CN108191966A - 一种含导肽可穿越血脑屏障螯合脑内铁降自由基的多肽 - Google Patents
一种含导肽可穿越血脑屏障螯合脑内铁降自由基的多肽 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种含导肽可穿越血脑屏障螯合脑内铁降自由基的多肽，包括螯合铁序列和导肽序列，所述螯合铁序列、导肽序列都由氨酸残基组成，所述螯合铁序列包括若干个X序列，所述X序列由H、A、Y、E、D组成，所述H、A、Y、E、D任意排列，所述H为组氨酸残基，所述A为丙氨酸残基，所述Y为酪氨酸残基，所述E为谷氨酸残基，所述D为天冬氨酸残基。本发明降低了脑脊液内冗余铁，减少了自由基对脑组织的损伤，缓解了智能丧失，不会对肾脏造成显著影响，并可降低AD导致的炎症。
Description
技术领域
本发明涉及一种含导肽可穿越血脑屏障螯合脑内铁降自由基的多肽。
背景技术
老年痴呆症(Alzheimer’s Disease，AD)是一种神经退行性疾病，因神经元大量坏死，导致脑萎缩而丧失记忆力，并伴有精神失常，语言障碍和人格变异。AD给病人家庭带来极大烦恼和负担。AD发病原因尚不明确，目前仍无有效方法治疗。
AD脑内铁含量比正常脑高出约35％。生物体在新陈代谢生命活动过程中，会不断生成一些氧化活性物质，如H2O2等，可与Fe2+离子发生Fenten’s反应，催生自由基。生成的·OH、O2˙-自由基可进一步与体内的生物大分子作用，破坏组织和细胞内的脂质，蛋白质等，导致细胞损伤，组织坏死。去除脑内冗余的过渡金属，是治疗AD的一个方向。曾有人用去铁敏，地拉罗斯等口服药用于去除血液和脑内过高的铁以缓解病症，但久服这些药物易引起肾衰和血液病，甚至死亡。
Aβ42是脑内由淀粉样样蛋白APP断裂分泌的一种含42个氨基酸残基的多肽。其中的酪氨酸(Tyr，Y)、谷氨酸(Glu，E)、以及天冬氨酸(Asp，D)、甲硫氨酸(Met，M)残基可与铁离子结合而沉积，降低溶液内铁的浓度，并减少自由基。这启发我们用Aβ42降低铁和自由基缓解AD。然而天然的Aβ42肽可结合铁的氨基酸残基只占全部氨基酸序列的1/3，而且溶解性小。要消除AD病人脑内全部冗余铁显得杯水车薪。因此我们考虑把Aβ42中可螯合铁的氨基酸残基如Tyr、Glu、Asp、Met，将它们整合到一起成五遍重复序列合成一种多肽，把结合铁的氨基酸残基含量提高，并且这些氨基酸含有更多离子，具有较高的溶解性，以便结合更多的铁离子降低脑脊液内冗余的铁，减少催生的自由基破坏脑组织。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种含导肽可穿越血脑屏障螯合脑内铁降自由基的多肽。
为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种含导肽可穿越血脑屏障螯合脑内铁降自由基的多肽，包括螯合铁序列和导肽序列，所述螯合铁序列、导肽序列都由氨酸残基组成，所述螯合铁序列包括若干个X序列，所述X序列由H、A、Y、E、D组成，所述H、A、Y、E、D 任意排列，所述H为组氨酸残基，所述A为丙氨酸残基，所述Y为酪氨酸残基，所述E为谷氨酸残基，所述D为天冬氨酸残基。所述导肽序列为MHKWILTWILPTLLYRSCFHIICLVGTISLAC，所述M为蛋氨酸残基，所述K为赖氨酸残基，所述W为色氨酸残基，所述I为异亮氨酸残基，所述L为亮氨酸残基，所述P为脯氨酸残基，所述T为苏氨酸残基，所述R为精氨酸残基，所述S为丝氨酸残基，所述C为半胱氨酸残基，所述F为苯丙氨酸残基，所述G为甘氨酸残基，所述V为缬氨酸残基。
