  0  无抑制(10ug肽的OD高于初始肽5倍)
  1  比初始表位要弱(10ug肽的OD低于初始肽5倍)
  2  强抑制(像初始表位一样；10ug肽的OD低于初始肽的2倍)
表2C：MV-001模拟表位
  内部肽编号   序列   抑制能力
  p4380   QDFRHYC   1
  p4381   SEFKHGC   1
  p4382   TSFRHGC   1
  p4383   TSVFRHC   1
  p4384   TPFRHTC   1
  p4385   SQFRHYC   1
  p4386   LMFRHNC   1
  p4387   SAFRHHC   1
  p4388   LPFRHGC   1
  p4389   SHFRHGC   1
  p4390   ILFRHGC   1
  p4391   QFKHDLC   1
  p4392   NWFPHPC   1
  p4393   EEFKYSC   1
  p4707   SPNQFRHC   1
  p4715   TLHEFRHC   2
  p4725   THTDFRHC   1
  p4730   DEHPFRHC   1
  p4738   QSEFKHWC   1
  p4740   ADHDFRHC   1
  p4741   DGLLFKHC   1
  p4746   EELRHSVC   1
  p4753   TEFRHKAC   2
  p4800   CSEFKH   2
  p4801   SEFKHC   1
  p4802   CHEFRH   2
  p4803   HEFRHC   2
对表2C的说明：抑制能力用下面的代码编码：
弱抑制意味着降低AB结合需要比初始表位要多的肽；强抑制意味着降低AB结合需要的模拟表位和初始表位的肽量相似。将模拟表位与作为标准的初始肽比较。使用测定法中10ug肽时的OD来计算与初始肽相比的竞争能力。
  竞争代码
  0  无抑制(10ug肽的OD高于初始肽3倍)
  1  比初始表位要弱(10ug肽的OD低于初始肽3倍)
  2  强抑制(像初始表位一样；10ug肽的OD低于初始肽的2倍)
表3：非模拟表位肽
Figure BDA0000046664870000271
2.4.体内表征模拟表位，所述表位是在用针对N端截短型和修饰型Aβ的单克隆抗体筛选噬菌体展示文库时鉴定得到的：
给雌性C57/bl6小鼠，每组5-6只小鼠，皮下免疫接种30μg偶联至KLH的肽。给对照组施用初始表位-KLH偶联物。使用明矾作为佐剂(始终每只小鼠1mg)。所施用的肽都能够特异性结合单克隆抗体，尽管一些肽在体外(在体外抑制测定法中)不抑制初始表位对其亲本抗体的结合。以两周间隔用每次免疫接种后单只小鼠的血清实施体外ELISA测定法以测定抗体滴度(分别见图15和16)。将ELISA板的孔用模拟表位-BSA偶联物和无关肽-BSA偶联物(阴性对照)包被。通过亲本抗体与各模拟表位-BSA偶联物的反应来实施阳性对照。用抗小鼠IgG来实施检测。另外，在ELISA板上固定化重组蛋白并相应地使血清反应。图15至17显示用于在体内表征模拟表位的测定法的代表性例子。
图15显示体内表征由模拟表位免疫接种引发的免疫应答的的例子，其是通过分析针对注射的肽和含有无关序列的无关肽的免疫应答来表征。在所显示的所有三个例子中，初始表位和模拟表位引发针对注射的肽的免疫应答但不能诱导针对无关序列(p1454)的有关免疫应答。
作为MV-003模拟表位的例子，初始表位p4373和模拟表位p4395，p4396，p4397，和p4399描绘于图15A。所有疫苗都引起相似的针对它们各自模拟表位的免疫应答。用初始表位p4373疫苗处理的动物或用模拟表位p4395，p4396，p4397或p4399疫苗处理的动物都没有引起针对无关肽p1454的有关滴度(比注射的肽低11倍-25倍)。
作为MV-004模拟表位的例子，初始表位p4372和模拟表位p4417，p4418，p4419，和p4420描绘于图15B。所有疫苗都引起相似的针对它们各自模拟表位的免疫应答。用初始表位p4372疫苗处理的动物或用模拟表位p4417，p4418，p4419，和p4420疫苗处理的动物都没有引起针对无关肽p1454的有关滴度(比注射的肽低20-80倍)。
作为MV-001模拟表位的例子，初始表位p4371和模拟表位p4381，p4382，和p4390描绘于图15C。所有疫苗都引起相似的针对它们各自模拟表位的免疫应答。用初始表位p4371疫苗处理的动物或用模拟表位p4381，p4382，和p4390疫苗处理的动物都没有引起针对无关肽p1454的有关滴度(比注射的肽低＞10倍)。
图16显示体内表征由模拟表位免疫接种引发的免疫应答的例子，所述接种是针对亲本抗体的各个初始表位以及针对Aβ的其它截短形式衍生的肽。
作为MV-003模拟表位的例子，初始表位p4373和模拟表位p4395，p4396，p4397，和p4399描绘于图16A。3/4的所示模拟表位疫苗引起可检测的针对初始表位p4373的免疫应答。分析针对p4371展示的未修饰形式的交叉反应性，能检测到类似的现象。初始表位p4373疫苗和2/4的模拟表位疫苗引起针对p4371的有关滴度。令人惊讶的是，通过特异性结合p4373的MV-003选出的模拟表位也诱导与未修饰形式的初始表位起交叉反应的免疫反应。
作为MV-004模拟表位的例子，初始表位p4372和模拟表位p4417，p4418，p4419，和p4420描绘于图16B。3/4的所示模拟表位疫苗引起可检测的针对初始表位p4372的免疫应答。
作为MV-001模拟表位的例子，初始表位p4371和模拟表位p4381，p4382，和p4390描绘于图16C。所有所示模拟表位疫苗都引起可检测的针对初始表位p4371的免疫应答。分析针对p4373展示的焦谷氨酸修饰形式的交叉反应性，能检测到与关于MV-003衍生模拟表位所述类似的现象。初始表位p4371疫苗和所有模拟表位疫苗都引起针对p4373的有关滴度。令人惊讶的是，通过特异性结合p4371的MV-001选出的模拟表位诱导比初始表位诱导的免疫反应或亲本抗体要好的与未修饰形式的初始表位起交叉反应的免疫反应。如此，这些模拟表位可令人惊讶地诱导但不是必然诱导比亲本抗体要宽泛的免疫反应而且可用于更宽泛地靶向多种形式的Aβ。
图17显示通过针对全长Aβ的模拟表位免疫接种引发的免疫应答的体内表征的例子。令人惊讶的是，通过使用MV-001和MV-003选择的模拟表位不仅诱导了与用于创建抗体的截短或修饰的短表位的交叉反应，而且诱导了与全长未修饰形式的Aβ的交叉反应性，就像初始序列一样好或甚至比p4371/p4373更有效。对于MV-002初始表位以及对于所鉴定的模拟表位，检测不到此类交叉反应性，证明了抗体的特异性转移至未修饰Aβ11-40/42的游离N末端。如此，本发明中呈现的模拟表位构成优化的疫苗候选物来靶向广谱的天然存在形式的Aβ肽，像在AD患者的脑中已经找到的那些。所述形式分别包括但不限于Aβ1-40/42，和N端截短的形式像Aβ3-40/42，Aβ(pE)3-40/42和未修饰的Aβ11-40/42。
在表4和5中，描述了通过使用MV-001和MV-003衍生模拟表位通过针对全长Aβ的模拟表位免疫接种引发的免疫应答的其它例子。
表4：模拟表位的体内表征：MV-001
  内部肽编号   Aβ/截短/修饰形式的检测
  p4381   +
  p4383   +
  p4385   +
  p4386   +
  p4390   +
  p4707   +
  p4714   +
  p4715   +
  p4725   +
  p4730   +
  p4738   +
  p4740   +
  p4748   +
  p4753   +
表4中列出的所有肽引起针对全长和/或截短和修饰形式的Aβ或其片段的特异性免疫反应。
表5：模拟表位的体内表征：MV-003
  内部肽编号   Aβ/截短/修饰形式的检测
  p4395   +
  p4396   +
  p4397   +
  p4399   +
表5中列出的所有肽引起针对全长和/或截短和修饰形式的Aβ或其片段的特异性免疫反应。
3.MV-002的结果
3.1.鉴定针对N端截短型和修饰型Aβ的特异性单克隆抗体(mAB)：
图21描绘自实验Alz-9衍生的单克隆抗体MV-002(内部名称A115；IgG2b)的表征，证明了对全长Aβ和在位置E11和H14处截短和在位置E11至pE11处修饰的Aβ片段的特异性。
3.2.筛选针对N端截短型和修饰型Aβ的特异性mAB：
3.2.1.噬菌体展示文库Ph.D.7
3.2.1.1.筛选针对D1323的单克隆抗体
在此筛选中通过筛选PhD 7噬菌体展示文库鉴定了47种序列。表1总结了所鉴定的肽及其与初始表位相比的结合能力。
表1：结合亲本抗体MV-002的模拟表位
  内部肽编号   序列   结合能力
  p4403   SHTRLYFC   1
  p4404   SGEYVFHC   1
  p4413   SGQLKFPC   1
  p4414   SGQIWFRC   1
  p4415   SGEIHFNC   1
  p4666   GQIWFISC   1
  p4667   NDAKIVFC   3
  p4668   GQIIFQSC   2
  p4669   GQIRFDHC   3
  p4670   HMRLFFNC   3
  p4671   GEMWFALC   3
  p4672   GELQFPPC   3
  p4673   GELWFPC   3
  p4674   SHQRLWFC   3
  p4675   HQKMIFAC   3
  p4676   GEMQFFIC   3
  p4677   GELYFRAC   3
  p4678   GEIRFALC   3
  p4679   GMIVFPHC   3
  p4680   GEIWFEGC   3
  p4681   GEIYFERC   3
  p4682   AIPLFVMC   1
  p4683   GDLKFPLC   3
  p4684   GQILFPVC   3
  p4685   GELFFPKC   3
  p4686   GQIMFPRC   3
  p4687   HMRMYFEC   3
  p4688   GSLFFWPC   2
  p4689   GEILFGMC   3
  p4690   GQLKFPFC   3
  p4691   KLPLFVMC   1
  p4692   GTIFFRDC   1
  p4693   THQRLWFC   3
  p4694   GQIKFAQC   3
  p4695   GTLIFHHC   2
  p4696   GEIRFGSC   3
  p4697   GQIQFPLC   3
  p4698   GEIKFDHC   3
  p4699   GEIQFGAC   3
  p4700   QLPLFVLC   1
  p4794   HQKMIFC   2
  p4795   GELFFEKC   2
  p4796   GEIRFELC   2
  p4804   Ac-GEIYFERC   2
  p4805   SGEIYFERC   1
  p4806   AGEIYFERC   1
  p4807   CGEIYFER   1
对表1的说明：结合能力用下面的结合代码编码：1:X描述亲本AB的稀释因子。Ac-...表示乙酰化AA。
  结合代码   OD半最大1:X
  0   无结合   :0
  1   弱结合   :＜40000
  2   中等结合   :40000-320000
  3   强结合   :＞320000
3.3.体外表征模拟表位，所述表位是在用针对N端截短型和修饰型Aβ的 单克隆抗体筛选噬菌体展示文库时鉴定得到的：
图21和22显示用于在体外表征模拟表位的结合和抑制测定法的代表性例子。获得的数据分别总结于表1和2。