多肽中丙氨酸残基的个数、组氨酸残基的个数、酪氨酸残基的个数、谷氨酸残基的个数、天冬氨酸残基的个数的总和超过该多肽中所有氨酸残基总数的 15％。
本发明的有益效果如下：本发明降低了脑脊液内冗余铁，减少了自由基对脑组织的损伤，缓解了智能丧失，不会对肾脏造成显著影响，并可降低AD导致的炎症。
附图说明
图1为无导肽序列的合成肽质谱；
图2为Aβ42与铁反应的等温滴定释热谱；
图3为本发明的多肽与铁反应的等温滴定释热谱；
图4为空样品台的X能谱；
图5为加FeCL3的样品台中的Fe的X能谱；
图6为本发明的多肽的透射电镜照片；
图7为本发明的多肽与FeCL3反应前的Fe元素的X能谱；
图8为本发明的多肽与FeCL3反应后的结合物的透射电镜照片；
图9为本发明的多肽与FeCL3反应后的结合物中Fe元素的X能谱；
图10本发明的多肽的红外光谱；
图11为本发明的多肽与FeCL3反应后的结合物的红外光谱；
图12为铁培养基内的.OH自由基的含量与本发明的多肽的浓度之间关系图；
图13为不同情况下的.OH自由基含量的对比图；
图14为不同情况下的细胞死亡率的对比图；
图15为正常细胞图；
图16为正常细胞中加入正常含量Fe后的细胞图；
图17为培养液内铁浓度为老年痴呆症患者脑内浓度的培养细胞图；
图18为正常细胞中加入本发明的多肽的细胞图；
图19为培养液内铁浓度为老年痴呆症患者脑内铁浓度的培养液中加入本发明的多肽后的细胞图；
图20为在脑血管壁上没有装入受体蛋白APoEK16后本发明多肽未能进入脑血管壁的状态图；
图21为在脑血管壁上装入受体蛋白APoEK16后,本发明多肽进入脑血管壁状态图；
图22为本发明多肽的高效液相图；
图23为脑脊液内本肽的HPLC分析图；
图24为在脑血管壁上装入受体蛋白APoEK16的图；
图25为在脑血管壁上装入受体蛋白APoEK16后分布在脑血管壁上的状态图；
图26为AD鼠的脑脊液内的·OH自由基的含量与本发明的多肽的浓度之间关系图；
图27为不同处理的AD鼠脑脊液内的铁浓度对比图；
图28为不同情况下老鼠的脑脊液内的OH自由基的含量对比图；
图29为正常小鼠的脑组织内神经凋亡状况图；
图30为正常小鼠加入APoEK16后的脑组织内神经凋亡状况图；
图31为正常小鼠加入本发明多肽后的状态图；
图32为痴呆小鼠的脑组织图；
图33为为痴呆小鼠脑内未加APoEK16但从血管注射了本发明的多肽的痴呆小鼠脑组织图；
图34为患有痴呆症小鼠脑血管内注入APoEK16后,再从血管注射了本发明的多肽的痴呆小鼠脑组织图；
图35为正常小鼠脑内血氧代谢核磁共振水平的fMRI图；
图36为痴呆小鼠脑内血氧代谢核磁共振水平的fMRI图；
图37为痴呆小鼠脑内未加APoEK16但从血管注射了本发明多肽的痴呆小鼠脑组织脑内血氧代谢核磁共振水平的fMRI图；
图38为痴呆小鼠脑血管内注射了APoEK16之后，再从血管注射本发明的多肽后的小鼠脑组织内血氧代谢核磁共振水平的fMRI图；
图39为正常小鼠找水台的路线图；
图40为患有痴呆症小鼠找水台的路线图；
图41为未加APoEK16但从血管注射了本发明的多肽的患有痴呆症小鼠的找水台的路线图；