MV-002模拟表位：在所呈现的47种序列中，11种序列在体外竞争实验中抑制单克隆抗体MV-002的结合。另36种序列被鉴定为在体外竞争实验中不抑制单克隆抗体的结合但仍保留对亲本抗体的结合能力(表2)。重要的是，如图23-25所示，在体外与初始表位竞争对亲本抗体的结合的能力不是在体内引起与特定肽起交叉反应的特异性免疫应答的先决条件。如此，抑制性以及非抑制性肽可用于在体内诱导检测肽的免疫应答(详情见图23-25)，这能导致自脑清除淀粉样蛋白肽。
表2：在本发明中鉴定的，在抑制测定法中给出阳性结果的模拟表位；MV-002模拟表位
  内部肽编号   序列   抑制能力
  p4667   NDAKIVFC   1
  p4670   HMRLFFNC   1
  p4673   GELWFPC   1
  p4674   SHQRLWFC   1
  p4675   HQKMIFAC   2
  p4680   GEIWFEGC   2
  p4681   GEIYFERC   2
  p4689   GEILFGMC   1
  p4698   GEIKFDHC   2
  p4699   GEIQFGAC   1
  p4794   HQKMIFC   1
对表2的说明：抑制能力用下面的代码编码：
弱抑制意味着降低AB结合需要比初始表位要多的肽；强抑制意味着降低AB结合需要的模拟表位和初始表位的肽量相似。将模拟表位与作为标准的初始肽比较。使用测定法中5ug肽时的OD来计算与初始肽相比的竞争能力。
  竞争代码
  0   无抑制(肽的OD高于初始肽4.6倍)
  1   比初始表位要弱(肽的OD低于初始肽4.6倍)
  2   强抑制(像初始表位一样；肽的OD低于初始肽的2.3倍)
3.4.体内表征模拟表位，所述表位是在用针对淀粉样蛋白β的单克隆抗 体筛选噬菌体展示文库时鉴定得到的：
给雌性C57/b16小鼠，每组5-6只小鼠，皮下免疫接种30μg偶联至KLH的肽。给对照组施用初始表位-KLH偶联物。使用明矾作为佐剂(始终每只小鼠1mg)。所施用的肽都能够特异性结合单克隆抗体，尽管一些肽在体外(在体外抑制测定法中)不抑制初始表位对其亲本抗体的结合。以两周间隔用每次免疫接种后单只小鼠的血清实施体外ELISA测定法以测定抗体滴度(分别见图25和26)。作为所有所显示的图中OD最大值/2来计算滴度。将ELISA板的孔用模拟表位-BSA偶联物和无关肽-BSA偶联物(阴性对照)包被。通过亲本抗体与各模拟表位-BSA偶联物的反应来实施阳性对照。用抗小鼠IgG来实施检测。另外，在ELISA板上固定化重组蛋白并相应地使血清反应。图23，24和25显示用于在体内表征模拟表位的测定法的代表性例子。所示结果分别衍生自在体外抑制测定法中有活性的肽，像p4670，p4675，p4680，和p4681及没有抑制能力的肽p4403。
图23显示通过分析针对注射的肽和含有无关序列的无关肽的免疫应答对通过模拟表位免疫接种引发的免疫应答的体内表征的例子。在所显示的例子中，表位p4377和模拟表位p4670，p4675，p4680，p4681和p4403引发针对注射的肽的免疫应答但不能诱导针对无关序列(p1454)的有关非特异性免疫应答。
图24显示对通过针对亲本抗体的各自初始表位(p4377)以及针对自Aβ的截短种类衍生的肽(p1323和p4374)及针对sAPPα的模拟表位免疫接种引发的免疫应答的体内表征的例子。
p4377和模拟表位p4670，p4675，p4680，p4681和p4403引起可检测的针对初始表位p4377的免疫应答。分析抗p4374展示的修饰形式的交叉反应性，能检测到类似的现象。有趣的是，初始表位和模拟表位疫苗引起针对p4374即修饰形式的初始表位的有关滴度。令人惊讶的是，模拟表位似乎能够诱导但不是必然诱导更有效的针对p1323的免疫应答，指示诱导与初始Aβ片段相比更宽的免疫反应性的潜力。另外，检测不到针对sAPPα的反应性。
图25显示通过针对全长Aβ的模拟表位免疫接种引发的免疫应答的体内表征的例子。令人惊讶的是，通过使用MV-002选择的模拟表位不仅诱导了与用于创建抗体的截短或修饰的短表位的交叉反应，而且诱导了与全长未修饰形式的Aβ的交叉反应性，就像初始序列一样好或甚至比p4377更有效。
有趣的是，竞争性以及非竞争性肽能够诱导相似的与含有初始Aβ序列的肽特异性相互作用的免疫应答。如此，本发明中呈现的模拟表位构成优化的新疫苗候选物来靶向广谱的天然存在形式的Aβ肽，像在AD患者的脑中已经找到的。所述形式分别包括但不限于Aβ1-40/42，和N端截短的形式像Aβ3-40/42，Aβ(pE)3-40/42，未修饰的Aβ11-40/42，修饰的Aβp(E)11-40/42和Aβ14-40/42。重要的是，所呈现的模拟表位也不诱导与自APP切除后sAPPα中存在的新表位的交叉反应性，如此不干扰正常sAPPα信号传导(详情见图24)。
表3：使用的非模拟表位肽
Figure BDA0000046664870000331
在表4中，描述了通过使用MV-002衍生模拟表位通过针对全长Aβ的模拟表位免疫接种引发的免疫应答的其它例子。表4中列出的所有肽引起针对全长和/或截短和修饰形式的Aβ或其片段的特异性免疫反应。
表4：模拟表位的体内表征：MV-002
  内部肽编号   Aβ/截短/修饰形式的检测
  p4403   +
  p4404   +
  p4413   +
  p4414   +
  p4415   +
  p4670   +
  p4673   +
  p4675   +
  p4680   +
  p4681   +
  p4693   +
  p4696   +
  p4698   +
  p4699   +
实施例9：体内表征模拟表位在转基因动物中减轻AD样疾病的功效
使用Tg2576AD小鼠来研究模拟表位疫苗的临床前功效。这种转基因系在仓鼠朊病毒蛋白质(PrP)启动子控制下表达在aa位置670/671处携带瑞典双重突变的人APP，这导致蛋白质的过表达。它是当前AD研究中最广泛采用的模型之一。Tg2576模型再现AD病理的各种标志，包括疾病特异性淀粉状蛋白斑沉积和星形细胞增多。正如迄今可得的所有其它AD模型系统，它不反映AD的所有主要神经病理特征。
为了评估用模拟表位处理是否能够预防大脑Aβ累积，以一个月间隔给Tg2576小鼠s.c注射6次吸附至ALUM(佐剂：氢氧化铝)的肽-KLH偶联物或单独的吸附至ALUM的PBS(称作PBS或对照)。直至最后一次免疫接种后8周，处死动物，收获它们的脑并分析它们的Aβ载荷(AD样病理)。在深度麻醉下处死小鼠。随后，分离脑，在4％PFA中固定并通过梯度乙醇系列来脱水，接着在二甲苯中温育及石蜡包埋。使用显微切片机将每一个石蜡包埋的脑以7μM切片并将切片安装在载玻片上。
作为测定Tg2576动物中AD样病理的一种方法，分析经处理动物的脑中被淀粉样蛋白沉积物占据的相对面积。使用自动化面积识别程序来实施这种分析。为了鉴定斑，将切片用单克隆抗体(mAb)3A5(对Aβ40/42特异性的)染色。将经模拟表位处理的动物与对照动物比较。在13.5-14月龄时处死所有动物。为了这种分析，选择覆盖皮质和海马的3片载玻片/动物，用mAb 3A5染色并随后使用Mirax-system(Zeiss)记录。为了计算被淀粉状蛋白斑占据的面积，分析多至4片切片/载玻片并在检查结果图片后排除携带组织假象和异常染色强度的切片。
对于自MV001衍生的模拟表位，使用三种例示候选物实施了面积分析。使用肽-KLH偶联物疫苗进行重复免疫接种后实施分析。对照组显示出平均占据0.35％，比较而言，经模拟表位处理的动物分别为0.11％，0.14％和0.22％。这对应于模拟表位处理后第2组中67％的降低，第3组中60％的降低和第4组中36％的降低(见图18)。
对于MV002的模拟表位，使用一种例示性候选物实施了面积分析。使用肽-KLH偶联物疫苗进行重复免疫接种后实施分析。对照组显示出平均占据0.35％，比较而言，经模拟表位处理的动物分别为0.24％。这对应于模拟表位处理后第2组中31％的降低。
对MV003衍生模拟表位组能检测到类似的现象。这里描绘了p4395的例子。正如关于MV001衍生模拟表位描述的，实施了肽偶联物免疫接种后被淀粉状蛋白斑占据的面积分析。对照组显示出平均占据0.35％，比较而言，经模拟表位处理的动物分别为0.21％。这对应于模拟表位处理后第2组中38％的降低(见图19)。
如此，这组数据清楚地指示模拟表位疫苗处理对转基因动物中AD样病理的有益效果。
实施例10：体内表征模拟表位在转基因动物中减轻PD样疾病的功效(概念分析的证据)
使用双重转基因小鼠模型(mThy1-APP751(TASD41系)与mThy1-wt人a-syn(TASD61系)杂交)来研究AD模拟表位疫苗减轻PD样疾病的临床前功效。该模型再现AD和PD病理的各种标志，包括疾病特异性淀粉状蛋白斑沉积和星形细胞增多以及突触核蛋白聚集和细胞损失。
为了评估用模拟表位处理是否能够改善PD样疾病，以一个月间隔给转基因小鼠s.c注射6次吸附至ALUM(佐剂：氢氧化铝)的肽-KLH偶联物或单独的吸附至ALUM的PBS(称作PBS或对照)。最后一次免疫接种后，遵循关于动物人道主义处理的指导方针处死动物。随后，分离脑，固定并使用振动切片机以40μM切片并将切片在防冻培养基中保存于-20℃。将切片用针对α-突触核蛋白和NeuN(神经元标志物)的抗体免疫染色并用激光共焦显微镜成像。用ImageQuant程序分析数字图像以评估α-突触核蛋白聚集物和神经元的数目。将经模拟表位处理的动物与对照动物比较。结果描绘本发明中描述的模拟表位的一组例示性数据。
为了分析接种AD模拟表位是否会导致PD相关病理减轻，分析了额皮质和海马中α-突触核蛋白的神经元内含体(Lewy小体样内含体)的发生率。在脑中过表达APP和α-突触核蛋白的动物发生暗示PD的病理改变。α-突触核蛋白阳性神经元内含体在图27中描绘为神经元体中的点。对内含体的定量分析揭示了新皮质和海马中的神经元细胞体中α-突触核蛋白的累积水平在AD模拟表位免疫接种后在双重转基因小鼠中显著降低。这种降低总计皮质中的32.7％(p＝0.0001)，指示AD模拟表位免疫接种对这个区域中PD样病理的有益效果。
作为评估转基因动物中PD样病理的第二种方法，通过NeuN染色分析了经处理动物的皮质和海马中神经元的数目。
在这种动物模型中，能检测到衰老后额皮质中以及海马中神经元的渐进损失。额皮质和海马中神经元密度的定量显示出双重转基因PBS处理小鼠中与非转基因对照动物相比的轻微降低。这种轻微的降低指示用于这个实验的品系中的神经变性。
有趣的是，用AD模拟表位处理的小鼠(图28)显示出水平与对照相当的NeuN阳性神经元。双重Tg动物揭示了分别与载体处理对照相比海马中统计学显著的27％升高(p＝0.044)。在皮质面积中，AD模拟表位处理后能观察到双重Tg动物中28.4％(p＝0.0053)的升高。这种与媒介处理动物相比的相对升高也可解释为得到成功治疗的动物中神经变性减轻的指标。
总之，这组数据清楚地指示AD模拟表位疫苗处理对转基因动物中PD样症状的有益效果。

Claims (17)

1.一种化合物，包含用于治疗、预防和/或改善帕金森氏病运动症状的肽，所述肽能结合特异于淀粉样蛋白β肽(Aβ)的表位的抗体。
2.依照权利要求1的化合物，其特征在于所述淀粉样蛋白β肽的表位选自下组：DAEFRH，EFRHDSGY，pEFRHDSGY，EVHHQKL，HQKLVF和HQKLVFFAED。
3.依照权利要求1或2的化合物，其特征在于所述肽不具有氨基酸序列DAEFRH，EFRHDSGY，pEFRHDSGY，EVHHQKL，HQKLVF和HQKLVFFAED。
4.依照权利要求1-3任一项的化合物，其特征在于所述肽包含氨基酸序列
X1X2X3X4X5X6X7，(式I)
其中X1为G或具有羟基的氨基酸或带负电荷的氨基酸，优选甘氨酸(G)，谷氨酸(E)，酪氨酸(Y)，丝氨酸(S)或天冬氨酸(D)，
X2为疏水性的氨基酸或带正电荷的氨基酸，优选天冬酰胺(N)，异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，缬氨酸(V)，赖氨酸(K)，色氨酸(W)，精氨酸(R)，酪氨酸(Y)，苯丙氨酸(F)或丙氨酸(A)，