图42为加APoEK16后再从血管注射了本发明的多肽的患有痴呆症小鼠的找水台的路线图；
图43为不同情况下小鼠血氧面积对比图；
图44为不同情况下小鼠找到水台所消耗时间的对比图；
图45为本发明多肽与脑组织反应图；
图46为本发明多肽与APoEK16联用患有痴呆症小鼠后的肾功能指标表；
图47为本发明多肽与APoEK16联用患有痴呆症小鼠后的血常规检测表。
本发明的具体实施方式
下面结合说明书附图对本发明的技术方案作进一步说明：
实施例1：
一种含导肽可穿越血脑屏障螯合脑内铁降自由基的多肽，包括螯合铁序列和导肽序列，所述螯合铁序列、导肽序列都由氨酸残基组成，所述螯合铁序列包括5种氨基酸残基：H、A、Y、E、D。它们(H、A、Y、E、D)可任意排列，其中H为组氨酸残基，所述A为丙氨酸残基，所述Y为酪氨酸残基，所述E为谷氨酸残基，所述D为天冬氨酸残基。
所述导肽序列为MHKWILTWILPTLLYRSCFHIICLVGTISLAC，其中所述M为蛋氨酸残基，所述K为赖氨酸残基，所述W为色氨酸残基，所述I为异亮氨酸残基，所述L为亮氨酸残基，所述P为脯氨酸残基，所述T为苏氨酸残基，所述R为精氨酸残基，所述S为丝氨酸残基，所述C为半胱氨酸残基，所述F为苯丙氨酸残基，所述G为甘氨酸残基，所述V为缬氨酸残基。多肽中丙氨酸残基的个数、组氨酸残基的个数、酪氨酸残基的个数、谷氨酸残基的个数、天冬氨酸残基的个数的总和占该多肽中所有氨酸残基总数的55.5％
因此一种含导肽可穿越血脑屏障螯合脑内铁降自由基的多肽的序列即螯合铁序列-导肽序列：
HAYEDHAYEDHAYEDHAYEDHAYEDHAYEDHAYEDHAYED-MHKWILTWILPTLLYRSCFHIICLVGTISLAC。
含导肽可穿越血脑屏障螯合脑内铁降自由基的多肽的鉴定如下：
无导肽序列的合成肽质谱如图1中所示，在m/z＝715.85峰处为5质子片段；894峰为4质子的片段,1192为3质子的片段；全序列为分子量为3574.5。
含导肽序列的合成肽测序结果为：
脑组织外围有一层由血管壁和胶质细胞组成的致密层，血液中的各种成分包括大分子药物不容易通过血液循环进入脑组织中，这样就降低了药物对脑疾病的疗效。为了能让药物，尤其是大分子透过血脑屏障进入脑组织发挥疗效，我们运用了一种能驻留在血脑屏障血管壁上皮细胞受体蛋白APoEK16联合本发明的多肽，这样在多肽就能到达脑血管壁时，受体蛋白识别并牵引多肽通过膜孔道进入脑组织，发挥多肽的治疗作用。
在实验中，我们将受体蛋白APoEK16注入小鼠心脏，并通过血液循环让它扩散到全身驻留在血管壁上，然后将合成本发明的多肽注射入患有老年痴呆的小鼠的血管随血液循环扩散到组织，如图45所示，实心圆点代表自由铁，雪花图案代表自由基，发现本发明的多肽进入了脑组织，并降低了脑脊液内冗余铁，减少了自由基对脑组织的损伤，缓解了智能丧失。而未注射通道蛋白APoEK16 的小鼠，注入的治疗多肽不能进入脑组织。注射了通道蛋白ApoEK16，但注射螯合铁序列也不能进入脑组织。
实施例2：
一种含导肽可穿越血脑屏障螯合脑内铁降自由基的多肽，包括螯合铁序列和导肽序列，所述螯合铁序列、导肽序列都由氨酸残基组成，所述螯合铁序列包括若干个氨基酸序列，这些序列均由H、A、Y、E、D任意顺序组合而成，如： HAYED或AHYED或AHEYD等等，其中H为组氨酸残基，所述A为丙氨酸残基，所述Y为酪氨酸残基，所述E为谷氨酸残基，所述D为天冬氨酸残基。