X3为带负电荷的氨基酸，优选天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)，
X4为芳香族的氨基酸或疏水性的氨基酸或亮氨酸(L)，优选酪氨酸(Y)，苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)，
X5为组氨酸(H)，赖氨酸(K)，酪氨酸(Y)，苯丙氨酸(F)或精氨酸(R)，优选组氨酸(H)，苯丙氨酸(F)或精氨酸(R)，且
X6不存在或为丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)，天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)，精氨酸(R)，异亮氨酸(I)，赖氨酸(K)，酪氨酸(Y)，或甘氨酸(G)，优选苏氨酸(T)，天冬酰胺(N)，天冬氨酸(D)，精氨酸(R)，异亮氨酸(I)或甘氨酸(G)，
X7不存在或为任何氨基酸，优选脯氨酸(P)，酪氨酸(Y)，苏氨酸(T)，谷氨酰胺(Q)，丙氨酸(A)，组氨酸(H)或丝氨酸(S)，
优选EIDYHR，ELDYHR，EVDYHR，DIDYHR，DLDYHR，DVDYHR，DI-DYRR，DLDYRR，DVDYRR，DKELRI，DWELRI，YREFFI，YREFRI，YAEFRG，EAEFRG，DYEFRG，ELEFRG，DRELRI，DKELKI，DRELKI，GREFRN，EYEFRG，DWEFRDA，SWEFRT，DKELR，SFEFRG，DAEFRWP，DNEFRSP，GSEFRDY，GAEFRFT，SAEFRTQ，SAEFRAT，SWEFRNP，SWEFRLY，SWELRQA，SVEFRYH，SYEFRHH，SQEFRTP，SSEFRVS，DWEFRD，DAELRY，DWELRQ，SLEFRF，GPEFRW，GKEFRT，AYEFRH，DKE(Nle)R，DKE(Nva)R或DKE(Cha)R。
5.依照权利要求1-3任一项的化合物，其特征在于所述肽包含氨基酸序列
X1RX2DX3(X4)n(X5)m(X6)o，        (式II)，
其中X1为异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)，
X2为色氨酸(W)或酪氨酸(Y)，
X3为苏氨酸(T)，缬氨酸(V)，丙氨酸(A)，甲硫氨酸(M)，谷氨酰胺(Q)或甘氨酸(G)，
X4为脯氨酸(P)，丙氨酸(A)，酪氨酸(Y)，丝氨酸(S)，半胱氨酸(C)或甘氨酸(G)，
X5为脯氨酸(P)，亮氨酸(L)，甘氨酸(G)或半胱氨酸(C)，
X6为半胱氨酸(C)，
n，m和o独立地为0或1，
优选IRWDTP(C)，VRWDVYP(C)，IRYDAPL(C)，IRYDMAG(C)，IRWDTSL(C)，IRWDQP(C)，IRWDG(C)或IRWDGG(C)。
6.依照权利要求1-3任一项的化合物，其特征在于所述肽包含氨基酸序列
EX1WHX2X3(X4)n(X5)m            (式III)，
其中X1为缬氨酸(V)，精氨酸(R)或亮氨酸(L)，
X2为精氨酸(R)或谷氨酸(E)，
X3为丙氨酸(A)，组氨酸(H)，赖氨酸(K)，亮氨酸(L)，酪氨酸(Y)或甘氨酸(G)，
X4为脯氨酸(P)，组氨酸(H)，苯丙氨酸(F)或谷氨酰胺(Q)或半胱氨酸
X5为半胱氨酸(C)，
n和m独立地为0或1，
优选EVWHRHQ(C)，ERWHEKH(C)，EVWHRLQ(C)，ELWHRYP(C)，ELWHRAF(C)，ELWHRA(C)，EVWHRG(C)，EVWHRH(C)和ERWHEK(C)，优选EVWHRHQ(C)，ERWHEKH(C)，EVWHRLQ(C)，ELWHRYP(C)或ELWHRAF(C)。
7.依照权利要求1-3任一项的化合物，其特征在于所述肽包含氨基酸序列QDFRHY(C)，SEFKHG(C)，TSFRHG(C)，TSVFRH(C)，TPFRHT(C)，SQFRHY(C)，LMFRHN(C)，SAFRHH(C)，LPFRHG(C)，SHFRHG(C)，ILFRHG(C)，QFKHDL(C)，NWFPHP(C)，EEFKYS(C)，NELRHST(C)，GEMRHQP(C)，DTYFPRS(C)，VELRHSR(C)，YSMRHDA(C)，AANYFPR(C)，SPNQFRH(C)，SSSFFPR(C)，EDWFFWH(C)，SAGSFRH(C)，QVMRHHA(C)，SEFSHSS(C)，QPNLFYH(C)，ELFKHHL(C)，TLHEFRH(C)，ATFRHSP(C)，APMYFPH(C)，TYFSHSL(C)，HEPLFSH(C)，SLMRHSS(C)，EFLRHTL(C)，ATPLFRH(C)，QELKRYY(C)，THTDFRH(C)，LHIPFRH(C)，NELFKHF(C)，SQYFPRP(C)，DEHPFRH(C)，MLPFRHG(C)，SAMRHSL(C)，TPLMFWH(C)，LQFKHST(C)，ATFRHST(C)，TGLMFKH(C)，AEFSHWH(C)，QSEFKHW(C)，AEFMHSV(C)，ADHDFRH(C)，DGLLFKH(C)，IGFRHDS(C)，SNSEFRR(C)，SELRHST(C)，THMEFRR(C)，EELRHSV(C)，QLFKHSP(C)，YEFRHAQ(C)，SNFRHSV(C)，APIQFRH(C)，AYFPHTS(C)，NSSELRH(C)，TEFRHKA(C)，TSTEMWH(C)，SQSYFKH(C)，(C)SEFKH，SEFKH(C)，(C)HEFRH或HEFRH(C)。
8.依照权利要求1-3任一项的化合物，其特征在于所述肽包含氨基酸序列
(X1)mGX2X3X4FX5X6(X7)n            (式IV)，
其中X1为丝氨酸(S)，丙氨酸(A)或半胱氨酸(c)，
X2为丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，谷氨酸(E)，天冬氨酸(D)，谷氨酰胺(Q)或甲硫氨酸(M)，
X3为异亮氨酸(I)，酪氨酸(Y)，甲硫氨酸(M)或亮氨酸(L)，
X4为亮氨酸(L)，精氨酸(R)，谷氨酰胺(Q)，色氨酸(W)，缬氨酸(V)，组氨酸(H)，酪氨酸(Y)，异亮氨酸(I)，赖氨酸(K)，甲硫氨酸(M)或苯丙氨酸(F)，
X5为丙氨酸(A)，苯丙氨酸(F)，组氨酸(H)，天冬酰胺(N)，精氨酸(R)，谷氨酸(E)，异亮氨酸(I)，谷氨酰胺(Q)，天冬氨酸(D)，脯氨酸(P)或色氨酸(W)，甘氨酸(G)
X6为任何氨基酸残基，
X7为半胱氨酸(C)，
m和n独立地为0或1，
优选SGEYVFH(C)，SGQLKFP(C)，SGQIWFR(C)，SGEIHFN(C)，GQIWFIS(C)，GQIIFQS(C)，GQIRFDH(C)，GEMWFAL(C)，GELQFPP(C)，GELWFP(C)，GEMQFFI(C)，GELYFRA(C)，GEIRFAL(C)，GMIVFPH(C)，GEIWFEG(C)，GDLKFPL(C)，GQILFPV(C)，GELFFPK(C)，GQIMFPR(C)，GSLFFWP(C)，GEILFGM(C)，GQLKFPF(C)，GTIFFRD(C)，GQIKFAQ(C)，GTLIFHH(C)，GEIRFGS(C)，GQIQFPL(C)，GEIKFDH(C)，GEIQFGA(C)，GELFFEK(C)，GEIRFEL(C)，GEIYFER(C)，SGEIYFER(C)，AGEIYFER(C)或(C)GEIYFER。
9.依照权利要求1-3任一项的化合物，其特征在于所述肽包含氨基酸序列
(X1)mHX2X3X4X5FX6(X7)n            (式V)，
其中X1为丝氨酸(S)，苏氨酸(T)或半胱氨酸(C)，
X2为谷氨酰胺(Q)，苏氨酸(T)或甲硫氨酸(M)，
X3为赖氨酸(K)或精氨酸(R)，
X4为亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，
X5为色氨酸(W)，酪氨酸(Y)，苯丙氨酸(F)或异亮氨酸(I)，
X6为天冬酰胺(N)，谷氨酸(E)，丙氨酸(A)或半胱氨酸(C)，
X7为半胱氨酸(C)，
n和m独立地为0或1，
优选SHTRLYF(C)，HMRLFFN(C)，SHQRLWF(C)，HQKMIFA(C)，HMRMYFE(C)，THQRLWF(C)或HQKMIF(C)。
10.依照权利要求1-3任一项的化合物，其特征在于所述肽包含氨基酸序列AIPLFVM(C)，KLPLFVM(C)，QLPLFVL(C)或NDAKIVF(C)。
11.依照权利要求1-10任一项的化合物，其特征在于该化合物为多肽且包含4-30个氨基酸残基。
12.依照权利要求1-11任一项的化合物，其特征在于该化合物偶联至药学可接受载体，优选KLH(匙孔
Figure FDA0000046664860000041
血蓝蛋白)。
13.依照权利要求1-12任一项的化合物，其特征在于该化合物为皮下，皮内，或肌肉内施用而配制。
14.依照权利要求1-13任一项的化合物，其特征在于该化合物与佐剂，优选氢氧化铝一起配制。
15.依照权利要求1-14任一项的化合物，其特征在于该化合物以0.1ng至10mg，优选10ng至1mg，特别是100ng至10μg的量包含在药物中。
16.依照权利要求1-15任一项的化合物，其特征在于所述帕金森氏病运动症状选自下组：静止性震颤，运动徐缓，强直，体位不稳，弯腰体位，张力障碍，疲劳，细微运动灵巧性和运动协调受损，整体运动协调受损，运动缺乏(摆臂缩小)，静坐不能，言语问题，面部表情丧失，写字过小，吞咽困难，性功能障碍和流涎。
17.依照权利要求1-12任一项的化合物在制备用于治疗、预防和/或改善帕金森氏病运动症状的药物中的用途。
CN2009801313674A 2008-06-12 2009-06-12 用于治疗与帕金森氏病有关的症状的化合物 Pending CN102123726A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT0095208A AT506820B1 (de) 2008-06-12 2008-06-12 Vakzine gegen alzheimer-krankheit
ATA952/2008 2008-06-12
AT0095108A AT506819B1 (de) 2008-06-12 2008-06-12 Vakzin zur behandlung von alzheimer-krankheit
ATA951/2008 2008-06-12
PCT/AT2009/000237 WO2009149487A2 (en) 2008-06-12 2009-06-12 Compounds for treating symptoms associated with parkinson's disease

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102123726A true CN102123726A (zh) 2011-07-13

Family

ID=41417160

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2009801313674A Pending CN102123726A (zh) 2008-06-12 2009-06-12 用于治疗与帕金森氏病有关的症状的化合物

Country Status (12)

Country Link
US (2) US20110092436A1 (zh)
EP (1) EP2310032A2 (zh)
JP (1) JP2011522842A (zh)
KR (1) KR20110036809A (zh)
CN (1) CN102123726A (zh)
AU (1) AU2009257170B2 (zh)
BR (1) BRPI0915134A2 (zh)
CA (1) CA2723995A1 (zh)