所述导肽序列为MHKWILTWILPTLLYRSCFHIICLVGTISLAC，所述M为蛋氨酸残基，所述K为赖氨酸残基，所述W为色氨酸残基，所述I为异亮氨酸残基，所述L为亮氨酸残基，所述P为脯氨酸残基，所述T为苏氨酸残基，所述R为精氨酸残基，所述S为丝氨酸残基，所述C为半胱氨酸残基，所述F为苯丙氨酸残基，所述G为甘氨酸残基，所述V为缬氨酸残基。
多肽中丙氨酸残基的个数、组氨酸残基的个数、酪氨酸残基的个数、谷氨酸残基的个数、天冬氨酸残基的个数的总和超过该多肽中所有氨酸残基总数的 15％。
实验数据如下：
如图2和图3所示，在图2中，ITC释热谱表明Fe与Aβ42反应后，复合物焓减2883kCal/mole，在图3中Fe与本发明的多肽反应后焓降低更多，为93011 kCal/mole，说明本发明的多肽比Aβ42结合更多铁因而比结合Aβ42更牢固。
图4为空样品台的X能谱，图5为加FeCl3的样品台上Fe的X能谱，图6 为本发明的多肽的透射电镜照片，图7为本发明的多肽与FeCl3反应前的Fe元素的X能谱，图8为本发明的多肽与FeCl3反应后的结合物的透射电镜照片，图 9为本发明的多肽与FeCL3反应后的结合物中Fe元素的X能谱，图10本发明的多肽的红外光谱，图11为Fe离子与本发明的多肽的结合物的红外光谱。
如图4、图5、图6、图7、图8、图9所示，对比图4、图5、图6、图7，可以看出图7的多肽为线状，X光能谱显示无铁与之共分布(白斑点所示为铁元素所在位置)，图8、图9可以看出本发明的多肽与铁反应后，多肽为团状，铁与多肽共分布。从图10和图11可以看出，多肽与FeCl3反应后，Tyr(Y)，Glu(E)， Asp(D)，Met(M)氨基酸上的羟基、巯基和氨基上的H谱线有变化，说明FeCl3与多肽上的Tyr，Glu，Asp，Met残基可能发生结合。
图13、图14中，横坐标CTL为正常细胞，横坐标NM Fe为正常细胞中加入正常含量Fe的细胞，横坐标AD Fe为老年痴呆症患者的细胞，横坐标HAYED 为正常细胞中加入本发明的多肽的细胞，横坐标AD Fe+HAYED为老年痴呆症患者的细胞中加入本发明的多肽后的细胞。
从图12、图13可以看出，本发明的多肽可以降低含铁培养基内的·OH自由基，且随多肽的含量增加而减少。从图14、图15、图16、图17、图18、图 19可以看出本发明的多肽可减少铁对细胞的毒性，减少细胞死亡。注：图中黑色部分为死亡细胞。
因为脑组织外围有一层由血管壁和胶质细胞组成的致密层，血液中的各种成分包括大分子药物不容易通过血液循环进入脑组织中，这样就降低了药物对脑疾病的疗效。为了能让药物，尤其是大分子透过血脑屏障进入脑组织发挥疗效，我们除了利用本发明的多肽，还需要运用了一种能驻留在血脑屏障血管壁上皮细胞受体蛋白APoEK16，这样在多肽就能到达脑血管壁时，受体蛋白识别并牵引药物多肽通过膜孔道进入脑组织，发挥药物的治疗作用，若没有受体蛋白APoEK16，本发明的多肽进不能进入脑组织。图20为在脑血管壁上没有装入受体蛋白APoEK16后本发明多肽不能进入脑血管壁的状态图；图21为在脑血管壁上装上受体蛋白APoEK16后的本发明多肽进入脑血管壁状态图；图22为本发明多肽的HPLC分析图；图23为脑脊液内本肽的HPLC分析图，30,40处可见本肽被切除的导肽部分。