IL (1) IL209896A0 (zh)
MX (1) MX2010013647A (zh)
RU (1) RU2011100127A (zh)
WO (1) WO2009149487A2 (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106632607A (zh) * 2016-12-29 2017-05-10 华东理工大学 靶向survivin纳米抗体及其制备方法和应用
CN108191966A (zh) * 2018-01-11 2018-06-22 台州学院 一种含导肽可穿越血脑屏障螯合脑内铁降自由基的多肽
CN108676071A (zh) * 2018-05-24 2018-10-19 华南理工大学 一种抗Aβ蛋白聚集的七肽及其应用与编码该合成多肽的基因
CN110156887A (zh) * 2018-02-12 2019-08-23 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 人vasn蛋白抗原表位、抗原模拟表位及其用途
WO2019223248A1 (zh) * 2018-05-24 2019-11-28 华南理工大学 一种具有抗 Aβ42 蛋白聚集功能的多肽及其应用与编码该多肽的基因
CN111040020A (zh) * 2018-12-28 2020-04-21 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种烯烃硫醚类订书肽及其制备方法与应用

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL3042917T3 (pl) 2010-08-12 2018-07-31 Eli Lilly And Company Przeciwciała przeciwko peptydowi beta amyloidu N3pGlu i ich zastosowanie
ES2496341T3 (es) 2011-10-04 2014-09-18 Affiris Ag Procedimiento para detectar anticuerpos Aß-específicos en una muestra biológica
EP2659908A1 (en) 2012-05-01 2013-11-06 Affiris AG Compositions
WO2015165961A1 (en) 2014-04-29 2015-11-05 Affiris Ag Treatment and prevention of alzheimer's disease (ad)
WO2015185602A1 (en) * 2014-06-04 2015-12-10 Affiris Ag Treatment and prevention of parkinson's disease (pd)
WO2016131420A1 (zh) * 2015-02-17 2016-08-25 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心 急性淋巴细胞白血病耐药复发相关突变基因及其应用
KR20180085736A (ko) 2015-11-09 2018-07-27 더 유니버시티 오브 브리티쉬 콜롬비아 아밀로이드 베타 중간-영역 내 에피토프 및 이에 대해 구조적으로 선택성인 항체
EP3374383A4 (en) 2015-11-09 2019-05-15 The University Of British Columbia BETA-AMYLOID EPITOPES AND ASSOCIATED ANTIBODIES
CN108350051A (zh) 2015-11-09 2018-07-31 英属哥伦比亚大学 淀粉样蛋白β中的N-末端表位及其构象选择性抗体
JOP20170004B1 (ar) 2016-01-15 2022-09-15 Lilly Co Eli الأجسام المضادة لببتيد بيتا النشوي مضاد N3pGlu واستخداماته
TWI798751B (zh) 2016-07-01 2023-04-11 美商美國禮來大藥廠 抗－N3pGlu類澱粉β肽抗體及其用途
US20180125920A1 (en) 2016-11-09 2018-05-10 The University Of British Columbia Methods for preventing and treating A-beta oligomer-associated and/or -induced diseases and conditions
JOP20190247A1 (ar) 2017-04-20 2019-10-20 Lilly Co Eli أجسام بيتا ببتيد النشوانية المضادة لـ N3pGlu واستخداماتها
EP3574020B1 (en) 2017-07-18 2024-05-15 The University of British Columbia Antibodies to amyloid beta

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7179892B2 (en) * 2000-12-06 2007-02-20 Neuralab Limited Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
KR100879810B1 (ko) * 2000-02-21 2009-01-22 하. 룬드벡 아크티에셀스카브 아밀로이드의 하향-조절을 위한 신규한 방법
US20040067535A1 (en) * 2002-10-03 2004-04-08 Life Sciences Development Corp. Alzheimer's disease linked genes
TW200509968A (en) * 2002-11-01 2005-03-16 Elan Pharm Inc Prevention and treatment of synucleinopathic disease
US20040265849A1 (en) * 2002-11-22 2004-12-30 Applera Corporation Genetic polymorphisms associated with Alzheimer's disease, methods of detection and uses thereof
AT413945B (de) * 2003-01-14 2006-07-15 Mattner Frank Dr Impfstoff für die alzheimer-krankheit
US20050176030A1 (en) * 2003-10-28 2005-08-11 Li Gan Regulated nucleic acids in pathogenesis of Alzheimer's Disease
JP2005330231A (ja) * 2004-05-20 2005-12-02 Otsuka Pharmaceut Co Ltd 医薬組成物
AT413946B (de) * 2004-07-13 2006-07-15 Mattner Frank Dr Impfstoff gegen die alzheimer-krankheit
GT200600031A (es) * 2005-01-28 2006-08-29 Formulacion anticuerpo anti a beta
KR20100123717A (ko) * 2008-02-12 2010-11-24 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Ｃ형 간염 바이러스 억제제로서의 헤테로시클릭 유도체

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106632607A (zh) * 2016-12-29 2017-05-10 华东理工大学 靶向survivin纳米抗体及其制备方法和应用
CN108191966A (zh) * 2018-01-11 2018-06-22 台州学院 一种含导肽可穿越血脑屏障螯合脑内铁降自由基的多肽
CN108191966B (zh) * 2018-01-11 2020-10-27 桂林医学院 一种含导肽可穿越血脑屏障螯合脑内铁降自由基的多肽
CN110156887A (zh) * 2018-02-12 2019-08-23 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 人vasn蛋白抗原表位、抗原模拟表位及其用途
CN108676071A (zh) * 2018-05-24 2018-10-19 华南理工大学 一种抗Aβ蛋白聚集的七肽及其应用与编码该合成多肽的基因
WO2019223248A1 (zh) * 2018-05-24 2019-11-28 华南理工大学 一种具有抗 Aβ42 蛋白聚集功能的多肽及其应用与编码该多肽的基因
CN108676071B (zh) * 2018-05-24 2021-05-14 华南理工大学 一种抗Aβ蛋白聚集的七肽及其应用与编码该合成多肽的基因
CN111040020A (zh) * 2018-12-28 2020-04-21 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种烯烃硫醚类订书肽及其制备方法与应用
CN111040020B (zh) * 2018-12-28 2022-04-12 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种烯烃硫醚类订书肽及其制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
AU2009257170A1 (en) 2009-12-17
EP2310032A2 (en) 2011-04-20
US20130287807A1 (en) 2013-10-31
RU2011100127A (ru) 2012-07-20
IL209896A0 (en) 2011-02-28
AU2009257170B2 (en) 2014-06-12
CA2723995A1 (en) 2009-12-17
MX2010013647A (es) 2011-04-05
JP2011522842A (ja) 2011-08-04
KR20110036809A (ko) 2011-04-11
US20110092436A1 (en) 2011-04-21
BRPI0915134A2 (pt) 2016-02-16
WO2009149487A3 (en) 2010-07-29
WO2009149487A2 (en) 2009-12-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102123726A (zh) 用于治疗与帕金森氏病有关的症状的化合物
CN102123727B (zh) 用于治疗β-淀粉样变的化合物
US11534484B2 (en) Mimotopes of alpha-synuclein and vaccines thereof for the treatment of synucleinopathy
CN102123728A (zh) 用于治疗淀粉样变的化合物
JP5901714B2 (ja) アルファシヌクレイン・エピトープのミモトープのレヴィ小体病治療への使用
KR20230044524A (ko) 면역원성 화합물

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20110713