图24为在脑血管壁上装入受体蛋白APoEK16的图,注射无导肽序列的本合成多肽，免疫组化未显示本发明的螯合铁序列进入脑组织内,无导肽的螯合铁序列未能进入脑内；图25为在脑血管壁上装入受体蛋白APoEK16后的本发明多肽结合到脑血管壁，从图20可以看出，没有受体蛋白APoEK16，多肽就不能进入脑组织，从图21可以看出，有受体蛋白APoEK16，多肽就能进入脑组织，图22、图23可检测到脑脊液内有切除的多肽片段，图24中可看出，虽然有受体蛋白 APoEK16，但是没有导肽序列，多肽也不能进入脑组织，图25可看出，既有受体蛋白APoEK16又有螯合铁序列和导肽的多肽才能进入脑组织，多肽分布于脑血管周围。
图26为AD鼠的脑脊液内的·OH自由基的含量与本发明的多肽的浓度之间关系图，其中·OH自由基的含量随本发明的多肽浓度增加而下降。图27为不同处理的AD鼠脑脊液内的铁浓度对比图，脑脊液内铁含量随本发明的多肽浓度增加而下降。图28为不同情况下脑脊液内的OH自由基的含量对比图。
图27、图28中，横坐标CTL为正常小鼠的细胞，AD为患有痴呆症小鼠的细胞；AD+HAYED-L为加入本发明多肽的患有痴呆症小鼠的细胞；AD+ APoEK16+HAYED-L为加入本发明多肽和APoEK16的患有痴呆症小鼠的细胞。
从图26可以看出老鼠的自由基含量随多肽浓度增加而减少，从图27可以看出加受体蛋白APoEK16和多肽后老鼠脑脊液中铁的含量降低，从图28可以看出加受体蛋白APoEK16和多肽后老鼠脑脊液中自由基减少。
图29为正常小鼠的脑组织内神经凋亡状况图,凋亡细胞数量较少。图30为正常小鼠加入APoEK16后的脑组织内神经凋亡状况图,APoEK16未引起脑细胞凋亡。图31为正常小鼠加入本发明多肽后的状态图，本发明多肽未引起脑细胞凋亡。图32为痴呆小鼠的脑组织图，亮斑显示为凋亡神经细胞，痴呆小鼠脑内凋亡神经元比较多。图33为为痴呆小鼠脑内未加APoEK16但从血管注射了本发明的多肽的痴呆小鼠脑组织图，仍见小鼠脑内有很多凋亡神经细胞；图34为患有痴呆症小鼠脑血管内注入APoEK16后,再从血管注射了本发明的多肽的痴呆小鼠脑组织图，可见小鼠脑内亮斑减少，说明神经细胞凋亡减少本发明的多肽起了保护作用。对比图29、30、31可以看出，受体蛋白APoEK16和多肽对正常脑组织损伤不明显，从图33可以看出，仅加多肽不加受蛋白APoEK16，多肽进不了脑组织，对患有痴呆症小鼠的脑组织损伤的保护不明显；而加受体蛋白APoEK16 和多肽后脑组织内坏死细胞减少。各图中灰色连扳为坏死细胞。
图35为正常小鼠脑内血氧代谢核磁共振水平的fMRI图，白色区域为血氧代谢核磁共振活跃区。图36为痴呆小鼠脑内血氧代谢核磁共振水平的fMRI图，可见AD小鼠脑内白色区域，说明血氧代谢核磁共振水平降低。图37为痴呆小鼠脑内未加APoEK16但从血管注射了本发明多肽的痴呆小鼠脑组织脑内血氧代谢核磁共振水平的fMRI图，可见未加APoEK16，本发明多肽未能进入脑内，白色区域增加不明显，未提高脑内血氧代谢水平。图38为痴呆小鼠脑血管内注射了APoEK16之后，再从血管注射本发明的多肽后的小鼠脑组织内血氧代谢核磁共振水平的fMRI图，可见加了APoEK16，本发明多肽进入脑内，白色区域面积明显增大，说明血氧代谢核磁共振水平提高了。各图中亮区为血氧代谢核磁共振活跃区，图43为不同情况下小鼠血氧面积对比图。从图35、图36、图37、图38对比可以看出，加入本发明多肽、APoEK16后的患有痴呆症小鼠的血氧代谢核磁共振比图36、图37更为活跃，因此可以得出受体蛋白APoEK16与本发明的多肽联用可提高患有痴呆症小鼠脑血氧代谢水平。
图39为正常小鼠找水台的路线图；图40为患有痴呆症小鼠找水台的路线图，其所花时间和路径比正常小鼠多和长。图41为未加APoEK16但从血管注射了本发明的多肽的患有痴呆症小鼠的找水台的路线图，其所花时间和寻找路径与痴呆小鼠无明显缩短。图42为加APoEK16后再从血管注射了本发明的多肽的患有痴呆症小鼠的找水台的路线图，其所花时间和寻找路径与痴呆小鼠明显缩短。图44为不同情况下小鼠找到水台所消耗时间的对比图。对比图39、图40、图41、图42、图43、图44可以得出经受体蛋白APoEK16和多肽联用处理后患有痴呆症小鼠找到水台的时间缩短，说明经受体蛋白APoEK16和多肽联用处理后患有痴呆症小鼠智能得以改善。
如表1所示，本发明的多肽与受体蛋白APoEK16联用未给患有痴呆症小鼠即AD小鼠肾功能指标尿肌酐sCR和血尿氮BUN带来显著改变，说明本发明的多肽是一种无副作用的多肽，不会对肾功能造成损害。
表2为本发明多肽与APoEK16联用患有痴呆症小鼠后的血常规检测表，表 2说明：本发明多肽未对MCV、NE造成显著影响，也没有改善AD导致的RDW， MO和WBC增加。
尽管如此，本发明多肽扭转了AD导致的红细胞数量、血球容积、嗜酸粒和嗜碱粒细胞百分比，血小板数量和血红蛋白浓度(RBC、HCT、EO、BA、PLT、MCHC) 的降低，减少了AD导致的淋巴细胞和血小板容积(LY、MPV)升高，说明本发明多肽可缓解AD导致的炎症。
需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一种具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形，总之，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种含导肽可穿越血脑屏障螯合脑内铁降自由基的多肽，其特征在于，包括螯合铁序列和导肽序列，所述螯合铁序列、导肽序列都由氨酸残基组成，所述螯合铁序列包括若干个X序列，所述X序列由H、A、Y、E、D组成，所述H、A、Y、E、D任意排列，所述H为组氨酸残基，所述A为丙氨酸残基，所述Y为酪氨酸残基，所述E为谷氨酸残基，所述D为天冬氨酸残基。
2.根据权利要求1所述含导肽可穿越血脑屏障螯合脑内铁降自由基的多肽，其特征在于，
所述导肽序列为MHKWILTWILPTLLYRSCFHIICLVGTISLAC，所述M为蛋氨酸残基，所述K为赖氨酸残基，所述W为色氨酸残基，所述I为异亮氨酸残基，所述L为亮氨酸残基，所述P为脯氨酸残基，所述T为苏氨酸残基，所述R为精氨酸残基，所述S为丝氨酸残基，所述C为半胱氨酸残基，所述F为苯丙氨酸残基，所述G为甘氨酸残基，所述V为缬氨酸残基。
3.根据权利要求1所述含导肽可穿越血脑屏障螯合脑内铁降自由基的多肽，其特征在于，所述多肽中丙氨酸残基的个数、组氨酸残基的个数、酪氨酸残基的个数、谷氨酸残基的个数、天冬氨酸残基的个数的总和超过该多肽中所有氨酸残基总数的15%。
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